NO340925B1

NO340925B1 - Nye insulinderivater

Info

Publication number: NO340925B1
Application number: NO20061026A
Authority: NO
Inventors: Ib Jonassen; Svend Havelund; Thomas Hoeg-Jensen; Peter Madsen; Ulla Bel-Madsen; Tina Møller Tagmose
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2017-07-17
Also published as: EP2264065A3; US20060183668A1; LU92213I9; US8828923B2; CA2531988C; WO2005012347A2; NO20061026L; AU2010200497B2; BE2013C038I2; PL2107069T3; BE2013C035I2; KR20060132543A; AU2004261353B2; BRPI0413276B1; CY2013027I2; FR13C0035I1; CY1113850T1; HUS1300033I1; US7615532B2; AU2010200497A1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår nye humane insulinderivater som er løselige ved fysiologiske pH-verdier og som har en forlenget virkningsprofil. Oppfinnelsen angår også farmasøytiske sammensetninger som inneholder dem.

Bakgrunn for oppfinnelsen

For tiden er behandlingen av diabetes, både type 1 diabetes og type 2 diabetes, i økende grad basert på såkalt intensiv insulinbehandling. Ifølge dette regimet blir pasientene behandlet med multiple daglige insulininjeksjoner som omfatter én eller to daglige injeksjoner med lengevirkende insulin for å dekke det basale insulinkravet, supplert med bolusinjeksjoner av et rasktvirkende insulin for å dekke insulinkravet som oppstår i forbindelse med måltider.

Lengevirkende insulinsammensetninger er velkjente innenfor den farmasøytiske industri. En type lengevirkende insulinsammensetninger omfatter således injiserbare vandige suspensjoner av insulinkrystaller eller amorft insulin. I disse sammensetningene vil de anvendte insulinforbindelsene typisk være protamininsulin, sinkinsulin eller protaminsinkinsulin.

Det er visse ulemper forbundet med bruken av insulinsuspensjoner. For å sikre en nøyaktig dosering, må således insulinpartiklene være homogent suspendert ved hjelp av forsiktig risting før et definert volum av suspensjonen kan trekkes ut fra en ampulle eller drives ut fra en patron. Også ved lagring av insulinsuspensjoner må temperaturen holdes innenfor trangere grenser enn det som brukes for insulinløsninger, for å unngå klumpdannelse eller koagulering.

Mens en tidligere antok at protaminer var ikke-immunogene, så har en nå funnet at protaminer kan være immunogene hos mennesker og at deres anvendelse for medisinske formål kan føre til dannelse av antistoffer. Det er videre også påvist at protamin-insulinkomplekset som sådan også er immunogent. For enkelte pasienter bør en således unngå å bruke lengevirkende insulinsammensetninger som inneholder protaminer.

En annen type lengevirkende insulinsammensetning er løsninger med en pH-verdi under den fysiologiske pH ved hvilken insulinet vil utfelles, på grunn av den stigning i pH-verdi som skjer når løsningen blir injisert. En ulempe ved disse løsningene er at partikkelstørrelsesfordelingen i den utfellingen som dannes i vevet ved injeksjonen, og således frigjøringsprofilen for medikamentet, er avhengig av blodstrømmen på injeksjonsstedet og andre parametere på en noe uforutsigbar måte. En ytterligere ulempe er at de faste insulinpartiklene kan virke som et lokalt irritasjonsmiddel og frembringe inflammasjon i vevet på injeksjonsstedet.

WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) beskriver løselige insulinsammensetninger som omfatter insulinkomplekser av kobolt(III). Virkningsprofilen for disse kompleksene er bare moderat forlenget og biotilgjengeligheten er redusert i forhold til humant insulin.

Humant insulin har tre primære aminogrupper: den N-terminale gruppen på A-kjeden og B-kjeden, og s-aminogruppen på Lys<829>. Det er tidligere kjent flere insulinderivater som er substituert i én eller flere av disse gruppene. US patent nr. 3 528 960 (Eli Lilly) angår således N-karboksyaroylinsuliner hvor én, to eller tre primære aminogrupper i insulinmolekylet har en karboksyaroylgruppe.

Ifølge GB patent nr. 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Corp.) er det blitt påvist at insulin med karbamylsubstitusjon iNeB<29>har en bedret profil når det gjelder den hypoglykemi ske effekten.

JP publisert patentsøknad nr. 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) beskriver insulin hvor en fettsyre er bundet til aminogruppen i Phe<B1>eller til s-aminogruppen i Lys<829>eller til begge. Det oppgitte formål ved denne derivatiseringen er å oppnå et farmakologisk akseptabelt og stabilt insulinpreparat.

Insuliner hvor en i B30-posisjonen har en aminosyre med minst fem karbonatomer som ikke nødvendigvis kan kodes av en triplett av nukleotider, er beskrevet i JP offisiell patentsøknad nr. 57-067548 (Shionogi). Det er angitt at insulinanalogene kan brukes ved behandling av diabetes mellitus, da spesielt i pasienter som er insulinresistente på grunn av utvikling av storfe- eller svineinsulinantistoffer. WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S) beskriver humane insulinderivater hvor s-aminogruppen på Lys<829>har en lipofil substituent. Disse insulinderivatene har en forlenget virkningsprofil og er løselig ved fysiologiske pH-verdier.

EP 894095 beskriver insulinderivater hvor den N-terminale gruppen på B-kjeden og/eller s-aminogruppen på Lys i posisjon B28, B29 eller B30 har en substituent med formelen -CO-W-COOH, hvor W kan være en langkjedet hydrokarbongruppe. Disse insulinderivatene har en forlenget virkningsprofil og er løselige ved fysiologiske pH-verdier.

WO 98/02460 beskriver en fremgangsmåte for selektiv acylering av et insulin, en insulinanalog, eller en forgjenger derav, som har en fri e-aminogruppe av et Lys-residum inneholdt deri og minst en fri e-aminogruppe hvor metoden omfatter reaksjon av s-aminogruppen med et aktivert amid i en polar løsning i nærvær av en base.

US 6251856 beskriver visse insulinderivater hvor enten aminogruppen av den N-terminale aminosyre på B-kjeden har bundet en lipofil substituent som omfatter fra 12-40 karbonatomer, eller hvor karboksylsyregruppen av den C-terminale aminosyre på B-kjeden har bundet en lipofil substituent som omfatter 12-40 karbonatomer.

US 5898067 beskriver en fremgangsmåte for å frembringe sinkholdige proteinderivatkrystaller med lysin-residum, som bærer en lipofil substituent på s-aminogruppen. Det er imidlertid stadig et behov for insuliner med en mer forlenget virkningsprofil enn de insulinderivater som til nå er kjent, og som samtidig er løselige ved fysiologiske pH-verdier og som har en styrke som lar seg sammenligne med den til humant insulin.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse er basert på erkjennelsen at den totale hydrofobisiteten på insulinderivatmolekylet spiller en viktig rolle for derivatets in vivo styrke.

I ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse angår således et insulinderivat som er et naturlig forekommende insulin eller en analog av dette, som har en sidekjede knyttet enten til a-aminogruppen til det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller til s-aminogruppen til et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden i hovedinsulinmolekylet, og hvor nevnte sidekjede har følgende generelle formel:

hvor W er:

• et a-aminosyreresidum med en karboksylisk syregruppe i sidekjeden hvor residumet danner, med én av sine karboksylsyregrupper, en amidgruppe sammen med a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller sammen med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden i selve insulinmolekylet; • en kjede sammensatt av to oc-aminosyreresidua forbundet via amidbindinger, hvor kjede - via en amidbinding - er forbundet til a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller til s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden i selve insulinmolekylet, og hvor aminosyreresiduaene i W er valgt fra gruppen bestående av y-Glu-Gly; Gly-y-Glu; a-Asp-y-Glu; y-Glu-a-Asp; P-Asp^y-Glu; y-Glu-Ø-Asp; a-Glu-y-Glu; y-Glu-a-Glu; y-Glu-a-hGlu; a-hGlu-y-Glu; y-Glu-y-Glu; y-Glu-5-hGlu; 6-hGlu-y-Glu; eller

X er:

-CO-; . -CH(COOH)CO-; -N(CH2COOH)CHaCO-; • -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CHaCO-; • -NfCHzCHaCOOHJCHaCHaCO-; -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-; -NHCH(C00H)(CH2)4NHCO;

. -N(CH2CH2CO0H)CH2CO-; eller

. -N(CH2COOH)CH2CH2CO-.

slik at når W er et aminosyreresidum eller en kjede av aminosyreresidua, så vil det via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet danne en amidbinding med en aminogruppe i W,

Yer:

• -(CH2)m- hvor m er et tall varierende fra 6-32; • en divalent hydrokarbonkjede som omfatter 1, 2 eller 3 -CH=CH- grupper og et antall -CH2- grupper som er tilstrekkelig til å gi et totalt antall karbonatomer i kjeden som varierer fra 10-32; • en divalent hydrokarbonkjede med formelen -(CH2)vC6H4(CH2)w- hvor v og w er tall, eller én av dem er null, slik at summen av v og w varierer fra 6-30;

Z er: -COOH

og ethvert Zn<2+->kompleks av disse.

I én utførelse av oppfinnelsen så er sidekjeden -W-X-Y-Z knyttet til a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden i selve insulinmolekylet.

I en annen utførelse av oppfinnelsen er sidekjeden -W-X-Y-Z knyttet til e-aminosyregruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden i selve insulinmolekylet. I et mer spesifikt aspekt av denne utførelsen er sidekjeden -W-X-Y-Z knyttet til e-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i posisjon 28 i B-kjeden. I et ytterligere mer spesifikt aspekt av denne utførelsen er sidekjeden -W-X-Y-Z knyttet til e-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i posisjon 29 på B-kjeden. I et ytterligere mer spesifikt aspekt av denne utførelsen er sidekjeden -W-X-Y-Z knyttet til e-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i posisjon 30 på B-kjeden.

Understrukturen W i sidekjeden -W-X-Y-Z kan være en kovalent binding. Alternativt kan W være et residum av en a-aminosyre med en karboksylsyregruppe i sidekjeden og som totalt omfatter fra 4-10 karbonatomer. Spesifikt kan W være residumet av en a-aminosyre som kan være kodet av den genetiske koden. W kan således være valgt fra gruppen bestående av a-Asp, P-Asp, a-Glu og y-Glu. Ytterligere muligheter for W er feks. a-hGlu og 5-hGlu.

I en ytterligere utførelse er W en kjede sammensatt av to oc-aminosyreresidua hvorav én har fra 4-10 karbonatomer og en karboksylsyregruppe i sidekjeden, mens den andre har fra 2-11 karbonatomer men ingen fri karboksylsyregruppe. a-aminosyreresidumet uten en fri karboksylsyregruppe kan være et nøytralt kodbart a-aminosyreresidum. Eksempler på W ifølge denne utførelsen er: oc-Asp-Gly; Glu-oc-Asp; p-Asp-Gly; Gly-p-Asp; cc-Glu-Gly; Gly-cc-Glu; y-Glu-Gly; Gly-y-Glu; cc-hGlu-Gly; Gly-ahGlu; 6-hGlu-Gly; og Gly-8-hGlu.

I en ytterligere utførelse er W en kjede sammensatt av to a-aminosyreresidua, uavhengig av hverandre med fra 4-10 karbonatomer, og hvor begge har en karboksylsyregruppe i sidekjeden. En av disse a-aminosyreresiduaene eller begge, kan være kodbare a-aminosyreresidua. Eksempler på W ifølge denne utførelsen er følgende: a-Asp-a-Asp; a-Aso-a-Glu; a-Asp-a-hGlu; a-Asp-P-Asp; a-Asp-y-Glu; a-Asp-5-hGlu; P-Asp-a-Asp; P-Asp-aGlu; P-Asp-a-hGlu; P-Asp-P-Asp; P-Asp-y-Glu; P-Asp-8-hGlu; a-Glu-a-Asp; a-Glu-a-Glu; a-Glu-a-hGlu; a-Glu-P-Asp; a-Glu-y-Glu; a-Glu-5-hGlu; y-Glu-a-Asp; y-Glu-a-Glu; y-Glu-a-hGlu; y-Glu-P-Asp; y-Glu-y-Glu; y-Glu-5-hGlu; a-hGlu-a-Asp; a-hGlu-a-Glu; a-hGlu-a-hGlu; a-hGlu-p-Asp; a-hGlu-y-Glu; a-hGlu-8-hGlu; 8-hGlu-a-Asp; 8-hGlu-a-Glu; 6-hGlu-a-hGlu; 6-hGlu-p-Asp; 8-hGlu-y-Glu; og 6-hGlu-8-hGlu.

