KR0178022B1 - 단백질-다가양이온 결합체 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 반응 혼합물의 이온 교환 크로마토그래피를 도시한 것이고,
제2도 및 제3도는 SDS 전기영동 결과를 도시한 것이며,
제4도는 다가 양이온에 대한 DNA의 결합을 겔 이동 변위 분석을 통해 도시한 것이고,
제5도는 배양된 닭 적아구의 형광 현상도이며,
제6도는 세포의 헤모글로빈 함량을 도시한 것이고,
제7도는 트랜스페린-폴리라이신 결합체에 의해 세포내로 효과적으로 수송될 수 있는 tDNA의 크기에 상응하는 크기의 DNA를 도시한 것이며,
제8도 및 제9도는 TfpL/DNA 및 Tfprot/DNA 비를 사용 하여 측정한 유전자 수송 시스템의 감도를 도시한 것이고,
제10도는 복합체에 의해 수행되는 루시페라제의 활성을 도시한 것이며,
제11도는 두개의 tRNA 리보자임 유전자의 작제도이고,
제12도는 세포에 의한 DNA의 흡수를 도시한 것이며,
제13도는 결합체 및 복합체가 HD3 세포에 결합하는 방식을 도시한 것이고,
제14도는 세포에 의한 결합체 또는 복합체의 흡수를 도시한 것이며,
제15도는 βGal 리포터 유전자를 발현하는 형광물질-함유 세포의 균일한 분포를 도시한 것이다.
본 발명은 다가 양이온에 대한 친화도를 갖는 물질, 특히 핵산을 세포내로 수송하는 것에 관한 것이며, 이때, 수송은 수용체-매개된 식작용(endocytosis)을 통해 이루어진다.
안티센스 RNA 및 DNA가 생 세포내에서 뿐만 아니라 세포-유리 시스템내의 특정 유전자 서열을 선택적으로 억제 하는데 효과적인 제제임이 밝혀졌다. 이들의 활성 양상은 상보 핵산 쇄를 특이적으로 인지하고 이에 부착함으로써, 전사, 해독 및 절단 과정에 영향을 미친다는 사실에 근거하고 있다. 이러한 활성 기작은 이론적으로는 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 생체내 특정 유전자(예: 탈조절된 온코진 또는 바이러스 유전자)의 발현을 차단하는 치료제로서 사용할 수 있게 한다. 비록 핵산의 강한 음전하로 인해 이의 세포막내로의 부분적으로 제한된 흡수 때문에 핵산의 세포내 농도가 낮다 할지라도, 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포내에 도입시켜 세포내에서 이들의 억제 활성을 수행시킬 수 있음이 이미 밝혀졌다[참조: Zamecnik et al., 1986].
유전자를 선택적으로 억제하는 또 다른 방법은, 특정 RNA 서열을 인지하고 이에 결합되며 이들을 절단할 수 있는 RNA 분자, 즉 리보자임(ribozyme)의 사용을 포함한다. 또한 세포내로의 수송은 제한 요인중의 하나이므로, 세포내에 활성 리보자임의 가능한 최고 농도를 보장해야만 한다.
이러한 제한 요인을 제거하기 위하여, 수많은 해결책들이 이미 제시되었다.
이러한 해결책중 하나는 하전된 포스포디에스테르 그룹을 비하전된 메틸 포스포네이트(Smith et al., 1986), 카바메이트(Stirchak et al., 1987) 또는 실릴화합물 (Cormier et al., 1988)로 치환하거나 포스포로티오에이트 (Stern et al., 1988)를 사용하는 핵산의 직접 변형법을 포함한다. 가능한 또 다른 직접 변형법은 뉴클레오시드 동족체의 사용을 포함한다(Morvan et al., 1988, Praseuth et al., 1988).
비록 이들 제안중 몇몇이 문제 해결의 가능성을 제시하고 있는 것처럼 보이기는 하지만, 이들 제안은, 예를 들어, 표적 분자에 대한 결합을 감소시키고 억제 효과를 저하시킨다는 커다란 단점을 갖는다. 또한 변형 올리고뉴클레오티드의 생채내 사용의 주요간 단점은 이들 화합물이 독성을 가질 수 있다는 것이다.
올리고뉴클레오티드의 직접 변형에 관한 또다른 방법은 올리고뉴클레오티드 자체는 변화시키지 앉은 채로 남겨두고, 이 뉴클레오티드에 목적하는 특징을 부여하는 그룹, 예를 들어 세포내로의 수송을 좀 더 쉽게 만드는 분자를 뉴클레오티드에 제공함을 포함한다. 상기 원리의 범주내에서 제시된 해결책중 하나는 올리고뉴클레오티드를 다가 양이온 화합물에 결합시키는 것이다(Lemaitre et al., 19870.
시험관내 포유동물 세포의 유전학적 형질 전환에 대한 다양한 기술이 공지되어 있으나 생체내에서의 이들 기술의 사용은 제한된다(여기에는 바이러스, 리포좀, 전기천공, 미세 주사, 세포 융합, DEAE 덱스트란 또는 인산칼슘 침전법에 의한 DNA의 도입을 포함한다).
따라서 수용체-매개 식작용에 의한 직접적인 방법을 통해 DNA를 세포내로 운반할,생체내에서 이용가능한 가용성 시스템을 개발하려는 시도가 있어 왔다[참조: G.Y. Wu, C.H. Wu, 1987]. 상기 시스템은 간세포를 대상으로 개발되었으며, 근본적으로 하기 두 요인에 근거하고 있다.
1. 간 세포 표면에는 특이적 당단백질과 결합하여 이들을 세포내로 운반하는 수용체가 있다.
2. 강한 정전기적 인력을 통해 DNA를 다가 양이온 화합물, 예를 들어, 폴리라이신에 결합시켜 가용성 복합체를 형성할 수 있다.
이러한 시스템은 폴리라이신을, 수용체가 반응하는 종류의 당단백질과 커플링시킨 다음, DNA를 가하여, 당단백질 수용체를 함유하는 세포로 수송되고 복합체가 세포내로 흡수된 후에 DNA 서열이 발현될 수 있는, 가용성 당단백질/폴리라이신/DNA 복합체 형성의 원리에 근거한 것이다.
본 발명의 목적은, 하나의 특정 세포 유형에 대한 수용체가 특이적으로 존재하기 때문에 이러한 하나의 세포 유형에만 사용될 수 있는 공지된 시스템보다 훨씬 더 광범위하게 적용될 수 있는 고도의 능동 수송 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명에 따르면, 상기 문제에 대한 해결 방안은 다가 양이온이 트랜스페린에 결합된다는 사실에 있다.
트랜스페린은 생체내에서 철에 대한 특이성을 갖는 금속-결합 수송 당단백질과 관련된 부류이다. 다양한 포유 동물의 트랜스페린은 대부분의 체조직에 철을 공급하는 혈장 트랜스페린으로 동정되었다. 트랜스페린의 주요생산자는 간이다.
트랜스페린은 약 80,000의 분자량을 가지며, 이의 6%가 당 잔기로 구성된다.
트랜스페린 한 분자는 2개의 철 분자와 결합할 수 있으며, 이러한 결합은 탄산염 또는 중탄산염 이온을 필요로 한다.
다양한 세포상에서 서로로부터 약간 상비할 수 있는 여러가지 형태(예: 탄수화물 그룹에 있어서)로 존재하는 트랜스페린 수용체는, 약 180,000의 분자량을 갖는 막전이 당단백질이며, 수용체 한 분자가 트랜스페린 한 분자 또는 가능하게는 두 분자와 결합할 수 있다.
생리학적 pH 7 4에서, 트랜스페린 수용체는 Fe2트랜스페린에 대해 매우 높은 친화도를 가지고, Fe 트랜스페린에 대해서는 좀더 낮은 친화도를 가지며, pH 5에서 아포트랜스페린이 수용체와 매우 안정한 복합체를 형성함에도 불구하고, 아포트랜스페린에 대해서는 사실상 친화도를 갖지 않는다.
트랜스페린 수용체는 적혈구, 태반 및 간의 전구물질에서 특히 많이 검출되며, 많은 다른 체조직내에서도 측정가능한 양으로 존재한다. 특히 흥미로운 관찰은 성장 세포내에서 수용체가 고도로 조절된다는 것이다. 또한 수용체의 수가 양성 병변과 비교하여 생체내 신생 조직내에서 상당히 증가되었음이 관찰되었는데, 이는 철 필요성이 증가함을 지시해준다. 수용체에 의한 트랜스페린-철 복합체의 흡수 기작 및 이의 세포내 사이클은 철저하게 조사된 바 있다.
