HU218716B - Nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló rendszerek, eljárás előállításukra és eljárás sejtekbe való bevitelükre - Google Patents

Nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló rendszerek, eljárás előállításukra és eljárás sejtekbe való bevitelükre Download PDF

Info

Publication number
HU218716B
HU218716B HU583/90A HU158390A HU218716B HU 218716 B HU218716 B HU 218716B HU 583/90 A HU583/90 A HU 583/90A HU 158390 A HU158390 A HU 158390A HU 218716 B HU218716 B HU 218716B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
transferrin
conjugate
complex
polycation
cells
Prior art date
Application number
HU583/90A
Other languages
English (en)
Other versions
HU901583D0 (en
HUT53921A (en
Inventor
Hartmut Beug
Max L. Birnstiel
Matthew Cotten
Ernst Wagner
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh. filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Publication of HU901583D0 publication Critical patent/HU901583D0/hu
Publication of HUT53921A publication Critical patent/HUT53921A/hu
Publication of HU218716B publication Critical patent/HU218716B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló újkonjugátumok képezik, amelyek transz- ferrinből és ehhez kovalensenkötött polikationból állnak, és polikationként egy protamint, egyszintetikus homológ polipeptidet vagy egy poli(etilén-imin)-ttartalmaznak. A találmány ezeket a konjugátumokat tartalmazótranszferrin-polikation-nukleinsav komplexekre, ezek előállítására éssejtekbe történő bevitelére is vonatkozik. A találmány tárgyát képeziktovábbá a fenti komplexeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és azelőállításukra szolgáló eljárás. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás nukleinsavak élő sejtekbe juttatására receptoron keresztüli endocitózis útján.
A „néma RNS- és DNS-szálak mind sejtmentes rendszerekben, mind az élő sejtekben meghatározott gének szelektív gátlószerei. Hatásmechanizmusuk lényege a saját szekvenciájukkal komplementer, „értelmes” nukleinsavszálak kötődés útján történő specifikus „felismerése” és ezzel a transzkripció, a transzláció vagy a DNS-megkettőződés folyamatainak lassítása vagy megakadályozása. Ez a hatásmechanizmus elvileg lehetővé teszi a „néma” (antiszenz) oligonukleotidok terápiás célú alkalmazását olyan esetekben, amikor egy meghatározott gén (például egy deregulált onkogén vagy egy virális gén) kifejeződését akarjuk in vivő meggátolni. Zamecnik és munkatársai (1986) beszámoltak arról, hogy rövid, „néma” oligonukleotidokat sejtekbe juttatva megfigyelték gátló hatásukat, habár a nukleinsavak erős negatív töltése miatt sejtmembránon keresztüli felvételük korlátozott, és ezért intracelluláris koncentrációjuk igen alacsony volt.
Gének szelektív gátlására egy másik lehetőséget az úgynevezett ribozimek nyújtanak. A ribozimek olyan RNS-molekulák, amelyek képesek meghatározott RNS-szekvenciák felismerésére, kötődni hozzájuk, és elhasítani azokat. A nehézséget ebben az esetben is az okozza, hogy a korlátozott membrántranszport miatt nem lehet kellően magas ribozimkoncentrációt elérni a sejtekben.
A probléma egyik megoldása a nukleinsavak közvetlen módosítása lehet: így például a töltést hordozó foszfát-diészter-csoportok helyettesíthetők nem ionizálható metil-foszfonát- [Smith és munkatársai (1986)], karbamát- [Stirchak és munkatársai (1987)] vagy tiofoszfát- [Stem és munkatársai (1988)] csoporttal. A közvetlen módosítás egy másik lehetőségét a nukleozidanalógok használata jelenti [Morván és munkatársai (1988), Praseuth és munkatársai (1988)].
Bár a fenti megoldások ígéretesek lehetnek, mégis van egy közös hátrányuk: a módosított nukleinsavaknak a célmolekulákhoz való affinitása csökken, és emiatt az elérni kívánt gátló hatás is gyengébb lesz. Figyelembe kell venni azt a lehetőséget is, hogy a módosított oligonukleotidok toxikusak lehetnek.
A másik megoldást az oligonukleotidok közvetett módosítása jelenti, amikor a sejtbe juttatni kívánt molekulát nem változtatjuk meg, de hozzákapcsolunk egy olyan (például egy transzportábilis) csoportot, ami a hiányzó tulajdonságot kölcsönzi az oligonukleotidnak. Ezt az elvet valósították meg Lemaitre és munkatársai (1987), amikor az oligonukleotidot polikationos vegyületekkel konjugálták. Emlősök sejtjeinek in vitro transzformálására számos technikát ismerünk. Az idegen DNS-t bejuttathatjuk például vírusok közvetítésével liposzómákba elektroporációval, mikroinjekcióval, sejtfúzióval vagy precipitációs úton (DEAE-dextránnal vagy kalcium-foszfáttal), de ezek a módszerek in vivő csak igen korlátozottan alkalmazhatók.
A fentiek miatt már folytak kutatások egy olyan megoldás kidolgozására, ahol a DNS-t oldott formában, célzottan, receptoron keresztüli endocitózis útján juttatják a sejtbe. A Wu és Wu (1987) által kidolgozott megoldás májsejteken valósítható meg, és lényegében két adottságon alapszik:
- a májsejtek felületén olyan receptorok vannak, amelyek meghatározott glikoproteideket kötnek meg, és transzportálnak a sejtbe;
- a DNS erős elektrosztatikus kölcsönhatásba léphet polikationokkal (például polilizinnel), és azokkal vízben oldódó komplexet képez.
Az eljárás lényege tehát az, hogy a receptorok számára felismerhető glikoproteidhez polilizint kapcsolnak, a bejuttatni kívánt DNS-t a glikoproteid-polilizin molekulával vízoldékony komplexbe viszik: a glikoproteidpolilizin-DNS komplex a receptoron keresztüli endocitózis útján bejut a sejtbe, ahol a DNS kifejeződhet.
Stavridis J. C. és munkatársai [Cell. Mól. Bioi. 28(1), 15-18 (1982)] transzferrin alkalmazását írják le nukleinsav vörösvérsejt-prekurzorokba való bejuttatására endocitózissal. A nukleinsavat hiszton polikationnal kötik a transzferrinhez.
A találmány kidolgozásához vezető munkánk célja a fent vázolt - egy specifikus receptor jelenlétéhez kötött, csak néhány sejttípuson megvalósítható - megoldással szemben egy széles körben alkalmazható, nagy hatékonyságú transzportrendszer létrehozása volt. A találmány tárgyát egy új fehérje-polikation konjugátum képezi, amely transzferrinből és ehhez kovalensen kötött polikationból áll, melyre jellemző, hogy a polikation egy protamin, egy szintetikus polipeptid vagy egy poli(etilén-imin).
A transzferrinek a fémkötő transzfer glikoproteidek egyik csoportját képezik, in vivő a vasra specifikusak. Az emlősökben számos különböző transzferrin található, ezek közül a plazmatranszferrin látja el a szervezet szöveteit vassal. A plazmatranszferrint (a továbbiakban : transzferrint) a máj termeli.
A transzferrin molekulatömege mintegy 80 000 D, amiből a szénhidrátrész tömege 6%. Egy transzferrinmolekula két vasatomot köthet meg; a kötődés karbonát- vagy hidrogén-karbonát-ionok jelenlétében megy végbe.
A különböző sejtek transzferrinreceptorai valószínűleg csak igen kis mértékben - talán a szénhidrátrészben - különböznek egymástól: a receptor egy körülbelül 180 000 D molekulatömegű transzmembránglikoproteid, amely egy esetleg két transzferrinmolekula megkötésére képes.
A transzferrinreceptor affinitása a fiziológiás pHértéken (7,4) a Fe2-transzferrinhez maximális jóval csekélyebb a félig telített Fe-transzferrinhez, és gyakorlatilag semmi a vasat nem hordozó apotranszferrinhez; ezzel szemben az utóbbi igen stabil komplexet képez a receptorral pH 5 érték körül.
Különösen sok transzferrinreceptor található éretlen vörösvérsejteken, a méhlepény és a máj sejtjein, de mérhető mennyiségben vannak jelen számos más szövet sejtjein is. Különösen érdekes az a megfigyelés, hogy a szaporodó sejteken a receptorok száma erősen szabályozott: a rosszindulatúan elfajult sejteken lényegesen több található, mint a jóindulatú, szabályozottan szapo2
HU 218 716 Β rodókon (ez összefügg a rosszindulatúan szaporodó sejtek ismerten magas vasigényével).
A vas-transzferrin komplex receptoron keresztüli felvételét és sejten belüli sorsát viszonylag jól ismerjük. A folyamat mechanizmusa ugyan nem teljesen tisztázott, de az biztos, hogy döntő mértékben intracellulárisan zajlik. Az első lépésben a Fe- vagy Fe2-transzferrin a sejtmembrán receptorához kötődik; ez a lépés energia- - azaz hőmérséklet- - függő. Ezt követően a komplex egy vezikulumba záródik (ezt endo- vagy receptoszómának nevezzük), amely most már a sejten belül egy Golgi-vezikulummal egyesül. Mivel az utóbbi vezikulum tartalma a környezethez képest erősen savas (pH < 5,5), a vasatomok felszabadulnak a transzferrinről, és a sejt anyagcseréjének rendelkezésére állnak, az apotranszferrin pedig visszatranszportálódik a sejt felszínére, ahol a pH 7,4 kémhatású környezetben elhagyja a receptort. Az egész ciklust, amely lényegében a transzferrin-vas és a transzferrinreceptor-kötődés pHfüggő voltán alapszik, végső soron a sejtek Golgi-apparátusa működteti. A molekuláris szintű részfolyamatok közül azonban még sokat nem ismerünk; lehetséges például, hogy egyes lépésekben foszforilálás is történik [Hubers és munkatársai (1987)].
A találmány tárgyát képező eljárással elsősorban azt kívánjuk elérni, hogy a fent bemutatott aktív transzportrendszer felhasználásával nukleinsavakat - amelyek felvétele a sejtek által egyébként nehézségbe ütközik - juttassunk a sejtekbe.
A találmány tárgyához tartozó új transzferrin-polikation konjugátumok képesek polikationaffinis vegyületekkel - különösen nukleinsavakkal vagy nukleinsavanalógokkal - komplexet képezni, és receptoron keresztüli endocitózissal a sejtbe jutni.
Kísérleteink során meglepetéssel tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti konjugátumok segítségével gátló hatásukat változatlanul megőrző nukleinsavakat nagy hatékonysággal juttathatunk élő sejtekbe.
A találmányban a „transzferrin” fogalom alatt a természetes transzferrineket és azokat a módosított transzferrinmolekulákat értjük, amelyek még képesek a receptorhoz kötődni és a sejtbe transzportálódni. Ilyen módosítások lehetnek például az egyes aminosavak cseréje vagy a molekulák receptorhoz nem kötődő részének megcsonkítása útján előállított transzferrinmolekulák.
A transzferrin :polikation mólarány előnyösen 10:1-1:4 közötti érték lehet; megadásánál figyelembe kell venni, hogy az aggregátum felépítésétől függ. Ez az arányszám még szélesebb határok között is változhat, amíg a következő feltételek teljesülnek: a nukleinsavak komplexbe vitele megtörténik és a komplex stabil, illetve a komplex kötődik a transzferrinreceptorhoz és transzportálódik a sejtbe. A fentiek miatt a tényleges mólarányt célszerű esetről esetre egyszerűen elvégezhető méréssel megállapítani.
A mólarányt adott esetben mindenekelőtt a polikationmolekula mérete, valamint pozitív töltésű csoportjainak száma és elhelyezkedése szabja meg, szoros összefüggésben a transzportálandó nukleinsav méretével, szerkezetével és esetleges módosításaival. Az adott konjugátumban szereplő polikationok lehetnek azonosak vagy különbözők. A találmány szerinti konjugátumokban polikationként a következő vegyületek jöhetnek számításba:
a) protaminok: kicsiny (mintegy 8000 D molekulatömegű), erősen bázikus fehérjék, amelyek pozitív töltésű aminosav maradékai (mindenekelőtt az argininek) általában úgy helyezkednek el, hogy a nukleinsavak negatív töltéseit közömbösíteni képesek [Warrant és munkatársai (1978)]. A találmány szempontjából szóba jöhető protaminok lehetnek természetes eredetűek vagy rekombinációs technikával előállítottak; az utóbbiak molekulamérete és aminosavszekvenciája módosított lehet. A mesterségesen előállított protaminok szintézise során lehetőség adódik a transzportfúnkció ellátásához nemkívánatos (például a DNS-sel kondenzátumot képező) aminosavak kicserélésére vagy a molekula végén egy olyan aminosav (például cisztein) elhelyezésére, amely a transzferrinnel való konjugálást segíti elő;
b) szintetikus polipeptidek: lehetnek homológ (polilizin, poliarginin) vagy heterológ polipeptidek; az utóbbiak kettő vagy több pozitív töltést hordozó aminosavból épülhetnek fel;
c) nem peptid polikationok: például poli(etilén-imin). A polikationok méretét előnyösen úgy választjuk meg, hogy a pozitív töltések száma a transzportálandó nukleinsav töltéseinek számától függően molekulánként 20 és 500 között legyen.
A találmány szerinti transzferrin-polikation konjugátumok kémiai úton vagy - ha a polikation egy polipeptid - rekombinációs technikával állíthatók elő. A kémiai úton történő kapcsolás a peptidkémia ismert módszereivel történhet; ha szükséges, a kapcsolást egy közvetítő (linker) molekula segítségével hajtjuk végre. Linkermolekulát akkor kell használni, ha a kapcsoláshoz szükséges funkciós csoportok (például merkaptovagy hidroxilcsoportok) nem állnak rendelkezésre a molekulákon. Linkerként olyan bifúnkciós vegyületeket használhatunk, amelyek a konjugátum alkotórészeivel külön-külön képesek reakcióba lépni.
