RU2518460C2 - Производные инсулина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к производным дез(B30)человеческого инсулина, которые имеют боковую цепь, присоединенную к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, где эта боковая цепь имеет общую формулу-W-X-Y-Z, где W, X, Y и Z являются такими, как определено в описании. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 37 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым производным человеческого инсулина, которые растворимы при физиологических значениях рН и обладают пролонгированным профилем действия. Изобретение также относится к способам получения таких производных, к фармацевтическим композициям, содержащим их, к способу лечения диабета и гипергликемии с использованием производных инсулина по изобретению и к применению таких производных инсулина при лечении диабета и гипергликемии.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время лечение диабета, как диабета типа 1, так и диабета типа 2, во все возрастающей степени основано на так называемой интенсивной инсулинотерапии. Согласно данному режиму пациентов лечат многократными суточными инъекциями инсулина, включающими одну или две инъекции в сутки инсулина длительного действия, чтобы покрыть основную потребность в инсулине, с дополнительными болюсными инъекциями инсулина быстрого действия, чтобы покрыть потребность в инсулине, связанную с приемом пищи.

Композиции инсулина длительного действия хорошо известны в данной области техники. Так, один основной тип композиций инсулина длительного действия представляет собой инъекционные водные суспензии кристаллов инсулина или аморфного инсулина. В этих композициях типично используемыми соединениями инсулина являются инсулин протамин, инсулин цинк или инсулин протамин цинк.

С применением суспензий инсулина связаны некоторые недостатки. Так, чтобы обеспечить точную дозировку, частицы инсулина должны быть однородно суспендированы путем осторожного встряхивания перед набором определенного объема суспензии из ампулы или выталкиванием из картриджа. Также для хранения суспензий инсулина температура должна поддерживаться в более узких пределах, чем для растворов инсулина, чтобы избежать образования комков или коагуляции.

Хотя раньше считали, что протамины являются неиммуногенными, теперь оказалось, что протамины могут быть иммуногенными у человека и что их применение в медицинских целях может привести к образованию антител. Также было сделано открытие, что комплекс протамин-инсулин сам по себе является иммуногенным. Следовательно, некоторым пациентам следует избегать применения композиций инсулина длительного действия, содержащих протамины.

Другим типом композиций инсулина длительного действия являются растворы, имеющие значение рН ниже физиологического рН, за счет которого инсулин будет выпадать в осадок в связи с повышением значения рН, когда этот раствор инъецируют. Недостатком этих растворов является то, что распределение частиц осадка, образовавшегося в ткани после инъекции, по размеру, а следовательно, профиль высвобождения лекарства несколько непредсказуемо зависит от кровотока в месте инъекции и от других параметров. Следующим недостатком является то, что твердые частицы инсулина могут действовать как локальный имитатор, вызывающий воспаление ткани в месте инъекции.

В WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) раскрыты композиции растворимого инсулина, содержащие инсулиновые комплексы кобальта (III). Профиль действия этих комплексов является лишь умеренно пролонгированным, и биодоступность снижена по сравнению с человеческим инсулином.

Человеческий инсулин имеет три первичные аминогруппы: N-концевые группы А-цепи и В-цепи и ε-аминогруппу Lys^B29. Некоторые производные инсулина, которые замещены в одной или более чем одной из этих групп, известны из предшествующего уровня техники. Так, патент США Ns 3528960 (Eli Lilly) относится к N-карбоксиароилинсулинам, в которых одна, две или три первичные аминогруппы молекулы инсулина имеют группу карбоксиароил.

Согласно патенту Великобритании №1492997 (Nat. Res. Dev. Corp.) обнаружено, что инсулин с карбамил-замещением при N^εB29 обладает улучшенным профилем гипогликемического эффекта.

В выложенной патентной заявке Японии №1-254699 (Kodama Co., Ltd.) раскрыт инсулин, где жирная кислота связана с аминогруппой Phe^B1 или с ε-аминогруппой Lys^B29 или с обеими из них. Поставленной задачей получения такого производного является получение фармакологически приемлемого, стабильного препарата инсулина.

Инсулины, которые в положении B30 имеют аминокислоту, содержащую по меньшей мере пять атомов углерода, которая не обязательно может кодироваться триплетом нуклеотидов, описаны в выложенной патентной заявке Японии №57-067548 (Shionogi). Аналоги инсулина заявлены как полезные при лечении сахарного диабета, в частности, у пациентов, которые являются устойчивыми к инсулину вследствие образования антител на бычий или свиной инсулин.

В WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S) раскрыты производные человеческого инсулина, где ε-аминогруппа Lys^B29 имеет липофильный заместитель. Эти производные инсулина обладают пролонгированным профилем действия и растворимы при физиологических значениях рН.

В ЕР 894095 раскрыты производные инсулина, где N-концевая группа В-цепи и/или ε-аминогруппа Lys в положении В28, В29 или B30 имеет заместитель формулы -CO-W-COOH, где W может представлять собой длинноцепочечную углеводородную группу. Эти производные инсулина обладают пролонгированным профилем действия и растворимы при физиологических значениях рН.

Однако все еще существует необходимость в инсулинах, имеющих более пролонгированный профиль действия, чем производные инсулина, известные до сих пор, и которые в то же время растворимы при физиологических значениях рН и обладают эффективностью, которая сравнима с таковой человеческого инсулина.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение основано на признании того, что общая гидрофобность молекулы производного инсулина играет важную роль в эффективности этого производного in vivo.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к производному инсулина, которое представляет собой встречающийся в природе инсулин или его аналог, который имеет боковую цепь, присоединенную либо к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка В-цепи либо к ε-аминогруппе остатка лизина, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, где эта боковая цепь имеет общую формулу:

-W-X-Y-Z,

где W представляет собой:

- α-аминокислотный остаток, имеющий карбоксильную группу в боковой цепи, где этот остаток образует посредством его карбоксильной группы амидную группу с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка В-цепи или с ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина;

- цепь, состоящую из двух, трех или четырех α-аминокислотных остатков, соединенных вместе посредством амидных связей, причем эта цепь посредством амидной связи присоединена к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка В-цепи или к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, где аминокислотные остатки цепи W выбраны из группы аминокислотных остатков, имеющих нейтральную боковую цепь, и аминокислотных остатков, имеющих карбоксильную группу в боковой цепи, так что W имеет по меньшей мере один аминокислотный остаток, который содержит карбоксильную группу в боковой цепи; либо

- ковалентную связь, соединяющую Х и α-аминогруппу N-концевого аминокислотного остатка В-цепи или ε-аминогруппу лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина;

Х представляет собой:

-СО-;

-СН(СООН)СО-;

-N(CH₂COOH)CH₂CO-;

-N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂CO-;

-N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CO-;

-N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CO-;

-NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCO-;

-N(CH₂CH₂COOH)CH₂CO- или

-N(CH₂COOH)CH₂CH₂CO-,

которые

а) образуют амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W, когда W представляет собой аминокислотный остаток или цепь аминокислотных остатков, или

б) образуют амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, когда W представляет собой ковалентную связь;

Y представляет собой:

-(СН₂)_m-, где m представляет собой целое число в интервале от 6 до 32;

- двухвалентную углеводородную цепь, содержащую 1, 2 или 3 группы -СН=СН- и число групп -СН₂-, достаточное для получения суммарного числа атомов углерода в цепи в интервале от 10 до 32;

- двухвалентную углеводородную цепь формулы

-(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w -, где v и w представляют собой целые числа или одно из них равно нулю, так что сумма v и w находится в интервале от 6 до 30; и

Z представляет собой:

-СООН;

-CO-Asp;

-CO-Glu;

-CO-Gly;

-CO-Sar;

-CH(COOH)₂;

-N(CH₂COOH)₂;

-SО₃Н или

-РО₃Н;

и любым комплексам этого производного с Zn²⁺, при условии, что когда W представляет собой ковалентную связь и Х представляет собой -СО-, тогда Z является отличным от -СООН.

В одном воплощении изобретения боковая цепь -W-X-Y-Z присоединена к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка В-цепи исходного инсулина.

В другом воплощении изобретения боковая цепь -W-X-Y-Z присоединена к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина. В одном более конкретном аспекте данного воплощения боковая цепь -W-X-Y-Z присоединена к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в положении 28 В-цепи. В следующем более конкретном аспекте данного воплощения боковая цепь -W-X-Y-Z присоединена к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в положении 29 В-цепи. В следующем более конкретном аспекте данного воплощения боковая цепь -W-X-Y-Z присоединена к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в положении 30 В-цепи.

Структура W боковой цепи -W-X-Y-Z может представлять собой ковалентную связь. Альтернативно W может представлять собой остаток α-аминокислоты, имеющей карбоксильную группу в боковой цепи и содержащей в сумме от 4 до 10 атомов углерода. Конкретно W может представлять собой остаток α-аминокислоты, которая может кодироваться генетическим кодом. Так, W может быть, например, выбран из группы, состоящей из α-Asp, β-Asp, α-Glu и γ-Glu. Дополнительными вариантами W являются, например, α-hGlu и δ-hGlu.

В следующем воплощении W представляет собой цепь, состоящую из двух α-аминокислотных остатков, из которых один имеет от 4 до 10 атомов углерода и свободную карбоксильную группу в боковой цепи, тогда как другой имеет от 2 до 11 атомов углерода, но не имеет свободной карбоксильной группы. Остаток α-аминокислоты без свободной карбоксильной группы может представлять собой нейтральный кодируемый α-аминокислотный остаток. Примерами W согласно данному воплощению являются: α-Asp-Gly; Gly-α-Asp; β-Asp-Gly; Gly-β-Asp; α-Glu-Gly; Gly-α-Glu; γ-Glu-Gly; Gly-γ-Glu; α-hGlu-Gly; Gly-α-hGlu; δ-hGlu-Gly и Gly-δ-hGlu.

В следующем воплощении W представляет собой цепь, состоящую из двух α-аминокислотных остатков, независимо имеющих от 4 до 10 атомов углерода, и которые оба имеют свободную карбоксильную группу в боковой цепи. Один из этих α-аминокислотных остатков или оба могут представлять собой кодируемые α-аминокислотные остатки. Примерами W согласно данному воплощению являются: α-Asp-α-Asp; α-Asp-α-Glu; α-Asp-α-hGlu; α-Asp-β-Asp; α-Asp-γ-Glu; α-Asp-δ-hGlu; β-Asp-α-Asp; β-Asp-α-Glu; β-Asp-α-hGlu; β-Asp-β-Asp; β-Asp-γ-Glu; β-Asp-δ-hGlu; α-Glu-α-Asp; α-Glu-α-Glu; α-Glu-α-hGlu; α-Glu-β-Asp; α-Glu-γ-Glu; α-Glu-δ-hGlu; γ-Glu-α-Asp; γ-Glu-α-Glu; γ-Glu-α-hGlu; γ-Glu-β-Asp; γ-Glu-γ-Glu; γ-Glu-δ-hGlu; α-hGlu-α-Asp; α-hGlu-α-Glu; α-hGlu-α-hGlu; α-hGlu-β-Asp; α-hGlu-γ-Glu; α-hGlu-δ-hGlu; δ-hGlu-α-Asp; δ-hGlu-α-Glu; δ-hGlu-α-hGlu; δ-hGlu-β-Asp; δ-hGlu-γ-Glu и δ-hGlu-δ-hGlu.

В следующем воплощении W представляет собой цепь, состоящую из трех a-аминокислотных остатков, независимо имеющих от 4 до 10 атомов углерода, где эти аминокислотные остатки цепи выбраны из группы из остатков, имеющих нейтральную боковую цепь, и остатков, имеющих карбоксильную группу в боковой цепи, так что эта цепь имеет по меньшей мере один остаток, который имеет карбоксильную группу в боковой цепи. В одном воплощении эти аминокислотные остатки представляют собой кодируемые остатки.

В следующем воплощении W представляет собой цепь, состоящую из четырех α-аминокислотных остатков, независимо имеющих от 4 до 10 атомов углерода, где эти аминокислотные остатки цепи выбраны из группы остатков, имеющих нейтральную боковую цепь, и остатков, имеющих карбоксильную группу в боковой цепи, так что эта цепь имеет по меньшей мере один остаток, который имеет карбоксильную группу в боковой цепи. В одном воплощении эти аминокислотные остатки представляют собой кодируемые остатки.

В одном воплощении W может быть соединен с ε-аминогруппой лизинового остатка в В-цепи через производное мочевины.

