FI105485B - Transferriini-polykationi-konjugaatit ja nukleiinihappokompleksit - Google Patents

Description

105485

Transferriini-polykationi-konjugaatit ja -nukleiinihappokompleksit - Trans-ferrin-polykatjonkonjugat och -nukleinsyrakomplex

Keksintö koskee polykationien suhteen affiniteettia omaavien aineiden, erityi-5 sesti nukleiinihappojen, kuljetusta soluun kuljetuksen tapahtuessa reseptorivä-litteisen endosytoosin välityksellä.

Antisense-RNA- ja antisense-DNA-sekvenssit ovat sekä soluvapaissa järjestelmissä että elävissä soluissa osoittautuneet tehokkaiksi aineiksi määrättyjen 10 geenisekvenssien selektiiviseksi inhiboimiseksi. Vaikutustapa perustuu komp-lementoivan nukleiinihapposäikeen spesifiseen tunnistukseen ja sille asettumiseen, jolloin sen transkriptio, translaatio ja lohkeamisprosessit häiriintyvät.

Tämä vaikutusmekanismi mahdollistaa periaatteessa antisense-oligonukleoti-dien käyttö terapeuttisina aineina, jotka salpaavat in vivo määrättyjen geenien 15 (kuten säätelemättömien kasvaintekijöiden tai virusgeenien) ilmaisun. Sittemmin osoitettiin, että lyhyet antisense-oligonukleotidit voidaan kuljettaa soluihin, joissa ne voivat harjoittaa estovaikutustaan (Zamecnik et ai., 1986), vaikkakin niiden solunsisäinen pitoisuus on alhainen, mikä on seurausta mm. niiden rajoitetusta, nukleiinihappojen voimakkaasta negatiivisesta varauksesta johtu-20 vasta otosta solumembraanin läpi.

Toinen lähtökohta geenien selektiivisesti inhiboimiseksi on käyttää ribotsyyme-jä, jotka ovat määrättyjä RNA-sekvenssejä tunnistamaan, niihin sitoutumaan ja niitä pilkkomaan kykeneviä RNA-molekyylejä. Myös tässä on välttämätöntä 25 saada soluun mahdollisimman korkea pitoisuus aktiivisia ribotsyymejä, jolloin kuljetuksesta soluun muodostuu yksi rajoittavista tekijöistä.

Näiden rajoittavien tekijöiden hallitsemiseksi esitettiin sitten useita ratkaisuja.

30 Eräs näistä ratkaisutavoista käsittää nukleiinihappojen suoran modifioinnin, esim. substituoimalla varauksia omaavat fosfodiesteriryhmät ei-varatuilla mety-leenifosfonaatti- (Smith et ai., 1986), karbamaatti- (Stirchak et ai., 1987) tai silyyliyhdiste- (Cormier et ai., 1988) ryhmillä tai fosforotioaattiryhmillä (Stern 2 105485 et ai., 1988). Toinen mahdollisuus suoran modifioinnin suorittamiseksi on nukleosidianalogien käyttö (Morvan et ai., 1988, Praseuth et ai., 1988).

Vaikkakin jotkut näistä ehdotuksista edustavat periaatteessa lupaavia lähtö-5 kohtia mainitun ongelman ratkaisemiseksi, niihin liittyy kuitenkin erilaisia huonoja puolia, esim. vähäisempi sitoutuminen kohdemolekyyliin sekä varsinaisen estovaikutuksen alhaisempi aste. Tärkeä huono puoli modifioituja oligonukleo-tideja in vivo käytettäessä on edelleen näiden yhdisteiden mahdollinen myrkyllisyys.

10

Vaihtoehtoisen lähtökohdan mukaan oligonukleotidin suoraksi modifoimiseksi oligonukleotidia sinänsä ei muuteta, mutta se varustetaan haluttuja ominaisuuksia mukanaan tuovalla ryhmällä, esim. kuljetusta soluun helpottavilla molekyyleillä. Eräs tämän periaatteen mukainen ratkaisuehdotus on konjugoi-15 da oligonukleotidi polykationisiin yhdisteisiin (Lemaitre et ai., 1987).

Nisäkässolujen geneettiseksi transformoimiseksi in vitro tunnetaan erilaisia tekniikoita, jolloin niiden käyttö in vivo on kuitenkin rajoitettua (mainittuun luetaan DNA:n kuljettaminen viruksia, liposomeja käyttämällä, elektroporaation 20 avulla, mikroruiskeena, solufuusion välityksellä, DEAE-dekstraania käyttäen tai kalsiumfosfaattisaostusmenetelmiä käyttäen).

Tämän vuoksi pyrittiin myöhemmässä vaiheessa kehittämään in vivo käyttökelpoinen liukoinen järjestelmä, joka kuljettaa DNA:n soluihin kohdistetusti resep-25 torivälitteisen endosytoosin välityksellä (G.Y. Wu, C.H. Wu, 1987). Tämä järjestelmä kehitettiin maksasoluille ja se perustuu oleellisesti seuraaviin kahteen seikkaan: 1. Maksasolujen pinnalla on reseptoreita, jotka sitovat määrättyjä glykoprote-30 iineja kuljettaen ne soluun.

105485 3 2. DNA voidaan voimakasta sähköstaattista vuorovaikutusta hyödyntäen sitoa polykationisiin yhdisteisiin, esim. polylysiiniin, jolloin muodostuu liukoisia komplekseja.

5 Järjestelmä perustuu periaatteeseen, jonka mukaan polylysiini kytketään tällaiseen glykoproteiiniin, joka sopii mainittuun reseptoriin, minkä jälkeen lisäämällä DNA muodostetaan liukoinen glykoproteiini/polylysiini/DNA-kompleksi, joka j tulee kuljetetuksi glykoproteiinireseptoriin omaaviin soluihin ja kompleksin siirryttyä soluun mahdollistäakyseisen DNA-sekvenssin ilmaisun.

10

Kyseisen keksinnön tehtävänä oli tarjota käyttöön hyvin aktiivinen kuljetusjärjestelmä, joka olisi laajemmin käyttökelpoinen kuin edeltävä entuudestaan tuttu järjestelmä, joka johtuen reseptorin spesifisestä esiintymisestä yhdessä ainoassa solutyypissä soveltuu käytettäväksi vain tämän solutyypin yhteydessä.

15

Keksinnön mukaan tämän tehtävä ratkaistaan siten, että polykationi sidotaan transferriiniin.

Transferriinit ovat luokka likeisiä, metalleja sitovia kuljetusglykoproteiineja, 20 jotka ovat raudalle spesifisiä in ivo. On tunnistettu erilaisia nisäkästransferrii-neja, jolloin plasman käsittämä transferriini huolehtii useimpien kudostyyppien raudantarpeesta. Transferriiniä tuottaa pääasiassa maksa.

Transferriinin molekyylipaino on noin 80 000, jolloin molekyylipainosta 6 % 25 muodostavat sokerijäännökset. Yksi transferriinimolekyyli kykenee sitomaan kaksi rautamolekyyliä, jolloin sitoutuminen edellyttää karbonaatti- tai bikarbo-naatti-ionien läsnäoloa.

Transferriinireseptori, josta esiintyy mahdollisesti eri soluissa vähäisessä mää-30 rin - ehkä hiilihydraattiryhmässä - toisistaan poikkeavia muotoja, on transmem-braaniglykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 180 000, jolloin yksi resep-torimolekyyli kykenee sitomaan yhden molekyylin tai ehkä kaksi molekyyliä transferriiniä.

4 105485

Transferriinireseptorilla on fysiologisessa pH:ssa 7,4 erittäin korkea affiniteetti Fe2-transferriinin suhteen, alhaisempi affiniteetti Fe-transferriinin suhteen eikä käytännöllisesti katsoen lainkaan affiniteettia apotransferriinin suhteen, vaikka tämä muodostaakin pH:ssa noin 5 reseptorin kanssa erittäin stabiilin komplek-5 sin.

Transferriinireseptoreita on osoitettu erityisen runsaasti varhaispunasoluista, istukasta ja maksasta ja mitattavia pitoisuuksia myös monista muista kudostyypeistä. Erityisen kiinnostava on havainto, että reseptori on kasvavissa soluissa 10 korkeasäädelty. Havaittiin myös, että reseptoriluku syöpäkudoksissa in vivo on hyvälaatuisiin kudosmuutoksiin nähden oleellisesti kohonnut, mitä viittaa kohonneeseen raudantarpeeseen. Transferriini-rautakompleksin siirtymismekanismia reseptoreilla ja sen solusisäistä sykliä on perusteellisesti tutkittu.

15 Täysin selvillä ei vielä olla rautamolekyylin irtoamisen transferriinistä mekanismista, joskin yleisesti ollaan kannalla, että luovutus tapahtuu valtaosin solun-sisäisesti. Energiasta ja lämpötilasta riippuvaisessa prosessissa Fe-transferrii-ni tai Fe2-transferriini sitoutuu reseptoriin solumembraanissa. Sen jälkeen kompleksi siirtyy rakkulaan, jota kutsutaan endosomiksi tai reseptosomiksi.

20 Tämä yhdistyy toiseen rakkulaan, jossa pH on alle 5,5; ympäristön muuttuessa happamaksi rauta irtoaa transferriinistä. Apotransferriinireseptorikompleksi tulee sitten kuljetetuksi takaisin solumembraaniin, josta aprotransferriini neutraalin pH:n vaikutuksesta liukenee ympäröivään väliaineeseen. On olemassa viitteitä siitä, että uudelleenkierrätys, jonka toimiminen perustuu reseptorin 25 happamassa ja neutraalissa pH:ssa erilaiseen affinitettiin apo- ja vastaavasti rautatransferriinin suhteen, tapahtuu Golgin laitteen rakkuloiden välityksellä.

Molekyylitasolla transferriinisyklin etenimistä ei ole vielä selvitetty; vain tiettyjen näkökohtien osalta löytyy viitteitä, esim. fosforylaation mahdollisesta osuu-30 desta (Hfibers et ai., 1987).

5 105485

Kyseisen keksinnön avulla on ensimmäistä kertaa onnistuttu hyödyntämään tätä aktiivista kuljetusjärjestelmää sellaisten nukleiinihappojen kuljettamiseksi soluihin, joiden siirtämisessä soluun on kohdattu vaikeuksia.

5 Keksintö koskee siten uusia proteiini-polykationikonjugaatteja, joille on tunnusomaista se, että ne kykenevät muodostamaan vesiliukoisia komplekseja nukleiinihappojen tai nukleiinihappo-analogien kanssa, jotka siirtyvät ihmis- tai eläin-soluihin reseptorivälitteisen endosytoosin in vitro avulla, jolloin moolisuhde transferriini:polykationi on 10:1 -1:4 ja polykationi on positiivisesti varattujen 10 aminohappojen synteettinen, homologinen tai heterologinen polypeptidi, polyetyleeni-imiini tai protamiini.

Yllättäen todettiin, että keksinnön mukaisia konjugaatteja käyttäen nukleiinihappoja kyetään kuljettamaan soluihin tehokkaasti siten, että niiden inhiboiva 15 aktiivisuus säilytetään.

"Transferriinilla" tarkoitetaan kyseisen keksinnön mielessä sekä luontaisia transferriinejä että transferriinimodifikaatioita, jotka sitoutuvat reseptoriin ja tulevat kuljetetuksi soluihin (tällaiset modifikaatiot voivat käsittää esimerkiksi 20 aminohappomuutoksen tai molekyylin lyhentämisen reseptorisitoutumisen määräävässä osuudessa).

