ES2354238T3 - Genes como herramienta de diagnóstico para autismo. - Google Patents

Abstract

Un método de diagnóstico in Vitro para determinar la predisposición, el comienzo o presencia del trastorno del espectro autista en una persona. Dicho método incluye detectar en esa persona la existencia de un cambio en un segmento intrónico del genoma, cuyo segmento está localizado al menos dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en la SEC. ID. Nº: 1 y en donde dicho cambio incluye una transición de G a A en la posición 5579 y/o una transición de T a C en la posición 5731 de la SEC. ID. Nº 1.

Description

ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere al trastorno del espectro autista y a los métodos para determinar la susceptibilidad a, o la presencia del autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello, tal como el síndrome de Asperger y los Trastornos Generalizados del Desarrollo No Especificados (PDD-NOS). Más 5 concretamente, la invención se refiere a la identificación del locus de susceptibilidad en individuos autistas, que puede utilizarse para diagnosticar enfermedades del desarrollo, especialmente el autismo. Además, la presente invención incluye polimorfismos del gen ENGRAILED 2 (EN2), que establece una correlación con un fenotipo íntimamente relacionado con el autismo o una enfermedad o trastorno 10 relacionado con ello. La invención se refiere además a la identificación de dos polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) que puede utilizarse para el desarrollo de un ensayo de análisis genético para ayudar en el diagnóstico del autismo. Dicho ensayo puede utilizarse para asesorar a los padres potenciales sobre las posibilidades de tener hijos autistas. 15

ORÍGENES DE LA INVENCIÓN

[0002] El trastorno del espectro autista (AS) incluye tres diagnósticos separados, que incluyen el autismo, el síndrome de Asperger y el Trastorno Generalizado del Desarrollo No Especificados (PDD-NOS). El PDD-NOS se caracteriza por los retrasos 20 en el desarrollo de la sociabilidad, la comunicación y el uso de la imaginación. El síndrome de Asperger es una forma más severa de PDD-NOS pero no tiene los déficits del lenguaje y la inteligencia asociados normalmente con el autismo. El autismo se ejemplifica por discapacidad grave en la comunicación, déficits en la interacción social y comportamientos repetitivos/estereotipados. Cada uno de estos 25 trastornos tiene un criterio de diagnóstico específico tal y como señala la Asociación de Psiquiatría de los Estados Unidos (American Psychiatric Association o APA) en su Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales (en inglés Diagnostic & Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV-TR).)

[0003] El autismo tiene un impacto sobre el desarrollo normal del cerebro en las zonas 30 de la interacción social y las capacidades de comunicación. Los niños y los adultos con autismo normalmente tienen dificultades en la comunicación verbal y no verbal, en las interacciones sociales y las actividades de ocio o de juego.

[0004] No existe una única causa para el autismo, pero está generalmente aceptado que está causado por anormalidades en la función o en la estructura del cerebro. Los 35

escáneres cerebrales muestran diferencias en la forma y estructura del cerebro entre los niños autistas y lo no autistas. Los investigadores están analizando distintas teorías, incluyendo el vínculo entre problemas hereditarios, genéticos y médicos. En muchas familias, parece existir un patrón de autismo o de discapacidades relacionadas, además de portar una base genética para el trastorno. Aunque aún no 5 se ha identificado ningún gen que cause el autismo, los investigadores buscan variantes del código genético que los niños autistas hayan podido heredar. También parece que algunos niños nacen con una susceptibilidad al autismo.

[0005] Otros investigadores analizan la posibilidad de que bajo ciertas condiciones, un número de genes con niveles o funciones alterados puedan interferir con el desarrollo 10 del cerebro y eso resulte en autismo. Por otro lado, ciertos genes del desarrollo pueden asociarse con el autismo, incluyendo la implicación de los genes Wnt2 y de la reelina (Wassink, et al. Am. J. Med. Genet. 105:406-413 (2001); Persico, et al. Mol. Psychiatry 6:150-159 (2001)). Otros investigadores estudian los problemas durante el embarazo o el parto y también los factores medioambientales como las infecciones 15 virales, los desequilibrios metabólicos y la exposición a los productos químicos medioambientales. PETIT, E. et al. (Association study with two markers of a human homeogene in infantile autism. Journal of medical genetics. 1995, vol. 32, páginas 269-274) muestra un polimorfismo en la región 5' del gen EN-2 que está asociado con el autismo. ZHONG, H et al. (No association between the EN2 gene and autistic 20 disorder. Journal of medical genetics. Enero 2003, vol. 40, páginas 1-4) proporciona un estudio de la asociación entre otro polimorfismo EN-2 y el autismo.

[0006] El autismo tiende a producirse más frecuentemente de lo esperado entre individuos que padecen ciertas enfermedades, incluyendo el síndrome de X frágil, la esclerosis tuberosa, la infección congénita por rubéola y la fenilcetonuria no tratada 25 (PKU). Algunas sustancias dañinas ingeridas durante el embarazo también se han asociado con un riesgo incrementado de autismo. A principios del año 2002, la Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades (en inglés Agency for Toxic Substances and Disease Registry o ATSDR) preparó una revisión de la literatura sobre exposiciones químicas peligrosas y el autismo y no halló pruebas convincentes 30 de una asociación. Sin embargo, la investigación era muy limitada y aún queda mucho por hacer.

[0007] La pregunta de una relación entre vacunas y autismo sigue debatiéndose. En una investigación de 2001 realizada por el Institute of Medicine, un comité concluyó que ―la evidencia favorece el rechazo de una relación causal…entre las vacunas MMR 35 y los trastornos del espectro autista (ASD).‖ El comité reconoció que, sin embargo, que

"no podían descartar" la posibilidad de que la vacuna del MMR pudiera contribuir al ASD en número reducido de niños. Mientras que otros investigadores coinciden en que los datos no respaldan una relación entre MMR y el autismo, está claro que es necesario realizar más investigaciones.