Структура Х боковой цепи -W-X-Y-Z может представлять собой группу формулы -СО-, которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -СН(СООН)СО- которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(CH₂COOH)CH₂CO-, которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(СН₂СН₂СООН)СН₂СО-, которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(CH₂COOH)CH₂CH₂CO-, которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂CO- которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CO- которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

В следующем воплощении структура Х боковой цепи может представлять собой группу формулы -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CO-, которая образует амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W или, когда W представляет собой ковалентную связь, N-концевой α-аминогруппой в В-цепи или ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина.

Структура Y боковой цепи -W-X-Y-Z может представлять собой группу формулы -(СН₂)_m-, где m представляет собой целое число в интервале от 6 до 32, от 8 до 20, от 12 до 20 или от 12-16.

В другом воплощении Y представляет собой двухвалентную углеводородную цепь, содержащую 1, 2 или 3 группы -СН=СН- и число групп -CH₂-, достаточное для получения суммарного числа атомов углерода в цепи в интервале от 6 до 32, от 10 до 32, от 12 до 20 или от 12-16.

В другом воплощении Y представляет собой двухвалентную углеводородную цепь формулы -(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-, где v и w представляют собой целые числа или одно из них равно нулю, так что сумма v и w находится в интервале от 6 до 30, от 10 до 20 или от 12-16.

В одном воплощении структура Z боковой цепи -W-X-Y-Z представляет собой -СООН при условии, что когда W представляет собой ковалентную связь и Х представляет собой -СО-, тогда Z является отличным от -СООН.

В другом воплощении Z представляет собой -CO-Asp.

В другом воплощении Z представляет собой -CO-Glu.

В другом воплощении Z представляет собой -CO-Gly.

В другом воплощении Z представляет собой -CO-Sar.

В другом воплощении Z представляет собой -СН(СООН)₂.

В другом воплощении Z представляет собой -N(CH₂COOH)₂.

В другом воплощении Z представляет собой -SО₃Н.

В другом воплощении Z представляет собой -РО₃Н.

В следующем воплощении W выбран из группы, состоящей из α-Asp, β-Asp, α-Glu и γ-Glu; X представляет собой -СО- или -СН(СООН)СО; Y представляет собой -(СН₂)_m-, где m представляет собой целое число в интервале 12-18 и Z представляет собой -СООН или -СН(СООН)₂.

Инсулиновая группировка, которую в настоящем тексте также называют исходным инсулином, производного инсулина согласно изобретению может представлять собой встречающийся в природе инсулин, такой как человеческий инсулин или свиной инсулин. Альтернативно исходный инсулин может представлять собой аналог инсулина.

В одной группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении А21 представляет собой Asn.

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении А21 представляет собой Gly. Конкретными примерами из этой группы аналогов являются человеческий инсулин Gly^A21, человеческий инсулин Gly^A21 дез(B30) и человеческий инсулин Gly^A21Arg^B31Arg^B32.

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении В1 делегирован. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин дез(В1).

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении B30 делетирован. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин дез(B30).

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении В28 представляет собой Asp. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин Asp^B28.

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении В28 представляет собой Lys и аминокислотный остаток в положении В29 представляет собой Pro. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин Lys^B28Pro^B29.

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении B30 представляет собой Lys и аминокислотный остаток в положении В29 представляет собой любую кодируемую аминокислоту, за исключением Cys, Met, Arg и Lys. Примером является аналог инсулина, где аминокислотный остаток в положении В29 представляет собой Thr и аминокислотный остаток в положении B30 представляет собой Lys. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин Thr^B29Lys^B30.

В другой группе аналогов исходного инсулина аминокислотный остаток в положении ВЗ представляет собой Lys и аминокислотный остаток в положении В29 представляет собой Glu. Конкретным примером из этой группы аналогов исходного инсулина является человеческий инсулин Lys^B3Glu^B29.

Примерами производных инсулина согласно изобретению являются приведенные ниже соединения:

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₇CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₈CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu)) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Asp-OC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Glu-OC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Glu-OC(CH₂)₁₄CO-) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Asp-OC(CH₂)₁₆CO-) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-α-Glu-N-(β-Asp)) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Gly-OC(CH₂)₁₃CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(Sar-OC(CH₂)₁₃CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₃CO)-γ-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина (N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₃CO)-β-Asp) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₃CO)-α-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-D-Glu) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-β-D-Asp) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-β-D-Asp) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-IDA) дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(карбоксиэтил)-Gly] дез(B30);

человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(карбоксиэтил)-Gly] дез(B30) и

человеческого инсулина N^εB29-[N-(НООС(СН₂)₁₄СО)-N-(карбоксиметил)-β-Alа]дез(B30).

Производные инсулина согласно изобретению могут быть представлены в форме соединений, по существу, не содержащих цинка, или в форме цинковых комплексов. Когда предложены цинковые комплексы производного инсулина согласно изобретению, два иона Zn²⁺, три иона Zn²⁺ или четыре иона Zn²⁺ могут быть связаны с каждым инсулиновым гексамером. Растворы цинковых комплексов производных инсулина будут содержать смеси различных видов.

В следующем аспекте изобретения фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество производного инсулина согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, может быть предложена для лечения диабета типа 1, диабета типа 2 и других состояний, которые вызывают гипергликемию, у пациентов, нуждающихся в таком лечении. Производное инсулина согласно изобретению можно применять для изготовления фармацевтической композиции для применения при лечении диабета типа 1, диабета типа 2 и других состояний, которые вызывают гипергликемию.

В следующем аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета типа 1, диабета типа 2 и других состояний, которые вызывают гипергликемию, у пациента, нуждающегося в таком лечении, содержащая терапевтически эффективное количество производного инсулина согласно изобретению в смеси с инсулином или аналогом инсулина, который начинает действовать быстро, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и добавками.

В одном воплощении изобретения предложена фармацевтическая композиция, представляющая собой смесь производного инсулина согласно изобретению и аналога инсулина быстрого действия, выбранного из группы, состоящей из человеческого инсулина Asp^B28; человеческого инсулина Lys^B28Pro^B29 и человеческого инсулина Lys^B3Glu^B29.

В одном воплощении в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая человеческий инсулин N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) дез(B30) и человеческий инсулин AspB28 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и добавками.

Производное инсулина согласно изобретению и аналог инсулина быстрого действия можно смешивать в соотношении примерно 90/10%; примерно 70/30% или примерно 50/50%.

В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения диабета типа 1, диабета типа 2 и других состояний, которые вызывают гипергликемию, у пациента, нуждающегося в таком лечении, при котором этому пациенту вводят терапевтически эффективное количество производного инсулина согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем и фармацевтически приемлемыми добавками.

В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения диабета типа 1, диабета типа 2 и других состояний, которые вызывают гипергликемию, у пациента, нуждающегося в таком лечении, при котором этому пациенту вводят терапевтически эффективное количество производного инсулина согласно изобретению в смеси с инсулином или аналогом инсулина, который имеет быстрое начало действия, вместе с фармацевтически приемлемым носителем и фармацевтически приемлемыми добавками.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным инсулина, которые обладают общей гидрофобностью, которая, по существу, подобна гидрофобности человеческого инсулина.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным инсулина, которые имеют индекс гидрофобности, k'_rel, который находится в интервале от примерно 2 до примерно 200.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным инсулина, которые имеют индекс гидрофобности, k'_rel, который находится в интервале от примерно 0,02 до примерно 10, от примерно 0,1 до примерно 5; от примерно 0,5 до примерно 5 или от примерно 0,5 до примерно 2.

Согласно одному воплощению настоящего изобретения производные инсулина содержат боковую цепь -W-X-Y-Z, как определено выше, которая имеет по меньшей мере один гидрофильный и по меньшей мере один гидрофобный участок.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения производные инсулина содержат боковую цепь -W-X-Y-Z, как определено выше, которая имеет по меньшей мере одну свободную карбоксильную группу, а согласно следующему воплощению боковая цепь будет иметь по меньшей мере две свободные карбоксильные группы.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей производное инсулина согласно изобретению, которое является растворимым при физиологических значениях рН.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей производное инсулина согласно изобретению, которое является растворимым при значениях рН в интервале от примерно 6,5 до примерно 8,5.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции с пролонгированным профилем действия, которая содержит производное инсулина согласно изобретению.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции, которая представляет собой раствор, содержащий от примерно 120 нмоль/мл до примерно 2400 нмоль/мл, от примерно 400 нмоль/мл до примерно 2400 нмоль/мл, от примерно 400 нмоль/мл до примерно 1200 нмоль/мл, от примерно 600 нмоль/мл до примерно 2400 нмоль/мл или от примерно 600 нмоль/мл до примерно 1200 нмоль/мл производного инсулина согласно изобретению или смеси производного инсулина согласно изобретению с аналогом инсулина быстрого действия.

Данные гидрофобности по производным инсулина согласно изобретению

Гидрофобность (индекс гидрофобности) производных инсулина по изобретению относительно человеческого инсулина, k'_rel, измеряли на колонке ВЭЖХ LiChrosorb RP18 (5 мкм, 250×4 мм) путем изократической элюции при 40°С, используя смеси А) 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,3, содержащий 10% ацетонитрила, и В) 50% ацетонитрил в воде в качестве элюентов. Мониторинг элюции проводили путем наблюдения УФ-поглощения элюата при 214 нм. Свободный объем t₀ находили путем впрыска 0,1 мМ нитрата натрия. Время удерживания для человеческого инсулина, t_{человек}, доводили по меньшей мере до 2t₀ путем варьирования соотношения между растворами А и В. k'_rel (t_{производное}-t₀)/(t_{человек}-t₀). k'_rel, найденные для ряда производных инсулина согласно изобретению, представлены в таблице 1.

Таблица 1
Производное инсулина	k'rel
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	0,87
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)18CO-γ-Glu) дез(B30)	1,15
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)8CO-γ-Glu) дез(B30)	0,45
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(Y-Glu) дез(B30)	1,17
человеческий инсулин NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu) дез(B30)	0,70
человеческий инсулин NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	0,33
человеческий инсулин NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-) дез(B30)	1,17
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(p-Asp) дез(B30)	1,11
человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-Glu) дез(B30)	0,58
человеческий инсулин NεB29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-γ-Glu) дез(B30)	0,63
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(AspAsp) дез(B30)	1,07
человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	0,88
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu) дез(B30)	1,13
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp) дез(B30)	0,69
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu) дез(B30)	0,54
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp) дез(B30)	0,47
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad) дез(B30)	0,84
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-D-Glu) дез(B30)	1,4
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-δ-L-Asp) дез(B30)	1,09
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp) дез(B30)	1,49
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Giu) дез(B30)	1,51
человеческий инсулин NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-) дез(B30)	0,90
человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp) дез(B30)	1,54
человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu) дез(B30)	1,57
человеческий инсулин NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(Kap6oKcnMeTnn)-β-Ala] дез(B30)	1,13
человеческий инсулин NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-γ-L-Glu] дез(B30)	0,42

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции, содержащие производное инсулина согласно настоящему изобретению, можно вводить парентерально пациентам, нуждающимся в таком лечении. Парентеральное введение можно осуществлять путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции с помощью шприца, возможно шприца карандашного типа. Альтернативно парентеральное введение можно осуществлять с помощью инфузионной помпы. Дополнительные возможности представляют собой введение инсулина интраназально или в легкие, предпочтительно в композициях, порошках или жидкостях, специально предназначенных для этой цели.

Инъекционные композиции производных инсулина по изобретению можно готовить, используя общепринятые методики фармацевтической промышленности, которые включают растворение и смешивание ингредиентов, как пригодно, с получением желаемого конечного продукта. Так, согласно одной методике, производное инсулина согласно изобретению растворяют в количестве воды, которое несколько меньше, чем конечный объем композиции, которую нужно готовить. Добавляют изотонический агент, консервант и буфер, как необходимо, и значение рН раствора доводят, если необходимо, используя кислоту, например соляную кислоту, или основание, например водный гидроксид натрия, по мере необходимости. Наконец объем раствора доводят водой до получения желаемой концентрации ингредиентов.

В следующем воплощении изобретения буфер выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата динатрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)-аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов составляет альтернативное воплощение изобретения.