Transferriinin ja polykationin välinen moolisuhde on edullisesti 10:1 -1:4, jolloin tulee ottaa huomioon aggregaattien mahdollinen muodostuminen. Tar-25 vittaessa tämä suhde voi kuitenkin vaihdella laajemmissa rajoissa, kunhan täytetään edellytykset, että nukleiinihappo/-ot kompleksoituvat ja että muodostunut kompleksi voi sitoutua transferriinireseptoriin ja tulla kuljetetuksi soluun, 4 mistä voidaan tapauskohtaisesti varmistua yksinkertaisilla kokeilla.

30 Edellä mainittu suhde on ennen muuta riippuvainen polykationimolekyylin koosta sekä positiivisesti varattujen ryhmittyminen lukumäärästä ja jakaumasta, jolloin mainitut kriteerit määräytyvät kuljetettavan yhden tai useamman nukleiinihapon koon, rakenteen sekä mahdollisesti läsnäolevien modifikaatio!- 6 105485 den perusteella. Polykationit voivat olla keskenään samanlaisia tai poiketa toisistaan.

Polykationeina voidaan käyttää seuraavia yhdisteitä: 5 a) Protamiinit: nämä ovat pieniä (mp. </= noin 8000), voimakkaasti emäksisiä proteiineja, joiden positiivisesti varatut aminohappojäännökset (ennen muuta arginiini-) ovat tavallisesti järjestäytyneet ryhmiksi ja jotka polykationisen luonteensa ansiosta neutraloivat nukleiinihappojen negatiivisia varauksia (Warrant 10 et ai., 1978). Kyseisen keksinnön puitteissa käyttökelpoiset protamiinit voivat olla luontaista alkuperää tai yhdistelmägeeniteknisesti valmistettuja, jolloin voidaan valmistaa monikertakopiota tai suorittaa molekyylikoon ja aminohapposekvenssin osalta modifikaatioita. Vastaavia yhdisteitä voidaan syntetisoida myös kemiallisesti. Synteettistä protamiinia valmistettaessa voidaan menetellä 15 esimerkiksi siten, että aminohappojäännökset, joilla luontaisessa protamiinissa on kuljetusfunktion kannalta epätoivottavia funktioita (esim. DNA:n kondensaa-tio), korvataan sopivilla muilla aminohapoilla ja/tai jompaankumpaan päätyyn liitetään aminohappo (esim. kysteiini), joka mahdollistaa kohdistetun konjugoinnin transferriiniin.

20 b) Synteettiset polypeptidit, kuten homologiset polypeptidit (polylysiini, polyar-giniini) tai heterologiset polypeptidit (jotka koostuvat kahdesta tai useammasta positiivisesti varatusta aminohaposta).

25 c) Ei-peptidiluonteiset kationit kuten polyetyleeni-imiini.

Polykationien koko valitaan edullisesti siten, että positiivisten varauksien summa on noin 20 - 500, jolloin summa määräytyy kuljettavan nukleiinihapon mukaan.

Keksinnön mukaiset transferriini-polykationikonjugaatit voidaan valmistaa kemialliset! tai - polykationin ollessa polypeptidi - yhdistelmägeenitekniikkaa käyttäen. Kemiallinen kytkeminen voidaan suorittaa peptidien kytkemisestä 30 105485 7 sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin tarvittaessa yksittäiset rakenneosat varustetaan ennen kytkemisreaktiota liittoaineilla (tämä toimenpide on välttämätön silloin, kun kytkentään soveliasta funktionaalista ryhmää, esim. merkapto- tai alkoholiryhmää, ei entuudestaan ole käytettävissä. Liittoaineet ovat bifunktio-5 naalisia yhdisteitä, jotka saatetaan ensin reagoimaan yksittäisten rakenneosien funktionaalisten ryhmien kanssa, minkä jälkeen modifioidut yksittäiset rakenneosat kytketään toisiinsa.

Kulloinkin riippuen konjugaatille halutuista ominaisuuksista, erityisesti sen 10 stabiilisuuden osalta, kytkeminen voidaan suorittaa seuraavasti: a) Käytetään disulfidisiltoja, jotka voidaan pelkistävissä olosuhteissa jälleen pilkkoa (esim. käyttämällä sukkinimidyylipyridyyliditiopropionaattia) (Jung et ai., 1981).

| 15 | b) Käytetään biologisissa olosuhteissa suuressa määrin stabiileja yhdisteitä ! 'Γ5 ti5Sr: (esim. tioeetteriä käyttämällä maleimidoliittoaineiden reaktiota toisen rakenneosaan sidotun liittoaineen sulfhydryyliryhmien kanssa).

20 c) Käytetään biologisissa olosuhteissa labiileja siltoja, esim. esterisidoksia, tai lievästi happamissa olosuhteissa epästabiileja asetaali- tai ketaaliyhdisteitä.

Valmistamalla keksinnön mukaiset konjugaatit yhdistelmägeeniteknisesti saavutetaan se etu, että voidaan saada tarkkaan määriteltyjä, homogeenisia yh-25 disteitä, kun puolestaan kemiallisesti kytkettäessä muodostuu konjugaattiseok-sia, jotka joudutaan erottamaan.

Keksinnön mukaiset konjugaatit voidaan yhdistelmägeeniteknisesti valmistaa menetelmillä, jotka tunnetaan kimeeristen polypeptidien valmistamiseksi. Täl-30 löin polykationisia peptidejä voidaan varioida niiden koon ja aminohapposekvenssin osalta. Geenitekninen valmistus tarjoaa myös sen edun, että konju-gaatin transferriiniosuutta voidaan modifioida, jolloin esimerkiksi sopivilla mutaatioilla voidaan nostaa sitoutumiskykyä reseptoriin tai transferriinosuutta 105485 8 molekyyliin sitoutumisen reseptoriin määräävässä osassa lyhennetään. Erityisen tarkoituksenmukaista keksinnön mukaisten konjugaattien yhdistelmägee-nitekniseksi valmistamiseksi valmistamiseksi on käyttää vektoria, joka sisältää transferriinosuutta koodaavan sekvenssin sekä polyliittäjän, johon kulloinkin 5 tarvittava polykationista peptidiä koodaava sekvenssi sijoitetaan. Tällä tavalla voidaan saada seos ilmaisuplasmideja, joista erotetaan tarpeen mukaan halutun sekvenssin sisältävä keksinnön mukaisten konjugaatin ilmaisemiseksi.

Soluun kuljetettavat nukleiinihapot voivat olla DNA- tai RNA-sekvenssejä, jol-10 loin nukleotidisekvenssiin nähden ei ole rajoituksia. Nukleiinihappoja voidaan modifioida, kunhan modifiointi ei häiritse nukleiinihappojen polyanioinista luonnetta; näihin modifikaatioihin kuuluvat esim. fosfodiesteriryhmän korvaaminen fosforotioaatilla tai nukleosidianalogien käyttö.

15 Esillä olevan keksinnön kohteena ovat transferriini-polykationi/nukleiinihappo- kompleksit, joille tunnusomaista on se, että niitä voidaan siirtää ihmis- tai eläinsoluihin reseptorivälitteisen endosyytin in vitro avulla.

Kyseisen keksinnön puitteissa tulevat nukleiinihappoina kyseeseen ennen 20 muuta ne, jotka halutaan kuljettaa soluun spesifisten geenisekvenssin inhiboi-miseksi. Mukaan luetaan antisense-oligonukleotidit ja ribotsyymit, valinnaisesti kantajanukleiinihapon ohella.

Nukleiinihappojen kokoon nähden keksintö mahdollistaa samoin laaja-alaisen 25 käytön. Alarajan suhteen keksinnön mukainen kuljetusjärjestelmä ei aseta mitään rajoituksia; summittainen alaraja perustuu käyttöspesifisyyteen liittyviin seikkoihin, jolloin esim. alle noin 10 nukleotidin antisense-oligonukleotidit tuskin tulevat kyseeseen johtuen niiden liian alhaisesta spesifisyydestä. Keksinnön mukaisia konjugaatteja käyttäen soluihin voidaan viedä myös plasmide-30 ja, jolloin käytännön merkitystä on ennen muuta pienehköillä plasmideilla, joita voidaan käyttää kantaja-nukleiinihappoina (esim. retrovisusvektorit, jotka käsittävät korkeintaan 5000 emäsparia).

i 9 105485

Keksinnön mukaisia konjugaatteja käyttämällä on samoin mahdollista viedä soluun samanaikaisesti erilaisia nukleiinihappoja.

Kyseisen keksinnön seuraava etu liittyy siihen, että transferriinille ja reseptoril-5 le muodostuu polymorfismeja, joita voidaan hyödyntää inhiboivien nukleiinihappojen kuljettamiseksi kohdistetusti määrättyihin soluihin.

Kyseisen keksinnön puitteissa kyettiin osoittamaan, että transferriini-polykat-ionikonjugaatit siirtyvät tehokkaasti eläviin soluihin ja sisäistyvät niihin. Keksin-10 nön mukaiset konjugaatit tai kompleksit eivät ole haitallisia solukasvulle. Tämä mahdollistaa niiden antamisen toistuvasti ja siten soluun vietyjen geenien jatkuvasti korkean ilmaisun.

Edelleen kyettiin osoittamaan, että kyseiset polykationi-transferriinikonjugaatit 15 kykenevät korvaamaan funktionaalisesti luontaisen transferriini-rautakomplek- sin. Siitä, että transferriini-polykationi/DNA-kompleksit siirtyvät soluun transfer-riinireseptorin välityksellä, varmistuttiin käyttämällä lusiferaasigeeniä DNA-rakenneosana. Osoitettiin, että luontainen transferriini syrjäyttää tehokkaasti transferriini-polykationi/DNA-kompleksin, mikä mitattiin lusiferaasiaktiivisuuden 20 alenemisena solussa.

Kyseisen keksinnön puitteissa suoritettujen kokeiden avulla kyettiin myös osoittamaan, että tRNA-ribotsyymigeeni (ribotsyymi oli kohdistettu V-erbB-sekvenssiin) voitiin viedä erbB:llä transformoituihin kanasoluihin keksinnön 25 mukaista konjugaattia (polylysiini-transferriini-) käyttämällä, jolloin kyseisen kasvaintekijän transformoivaa vaikutusta pystyttiin alentamaan. Tämä tulos on sitäkin merkittävämpi, koska näissä kokeissa käytettiin vain vähäistä määrää ribotsyymigeeniä.

30 Nukleiinihapon ja konjugaatin keskinäinen suhde voi vaihdella laajoissa rajoissa, ellei ole aivan välttämätöntä saada neutraloiduksi kaikkia nukleiinihapon käsittämiä varauksia. Tämä suhde säädetään tapauskohtaisesti kriteerien, kuten kuljettavan nukleiinihapon koko ja rakenne, polykationin koko, sen va- 105485 10 rauksien lukumäärä ja jakauma mukaan siten, että kulloiseenkin käyttöön saadaan edullinen suhde kuljetuskyvyn ja nukleiinihapon biologisen aktiivisuuden välille. Tämä suhde voidaan määrätä ensin karkeasti, esimerkiksi DNA:n kulkeutumisen geelissä hidastumista tarkastelemalla (esim. käyttäen "liikesiir-5 toa" agaroosigeelissä) tai tiheysgradienttitrifugointia käyttäen. Kun tämä alustava suhde on saatu, saattaa silmälläpitäen solussa maksimaalisesti käytettävissä olevaa nukleiinihappoaktiivisuutta olla tarkoituksenmukaista suorittaa kuljetuskokeita radioaktiivisesti leimattua kompleksia käyttäen ja mahdollisesti pienentää konjugaattiosuutta siten, että nukleiinihapon jäljellejäävät negatiivi-10 set varaukset eivät estä kuljetusta soluun.