[0008] Cualquiera que sea la causa, está claro que los niños con autismo y PDD-NOS 5 nacen con el trastorno o nacen con el potencial de desarrollarlo. El autismo no es una enfermedad mental. Los niños con autismo no son niños revoltosos que eligen no comportarse. Además, ningún factor psicológico conocido en el desarrollo del menor ha demostrado causar el autismo.

[0009] No hay pruebas médicas para diagnosticar el autismo. Y un diagnóstico exacto 10 debe basarse en la observación de la comunicación del individuo, el comportamiento y los niveles de desarrollo. Sin embargo, dado que muchos comportamientos asociados con el autismo se comparten con otros trastornos, pueden ordenarse varias pruebas médicas para descartar o identificar otras posibles causas de los síntomas que se muestran. 15

[0010] Una breve observación en un caso individual no puede presentar una imagen real de las capacidades y comportamientos de un individuo. La acción de los padres y de otros cuidadores junto con la historia del desarrollo son componentes muy importantes para hacer un diagnóstico exacto. A primera vista, algunas personas con autismo parecen tener un retraso mental, un trastorno del comportamiento, problemas 20 de audición o incluso y un comportamiento extraño y excéntrico. Para complicar aún más la materia, estas condiciones pueden co-ocurrir con el autismo. Sin embargo, es importante distinguir el autismo de otras situaciones, dado que un diagnóstico exacto y una identificación temprana pueden proporcionar las bases para crear un programa de tratamiento apropiado y educativamente efectivo. 25

[0011] La investigación indica que el diagnóstico precoz se asocia con resultados radicalmente mejores para individuos con autismo. Cuanto antes se diagnostique a un niño, antes podrá beneficiarse de uno de los muchos tratamientos especializados de intervención.

[0012] La presente invención trata la necesidad no cumplida para identificar un locus 30 de susceptibilidad del autismo y los usos para un diagnóstico precoz y los fines de los pronósticos.

[0013] En consecuencia, lo que se necesita es un marcador genético para valorar la susceptibilidad de un sujeto al autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello. También se necesita un marcador genético para diagnosticar el autismo y el 35 desarrollo de agentes o fármacos potenciales que tengan aplicaciones en el

tratamiento del autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello, tal como el Trastorno de Asperger o PDD-NOS.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0014] Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método 5 de diagnóstico in Vitro para determinar la predisposición, el comienzo o la presencia del trastorno del espectro autista en una persona. Dicho método incluye detectar en esa persona la existencia de un cambio en un segmento intrónico del genoma, el cual se localiza al menos dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en la SEC. ID Nº:1, y en donde dicho cambio incluye una transición de G a A en la 10 posición 5579 y/o una transición de T a C en la posición 5731 de la SEC. ID Nº: 1. Según otro aspecto, se proporciona un método in Vitro para determinar si una persona tiene una anormalidad genética que le predisponga al trastorno del espectro autista. Dicho método incluye o bien:

a) examinar el cromosoma 7 de dicha persona y detectar, donde esté presente, la 15 existencia de un cambio en un segmento intrónico del genoma localizado en dicho cromosoma 7. En los casos donde dicho segmento esté localizado en la SEC ID Nº:1 y donde dicho cambio incluye una transición de G a A en la posición 5579 y/o una transición de T a C en la posición 5731 de la SEC. ID. Nº: 1; o

b) detectar en el tejido o células de esa persona, la secuencia del ácido nucleico 20 EN2 tal y como se establece en la SEQ ID Nº:1, que incluye además un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) en un segmento intrónico suyo en donde dicho SNP incluya una transición de G a A en la posición 5579 y/o una transición de T a C en la posición 5731 de la SEC. ID. Nº: 1.

[0015] Una molécula aislada del ácido nucleico que codifica el ENGRAILED 2 (EN2), y 25 se describe la secuencia de aminoácidos del EN2 humano. Además, se proporciona, de acuerdo con los presentes métodos publicados para determinar la susceptibilidad de un sujeto al autismo o una enfermedad o un trastorno relacionado con ello, tal como el Trastorno de Asperger o PDD-NOS que utilice un alelo variante del gen ENGRAILED 2 (EN2), que traza el mapa del cromosoma 7, en concreto, al 7q36.3. 30 Además, los ensayos de transmisión/desequilibrio (TDT), que se realizaron para dos polimorfismos de nucleótido sencillo (rs1861972 y rsl861973), mostraron una sobretransmisión importante del alelo A de rs1861972 y el alelo C de rs1861973 (rs1861972 P=0.0009; rsl861973 P-0.0006). El análisis de haplotipos indicó que el haplotipo A,C se sobretransmite específicamente en individuos autistas (P=0.000062). 35 La detección de tal alelo variante en el genoma de un sujeto puede ser indicativa de la

susceptibilidad del sujeto al autismo. Además, un alelo variante del gen ENGRAILED 2 también puede utilizarse para probar fármacos y agentes para uso potencial en el tratamiento del autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello, como el Trastorno de Asperger o PDD-NOS.