분자들이 주로 세포내적으로 방출된다는 견해가 지배적이기는 하지만, 아직도 트랜스페린에 의해 철 분자가 방출되는 경우의 정확한 진행 순서에 대해서는 어떠한 절대적 확신이 없는 상태이다. 에너지 및 온도에 의존하는 방법에서는, Fe 트랜스페린 또는 Fe2트랜스페린은 세포막상의 수용체와 결합한다. 이어서 복합체는 엔도솜(endosome) 또는 리셉토솜(receptosome)으로 명명되는 소포내로 흡수된다. 이것은 5.5 미만의 pH를 갖는 다른 소포와 결합되어, 이로 인한 산성화가 트랜스페린에 의한 철 방출을 유발시킨다. 이어서, 아포트랜스페린 수용체 복합체가 세포막으로 재수송되어, 여기서 중성 pH는 아포트랜스페런이 수용체로부터 주위 매질로 방출되게끔 한다. 산 및 중성 pH 값에서 다양하게 나타나는 아포- 또는 철 트랜스페린에 대한 수용체의 친화도에 근거하고 있는 기능인 재순환은 골지체의 소포를 통해 일어난다는 지적이 있다.
분자 수준에서의, 트랜스페린 사이클의 개시는 지금까지 설명되지 않았으며, 단지 몇가지 측면, 예를 들어, 포스포릴화 작용의 있음직한 역할에 관한 지적만이 있을 뿐이다(참조: Huebers et al'., 1987).
본 발명을 이용하여, 최초로, 이러한 능동 수송 시스템을 사용하여 그의 흡수가 어려운 핵산을 세포내로 운반시킬 수 있게 되었다.
따라서 본 발명은 다가 양이온에 대한 친화도를 갖는 물질, 특히 핵산 및 핵산 동족체와 복합체를 형성할 수 있는 신규한 단백질-다가 양이온 결합체(이때, 상기 복합체는 수용체-매개된 식작용을 통해 세포내로 흡수되며, 결합체의 단백질 성분은 트랜스페린이다)에 관한 것이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 결합체를 사용하면, 핵산의 억제 활성을 유지하면서 핵산을 세포내로 효과적으로 수송시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 용어 트랜스페린은 천연 트랜스페린, 및 수용체에 연결되어 세포내로 수송되는 트랜스페린 변형물 (이러한 변형예는, 에를 들어, 아미노산을 변화시키거나, 분자를 수용체 결합 능력이 있는 분획으로 자르는 것 등이 포함될 수 있다) 둘다에 관한 것이다.
다가 양이온에 대한 트랜스페린의 몰비는 바람직하게는 10:1 내지 1:4이나, 응집세가 생성될 수 있음을 주지해야 한다. 그러나, 이 비는 핵산(들)의 복합화가 일어나는 조건을 만족하고 형성된 복합체가 트렌스페린 수용체에 의해 결합되어 세포내로 운반됨이 확실할 경우, 필요하다면 더 넓은 범위로 제한될 수 있으며 ; 이는 한 단계를 수행한 후 다음 단계를 수행하는 간단한 실험을 통해 용이하게 점검할 수 있다.
선택되는 비는 특히 다가 양이온 분자의 크기, 및 양으로 하전된 그룹의 분포 및 수에 따라 결정되며, 이때 이들 기준은 수송될 핵산(들)의 크기 및 구조 그리고 이의 모든 변형에 상응한다. 다가 양이온은 동일하거나 상이할 수 있다.
하기 화합물을 다가 양이온으로 사용할 수 있다.
a) 프로타민: 프로타민은 작은(분자량이 약 8000 이하임) 강염기 단백질로서, 이의 양으로 하전된 아미노산 그룹(특히 아르기닌)은 일반적으로 그룹으로 배열되어, 이들 다가 양이온성 특성으로 인해 핵산의 음전하를 중화한다(Warrant et al., 1978). 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있는 프로타민은 천연 기원이거나 재조합에 의해 생성될 수 있는 반면, 다중 복사물이 생성될 수 있거나 분자 크기 및 아미노산 서열에서의 변형물이 제조될 수 있다. 또한 상응하는 화합물을 화학적으로 합성할 수도 있다. 인공 프로타민을 합성할 경우, 사용되는 공정은, 예를 들어, 천연 프로타민내에서 수송기능에 바람직하지 않은 기능(예를 들어, DNA의 축합)을 갖는 아미노산 잔사를 다른 적합한 아미노산으로 대체하며/하거나, 한쪽말단에 트랜스페린과 목적하는 결합을 가능케하는 아미노산(예를 들어, 시스테인)을 제공함을 포함한다.
b) 히스톤: 히스톤은 염색질내에 존재하는 작은 DNA-결합 단백질로서, 뉴클레오티드 서열과 무관하게 DNA와 결합할 수 있고 이를 뉴클레오좀 내로 중첩시킬 수 있게 하는 양전하 아미노산(리신 및 아르기닌)을 고비율로 가지며, 이때, 아르기닌이 풍부한 히스톤 H3 및 H4가 특히 적합하다(Felsenfeld, 1978). 이의 제조 및 변형에 대해서는, 프로타민과 관련하여 상기 언급된 내용이 다시 적용된다.
(c) 동형 폴리펩타이드(폴리라이신, 폴리아르기닌) 또는 이형 폴리펩타이드(양으로 하전된 대표적인 아미노산 두개 이상으로 이루어짐)와 같은 합성 폴리펩타이드.
(d) 비-펩타이드 양이온 (예: 폴리에틸렌이민)다가 양이온의 크기를 양전하의 합이 약 20 내지 500이 되어, 수송될 핵산에 부합되도록 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 트랜스페린-다가 양이온 결합체를 화학적으로 또는, 다가 양이온이 폴리펩타이드일 경우에는, 재조합을 통해 생성할 수 있다. 화학적 방법을 통한 커플링은 펩타이드의 단백질 커플링에 대해 당해 분야에서의 공지된 방법을 통해 수행할 수 있으며, 경우에 따라서는, 커플링 반응전에 개별 성분에 링커 물질을 제공할 수 있다(여기에서, 후자의 처리 공정은 처음부터 커플링에 유용한 ·적합한 작용 그룹(예: 머캅토 또는 알코올 그룹)이 없을때 필요하다). 링커 물질은 먼저 개별 성분의 작용 그룹과 반응하고, 나중에 변형된 개별 성분의 커플링을 수행하는 이작용성 화합물이다.
결합체의 목적하는 특성, 특히 이의 목적하는 안정성에 따라서, 커플링을 하기와 방법을 통해 수행할 수 있다:
a) 환원 조건하에, 예를 들어, 석신이미딜 피리딜디티오 프로피오네이트를 사용하여 다시 절단할 수 있는 디설파이드 브릿지(.lung et al, 1981).
b) 생물학적 조건하에서 대체로 안정한 화합물을 사용한다(예를 들어, 티오에테르를 제2성분에 결합된 링커의 설프하이드릴 그룹파 말레이미도 링커를 반응시켜 사용한다).
c) 생물학적 조건하에서 불안정한 브릿지, 예를 들어, 에스테르 결합을 사용하거나. 약산성 조건하에서 불안정한 아세탈 또는 케탈 결합을 사용한다.
재조합을 이용한 본 발명에 따른 결합체의 제조방법은 세밀하게 한정된, 균일 화합물의 생성에 유리한 반면, 화학적 커플링은 분리시켜야 하는 결합체 혼합물을 생성한다.
본 발명에 따른 결합체의 재조합 제조는 공지된 키메릭 폴리펩타이드의 제조에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 다가 양이온 펩타이드는 크기 및 아미노산 서열면에서 다양하다. 또한 유전 공학을 통한 제조는, 예를 들어, 적합한 돌연변이에 의해 수용체에 대한 결합 능력을 증가시키거나, 트랜스페린 분획을 수용체에 결합할 수 있는 일정 부분의 분자로 단절시킴으로써, 결합체의 트랜스페린 부분을 변형시킬 수 있는 이점을 갖는다. 본 발명에 따른 결합체의 재조합 제조에 있어, 트랜스페린 부위를 암호화하는 서열 및 다가 양이온 펩타이드를 암호화하는데 필요한 서열이 삽입된 폴리링커를 함유하는 벡터를 사용하는 것이 특히 편리하다. 이와 같은 방법을 통해, 한 셋트의 발현 플라스미드를 수득할 수 있는데, 이 중에서 본 발명에 따른 결합체를 발현시키기 위하여 목적하는 서열을 함유하는 플라스미드를 필수적으로 사용할 수 있다.
세포내로 수송될 핵산은 뉴클레오티드 서열에 제한없이 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 변형이 핵산의 다가음이온 성질에 영향을 주지 않는다면, 핵산은 변형될 수 있으며; 이들 변형은, 예를 들어, 포스포로티오에이트에 의한 포스포디에스테르 그룹의 치환 또는 뉴클레오시드 동족체의 사용을 포함한다.
본 발명의 범주내에서 사용될 수 있는 핵산은 특히, 특정 유전자 서열을 억제하기 위해 세포내로 수송되는 핵산을 포함한다. 이러한 핵산에는 임의로 운반체 핵산과 함께, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임이 포함된다. 핵산의 크기에 있어서, 본 발명은 넓은 용도 범위를 허용한다. 본 발명에 따른 수송 시스템에 의해 야기되는 하한치는 존재하지 않는다; 하한치가 정해질 수 있는 것은 적용에 대한 특이한 이유 때문일 것이다. 예를 들어, 약 10개 미만의 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이의 특이성 결핍으로 인해 거의 적합하지 않기 때문이다.
