PT93441B - Processo para a preparacao de novos conjuntos proteina-policatiao e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

A invenção refere-se ao transporte de substâncias afins de policatiSes, especialmente de ácidos nucleicos, para o interior das células, transporte esse que decorre por meio de endocitose mediada por receptores.

Verificou-se que os ARNs e os ADNs anti-sentido (antisense) são agentes activos para a inibição selectiva de determinadas sequências génicas em sistemas isentos de células bem como no interior das células vivas.

modo de acção baseia-se no reconhecimento específico de uma cadeia de ácido nucleico complementar e na acumulação deste, prejudicando deste modo a transcrição, a tradução e o

processo de cisão. Este mecanismo de acção possibilita basicamente a utilização de oligonucleótidos anti-sentido que bloqueiam in vivo a expressão de determinadas genes (como sejam oncogenes desregulados ou genes virais) para fins terapêuticos. Já tinha sido demonstrado que é possível importar para o interior das células oligonucleótidos anti-sentido curtos e que a actividade inibitória destes pode ser aí exercida (Zamecnik et al., 1986), mesmo que a respectiva concentração intracelular seja reduzida, entre outras razões por causa da absorção limitada através da membrana celular em virtude da forte carga negativa dos áci dos nucleicos.

Um outro modo de inibição seleotiva de genes baseia-se na utilização de ribozimas, que são moléculas de ARN que reconhecem determinadas sequências de ARN, se ligam a estas sequências e podem provocar a sua cisão. Também neste caso subsiste a necessidade de garantir uma concentração tão alta quanto possível de ribozimas activas nas células, sendo o transporte para o interior das células um factor limitante para esse fim.

A fim de contrariar a acção deste factor limitante foram já propostas várias soluções.

Uma destas soluções consiste em modificações directas dos ácidos nucleicos, por exemplo por substituição dos grupos fosfodiéster earregados por grupos metilfosfonato não carregados (Smith et al., 1986), por compostos de sililo (Cotmier et al., 1988) ou por fosfotionatos (Stern et al., 1988). Uma outra possibilidade de modi ficaçâo directa consiste na utilização de análogos de nucleósidos (Morvan et al., 1988, Praseuth et al., 1988).

Se bem que algumas destas propostas possam contribuir basicamente de modo prometedor para a solução do problema, também apresentam diferentes inconveni

entes, por exemplo uma ligação reduzida à molécula visada be como um grau mais reduzido da própria actividade inibidória. Um inconveniente importante na utilização in vivo de oligonucleótidos modificáveis é constituido pela possível toxicidade destes compostos.

Uma solução alternativa para a modificação directa dos oligonucleótidos é constituída por deixar o oligonuoleótido propriamente dito sem alteração e ligá-lo a um grupo que lhe confira as propriedades pretendidas, por exemplo com moléculas que facilitem o transporte para o interior das células. Uma destas propostas de solução no quadro destes princípios consiste em conjugar o oligonuoleótido com compostos policatiónicos (Lemaitre et al., 1987).

Para a transformação genética de células de mamífero in vitro são conhecidas diferentes técnicas cujas possibilidades de utilização in vivo no entanto é reduzida (podendo ser referidas as técnicas de introdução de ADN por meio de virus e os métodos de lipossomas, electroporaçâo, microinjecção, fusão celular, DEAE-dextrano ou fosfato de cálcio-precipitação).

Já foram empreendidas investigações a fim de desenvolver um sistema solúvel utilizável in vivo que transporte o ADN dirigido para o interior das células por meio de endocitose mediada por receptores (G. Y. Wu,

C,H. Wu, 1987). Este sistema foi desenvolvido para hepatócitos e baseia-se essencialmente nos seguintes factos:

1. Sobre a superfície dos hepatócitos existem receptores que se ligam a determinadas glicoproteínas e as transportam para o interior das células.

ADN pode ser ligado por meio de fortes campos eljctrostóticos recíprocos com formação de comple- 3 2.

xos de compostos policatiónicos, por exemplo polilisina.

sistema baseia-se no principio de acoplar a polilisina a uma glicoproteína tal que corresponde ao receptor e em seguida formar um complexo solúvel glicoproteína/polilisina/ADN que seja transportado para as células que apresentam receptores de gliooproteínas e após a absorção do complexo pelas células possibilite a expressão da sequência de ADN.

objectivo da presente invenção consiste em proporciona um sistema de transporte de alta actividade com um campo de utilização mais alargado ao contrário do sistema conheoido referido que, por causa do carácter especifico do receptor sobre um único tipo de células, só pode ser utilizado neste tipo.

Este objectivo é alcançado de acordo com o processo da presente invenção por meio da ligação do policatião à transferrina.

As transferrinas são uma classe de glicoproteinas modificadas que possuem a capacidade de se ligarem a metais com uma especificidade in vivo para o ferro. Foram identificadas diferentes transferrinas de mamíferos, sendo a traneferrina do plasma a responsável pelo fornecimento de ferro aos tecidos corporais principais. 0 órgão mais importante para a produção de transferrina é o fígado.

A transferrina apresenta um peso molecular de cerca de 80000, correspondendo cerca de 6 $ deste peso aos resíduos de açúcar. Uma molécula de transferrina pode ligar duas poléculas de ferre, podendo a ligação ter lugar na presença de ioes de carbonato ou de bicarbonato.

receptor de transferrina, de que existem possivelmentte formas com pequenas diferenças - como

por exemplo nos grupos de hidratos de carbono, é uma glicoproteína de transmembrana com um peso molecular de cerca de 180000, podendo uma molécula de receptor ligar-se a uma ou possivelmente a duas moléculas de transferrina.

receptor de transferrina possui a valores de pH fisiológicos de 7,4 uma afinidade muito elevada para o complexo Feg-transferrina, uma afinidade mais reduzida para o complexo Ee-transferrina e praticamente nenhuma afinidade para a aprotransferrina, embora esta forme a pH Z5 um complexo muito aceitável com o receptor.

Os receptores de transferrina foram detectados em número especialmente elevado em precursores de eritrócitos, na placenta e no fígado e ainda em número mensurável em muitos outros tecidos do corpo. E de especial interessa a observação de que o receptor em células em crescimento é altamente regulado. Também se observou que o número de receptores em tecidos neoplásticos in vivo se encontra consideravelmente aumentado em comparação com lesóes benignas, o que indica uma necessidade de ferro mais elevada. 0 mecanismo de absorção do complexo transferrina-ferro pelos receptores e o seu ciclo intracelular encontram-se bem esclarecidos.

Não existe ainda uma compreensão completa de como decorre exactamente a absorção da molécula de ferro por meio da transferrina, embora predomine a opinião de que a absorção é feita principalmente por via intracelular. Num processo dependente de energia e da temperatura os complexos Ee-transferrinas ou PEg-transferrina são ligados na membrana celular nos receptores. Em seguida o complexo é englobado numa vesícula, chamada endossoma ou receptossoma. Esta vesícula reune-se a outra vesícula que apresen ta um valor de pH < 5,5; a acidez resultante provoca a libertação do ferro da transferrinaç Θ complexo apotransferrina-receptor é em seguida transportado novamente em sen5

tido contrário através da membrana celular, onde o valor de pH neutro provoca a separação entre a apotransferrina e o receptor no meio circundante. Existem indicações de que a reciclagem, cujo funcionamento se baseia nas diferentes afinidades do receptor para a apotransferrina e para a ferro-transferrina, segundo o valor do pH é ácido ou neutro, é levado a efeito em vesículas do aparelho de Golgi.

Não se encontra ainda esclarecido ao nível molecular como se desencadeia o ciclo da transferrina; simplesmente no qua diz respeito a alguns aspectos existem indicações, por exemplo sobre o possível papel da fosforilação (Huebers et al., 1987).

Com o auxílio da presente invenção consegue-se peia primeira vez utilizar este sistema de transporte activo a fim de fornecer às células ácidos nucleicos que de outro modo encontrariam resistência que dificultaria a sua absorção pela célula.

Deste modo é um objectivo da presente invenção a preparação de novos conjugados proteina-policat ião que possuem a capacidade de formar complexos com substâncias que apresentam afinidade para com policatiões, especialmente ácidos nucleicos ou análogos de ácidos nucleicos, sendo estes complexos absorvidos pelas células por meio de endocitose mediada por receptores, de tal modo que a fracção proteica do conjugado é constituída por transferrina.

Surpreendentemente verificou-se que com a ajunda dos conjugados da presente invenção é possível efectuar de modo eficaz o transporte de ácidos nucleicos para o interior das células conservando a sua actividade inibitória.

Por transferrina entende-se no quadro da presentte invenção tanto as transferrinas naturais como as transferrinas modificadas que se ligam aos receptores e

são transportados para ? o interior das células (estas modificações podem por exemplo ser oonstituidas por uma alteração de ácidos aminados ou por um encurtamento da molécula na fracção determinante para a ligação ao receptor).

