KR20060132543A

KR20060132543A - 신규의 인슐린 유도체

Info

Publication number: KR20060132543A
Application number: KR1020067002551A
Authority: KR
Inventors: 이브 요나센; 토마스 호에그-옌센; 스벤드 하벨룬드; 울라 리벨-마드센; 티나 묄러 타그모세; 페터 마드센
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2006-12-21
Also published as: US8828923B2; CY1113850T1; HUS1300033I1; EP1660531A2; CY2013029I2; EP2107069A3; CA2531988A1; RU2008152033A; KR101159559B1; EP2264065A2; MXPA06001283A; LU92226I9; BE2013C035I2; AU2010200497A1; JP4463814B2; BRPI0413276A; LU92213I9; BE2013C038I2; IL172980A0; US20140349925A1

Abstract

본 발명은 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기 중 하나에 부착되는 곁사슬을 가지는 자연발생 인슐린 또는 그 유사체인 인슐린 유도체에 관한 것으로, 곁사슬은 일반식: -W-X-Y-Z이며, 여기에서 W, X, Y, Z는 명세서에 정의된 대로이다.

인슐린, 인슐린 유도체, 당뇨병, 과혈당증

Description

신규의 인슐린 유도체{NOVEL INSULIN DERIVATIVES}

본 발명은 생리적인 pH값에서 가용성이고 지속되는 작용 프로파일을 가지는 신규의 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그런 유도체를 제공하는 방법, 그런 유도체를 함유하는 약제학적 조성물, 본 발명의 인슐린 유도체를 사용하여 당뇨병 및 과혈당증을 치료하는 방법, 및 당뇨병 및 과혈당증의 치료에서의 그런 인슐린 유도체의 용도에 관한 것이다.

현재, 1종 당뇨병 및 2종 당뇨병 양쪽 모두의 당뇨병의 치료는 증가하는 정도로 소위 집중적 인슐린 치료에 의존하고 있다. 이러한 요법에 따라서, 환자는 식사에 대하여 인슐린 요구를 커버하기 위한 즉시 작용 인슐린의 덩어리 주입에 의해 보충되는 기초 인슐린 필요를 커버하기 위하여 지속성 인슐린의 하나 또는 둘의 매일의 주입을 포함하는 다수의 매일의 인슐린 주입으로 치료되고 있다.

지속성 인슐린 조성물은 기술분야에서 공지되어 있다. 예컨데, 지속성 인슐린 조성물의 한가지 주요한 종류는 인슐린 결정 또는 무정형 인슐린의 주입가능한 수성 현탁액을 포함한다. 이러한 조성물에서, 전형적으로 이용되는 인슐린 화합물은 프로타민 인슐린, 아연 인슐린 또는 프로타민 아연 인슐린이다.

어떤 결점이 인슐린 현탁액의 사용과 관련되어 있다. 따라서, 정확한 투약 을 확보하기 위하여, 인슐린 입자는 현탁액의 한정된 부피를 바이알에서 빼내기 전에 또는 카트리지에서 방출되기 전에 부드러운 흔들기에 의해 균질하게 부유되어야 한다. 또한, 인슐린 현탁액의 저장에 대하여, 온도는 덩어리 형성 또는 응고 작용을 피하기 위하여 인슐린 용액에서 보다 더 좁은 제한 내에서 유지되어야 한다.

프로타민이 비면역원성이라는 것을 일찍 알았음에도 불구하고, 프로타민이 사람에게 면역원성일 수 있다는 것 및 그것의 의학 목적으로의 사용이 항체의 형성을 이끌 수도 있다는 것이 이제 밝혀졌다. 또한, 프로타민-인슐린 착물이 그 자체로 면역원성이라는 증거가 발견되었다. 따라서, 일부 환자에게 프로타민을 함유하는 지속성 인슐린 조성물의 사용은 회피되어야 한다.

지속성 조성물의 다른 종류는 용액이 주입될 때 pH값의 상승으로 인하여 인슐린이 침전할 생리적인 pH 아래의 pH값을 가지는 용액이다. 이러한 용액에 대한 결점은 침전물의 입자 크기 분포가 주입시 조직에 형성된다는 것이며, 따라서, 약물의 방출 프로파일은 주입 지점에서의 혈액 속도 및 어느정도 예측할 수 없는 방식의 다른 파라미터에 의존한다. 또 다른 결점은 인슐린의 고체 입자가 주입 지점에서 조직의 염증을 일으키는 국소적인 자극제로 작용할 수 있다는 것이다.

WO 91/12817(Novo Nordisk A/S)는 코발트(Ⅲ)의 인슐린 착물을 포함하는 가용성 인슐린 조성물을 개시한다. 이러한 착물의 작용 프로파일은 단지 알맞게 지속되며, 생물학적 이용가능성은 인간 인슐린에 비하여 감소된다.

인간 인슐린은 3개의 1차 아미노기를 가진다: A사슬 및 B사슬의 N말단기 및 Lys^B29의 ε아미노기. 하나 이상의 이러한 기에서 치환된 수개의 인슐린 유도체가 선행기술에서 공지되어 있다. 예컨데, 미국특허 제 3,528,960(Eli Lilly)는 인슐린 분자의 1개, 2개 또는 3개의 1차 아미노기가 카르복시아로일기를 가지는 N-카르복시아로일 인슐린에 관한 것이다.

영국특허 제1.492.997호(Nat. Res. Dev. Corp.)에 따르면, N^εB29에 카르바밀 치환을 가지는 인슐린이 저혈당 효과의 개선된 프로파일을 가진다는 것이 발견되었다.

일본 특허출원공개 제1-254699호(Kodama Co., Ltd.)는 지방산이 Phe^B1의 아미노기 또는 Lys^B29의 ε아미노기 또는 이들 모두에 결합된 인슐린을 개시한다. 이러한 유도의 구술된 목적은 약리학적으로 수용가능한 안정한 인슐린 조제약을 얻기 위함이다.

B30 위치에서 삼중의 뉴클레오티드에 의해 필수적으로 암호화될 수 없는 적어도 5개의 탄소원자를 가지는 아미노산을 가지는 인슐린이 일본 특허출원공개 제57-067548(Shionogi)에 개시되어 있다. 인슐린 유사체는 당뇨병의 치료에, 특히 소 또는 돼지의 인슐린 항체의 발생으로 인한 인슐린 저항성인 환자에 유용하다는 것으로 청구되어 있다.

WO 95/07931(Novo Nordisk A/S)는 Lys^B29의 ε아미노기가 친유성 치환기를 가지는 인간 인슐린 유도체를 개시한다. 이러한 인슐린 유도체는 지속되는 작용 프 로파일을 가지며 생리적인 pH값에서 가용성이다.

EP 894095는 B28, B29 또는 B30 위치에서 B사슬의 N말단기 및/또는 Lys의 ε아미노기가 식 -CO-W-COOH (여기에서 W는 긴 사슬의 탄화수소기)의 치환기를 가지는 인슐린 유도체를 개시한다. 이러한 인슐린 유도체는 지속되는 작용 프로파일을 가지며 생리적인 pH값에서 가용성이다.

그러나, 지금까지 공지된 인슐린 유도체보다 더 지속되는 작용 프로파일을 가지며, 동시에 생리적인 pH값에서 가용성이고 인간 인슐린과 유사한 효능을 가지는 인슐린에 대한 필요가 여전히 있다.

발명의 개요

본 발명은 인슐린 유도체 분자의 전체에 걸친 소수성도가 유도체의 생체 내에서의 효능에 대하여 중요한 역할을 한다는 인식에 기초를 두고 있다.

본 발명의 한 양태는 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린(parent insulin)의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기 중 하나에 부착된 곁사슬을 가지는, 자연발생 인슐린 또는 그 유사체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체에 관한 것이며, 곁사슬은 하기 일반식으로 되어 있다.

(화학식)

-W-X-Y-Z

상기식에서 W는:

* 곁사슬에서 카르복실산기를 가지는 α아미노산 잔기, 이러한 잔기는 그것의 카르복실산기 중 하나와 함께, B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 더불어 아미드기를 형성하거나;

* 아미드 결합을 통하여 함께 연결된 2개, 3개 또는 4개의 α아미노산 잔기로 구성된 사슬, 이러한 아미드 결합을 통한 사슬은 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 연결되어 있고, W의 아미노산 잔기는 중성 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 및 W가 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 가지도록 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되거나; 또는

* X로부터 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기로의 공유결합이며;

상기식에서 X는:

* -CO-;

* -CH(COOH)CO-;

* -N(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂ CO-; 또는

* -N(CH₂COOH)CH₂CH₂ CO- 이고, 이것은

a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 사슬일 때, 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에 있는 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는

b) W가 공유결합일 때, 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하며;

상기식에서 Y는:

* -(CH₂)m-, 여기에서 m은 6 내지 32의 범위에서의 정수이거나;

* 1, 2 또는 3 -CH=CH-기 및 사슬에서 탄소원자의 총수를 10 내지 32의 범위로 주기 위하여 충분한 다수의 -CH₂-기를 포함하는 2가의 탄화수소 사슬이거나; 또는

* 식 -(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-의 2가 탄화수소 사슬, 여기에서 v 및 w는 정수이거나 또는 이들 중 하나가 0으로서 v 및 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있으며;

상기식에서 Z는:

* -COOH;

* -CO-Asp;

* -CO-Glu;

* -CO-Gly;

* -CO-Sar;

* -CH(COOH)₂;

* -N(CH₂COOH)₂;

* -SO₃H; 또는

* -PO₃H; 그리고

W가 공유결합이고 X가 -CO-일 때, Z가 -COOH와 다르다면, 이것의 임의의 Zn²⁺ 착물이다.

본 발명의 한 구체예에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 모인슐린의 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기에 부착된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착된다. 이 구체예의 다른 특정한 형태에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 B 사슬의 28 위치에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착된다. 이 구체예의 다른 특정한 형태에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 B 사슬의 29 위치에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착된다. 이 구체예의 또 다른 특정한 형태에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 B사슬의 30 위치에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착된다.

곁사슬 -W-Z-Y-Z의 하위구조 W는 공유결합일 될 수 있다. 대안으로, W는 곁사슬에 카르복실산기를 가지고 총수가 4 내지 10의 탄소원자를 포함하는 α아미노산의 잔기가 될 수 있다. 구체적으로, W는 α아미노산의 잔기가 될 수 있고, 이것은 유전 코드에 의해 암호화될 수 있다. 따라서, 예를 들어, W는 α-Asp, β-Asp, α-Glu, 및 γ-Glu로부터 선택될 수 있다. W에 대한 다른 선택권은 예를 들어 α-hGlu 및 δ-hGlu이다.

다른 구체예에서, W는 2개의 α아미노산 잔기로 구성되며, 그 중 하나는 4 내지 10의 탄소원자 및 곁사슬에 카르복실산기를 가지고, 반면에 다른 하나는 2 내지 11의 탄소원자를 가지지만 유리 카르복실산기는 없다. 유리 카르복실산기가 없는 α아미노산 잔기는 중성의 암호화가능한 α아미노산 잔기가 될 수 있다. 이 구체예에 따른 W의 예는 α-Asp-Gly; Gly-α-Asp; β-Asp-Gly; Gly-β-Asp; α-Glu-Gly; Gly-α-Glu; γ-Glu-Gly; Gly-γ-Glu; α-hGlu-Gly; Gly-α-hGlu; δ-hGlu-Gly; 및 Gly-δ-hGlu이다.

다른 구체예에서, W는 독립적으로 4 내지 10의 탄소원자를 가지는 2개의 α아미노산 잔기로 구성되고, 둘 모두는 곁사슬에 카르복실산기를 가진다. 이들 α아미노산 잔기 중 하나 또는 이들 중 모두는 암호화가능한 α아미노산 잔기가 될 수 있다. 이 구체예에 따른 W의 예는 α-Asp-α-Asp; α-Asp-α-Glu; α-Asp-α-hGlu; α-Asp-β-Asp; α-Asp-γ-Glu; α-Asp-δ-hGlu; β-Asp-α-Asp; β-Asp-α-Glu; β-Asp-α-hGlu; β-Asp-β-Asp; β-Asp-γ-Glu; β-Asp-δ-hGlu; α-Glu-α-Asp; α-Glu-α-Glu; α-Glu-α-hGlu; α-Glu-β-Asp; α-Glu-γ-Glu; α-Glu-δ-hGlu; γ-Glu-α-Asp; γ-Glu-α-Glu; γ-Glu-α-hGlu; γ-Glu-β-Asp; γ-Glu-γ-Glu; γ-Glu-δ-hGlu; α-hGlu-α-Asp; α-hGlu-α-Glu; α-hGlu-α-hGlu; α-hGlu-β-Asp; α-hGlu-γ-Glu; α-hGlu-δ-hGlu; δ-hGlu-α-Asp; δ-hGlu-α-Glu; δ-hGlu-α-hGlu; δ-hGlu-β-Asp; δ-hGlu-γ-Glu; 및 δ-hGlu-δ-hGlu이다.