A konjugátumok kívánt tulajdonságaira, elsősorban stabilitására tekintettel az alábbi kapcsolódásokat alakíthatjuk ki:
a) diszulfidhídon keresztül [például szukcinimido-piridil-ditiopropionáttal, Jung és munkatársai (1981) szerint], amely redukálóközegben felbontható;
b) biológiai környezetben igen stabil tioészterkötésen keresztül, ami az egyik komponenshez kapcsolt linker merkaptocsoportja és egy maleinimino-linker között alakítható ki:
c) biológiai környezetben instabil kötéseken keresztül, ami lehet például egy észterkötés vagy enyhén savas közegben instabil acetál- vagy ketálkötés.
A találmány szerinti konjugátumok rekombinációs technikával történő előállítása azt az előnyt kínálja, hogy pontosan meghatározható, egységes vegyületet nyerhetünk, szemben a kémiai kapcsolás során kapható konjugátumkeverékkel, amit utólag tisztítani kell. A szüksé3
HU 218 716 Β ges rekombinációs technika jól ismert: kiméra polipeptidek előállítása nem jelent nehézséget, és mind méretük, mind aminosavszekvenciájuk tetszés szerint variálható. A géntechnológia a transzferrinrész módosítását is lehetővé teszi: megfelelő mutációval elérhető, hogy a receptorhoz erősebben kötődő vagy a receptorhoz való kötődésben szerepet nem játszó résszel rövidebb transzferrin keletkezzen.
A találmány szerinti konjugátumok rekombinációs előállítását különösen célszerű egy olyan vektor segítségével végezni, amelyben a transzferrinrészt kódoló szekvencia mellett egy polilinkerszakasz is van, hogy a polikationos peptidet kódoló szekvencia is beültethető legyen. Ezen az alapon egy sor olyan expressziós plazmid készíthető el, amelyek a találmány szerinti konjugátumok előállításához szükséges génszekvenciákat hordozzák.
A sejtbe transzportálandó nukleinsavak lehetnek dezoxiribo- vagy ribonukleinsavak, amelyek szekvenciájával kapcsolatban semmiféle megkötés nincsen. A nukleinsavak módosítottak is lehetnek, de a módosítás nem érintheti azok polianionos jellegét: elfogadható például a foszfát-diészter-csoportok tiofoszfátcsoportokkal való helyettesítése vagy nukleozidanalógok használata.
A találmány szerinti eljárás szempontjából mindazok a nukleinsavak szóba jöhetnek, amelyek egy meghatározott gén gátlása céljából a sejtekbe juttathatók. Ilyenek lehetnek „néma” oligonukleotidok vagy ribozimek, adott esetben egy hordozó nukleinsavval együtt. A nukleinsavak mérete tág határok között változhat, mert a transzportrendszer nem szab korlátokat. Ennek ellenére nincs jelentősége a 10 nukleotidnál rövidebb „néma” oligonukleotidok transzportálásának, mert ezek specifícitása már elveszett. A találmány szerinti konjugátumok segítségével egyébként plazmidok is bejuttathatok a sejtbe: itt gyakorlati szempontból elsősorban a kisebb, körülbelül 5000 bázispár méretű, retrovírus eredetű plazmidok jöhetnek szóba mint hordozó nukleinsavak.
A találmány szerinti konjugátumokkal egyszerre több, különböző nukleinsav is transzportálható.
A találmány szerinti eljárás egy további előnye, hogy a gátló nukleinsavak célzottan egy meghatározott sejttípusba is transzportálhatók. Erre az ad lehetőséget, hogy mind a transzferrinek, mind a transzferrinreceptorok - az utóbbiak sejttípustól függő - polimorfizmust mutatnak.
A találmány szerinti eljárásból következik, hogy a transzferrin-polikation konjugátumok bejutnak az élő sejtekbe, és a konjugátumok, illetve komplexeik nem károsítják a sejteket. Ez lehetővé teszi ismételt adagolásukat, és így a bevitt gének egyenletesen magas kifejeződési szintjének biztosítását.
Kimutatták azt is, hogy a transzferrin-polikation konjugátumok a természetes vas-transzferrin komplexet képesek funkcionálisan helyettesíteni.
A transzferrin-polikation-DNS komplexnek a transzferrinreceptoron keresztüli felvételét egy sejtbe úgy bizonyíthatjuk, hogy a komplex DNS részeként a luciferáz enzim struktúrgénjét használjuk. Ezzel a módszerrel állapítottuk meg azt is, hogy a természetes transzferrin kiszorítja a sejtekből a transzferrin-polikation-DNS komplexet, mivel a sejtekben mérhető luciferázaktivitás a jelenlétében csökken.
A találmány kidolgozása érdekében végzett kísérletek során egy tRNS-ribozimgént (a V-erbB-szekvencia elleni ribozim génjét) juttattunk az erbB-szekvenciával transzformált csirkesejtekbe transzferrin-polilizin konjugátum segítségével, és azt tapasztaltuk, hogy az onkogén transzformáló hatása gyengült. Ez az eredmény azért különösen jelentős, mert a kísérletben csak egészen csekély mennyiségű ribozimgént használtunk.
A találmány tárgyát képezik a transzferrin-polikation-nukleinsav komplexek is, melyekben a nukleinsav-konjugátum arány széles határok között változhat: nem szükséges arra törekedni, hogy a nukleinsav öszszes töltését közömbösítsük. Az arányt esetről esetre, a transzportálandó nukleinsav méretének és szerkezetének, valamint a poiikation méretének, töltései számának és eloszlásának figyelembevételével kell megállapítani úgy, hogy a nukleinsav transzportálódjon, de ne veszítse el biológiai aktivitását. Ez az arány előzetesen durván beállítható például a DNS agarózgélben mérhető elektroforetikus vándorlási sebességének változása vagy sűrűséggradiensben végzett centrifugálás segítségével. Az előzetesen beállított arány megtartása különösen célszerű lehet azokban a kísérletekben, amikor a nukleinsavak transzportját a sejtekbe radioaktív jelöléssel kísérjük nyomon, és a konjugátum részarányát adott esetben addig csökkentjük, amíg a nukleinsav szabadon maradó negatív töltéseinek száma a transzport lezajlását nem befolyásolja hátrányosan.
A transzferrin-polikation-DNS komplexek előállítása - ami ugyancsak a találmány tárgyát képezi - a poliionos vegyületekből képezhető komplexek előállításának ismert módszereivel történhet. Az ellenőrizhetetlen aggregálódás vagy csapadékképződés megelőzésére célszerű mindkét komponenst előbb magas (körülbelül 1 mólos) koncentrációjú nátrium-klorid-oldatban elkeverni, majd a sókoncentrációt dialízissel vagy hígítással a fiziológiás értékre (0,255 M) beállítani. A komplexképzést előnyösen alacsony (100 pg/ml alatti) DNS-, illetve konjugátumtartalmú oldatokkal végezzük, hogy a keletkező komplex kicsapódását megakadályozzuk.
A találmány szerinti transzferrin-polikation-nukleinsav komplexek nukleinsavrésze előnyösen egy „néma” DNS, egy „néma” RNS vagy egy ribozim, illetve az azt kódoló gén lehet. Különösen előnyös a „néma” RNS-ek és a ribozimek használata, amikor ezeknek az RNSgátló RNS-eknek a kódoló génjeit - előnyösen egy hordozógénnel együtt - vihetjük be. A gén bevitelével egy sejtbe a gátló RNS beviteléhez képest igen számottevő biológiai hatásnövekedést érhetünk el. Különösen előnyös hordozógének azok, amelyek transzkripciója a polimeráz-ΠΙ révén történik meg; ilyenek például a tRNSgének. Ezek úgy illeszthetők például a ribozim-génekhez, hogy a ribozimrész transzkripciója egy egységes polimeráz-III-transzkriptumként valósul meg. A találmány szerinti transzportrendszer használatával ezeknek a genetikai egységeknek a hatása jelentősen felerősít4
HU 218 716 Β hető, mert lehetővé teszi a sejtekben egy magas kezdeti génkoncentráció elérését.
A találmány tárgyához tartozik továbbá egy eljárás nukleinsav(ak)nak emberi vagy állati sejtekbe történő in vitro vagy ex vivő bejuttatására, ami előnyösen egy fiziológiás körülmények között vízoldékony komplex előállításán keresztül valósítható meg.
A találmány tárgyához tartoznak azok a gyógyszerkészítmények is, amelyek hatóanyagként egy transzferrin-polikation konjugátummal komplexet alkotó, egy gén specifikus gátlására képes nukleinsavat tartalmaznak például liofilizátum formájában. Ezeket a gyógyszerkészítményeket úgy állítjuk elő, hogy a találmány szerinti komplexet a szokásos hordozó-, vivő- és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménynyé alakítjuk. Ezek a gyógyszerkészítmények - amelyek „néma” oligonukleotidokat, oligonukleotidanalógokat vagy ribozimeket, illetve az előbbieket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazhatnak adott esetben egy hordozó nukleinsavval együtt - emberi vagy állati kórokozó vírusok (például a HÍV=Humán Immunodeficiency Vírus és hasonló retrovírusok), onkogének vagy a sejtek szaporodásában és/vagy differenciálódásában kulcsszerepet játszó más gének (például a c-fos- vagy c-myc-gén) intracelluláris gátlására használhatók. A fenti gyógyszerkészítmények egy további alkalmazási területe lehet az endogén géntermékek okozta betegségek elleni küzdelem a nemkívánatos géntennék produkciójának gátlása útján; ilyen betegségek például az Alzheimer-kór (dementia praesenilis, koravén elbutulás), amelyben az úgynevezett plakkfehérje, vagy az autoimmun betegségek, amelyekben különböző immunfehérjék játszanak kóroki szerepet.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon mutatjuk be.
1. példa
Transzferrin-polilizin 90 konjugátum előállítása
A kapcsolást az irodalomból ismert módon [Jung és munkatársai (1981)], szukcinimido-piridil-ditiopropionáttal történt módosítás után kialakított diszulfídhíddal valósítjuk meg.
a) A transzferrin módosítása 3-(2-piridil-ditio)-propionáttal.
120 mg (1,5 pmol) transzferrin (Sigma gyártmány, tojásfehérjéből, conalbumin I típusú, vasmentes) 6 ml térfogatú, Sephadex G-25 gélen tisztított oldatához 3 ml 0,1 M nátrium-foszfát-puffert (pH 7,8) adunk, majd erélyesen összerázzuk a szukcinimido-3-(2-piridilditio)-propionát (SPDP, Pharmacia) 15 M etanolos oldatának 200 μΐ-ével (3 pmol SPDP). Az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten - időnként megrázva - állni hagyjuk, majd Sephadex G-25 oszlopon (14x180 mm) 0,1 M nátrium-foszfát-pufferrel (pH 7,8) eltávolítjuk belőle az alacsonyabb molekulatömegű termékeket és a reagens maradékát. A terméket tartalmazó frakció térfogata 7 ml; az ebből végzett meghatározás (a transzferrinhez kötött piridil-ditiopropionát-csoportból ditiotreitol hatására piridin-2-tion szabadul fel, ami fotometriásan mérhető) alapján a transzferrinhez kapcsolódott SPDP mennyisége 2,6 pmol.
A fentiekkel analóg módon végeztük el az emberi transzferrin (Sigma, vasmentes) módosítását is.
b) A polilizin 90 (pL 90) módosítása merkapto-propionáttal.
mg (körülbelül 1,0 pmol) poli-L-lizin-hidrobromidot [Sigma, fluoreszcein-izotiocianáttal (=FITC) jelölt, móltömeg körülbelül 18 000, átlagos polimerizációfok=90] 3 ml 0,1 mólos nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,8) feloldunk, és Sephadex G-25 gélen megtisztítjuk [a fluoreszceines jelölést nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben (pH 9), 3 órán keresztül végezzük]. A polilizinoldatot vízzel 7 ml-re hígítjuk, majd erélyesen összerázzuk az SPDP 15 mM etanolos oldatának 270 μΐ-ével. Az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten sötétben állni hagyjuk, majd 0,5 ml 1 M nátrium-acetátpuffert (pH 5,0) adunk hozzá, és Sephadex G-25 oszlopon 20 mmólos nátrium-acetát-pufferrel megtisztítjuk. A terméket tartalmazó frakciót (ninhidrinreakcióval és a fluoreszcencia alapján elhatárolva) vákuumban bekoncentráljuk, a pH-ját megfelelő pufferrel körülbelül 7-re állítjuk be, és hozzáadunk 200 pl vízben feloldott 23 mg (150 pmol) ditiotreitolt. Az elegyet szobahőmérsékleten, argongáz alatt sötétben 1 órán át állni hagyjuk, majd újra Sephadex G-25 oszlopra (14x130 mm, 10 mM nátrium-acetát-puffer, pH 5,0) visszük, és eltávolítjuk belőle a reagens feleslegét. A terméket tartalmazó 3,5 ml térfogatú frakcióban 3,8 pmol polilizinhez kapcsolt merkaptocsoport volt mérhető (Ellman-reagens, fotometria).
c) Transzferrin-polilizin konjugátum előállítása.
Az a) pont szerint módosított transzferrin oldatát [7 ml 0,1 M nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,8); körülbelül 1,5 pmol transzferrin körülbelül 2,6 pmol piridilditiopropionát-csoporttal] argongázzal átöblítjük, majd a b) pont szerint módosított polilizin ugyancsak argongázzal átöblített oldatával [2 ml 10 mM nátrium-acetátpufferben (pH 5,0), körülbelül 0,6 pmol polilizin körülbelül 2,2 pmol merkaptocsoporttal] összerázzuk, és szobahőmérsékleten, fénytől védve argongáz alatt állni hagyjuk 18 órán át. Ezután az elegyet vízzel 14 ml-re hígítjuk, és ioncserés kromatográfiával [Pharmacia Mono S oszlop HR 10/10, gradiens elúció; A-puffer: 50 mM HEPES (pH 7,9); B-puffer: A-puffer+3 M nátrium-klorid, 0,5 ml/perc] elválasztjuk a konjugátumot a visszamaradt alkotórészektől (1. ábra). Az el nem reagált transzferrin már kezdetben, a termék pedig 0,66-1,5 M nátrium-klorid-koncentrációnál eluálódik.