A proporção molar transferrina:policatião é de preferência de 10:1 a 1:4, sendo de tomar em consideração que se podem formar agregados. Esta proporção pode no entanto ser tomada em relação a limites mais amplos, desde que seja satisfeita a condição de que tem lugar a complexão do(s) ácido(s) nucleico(s) e se garanta que o complexo formado pelo receptor de transferrina se liga e é fornecido à célula, o que pode ser verificado por meio de experiências simples praticáveis conforme os casos.

A proporção escolhida em cada caso depen de principalmente da dimensão da molécula de policatião bem como do número e da distribuição dos agrupamentos carregados positivamente, dos critérios, da dimensão, da estrutura bem oomo das eventuais modificações existentes que forem introduzidas no(s) ácido(s) nucleico(s) a transportar. Os policatiões podem ser iguais ou diferentes.

Os policatiõts usados podem ser selecoio nados de entre os seguintes compostos:

a) Protaminas: Neste caso trata-se de proteinas de pequena dimensão (P.M. até cerca de 8000) e fortemente básicos cujos resíduos de ácidos aminados de carga positiva (principalmente arginina) se encontram habitualmente em grupos e neutralizam a carga negativa dos ácidos nucleicos em virtude do seu carácter policatiónioo (Warrant et al., 1978). As pro teínas util izáveis no quadro da presente invenção podem ser de origem natural ou ter sido preparadas por via recombinante, podendo neste caso ser preparadas várias cópias ou introduzidas modificações

no que respeita à dimensão da molécula e à sequência de ácidos aminados. Os compostos correspondentes podem também ser sintetizados por nia química. Na sintese de uma protamina não natural é possível por exempl© proceder de tal modo que se substituam os resíduos de ácidos aminados que nas funções da protamina natural são indesejáveis para a função de transporte (por exempl© condensação de ADN) por outros ácidos aminados apropriados e/ou é possível colocar numa extremidade um ácido aminado (por exemplo cisteína) que possibilite a conjugação dirigida com a transferrina.

b) Histonas: Estas são pequenas proteínas que se ligam a ADN existentes na cromatografia com uma alta fraoçâo de ácidos aminados carregados (lisina e arginina) que possuem a capacidade, independentemente da sequência de nucleótidos, de se ligarem a ADN e de provocar o respectivo enrolamento em nucleossomas. sendo especialmente apropriado as histonas H3 e H4 ricas em arginina (Pelsenfeld, 1978).

Com respeito à preparação e às modificações é válido basicamente o que foi dito sobre as protaminas.

c) Polipeptideos sintéticos, como polipeptideos homólogas (polilisina e poliarginina) ou polipeptideos heterólogos (formados por dois ou mais ácidos aminados substituídos com cargas positivas).

d) Catiões não peptídicos como polietileniminas.

cia escolhida de de cerca de 20 a ácidos nucleicos

A dimensão dos policatiões é de preferêrjital modo que a soma das cargas positivas é 500, sendo determinada de acordo com os a transportar.

Os conjugados transferrina-policatião de acordo com a presente invenção podem ser preparados por

via química ou, no caso do policatião ser um polipeptídeo, por via recombinante. 0 acoplamento por via química pode sei· levado a efeito de um modo conhecido apropriado para o acoplamento de peptídeo, sendo se necessário os componentes isolados feitos reagir com substâncias promotoras de ligação antes da reacção de acoplamento (esta medida é necessária se no início não e stiver disponível qualquer grupo funcional, por exemplo um grupo mercapto ou álcool. Ás substâncias promotoras de ligação podem ser compostos bifuncionais que são em primeiro lugar feitos reagir com grupos funcionais dos componentes isolados, sendo deste modo levado a efeito o acoplamento dos componentes modificados um a um.

De acordo com as propriedades dos conjugados, especialmente no que se refere à respectiva estabilidade, o acoplamento pode ser levado a efeito por meio de

a) Pontes de dissulfureto, as quais em condições redutoras podem ser novamente cindidas (por exemplo usando piridilditiopropionato de succinimidllo (Jung et al., 1981)).

b) Compostos suficieatemente estáveis sob condições biológicas (por exemplo tioéteres por reacção de ligantes de maleimido com grupos sulfidrilo do ligante ligado ao segundo componente).

c) Pontes lábeis sob condições biológicas, por exemplo ligações de éster, ou ligações de acetal ou de cetal instáveis sob condições fracamente ácidas.

A preparação dos conjugados da presen te invenção por via recombinante apresenta a vantagem de ser possível ebter compostos homogéneos bem definidos, enquanto que no acoplamento químico resultam misturas de

- 9 conjugados que tem de ser separados.

A preparação por via recombinante dos conjugados da presente invenção pode ser levada a efeito por meio de métodos conhecidos para a preparação de polipeptídeos qumíricos. Nesta preparação é possível variar os polipeptídeos policartiónicos no que se refere à respectiva dimensão e à sequência de ácidos aminados. A preparação por tecnologia genética apresenta também a vantagem de que é possível deste modo por exemplo modificar a fracção de transferrina do conjugado, sendo possível deste modo por exemplo por meio de mutações apropriadas aumentar a facilidade de ligação ao receptor ou encurtar a molécula na fracção de transferrina no sector responsável pela ligação ao receptor. É especialmente conveniente para a preparação por via recombinante dos conjugados da presente invenção a uti lização de um vector que contenha a sequência que codifica para a fracção de transferrina bem como um poliadaptador, em que se enoorpora a sequência que codifica para a polipeptídeo policatiónico necessário em cada caso. Deste modo é possível obter um conjunto de plasmídeos de expressão a partir dos quais em caso de necessidade se provoca a expres são dos conjugados da presente invenção que contém a sequên cia pretendida.

No que se refere aos ácidos nucleicos a transportar para o interior das células pode tratar-se de ADN ou de ARNs, não existindo qualquer limitação com respeito à sequência nucleotidica. Os ácidos nucleicos pode ser modificados desde que a modificação não prejudique o carácter polianiénico dos ácidos nucleicos; entre essas modificações contam-se por exemplo a substituição dos grupos diésteres fosfóricos por fosfotioato ou a utilização de aná logos de nucleósidos.

Os ácidos nucleicos a considerar no quadro da presente invenção são principalmente os que podem

ser transportados para o interior da célula com o fim de inibir sequências especificas de genes. Neste número contam-se oligonucleótidos anti-sentido e ribozimas, eventualmente em conjunto com um ácido nucleico de transpor

Com respeito à dimensão dos ácidos nucleicos, a presente invenção possibilita igualmente a utilização de uma ampla gama. No que se refere ao limite inferior não existe qualquer limitação dependendo do sistema de transporte da presente invenção; uma eventual limitação inferior resulta de razões específicas do modo de utilização, porque por exemplo os oligonucleótidos anti-sentido abaixo de 10 nucleótidos raramente podem ser consi derados para utilização por causa da sua reduzida especificidade. Com o auxílio dos conjugados da presente invenção é possível também fornecer plasmídeos às células, sendo especialmente importantes os plasmídeos de pequena dimensão que podem ser utilizados na sua função de transpor tadores de ácidos nucleicos (possivelmente vectores retrovirais até um máximo de 5000 pb). E também possível fornecer às células simultaneamente diferentes ácidos nucleicos com o auxílio dos conjugados da presente invenção.

Uma outra vantagem da presente invenção reside na circunstância de que existem polimorfismos entre a transferrina e o repeptor que podem ser aproveitados para o transporte dirigido a um objectivo de ácidos nucleicos inibidores para determinadas células.

No quadro da presente invenção foi possível demonstrar que os conjugados tranaferrina-policatião são absorvidos e são internalizados de forma eficaz pelas células vivas. Os conjugados e os complexos da presente in enção não são prejudiciais para o crescimento celular. Este facto possibilita uma administração repetida e em consequência uma expressão constante elevada do gene introduzido na célula.

Para além disso foi possível demonstrar que os conjugados policatião-transferrina podem substituir o complexo transferrina-ferro nativo de modo funcional. Confirmou-se com o auxílio do gene de luciferase como componente de ADN que os complexos transferrina-polioatiâo/ /ADN são absorvidos pelas células através do receptor de transferrina. Lemonstrau-se que a transferrina nativa desloca eficazmente o oomplexo transferrina-policatião/ADN, o que foi medido por meio da redução de actividade de luciferase na célula.

Por meio das investigações levadas a efeito no quadro da presente invenção foi também possível demonstrar que é possível introduzir em células de galinha transfermádas por erbB um gene de ARNt-ribozima (a ribozima foi dirigida contra uma sequência V-erbB) com o auxílio de um conjugado da presente invenção (polilisina-transferrina) e enfraquecer a actividade de transformação do oncogene. Este resultado é significativo uma vez que nestas investiga çles apenas se usou uma quantidade reduzida de gene de ribozima.