I en ytterligere utførelse er W en kjede sammensatt av tre a-aminosyreresidua, uavhengig av hverandre med fra 4-10 karbonatomer, og hvor aminosyreresiduaene i kjeden er valgt fra gruppen av residua med en nøytral sidekjede, og residua med en karboksylsyregruppe i sidekjeden, slik at kjeden har minst ett residum som har en karboksylsyregruppe i sidekjeden. I én utførelse er aminosyreresiduaene kodbare residua.

I en ytterligere utførelse er W en kjede sammensatt av fire a-aminosyreresidua uavhengig av hverandre med fra 4-10 karbonatomer, og hvor aminosyreresiduaene i kjeden er valgt fra gruppen med en nøytral sidekjede og residua med en karboksylsyregruppe i sidekjeden, slik at kjeden har minst ett residum som har en karboksylsyregruppe i sidekjeden. I én utførelse er aminosyreresiduaene kodbare residua.

I én utførelse kan W være forbundet med e-aminogruppen i Lys-residumet i B-kjeden via et ureaderivat.

Understrukturen X i sidekjeden -W-X-Y-Z, kan være en gruppe med formel -CO-, slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -CH(COOH)CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2COOH)CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2CH2COOH)CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2COOH)CH2CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

I en ytterligere utførelse kan understrukturen X i sidekjeden være en gruppe med formel -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO- slik at den via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet, danner en amidbinding med en aminogruppe i W, eller når W er en kovalent binding, med den N-terminale a-aminogruppen i B-kjeden, eller med e-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede i B-kjeden på selve insulinmolekylet.

Understrukturen Y i sidekjeden -W-X-Y-Z kan være en gruppe med

formelen -(CH2)m- hvor m er et tall fra 6-32, fra 8-20, fra 12-20 eller fra 12-16.

I en annen utførelse er Y en divalent hydrokarbonkjede som omfatter 1, 2 eller

3 -CH=CH- grupper, og et antall -CH2- grupper som er tilstrekkelig til å gi et totalt antall karbonatomer i kjeden varierende fra 6-32 fra 10-32, fra 12-20 eller fra 12-16.

I en annen utførelse er Y en divalent hydrokarbonkjede med

formelen -(CH2)vC6H4(CH2)w- hvor v og w er tall, eller hvor én av dem er null, slik at summen av v og w ligger i området fra 6-30, fra 10-20 eller fra 12-16.

I én utførelse er understrukturen Z i sidekjeden -W-X-Y-Z -COOH, forutsatt at når W er en kovalent binding, og X er -CO-, så er Z forskjellig fra -COOH.

I en annen utførelse er Z -CO-Asp.

I en annen utførelse er Z -CO-Glu.

I en annen utførelse er Z -CO-Gly.

I en annen utførelse er Z -CO-Sar.

I en annen utførelse er Z -CH(COOH)2.

I en annen utførelse er Z -N(CH2COOH)2.

I en annen utførelse er Z -SO3H.

I en annen utførelse er Z -PO3H.

I en ytterligere utførelse er W valgt fra gruppen bestående av oc-Asp, P-Asp, a-Glu og y-Glu; X er -CO- eller -CH(COOH)CO; Y er -(CH2)m-, hvor m er et tall fra 12-18, og Z er -COOH eller -CH(COOH)2.

Insulingruppen, i den foreliggende tekst også betegnet som selve insulinmolekylet, av et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være et naturlig forekommende insulin, så som humant insulin eller svininsulin. Alternativt kan selve insulinmolekylet være en insulinanalog.

I én gruppe av insulinanaloger kan aminosyreresidumet i posisjon A21 være Asn.

I en annen gruppe av insulinanaloger kan aminosyreresidumet i posisjon A21 være Gly. Spesifikke eksempler fra denne gruppen av analoger er Gly<A21>humant insulin, Gly<A21>des(B30) humant insulin; ogGlyA<21>ArgB<31>Arg<B32>humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon Bl blitt fjernet. Et spesifikt eksempel på denne gruppen av insulinanaloger er des(Bl) humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon B30 blitt fjernet. Et spesifikt eksempel fra denne gruppen av insulinanaloger er des(B30) humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon B28 Asp. Et spesifikt eksempel fra denne gruppen av insulinanaloger er Asp<828>humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon B28 Lys, mens aminosyreresidumet i B29 er Pro. Et spesifikt eksempel fra denne gruppen av insulinanaloger erLysB2<8>Pro<B28>humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon B30 Lys, mens aminosyreresidumet i posisjon B29 er enhver kodbar aminosyre bortsett fra Cys, Met, Arg og Lys. Et eksempel er en insulinanalog hvor aminosyreresidumet i posisjon B29 er Thr, mens aminosyreresidumet i posisjon B30 er Lys. Et spesifikt eksempel fra denne gruppen av insulinanaloger er ThrB29Lys<B30>humant insulin.

I en annen gruppe av insulinanaloger er aminosyreresidumet i posisjon B30 Lys, mens aminosyreresidumet i posisjon B29 er Glu. Et spesifikt eksempel fra denne gruppen av insulinanaloger erLysB3<0>Glu<B29>humant insulin.

Eksempler på insulinderivater ifølge foreliggende oppfinnelse er de følgende forbindelsene:NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin;NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i5CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin;NEB29-(Na<->(HOOC(CH2)i6CO)-y-Glu) des(B30) humant insulin;NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i7CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin;NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i8CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin; N<EB29->(Na<->(HOOC(CH2)i6CO)-Y-Glu-N(Y-Glu)) des(B30) humant insulin;NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i3CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin;NEB2<9->(Na<->(HOOC(CH2)i6CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin;

Insulinderivater ifølge forbindelsen kan være tilveiebrakt i form av i alt vesentlig sinkfrie forbindelser, eller i form av sinkkomplekser. Når det er tilveiebrakt sinkkomplekser av et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse, så kan to Zn<2+->ioner, tre Zn<2+->ioner eller 4 Zn<2+->ioner være bundet til hver insulinheksamer. Løsninger av sinkkomplekser av insulinderivatene vil inneholde blandinger av slike derivater.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer, for behandling av type 1 diabetes, type 2 diabetes eller andre tilstander som forårsaker hyperglykemi i pasienter, som har behov for en slik behandling. Et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for anvendelse ved behandlingen av type 1 diabetes, type 2 diabetes og andre tilstander som forårsaker hyperglykemi.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk

sammensetning for å behandle type 1 diabetes, type 2 diabetes eller andre tilstander som forårsaker hyperglykemi, i en pasient som har behov for en slik behandling, og som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse i blanding med et insulin eller en insulinanalog, som har rask virkningsgrad, sammen med farmasøytisk akseptable bærere og additiver.

I én utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes en farmasøytisk sammensetning som er en blanding av et insulinderivat ifølge oppfinnelsen og en rasktvirkende insulinanalog valgt fra gruppen bestående av Asp<828>humant insulin; LysB28ProB29humant insulin og Lys<B3>Glu<B29>humant insulin.

I én utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer en farmasøytisk sammensetning som omfatter N<eB29->(HOOC(CH2)14CO-y-G1u) des(B30) humant insulin og AspB28 humant insulin sammen med farmasøytisk akseptable bærere og additiver.

Insulinderivatet ifølge oppfinnelsen og nevnte rasktvirkende insulinanalog kan blandes i et forhold fra ca. 90/10 %; ca. 70/30 % eller ca. 50/50 %.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å behandle type 1 diabetes, type 2 diabetes og andre tilstander som forårsaker hyperglykemi i en pasient som har behov for en slik behandling, som omfatter at pasienten administreres en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer og farmasøytisk akseptable additiver.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å behandle type 1 diabetes, type 2 diabetes og andre tilstander som forårsaker hyperglykemi i en pasient som har behov for en slik behandling, som omfatter at pasienten blir administrert en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge oppfinnelsen i blanding med et insulin eller en insulinanalog med rask virkningsgrad, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller farmasøytisk akseptable additiver.

I et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse insulinderivater som har en generell hydrofobisitet som i alt vesentlig er lik den i det humane insulinet.

I et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse insulinderivater som har en hydrofobisitetsindeks k'rei, som ligger i området fra ca. 2 til ca. 200.

I et ytterligere aspekt har insulinderivater ifølge foreliggende oppfinnelse en hydrofobisitetsindeks k'rei, som ligger i området fra ca. 0,02 til ca. 10, fra ca. 0,1 til ca. 5, fra ca. 0,5 til ca. 5; eller fra ca. 0,5 til ca. 2.

Ifølge én utførelse av foreliggende oppfinnelse vil insulinderivatene omfatte en sidekjede -W-X-Y-Z som definert ovenfor, som har minst ett hydrofilt og minst ett hydrofobt område.

Ifølge en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse vil insulinderivatene omfatte en sidekjede -W-X-Y-Z som definert ovenfor, som har minst én fri karboksylsyregruppe, og ifølge en ytterligere utførelse, vil sidekjeden ha minst to frie karboksyl sy regrupper.

I en annen utførelse angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse som er løselig ved fysiologiske pH-verdier.

I en annen utførelse angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter et insulinderivat ifølge oppfinnelsen, som er løselig ved pH-verdier i området fra ca. 6,5 til ca. 8,5.

I en annen utførelse angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning med forlenget virkningsprofil, som omfatter et insulinderivat ifølge oppfinnelsen.

I en annen utførelse angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som er en løsning som inneholder fra ca. 120 nm ol/ml til ca. 2400 nmol/ml, fra ca. 400 nm ol/ml til ca. 2400 nmol/ml fra ca. 400 nmol/ml til ca. 1200 nmol/ml, fra ca. 600 nmol/ml til ca. 2400 nmol/ml eller fra ca. 600 nmol/ml til ca. 1200 nmol/ml av et insulinderivat ifølge oppfinnelsen, eller en blanding av insulinderivatene ifølge oppfinnelsen med en rasktvirkende insulinanalog.

Hydrofobisitetsdata for insulinderivater ifølge oppfinnelsen

Hydrofobisiteten (hydrofobisitetsindeksen) til insulinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til humant insulin, k'rei, ble målt på en LiChrosorb RP18 (5 um, 250 x 4 mm) HPLC-kolonne ved isokratisk eluering ved 40°C og ved å bruke blandinger av A) 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,3, som inneholdt 10 % acetonitril, og B) 50 % acetonitril i vann, som elueringsmidler. Elueringen ble kontrollert ved å følge UV-absorpsjonen for eluatet ved 214 nm. Tomromstiden to ble funnet ved å injisere 0,1 mM natriumnitrat. Oppholdstiden for humant insulin, thuman, ble justert til minst 2to ved å variere forholdet mellom A- og B-løsningene. K'rei=(tderivatet-to)/(thuman-to). k'rei som ble funnet for en rekke insulinderivater ifølge foreliggende oppfinnelse, er gitt i tabell 1.

Farmasøytiske sammensetninger

Farmasøytiske sammensetninger som inneholder et insulinderivat ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan administreres parenteralt til pasienter som har behov for en slik behandling. Parenteral administrering kan utføres ved subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon ved hjelp av en sprøyte, eventuelt en blyantlignende sprøyte. Alternativt kan parenteral administrering utføres ved hjelp av en infusjonspumpe. Ytterligere muligheter er å administrere insulinet nasalt eller pulmonalt, fortrinnsvis i sammensetninger, pulvere eller væsker, som spesielt er utformet for dette formålet.