[0016] Se describe un alelo variante aislado de un gen humano ENGRAILED 2 (EN2), 5 en donde el gen ENGRAILED 2 incluye una secuencia de ADN de SEC. ID Nº: 1, y el alelo variante incluye una secuencia de ADN que tiene al menos un polimorfismo de nucleótido sencillo, en donde al menos una variación incluye:

Una transición de G a A en la posición 154670848, en lo sucesivo denominada 154670848, el número correspondiente cuando se refiere a la versión de conjunto 10 número 69 de julio de 2003; o

una transición de T a C en la posición 154671000, en lo sucesivo denominada 154671000, el número correspondiente cuando se refiere a la versión de conjunto número 69 de julio 2003; o

una combinación de las mismas; y 15

en donde dicho alelo variante se correlaciona con la predisposición, el comienzo o la presencia del trastorno del espectro autista en un mamífero.

[0017] Se describe un método diagnóstico para determinar la predisposición, el comienzo o la presencia del trastorno del espectro autista en un mamífero, dicho método incluye detectar en dicho mamífero la existencia de un cambio en un 20 segmento del genoma, ese segmento se localiza dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en SEC. ID. Nº: 1. El segmento puede incluir el gen humano EN2 y se localiza en el cromosoma 7 de la posición aproximada 15455200 a la posición aproximada 154560000. El trastorno del espectro autista puede seleccionarse del grupo formado por el autismo, el trastorno de Asperger y el Trastornos 25 Generalizados del Desarrollo (PDD-NOS). El segmento del genoma puede contener un alelo variante o mutación que predispone a los individuos al Trastorno del Espectro Autista y este alelo variante o mutación puede ser una deleción, adición y sustitución de al menos un nucleótido. Además, la sustitución puede ser un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) localizado en la posición 154670848. Esta sustitución puede 30 incluir una transición de G a A en la posición 154670848. Además, la sustitución puede ser un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) localizado en la posición 154671000. Esta sustitución puede incluir una transición de T a C en la posición 154671000, o la sustitución puede ser una combinación de ambos SNPs.

[0018] Se describe un alelo variante detectablemente aislado y marcado de un gen 35 EN2 humano, en donde el gen EN2 incluye una secuencia de ADN de SEC. ID Nº: 1, y

el alelo variante incluye una secuencia de ADN que tiene al menos una variación en la SEC. ID. Nº: 1, en donde al menos una variación incluye:

una transición de G a A en la posición 154670848; o

una transición de T a C en la posición 154671000; o

una combinación de la misma. 5

[0019] Numerosas etiquetas detectables tienen aplicaciones. Por ejemplo, la etiqueta detectable puede ser un elemento radioactivo, como los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re por nombrar algunos.

Los productos químicos con fluorescencias de enzimas, como la fosfatasa alcalina o la peroxidada de rábano, también puede utilizarse como marcas detectables. 10

[0020] Se describe un método diagnóstico para determinar que una persona tiene una anormalidad genética que predispone a esa persona, o a su descendencia, al trastorno del espectro autista, incluyendo el autismo, el trastorno de Asperger, o PDD-NOS, en donde dicha anormalidad genética se encuentra en el cromosoma 7. Dicho método incluye detectar, en esa persona, la existencia de un cambio en un segmento del 15 genoma, ese segmento se localiza dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en la SEC. ID. Nº: 1. El segmento incluye el gen humano EN2 que se localiza en el cromosoma 7 de la posición aproximada 154552000 a la posición aproximada de 154560000, la secuencia establecida de dicho segmento es la SEC. ID. Nº: 1. La persona diagnosticada puede no ser autista (es decir, puede no mostrar 20 ningún síntoma ni comportamiento autista). Sin embargo, si la persona diagnosticada tiene anormalidad genética que le predispone al autismo, entonces este diagnóstico significa que la persona diagnosticada podría tener niños con predisposición al autismo. La determinación puede realizarse antes de que nazca la persona, tan pronto como la fase de blastocito del desarrollo embrionario y hasta la fase fetal, o en 25 cualquier momento después de que nazca la persona. Es suficiente que la anormalidad se produzca en un cromosoma de una persona, es decir, la persona puede ser heterocigoto en cuanto a la anormalidad. También se describe un método para determinar si una persona tiene una anormalidad genética que le predisponga al trastorno del espectro autista, dicho método incluye: 30

examinar el cromosoma 7 de dicha persona y;

detectar, donde esté presente, la existencia de un cambio en un segmento del genoma localizado en dicho cromosoma 7,

en donde dicho segmento se establece en la SEC. ID. Nº.1.

[0021] El método diagnóstico incluye detectar cambios en el gen ENGRAILED 2 35 (EN2). Los cambios (o alelos variantes) son adiciones, deleciones o sustituciones de al

menos un nucleótido. Por ello, el método diagnóstico incluye detectar un cambio en una región del cromosoma 7 que abarca el gen EN2. En el contexto de esta aplicación, el gen EN2 significa la secuencia necesaria para la trascripción y la translación de tal forma que se generen niveles normales de la proteína EN2 funcional. La sustitución puede ser un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) localizado en la posición 5 154670848, y la sustitución puede consistir en una transición de guanina (G) a adenina (A). Alternativamente, la sustitución puede ser un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) localizado en la posición 154671000 y puede consistir en una transición de tiamina (T) a cistosina (C). Además, dado que las regiones regulatorias-cis necesarias para la expresión EN2 podrían estar, por ejemplo, tan lejos como a 1000 kb de la 10 secuencia de codificación del gen, el gen EN2 también significa una región en el cromosoma humano 7 de aproximadamente 154010087-155102101 pares bases y abarca la región de codificación EN2 (aproximadamente 8000 pares bases) y una secuencia flanqueadora.

[0022] Se describe un método diagnóstico útil para determinar que una persona tiene 15 una anormalidad genética que le predispone al trastorno del espectro autista. Dicho método incluye detectar en esa persona la existencia de una mutación en el gen EN2 de forma que tal mutación derive en la deleción, adición o sustitución de al menos un aminoácido en la proteína EN2.