A konjugátumban a transzferrin:polilizin arány az összes frakció átlagában - 1,3:1 volt. A terméket hat frakcióban fogtuk fel, amelyek egyenként körülbelül 10 mg transzferrint tartalmaztak (ninhidrinreakció, a fehérje 280 nm-nél mért extinkciója és az FITC-vel jelölt polilizin 495 nm-nél mért fluoreszcenciája alapján).
A konjugátumot tartalmazó frakciókat ezután először 100 mmólos vas(lll)-citrát-oldattal (pH 7,8, nátrium-hidrogén-karbonáttal beállítva), majd még kétszer 1 mM HEPES-pufferrel (pH 7,5) szemben dializáljuk.
HU 218 716 Β
Gélelektroforézissel (8%-os poliakrilamid, 10% SDS), kimutattuk (2. ábra), hogy mind a hat konjugátumot tartalmazó frakcióban közel ugyanakkora menynyiségű transzferrin van jelen. A 2(A) ábrán a 2-merkapto-etanollal redukált minták elektroforetogramja látható, míg a redukálatlan mintákban [2(B) ábra] alig van szabad transzferrin, és csak az alig vándorló konjugátum látható.
2. példa
Transzferrin-polilizin 270 és transzferrin-polilizin
450 konjugátumok (pL 270 és pL 450) előállítása
a) A transzferrint az 1. példa a) pontjában leírtak szerint módosítottuk.
b) Módosított polilizin 270 és polilizin 450 előállítása.
1,2 ml 75 mM nátrium-acetát-pufferben oldott
0,33 pmol (19 mg hidrogén-bromid-sónak megfelelő) polilizin 270 (átlagosan 270 lizinmaradék, FITC-jelöléssel vagy anélkül) oldatának pH-ját nátrium-hidrogén-karbonát-pufferrel 8,5-re állítjuk be, és erős keverés közben 1,9 pmol SPDP-t (182 pl 15 mM etanolos oldat) adunk hozzá. Az elegyhez egy óra múlva 200 pl 1 M nátrium-acetát-oldatot (pH 5) adunk, majd 20 mM nátrium-acetát-oldatban gélszűréssel megtisztítjuk. A kapott oldat 0,27 pmol polilizin 270-et tartalmaz 1,3 pmol merkaptocsoporttal, ami átlagban 4,8 linker/polilizinmolekula aránynak felel meg.
Hasonló módon reagáltatunk 0,20 pmol polilizin 450-et (átlagos polimerizációfoka 450 lizinmaradék) 2,25 pmol SPDP-vei: a kapott oldat 0,19 pmol polilizin 450-et tartalmaz 2,1 pmol merkaptocsoporttal (11 linker/molekula). A szabad merkaptocsoportok létrehozását az 1. példa b) pontja szerint ditiotreitolos redukcióval végezzük.
c) A transzferrin-polilizin konjugátumok előállítása.
A transzferrin-polilizin 270 konjugátum előállításához 100 mólos foszfátpufferben (pH 7,8) oldott 1,0 pmol módosított transzferrinhez 20 mmólos nátrium-acetátpufferben oldott 0,14 pmol módosított polilizin 270-et adunk argongáz alatt. A reakcióelegyet 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd vízzel 10 ml-re hígítjuk, és kationcserélő kromatográfiával [Pharmacia Mono S oszlop HR 10/10, gradiens elúció; A-puffer: 50 mM, HEPES (pH 7,9); B-puffer: A-puffer+3 M nátrium-klorid] megtisztítjuk. A szabad transzferrin feleslege eluálódik először, a termék a B-pufferrel létrehozott gradiens 30-50%-a között jelenik meg. A három termékfrakcióban a transzferrin:polilizin mólarány a következő: 5,5:1, 3,4:1 és 1,8:1; az átlagos kitermelés 0,23 pmol transzferrin, 0,075 pmol polilizin 270 tartalommal.
Hasonló módon állítjuk elő a transzferrin-polilizin 450 konjugátumot: 1,2 pmol, az 1. példa a) pontja szerint módosított transzferrint [20 mmólos HEPES-pufferben (pH 7,9), ami 80 mM nátrium-kloridot is tartalmaz] 71 nmol merkaptocsoportokat hordozó módosított polilizinnel reagáltatunk a 2. példa b) pontja szerint. A reakcióelegyet Pharmacia Superose 12 géloszlopon 1 mólos guanidin-hidroklorid (pH 7,3) oldattal tisztítjuk, majd dialízis után [20 mM HEPES (pH 7,3), 100 mM nátrium-kloriddal kiegészítve] 0,40 pmol transzferrin-polilizin konjugátumot kapunk 38 nmol polilizin 450 tartalommal.
3. példa
a) Transzferrin-protamin konjugátum előállítása.
A módosított transzferrint az 1. példa a) pontja szerint állítjuk elő.
b) 3-Merkapto-propionsavval módosított protamin előállítása mg (3 pmol protamin-triíluor-acetát-sót - amit Sigma gyártmányú lazacprotaminból állítunk elő ioncserélő kromatográfiával - feloldunk 2,6 pl (15 pmol) etil-diizopropil-amint tartalmazó 2 ml dimetil-szulfoxid és 0,4 ml izopropanol keverékében. Az oldathoz egy óra alatt részletekben hozzáadunk 30 pmol SPDP-t 250 pl dimetil-szulfoxid és 250 pl izopropanol keverékében oldva. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten tartjuk 3,5 órán át, majd az oldószert nagyvákuumban ledesztilláljuk, és a maradékot 10% metanolt tartalmazó, 0,5%-os ecetsavoldatban feloldjuk. Gélszűrés (Sephadex G-10, 10% metanolt tartalmazó 0,5%-os ecetsavoldat) és liofilizálás után 16 mg (2,5 pmol) protaminacetát-sót kapunk, ami 2,5 pmol ditiopiridin-linker-csoportot tartalmaz.
A módosított protamin-acetátból 1,75 pmolt nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben (pH 7,5) feloldunk, és argongáz alatt egy órán át reagáltatunk 16 mg ditiotreitollal. A reakció végén az elegyet gélszűréssel [Sephadex G-10, 20 mmólos nátrium-acetát-puffer (pH 5,2)] megtisztítjuk: 1,6 pmol merkapto-propionát-csoportot hordozó, módosított protamint kapunk oldat alakjában.
c) Transzferrin-protamin konjugátum előállítása
A b) pont szerint előállított protaminoldatot (1,6 pmol linker) 1,34 pmol transzferrinnel (3,1 pmol ditiopiridin-linker) reagáltatjuk, majd a terméket kationcserélő kromatográfiával megtisztítjuk a transzferrinpolilizin konjugátum előállításánál leírt módon. A terméket négy egymást követő (A-D) frakció tartalmazza, amelyekben rendre 90, 320, 240 és 120 nmol módosított transzferrin van a megfelelő mennyiségű protaminnal. Ezt a 3. ábrán látható elektroforetogramok bizonyítják (8% poliakrilamid, 10% SDS, Coomassie-kék festés): a kezeletlen mintákban (a) csak a konjugátum látható, amiből a 2-merkapto-etanollal redukált mintákban (b) felszabadul a transzferrin.
A minták további kezelését - a dialízist és vassal való telítést - a 2. példában leírt módon végezzük.
4. példa
Transzferrin-polikation konjugátum-DNS komplexek előállítása
A komplexeket úgy állíthatjuk elő, hogy a DNS híg (30 pg/ml vagy kevesebb) oldatát összekeverjük a transzferrin-polikation konjugátum oldatával. A komplex kicsapódását megelőzendő, az összekeverést foszfátmentes pufferben végezzük (a foszfátionok csökkentik a komplex oldékonyságát). A DNS kötődését a polikationkonjugátumhoz a fiziológiásat megközelítő ionkörnyezetben a gélmobilitás változásának meghatározásával vizsgáljuk.
HU 218 716 Β
A 4. ábrán bemutatott kísérletben a DNS egy fágDNS-ből EcoRI és HindlII endonukleázokkal kivágott, a 3’-végén 32P izotóppal jelölt szekvencia volt. Minden minta 1 pl (35 ng) DNS-t tartalmazott 3 pl 100 mM HEPES-pufferben (pH 7,9, 1 M nátrium-kloriddal kiegészítve), amit rendre emelkedő mennyiségű (10 ngtól 1000 ng-ig) transzferrinkonjugátumot tartalmazó 11 pl vizes oldattal kevertünk össze; a nátrium-klorid végkoncentrációja 200 mM. Az elektroforézist 1%-os agarózgélben, TAE-pufferben, 50 V (45 mA) feszültséggel, 2,5 órán át végeztük, majd a kiszárított gélekről Kodak XAR filmen, -80 °C hőmérsékleten, 2 órás expozícióval autoradiogramokat készítettünk.
5. példa
A transzferrin-polilizin konjugátum transzportja élő sejtekbe
Annak megállapítására, hogy az 1. példa szerint előállított transzferrin-polilizin konjugátumokat élő vörösvérsejtek (eritroblasztok) képesek-e hatékonyan felvenni, az
1. példa szerint előállított, FITC-vei jelölt konjugátumot használjuk. Ismert [Schmidt és munkatársai (1986)], hogy az FITC-vei jelölt transzferrint néhány órás inkubáció alatt a vörösvérsejtek felveszik, amit a vezikulumok mikroszkóp alatt jól látható fluoreszcenciája igazol.
EGF-receptor-retrovírussal transzformált vörös vérsejteket [Khazaie és munkatársai (1988)] 18 órán át inkubálunk transzferrinmentes differenciáló tápfolyadékban [Zenke és munkatársai (1988)] 37 °C hőmérsékleten (1,5 χ 106 sejt/ml). A transzferrin-polilizin konjugátum (a kontroll esetében steril desztillált víz) hozzáadása után az inkubálást 10 ng/ml EGF jelenlétében - a transzformált állapot fenntartására - folytatjuk; mintaként 24 és 48 óra múlva 5xl05 sejtet veszünk.
A sejtmintát foszfátpufferrel kiegészített fiziológiás sóoldatban (PBS, pH 7,2) mossuk, majd 50-szeres térfogatú 3,7 tömeg% formaldehidet és 0,02 tömeg% glutáraldehidet tartalmazó PBS-ben, 40 °C hőmérsékleten 10 percen át fixáljuk. A fixált sejteket újabb mosás (PBS) után Elvanolba ágyazva vizsgáljuk fluoreszcens mikroszkóp (Zeiss Axiophot) alatt.
A sejtek szaporodási sebességét 100 pl-es, a fenti inkubációs elegyből vett mintákban vizsgáljuk a 3Htimidin beépülésének mérésével (8 pCi/ml, 2 óra).
Az 5. ábrán látható, hogy a transzferrin-polilizin konjugátummal inkubált vörösvérsejtek 24 óra múlva 2-10, erősen fluoreszkáló vezikulumot tartalmaznak, amilyenek nem láthatók a kontroliban. Az I. táblázatban látható, hogy - a 6. frakció kivételével - gyakorlatilag a sejtek mindegyike felvette a konjugátumot. Az 5(B) ábrán látható felvételen a megvilágító fény kék volt, emiatt az FITC-t tartalmazó vezikulumok láthatók, míg az (A) és (C) felvételeken zöld megvilágításban csak a sejtek aspecifikus fluoreszcenciája látható.
Az a tény, hogy a sejtek szaporodási sebessége a kezelés hatására nem változott (I. táblázat, a 3H-timidin beépülése), arra utal, hogy a polilizintartalmú konjugátumok nem károsítják a sejteket, és így aspecifikus felvételük (például a károsodott sejtmembránon keresztül) kizárható.
6. példa
Transzferrin-polilizin konjugátumok élettani hatásának vizsgálata
A példában bemutatott kísérletek célja annak megállapítása, hogy a transzferrin-polilizin konjugátumok képesek-e a természetes transzferrin helyettesítésére, és részt vesznek-e a sejt transzferrinciklusában. Kísérleti alanyként transzformált csirkevörösvérsejteket használunk, amelyekben az onkogén „kikapcsolható”, és így a további differenciálódás igen jól megfigyelhető [Beug és munkatársai (1982)]. Azt is tudjuk az irodalomból, hogy az ilyen sejtek igen sok, 100-200 pg/ml vas-transzferrin komplexet igényelnek a fejlődésükhöz; ha ennek egyharmada van csak jelen, a sejtek fejlődése már megáll, és pár napon belül el is pusztulnak [Kowenz és munkatársai (1986)]. Bizonyított az is, hogy a transzferrinreceptorok „újrafelhasználásának” sebessége, azaz a transzferrinciklus optimális sebességgel való működése elengedhetetlen a sejtek normális differenciálódásához [Schmidt és munkatársai (1986)].
Az EGF-receptor-retrovírussal transzformált csirkevörösvérsejtek az EGF megvonásával és részlegesen tisztított csirke-eritroproetin optimális mennyiségével transzferrin nélkül is újradifferenciálódásra bírhatok [Kowenz és munkatársai (1986)]. A transzferrinmentes differenciáló tápközegben, 42 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid jelenlétében végzett inkubáció 106 sejt/ml sejtkoncentrációt eredményezett (kontroll). A természetes vas-transzferrin komplexet (Sigma) vagy a vassal telített transzferrin-polilizin konjugátumot 100 pg/ml koncentrációban, az inkubáció kezdetén adjuk a tápközeghez.