Injiserbare sammensetninger av insulinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å bruke vanlig kjent teknikk fra den farmasøytiske industri, som innbefatter å løse eller å blande bestanddelene etter behov til det forønskede sluttproduktet. Ifølge én fremgangsmåte kan således et insulinderivat ifølge oppfinnelsen løses i en vannmengde som er noe mindre enn det endelige volumet på den sammensetningen som skal fremstilles. Et isotonisk middel, et konserveringsmiddel og en buffer kan tilsettes etter behov, og løsningens pH-verdi kan justeres hvis nødvendig, ved å bruke en syre, feks. saltsyre, eller en base, feks. vandig natriumhydroksid etter behov. Volumet på løsningen kan så til slutt justeres med vann til den forønskede konsentrasjonen av bestanddelene.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er bufferen valgt fra gruppen bestående av natriumacetat, natriumkarbonat, sitrat, glysylglysin, histidin, glysin, lysin, arginin, natriumdihydrogenfosfat, dinatriumhydrogenfosfat, natriumfosfat og tris(hydroksymetyl)-aminometan, bisin, trisin, malinsyre, suksinat, maleinsyre, fumarsyre, tartarsyre, aspartinsyre og blandinger av disse. Hvert av disse spesifikke bufferne utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil formuleringen eller sammensetningen ytterligere omfatte et farmasøytisk akseptabelt konserveringsmiddel som kan velges fra gruppen bestående av fenol, o-kresol, m-kresol, p-kresol, metyl-p-hydroksybenzoat, propyl-p-hydroksybenzoat, 2-fenoksyetanol, butyl-p-hydroksybenzoat, 2-fenyletanol, benzylalkohol, klorbutanol og tiomerosal, bronopol, benzosyre, imiduream klorheksidin, natriumdehydroacetat, klorkresol, etyl-p-hydroksybenzoat, benzetoniumklorid, klorfenisin (3p-klorfenoksypropan-l,2-diol) eller blandinger av disse. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil konserveringsmidlet være tilstede i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 20 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil konserveringsmidlet være tilstede i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 5 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil konserveringsmidlet være tilstede i en konsentrasjon fra ca. 5 mg/ml til 10 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil konserveringsmidlet være tilstede i en konsentrasjon fra 10 mg/ml til 20 mg/ml. Hver av disse spesifikke konserveringsmidlene utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen. Bruken av konserveringsmidler i farmasøytiske sammensetninger er velkjente innenfor den farmasøytiske industri. For ytterligere detaljer refereres det til Remington: The Science andPractice ofPharmacy, 19. utgave 1995.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen vil formuleringen eller sammensetningen ytterligere omfatte et isotonisk middel som kan velges fra gruppen bestående av et salt (feks. natriumklorid), et sukker eller en sukkeralkohol, en aminosyre (feks. L-glysin, L-histidin, arginin, lysin, isoleucin, aspartinsyre, tryptofan eller treonin), en alditol (feks. glyserol (glyserin), 1,2-propandiol (propylenglykol), 1,3-propandiol, 1,3-butandiol) polyetylenglykol (feks. PEG400), eller blandinger derav. En kan bruke ethvert sukker så som mono-, di- eller polysakkarider, eller vannløselige glukoaner, feks. fruktose, glukose, mannose, sorbose, xylose, maltose, laktose, sukrose, trehalose, dekstran, pullulan, dekstrin, syklodekstrin, løselig stivelse, hydroksyetylstivelse og karboksymetylcellulose-Na. I én utførelse er sukkeradditivet sukrose. Sukkeralkohol er definert som et C4-C8-hydrokarbon med minst én ~OH-gruppe, og inkluderer feks. mannitol, sorbitol, inositol, galaktitol, dulsitol, xylitol og arabitol. I én utførelse er sukkeralkoholadditivet mannitol. De sukre og sukkeralkoholer som er nevnt ovenfor kan brukes individuelt eller i kombinasjon. Det er ingen fast grense med hensyn til den mengde som brukes, så lenge sukkeret eller sukkeralkoholen er løselig i den væske som brukes for fremstillingen, og som ikke skadelig påvirker de stabiliserende effekter som oppnås ved hjelp av de foreliggende fremgangsmåter. I én utførelse er sukker eller sukkeralkoholkonsentrasjonen mellom 1 mg/ml og 150 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er det isotoniske midlet tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml til 50 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er det isotoniske midlet tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml til 7 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er det isotoniske midlet tilstede i en konsentrasjon fra 8 mg/ml til 24 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er det isotoniske midlet tilstede i en konsentrasjon fra 25 mg/ml til 50 mg/ml. Hver av disse spesifikke isotoniske midler utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen. Bruken av et isotonisk middel i farmasøytiske sammensetninger er velkjente innenfor den farmasøytiske industri. For ytterligere detaljer refereres det til Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave 1995.

Typiske isotoniske midler er natriumklorid, mannitol, dimetylsulfon og glyserol, og typiske konserveringsmidler er fenol, m-kresol, metyl-p-hydroksybenzoat og benzylalkohol.

Eksempler på egnede buffere er natriumacetat, glysylglysin, HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre) og natriumfosfat.

En sammensetning for nasal administrering av et insulinderivat ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan feks. fremstilles slik det er beskrevet i europeisk patent nr. 272097 (til Novo Nordisk A/S).

Sammensetninger som inneholder insulinen ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes ved behandlingen av tilstander som er følsomme for insulin. De kan således brukes ved behandlingen av type 1 diabetes, type 2 diabetes og hyperglykemi feks., som av og til opptrer hos alvorlig skadede personer eller personer som går igjennom kirurgiske inngrep. Det optimale dosenivået for en pasient vil være avhengig av en rekke faktorer så som effekten av det spesifikke insulinderivat som brukes, pasientens alder, kroppsvekt, fysiske aktivitet og pasientens diett, en mulig kombinasjon med andre medikamenter som anvendes, samt graden av den tilstand som skal behandles. Det er anbefalt at den daglige dosen av insulinderivatet ifølge oppfinnelsen bør bestemmes for den individuelle pasient av den behandlende legen eller på lignende måte som er kjent for andre insulinsammensetninger.

Når det er ønskelig eller nødvendig kan insulinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse brukes i en blanding med andre typer insulin, feks. insulinanaloger med raskere virkning. Eksempler på slike insulinanaloger er beskrevet, feks. i de europeiske patentsøknadene med publikasjonsnumrene EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) og EP 383472 (Eli Lilly & Co.).

Den foreliggende oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de følgende eksempler, som imidlertid ikke må anses å være begrensende for oppfinnelsen som sådan.

Definisjoner

Med "insulinanalog" slik dette begrepet brukes her, forstås et polypeptid som har en molekylær struktur som formelt kan avledes fra strukturen til et naturlig forekommende insulin, feks. et humant insulin, ved å fjerne og/eller bytte ut minst én aminosyreresidum som forekommer i det naturlig forekommende insuling, og/eller addere minst ett aminosyreresidum. De tilsatte og/eller utbyttede aminosyreresiduaene kan enten være kodbare aminosyreresidua eller andre naturlig forekommende residua eller rent syntetiske aminosyreresidua. Insulinanalogene kan være slike hvor posisjon 28 i B-kjeden er blitt modifisert fra det naturlige Pro-residum til ett med Asp, Lys eller Ile. I en annen utførelse er Lys i posisjon B29 modifisert til Pro. I én utførelse kan B30 være Lys hvoretter B29 kan være enhver kodbar aminosyre bortsett fra Cys, Met, Arg og Lys.

Også Asn i posisjon A21 kan være modifisert til Ala, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr eller Val, spesielt Gly, Ala, Ser og Thr, fortrinnsvis til Gly. Videre kan Asn i posisjon B3 være modifisert til Lys eller Asp. Ytterligere eksempler på insulinanaloger er des(B30) human insulin; des(B30) humane insulinanaloger; insulinanaloger hvor PheBl er fjernet; insulinanaloger hvor A-kjeden og/eller B-kjeden har en N-terminal forlengelse, og insulinanaloger hvor A-kjeden og/eller B-kjeden har en C-terminal forlengelse. Således kan én eller to Arg være addert til posisjonen Bl.

Med "insulinderivat" slik dette begrepet brukes her, forstås et naturlig forekommende insulin eller en insulinanalog som er blitt kjemisk modifisert, feks. ved å innføre en sidekjede i én eller flere posisjoner i selve insulinhovedkjeden eller ved å oksidere eller å redusere grupper i aminosyre i insulinet, eller ved å omdanne en fri karboksylsyregruppe til en estergruppe, eller ved å acylere en fri aminogruppe eller en hydroksygruppe.

Begrepet "en kodbar aminosyre" eller "et kodbart aminosyreresidum" brukes for å indikere en aminosyre eller et aminosyreresidum som kan kodes av en triplett ("kodon") av nukleotider.

hGlu er homoglutaminsyre.

cc-Asp er L-formen av -HNCH(CO-)CH2COOH.

p-Asp er L-formen av -HNCH(COOH)CH2CO-.

a-Glu er L-formen av -HNCH(CO-)CH2CH2COOH.

Y-Glu er L-formen av -HNCH(COOH)CH2CH2CO-,

cc-HgGlu er L-formen av -HNCH(CO-)CH2CH2CH2COOH.

8-hGlu er L-formen av -HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-.

p<->Ala er -NH-CH2-CH2-COOH.

Sar er sarkosin (N-metylglysin).

Uttrykket "et aminosyreresidum med en karboksylsyregruppe i sidekjeden" betegner aminosyreresidua så som Asp, Glu og hGlu. Aminosyrene kan enten være i L- eller D-konfigurasjon. Hvis intet er angitt er det underforstått at aminosyren er i L-konfigurasjonen.

Uttrykket "et aminosyreresidum med en nøytral sidekjede" betegner aminosyreresidua som Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Tyr, Asn og Gin.

Når et insulinderivat ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt å være "løselig ved fysiologiske pH-verdier" betyr dette at insulinderivatet kan brukes for å fremstille injiserbare insulinsammensetninger som fullt ut er løselige ved fysiologiske pH-verdier. En slik gunstig løselighet kan enten skyldes egenskaper som sådan i insulinderivatet alene, eller som et resultat av en gunstig interaksjon mellom insulinderivatet og én eller flere andre bestanddeler som forefinnes i formuleringen eller i bærevæsken.

De følgende forkortelser er brukt i beskrivelsen og eksemplene:

Aad: Alfa-amino-adipinsyre (homoglutaminsyre)

Bzl = Bn: benzyl

DIEA: N,N-diisopropyletylamin

DMF: N,N-dimetylformamid

IDA: iminodieddiksyre

Sar: sarkosin (N-metyl-glysin)

tBu: tert-butyl

TSTU: 0-CN-suksinimidyl)-l,l,3,3-tetrametyluroniumtetrafluorborat

THF: tetrahydrofuran

EtOAc: etylacetat

DIPEA: diisopropyletylamin

HO At: 1 -hy droksy-7-azabenzotriazol

TEA: trietylamin

Su: suksinimidyl = 2,5-diokso-pyrrolidin-l-yl

TFA: trifluoreddiksyre

DCM: diklormetan

DMSO: dimetylsulfoksid

TLC: tynnsjiktkromatografi

RT: romtemperatur

EKSEMPLER

Eksempel 1

Syntese av NeB29- fNa-( HOOC( CH2^ i4COVy- Glu) des( B3( » humant insulin

200 mg des(B30) humant insulin ble løst i 10 ml av 50 mM Na2C03(pH 10,2) som var tilstede i et rør som var plassert i et vannbad ved 15°C. Metylheksadekandioyl-Glu(OSu)-OMe (37,90 mg, fremstilt som beskrevet i det etterfølgende), ble løst i 10 ml acetonitril og deretter tilsatt insulinløsningen. Reaksjonen ble stoppet etter 30 min ved å tilsette 3,8 ml 0,2 M etanolamin justert til pH 9,0 med fortynnet HC1. Utbyttet av reaksjonen var 37 % slik dette kunne bestemmes ved RP-HPLC. Produktet ble utfelt etter tilsetning av 2,5 volumer vann og justering av pH til 5,5. Bunnfallet ble så løst i 10 ml vann ved pH 8 og plassert på is. Løsningen ble så tilsatt 10 ml iskald 0,2 M NaOH for forsåpning, og blandingen ble inkubert i 40 min. ved isavkjøling og så justert til pH 5,5 for utfelling av produktet. Bunnfallet ble isolert og løst i 5 ml av A-buffer (se nedenfor) og fortynnet med 33 ml av 42,5 % vekt/vekt vandig etanol delt i tre porsjoner, og så underkastet en anionutbytningskromatografi ved å anvende en Resource™ 6 ml anionutbytningskolonne, og eluert med et buffersystem bestående av A-buffer: Tris 0,24 % vekt/vekt, NH4Ac 0,25 %, 42 % etanol vekt/vekt, pH 7,5 og B-buffer, Tris 0,24 % vekt/vekt, NH4Ac 1,25 %, 42 % etanol vekt/vekt pH 7,5. Prøven ble eluert med en strømhastighet på 6 ml/min. i en gradient fra 0-100 % av D-buffer i løpet av 30 min. De fraksjonene som inneholdt den forønskede forbindelsen, ble identifisert ved RP-HPLC. Utbyttet av det forønskede produktet var 15,3 mg (renhet: 72,9 %). Volumet av de sammenslåtte fraksjonene som inneholdt den forønskede forbindelsen ble redusert til 20 ml under vakuum, og denne løsningen ble så underkastet rensing ved hjelp av RP-HPLC ved å bruke en revers fase HPLC-kolonne Nucleosil, C4 250/10 mm, 10 um, 300 Å. Buffersystemet bestod av A-buffer: 10 mM Tris, 15 mM (NH4)2S04, 10 % etanol, pH 7,3 og B-buffer: 70 % volum/volum etanol.

Produktet ble eluert med en gradient fra 10-60 % B-buffer i løpet av 120 min. ved en strømhastighet på 2 ml/min. Passende fraksjoner ble slått sammen, og forbindelsen ble utfelt og frysetørket. Utbyttet var 7,7 mg (renhet: 99,4 %).

Molekylvekt funnet ved massespektroskopi: 6097,2, beregnet 6104,1. Det B-terminale peptidet med sidekjeden ble fremstilt etter kutting med staphylococcus aureus-protease. Molekylvekt, funnet ved massespektroskopi: 1413,1, beregnet 1413,5.