Transferriini-polykationi/nukleiinihappokompleksit, jotka samoin kuuluvat keksintöön, voidaan valmistaa polyionisten yhdisteiden kompleksoimiseksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Eräs mahdollisuus säätelemättömän aggregaatin 15 tai saostumisen välttämiseksi on sekoittaa ensin molemmat rakenneosat korkean (noin 1 M) keittosuolapitoisuuden läsnäollessa, minkä jälkeen pitoisuus säädetään dialysoimalla tai laimentamalla vastaamaan fysiologista keittosuo-lapitoisuutta. Kompleksinmuodostusreaktiossa ei edullisesti käytetä liian korkeita DNA-ja konjugaattipitoisuuksia (yli 100 mikrogrammaa/ml) kompleksin 20 saostumisen välttämiseksi.

Keksinnön mukaisissa transferriini-polykationi-nukleiinihappokomplekseissa nukleiinihappo-osuus on edullisesti antisense-DNA, antisense-RNA tai ribot-syymi tai sitä koodaava geeni. Käytettäessä ribotsyymejä tai antisense-RNA-25 sekvenssejä käytetään erityisen edullisesti näitä RNA-funktioita inhiboivia RNA-sekvenssejä koodaavia geenejä, edullisesti yhdessä kantajageenin kanssa. Vietäessä soluun geeni saadaan vastoin kuin RNA.ta sellaisenaan siirrettäessä RNA:n merkittävä vahvistuminen ja siten haluttuun biologisen reaktion estoon riittävä varanto. Erityisen sopivia kantajageenejä ovat transkriptiolle 30 polymeraasi-lll:n toimesta välttämättömät transkriptioyksiköt, esim. tRNA-gee-nit. Näihin voidaan liittää esim. ribotsyymigeenejä siten, että transkriptiossa ribotsyymistä tulee osa tiivistä polymeraasi-lll-transkriptiä. Kyseisen keksinnön i „ 105485 mukaisen kuljetusjärjestelmän avulla voidaan vahvistaa näiden geneettisten yksiköiden vaikutusta, koska soluun saadaan geenin korkeampi lähtöpitoisuus.

Keksintö koskee edelleen käyttöä nukleiinihapon tai -happojen viemiseksi 5 ihmis- tai eläinsoluihin in vitro tai ex vivo, jolloin edullisesti muodostetaan fysiologisissa olosuhteissa liukoinen kompleksi.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavien esimerkkien avulla.

10 Esimerkki 1 T ransferriini-polylysiini-90-konjugaattien valmistus v Kytkeminen suoritettiin kirjallisuudesta tutuilla menetelmillä (Jung et ai., 1981) Ξ 15 aikaansaamalla disulfidisiltoja sukkinimidyylipyidyyliditiopropionaatilla modifi oinnin jälkeen.

a) 3-(2-Pyridyyliditio)propionäatilla modifioitu transferriini 20 6 ml:aan Sephadex-G-25-geelillä suodatettua liuosta, jossa oli 120 mg (1,5 mikromoolia) transferriiniä (kananmunanvalkuaisesta, Sigma, Conalbumin Type I, ei sisällä rautaa) 3 ml:ssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,8), lisättiin samalla tehokkaasti sekoittaen 200 mikrolitraa sukkinimidyyli-3-(2-pyri-dyyliditio)propionaatin (3 mikro-M, SPDP, Pharmacia) 15 mM etanoliliuosta ja 25 seoksen annettiin reagoida 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa silloin tällöin sekoittaen. Geelikolonnissa (Sephadex-G-25, 14 x 180 mm, 0,1 M natriumfos-faattipuskuri, pH 7,8) erotettiin alhaisen molekyylipainon omaavat reaktiotuotteet ja reagenssijäämät, jolloin saatiin 7ml:n tuotefraktio; fransferriiniin sitoutuneiden pyridyylipropionaattijäännöksien pitoisuus saatiin määrittämällä ditio-30 treitolilla pelkistetystä näytteestä fotometrisesti vapautuneen pyridiini-2-tionin määrä ja pitoisuus oli noin 2,6 mikromoolia.

Humaanitransferriiniä (Sigma, ei sisällä rautaa) modifioitiin vastaavasti.

105485 12 b) Merkaptopropionaatilla modifioitu polylysiini-90 (pL-90):

Liuos, jossa oli 18 mg (noin 1,0 mikromoolia) poly-L-lysiinihydrobromidia (Sigma, leimattu fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC), molekyylipaino noin 5 18 000, joka vastaa keskimääräistä polymerisaatioastetta noin 90) 3 ml:ssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,8), suodatettiin Sephadex-G-25:llä (fluoresenssileimaus suoritettiin natriumbikarbonaattipuskurissa, pH 9, 3 tuntia kestävänä). Polylysiiniliuos laimennettiin vettä lisäämällä 7 ml:ksi, minkä jälkeen siihen lisättiin samalla tehokkaasti ravistellen 270 mikrolitraa SPDP:n 10 15 mM etanoliliuosta ja seoksen annettiin reagoida 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa silloin tällöin sekoittaen. Seokseen lisättiin 0,5 ml 1 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,0), minkä jälkeen alhaisen molekyylipainon omaavien ainesosien erottamiseksi se suodatettiin Sephadex-G-25:llä (eluent-ti: 20 mM natriumasetaattipuskuri, pH 5,0). Tuotefraktiota (ninhydriinivärjäys, 15 fluorointi) haihdutettiin tyhjössä, jäännöksen pH säädettiin puskuria lisäämällä noin 7:ksi ja siihen lisättiin liuos, jossa oli 23 mg (150 mikromoolia) ditiotreitolia 200 mikrolitrassa vettä, minkä jälkeen seos jätettiin tunniksi huoneen lämpötilaan pimeään argon-suojakaasuun. Toistamiseen geelisuodattamalla (Sephadex G-25,14 x 130 mm kolonni, 10 mM natriumasetaattipuskuri, pH 20 5,0) erotettiin pelkistinylimäärä ja saatiin 3,5 ml tuoteliuosta, jossa fluoreseiinil- la leimattu polylysiini sisälsi 3,8 moolin pitoisuuden merkaptoryhmiä (fotometrinen määritys käyttäen Ellmanin reagenssia, 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoehap-PO))· 25 c) Transferriini-polylysiinikonjugaatti:

Kohdassa a) saatu liuos, jossa oli modifioitua transferriiniä (7 ml 0,1 M nat-riumfosfaattipuskurissa, pH 7,8, noin 1,5 mikromoolia transferriiniä, jossa noin 2,6 mikromoolin pitoisuus pyridyyliditiopropionaattijäännöksiä), huuhdottiin 30 argon-kaasulla; liuokseen lisättiin 2,0 ml edellä kohdassa b) saatua liuosta, jossa oli merkapto-modifioitua polylysiiniä (10 mM natriumasetaattipuskurissa, pH 5,0, mikä vastaa noin 0,6 mikromoolia polylysiiniä, jossa noin 2,2 mikromoolia merkaptoryhmiä), se huuhdottiin argonilla ja sitä ravistettiin, minkä 105485 13 jälkeen seos jätettiin reagoimaan 18 tunniksi huoneen lämpötilaan pimeään argon-suojakaasuun. Reaktioseos laimennettiin vettä lisäämällä 14 ml.ksi ja erotettiin ioninvaihtokromatografisesti (Pharmacia Mono S -kolonni HR 10/10, gradienttieluointi: puskuri A - 50 mM HEPES, pH 7,9, puskuri B - A + 3 M nat-5 riumkloridi, 0,5 ml/min, kuvio 1). Ei-konjugoitunut transferriini eluoitui ensin ja tuotefraktiot pitoisuudessa noin 0,66 -1,5 M natriumkloridi.

Kaikki fraktiot huomioiden saatiin konjugaatteja, joissa transferriini-poly-lysiinisuhde oli 1,3:1.

10

Konjugoidut tuotteet (ninhydriinivärjäys, UV 280 nm -proteiiniabsorptio sekä FITC-leimatun polylysiinin fluoresenssimittaus 495 nm:n aallonpituudella) kerättiin 6 fraktiossa, joista kussakin transferriinin pitoisuus oli noin 10 mg. Fraktioita dialysoitiin ensin 100 mM rauta(3)sitraattiliuosta (jonka pH säädetty 7,8:ksi 15 natriumvetykarbonaatilla) vastaan ja sen jälkeen vielä kaksi kertaa 1 mM HEPES-puskuria (pH 7,5) vastaan.

2-Merkaptoetanolilla suoritetun esikäsittelyn jälkeen natriumdodesyylisulfaatti-geelielektroforeeseissa (10 % SDS, 8 % polyakryyliamidi), katso kuvio 2, kai-20 kissa 6 fraktiossa esiintyi suunnilleen sama pitoisuus transferriiniä (kuvio 2A), kun sitä vastoin ei-pelkistetyissä näytteissä ei ollut havaittavissa lainkaan vapaan transferriinin nauhoja, vaan ainoastaan pieni määrä pitkälle kulkeutuneita konjugaatteja (kuvio 2B, T = ei-käsitelty transferriini; 1-6 = konjugaatti-fraktiot 1-6).

25

Esimerkki 2 T ransferriini-polylysiini-270- ja transferriini-polylysiini-450-konjugaattien (pL270 ja pL450) valmistus 30 a) Modifioitu transferriini valmistettiin esimerkin 1a) mukaan.

b) Modifioidun polylysiini-270:n ja polylysiini-450:n valmistus ., 105485 14

Suodatetun liuoksen, jossa oli 0,33 mikromoolia polylysiini-270:ää (jonka keskimääräinen polymerisaatioaste oli 270 lysiinijäännöstä, fluoroivasti leimattuna tai ei; vastaten 19 mg hydrobromidisuolaa) 1,2 ml:ssa 75 mM natriumasetaat-tipuskuria, pH säädettiin natriumkarbonaattipuskuria lisäämällä 8,5:ksi, minkä 5 jälkeen lisättiin 182 mikrolitraa SPDP:n 15 mM etanoliliuosta (1,9 mikromoolia) samalla tehokkaasti sekoittaen. Tunnin kuluttua lisättiin 200 mikrolitraa 1 M natriumasetaattiliuosta, pH 5; geelisuodattamalla 20 mM natriumasetaattiliuos-ta käyttäen saatiin liuos, joka sisälsi 0,27 mikromoolin pitoisuuden polylysiini-270:ää, jossa oli 1,3 mikromoolin pitoisuus merkaptoryhmiä (4,8 liittäjää poly-10 lysiiniketjua kohden).