A proporção ácido nucleico : conjugado pode variar num domínio amplo, não devendo ser necessário neutralizar sem limite a carga total dos ácidos nucleicos. Esta proporção deve ser ajustada em cada caso de acordo com critérios de dimensão e e strutura dos ácidos nucleicos a transportar, dimensão do policatião, número e distribuição das suas cargas de modo a que exista uma proporção entre a transportabilidade e a actividade biológica dos áci dos nucleicos favorável para cada utilização. Esta proporção pode ser em primeiro lugar ajustada apenas aproximadamente, como seja por meio de retardamento da velocidade de migração do ADN num gel (por exemplo por meio do desvio de mobilidade (mobility shift) num gel de agarose) ou por meio de centrifugação de gradiente de densidade. Após obten ção desta proporção preliminar que pode vantajoso ser, com

respeito à actividade máxima utilizável nas células, levar a efeito ensaios de transporte de ácidos nucleicos com o complexo marcado com radioisótopos, e eventualmente reduzir a fracção do conjugado de tal podo que as cargas negativas restantes não sejam impeditivas do transporte dos ácidos nucleicos para o interior das células.

A preparação dos complexos transferrina-policatiâo/ácido nucleice, que é igualmente um objectivo da presente invenção, pode ser efectuada mediante a utilização de métodos conhecidos para a complexâo de compostos poiiiénicos. Uma possibilidade de evitar a agregação ou a precipitação descontrolada consiste em misturar em primeiro lugar os dois componentes numa concentração elevada de cloreto de sódio (cerca de 1 molar) e em seguida ajustar a concentração de sal até um nível fisiologico por meio de diálise ou de diluição. Na reacção de formação de complexos são usadas de preferência elevadas concentrações de ADN e de conjugado (superiores a 100 /ig/ml) a fim de evitar uma precipitação dos complexos.

A fracção de ácido nucleico do complexo transferrina-policatião-ácido nucleico da presente invenção é de preferência um ADN anti-sentido, um ARN anti-sentido ou uma ribozima ou o gene que codifica para uma ribozima. Na utilização de ribozimas e de ÁRNs antisentido é especialmente vantajoso utilizar os genes que codificam para os ARNs que inibem esta função do ARN, de preferência em conjunto com um gene de transporte. Por meio da introdução do gene nas células garante-se uma amplificação em alto grau do ARN, em comparação com a importação simples do ARN na célula, e deste modo um abastecimento suficiente para a inibição pretendida da reacção biológica. São genes de transporte especialmente apropriados as unidades de transcrição necessárias para a transcrição por meio da polimerase III, por exemplo ARNt-genes, é possível introduzir nestas unidades por exemplo gen de ribozimas de tal modo que na transcrição a fracção de ribo

zima é um predut® transcrito compacto de polimerase III.

Com o auxílio do sistema de transporte de acordo oom a presente invenção é possível reforçar a actividade destas unidades genéticas garantindo uma concentração de partida mais elevada do gene nas células.

B ainda um objectivo da presente invenção um processo para a introdução de ácido(s) nucleico(s) em células humanas ou animais, sendo de preferência formado um complexo solúvel em condições fisiológicas.

E ainda um outro objectivo da presente invenção um processo para a preparação de composições farmacêuticas por incorporação como ingrediente activo de um ácido nucleico que inibe de modo específico um gene, complexado com um conjugado transferrina-policatiãe, por exemplo sob uma forma liofilizada. Estas composições farmacêuticas podem ser usadas a fim de inibir oom oligonucleótidos anti-sentido, análogos de oligonucleótidos anti-sentido ou ribozimas ou os ADNs que as codificam, eventualmente em conjunto com um ácido nucleico de transporte, no organismo humano ou de animais, virus patogénicos, oomo o HIV ou retrovirus aparentados, oncogenes ou outros genes fundamentais que controlam o crescimento e/ou a diferenciação das células, por exemplo o gene c-fos ou o gene c-myc.

Um outro domínio de utilização é o combate a doenças pela inibição da produção de produtos génicos indesejados, por exemplo da proteína principal das placas (major plaque protein) que ocorre na doença de Alzheimer ou de proteína ocasionalmente ocasionadas por doenças autoimunes .

A presente invenção é ilustrada por meio dos exemplos que se segue».

Exemplo 1

Preparação de conjugados transferrina-polilisina 90 acoplamento foi efectuado de modo análogo ao método conhecido da literatura (Jung et al., (1981)) por introdução de pontes de disulfureto após modificação com pirididitiopropionato de succinimidilo.

a) Transferrina modificada por 3-(2-piridiltio)-propionatoi

Trataram-se 6 ml de uma solução filtrada através de gel de Sephadex G-25 de 120 mg (1.5 λι®ο1) de transferrina (de clara de ovo de galinha), Sigma, Conalbumina Tipo I, isenta de ferro) em 3 ml de tam pão de fosfato de sódio 0.1 M (mH 7,8) com agitação vigorosa oom 200 ul de uma solução etanólica 15 mM de 3-(2-piridilditio)-propionato de succinimidilo (3 /UM, SPDP, Pharmacia) e deixou-se reagir durante 1 hora à temperatura ambiente e com agitação ocasional. Eliminaram-se os produtos reaccionais e os resíduos da reacção de baixo peso molecular através de uma coluna de gel (Sephadex G-25, x 180 mm, tampão de fosfato de sódio 0,1 M pH 7.8) e obtiveram-se 7 ml das fraeções do produto; o conteúdo de resíduos de piridilditiopropionato ligados a transferrina numa aliquota após redução com ditiotreitol por determinação fotométrica da quantidade de piridina-2-tiona libertada era de cerca de 2,6_yumol.

De modo análogo modificaram-se transferrina humana (Sigma, isenta de ferro).

b) Polilisina 90 (pL 90) modificada por mercaptopropionato:

Filtrou-se uma solução de 18 mg (cerca de 1.0_zumol) de bromidrato de poii(L)lisina (Sigma, marcada por isotiocianato de fluoresceina (=FITC), peso molecular cerca de 18000 / correspondente a um grau de polimerização médio de cerca de 90) através de Sephadex 0-25 ( a marcação fluorescente foi realiza da em tampão de bicarbonato de sédio a pH 9 durante 3 h). Diluiu-se a solução de polilisina com água até 7 ml, tratou-se com boa agitação com 270 ul de uma solução etanólica de 15 mM de SPDP e deixou-ae reagir durante 1 h ao a brigo da luz à temperatura ambiente e com agitação ocasional. Apés adição de 0,5 ml de tampão de acetato de sódio 1 M (pH 5,0) filtrou-se através de Sephadex G-25 para eliminação das substâncias de baixo peso molecular (Eluente: tampão de acetato de sódio 20 mM de pH 5,0). Concentrou-se à secura sob vácuo o produto da filtração )coloraçâo por ninidrina, fluorescência), ajustou-se com tampão a cerca de pH 7, adicionou-se uma solução de 23 mg (150 /imol) de ditiotreitol em 200 >il de água e deixou-se em repouso durante 1 h à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon e ao abrigo da luz. Separou-se ® excesso de redutor por uma nova filtração em gel (Sephadex G-25, coluna de 14 x 130 mm, tampão de acetato de sódio 10 mM de pH 5,0) e obtiveram-se 3,5 ml de solução contendo o produto polilsina marcada por fluorescência com um conteúdo de 3,8 umol de grupos marcapto (determinação fotométrica por meio de reagente de Ellman, ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzóico)

c) Conjugado transferrina - polilisina:

Purgou-se com árgon a solução obtida em a) de transferrina modificada (7 ml em tampão de fosfato de sódio 0,1 M de pH 7.8, cerca de umol de transferrina com cerca de 2,6 umol de resíduo de piridil- 16 -

ditioptopionato): adicionaram-se 2,0 ml de solução obtida em b) de polilisina modificada por mercapto (em tampão de aoetato de sódio 10 mM de pH 5,0, que corresponde a cerca de 0,6 umol de polilisina com cerca de 2,2 umol de grupos mercapto), purgou-se com árgen, agitou-se e deixou-se reagir durante 18 horas à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Dildiu-se a mistura reaccional com água até 14- ml e submeteu-se a cromatografia de permuta iónica (Coluna Pharmacia Mono S HR 10/10, eluição por gradiente, tampão A : HEPES 50 mH pH 7,9, tampã·

B ; A + cloreto de sódio 3 M, 0,5 ml/min, Pig. 1).

A transferrina não conjugada foi eluída no início e as fracções contendo o produto foram obtidas a oerca de 0,66 a 1,5 M em cloreto de sódio.