Fremstilling av metvlheksadekandiovl- GlufOSuVOMe

Dimetylheksadekandioat ble forsåpet i metanol ved å bruke 1,0 ekvivalenter av NaOH, og mono-metylesteren blir isolert ved surgjøring med HC1 og ved omkrystallisering fra heptan.

Mono-metylheksadekandioat (275 mg, 0,91 mmol) ble løst i 3 ml THF og behandlet med suksinimidyltetrametyluroniumtetrafluorborat (331 mg, 1,1 mmol) ogN,N-diisopropyletylamin (188 ul, 1,1 mmol), og blandingen ble rørt i 20 timer. Løsemidlet ble fjernet i vakuum, og resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med 0,1 M HC1 og så med vann. Den organiske fasen ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og fordampet i vakuum, noe som ga 350 mg (96 %) av metylsuksinimidylheksadekandioat.

1H-NMR (CDC13) 6: 3,66 (s, 3H), 2,83 (s, 4H), 2,60 (t, 2H), 2,30 (t, 2H), 1,74 (p, 2H), 1,62 (p, 2H), 1,40 (m, 2H), 1,35-1,22 (m, 18H).

Metylsuksinimidylheksadekandioat (240 mg, 0,58 mmol) i 5 ml dimetylformamid ble behandlet med GluOMe (93 mg, 0,58 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (200 ul, 1,16 mmol). Blandingen ble rørt i 20 timer og så fordampet i vakuum. Resten ble på nytt løst i etylacetat. Vasking med 0,1 M HC1 og vann fulgt av tørking (magnesiumsulfat) og fordamping i vakuum, ga 226 mg (88 %) av metylheksadekandioyl-Glu-OMe.

1H-NMR 5: 6,22 (d, 1H), 4,65 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 2,42 (t, 2H), 2,29 (m, 4H), 2,22 (t, 2H), 1,97 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,35-1,22 (m, 20H).

Metylheksadekandioyl-Glu-OMe (200 mg, 0,45 mmol) ble løst i 4 ml diklormetan og avkjølt på et isbad, og så behandlet med disykloheksylkarbodiimid (93 mg, 0,45 mmol) og N-hydroksysuksinimid (52 mg, 0,45 mmol). Blandingen ble omrørt i 20 timer, filtrert og fordampet i vakuum, noe som ga 243 mg (100 %) av det forønskede mellomproduktet.

1H-NMR (CDC13) 8:6,34 (d, 1H), 4,67 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,64 (s, 3H), 2,81 (s, 4H), 2,66 (m, 2H), 2,27 (m, 4H), 2,20 (t, 2H), 1,89 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 1,58 (m, 4H), 1,29-1,20 (m, 20 H).

Eksempel 2

Syntese av N^- f^ mOOCæ^ ieCOVy- GluMesfBSO^ humant insulin

300 mg des(B30) humant insulin ble acylert, renset og isolert som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at i det foreliggende eksempel ble metyloktadekandioyl-Glu(OSu)-OMe (fremstilt som beskrevet nedenfor), brukt som acetyleringsmiddel istedenfor det metylheksadekandioyl-Glu(OSu)-OMe som ble brukt i eksempel 1. Det ble oppnådd 25,5 mg av tittelforbindelsen (renhet: 97,4 %). Molekylvekt funnet ved massespektroskopi: 6136,6, beregnet: 6132. Det B-terminale peptidet med liganden ble oppnådd etter kutting med staphylococcus aureus-protease. Molekylvekt funnet ved massespektroskopi: 1439,1, beregnet 1442,5.

Fremstilling av metvloktadekandiovl- GlufOSuVOMe

Denne forbindelsen ble fremstilt fra dimetyloktadekandioat i analogi med det heksadekandioylderivatet, som er beskrevet i eksempel 1.

1H-NMR (CDC13) 8: 6,20 (d, 1H), 4,70 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,67 (s, 3H), 2,84 (s, 4H), 2,70 (m, 2H), 2,30 (m, 4H), 2,22 (t, 2H), 1,93 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 1,62 (m, 4H), 1,33-1,23 (m, 24 H).

Eksempel 3

Syntese av NEB29-( NamOOC( CH2) i6COVv- Glu- N-( V- GluV) des( B30) humant insulin På lignende måte som beskrevet i eksempel 1, ble 300 mg des(B30) humant insulin acylert med metyloktadekandioyl-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe. Rensing ved anionutbytting ble utført som beskrevet ovenfor. Det ble imidlertid utført en forlenget eluering med 100 % B-buffer for å få eluert det forønskede produktet. De fraksjonene som inneholdt det forønskede produktet ble identifisert ved RP-HPLC, og det ble oppnådd 47,5 mg med en renhet på 55 %. Volumet av de fraksjonene som inneholdt det forønskede produktet ble redusert i vakuum, og den resulterende løsningen ble underkastet rensing ved hjelp av RP-HPLC og ved å bruke en revers fase HPLC Jupiterkolonne, C4 250/10 mm, 10 um, 300 Å fra Phenomerex. Buffersystemet bestod av A-buffer: 0,1 % TF A, 10 % volum/volum etanol og B-buffer: 80 % volum/volum etanol. Prøven ble eluert med en gradient fra 40-60 % B-buffer ved 40°C i 120 min. og en strømhastighet på 2 ml/min. Passende fraksjoner ble slått sammen og frysetørket, og det ble oppnådd 31,1 mg av tittelforbindelsen (renhet: 94 %).

Molekylvekt av tittelforbindelsen funnet ved massespektroskopi: 6259,65, beregnet: 6261,2. Molekylvekt (ved massespektroskopi) av det B-terminale peptidet med sidekjeden, oppnådd etter kutting med staphylococcus aureus-protease, var 1569,88, beregnet 1569,88.

Fremstilling av metvloktadekandiovl- Glu( Glu( OsuVOMeVOMe Metyloktadekandioyl-Glu(OSu)-OMe (fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 200 mg, 0,35 mmol) i 5 ml dimetylformamid ble behandlet med GluOMe (62 mg, 0,39 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (90 ul, 53 mmol), og blandingen ble rørt i 20 timer. Løsemidlet ble fjernet i vakuum, og resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med 0,2 M HC1, vann og saltløsning. Tørking over magnesiumsulfat og fordampning ga metyloktandioyl-Glu(Glu-OMe)-OMe, 180 mg (83 %).

Metyloktadekandioyl-Glu(OSu)-OMe (180 mg, 0,29 mmol) ble løst i 9 ml THF og behandlet med suksinimidyltetrametyluroniumtetrafluorborat (106 mg, 0,35 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (60 ul, 0,35 mmol). Blandingen ble rørt over natten, fordampet, på nytt løst i etylacetat og vasket med 2 x 0,1 M HC1 og vann. Tørking over magnesiumsulfat og fordampning ga 190 mg (93 %) av det forønskede mellomproduktet.

^-NMR (CDCb) 6: 6,73 (d, 1H), 6,43 (d, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 2,85 (s, 4H), 2,72 (m, 2H), 2,41-2,12 (m, 8H), 2,95 (m, 2H), 1,72-1,56 (m, 6H), 1,35-1,22 (m, 22 H).

Eksempel 4

Syntese av NEB29- fNamOOCæH2^ i4COVy- L- Glu) des( B30^ humant insulin Des(B30) humant insulin (500 mg, 0,088 mmol) ble løst i 100 mM Na2C03(5 ml, pH 10,2) ved romtemperatur. Tert-butylheksadekandioyl-Glu(OSu)-OtBu (66 mg, 0,105 mmol, fremstilt som beskrevet nedenfor), ble løst i 5 ml acetonitril og så tilsatt insulinløsningen. Etter 30 min. ble det tilsatt 0,5 ml 0,2 M metylamin. pH ble justert ved hjelp av HC1 til 5,5, og det isoelektriske bunnfallet ble sentrifugert og tørket i vakuum til 525 mg. Koblingsutbyttet var 78 % (RP-HPLC, C4-kolonne; Buffer A: 10 % MeCN i 0,1 % TFA-vann, buffer B: 80 % MeCN i 0,1 % TFA-vann; gradient 20 % til 90 % B i løpet av 16 min.). Det beskyttede produktet ble løst i 10 ml TF A, hensatt i 30 min. og så fordampet i vakuum. Råproduktet ble løst i vann og frysetørket (610 mg). 0454 ble renset ved RP-HPLC på en C4-kolonne, buffer A: 20 % etanol + 0,1 % TF A, buffer B: 80 % etanol + 0,1 % TF A; gradient 15-60 % B, fulgt av HPLC på en C4-kolonne, buffer A: 10 mM Tris +15 mM ammoniumsulfat i 20 % etanol, pH 7,3, buffer B: 80 % etanol, gradient 15-60 % B. De oppsamlede fraksjoner ble avsaltet på en Sep-Pak kolonne med 70 % acetonitril + 0,1 % TF A, nøytralisert ved å tilsette ammoniakk og så frysetørket. Det ikke-optimaliserte utbyttet var 64 mg, 12 %. Renhet bedømt ved HPLC var 99,2 %. LCMS 6102,9, C274H411N65O81S6krever 6104,1. Det B-terminale peptidet med sidekjeden (RGFFYTPK(N<E->(Na<->(HOOC(CH2)i4CO)-y-L-Glu) ble oppnådd etter kutting med staphylococcus aureus-protease. MALDI-MS: 1413,1, beregnet: 1412,7.

Fremstilling av tert- butvlheksadekandioyl- L- Glu( OSu)- OtBu

Heksadekanoinsyre (40,0 g, 140 mmol) ble suspendert i 250 ml toluen, og blandingen ble kokt under tilbakeløp. N,N-dimetylformamid di-tert-butylacetal (76,3 g, 375 mmol) ble så dråpevis tilsatt over 4 timer. Blandingen ble så kokt under tilbakeløp over natten. Løsemidlet ble fjernet i vakuum ved 50°C, og råproduktet ble suspendert i DCM/AcOEt (500 ml, 1:1) og rørt i 15 min. De faste stoffene ble frafiltrert og gnidd med 200 ml DCM. Filtratet ble fordampet i vakuum, noe som ga 30 g urent mono-tert-butyl-heksadekandioat. Dette produktet ble suspendert i 50 ml DCM og avkjølt med i is i 10 min. og så filtrert. Løsemidlet ble fjernet i vakuum, noe som ga 25 g urent mono-tert-butylheksadekandioat, som ble omkrystallisert fra 200 ml heptan, og dette ga mono-tert-butyl-helsadekandioat, 15,9 g (33 %). Alternativt til omkrystallisering kan mono-esteren renses ved silikakromatografi i AcOEt/heptan.

^-NMR (CDCb) 6: 2,35 (t, 2H), 2,20 (t, 2H), 1,65-1,55 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,34-1,20 (m, 20 H).

Mono-tert-butylesteren (2 g, 5,8 mmol) ble løst i 20 ml THF og behandlet med TSTU (2,1 g, 7,0 mmol) og DIEA (1,2 ml, 7,0 mmol) og så rørt over natten. Blandingen ble filtrert, og filtratet fordampet i vakuum. Resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med kald 0,1 M HC1 og vann. Tørking over magnesiumsulfat og fordamping i vakuum ga suksinimidyl tert-butyl heksadekandioat, 2,02 g (79 %).

^-NMR (CDCb) 6: 2,84 (s, 4H), 2,60 (t, 2H), 2,20 (t, 2H), 1,74 (p, 2H), 1,56 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,40 (m, 2H), 1,30-1,20 (m, 18H).

Suksinimidyl tert-butylheksadekandioat (1 g, 2,27 mmol) ble løst i 15 ml DMF og behandlet med L-Glu-OtBu (0,51 g, 2,5 mmol) og DIEA (0,58 ml, 3,41 mmol), og blandingen ble rørt over natten. Løsemidlet ble fjernet i vakuum, og råproduktet ble løst i etylacetat og vasket to ganger med 0,2 M HC1, og så med vann og saltløsning. Tørking over magnesiumsulfat og fordamping i vakuum ga tert-butyl heksadekandioyl-L-Glu-OtBu, 1,2 g (100 %).

^-NMR (CDCb) 6: 6,25 (d, 1H), 4,53 (m, 1H), 2,42 (m, 2H), 2,21 (m, 4H), 1,92 m, 1H), 1,58 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 1,43-1,22 (m, 18H).

Tert-butyl heksadekandioyl-L-Glu-OtBu (1,2 g, 2,27 mmol) ble løst i 15 ml THF og behandlet med TSTU (0,82 g, 2,72 mmol) og DIEA (0,47 ml, 2,72 mmol) og rørt over natten. Blandingen ble filtrert, og filtratet fordampet i vakuum. Resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med kald 0,1 M HC1 og vann. Tørking over magnesiumsulfat og fordamping i vakuum ga tert-butyl heksadekandioyl-L-Glu(OSu)-OtBu, 1,30 g (92 %).