A sejtek szaporodását és differenciálódását 24 és 48 óra elteltével vizsgáljuk a következő módszerekkel:
- a sejtszámot számlálóberendezéssel, Beug és munkatársai (1986) szerint (Coulter Counter ZM);
- a sejtek méret szerinti megoszlását Coulter Channelizer berendezéssel;
- a sejtek hemoglobintartalmát fotométerrel, Kowenz és munkatársai (1986) szerint.
A vizsgált sejtszuszpenziókból a 72. órában vett mintákat mikroszkóposán is megvizsgáltuk hemoglobintartalomra benzidines gyorsfestés után [Beug és munkatársai 1982)].
A II. táblázatban bemutatott eredményekből világosan látható, hogy az 1. példa szerinti transzferrinpolilizin konjugátum 1-5. frakciói éppoly hatékonyan serkentették a sejtek differenciálódását, mint a természetes vas-transzferrin. A vasmentes tápközegben nevelt sejtek szaporodása lelassult, és hemoglobintartalmuk is erősen csökkent. A sejttípusok vizsgálata kimutatta azt is, hogy a sejtek differenciáltsági foka azonos a transzferrin-polilizin konjugátummal, és a természetes transzferrinnel kezelt tenyészetekből vett mintákban magas arányban vannak jelen az érett vörösvértestek, míg a transzferrin nélkül nevelt sejtekből vett mintában éretlen és dezintegrált sejtek voltak láthatók. Csak a transzferrinpolilizin 6. frakcióval kezelt sejtek hemoglobintartalma volt kissé csökkent és - ennek megfelelően - magasabb az éretlen sejtek aránya. Ez arra utal, hogy azok a kon7
HU 218 716 Β jugátumok, amelyek az átlagosnál több polilizinrészt tartalmaznak, nem képesek tökéletesen részt venni a transzferrinciklusban. Az utóbbi eredmény egyébként a vizsgálati módszer érzékenységét is bizonyítja.
7. példa
Transzferrin-protamin konjugátumok élettani hatásának vizsgálata
A transzferrin-protamin konjugátumok hatásait csirkevörösvérsejtek differenciálódására a 6. példában leírt módon vizsgáltuk.
Ismert, hogy a csirkevörösvérsejtek differenciálódása a transzferrinciklus optimális működését (is) igényli, azaz transzferrin hiányában vagy az intracelluláris transzferrinciklus - a receptorok funkcionális regenerálása - gátlása esetén a sejtek elpusztulnak [Kowenz és munkatársai (1986); Schmidt és munkatársai (1986)]. Mivel a részlegesen tisztított csirkeeritroprotein (EPO) rendszerint tartalmaz transzferrint is, helyette az úgynevezett REV-faktort használjuk; ez egy részlegesen tisztított, vörösvérsejt eredetű növekedési faktor, ami serkenti a vörösvérsejtek differenciálódását [Kowenz és munkatársai (1986); Beug és munkatársai (1986)]. A célsejtek csirkevörösvérsejtek, amelyeket egy emberi hámszövet-növekedési faktor (EGF) receptorát és egy hőérzékeny v-myb onkogént hordozó retrovírussal transzformálva CFU-E tápközegben [Radke és munkatársai (1982)] szaporítunk 20 ng/ml EGF jelenlétében. Ezeket a sejteket az EGF jelenléte abnormális szaporodásra serkenti, ezért az EGF megvonása és egyidejűleg a REV-faktor hozzáadása visszaállítja a normális sejtciklust, a differenciálódást. A sejteket tehát kétszer mossuk transzferrinmentes tápközeggel, majd ilyen tápközegbe tesszük, és különböző mennyiségű, vassal telített transzferrint vagy transzferrin-polikation konjugátumot adunk hozzá, az utóbbit a plazmid-DNS-sel való komplexképzés előtt vagy után. A kísérletet 42 °C hőmérsékleten történő inkubáció során, naponta vett mintákból sejtfestéssel és a hemoglobintartalom mérésével értékeljük.
Az eredményeket a 6. ábrán és a III. táblázatban láthatjuk. A sejteket 106 sejt/ml koncentrációban, conalbuminmentes differenciáló tápközegben [Zenke és munkatársai (1988)], 1 pg/ml inzulin és 1:5000 arányban hígított REV-faktor jelenlétében [Kowenz és munkatársai (1986)] tenyésztettük adalék nélkül (6. ábra, háromszöggel jelölve), vassal telített conalbuminnal (kör) vagy vassal telített TfpL 270-konjugátummal (100 pg/ml, négyszög) kiegészítve. 24 és 48 óra elteltével a tenyészetekből 100 μΐ-es mintákat vettünk, és meghatároztuk a sejtek hemoglobintartalmát: a 6(A) ábrán alul látható vonalkázott terület a transzferrin nélkül tenyésztett sejtek átlagos hemoglobintartalmát jelzi (4 mérés átlaga).
A differenciálódás és a transzferrin-, illetve transzferrin-polilizin konjugátum-koncentráció összefüggését mutatja a 6(B) ábra. A mintákat a fent leírt tenyészetekből, a 2. napon vettük (conalbumin: kör; TfpL 90: üres négyszög; TfpL 270: tele négyszög).
A III. táblázatban az előzőekben leírt módon elvégzett kísérletek eredményeit mutatjuk be. Az 1. kísérletben a konjugátumok koncentrációja 60 pg/ml, a 2. és 3. kísérletekben 100 pg/ml, a 2. kísérletben a plazmidDNS koncentrációja 10 pg/ml volt. A mintákban a hemoglobintartalom mellett meghatároztuk a dezintegrálódott, az éretlen, az érés utolsó stádiumában lévő és az érett sejtek arányát is Beug és munkatársai (1982b) és Schmidt és munkatársai (1986) módszerével. Az eredmények azt mutatják, hogy mind a két különböző transzferrin-polilizin konjugátum (TfpL 90 és TfpL 270) éppúgy, mint a transzferrin-protamin konjugátum megfelelően helyettesítik a természetes transzferrint a vas-transzportban, bár aktivitásuk 1,5-2-ször alacsonyabb. A DNS-sel történő komplexképzés nem változtatta meg észrevehetően a konjugátumok biológiai aktivitását. Egy kontrollkísérletben azt is megállapítottuk, hogy ha a sejteknek polilizint vagy protamint adunk megfelelő vas(III)-citráttal együtt a transzferrinkonjugátumok helyett, úgy a sejtek nem differenciálódnak, és éppúgy elpusztulnak, mint a transzferrin nélkül inkubált sejtminták.
A 6. és 7. példákban bemutatott eredményeket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a transzferrinpolikation konjugátumok mindkét csoportja képes vasat transzportálni a sejtekbe, és hatékonyságuk alig marad el a természetes transzferriné mögött.
8. példa
DNS transzportja csirkevörösvérsejtekbe transzferrin-polilizín konjugátummal
Ebben a példában azt vizsgáljuk, hogy a transzferrin-polilizin konjugátum képes-e megfelelő hatékonysággal a sejtbe transzportálni egy, a tDNS-ribozimekéhez (7. ábra) hasonló méretű DNS-szekvenciát. A kísérletekben egy körülbelül 300 000 D molekulatömegű, a végein Maniatis szerint 32P izotóppal jelölt tDNSt használunk. A tDNS az alábbi szekvenciájú inszertumot tartalmazza:
CGTTAACAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC
CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC
Ebből a DNS-ből körülbelül 0,3 pg-ot oldunk TE-pufferben, majd ezt összekeverjük 50 pl-nyi 400 pg/ml 55 marha-szérumalbumint [BSA, Beug és munkatársai (1982)] is tartalmazó kétszer desztillált vízben oldott 10 pg természetes transzferrinnel vagy ugyanannyi transzferrin-polilizin konjugátummal (1. példa, 3. frakció). Kontrollként a DNS-t a transzferrint nem tartalma- 60 zó oldathoz keverjük. A keverékeket 2 ml transzferrinmentes differenciáló tápközeghez adjuk, amelyben 4xl06, EGF-receptor-retrovírussal transzformált és 18Hin transzferrinmentes tápközegben előtenyésztett [Khazaie és munkatársai (1988)] csirkevörösvérsejtet inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid jelenlétében. Nyolc óra múlva a sejteket centrifugáljuk, a fe8
HU 218 716 Β lülúszót elöntjük, az üledéket transzferrinmentes tápfolyadékkal háromszor mossuk. A sejteket PK/SDS-pufferben [20 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 300 mM nátrium-klorid, 1 mg/ml proteináz-K, 10 mg/ml SDS] felvesszük, 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, fenol/kloroform (1:1) eleggyel extraháljuk, és a DNS-t etanolos kicsapás után izoláljuk. A 3,5%-os, nem denaturáló akrilamidgélen végzett elektroforézis (TBE, Maniatis) és autoradiográfiás kimutatás után a minták összaktivitása 2000 cpm körüli érték volt. Megállapítható, hogy a transzferrin-polilizin-DNS komplexszel kezelt sejtek DNS-tartalma mintegy 5-10-szerese a natív transzferrin+DNS keverékkel kezelt sejtekének.
9. példa
A transzformált DNS kifejeződése csirkevörösvérsejtekben
A géntranszport és kifejeződés vizsgálatára egy olyan plazmidot használunk, amely markerként a szentjánosbogár (Photinus pyralis) luciferázgénjét tartalmazza [pRSVluc; DeWet és munkatársai (1987)]. A plazmidot Triton-X segítségével nyerjük ki a gazdasejtből (Maniatis), cézium-klorid sűrűséggradiensben (ethidium-bromid jelzőfestéssel) történő centrifugálással izoláljuk, butanollal színtelenítjük, és dializáljuk 1 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM Tris/HCl-pufferrel (pH 7,5) szemben. Komplexek előállításához 10 pg transzferrinpolilizin vagy -protamin konjugátumot keverünk lassan és óvatosan 250 pl, 0,3 M nátrium-klorid-oldatban oldott 3 pg pRSVluc plazmid-DNS-hez (ha megfelelően járunk el, úgy 500 pl sóoldatban oldott 30 pg DNS-hez 100 pg konjugátumot is hozzákeverhetünk anélkül, hogy a konjugátum-DNS komplex kicsapódna). Az elegyet 30 percig állni hagyjuk szobahőmérsékleten, majd közvetlenül hozzáadjuk a 10 ml térfogatú sejttenyészethez [0,5-1 xlO6 sejt/ml, ts-v-erbB transzformált csirkevörösvérsejtek, HD3 sejtvonal; Beug és munkatársai (1982a)], amelyeket ezután 16-48 órán át inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid jelenlétében.
Az inkubáció végén a sejteket centrifugálással (1500 g, 5 perc, 4 °C) kinyeijük, PBS-oldattal kétszer mossuk, és 100 pl 0,25 M Tris-HCl-pufferben (pH 7,5) felszuszpendáljuk. A sejteket háromszor megismételt fagyasztással és olvasztással feltáljuk, majd centrifugáljuk (18 500 g, 15 perc, 4 °C), és a felülúszóból vett mintákban méijük a luciferáz aktivitását DeWet és munkatársai (1987) szerint.
A kísérletből megállapítható volt, hogy a transzferrin-polikation-DNS komplexek nem gátolták a sejtek szaporodását. A 8. ábrán látható, hogy a maximális luciferázaktivitást a 3 pg DNS/10 pg TipL (négyszögek), illetve a 0,3-1 pg DNS/Tfprot (körök) komplexekkel kezelt sejtek mutatták.
Feltételezve, hogy a keletkezett konjugátum/DNS komplexek azonosak voltak, 25-75 konjugátummolekula jutott egy plazmid-DNS-molekulára. Ebből arra lehet következtetni, hogy a DNS teljes felületét konjugátummolekulák borítják, és ennél a konjugátum/DNS aránynál megvalósulhat a DNS negatív töltéseinek teljes közömbösítése a polikationmolekulák által. A feltevést megerősíti az a megfigyelés is, hogy a kevésbé erős pozitív töltéseket hordozó transzferrinprotamin konjugátumból háromszor annyi kell az optimális komplexképzéshez és géntranszferhez, mint a transzferrin-polilizin konjugátumokból, de megfelel a 4. példa eredményeinek is, amelyek a hatékony komplexek képzésének feltételeit írják le.
A fenti módon optimalizált TfpL:DNS arányok alkalmazása megfelel a találmány szerinti géntranszferrendszer érzékenységének. A 9. ábrán látható, hogy 1 ng körüli plazmid-DNS felvétele után már mérhető luciferázaktivitást mutatnak a sejtek, míg 2 pg DNS-nél nagyobb mennyiségek [6 pg TfpL-konjugátummal (körök) vagy 20 pg Tfprot-konjugátummal (négyzetek)] esetén az aktivitás nem növekszik tovább, minden bizonnyal a transzportrendszer telítődése miatt. Azt is megállapítottuk, hogy a komplexképzéshez nem szükséges különleges só- vagy ionkoncentráció: a különböző sókoncentrációk (0, 20, 50, 100 és 200 mM nátriumklorid) mellett elkészített TfpL-DNS komplexek egyformán hatékonyak voltak a géntranszferkísérletekben.
Megállapíthatjuk tehát, hogy a transzferrin-polikation-DNS komplexeket a sejtek a transzferrinreceptorokon keresztül veszik fel. Ezt bizonyítja, hogy a TfpLDNS komplexekkel elérhető luciferázaktivitás százszorosa a polilizin-DNS komplexekkel elérhetőnek [10(A) ábra]. Egy ellenőrző kísérlettel kimutattuk azt is, hogy a transzferrin-polilizin egyszerű keveréke nem segítette a plazmid-DNS felvételét a sejtbe. Egy további kísérletben állandó mennyiségű TfpL-DNS komplex mellé növekvő mennyiségű transzferrint adtunk, és megállapítottuk, hogy a szabad transzferrin kompetitív módon gátolja a komplex felvételét [10(B) ábra], amit a transzferrinkoncentrációval arányosan csökkenő luciferázaktivitás igazol.