Obtiveram-se nas fracções reunidas conjugadas que apresentam uma proporção transferrina-polilisina de l,3il.

Os produtos conjugados (coloração por minidrina, determinação da absorção da proteína em UV a 280 nm e da fluorescência da polilisina marcada por PITO a 495 nm) foram reunidos em 6 fracções com um conteúdo de 10 mg de transferrina cada.

Dialisaram-se em primeiro lugar as fracções contra uma solução de citrato de ferro (III) 100 mM (ajustado com hidrogenocarbonato de sódio a pH 7,8) e em seguida duas vezes contra tampão HEPES 1 mM (pH 7,5).

Por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio (10$ de SDS, 8 $ de poliacrilamida, ver Pigura 2) verificou-se com pré-tratamento com 2-mercaptoetanol um conteúdo aproximadamente igual a transferrina (Pig. 2A), enquanto que nas amostras não reduzidas

não era visível qualquer banda de transferrina livre, mas apenas uma pequena quantidade de conjugados de migração rápida (Fig. 2B, T= transferrina não tratada; 1 a 6 = fracçães de conjugados 1 a 6).

Exemplo 2

Preparação de conjugados transferrina-polilsina 270 e transferrina-polilisina 450 (pL270 e pL45O)

a) Preparação de transferrina modificada foi efectuada de modo análogo ao do Exemplo 1 a)

b) Preparação de polilisina modificada 270 e polilisina modificada 450

Ajustou-se a pH 8,5 por adição de tampão de carbonato de sódio uma solução filtrada por gel de 0,53 umol de polilisina 270 (com um grau de poliàerização médio de 270 resíduos de lisina, com ou sem marcação por fluorescência; correspondente a 19 mg do bromidrato) em 1,2 ml de tampão de acetato de sódio 75 mM. Adicionaram-se 182 ul de uma solução etanólica de 15 mM de SPDP (1,9 umol) com agitação forte. Uma hora mais tarde adicionaram-se 200 ul de acetato de sódio 1 M a pH 5; após filtração por gel com acetato de sódio 20 mM obteve-se uma solução que continha 0,27 umol de polilisina 270 com 1,5 umol de grupos mercapto (4,8 ligantes por cadeia de polilisina).

De modo a nálogo modificaram-se 0,20 umol de polilisina 450 (com um grau médio de polimerização de 450 de resíduos de lisina) com 2,25 ju^ol de SPDP, tendo obtido um produto de 0,19 umol de polilisina 450 com 2,l_/umol de grupos mercapto (11 ligantes por cadeia de polilisina). De modo análogo ao do Exemplo 1 b) reduziram-se os grupos ditiopiridina

com ditiotreitol a fim de obter os componentes de sulfiridrilo livres.

c) PreparaçSo de conjugados transferrina-polilisina

Preparam-se conjugados de transferina-polilisina 270 por mistura de 1,0 jumol de transferrina modificada em tampão de fosfato 100 mM de pH 7,8 com o,14 /imol de polilisina 270 modificada (em tampão de acetato de sódio 20 mM) ao abrigo do oxigénio numa atmosfera de árgon. Após 18 h à temperatura ambiente diluiu-se a mistura reaocional com água até um volume de 10 ml e por meio de cromatografia de permuta catiónica (coluna Pharmacia Mono 8 HR 10/10; eluição por gradiente, tampão A ; HEPES 50 mM pH 7,9 } tampão B : A + cloreto de sódio 3 M; Absorção de UV a 280 nm e determinação da fluorescên cia, excitação a 480 nm, emissão a 530 nm), Nesta operação eluiu-se em primeiro lugar o excesso de transferrina não acoplada; as fraeções contendo 0 produto foram eluídas entre 30 e 50 % do gradiente de B e foram reunidas em 3 fraeções de conjugado (proporção molar entre a transferrina e a polilisina: Conjunto A : 5,5 a 1 ; conjunto B : 3,4 a 1 : conjunto C : 1,8 a 1). Os conjugados foram obtidos num rendimento médio de 0,23 umol de transferrina com 0,075 /imol de polilisina 270.

De modo análogo foram preparados conjugados de trans ferrina-polilisina 450 partindo de l^^umol de transferrina modificada de acordo com 0 Exemplo 1 a) (em HEPES 20 mM pH 7,9 contendo cloreto de cálcio 80 mM) e 71 nmol is polilisina 450 modificada por mercapto de acordo com o Exemplo 2 b) em tampão de acetato.

Efectuou-se a purificação da mistura reaccional por meio de cromatografia de permaação em gel (coluna de

Pharmacia Superose 12, cloreto de guanidina 1 M a pH 7,3^ e obteve-se após diálise (HEPES 20 mM pH 7,3, contendo cloreto de sódio 100 mM) um conjugado transferrina-polilisina, contendo 0,40 umol de transferrina com 38 nmol de polilisina 450.

A incorporação de ferro foi efectuada por adição à amostra 6 de 12 ^ul de tampão de citrato de ferro 100 mM (contendo carbonato de sódio, ajustado a pH 7,8) por mg de fracçâo de transferrina.

Exemplo 3

a) Preparação de conjugados transferrinaaprotamina

A preparação de transferrina modificada foi efectuada de modo análogo ao do Exemplo 1 a) >) Preparação de protamina modificada por 3-aaercaptopropionato

A uma solução de 20 mg (3^umol) de trifluoroacetato de protamina (preparada por cromatografia de permuta iónica de sulfato de protamina de salmão (= Saimin, Sigma) em 2 ml de DMSO e 0,4 ml de isopropanol, conten do 2,6 >ul (15 umol) de etildiisopropilamina, adicionou-se em várias pprções no decurso de uma hora uma solução de 30 /imol de SPDP em 250 >il de isopropanol e 250 jal de DMSO. Após 3,5 h à temperatura ambiente eveporou-se a solução à secura sob alto vácuo e retmou-se em ácido acético a 0,5 % com um conttúdo de 10% de metanol. Por filtração em gel· (Sephadex G10; ácido acético a 0,5 % coo 10 % de metanol) obteve-se após liofilização 16 mg (2,5 yumol) de acetato de protamina modificada com 2,5 /imol de ligante de ditiopiridina. Por redução de 1,75 ^umol de protamina (contendo 1,75 umol de adaptador) com

mg de ditiotreitol em tampão de bicarbonato de sócio de pH 7,5 durante 1 h sob árgon seguida de ajun te do pH a 5,2 com tampão de acetato de sódio de pH 5,2 obteve-se uma solução de protamina modificada com l,6_xumol de adaptador de mercaptopropionato.

c) Preparação de conjugados transferrina-protamina

Por reacção da solução de protamina obtida de acordo com b) (1,6/imol de ligante) com l,34_zumol de transferrina (modificada com 3,l_zumpl de ligante de ditiopiridina) seguida de purificação por cromatografia de permuta catiónica, conforme descrito para os conjugados transferrina-polilisina, obtiveram-se quatro fracções A a D eluídas sucessivamente de produto, contendo 90, 320, 240 e 120 nmol respectivamente de transferrina modificada com quantidades crescentes de protamina (determinadas por meio de electroforese em gel de SDS; 10 % de SDS, 8 % de poliacrilamida, coloração por azul de Coomassie).

Na Pigura 3 apresenta-se o resultado da electroforese em gel de SDS. As fracções de conjugados Tfprot A a D apresentam bandas de migração lenta (a), enquanto que nas amostras reduzidas por -mercaptoetanol (b) apenas era visível a banda de transferrina. Efectuou-se a diálise e a incorporação de ferro como para os conjugados transferrina-polilisina TfpL270 e TfpL45O descritos no Exemplo 2.

Exemplo 4

Preparação de complexos de conjugados transferrina-policatião com ADN

Prepararam-se os complexos por mistura de soluções diluídas de ADN (30 /ug/ml ou menos) com os conjugados transferrina-policatião. A fim de evitar uma pre21

cipitação de complexos de ADN, usou-se tampão isento de fosfato (os fosfatos reduzem a solubilidade dos conjugados). A ligação do ADN aos conjugados de policatião em condições iónicas fisiológicas foi confirmado por meio de um ensaio de desvio de mobilidade em gel (gel mobility shift assay) usando ADN lambda marcado na extremidade 3’ por 32p, cortado com EcoR i/Hind III (Fig. 4), A oada'amostra com 1 _zul (35 Bg) de ADN adicionaram-se 3 ul de um tampão HEPES 100 mM de pH 7,9 contendo cloreto de sódio 1 M e misturaram-se as amostras com quantidades crescentes (10 ng a 1000 ng) de conjugados de transferrina em 11 ul de solução aquosa, o que deu origem a uma concentração final de cloreto de sódio de 200 mM. Efectuou-se electroforese sobre um gel de agarose a 1 / com tampão de desenvolvimento 1 x TAE a 50 Volt (45 mA) durante 2,5 h; secou-se o gel e visualizou-se por auto-radiografia durante 2 horas a -80°C usando uma película XAR (Kodak).