В следующем воплощении изобретения препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант, который может быть выбран из группы, состоящей из фенола, орто-крезола, мета-крезола, пара-крезола, метил-пара-гидроксибензоата, пропил-пара-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бутил-пара-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, хлорбутанола и тиомеросала, бронопола, бензойной кислоты, имидомочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, хлоркрезола, этил-пара-гидроксибензоата, бензетония хлорида, хлорфенезина (3-пара-хлорфеноксипропан-1,2-диола) или их смесей. В следующем воплощении изобретения консервант присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В следующем воплощении изобретения консервант присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В следующем воплощении изобретения консервант присутствует в концентрации от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В следующем воплощении изобретения консервант присутствует в концентрации от 10 мг/мл до 20 мг/мл. Каждый из этих конкретных консервантов составляет альтернативное воплощение изобретения. Использование консерванта в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства сделана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В следующем воплощении изобретения препарат дополнительно содержит изотонический агент, который может быть выбран из группы, состоящей из соли (например, хлорида натрия), сахара или сахарного спирта, аминокислоты (например, L-глицина, L-гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина), альдита (например, глицерола (глицерина), 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола), полиэтиленгликоля (например, ПЭГ400) или их смесей. Можно использовать любой сахар, такой как моно-, ди- или пописахариды, или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, цикподекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и карбоксиметилцеллюлоза-Na. В одном воплощении сахарная добавка представляет собой сахарозу. Сахарный спирт определяют как С4-С8 углеводород, имеющий по меньшей мере одну группу -ОН, и он включает, например, маннит, сорбит, инозит, галактит, дульцит, ксилит и арабит. В одном воплощении сахарная спиртовая добавка представляет собой маннит. Сахара или сахарные спирты, упомянутые выше, можно использовать индивидуально или в комбинации. Нет фиксированного предела используемого количества, поскольку сахар или сахарный спирт растворим в жидком препарате и не оказывает вредного воздействия на стабилизирующие эффекты, достигнутые с использованием способов по изобретению. В одном воплощении концентрация сахара или сахарного спирта составляет между примерно 1 мг/мл и примерно 150 мг/мл. В следующем воплощении изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 1 мг/мл до 50 мг/мл. В следующем воплощении изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 1 мг/мл до 7 мг/мл. В следующем воплощении изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 8 мг/мл до 24 мг/мл. В следующем воплощении изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 25 мг/мл до 50 мг/мл. Каждый из этих конкретных изотонических агентов составляет альтернативное воплощение изобретения. Использование изотонического агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства сделана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

Типичными изотоническими агентами являются хлорид натрия, маннит, диметилсульфон и глицерин, а типичными консервантами являются фенол, мета-крезол, метил-пара-гидроксибензоат и бензиловый спирт.

Примерами подходящих буферов являются ацетат натрия, глицилглицин, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) и фосфат натрия.

Композиция для интраназального введения производного инсулина согласно настоящему изобретению может быть, например, изготовлена, как описано в Европейском патенте №272097 (от Novo Nordisk A/S).

Композиции, содержащие инсулины по данному изобретению, можно применять при лечении состояний, которые чувствительны к инсулину. Следовательно, их можно применять при лечении диабета типа 1, диабета типа 2 и гипергликемии, например, как иногда наблюдается у серьезно раненых людей и людей, которые перенесли большую операцию. Оптимальный уровень дозы для любого пациента будет зависеть от ряда факторов, включая эффективность конкретного применяемого производного инсулина, возраст, массу тела, физическую активность и режим питания пациента, от возможной комбинации с другими лекарствами и от тяжести состояния, подлежащего лечению. Рекомендовано, чтобы суточная дозировка производного инсулина по данному изобретению определялась для каждого индивидуального паицента специалистом в данной области техники подобным образом, как для известных композиций инсулина.

Где это целесообразно, производные инсулина по данному изобретению можно применять в смеси с другими типами инсулина, например с аналогами инсулина с более быстрым началом действия. Примеры таких аналогов инсулина описаны, например, в Европейских патентных заявках, имеющих публикацию, №№ EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) и EP 383472 (Eli Lilly & Co.).

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже примерами, которые, однако, не следует рассматривать как ограничивающие объем защиты.

Определения

Под "аналогом инсулина", как его используют здесь, подразумевают полипептид, который имеет молекулярную структуру, которая формально может быть производной от структуры инсулина, встречающегося в природе, например от структуры человеческого инсулина, за счет делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, встречающегося в природном инсулине, и/или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка. Добавленные и/или замененные аминокислотные остатки могут представлять собой либо кодируемые аминокислотные остатки либо другие встречающиеся в природе остатки, либо чисто синтетические аминокислотные остатки. Аналоги инсулина могут быть такими, где природный остаток Pro в положении 28 В-цепи может быть заменен на один из Asp, Lys или Ilе. В другом воплощении Lys в положении В29 заменен на Pro. В одном воплощении B30 может представлять собой Lys, и тогда В29 может представлять собой любую кодируемую аминокислоту, за исключением Cys, Met, Arg и Lys.

Также Asn в положении А21 может быть заменен на Аlа, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val, в частности, на AGay, Ala, Ser или Thr и предпочтительно на Gly. Кроме того, Asn в положении В3 может быть заменен на Lys или Asp. Дополнительными примерами аналогов инсулина являются аналоги дез(B30) человеческий инсулин; дез(B30) человеческий инсулин; аналоги инсулина, где PheВ1 делегирован; аналоги инсулина, где А-цепь и/или В-цепь имеет N-концевое удлинение, и аналоги инсулина, где А-цепь и/или В-цепь имеет С-концевое удлинение. Таким образом, один или два Arg могут быть добавлены к положению В1.

Под "производным инсулина", как его используют здесь, подразумевают встречающийся в природе инсулин или аналог инсулина, который был химически модифицирован, например, путем введения боковой цепи в одно или более чем одно положение инсулинового каркаса, либо путем окисления или восстановления групп аминокислотных остатков в инсулине, либо путем превращения свободной гидроксильной группы в эфирную группу или ацилирования свободной аминогруппы или гидроксигруппы.

Выражение "кодируемая аминокислота" или "кодируемый аминокислотный остаток" используют для обозначения аминокислоты или аминокислотного остатка, который может кодироваться триплетом ("кодоном") нукпеотидов.

hGlu представляет собой гомоглутаминовую кислоту.

α-Asp представляет собой L-форму -HNCH(CO-)CH₂COOH.

β-Asp представляет собой L-форму -HNCH(COOH)CH₂CO-.

α-Glu представляет собой L-форму-НNСН(СО-)СН₂СН₂СООН.

γ-Glu представляет собой L-форму -HNCH(COOH)CH₂CH₂CO-.

α-hGlu представляет собой L-форму -HNCH(CO-)CH₂CH₂CH₂COOH.

δ-hGlu представляет собой L-форму -НNСН(СООН)СН₂СН₂СН₂СО-.

b-Аlа представляет собой -NH-CH₂-CH₂-COOH.

Sar представляет собой саркозин (N-метилглицин).

Выражение "аминокислотный остаток, имеющий карбоксильную группу в боковой цепи" обозначает аминокислотные остатки, подобные Asp, Glu и hGlu. Аминокислоты могут находиться либо в L-, либо в D-конфигурации. Если ничего не указано специально, следует понимать, что аминокислотный остаток находится в L-конфигурации.

Выражение "аминокислотный остаток, имеющий нейтральную боковую цепь" обозначает аминокислотные остатки, такие как Gly, Аlа, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Tyr, Asn и Gln.

Когда указано, что производное инсулина согласно изобретению является "растворимым при физиологических значениях рН", это означает, что это производное инсулина можно применять для изготовления инъекционных композиций инсулина, которые полностью растворяются при физиологических значениях рН. Такая хорошая растворимость может быть либо следствием собственных свойств одного производного инсулина либо результатом благоприятного взаимодействия между производным инсулина и одним или более чем одним ингредиентом, содержащимся в носителе.

В описании и примерах использованы следующие сокращения:

Aad: альфа-амино-адипиновая кислота (гомоглутаминовая кислота)

Bzl = Вn:бензил

DIEA: N,N-диизопропилэтиламин

ДМФ: N,N-диметилформамид

ИДУ: иминодиуксусная кислота

Sar: саркозин (N-метил-глицин)

tBu: трет-бутил

TSTU: O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат

ТГФ: тетрагидрофуран

EtOAc: этилацетат

DIPEA: диизопропилэтиламин

HOAt: 1-гидрокси-7-азабензотриазол

TEA: триэтиламин

Su: сукцинимидил=2,5-диоксо-пирролидин-1-ил

ТФУ: трифторуксусная кислота

ДХМ: дихлорметан

ДМСО: диметилсульфоксид

ТСХ: тонкослойная хроматография

КГ: комнатная температура

Примеры

Пример 1

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) дез(B30)

200 мг дез(B30) человеческого инсулина растворяли в 10 мл 50 мМ Nа₂СО₃ (рН 10,2), содержащегося в пробирке, которую помещали в водяную баню при 15°С. Метилгексадекандиоил-Glu(OSu)-ОМе (37,90 мг, получен, как описано ниже) растворяли в 10 мл ацетонитрила, а затем добавляли к раствору инсулина. Реакцию останавливали через 30 мин путем добавления 3,8 мл 0,2 М этаноламина, доведенного до рН 9,0 разбавленной HCl. Выход реакции составил 37%, как определили с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Продукт выпадал в осадок после добавления 2,5 объемов воды и доведения рН до 5,5. Затем этот осадок растворяли в 10 мл воды при рН 8 и помещали на лед. К этому раствору добавляли 10 мл охлажденного во льду 0,2 М NaOH для омыления, и смесь инкубировали в течение 40 мин при охлаждении во льду, в затем доводили до рН 5,5 для осаждения продукта. Осадок выделяли и растворяли в 5 мл А-буфера (см. ниже) и разбавляли 33 мл 42,5% масс/масс водного этанола, делили на три части и подвергали анионообменной хроматографии, используя анионообменную колонку Resource™ на 6 мл, элюируя буферной системой, состоящей из А-буфера: Трис 0,24% масс/масс, NH₄Ac 0,25%, 42% этанол масс/масс, рН 7,5, и В-буфера: Трис 0,24% масс/масс, NH₄Ac 1,25%, 42% этанол масс/масс рН 7,5. Образец элюировали потоком 6 мл/мин в градиенте от 0 до 100% В-буфера за 30 мин. Фракции, содержащие желаемое соединение, идентифицировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Выход желаемого продукта составил 15,3 мг (чистота: 72,9%). Объем объединенных фракций, содержащих желаемое соединение, уменьшали до 20 мл в вакууме, а затем этот раствор подвергали очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку ВЭЖХ обращенной фазы Nudeosil, C4 250/10 мм, 10 мкм, 300 А. Буферная система состояла из А-буфера: 10 мМ Трис, 15 мМ (NH₄)₂SO₄, 10% этанол, рН 7,3, и В-буфера: 70% об/об этанол.

Продукт элюировали градиентом от 10% до 60% В-буфера за 120 мин при потоке 2 мл/мин. Соответствующие фракции объединяли, и соединение осаждали и лиофилизировали. Выход составил 7,7 мг (чистота: 99,4%).

Молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектрометрии: 6097,2, вычисленная: 6104,1. В-концевой пептид, содержащий боковую цепь, получили после ферментативного гидролиза протеазой Staphylococcus aureus. Молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии: 1413,1, вычисленная: 1413,5.

Получение метилгексадекандиоил-Glu(OSu)-ОМе

Диметилгексадекандиоат омыляли в МеОН, используя 1,0 эквивалент NaOH, и монометиловый эфир выделили после подкисления HCl путем перекристаллизации из гептана.

Монометилгексадекандиоат (275 мг, 0,91 ммоль) растворяли в ТГФ (3 мл) и обрабатывали сукцинимидилтетраметилурония тетрафторборатом (331 мг, 1,1 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (188 мкл, 1,1 ммоль), и эту смесь перемешивали в течение 20 часов. Растворитель удаляли в вакууме, и остаток растворяли в этилацетате и промывали 0,1 М HCl (дважды) и водой. Органическую фазу высушивали над MgSO₄, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением 350 мг (96%) метилсукцинимидилгексадекандиоата.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 3.66 (s, 3Н), 2.83 (s, 4H), 2.60 (t, 2H), 2.30 (t, 2H), 1.74 (р, 2Н), 1.62 (р, 2H), 1.40 (m, 2H), 1.35-1.22 (m, 18H).

Метилсукцинимидилгексадекандиоат (240 мг, 0,58 ммоль) в диметилформамиде (5 мл) обрабатывали GluOMe (93 мг, 0,58 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (200 мкл, 1,16 ммоль). Эту смесь перемешивали в течение 20 часов, а затем выпаривали в вакууме. Остаток повторно растворяли в этилацетате. В результате промывания 0,1 М НСl и водой с последующим высушиванием (MgSO₄) и выпариванием в вакууме получили 226 мг (88%) метилгексадекандиоил-Glu-ОМе.