또한 본 발명에 따른 결합체를 사용하여 플라스미드를 세포내로 운반할 수 있는데, 특히 실용적인 용도에서는 운반체 핵산으로서 더 작은 플라스미드(예를 들어, 5000개 이하의 bp를 갖는 레트로바이러스성 벡터)를 사용한다. 또한 본 발명에 따른 결합체를 사용함과 동시에 세포내로 상이한 핵산을 운반할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 장점은 트랜스페린에 대한 다형성이 존재하고 특정 세포내로의 억제 핵산을 계획적으로 수송할 수 있게하는 수용체가 존재한다는 사실이다.
본 발명의 범주내에서는 트랜스페린-다가 양이온 결합체를 생 세포안으로 효율적으로 흡수시켜 내화시킬 수 있다는 사실을 증명할 수 있다. 본 발명에 따른 결합체 또는 복합체는 세포성장에 유해하지 않다. 이러한 사실은 이들을 반복적으로 투여할 수 있으며 따라서 세포내로 삽입된 유전자의 지속적인 높은 발현을 보장할 수 있다는 것을 의미한다.
또한 다가 양이온-트랜스페린 결합체가 천연 트랜스페린-철 복합체를 작용적으로 대체할 수 있음을 나타낸다. 트랜스페린-다가 양이온/DNA 복합체가 트랜스페린 수용체에 의해 세포로 흡수된다는 사실은 DNA 성분으로서 루시페라제 유전자를 사용하여 확인한다. 천연 트랜스페린이 효과적으로 트랜스페린- 다가 양이온 DNA복합체로 대체된다는 것은 발표된 바 있으며, 이는 세포내에서의 루시페라제 활성의 저하로써 측정된다.
본 발명의 범주내에서 수행된 실험은 또한 tRNA 리보자임 유전자(리보자임은 V-erbB 서열에 대해 유도된다)가 본 발명에 따른 결합체(폴리라이신-트랜스페린)를 사용하여 erbB-형질전환된 닭 세포내로 도입되어 온코진의 형질전환 활성을 감소시킬 수 있다는 사실을 증명한다. 상기 결과는 이들 실험에서 단지 소량의 리보소옴 유전자만을 사용하므로 더욱 중요한 의미를 갖는다.
결합체에 대한 핵산의 비는 광범위하며, 핵산의 모든 전하를 중화시킬 절대적인 필요는 없다. 이러한 비는 특정의 경우에 알맞은 핵산의 수송 능력 및 생물학적 활성 비를 수득하기 위해서, 몇몇 기준(예: 수송될 핵산의 크기 및 구조, 다가 양이온의 크기 및 다가 양이온의 전하수 및 분포)에 따라 각 개별적 경우에 알맞게 조정된다. 이들 비를 우선, 예를 들어, 겔중에서 DNA 이동 속도를 지연시킴으로써(예를 들어, 아가로스 겔 상에서 이동변위를 이용한다), 또한 밀도구배 원심분리법에 의해 대충 조정할 수 있다. 일단 이러한 임시비를 수득하면, 세포내에서 핵산의 유용한 최대 활성에 대해서 방사선 표지된 복합체를 사용한 수송 시험을 수행한 다음, 필요한 경우, 핵산의 잔존하는 음전하가 세포내로의 수송에 장해가 되지 않도록 결합체의 비를 감소시키는 것이 편리할 수 있다.
또한 본 발명의 요지이기도 한, 트랜스페린-다가 양이온/핵산 복합체의 제조방법은 공지되어 있는 다가이온성 화합물의 복합화 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 조절되지 않은 응집 또는 침전을 피할 수 있는 가능한 방법은 우선 두개의 성분을 고농도(약 1몰)의 통상적 염과 혼합한 뒤 투석 또는 희석을 통해 생리학적 식염수 농도로 조절하는 것이다. 바람직하게는, 복합체 생성 반응에 사용된 DNA 및 결합체의 농도는 복합체가 침전되지 않도록, 너무 높지 않아야 한다(100㎍/ml 이상).
본 발명에 따른 트랜스페린-다가 양이온-핵산 복합체의 바람직한 핵산성분은 안티센스-DNA, 안티센스 RNA, 또는 리보자임 또는 이를 암호화하는 유전자이다. 리보자임 및 안티센스-RNA를 사용할 경우, RNA의 작용을 억제하는 이들 RNA를 암호화하는 유전자를, 바람직하게는 운반체 유전자와 함께 사용하는 것이 특히 유리하다. 세포내로 유전자를 도입함으로써 RNA의 상당한 증폭이 보장되어, RNA만의 진입에 반해 생물학적 반응을 억제하기에 충분한 양이 보장된다. 특히, 적합한 운반체 유전자는 폴리머라제 III에 의한 전사에 필요한 전사 단위(예를 들어, tRNA 유전자)이다. 예를 들어, 리보자임 유전자를, 전사가 수행될 경우 리보자임이 조밀한 폴리머라제 III 전사물의 일부가 되도록 하는 방식으로 그들 안으로 삽입시킬 수 있다. 본 발명에 따른 수송시스템을 사용하여, 세포내에서의 유전자의 증가된 초기 농도를 보장함으로써 이들 유전 단위의 활성을 강화할 수 있다.
본 발명은 핵산(들)을 사람 또는 동물 세포내로 도입하여, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 가용성인 복합체를 형성하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 트랜스페린-다가 양이온 결합체와 복합화된, 예를 들면 동결 건조물 형태의, 특이적으로 유전자를 억제하는 핵산을 활성성분으로 함유하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 이러한 약제학적 제제는, 임의로 운반체 핵산과 함께, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 동족체 또는 리보자임, 이를 암호화하는 DNA와 함께 사용하여 사람 또는 동물내에서 병원성 바이러스(예: HIV 또는 관련된 레트로바이러스), 온코진 또는 세포의 성장 및/또는 분화를 조절하는 기타 주요 유전자, 예를 들어, c-fos 유전자 또는 c-myc 유전자를 억제할 수 있다.
또 다른 영역의 용도는 목적하지 않은 유전자 생성물 예를 들어, 알쯔하이머 질환에서 나타나는 주요 플라그 단백질 또는 자기면역 질환을 일으키는 단백질의 생성을 억제함으로써 질병을 퇴치함에 있다.
본 발명은 하기의 실시예로써 설명한다.
[실시예 1]
[트랜스페린-폴리라이신 90 결합체의 제조]
문헌에 공지된 방법(참조: Jung et al., (1981))을 사용하여 석신이미딜피리딜 디티오프로피오네이트로 변형후 디설파이드 브릿지를 도입하여 커플링을 수행한다.
a) 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트-변형된 트랜스페린
세파덱스 G-25를 통해 겔-여과시킨, 0.1M 인산 나트륨 완충액 3ml(pH 7.8)중의 트랜스페린(닭 알부민으로부터 유도, Sigma, 콘알부민 타입 I, 철-유리된)120mg(1.5μmol)의 용액 6ml을 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(3μM, SPDP, Pharmacia)의 15mM 에탄을 용액 200㎕와 함께 격렬히 진탕시키면서 혼합하고, 가끔씩 진탕시키며 혼합물을 주위온도에서 1시간 동안 방치한다. 저분자 반응 생성물 및 미량의 시약을 겔 컬럼(세파덱스 G-25, 14 x 180mm, 0.1몰 인산나트륨 완충액 (pH 7.8))을 사용하여 제거하고 7ml의 생성물 분획을 수득한다: 트랜스페린에 결합한 피리딜 디티오프로피오네이트 잔사 함량은, 한 분취량에 대하여 디티오트레이톨로 환원시킨 후 방출된 피리딘-2-티온의 양을 분광 분석 측정으로 결정하였으며, 그 결과는 2.6μmol 이다. 동일한 방법으로 사람의 트랜스페린(Sigam, 철-유리된)을 변형시켰다.
b) 머캅토프로피오네이트-변형된 폴리라이신 90(pL 90):
0.IM 인산나트륨 3ml (pH 7.8) 중의 폴리(L)라이신-하이드로브로마이드 18mg(약 1.0μmol)(Sigma, 플루오레신 이소티오시아네이트(=FITC)-표지된, 분자량 약 18,000-평균 중합도 약 90에 상응함)의 용액을 세파덱스 G-25를 통해 여과한다(형광 표지화는 pH 9의 중탄산나트륨 완충액중에서 3시간 동안 수행한다). 폴리라이신 용액을 7ml의 물로 희석하고, 격렬히 진탕시키면서 SPDP의 15mM 에탄을 용액 270㎕와 혼합하고, 주위 온도의 암소에서 가끔씩 진탕하며 방치해 1시간 동안 반응시킨다. 1몰 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5.0) 0.5ml를 가한 후, 혼합물을 세파덱스 G-25상에서 여과하여 모든 저분자 물질을 분리제거한다(용출액: pH 5.0의 20mM 아세트산 나트륨 완충액). 생성물 분획(닌히드린 염색, 형광)을 진공하에서 증발시켜 완충액을 써서 pH를 약 7로 조정하고, 물 200㎕중의 디티오트레이톨 23mg(150μmol)의 용액을 가하고, 아르곤 존재하에 주위온도에서 혼합물을 암소에서 1시간 동안 방치해 둔다. 추가로 겔 여과시켜 과량의 환원제를 분리 제거하고 (세파덱스 G-25, 14 × 130mm 컬럼, 10mm 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0), 3.8μmol의 머캅토 그룹을 함유하는 형광으로 표지된 폴리라이신의 생성물 용액 3.5ml(엘만의 시약, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)을 사용하여 광도측정)을 수득한다.