다른 구체예에서, W는 독립적으로 4 내지 10의 탄소원자를 가지는 3개의 α아미노산 잔기로 구성되는 사슬이고, 사슬의 아미노산 잔기는 중성 곁사슬을 가지는 잔기 및 사슬이 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 적어도 하나의 잔기를 가지도록 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 잔기의 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 아미노산 잔기는 암호화가능한 잔기이다.

다른 구체예에서, W는 독립적으로 4 내지 10의 탄소원자를 가지는 4개의 α아미노산 잔기로 구성되는 사슬이고, 사슬의 아미노산 잔기는 중성 곁사슬을 가지는 잔기 및 사슬이 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 적어도 하나의 잔기를 가지도록 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 잔기의 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 아미노산 잔기는 암호화가능한 잔기이다.

한 구체예에서, W는 요소 유도체를 통하여 B사슬에서 Lys 잔기의 ε아미노기에 연결될 수 있다.

곁사슬 -W-X-Y-Z의 하위구조 X는 식 -CO-의 기가 될 수 있으며, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -CH(COOH)CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂COOH)CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂CH₂COOH)CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

다른 구체예에서, 곁사슬의 하위구조 X는 식 -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-의 기가 될 수 있고, 이것은 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에서 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는 W가 공유결합일 때, B사슬에서 N말단 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성한다.

곁사슬 -W-X-Y-Z의 하위구조 Y는 식 -(CH₂)_m-의 기가 될 수 있고, 여기에서 m은 6 내지 32, 8 내지 20, 12 내지 20, 또는 12 내지 16의 범위에서의 정수이다.

다른 구체예에서, Y는 1, 2 또는 3 -CH=CH-기 및 사슬에서 탄소원자의 총수를 6 내지 32, 10 내지 32, 12 내지 20, 또는 12 내지 16의 범위로 주기 위하여 충분한 다수의 -CH₂-기를 포함하는 2가의 탄화수소 사슬이다.

다른 구체예에서, Y는 식 -(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-의 2가 탄화수소 사슬, 여기에서 v 및 w는 정수이거나 또는 이들 중 하나가 0으로서 v 및 w의 합이 6 내지 30, 10 내지 20, 또는 12 내지 16의 범위에 있다.

한 구체예에서, 곁사슬 -W-X-Y-Z의 하위구조 Z는, W가 공유결합이고 X가 -CO-일 때, Z가 -COOH와 다르다면, -COOH이다.

다른 구체예에서, Z는 -CO-Asp이다.

다른 구체예에서, Z는 -CO-Glu이다.

다른 구체예에서, Z는 -CO-Gly이다.

다른 구체예에서, Z는 -CO-Sar이다.

다른 구체예에서, Z는 -CH(COOH)₂이다.

다른 구체예에서, Z는 -N(CH₂COOH)₂이다.

다른 구체예에서, Z는 -SO₃H이다.

다른 구체예에서, Z는 -PO₃H이다.

다른 구체예에서, W는 α-Asp, β-Asp, α-Glu, 및 γ-Glu로 구성된 군으로부터 선택되고; X는 -CO- 또는 -CH(COOH)CO이고; Y는 -(CH₂)_m, 여기에서 m은 12 내지 18의 범위에서의 정수이고, Z는 -COOH 또는 -CH(COOH)₂이다.

본 명세서에 모인슐린이라고 또한 불리우는, 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 인슐린 부분은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린과 같은 자연발생 인슐린이 될 수 있다. 대안으로, 모인슐린은 인슐린 유사체가 될 수 있다.

모인슐린 유사체의 하나의 군에서, A21 위치에서 아미노산 잔기는 Asn이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, A21 위치에서 아미노산 잔기는 Gly이다. 이러한 군의 유사체로부터의 구체적인 예는 Gly^A21 인간 인슐린, Gly^A21 des(B30) 인간 인슐린, 및 Gly^A21Arg^B31Arg^B32 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B1 위치에서 아미노산 잔기는 제거되었다. 이러한 군의 모인슐린 유도체로부터의 구체적인 예는 des(B1) 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B30 위치에서 아미노산 잔기는 제거되었다. 이러한 군의 모인슐린 유도체로부터의 구체적인 예는 des(B30) 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B28 위치에서 아미노산 잔기는 Asp이다. 이러한 군의 모인슐린 유사체로부터의 구체적인 예는 Asp^B28 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B28 위치에서 아미노산 잔기는 Lys이고 B29 위치에서 아미노산 잔기는 Pro이다. 이러한 군의 모인슐린 유사체로부터의 구체적인 예는 Lys^B28Pro^B29 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B30 위치에서 아미노산 잔기는 Lys이고 B29 위치에서 아미노산 잔기는 Cys, Met, Arg 및 Lys를 제외한 임의의 암호화가능한 아미노산이다. 예는 B29 위치에서 아미노산 잔기가 Thr이고 B30 위치에서 아미노산 잔기가 Lys인 인슐린 유사체이다. 이러한 군의 모인슐린 유사체의 구체적인 예는 Thr^B29Lys^B30 인간 인슐린이다.

모인슐린 유사체의 다른 군에서, B3 위치에서 아미노산 잔기는 Lys이고 B29 위치에서 아미노산 잔기는 Glu이다. 이러한 군의 모인슐린 유사체의 구체적인 예는 Lys^B3Glu^B29 인간 인슐린이다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체의 예는 다음의 화합물이다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체는 본질적으로 무아연 화합물의 형태 또는 아연 착물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 아연 착물이 제공될 때, 2개의 Zn²⁺ 이온, 3개의 Zn²⁺ 이온 또는 4개의 Zn²⁺ 이온이 각각의 인슐린 6분자체(hexamer)에 결합될 수 있다. 인슐린 유도체의 아연 착물의 용액은 그러한 종류들의 혼합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 약제학적으로 수용가능한 담체와 함께 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 과혈당증을 일으키는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 그러한 치료를 위하여 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 인슐린 유도체는 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 과혈당증을 일으키는 다른 상태의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 과혈당증을 일으키는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 그러한 치료를 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 이러한 약제학적 조성물은 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 첨가물과 함께, 즉효의 작용을 가지는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로, 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인슐린 유도체 및 Asp^B28 인간 인슐린; Lys^B28Pro^B29 인간 인슐린 및 Lys^B3Glu^B29 인간 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택되는 즉시 작용 인슐린 유사체의 혼합물인 약제학적 조성물을 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 담체 및 첨가물과 함께 N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) des(B30) 인간 인슐린 및 Asp^B28 인간 인슐린을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체 및 즉시 작용 인슐린 유사체는 약 90/10%; 약 70/30% 또는 약 50/50%로부터의 비율로 혼합될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 과혈당증을 일으키는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 그러한 치료 방법이 제공되며, 이러한 방법은 약제학적으로 수용가능한 담체 및 약제학적으로 수용가능한 첨가물과 함께 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서, 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 과혈당증을 일으키는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 그러한 치료 방법이 제공되며, 이러한 방법은 약제학적으로 수용가능한 담체 및 약제학적으로 수용가능한 첨가물과 함께, 즉효 작용을 가지는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로, 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린과 본질적으로 유사한 전체에 걸친 소수성도를 가지는 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 약 2 내지 약 200의 범위에서의 소수성율, k'_rel을 가지는 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명의 인슐린 유도체는 약 0.02 내지 약 10; 약 0.1 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 5; 또는 약 0.5 내지 약 2의 범위에 있는 소수성율, k'_rel을 가진다.

본 발명의 한 구체예에 따라서, 인슐린 유도체는 적어도 하나의 친수성 및 적어도 하나의 소수성 영역을 가지는 상기 정의된 곁사슬 -W-X-Y-Z을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따라서, 인슐린 유도체는 적어도 하나의 유리 카르복실산기를 가지는 상기 정의된 곁사슬 -W-X-Y-Z을 포함할 수 있고, 다른 구체예에 따라서, 곁사슬은 적어도 2개의 유리 카르복실산기를 가질 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 생리적인 pH값에 가용성인 본 발명에 따른 인슐린 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 약 6.5 내지 약 8.5의 간격의 pH값에서 가용성인 본 발명에 따른 인슐린 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인슐린 유도체를 포함하는 지속되는 작용 프로파일을 가지는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 또는 즉시 작용 인슐린 유사체와 함께 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 혼합물의, 약 120nmol/ml 내지 약 2400nmol/ml, 약 400nmol/ml 내지 약 2400nmol/ml, 약 400nmol/ml 내지 약 1200nmol/ml, 약 600nmol/ml 내지 약 2400nmol/ml, 약 600nmol/ml 내지 약 1200nmol/ml을 함유하는 용액인 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체에 대한 소수성도 데이터

인간 인슐린에 대한 본 발명의 인슐린 유도체의 소수성도(소수성율), k'_rel는 A) 10% 아세토니트릴을 함유한, pH 7.3, 0.1 M 인산나트륨 버퍼, 및 B) 용리액으로서 물에서의 50% 아세토니트릴의 혼합물을 사용하는 40℃에서 등용매 용리에 의해 LiChrosorb RP18(5㎛, 250×4mm) HPLC상에서 측정하였다. 용리는 214nm에서 용출액의 하기의 UV 흡수에 의하여 모니터하였다. 공시간, t₀은 0.1mM 질산나트륨을 주입하여 확인하였다. 인간 인슐린에 대한 보유시간, t_인간은 A와 B 용액 사이의 비율을 변화시켜 적어도 2t₀으로 조절하였다. k'_rel=(t_유도체-t₀)/(t_인간-t₀). 본 발명에 따른 다수의 인슐린 유도체에 대하여 확인된 k'_rel는 표 1에 주어진다.

약제학적 조성물

본 발명에 따른 인슐린 유도체를 함유하는 약제학적 조성물은 그런 치료의 필요로 하는 환자에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여는 주사기, 선택적으로는 펜모양 주사기에 의해 피하, 근육내 또는 정맥내 주입에 의해 수행될 수 있다. 다른 선택권은 바람직하게는 그 목적을 위하여 특정하게 디자인된 조성물, 분말 또는 액체로, 인슐린을 코로 또는 폐로 투여하는 것이다.

본 발명의 인슐린 유도체의 주입가능한 조성물은 원하는 목적 생성물을 얻기 위하여 적절한 성분을 용해하고 혼합하는 것을 포함하는 제약 산업의 전통적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨데, 한 과정에 따르면, 본 발명에 따른 인슐린 유도체는 준비되는 조성물의 최종 부피보다 다소 적은 양의 물에 용해된다. 등장제, 보존제 및 버퍼가 필요한 만큼 첨가되고, 용액의 pH값은 필요하다면, 예를 들어 염산과 같은 산, 또는 예를 들어 수성 수산화나트륨과 같은 염기를 필요한 만큼 사용하여 조절된다. 마지막으로, 용액의 부피는 성분의 원하는 농도를 얻기 위하여 물로 조절된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 버퍼는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말리산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 구체적인 버퍼의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 제제는 페놀, o-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로잘, 브로노폴, 벤조산, 이미두레아, 클로로엑시딘, 나트륨 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로페네신 (3p-클로로페녹시프로판-1,2-디올) 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 약제학적으로 수용가능한 보존제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 보존제는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 보존제는 0.1mg/ml 내지 5mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 보존제는 5mg/ml 내지 10mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 보존제는 10mg/ml 내지 20mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 구체적인 보존제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다. 약제학적 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 편의상 참고문헌은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 제제는 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, L글리신, L히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 등장제를 더 포함한다. 예를 들어 프룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덴스트린, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는, 단당류, 이당류, 또는 다당류와 같은 임의의 당, 또는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 당 첨가물은 수크로오스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH기를 가지는 C4-C8 탄화수소로 정의되고, 예를 들어, 만니톨, 스로비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가물은 만니톨이다. 상기 언급한 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 조제약에서 가용성이고, 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정 효과에 악영향을 미치지 않는 한, 사용되는 양에 대하여 고정된 제한은 없다. 한 구체예에서, 당 또는 당 알코올 농도는 약 1mg/ml과 약 150mg/ml 사이이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 등장제는 1mg/ml 내지 50mg/ml의 농도에서 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 등장제는 1mg/ml 내지 7mg/ml의 농도에서 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 등장제는 8mg/ml 내지 24mg/ml의 농도에서 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 등장제는 25mg/ml 내지 50mg/ml의 농도에서 존재한다. 이들 구체적인 등장제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다. 약제학적 조성물에서 등장제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 편의상 참고문헌은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

전형적인 등장제는 염화나트륨, 만니톨, 디메틸 설폰 및 글리세롤이고, 전형적인 보존제는 페놀, m-크레졸, 메틸 p-히드록세본조에이트 및 벤질 알코올이다.