¹Н-ЯМР δ: 6.22 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 3.76 (s, 3Н), 3.66 (s, 3Н), 2.42 (t, 2H), 2.29 (m, 4H), 2.22 (t, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.62 (m, 4H), 1.35-1.22 (m, 20H).

Метилгексадекандиоил-Glu-OMe (200 мг, 0,45 ммоль) растворяли в дихлорметане (4 мл), охлаждали ледяной баней и обрабатывали дициклогексилкарбодиимидом (93 мг, 0,45 ммоль) и N-гидроксисукцинимидом (52 мг, 0,45 ммоль). Эту смесь перемешивали в течение 20 часов, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением 243 мг (100%) желаемого промежуточного соединения.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 6.34 (d, 1H), 4.67 (m, 1H), 3.73 (s, 3Н), 3.64 (s, 3Н), 2.81 (s, 4H), 2.66 (m, 2H), 2.27 (m, 4H), 2.20 (t, 2H), 1.89 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.58 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 20H).

Пример 2

Синтез NεB29-(Nα-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu) дез(B30) человеческого инсулина

300 мг дез(B30) человеческого инсулина ацилировали, очищали и выделяли, как описано в Примере 1, за исключением того, что в этом примере метилоктадекандиоил-Glu(OSu)-ОМе (полученный, как описано ниже) использовали в качестве ацилирующего агента вместо метилгексадекандиоил-Glu(OSu)-Ome, использованного в Примере 1. Получили 25,5 мг соединения, указанного в заголовке (чистота: 97,4%). Молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии: 6136,6, вычисленная: 6132. В-концевой пептид, содержащий лиганд, получили после ферментативного гидролиза протеазой Staphylococcus aureus. Молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии: 1439,1, вычисленная: 1442,5.

Получение метилокгадекандиоил-Glu(OSu)-ОМе

Это соединение получили из диметилоктадекандиоата по аналогии с производным гексадекандиоила, описанным в Примере 1.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 6.20 (d, 1Н), 4.70 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 2.84 (s, 4H), 2.70 (m, 2H), 2.30 (m, 4H), 2.22 (t, 24), 1.93 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.62 (m, 4H), 1.33-1.23 (m, 24H).

Пример 3

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu)) дез(B30)

Подобно способу, описанному в Примере 1, 300 мг дез(B30) человеческого инсулина ацилировали метилоктадекандиоил-Glu(Glu(OSu)-ОМе)-ОМе. Очистку анионообменной хроматографией проводили, как описано выше. Однако проводили пролонгированную элюцию 100% В-буфером, чтобы элюировать желаемый продукт. Фракции, содержащие желаемый продукт, идентифицировали с помощью ОФ-ВЭЖХ и получили 47,5 мг 55% чистоты. Объем фракций, содержащих желаемый продукт, уменьшали в вакууме, и полученный в результате раствор подвергали очистке с помощью ОФ-ВЭЖХ, используя колонку ОФ-ВЭЖХ Jupiter, C4 250/10 мм, 10 мкм, 300 А фирмы Phenomerex. Буферная система состояла из А-буфера: 0,1% ТФУ, 10% об/об этанол, и В-буфера: 80% об/об этанол. Образец элюировали градиентом от 40% до 60% В-буфера при 40°С в течение 120 мин при потоке 2 мл/мин. Соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали и получили 31,1 мг соединения, указанного в заголовке (чистота: 94%).

Определенная молекулярная масса соединения, указанного в заголовке, с помощью масс-спектроскопии: 6259,65, вычисленная: 6261,2. Определенная молекулярная масса (с помощью масс-спектроскопии) В-концевого пептида, содержащего боковую цепь, полученного после ферментативного гидролиза протеазой Staphylococcus aureus, составила 1569,88, вычисленная: 1569,88.

Получение метилоктадекандиоил-Glu(Glu(OSu)-ОМе)-ОМе

Метилоктадекандиоил-Glu(OSu)-ОМе (получен, как описано в Примере 2, 200 мг, 0,35 ммоль) в диметилформамиде (5 мл) обрабатывали GluOMe (62 мг, 0,39 ммоль) N,N-диизопропилэтиламин (90 мкл, 53 ммоль), и эту смесь перемешивали в течение 20 часов. Растворитель удаляли в вакууме, и остаток растворяли в этилацетате и промывали дважды 0,2 М HCl, водой и рассолом. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания получили метилоктадекандиоил-Glu(Glu-ОМе)-ОМе, 180 мг (83%).

Метилоктадекандиоил-Glu(Glu-ОМе)-ОМе (180 мг, 0,29 ммоль) растворяли в ТГФ (9 ил) и обрабатывали сукцинимидилтетраметилурония тетрафторборатом (106 мг, 0,35 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламином (60 мкл, 0,35 ммоль). Эту смесь перемешивали в течение ночи, выпаривали, повторно растворяли в этилацетате и промывали 2×0,1 М HCl и водой. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания получили 190 мг (93%) желаемого промежуточного соединения.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.73 (d, 1Н), 6.43 (d, 1Н), 4.69 (m, 1H), 4.56 (m, 1H), 3.77 (s, 3Н), 3.74 (s, 3Н), 3.66 (s, 3Н), 2.85 (s, 4H), 2.72 (m. 2H), 2.41-2.12 (m, 8H), 2.95 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 6H), 1.35-1.22 (m, 22H).

Пример 4

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-L-Glu) дез(B30)

Человеческий инсулин дез(B30) (500 мг, 0,088 ммоль) растворяли в 100 мМ Na₂CO₃ (5 мл, рН 10,2) при комнатной температуре. Трет-бутилгексадекандиоил-Glu(OSu)-OtBu (66 мг, 0,105 ммоль, полученный, как описано ниже), растворяли в 25 ацетонитриле (5 мл), а затем добавляли к раствору инсулина. Через 30 мин добавляли 0,2 М метиламин (0,5 мл). Доводили рН HCl до 5,5 (изоэлектрическая точка), осадок собирали центрифугированием и высушивали в вакууме с получением 525 мг. Выход составил 78% (ОФ-ВЭЖХ, колонка С4; буфер А: 10% MeCN в 0,1% ТФУ-воде, буфер В: 80% MeCN в 0,1% ТФУ-воде; градиент от 20% до 90% В за 16 мин). Защищенный продукт растворяли в ТФУ (10 мл), оставляли на 30 мин и выпаривали в вакууме. Сырой продукт растворяли в воде и лиофилизировали (610 мг). 0454 очищали ОФ-ВЭЖХ на колонке С4, буфер А: 20% EtOH+0,1% ТФУ, буфер В: 80% EtOH+0,1% ТФУ; градиент 15-60% В, с последующей ВЭЖХ на колонке С4, буфер А: 10 мМ Трис+15 мМ сульфат аммония в 20% EtOH, рН 7,3, буфер В: 80% EtOH (этанол), градиент 15-60% В. Собранные фракции обессоливали на Sep-Pak 70% ацетонитрилом + 0,1% ТФУ, нейтрализовали добавлением аммиака и лиофилизировали. Неоптимизированный выход составлял 64 мг, 12%. Чистота, оцененная с помощью ВЭЖХ, составила 99,2%. Определенная с помощью масс-спектроскопии молекулярная масса соединения: 6102,9, вычисленная для C₂₇₄H₄₁₁N₆₅O₈₁S₆: 6104,1. В-концевой пептид, содержащий боковую цепь (RGFFYTPK(N^ε-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-L-Glu), получили после ферментативного гидролиза протеазой Staphylococcus aureus. Определенная молекулярная масса соединения методом MALDI-MS (времяпролетный масс-спектр с лазерной ионизацией путем десорбции из матрицы): 1413,1, вычисленная: 1412,7.

Получение трет-бутилгексадекандиоил-L-Glu(OSu)-OtBu

Гексадекадионовую кислоту (40,0 г, 140 ммоль) суспендировали в толуоле (250 мл), и эту смесь кипятили с обратным холодильником. N,N-диметилформамид-ди-трет-бутилацеталь (76,3 г, 375 ммоль) добавляли по каплям в течение 4 часов. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Растворитель удаляли в вакууме при 50°С, и сырое вещество суспендировали в ДХМ/AcOEt (500 мл, 1:1) и перемешивали в течение 15 мин. Твердые вещества собирали фильтрованием и растирали с ДХМ (200 мл). Фильтрат выпаривали в вакууме с получением сырого моно-трет-бутилгексадекандиоата, 30 г. Это вещество суспендировали в ДХМ (50 мл), охлаждали льдом в течение 10 мин и фильтровали. Растворитель удаляли в вакууме с остатком 25 г сырого моно-трет-бутилгексадекандиоата, который перекристаллизовали из гептана (200 мл) с получением моно-трет-бутилгексадекандиоата, 15,9 г (33%). В качестве альтернативы перекристаллизации моноэфир можно очистить хроматографией на силикагеле в AcOEt/гептане.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 2.35 (t, 2Н), 2.20 (t, 2Н), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.34-1.20 (m, 20H).

Моно-трет-бутиловый эфир (2 г, 5,8 ммоль) растворяли в ТГФ (20 мл) и обрабатывали TSTU (2,1 г, 7,0 ммоль) и DIEA (1,2 мл, 7,0 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Эту смесь фильтровали, и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток растворяли в AcOEt и дважды промывали холодной 0,1 М HCl и водой. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания в вакууме получили сукцинимидил-трет-бутилгексадекандиоат, 2,02 г (79%).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 2.84 (s, 4H), 2.60 (t, 2Н), 2.20 (t, 2Н), 1.74 (p, 2Н), 1.56 (m, 2Н), 1.44 (s, 9H), 1.40 (m, 2Н), 1.30-1.20 (m, 18H).

Сукцинимидил-трет-бутилгексадекандиоат (1 г, 2,27 ммоль) растворяли в ДМФ (15 мл) и обрабатывали L-Glu-OtBu (0,51 г, 2,5 ммоль) и DIEA (0,58 мл, 3,41 ммоль), и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель выпаривали в вакууме, и сырой продукт растворяли в AcOEt и дважды промывали 0,2 М НСl, водой и рассолом. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания в вакууме получили трет-бутилгексадекандиоил-L-Glu-OtBu, 1,2 g (100%).

¹H-ЯMR (СDСl₃) δ: 6.25 (d, 1H), 4.53 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.21 (m, 44), 1.92 (m, 1H), 1.5C Cm, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.43-1.22 (m, 18H).

Трет-бутилгексадекандиоил-L-Glu-OtBu (1,2 г, 2,27 ммоль) растворяли в ТГФ (15 мл) и обрабатывали TSTU (0,82 г, 2,72 ммоль) и DIEA (0,47 мл, 2,72 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Смесь фильтровали, и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток растворяли в AcOEt и дважды промывали холодной 0,1 М НСl и водой. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания в вакууме получили трет-бутилгексадекандиоил-L-Glu(OSu)-OtBu, 1,30 г (92%).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 6.17 (d, 1H), 4.60 (m, 1H), 2.84 (s, 4H), 2.72 (m, 1H), 2.64 (m, 1H), 2.3C Cm, 1H), 2.20 (m, 4H), 2.08 (m, 1H), 1.6 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.33-1.21 (m, 20H).

Пример 5

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-L-Glu) дез(B30)

Инсулин дезB30 (50 мг, 9 ммоль) растворяли в 0,1 М водном Na₂CO₃ (0,65 мл), рН 10,5. Октадекандиоил-L-Glu(OSu) (50,1 мг, 9,9 ммоль, полученный, как описано ниже), растворяли в ацетонитриле (0,65 мл) и добавляли к раствору инсулина; рН составлял 10,3. Через 30 мин добавляли 0,2 М метиламин (50 мл). Доводили рН HCl до 5,5 (изоэлектрическая точка), и осадок собирали центрифугированием и высушивали в вакууме. ВЭЖХ показала степень сочетания сырого продукта 52% (неоптимизированный выход): колонка С4; буфер А: 10% MeCN в 0,1% ТФУ-воде, буфер В: 80% MeCN в 0,1% ТФУ-воде; градиент от 20% до 90% В за 16 минут. Определенная с помощью масс-спектроскопии молекулярная масса соединения: 6133,2, вычисленная для C₂₇₆H₄₁₅N₆₅O₈₁S₆: 6132,2.