Vastaavalla tavalla 0,20 mikromoolia polylysiini-450:tä (jonka keskimääräinen polymerisaatioaste oli 450 lysiinijäännöstä) modifioitiin käyttäen 2,25 mikromoolia SPDP:tä, jolloin saatiin tuote, jossa oli 0,19 mikromoolin pitoisuus poly-15 lysiini-450:tä, jossa oli 2,1 mikromoolin pitoisuus merkaptoryhmiä (11 liittäjää polylysiiniketjua kohden). Analogisesti esimerkkiin 1b) nähden ditiopyridiini-ryhmät pelkistettiin ditiotreitolilla vapaiden sulfhydryyliryhmien saamiseksi.

c) Transferriini-polylysiinikonjugaattien valmistus 20

Transferriini-polylysiini-270-konjugaatteja valmistettiin sekoittamalla 1,0 mikromoolia modifioitua transferriiniä 100 mM fosfaattipuskuriin, pH 7,8, 0,14 mikromoolin modifioitua polylysiini-270:ää ohella (20 mM natriumasetaattipuskuris-sa) happisulkua käyttäen argon-suojakaasussa. 18 tunnin huoneen lämpötilas-25 sa kuluttua reaktioseos laimennettiin vettä lisäämällä 10 ml:n tilavuudeksi ja saatu liuos puhdistettiin kationinvaihtokromatografisesti (Pharmacia Mono S -kolonni HR 10/10; gradienttieluointi: puskuri A: 50 mM HEPES, pH 7,9; puskuri B: A + 3 M natriumkloridia; UV-absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella ja fluo-resenssimittaus, herätys 480 nm:n aallonpituudella, emissio 530 nm:n aallonpi-30 tuudella). Tällöin ensimmäisenä eluoitui ei-kytkeytynyt transferriiniylijäämä; tuotefraktiot eluoituivat pitoisuudessa 30 - 50 % gradienttia B ja yhdistettiin 3 konjugaattifraktioksi (moolisuhde transferriini-polylysiini: erä A: 5,5:1; erä B: f 105485 15 3,4:1; erä C: 1,8:1). Keskimääräinen konjugaattisaanto käsitti 0,23 mikromoolia transferriiniä ja 0,075 mikromoolia polylysiini-270:ää.

Vastaavalla tavalla valmistettiin transferriini-polylysiini-450-konjugaatteja, 5 jolloin lähtöaineena käytettiin 1,2 mikromoolia esimerkin la) mukaista modifioitua transferriiniä (20 mm HEPES-puskurissa, pH 7,9, joka sisälsi 80 mM nat-riumkloridia) ja 71 nanomoolia esimerkin 2b) mukaista merkaptomodifioitua polylysiini-450:tä asetaattipuskurissa.

10 Reaktioseokset puhdistettiin geelipermeaatiokromatografisesti (Pharmacia Superose 12 -kolonni, 1 M guanidiinikloridi, pH 7,3), jolloin dialysoimalla (20 mM HEPES, pH 7,3, jossa oli 100 mM natriumkloridia) saatiin transferriini-polylysiinikonjugaatteja, jotka sisälsivät 0,40 mikromoolia transferriiniä ja 38 nanomoolia polylysiini-450:tä.

15 .........

Rauta saatiin mukaan lisäämällä näytteisiin 6-12 mikrolitraa 100 mM rautasit-raatti puskuri a Qoka sisälsi natriumbikarbonaattia, pH säädetty 7,8:aan) milligrammaa transferriinisisältöä kohden.

20 Esimerkki 3 a) Transferriini-protamiinikonjugaattien valmistus

Modifioitu transferriini valmistettiin kuten esimerkissä 1 a).

25 b) 3-Merkaptopropionaatilla modifioidun protamiinin valmistus

Liuokseen, jossa oli 20 mg (3 mikromoolia) protamiinitrifluoriasetaattisuolaa [joka oli valmistettu ioninvaihtokromatografisesti lohiprotamiini- (= salmiini-) 30 sulfaatista, Sigma] 2 ml:ssa DMSO:ta ja 0,4 ml:ssa isopropanolia ja 2,6 mikro-litraa (15 mikromoolia) etyylidi-isopropyyliamiinia, lisättiin liuos jossa oli 30 mikromoolia SPDP:tä 250 mikrolitrassa isopropanolia ja 250 mikrolitrassa DMSO:ta, useana eränä tunnin aikana. 3,5 tunnin huoneen lämpötilassa kulut- 105485 16 tua liuos haihdutettiin tehokkaassa tyhjössä kuiviin ja jäännös lietettiin 0,5-%:iseen etikkahappoliuokseen, jossa oli 10 % metanolia. Geelisuodatta-malla (Sephadex G10; 0,5-%:inen etikkahappoliuos, jossa 10 % metanolia) saatiin sitten kylmäkuivaamalla 16 mg (2,5 mikromoolia) protamiiniasetaat-5 tisuolaa, jota oli modifioitu 2,5 mikromoolilla ditiopyridiiniliittäjää. Pelkistämällä 1,75 mikromoolia protamiinia (joka sisälsi 1,75 mikromoolia liittäjää) liuoksella, jossa oli 16 mg ditiotreitolia natriumbikarbonaattipuskurissa, pH 7,5,1 tunnin ajan argonsuojakaasussa, säätämällä sitten pH 5,2:ksi ja geelisuodattamalla Sephadex G10 -hartsikakun läpi eluoiden 20 mM natriumasetaattipuskurilla, 10 pH 5,2, saatiin protamiiniliuos, jossa modifikaatio käsitti 1,6 mikromoolia merkaptopropionaattiliittäjää.

c) Transferriini-protamiinikonjugaattien valmistus 15 Suorittamalla kohdan b) mukaan saadun protamiiniliuoksen (1,6 mikromoolia liittäjää) reaktio 1,34 mikromoolin transferriiniä (jota oli modifioitu 3,1 mikrokoo-lilla ditiopyridiiniliittäjää) kanssa ja sitten puhdistamalla kationinvaihtokromato-grafisesti kuten transferriini-polylysiinikonjugaateille kuvattu saatiin neljä peräkkäin eluoituvaa tuotefraktiota A - D, jotka sisälsivät 90, 320, 240 ja vastaavasti 20 120 nanomoolia modifioitua transterriiniä protamiinimäärän vastaavasti kasva essa (määritettynä SDS-geelielektroforeettisesti; 10 % SDS, 8 % polyakryyli-amidi, Coomassie-sinivärjäys). Kuviossa 3 esitetään SDS-geelielektroforeesin 9 tulos. Tfprot-konjugaattifraktioissa A - D esiintyi hitaammin kulkeutuvia nauhoja (a), kun taas beta-merkaptoetanolilla pelkistetyissä näytteissä (b) todettiin vain 25 transferriininauha. Dialyysi ja raudan liittäminen suoritettiin kuten kuvattu esimerkissä 2 transferriinipolylysiinikonjugaateille TfpL270 ja TfpL450.

Esimerkki 4 30 Transferriini-polykationikonjugaattien DNA-kompleksien valmistus

Kompleksit valmistettiin sekoittamalla laimeita (30 mikrogrammaa/ml tai alle) DNA-liuoksia transferriini-palykationikonjugaatteihin. DNA-kompleksien saos- 105485 17 tumisen estämiseksi käytettiin fosfaattivapaata puskuria (fosfaatti vähentää konjugaatin liukoisuutta). DNA:n sitoutuminen polykationikonjugaattiin fysiologisissa ioniolosuhteissa varmistettiin geeliliikesiirtomäärityksen avulla käyttäen 3'-päädyssä 32P-leimattua lambda-DNA:ta, jota oli pilkottu EcoRI/Hindlll:lla 5 (kuvio 4). Kuhunkin 1 mikrolitran (35 ng) DNA-näytteeseen lisättiin 3 mikrolit-raa 100 mM HEPES-puskuria, pH 7,9, joka sisälsi 1 M natriumkloridia ja näytteet sekoitettiin kasvaviin määriin (10 ng -1000 ng) transferriinikonjugaatteja 11 mikrolitrassa vesiliuosta, jolloin natriumkloridin loppupitoisuudeksi tuli 200 mM. Elektroforeesi 1-%:isessa agaroosigeelissä 1 x TAE -ajopuskuria 10 käyttäen suoritettiin 50 voltin jännitteellä (vastaa 45 mA) 2,5 tuntia kestävänä; geeli kuivattiin ja otettiin autoradiokuva XAR-filmille (Kodak) valottaen 2 tunnin ajan -80°C:ssa.

Esimerkki 5 15

Transferriini-polylysiinikonjugaattien kuljetus eläviin soluihin

Sen osoittamiseksi, että esimerkissä 1 kuvatut transferriinipolylysiinikonjugaatit siirtyvät tehokkaasti eläviin värhaispunasoluihin, nämä konjugaatit leimattiin 20 FITC:llä. Tunnetusti (Schmidt et.al., 1986) FITC-leimattu transferriini on voitu osoittaa (fluoresenssimikroskooppi-tarkastelu) solusisäisistä rakkuloista var-haispunasoluissa, joista transferriini oli aiemmin poistettu, sen jälkeen kun # soluja inkuboitiin muutaman tunnin ajan transferriinillä.

25 Kyseisessä esimerkissä varhaispunasoluja (jotka oli transformoitu EGF-resep-toriretroviruksella, Kahazaie et.al., 1988) inkuboitiin 18 tunnin ajan transferriini-vapaassa differentiaatiokasvualustassa (koostumus lähteessä Zenke et.al., « 1988) 37°C:ssa (solupitoisuus 1,5 x 106/ml). Soluihin lisättiin eri transferriinipo-lylysiinikonjugaatteja (tai verrokkina vastaava määrä steriiliä vettä (aq bidest)), 30 minkä jälkeen niitä inkuboitiin 37°C:ssa 10 ng:lla/ml EGF:ää (transformoidun tilan säilyttämiseksi). 24 ja 48 tunnin kuluttua otettiin noin 5 x 105 solua, jotka pestiin kerran fosfaattipuskuroidulla fysiologisella keittosuolaliuoksella (PBS, pH 7,2), minkä jälkeen ne kiinnitettiin käyttäen 50x tilavuus seosta, jossa oli 105485 18 3,7 % formaldehydiä ja 0,02 % glutaarialdehydiä PBS.ssä (10 min, 40°C), pestiin kerran PBSillä sekä siirrettiin sitten Elvanol-valmisteeseen ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Axiophot, ohutnauha-FITC ja TRITC-herä-tys). Samanaikaisesti eri seoksien toisista näytteistä määritettiin solujen kasvu-5 nopeus. Tässä tarkoituksessa otettiin 100 mikrolitraa solususpensiota, jolla määritettiin 3H-tymidiinin otto (8 mikrocurie-yksikköä/ml, 2 tuntia) kuten kuvattu lähteessä Leutz et.al., 1984. Kuviosta 5 ilmenee, että transferriini-polylysiinillä inkuboidut varhaispunasolut sisälsivät 24 tunnin kuluttua 2-10 voimakkaasti fluoroivaa rakkulaa, joita ei löytynyt verrokeista. Taulukosta A ilmenee, että 10 käytännöllisesti katsoen kaikki solut ottivat fraktiota 6 lukuun ottamatta kaikkia konjugaatteja.

Kuviossa 5 esitetään fluoresenssimittaustulokset kanan varhaispunasoluille, joita oli inkuboitu 24 tunnin ajan ilman konjugaatteja (A) tai FITC-leimatuilla 15 transferriinipolylysiinikonjugaateilla (B,C). Suoritettaessa herätys sinisellä valolla (B, FITC:n osoittamiseksi) on kussakin solussa selvästi havaittavissa enemmän fluoroivia rakkuloita. Kyseisen fluoresenssin spesifisyyden osoittaa se, ettei rakkulafluoresenssia saada suoritettaessa herätys vihreällä valolla (C; tällöin voidaan todeta solujen samankaltainen ei-spesifinen fluorointi kuin 20 A:ssa).