적당한 버터의 예는 아세트산나트륨, 글리실글리신, HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) 및 인산나트륨이다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체의 코 투여를 위한 조성물은 예를 들어, 유럽특허 제272097(Novo Nordisk A/S)에 기재된 대로 제조될 수 있다.

본 발명의 인슐린을 함유하는 조성물은 인슐린에 민감한 상태의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 조성물은 1종 당뇨병, 2종 당뇨병 및 예를 들어 심각하게 부상당한 사람 및 대수술을 겪은 사람에게 때때로 보여지는 과혈당증의 치료에 사용될 수 있다. 임의의 환자에 대한 최적의 투여수준은 사용되는 특정 인슐린 유도체의 효능, 환자의 연령, 체중, 신체 활동, 및 규정식을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 본 발명의 인슐린 유도체의 매일 투여량은 공지의 인슐린 조성물에서와 같은 방식으로 당업자에 의해 각각의 개별 환자에 대하여 결정된다는 것이 권해진다.

적당한 경우에, 본 발명의 인슐린 유도체는 예를 들어, 보다 즉효로 작용하는 인슐린 유사체와 같은 다른 종류의 인슐린과 혼합하여 사용될 수 있다. 그러한 인슐린 유사체의 예는 예를 들어, 공개번호 EP 214826(Novo Nordisk A/S), EP 375437(Novo Nordisk A/S) 및 EP 383472(Eli Lilly & Co.)를 가지는 유럽특허 출원서에 기재되어 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 더 설명되지만, 이것이 보호범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

정의

본문에 사용된 "인슐린 유사체"는 자연발생 인슐린, 예를 들어 인간 인슐린의 구조로부터, 자연발생 인슐린에서 나타나는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거 및/또는 교체, 및/또는 적어도 하나의 아미노산 자기를 삽입시킴으로써, 정식으로 유도될 수 있는 분자구조를 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 삽입 및/또는 교체된 아미노산 잔기는 암호화가능한 아미노산 잔기 또는 다른 자연발생 잔기 또는 순수하게 합성된 아미노산 잔기 중 하나가 될 수 있다. 인슐린 유사체는 B사슬의 28 위치가 중성 Pro 잔기에서 Asp, Lys, 또는 Ile 중 하나로 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, B29 위치에서 Lys이 Pro로 변형될 수 있다. 한 구체예에서, B30은 Lys이 될 수 있고, 그러면 B29는 Cys, Met, Arg 및 Lys를 제외한 임의의 암호화가능한 아미노산이 될 수 있다.

또한, A21 위치에서 Asn은 Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly, Ala, Ser 또는 Thr, 및 바람직하게는 Gly로 변형될 수 있다. 더욱이, B3 위치에서 Asn은 Lys 또는 Asp로 변형될 수 있다. 인슐린 유사체의 다른 예는 des(B30) 인간 인슐린; des(B30) 인간 인슐린 유사체; PheB1이 제거된 인슐린 유사체; An사슬 및/또는 B사슬이 N말단 연장부분을 가지는 인슐린 유사체; 및 A사슬 및/또는 B사슬이 C말단 연장부분을 가지는 인슐린 유사체이다. 따라서 1개 또는 2개의 Arg이 B1 위치에 삽입될 수 있다.

본문에 사용된 "인슐린 유도체"는 예를 들어, 인슐린 골격의 하나 이상의 위치에 곁사슬을 도입함으로써 또는 인슐린에서 아미노산 잔기의 기들을 산화 또는 환원시킴으로써 또는 유리 카르복실기를 에스테르기로 변환시킴으로써 또는 유리 아미노기 또는 히드록시기를 아실화시킴으로써, 화학적으로 변형된 자연발생 인슐린 또는 인슐린 유사체를 의미한다.

"암호화가능한 아미노산" 또는 "암호화가능한 아미노산 잔기"라는 표현은 삼중("코돈")의 뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 또는 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용된다.

hGlu는 호모글루탐산이다.

α-Asp는 -HNCH(CO-)CH₂COOH의 L형태이다.

β-Asp는 -HNCH(COOH)CH₂CO-의 L형태이다.

α-Glu는 -HNCH(CO-)CH₂CH₂COOH의 L형태이다.

γ-Glu는 -HNCH(COOH)CH₂CH₂CO-의 L형태이다.

α-hGlu는 -HNCH(CO-)CH₂CH₂CH₂COOH의 L형태이다.

δ-hGlu는 -HNCH(COOH)CH₂CH₂CH₂CO-의 L형태이다.

β-Ala는 -NH-CH₂-CH₂-COOH이다.

Sar은 사크코신 (N-메틸글리신)이다.

"곁가지에 카르복실산기를 가지는 아미노산 잔기"라는 표현은 Asp, Glu 및 hGlu와 같은 아미노산 잔기를 나타낸다. 아미노산은 L구조 또는 D구조 중 하나로 있을 수 있다. 어떤것도 특정되지 않는다면, 아미노산 잔기는 L구조로 있다는 것으로 이해된다.

"중성 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기"라는 표현은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Tyr, Asn 및 Gln와 같은 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체가 "생리적 pH값에서 가용성"이라고 말해질 때, 그것은 인슐린 유도체가 생리적 pH값에서 완전히 용해되는 주입가능한 인슐린 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 그런 유리한 용해도는 인슐린 유도체 자체의 본래의 특성 또는 인슐린 유도체와 운반물에 함유된 하나 이상의 성분 사이의 유리한 상호작용의 결과 중 하나로 인한 것일 것이다.

하기의 약어가 명세서 및 실시예에서 사용된다.

Aad : 알파-아미노-아디프산 (호모글루탐산)

Bzl = Bn : 벤질

DIEA : N,N-디이소프로필에틸아민

DMF : N,N-디메틸포름아미드

IDA : 이미노디아세트산

Sar : 사르코신 (N-메틸-글리신)

tBu : tert-부틸

TSTU : O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트

THF : 테트라히드로푸란

EtOAc : 에틸 아세테이트

DIPEA : 디이소프로필에틸아민

HOAt : 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸

TEA : 트리에틸 아민

Su : 숙신이미딜 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일

TFA : 트리플루오르아세트산

DCM : 디클로로메탄

DMSO : 디메틸 설폭사이드

TLC : 박막 크로마토그래피

RT : 실온

실시예 1

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

200mg의 des(B30) 인간 인슐린을 15℃에서 수욕조(water bath)에 위치하는 관에 함유된 10ml의 50mM Na₂CO₃(pH 10.2)에 용해하였다. 메틸 헥사데칸디오일- Glu(OSu)-OMe(37.90mg, 하기 기재된대로 제조)를 10ml의 아세토니트릴에 용해하였고 이어서 인슐린 용액에 첨가하였다. 묽은 HCl로 pH 9.0으로 조절한 3.8ml의 0.2M 에탄올아민의 첨가하여 30분 후에 반응을 멈추었다. 반응의 수율은 RP-HPLC에 의해 측정한 결과 37%였다. 물의 2.5 부피의 추가하여 pH를 5.5로 조절한 후에 생성물이 침전하였다. 그런후 침전물을 pH 8에서 10mL의 물에 용해하였고, 얼음에 두었다. 이 용액에 비누화하기 위하여 10ml의 찬 0.2M NaOH을 첨가하였고, 혼합물을 얼음 냉각으로 40분 동안 배양하였고, 그런후 생성물을 침전시키기 위하여 pH 5.5로 조절하였다. 침전물을 분리하였고 5ml의 A버퍼(하기 참조)에 용해하였고, 3번으로 나누어진 33ml의 42.5% w/w 수성 에탄올로 희석하였고, A버퍼(Tris 0.24%w/w, NH₄Ac 0.25%, 42% 에탄올 w/w, pH 7.5) 및 B버퍼(Tris 0.24%w/w, NH₄Ac 1.25%, 42% 에탄올 w/w, pH 7.5)로 구성된 버퍼 시스템으로 용리한 Resource^TM 6ml 음이온 교환 칼럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 샘플을 30분에서 B버퍼의 0 내지 100%의 기울기에서 6ml/분의 속도에 의해 용리하였다. 원하는 화합물을 함유한 분획을 RP-HPLC에 의해 확인하였다. 원하는 생성물의 수율은 15.3mg(순도: 72.9%)이었다. 원하는 화합물을 함유하는 연합 분획의 부피는 진공하에서 20ml로 감소하였고, 그런후 이 용액을 역상 HPLC 칼럼 뉴클레오실, C4 250/10mm, 10㎛, 300Å을 사용하는 RP HPLC에 의해 정제하였다. 버퍼 시스템은 A버퍼(10mM Tris, 15mM (NH₄)₂SO₄, 10% 에탄올, pH 7.3) 및 B버퍼(70% vol/vol 에탄올)로 구성된다.

생성물을 2ml/분의 속도에서 120분에서 B버퍼의 10% 내지 60%의 기울기로 용리하였다. 적절한 분확을 연합하였고, 화합물을 침전하였고 동결건조하였다. 수율은 7.7mg(순소: 99.4%)이었다.

분자량, 질량분광기에 의한 확인치: 6097.2, 계산치: 6104.1. 곁사슬을 함유하는 B말단 펩티드를 스타필로코쿠스 아우레우스 프로테아제와의 소화 후에 얻었다. 분자량, 질량분광기에 의한 확인치: 1413.1, 계산치: 1413.5.

메틸 헥사데칸디오일-Glu(OSu)-OMe의 제조

디메틸 헥사데칸디오에이트를 1.0 당량의 NaOH를 사용하여 MeOH에서 비누화하였고, 모노-메틸 에스테르를 헵탄으로부터의 재결정화에 의해 HCl 산성화 하에서 분리하였다.

모노-메틸 헥사데칸디오에이트(275mg, 0.91mmol)을 THF(3ml)에서 용해하였고, 숙신이미딜 테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(331mg, 1.1mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(188㎕, 1.1mmol)로 처리하였고, 그 혼합물을 20시간 동안 휘저었다. 용매를 진공속에서 제거하였고, 잔류물을 에틸 아세테이트에서 용해하였고, 0.1M HCl(두번) 및 물로 세척하였다. 유기상을 MgSO₄를 통해 건조하고, 여과하고 진공속에서 증발시켜 350mg(96%)의 메틸 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3.66(s, 3H), 2.83(s, 4H), 2.60(t, 2H), 2.30(t, 2H), 1.74(p, 2H), 1.62(p, 2H), 1.40(m, 2H), 1.35-1.22(m, 18H).

디메틸포름아미드(5ml)에서 메틸 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트(240mg, 0.58mmol)을 GluOMe(93mg, 0.58mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(200㎕, 1.16mmol)로 처리하였다. 혼합물을 20시간 동안 휘저었고, 그런후 진공속에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에서 재용해하였다. 0.1M HCl 및 물로 세척하고, 그후에 건조(MgSO₄)하고, 진공속에서 증발시켜, 226mg(88%)의 메틸 헥사데칸디오일-Glu-OMe를 얻었다.

¹H-NMR δ: 6.22(d, 1 H), 4.65(m, 1H), 3.76(s, 3H), 3.66(s, 3H), 2.42(t, 2H), 2.29(m, 4H), 2.22(t, 2H), 1.97(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.35-1.22(m, 20H).

메틸 헥사데칸디오일-Glu-OMe(200mg, 0.45mmol)을 디클로로메탄(4ml)에서 용해하였고, 얼음욕조로 냉각하였고, 디시클로헥실카르복디이미드(93mg, 0.45mmol) 및 N-히드록시숙신이미드(52mg, 0.45mmol)로 처리하였다. 혼합물을 20시간 동안 휘저었고, 여과하고, 진공속에서 증발시켜서, 243mg(100%)의 원하는 중간물을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.34(d, 1H), 4.67(m, 1H), 3.73(s, 3H), 3.64(s, 3H), 2.81(s, 4H), 2.66(m, 2H), 2.27(m, 4H), 2.20(t, 2H), 1.89(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.58(m, 4H), 1.29-1.20 (m, 20H).