c) 트랜스페린-폴리라이신 결합체
a)에서 수득한 변형된 트랜스페린 용액(pH 7.8 0.1M 인산나트륨 완충액 중의 약 2.6μmol 피리딜 디티오프로피오네이트 잔기를 갖는 1.5μmol 트랜스페린 7ml)을 아르곤으로 세정한다; b)에서 수득한 머캅토-변형된 폴리라이신 용액 2.0ml(10mm 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.0중의, 머캅토 그룹 약 2.2μmol을 갖는 약 0.6μmol의 폴리라이신에 상응함)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤으로 세정한 후 진탕하고, 아르곤하에 주위 온도의 암소에서 18시간 동안 방치하여 반응시킨다. 반응 혼합물을 14ml의 물로 희석하고 이온 교환 크로마토그래피로 분리한다(파마시아 모노(Pharmacia Mono S 컬럼 HR 10/10, 구배 용출, 완충액 A: 50mM HEPES pH 7.9, 완충액 B: A + 3M 염화나트륨, 0.5ml/분, 제 1도). 비-결합된 트랜스페린은 출발점에서 용출되고 생성물 분획은 약 0.66 내지 1.5몰 염화나트륨에서 용출된다.
모든 분획은 평균하면 트랜스페린:폴리라이신의 비가 1.3:1인 결합체가 수득된다.
결합된 생성물(닌히드린 염색, UV 280nm에서 단백질 흡광, 및 495nm에서 FITC-표지된 폴리라이신의 형광 측정)을 약 10mg의 트랜스페린을 함유하는 각각 6개의 분획에 수집한다. 분획을 우선 100mm 철(III) 시트레이트 용액(탄산수소나트륨으로 pH를 7.8로 조정)에 대해 투석시키고 다음에는 ImM HEPES 완충액 (pH 7.5)으로 2회 투석시킨다.
나트륨 도데실설페이트 겔 전기영동(10% SDS, 8% 폴리아크릴아미드; 제2도 참고)은, 2-머캅토에탄올로 전처리한 후 6개 모두의 분획에서 거의 동등한 트랜스페린의 함량을 보여주고 있는 반면(제 2A도), 비환원된 샘플의 경우는 유리된 트랜스페린의 가시적 밴드가 전혀 없었으며, 단지 광범위하게 이동하는 결합체 소량만이 발견됐을 뿐이다(제 2B도, T=처리되지 않은 트랜스페린; 1-6=결합체 분획 1 내지 6).
[실시예 2]
트랜스페린-폴리라이신 270 및 트랜스페린-폴리라이신 450
결합체 (pL 270 및 pL 450)의 제조
a) 실시예 la)와 동일한 방법으로 변형된 트랜스페린을 제조한다.
b) 변형된 폴리라이신 270 및 폴리라이신 450의 제조
75mM 아세트산나트륨 완충액 1.2ml중 0.33μmol 폴리라이신 270(형광 표지를 거나 또는 갖지 않은 270개 라이신 그룹의 평균 중합도를 가짐; 19mg의 하이드로브로마이드 염에 상응함)의 겔-여과된 용액을, 탄산나트륨 완충액을 가하여 pH 8.5로 조정한다. SPDP(1.9μmol)의 15mM 에탄을 용액 182㎕을 격렬하게 교반시키면서 가한다. 1시간 후, pH 5인 1M 아세트산 나트륨 200㎕를 가한다; 20mM 아세트산 나트륨으로 겔 여과한 후, 1.3μmol 머캅토 그룹을 갖는 0.27rmol의 폴리라이신 270(폴리라이신 쇄당 4.8링커)을 함유한 용액을 수득한다. 같은 방법으로, 0.20umol의 폴리라이신 450(450개의 라이신 그룹의 평균 중합도를 가짐)을 2.25μmol의 SPDP로 변형시키고, 2.1μmol 머캅토 그룹을 갖는 0.19rmol 폴리라이신 450 생성물(폴리라이신 쇄당 11개 링커)을 수득한다. 실시예 1b)와 같은 방법으로, 자유 설프하이드릴 성분을 수득하기 위해, 디티오피리딘 그룹을 디티오트레이톨로 환원시킨다.
c) 트랜스페린-폴리라이신 결합체의 제조
pH 7.8인 100mM 인산염 완충액중의 변형된 트랜스페린 1.0μmol을 변항된 폴리라이신 270 0.14μmol(20mM 아세트산 나트륨 완충액 중)과 함께, 산소 배제하에 아르곤 대기중에서 혼합하여, 트랜스페린-폴리라이신 270 결합체를 제조한다. 주위 온도에서 18시간 경과후, 반응 혼합물을 물로 희석시켜 10ml 용량으로 만들고 양이온 교환 크로마토그래피로 분리한다(파마시아 모노 S 컬럼 HR 10/10; 구배 용출, 완충액 A: 50mM HEPES pH 7.9; 완충액 B: 완충액 A + 3M 염화나트륨; 280nm에서의 UV 흡광 및 형광 측정, 여기 480nm, 방출 530nm). 과량의 비-커플링된 트랜스페린을 먼저 용출시킨다. 생성물 분획을 30% 내지 50% 구배 B 사이에서 용출시키고 3개의 결합체 분획으로 수거한다(트랜스페린:폴리라이신의 몰비:풀 A:5.5 대 1; 풀 B:3.4 대 1; 풀 C: 1.8대 1). 결합체를 폴리라이신 270 0.075μmol를 갖는 트랜스페린 0.23μmol의 평균 수율로 수득한다.
트랜스페린-폴리라이신 450 결합체를, 아세테이트 완충액 중에서 실시예 la)의 변형된 트랜스페린 1 2μmol(80mM의 염화나트륨을 함유하는 pH 7.9의 HEPES 20mM중에서) 및 실시예2 b)의 머캅토-변형된 폴리라이신 450 71nmol로부터 출발하여, 유사한 방법으로 제조한다.
반응 혼합물을 겔 투과 크로마토그래피(파마시아 수퍼로스 12 컬럼, 1M 구아니딘 클로라이드 pH 7.3)를 통해 정제하고 투석한 후(100mM 염화나트륨을 함유하는 20mM HEPES pH 7.3), 트랜스페린 0.40μmol 및 38nmol의 폴리라이신 450을 함유하는 트랜스페린-폴리라이신-결합체를 수득한다.
트랜스페린 분획 1mg당, 표본에 l00mM 철 시트레이트 완충액(pH를 7.8로 조절된 중탄산나트륨 함유) 6 내지 12㎕를 가하여 철을 도입시킨다.
[실시예 3]
a) 트랜스페린-프로타민 결합체의 제조
변형된 트랜스페린을 실시예 1 a)에서와 같이 제조한다.
b) 3-머캅토프로피오네이트-변형된 프로타민의 제조
에틸 디이소프로필아민 2.6㎕(15μmol)을 함유하는, DMSO 2ml및 이소프로판올 0.4ml 중의 프로타민트리플루오로아세테이트 염 (이온 교환 크로마토그래피를 통해 연어 프로타민(=살민)-설페이트, Sigma) 20mg(3μmol) 용액에 이소프로판올 250㎕ 및 DMSO 250㎕ 중의 SPDP 용액 30umol을 1시간에 걸쳐 여러 배치로 가한다. 3.5시간 후에 주위 온도에서 상기 용액을 고 진공 상태 하에서 증발시킨 뒤 10% 메탄올을 함유하는 0.5% 아세트산중에서 용해한다. 동결 건조한 후에, 겔 여과 (세파덱스 G10; 10% 메탄올을 갖는 0.5% 아세트산)로 2.5μmol의 디티오피리딘 링커로 변형된 프로타민 아세테이트 염 16mg(2.5μmol)을 수득한다. pH 5.2로 조절하고 pH 5.2의 아세트산나트륨 완충액 20mM과 함께 세파덱스 G 10을 통해 겔 여과한 후, 아르곤하에서 1시간 동안 pH 7.5의 중탄산나트륨 완충액 중의 디티오트레이톨 16mg을 사용하여 프로타민 1.75μmol(1.75μmol의 링커를 함유하는)을 환원하여 머캅토프로피오네이트 링커 1.6μmol을 갖는 변형된 프로타민 용액을 수득한다.
c) 트랜스페린-프로타민 결합체의 제조
b)에서 수득된 프로타민 용액(1.6umol 링커)을 트랜스페린 1.34μmol(디티오피리딘 링커 3.1mol로 변형된)과 반응시킨 뒤 트랜스페린-폴리라이신 결합체에서 기술한 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 연속 정제하여, 증가량의 프로타민(SDS 겔 전기영동을 통해 측정함; 10% SDS, 8% 폴리아크릴아미드, 쿠마시 블루 염색)과 함께 각각 90, 320, 240 및 120nMol의 변형된 트랜스페린을 함유하는 4개의 성분 분획 A 내지 D(순서대로 용출)를 수득한다. 제3도는 SDS 겔 전기영동의 결과를 나타낸 것이다. Tfprot 결합체 분획 A 내지 D는 매우 천천히 이동하는 밴드(a)를 형성하는 반면, β-머캅토에탄올-환원된 표본(b)에서는 트랜스페린 밴드만이 가시적이다. 투석 및 철의 삽입은 실시예 2에서 트랜스페린-폴리라이신 결합체 TfpL270 및 TfpL450에 대해 기술한 바대로 수행한다.