Se, että solut kasvavat kaikissa näytteissä yhtä nopeasti (tritioidun tymidiinin • < (3H-TdR) ottona mitattuna; taulukko A), osoittaa, etteivät polylysiinirakenteet vahingoita soluja, jolloin kyseessä ei ole ei-spesifinen siirtyminen (esim. läpäi-25 seviksi muuttuneiden solumembraanien läpi).

Esimerkki 6 Tällä kokeella oli määrä osoittaa, että tässä käytetyt transferriini-polylysiinikon-30 jugaatit tulevat solujen toimesta käytetyksi natiivin transferriinin tapaan, eli että konjugaatit läpikäyvät normaalin transferriinisyklin vastaavalla teholla. Testijär-jestelmäksi tässä soveltuvat erityisen hyvin varhaispunasolut, jotka transformoiva kasvaintekijä "poissulkemalla" voidaan indusoida kypsymään normaa- 105485 19 leiksi punasoluiksi (Beug et.ai., 1982). Kirjallisuudesta ilmenee, että tällaiset solut tarvitsevat normaalisti kypsyäkseen korkeita pitoisuuksia transferriini-rautakompleksia (100 - 200 mikrogrammaa/ml, 3x alhaisemmat pitoisuudet estävät solujen kypsymisen ja johtavat muutamassa päivässä solujen kuole-5 maan (Kowenz et.al., 1986). Samoin voitiin osoittaa (Schmidt et.al., 1986), että "uudelleenkierrätys", eli transferriinireseptorien uudelleenkäyttö ja sen välityksellä optimaalisella nopeudella etenevä transferriinisykli ovat normaalille in vitro -differentiaatiolle välttämättömät.

10 Varhaispunasolut Qotka oli transformoitu EGF-reseptoriretroviruksella) saatettiin differentioitumaan poistamalla EGF ja lisäämällä optimaalinen määrä osittain puhdistettua kanan erytropoietiinia (Kowenz et.al., 1986, transferriiniva-paata). Inkuboinnissa käytettiin solupitoisuutta 1 x 106 solua/ml ja se suoritettiin transferriinivapaassa differentiaatiokasvualustassa 42°C:ssa ja 5 %:n hiili-15 dioksidi-ilmakehässä. Inkubointia aloitettaessa lisättiin joko natiivia transfer-riini-rautakompleksia (Sigma, 100 mikrogrammaa/ml) tai raudalla kyllästettyä transferriini-polylysiinikonjugaattia (pitoisuus samoin 100 mikrogrammaa/ml). Solujen kasvu ja kypsymisaste analysoitiin 24 ja 48 tunnin kuluttua seuraavasti: 20 1. Soluluvun määritys (Coulter-laskijalla, malli ZM, Beug et.al., 1984); • · 2. Solujen kokojakauman mittaus (Coulter Channelyzer-laitteella, malli 256); ja 25 3. Solujen hemoglobiinipitoisuuden fotometrinen mittaus (Kowenz et.al., 1986).

m

Lisäksi seosnäytteitä sentrifugoitiin 72 tunnin kuluttua Cytozentrifuge-laittees-sa (Shandon) objektilasilla ja suoritettiin hemoglobiinin histokemiallinen määri-30 tys (värjäys neutraali-bentsidiinillä sekä Diff-Quick-pikavärjäys verisoluille, Beug et.al., 1982).

105485 20

Taulukossa B esitetyistä tuloksista ilmenee selvästi, että solut, jotka indusoitiin differentioitumaan polylysiinitransferriinikonjugaattifraktioiden 1-5 läsnäololla, kypsyivät aivan yhtä tehokkaasti ja samalla nopeudella kuin solut, joita oli inku-boitu natiivilla transferriini-raudalla. Solut transferriinivapaissa verrokeissa sitä 5 vastoin osoittivat voimakkaasti hidastunutta solukasvua ja akkumuloivat vain pieniä määriä hemoglobiinia. Tutkimalla solufenotyyppiä värjätyillä sytospiinip-reparaateilla todettiin, että polylysiinitransferriinikonjugaateilla inkuboidut solut olivat kypsyneet myöhäisretikulosyyteiksi (Beug et.al., 1982) aivan samoin kuin natiivilla transferriinillä käsitellyt solut, kun puolestaan ilman transferriiniä 10 inkuboidut solut käsittivät seoksena hajonneita ja epäkypsiä, varhaispunasolun kaltaisia soluja (Schmidt et.al., 1986). Vain transferriini-polylysiinifraktiolla 6 käsitellyt solut käsittivät alhaisemman hemaglobiinipitoisuuden ja korkeamman prosentuaalisen osuuden kypsymättä jääneitä soluja (taulukko B). Tämä osoittaa, että erityisen runsaalla määrällä polylysiiniä konjugoitu fraktio 6 toimii 15 huonommin transferriinisyklissä. Samanaikaisesti tämä tulos osoitti testimenetelmän herkkyyden.

Esimerkki 7 20 Samoin kuin esimerkissä 6 tutkittiin eri transferriini-polylysiinikonjugaattien ja transferriini-protamiinikonjugaattien kykyä korvata funktionaalisesti natiivi transferriinirautakompleksi kanan varhaispunasolujen kypsymisessä.

* ·« m

Osoitettiin, että päätydifferentioiduilta kanan varhaispunasoluilta puuttuu opti-25 maalisesti toimiva transferriinisykli, jolloin ilman transferriiniä tai estämällä transferriinireseptori-uudelleenkierrätys solut kuolevat (Kowenz et ai., 1986; Schmidt et ai., 1986). Koska tavallisesti käytetty osittain puhdistettu kanan erytropoietiini sisältää edelleen transferriiniä, EPO korvattiin transferriiniva-paalla osittain puhdistetulla punasolukasvutekijällä punasolujen differentiaation 30 mahdollistamiseksi (REV-tekijä; Kowenz et ai., 1986; Beug et ai., 1982): koh-desoluina varhaispunasoluja, jotka oli transformoitu ihmisen orvaskeden kasvu-tekijäreseptorin (EGFR.n) lämpöherkän v-myb-kasvaintekijän ohella sisältävällä retroviruksella, lisäännytettiin CFU-E-kasvualustassa (Radke et ai., 1982) 105485 21 pitoisuuden 20 ng/ml EGF:ää läsnäollessa. EGF:n vaikutuksesta nämä solut indusoidaan lisääntymään epänormaalisti, jollain poistamalla kasvutekijä EGF ja lisäämällä samanaikaisesti REV-tekijä solut saadaan siirtymään normaaliin differentiaatioon. Solut pestiin kahdesti transferriinivapaassa kasvualustassa, 5 minkä jälkeen ne siirrostettiin transferriinivapaaseen kasvualustaan ja lisättiin eri määriä raudalla kyllästettyä transferriiniä tai transferriini-polykationikonju-gaatteja (ennen niiden kompleksointia plasmidi-DNA.han tai tämän jälkeen). 1, 2 ja 3 päivän inkuboinnin 42°C:ssa jälkeen määritettiin solujen differentiaatioti-la sytosentrifugoimalla sekä histokemiallisesti värjäämällä tai määrittämällä 10 kvantitatiivisesti hemoglobiini.

Tämän kokeen tulos on esitetty kuviossa 6 ja taulukossa C.

Soluja (1 x 106 kpl/ml) inkuboitiin konalbumiinivapaassa differentiaatiokasvu-15 alustassa (Zenke et ai., 1988), jota oli täydennetty 1 mikrogramman/ml pitoisuudella insuliinia ja REV-tekijällä optimipitoisuutena (Kowenz et ai., 1986; laimennus 1:5000), kerran lisäämättä mitään (kolmiot), kerran lisäämällä raudalla kyllästettyä konalbumiinia (ympyrät) ja kerran lisäämällä raudalla kyllästettyä TfpL-270-konjugaattia (kulloinkin 100 mikrogrammaa/ml) (nelikulmiot), 20 14 mm:n halkaisijan omaavissa maljoissa. 24 ja 48 tunnin inkuboinnin jälkeen mitattiin fotometrisesti hemoglobiinipitoisuus 100 mikrolitran näyte-eristä. Viivattu alue ilmoittaa hemoglobiinipitoisuuden transferriinivapaissa olosuhteissa viljellyissä soluissa (keskiarvo 4 määrityksestä; kuvio 6A).

25 Punasolujen differentiaation transferriini- tai transferriinipolylysiinipitoisuuden funktiona analysoimiseksi soluja inkuboitiin kuten edellä kuvattu kasvualustassa, joka sisälsi ilmoitetut määrät raudalla kyllästettyä konalbumiinia (avoimet ympyrät), TfpL-90:ää (avoimet nelikulmiot) tai TfpL-270:ää (umpinaiset nelikulmiot), minkä jälkeen 2 päivän kuluttua hemoglobiinipitoisuus määritettiin foto-30 metrisesti (kuvio 6B).

Taulukko C: 22 105485

Punasolujen differentiaatiota seurattiin määrittämällä hemoglobiini fotometri-sesti (vrt. kuvio 6), laskemalla soluja Coulter-laskijalla tai sytosentrifugoimalla ja sitten värjäämällä neutraali-bentsidiinillä (hemoglobiinin määrittämiseksi) sekä histologisilla väriaineilla (Diff Quick; Beug et ai., 1982b). Transferriinin ja 5 transferriini-konjugaattien loppupitoisuudet kokeessa 1 olivat 60 mikrogram-maa/ml; kokeissa 2 ja 3 100 mikrogrammaa/ml. DNA-pitoisuus kokeessa 2 oli 10 mikrogrammaa/ml. Hajonneiden solujen, kypsien solujen (LR: myöhäis-retikulosyytit; E: punasolut) ja epäkypsien solujen (Ebl) osuudet määritettiin Beugin et ai., 1982b, ja Schmidtin et ai., 1986, kuvaamien menetelmien mu-10 kaan. Saadut tulokset osoittavat, että kaksi erilaista transferriini-polylysiini-konjugaattia (TfpL-90 tai TfpL-270) kuten myös transferriiniprotamiinikonju-gaatti kykenevät korvaamaan funktionaalisesti natiivin transferriinin niiden salliessa raudan nopean kuljetuksen differentioituviin punasoluihin - niiden spesifinen aktiivisuus oli 1,5x - 2x alhaisempi (vrt. kuvio 6). DNA:n komplek-15 sointi transferriini-polylysiini-270:ään ja transferriirii-protamiiniin ei oleellisesti muuttanut konjugaattien biologista aktiivisuutta. Verrokkikokeessa varmistettiin, että lisättäessä polylysiiniä tai protamiinia sekoitettuna sopivaan määrään rautasitraattia transferriinikonjugaattien asemesta solut eivät kyenneet diffe-rentioitumaan vaan kuolivat, mikä vastasi verrokkikokeissa ilman transferriiniä 20 inkuboitujen solujen kohtaloa.

Kaikkiaan esimerkkien 6 ja 7 mukaiset kokeet ovat osoittaneet, että kumpikin a« polykationi-transferriinikonjugaattilaji siirtää rautaa vain hiukan vähemmän tehokkaasti kuin luontainen transferriini.