^-NMR (CDCb) 6: 6,17 (d, 1H), 4,60 (m, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,72 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,20 (m, 4H), 2,08 (m, 1H), 1,6 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 1,33-1,21 (m, 20 H).

Eksempel 5

Syntese av NEB29-( NamOOC( CH2) i6COVv- L- Glu) des( B30) humant insulin DesB30 insulin (50 mg, 9 umol) ble løst i 0,65 ml 0,1 M vandig Na2C03, pH 10,5. Oktadekandioyl-L-Glu(OSu) (50,1 mg, 9,9 umol, fremstilt som beskrevet nedenfor) ble løst i 0,65 ml acetonitril og tilsatt insulinløsningen, pH var 10,3. Etter 30 min. ble det tilsatt 50 ul 0,2 M metylamin. pH ble justert til 5,5 med HC1, og det isoelektriske bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering og tørket i vakuum. HPLC viste at utbyttet av det urene koblingsproduktet var 52 % (ikke-optimalisert); C4-kolonne; buffer A: 10 % MeCN i 0,1 % TFA-vann, buffer B: 80 % MeCN i 0,1 % TFA-vann; gradient 20-90 % B i løpet av 16 min.). LCMS 6133,2, C276H415N65O81S6kreves 6132,2.

Fremstilling av oktadekandiovl- L- Glu( OSu)

Oktadekandioinsyre (2,5 g, 8,0 mmol) ble suspendert i 60 ml DCM og behandlet med trietylamin (1,16 ml, 8,3 mmol) og så isavkjølt. 1,14 ml benzylklorformat ble dråpevis tilsatt under nitrogen, og blandingen ble rørt i 10 min. og så tilsatt DMAP (0,097 g, 0,80 mmol). Etter røring i 20 min. ved 4°C (TLC, 1:1 etylacetat:heptan), ble reaksjonsblåndingen fordampet til tørrhet. Råproduktet på 3,9 g ble løst i 60 ml DCM, så behandlet med 15 g silika og deretter fordampet. Silikasuspensjonen ble påsatt en silikakolonne på 175 g, og produktet ble eluert med etylacetat/heptan 1:7 til 1:1. Fordampning av de forønskede fraksjonene ga mono-benzyl-oktadekandioat (1,15 g, 36%).

^-NMR (CDCb) 6:7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 2,35 (t, 4H), 1,64 (t, 4H), 1,30-1,22 (m, 24).

Mono-benzyloktadekandioat ble løst i 3,5 ml DMF og 7 ml THF og avkjølt på et isbad. 0,103 ml DIEA og TSTU ble tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 time på isbadet og så ved romtemperatur over natten. Løsemidlet ble fordampet i vakuum, og resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med 0,2 N HC1, mettet NaHCCh, tørket, filtrert og fordampet til tørrhet, noe som ga suksinimidyl-mono-benzyloktadekandioat (0,25 g, 100 %).

^-NMR (CDCb) 6: 7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 2,83 (s, 4H), 2,60 (t, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,40-1,20 (m, 24).

Suksinimid-mono-benzyloktadekandioat (95 mg, 0,19 mmol) ble løst i 1,5 ml DMF og behandlet med L-Glu-OBzl (49 mg, 0,21 mmol) og DIEA (50 ul 0,28 mmol), og blandingen ble rørt over natten. Løsemidlet ble fordampet i vakuum, og råproduktet ble løst i etylacetat, vasket to ganger med 0,2 M HC1, og så med vann og saltløsning. Tørking over magnesiumsulfat og fordamping i vakuum ga BzlO-oktadekandioyl-L-Glu-OBzl, 114 mg (97 %).

^-NMR (CDCb) 6: 7,35 (m, 5H), 6,22 (d, 2H), 5,17 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 4,71 (m, 1H), 2,37 (m, 4H), 2,22 (m, 3H), 1,98 (m, 1H), 1,63 (m, 4H), 1,31-1,20 (m, 24H).

BzlO-oktadekandioyl-L-Glu-OBzl (110 g, 0,18 mmol) ble løst i 2 ml THF og behandlet med TSTU (64 mg, 0,21 mmol) og DIEA (36 ul, 0,21 mmol) og så rørt over natten. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble fordampet i vakuum. Resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med kald 0,1 M HC1 og vann. Tørking over magnesiumsulfat og fordamping i vakuum ga BzlO-oktadekandioyl-L-Glu(OSu)-OBzl, 119 g (94%).

^-NMR (CDCb) 6: 7,36 (m, 5H), 6,40 (d, 2H), 5,19 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 2,82 (s, 4H), 2,68 (m, 1H), 2,59 (m, 1H), 2,35 (t, 2H), 2,19 (t, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,32-1,21 (m, 24H).

BzlO-oktadekandioyl-L-Glu(OSu)-OBzl (59 mg, 0,082 mmol) ble løst i 1 ml aceton/0,1 % TF A. 20 mg Pd/C ble så tilsatt. Kolben ble evakuert og fylt med nitrogen flere ganger, hvoretter den ble forbundet med en H2-fylt ballong. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 3 timer og så filtrert gjennom celite. Utfelning fra heptan og fordampning av gjenværende løsemidler ga oktadekandioyl-L-Glu(OSu) (27 mg, 61 %).

^-NMR (CDCb) 6: 6,32 (d, 1H), 4,70 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,06 (m, 2H), 2,88 (s, 4H), 2,62 (m, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 1,74 (m, 1H), 1,64 (m, 2H), 1,50-1,20 (m, 26 H).

Eksempel 6

Syntese avNEB2<9->(N-(L-Asp-OC(CH2)i6CO)-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Denne forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4, via en reaksjon mellom L-Asp(OtBu)-OtBu og suksinimidyloktadekandioat fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved hjelp av TF A.

LCMS 6247,5, beregnet 6,247,3.

Eksempel 7

Syntese avNeB2<9->(N-(L-G1u-OC(CH2)i4CO)-y-L-G1u) des(B30) humant insulin Denne forbindelsen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 4 via en reaksjon mellom L-Glu(OtBu)-OtBu og suksinimidylheksadekandioat fulgt av en aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved hjelp av TF A. LCMS 6261,3, beregnet 6261,3.

Eksempel 8

Syntese av N<EB29->(N-(L-Glu-OC(CH2)i4CO-) des(B30) humant insulin Denne forbindelsen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 4 ved en reaksjon mellom L-Glu(OtBu)-OtBu og suksinimidylheksadekandioat fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6130,8, beregnet 6132,2.

Eksempel 9

Syntese av N<EB29->(N-HOOC(CH2)i6CO-a-L-Glu)-N-(p-L-Asp) des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butyl-suksinimidyloktandioat med L-Glu(OtBu) fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-AspOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse med TFA. LCMS 6246,9, beregnet 6247,3.

Eksempel 10

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i5CO-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via reaksjonen mellom tert-butyl-suksinimidylheptadekandioat (A.C. Cope, U. Axen, E.P. Burrows, J. Weinlich, J. Am. Chem Soc. 1966, 88, 4228) med L-GluOtBu fulgt av aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6118,3, beregnet 6118,1.

Eksempel 11

Syntese av N<EB29->(N-Gly-OC(CH2)i3CO-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom L-GluOtBu og suksinimidylpentadekandioat fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6147,5, beregnet 6147,1.

Eksempel 12

Syntese av N<EB29->(N-(L-Sar-OC(CH2)i3CO-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom L-Sar-OtBu med suksinimidyloktadekandioat fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6161,0, beregnet 6161,1.

Eksempel 13

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-a-L-Asp)-N-(p-L-Asp) des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butyl-suksinimidyloktadekandioat med L-Asp(OtBu), fulgt av en aktivering med TSTU, reaksjon med L-AspOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6233,8, beregnet 6233,2.

Eksempel 14

Syntese avNEB2<9->(N-(Gly-OC(CH2)i3CO-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom L-GlyOtBu og suksinimidylheksadekandioat fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6160,7, beregnet 6161,1.

Eksempel 15

Syntese av N<EB29->(N-HOOC(CH2)i4CO-p-L-Asp)-N-(p-L-Asp) des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butyl-suksinimidylheksadekandioat med L-AspOtBu fulgt av aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6089,8, beregnet 6089,8.

Eksempel 16

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-p-L-Asp)-N-(p-L-Asp) des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butyl-suksinimidyloktadekandioat med L-AspOtBu fulgt av aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6117,8, beregnet 6118,1.

Eksempel 17

Syntese av N<EB29->(N-(Gly-OC(CH2)i6CO-y-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom L-GlyOtBu og suksinimidyloktadekandioat fulgt av aktivering med TSTU, reaksjon med L-GluOtBu, aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6189,2, beregnet 6189,2.

Eksempel 18

Syntese av N<EB29->(N-HOOC(CH2)i4CO-s-L-LysCO-) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidylheksadekandioat og L-Lys(Z)-OtBu, fulgt av en hydrogenering over Pd/C og en in situ aktivering ved hjelp av 4-nitrofenylklorformat, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6189,2, beregnet 6189,2.

Eksempel 19

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-a-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 ved en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidyloktadekandioat og L-Glu(OtBu) fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6132,1, beregnet 6132,2.

Eksempel 20

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-a-L-Asp) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 ved en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidyloktadekandioat og L-Asp(OtBu) fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6117,8, beregnet 6118,1.

Eksempel 21

Syntese av N<EB29->(N-HOOC(CH2)i5CO-p-L-Asp) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 ved en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidylheptadekandioat og L-AspOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6104,2, beregnet 6104,1.

Eksempel 22

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-y-D-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 ved en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidyloktadekandioat og L-GluOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6132,4, beregnet 6132,2.

Eksempel 23

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-5-L-Aad) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 ved en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidyloktadekandioat og L-AadOtBu (fremstilt fra kommersielt L-Aad(OMe) ved tert-butylering med AcOtBu/BF3.0Et2og forsåpning av metylesteren), fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6116,9, beregnet 6118,1.

Eksempel 24

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i3CO-p-L-Asp) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidylpentadekandioat og L-AspOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6074,7, beregnet 6076,1.

Eksempel 25

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i3CO-p-L-Glu) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidylpentadekandioat og L-GluOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. MALDI-MS 6080,6, beregnet 6076,1.

Eksempel 26

Syntese av N<EB29->(N-HOOC(CH2)i4CO-p-L-Asp) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidylheksadekandioat og L-AspOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6089,1, beregnet 6090,1.

Eksempel 27

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i6CO-p-D-Asp) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butylsuksinimidyloksadekandioat og D-AspOtBu fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6117,1, beregnet 6118,1.

Eksempel 28

Syntese avNEB2<9->(N-HOOC(CH2)i4CO-IDA) des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 4 via en reaksjon mellom tert-butyl 3,4-dihydro-4-okso-l,2,3-benzotriazin-3-yl-heksadekandioat med iminodieddiksyre fulgt av en aktivering med TSTU, kobling med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. LCMS 6089,1, beregnet 6090,1.

Eksempel 29

Syntese avNEB2<9->[N-(HOOC(CH2)i6CO)-N-(karboksymetyl)-p-Ala] des(B30) humant insulin

A1N, BIN-diBoc DesB30 humant insulin (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen DU; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (186 mg, 0,031 mmol) ble løst i 1,8 ml DMSO. En løsning av tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OSu (27 mg, 0,04 mmol) i 1,8 ml THF og trietylamin (0,045 ml, 0,31 mmol) ble tilsatt (pH var 10). Etter langsom røring ved romtemperatur i 45 min. ble reaksjonen stoppet med 0,2 M metylamin i 0,20 ml THF. 5 ml vann ble tilsatt, og pH ble justert til 5,5 med 1 N HC1. Det isoelektriske bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering og frysetørket, noe som ga 150 mg produkt. Koblingsutbyttet var 74 % (LCMS m/z: 2148,9 [(M+3)/3], rt 5,04). Det beskyttede produktet ble løst i 2,5 ml TFA og hensatt i 1 time og så fordampet i vakuum. Råproduktet ble renset ved RP-HPLC på en C4-kolonne, buffer A: 0,1 % TFA, buffer B: MeCN + 0,1 % TFA; gradient 10-70 % B. De oppsamlede fraksjoner ble frysetørket. Utbyttet var 75 mg, 52 %. Renheten slik denne ble bedømt ved HPLC var 97,2 %. MALDI-MS: 6132,1, beregnet: 6132,2.