[실시예 4]
[DNA와 트랜스페린-다가 양이온 결합체와의 복합체 제조]
복합체를 DNA의 묽은 총액(30μg/ml 이하)과 트랜스페린-다가 양이온 결합체를 혼합하여 제조한다. DNA 복합체의 침전을 막기 위해, 인산염-비함유 완충액을 사용한다(인산염은 결합체의 용해도를 감소시킨다). 생리학적 이온 상태하에서의 다가 양이온 결합체에 대한 DNA의 결합을, EcoR 1/Hind III로 절단된 3'-말단에32P-표지된 λDNA를 사용하여 겔 이동 변위 검색을 통해 확인한다(제4도). 1㎕(35ng)의 DNA 표본 각각에 1M 염화나트륨을 함유하는 pH 7.9의 100mM HEPES 완충액 3μml을 가한 뒤, 표본을 11μl의 수성 용액중에서 트랜드페린 결합체의 증가량 (10ng 내지 1000ng)과 혼합시켜 염화나트륨의 최종 농도가 200mM이 되게 한다. 1 X TAE 용출 완충액을 사용한 1% 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 2.5시간 동안 50볼트 (45mA)에서 수행한 뒤; 겔을 건조시킨 다음, XAR 필름(Kodak)을 사용하여 -80℃에서 2시간 동안 자기방사 사진법을 수행한다.
[실시예 5]
[트렌스페린-폴리라이신 결합체의 생세포내로의 수송]
실시예 1에서 기술한 트랜스페린-폴리라이신 결합제가 효과적으로 생존 적아구내로 흡수됨을 증명하기 위해서, FITC-표지된 결합체를 사용한다. FITC-표지된 트랜스페린이 사전에 트랜스페린을 제거한 적아구를 사용하여 수시간 동안 배양한 후에 세포내의 소포에서 검출(형광 현미경하에서 검사했을 때) 됨은 공지되어 있다(Schmidt et al, 1986).
본 실시예에서는, 적아구(EGF-수용체 레트로바이러스에 의해 형질전환된, Khazaie et al, 1988)를 37℃(세포 농도 1.5x106/ml)의 트랜스페린-비함유 분화 배지(Composition in Zenke et al, 1988)에서 18시간 동안 배양한다. 다양한 트랜스페린-폴리라이신 결합체(또는, 대조구로서, 상응하는 양의 2회 증류한 살균수(水)를 가한 후에, 세포를 형질전환된 상태의 유지를 위해 10ng/ml의 EGF 존재하에 37℃에서 배양한다. 24 및 48시간 후에, 약 5x105세포를 제거하고, 인산염-완충된 생리학적 식염수(PBS; pH 7.2)중에서 한번 세척한 뒤, PBS중의 3.7% 포름알데히드 및 0.02% 글루타르알데히드 혼합물을 50배 용적으로 고정(10분, 40℃)하며, PBS 중에서 한번 세척한 후에 엘바놀(Elvanol)중에 봉매하고 형광 현미경하에서 검사한다(Zeiss Axiophot, Narrow Band FITC 및 TRITC 활성). 동시에, 세포의 성장률을 다양한 혼합물의 기타 분취량중에서 측정한다. 100㎕ 세포 현탁액을 취한 뒤3H-티미딘(8μCi/ml, 2시간)의 도입을 문헌[참조: Leutz et al, 1984]에 기술한 바대로 측정한다. 제5도는 트랜스페린-폴리라이신으로 배양된 적아구가 24시간 후에, 대조구에서는 검출할 수 없는, 2 내지 10배 강한 형광 소포를 보임을 나타낸다. 표 1는 분획 6을 제외한 모든 결합체가 실질적으로 모든 세포에 의해 흡수됨을 제시한다.
제5도는 FITC-표지된 트랜스페린-폴리라이신 결합체(B,C)를 사용하거나 이의 부재한 상태(A)에서 24 시간 동안 배양된 닭 적아구의 형광현상을 도시한 것이다.
이들을 청색광으로 활성화시킬 경우(B, FITC를 검출하기 위해서), 상당량의 형광 소포를 각각의 세포에서 검출할 수 있다. 이들 형광의 특이성은 소포 형광이 녹색광으로 활성화되는 경우(C)에는 일어나지 않는다는 사실을 통해 나타난다(C: 세포의 유사한 비-특이적 형광을 A에서 처럼 관찰할 수 있다).
모든 표본내에서 세포가 동등하게 신속히 성장한다는 사실(3중 수소 결합된 티미딘(3H TdR)의 혼입에 의해 측정된 바와 같이, 표 1)은 세포가 폴리라이신 작제물에 의해 디멘죤화되지 않으며 결과적으로 비-특이적 흡수(예를 들어, 투과 가능한 세포막을 통한)가 배제될 수 있음을 나타낸다.
[실시예 6]
본 실시예에서 수행되는 시험의 목적은 여기에서 사용된 트랜스페린-폴리라이신 결합체가 천연 트랜스페린에서와 동일한 방법 즉, 이들이 유사한 효율로 정상적인 트랜스페린 사이클을 통과하는 방식으로 세포에 의해 사용됨을 보여주는 것이다. 형질전환 온코진을 스위치-오프(switch off)함으로써 정상 적혈구로 성숙될 수 있는 적아구는 상기 목적을 위한 시험 시스템으로써 특히 적합하다(Beug et al, 1982). 문헌은 정상적 성숙을 위해서는 이들 세포들이 고농도의 트랜스페린-철 복합체[100 내지 200μg/ml, 3배 이하의 농도는 세포의 성숙을 저지하여, 수일 후에 세포의 사멸을 초래한다(Kowenz et al, 1986)]를 필요로 함을 기술하고 있다. 또한 재순환, 즉 트랜스페린 수용체의 재사용 및 이에 따른 최적 속도로의 트랜스페린 사이클의 진행은 정상적인 시험관내 분화에 불가결한 것임을 나타낸다.
적아구(EGF-수용체 레트로바이러스에 의해 형질전환된)는 EGF를 제거하고 부분적으로 정제된 닭의 에리트로포이에틴(Kowenz et al., 1986, 트랜스페린으로부터 유리) 최적량을 가하여 분화하도록 유도된다. 배양을 42℃의 트랜스페린-비함유 분화 배지중의 세포 농도 1x106/ml 및 5% CO2에서 수행한다. 배양 초기에, 천연 트랜스페린-철 복합체(Sigma, 100μg/ml)를 가하거나 철-포화된 트랜스페린-폴리라이신 결합체를 가한다(농도는 다시 100μg/ml). 세포의 성장 및 성숙을 하기 방법을 통해 24 및 48시간 후에 분석한다.
1. 세포수의 측정(코울터 계수기, 모델 ZM을 사용, Beug et al, 1984)
2. 세포 크기 분포의 기록(코울터 채널라이저 모델 256을 사용) 및
3. 세포의 헤모글로빈 함량의 분광 측정(Kowenz et al., 1986)
또한, 72시간 후에 혼합물의 분취량을 목적 담체상에서 세포원심분리기(Shandon)에서 원심분리하고 조직화학적 분석을 실시하여 헤모글로빈을 검출한다(혈구 세포에 대해 뉴트랄 벤지딘과 디프-윅(Diff-Quick) 급속 염색으로 염색, Beug et al . 1982).
표 2의 결과는 명백하게 폴리라이신-트랜스페린 결합체 분획 1 내지 5의 존재하에서 분화가 유도된 세포가 천연 트랜스페린-철로 배양된 세포만큼 효율적이고 빠르게 성숙됨을 나타낸다. 반대로 트랜스페린-비함유 대조구에선의 세포는 매우 느린 세포 성장을 보이며 단지 소량의 헤모글로빈만을 축적한다. 염색된 사이토스핀 제제상에서 세포 표현형에 대한 연구는 폴리라이신-트랜스페린 결합체와 함께 배양된 세포가 천연 트랜스페린으로 처리된 것과 동일한 방식으로 말기 망상 적혈구(말기 망상 적혈구, Beug et al., 1982) 상태로 성숙되는 반면, 트랜스페린 없이 배양된 세포는 적아구와 유사한 붕해되고 비성숙된 세포 혼합체를 구성한다(Schmidt et al., 1986) 트랜스페린-폴리라이신 분획 6만으로 처리된 세포는 낮은 헤모글로빈 함량 및 높은 비율의 비성숙 세포를 나타낸다(표 2). 이는 특별히 많은 양의 폴리라이신으로 결합된 분획 6이 트랜스페린 사이클내에서 잘 작용하지 못함을 의미한다. 동시에, 이 결과는 검사 방법의 감도를 나타내기도 한다.