25

Esimerkki 8

Polylysiini-transferriinikonjugaatit mahdollistavat DNA:n oton kanan varhais-punasoluissa 30

Kyseisessä kokeessa tuli tutkia, voisiko kooltaan tDNAribotsyymejä (vrt. kuvio 7) vastaava DNA tulla transferriinipolylysiinikonjugaattien toimesta tehokkaasti 105485 23 kuljetetuksi soluihin. Kyseisessä esimerkissä käytettiin tDNA:ta, joka sisälsi seuraavan sekvenssin mukaisen insertin:

CGTTAACAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC 5 CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC

jonka molekyylipaino oli noin 300 000 ja joka oli päätyleimattu 32P-ATP:llä (Maniatis). Noin 0,3 mikrogrammaa tätä DNA.ta sekoitettiin 20 mikrolitraan TE-puskuria liuotettuna joko 10 mikrogrammaan natiivia transferriiniä, 10 mik-10 rogrammaan transferriini-polylysiinikonjugaattia fraktio 3, liuotettuna kulloinkin 50 mikrolitraan vettä (aq bidest) 400 mikrogramman/ml nautaseerumialbumii-nia ohella (Beug, H. et.al, 1982), tai 50 mikrolitraan tätä liuotinta ilman transferriiniä. Kuhunkin DNA-proteiiniseokseen lisättiin 2 ml transferriinivapaata differentaatiokasvualustaa ja 4 x 10® kanan varhaispunasolua (jotka oli trans-15 formoitu EGF-reseptoriretroviruksella ja joita oli esi-inkuboitu 18 tunnin ajan transferriinivapaassa kasvualustassa EGF:n läsnäollessa (Kahazaie et.al., 198)), minkä jälkeen seoksia inkuboitiin 8 tunnin ajan 37°C:ssa 5 %:n hiilidioksidi-ilmakehässä. Sitten solut sentrifugoitiin eroon, supernatantti erotettiin ja solut pestiin 3 kertaan transferriinivapaalla kasvualustalla. Solusakka ja viljely-20 alusta lietettiin liuokseen, joka käsitti pitoisuudet 1 % SDS, 1 mg/ml protei-naasi-K, 300 mM NaCI, 20 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA (PK/SDS-puskuri), ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37°C:ssa, minkä jälkeen liuoksia uutettiin fenoli/kloroformilla ja DNA eristettiin etanolilla saostamalla. Eristetty DNA, jonka kokonaisradioaktiivisuus oli 2000 tuiketta/min, erotettiin ei-denaturoivas-25 sa 3,5-%:isessa akryyliamidigeelissä (TBE, Maniatis) ja DNA todettiin ottamalla autoradiokuva. Osoitettiin, että transferriini-polylysiinillä käsitellyissä solunäytteissä solut ottavat noin 5 -10 kertaa enemmän DNA:ta kuin verrokkinäytteis-: sä, jotka sisältävät natiivia transferriiniä.

105485 24

Esimerkki 9

Polylysiini-transferriinikonjugaatit mahdollistavat plasmidi-DNA:n oton ja ilmaisun kanan varhaispunasoluissa 5 Näissä kokeissa käytettiin plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi Photinus pyralis -lusi-feraasigeenin reportterigeeninä, geenisiirron ja ilmaisun tutkimiseksi. Tässä tarkoituksessa valmistettiin pRSVIuc-plasmidi-DNA:ta (De Wet, J.R., et ai., 1987) käyttämällä Triton-X-lyysi-vakiomenetelmää (Maniatis), minkä jälkeen 10 suoritettiin CsCI/EtBr-tasapainotiheysgradienttisentrifugointi, poistettiin väri 1-butanolia käyttäen ja dialysoitiin 10 mM Tris/HCI-puskuria, pH 7,5, vastaan, joka sisälsi pitoisuuden 1 mM EDTA. Tyypillisessä kompleksinmuodostusreak-tiossa 10 mikrogrammaa transferriini-polylysiini- tai transferriini-protamiinikon-jugaattia lisättiin hitaasti, samalla varovaisesti sekoittaen 3 mikrogrammaan 15 pRSVIucplasmidi-DNA:ta, joka oli 250 mikrolitrassa 0,3 M NaCI-liuosta (todettiin, että käytettäessä näitä olosuhteita voidaan 500 mikrolitran tilavuudessa käyttää aina 100 mikrogrammaa transferriini-polykationikonjugaattia ja 30 mikrogrammaa plasmidi-DNA:ta, ilman että konjugaatti/DNA-kompleksit saostuvat). 30 minuutin huoneen lämpötilassa kuluttua kompleksit lisättiin suoraan 20 5-10x10® HD3-soluun [0,5 -1x10® solua/mi, EBM+H-kasvualusta (Beug et ai., 1982a; 37°C, 5 % C02] ja inkuboitiin 16 - 48 tunnin ajan (solulinjana käytettiin ts-v-erbB:llä transformoitua kanan varhaispunasolusolulinjaa HD3). Solut otettiin talteen (5 min 1500 x g, 4°C), pestiin kahdesti fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lietettiin 100 mikrolitraan 0,25 M Tris/HCI-puskuria, 25 PH 7,5. Solu-uutteet valmistettiin suorittamalla kolme jäädytys-sulatussykliä ja sitten sentrifugoimalla korkeaa kierrosnopeutta käyttäen (15 min, 18 500 x g, 4°C). Eristä tällaisia solu-uutteita tutkittiin lusiferaasientsyymiaktiivisuuden läsnäolo (De Wet, J.R., et ai., 1987). Bioluminointi mitattiin Clinilumat-laitetta (Berthold, Wildbach, Länsi-Saksa) käyttäen. Todettiin, ettei transferriini-poly-30 kationi/DNA-kompleksien läsnäololla kasvualustassa ollut haitallista vaikutusta solukasvuun tai solujen lisääntymiseen. Kuten kuviosta 8 ilmenee, maksimaaliseen lusiferaasiaktiivisuuteen päästiin käytettäessä pitoisuuksia 3 mikrogrammaa DNA:ta/10 mikrogrammaa TfpL:ää ja 0,3 -1 mikrogrammaa DNA:ta/Tfprot.

105485 25

Olettaen, että kaikki muodostuneet konjugaatti/DNA-kompleksit olivat identtisiä, tämä vastaa moolisuhdetta 25 tai 75 konjugaattimolekyyliä yhtä plasmidi-DNA-molekyyliä kohden. Tästä voidaan päätellä, että kompleksissa DNA on täysin konjugaattimolekyylien peittämä, ja konjugaatti/DNA-suhteessa, joka 5 ilmeisesti sallii neutraalin sähkövarauksen (laskettuna DNA:n fosfaattiryhmien käsittämien negatiivisten varausten neutralointiin tarvittavien positiivisten varauksien polykationissa lukumäärästä). Tämä oletus sopii havaintoon, jonka mukaan transferriini-polylysiiniin verrattuna vähemmän voimakkaasti positiivisesti varattua transferriini-protamiinia tarvitaan kolme kertaa enemmän opti-10 maaliseen kompleksinmuodostukseen ja geenisiirtoon pääsemiseksi. Tämä oletus sopii myös esimerkissä 4 saatuun tulokseen tehokkaaseen kompleksinmuodostukseen tarvittavasta. konjugaatti/DNA-suhteesta.

Käyttämällä kompleksinmuodostukselle täten optimoitua TfpL/DNAsuhdetta 15 määritettiin tämän geenisiirtojärjestelmän herkkyys. Tämän kokeen tulos on esitetty kuviossa 9: alle 1 ng.lla lusiferaasia koodaavaa plasmidi-DNA:ta saadaan vielä todettava signaali. Jos käytetään yli 2 mikrogrammaa plasmidi-DNA:ta, kompleksoituna 6 mikrogrammaan TfpL:ää tai 20 mikrogrammaan -

Tfprot-.ia, lusiferaasiaktiivisuus ei enää kasva, mikä oletettavasti johtuu järjestel-20 män kyllästymisestä. Edelleen todettiin, ettei kompleksinmuodostus edellytä =

mitään erityisiä suola- tai ionipitoisuuksia, koska eri suolapitoisuuksissa (0, 20, E

50, 100, 200 mM NaCI) muodostetut TfpL/DNA-kompleksit olivat yhtä tehokkai- - * ta geenisiirtokokeissa (kuvio 8 ja kuvio 9: ympyrät Tfprot, nelikulmiot TfpL).

Voitiin osoittaa, että transferriini-polykationi/DNA-kompleksit siirtyvät soluun = 25 transferriinireseptorin välityksellä. Samoin osoitettiin kuviossa 10A esitetyn mukaisesti, että lusiferaasiaktiivisuus, johon päästään TfpL-DNA-kompleksia käyttäen, on ainakin 100 kertaa korkeampi kuin pL-DNA-kompleksille mitattu s aktiivisuus.

30 Verrakkikokeessa ilmeni, että polylysiinin.ja transferriinin seos yksinään ei ~ helpota plasmidi-DNA:n ottoa. Toisessa kokeessa vakiomäärään TfpL-DNA-kompleksia lisättiin ylimäärä natiivia transferriinia. Kuviosta 10B ilmenee, että vapaa transferriini kilpailee kasvualustassa tehokkaasti TfpLvälitteisestä DNA- 105485 26 otosta, mikä johtaa lusiferaasientsyymiaktiivisuuden alenemiseen. Tästä voidaan päätellä, että TfpL-DNA-kompleksien siirtyminen soluun tapahtuu trans-ferriinireseptorin kautta.

5 Esimerkki 10

Esikokeissa oli kanan sidekudosmuodostussoluja erbB-pala-DNA.IIa transfek-toimalla osoitettu, että erbB-palaribotsyymi-tDNA tulee ilmaistuksi kanasoluis-sa.

10 Tämän esimerkin avulla kyettiin osoittamaan, että erbB-kasvaintekijän vastaiset tDNA-ribotsyymit tulevat polylysiinitransferriinikonjugaattien toimesta kuljetetuiksi erbB:llä transformoituihin kanan varhaispunasoluihin, joissa ne kykenevät heikentämään kasvaintekijän transformoivaa vaikutusta.

15

Rakennettiin kaksi erbB:n translaatio-aloitusalueen vastaista tRNA-ribotsyymi-geeniä (vrt. kuviot 7 ja 11). Noin 100 mikrogrammaa kutakin geenin sisältävää plasmidia pilkottiin EcoRl llä tRNA-ribotsyymigeenin vapauttamiseksi 325 emäsparin fragmenttina. Pilkkomistuotteet päätyleimattiin Klenow-fragmenttia 20 käyttäen ja niitä puhdistettiin geelielektroforeettisesti 2 % agaroosiTTBE-geelis-sä. Vektorifragmentti ja tRNA-ribotsyymigeenifragmentit paikannettiin etidium-bromidi-värjäyksellä ja leikattiin irti, minkä jälkeen ne otettiin talteen elektro-eluutiolla, fenoli/kloroformilla ja kloroformilla uuttamalla sekä etanolilla seostamalla. Puhdistettuja, radioaktiivisesti leimattuja DNA-fragmentteja käytettiin 25 sitten transferriini-palylysiinikulletusjärjestelmää hyödyntäen erbB-RNA:n oton ja inhibition määrittämiseksi. Verrokki-DNA:na käytettiin vektoria pSPT18.