Получение октадекандиоил-L-Glu(OSu)

Октадекандионовую кислоту (2,5 г, 8,0 ммоль) суспендировали в ДХМ (60 мл), обрабатывали триэтиламином (1,16 мл, 8,3 ммоль) и охлаждали во льду. Бензилхлорформиат (1,14 мл) добавляли по каплям в атмосфере азота, и смесь перемешивали в течение 10 мин, и тогда добавляли DMAP (0,097 г, 0,80 ммоль). После перемешивания в течение 20 мин при 4°С (ТСХ, 1:1 АсОЕt:гептан) реакционную смесь выпаривали досуха. Сырое вещество (3,9 г) растворяли в ДХМ (60 мл), обрабатывали силикагелем (15 г) и выпаривали. Этот силикагель загружали на колонку силикагеля (175 г), и продукт элюировали AcOEt/гептаном от 1:7 до 1:1. В результате выпаривания делаемых фракций получили моно-бензилоктадекандиоат (1,15 г, 36%).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.35 (m, 5Н), 5.11 (s, 2H), 2.35 (t, 4H), 1.63 (t, 4H), 1.30-1.22 (m, 24H).

Моно-бензилоктадекандиоат растворяли в ДМФ (3,5 мл) и ТГФ (7 мл) и охлаждали в ледяной бане. Добавляли DIEA (0,103 мл) и TSTU, и смесь перемешивали в течение 1 ч в ледяной бане и при КГ в течение ночи. Растворитель выпаривали в вакууме, и остаток растворяли в AcOEt и дважды промывали 0,2 н. НСl, насыщенным NaHCO₃, высушивали, фильтровали и выпаривали досуха с получением сукцинимидил-моно-бензилоктадекандиоата (0,25 г, 100%).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.35 (m, 5Н), 5.11 (s, 2H), 2.83 (s, 4H), 2.60 (t, 2H), 2.35 (t, 2H), 1.8C-C.60 (m, 4H), 1.40-1.20 (m, 24H).

Сукцинимидил-моно-бензилоктадекандиоат (95 мг, 0,19 ммоль) растворяли в ДМФ (1,5 мл, 0,28 ммоль) и обрабатывали L-Glu-OBzl (49 мг, 0,21 ммоль) и DIEA (50 мкл), и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель выпаривали в вакууме, и сырой продукт растворяли в AcOEt и дважды промывали 0,2 М НСl, водой и рассолом. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания в вакууме получили BzlO-октадекандиоил-L-Glu-ОВzl, 114 мг (97%).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 7.35 (m, 5Н), 6.22 (d, 2H), 5.17 (s, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.71 (m, 1H), 2.37 (m, 4H), 2.22 (m, 3Н), 1.98 (m, 1H), 1.63 (m, 4H), 1.31-1.20 (m, 24H).

BzlO-октадекандноил-L-Glu-ОВzl (110 г, 0,18 ммоль) растворяли в ТГФ (2 мл) и обрабатывали TSTU (64 мг, 0,21 ммоль) и DIEA (36 мл, 0,21 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Смесь фильтровали, и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток растворяли в AcOEt и дважды промывали холодной 0,1 М HCl и водой. В результате высушивания над MgSO₄ и выпаривания в вакууме получили ВzlO-октадекандиоил-L-Glu(OSu)-ОВzl, 119 г (94%).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.36 (m, 5Н), 6B40 (d, 2H), 5.19 (s, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.75 (m, 1H), 2.8C Cs, 4H), 2.68 (m, 1H), 2.59 (m, 1H), 2.35 (t, 2H), 2.19 (t, 2H), 1.62 (m, 4H), 1.32-1.21 (m, 24H).

BzlO-октадекандиоил-L-Glu(OSu)-ОВzl (59 мг, 0,082 ммоль) растворяли в ацетоне/0,1% ТФУ (1 мл). Добавляли Pd/C (20 мг). Из колбы откачивали газ и несколько раз наполняли ее N₂ и подсоединяли баллон с H₂. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем фильтровали через целлит. В результате осаждения из гептана и выпаривания остаточных растворителей получили октадекандиоил-L-Glu(OSu) (27 мг, 61%).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 6.32 (d, 1H), 4.70 (m, 1H), 3.70 (m, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.88 (s, 4H), 2.62 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.24 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.64 (m, 2H), 1.50-1.20 (m, 26H).

Пример 6

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(L-Asp-OC(CH₂)₁₆CO)-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-Asp(OtBu)-OtBu с сукцинимидилоктадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ.

Определенная с помощью масс-спектроскопии молекулярная масса соединения (LCMS) - 6247,5, вычисленная - 6247,3.

Пример 7

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(L-Glu-OC(CH₂)₁₄CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-Glu(OtBu)-OtBu с сукцинимидилоктадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6261,3, вычислено 6261,3.

Пример 8

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(L-Glu-OC(CH₂)₁₄CO-) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-Glu(OtBu)-OtBu с сукцинимидилгексадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6130,8, вычислено 6132,2.

Пример 9

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Glu)-N-(β-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-Glu(OtBu) с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-AspOtBu, активацией TSTU, сочетанием человеческого инсулина дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6246,9, вычислено 6247,3.

Пример 10

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₅CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилгептадекандиоата (А.С.Соре, U.Axen, E.Р.Burrows, J.Weintich, J. Am. Chem Soc. 1966, 88, 4228) с L-GluOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6118,3, вычислено 6118,1.

Пример 11

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₃CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-GlyOtBu с сукцинимидилпентадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6147,5, вычислено 6147,1.

Пример 12

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(L-Sar-OC(CH₂)₁₃CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-Sar-OtBu с сукцинимидилоктадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6161,0, вычислено 6161,1.

Пример 13

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Asp)-N-(b-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-Asp(OtBu) с сукцинимидилоктадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-AspOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6233,8, вычислено 6233,2.

Пример 14

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₄CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-GlyOtBu с сукцинимидилгексадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6160,7, вычислено 6161,1.

Пример 15

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-β-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилгексадекандиоата с L-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6089,8, вычислено 6089,8.

Пример 16

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-β-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6117,8, вычислено 6118,1.

Пример 17

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₆CO-γ-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия L-GlyOtBu с сукцинимидилоктадекандиоатом с последующей активацией TSTU, взаимодействием с L-GluOtBu, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6189,2, вычислено 6189,2.

Пример 18

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-(HOOC(CH₂)₁₄CO-ε-L-LysCO-) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилгексадекандиоата с L-Lys(Z)-OtBu с последующей гидрогенизацией над Pd/C и активацией in-situ 4-нитрофенилхлорформиатом, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6189,2, вычислено 6189,2.

Пример 19

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-Glu(OtBu) с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6132,1, вычислено 6132,2.

Пример 20

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-Asp(OtBu) с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6117,8, вычислено 6118,1.

Пример 21

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₅CO-β-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилгептадекандиоата с L-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6104,2, вычислено 6104,1.

Пример 22

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-γ-D-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с D-GluOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6132,4, вычислено 6132,2.

Пример 23

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-δ-L-Aad) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с L-AadOtBu (полученного из имеющегося в продаже L-Aad(OMe) путем трет-бутилирования с AcOtBu/BF₃. OEt₂ и омыления метилового эфира) с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6116,9, вычислено 6118,1.

Пример 24

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₃CO-β-L-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилпентадекандиоата с L-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6074,7, вычислено 6076,1.

Пример 25

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₃CO-β-L-Glu) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилпентадекандиоата с L-GluOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. MALDI-MS 6080,6, вычислено 6076,1.

Пример 26

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-β-D-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилгексадекандиоата с D-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6089,1, вычислено 6090,1.

Пример 27

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-β-D-Asp) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутилсукцинимидилоктадекандиоата с D-AspOtBu с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6117,1, вычислено 6118,1.

Пример 28

Синтез человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-IDA) дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 4 посредством взаимодействия трет-бутил-3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-бензотриазин-3-илгексадеканоата с иминодиуксусной кислотой с последующей активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином дез(B30) и удалением защиты ТФУ. LCMS 6089,1, вычислено 6090,1.

Пример 29

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(карбоксиметил)-В-Аlа] дез(B30)

Человеческий инсулин A1N, BIN-диВос дезB30 (Kurtzhals P; Havelund S; Aonassen I; Kiehr В; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (186 мг, 0,031 ммоль) растворяли в ДМСО (1,8 мл). Добавляли раствор трет-бутил-октадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонил-метил)-β-Аlа-OSu (27 мг, 0,04 ммоль) в ТГФ (1,8 мл) и триэтиламина (0,045 мл, 0,31 ммоль) (рН составлял 10). После медленного перемешивания при комнатной температуре в течение 45 мин реакционную смесь гасили 0,2 М метиламином в ТГФ (0,20 мл). Добавляли воду (5 мл) и доводили рН до 5,5 (изоэлектрическая точка) 1 н. HCl. Осадок собирали центрифугированием и лиофилизировали с получением 150 мг. Выход составлял 74% (LCMS m/z: 2148,9 [(М+3)/3], rt 5,04). Защищенный продукт растворяли в ТФУ (2,5 мл) и оставляли на 1 ч и выпаривали в вакууме. Сырой продукт очищали ОФ-ВЭЖХ на колонке С4, буфер А: 0,1% ТФУ, буфер В: MeCN+0,1% ТФУ; градиент 10-70% В. Собранные фракции лиофилизировали. Выход составлял 75 мг, 52%. Чистота, оцененная по ВЭЖХ, составляла 97,2%.

MALDI-MS: 6132,1, вычислено: 6132,2.

Получение трет-бутил-октадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонил-метил)-β-Ala-OSu

Октадекандионовую кислоту (5,64 г, 17,9 ммоль) растворяли в толуоле (80 мл) при 115°С. N,N-диметилформамид-ди-трет-бутилацеталь (12,9 мл, 53,8 ммоль) добавляли по каплям в течение 1,5 ч. После кипячения с обратным холодильником в течение 3 ч добавляли дополнительное количество N,N-диметилформамид-ди-трет-бутилацеталя (2,15 мл) в течение 20 мин. Кипячение с обратным холодильником продолжали в течение ночи и добавляли дополнительное количество N,N-диметилформамид-ди-трет-бутилацеталя (2,15 мл) в течение 20 мин. После перемешивания в течение следующих 2 ч реакционную смесь охлаждали до КГ. Добавляли воду и ДХМ. Дикислоту удаляли фильтрованием. Фильтрат концентрировали на силикагеле (40 г) и очищали на колонке силикагеля 1,5 л, используя ДХМ/МеОН 14:1. Моно-трет-бутиловый эфир октадекандионовой кислоты выделили с выходом 53% (3,52 г).

LC-MS: 393 (M+Na), rt 6,40.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆): δ 1.22 (brs, 24H), 1.38 (s, 9H), 1.47 (m, 4H), 2.14 (t, 2H), 2.18 (t, 2H) млн^-1.

К раствору моно-трет-бутилоктадекандиоата (1,00 г, 2,7 ммоль) в сухом ТГФ (8 мл) добавляли DРЕА (0,555 мл, 3,2 ммоль), а затем TSTU (1,00 г, 3,2 ммоль). Эту реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 18 ч. Растворитель выпаривали. К остатку добавляли AcOEt, и полученную в результате суспензию фильтровали. Фильтрат промывали холодной 0,1 М HCl (2×) и водой, высушивали и концентрировали с получением сукцинимидил-трет-бутил-октадекандиоат в виде белого твердого вещества.

¹Н-ЯМР (СDСl₃): δ 1.25 (m s, 20H), 1.39 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.58 (m, 4H), 1.74 (p, 2H), C.C (t, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.85 (m, 2H) млн^-1.

К суспензии H-Gly-OtBu (1,00 г, 6,0 ммоль) в сухом ДМФ (6 мл) добавляли триэтиламин (0,835 мл, 6,0 ммоль). Наблюдали выпадение в осадок гидрохлорида триэтиламина. Добавляли раствор бензилакрилата (0,910 мл, 6,0 ммоль) в ДМФ (6 мл). Полученную в результате суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Осадок удаляли фильтрованием, и фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в AcOEt и промывали насыщенным NаНСО₃. Органический слой высушивали (MgSO₄), фильтровали и концентрировали с получением прозрачного масла, которое очищали флэш-хроматографией, используя AcOEt/гептан 1:3 и 1:1 в качестве элюента. N-трет-бутоксикарбонилметил-β-Ala-OBn выделили с выходом 29% (0,505 г).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: млн^-1 1.43 (s, 9Н), 2.55 (t, 2H), 2.92 (t, 2H), 3.30 (s, 2H), 5.15 (s, 2HC,C7.65 (m, 5H).