[0023] Otro ejemplo del gen EN2 son los polimorfismos de nucleótido sencillo (SNPs) 20 que incluyen una región ampliable por la reacción en cadena de la polimerasa, en donde dicha región se amplía utilizando un par cebo, en donde un par cebo se selecciona a partir del grupo formado por las secuencias establecidas en las SEC. ID. Nºs: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

En consecuencia, se describe un método diagnóstico para determinar que una 25 persona tiene una anormalidad genética que predispone a dicha persona al autismo. Dicho método incluye detectar, en esa persona, la existencia de un cambio, es decir, una deleción, adición o sustitución en un segmento del genoma, la secuencia localizada dentro de la porción del cromosoma 7 indicado en la SEC ID Nº:1 (el gen EN2) y las porciones de ampliación de esa secuencia que contiene los SNPs aquí 30 identificados, utilizando pares cebo seleccionados del grupo formado por la secuencia establecida en las SEC. ID. Nº s: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

[0024] Las secuencias de cebo que flanquean en la trascripción de EN2 (es decir, la región codificadora) en el cromosoma 7 son:

[0025] rsl861972 35

Delantero externo - 5’TGAAGCTGGGGCCAGATGCTCCTA3' (SEC. ID Nº-3) y Trasero externo - 5’CATGGGGAAAGGGCAGAGGGAGGAG3’ (SEC. ID Nº:4) Delantero interno - 5’AGGCGAGGTCACCACTCCCTGCCAAG3’ (SEC. ID Nº; 5) y Trasero interno- 5’GGGGGAAGAAGGGGGCAAGGCAAT3’ (SEC. ID Nº: 6)

5

[0026] rs1861973

Delantero externo 5’GCCAGGGGGTTGAGCCTCTTAT3' (SEQ ID Nº: 7):

Trasero externo 5’CAGGTCCACTTCTGACCCTCCЗ’ (SEQ ID Nº: 8)

Delantero interno 5'GAAGGCCTTACAGCGACCCGGT3’ (SEQ ID Nº: 9) y:

Trasero interno 5'GACCTGCCCCAGGTTTTTGG3'(SEQ ID Nº: 10) 10

[0027] Dentro de esa región se encuentra la región codificadora del gen EN2. Uno o más polimorfismos de nucleótido sencillo (SNPs) en el gen EN2 son un indicador preferente de una predisposición al autismo. Dichos SNPs pueden producirse en cualquier parte del gen EN2 tal y como se define anteriormente. Alternativamente, una 15 deleción en la región codificadora afectaría la secuencia de la proteína expresada. Una deleción en la región no codificadora 5’ o 3’ afectaría los niveles de expresión o la estabilidad del ARN. Una deleción 5’ o 3’ de los exones que codificaron EN2 ARNm afectaría los niveles de expresión perturbando al promotor o a los potenciadores. Cualquiera de estas deleciones puede tener un impacto en el producto de expresión 20 del gen EN2 y, consecuentemente, provocar una predisposición al autismo.

[0028] Cualquier segmento eliminado de una o más bases en el tamaño es importante para el diagnóstico. En consecuencia, una deleción de un nucleótido sencillo es importante en términos de diagnóstico, en concreto esta u otra cualquier otra deleción 25 que cambie la función, actividad, o los niveles de expresión de la proteína EN2. La deleción puede ser tan grande como la deleción de todo el gen en2, o cualquier porción del mismo.

[0029] Se describen otros cambios (referidos a mutaciones generales, pero que incluyen cualquier diferencia posible en la secuencia del gen salvaje) en el gen en2 30 como se define anteriormente. Además de las deleciones tal y como se indica anteriormente, estos cambios pueden incluir añadidos o sustituciones (lo que quiere decir la sustitución de un nucleótido dado o aminoácido por otro nucleótido o aminoácido). El tamaño o extensión de la adición o sustitución puede ser un nucleótido, a cualquier tamaño o extensión que cambie o interrumpa la expresión EN2 35 como se describe anteriormente. Pueden producirse uno, dos o tres cambios o

mutaciones en un individuo. Las mutaciones o cambios particulares de interés son aquellos que alteran la función, actividad o niveles de expresión de la proteína EN2. Estas adiciones o sustituciones pueden encontrarse en la región codificadora y, por tanto, afectarían a la proteína EN2 tal y como se describe inmediatamente abajo. Las adiciones o sustituciones también pueden encontrarse en la región no codificadora 5’ o 5 3’ en los intrones y, en consecuencia, afectarían a la expresión de la proteína de forma equivalente al efecto de las deleciones en estas regiones tal y como se describe inmediatamente antes. Las adiciones o sustituciones en zonas abarcadas por los pares de secuencia indicados anteriormente son de un interés especial. En consecuencia, se describe un método diagnóstico para determinar que una persona 10 tiene una anormalidad genética que predispone a esa persona al autismo. Dicho método incluye detectar, en esa persona, la existencia de una adición o deleción de al menos un nucleótido a un segmento del genoma, ese segmento localizado dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en la SEC. ID. No. 1. Dichos cambios (es decir, deleciones, adiciones o sustituciones) afectan a la función de EN2, 15 dado que ocurren en algunos segmentos del gen en2.

[0030] Además, de especial interés son los métodos diagnósticos donde los cambios (deleciones, adiciones o sustituciones) se detectan dentro de la porción del cromosoma 7, en un intrón o en un segmento de un gen en2 definido por las secuencias seleccionadas del grupo formado por la SEC. ID. Nº 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. 20

[0031] Se describe la detección de una mutación en un exón en una región cromosómica o segmento especificado anteriormente, siempre que la mutación resulte en un cambio en un aminoácido en la proteína que se ha codificado. Por tanto, detectar la existencia de una mutación en el gen en2 de tal forma que la mutación resulte en la deleción, adición o sustitución de al menos un aminoácido en la proteína 25 EN2.