Exemplo 5

Transporte de conjugados transferrina-polilisina em células vivas

A fim de verificar se os conjugados transferrina-polilisina descritos no Exemplo 1 são absorvidos eficazmente pelas células vivas, usaram-se conjugados marcados por FITC. E sabido (Schmidt et al., 1986) que a transferrina marcada por FITC após algumas horas de incubação com eritroblastos, cuja transferrina foi previamente removida, é detectável em vesículas no interior das células (observação ao microscópio de fluorescência).

No presente exemplo incubaram-se eritroblastos (transformados por meio de um retrovirus com o receptor de EGF, Khazaie et al., 1988) durante 18 horas em meio de diferenciação isento de cransferrina (composição em Zenke et al., 1988) a 37°C (concentração celular

1,5 x ΙΟθ/ml). Após adição dos diferentes conjugados de trans ferrina-polilisina (ou, para branco de comparação, duma quan+ tidade igual de água bidestilada) incubaram-se as células a

37°C na presença de 10 ng/ml de EB? (a fim de conservar o estado de transformação). Após 24 a 48 horas tomaram-se ς cerca de 5 x 10 células, lavaram-se uma vez com solução salina fisiológica tamponizada por fosfato (BBS; pH 7,2), fixou^ee com um volume de 50 vezes de uma mistura de 3,7 de formaldeido e 0,02 % de glutaraldeído em PBS (10 min,

C), lavou-se uma vez em PBS, inoorporou-se em elvanol e observou-se no microscópio de fluorescência (Zeiss Axiophot, banda estreita de PITO e exaltação com TRITC). Simultaneamente determinaram-se em outras alíquotas os diferentes parâmetros da taxa de crescimento das células. Para este fim tomaram-se 100 ul da suspensão celular e determina-se a incorporação de ^H-timidina (8 uCi/ml, 2 horas), conforme descrito em Leutz et al., 1984. A partir da Figura 5 verificou-se que os eritroblastos incubados com transferrina polibsina apresentam após 24 horas 2 a 10 vesículas de forte fluorescência que não são detectáveis nas amostras de comparação. 0 Quadro A mostra que com excepçâo da Fracção 6 todos os conjugados foram assimilados por praticamente todas as oélulas.

A Figura 5 mostra a asimilàção de fluorescência por eritroblastos de galinha que foram incubados durante 24 horas sem (A) ou com conjugados de transferri na-polilisina marcados com FITC (B, C). Por estimilação com luz azul (B), para a detecção de FITC) são visíveis niti damente várias vesículas fluorescentes em cada célula. A especificidade desta fluorescência foi demonstrada pelo facto de que a excitação com luz verde (C: com a qual se pode observar uma fluorescência inespecífica das células como em A) não se verifica (C).

facto de que as células em todas as amostras crescem com igual velocidade (como se verifica por

medida da incorporação de timidina tritiada (^H TdR),

Quadro A), demonstra que as células não foram prejudicadas pelas construções de polilisina e que deste modo é de excluir uma assimilação inespecifica (por exemplo através das membranas tornadas permeáveis).

Exemplo 6 objectivo das experiências realizadas neste exemplo era demonstrar que os conjugados de transferrina-polilisina usados são utilizados por todas as células como a transferrina nativa, isto é, realizam o ciclo normal da transferrina oom eficácia semelhante. São especial mente adequados para sistema de ensaio para este fim eritroblastos cuja maturação em eritrócitos normais foi induzida pela acção de desligar o oncogene transformador (Beug et al., 1982). A partir da literatura concluiu-se que estas células necessitam de uma alta concentração do complexo transferrina-ferro para a maturação normal· (100 a 200 ug/ml, concentrações 3 vezes mais reduzidas inibem a maturação das células e provocam após vários dias a morte das células (Kowenz et al., 1986)). Foi também possível mostrar (Schmidt et al., 1986) que a reciclagem, isto é, a reutilização de receptores de transferrina e em consequência um decurso do ciolo de transferrina com velocidade óptima, é indèspensável para uma diferenciação normal in vitro.

Induziik-se a diferenciação de eritroblas tos (transformados pelo retrovirus do receptor de EGF) por privação de EOF e adição de uma quantidade óptima de eritropoietina de galinha parcialmente purificada (Kowenz et al., 1986, isenta de transferrina). A incubação foi levada a efeito a uma concentração celular de lxlO^/ml em meio de diferenciação isento de transferrina a 42°C e com 5% de 0θ£. No início da incubação adicionou-se complexo transferrina-ferro nativo (Sigma, 100 ,ug/ml) ou os conju- 24 ιλλη gados âe transferrina-poiilisina saturada com ferro (concentração igualmente 100 ug/ml). 0 crescimento e o esqado de maturação das células foram analisadas do modo que se segue após 24 c 48 h.

1. Determinação do número de células (num Coulter Counter,Modelo ZM, Beug et al., 1984)

2. Medição da distribuição de dimensões das células (num Coulter Channelyzer Mod. 256) e

3. Determinação fotométrica do conteúdo em hemoglobina das células (Kowenz et al., 1986).

Para além disso centrifugaram-se alíquotas da mistura após 72 horas num citocentrifuga (Shandon) e efeotuou-se uma determinação histoquímica da hemoglobina (coloração com benziàina neutra mais corante rápido Diff-Quik para células sanguíneas, Beug et al., 1982).

Os resultados apresentados no Quadro B mostram claramente que a maturação das células cuja diferenciação foi induzida na presença das fracções 1 a 5 do conjugado de polilisina -transferrina ooorre tão eficazmente e com a mesma velocidade que a das células que foram incubadas com transferrina nativa-ferro. As células nas amostras de comparação isentas de transferrina mostram pelo contrário um crescimento celular fortemente retardado e acumulam homoglobina apenas e quantidades reduzidas. A investigação do fenótipo celular em preparados corados com citospina indicou que as células incubadas com os conjugados de transferrina-poiilisina apresentam uma maturação para reticulócitos tardios (late reticulocytes, Beug et al., 1982) do mesmo modo que as tratadas com transferrina nativa, enquanto que as células incubadas sem transferrina apresentam uma mistura de células desintegradas e células semelhantes e eritroblastos não amadurecidos (Schàidt et al. , 1986. Apenas as células tratadas com a fracção 6 de transferrina-poiilisina apresentam um conteúdo em hemoglobina mais reduzido e uma maior percen- 25 tagem de células não amadurecidas (Quadro B). Este facto indica que a fracção 6 que contém uma quantidade especialmente elevada de polilisina conjugada funciona menos bem no ciclo da transferrina. Simultaneamente este resultado demonstra a sensibilidade do método de ensaio.

Exemplo 7

De modo análogo ao do Exemplo 6 ensaiou-se a capacidade de diferentes conjugados de transferrina-polilisina e conjugados transferrina-protamina na substituição funcional do complexo nativo transferrina-ferro na maturação de eritroblastos de galinha para eritrócitos.

Já foi anteriormente demonstrado que os eritroblastos de galinha em diferenciação terminal apresentam um ciclo de transferrina de funcionamento óptimo; isto é sem transferrina ou quando a reciclagem do receptor de transferrina é inibida as células morrem (Kowenz et al.,

1986; Schmidt et al., 1986). Uma vez que normalmentô a eritropoietina de galinha parcialmente purificada utilizada ainda contém transferrina, substituiu-se a EPO por um factor de crescimento eritróide parcialmente purificado isento de transferrina, a fim de possibilitar a diferenciação eritróide (factor REV; Kowenz et al., 1986; Beug et al., 1982); Usaram-se como células visadas eritroblastos que foram cultivados com um receptor do factor de crescimento epidérmito humano (EGFR) e transformados em conjunto com um retrovírus que continha um oncogene v-myb sensível à temperatura em meio CFU-E (Radke et al., 1982) na presença de 20 ng/ml de EGF. Estas células são estimuladas a uma multiplicação anormal por meio de EGF, a eliminação do factor de crescimento EGF com adição simultânea de factor REV provoca a integração das células na diferenciação normal. Após duas lavagens em meio isento de transferrina as células são inoculadas em meio isento de transferrina e adicionam-se diferentes quantidades de transferrina saturada com ferro ou de conjugados

transferrina-policatião (antes ou após a respectiva complexação com ADN plasmidico). Após 1, 2 ou 3 dias de incubação a 42°C verificou-se o estado de diferenciação das células por citocentrifugaçâo e coloração histoquímica ou por determinação quantitativa da hemoglobina.

resultado deste ensaio é apresentado na Figura 6 e no Quadro C.

g

Depositaram-se as oélulas (1 x 10 /ml) em meio de diferenciação isento de conalbumina (Zenke et al., 1988) completado por meio de 1 _zug/ml de insulina e factor EEV em concentração óptima (Kowenz et al. 1986); diluição:

: 5000), uma vez sem aditivo (triângulos), uma vez com conalbumina saturada de ferro (circulos) e uma vez com conjugados Tfpl 270 saturados de ferro (100 _zug/ml oada; quadrados) em placas de 14 mm. Após incubação durante 24 a 48 horas determinou-se fotometricamentè o conteúdo de hemoglobina em alíquotas de 100 >ul. A área tracejada indica o conteúdo em hemoglobina na ausência de transferrina de células em cultura (média de 4 determinações; Fig. 6A).