실시예 2

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

300mg의 des(B30) 인간 인슐린을 실시예 1에서 기재된 대로 아실화하고, 정제하고, 분리하였다. 단, 본 실시예에서는 메틸 옥타데칸디오일-Glu(OSu)-OMe(하기 기재된대로 제조)를 실시예 1에 사용된 메틸 헥사데칸디오일-Glu(OSu)-OMe 대신 아실화제로 사용하였다. 25.5mg의 표제 화합물을 얻었다 (순도: 97.4%). 분자량, 질량 분광기에 의한 확인치: 6136.6, 계산치: 6132. 리간드를 함유하는 B말단 펩티드를 스타필로코쿠스 아우레우스 프로테아제에 의한 소화 후 얻었다. 분자량, 질량 분광기에 의한 확인치: 1439.1, 계산치: 1442.5.

메틸 옥타데칸디오일-Glu(OSu)-OMe의 제조

이 화합물은 실시예 1에 기재된 헥사데칸디오일 유도체와 유사하게 디메틸 옥타데칸디오에이트로부터 제조된다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 6.20(d, 1H), 4.70(m, 1H), 3.78(s, 3H), 3.67(s, 3H), 2.84(s, 4H), 2.70(m, 2H), 2.30(m, 4H), 2.22(t, 2H), 1.93(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.62(m, 4H), 1.33-1.23(m, 24H).

실시예 3

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu)) des(B30) 인간 인슐린의 합성

실시예 1에 기재된 것과 같은 유사한 방식으로, 300mg의 des(B30) 인간 인슐린을 메틸 옥타데칸디오일-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe로 아실화하였다. 음이온 교환에 의한 정제는 상기 기재된대로 수행하였다. 그러나, 원하는 생성물을 용리하기 위 하여 100% B버퍼로 연장된 용리를 수행하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 RP-HPLC에 의해 확인하였고, 47.5mg을 55%의 순도에서 얻었다. 원하는 생성물을 함유하는 분획의 부피를 진공속에서 감소시켰고, 결과용액을 페노메렉스(Phenomerex)로부터의 역상 HPLC Jupiter 칼럼, C4 250/10mm, 10㎛, 300Å을 사용하는 RP HPLC에 의해 정제하였다. 버퍼 시스템은 A버퍼(0.1% TFA, 10% vol/vol 에탄올) 및 B버퍼(80% vol/vol 에탄올)로 구성된다. 샘플을 2ml/분의 속도에서 120분 동안 40℃에서 B버퍼의 40% 내지 60%의 기울기로 용리하였다. 적절한 분확을 연합하였고, 동결건조하였고, 31.1mg의 표제 화합물을 얻었다 (순도: 94%)

표제 화합물의 분자량, 질량분광기에 의한 확인치: 6259.65, 계산치: 6261.2. 스타필로코쿠스 아오레우스 프로테아제와의 소화 후에 얻은 곁사슬을 함유하는 B말단 펩티드의 분자량(질량분광기에 의한), 확인치: 1569.88, 계산치: 1569.88.

메틸 옥타데칸디오일-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe의 제조

디메틸포름아미드(5ml)에서 메틸 옥타데칸디오일-Glu(OSu)-OMe (실시예 2에서 기재된대로 제조, 200mg, 0.35mmol)을 GluOMe(62mg, 0.39mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(90㎕, 53mmol)로 처리하였고, 그 혼합물을 20시간 동안 훠저었다. 용매를 진공속에서 제거하였고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해하였고, 0.2M HCl, 물 및 염수로 2번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 증발로 인하여 메틸 옥타데칸디오일-Glu(Glu-OMe)-OMe, 180mg(83%)를 얻었다.

메틸 옥타데칸디오일-Glu(Glu-OMe)-OMe(180mg, 0.29mmol)을 THF(9ml)에서 용해하였고, 숙신이미딜 테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(106mg, 0.35mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(60㎕, 0.35mmol)로 처리하였다. 그 혼합물을 밤새 휘저었고, 증발시키고, 에틸 아세테이트에서 재용해하고, 2×0.1M HCl 및 물로 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 증발로 인하여 190mg(93%)의 원하는 중간물을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.73(d, 1H), 6.43(d, 1H), 4.69(m, 1H), 4.56(m, 1H), 3.77(s, 3H), 3.74(s, 3H), 3.66(s, 3H), 2.85(s, 4H), 2.72(m, 2H), 2.41-2.12(m, 8H), 2.95(m, 2H), 1.72-1.56(m, 6H), 1.35-1.22(m, 22H).

실시예 4

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

des(B30) 인간 인슐린(500mg, 0.088mmol)을 실온에서 100mM Na₂CO₃(5ml, pH 10.2)에서 용해하였다. tert-부틸 헥사데칸디오일-Glu(OSu)-OtBu(66mg, 0.105mmol, 하기 기재된대로 제조)를 아세토니트릴(5ml)에서 용해하였고, 이어서 인슐린 용액에 첨가하였다. 30분 후, 0.2M 메틸아민(0.5ml)을 첨가하였다. pH를 HCl에 의해 5.5까지 조절하였고, 등전위 침전물을 원심분리 및 진공속의 건조에 의해 수집하여 525mg을 얻았다. 결합 수율은 78%이었다 (RP-HPLC, C4 칼럼; 버퍼A: 0.1% TFA-물에서 10% MeCN, 버퍼 B: 0.1% TFA-물에서 80% MeCN; 16분에서 기울기 20% 내지 90% B). 보호된 생성물을 TFA(10ml)에서 용해하였고, 30분 방치하였고, 진공속에서 증발시켰다. 정제하지 않은 생성물을 물에서 용해하였고 동결건조하였다(610mg). 0454를 C4칼럼, 버퍼 A(20% EtOH + 0.1% TFA), 버퍼 B(80% EtOH + 0.1% TFA), 기울기 15-60% B 상의 RP-HPLC에 의해 정제하였고, 이어서 C4칼럼, 버퍼 A(10mM Tris + 20% EtOH에서 15mM 암모늄 설페이트, pH 7.3), 버퍼 B(80% EtOH), 기울기 15-60% B 상의 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 수집된 분획을 70% 아세토니트릴 + 0.1% TFA를 가진 Sep-Pak 상에서 탈염하였고, 암모니아의 첨가에 의해 중성화하였고, 동결건조하였다. 최적아닌 수율은 64mg, 12%이었다. HPLC에 의해 측정된 순소는 99.2%이었다. LCMS 6102.9, C₂₇₄H₄₁₁N₆₅O₈₁S₆은 6104.1을 필요로 한다. 곁사슬 (RGFFYTPK(N^ε-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-L-Glu)를 함유하는 B말단 펩티드를 스타필로코쿠스 아우레우스 프로테아제와의 소화 후에 얻었다. MALDI-MS: 1413.1, 계산치: 1412.7.

tert-부필 헥사데칸디오일-L-Glu(OSu)-OtBu의 제조

헥사데칸이산(40.0g, 140mmol)을 톨루엔(250ml)에 부유시켰고, 그 혼합물을 가열환류하였다. N,N-디메틸포름아미드 디-tert-부틸 아세탈(76.3g, 375mmol)을 4시간 동안 한방울씩 첨가하였다. 혼합물을 밤새도록 환류하였다. 용매를 50℃에서 진공속에서 제거하였고, 원 재료를 DCM/AcOEt(500ml, 1:1)에서 부유시켰고, 15분 동안 휘저었다. 여과하여 고체를 수집하였고, DCM(200ml)로 분쇄하였다. 여과된 것을 진공속에서 증발시켜서 정제하지 않은 모노-tert-부틸 헥사데칸디오에이 트, 30g을 얻었다. 이 재료를 DCM(50ml)에 부유시켰고, 10분 동안 얼음으로 냉각하였고 여과하였다. 용매를 진공속에서 제거하여, 25g의 정제하지 않은 모노-tert-부틸 헥사데칸디오에이트를 얻었고, 이것을 헵탄(200ml)로부터 재결정하여 모노-tert-부틸 헥사데칸디오에이트 15.9g(33%)를 얻었다. 대안으로는 재결정에 대하여, 모노-에스테르를 AcOEt/헵탄에서 실리카 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 2.35(t, 2H), 2.20(t, 2H), 1.65-1.55(m, 4H), 1.44(s, 9H), 1.34-1.20(m, 20H).

모노-tert-부틸 에스테르(2g, 5.8mmol)을 THF(20ml)에서 용해하였고 TSTU(2.1g, 7.0mmol) 및 DIEA(1.2ml, 7.0mmol)로 처리하였고 밤새 휘저었다. 혼합물을 여과하였고, 그 여과된 것을 진공속에서 증발시켰다. 잔류물을 AcOEt에서 용해하였고 찬 0.1M HCl 및 물로 2번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 진공속에서 증발에 의하여 숙신이미딜 tert-부틸 헥사데칸디오에이트 2.02g(79%)를 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 2.84(s, 4H), 2.60(t, 2H), 2.20(t, 2H), 1.74(p, 2H), 1.56(m, 2H), 1.44(s, 9H), 1.40(m, 2H), 1.30-1.20(m, 18H).

숙신이미딜 tert-부틸 헥사데칸디오에이트(1g, 2.27mmol)을 DMF(15ml)에서 용해하였고, L-Glu-OtBu(0.51g, 2.5mmol) 및 DIEA(0.58ml, 3.41mmol)로 처리하였고, 혼합물을 밤새 휘저었다. 용매를 진공속에서 증발시켰고, 정제하지 않은 생성 물을 AcOEt에서 용해하였고, 0.2M HCl, 물 및 염수로 2번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 진공속에서 증발에 의하여 tert-부틸 헥사데칸디오일-L-Glu-OtBu 1.2g(100%)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.25(d, 1H), 4.53(m, 1H), 2.42(m, 2H), 2.21(m, 4H), 1.92(m, 1H), 1.58(m, 4H), 1.47(s, 9H), 1.43(s, 9H), 1.43-1.22(m, 18H).

tert-부틸 헥사데칸디오일-L-Glu-OtBu(1.2g, 2.27mmol)을 THF(15ml)에서 용해하였고, TSTU(0.82g, 2.72mmol) 및 DIEA(0.47ml, 2.72mmol)로 처리하였고, 밤새 휘저었다. 혼합물을 여과하였고, 여과물을 진공속에서 증발시켰다. 잔류물을 AcOEt에서 용해하였고, 찬 0.1M HCl 및 물로 두 번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 진공속에서 증발에 의하여 tert-부틸 헥사데칸디오일-L-Glu(OSu)-OtBu 1.30g(92%)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.17(d, 1H), 4.60(m, 1H), 2.84(s, 4H), 2.72(m, 1H), 2.64(m, 1H), 2.32(m, 1H), 2.20(m, 4H), 2.08(m, 1H), 1.6(m, 4H), 1.47(s, 9H), 1.43(s, 9H), 1.33-1.21(m, 20H).

실시예 5

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

des(B30) 인슐린(50mg, 9μmol)을 0.1M 수성 Na₂CO₃(0.65ml), pH 10.5에서 용해하였다. 옥타데칸디오일-L-Glu(OSu)(50.1mg, 9.9μmol, 하기 기재된대로 제조)를 아세토니트릴(0.65ml)에 용해하였고, 인슐린 용액에 첨가하였다. pH는 10.3이었다. 30분 후, 0.2M 메틸아민(50㎕)을 첨가하였다. pH를 HCl로 5.5까지 조절하였고, 등전위 침전물을 원심분리에 의해 수집하였고, 진공속에서 건조하였다. HPLC(C4 칼럼; 버퍼 A: 0.1% TFA-물에서 10% MeCN, 버퍼 B: 0.1% TFA-물에서 80% MeCN; 16분에서 기울기 20% 내지 90% B)는 정제되지 않은 결합 수율이 52%(최적화되지 않음)라는 것을 나타내었다. LCMS 6133.2, C₂₇₆H₄₁₅N₆₅O₈₁S₆은 6132.2를 필요로 한다.

옥타데칸디오일-L-Glu(OSu)의 제조

옥탄데칸이산(2.5g, 8.0mmol)을 DCM(60ml)에 부유시켰고, 트리에틸아민(1.16ml, 8.3mmol)으로 처리하였고 얼음냉각하였다. 벤질클로로포르메이트(1.14ml)을 질소하에서 한방울씩 첨가하였고 혼합물을 10분 동안 휘저었으며, 이 때 DMAP(0.097g, 0.80mmol)을 첨가하였다. 4℃에서 20분 동안 휘저은 후 (TLC, 1:1 AcOEt:헵탄), 반응물을 증발시켜 건조하였다. 정제되지 않은 재료(3.9g)을 DCM(60ml)에 용해하였고 실리카(15g)으로 처리하였고 증발시켰다. 실리카를 실리콘 칼럼(175g)에 적재하였고 생성물을 AcOEt/헵탄 1:7 내지 1:1로 용리하였다. 원하는 분획을 증발시켜 모노-벤질 옥타데칸디오에이트(1.15g, 36%)를 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 7.35(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.35(t, 4H), 1.63(t, 4H), 1.30-1.22(m, 24).