[0032] Se describe la detección de las deleciones o mutaciones en las proteínas codificadas por los segmentos especificados anteriormente, especialmente en la proteína EN2 (SEC. ID. Nº 2). Por tanto, se describe detectar un cambio con respecto a al menos un aminoácido en, por ejemplo, la proteína EN2 cuyo cambio puede tener 30 una o más adiciones, deleciones o sustituciones o una combinación de ellos (la proteína en cuestión mantiene su identidad en virtud de estar codificada por el locus que codifica dicha proteína, por ejemplo, incluso si hay múltiples cambios en la proteína EN2, aún se considera la proteína EN2 en el contexto de esta invención tal y como está codificada por el gen en2). 35

[0033] Se describe un diagnóstico para determinar la susceptibilidad de un sujeto al autismo o a un trastorno relacionado, que incluye medir: la presencia o ausencia del alelo A de rs1861972 y/o la presencia o ausencia del alelo C de rs1861973.

[0034] Un método diagnóstico que incluye detectar, en el tejido o células de una persona, un aumento o descenso en el nivel de ARN normal (ARNm y/o ARNhn) 5 transcrito de una región de la SEC. ID. No: 1, por ejemplo se describen aquéllos segmentos especificados por las secuencias establecidas anteriormente. Por ARN normal se entiende un ARN que codifica una proteína que no tiene una adición, deleción, proteína salvaje, en particular aquélla que codifica tal proteína que está en una proteína EN2. Por tanto, el método diagnóstico puede incluir detectar ARN 10 anormal, que significa que el ARN es más largo que el ARN normal (es decir, tiene al menos una adición), más corto que un ARN normal (es decir, tiene al menos una deleción) o es diferente al ARN normal (es decir, tiene al menos una sustitución o tiene un número igual de deleciones y adiciones).

[0035] Un ejemplo son los métodos para diagnosticar el autismo y/o el trastorno de 15 Asperger y/o PDD-NOS y enfermedades clínicas relacionadas. Esto incluye el uso de genes o productos genéticos identificados por los métodos aquí descritos, incluyendo, pero no limitados a aquéllos genes y productos genéticos identificados a través del uso de un modelo mamífero de autismo. En un ejemplo preferente, el gen útil para diagnosticar el autismo, el trastorno de Asperger o el PDD-NOS y otras enfermedades 20 relacionadas, incluyen el gen identificado en el ácido nucleico de la SEC. ID. Nº. 1 (EN2).

[0036] Otro ejemplo incluye el uso de productos genéticos, en concreto, la proteína identificada por métodos aquí descritos, incluyendo, pero no limitándose, al producto genético identificado como la proteína de SEC. ID. Nº: 2. 25

[0037] Se describe un método para determinar si un sujeto corre el riesgo de desarrollar autismo y/o el trastorno de Aperger y/o PDD-NOS. Dicho método incluye:

(I) medir una cantidad del gen EN2 o del producto genético en una muestra de tejido derivado del sujeto, en donde dicho gen o producto genético es:

(a) un ADN correspondiente a la SEC. ID. Nº: 1, o un ácido nucleico derivado de él; 30

(b) una proteína que incluya la SEC. ID. Nº: 2 ;

(c) Un ácido nucleico que incluya una secuencia hibridizable a la SEC. ID. Nº: 1 o su complemento en condiciones de alta estringencia, o una proteína que incluya una secuencia codificada por dicha secuencia hibridizable;

(d) un ácido nucleico al menos un 90% homólogo a la SEC. ID. Nº:1, o su complemento tal y como se determina utilizando el algoritmo NBLAST; o una proteína codificada de ahí; y

(II) comparar la cantidad de dicho producto genético en el sujeto con la cantidad de producto genético presente en una muestra de tejido normal (tomada de un individuo 5 no autista) o un estándar predeterminado para una muestra de tejido normal, en donde una elevada cantidad de dicho producto genético en el sujeto comparado con la cantidad en la muestra de tejido normal o estándar predeterminado para una muestra de tejido normal indica un riesgo de desarrollar autismo y/o el trastorno de Asperger y/o PDD-NOS en el sujeto. 10

[0038] Otro ejemplo es un método de análisis, diagnóstico o pronóstico de AS seleccionado del grupo formado por autismo, el trastorno de Asperger y PDD-NOS. Dicho método incluye:

(I) medir una cantidad del gen EN2 o del producto genético en una muestra de tejido derivado del sujeto, en donde dicho gen o producto genético es: 15

(a) un ADN correspondiente a la SEC. ID. Nº: 1, o un ácido nucleico derivado de ahí;

(b) una proteína que incluya la SEC. ID. Nº: 2;

(c) un ácido nucleico que incluya una secuencia hibridizable a la SEC. ID. Nº: 1 o su complemento en condiciones de una alta estringencia, o una proteína que incluye una 20 secuencia codificada por dicha secuencia hibridizable;

(d) un ácido nucleico al menos un 90% homólogo a la SEC. ID. Nº 1, o su complemento según se determinó utilizando el algoritmo NBLAST; o una proteína codificada de ahí; y

(II) comparar la cantidad de dicho producto genético en el sujeto con la cantidad del 25 producto genético EN2 presente en una muestra de tejido no autista o estándar predeterminado para una muestra de tejido no autista, en donde una elevada cantidad de dicho producto genético EN2 en el sujeto comparado con la cantidad en la muestra de tejido no autista o estándar predeterminado para una muestra de tejido no autista indica un riesgo de desarrollar autismo o el trastorno de Asperger y/o PDD-NOS en el 30 sujeto.