Fremstilling av tert- butvloktadekandiovl- N-( tert- butoksvkarbonylmetvl)- 3- Ala- OSu Oktadekandioinsyre (5,64 g, 17,9 mmol) ble løst i 80 ml toluen ved 115°C. N,N-dimetylformamid di-tert-butylacetal (12,9 ml, 53,8 mmol) ble så dråpevis tilsatt i løpet av 1,5 time. Etter koking med tilbakeløp i 3 timer ble det så tilsatt ytterligere 2,15 ml N,N-dimetylformamid di-tert-butylacetal i løpet av 20 min. Koking med tilbakeløp ble fortsatt over natten og ytterligere 2,15 ml N,N-dimetylformamid di-tert-butylacetal ble tilsatt i løpet av 20 min. Etter røring i ytterligere 2 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til RT. Vann og DCM ble tilsatt. Disyren kan fjernes ved filtrering. Filtratet ble konsentrert på 40 g silikagel og renset på en 1,5 L silikagelkolonne ved å bruke DCM/MeOH 14:1. Oktadekandionsyremono-tert-butylesteren ble isolert i et utbytte på 53 % (3,52 g).

LC-MS: 393 (M+Na), rt 6,40.

^-NMR (DMSO-de): 6 1,22 (br s, 24H), 1,38 (s, 9H), 1,47 (m, 4H), 2,14 (t, 2H), 2,18 ppm (t, 2H).

En løsning av mono-tert-butyloktadekandioat (1,00 g, 2,7 mmol) i 8 ml tørr THF ble tilsatt DIPEA (0,555 ml, 3,2 mmol) fulgt av TSTU (1,00 g, 3,2 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt under nitrogen i 18 timer. Løsemidlet ble så fordampet. Etylacetat ble tilsatt resten, og den resulterende suspensjonen ble filtrert. Filtratet ble vasket to ganger med 0,1 M HC1 og så med vann, tørket og konsentrert, noe som ga suksinimidyl tert-butyloktadekandioat som et hvitt fast stoff.

^-NMR (CDCb): 6 1,25 (m s, 20H), 1,39 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,58 (m, 4H), 1,74 (p, 2H), 2,2 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,85 ppm (m, 2H).

En suspensjon av H-Gly-OtBu (1,00 g, 6,0 mmol) i 6 ml tørr DMF ble tilsatt trietylamin (0,835 ml, 6,0 mmol). Det ble utfelt trietylaminhydroklorid. En løsning av benzyl akryl at (0,910 ml, 6,0 mmol) i 6 ml DMF ble tilsatt. Den resulterende suspensjonen ble rørt ved romtemperatur i 2 døgn. Bunnfallet ble frafiltrert, og filtratet ble konsentrert. Resten ble løst i etylacetat og vasket med mettet NaHCCh. Det organiske laget ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert til en klar olje som ble renset ved flashkromatografi ved å bruke etylacetat/heptan 1:3 og 1:1 som elueringsmiddel. N-tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OBn ble isolert i et utbytte på 29 % (0,505 g).

^-NMR (CDCb) 6: ppm 1,43 (s, 9H), 2,55 (t, 2H), 2,92 (t, 2H), 3,30 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 7,65 (m, 5H).

Suksinimidyl tert-butyloktadekandioat (0,15 g, 0,32 mmol) og N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-p-Ala-OBn (0,10 g, 0,32 mmol) ble løst i 2,5 ml DMF og tilsatt DIEA (0,070 ml, 0,38 mmol). Etter røring under nitrogen i 30 min. ble det tilsatt HOAt (0,045 g, 0,32 mmol), og blandingen ble gul. Røring ble fortsatt ved RT under nitrogen av hensiktsmessighetsårsaker i 13 døgn. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert. Resten ble løst i etylacetat, vasket to ganger med 0,1 N HC1 og vann, tørket over natrium sulfat og konsentrert, noe som ga tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OBn som en hvit olje. 205 mg, utbytte 99 %.

^-NMR (CDCb) 6: ppm 1,25 (m, 26H), 1,45 (s, 9H), 1,50 (s, 9H), 1,6 (m, 4H), 2,20 (t, 2H), 2,40 (t, 2H), 2,75 (q, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,97 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 7,35 (m, 5H).

Tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OBn (200 mg, 0,31 mmol) ble løst i 10 ml etylacetat og 5 ml THF. 10 % Pd/C ble tilsatt, og blandingen ble hydrogenert ved et trykk på 1 atm i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert og konsentrert, noe som ga tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OH som en klar olje. Utbytte 180 mg, 100 %.

<!>H-NMR (CDCb) 6: ppm 1,25 (m, 26H), 1,45 (s, 9H), 1,50 (s, 9H), 1,6 (m, 4H), 2,20 (t, 2H), 2,40 (t, 2H), 2,70 (m, 2H), 3,65 (m, 2H), 4,05 (s, 2H).

Tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-p-Ala-OH (0,110 g, 0,2 mmol) ble løst i 2 ml tørr THF. DIEA (0,045 ml, 0,24 mmol) og TSTU (0,075 g, 0,24 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble rørt under nitrogen i 18 timer og så filtrert. Etylacetat ble tilsatt filtratet og vasket to ganger med 0,2 M HC1, én gang med saltløsning, tørket over natriumsulfat og konsentrert, noe som ga tert-butyloktadekandioyl-N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OSu som en klar sirup. Utbytte 124 mg, 96 %.

^-NMR (CDCb) 5: ppm 1,25 (m, 26H), 1,40 (s, 9H), 1,57 (s, 9H), 1,6 (m, 4H), 2,40 (m, 4H), 2,58 (br s, 4H), 3,0 (t, 2H), 3,7 (t, 2H), 4,03 (s, 2H).

Eksempel 30

Syntese av N<EB29->[N-(HOOC(CH2)i6CO)-N-(2-karboksyetyl)-Gly] des(B30) humant insulin

A1N, BIN-diBoc DesB30 humant insulin (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen DU, Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731 (120 mg, 0,020 mmol) ble løst i 1,2 ml DMSO. En løsning av tert-butyloktadekandioyl-N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OSu (16 mg, 0,025 mmol) i 1,3 ml THF og trietylamin (0,033 ml, 0,24 mmol) ble tilsatt (pH var 10). Etter langsom røring ved romemperatur i 3 timer og 20 min. ble det tilsatt 4 ml vann, og pH ble justert til 5,5 med 1 N HC1. Det isoelektriske bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket med vann og isolert ved sentrifugering. Produktet ble så frysetørket. Råproduktet ble renset ved RP-HPLC på en Cl8-kolonne, buffer A: 0,1 % TFA, buffer B: MeCN + 0,1 % TFA; gradient 20-90 % B. De oppsamlede fraksjoner ble frysetørket. Det uoptimaliserte koblingsutbyttet var 15 mg, 11 % (MALDI-MS 6441, beregnet 6444,5). Det beskyttede produktet ble løst i 1 ml TFA og hensatt i 1 time og så fordampet i vakuum. Råproduktet ble renset ved RP-HPLC på en C4-kolonne, buffer A: 0,1 % TFA, buffer B: MeCN + 0,1 % TFA, gradient 10-80 % EtOH + 0,1 % TFA, gradient 15.60 % B, fulgt av HPLC på C4-kolonne, buffer A: 10 mM Tris +15 mM ammoniumsulfat i 20 % etanol, pH 7,3, buffer B: 80 % etanol, gradient 15.60 % B. De oppsamlede fraksjonene ble avsaltet på en Sep-Pak-kolonne med 70 % acetonitril + 0,1 % TFA, nøytralisert ved tilsetting av ammoniakk og så frysetørket. Det uoptimaliserte utbyttet var 1,8 mg, 13 %. Renheten bedømt ved HPLC var 96,4 %. MALDI: 6132,1, beregnet 6132,2.

Fremstilling av tert- butvloktadekandiovl- N-^- tert- butoksvkarbonvnetvn- Glv- OSu H-Gly-OBn, HC1 (3,03 g, 15 mmol) ble løst i 15 ml tørr DMF og avkjølt på et isbad. TEA (2,10 ml, 15 mmol) ble tilsatt under utfelling av TEA-hydroklorid. Suspensjonen ble rørt i 5 min. og så tilsatt t-butyl akryl at (2,20 ml, 15 mmol). Kjølebadet ble hensatt for oppvarming til romtemperatur og røring ble fortsatt under nitrogen i 2 døgn. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert. Resten som stadig inneholdt noe DMF, ble løst i etylacetat og vasket to ganger med mettet vandig NaHCCh, og én gang med vann. Det organiske laget ble filtrert før tørking med natriumsulfat, og konsentrasjon ga en gul olje. Rensing ved flashkromatografi eller preparativ HPLC ga N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OBn som en klar olje (0,739 g, 17 %).

^-NMR (CDCb) 5: ppm 1,46 (s, 9H), 2,50-2,61 (m, 2H) 2,82-2,99 (m, 2H) 3,31 (s, 2H) 5,14 (s, 2H) 7,29-7,43 (m, 5H).

N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OBn (0,030 g, 0,1 mmol) og suksinimidyl-tert-butyloktadekandioat (beskrevet i eksempel 29, 0,050 mg, 0,1 mmol) ble suspendert i 1 ml tørr DMF. HOAt (0,014 g, 0,1 mmol) og DIEA (0,21 ml, 1,2 mmol) ble tilsatt. Den gule reaksjonsblandingen ble rørt under nitrogen i 42 timer. Den ble så konsentrert. Resten ble løst i etylacetat og vasket to ganger med 0,1 N HC1 og én gang med vann, tørket over natriumsulfat og konsentrert, noe som ga tert-butyloktadekandioyl-N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OBn i et utbytte på 85 % (55 mg).

<!>H-NMR (CDCb) 6: ppm 1,3 (m, 26H) 1,38 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,6 (m, 4H), 2,2 (m, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,65 (m, 2H), 2,85 (s, 2H), 3,65 (m, 2H), 5,15 (s, 2H) 7,35 (m, 5H).

Tert-butyloktadekandioyl-N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OBn (0,054 g, 0,08 mmol) ble løst i 2 ml THF. 10 % palladium på trekull ble tilsatt, og blandingen ble hydrogenert ved 1 atm. og ved romtemperatur over weekenden. Den tørre reaksjonsblandingen ble løst i etylacetat og filtrert tre ganger for å fjerne karbonet. Filtratet ble konsentrert, noe som ga tert-butyloktadekandioyk-N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OH i et utbytte på 80 % (37 mg).

<!>H-NMR (CDCb) 5: ppm 1,3 (m, 26H) 1,40 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,6 (m, 4H), 1,75 (p, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,63 (m, 2H), 2,83 (s, 2H).

0,07 mmol Tert-butyloktadekandioyl-N-(2-(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OH ble løst i 2 ml tørr THF. TSTU (24 mg, 0,08 mmol) og DIPEA (15 ul, 0,08 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved RT under nitrogen. Etter 19 timer var reaksjonen ikke fullstendig ifølge TLC (DCM/metanol 10:1). Mer DIEA ble tilsatt 20 ul, 0,11 mmol) og røringen ble fortsatt. Etter 42 timer ble reaksjonsblandingen filtrert. Filtratet ble fortynnet med etylacetat og vasket to ganger med 0,1 N HC1 og én gang med saltløsning, tørket over natriumsulfat og konsentrert til tert-butyloktadekandioyl-N-(2-(tert-butyloksykarbonyl)etyl)-Gly-OSu som et hvitt fast stoff i et utbytte på 84 % (36 mg).

<!>H-NMR (CDCb) 5: ppm 1,3 (m, 26H) 1,40 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,58 (m, 2H), 1,73 (p, 2H), 2,2 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,8 (m, 6H).

Eksempel 31

Syntese avNEB2<9->[N-(HOOC(CH2)i4CO)-N-(karboksyetyl)-Gly] des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 30, via en reaksjon mellom N-(2-

(tert-butoksykarbonyl)etyl)-Gly-OBn med suksinimidylheksadekandioat (beskrevet i eksempel 4) fulgt av en debenzylering, aktivering med TSTU, kobling med AlN,BlN-diBOC-Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. MALDI-MS: 6093,0, beregnet 6104,1.

Eksempel 32:

Syntese avNEB2<9->[N-(HOOC(CH2)i4CO)-N-(karboksyetyl)-p-Ala] des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 29, via en reaksjon mellom N-(tert-butoksykarbonylmetyl)-P-Ala-OBn med suksinimidylheksadekandioat (beskrevet i eksempel 4) fulgt av en debenzylering, aktivering med TSTU, kobling med AlN,BlN-diBOC-Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved TFA. MALDI-MS: 6097,6, beregnet 6104,1.

Eksempel 33

Syntese av N<EB29->[Na<->(HOOC(CH2)nNHCO(CH2)3CO)-y-L-Glu] des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 1, ved å bruke (MeOOC(CH2)iiNHCO(CH2)3CO)-Clu(OSu)-OMe, fremstilt som beskrevet i det etterfølgende, som acyleringsmiddel.

LCMS (elektrospray): M+3: 2049, beregnet 2050; M+4: 1538, beregnet 1537,8; M+5: 1231, beregnet 1230,4.

MALDI-TOF MS: beregnet: 6147, funnet: 6153.