Сукцинимидил-трет-бутилоктадекандиоат (0,15 г, 0,32 ммоль) и N-трет-бутоксикарбонилметил-β-Ala-OBn (0,10 г, 0,32 ммоль) растворяли в сухом ДМФ (2,5 мл) и добавляли DIEA (0,070 мл, 0,38 ммоль). После перемешивания в атмосфере азота в течение 30 мин добавляли HOAt (0,045 г, 0,32 ммоль), и смесь становилась желтой. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в атмосфере азота по причинам удобства в течение 13 суток. Реакционную смесь концентрировали. Остаток растворяли в AcOEt, промывали 0,1 н. HCl (2×) и водой, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением трет-бутилоктадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-ОВn в виде белого масла. 205 мг, выход 99%.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: млн^-1 1.25 (m, 26A)a 1.45 (s, 9Н), 1.50 (s, 9Н), 1.6 (m. 4H), 2.20 (t, 2H), 2.40 (t, 2H), 2.75 (q, 2H), 3.62 (t, 2H), 3.97 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 7.35 (m, 5H).

Трет-бутилоктадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-ОВп (200 мг, 0,31 ммоль) растворяли в ЕtOАс (10 мл) и ТГФ (5 мл). Добавляли 10% AdaC, и смесь подвергали гидрогенизации при 1 атм в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали с получением трет-бутилоктадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-ОН в виде прозрачного масла. Выход 180 мг, 100%.

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: млн^-1 1.25 (A,a26Н), 1.45 (s, 9Н), 1.50 (s, 9Н), 1.6 (m, 4H), 2.20 (t, 2HC,C2.40 (t, 2H), 2.70 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 4.05 (s, 2H).

Трет-бутилоктадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-ОН (0,110 г, 0,2 ммоль) растворяли в сухом ТГФ (2 мл). Добавляли DIEA (0,045 млA a,24 ммоль) и TSTU (0,075 г, 0,24 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 18 ч. Реакционную смесь фильтровали. К фильтрату добавляли AcOEt и промывали 0,2 М НСl (2×), рассолом (1×), высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением трет-бутилоктадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-OSu в виде прозрачного сиропа. Выход 124 мг, 96%.

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: млн^-1 1.25 Ama 26Н), 1.40 (s, 9Н), 1.57 (s, 9Н), 1.6 (m, 4H), 2.40 (m, 4HC,C2.58 (br s, 4H), 3.0 (t, 2H), 3.7 (t, 2H), 4.03 (s, 2H).

Пример 30

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(2-карбоксиэтил)-Gly] дез(B30)

Человеческий инсулин A1N, B1N-диВос дез(B30) (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr В; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (120 мг, 0,020 ммоль) растворяли в ДМСО (1,2 мл). Добавляли раствор трет-бутилоктадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-OSu (16 мг, 0,025 ммоль) в ТГФ (1,2 мл) и триэтиламин (0,033 мл, 0,24 ммоль) (рН составляла 10). После медленного перемешивания при комнатной температуре в течение 3 ч и 20 мин добавляли воду (4 мл) и доводили рН до 5,5 (изоэлектрическая точка) 1 н. HCl Осадок выделяли центрифугированием, промывали водой и выделяли центрифугированием. Продукт лиофилизировали. Сырой продукт очищали ОФ-ВЭЖХ на С18-колонке, буфер А: 0,1% ТФУ. буфер В: MeCN+0,1% ТФУ; градиент 20-90% В. Собранные фракции лиофилизировали. Неоптимизированная степень сочетания составляла 15 мг, 11% (MALDt-MS 6441, вычислено: 6444,5). Защищенный продукт растворяли в ТФУ (1 мл) и оставляли на 1 ч и выпаривали в вакууме. Сырой продукт очищали ОФ-ВЭЖХ на С4-колонке, буфер А: 0,1% ТФУ, буфер В: MeCN+0,1% ТФУ; градиент 10-80% В, и ОФ-ВЭЖХ на С4-колонке, буфер А: 20% EtOH+0,1% ТФУ, буфер В: 80% ЕtOН+0,1% ТФУ; градиент 15-60% В, с последующей ВЭЖХ на С4-колонке, буфер А: 10 мМ Eрис+15 мМ сульфат аммония в 20% EtOH, рН 7,3, буфер В: 80% EtOH, градиент 15-60% В. Собранные фракции обессоливали на Sep-Pak 70% ацетонитрилом + 0,1% ТФУ, нейтрализовали добавлением аммиака и лиофилизировали. Неоптимизированный выход составлял 1,8 мг, 13%. Чистота, как оценивали по ВЭЖХ, составляла 96,4%.

MALDI: 6132,1, вычислено: 6132.2.

Получение трет-бутилоктадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)-этил)-Gly-OSu

H-Gly-OBn, HCl (3,03 г, 15 ммоль) растворяли в сухом ДМФ (15 мл) и охлаждали на ледяной бане. Добавляли TEA (2,10, 15 ммоль) при выпадении в осадок ТЕА-гидрохпорида. Суспензию перемешивали в течение 5 мин, после чего добавляли трет-бутилакрилат (2,20 мл, 15 ммоль). Охлаждающей бане давали медленно достичь комнатной температуры, и перемешивание продолжали в атмосфере азота в течение 2 суток. Реакционную смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали. Остаток, еще содержащий ДМФ, растворяли в AcOEt и промывали насыщенным водным NaHCO₃ (2×) и водой (1×). Органический слой фильтровали, после чего высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением желтого масла. В результате очистки флэш-хроматографией или препаративной ВЭЖХ получили N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-OBn в виде прозрачного масла (0,739 г, 17%).

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: млн^-1 1.46 (s, 9H), 2.50-2.61 (m, 2H), 2.82-2.99 (m, 2H), 3.31 (s, 2H), 5C1C (s, 2H), 7.29-7.43 (m, 5H).

N-(2-(Трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОВn (0,030 г, 0,1 ммоль) и сукцинимидил-трет-бутилоктадекандиоат (описан в примере 29, 0,050 мг, 0,1 ммоль) суспендировали в сухом ДМФ (1 мл). Добавляли HOAt (0,014 г, 0,1 ммоль) и DIEA (0,21 мл, 1,2 ммоль). Эту желтую реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 42 ч. Реакционную смесь концентрировали. Остаток повторно растворяли в AcOEt и промывали 0,1 н. HCl (2×), водой (1×), высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением трет-бутил-октадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОВn с выходом 85% (55 мг).

¹Н-ЯМР (СDCl₃) δ: млн^-1 1.3 (m, 26Н), 1.38 (s, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.6 (m, 4H), 2.2 (m, 2H),C2.35 (m, 2H), 2.65 (m, 2H), 2.85 (s, 2H), 3.65 (m, 2H), 5.15 (s, 2H), 7.35 (m, 5H).

Трет-бутил-октадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОВn (0,054 г, 0,08 ммоль) растворяли в ТГФ (2 мл). Добавляли 10% палладий на угле, и смесь подвергали гидрогенизации при 1 атм и КГ в течение выходных дней. Сухую реакционную смесь растворяли в AcOEt и фильтровали 3 раза для удаления углерода. Фильтрат концентрировали с получением трет-бутилоктадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОН с выходом 80% (37 мг).

¹Н-ЯМР (СDCl₃) δ: млн^-1 1.3 (m, 26Н), 1.40 (s, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.6 (m, 4H), 1.75 (p, 2H)C 2.2 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.63 (m, 2H), 2.83 (s, 2H).

Трет-бутилоктадекандиоил-N-(2-(трет)-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОН (0,07 ммоль) растворяли в сухом ТГФ (2 мл). Добавляли TSTU (24 мг, 0,08 ммоль) и DIPEA (15 мкл, 0,08 ммоль). Эту смесь перемешивали при КГ в атмосфере азота. После 19 ч реакция не была завершена на основании ТСХ (ДХМ/МеОН 10:1). Добавляли дополнительное количество DIEA (20 мкл, 0,11 ммоль), и перемешивание продолжали. После 42 ч реацкионную смесь фильтровали. Фильтрат разбавляли AcOEt и промывали 0,1 н. НСl (2×) и рассолом (1×), высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением трет-бутилоктадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-OSu в виде белого твердого вещества с выходом 84% (36 мг).

¹Н-ЯМР (СDCl₃) δ: млн^-1 1.3 (m, 26Н), 1.40 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.58 (m, 2H), 1.73 (p, 2H), 2.2 (t, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.8 (m, 6H).

Пример 31

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(карбоксиэтил)-Gly] дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 30 посредством взаимодействия N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-ОВn с сукцинимидилгексадекандиоатом (описан в примере 4) с последующим дебензилированием, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином А1N, В1N-диВОС-дез(B30) и удалением защиты ТФУ.

MALDI-MS: 6093,0, вычислено 6104,1.

Пример 32

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(карбоксиметил)-β-Аlа] дез(B30)

Это соединение было получено по аналогии с примером 29 посредством взаимодействия N-(трет-бутоксикарбонилметил)-β-Аlа-ОВn и с сукцинимидилгексадекандиоатом (описан в примере 4) с последующим дебензалaрованием, активацией TSTU, сочетанием с человеческим инсулином А1N, В1N-диВОС-дез(B30) и удалением защиты ТФУ.

MALD)-MS: 6097,6, вычислено 6104,1.

Пример 33

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-γ-L-Glu] дез(B30)

Это соединение было получено подобно тому, как описано в примере 1, используя (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu(OSu)-OMe, полученный, как описано ниже, в качестве ацилирующего агента.

LCMS (электроспрей): М+3: 2049, вычислено 2050; М+4: 1538, вычислено 1537,8; М+5: 1231, вычислено 1230,4.

MALDI-TOF MS: Вычислено: 6147; обнаружено: 6153.

Получение (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu(OSu)-OMe

МеОН (40 мл) охлаждали до 0-5°С и добавляли SOCl₂ (4 мл) по каплям при перемешивании в течение 30 минут. Добавляли 12-аминододекановую кислоту (3 г, 13,9 ммоль), и полученную в результате суспензию перемешивали при 0-5°С, пока лед в охлаждающей бане не растаял, и давали нагреться до комнатной температуры в течение 16 часов. Смесь фильтровали, и твердое вещество высушивали отсасыванием с получением 2,23 г (60%) гидрохлорида метилового эфира 12-аминододекановой кислоты. Из маточного раствора выделили дополнительную партию 0,92 г (25%).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 7.97 (bs, 3Н), 3.58 (s, 3H), 2.73 (m, 2H), 2.28 (t, 2H), 1.52 (m, 4H), 1.25 ("s", 14H).

Гидрохлорид метилового эфира 12-аминододекановой кислоты (1 г, 3,8 ммоль) суспендировали в ТГФ (15 мл) и добавляли ангидрид глутаровой кислоты (1,29 г, 3,8 ммоль) и TEA (0,52 мл, 3,8 ммоль), и полученную в результате смесь (суспензию) перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Постепенно добавляли воду (75 мл). После добавления 25 мл получили раствор, а затем образовалась суспензия. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и фильтровали. Твердое вещество промывали водой и высушивали в вакууме. Таким образом, получили 1,02 г (80%) метилового эфира 12-(4-карбоксибутириламино)додекановой кислоты.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 12 (bs, 1Н), 7.73 (t, 1Н), 3.57 (s, 3H), 3.00 (q, 2H), 2.28 (t, 2H), 2.18 (t, 2H), 2.06 (t, 2H), 1.69 (p, 2H), 1.50 (p, 2H), 1.36 (p, 2H), 1.23 ("s", 14H).

Метиловый эфир 12-(4-карбоксибутириламино)додекановой кислоты (0,33 г, 0,95 ммоль) растворяли в смеси ТГФ и ДМФ (2:1, 6 мл) и добавляли DIEA (0,178 мл, 1,04 ммоль). Смесь охлаждали до 0-5°С и добавляли TSTU (0,314 г, 1,04 ммоль). Смесь перемешивали при 0-5°С в течение 1 часа и при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь концентрировали досуха в вакууме. Остаток (OSu-активированный метиловый эфир 12-(4-карбоксибутириламино)додекановой кислоты) растворяли в ДМФ (10 мл) и добавляли DIEA (0,24 мл, 1,4 ммоль) и H-Glu-ОМе (0,168 г, 1,04 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь концентрировали в вакууме, и остаток растворяли в AcOEt (100 мл) и промывали 0,2 М соляной кислотой (3×50 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме. Таким образом, получили 0,358 г (78%) (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu-OMe.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), δ: 12 (bs, 1Н), 8.22 (d, 1Н), 7.73 (t, 1Н), 4.24 (m, 1Н), 3.61 (s, 3H), 3.57 (s, 3H), 3.00 (q, 2H), 2.27 (m, 4H), 2.10 (t, 2H), 2.04 (t, 2H), 1.9 (m, 1Н), 1.8 (m, 1Н), 1.68 (t, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.23 ("s", 14H).