[0039] En otro ejemplo, el método diagnóstico incluye detectar, en el tejido o células de una persona, un aumento o descenso en el nivel de proteína normal EN2, por ejemplo, la proteína codificada por una región del cromosoma 7 establecido en la SEC. ID. Nº: 1, en concreto, un segmento o región especificado anteriormente, por ejemplo 35 aquéllos segmentos especificados por las secuencias establecidas anteriormente. Por

proteína normal se entiende una proteína que no tiene una adición, deleción o sustitución, una proteína salvaje, en concreto una proteína EN2. Por tanto, el método diagnóstico puede incluir detectar una proteína anormal, que significa una proteína que es más larga que la proteína normal (es decir, que tiene al menos una adición), es más corta que la proteína normal (es decir, tiene al menos una deleción) o diferente a la 5 proteína normal (es decir, tiene al menos una sustitución o tiene un número igual de deleciones y adiciones).

[0040] Una sobreexpresión de la proteína EN2 también puede indicar autismo o predisposición al autismo. En consecuencia, el método diagnóstico puede incluir detectar, en tejidos o células de una persona, un nivel incrementado del ARN normal 10 transcrito de una región del cromosoma 7 establecido en la SEC. ID. Nº:1, en un segmento concreto o región, por ejemplo, aquellos segmentos especificados por las secuencias establecidas anteriormente.

[0041] En un ensayo relacionado basado en la proteína, el método diagnóstico incluye detectar, en el tejido o en células de una persona, un nivel incrementado de la proteína 15 EN2 normal, por ejemplo, la proteína codificada por una región del cromosoma 7 establecido en la SEC. ID. Nº 1, un segmento concreto o región, por ejemplo, aquellos segmentos especificados por las secuencias establecidas anteriormente.

[0042] Por niveles aumentados o reducidos de ARN o proteínas se entienden los niveles que difieren de los niveles encontrados en una persona normal sin 20 predisposición al autismo. En consecuencia, el nivel normal de ARN o la proteína pueden determinarse midiendo los niveles de ARN o niveles de proteína de la muestra suficientemente grande de la población normal (aproximadamente N= 100 o mayor). Dado que habrá cierta cantidad de variabilidad, los análisis estadísticos convencionales pueden utilizarse para establecer un medio del nivel normal del ARN o 25 la proteína. Un nivel aumentado de ARN o proteína es un nivel que es significativamente mayor que el nivel medio normal por los análisis estadísticos. Un nivel disminuido de ARN o proteína es un nivel que es significativamente más bajo que el nivel medio normal por los análisis estadísticos. Por ejemplo, un nivel del 10% superior o inferior a lo normal puede considerarse un nivel aumentado o disminuido de 30 ARN o de proteína.

[0043] Se describe un kit de diagnóstico, que incluye una sonda de hibridación del ácido nucleico específica para parte o toda la región del gen que codifica en2 o un segmento del mismo. De forma alternativa, el kit incluye cebos PCR que pueden utilizarse para ampliar parte de un cromosoma que caiga en una región así 35

especificada (por ejemplo, el cromosoma 7). En concreto, tales kits contienen los cebos PCR especificados anteriormente, emparejados adecuadamente.

El kit puede ser basado en la proteína que incluya una sonda anticuerpos específica para toda la proteína EN2 o parte de la misma.

[0044] Se describe un anticuerpo que reconoce y se vincula a la secuencia del 5 aminoácido SEC. ID. Nº: 2, codificado por la secuencia del ácido nucleico EN2 normal y/ la secuencia del ácido nucleico de SEC ID Nº: 1, que contiene el alelo A de rs1861972 localizado en la posición 154670848 y/o el alelo C de rs1861976 localizado en la posición 154671000 de la SEC. ID. Nº: 1, sus variantes conservadoras, sus fragmentos o análogos o derivados, como un inmunógeno. Dicho anticuerpo puede ser 10 policlonal, monoclonal, de cadena sencilla o quimérico. Pueden ser de humanos, de ratones, ratas, conejos, cabras, caballos, ovejas o pueden obtenerse de otros animales no humanos. Además, un anticuerpo con un EN2 humano como un inmunógeno puede etiquetarse de forma que pueda detectarse. Como se explicó anteriormente, los ejemplos de las etiquetas detectables incluyen, pero ciertamente 15 no están limitadas a, los isótopos radioactivos como 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re por nombrar algunos. Los productos químicos cuya fluorescencia, o enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidada de rábano, también pueden utilizarse como etiquetas detectables. Estos anticuerpos pueden utilizarse para fines de diagnósticos o terapéuticos. 20

[0045] Se describe un método para tratar a un sujeto con autismo o un trastorno relacionado con el autismo como el de Asperger o PPD-NOS o una persona con predisposición a un trastorno del desarrollo (especialmente autismo), el método incluye administrar un gen o una proteína a la persona. El método para tratar al sujeto puede incluir el paso de introducir una molécula de ADN que codifique un polipéptido 25 normalmente codificado (por ejemplo, pacientes no autistas) por un gen localizado en la región del cromosoma 7 establecido en la SEC. ID. Nº: 1. El polipéptido puede ser la proteína EN2 y el trastorno puede ser autismo.

[0046] La molécula de ADN puede introducirse en una célula y la célula administrada a la persona (postnatal o prenatal). La célula puede, por ejemplo, ser una célula madre. 30 La célula madre en la que se introduce la molécula de ADN para fines terapéuticos es preferiblemente una célula madre aislada de la persona que recibirá la célula madre que contenga la molécula de ADN que codifica la proteína EN2. La célula madre puede, por ejemplo, obtenerse de la médula ósea de esa persona. Alternativamente, la célula madre puede obtenerse de otra persona. Una alternativa adicional es que la 35 célula madre se obtenga de un animal, especialmente un mamífero.