Fremstilling av ( MeOOC( CH2hnNHCO( CH2) 3COVGlu( OSuVOMe

40 ml metanol ble avkjølt til mellom 0 og 5°C og så dråpevis tilsatt 4 ml SOCh

under røring i løpet av 30 min. 12-aminododekaoinsyre (3 g, 13,9 mmol) ble tilsatt, og den resulterende suspensjonen ble rørt ved 0-5°C mens isen i kjølebadet smeltet, hvoretter reaksjonsblandingen ble hensatt for oppvarming til romtemperatur og rørt i 16 timer. Blandingen ble så filtrert, og det faste stoff tørket ved vannsug, noe som ga 2,23 g (60 %) 12-aminododekaoinsyremetylesterhydroklorid. Fra moderluten ble det isolert en ytterligere porsjon på 0,92 g (25 %).

^-NMR (DMSO-de) 6: 7,97 (bs, 3H), 3,58 (s, 3H), 2,73 (m, 2H, 2,28 (t, 2H), 1,52 (m, 4H), 1,25 ("s", 14H).

12-aminododekaoinsyremetylesterhydroklorid (1 g, 3,8 mmol) ble suspendert i 15 ml THF og tilsatt glutarsyreanhydrid (1,29 g, 3,8 mmol) og TEA (0,52 ml, 3,8 mmol), og den resulterende blandingen (suspensjon) ble rørt ved romtemperatur i 16 timer. 75 ml vann ble så gradvis og forsiktig tilsatt. Etter 25 ml tilsetning ble det oppnådd en løsning som senere gikk over til en suspensjon. Denne ble rørt ved romtemperatur i 1 time og så filtrert. Det faste stoff ble vasket med vann og tørket i vakuum. Dette ga 1,02 g (80 %) av 12-(4-karboksybutyrylamino)dodekaoinsyremetylester.

^-NMR (DMSO-de) 6: 12 (bs, 1H), 7,73 (t, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,00 (q, 2H), 2,28 (t, 2H), 2,18 (t, 2H), 2,06 (t, 2H), 1,69 (p, 2H), 1,50 (p, 2H), 1,36 (pm 2H), 1,23 ("s", 14H).

12-(4-karboksybutyrylamino)dodekaoinsyremetylester (0,33 g, 0,95 mmol) ble løst i en blanding av THF og DMF (2:1, 6 ml), og tilsatt DIEA (0,178 ml, 1,04 mmol). Blandingen ble avkjølt til mellom 0 og 5°C og tilsatt TSTU (0,314 g, 1,04 mmol). Den ble så rørt ved 0-5°C i 1 time og ved romtemperatur i 16 timer. Den ble så konsentrert til tørrhet i vakuum. Resten (OSu-aktivert 12-(4-karboksybutyrylamino)dodekaoinsyremetylester) ble løst i 10 ml DMF og tilsatt DIEA (0,24 ml, 1,4 mmol) og H-Glu-OMe (0,168 g, 1,04 mmol), og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 16 timer. Den ble så konsentrert i vakuum, og resten ble løst i 100 ml etylacetat og vasket med 3 x 50 ml 0,2 M saltsyre. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Dette ga 0,358 g (78 %) av (MeOOC(CH2)ii)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe.

^-NMR (DMSO-de) 6: 12 (bs, 1H), 8,22 (d, 1H), 7,73 (t, 1H), 4,24 (m, 1H), 3,61 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,00 (q, 2H), 2,27 (m, 4H), 2,10 (t, 2H), 2,04 (t, 2H), 1,9 (m, 1H), 1,8 (m, 1H), 1,68 (t, 2H), 1,50 (m, 2H), 1,36 (m, 2H), 1,23 ("s"m 14H).

(MeOOC(CH2)ii)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe (0,36 g, 0,36 mmol) ble løst i 10 ml THF og avkjølt til mellom 0 og 5°C. DIEA (0,13 ml) og TSTU (0,129 g, 0,43 mmol) ble tilsatt blandingen som ble rørt ved 0-5°C i et par timer, og ved romtemperatur i 3 døgn. Blandingen ble så konsentrert i vakuum. Resten ble løst i 100 ml etylacetat og vasket tre ganger med 50 ml 0,2 N saltsyre og tre ganger med 100 ml av en mettet NaHCCh-løsning. Tørking over natriumsulfat og konsentrering i vakuum ga 0,17 g (84 %) av (MeOOC(CH2)ii)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe.

<!>H-NMR (DMSO-de), utvalgte topper, 6: 8,27 (d, 1H), 7,72 (t, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,00 (q, 2H), 2,81 (s, 4H), 2,28 (t, 2H), 2,12 (t, 2H), 2,05 (t, 2H), 1,70 (m, 2H), 1,50 (m, 2H), 1,35 (m, 2H), 1,23 ("s", 14H).

Eksempel 34

Syntese av NEB29-[Na-(HOOC(CH2)n)NHCO(CH2)2CO)-y-L-Gly] des(B30) humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 1 ved å bruke (MeOOC(CH2)n)NHCO(CH2)2CO)-Glu(OSu)-OMe, som igjen ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 33 ved å bruke ravsyreanhydrid istedenfor glutarsyreanhydrid som acyleringsmiddel.

MALDI-TOF MS: beregnet: 6133; funnet: 6134.

Eksempel 35

Syntese avNEB2<9->[Na<->(HOOC(CH2)i6CO)]-Gly-Y-L-Glu des(B30) humant insulin Forbindelsen ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 4 ved å bruke tert-butyloktanknadioyl-Gly-Gly(OSu)-O<t>Bu, fremstilt som beskrevet i det etterfølgende, som acyleringsmiddel.

MALDI-TOF MS: beregnet: 6189; funnet: 6191.

Fremstilling av tert- butvloktadekandiovl- Glv- Glu( OSuVOtBu Z-Gly-OH (1,0 g, 4,78 mmol) ble tilsatt 10 ml THF, DIEA (0,98 ml, 5,74 mmol) og TSTU (1,7 g, 5,74 mmol) og den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer. 100 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen ble vasket med 100 ml 0,2 N saltsyre og to ganger med 100 ml vann. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum, og dette ga 1,34 g (92 %) av Z-Gly-OSu som en olje.

^-NMR (CDCb) 5: 7,35 (s, 5H), 5,32 (t, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,35 (d, 2H), 2,83 (s, 4H).

Z-Gly-OSu (1,3 g, 4,25 mmol) ble løst i 15 ml DMF og DIEA (1,82 ml, 10,6 mmol) og H-Glu-OtBu (0,949 g, 4,67 mmol), og den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur i 16 timer. 100 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen ble vasket med 100 ml 2 N saltsyre og to ganger med 100 ml vann. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum, og dette ga 1,7 g (kvantitativt utbytte) av Z-Gly-Glu-OtBu som en olje.

^-NMR (CDCb) 5: 7,33 (s, 5H), 7,1 (d, 1H), 5,80 (t, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,53 (m, 1H), 3,90 (d, 2H), 2,36 (t, 2H), 2,22 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,45 (s, 9H).

Z-Gly-Glu-OtBu (1,7 g, 4,3 mmol) ble løst i 15 ml 1,4-dioksan i en nitrogenatmosfære, hvoretter det ble tilsatt 0,6 g 10 % svart palladium. Blandingen ble hydrogenert ved atmosfærisk trykk i 5 timer. Den ble så filtrert, og palladiet ble rørt med 200 ml vann i 2 timer, filtrert, hvoretter filtratet ble frysetørket. Dette ga 0,65 g (58 %) av H-Gly-Glu-OtBu.

<!>H-NMR (DMSO-de), utvalgte topper, 8: 8,31 (d, 1H), 2,20 (t, 2H), 1,91 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,40 (s, 9H).

H-Gly-Glu-OtBu (0,15 g, 0,58 mmol) ble suspendert i 5 ml DMF og DIEA (0,15 ml, 0,86 mmol) og så tilsatt suksinimidyl tert-butyloktadekandioat (0,27 g, 0,58 mmol), og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 16 timer. 50 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen ble vasket med 100 ml 0,2 N saltsyre og tre ganger med 100 ml vann. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum, og dette ga 0,34 g (kvantitativt utbytte) av tert-butyloktadekandioyl-Gly-Glu-OtBu.<!>H-NMR (CDCb), 6: 7,11 (d, 1H), 6,55 (t, 1H), 4,55 (dt, 1H), 4,00 (dq, 2H), 2,40 (t, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,20 (t, 4H), 2,00 (m, 1H), 1,57-1,65 (m, 5H), 1,47 (s, 9H), 1,44 (s, 9H), 1,25 ("s", 22H, overlapping med HDO).

Tert-butyloktadekandioyl-Gly-Glu-OtBu (0,32 g, 0,52 mmol) ble løst i 5 ml THF og tilsatt DIEA (0,11 ml, 0,63 mmol) og TSTU (0,19 g, 0,63 mmol), og den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur i en nitrogenatmosfære i 3 døgn. 100 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen ble vasket med 100 ml 0,15 N saltsyre og tre ganger med 100 ml vann. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum, og dette ga 0,3 g (81 %) av tert-butyloktadekandioyl-Gly-Glu(OSu)-OtBu.

^-NMR (DMSO-de), utvalgte topper, 5: 6,89 (d, 1H), 6,44 (t, 1H), 4,60 (m, 1H), 3,95 (dq, 2H), 2,86 (s, 4H), 2,68 (q, 2H), 2,24 (t, 2H), 2,20 (t, 4H), 1,57-1,65 (m, 5H), 1,48 (s, 9H), 1,44 (s, 9H), 1,25 ("s", 22H, overlapping med HDO).

Eksempel 36

Syntese avNEB2<9->[N-(HOOC(CH2)i4CO)-N-(2-karboksyetyl)-p-Ala] des B30 humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 1 via kobling av 15-[[2-(2,5-diokso-pyrrolidin-l-yloksykarbonyl)-etyl]-(2-metoksykarbonyl-etyl)-karbamoyl]-pentadekanoinsyremetylester med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved NaOH.

LC-MS: M+4. 1530,3, beregnet 1529,5.

Fremstilling av N-( 2- metoksvkarbonvOetvO- 3- Ala- OSu

H-p-Ala-OMe-hydroklorid (5,45 g, 39 mmol) ble løst i 100 ml DMSO og tilsatt tert-butylakrylat (5,71 ml, 39 mmol) og DIEA (13,4 ml, 78 mmol), og den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur i 6 døgn. Den ble så delt med 500 ml vann og 2 x 250 ml etylacetat. De samlede organiske faser ble vasket med en mettet vandig NFUCl-løsning, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Dette ga 7,24 g (80 %) av N-(2-metoksykarbonyl)etyl)-p-Ala-OtBu.

^-NMR (CDCb) 6: 3,58 (s, 3H), 2,72 (t, 2H), 2,67 (t, 2H), 2,41 (t, 2H), 2,29 (t, 2H), 1,39 (s, 9H).

Heksadekandionsyremonometylester (150 mg, 0,5 mmol) ble løst i 5 ml DMF. HOAt (102 mg, 0,75 mmol) og EDAC (143 mg, 0,75 mmol) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt ved 50°C i 1 time. Etter avkjøling til romtemperatur ble det tilsatt DIEA (0,256 ml, 1,5 mmol) og N-(2-(metoksykarbonyl)etyl)-p-Ala-OtBu (139 mg, 0,6 mmol). Reaksjonsblandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. Den ble så delt mellom 2 x 50 ml vann og 100 ml etylaceta. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum til en olje. 10 ml DCM og 10 ml TFA ble tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 time ved romtemperatur, hvoretter løsemidlet ble fjernet i vakuum, og dette ga 170 mg 87 % av metylheksadekandioyl-N-(2-(metoksykarbonyl)etyl-P-Ala-OH.

LC-MS: 458 (M+l).

Metylheksadekandioyl-N-(2-(metoksykarbonyl)etyl-P-Ala-OH (161 mg, 0,351 mmol) ble løst i 10 ml THF og ble så tilsatt DIEA (0,073 ml, 0,42 mmol) og TSTU 127 mg, 0,42 mmol). Blandingen ble rørt under avkjøling på et isbad i 30 min. fulgt av røring i 2 timer ved romtemperatur. Blandingen ble delt mellom 100 ml etylacetat og 2 x 80 ml 0,2 N vandig HC1. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Dette ga 140 mg (72 %) av metylheksadekandioyl-N-(2-(metoksykarbonyl)etyl)-P-Ala-OSu som en olje. LC-MS: 555 (M+l).

Eksempel 37

Syntese avNEB2<9->[N-(HOOC(CH2)i6CO)-N-(2-karboksyetyl)-p-Ala] des B30 humant insulin

Forbindelsen ble fremstilt i analogi med eksempel 1 og 36 via kobling med metyloktadekandioyl-N-(2-metoksykarboyl)etyl)-P-Ala-OSu med Des(B30) humant insulin og avbeskyttelse ved NaOH.