A fim de analisar a deferenciação eritróide em função da concentração de transferência ou de transferrina-polilisina, depositaram-se as células, como descrito anteriormente, em meio que continha as quantidades referidas de conalbumina saturada de ferro (circulos vazios), TfpL 90 (quadrados vazios) ou TfpL 270 (quadrados a cheio) e após 2 dias determinou-se fotometricamente o conteúdo em hemoglobina (Fig. 6B).

Quadro C:

A diferenciação eritroide foi seguida por determinação fotométrica da hemoglobina (ver Fig. 6), por contagem num contador Coulter ou por citocentrifugaçâo seguida de coloração por benzidina neutra (para determinação

de hemoglobina) e corante histológico (Diff Quik; Beug et al 1982b). A concentração final da transferrina e de conjugados de transferrina era no ensaio 1 de 60 ,,ug/ml; no ensaio 2 e 3 de 100 ^ug/ml. A concentração de ADN no ensaio 2 era de 10 xug/ml. Determinou-se a fracção de células desintegrantes, de células maduras (LR: reticulatócitos tardios;

E: erotrócitos) e de células não amadurecidas (Ebl) de acordo com os métodos descritos por Beug et al., 1982b e Schmidt et al., 1986. Os resultados obtidos mostram que dois conjugados de transferrina-polilisina (TfpL 90 ou TfpL 270) bem como o conjugado transferrina-promamina são capazes de substituir funcionalmente a transferrina nativa, garantindo um rápido transporte de ferro para os glóbulos vermelhos diferenciados, como uma actividade específica 1,5 a 2 vezes mais baixa (ver Fig. 6). A complexação de ADN com transferrina-polilisina 270 e transferrina-proteína não modificou essencialmente a actividade biológica dos conjugados. Num ensaio de comparação verificou-se que com adição de polilisina ou de protamina, misturadas com uma quantidade apropriada de citrato de ferro em vez dos conjugados de transferrina as células não foram capazes de alcançar a diferenciação a morreram, de modo análogo às células nas amostras de comparação que foram incubadas sem transferrina .

Em conjunto os ensaios de acordo com os Exemplos 6 e 7 mostraram que os dois tipos de conjugados de policatião-transferrina transportam ferro apenas ligeiramen te menos eficientemente do que a transferrina natural.

Exemplo 8

Os conjugados polilisina-transferrina possibilitam a absorção de ADN em eritroblastos de galinha.

No exemplo que se segue pretendia-se investigar se o ADN numa dimensão que corresponde à de ADNt28

-ribozimas (ver Fig. 7) que pode ser transportado eficazmente para o interior das células. No presente exemplo utilizou-se ADNt com uma inserção da sequência

CGTTAAOAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC

CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC com um peso molecular de cerca de 300 000, marcado na extremidade com 32P ATP gama (Maniatis). Misturaram-se cerca de 0,3 /ig deste ADN, dissolvido em 20 ,ug de tampão TE, com 10 ,ug de transferrina nativa ou com 10 ug da fracção 3 do conjugado de transferrina-polilisina, ambos dissolvidos em 50 ,ul de água bidestilada com 400 /íg/ml de albumina de soro de bovino (Beug. Η., et al.,

1982) ou com 50 _zul deste solvente sem transferrina. Adicionou-se cada uma das misturas ADN-proteína a 2 ml de meio g

de diferenciação isento de transferrina, 4 x 10 eritroblastos de galinha (que tinham sido transformados com um retrovírus receptor de EGF e pré-incubados durante 18 h em meio isento de transferrinâ na presença de EGF (Khazaie K., et al., 1988)) e incubaram-se as misturas durante 8 horas a 37°C e com 5 % de COg. Em seguida separaram-se as células por centrifugação, tomou-se o sobrenadante e lavaram-se as células 3 vezes em meio isento de transferrina. Retomaram-se o sedimento celular e o meio de cultura em SDS a 1 % mg/ml de proteinase K, NaCl 300 mM, tris 20 mM de pH 8,o, EDTA 10 mM (tampão PK/SDS), incubaram-se durante 30 minutos a 37°C, extraíu-se com fenol/cloroférmio e isolou-se o ADN por precipitação com etanol. Separou-se o ADN isolado com uma radioactividade total de 2000 cpm num gel de acrilamida não desnaturante a 3,5 $ (TBE, Maniatis) e detectou-se o ADN por auto-radiografia. Verificou-se que nas amos tras celulares tratadas com transferrina-polilisina tinha sido obtido cerca de 5 a 10 vezes mais ADN das células do que nas amostras de comparação com transferrina nativa.

- 29 Exemplo 9

Os conjugados polilisina-transferrina possibilitam a integração e a expressão de ADN plasmídico em eritroblastos de galinha

Nestas experiências utilizou-se ADN plasmidico que continha o gene de luciferase de Photinua pyralis como gene de relatório (repórter), a fim de investigar a transferência e a expressão de genes. Para este fim preparou-se o ADN do plasmídeo pRSVluc (De Wet, J. R., et al., 1987) usando o método normal de lise por Triton X (Maniatis), seguido de centrifugação por gradiente de equilíbrio CsCl/EtBr, descoloração com butanol-1 e diâlise contra tris-HCl 10 mM de pH 7,5 e EDTA 1 mM. Numa reacção de formação de complexos típica adicionaram-se 10 _xug de conjugado de transferrina-polilisina ou de transferrina-protamina a 3 ,ug de ADN do plasmídeo pRSVluc em 250 _xul de NaCl 0,3 M, com agitação cuidadosa e lenta. (Verificou-se que mantendo estes condiçóes é possível usar até 100 _zug de conjugado transferrina-policatiâo e 30 _zu.g de ADN plasmídico num volume final de 500 _zul·, sem que os complexos conjugado/ADN precipitem). Após 30 min à temperatura ambiente adicionaram-se os complexos directamente a 5 a 10 x IO⁶ células HD$ (0,5 a 1 x 10θ células por ml, meio EBM+H (Beug et al·., 1982a; 37°G, 5 % de C0₂) e incubou-se durante 16 a 48 h (a linha de células utilizada foi a linha de células de eritroblastos de galinha HD3 transformada por ts-v-erbB). Separaram-se as células (5 min a 1500 x g, 4°C), lavaram-se duas vezes com solução salina tamponizada com fosfato (PBS) e retomaram-se em 100 ,ul de tris.HGl e 0,25 M de pH 7,6. Preparam-se extractos celulares por meio de três ciclos de congelação e descongelação, seguidos de centrifugação a alta velocidade (15 min, 18 500 x g, 4°C). Analisaram-se aliquotas destes extractos celulares para verificação da ocorrência de actividade de luciferase (De Wet, J. R. et al., 1987). Mediu-se a bioluminescência usando o Clinilumat (Berthold, Wildbach, RPA).

Verifioou-se que a presença dos complexos transferrina-polilcatiao/ADN no meio de cultura não tem qualquer influência prejudicial sobre o crescimento e a multiplicação celular. Como se pode verificar por meio da Figura 8, a actividade mámima de luciferase foi alcançada quando se usaram 3 Ug de ADN/10 ug de TfpL e 0,3 a 1 ug de ADN/Tfprot. Na hipótese de que todos os complexos conjugado)ADN formados serem idênticos, corresponde a uma proporção molar de 25 a 75 moléculas de conjugação por molécula de ADN plasmídioo. A partir daqui é possível concluir-se que o ADN é completamente abrangido no complexo por meio da molécula de conjugado e a uma proporção conjugado/ADN que garante de modo evidente a neutralidade eléctrica (calculada com base nas cargas posi tivas no policatião que são necessárias para neutralizar as cargas negativas dos grupos fosfato no ADN). Esta hipótese está em concordância com a observação anterior de que em comparação com a transferrina-polilisina é necessário três vezes menos transferrina/protamina fortemente carregada positivamente para a formação óptima de complexo e para a transferência de genes. Esta hipótese está de acordo com o resultado obtido no Exemplo 4 para a proporção conjugado/ADN que é uecessária para a formação eficaz de complexo.