모노-벤질 옥타데칸디오에이트를 DMF(3.5ml) 및 THF(7ml)에 용해하였고 얼음욕조로 냉각하였다. DIEA(0.103ml) 및 TSTU를 참가하였고 혼합물을 얼음욕조에서 1시간 동안 휘저었고 0.2N HCl로 두 번 세척하고, NaHCO₃에 담그고, 건조하고, 여과하고, 증발시켜서 숙신이미딜 모노-벤질 옥타데칸디오에이트(0.25g, 100%)를 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 7.35(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.83(s, 4H), 2.60(t, 2H), 2.35(t, 2H), 1.80-1.60(m, 4H), 1.40-1.20(m, 24).

숙신이미딜 모노-벤질 옥타데칸디오에이트(95mg, 0.019mmol)을 DMF(1.5ml)에 용해하였고, L-Glu-OBzl(49mg, 0.21mmol) 및 DIEA(50ml, 0.28mmol)로 처리하였고, 혼합물을 밤새 훠저었다. 용매를 진공속에서 증발시켰고, 정제되지 않은 생성물을 AcOEt에서 용해하였고, 0.2M HCl, 물 및 염수로 2번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 진공속에서 증발하여 BzlO-옥타데칸디오일-L-Glu-OBzl, 114mg(97%)을 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 7.35(m, 5H), 6.22(d, 2H), 5.17(s, 2H), 5.11(s, 2H), 4.71(m, 1H), 2.37(m, 4H), 2.22(m, 3H), 1.98(m, 1H), 1.63(m, 4H), 1.31-1.20(m, 24H).

BzlO-옥타데칸디오일-L-Glu-OBzl(110g, 0.018mmol)을 THF(2ml)에 용해하였고, TSTU(64mg, 0.21mmol) 및 DIEA(36㎕, 0.21mmol)로 처리하였고 밤새 휘저었다. 혼합물을 여과하였고, 여과물을 진공속에서 증발시켰다. 잔류물을 AcOEt에 용해하였고, 찬 0.1M HCl 및 물로 2번 세척하였다. MgSO₄를 통한 건조 및 진공속에서 증발하여 BzlO-옥타데칸디오일-L-Glu(OSu)-OBzl, 119mg(94%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7.36(m, 5H), 6.40(d, 2H), 5.19(s, 2H), 5.11(s, 2H), 4.75(m, 1H), 2.82(s, 4H), 2.68(m, 1H), 2.59(m, 1H), 2.35(t, 2H), 2.19(t, 2H), 1.62(m, 4H), 1.32-1.21(m, 24H).

BzlO-옥타데칸디오일-L-Glu(OSu)-OBzl(59mg, 0.082mmol)을 아세톤/0.1% TFA(1ml)에 용해하였다. Pd/C를 첨가하였다 (20mg). 플라스크를 증발시켰고 N₂로 여러번 충전시켰고, H₂ 충전된 풍선을 연결하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 휘저었고, 그런후 셀라이트를 통해 여과하였다. 헵탄으로부터의 침전 및 잔류 용매의 증발하여 옥타데칸디오일-L-Glu(OSu)(27mg, 61%)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6.32(d, 1H), 4.70(m, 1H), 3.70(m, 1H), 3.06(m, 2H), 2.88(s, 4H), 2.62(m, 2H), 2.35(m, 2H), 2.24(m, 1H), 1.74(m, 1H), 1.64(m, 2H), 1.50-1.20 (m, 26H).

실시예 6

N^εB29-(N-(L-Asp-OC(CH₂)₁₆CO)-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-Asp(OtBu)-OtBu와 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트의 반응, 이 후 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6247.5, 계산치 6247.3.

실시예 7

N^εB29-(N-(L-Glu-OC(CH₂)₁₄CO)-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-Glu(OtBu)-OtBu와 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6261.3, 계산치 6261.3.

실시예 8

N^εB29-(N-(L-Glu-OC(CH₂)₁₄CO-) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-Glu(OtBu)-OtBu와 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6130.8, 계산치 6132.2.

실시예 9

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Glu)-N-(β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-Glu(OtBu)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-AspOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린 과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6246.9, 계산치 6247.3.

실시예 10

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₅CO-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 헵타데칸디오에이트(A.C. Cope, U. Axen, E.P. Burrows, J.Weinlich, J. Am. Chem Soc. 1966, 88, 4228)와 L-GluOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6118.3, 계산치 6118.1.

실시예 11

N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₃CO-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-GlyOtBu와 숙신이미딜 펜타데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6147.5, 계산치 6147.1.

실시예 12

N^εB29-(N-(L-Sar-OC(CH₂)₁₃CO-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-Sar-OtBu와 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6161.0, 계산치 6161.1.

실시예 13

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Asp)-N-(β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-Asp(OtBu)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-AspOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6233.8, 계산치 6233.2.

실시예 14

N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₄CO-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-GlyOtBu와 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6160.7, 계산치 6161.1.

실시예 15

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트와 L-AspOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통 하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6089.8, 계산치 6089.8.

실시예 16

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-AspOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6117.8, 계산치 6118.1.

실시예 17

N^εB29-(N-(Gly-OC(CH₂)₁₆CO-γ-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 L-GlyOtBu와 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트의 반응, 이어 TSTU로 활성화, L-GluOtBu와 반응, TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6189.2, 계산치 6189.2.

실시예 18

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-ε-L-LysCO-) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트와 L-Lys(Z)-OtBu의 반응, 이어 Pd/C를 통한 수소화, 4-니트로페닐 클로로포르메이트에 의한 제자리 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6189.2, 계산치 6189.2.

실시예 19

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-Glu(OtBu)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6132.1, 계산치 6132.2.

실시예 20

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-α-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-Asp(OtBu)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6117.8, 계산치 6118.1.

실시예 21

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₅CO-β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 헵타데칸디오에이트와 L-Asp(OtBu)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6104.2, 계산치 6104.1.

실시예 22

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-γ-D-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 D-GluOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6132.4, 계산치 6132.2.

실시예 23

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-δ-L-Aad) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 L-AadOtBu(AcOtBu/BF₃OEt₂로 tert-부톡시화 및 메틸 에스테르의 비누화에 의하여 상업적인 L-Aad(OMe)로부터 제조)의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6116.9, 계산치 6118.1.

실시예 24

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₃CO-β-L-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 펜타데칸디오에이트와 L-AspOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6074.7, 계산치 6076.1.

실시예 25

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₃CO-β-L-Glu) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 펜타데칸디오에이트와 L-GluOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6080.6, 계산치 6076.1.

실시예 26

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-β-D-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트와 D-AspOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6089.1, 계산치 6090.1.

실시예 27

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₆CO-β-D-Asp) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 숙신이미딜 옥타데칸디오에이트와 D-AspOtBu의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였다. LCMS 6117.1, 계산치 6118.1.

실시예 28

N^εB29-(N-HOOC(CH₂)₁₄CO-IDA) des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 tert-부틸 3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-복조트리아진-3-일 헥사데칸디오에이트와 이미노디아세트산의 반응, 이어 TSTU로 활성화, des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 4와 유사하게 제조하였 다. LCMS 6089.1, 계산치 6090.1.

실시예 29

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(카르복시메틸)-β-Ala] des(B30) 인간 인슐린의 합성

A1N, B1N-diBoc DesB30 인간 인슐린(Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochmical Journal, 1995, 312, 725-731) (186mg, 0.031mmol)을 DMSO(1.8ml)에 용해하였다. THF(1.8ml)에서의 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OSu (27mg, 0.04mmol) 및 트리에틸아민(0.045ml, 0.31mmol)을 첨가하였다 (pH는 10이었다). 45분 동안 실온에서 느리게 휘저은 후, 반응을 THF(0.20ml)에서 0.2M 메틸아민으로 담금질하였다. 물(5ml)을 첨가하였고, pH를 1N HCl로 5.5까지 조절하였다. 등전위 침전물을 원심분리에 의해 수집하였고 동결건조하여 150mg을 얻었다. 결합 수율은 74%이었다 (LCMS m/z: 2148.9[(M+3)/3], rt 5.04). 보호된 생성물을 TFA(2.5ml)에 용해하였고, 1시간 동안 방치하였고, 진공속에서 증발시켰다. 정제되지 않은 생성물을 C4 칼럼, 버퍼 A(0.1% TFA), 버퍼 B(MeCN+0.1% TFA), 기울기 10-70% B 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 수집된 분획을 동결건조하였다. 수율은 75mg, 52%이었다. HPLC에 의해 측정된 순도는 97.2%이었다.

MALDI-MS: 6132.1, 계산치:6132.2

옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OSu의 제조

옥타데칼이산(5.64g, 17.9mmol)을 115℃에서 톨루엔(80ml)에 용해하였다. N,N-디메틸포름아미드 디-tert-부틸아세탈(12.9ml, 53.8mmol)을 1.5시간에 걸쳐 한방울씩 첨가하였다. 3시간 동안 환류한 후, N,N-디메틸포름아미드 디-tert-부틸아세탈(2.15ml)을 20분에 걸쳐 더 첨가하였다. 환류를 밤새 진행하였고, N,N-디메틸포름아미드 디-tert-부틸아세탈(2.15ml)을 20분에 걸쳐 더 첨가하였다. 2시간 동안 휘저은 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각하였다. 물과 DCM을 첨가하였다. 이산을 여과하여 제거하였다. 여과물을 실리카겔(40g) 상에서 농축하였고, DCM/MeOH 14:1을 사용하는 1.5L 실리카겔 캄럼상에서 정제하였다. 옥타데칸이산 모노-tert-부틸 에스테르를 53% 수율(3.52g)로 분리하였다.

LC-MS: 393(M+Na), rt 6.40

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1.22(br s, 24H), 1.38(s, 9H), 1.47(m, 4H), 2.14(t, 2H), 2.18 ppm(t, 2H).

건조 THF(8ml)에서의 모노-tert-부틸 옥타데칸디오에이트(1.00g, 2.7mmol)의 용액에, DIPEA(0.555ml, 3.2mmol)을 첨가하고, 이후 TSTU(1.00g, 3.2mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 질소하에서 휘저었다. 용매를 증발시켰다. AcOEt를 잔류물에 첨가하였고, 결과의 현탁액을 여과하였다. 여과물을 찬 0.1M HCl(2x) 및 물로 세척하고, 건조하고, 농축하여 숙신이미딜 tert-부틸-옥타데칸디오에이트을 흰 고체로서 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃): δ 1.25(m s, 20H), 1.39(m, 2H), 1.44(s, 9H), 1.58(m, 4H), 1.74(p, 2H), 2.2(t, 2H), 2.60(t, 2H), 2.85 ppm(m, 2H).

건조 DMF(6ml)에서의 H-Gly-OtBu(1.00g, 6.0mmol)의 현탁액에 트리에틸 아민(0.835ml, 6.0mmol)을 첨가하였다. 트리에틸 아민 히드로클로라이드의 침전을 관찰하였다. DMF(6ml)에서의 벤질 아크릴레이트(0.910ml, 6.0mmol)의 용액을 첨가하였다. 결과의 현탁액을 2일 동안 실온에서 휘저었다. 침전물을 여과에 의해 제거하였고, 여과물을 농축하였다. 잔류물을 AcOEt에 용해하였고, 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 유기층을 건조(MgSO₄)하고, 여과하고, 농축하여 순수한 기름을 얻었고, 이것을 용리액으로 AcOEt/헵탄 1:3 및 1:1을 사용하는 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. N-tert-부톡시카르보닐메틸-β-Ala-OBn을 29% 수율(0.505g)으로 분리하였다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.43(s, 9H), 2.55(t, 2H), 2.92(t, 2H), 3.30(s, 2H), 5.15(s, 2H), 7.65(m, 5H).