Testisolujärjestelmäksi valittiin kanan varhaispunasolusolulinja, joka on transformoitu linnun varhaispunasoluviruksen AEV lämpöherkällä mutantilla (ts 34, 30 Graf et.al., 1978) (Beug et.al., 1982 b). Näissä soluissa samoin ilmaistuksi tuleva erbA-kasvaintekijä voidaan inhiboida spesifisellä proteiinikinaasiestäjäl-lä (H7). [Todettiin, että sekä in vivo että in vitro (eli proteiini bakteereissa ilmaistaessa) proteiinikinaasi-C tai cAMP-riippuvainen proteiinikinaasi fosforyloi 105485 27 v-erbA-kasvaintekijän kahdesta kohdasta, nimittäin Ser28 ja Ser29. Mutatoi-malla nämä seriinit alaniineiksi estetään fosforylaatio ja tuhotaan v-erbA-kas-vaintekijäaktiivisuus. H7 on kummankin mainitun kinaasin spesifinen inhibiittori, joka kykenee v-erbA-v-erbB-pitoisissa varhaispunasoluissa poistamaan 5 selektiivisesti v-erbA:n aiheuttamat muutokset (esim. differentiaation salpaus)].

Tiedetään, että varhaispunasolut, joiden erbB-kasvaintekijä inaktivoidaan, tämän johdosta indusoituvat - esim. lämpötilaa kohottamalla, jos kyseessä ovat lämpöherkät erbB-mutantit - kypsymään punasoluiksi. Eräs tämän tapahtuma-10 sarjan ensimmäisistä merkeistä on hemoglobiinisynteesin induktio, joka voidaan herkällä menetelmällä (hapan bentsidiinivärjäys, Orkin et.al., 1975, Graf et.al., 1978) osoittaa yksittäisten solujen tasolla. ErbB-vastaisen ribotsyymin fenotyyppivaikutuksena tässä testijärjestelmässä olisi siten odotettavissa bentsidiinipositiivisten solujen lukumäärän spesifinen kohoaminen.

15 Tämän esimerkin perustana oleva koesarja suoritettiin seuraavasti: eri DNA-preparaatit (katso edellä sekä taulukko D) 30 mikrolitraan TE-puskuria liuotettuina sekoitettiin kulloinkin 10 mikrogrammaan natiivia transferriini-rautakom-pleksia tai transferriini-polylysiinikonjugaattia (liuotettuna 50 mikrolitraan vettä 20 (aq bidest)) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37°C:ssa.

Vektori-DNA: n (10 mikrogrammaa) kyseessä ollen käytettiin vastaavasti enemmän (100 mikrogrammaa) transferriini-valmisteita. DNA-transferriini-DNA-seok-set lisättiin kukin 1 ml:aan transferriinivapaata differentiaatiokasvualustaa 25 (Zenke et.al., 1988). Testisoluja (erää kohden 3 x 106 kpl) inkuboitiin ennen koetta 60 minuutin ajan transferriinivapaassa differentiaatiokasvualustassa 42°C:ssa (tämä vahvistaa transferriininottoa), minkä jälkeen ne lisättiin DNA- : transferriinipitoisiin seoksiin. Kuuden (6), 18 ja 68 tunnin kuluttua (solujen käsittely kuten alla) seoksista otettiin kuvattuun tapaan näytteitä, jatka erotet-30 tiin supernatantiksi ja solusakaksi, jotka puolestaan lietettiin PK/SDS-puskuriin ja analysoitiin DNA.

105485 28

Kuviosta 12 ilmenee, että analogisesti esimerkkiin 8 nähden transferriini-poly-lysiinillä käsitellyissä solunäytteissä noin 5-10 kertaa enemmän DNA.ta siirtyi soluihin kuin natiivia transferriiniä sisältävistä verrokki näytteistä.

5 Täplä m: molekyylipainomerkki: pBR322-DNA, joka on pilkottu HPalhlla ja leimattu radioaktiivisesti alfa-32P-CTP:llä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia käyttäen (Maniatis).

Täplä 1: 2000 tuiketta/min ES13-fragmentti.

10 Täplä 2: materiaalia transferriinilla ja ES13:lla käsitellyistä soluista.

Täplä 3: materiaalia transferriini-polylysiinillä ja ES13:lla käsitellyistä soluista.

15 Inkuboinnin päätyttyä (6 tuntia) solut sentrifugoitiin eroon ja siirrettiin transfer-riinipitoiseen differentiaatiokasvualustaan, 2 ml erää kohden, joka sisälsi eryt-ropoietiinia ja insuliinia (Kowenz et.al., 1986, Zenke et.al., 1988), ja inkuboitiin 37oC:ssa aktiivisen v-erbB-proteiinin läsnäollessa edelleen 72 tunnin ajan.

20 Saatiin seuraavat tulokset: 1. Kuten esimerkissä 8 voitiin transferriini-polylysiinillä käsitellyissä solunäyt-teissä erbB-pala-DNA-sekvenssien koosta havaita voimistunut (noin 5x) DNA:n otto.

25 2. Taulukosta D ilmenee, että kaikissa tapauksissa, joissa erbB-pala-ribot-syymi-tDNA vietiin polylysiini-transferriinirakenteita käyttäen erbB:llä transformoituihin varhaispunasoluihin, bentsidiinipositiivisten solujen prosentuaalinen osuus oli merkittävästi kohonnut (noin 2-kertaiseksi) (verrokkeina 30 käytettiin näytteitä, joita oli käsitelty vektori-DNA:lla ja joissa polylysiini- transferriinikonjugaattien käyttö ei oletettavasti johtaisi bentsidiinipositiivisten solujen lukumäärän kohoamiseen).

105485 29

Esimerkki 11

Transferriini-polylysiini/DNA~kompleksien tehokas sitoutuminen ja sisäistyminen verta muodostaviin kanasoluihin 5

TfpL.n ja TfpL-DNA:n sitoutuminen solupintareseptoreihin mitattiin käyttäen tritiumilla leimattuja aineita Steinin et ai., 1984, kuvaaman menetelmän mukaan. 3H-leimattua TfpL.:ää valmistettiin konjugoimalla leimattua polylysiiniä transferriiniin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaan. Polylysiini-90 lei-10 mattiin käsittelemällä formaldehydillä ja leimatulla natriumborohydridillä (Ascoli ja Puet, 1974). Tämän kokeen tulos on esitetty kuviossa 13. Tutkittiin leimatun TfpL-90:n (nelikulmiot) tai leimatun TfpL-90:n, joka oli kompleksoitu pB-SK-DNA:han (Promega Biotech, valmistus käyttäen Triton-X-lyysiä, CsCI/EtBr-tasapainotiheysgradienttisentrifugointia, värin poistoa 1-butanolilla ja dialyysiä 15 10 mM Tris/HCI-puskuria, pH 7,5,1 mM EDTA vastaan) (kolmiot), spesifistä sitoutumista HD3-solujen transferriinireseptoriin. Tässä tarkoituksessa konju-gaatti tai kompleksi (0,1 -100 nM) lisättiin HD3-soluihin [1 x 106 kpl/ml MEM (= Eaglen minimivaatimuskasvualusta) + 1 % BSA] ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Kuviosta 13 ilmenee, että sekä konjugaatti että kompleksi sitoutuvat HD3-solui-20 hin siten, että tapahtuu kyllästyminen. Näistä tiedoista lasketut näennäiset sitoutumisvakiot olivat 22 nM TfpLIle ja 43 nM TfpL-DNA-kompleksille. Nämä arvot - vaikkakin ne ovat jokin verran korkeampia - sopivat suhteellisen hyvin natiiville transferriinille saatuihin arvoihin, jotka määritettiin käyttäen pitoisuutta 15 nM.

25

TfpL-DNA-kompleksien siirtymistä solunsisäiseen rakkulaan seuraamiseksi inkuboitiin HD3-soluja transferriinivapaassa differentiaatiokasvualustassa 37°C:ssa 18 tunnin ajan. FITC-transferriini tai TfpL-konjugaatit (FITC:llä polyly-siiniryhmässä leimattuina, joissakin kokeissa DNA: hän kompleksoituina) lisät-30 tiin ja soluja inkuboitiin edelleen 18 tunnin ajan. Solut sytosentrifugoitiin, kiinnitettiin käyttäen seosta, jossa oli 3,7-%:ista formaldehydiliuosta ja 0,02-%:ista glutaarialdehydiliuosta, ne pestiin PBS:llä, siirrettiin Mowiol 4.88 -alustaan ja tarkasteltiin Zeiss Axiophot - fluoresenssimikroskoopilla. Verrokkeina käytettiin äo 105485 FITC-leimattuja vuohen hiirivastaisia vasta-aineita (0,1 mg/ml) (vrt. esimerkki 5). FITC-Tf:n, FITC-TfpL:n tai FITC-TfpL/DNA.n kvantitatiiviseksi määrittämiseksi soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan kulloisellakin valmisteella [Tf: 40 mikrogram-maa/ml; TfpL270: 50 mikrogrammaa/ml; TfpL270 + pB-SK-DNA (Promega 5 Biotech, valmistus käyttäen Triton-X-lyysiä, CsCI/EtBr-tasapainotiheysgradi-enttisentrifugointia, värin poistoa 1-butanolilla ja dialyysiä 10 mM Tris/HC1-puskuria, pH 7,5, 1 mM EDTA vastaan): 50 mikrogrammaa/ml tai 16 mikrogrammaa/ml; sitoutumispuskuri], minkä jälkeen ne pestiin kolmeen kertaan kylmällä PBS/BSA-liuoksella ja suoritettiin kvantitatiivinen FACS-analyysi 10 Becton-Dickinson- (BD-) FACSAN-laitetta käyttäen.

Kuviosta 14 ilmenee, että sekä TfpL:ää että TfpL-DNA:ta käytettäessä kaikki solut osoittavat enemmän kuin 10x kohonnutta suhteellista fluoresenssia, mikä viittaa siihen, että konjugaattia tai kompleksia siirtyy yli 95 %:iin soluista 15 (Tf:.....; TfpL:...; TfpL/DNA:_; sitoutumispuskuri: —).

Esimerkki 12

TfpL:n välityksellä soluihin siirtyneen DNA:n ilmaisu 20

Sen jälkeen kun edeltävissä esimerkeissä oli osoitettu, ettei geenisiirto TfpL.n välityksellä häiritse solukasvua, tutkittiin TfpL-DNA-kompleksien vaikutusta soluihin pitkähkön aikajakson puitteissa (DNA.na käytettiin lusiferaasigeenin sisältävää plasmidi-DNA.ta esimerkissä 9 kuvatun mukaisesti). Tässä kokees-25 sa HD3-soluja inkuboitiin aina samana pitoisuutena 1-4 päivän ajan lisäten tai ollen lisäämättä päivittäin TfpL-DNA . komplekseja.

V

«

Eri ajankohtina otetuista näytteistä tutkittiin lusiferaasientsyymiaktiivisuus esi-30 merkissä 9 kuvatun mukaisesti. Viljelmissä, joihin oli toistuvasti lisätty komplekseja, mitattiin suhteellisen korkea lusiferaasigeeni-ilmaisu (100 000 - 200 000 valoyksikköä/107 solua), joka säilyi kautta tutkimusajan oleellisesti vakiona. Tänä aikana ei havaittu solumyrkkyvaikutuksia. Panostettaessa komplekseja 105485 31 soluihin vain kerran lusiferaasiaktiivisuus aleni 2. ja 4. päivän väillä 10- - 20-kertaisesti. Nämä tulokset osoittavat, että huolimatta soluihin keksinnönmukai-sia konjugaatteja käyttäen viedyn lusiferaasigeenin ilmeisesti tilapäisestä ilmaisusta käyttämällä toistuvia lisäyksiä voidaan päästä siirretyn geenin va-5 kiollisesti korkeaan ilmaisuun.