10. példa
Ribozimgének transzportja csirkevörösvérsejtekbe transzferrin-polilizin konjugátummal Előkísérletekben, erbB onkogénnel transzformált csirkefibroblasztokon tisztáztuk, hogy az erbB-ribozimtDNS kifejeződik a csirkesejtekben.
E példában bemutatjuk azokat a kísérleteket, amelyek bizonyítják, hogy az erbB onkogénre specifikus ribozim-tDNS a transzferrin-polilizin konjugátumok segítségével bejuttatható csirkevörösvérsejtekbe, és ott csökkenteni képes az onkogén transzformáló hatását.
Két tRNS-ribozimgént terveztünk, amelyek az erbB transzláció iniciátorszakaszára irányulnak (7. és 11. ábrák). Mintegy 100-100 pg, a géneket tartalmazó plazmidból EcoRI endonukleázzal tesszük szabaddá a tRNS-ribozimgént, egy 325 bp méretű fragmentumot. A génhez Klenow-fragmentumot kapcsolunk, majd 2% agaróz/RBE gélen, elektroforézissel izoláljuk. A vektor- és a tRNS-ribozimgén fragmentumokat ethidiumbromidos festéssel lokalizáljuk, a megfelelő csíkokat kivágjuk a gélből, majd elektroelúcióval, fenol/kloroformos (1:1) és kloroformos extrakció val, végül etanolos kicsapással izoláljuk azokat. A tisztított és radioaktivi9
HU 218 716 Β tással jelölt DNS-fragmentumokat a transzferrin-polilizin konjugátummal komplexbe visszük, és így végezzük a transzporttal kapcsolatos kísérleteket. KontrollDNS-ként a pSPT 18 jelzésű vektort használjuk.
Kísérleti rendszerként olyan csirkevörösvérsejt-vonalat használunk [ts34, Gráf és munkatársai (1978)], amely a madár-eritroblasztózis vírus hőérzékeny mutánsával lett transzformálva [Beug és munkatársai (1982b)]. A sejtvonalban ugyancsak jelen lévő erbA onkogént egy specifikus proteinkináz-gátló szerrel (H7) gátoljuk. [Ismert, hogy a v-erbA onkogénen termelődő fehéije aktivitásához két aminosav maradékának - a 27. és 28. helyzetű szerinekenek - foszforilációja szükséges, amit in vivő és in vitro vagy a proteinkináz-C, vagy egy cAMP-függő proteinkináz hajt végre. A két szerin alaninra történő cseréje (mutáció útján) inaktiválja az onkogént. A H7 mindkét féle proteinkináz specifikus gátlószere, ezért jelenlétében a v-erbA és v-erbB onkogéneket hordozó sejtvonalakban a v-erbA megnyilvánulása (a differenciálódás gátlása) elmarad.]
Ismert az is, hogy azok a transzformált vörösvérsejtvonalak, amelyekben az erbB onkogén - például hőérzékeny mutáns esetében a hőmérséklet emelése miatt - gátolt, érett vörösvértestekké differenciálódnak. A differenciálódás egyik első jele a hemoglobin-szintézis indukálódása, amely kellően érzékeny módszerrel [például savas benzidinfestéssel, Orkin és munkatársai (1975) és Gráf és munkatársai (1978)] már az egyes sejtek szintjén is kimutatható. Az erbB ellen irányuló ribozim hatásának egyik fenotípusos megnyilvánulása ezért éppen a benzidinpozitív sejtek számának emelkedése lehet.
A példában bemutatott kísérletsorozatot a következő módon végezzük el.
A különböző DNS-készítményeket (lásd fent és a IV. táblázatban) 30 pl ΤΕ-pufferben oldjuk, és minden esetben 50 pl desztillált vízben oldott 10-10 μg természetes vastranszferrinkomplexszel vagy transzferrinpolilizin konjugátummal összekeverve, 30 percen át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Csak a vektor-DNS (10 pg) esetében használunk több (100 pg) transzferrinkészítményt.
A transzferrin-DNS keverékeket 1-1 ml, transzferrinmentes differenciáló tápközeghez adjuk [Zenke és munkatársai (1988)], majd ezekbe egyenként 3xl06 erbB-vel transzformált csirkevörösvérsejtet teszünk (a sejteket a kísérlet előtt 60 percig 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk ugyanolyan tápközegben, hogy fokozzuk a transzferrinfelvételt). Mintákat 6, 18 és 68 óra múlva veszünk, és a már leírt módon kinyert, mosott és feltárt sejtekből izoláljuk a DNS-t.
A 12. ábrán látható, hogy - a 8. példában bemutatott eredménnyel analóg módon - a transzferrinpolilizin-DNS-komplexszel kezelt sejtek DNS-tartalma 5-10-szer magasabb, mint a natív transzferrin-DNS eleggyel kezelt sejteké. Molekulatömeg-markerként a pBR322 plazmid Hpall-fragmentumait használtuk, amelyeket Maniatis szerint jelöltünk 32P-citozin-foszfátot tartalmazó Klenow-fragmentumokkal. A kontroll egy 2000 cpm összaktivitású ES13-fragmentum volt.
óra inkubáció után a sejteket lecentrifugáljuk, és transzferrint tartalmazó differenciáló tápközegbe teszszük át, amely eritropoetint és inzulint is tartalmaz [Kowenz és munkatársai (1986), Zenke és munkatársai (1986); kezelésenként 2 ml], és 37 °C hőmérsékleten egy aktív v-erbB-fehéije [Beug et al., (1982) és (1984)] jelenlétében, további 72 órán át inkubáljuk. A kísérlet eredményei a következők:
1. Ahogy a 8. példában láttuk, itt is a transzferrinpolilizin konjugátumot tartalmazó mintákban volt fokozott (mintegy ötszörös) a DNS felvétele.
2. A IV. táblázatból látható, hogy ha a sejtek felvették a transzferrin-polilizin-ribozim tDNS-komplexet, úgy szignifikánsan (mintegy kétszeresére) emelkedett a benzidinpozitív sejtek aránya a vektor-DNSsel vagy a transzferrin+ribozim eleggyel kezelt mintákhoz képest.
11. példa
A transzferrin-polilizin-DNS komplexek kötődésének és transzportjának vizsgálata csirkevörösvérsejteken
A TfpL-konjugátumok és a TfpL-DNS komplexek kötődését a sejtek felületi receptoraihoz tríciummal jelzett vegyületekkel Stein és munkatársai (1984) módszerével vizsgáljuk. A 3H-TfpL-konjugátumokat jelzett polilizinből állítjuk elő az 1. példában leírt módon; a polilizin 90-et formaldehiddel és 3H-[nátrium-(tetrahidrido-borát)]-tal kezeljük Ascoli és Puet (1974) szerint.
A kísérletek eredményét a 13. ábrán mutatjuk be. A jelzett TfpL90 (négyszögek) vagy a TfpL90-pB-SK -DNS komplex (háromszögek) egyaránt kötődtek a sejtek transzferrinreceptoraihoz; a kötődött konjugátum, illetve komplex mennyisége telítettséghez tart az alkalmazott mennyiségek függvényében. A görbéből számítható kötődési állandó 22 nM a TfpL és 43 nM a TfpLDNS komplex esetében; ez jó egyezést mutat a természetes transzferrin kötődési állandójával (15 nM).
[A pB-SK plazmidot a Promega Biotech. forgalmazza, a gazdasejtből a szokott módon állítottuk elő. A kötődési kísérleteket a HD3-sejtvonalon, 106 sejt/mles szuszpenzión, MEM + 1% BSA tápközegben (MEM=Eagle-féle minimáltápközeg), 3 órás inkubációval végeztük.]
A TfpL-DNS komplexek intracelluláris felvételének követése érdekében a HD3-sejteket először transzferrinmentes differenciáló tápközegben inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 18 órán át. Ezután a tenyészethez FITC-vei jelölt transzferrint vagy transzferrin-polilizin konjugátumot adunk (utóbbi esetben a polilizinrész a jelölt; a konjugátumot egyes kísérletekben DNS-komplex alakjában adjuk) és további 18 órán át inkubáljuk azokat. Ezután a sejteket lecentrifugáljuk, 3,7% formaldehid és 0,02% glutáraldehid-tartalmú oldatban fixáljuk PBS-oldattal mossuk, Mowiol 4.88 készítménnyel beágyazzuk és Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. Kontrollként FITC-vei jelölt kecske-antiegér-antitestet használunk (0,1 mg/ml). Az FITC - Tf, FITC - TfpL és FITC - TfpL-DNS kvantitatív meghatározásához a sejteket 6 órán át inkubáljuk a következő elegyekkel:
HU 218 716 Β
Tf=40 pg/ml; TípL270=50 pg/ml; TfpL270 - pBSK--DNS=50 vagy 16 pg/ml tartalmú tápközeg. Az inkubáció végén a sejteket háromszor mossuk hideg PBS/BSA oldattal, majd fluoreszcenciájukat egy Becton-Dickinson FASCAN berendezéssel megmérjük. 5
A 14. ábrán látható, hogy mind a TfpL, mind a TfpL-DNS komplex felvétele esetén a sejtek fluoreszcenciájának relatív erőssége mintegy tízszerese a kontroliénak, ami arra utal, hogy a konjugátumot és a komplexet a sejtek több mint 95%-a felvette. 10
12. példa
A transzferrin-polilizin konjugátummal a sejtekbe transzportált DNS kifejeződésének vizsgálata Miután az előzőekben bemutatott kísérletek tisztáz- 15 ták, hogy a TfpL segítségével végzett géntranszport a sejteket nem károsítja, meg kívántuk vizsgálni, hogy a TfpL-DNS komplexszel való huzamosabb érintkezés milyen hatással lehet a sejtekre. Ennek érdekében a HD3sejteket 14 napon át inkubáljuk olyan tápközegben, 20 amely TfpL-DNS komplexet tartalmaz, az egyik sorozatban naponta történő utánpótlással. DNS-ként a 9. példában leírt, luciferázgént hordozó plazmidot használjuk.
A különböző időpontokban vett mintákban a luciferázaktivitást a 9. példában leírt módon határozzuk meg. 25
Azokban a kísérletekben, ahol ismételten adtuk a komplexet, igen magas luciferázaktivitást (100 000-200 000 fényegység/107 sejt), azaz igen nagy fokú génkifejeződést figyelhettünk meg, ami a kísérlet időtartama alatt lényegében nem változott; ugyan- 30 akkor semmilyen citotoxikus hatást nem tapasztaltunk.
Ha csak egyszer, a kísérlet kezdetén adtuk a komplexet a sejtekhez, úgy a luciferázaktivitás a 2. és 4. nap között az egytizedére-egyhuszadára esett vissza. Az eredmények azt mutatják, hogy bár a találmány szerinti 35 konjugátumokkal a sejtekbe juttatott luciferázgén képes kifejeződni, tartósan magas szintű kifejeződéséhez ismételt adagolása szükséges.
13. példa 40
A plazmid-DNS kifejeződési arányának meghatározása
Annak meghatározására, hogy a transzferrin-polilizin konjugátumokkal a sejtekbe juttatott DNS a sejtek hány százalékában fejeződik ki ténylegesen, plazmid- 45 DNS-t transzportáltunk HD3-sejtekbe TfpL-konjugátummal. A jelölt DNS a pRSV-béta-Gal-plazmid volt, amely kifejeződése esetén a béta-galaktozidáz enzimet termeli. Az enzim aktivitása Nolan és munkatársai szerint intracellulárisan mérhető, ha a sejtbe ozmotikus sokk segítségével fluoreszcein-di-béta-D-galaktopiranozidot juttatunk, amiből az enzim hatására szabaddá válik a festékmolekula. Kontrolként a pB-SK--plazmidot használtuk.
A 15. ábrán bemutatott eredményből megállapítható, hogy a transzportált gén a kezelt sejtek többségében kifejeződik.
IRODALOM
Ascoli, M. és Puett, D. (1974), Biochem. Biophys. Acta
371, 203-210.
Beug, H. et al. (1982a), J. Cell Physiol. Suppl. 1,
195-207.
Beug, H. et al. (1982b), Cell 28, 907-919.
Beug, H. Et al. (1984), Cell 36, 963-972.
Cormier et al. (1988), Nucleic Acids Rés. 16, 4583. Deakin, H. et al. (1963), Biochem. J. 89, 296. Felsenfeld et al. (1978), Natúré 271, 115-122.
Gráfét al. (1978), Natúré 275, 496-501.
Huebers et al. (1987), Physiol. Rév. 67, 520-582.
Jung et al. (1981), Biochem. Rés. Commun. 101, 599. Khazaie, K. et al. (1988), EMBO J. 10, 3061 -3071. Killisch, I. et al. (1990), publikálás alatt.
Kowenz, E. et al. (1986), Mód. Trends in Humán
Leukémia VII. Springer Verlag, pp. 199-209. Lemaitre et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 648. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
1982.
Morván et al. (1988) Nucleic Acids Rés. 16, 833. Nolan, G. P. et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., 85,
2603-2607.
Praseuth et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 1349. Orkin, et al. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 98-102. Radke, K. et al. (1982), Cell 31, 643-653.
Schmith et al. (1986), Cell 46, 41-51.
Schmith et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 2787. Stein et al. (1984), J. Bioi. Chem. 259, 14 762-14 772. Stein et al. (1988), Nucleic Acids Rés. 16, 3209. Stirchak et al. (1987), J. Org. Chem. 52, 4203.
Warrant R. W. et al. (1978), Natúré 271, 130-135.
Wu, G. Y. et al. (1988), J. Bioi. Chem. 263,
621-14 624.
Zamechnik et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 4143. Zenke, M. et al. (1988), Cell 12, 107-119.
1. táblázat.