[실시예 7]
실시예 6에서와 같이, 다양한 트랜스페린-폴리라이신 결합체 및 트랜스페린-프로타민 결합체가 닭 적아구의 적혈구로의 성숙 과정에서 천연 트랜스페린-철 복합체를 기능적으로 대치하는 능력에 대해서 조사한다.
말기 분화 닭 적아구가 최적으로 작용하는 트랜스페린 사이클을 필요로 함은 이미 밝혀졌다. 즉 트랜스페린이 없거나 트랜스페린 수용체 재순환이 억제될 경우 세포가 사멸한다[참조: Kowenz et al., 1986; Schmidt et al., 19861. 정상적으로 사용되는 부분 정제된 닭의 에리트로포이에틴은 여전히 트랜스페린을 함유하므로, EPO를 적혈구가 분화되도록 트랜스페린이 없는 부분 정제된 적혈구 성장 인자로 대치한다[참조: REV 인자; Kowenz et al., 1986; Beug et al., 1982]: 표적 세포로서, 온도-민감성 V-myb 온코진과 함께 사람의 상피 성장 인자수용체(EGFR)를 함유하는 레트로바이러스로 형질전환된 적아구를 20ng/ml의 EGF 존재하 CFU-I 배지[참조: Radke et al., 1982]에서 복제시킨다. 이 세포를 활성화시켜 EGF에 의해 비정상적으로 복제시키는 한편, 성장 인자 EGF의 수거 및 REV 인자의 동시 부가로 세포가 정상 분화 상태에 이르게한다. 트랜스페린-비함유 배지에서 2회 세척한 후 세포를 트랜스페린-비함유 배지내로 이동시켜 여러 양의 철-포화 트랜스페린 또는 트랜스페린-다가 양이온 결합체를 가한다(플라스미드 DNA와 복합화하기 전 또는 후). 42℃에서 1, 2 및 3일간 배양시킨 후 세포의 분화 상태를 세포 원심분리법 및 조직화학적 염색법 또는 헤모글로빈의 정량 측정법에 의해 결정한다.
이 시험 결과가 제6도 또는 표 3에 기재되어 있다.
세포(1×106/ml)를 14mm 디쉬내에서, 최적 농도의 REV 인자 및 1μg/ml의 인슐린으로 보충된(참조: Kowenz et al., 1986; 1:5,000배 희석) 콘알부민-비함유 분화 배지(Zenke et al.,1988)에 첨가제 없이 1회(△), 철-포화 콘알부민(○) 으로 1회 및 철-포화 TfpL 270 결합체(□)로 1회(각각의 경우 100μg/ml) 가한다. 24 및 48시간 배양후 헤모글로빈 함량을 100㎕ 분취액중에서 광도법으로 측정한다. 어두운 부분이 트랜스페린이 없는 조건하에서 성장한 세포중 헤모글로빈 함량을 나타낸다(4개 평균 측정치 ; 제 6A도).
적혈구 분화를 트랜스페린-폴리라이신의 농도 함수로서 분석하기 위해, 세포를 특정량의 철-포화 콘알부민(○), TfpL 90(□) 또는 TfpL 270(■)을 함유하는 배지에 상기한 바와 같이 놓고 2일 후 헤모글로빈 함량을 광도법으로 측정한다(제 6B도).
[표 3]
적혈구 분화는 헤모글로빈 광도 측정에 의하거나(참조: 제6도), 코울터 계수기에서 카운팅하거나 또는 세포 원심분리 및 연속적으로 조직 염료(참조: Diff Quik; Beug et al., 1982b)와 더불어 뉴트랄 벤지딘 염색을(헤모글로빈을 측정하기 위해) 실시함으로서 조사된다. 시험 1에서의 트랜스페린 및 트랜스페린 결합체의 최종 농도는 60μg/ml이고, 시험 2 및 3에서는 100μg/ml 이다. 시험 2에서의 DNA 농도는 10μg/ml 이다. 붕해된 세포, 성숙 세포(LR: 후기 망상 적혈구; E: 적혈구) 및 비성숙 세포(Eb1)의 비율은 문헌[Beug et al., 1982b, Schmidt et al., 1986]에 의해 기술된 방법을 사용하여 측정한다. 수득된 결과는 2개의 상이한 트랜스페린-폴리라이신 결합체(TfpL90 또는 TfpL 270) 및 트랜스페린-프로타민 결합체가, 철을 분화하는 적혈구로 신속하게 운반시킴을 보증함으로써(이의 특이 활성은 1.5 내지 2배 낮다) 천연 트랜스페린을 기능적으로 대체시킬 수 있음을 보여준다(참조: 제 6도). DNA와 트랜스페린-폴리라이신 270 및 트랜스페린 단백질과의 복합화는 결합체의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다. 대조구 실험에서는, 폴리라이신 또는 프로타민이 가해지고 트랜스페린 결합체 대신 적절한 양의 철 시트레이트와 혼합되는 경우, 트랜스페린 없이 배양되었던 비교 표본에서의 세포와 같이, 세포는 분화하게 되어 사멸함이 밝혀졌다.
대체로, 실시예 6 및 7에 따른 시험은 다가 양이온-트렌스페린 결합체의 두 유형이 천연 트렌스페린보다 단지 경미한 정도로 덜 효율적으로 철을 수송함을 보여 준다.
[실시예 8]
폴리라이신-트랜스페린 결합체는 DNA가 닭 적아구내로 흡수 가능케 한다.
본 실시예는 tDNA 리보자임의 크기에 상응하는 DNA(참조: 제7도)가 트렌스페린-폴리라이신 결합체에 의해 효율적으로 세포 내부로 수송될 수 있는지의 여부를 조사하기 위함이다. 본 실시예에서는, 분자량 약 300,000인 하기 서열의 삽입체를 갖는, 말단에 γ32P ATP로 표지된 tDNA를 사용한다(Manialis).
TE 완충액 20㎕ 중에 용해된 이 DNA 약 0.3μg을 천연 트렌스페린 10μg 또는 트랜스페린-폴리라이신 결합체 분획 3 10μg과 혼합하는데, 각각의 경우 소의 혈청 알부민 400μg/ ml에 2회 증류된 물 50㎕를 가한 용액중에 용해시키거나(참조: Beug H., et al., 1982) 트랜스페린 없이 이 용매의 50㎕ 중에 용해시킨다.
DNA 단백질 혼합물을 각각 2ml의 트랜스페린- 비함유 분화 배지에 가하고, 미리 EGF 수용체 레트로바이러스로 형질전환시키고 EGF의 존재하에 트랜스페린-비함유배지에서 18시간 동안 예비 배양된 4×106닭의 적아구를 가하고(참조: Khazaie K., et al., 1988), 혼합물을 37℃, 5% CO2중에서 8시간 동안 배양한다. 이후 세포를 원심분리시키고, 상등액을 제거한 뒤 세포를 트랜스페린-비함유 배지내에서 3회 세척한다. 세포 침전물 및 배양 배지를 1% SDS, 단백질 분해효소 K 1mg/ml, 300mM NaCl, 20nM 트리스(pH 8.0), 10mM EDTA(PK/SDS 완충 용액)중에서 용해시키고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후 페놀/클로로 포름으로 추출하여 에탄을 침전에 의해 DNA를 분리한다. 총 2000cpm 방사능을 갖는 분리된 DNA는 비-변성 조건의 3.5% 아크릴 아미드 겔 (TBE, Manialis) 상에서 분리되어 DNA는 자기방사선 사진법에 의해 검출된다. 트랜스페린-폴리라이신으로 처리된 세포 표본내에서는, 천연 트랜스페린을 갖는 대조구내에서 보다 약 5 내지 10배 많은 DNA가 세포에 의해 흡수되어짐이 밝혀 졌다.
[실시예 9]
폴리라이신-트랜스페린 결합체는 플라스미드-DNA가 닭의 적아구로 흡수되어져 발현을 가능케 한다.