Determinou-se a sensibilidade deste sistema de transferência de genes usando uma proporção Tlpl/ADN optimizada como referido. 0 resultado desta experiência é apresentado na Figura 9; Menos de 1 ng de ADN plasmídioo que codifica para a luciferase apresenta ainda um sinal detectável. A utilização de mais do que 2 ug de ADN plasmídioo complexado com 6 ug de TfpL ou 20 ug de Tfprot não provavelmente em virtude da saturação do sistema, verificou-se ainda que não é necessária qualquer concentração especial de sais ou dd iões para a forma ção de complexos, uma vez que os complexos TfpL/ADN formados com várias concentrações salinas (NaCl 0, 20, 50, 100,

200 mM) apresentavam actividades idênticas nas experiências de transferência de genes. (Fig. 8 e Fig. 9: círculos= = Tfprot, quadrados = TfpL). Foi possível demonstrar que se verifica a hipótese de que os complexos transferrina-policatião/ADN se ligam às células por meio do receptor de transferrina. Em primeiro lugar, conforme se apresenta na Figura 10A, demonstrou-se que a actividade de luciferase que se pode atingir por intermédio dos complexos TfpL-ADN é pelo menos 100 vezes superior à actividade medida para o complexo pL-ADN. Uma experiência de comparação mostrou que uma mistura de polilisina e transferrina isi ladamente não facilita a absorção do ADN plasmídico. Numa outra experiência adicionou-se a uma quantidade constante de complexo TfpL-ADN um excesso de transferrina nativa.

A Figura 10B mostra que a transferrina livre no meio concorre eficazmente para a absorção de Adn mediada por TfpL, o que tem como resultado uma diminuição da actividade enzimática de luciferase. Daqui é possível conoluir que a absor· ção do complexo TfpL-ADN tem lugar nas células através dos receptores de transferrina.

Exemplo 10

Em experiências preliminares tinha sido verificado por meio de transfecção de fibroblastos de galinha com ADN da secção erbB que o ADNt da secção erbB-ribozima é expresso em células de galinha.

Com este exemplo foi possível demonstrar que as ADNt-ribozimas que são dirigidas contra o oncogene erb B são incorporadas em eritroblastos de galinha transformados por erb B com o auxílio de conjugados polilisina-transferrina e podem enfraquecer a actividade de trans formação do oncogene.

Construiram-se dois genes de ARNt-ribozima dirigidos contra a região de início de tradução

- 32 RN

de erbB (ver Figs. 7 e 11).

Digeriram-se com EcoRI cerca de 100 ug de cada um dos plasmídeos que contém o gene, a fim de libertar o gene de ARNt-ribozima de um fragmento de 325 pb. Os produtos da digestão foram marcados na extremidade por meio do fragmento de Klenow e foram purificados por meio de electroforese em gel através de um gel de agarose a 2 $/TBE. Localizaram-se o fragmento vector e os fragmentoe do gene de ARNt-ribozima por meio de coloração com brometo de etídio, recortaram-se e isolaram-se por electroeluição, extracção por fenol/clorofórmio e clorofórmio e poi precipitação com etanol. Em seguida utilizaram-se os fragmentos de Adn purificados e marcados por isótopos radioactivos com utilização do sistema de transporte de transferrina-polilisina de determinar a absorção e a inibição do ARN de erbB. Utilizou-se como amostra de ADN de comparação o vector pSRT 18.

Para sistema de ensaio escolheu-se uma linha de células de eritroblastos de galinha transformada por meio de um mutante sensível à temperatura (ts 34, Graf et al., 1978) do vírus da eritroblastos das aves (Beug et al., 1982 b). 0 oncogene erb B igualmente expresso nestas células pode ser inibido por meio de um inibidor específico de quinase de proteína (H 7). (Verificou-se que o oncogene v-erbA in vivo e in vitro (isto é sob a forma de uma proteína expressa por bactérias) é fosforilado em dois locais, nomeadamente Ser 28 e Ser 29, por meio da quina de proteína C ou através de quinase de proteína dependente de cAMP. A mutação destas serinas para alaninas reduz a fosforilação e prejudica a actividade do oncogene v-ebrA. 0 inibidor H7 é específico destas duas quinase e possui a capacidade de neutralizar selectivamente as alterações causadas por v-erbA em eritroblastos que contém v-erbA-v-erbB (por exemplo bloqueamentos da diferenciação).

se

E conhecido que os eritroblastos cujo oncogene erbB se encontra inactivado - por exemplo por elevação da temperatura no caso de um mutante de erb B sensível à temperatura, sofram mutação transformando-se em eritrócitos. Um dos indícios para este processo é uma indução da síntese da hemoglobina que pode ser detectada ao nível da célula isolada por meio de uma análise simples (coloração com benzidina ácida, Orkin et al., 1975,

Graf et al., 1978). Como actividade fenotípica de uma ribozima dirigida contra erb B neste sistema de ensaio era deste modo de esperar uma elevação específica do número de células positivas em relação à benzidina.

A série de experiências em que se baseia este exemplo foi realizado do modo seguinte: Misturaram-se as diferentes preparaçães de ADN (ver no Quadro D anterior), dissolvidas em 30 /il de tampão TE, com 10 ug cada de complexo transferrina nativa-ferro ou de conjugado transferrina-polilisina (dissolvido em 50 ^μΐ de água bidestilada) e incubou-se durante 30 minutos a 37°G.

No caso de ADN plasmídico, (10 /ig) realizou-se uma maior quantidade dos preparados de transfer rina (100 /íg). Adicionou-se cada uma das misturas ADN-transferrina-ADN a 1 ml de meio de diferenciação isento de transferrina (Zenke et al., 1988). Incubaram-se previamente as células do ensaio (3 x 10^ por experiência) du rante 60 minutos de diferenciação isento de transferrina a 42°C, (fortalecendo-se deste modo a absorção de transferrina) e adicionou-se às amostras que continham a mistura ADN-transferrina. Após 6 h, 18 h e 68 h (para o tratamento das células ver acima) colheram-se amostras, conforme descrito, separaram-se em sobrenadante e sedimento celular, retomaram-se em tampão PK/SDS e analisaram-se o ADN.

A Pigura 12 mostra que, de modo análogo ao do Exemplo 8, nas amostras de células tratadas

com transferrina-polilisina foi absorvido cerca de mais 5 a 10 vezes de ADN pelas células do que nas amostras de comparação com transferrina nativa.

Pista m: Marcadores de peso molecular: ADN de pBR322, cindindo com Hpall e marcado com alfa-32p-CTP radioactivo por meio do fragmento de Klenow da polimerase de ADN (Maniatis)

Pista 1 : Fragmento ES13 de 2000 cpm

Pista 2 : Material celular tratado com transferrina e ES13

Pista 3 : Material celular tratado com transferrina-polilisina e ES13.

Após terminada a incubação (6 h) separa ram-se as células por centrifugação e incubaram-se mais 72 horas em meio de diferenciação que contém transferrina com eritropoietina e insulina (Kowenz et al., 1986, Zenke et al 1988, 2 mi por ensaio e a 37°0, isto é na presença de uma proteína v-erb B activa).

Foram obtidos os seguintes resultados:

1. De modo análogo ao do Exemplo 8 foi possível observar uma absorção mais elevada de ADN (cerca de vezes) na dimensão dos ADNs do sector erbB nas amostras celulares tratadas com transferrina-polilisina .

2. 0 Quadro D mostra que em todos os casos em que se incorporou ADNt de sector de erbB-ribozima com o auxilio de construções polihsina-transferrina em eritroblastos transformados em erb B, e percentagem de células positivas em relação à benzidina é si- 35

gnificativamente mais elevada (até cerca do dobro) (como referência serviram as amostras que foram tratadas com o ADN do vector e em que a utilização de conjugados polilisina-transferrina não provocava previsivelmente uma elevarão do número de células positivas em relação à benzidina).

Exemplo 11

Ligação eficaz e interaalizaçâo de complexos transferrina-polilisina/ADN em células hematopoiéticas de galinha

Mediu-se a ligação de TfpL e de ADN de TfpL a receptores da superfície celular com substâncias marcadas com tritio de acordo com o método descrito por x

Stein et al., 1984. Preparou-se TfpL marcado com H por conjugação de polilisina marcada com transferrina de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A marcação da polilisina 9θ foi levada a efeito por tratamento com formal2 deído e boro-hidreto de sódio marcado com ^JH (Ascoli e Puet, 1974). Os resultados desta experiência são apresentados na Pigura 13. Investigou-se a ligação especifica ao receptor de transferrina de células HD3 de TfpL 90 marcado (quadrados) ou TfpL 90 marcado complexado com ADN de pS-SK- (Promega Biotech, preparado por meios de lise com ^Triton X, centrifugação de gradiente de densidade equilibrada com CsCl/EtBr, descoloração com 1-butanol e diâlise contra tris.HOl 10 mM de pH 7,5, EDTA 1 mM) (triângulos). Para este fim juntaram-se os conjugados ou os complexos (0,1 a 100 nM) a células HD3 (1 x 10^/ml em MEM (= meio mínimo de Eagle) + 1 % de BSA) e incubou-se durante 3 h.