[0047] El proceso terapéutico puede incluir el paso de introducir la proteína EN2 en una persona.

[0048] El proceso terapéutico también incluye el paso de administrar un fármaco a una persona para normalizar (es decir aumentar o reducir a niveles normales) el nivel de la proteína EN2 en un tejido en dicha persona. 5

[0049] El proceso terapéutico también puede incluir el paso de administrar un fármaco para normalizar (es decir, aumentar o reducir a niveles normales) el nivel de genes que se activan por medio de la proteína EN2.

[0050] Cualquiera de estos procesos terapéuticos puede utilizarse en particular para tratar el autismo o una predisposición al autismo o un trastorno relacionado con el 10 autismo, como el de Asperger o PDD-NOS.

[0051] Se describen las composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de los genes o productos genéticos, incluyendo pero no limitándose, al ácido nucleico con la SEC. ID. Nº: 1 o la proteína de la SEC. ID. Nº:2, con un portador farmacéuticamente aceptable para proporcionarla a un individuo que 15 necesite dicha terapia. Se incluyen los agonistas o antagonistas del gen o productos genéticos aquí identificados. Dichos agonistas o antagonistas pueden ser pequeñas moléculas orgánicas sintéticas, proteínas, péptidos, polipéptidos o anticuerpos. Además, se describe una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que module la expresión y/o actividad del gen EN2 o productos genéticos y un portador 20 farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden liberarse por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intracraneal. Pueden ser en forma de comprimidos, cápsulas, suspensiones, supositorios o en una forma líquida idónea para la liberación intravenosa.

25

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0053] Figura 1. Secuencia de ADN que codifica el EN2 humano

[0054] Figura 2. Secuencia de proteína para el EN2 humano.

[0055] Figura 3. Cebos delantero y trasero para rs1861972 y rs1861973

[0056] Figura 4. Secuencias de ADN para SNP Nos, rs1861972 y rs1861973 30

[0057] Figura 5. Representación esquemática del gen ENGRAILED 2 humano.

[0058] Figura 6. Ilustración esquemática de valores de desequilibrio del enlace intermarcador.

35

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0059] Antes de describir los presentes métodos y la metodología del tratamiento, hay que entender que esta invención no está limitada a métodos concretos y a las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También hay que entender que la terminología aquí utilizada es para fines de 5 describir sólo realizaciones concretas, y no está concebida para ser limitadora, dado que el ámbito de la presente invención estará limitado sólo en las reivindicaciones anexas.

[0060] Tal y como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de ―un/una‖ y ―el/la‖ incluyen las referencias en plural a menos 10 que el contexto indique lo contrario. Por ello, por ejemplo, las referencias ―al método‖ incluyen uno o más métodos, y/o pasos del tipo aquí descrito y/o que resultarán aparentes a aquellas personas expertas en la materia en lo relativo a esta publicación y otras.

[0061] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos 15 utilizados aquí tienen el mismo significado tal y como lo entendería comúnmente un experto en la materia al cual pertenezca esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la invención, los métodos preferentes y materiales se describen ahora.

20

Definiciones

[0062] Los términos que aquí se emplean tienen los significados reconocidos y conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, por comodidad y para que sea más completo, más abajo se definen algunos términos concretos y sus definiciones.

[0063] ―Tratamiento‖ se refiere a la administración de la medicina o el resultado de los 25 procedimientos médicos respecto a un paciente, para cualquier profilaxis (prevención) o para curar la enfermedad en los casos donde el paciente esté afectado.

[0064] Una ―cantidad terapéuticamente efectiva‖ es una cantidad suficiente para reducir o evitar los síntomas asociados con el autismo asociado con la presencia de al menos un de los SNPs identificados en la presente invención. 30

[0065] El término ―anticuerpo‖ tal y como aquí se emplea, incluye moléculas intactas y también sus fragmentos, tales como Fab y F(ab’)2, que son capaces de vincular el determinante epitópico. Los anticuerpos que vinculan EN2 pueden prepararse utilizando polipéptidos intactos o fragmentos que contengan pequeños péptidos de interés como el antígeno inmunizador unido a la molécula portadora. Los portadores 35 utilizados comúnmente que están químicamente acoplados a los péptidos incluyen la

albúmina de suero bovino y la tiroglobulina. El péptido acoplado se utiliza entonces para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, rata o conejo).

[0066] ―Producto genético‖ tal y como aquí se emplea, a menos que se indique de otro modo, es una proteína o polipéptido codificado por las secuencias de ácido nucleico identificadas por los métodos aquí descritos, incluyendo, pero no limitándose a la SEC. 5 ID. Nº: 1; un ácido nucleico que incluye una secuencia hibridizable a la SEC. ID. Nº: 1 o su complemento en condiciones de alta estringencia, o una proteína que incluya una secuencia codificada por dicha secuencia hibridizable; un ácido nucleico al menos un 90% homólogo para la SEC. ID. Nº: 1 o su complemento tal y como se determina utilizando el algoritmo NBLAST; un ácido nucleico al menos un 90% homólogo a SEC. 10 ID. Nº: 1 o un fragmento o derivado de cualquiera de las proteínas anteriores o ácidos nucleicos.