(МеООС(СН₂)₁₁)NНСО(СН₂)₃СО)-Glu-ОМе (0,36 г, 0,36 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и охлаждали до 0-5°С. Добавляли DIEA (0,13 мл) и TSTU (0,129 г, 0,43 ммоль), и смесь перемешивали при 0-5°С в течение нескольких часов и при комнатной температуре в течение 3 суток. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в AcOEt (100 мл) и промывали 0,2 н. соляной кислотой (3×50 мл) и насыщенным водным NaHCO₃ (3×100 мл). В результате высушивания (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме получили 0,17 г (84%) (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu(OSu)-OMe.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), избранные пики, δ: 8.27 (d, 1H), 7.72 (t, 1H), 4.31 (m, 1H), 3.63 (s, 3Н), 3.57 (s, 3Н), 3.00 (q, 2H), 2.81 (s, 4H), 2.28 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.05 (t, 2H), 1.70 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.35 (m, 2H), 1.23 ("s", 14H).

Пример 34

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₂CO)-γ-L-Glu] дез(B30)

Это соединение было получено подобно тому, как описано в примере 1, используя (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₂CO)-Glu(OSu)-OMe, который, в свою очередь, получили подобно тому, как описано в примере 33, используя ангидрид янтарной кислоты вместо ангидрида глутаровой кислоты в качестве ацилирующего агента.

MALDI-TOF MS: вычислено: 6133; обнаружено: 6134.

Пример 35

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)]-Gly-γ-L-Glu дез(B30)

Это соединение было получено подобно тому, как описано в примере 4, используя трет-бутилоктадекандиоил-Gly-Glu(OSu)-OtBu, полученный, как описано ниже, в качестве ацилирующего агента.

MALDI-TOF MS: Вычислено: 6189; обнаружено: 6191.

Получение трет-бутилоктадекандиоил-Gly-Glu(OSu)-OtBu

К Z-Gly-OH (1,0 г, 4,78 ммоль) добавляли ТГФ (10 мл), DIEA (0,98 мл, 5,74 ммоль) и TSTU (1,7 г, 5,74 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли AcOEt (100 мл), и смесь промывали 0,2 н. соляной кислотой (100 мл) и водой (2×100 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме с получением 1,34 г (92%) Z-Gly-OSu в виде масла.

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.35 (s, 5Н), 5.32 (t, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.35 (d, 2H), 2.83 (s, 4H).

Z-Gly-OSu (1,3 г, 4,25 ммоль) растворяли в ДМФ (15 мл) и добавляли DIEA (1,82 мл, 10,6 ммоль) и H-Glu-O^tBu (0,949 г, 4,67 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли AcOEt (100 мл), и смесь промывали 0,2 н. соляной кислотой (100 мл) и водой (2×100 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме с получением 1,7 г (количественно) Z-Gly-Glu-O^tBu в виде масла.

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.33 (s, 5Н), 7.1 (d, 1H), 5.80 (t, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.53 (m, 1H), 3.90C(C, 2H), 2.36 (t, 2H), 2.22 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.45 (s, 9H).

Z-Gly-Glu-O^tBu (1,7 г, 4,3 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (15 мл) и в атмосфере N₂ добавляли 10% палладий черный (0,6 д). Эту смесь подвергали гидрогенизации при атмосферном давлении в течение 5 часов. Смесь фильтровали, и палладий перемешивали с водой (200 мл) в течение 2 часов, фильтровали, и фильтрат лиофилизировали. Таким образом, получили 0,65 г (58%) H-Gly-Glu-O^tBu.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), избранные пики, δ: 8.31 (d, 1Н), 2.20 (t, 2H), 1.91 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 1.40 (s, 9H).

H-Gly-Glu-O^tBu (0,15 г, 0,58 ммоль) суспендировали в ДМФ (5 мл) и добавляли DIEA (0,15 мл, 0,86 ммоль) и сукцинимидил-трет-бутилоктадекандиоат (0,27 г, 0,58 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли AcOEt (50 мл), и смесь промывали 0,2 н. соляной кислотой (100 мл) и водой (3×100 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме с получением 0,34 г (количественно) трет-бутилоктадекандиоил-Gly-Glu-О^tВu.

¹Н-ЯМР (СDСl₃) δ: 7.11 (d, 1H), 6.55 (t, 1H), 4.55 (dt, 1H), 4.00 (dq, 2H), 2O4Bи(t, 2H), 2C2C (t, 2H), 2.20 (t, 4H), 2.00 (m, 1H), 1.57-1.65 (m, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.44 (s, 9H), 1.25 ("s", 22H, перекрывается с HDO).

Трет-бутилоктадекандноил-Gly-Glu-О^tВи (0,32 г, 0,52 ммоль) растворяли в ТГФ (5 мл) и добавляли DIEA (0,11 мл, 0,63 мOоль) и TSTU (0,19 г, 0,63 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере N₂ в течение 3 суток. Добавляли AcOEt (100 мл), и смесь промывали 0,15 н. соляной кислотой (100 мл) и водой (3×100 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме с получением 0,3 г (81%) трет-бутилоктадекандиоил-Gly-Glu(OSu)-O^tВu.

¹Н-ЯМР (СDCl₃), избранные пики, δ: 6.89 (d, 1H), 6.44 (t, 1H), 4.60 (m, 1H), 3.B5 (dq, 2H),C2.86 (s, 4H), 2.68 (q, 2H), 2.24 (t, 2H), 2.20 (t, 4H), 1.57-1.65 (m, 5H), 1.48 (s, 9H), 1.44 (s, 9H), 1.25 ("s", 22H, перекрывается с HDO).

Пример 36

Синтез человеческого инсулина N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(2-карбоксиэтил)-β-Аlа] дезB30

Это соединение было получено по аналогии с примером 1 посредством сочетания метилового эфира 15-[[2-(2,5-диоксо-пирролидин-1-илоксикарбонил)-этил]-(2-метоксикарбонил-этил)-карбамоил]-пентадекановой кислоты с человеческим инсулином дез(B30) и удаления защиты NaOH.

LC-MS: М+4 1530,3, вычислено 1529,5.

Получение метилгексадеканоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OSu

H-β-Ala-OMe гидрохлорид (5,45 г, 39 ммоль) растворяли в ДМСО (100 мл) и добавляли трет-бутилакрилат (5,71 мл, 39 ммоль) и DIEA (13,4 мл, 78 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 суток. Смесь распределяли между водой (500 мл) и AcOEt (2×250 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным водным NH₄Cl, высушивали (MgSO₄) и концентрировали в вакууме. Таким образом, получили 7,24 г (80%) N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OtBu.

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ: 3.58 (s, 3Н), 2.72 (t, 2Н), 2.67 (t, 2Н), 2.41 (t, 2H),A2a29 (t, 2H), 1.39 (s, 9H).

Монометиловый эфир гексадекандионовой кислоты (150 мг, 0,5 ммоль) растворяли в ДМФ (5 мл). Добавляли HOAt (102 мг, 0,75 ммоль) и EDAC (143 мг, 0,75 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 часа. После охлаждения до комнатной температуры добавляли DIEA (0,256 мл, 1,5 ммоль) и N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OtBu (139 мг, 0,6 ммоль). Эту реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь распределяли между водой (2×50 мл) и AcOEt (100 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме до масла. Добавляли ДХМ (10 мл) и ТФУ (10 мл), и смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, растворитель удаляли в вакууме с получением 170 мг (87%) метилгексадекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил-β-Аlа-ОН.

LC-MS: 458 (M+1).

Метилгексадекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил-β-Аlа-ОН A1a1 мг, 0,351 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и добавляли DIEA (0,073 мл, 0A4a ммоль) и TSTU (127 мг, 0,42 ммоль). Эту смесь перемешивали, пока она не охладилась на ледяной бане, в течение 30 мин, с последующим перемешиванием в течение 2 часов при комнатной температуре. Смесь распределяли между AcOEt (100 мл) и водной HCl (0,2 н., 2×80 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали в вакууме. Таким образом, получили 140 мг (72%) метилгексадекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OSu в виде масла.

LC-MS: 555 (M+1).

Пример 37

Синтез человеческого инсулина N^εBA9a[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(2-карбоксиэтил)-β-Аlа] дезB30

Это соединение было получено по аналогии с примером 1 и 36 посредством сочетания метилоктадекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OSu с человеческим инсулином дез(B30) и удаления защиты NaOH.

Получение метилоктaдекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OSu

Это соединение синтезировали по аналогии с метилгексадекандиоил-N-(2-(метоксикарбонил)этил)-β-Аlа-OSu, используя монометиловый эфир октадекандионовой кислоты.

MALDI-TOF MS: вычислено 6146; обнаружено: 6151.

LC-MS: 583 (M+1).

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Анализ (I)

Связывание производных инсулина по изобретению с рецептором инсулина

Сродство аналогов инсулина по изобретению с человеческим рецептором инсулина определяли с помощью бесконтактного сцинтилляционного анализа (SPA, Scintillation Proximity Assay) захвата антитела на микротитровальных планшетах. Связывающие антитела шарики SPA-PVT, противомышиный реагент (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017) смешивали с 25 мл связывающего буфера (100 мМ HEPES рН 7,8; 100 мМ хлорид натрия, 10 мМ MgSO₄, 0,025% Твин-20). Реакционная смесь для одного планшета Packard Optiptate (Packard No. 6005190) состоит из 2,4 мкл разведенного 1:5000 очищенного рекомбинантного человеческого рецептора инсулина - экзон 11, количества исходного раствора А14 Тyr[¹²⁵I]-человеческого инсулина, соответствующего 5000 имп/мин на 100 мкл реакционной смеси, 12 мкл 1:1000 разведения антитела F12, 3 мл SPA-гранул и связывающего буфера до суммарного объема 12 мл. Затем суммарно добавляли 100 мкл и делали серию разведений из соответствующих образцов. Затем к этой серии разведений добавляли 100 мкл реакционной смеси, и образцы инкубировали в течение 16 часов при мягком встряхивании. Затем фазы разделяли центрифугированием в течение 1 мин, и планшеты считали в счетчике Topcounter. Данные по связыванию приводили в соответствие, используя алгоритм нелинейной регрессии в программе GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Получение моноклональных антител mIR

Специфичные антитела (F12) получили с помощью моноклональной методики: мышей RBF иммунизировали путем инъекции 50 мкг очищенного mIR в FCA подкожно с двумя последующими инъекциями 20 мкг mIR в FIA. Мышей с высоким ответом иммунизировали внутривенно 25 мкг mIR, и селезенки собирали через 3 суток. Проводили слияние спленоцитов с клеточной линией миеломы Fox (Koh)er, G & Milstein С. (1976), European J. Immunology, 6: 511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219: 1228-30). Проводили скрининг надосадочных жидкостей на продуцирование антител в специфичном к mIR анализе ELISA (твердофазном иммуноферментном анализе). Положительные лунки клонировали и тестировали Вестерн-блоттингом (см. табл.2).

Таблица 2
Продукт	Связывание рецептора (% от человеческого инсулина)
Человеческий инсулин	100
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	26
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu) дез(B30)	9,2
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu) дез(B30)	11
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Giu) дез(B30)	13
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	13
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-) дез(B30)	9,4
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(β-Asp) дез(B30)	11
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-Glu) дез(B30)	22
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-γ-Glu) дез(B30)	20
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)-N-(β-L-Asp) дез(B30)	14
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	32
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu) дез(B30)	4
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp) дез(B30)	16
0525 Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-D-Asp) дез(B30)	37
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu) дез(B30)	15
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp) дез(B30)	11
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad) дез(B30)	7
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-D-Glu) дез(B30)	13
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-β- L-Asp) дез(B30)	5,4
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp) дез(B30)	13
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu) дез(B30)	16
Человеческий инсулин NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-) дез(B30)	5.7
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp) дез(B30)	11
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu) дез(B30)	9,1
Человеческий инсулин NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(карбоксиметил)-β-Аlа] дез(B30)	9,4
Человеческий инсулин NεB29-[Nα-(НООС(СН2)11)NНСО(СН2)3СО)-γ-L-Glu] дез(B30)	46

Анализ (II)

Эффективность производных инсулина по изобретению относительно человеческого инсулина

Самцов крыс Sprague Dawley массой 238-383 г на сутки эксперимента использовали для damp эксперимента. Крысы имели свободный доступ к пище при регулируемых условиях окружающей среды и голодали в течение ночи (с 15.00) перед кламп-экспериментом.