숙신이미딜 tert-부틸 옥타데칸디오에이트(0.15g, 0.32mmol) 및 N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OBn(0.10g, 0.32mmol)을 건조 DMF(2.5ml)에 용해하였고, DIEA(0.070ml, 0.38mmol)을 첨가하였다. 30분 동안 질소하에서 휘저은 후, HOAt(0.045g, 0.32mmol)을 첨가하였고, 혼합물은 황색으로 변하였다. 13일 동안 편리하게 질소하의 실온에서 계속 휘저었다. 반응 혼합물을 농축하였다. AcOEt에 용해한 잔류물을 0.1N HCl(2x) 및 물로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)하고, 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OBn을 흰 기름으로 얻었다. 수율 99%, 205mg.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: ppm 1.25(m, 26H), 1.45(s, 9H), 1.50(s, 9H), 1.6(m, 4H), 2.20(t, 2H), 2.40(t, 2H), 2.75(q, 2H), 3.62(t, 2H), 3.97(s, 2H), 5.20(s, 2H); 7.35(m, 5H)

tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OBn (200mg, 0.31mmol)을 EtOAc(10ml) 및 THF(5ml)에 용해하였다. 10% Pd/C를 첨가하였고, 혼합물을 13시간 동안 1기압에서 수소화하였다. 반응 혼합물을 여과하고 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OH를 순수한 기름으로 얻었다. 수율 180mg, 100%.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.25(m, 26H), 1.45(s, 9H), 1.50(s, 9H), 1.6(m, 4H), 2.20(t, 2H), 2.40(t, 2H), 2.70(m, 2H), 3.65(m, 2H), 4.05(s, 2H).

tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OH (0.110g, 0.2mmol)을 건조 THF(2ml)에 용해하였다. DIEA(0.045ml, 0.24mmol) 및 TSTU(0.075g, 0.24mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 18시간 동안 질소하에서 휘저었다. 반응 혼합물을 여과하였다. AcOEt를 여과물에 첨가하였고, 0.2M HCl(2x), 염수(1x)로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)하고, 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N- (tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OSu를 순수한 시럽으로 얻었다. 수율 124mg, 96%.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.25(m, 26H), 1.40(s, 9H), 1.57(s, 9H), 1.6(m, 4H), 2.40(m, 4H), 2.58(br s, 4H), 3.0(t, 2H), 3.7(t, 2H), 4.03(s, 2H).

실시예 30

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(2-카르복시에틸)-Gly] des(B30) 인간 인슐린의 합성

A1N, B1N-diBoc DesB30 인간 인슐린(Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochmical Journal, 1995, 312, 725-731) (120mg, 0.020mmol)을 DMSO(1.2ml)에 용해하였다. THF(1.2ml)에서의 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OSu(16mg, 0.025mmol) 및 트리에틸아민(0.033ml, 0.24mmol)을 첨가하였다 (pH는 10이었다). 3시간 20분 동안 실온에서 느리게 휘저은 후, 물(4ml)을 첨가하였고, pH를 1N HCl로 5.5까지 조절하였다. 등전위 침전물을 원심분리에 의해 수집하고 물로 세척하고 원심분리에 의해 분리하였다. 생성물을 동결건조하였다. 정제되지 않은 생성물을 C18칼럼, 버퍼 A(0.1% TFA), 버퍼 B(MeCN+0.1% TFA), 기울기 20-90% B 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 최적화되지 않은 결합 수율은 15mg, 11% (MALDI-MS 6441, 계산치 6444.5)이었다. 보호된 생성물을 TFA(1ml)에 용해하였고, 1시간 동안 방치하였고, 진공속에서 증발시켰다. 정제되지 않은 생성물을 C4 칼럼, 버퍼 A(0.1% TFA), 버퍼 B(MeCN + 0.1% TFA), 기울기 10-80% B 상에서 RP-HPLC에 의해, 그리고 C4 칼럼, 버퍼 A(20% EtOH + 0.1% TFA), 버퍼 B(80% EtOH + 0.1% TFA), 기울기 15-60% B 상에서 RP-HPLC에 의해, 이어서, C4 칼럼, 버퍼 A(10mM Tris + 15mM 20% EtOH에서의 황산암모늄, pH 7.3), 버퍼 B(80% EtOH), 기울기 15-60% B 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 수집된 분획을 70% 아세토니트릴 + 0.1% TFA로 Sep-Pak상에서 탈염하고, 암모니아의 첨가로 중화하고, 동결건조하였다. 최적화되지 않은 수율은 1.8mg, 13%이었다. HPLC에 의해 측정된 순도는 96.4%이었다.

MALDI-MS: 6132.1, 계산치:6132.2

tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OSu의 제조

H-Gly-OBn, HCl(3.03g, 15mmol)을 건조 DMF(15ml)에 용해하였고, 얼음욕조에서 냉각하였다. TEA(2.10, 15mmol)을 TEA-염화수소의 침전하에서 첨가하였다. t-부틸 아크릴레이트(2.20ml, 15mmol)이 첨가되기 전에 현탁액을 5분 동안 휘저었다. 냉각욕조로 인하여 실온으로 서서히 도달하였고, 2일 동안 질소하에게 계속 휘저었다. 반응 혼합물을 여과하였고, 여과물을 농축하였다. 여전히 DMF를 함유하는 잔류물을 AcOEt에 용해하였고, 포화 aq. NaHCO₃(2x) 및 물(1x)로 세척하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄) 전에 여과하였고, 농축하여 황색 기름을 얻었다. 플래시 크로마토그래피 또는 예비 HPCL에 의해 정제하여 N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OBn을 순수한 기름(0.739g, 17%)으로 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.46(s, 9H) 2.50-2.61(m, 2H) 2.82-2.99(m, 2H) 3.31(s, 2H) 5.14(s, 2H) 7.29-7.43(m, 5H).

N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OBn(0.030g, 0.1mmol) 및 tert-부틸옥타데칸디오에이트(실시예 29에 기재, 0.050mg, 0.1mmol)을 건조 DMF(1ml)에 부유시켰다. HOAt(0.014g, 0.1mmol) 및 DIEA(0.21ml, 1.2mmol)을 첨가하였다. 황색의 반응 혼합물을 42시간 동안 질소하에서 휘저었다. 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 AcOEt에 재용해하고, 0.1N HCl(2x), 물(1x)로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)하고, 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OBn을 85% 수율(55mg)로 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.3(m, 26H) 1.38(s, 9H), 1.46(s, 9H), 1.6(m, 4H), 2.2(m, 2H), 2.35(m, 2H), 2.65(m, 2H), 2.85(s, 2H) 3.65(m, 2H), 5.15(s, 2H), 7.35(m, 5H).

tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OBn (0.054g, 0.08mmol)을 THF(2ml)에 용해하였다. 목탄 상의 10% 팔라듐을 첨가하였고, 혼합물을 주말 내내 1기압, 실온에서 수소화하였다. 건조 반응 혼합물을 AcOEt에 용해하고 3시간 동안 여과하여 탄소를 제거하였다. 여과물을 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OH를 80% 수율(37mg)으로 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.3(m, 26H), 1.40(s, 9H), 1.46(s, 9H), 1.6(m, 4H), 1.75(p, 2H), 2.2(m, 2H), 2.35(m, 2H), 2.63(m, 2H), 2.83(s, 2H).

tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OH (0.07mmol)을 건조 THF(2ml)에 용해하였다. TSTU(24mg, 0.08mmol) 및 DIPEA(15uL, 0.08mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소하의 실온에서 휘저었다. 19시간 후, 반응을 TLC(DCM/MeOH 10:1)에 따라 완결하지 않았다. DIEA를 더 첨가(20uL, 0.11mmol)하였고, 계속 휘저었다. 42시간 후, 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 AcOEt로 희석하고, 0.1N HCl(2x) 및 염수(1x)로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)하고, 농축하여 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OSu를 흰 고체로서 84% 수율(36mg)으로 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: ppm 1.3(m, 26H), 1.40(m, 2H), 1.44(s, 9H), 1.46(s, 9H), 1.58(m, 2H), 1.73(p, 2H), 2.2(t, 2H), 2.60(t, 2H), 2.8(m, 6H).

실시예 31

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(카르복시에틸)-Gly] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OBn과 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트(실시예 4에 기재)의 반응, 이어 탈벤질화, TSTU로 활성화, A1N, B1N- diBOC-des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 30과 유사하게 제조하였다.

MALDI-MS: 6093.0, 계산치 6104.1.

실시예 32

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(카르복시메틸)-β-Ala] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-β-Ala-OBn과 숙신이미딜 헥사데칸디오에이트(실시예 4에 기재)의 반응, 이어 탈벤질화, TSTU로 활성화, A1N, B1N-diBOC-des(B30) 인간 인슐린과 결합 및 TFA에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 29와 유사하게 제조하였다.

MALDI-MS: 6097.6, 계산치 6104.1.

실시예 33

N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO-γ-L-Glu] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 아실화제로서 하기 기재된 대로 제조된, (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu(OSu)-OMe를 사용하여 실시예 1에 기재된 것과 유사하게 제조하였다.

LCMS(전기분무): M+3: 2049, 계산치 2050; M+4: 1538, 계산치 1537.8; M+5: 1231, 계산치 1230.4.

MALDI-TOF MS: 계산치: 6147; 확인치: 6153.

(MeOOC(CH ₂ ) ₁₁ )NHCO(CH ₂ ) ₃ CO)-Glu(OSu)-OMe의 제조

MeOH(40ml)를 0-5℃로 냉각하였고, SOCl₂(4ml)을 30분 동안 휘저으면서 한방울씩 첨가하였다. 12-아미노도데칸산(3g, 13.9mmol)을 첨가하였고, 결과의 현탁액을 0-5℃에서 휘저었다. 그 동안 냉각욕조에 얼음이 녹으면서 16시간 동안 실온으로 따뜻해졌다. 혼합물을 여과하고, 고체를 흡입에 의해 건조하여 2.23g(60%)의 12-아미노도데칸산 메틸 에스테르 염화수소를 얻었다. 모액(mother liquor)으로부터 0.92g(25%)의 여분의 배치(batch)를 분리하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 7.97(bs, 3H), 3.58(s, 3H), 2.73(m, 2H), 2.28(t, 2H), 1.52(m, 4H), 1.25("s", 14H).

12-아미노도데칸산 메틸 에스테르 염화수소(1g, 3.8mmol)을 THF(15ml)에 부유사켰고, 글루타르산 무수물(1.29g, 3.8mmol) 및 TEA(0.52ml, 3.8mmol)을 첨가하였고, 결과의 혼합물(현탁액)을 16시간 동안 실온에서 휘저었다. 물(75ml)을 점차적으로 첨가하였다. 25ml후, 용액을 얻었고, 뒤에 현탁액이 나타났다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 휘저었고 여과하였다. 고체를 물로 세척하였고, 진공속에서 건조하였다. 1.02g(80%)의 12-(4-카르복시부티릴아미노)도데칸산 메틸 에스테르를 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 12(bs, 1H), 7.73(t, 1H), 3.57(s, 3H), 3.00(q, 2H), 2.28(t, 2H), 2.18(t, 2H), 2.06(t, 2H), 1.69(p, 2H), 1.50(p, 2H), 1.36(p, 2H), 1.23("s", 14H).

12-(4-카르복시부티릴아미노)도데칸산 메틸 에스테르(0.33g, 0.95mmol)을 THF와 DMF의 혼합물(2:1, 6ml)에 용해하였고, DIEA(0.178ml, 1.04mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃까지 냉각하였고, TSTU(0.314g, 1.04mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 0-5℃에서, 16시간 동안 실온에서 휘저었다. 혼합물을 진공속에서 건조하여 농축하였다. 잔류물(OSu-활성 12-(4-카르복시부티릴아미노)도데칸산 메틸 에스테르)를 DMF(10ml)에 용해하였고, DIEA(0.24ml, 1.4mmol) 및 H-GluOMe(0.168g, 1.04mmol)을 첨가하였고, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 휘저었다. 혼합물을 진공에서 농축하였고, 잔류물을 AcOEt(100ml)에 용해하고, 0.2M 염산(3×50ml)로 세척하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하였다. 0.358g(78%)의 (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO-Glu-OMe를 얻었다.

¹H-NMR(DMSO-d₆), δ: 12(bs, 1H), 8.22(d, 1H), 7.73(t, 1H), 4.24(m, 1H), 3.61(s, 3H), 3.57(s, 3H), 3.00(q, 2H), 2.27(m, 4H), 2.10(t, 2H), 2.04(t, 2H), 1.9(m, 1H), 1.8(m, 1H), 1.68(t, 2H), 1.50(m, 2H), 1.36(m, 2H), 1.23("s", 14H).

(MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO-Glu-OMe(0.36g, 0.36mmol)을 THF(10ml)에 용해하였고, 0-5℃까지 냉각하였다. DIEA(0.13ml) 및 TSTU(0.129g, 0.43mmol)을 첨가하 였고, 혼합물을 3시간 동안 0-5℃에서, 3시간 동안 실온에서 휘저었다. 혼합물을 진공속에서 농축하였다. 잔류물을 AcOEt(100ml)에 용해하고, 0.2N 염산(3×50ml) 및 포화 수성 NaHCO₃(3×100ml)로 세척하였다. 건조(Na₂SO₄) 및 진공속에서 농축하여 0.17g(84%)의 (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₃CO)-Glu(OSu)-OMe를 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆), 선택 피크, δ: 8.27(d, 1H), 7.72(t, 1H), 4.31(m, 1H), 3.63(s, 3H), 3.57(s, 3H), 3.00(q, 2H), 2.81(s, 4H), 2.28(t, 2H), 2.12(t, 2H), 2.05(t, 2H), 1.70(m, 2H), 1.50(m, 2H), 1.35(m, 2H), 1.23("s", 14H).

실시예 34

N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₂CO-γ-L-Glu] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 아실화제로서 글루타르산 무수물 대신 숙신산 무수물을 이용하여 실시예 33에 기재된 것과 유사하게 제조된, (MeOOC(CH₂)₁₁)NHCO(CH₂)₂CO)-Glu(OSu)-OMe를 사용하여 실시예 1에 기재된 것과 유사하게 제조하였다.

MALDI-TOF MS: 계산치: 6133; 확인치: 6134.

실시예 35

N^εB29-[N^α-(HOOC(CH₂)₁₆CO)]-Gly-γ-L-Glu des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 아실화제로서 하기 기재된 대로 제조된, tert-부틸 옥타데칸디오일-Gly-Glu(OSu)-OtBu을 사용하여, 실시예 4에 기재된 것과 유사하게 제조하였 다.

MALDI-TOF MS: 계산치: 6189; 확인치: 6191.

tert-부틸 옥타데칸디오일-Gly-Glu(OSu)-OtBu의 제조

Z-Gly-OH(1.0g, 4.78mmol)을 THF(10ml), DIEA(0.98ml, 5.74mmol), 및 TSTU(1.7g, 5.74mmol)에 첨가하였고, 결과의 혼합물을 2시간 동안 실온에서 휘저었다. AcOEt(100ml)을 첨가하였고, 혼합물을 0.2N 염산(100ml) 및 물(2×100ml)로 세척하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하여 1.34g(92%)의 Z-Gly-OSu을 기름으로 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃), δ: 7.35(s, 5H), 5.32(t, 1H), 5.15(s, 2H), 4.35(d, 2H), 2.83(s, 4H).

Z-Gly-OSu(1.3g, 4.25mmol)을 DMF(15ml) 및 DIEA(1.82ml, 10.6mmol)에 용해하였고, H-Glu-OtBu(0.949g, 4.67mmol)을 첨가하였고, 결과의 혼합물을 16시간 동안 실온에서 휘저었다. AcOEt(100ml)을 첨가하였고 혼합물을 0.2N 염산(100ml) 및 물(2×100ml)로 세척하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하여 1.7g(quant.)의 Z-Gly-Glu-OtBu를 기름으로 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃), δ: 7.33(s, 5H), 7.1(d, 1H), 5.80(t, 1H), 5.12(s, 2H), 4.53(m, 1H), 3.90(d, 2H), 2.36(t, 2H), 2.22(m, 1H), 1.95(m, 1H), 1.45(s, 9H).

Z-Gly-Glu-OtBu(1.7g, 4.3mmol)을 1,4-디옥산(15ml)에 용해하였고, 질소하에 서 10% 팔라듐 블랙(0.6g)을 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 대기압에서 수소화하였다. 혼합물을 여과하였고, 팔라듐을 2시간 동안 물(200ml)로 휘저었고, 여과하였고, 여과물을 동결건조하였다. 0.65g(58%)의 H-Gly-Glu-OtBu를 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆), 선택 피크, δ: 8.31(d, 1H), 2.20(t, 2H), 1.91(m, 1H), 1.80(m, 1H), 1.40(s, 9H).

H-Gly-Glu-OtBu(0.15g, 0.58mmol을 DMF(5ml) 및 DIEA(0.15ml, 0.86mmol)에 부유시켰고, 숙신이미딜 tert-부틸 옥타데칸디오에이트(0.27g, 0.58mmol)을 첨가하였고, 결과의 혼합물을 16시간 동안 실온에서 휘저었다. AcOEt(50ml)을 첨가하였고, 혼합물을 0.2N 염산(100ml) 및 물(3×100ml)로 세척하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하여 0.34g(quant.)의 tert-부틸 옥타데칸디오일-Gly-Glu-OtBu를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃), δ: 7.11(d, 1H), 6.55(t, 1H), 4.55(dt, 1H), 4.00(dq, 2H), 2.40(t, 2H), 2.26(t, 2H), 2.20(t, 4H), 2.00(m, 1H), 1.57-1.65(m, 5H), 1.47(s, 9H), 1.44(s, 9H), 1.25("s", 22H, HDO와 포개짐).

tert-부틸 옥타데칸디오일-Gly-Glu-OtBu(0.32g, 0.52mmol)을 THF(5ml)에 용해하였고, DIEA(0.11ml, 0.63mmol) 및 TSTU(0.19g, 0.63mmol)을 첨가하였고, 결과의 혼합물을 3일 동안 질소하의 실온에서 휘저었다. AcOEt(100ml)을 첨가하였고, 혼합물을 0.15N 염산(100ml) 및 물(3×100ml)로 세척하였다. 유기층을 건조 (Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하여 0.3g(81%)의 tert-부틸 옥타데칸디오일-Gly-Glu(OSu)-OtBu를 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃), 선택 피크, δ: 6.89(d, 1H), 6.44(t, 1H), 4.60(m, 1H), 3.95(dq, 2H), 2.86(s, 4H), 2.68(q, 2H), 2.24(t, 2H), 2.20(t, 4H), 1.57-1.65(m, 5H), 1.48(s, 9H), 1.44(s, 9H), 1.25("s", 22H, HDO와 포개짐).

실시예 36

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N-(2-카르복시에틸)-β-Ala] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 15-[[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐)-에틸]-(2-메톡시카르보닐-에틸)-카르바모일]-펜타데칸산 메틸 에스테르와 des(B30) 인간 인슐린의 결합 및 NaOH에 의한 탈보호반응을 통하여, 실시예 1과 유사하게 제조된다.

LC-MS: M+4. 1530.3, 계산치 1529.5.

메틸 헥사데칸디오일 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OSu의 제조

H-β-Ala-OMe 염화수소(5.45g, 39mmol)을 DMSO(100ml)에 용해하였고, tert-부틸 아실레이트(5.71ml, 39mmol) 및 DIEA(13.4ml, 78mmol)을 첨가하였고, 결과의 혼합물을 6일 동안 실온에서 휘저었다. 혼합물을 물(500ml)과 AcOEt(2×250ml) 사이에서 분할하였다. 결합된 유기층을 포화 수성 NH₄Cl로 세척하고, 건조(MgSO₄)하고, 진공속에서 농축하였다. 7.24g(80%)의 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala- OtBu을 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) δ: 3.58(s, 3H), 2.72(t, 2H), 2.67(t, 2H), 2.41(t, 2H), 2.29(t, 2H), 1.39(s, 9H).

헥사데칸이산 모노메틸 에스테르(150mg, 0.5mmol)을 DMF(5ml)에 용해하였다. HOAt(102mg, 0.75mmol) 및 EDAC(143mg, 0.75mmol)을 첨가하였고, 혼합물을 1시간 동안 50℃에서 휘저었다. 실온까지 냉각한 후, DIEA(0.256ml, 1.5mmol) 및 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OtBu(139mg, 0.6mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 휘저었다. 혼합물을 물(2×50ml)과 AcOEt(100ml) 사이에서 분할하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하여 기름이 되었다. DCM(10ml) 및 TFA(10ml)을 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 휘저었고, 용매를 진공속에서 제거하여 170mg(87%)의 메틸 헥사데칸디오일 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OH를 얻었다.

LC-MS: 458 (M+1).

메틸 헥사데칸디오일 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OH(161mg, 0.351mmol)을 THF(10ml)에 용해하였다. DIEA(0.073ml, 0.42mmol) 및 TSTU(127mg, 0.42mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음욕조 상에서 냉각하면서 휘저었고, 이어 실온에서 2시간 동안 휘저었다. 혼합물을 AcOEt(100ml)와 수성 HCl(0.2N, 2×80ml) 사이에서 분할하였다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)하고, 진공속에서 농축하였다. 140mg(72%)의 메틸 헥사데칸디오일 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β- Ala-OSu를 기름으로 얻었다.

LC-MS: 555 (M+1).

실시예 37

N^εB29-[N-(HOOC(CH₂)₁₆CO)-N-(2-카르복시에틸)-β-Ala] des(B30) 인간 인슐린의 합성

이 화합물은 메틸 옥타데칸디오일 N-(2-메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OSu와 des(B30) 인간 인슐린의 결합 및 NaOH에 의한 탈보호반응을 통하여 실시예 1 및 36과 유사하게 제조하였다.

메틸 옥타데칸디오일 N-(2-메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OSu의 제조

이 화합물은 옥타데칸이산 모노 메틸 에스테르를 사용하여 메틸 헥사데칸디오일 N-(2-(메톡시카르보닐)에틸)-β-Ala-OSu와 유사하게 합성하였다.

MALDI-TOF MS: 계산치 6146; 확인치: 6151

LC-MS: 583 (M+1)

약리학적 방법

측정법(I)

본 발명의 인슐린 유도체의 인슐린 수용체 결합

인간 인슐린 수용체에 대한 본 발명의 인슐린 유사체의 친화도는 SPA 측정법(섬광근접측정법) 및 마이크로타이터플레이트 항체 포획 측정법에 의해 측정하였다. SPA-PVT 항체-결합 비드, 항-마우스 약품(Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)을 25ml의 결합 버퍼(100mM HEPES pH 7.8; 100mM 염화나트륨, 10mM MgSO₄, 0.025% Tween-20)와 혼합하였다. 단일 Packard Optiplate(Packard No. 6005190)에 대한 약품 혼합물은 2.4㎕의 1:5000 희석 정제된 재조합 인간 인슐린 수용체-엑손 11, 100㎕당 5000cpm의 약품 혼합물에 상응하는 양의 A14 Tyr[¹²⁵I]-인간 인슐린의 스톡 용액, 12㎕의 F12 항체 1:1000 희석, 3ml의 SPA-비드 및 총 12ml에 대한 결합 버퍼로 구성된다. 그런후 총 100㎕이 추가되고, 희석 연속물을 적절한 샘플로부터 만든다. 그런후, 희석 연속물에 100㎕의 약품 혼합물을 첨가하고, 샘플을 천천히 흔들면서 16시간 동안 배양하였다. 그런후 상을 1분 동안 원심분리에 의해 분리하였고, 플레이트를 탑카운터(Topcounter)에서 계산하였다. 결합 데이터는 GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego, CA)에서 비선형 회귀 알고리즘을 사용하여 맞추었다.

단일클론의 mIR 항체의 제조

특이적 항체(F12)를 단일클론 기술에 의해 생산하였다: RBF 마우스를 FCA에 50㎍의 정제된 mIR을 피하주사하고 이어 FIA에 20㎍의 mIR로 2번 주사하여 면역성을 주었다. 고응답 마우스에 25㎍의 mIR을 정맥으로 밀어넣었고, 3일 후에 비장을 채취하였다. 비장 세포를 골수종 여우 세포주와 융합하였다 (Kohler, G & Milstein C.(1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al(1983), Science 219:1228-30). 상청액을 mIR 특이적 ELISA에서 항체 생성에 대하여 선별하였다. 양성 웰을 복제하였고 웨스턴 블롯법으로 테스트하였다.

측정법(II)

인간 인슐린에 대한 본 발명의 인슐린 유도체의 효능

실험일에 238-383g의 무게가 나가는 스프라그 다울리 수컷 쥐를 클램프 실험을 위하여 사용하였다. 쥐는 조절된 주위 조건하에서 사료에 자유롭게 접근하였고 클램프 실험 전에 밤새(3pm으로부터) 단식하였다.

실험 프로토콜

수술 과정 전에 적어도 1주일 동안 동물 시설에서 순응시켰다. 크램프 실험 약 1주 전에, 타이곤(Tygon) 카테터를 할로세인 마취하에서 목정맥(주입용) 및 목동맥(혈액 추출용)으로 삽입하있고, 몸 밖으로 내었고, 목 뒤에 고정하였다. 쥐를 스트렙토실린 동물병원(Boehringer Ingelheim; 0.15ml/쥐, i.m.)에 수술후에 넘겼고, 회복기간 동안 동물 보관장치(25℃)에 두었다. 진통을 얻기 위하여, 아노핀(Anorphin)(0.06mg/쥐, s.c.)를 마취 동안 투여하였고, 리마딜(Rimadyl)(1.5mg/kg, s.c.)을 마취(2-3시간)에서 완전환 회복 후에 다시 2일 동안 매일 한번씩 투여하였다.