A Pigura 13 mostra que tanto os conjugados como os complexo se ligam a células HD3 de tal modo que atingem a saturação. As constantes de ligação aparentes calculadas a partir destes dados são de 22 nM para o TfpL e de 43 nM para o complexo TfpL-ADN. Se bem que um pouco mais elevado, estes valores estão em concordância relativa com os da transferri na nativa, que tinham sido determinados obtendo-se o valor

de 15 nM.

A fim de seguir a absorção de complexos TfpL-ADN em vesículas intracelulares incubaram-se em primeiro lugar durante 18 h a 37°c células HD3 com meio de diferenciação isento de transferrina. Após adição de FITC-transferrina ou de conjugados de TfpL (marcados com FITO no grupo polilisina e em algumas experiências complexadas com ADN) incubaram-se as células durante mais 18 h. Separaram-se as células por citoentrifugação, fixaram-se com uma mistura de formaldeído a 3,7 % e glutaraldeído a 0,02 lavaram-se com DBS, integraram-se em Mowiol 4,88 e observaram-se num microscópio de fluorescência Zeiss Axiophot. Para amostras de comparação usaram-se anticorpos de cabra anti-rato marcado com FITC (0,1 mg/ml) (ver Exemplo 5). Para a determinação quantitativa de FITC-Tf, PITC-TfpL e PITC-TfpL/ /ADN incubaram-se as células durante 6 h com cada um dos preparados (TF: 40 /ig/ml; TfpL 270: 50 /íg/ml; Tfpll270 com ADN de pB-SK (Promega Biotech, preparado por meio de lise com Triton X, centrifugação de gradiente de densidade com CsCl/EtBr, descoloração com 1-butanol e diálise contra tris-HCl 10 mM a pH 7,6, EDTA 1 mM) ί 50 _zug/ml ou 16 _zug/ml, respectivamente; tampão de ligação), lavaram-se 3 x em PBS/ /BSA frio e submeteram-se a análise FACS quantitativa num FCSAN de Becton-Dickinson (BD).

A Figura 14 mostra que tanto com TfpL como também com TfpL-ADN todas as células apresentam uma fluorescência relativa elevada mais de 10 χ, o que indica em consequência que os conjugados ou os complexos, respectivamente, foram absorvidos por mais do que 95 % das células (Tf:......; TfpL: ....; TfpL/ADN:-; tampão de ligação; ---).

Exemplo 12

Expressão de ADN absorvido pelas células por meio de TfpL

Depois de ter sido demonstrado nos exemplos anteriores que a transferencia de genes com TfpL não é prejudicial para o crescimento das células, ensaiou-se a actividade dos complexos TfpL-ADN que foram utilizados durante um período de tempo mais longo sobre as células (o ADN usado foi o ADN plasmidico que contém o gene de luciferase, conforme descrito no Exemplo 9)· Nesta experiência incubou-se sempre a mesma concentração oom células HD3 durante 1 a 4 dias com ou sem suplemento diário com complexos TfpL-ADN.

Determinou-se a actividade enzimática de luciferase em alíquotas ooihidas em diversos momentos, conforme descrito no Exemplo 9. Nas culturas com adição repetida dos complexos determinou-se uma expressão do gene da luciferase relativamente alta (100 000 a 200 000 unidades de luz/10> células) que se conserva essencialmente constante durante todo o período da investigação. Durante este período não se observaram quaisquer efeitos cititóxicos. Quando as células foram carregadas apenas uma vez com os complexos, a actividade de luciferase diminuiu entre o 22 e o 4^S dia de 10 a 20 vezes. Estes resultados mostram que apesar de uma expressão evidentemente transitória do gene da luciferase, que foi introduzida com o auxílio dos conjugados da presente invenção nas células, por adição repetida é possível conservar uma expressão elevada constante do gene introduzido.

Exemplo 13

A fim de determinar a dimensão da fraeção das células que expressa de facto o ADN plasmítioo que foi introduzido por meio transferrina, foram incubadas células HD3 com complexos TfpL/ADN como descrito nos exemplos anteriores. 0 ADN usado foi ADN do plasmídeo pRSV/- β Gal ( -). A expressão deste gene de relatório (repórter) foi investigado em consequência em células isoladas por meio

de análise de FAGS (Nolan et al., 1986). Para comparação utilizou-se ADN de TfpL-pB-SK-ADN (...). Para este fim introduzià-se o substrato fluorescente % Gal-FDG (fluoresceina-di- β -d-galactopiranosido) por meio de choque osmótico e investigou-se a distribuição das células que continham fluoresceina que tinha sido libertada em virtude da actividade enzimática de $ Gal em PDG. A distribuição homogénea das células que contém fluoresceina leva à conclusão de que uma fracção importante das células expressa o gene β Gal-reporter, 0 resultado desta experiência é apresentado na Figura 15.

QUADRO A

Transporte de Polilisina-transferrina em eritroblastos

Quadro ο

- . . ... Quadro D Maturação (conteúdo em hemoglobina) de eritroblastos transformados por ν-erbB que obsorveram ν-erbB - ribozima -ADN

Por determinação co taram-se ^200 células,valor + - desvio padrão Número de determinações independentes

- 43 ”*s .74 AíWt» Aa\<*-*.1 hb«t 1 à*ÃA^l *4 ^Γ2ϊν^3ϊΐΏ3?κ*^,

Ku xfui****⁴

Ascoli, M. e Puett, D. (1974), Biochem. Biophys.

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ Processo para a preparação de novos conjugados de proteína-policatião dotados de capacidade para formar complexos solúveis com substâncias com afinidade para com policatiões, especialmente ácidos nucleicos ou análogos de ácidos nucleicos, os quais se ligam às células por meio de endocitose mediada por um receptor, caracterizado por se efectuar o acoplamento de uma proteína constituida por transferrina a um policatiâo por via química por meio de um método de acoplamento de peptídeos ou em alternativa por via recombinante por meio de um método de preparação de polipeptideos quiméricos.

   - 2* Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por o policatiâo ser uma protamina eventual· mente modificada.

   _ 3a _

   Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por o poiicatião ser uma histona eventualmente modificada.

   _ 4a _

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 0 policatiâo ser um polipeptídeo sintético homólogo ou heterólogo.

   - 45 Al-!!SBWaBatg^?^^'^i»^^^·^^—

   Processo de acordo com a reivindicação 4, caracèerizado por o polipeptídeo ser polilisina.

   - 6§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o policatião apresentar cerca de 20 a 500 cargas positivas.

   _ 7§ _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a proporção molar entre a transferrina e a policatião ser de cerca de 10:1 a 1:4.

   _ 8& Processo para a preparação de novos complexos proteína-policatião/ácido nucleico que se ligam às células por meio de endocitose mediada por um receptor, caracterizado por se efectuar o acoplamento de uma proteína constituida por transferrina a um policatiâo/ácido nucleico por via química por meio de um método de acoplamento de peptídeos ou em alternativa por via recombinante por meio de um método de preparação de polipeptideos quiméricos.

   - _

   Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o complexo obtido conter como fracção de conjugado um conjugado obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.

   - 10ã Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o complexo obtido conter como ácido nucleico um ácido nucleico dotado de capacidade para a inibição específica de genes ou da função de ARN.

   - 11 & Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o complexo obtido conter um ácido nucleico dotado de capacidade para a inibição de ácido nucleico virai.

   - 12 δ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o complexo obtido conter um ácido nucleico dotado de capacidade para a inibição de oncogenes ou de outros genes chave que regulam o crescimento e/ou a diferenciação das células.

   - 13 δ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizado por o complexo obtido conter como ácido nucleico uma ribozima eventualmente em conjunto com um ARN veículo ou o gene que codifica para aquela.

   Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o complexo obtido conter como ácido nucleico uma unidade genética constituída por um gene de ARNt como gene veículo e um gene de uma ribozima ordenada no interior deste gene.

   - 15 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 12, caracterizado por o complexo obtido conter como ácido nucleico um oligonucleótido anti-sentido, eventualmente modificado, eventualmente em conjunto com um ácido nucleico veículo ou, no caso de um oligonucleótido de ARN, o gene que codifica para aquele.

   - 16 Utilização in vitro ou ex vivo de um complexo de um conjugado de transferrina-policatião e de um ácido nucleico ou de ácidos nucleicos solúveis sob condições fisiológicas caracterizado por se destinar à introdução de ácidos nucleicos em células humanas ou animais por meio de endocitose mediada por um receptor.

   - 17 Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um complexo quando obtido de acordo com

   -48qualquer das reivindicações 8 a 15.