Протокол эксперимента

Крыс акклиматизировали в благоприятных условиях для животных в течение по меньшей мере 1 недели перед операцией. Примерно за 1 неделю до кламп-эксперимента катетеры Tygon встраивали под галотановой анестезией в яремную вену (для инфузии) и в сонную артерию (для взятия образцов крови), выводили наружу и фиксировали на задней стороне шеи. Крысам давали ветеринарный стрептоцилин (Boehringer hgetheim; 0,15 мл/крыса, внутримышечно) после операции и помещали в клетку для ухода (25°С) на восстановительный период. Для получения обезболивания анорфин (0,06 мг/крыса, s.с.) вводили во время анестезии, а римадил (1,5 мг/кг, s.с.) вводили после полного восстановления от анестезии (2-3 ч) и снова один раз в сутки в течение 2 суток.

Применяемая кпамп-методика была адаптирована из (1). В 7.00 на сутки эксперимента крыс, голодавших в течение ночи (с 15.00 предшествующих суток), взвешивали и присоединяли к шприцам для взятия образцов и к инфузионной системе (Harvard 22 Basic pumps, Harvard, и стеклянный шприц Perfectum Hypodermic, Atdrich), а затем помещали в индивидуальные кламп-клетки, где они оставались примерно 45 мин до начала эксперимента. Крысы могли свободно двигаться на их обычной подстилке в течение всего эксперимента и имели свободный доступ к питьевой воде. После 30 мин начального периода, во время которого уровни глюкозы в плазме измеряли через 10-минутные интервалы, производное инсулина, подлежащее тестированию, и человеческий инсулин (один уровень дозировки на крысу, n=6-7 на уровень дозировки) инфузировали (внитривенно) с постоянной скоростью в течение 300 мин. Уровни глюкозы в плазме измеряли через 10-минутные интервалы на протяжении всего эксперимента, и инфузию 20% водной глюкозы проводили соответственно для поддержания эугликемии. Образцы ресуспендированных эритроцитов объединяли от каждой крысы и возвращали примерно в ½ мл объемах через каротидный катетер.

На каждые сутки эксперимента образцы растворов индивидуальных производных инсулина, подлежащих тестированию, и раствора человеческого инсулина отбирали перед кламп-экспериментами и в конце экспериментов, и концентрации пептидов подтверждали с помощью ВЭЖХ. Концентрации крысиного инсулина и С-пептида в плазме, а также производных инсулина, подлежащих тестированию, и человеческого инсулина измеряли в соответствующие моменты времени перед исследованиями и в конце исследований. Крыс забивали в конце эксперимента, используя передозировку пентобарбитала.

Тестируемые соединения и дозы: Инсулины, подлежащие тестированию, разводили из исходного раствора, содержащего 97 мкМ производного инсулина в 5 мМ фосфатном буфере с рН 7,7. Конечная концентрация в растворе, готовом к применению, составляла 0,45 мкМ производного инсулина, 5 мкМ фосфата, 100 мкМ хлорида натрия, 0,007% полисорбата 20. рН составлял 7,7, и скорость внутривенной инфузии составляла 15 и 20 пмоль·мин^-1·кг^-1.

Препарат исходного раствора человеческого инсулина, который использовали в качестве сравнительного соединения, готовили в аналогичной среде и инфузировали внутривенно при 6, 15 или 30 пмоль·мин^-1·кг^-1.

Оба исходных раствора хранили при -20°С и оттаивали в течение ночи при 4°С перед применением. Растворы мягко переворачивали несколько раз сверху вниз за 15 мин до того, как их переносили в инфузионные шприцы (см. табл.3).

Таблица 3
Производное инсулина	Эффективность относительно человеческого инсулина
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	>50%
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu) дез(B30)	>50%
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu) дез(B30)	>50%
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp) дез(B30) human insulin	>50%
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	>50%
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp) дез(B30)	>50%

Анализ (III)

Определение T_50% производных инсулина по изобретению у свиней

Т_50% представляет собой время, когда 50% инъецированного количества меченого производного инсулина А14 Тyr[¹²⁵I], подлежащего тестированию, исчезало из места инъекции, как измерено наружным γ-счетчиком.

Выполняли принципы содержания и ухода за лабораторными животными. Для фармакокинетических и фармакодинамических исследований использовали свободных от специфических патогенов LYYD самок свиней без диабета, перекрестных гибридов Danish Landrace, Yorkshire и Duroc (Holmenlund, Haarloev, Denmark). Свиньи находились в сознании, в возрасте 4-5 месяцев и с массой 70-95 кг. Животные голодали в течение ночи за 18 ч до эксперимента.

Приготовленные препараты производных инсулина, меченных ¹²⁵I по Тyr^A14, инъецировали подкожно свиньям, как описано ранее (Ribei, U., Jørgensen, К, Brange, J, and Henriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Tefèbvre, P.J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Материалы конференции)).

В начале экспериментов дозу 60 нмоль производного инсулина согласно изобретению (тестируемого соединения) и дозу 60 нмоль инсулина determir (аналога инсулина длительного действия) (оба меченные ¹²⁵I по Тyr А14) инъецировали в два отдельных места на шее каждой свиньи.

Мониторинг исчезновения радиоактивной метки из места подкожной инъекции проводили, используя модификацию традиционного способа наружного гамма-счета (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. and Gries, F.A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Материалы конференции)). С помощью этого модифицированного способа было возможно непрерывное измерение исчезновения радиоактивности из подкожного депо в течение нескольких суток, используя беспроводное портативное устройство (Scancys Laboratorieteknik, Vaeløse, DK-3500, Denmark). Измерения проводили через интервалы по одной минуте, и значения счета корректировали на фоновую активность.

В таблице 4 в колонке "тест/determir" показаны значения Т_50%, найденные для каждого из тестируемых соединений ("тест"), и T_50%, найденные для инсулина determir ("determir"; аналог инсулина длительного действия) в том же эксперименте.

Таблица 4
Производное инсулина	T50%, часы тест/determir
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu) дез(B30)	9,0/9,5
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu) дез(B30)	10,6/9,7
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(y-Glu) дез(B30)	7,8/7,4
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu) дез(B30)	3,5/7,4
Человеческий инсулин NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO-) дез(B30)	4,1/7,4
Человеческий инсулин NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(β-Asp) дез(B30)	8,7/9,1

Claims (16)

1. Производное дез(В30) человеческого инсулина, которое имеет боковую цепь, присоединенную к ε-аминогруппе остатка лизина, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, где эта боковая цепь имеет общую формулу:
-W-X-Y-Z,
где W представляет собой:
- α-аминокислотный остаток, имеющий карбоксильную группу в боковой цепи, где этот остаток образует посредством его карбоксильной группы амидную группу с ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина;
- цепь, состоящую из двух, трех или четырех α-аминокислотных остатков, соединенных вместе посредством амидных связей, причем эта цепь посредством амидной связи присоединена к ε-аминогруппе лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, где аминокислотные остатки цепи W выбраны из группы аминокислотных остатков, имеющих нейтральную боковую цепь, и аминокислотных остатков, имеющих карбоксильную группу в боковой цепи, так что W имеет по меньшей мере один аминокислотный остаток, который содержит карбоксильную группу в боковой цепи; либо
- ковалентную связь, соединяющую Х и ε-аминогруппу лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина;
Х представляет собой:
-CON(CH₂COOH)СН₂ СО-;
-CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;
-CON(CH₂CH₂COOH)CH₂ CO- или
-CON(CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-,
которые
а) образуют амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и аминогруппой в W, когда W представляет собой аминокислотный остаток или цепь аминокислотных остатков, или
б) образуют амидную связь между подчеркнутым атомом углерода карбонильной группы и ε-аминогруппой лизинового остатка, присутствующего в В-цепи исходного инсулина, когда W представляет собой ковалентную связь;
Y представляет собой:
-(CH₂)_m-, где m представляет собой целое число в интервале от 6 до 32;
и
Z представляет собой -СООН;
или любые комплексы этого производного с Zn²⁺.

2. Производное инсулина по п.1, где W представляет собой ковалентную связь.

3. Производное инсулина по п.1, где W представляет собой остаток α-аминокислоты, имеющей от 4 до 10 атомов углерода.

4. Производное инсулина по п.3, где W выбран из группы, состоящей из α-Asp, β-Asp, α-Glu, γ-Glu, α-hGlu и δ-hGlu.

5. Производное инсулина по п.1, где W представляет собой цепь, состоящую из двух α-аминокислотных остатков, из которых один имеет от 4 до 10 атомов углерода и свободную карбоксильную группу, тогда как другой имеет от 2 до 11 атомов углерода, но не имеет свободной карбоксильной группы.

6. Производное инсулина по п.5, где W выбран из группы, состоящей из α-Asp-Gly; Gly-α-Asp; β-Asp-Gly; Gly-β-Asp; α-Glu-Gly; Gly-α-Glu; γ-Glu-Gly; Gly-γ-Glu; α-hGlu-Gly; Gly-α-hGlu; δ-hGlu-Gly и Gly-δ-hGlu.

7. Производное инсулина по п.1, где W представляет собой цепь, состоящую из двух α-аминокислотных остатков, независимо имеющих от 4 до 10 атомов углерода, и которые оба имеют свободную карбоксильную группу в боковой цепи.

8. Производное инсулина по п.7, где W выбран из группы, состоящей из α-Asp-α-Asp; α-Asp-α-Glu; α-Asp-α-hGlu; α-Asp-β-Asp; α-Asp-γ-Glu; α-Asp-δ-hGlu; β-Asp-α-Asp; β-Asp-α-Glu; β-Asp-α-hGlu; β-Asp-β-Asp; β-Asp-γ-Glu; β-Asp-δ-hGlu; α-Glu-α-Asp; α-Glu-α-Glu; α-Glu-α-hGlu; α-Glu-β-Asp; α-Glu-γ-Glu; α-Glu-δ-hGlu; γ-Glu-α-Asp; γ-Glu-α-Glu; γ-Glu-α-hGlu; γ-Glu-β-Asp; γ-Glu-γ-Glu; γ-Glu-δ-hGlu; α-hGlu-α-Asp; α-hGlu-α-Glu; α-hGlu-α-hGlu; α-hGlu-β-Asp; α-hGlu-γ-Glu; α-hGlu-δ-hGlu; δ-hGlu-α-Asp; δ-hGlu-α-Glu; δ-hGlu-α-hGlu; δ-hGlu-β-Asp; δ-hGlu-γ-Glu и δ-hGlu-δ-hGlu.

9. Производное инсулина по п.1, где Y представляет собой -(СН₂)_m-, где m представляет собой целое число в интервале от 8 до 20, от 12 до 20 или от 12-16.

10. Производное инсулина по п.1, где исходный инсулин имеет Asn или Gly в положении А21.

11. Производное инсулина по п.1, где исходный инсулин выбран из группы, состоящей из человеческого инсулина дез(В30) и человеческого инсулина дез(В30) Gly^A21.

12. Производное инсулина по п.1, выбранное из группы, состоящей из человеческого инсулина N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-IDA) дез(В30); человеческого инсулина N^εB29-[N-HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(карбоксиэтил)-Gly]дез(В30); человеческого инсулина N^εB29-[N-HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(карбоксиэтил)-Gly]дез(В30) и человеческого инсулина N^εB29-[N-HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(карбоксиметил)-β-Ala]дез(В30).

13. Производное инсулина по п.1 в форме комплекса с цинком, где каждый гексамер инсулина связывает два иона цинка, три иона цинка или четыре иона цинка.

14. Фармацевтическая композиция для лечения диабета у пациента, нуждающегося в таком лечении, содержащая терапевтически эффективное количество производного инсулина по п.1, взятого отдельно или в смеси с инсулином или аналогом инсулина с быстрым действием, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, где аналог инсулина с быстрым действием представляет собой Asp^B28-человеческий инсулин.

16. Способ лечения диабета у пациента, нуждающегося в таком лечении, при котором пациенту вводят терапевтически эффективное количество производного инсулина по п.1, взятого отдельно или в смеси с инсулином или аналогом инсулина с быстрым действием вместе с фармацевтически приемлемым носителем.