A transzferrin-polilizin konjugátum felvétele csirkevörösvérsejtekbe
Kísérlet Tápközeg Transzferrin-polilizin V czikulumfluoreszcencia Élctkcpcsscg (3H-timidin beépülés)
24 óra 48 óra 48 óra
1. 2 ml - <1% <1% 140 000 cpm
2. 2 ml 145 pl desztillált víz <1% <1% 126 000 cpm
3. 2 ml 145 pl TfpL, 1. frakció >90%++ >90%+ + 137 000 cpm
HU 218 716 Β
1. táblázat (folytatás)
Kísérlet Tápközeg Transzferrin-polilizin V ezikulumfluoreszcencia Életképesség (3H-timidin beépülés)
24 óra 48 óra 48 óra
4. 2 ml 145 pl TfpL, 2. frakció >90%+ + + >90%+ + + 161 000 cpm
5. 2 ml 145 μΐ TfpL, 3. frakció >90%+ + + >90%+ + + 153 000 cpm
6. 2 ml 145 μΐ TfpL, 4. frakció kb. 80%+ + + >90%+ + + 151 000 cpm
7. 2 ml 145 μΐ TfpL, 5. frakció kb. 60%+++ >90%+ + + 153 000 cpm
8. 2 ml 145 μΐ TfpL, 6. frakció kb. 40%+++ >90%+++ 165 000 cpm
’ és ’ * ' a vczikulum-fluoreszcencia relatív mértéket jelzi
II. táblázat
Vassal telített transzferrin-polilizin konjugátum hatása transzformált csirkevörösvérsejtek differenciálódására
Szám Tápközeg Adalék Sejtszám (xl06/ml) Hemoglobin E492 Differenciálódás (vörösvértest %)
24 óra 48 óra 24 óra 48 óra 72 óra
1. 2 ml Fe-transzferin1* 3,28 4,38 1,38 2,74 80%
2. 2 ml - 2,62 2,56 0,35 0,23 1%
3. 2 ml deszt. víz2> 2,60 2,42 0,30 0,13 1%
4. 2 ml TfpL3) 1. frakció 3,70 4,44 1,36 2,69 80%
5. 2 ml TfpL3> 2. frakció 3,56 4,24 1,16 2,51 nincs meghatározva
6. 2 ml TfpL3> 3. frakció 3,72 4,54 1,58 2,54 80%
7. 2 ml TfpL3) 4. frakció 3,48 4,56 1,57 2,55 nincs meghatározva
8. 2 ml TfpL3) 5. frakció 3,36 4,26 1,41 2,47 nincs meghatározva
9. 2 ml TfpL3) 6. frakció 3,58 4,4 1,14 1,93 60-65%
1) 200 pg 13 μΐ-ben 2) 130 pl 3) 200 pg 130 μΐ-ben
III. táblázat
Vassal telített transzferrin-polisation konjugátumok hatása transzformált csirkevörösvérsejtek differenciálódására
Kísérlet Transz- ferrin Konjugátum DNS Sejtszám (xl06/ml) Hemoglobin Ext492) Dezintegrált sejtek (%) Érett+utolsó stádium (%) Éretlen (%)
1. - - 2,56 0,259 56 1 44
+ - - 3,72 1,997 3 73 1
- TfpL90 - 3,67 1,105 5 54 8
- TfpL270 - 3,30 1,366 11 60 4
2. - - pRSVLuc 1,24 0,28 nincs meghatározva
+ - pRSVLuc 5,22 2,459 nincs meghatározva
- TfpL90 pRSVLuc 4,46 2,265 nincs meghatározva
3. - - - 2,1 0,222 79 1 21
+ - - 2,5 1,369 6 72 0
- TfpL90 - 2,64 1,016 10 56 7
- Tf-protamin - 2,76 1,055 9 72 4
HU 218 716 Β
IV. táblázat
Különböző ribozimkészítmények hatása a v-erbB onkogénnel transzformált csirkevörösvérsejtek differenciálódására
Kísérlet DNS Transzferrin Hemoglobompozitiv sejtek aránya (%)
fajta mt mennyiség fajta mennyiség 14. óra 62. óra
1. ES 13 2x105 1 pg Tf 10 pg 1 15+3* (3)**
2. ES 13 TfpL 5. frakció 10 pg 1 37+4 (2)
3. ES 53 2x105 1 pg Tf 10 pg 1 25+2 (2)
4. ES 53 TfpL 5. frakció 10 pg 1 42+1 (2)
5 vektor ribozim nélkül 2χ106 10 pg Tf 100 pg 1 23+3(2)
6 vektor ribozim nélkül 10 pg TfpL 5. frakció 100 pg 1 22+2 (2)
7 ES 13+ES 53 0,5+0,5 pg Tf io pg 1 21+2(2)
8 ES13+ES53 0,5+0,5 pg TfpL 5. frakció 10 pg 1 38+2(2)
* meghatározásonként több mint 200 sejt átlagai a kísérletek szórása ** párhuzamos meghatározások száma

Claims (24)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy konjugátum, amely transzferrinből és ehhez kovalensen kötött polikationból áll, azzal jellemezve, hogy a polikation egy protamin, egy szintetikus homo- 30 lóg polipeptid vagy egy poli(etilén-imin).
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polikation egy protamin.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polikation egy szintetikus homológ poli- 35 peptid.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polipeptid polilizin.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polikation poli(etilén-imin). 40
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polikation pozitív töltéseinek száma molekulánként 20-500.
  7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a transzferrinnek a poli- 45 kationhoz viszonyított mólaránya 10:1-1:4.
  8. 8. Egy transzferrin-polikation-nukleinsav komplex, azzal jellemezve, hogy egy 1-7. igénypont szerinti transzferrin-polikation konjugátumot tartalmaz.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti komplex, azzal jellemez- 50 ve, hogy egy gént vagy annak RNS-átiratát specifikusan gátolni képes nukleinsavat tartalmaz.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy vírus eredetű nukleinsavak gátlására képes nukleinsavat tartalmaz. 55
  11. 11. A 9. igénypont szerint komplex, azzal jellemezve, hogy onkogének gátlására képes nukleinsavat tartalmaz.
  12. 12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként egy ribozimet vagy ezt kódoló gént tartalmaz. 60
  13. 13. A 12. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy a ribozimet egy hordozó RNS-sel vagy a ribozimet kódoló gént egy hordozó RNS-sel együtt tartalmazza.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként egy hordozó tRNS-ből és ezen belül egy ribozimet kódoló génből álló genetikai egységet tartalmaz.
  15. 15. A 8. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként egy adott esetben módosított antiszenz-oligonukleotidot vagy RNS-oligonukleotid esetén az azt kódoló gént tartalmazza.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti komplex, azzal jellemezve, hogy az antiszenz-oligonukleotidot vagy az RNS-oligonukleotidot kódoló gént egy hordozó nukleinsavval együtt tartalmazza.
  17. 17. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy vagy több, a 8 -16. igénypontok bármelyike szerinti komplexet tartalmaz.
  18. 18. Eljárás egy transzferrin-polikation konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy transzferrint protaminnal, egy szintetikus homológ polipeptiddel vagy poli(etilén-imin)-nel kovalensen összekapcsolunk.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzferrin-protamin konjugátumot állítunk elő.
  20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzferrin-polilizin konjugátumot állítunk elő.
  21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzferrin-poli(etilén-imin) konjugátumot állítunk elő.
  22. 22. Eljárás egy transzferrin-polikation-nukleinsav komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy egy
    HU 218 716 Β
    18. igénypont szerinti eljárással előállított transzferrinpolikatlon konjugátumból és egy nukleinsavból vagy nukleinsavakból vízoldékony komplexet képzünk.
  23. 23. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 22. igénypont szerint előál- 5 lított transzferrin-polikation-nukleinsav komplexet a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó- és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
  24. 24. Eljárás nukleinsavak bevitelére emberi vagy állati sejtekbe receptor közvetítette endocitózissal, azzal jellemezve, hogy a sejteket egy 22. igénypont szerint előállított komplexszel, megfelelő körülmények között, in vitro vagy ex vivő érintkezésbe hozzuk.
    Transzferrin-polilizin konjugátum tisztítása ioncserélő kromatográfíával
HU583/90A 1989-03-16 1990-03-14 Nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló rendszerek, eljárás előállításukra és eljárás sejtekbe való bevitelükre HU218716B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT61089 1989-03-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU901583D0 HU901583D0 (en) 1990-06-28
HUT53921A HUT53921A (en) 1990-12-28
HU218716B true HU218716B (hu) 2000-11-28

Family

ID=3495147

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU583/90A HU218716B (hu) 1989-03-16 1990-03-14 Nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló rendszerek, eljárás előállításukra és eljárás sejtekbe való bevitelükre
HU95P/P00693P HU211944A9 (en) 1989-03-16 1995-06-30 New protein-polycation conjugates

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00693P HU211944A9 (en) 1989-03-16 1995-06-30 New protein-polycation conjugates

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5354844A (hu)
EP (1) EP0388758B1 (hu)
JP (1) JP3138461B2 (hu)
KR (1) KR0178022B1 (hu)
AT (1) ATE195144T1 (hu)
AU (1) AU637085B2 (hu)
CA (1) CA2012311C (hu)
DD (1) DD297842A5 (hu)
DE (1) DE59010910D1 (hu)
DK (1) DK0388758T3 (hu)
ES (1) ES2148136T3 (hu)
FI (1) FI105485B (hu)
GR (1) GR3034717T3 (hu)
HU (2) HU218716B (hu)
IL (1) IL93755A (hu)
NO (1) NO301932B1 (hu)
NZ (1) NZ232918A (hu)
PT (1) PT93441B (hu)
RU (2) RU2098487C1 (hu)
ZA (1) ZA901974B (hu)

Families Citing this family (389)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830923B1 (en) * 1989-03-16 2004-12-14 Boehringer Inglheim International Gmbh Genetics units for inhibiting the function of RNA
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
AU625013B2 (en) * 1989-11-03 1992-06-25 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5804604A (en) * 1989-12-21 1998-09-08 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
AU658818B2 (en) * 1989-12-21 1995-05-04 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Method of delivering molecules into eukaryotic cells using tat protein conjugate
US5747641A (en) * 1989-12-21 1998-05-05 Biogen Inc Tat-derived transport polypeptide conjugates
ATE131042T1 (de) * 1990-04-25 1995-12-15 Hoechst Ag Pharmakologische zubereitung, enthaltend polyelektrolytkomplexe in mikropartikulärer form und mindestens einen wirkstoff.
DE4110410C2 (de) * 1991-03-29 1999-05-27 Boehringer Ingelheim Int Neue Protein-Polykation-Konjugate
ES2078521T3 (es) * 1990-05-18 1995-12-16 Boehringer Ingelheim Int Nuevos conjugados de proteina-polication.
DE4104186A1 (de) * 1991-02-12 1992-08-13 Genentech Inc Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe
DE4110409C2 (de) * 1991-03-29 1999-05-27 Boehringer Ingelheim Int Neue Protein-Polykation-Konjugate
DE4115038A1 (de) * 1991-05-08 1992-11-12 Genentech Inc Neue konjugate, bestehend aus einem glykoprotein und einer nukleinsaeure-bindenden substanz
US6030954A (en) * 1991-09-05 2000-02-29 University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
IL103059A0 (en) * 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
RU2138553C1 (ru) * 1991-09-30 1999-09-27 Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
DE4139001A1 (de) * 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur einschleusung von nukleinsaeuren in zellen
EP0620851B1 (de) * 1991-12-23 1997-10-15 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Neuroblastom-assoziiertes regulator-gen
US5922859A (en) * 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
ATE260679T1 (de) * 1992-04-03 2004-03-15 Univ California Selbstorganisierendes system zur verabreichung von polynukleotiden enthaltend ein amphiphatisches peptid
US5656609A (en) * 1992-09-24 1997-08-12 University Of Connecticut Method of enhancing and/or prolonging expression of gene introduced into a cell using colchicine
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
EP0693939A1 (de) * 1993-04-14 1996-01-31 Roche Diagnostics GmbH Nukleinsäure-transferpeptide und deren verwendung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryontische zellen
US6106824A (en) * 1993-08-13 2000-08-22 The Rockefeller University Expression of growth associated protein B-50/GAP-43 in vitro and in vivo
RU2025487C1 (ru) * 1993-10-18 1994-12-30 Товарищество с ограниченной ответственностью "БиоПрогресс" Способ направленной генетической трансформации молочной железы животного и устройство для введения генетического материала в молочный проток молочной железы животного
US20030036056A1 (en) * 1994-01-24 2003-02-20 John J. Rossi Inhibitors and target molecule co-localization
FR2715847B1 (fr) * 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
AU1925195A (en) * 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6037329A (en) 1994-03-15 2000-03-14 Selective Genetics, Inc. Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment
ES2316148T3 (es) * 1994-03-23 2009-04-01 Ohio University Acidos nucleicos compactados y su suministro a celulas.