Esimerkki 13

Siirtotartutuksella soluun viedyn plasmidi-DNA:n tosiasiallisesti ilmaisevien 10 solujen suhteellisen osuuden määrittämiseksi HD3-soluja inkuboitiin i TfpL/DNA-komplekseilla kuten edeltävissä esimerkeissä kuvattu. DNA:na käy-tettiin pRSV-beta-Gal-plasmidiDNA:ta (_). Tämän reportterigeenin ilmai sua tutkittiin sitten yksittäisissä soluissa FACS-analyysin avulla (Nolan et ai., 1986). Verrokkeina käytettiin TfpL-pB-SK-DNA:ta (. . .). Tällöin fluoroiva 15 beta-Gal-substraatti-FDG (-Eluoreseiini-dibeta-D-galaktopyranosidi) lisättiin käyttäen osmoottista shokkia, minkä jälkeen tutkittiin beta-Gal-entsyymiaktiivi-suuden vaikutuksesta FDG:stä vapautunutta fluoreseiinia sisältävien solujen jakaumaa. Fluoreseiinia sisältävien solujen tasaisesta jakautumisesta voidaan päätellä, että runsas osuus soluista ilmaisee beta-Gal-reportterigeenin. Tämän 20 kokeen tulos on esitetty kuviossa 15.

«

Taulukko A

105485 32

Polylysiinitransferriinin kuljetus varhaispunasoluihin 5 Rakkula-fiuorointi Elinkelpoisuus

Koe- Kasvu- Transferriini- -- (3HTdR-otto) , ....... 24 h 48 h ...

erä alustaa polyglysnniä 48 h 1 2 ml eilisäystä <1% <1% 140.000tuike/min.

2 2 ml 145 pl H20 < 1 % <1 % 126.000 tuike/min.

10 3 2 ml 145 μΙ TfpL Fri >90%++ >90%++ 137.000 tuike/min.

4 2 ml 145 μΙ TfpL Fr2 > 90 %+++ > 90 %+++ 161.000 tuike/min.

5 2 ml 145 μΙ TfpL Fr3 > 90 %+++ > 90 %+++ 153.000 tuike/min.

6 2 ml 145 μΙ TfpL Fr4 n. 80 %+++ > 90 %+++ 151.000 tuike/min.

7 2 ml 145 μΙ TfpL Fr5 n. 60 %+++ >90%+++ 153.000 tuike/min.

15 8 2 ml 145 μΙ TfpL Fr6 n. 40 %+++ >90%+++ 165.000 tuike/min.

++ ja +++ merkitsevät rakkulafluoroinnin suhteellista voimakkuutta i 33 105485

Taulukko B

Polylysiini-transferriini kykenee varhaispunasolujen in vitro-indusoidun kypsymisen stimuloinnissa funktionaalisesti korvaamaan normaalin transferriinin 5

Soluluku Hemoglogoliini Kypsymisaste Kasvu- (x106/ml) E 492 % retikulo-

No. alustaa Lisäysb 24 h 48 h 24 h 48 h syyttejä 72 h 1 2 ml Fe-Transferriini 3,28 4,38 1,38 2,74 >80% 10 2 2 ml - 2,62 2,56 0,35 0,23 <1% 3 2 ml H20 2,60 2,42 0,30 0,13 < 1 % 4 2 ml TfpLFrl_ 3,70 4,44 1,36 2,69 >80% 5 2 ml TfpL Fr2 3,56 4,24 1,16 2,51 n.b.8 6 2 ml TfpL Fr3 3,72 4,54 1,58 2,54 >80% 15 7 2 ml TfpL Fr4 3,48 4,56 1,57 2,55 n.b.

8 2 ml TfpL Fr5 3,36 4,26 1,41 2,47 n b· 9 2 ml TfpL Fr6 3,58 4,4 1,14 1,93 80%_ a: ei määritetty 20 b: Fe-transferriini, 200 pg/13 μΙ; TfpL-fraktiot, 200 pg/130pl, H20, 13 μΙ m ·

Taulukko C

105485 34

Kasvualusta-lisäys Differentaatioparametri 5 Trans- Transfer- Soluluku

Koe ferriini riinikonju- (x106/ml) Hb % haja- % % gaatti DNA (E492) soluja LR+E Ebl 1 - - - 2,56 0,259 56 <1 44 + - - 3,72 1,997 3 73 1

Tfpl90 - 3,67 1,105 5 54 8 10 - Tfpl270 - 3,30 1,366 11 60 4 2 - - pRSVLuc 1,24 0,28 + - pRSVLuc 5,22 2,459 -

Tfpl90 pRSVLuc 4,46 2,265 - 3 - - - 2,1 0,222 79 <1 21 15 + 2,55 1,369 6 72 o

Tfpl90 - 2,64 1,106 10 56 ?

Tf-Prot - 2,76 1,055 9 72 4 f

Taulukko D

105485 35 V-erbB-transformoitujen varhaispunasolujen kypsyminen (hemoglobiinipitoisuus), kun soluihin on siirretty v-erbB-ribotsyymi-DNA:ta 5

Hemoglobiinipi-

No. DNA Transferriini toisuus (% posi tiivisia soluja happaman bent-sidiinivärjäyksen jälkeen.

10 Laji Mp. Määrä Laji Määrä 14 h 62 h 1 erb-pala-13 2x105 1 pg Tf 10 pg <1 15±3a(3)b 2 erb-pala-13 TfpLFr5 10 pg <1 37±4 (2) 3 erb-pala-53 2x105 1 pg Tf 10 pg < 1 25±2 (2) 4 erb-pala-53 TfpL Fr5 10 pg <1 42±2 (2) 15 5 vektori vailla 2x10® 10 pg Tf 100 pg <1 23±2 (2) ribotsyymiä 6 vektori vailla 10 pg TfpL Fr5 100 pg <1 22±2 (2) ribotsyymiä 7 erb-pala-13+53 kts. ed 0,5+0,5pg Tf 10 pg <1 21±2 (2) 20 8 erb-pala-13+53 0,5+0,5pg TfpL Fr5 10 pg <1 38±2 (2) a: Määritystä kohden laskettiin > 200 solua, arvo +/-standardipoikkeama b: Riippumattomien määritysten lukumäärä 105485 36

Kirjallisuusluettelo:

Ascoli, M. ja Puett, D. (1974), Biochem.Biophvs. Acta 371. 203-210.

Beug. H., et ai.. (1982a), J. Cell Phvsiol. SuppI. 1. 195-207.

Beug. H., et ai.. (1982b), Cell 28. 907-919.

5 Beug. H., et ai,. (1984), Cell 36. 963-972.

Cormier et ai.. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 4583.

Deakin, H., et ai.. (1963), Biochem. J. 89. 296.

Felsenfeld et ai.. (19781. Nature 271 115-122.

Graf et ai.. (1978), Nature 275. 496-501.

10 Huebers et ai.. (1987), Phvsiol.Rev. 67, 520-582.

Jung et ai.. (1981), Biochem.Res.Commun. 101. 599.

Kahazaie, K., et ai,. (1988), EMBO J.. 10, 3061-3071.

Killisch, I., et.al.. (1990), painossa

Kowenz, E., et.al.. (1986), "Mod.Trends in Human Leukemia VII", 15 Springer Verlag, ss. 199-209.

Lemaitre et ai.. (1987), Proc.Natl.Acad.Sci. 84. 648.

Maniatis et ai.. "Molecular Cloning". Cold Spring Harbor 1982.

Morvan et al.. (1988) Nucleic Acids Res. 16. 833.

Nolan, G.P. et al.. (1986), Proc.Natl.Acad.Sci. 85,2603-2607.

20 Praseuth et al.. (1988), Proc.Natl.Acad.Sci. 85, 1349.

Orkin, et al,. (1975), Proc.Natl.Acad.Sci. 72, 98-102.

. . Radke, K„ et al.. (1982), Ceil 31, 643-653.

Schmidt et al., (1986), Cell 46, 41-51.

Smith et al,. (1986), Proc.Natl.Acad.Sci. 83, 2787.

25 Stein et al.. (1984), J.Biol.Chem 259. 14762-14772.

Stein et al.. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3209.

Stirchak et al.. (1987), J.Ora.Chem. 52, 4203.

Warrant R.W., et al., (1978), Nature 271. 130-135.

Wu, G.Y., et al.. (1988), J.Biol.Chem. 263. 14621-14624.

30 Zamecik et aL (1986), Proc.Natl.Acad.Sci. 83, 4143.

Zenke, M., etal., (1988), Cell 52,107-119.

De Wet, J.R., Wood, K.V. DeLuca, M., Helinski, D R. ja Subramani, S., (1987) Mol. Cell, Biol. 7, 725-737

Claims (12)

37 105485

1. Transferriini-polykationi-konjugaatit, tunnettu siitä, että ne kykenevät muodostamaan vesiliukoisia komplekseja nukleiinihappojen tai nukleiinihappo-ana-5 logien kanssa, jotka siirtyvät ihmis- tai eläinsoluihin reseptorivälitteisen endo-sytoosin in vitro avulla, jolloin moolisuhde transferriini:polykationi on 10:1 -1:4 ja polykationi on positiivisesti varattujen aminohappojen synteettinen, homologinen tai heterologinen polypeptidi, polyetyleeni-imiini tai protamiini.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset konjugaatit, tunnettu siitä, että polykationi on polylysiini.

= 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset konjugaatit, tunnettu siitä, että poly kationi sisältää 20 - 500 positiivista varausta. 15

4. Transferriini-polykationi/nukleiinihappo-kompleksit, tunnettu siitä, että ne | ; siirtyy ihmis- tai eläinsoluurTreseptorivälitteisen endosytoosin in vitro avulla, ja sisältää jonkun patenttivaatimuksen 1-3 mukaista konjugaattia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät nukleiinihappona nukleiinihapon, joka kykenee spesifisesti inhiboimaan geenin .. tai RNA-funktion ilmentämisen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät 25 nukleiinihapon, joka kykenee inhiboimaan viraalisen nukleiinihapon.

. 7. Patenttivaatimuksen 5 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät nukleiinihapon, joka kykenee inhiboimaan onkogeenejä tai muita avaingee-nejä, jotka säätelevät solujen kasvua ja/tai differentiaatiota.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät nukleiinihappona ribotsyymin, valinnaisesti yhdessä kantaja-RNA:n kanssa, tai sitä koodaavan geenin. 30 105485

9. Patenttivaatimuksen 8 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät nukleiinihappona geneettisen yksikön, joka koostuu tRNA-geenistä kantaja-geeninä ja tähän geeniin järjestäytyneestä ribotsyymigeenistä.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukaiset kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältävät nukleiinihappona antisense-oligonukleotidin, valinnaisesti yhdessä kantajanukleiinihapon kanssa, tai RNA-oligonukleotidin kyseessä ollen sitä koodaavan geenin.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kompleksit, tunnettu siitä, että ne sisältä vät proteiinia koodaavan nukleiinihapon.

12. Konjugaatin, jossa moolisuhde transferriinhpolykationi on 10:1 -1:4, ja polykationi on positiivisesti varattujen aminohappojen synteettinen, homologi-15 nen tai heterologinen polypeptidi, polyetyleeni-imini tai protamiini, käyttö nukleiinihapon(happojen) siirtämiseksi ihmis- tai eläinsoluun in vitro tai ex vivo. reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, jossa transferriini-polykationi-konju-gaatista ja nukleiinihaposta(hapoista) muodostetaan suositellusti fysiologisissa olosuhteissa liukoinen kompleksi ja saatetaan solut kosketukseen tämän 20 kompleksin kanssa. - i 105485