사용된 클램프 기술은 (1)로부터 순응되었다. 실험일 7am에 밤새 단식한(전날 3pm부터) 쥐를 무게를 달았고 추출 주사기 및 주입 시스템(하버드 22 기본 펌프, 하버드, 및 퍼펙텀 피하 주사용 유리 주사기, 알드리치)에 연결시키고, 그런후 실험 시작 전 약 45분 동안 쉬는 개별 클램프 우리에 두었다. 쥐는 전체 실험 동안 그것들의 보통의 깔개 상에서 자유롭게 움직일 수 있었고, 음료수에 자유롭게 접근하였다. 혈장 글루코오스 농도가 10분 간격으로 측정되는 30분 기초 기간 후에, 테스트될 인슐린 유도체 및 인간 인슐린(쥐당 한번의 투여농도, n=투여 농도당 6-7)을 300분 동안 일정한 속도로 주입(i.v.)하였다. 혈장 글루코오스 농도를 10분 간격으로 처음부터 끝까지 측정하였고, 20% 수성 글루코오스의 주입을 정상혈당(euglyceamia)을 유지하기 위하여 적절히 조절하였다. 재부유된 적혈구 샘플을 각각의 쥐로부터 합동하였고, 경동맥 카테터를 통하여 약 1/2 ml 부피로 되돌려 보냈다.

각 실험날에, 테스트될 개별 인슐린 유도체 용액 및 인간 인슐린 용액의 샘플을 클램프 실험 전과 후에 수집하였고, 펩티드의 농도를 HPLC에 의해 확인하였다. 쥐 인슐린 및 C-펩티드의 혈장 농도 그리고 테스트될 인슐린 유도체 및 인간 인슐린의 혈장 농도를 실험 전과 후에 적절한 시간 지점에서 측정하였다. 펜토바르비탈 과투여를 사용하여 실험 후에 쥐를 죽였다.

테스트 화합물 및 투여량

테스트될 인슐린을 5mM 인산염 pH 7.7에서 97μM의 인슐린 유도체를 함유한 스톡 용액으로부터 희석하였다. 사용될 준비가 된 용액에서 최종 농도는 0.45μM의 인슐린 유도체, 5mM의 인산염, 100mM의 염화나트륨, 0.007%의 폴리소르베이트 20이었다. pH는 7.7이었고, i.v. 주입 속도는 15 및 20 pmol·min^-1·kg^-1이었다.

참고 화합물로 사용되는 인간 인슐린의 스톡 용액을 유사한 매질에서 제제화하였고, 6, 15 또는 30pmol·min^-1·kg^-1에서 주입하였다.

양 스톡 용액은 -20℃에서 저장하였고, 사용 전에 4℃에서 밤새 해동하였다. 용액은 주입 주사기에 수송되기 전에 15분 동안 여러번 아래위로 천천히 돌려주었다.

측정법(III)

돼지에서 본 발명의 인슐린 유도체의 T _50% 의 측정

T_50%은 테스트될 인슐린의 A14 Tyr[¹²⁵I] 표지가 붙은 유도체의 주입량의 50%가 외부 γ-카운터로 측정되는 주입 지점으로부터 사라지는 시간이다.

실험실 동물 보관의 원칙은 다음과 같았다. 특이성 병원균 없는 LYYD, 당뇨병 없는 암컷 돼지, 덴마크 랜드레이스, 요크셔 및 두록의 잡종을 약물 동역학 및 약물 역학 연구에 대하여 사용하였다. 돼지는 의식이 있으며, 4-5달 연령이고, 70-95kg이 나간다. 동물은 실험 전 18시간 동안 밤새 단식시켰다.

125I로 TyrA14에서 표지가 붙은 인슐린 유도체의 제조된 조제물을 이전에 기재된 대로 돼지에 피하 주입하였다 (Ribel, U., Jorgensen, K, Brange, J, and Henriksen, U. 사람의 피하 인슐린 흡수의 모델로서의 돼지(The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man), Serrano-Rios, M and Lefebvre, P. J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (학회보)).

실험 시작할 때, 60nmol의 본 발명에 따른 인슐린 유도체(테스트 화합물)의 투여량 및 60mmol의 인슐린 데테머(detemir) (둘 모두 TyrA14에서 125I 표지가 붙음)를 각각의 돼지의 목에서 2개의 떨어진 부위에 주입하였다.

피하 주입으로부터 방사능 표지의 소멸을 정통적인 외부 감마-카운팅 방법의 변형을 이용하여 모니터하였다 (Ribel, U. 인슐린 유사체의 피하 흡수(Subcutaneous absorption of insulin analogues). Berger, M. and Gries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (학회지)). 이러한 변형된 방법으로, 무선 휴대용 장치를 이용하여 며칠동안 피하 저장소로부터 방사능의 소멸을 연속적으로 측정하는 것이 가능하였다 (덴마크 디케이-3500 배르뢰제 스칸시스 연구기술실(Scancys Laboratorieteknik, Vaerlose, DK-3500, Denmark)). 측정은 1분 간격으로 수행하였고, 측정값은 배후방사능에 대하여 보정하였습니다.

표 4에서, "테스트/데테머" 칼럼은 각각의 테스트되는 화합물("테스트")에 대하여 확인된 T_50% 및 동일한 실험에서 인슐린 데테머("데테머")에 대하여 확인된 T_50%를 나타낸다.

Claims

B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착된 곁사슬을 가지는, 자연발생 인슐린 또는 그 유사체인 인슐린 유도체로서, 곁사슬은 하기 일반식으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.

(화학식)

-W-X-Y-Z

상기식에서 W는:

* 곁사슬에서 카르복실산기를 가지는 α아미노산 잔기, 이러한 잔기는 그것의 카르복실산기 중 하나와 함께, B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 더불어 아미드기를 형성하거나;

* 아미드 결합을 통하여 함께 연결된 2개, 3개 또는 4개의 α아미노산 잔기로 구성된 사슬, 이러한 아미드 결합을 통한 사슬은 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 연결되어 있고, W의 아미노산 잔기는 중성 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 및 W가 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 가지도록 곁사슬에 카르복실산기를 가지는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되거나; 또는

* X로부터 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사 슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기로의 공유결합이며;

상기식에서 X는:

* -CO-;

* -CH(COOH)CO-;

* -N(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂ CO-; 또는

* -N(CH₂COOH)CH₂CH₂ CO- 이고, 이것은

a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 사슬일 때, 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 W에 있는 아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하거나, 또는

b) W가 공유결합일 때, 밑줄 친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통하여 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기 또는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기와 함께 아미드 결합을 형성하며;

상기식에서 Y는:

* -(CH₂)m-, 여기에서 m은 6 내지 32의 범위에서의 정수이거나;

* 1, 2 또는 3 -CH=CH-기 및 사슬에서 탄소원자의 총수를 10 내지 32의 범위로 주기 위하여 충분한 다수의 -CH₂-기를 포함하는 2가의 탄화수소 사슬이거나; 또는

* 식 -(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-의 2가 탄화수소 사슬, 여기에서 v 및 w는 정수이거나 또는 이들 중 하나가 0으로서 v 및 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있으며;

상기식에서 Z는:

* -COOH;

* -CO-Asp;

* -CO-Glu;

* -CO-Gly;

* -CO-Sar;

* -CH(COOH)₂;

* -N(CH₂COOH)₂;

* -SO₃H; 또는

* -PO₃H; 그리고

W가 공유결합이고 X가 -CO-일 때, Z가 -COOH와 다르다면, 이것의 임의의 Zn²⁺ 착물이다.
제 1항에 있어서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 모인슐린의 B사슬의 N말단 아미노산 잔기의 α아미노기에 부착되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, 곁사슬 -W-X-Y-Z는 모인슐린의 B사슬에 존재하는 Lys 잔기의 ε아미노기에 부착되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, W는 공유결합인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, W는 4 내지 10의 탄소원자를 가지는 α아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 5항에 있어서, W는 α-Asp, β-Asp, α-Glu, γ-Glu, α-hGlu 및 δ-hGlu로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, W는 2개의 α아미노산 잔기로 구성되며, 그 중 하나는 4 내지 10의 탄소원자 및 유리 카르복실산기를 가지고, 다 른 하나는 2 내지 11의 탄소원자를 가지지만 유리 카르복실산은 가지지 않는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 7항에 있어서, W는 α-Asp-Gly; Gly-α-Asp; β-Asp-Gly; Gly-β-Asp; α-Glu-Gly; Gly-α-Glu; γ-Glu-Gly; Gly-γ-Glu; α-hGlu-Gly; Gly-α-hGlu; δ-hGlu-Gly; 및 Gly-δ-hGlu로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, W는 독립적으로 4 내지 10의 탄소원자를 가지는 2개의 α아미노산 잔기로 구성되며, 둘 모두가 카르복실산기를 가지는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 9항에 있어서, W는 α-Asp-α-Asp; α-Asp-α-Glu; α-Asp-α-hGlu; α-Asp-β-Asp; α-Asp-γ-Glu; α-Asp-δ-hGlu; β-Asp-α-Asp; β-Asp-α-Glu; β-Asp-α-hGlu; β-Asp-β-Asp; β-Asp-γ-Glu; β-Asp-δ-hGlu; α-Glu-α-Asp; α-Glu-α-Glu; α-Glu-α-hGlu; α-Glu-β-Asp; α-Glu-γ-Glu; α-Glu-δ-hGlu; γ-Glu-α-Asp; γ-Glu-α-Glu; γ-Glu-α-hGlu; γ-Glu-β-Asp; γ-Glu-γ-Glu; γ-Glu-δ-hGlu; α-hGlu-α-Asp; α-hGlu-α-Glu; α-hGlu-α-hGlu; α-hGlu-β-Asp; α-hGlu-γ-Glu; α-hGlu-δ-hGlu; δ-hGlu-α-Asp; δ-hGlu-α-Glu; δ-hGlu-α-hGlu; δ-hGlu-β-Asp; δ-hGlu-γ-Glu; 및 δ-hGlu-δ-hGlu로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
전술한 한 중 어느 한 항에 있어서, X는 -CO- 또는 -CH(COOH)CO-인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, X는

* -N(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂COOH)CH₂CON(CH₂COOH)CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂CON(CH₂CH₂COOH)CH₂CH₂ CO-;

* -N(CH₂CH₂COOH)CH₂ CO-; 또는

* -N(CH₂COOH)CH₂CH₂ CO- 인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 -(CH₂)_m-이며, 여기에서 m은 6 내지 32, 8 내지 20, 12 내지 20 또는 12 내지 16의 범위에 있는 정수인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 -COOH인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 -CH(COOH)₂인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 -N(CH₂COOH)₂인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 -SO₃H인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 -PO₃H인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린은 A21 위치에서 Asn 또는 Gly를 가지는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린은 des(B1) 유사체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린은 des(B30) 유사체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린에서의 B29 위치가 Cys, Met, Arg 및 Lys를 제외한 임의의 암호화가능한 아미노산이 될 수 있으며, B30 위치의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린이 B29 위치에서 Thr을 가지고 B30 위치에서 Lys을 가지는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 모인슐린이 인간 인슐린; des(B1) 인간 인슐린; des(B30) 인간 인슐린; Gly^A21 인간 인슐린; Gly^A21 des(B30) 인간 인슐린; Asp^B28 인간 인슐린; 돼지 인슐린; Lys^B28Pro^B29 인간 인슐린; Gly^A21Arg^B31Arg^B32 인간 인슐린; 및 Lys^B3Glu^B29 인간 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, 인슐린 유도체가

으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
전술하는 항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체의 아연 착물로서, 각각의 인슐린 6분자체가 2개의 아연이온, 3개의 아연이온 또는 4개의 아연이온과 결합되 는 것을 특징으로 하는 아연 착물.
약제학적으로 수용가능한 담체와 함께 제 1항에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 포함하는, 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 당뇨병 치료를 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 수용가능한 담체와 함께, 즉효 작용을 가지는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로서 제 1항에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 포함하는, 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 당뇨병 치료를 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 수용가능한 담체와 함께 제 1항에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 당뇨병을 치료하는 방법.
약제학적으로 수용가능한 담체와 함께, 즉효 작용을 가지는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로서 제 1항에 따른 인슐린 유도체의 치료상 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에 있어서 당뇨병을 치료하는 방법.