이 시험에서는, 리포터 유전자로서 포티누스 파랄리스 (Phnotinus pyralis) 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드- DNA가 유전자 이동 및 발현을 연구하는데 사용된다. 이를 위하여, 트리톤-X 용해 표준법(Manialis)을 사용하여 pRSVluc 플라스미드 DNA(참조: De Wet, J,R., et al., 1987)를 제조하고, CsCl/EtBr 평형밀도 구배 원심분리시켜 부탄올-1로 탈색시킨 후 10mm 트리스/HCl (pH 7.5), 1mm IDTA로 투석시킨다. 일반적인 복합체 형성 반응에 있어서, 트랜스페린-폴리라이신 또는 트랜스페린-프로타민 결합체 10μg을, 주의깊게 교반하면서, 0.3M NaCl 250u1 중에 함유된 pRSVluc 플라스미드 DNA 3μg에 서서히 가한다(이와 같은 상태는 트랜스페린-다가 양이온 결합체 100μg 이하 및 플라스미드-DNA 30μg이 사용되어 결합체/DNA 복합체의 침전 없이 최종 용적 500㎕을 생성함으로서 이루어진다). 주위 온도에서 30분 후, 복합체를 바로 5 내지 10×106HD3 세포(EBM+H 배지, 1ml당 0.5 내지 Ix106세포, Beug et al., 1982a; 37℃, 5% CO2)로 가하여 혼합물을 16 내지 48시간 동안 배양시킨다(사용된 세포주는 ts-v-erbB 형질 전환된 닭의 적아구세포 세포주 HD3이다). 세포를 4℃에서 수거 하고(1500 x g에서 5분), 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척 후 PH 7.5인 0.25M 트리스/HCl 100㎕에 용해시킨다. 세포 추출물을 냉동 및 해동 3주기에 의해 제조한 뒤 고속 원심 분리시킨다(4℃, 18,500xg 에서 15분). 이들 세포 추출물의 분취액을 루시페라제 효소 활성에 대해 고찰한다. (참조: De wet, .J. R., et al., 1987). 생물 발광은 클리닐루메이트를 사용하여 측정한다(참조: Berthold, Wildbach, BRD). 배양 배지중의 트랜스페린-다가 양이 은/DNA 복합체의 존재가 세포 성장 또는 복제에 있어 어떠한 해로운 효과를 갖지 않음이 밝혀졌다. 제8도에 나타난 바와 같이, DNA 3μg/TfpL 10μg 및 DNA 0.3 내지 1μg/Tfprot을 사용할 때 최대 루시페라제 활성을 이룬다. 형성된 모든 결합체/DNA 복합체가 동일하다고 가정할때, 이것은 플라스미드 DNA 분자당 25 또는 75 결합체 분자의 몰기에 상응한다. 이로부터 복합체중의 DNA는 결합체 분자에 의해 완전히 커버되고 결합체/DNA 비는 명백히 전기적 중성(DNA 중의 인산 그룹의 음전하를 중성화하기 위해 필요한 다가 양이온 중의 양전하를 기준으로 계산된다)을 보장한다. 이 가정은, 트랜스페린-폴리라이신과 비교했을때, 덜 강하게 양으로 하전된 3배 이상의 트랜스페린/프로타민이 최적 복합체 형성 및 유전자 수송에 필요하다는 관찰된 결과와 일치한다. 이 가정은 또한 효율적 복합체 형성에 요구되는 결합체 /DNA 비에 대한 실시예 4의 수득된 결과와 일치한다.
이와 같은 유전자 수송 시스템의 감도는 복합체 형성을 위해 최적으로 조정된 TfpL/DNA비를 사용하여 측정된다 이들 시험의 결과는 제9도에 도시되어 있다: 루시페라제를 암호화하는 플라스미드 DNA Ing 이하도 여전히 검출가능한 시그날을 나타낸다. TfpL 6μg 또는 Tfprot 20μgg과 복합화된 플라스미드 DNA 2μg 이상의 사용은 아마도 시스템이 포화되었기 때문에 루시페라제 활성에 있어 더 이상의 증가를 야기하지 않는다. 다양한 염 농도(0, 20, 50, 100, 200mM NaCl) 에서 형성된 TfpL/DNA 복합체가 동일하게 유전자 수송 실험중에 효과적인 것으로 판명되었기 때문에 염 또는 이온의 특별한 농도가 복찹체 헝성을 위해 요구되지 않음이 또한 밝혀졌다(제8도 및 제9도: 기초(○)는 Tfprot를 나타내고, 기호(□)는 TfpL을 나타낸다). 세포내로의 트랜스페린-다가 양이온/DNA 복합체의 흡수가 트랜스페린 수용체를 경유하머 이루어진다고 증명할 수 있다. 먼저, 제10A도에서 도시된 바와 같이, TfpL-DNA 복합체에 의해 이루어진 루시페라제 활성은 pL-DNA 복합체에서 측정된 활성보다 최소한 100배가 더 높은 .것으로 밝혀졌다. 비교 시험은 폴리라이신과 트렌스페린 혼합물만이 플라스미드 DNA의 흡수를 용이하게 하지 않음을 보인다. 다른 시험에서는, 과도의 천연 트랜스페린을 일정량의 TfpL-DNA 복합체에 가한다. 제10B도는 배지중에 유리된 트랜스페린이 TfpL에 의혜 매개되는 DNA 흡수를 위해 효율적으로 경쟁하여 루시페라제의 효소 활성이 감소됨을 도시한다. 이것으로부터 세포에 의한 TfpL-DNA 복합체의 흡수가 트랜스페린 수용체를 경유하여 일어남을 결론지을 수 있다.
[실시예 10]
예비 시험에서, 닭의 섬유아세포를 erbB 절단된 DNA로 형질감염시킴으로서 erbB 절단된 리보자임-tDNA가 닭의 세포내에서 발현됨이 밝혀졌다.
본 실시예는 erbB 온코진에 대해 유도되는 tDNA 리보자임을 폴리라이신-트랜스페린 결합체의 보조로 erbB- 형질전환된 닭의 적아구내로 도입하여 온코진의 형질전환 활성을 약화시킬 수 있음을 보여준다.
erbB의 해독 개시 영역에 대해 유도되는 두개의 tRNA 리보자임 유전자를 작제한다(참조: 제7도 및 제11도). 유전자를 함유하는 각각의 플라스미드 약 100μg을 325bp 단편상의 tRNA 리보자임 유전자를 유리시키기 위하여 EcoRl으로 분해시킨다.
분해 생성물을 클레나우 단편에 의해 말단 표지시키고 2% 아가로즈/TBE 겔을 사용하여 겔 전기영동에 의해 정제시킨다. 벡터 단편 및 tRNA-리보자임 유전자 단편을 에티디움브로라이드로 염색시켜 위치 확인하고, 절단한 뒤 전기 용출에 의해 회수한 후, 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 추출한 뒤 에탄올로 침전시킨다.
이후 정제되고 방사선 표지된 DNA 단편을 트랜스페린-폴리라이신 수송 시스템의 도움으로 erbB-RNA 흡수 및 억제를 측정한다. 벡터 pSPT 18은 대조구 DNA로서 사용된다.
사용된 시험 세포 시스템은 조류의 적아구증 바이러스 AEV(참조: Beug et al, 1982b)의 온도-민감성 돌연변이체(ts 34, Graf et al. 1978)에 의해 형질전환된 닭의 적아구 세포주이다. 이들 세포내에서 또한 발현된 erbA 온코진은 특이적 단백질 키나제 억제제(H7)에 의해 억제된다[v-erbA 온코진은 생체내 및 시험관내(즉, 세균적으로 발현된 단백질로서)에서 두 부위, 즉 Ser 28 및 Ser 29에서 단백질 키나제 C 또는 cAMP-의존성 단백질 키나제에 의해 포스포릴화되어짐이 밝혀졌다). 이들 세린의 알라닌 형성으로의 돌연변이는 포스포릴화를 방해하여. v-erbA 온코진 활성을 파괴한다. H7은 이들 두 키나제의 특이적 억제제로서, v-erbA-v-erbB를 함유하는 적아구내에서 v-erbA에 의해 야기되는 변화(즉 분화의 차단)를 선별적으로 정지시킬 수 있다.
그 안에서 erbB 온코진이 불활성돠되는-즉 온도-민감성 erbB 들연변이체의 경우 온도를 증가시킴으로써 적아구가 적혈구로 성숙됨이 공지되어 있다. 이 과정의 최초의 징후중 하나는, 헤모글로빈 합성의 유발인데, 이는 단일 제포의 수준에서 감도 시험(참조: 산성벤지딘 염색, Orkin et al, 1975, Graf et al, 1978)에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 벤지딘- 양성 세포의 수에 있어서의 특이적 증가는 이 시험 시스템에서의 erbB에 대해 유도되는 리보자임의 표현형적 효파로서 기대될 수도 있다.
본 실시예가 기반을 두는 일련의 시험은 하기와 같이 실행된다: TE 완충액 30㎕ 중에 용해된 다양한 DNA 제제를 천연 트랜스페린-철 복합체 또는 트랜스페린-폴리라이신 결합체 (2회 증류된 물 50㎕ 중에 용해된) 10μg과 혼합한 뒤 37℃에서 30분 동안 배양한다.
벡터 DNA(10μg)의 경우, 상응하게 더 많은(100μg) 트랜스페린 제제를 사용한다. DNA 트랜스페린-DNA 혼합물을 트랜스페린-비함유 분화 배지 1ml에 가한다(참조: Zenke et al., 1988). 시험 세포(뱃치당 3×106)를 시험 전에 트랜스페린-비함유 분화 배지중에서 42℃에서 60분간 배양하고(트랜스페린 흡수를 강화하기 위해) DNA-트랜스페린-함유 혼합물에 가한다. 6시간, 18시간 및 68시간 후 (세포 처리는 하기 참조) 표본을 기술된 바와 같이 취하고 상등액 및 세포 침전물로 분리시켜 PK/SDS 완충액중에 용해시킨 뒤 DNA를 분석한다.
제12도는, 실시예 8에서와 유사하게, 트랜스페린-폴리라이신으로 처리된 세포 표본에서는, 천연 트랜스페린으로 처리된 대조구에서 보다 약 5 내지 10배의 DNA가 세포에 의해 흡수되어짐을 도시하고 있다.