US5844107A (en) * 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US6077835A (en) * 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5972901A (en) * 1994-03-23 1999-10-26 Case Western Reserve University Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer
US5670347A (en) * 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
WO1995033062A2 (de) 1994-05-30 1995-12-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zum einbringen von fremdmaterial in höhere eukaryotische zellen
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
EP0769063A1 (en) * 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5728399A (en) * 1994-06-29 1998-03-17 University Of Conn. Use of a bacterial component to enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
US6124448A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockfeller University Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US6124439A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockefeller University OB polypeptide antibodies and method of making
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6962686B2 (en) 1994-10-12 2005-11-08 California Institute Of Technology Cell-specific gene delivery vehicles
US6232295B1 (en) 1994-10-12 2001-05-15 Jon Faiz Kayyem Cell-specific contrast agent and gene delivery vehicles
GB9422495D0 (en) * 1994-11-08 1995-01-04 Medical Res Council DNA transfer method
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
AU4690596A (en) * 1994-12-30 1996-07-24 Chiron Viagene, Inc. Nucleic acid condensing agents with reduced immunogenicity
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
AU5259796A (en) 1995-02-10 1996-08-27 Worcester Foundation For Biomedical Research, Inc. Delivery of exogenous compounds
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
EP0874910A4 (en) * 1995-06-07 1999-04-21 Life Technologies Inc ENHANCED CATIONIC LIPID TRANSFECTION BY PEPTIDES
US5646034A (en) * 1995-06-07 1997-07-08 Mamounas; Michael Increasing rAAV titer
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6127116A (en) * 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
US5744326A (en) * 1996-03-11 1998-04-28 The Immune Response Corporation Use of viral CIS-acting post-transcriptional regulatory sequences to increase expression of intronless genes containing near-consensus splice sites
JP2000506865A (ja) * 1996-03-14 2000-06-06 ジ イミューン リスポンス コーポレイション インターフェロンをコードする遺伝子の標的を定めた送達
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5679559A (en) * 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6387700B1 (en) 1996-11-04 2002-05-14 The Reagents Of The University Of Michigan Cationic peptides, Cys-Trp-(LYS)n, for gene delivery
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
FR2755976B1 (fr) 1996-11-15 1999-01-15 Idm Immuno Designed Molecules Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US6153596A (en) * 1996-12-18 2000-11-28 Emory University Polycationic oligomers
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
IL132323A0 (en) 1997-04-28 2001-03-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
CA2291074C (en) 1997-05-21 2008-04-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6919076B1 (en) 1998-01-20 2005-07-19 Pericor Science, Inc. Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules
US6958148B1 (en) * 1998-01-20 2005-10-25 Pericor Science, Inc. Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase
AU2868099A (en) 1998-02-13 1999-08-30 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
US7101575B2 (en) * 1998-03-19 2006-09-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly
EP1071472A4 (en) * 1998-04-23 2002-04-17 Univ Michigan Technology Man W PEPTIDES FOR EFFICIENT GENE TRANSFER
US6169078B1 (en) * 1998-05-12 2001-01-02 University Of Florida Materials and methods for the intracellular delivery of substances
US6171855B1 (en) 1998-05-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of Michigan Vectors
US6927278B1 (en) * 1998-09-01 2005-08-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptide scaffolds for transfer of molecules into eukaryotic cells
US6696089B2 (en) 1998-09-03 2004-02-24 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Nanogel networks including polyion polymer fragments and biological agent compositions thereof
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1129064B1 (en) 1998-11-12 2008-01-09 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US6773911B1 (en) 1998-11-23 2004-08-10 Amgen Canada Inc. Apoptosis-inducing factor
US6395029B1 (en) * 1999-01-19 2002-05-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Sustained delivery of polyionic bioactive agents
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
US7674951B1 (en) 1999-05-21 2010-03-09 Michigan Technological University Isolated cellulose synthase promoter regions
US7049481B1 (en) 1999-05-21 2006-05-23 Board Of Control Of Michigan Technological University Cellulose synthase encoding polynucleotides and uses thereof
DE19929104A1 (de) * 1999-06-24 2000-12-28 Aventis Pharma Gmbh Neue Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
DE19933506A1 (de) * 1999-07-16 2001-01-25 Deutsches Krebsforsch Zelluläre Aufnahme von DNA
EP1209971A4 (en) * 1999-08-20 2004-04-14 Mirus Corp POLYION COMPLEX LOAD INVERSION
US6730293B1 (en) 1999-08-24 2004-05-04 Cellgate, Inc. Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
EP1210121A2 (en) 1999-08-24 2002-06-05 Cellgate Inc. Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties
US20010009759A1 (en) * 1999-12-08 2001-07-26 Jsr Corporation Virus-binding particles, virus-separating reagent, separation of viruses, and detection of viruses
EP1242052A4 (en) * 1999-12-29 2003-07-02 A James Mixson HISTIDIN COPOLYMER AND METHODS OF USE THEREOF
US7070807B2 (en) * 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US20030134420A1 (en) * 2000-02-18 2003-07-17 Lollo Charles Peter Methods and compositions for gene delivery
ES2368419T3 (es) 2000-03-13 2011-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Bloqueo de la migración de leucocitos y de la inflamación por interferencia con cd99/hec2.
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
US7416726B2 (en) 2000-04-13 2008-08-26 The Rockefeller University Enhancement of antibody-mediated immune responses
AU2001257613A1 (en) * 2000-04-23 2001-11-12 Arizeke Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising carriers and transportable complexes
ATE536375T1 (de) 2000-05-10 2011-12-15 Mayo Foundation Menschliche igm antikörper, welche die fähigkeit besitzen, den wiederaufbau der myelinstruktur zu induzieren und deren diagnostische und therapeutische anwendung im zentralen nervensystem
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
US7355019B2 (en) 2000-06-06 2008-04-08 Sibtech, Inc. Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins
WO2002012294A2 (en) 2000-08-08 2002-02-14 St. Jude Children's Research Hospital Group b streptococcus polypeptides nucleic acids and therapeutic compositions and vaccines thereof
CA2422524A1 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 Motoyuki Yamashita Pei: dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
CA2424730A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Arizeke Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the transport of biologically active agents across cellular barriers
US20030166160A1 (en) * 2001-09-06 2003-09-04 Hawley Stephen B. Compounds and molecular complexes comprising multiple binding regions directed to transcytotic ligands
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
ATE501161T1 (de) 2000-12-28 2011-03-15 Wyeth Llc Rekombinantes schutzprotein aus streptococcus pneumoniae
MXPA03007492A (es) 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso.
EP1373470B1 (en) 2001-02-20 2013-04-24 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
DK1499349T3 (da) 2001-03-02 2010-04-06 Univ Rockefeller Rekombinante hybrid-allergenkonstrukter med reduceret allergenitet, der bibeholder det naterulige allergens immunogenitet
AU2002254400B2 (en) * 2001-03-23 2007-08-09 Napro Biotherapeutics, Inc. Molecular conjugates for use in treatment of cancer
US20030096748A1 (en) * 2001-06-04 2003-05-22 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the treatment of diseases associated with signal transduction aberrations
ES2372321T3 (es) 2001-06-20 2012-01-18 Genentech, Inc. Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de un tumor de pulmón.
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
NZ531674A (en) 2001-09-18 2009-03-31 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
ATE516364T1 (de) 2001-10-09 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense-modulation der expression des insulinähnlicher-wachstumsfaktor-bindungsprotei s 5
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
IL161733A0 (en) 2001-11-02 2005-11-20 Insert Therapeutics Inc Methods and compositions for therapeutic use of rna interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR20070087247A (ko) 2002-01-02 2007-08-27 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
CA2481507A1 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003086272A2 (en) * 2002-04-16 2003-10-23 Kamada Ltd. Ultrapure transferrin for pharmaceutical compositions
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7074893B2 (en) * 2002-06-03 2006-07-11 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the treatment of diseases associated with signal transduction aberrations
GB0215534D0 (en) * 2002-07-04 2002-08-14 Ecole Polytech Selective photochemotherapy using oligonucleotide targeting agents
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
WO2004024919A1 (en) 2002-09-13 2004-03-25 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US7229976B2 (en) 2002-09-26 2007-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
SI2336318T1 (sl) 2002-11-13 2013-07-31 Genzyme Corporation Protismiselna modulacija ekspresije apolipoproteina B
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7465708B2 (en) 2002-11-25 2008-12-16 Mixson A James Branched cationic copolymers and methods for antimicrobial use
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
AU2004231740A1 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
WO2005002507A2 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of survivin expression
WO2005007812A2 (en) 2003-07-03 2005-01-27 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Genes as diagnostic tools for autism
EP1648914A4 (en) 2003-07-31 2009-12-16 Regulus Therapeutics Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR MODULATING SMALL NON-CODING RNA
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
AU2004274942B2 (en) 2003-09-18 2008-02-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E expression
WO2005035548A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Meditech Research Limited The moduilation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
ES2411962T3 (es) 2003-10-24 2013-07-09 Gencia Corporation Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
JP4901478B2 (ja) 2003-11-17 2012-03-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 造血系起源の腫瘍の治療のための組成物と方法
JP2007520222A (ja) 2004-01-20 2007-07-26 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド グルココルチコイドレセプター発現の調節
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US8790919B2 (en) 2004-03-15 2014-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNase H
DE102004013637A1 (de) 2004-03-19 2005-10-13 Capsulution Nanoscience Ag Verfahren zur Herstellung von CS-Partikeln und Mikrokapseln unter Verwendung poröser Template sowie CS-Partikel und Mikrokapseln
CA2561221C (en) * 2004-03-26 2016-09-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
EP1745295B1 (en) 2004-04-20 2010-10-06 Galapagos N.V. Methods, compositions and compound assays for inhibiting amyloid-beta protein production
ES2427177T3 (es) 2004-04-27 2013-10-29 Galapagos N.V. Métodos, agentes y ensayos de detección de compuestos para inducir diferenciación de células de mamífero no diferenciadas para dar lugar a osteoblastos
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
CA2569511A1 (en) 2004-06-14 2005-12-22 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative & inflammatory diseases
TW200613554A (en) 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
EP2386856B1 (en) 2004-06-21 2013-07-24 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
JP5101288B2 (ja) 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
US8673268B2 (en) 2004-10-15 2014-03-18 Galapagos N.V. Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
CA2596506C (en) 2005-02-09 2021-04-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
EP1869076A2 (en) 2005-03-10 2007-12-26 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating vascular integrity
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
WO2007005898A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99l2
US8129585B2 (en) 2005-08-03 2012-03-06 Michigan Technological University Methods for enhancing expression of secondary cell wall cellulose synthases in plants
CA2630602A1 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eif4e-bp2 expression
PL2161038T3 (pl) 2006-01-26 2014-06-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozycje i ich zastosowanie ukierunkowane na huntingtynę
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
WO2007125173A2 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Baltic Technology Development, Ltd. Antisense agents combining strongly bound base - modified oligonucleotide and artificial nuclease
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
KR101137454B1 (ko) 2006-07-28 2012-04-20 사노피 종양 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
CA2671850A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
EP2118118B1 (en) * 2007-01-19 2017-09-27 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of lna oligonucleotides
EP2641971A1 (en) 2007-01-29 2013-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
CA2676790A1 (en) 2007-02-22 2008-08-28 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
KR101583592B1 (ko) * 2007-04-05 2016-01-12 심바이오텍 게젤샤프트 주어 포르슝 운트 엔트빅클룽 아우프 뎀 게비엣 데어 바이오테크놀로지 엠베하 비스-ｍｅｔ 히스톤
MX363066B (es) 2007-05-29 2019-03-07 Intrexon Corp Ligandos quirales de diacilhidrazina para modular la expresion de genes exogenos por medio de un complejo receptor de ecdisona.
EP2162747B1 (en) 2007-06-20 2014-04-30 Galapagos N.V. Molecular targets and methods to identify compounds for treating bone and joint degenerative diseases
WO2009011855A2 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
CA2698212A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Intrexon Corporation Methods and compositions for diagnosing disease
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008302504B2 (en) * 2007-09-17 2014-08-14 Agrofresh Inc. Compositions and methods for the modification of physiological responses in plants
CA2715078C (en) 2007-09-26 2019-07-23 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
AU2008307643B9 (en) 2007-09-28 2014-04-17 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
EP2205741A2 (en) 2007-10-02 2010-07-14 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-rna and precursors thereof
US7973019B1 (en) * 2007-10-03 2011-07-05 Alcon Research, Ltd. Transferrin/transferrin receptor-mediated siRNA delivery
HUE024479T2 (hu) 2007-10-08 2016-01-28 Intrexon Corp Genetikailag megváltoztatott dendritikus sejtek és felhasználások rák kezelésére
DE102008023913A1 (de) 2008-05-16 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
DE102007056488A1 (de) 2007-11-22 2009-07-23 Biontex Laboratories Gmbh Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
DE102008016275A1 (de) 2008-03-28 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
EP2212425A2 (de) 2007-11-22 2010-08-04 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
WO2009123764A2 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
US8093043B2 (en) 2008-06-04 2012-01-10 New York University β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
MX2011002143A (es) 2008-08-25 2011-07-20 Excaliard Pharmaceuticals Inc Oligonucleotidos antisentido dirigidos contra el factor de crecimiento del tejido conectivo y usos de los mismos.