Fremstilling av metyloktadekandiovl- N-( 2- metoksvkarbonyl) etvl)- P- Ala- OSu Forbindelsen ble syntetisert i ananlogi med metylheksadekandioyl-N-(S-(metylkarbonyl)etyl)-P-Ala-OSu ved å bruke oktadekandionsyremonometylester.

MALDI-TOF MS: beregnet 6146, funnet 6151

LC-MS: 583 (M+l).

FARMAKOLOGISKE METODER

Prøve (I)

Insulinreseptorbinding av insulinderivater ifølge oppfinnelsen

Affiniteten for insulinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse for den humane insulinreseptoren ble bestemt ved en SPA-prøve (scintillasjonsnærhetsprøve), en mikrotiterplateantistoffinnfangningsprøve. SPA-PVT antistoffbindende perler, anti-mus reagens (Amersham Biosciences, kat. nr. PRNQ0017) ble blandet med 25 ml bindebuffer (100 mM HEPES, pH 7,8; 100 mM natriumklorid, 10 mM MgS04, 0,025 % Tween-20). Reagensblandingen for en enkelt Packard Optiplate (Packard nr. 6005190) er sammensatt av 2,4 ul av et 1:5000 fortynnet renset rekombinant human insulinreseptor - ekson 11, en mengde av en lagerløsning av A14 Tyr[125I]-humant insulin som tilsvarer 5000 cpm pr. 100 ul reagensblanding, 12 ul av en 1:1000 fortynning av F12 antistoff, 3 ml SPA-perler og bindebuffer til et totalt volum på 12 ml. Totalt ble 100 ul tilsatt, og det ble utført fortynningsserier fra passende prøver. Fortynningsseriene ble så tilsatt 100 ul av reagensblandingen, hvoretter prøvene ble inkubert i 16 timer under forsiktig risting. Fasene ble så skilt ved sentrifugering i 1 min., hvoretter platene ble tellet i en Topocounter. Bindingsdata ble justert ved å bruke en ikke-lineær regresjonsalgoritme i GraphPad Prism 2.01 (GrapPad Software, San Diego, CA).

Fremstilling av monoklonale mER-antistoffer

Spesifikke antistoffer (F 12) ble fremstilt ved en monoklonal teknikk: RBF-mus ble immunisert ved å injisere 50 ug renset mIR i FCA subkutant fulgt av to injeksjoner med 20 ug mIR i FIA. Sterktreagerende mus ble supplert intravenøst med 25 ug mIR, og miltene ble innhøstet etter 3 døgn. Miltcellene ble fusjonert med my ol om fokscellelinjen (Kohler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al. (1983), Science 219: 1228-30). Supernatantene ble så undersøkt for antistoffproduksjon i en mIR-spesifikk ELISA. Positive brønner ble klonet og testet i Western blotting.

Prøve (II)

Styrken på insulinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til

humant insulin

Sprague Dawley hannrotter som veide fra 238-383 g på eksperimentdagen ble brukt for clamp-eksperimentet. Rottene hadde fri adgang til for under kontrollerte omgivelsesbetingelser og fastet over natt (fra 15.00) ifølge clamp-eksperimentet.

Eksperimentell protokoll

Rottene ble akklimatisert i forhold til burene i minst 1 uke før de kirurgiske inngrep. Ca. 1 uke før clamp-eksperimentet ble Tygo-katetere innsatt under bedøvelse med halotan i lårvenen (for infusjon) og i karotidarterien (for blodprøveuttak) forlenget utvendig og festet på baksiden av nakken. Rottene ble gitt streptosilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0,15 ml/rotte, i.m.) etter det kirurgiske inngrepet og plassert i en dyrepleieenhet (25°C) under oppvåkningsperioden. For å oppnå smertefrihet ble det administrert anorfin (0,06 mg/rotte s.c.) under bedøvelsen, og Rimadyl (1,5 mg/kg s.c.) ble administrert etter full oppvåkning av bedøvelsen (2-3 timer), og igjen én gang daglig i 2 døgn.

Den clamp-teknikk som ble brukt, var tilpasset fra (1). klokken 7.00 på eksperimentdagen ble rottene som var fastet over natten (fra klokken 15.00 dagen før) veiet og forbundet med prøvesprøytene og infusjonssystemet (Harvard 22 Basic pumps, Harvard og Perfectum hypodermisk glassprøyte, Aldrich) og plassert i individuelle clampbur hvor de hvilte i ca. 45 min. før eksperimentet startet. Rottene kunne bevege seg fritt på underlaget under hele eksperimentet og hadde fri adgang til drikkevann. Etter en 30 min. basalperiode hvor plasmaglukosenivåene ble målt med 10 min. mellomrom, ble insulinderivatene som skulle testes, og humant insulin (ett dosenivå pr. rotte, n = 6-7 pr. dosenivå) infusert (i.v.) i en konstant hastighet i 300 min. Plasmaglukosenivåene ble målt med 10 min. mellomrom under hele eksperimentet, og en infusjon av 20 % vandig glukose ble justert alt etter behov for å opprettholde euglykemi. Prøver av resuspenderte erytrocytter ble slått sammen fra hver rotte og ført tilbake i ca. V2 ml volumer via karotidkateteret.

På hver eksperimentdag ble prøver av løsningene av de individuelle insulinderivater som skulle testes, og den humane insulinløsningen, tatt før og etter clamp-eksperimentene, og konsentrasjonene av peptidene ble bekreftet ved HPLC. Plasmakonsentrasj onene av rotteinsulin og C-peptid så vel som det insulinderivat som skulle testes og det humane insulinet, ble målt på relevante tidspunkter før og etter undersøkelsen. Rottene ble avlivet ved slutten av hvert eksperiment ved å bruke en overdose av pentobarbital.

Prøveforbindelser og doser: De insuliner som skulle testes, ble fortynnet fra en lagerløsning som inneholdt 97 uM av insulinderivatet i 5 mM fosfatbuffer pH 7,7. Sluttkonsentrasjonen i løsningen som var ferdig for bruk, var 0,45 uM av insulinderivatet, 5 mM fosfat, 100 mM natriumklorid, 0,007 % polysorbat 20. pH var 7,7, og infusjonsmengden var 15 og 20 pmol/min/Vkg"<1>kroppsvekt.

En lagerløsning av humant insulin som ble brukt som en referanseforbindelse, ble opparbeidet i et lignende medium og infusert i.v. i en mengde på 6, 15 eller 30 pmol/min/Vkg"<1>kroppsvekt.

Begge lagerløsningene ble lagret ved -20°C og tint over natten ved 4°C før bruk. Løsningene ble forsiktig vendt opp-ned flere ganger 15 min. før de ble overført til infusj onssprøytene.

Prøve (III)

Bestemmelse i griser av Tso%for insulinderivatene ifølge oppfinnelsen

Tso%er det tidsrom når 50 % av en injisert mengde av A14 Tyr[<125>I] merket derivat av et insulinderivat som skal testes, er forsvunnet fra injeksjonsstedet slik at det kan måles ved en ekstern y-teller.

Prinsippene for laboratoriedyrbehandling ble fulgt, spesifikke patogenfrie LYYD, ikke-diabetiske hunngriser, krysninger av dansk landrase, Yorkshire og Duroc, ble brukt (Holmenlund, Haarløv, Danmark) for farmakokinetiske og farmakodynamiske undersøkelser. Grisene var bevisste, hadde en alder på fra 4-5 måneder og veide fra 70-95 kg. Dyrene ble fastet over natten 18 timer før eksperimentet.

Opparbeidede preparater av insulinderivater merket i TyrA14med<1>25I ble injisert sc. i grisene slik det er beskrevet tidligere (Ribel, U., Jørgensen, K, Brange, J, og Henriksen, U. The pis as a modell for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M og Lefébvre, P.J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceedings)).

Ved begynnelsen av eksperimentene ble en dose på 60 nmol av insulinderivatet ifølge foreliggende oppfinnelse (testforbindelsen) og en dose på 60 nmol av insulindetemir (både<125>I merket i Tyr A14) injisert på to separate steder i nakken på hver gris.

Forsvinningen av den radioaktive markøren fra injsksjonsstedet ble kontrollert ved å bruke en modifikasjon av den tradisjonelle eksterne gamma-tellingsmetoden (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. og Gries, F. A. 70-77

(1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceedings)). Med denne modifiserte fremgangsmåten er det mulig å måle kontinuerlig forsvinningen av radioaktivitet fra et subkutant depot over flere døgn ved å bruke en trådløs bærbar anordning (Scancys Laboratoriueteknik, Værløse, DK-3500 Danmark). Målingene ble utført med 1 min. mellomrom, og de tellede verdier ble korrigert for bakgrunnsakti vitet.

I tabell 4 viser kolonnen "test/detemir" den Tso%-verdi som ble funnet for hver av de testede forbindelsene ("test"), og den Tso%-verdi som ble funnet for insulin detemir ("detemir") i det samme eksperimentet.

Claims

1. Insulinderivat til des(B30) humant insulin som har en sidekjede knyttet til a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller til e-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden i des(B30) insulin,karakterisert vedat sidekjeden har følgende generelle formel:

hvor W er: • et a-aminosyreresidum med en karboksylisk syregruppe i sidekjeden hvor residumet danner, med én av sine karboksylsyregrupper, en amidgruppe sammen med a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller sammen med s-aminogruppen til en Lys-residium tilstede i B-kjeden til des(B30) humant insulin; hvori a-aminosyren er y-Glu: eller • en kjede sammensatt av to a-aminosyreresidua forbundet via amidbindinger, hvor kjede - via en amidbinding - er forbundet til a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden, eller til s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden til des(B30) humant insulin, og hvor aminosyreresiduaene i W er valgt fra gruppen bestående y-Glu-Gly; Gly-y-Glu; a-Asp-y-Glu; y-Glu-a-Asp; P-Asp-y-Glu; y-Glu-P-Asp; a-Glu-y-Glu; y-Glu-a-Glu; y-Glu-a-hGlu; a-hGlu-y-Glu; y-Glu-y-Glu; y-Glu-5-hGlu; 5-hGlu-y-Glu; ; eller X er:

slik at når W er et aminosyreresidum eller en kjede av aminosyreresidua, så vil det via en binding fra det umettede karbonylkarbonatomet danne en amidbinding med en aminogruppe i W, Yer: • -(CH2)m- hvor m er et tall varierende fra 6-32; • en divalent hydrokarbonkjede som omfatter 1, 2 eller 3 -CH=CH- grupper og et antall -CH2- grupper som er tilstrekkelig til å gi et totalt antall karbonatomer i kjeden som varierer fra 10-32; • en divalent hydrokarbonkjede med formelen -(CH2)vC6H4(CH2)w- hvor v og w er tall, eller én av dem er null, slik at summen av v og w varierer fra 6-30; Z er -COOH og ethvert Zn<2+->kompleks av disse.

2. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert vedat sidekjeden -W-X-Y-Z er knyttet til a-aminogruppen i det N-terminale aminosyreresidumet i B-kjeden til des(B30) humant insulin.

3. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert vedat sidekjeden -W-X-Y-Z er knyttet til s-aminogruppen i et Lys-residum som er tilstede på B-kjeden til des(B30) humant insulin.

4. Insulinderivat ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert vedat W er en kovalent binding.

5. Insulinderivat ifølge ethvert av kravene 3, karakterisert vedat X er

6. Insulinderivat ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert vedatYer -(CH2)m- hvor m er et tall fra 6-32, fra 8-20, fra 12-20, eller fra 12-16.

7. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert vedå være NEB29-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu) des(B30) humant insulin.

8. Sinkkompleks av et insulinderivat ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat hver insulinheksamer binder to sinkioner, tre sinkioner eller fire sinkioner.

9. Farmasøytisk sammensetning for behandling av diabetes i en pasient som har behov for slik behandling, karakterisert vedå omfatte en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge krav 1 sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

10. Farmasøytisk sammensetning for behandling av diabetes i en pasient som har behov for slik behandling, karakterisert vedå omfatte en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge krav 1 i blanding med et insulin eller en insulinanalog som har rask virkningsgrad, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Farmasøytisk preparat i følge krav 10, hvori insulinderivatet er N6829-^"-(HOOC(CH2)i4CO)-y-Glu) des(B30) humant insulin og insulin analogen som har en rask virkningsgrad er Asp<828>humant insulin.

12. Insulinderivat ifølge krav 1 for anvendelse som et medikament for behandling av diabetes i en pasient med behov for slik behandling omfattende å administrere til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge krav 1, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

13. Insulinderivat i følge krav 1 for anvendelse som et medikament for behandling av diabetes i en pasient med behov for slik behandling omfattende å administrere til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et insulinderivat ifølge krav 1, i blanding med et insulin eller en insulinanalog som har rask virkningsgrad, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.