트레이스 m: 분자량 마커: pBR 322 DNA를, HpaII로 절단하고 알파-32P-CTP로 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편을 사용하여 방사능 표지한다(Manialis).
트레이스 1: 2000cpm ES13 단편
트레이스 2:. 트랜스페린 및 ES13으로 처리된 세포로부터의 물질
트레이스 3: 트랜스페린-폴리라이신 및 ES13으로 처리된 세포로부터의 물질
배양(6시간)이 종결된 후 세포를 원심분리시키고 에리트로포이에틴 및 인슐린과 함께 트랜스페린 함유 분화 배지 내에서 추가로 72시간 배양한다(참조: Kowenz et al, 1986, Zenke et al 1988, 뱃치당 2ml 씩 37℃에서, 즉 활성 v-erbB 단백질의 존재 하에서).
하기 결과를 수득한다:
1. 실시예 8에서와 같이, DNA의 증가된 흡수는 트랜스페린-폴리라이신으로 처리된 세포 표본 내의 erbB 절단 DNAs의 크기에서 관찰될 수 있다(약 5배 증가).
2. 표 4는 erbB 절단 리보자임 tDNA가 폴리라이신-트랜스페린 작제물의 보조로 IrbB 형질전환된 적아구 내로 도입될때, 벤지딘-양성 세포의 비율이 크게 증가 (약 2배)되어짐을 보여준다(사용된 표준은 벡터 DNA로 처리된 표본인데 여기서 폴리라이신-트랜스페린 결합체의 사용은, 기대한 바와 같이, 벤지딘-양성 세포의 수에 있어서 어떠한 증가도 유도하지 않았다).
[실시예 11]
닭의 조혈세포내에서의 트랜스페린-폴리라이신/DNA 복합체의 효율적인 결합 및 내화 세포 표면 수용체로 TfpL 및 TfpL-DNA의 결합은 스테인 등에 의해 기술된 방법(1984)을 사용하여 트리티움-표지된 물질로 측정한다.3H-표지된 TfpL은 실시예 1에서 기술된 방법을 사용하여 트랜스페린과 표지된 폴리라이신의 결합에 의해 제조된다. 폴리라이신 90의 표지하는 포름알데히드 및3H-표지된 불화수소 나트륨으로 처리함으로서 실행된다(참조: Ascoli and Puet, 1974). 이 시험의 결과는 제13도에 도시하고 있다. 표지된 TfpL 90(□) 또는 pB-SK-DNA(Promega Biotech, 트리톤-X로 용해시키고. CsCl/EtBr 평형 밀도 구배로 원심분리하여 1-부탄올로 탈색시킨뒤 10mM 트리스/HCl(PH 7.5), lief EDTA에 대해 투석하여 제조됨)와 복합화된 표지된 TfpL 90(△)을 HD3 세포의 트랜스페린 수용체로의 이들의 특이적 결합을 위해 연구한다. 이를 위하여 결합체 또는 복합체(0.1 내지 100nM)를 HD3 세포(MEM(Eagle's Minimum Medium)중 1x106/ ml+1% BSA)로 가한뒤 3시간동안 배양한다.
제13도는 결합체 모두와 복합체가 포화되는 방식으로 HD3 세포에 결합함을 보여준다. 이들 자료로부터 계산된 겉보기 결합상수는 TfpL에 있어서 22nM이고 TfpL-DNA 복합체에서는 43nM에 이른다. 비록 다소 높을지라도, 이들 값은, 15nM로 나타난 천연 트랜스페린에서 수득된 값과 비교적 상응한다.
세포내 소포내로 TfpL-DNA 복합체의 흡수를 조사하기 위하여, 먼저 모든 HD3 세포를 트랜스페린-비함유 분화 배지에서 37℃에서 18시간동안 배양한다. FITC 트랜스페린 또는 TfpL 결합체(폴리라이신 그룹에서 FITC로 표지되고 어떤 실험에서는 DNA와 복합화된)의 첨가후, 세포를 추가로 18시간 배양한다. 세포를 세포원심 분리시키고, 3.7% 포름알데히드 및 0.02% 글루타르알데히드의 혼합물로 고정하여, PBS로 세척한뒤 모비올(Mowiol) 4.88내로 봉매하여 형광 현미경(Zeiss Axiophot)하에서 검경한다 사용된 대조구는 FITC-표지된 염소의 항-마우스 항체(0.1mg/ml)로 구성된다(참조: 실시예 5). FITC-Tf, FITC-TfpL 및-FITC-TfpL/ DNA의 정량적 측정을 위해서, 세포를 미지의 제조물(Tf: 40μg/ ml; TfpL 270: 50μg/ml; TfpL 270 및 PB-SK-DNA(Proinega Biotech, 트리톤-X로 용해시키고, CSCl/EtBr 평형 밀도 구배로 원심분리시켜, 1-부탄올로 탈색시킨뒤 100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 1mM EDTA에 대해 투석시킴으로서 제조된다): 50μg/ml 또는 16μg/ml; 결합 완충용액)과 함께 6시간 동안 배양하고 냉 PBS/BSA중에서 3회 세척한뒤 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson (BD)) FACSAN내에서 정량 FACS 분석한다.
제14도는 TfpL 및 TfpL-DNA로, 모든 세포는 10배 이상 증가된 상대 형광성을 갖는데, 이것은 결합체 또는 복합체가 95% 이상의 세포에 의해 흡수되어짐을 나타낸다(Tf:‥‥‥; TfpL:‥‥ ; TfpL/DNAL:__ ; 결합 완충액 :----).
[실시예 12]
[TfpL에 의해 세포내로 흡수된 DNA의 발현]
전 실시예에서 TfpL에 의한 유전자 수송이 세포성장에 위해하지 않다는 것이 밝혀진후, 좀더 오랜 기간동안 사용되었딘 TfpL-DNA 복합체의 활성이 시험되었다.
(사용된 DNA는, 실시예 9에 기술된 바와 같이, 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA이다) 이 시험에서 동일 농도의 HD3 세포가 TfpL-DNA 복합체로 매일 보충되거나/보충없이 1 내지 4일 동안 배양되었다.
다양한 시간 간격을 두고, 실시예 5에서 기술된 바와 같이 루시페라제 효소활성에 대해 분취액을 조사하였다. 반복적으로 복합체를 가한 배양에서는, 비교적 높은 수준의 루시페라제 유전자 발견이 측정되고(107세포당 100,000 내지 200,000 광단위), 이는 전체 관찰 시간에 걸쳐 실질적으로 일정하게 유지된다 이 기간 동안에는 세포독성효과는 관찰되지 않는다.. 만일 세포를 단지 1회 복합체로 처리한다면, 루시페라제 활성은 제2일과 4일 사이에 10 내지 20만큼 감소한다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 결합체의 도움으로 세포내로 도입된 루시페라제 유전자의 명백한 순간적인 발현에도 불구하고, 도입된 유전자의 변함없는 높은 발현이 반복된 첨가제에 의해 유지될 수 있음을 보여준다.
[실시예 13]
얼마나 많은 비율의 세포가 트랜스페린 감염에 의해 도입된 플라스미드 DNA를 실제로 발현시킬 수 있는지 알기 위해, 전 실시예에서 기술된 바와 같이 HD3 세포를 TfpL/DNA 복합체와 함께 배양한다. pRSV-βGal 플라스미드 DNA(_)가 DNA로서 사용된다. 이 리포터 유전자의 발현을 개개의 세포내에서 FACS 분석에 의해 조사한다(참조. Nolan et al., 1986). TfpL-pB-SK- DNA(‥‥)를 대조구로서 사용한다. 형광 βGal 기질 FDG (플루오레신-디-β-d-갈락토피라노시드)를 삼투 쇼크에 의해 도입하고, βGal 효소 활성에 의해 FDG로부터 유리된 플루오레신을 함유하는 세포의 분포를 조사한다. 플루오레신-함유 세포의 획일적 분포는 많은 비율과 세포가 βGal 리포터 유전자를 발현시킨다는 결론을 이끌어낸다. 이 시험의 결과는 제15도에 도시되어 있다.
Claims (5)
- 결합체의 단백질 부분이 트랜스페린이고 다가 양이온이 프로타민 또는 폴리라이신임을 특징으로 하는, 핵산 또는 핵산 동족체와 함께 가용성 복합체를 형성할 수 있으며, 이때 가용성 복합체가 수용체-매개된 식작용(endocytosis)에 의해 세포내로 흡수되는, 단백질-다가 양이온 결합체.
- 제1항에 있어서, 다가 양이온이 프로타민임을 특징으로 하는 결합체.
- 제1항에 있어서, 다가 양이온이 폴리라이신임을 특징으로 하는 결합체.
- 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온이 20 내지 500개의 양전하를 함유함을 특징으로 하는 결합체.
- 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린 대 다가 양이온의 몰비가 10:1 내지 1:4임을 특징으로 하는 결합체.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ATA610/89 | 1989-03-16 | ||
AT61089 | 1989-03-16 |
Publications (2)
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