WO2010029118A1 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Biofocus Dpi B.V. Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of cf-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
AR074273A1 (es) 2008-11-05 2011-01-05 Wyeth Corp Composicion inmunigenica de multiples componentes para la prevencion de la enfermedad estreptococica beta-hemolitica bhs. uso. metodo
KR101829469B1 (ko) 2008-12-04 2018-03-30 큐알엔에이, 인크. Ｅｐｏ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(ｅｐｏ) 관련된 질환의 치료
RU2551234C2 (ru) 2008-12-04 2015-05-20 КьюРНА,Инк.,US Лечение сиртуин 1 (sirt1)-связанных заболеваний путем ингибирования натурального антисмыслового транскрипта
KR101866152B1 (ko) 2008-12-04 2018-06-08 큐알엔에이, 인크. 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
EP2216341A1 (en) 2009-02-10 2010-08-11 Novozymes Biopharma UK Limited Transferrin variants and conjugates
WO2010093906A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Curna, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
CA2752237C (en) 2009-02-12 2020-03-24 Opko Curna, Llc Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
WO2010094732A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US20110306655A1 (en) 2009-02-19 2011-12-15 Richard Antonius Jozef Janssen Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
JP2012517822A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
WO2010102058A2 (en) 2009-03-04 2010-09-10 Curna, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
WO2010107740A2 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
EP2414830A2 (en) 2009-03-31 2012-02-08 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010115841A1 (en) 2009-04-01 2010-10-14 Galapagos Nv Methods and means for treatment of osteoarthritis
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
CN102724993B (zh) 2009-04-17 2016-04-27 纽约大学 靶向tnf家族受体并拮抗tnf作用的肽、组合物、方法及其用途
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
NO2424987T3 (hu) 2009-05-01 2018-04-14
KR101722541B1 (ko) 2009-05-06 2017-04-04 큐알엔에이, 인크. Ｔｔｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료
US9155754B2 (en) 2009-05-06 2015-10-13 Curna, Inc. Treatment of ABCA1 gene related diseases by inhibition of a natural antisense transcript to ABCA1
DK2432881T3 (en) 2009-05-18 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR
EP2432882B1 (en) 2009-05-22 2019-12-25 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
WO2010138806A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 Curna, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
US20120171170A1 (en) 2009-06-16 2012-07-05 Opko Curna, Llc Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
CN102612560B (zh) 2009-06-16 2017-10-17 库尔纳公司 通过抑制针对对氧磷酶1(pon1)的天然反义转录物来治疗pon1相关的疾病
JP6073133B2 (ja) 2009-06-24 2017-02-01 クルナ・インコーポレーテッド 腫瘍壊死因子受容体２（ｔｎｆｒ２）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｎｆｒ２関連疾患の治療
WO2010151674A2 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Curna, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
ES2585360T3 (es) 2009-08-05 2016-10-05 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen de la insulina (INS) por inhibición de la transcripción antisentido natural en un gen de la insulina (INS)
KR101892760B1 (ko) 2009-08-25 2018-08-28 큐알엔에이, 인크. ＩＱＧＡＰ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ＧＴＰａｓｅ 활성화 단백질을 함유하는 ＩＱ 모티프(ＩＱＧＡＰ)와 관련된 질환의 치료
EP2473522B1 (en) 2009-09-02 2016-08-17 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
BR112012009409A2 (pt) 2009-10-22 2017-02-21 Genentech Inc método de identificação de uma substância inibidora, molécula antagonista, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para fabricar a molécula, composição, artigo de fabricação, método de inibição de uma atividade biológica, método de tratamento de uma condição patológica, método para detectar msp em uma amostra e método para detectar hepsina em uma amostra
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
SG10201408598XA (en) 2009-11-30 2015-02-27 Genentech Inc Antibodies for treating and diagnosing tumors expressing slc34a2 (tat211 = seqid2 )
WO2011070177A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Baltic Technology Development, Ltd. Methods of facilitating neural cell survival using gdnf family ligand (gfl) mimetics or ret signaling pathway activators
RU2639550C2 (ru) 2009-12-16 2017-12-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1
WO2011079263A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
WO2011079261A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
WO2011090741A2 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Opko Curna, Llc TREATMENT OF TUMOR PROTEIN 63 (p63) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO p63
ES2657452T3 (es) 2009-12-29 2018-03-05 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor respiratorio nuclear 1 (NRF1) mediante inhibición de transcrito antisentido natural a NRF1
WO2011082409A2 (en) 2010-01-04 2011-07-07 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (irf8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irf8
KR101853509B1 (ko) 2010-01-06 2018-04-30 큐알엔에이, 인크. 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료
ES2664866T3 (es) 2010-01-11 2018-04-23 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la globulina fijadora de hormonas sexuales (shbg) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a shbg
US8883739B2 (en) 2010-01-19 2014-11-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
WO2011091390A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Opko Curna, Llc Treatment of rnase h1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to rnase h1
US8962586B2 (en) 2010-02-22 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1
MA34057B1 (fr) 2010-02-23 2013-03-05 Genentech Inc Compositions et methodes pour le diagnostic et le traitement d'une tumeur
MX362513B (es) 2010-03-23 2019-01-22 Intrexon Corp Vectores que expresan de manera condicional proteinas terapeuticas, celulas hospedadoras que comprenden vectores, y usos de los mismos.
US9080171B2 (en) 2010-03-24 2015-07-14 RXi Parmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
JP5978203B2 (ja) 2010-04-09 2016-08-24 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｆｇｆ２１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２１）線維芽細胞増殖因子ｆｇｆ２１）関連疾患の治療
MX343559B (es) 2010-04-29 2016-11-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacion de la expresion de transtiretina.
PE20130460A1 (es) 2010-05-03 2013-04-26 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores
RU2018110642A (ru) 2010-05-03 2019-02-27 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
ES2705236T3 (es) 2010-05-12 2019-03-22 Univ Columbia Procedimientos para producir células enteroendocrinas que producen y secretan insulina
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
CN103068982B (zh) 2010-07-14 2017-06-09 库尔纳公司 通过抑制盘状大同系物(dlg)的天然反义转录物而治疗dlg相关疾病
RU2580620C2 (ru) 2010-08-23 2016-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis rLP2086
PE20140173A1 (es) 2010-09-10 2014-02-20 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
EP2625274B1 (en) 2010-10-06 2017-07-19 CuRNA, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
JP6049623B2 (ja) 2010-10-22 2016-12-21 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド α‐Ｌ‐イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるＩＤＵＡ関連疾患の治療
JP6073795B2 (ja) 2010-10-27 2017-02-01 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド インターフェロン関連発生制御因子１（ｉｆｒｄ１）への天然アンチセンス転写物の阻害によるｉｆｒｄ１関連疾患の治療
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
JP6071893B2 (ja) 2010-11-23 2017-02-01 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｎａｎｏｇへの天然アンチセンス転写物の阻害によるｎａｎｏｇ関連疾患の治療
MX365647B (es) 2011-02-02 2019-06-10 Excaliard Pharmaceuticals Inc El uso de compuestos antisentido dirigidos al factor de crecimiento del tejido conectivo (ctgf) para tratar queloides o cicatrices hipertroficas.
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
JP6189754B2 (ja) 2011-03-04 2017-08-30 イントレキソン コーポレーション タンパク質を条件的に発現するベクター
KR101839177B1 (ko) 2011-04-13 2018-03-15 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Ｐｔｐｉｂ 발현의 안티센스 조절
ES2653247T3 (es) 2011-06-09 2018-02-06 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la frataxina (FXN) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen FXN
WO2012174476A2 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
FR2979919B1 (fr) 2011-09-12 2015-12-11 Centre Nat Rech Scient Genomes lentiviraux chimeriques non-integratifs comme vaccins innovants contre vih-1
CN103814132B (zh) 2011-09-20 2018-06-05 苏州瑞博生物技术有限公司 Gcgr表达的反义调节
PL2760463T3 (pl) 2011-09-20 2019-05-31 Univ North Carolina Chapel Hill Regulacja kanałów sodowych przez białka PLUNC
FR2980801B1 (fr) 2011-09-29 2016-02-05 Centre Nat Rech Scient Utilisation de "polyketide synthases" de type iii (pks iii) recombinantes d'algues brunes marines
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
IN2014CN03749A (hu) 2011-10-25 2015-09-25 Isis Pharmaceuticals Inc
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
MY198910A (en) 2012-03-09 2023-10-02 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
TR201815503T4 (tr) 2012-03-15 2018-11-21 Curna Inc Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (bknf) ile ilişkili hastalıkların doğal antisens transkriptinin bknf'ye inhibisyonu ile muamelesi.
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
JP6469012B2 (ja) 2012-10-22 2019-02-13 ファウンテン バイオファーマ インコーポレーテッドＦｏｕｎｔａｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ． インターロイキン−６に対する抗体およびその使用
CN104884618A (zh) 2012-11-15 2015-09-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合物
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
EP2972380A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrosis
US20160054304A1 (en) 2013-03-14 2016-02-25 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
EP2972381A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
WO2014152497A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
AU2014280847B2 (en) 2013-06-13 2019-07-04 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
CN105793422B (zh) 2013-09-05 2020-03-03 萨罗塔治疗公司(美国) 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
MX369534B (es) 2013-09-08 2019-11-11 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos.
WO2015042466A2 (en) 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
GB2526867A (en) 2014-06-05 2015-12-09 Oxitec Ltd Gene expression system
CA2985344A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
EP3611186A1 (en) 2015-02-06 2020-02-19 The University of North Carolina at Chapel Hill Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use
CN107249626A (zh) 2015-02-19 2017-10-13 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟球菌组合物及其方法
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3851531A1 (en) 2015-06-01 2021-07-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type vii collagen
WO2017058881A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
CN108699555A (zh) 2015-10-09 2018-10-23 萨勒普塔医疗公司 用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法
AU2016334401A1 (en) 2015-10-10 2018-04-26 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
CA3007424A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Children's Hospital Los Angeles "mobilizing leukemia cells"
CN106699889A (zh) 2015-11-18 2017-05-24 礼进生物医药科技（上海）有限公司 抗pd-1抗体及其治疗用途
SG10202008046UA (en) 2015-12-23 2020-09-29 Univ Queensland Technology Nucleic acid oligomers and uses therefor
CA3019952A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2017147128A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 The University Of North Carolina At Chapel Hill Peptide inhibitors of calcium channels
AU2017254106B2 (en) 2016-04-18 2024-07-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
US11827876B2 (en) 2016-08-12 2023-11-28 Oxitec Ltd. Self-limiting, sex-specific gene and methods of using
MX2019005235A (es) 2016-11-09 2019-12-05 Intrexon Corp Constructos de expresion de frataxina.
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US10994025B2 (en) 2017-05-12 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded RNA complexes and uses related thereto
WO2019055460A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 The Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TRANSPOSON-ASSOCIATED DISEASES
EP3697910A4 (en) 2017-10-18 2021-07-14 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERIC COMPOUNDS
KR101915949B1 (ko) 2018-01-09 2018-11-07 주식회사 쎌바이오텍 유전자 발현 카세트 및 그를 포함하는 발현벡터
AR117409A1 (es) 2018-03-29 2021-08-04 Oxitec Ltd Noctuidas autolimitantes
CA3096274A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
KR20210043623A (ko) 2018-08-10 2021-04-21 주식회사 유틸렉스 Hla-dr에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포
PE20210980A1 (es) 2018-08-14 2021-06-01 Oxitec Ltd Autoseleccion de artropodos machos esteriles
CA3122914A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/sirp.alpha. molecule
WO2020127377A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
BR112021012027A2 (pt) 2018-12-21 2021-11-03 Ose Immunotherapeutics Molécula bifuncional direcionada contra pd-1 humano
US11352430B2 (en) 2018-12-21 2022-06-07 Ose Immunotherapeutics Humanized anti-human-PD-1 antibody and its use in cancer treatment
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
SG11202109225WA (en) 2019-03-08 2021-09-29 Obsidian Therapeutics Inc Cd40l compositions and methods for tunable regulation
EP3835421A1 (en) 2019-12-11 2021-06-16 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Vectors for tissue specific transcriptomics
BR112022013355A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-20 Obsidian Therapeutics Inc Célula modificada, molécula de ácido nucleico, vetor, primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo, método de produção de uma célula modificada, métodos para tratar ou prevenir uma doença em um sujeito em necessidade, para introduzir uma célula modificada, para modificar geneticamente uma ou mais células, e, sistema para a expressão sintonizável
WO2021174742A1 (zh) 2020-03-06 2021-09-10 生物岛实验室 一种动物的制备方法
EP4240408A1 (en) 2020-11-05 2023-09-13 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of an il-7 protein and a nucleotide vaccine
EP4019539A1 (en) 2020-12-22 2022-06-29 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Recombinant bacterium and uses thereof
EP4326873A1 (en) 2021-04-22 2024-02-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522750A (en) * 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
IN165717B (hu) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
EP0273085A1 (en) * 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation

Also Published As

Publication number Publication date
NZ232918A (en) 1997-07-27
GR3034717T3 (en) 2001-01-31
IL93755A (en) 1995-12-31
CA2012311A1 (en) 1990-09-16
DD297842A5 (de) 1992-01-23
NO901214D0 (no) 1990-03-15
HU211944A9 (en) 1996-01-29
PT93441B (pt) 1997-01-31
US5354844A (en) 1994-10-11
EP0388758A1 (de) 1990-09-26
PT93441A (pt) 1990-11-07
CA2012311C (en) 2003-06-24
IL93755A0 (en) 1990-12-23
NO901214L (no) 1990-09-17
EP0388758B1 (de) 2000-08-02
FI105485B (fi) 2000-08-31
ES2148136T3 (es) 2000-10-16
RU2098487C1 (ru) 1997-12-10
KR0178022B1 (ko) 1999-03-20
AU637085B2 (en) 1993-05-20
DK0388758T3 (da) 2000-11-13
US5792645A (en) 1998-08-11
RU2113485C1 (ru) 1998-06-20
HU901583D0 (en) 1990-06-28
NO301932B1 (no) 1997-12-29
AU5137290A (en) 1990-09-20
JPH03200800A (ja) 1991-09-02
HUT53921A (en) 1990-12-28
ZA901974B (en) 1991-11-27
FI901297A0 (fi) 1990-03-15
JP3138461B2 (ja) 2001-02-26
ATE195144T1 (de) 2000-08-15
KR900013980A (ko) 1990-10-22
DE59010910D1 (de) 2000-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218716B (hu) Nukleinsavak sejtekbe való bevitelére szolgáló rendszerek, eljárás előállításukra és eljárás sejtekbe való bevitelükre
JP6698756B2 (ja) 細胞に分子を送達する方法及び担体複合体
US5595897A (en) Polylysine conjugates
Wagner et al. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells.
JP3814294B2 (ja) 親水性分子の脂質化のための方法および組成物
AU705035B2 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US6372720B1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
CA2221269A1 (en) Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment
US5830852A (en) Compositions for insulin-receptor mediated nucleic acid delivery
US20050181474A1 (en) Transport peptides and uses therefor
Bøe et al. Photochemically induced gene silencing using PNA-peptide conjugates
JPH10505835A (ja) 特定の細胞型への化学試薬の細胞内送達
JP3351524B2 (ja) 糖蛋白質および核酸結合物質を含む新しい結合体
AU749113B2 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
AU705060B2 (en) Improved pharmaceutical compositions
IE83273B1 (en) New protein-polycation-conjugates