[0067] Un ―variante‖ (v) de polinucleótidos o polipéptidos, tal y como aquí se utiliza el término, son polinucleótidos o polipéptidos que son diferentes de un polinucleótido o un polipéptido de referencia, respectivamente. Los polinucleótidos variantes están 15 limitados generalmente, de manera que la secuencia nucleótida de referencia y el variante estén íntimamente relacionados en general y, en muchas regiones, sean idénticos. Los cambios en la secuencia nucleótida del variante puede ser silente. Por ello, puede no alterar la secuencia del aminoácido codificado por el polinucleótido. En los casos donde las alteraciones se limiten a los cambios silentes de este tipo, un 20 variante codificará un polipéptido con la misma secuencia de aminoácido que la referencia. Sin embargo, los variantes silentes pueden afectar los niveles proteicos por el uso del codón. Por tanto, en esta situación particular, los diferentes ARNst pueden variar abundantemente de forma que incluso si el cambio es silente, aún así puede ser funcionalmente importante. Alternativamente, los cambios en la secuencia nucleótida 25 del variante puede alterar la secuencia del aminoácido de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Dichos cambios de nucleótido pueden resultar en las sustituciones de amino ácidos, adiciones, deleciones, fusiones y truncamiento en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Los polipéptidos variantes se limitan generalmente de manera que las secuencias de la referencia y el variante son 30 los que generalmente sean íntimamente similares y, en muchas regiones, idénticos.

Por ejemplo, un polipéptido de referencia y variante puede diferir en una secuencia de aminoácido por una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos que pueden estar presentes o ausentes en cualquier combinación. Tales variantes pueden diferir en su composición de aminoácido (por ejemplo, como 35 resultado de una variación natural o alelica en la secuencia del aminoácido, por

ejemplo, como resultado de un ARNm alternativo o un proceso de pre-ARNm, por ejemplo, ensamblado alternativo o proteolisis limitada) y, además, o como alternativa, puede surgir de la modificación post-translacional diferencial (por ejemplo, glicosilación, acilación, fosforilación, isoprenilación, lipidación).

[0068] ―Análogo‖ tal y como aquí se emplea, se refiere a un nucleótido, una proteína o 5 un polipéptido que posee una actividad similar o idéntica o funciones a las de un nucleótido, proteína o polipéptido con una actividad deseada y un efecto terapéutico de la presente invención (por ejemplo, método diagnóstico para determinar la predisposición, el comienzo o presencia del trastorno del espectro autista en un mamífero), pero la necesidad no incluye necesariamente una secuencia que sea 10 similar o idéntica a la secuencia de la realización preferente, tal como la SEC. ID. Nos: 1 y 2, o posee una estructura que sea similar o idéntica a la de las SEC. ID. Nºs: 1 y 2. Tal y como aquí se emplea, un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido es ―similar‖ a la de dicho ácido nucleico, nucleótido o proteína o polipéptido que tiene la actividad deseada si 15 cumple al menos uno de los siguientes criterios: (a) el ácido nucleico, el nucleótido, la proteína o el polipéptido tiene una secuencia que es al menos un 30% (más preferiblemente, al menos 35%, 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99%) idéntica al ácido nucleico, 20 nucleótido, proteína o secuencias de polipéptidos que tienen la actividad deseada tal y como aquí se describe (b) el polipléptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones estringentes a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 5 residuos de aminoácidos (más preferentemente, al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 15 residuos de aminoácidos, al menos 25 20 residuos de aminoácidos, al menos 25 residuos de aminoácidos, al menos 40 residuos de aminoácidos, al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 60 residuos de amino, al menos 70 residuos de aminoácidos, al menos 80 residuos de aminoácidos, al menos 90 residuos de aminoácidos, al menos 100 residuos de aminoácidos, al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de 30 aminoácidos) del AAPI; o (c) el polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 30% (más preferentemente, al menos 35%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99%) idéntico a la secuencia de nucleótido que codifica los polipéptidos de la presente invención con el 35 efecto terapéutico deseado. Tal y como aquí se emplea, un polipéptido con una

―estructura similar‖ a la de las realizaciones preferentes de la invención se refiere a un polipéptido que es una estructura similar secundaria, terciaria o cuartanaria como la de la realización preferente (por ejemplo SEC. ID. Nº:2). La estructura de un polipéptido puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo pero no limitándose a la cristalografía por rayos X, resonancia magnética nuclear y 5 microscopia de electrón cristalográfico.

[0069] ―Derivado‖ se refiere a cualquier proteína o polipéptido que incluye una secuencia de amino ácido de una proteína básica o polipéptido que se ha alterado por la introducción de sustituciones de residuos de aminoácidos, deleciones o adiciones o un ácido nucleico o nucleótido que ha sido modificado por la introducción de 10 sustituciones o deleciones de nucleótidos, adiciones o mutaciones. El ácido nucleico, nucleótido, proteína o polipéptido derivado posee una función similar o idéntica que el polipéptido base.

[0070] ―Fragmento‖ se refiere o bien a una proteína o polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos (preferentemente, 15 al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 15 residuos de aminoácidos, al menos 20 residuos de aminoácidos, al menos 25 residuos de aminoácidos, al menos 40 residuos de aminoácidos, al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 60 residuos de aminoácidos, al menos 70 residuos de aminoácidos, al menos 80 residuos de aminoácidos, al menos 90 residuos de aminoácidos, al menos 100 residuos de 20 aminoácidos, al menos 125 residuos de aminoácidos, al menos 150 residuos de aminoácidos, al menos 175 residuos de aminoácidos, al menos 200 residuos de aminoácidos, o al menos 250 residuos de aminoácidos) de la secuencia de aminoácidos de una proteína base o polipéptido, o un ácido nucleico que incluya una secuencia nucleótida de la menos 10 pares base (preferentemente al menos 20 pares 25 base, al menos 30 pares base, al menos 40 pares base, al menos 50 pares base, al menos 50 pares base, al menos 100 pares base, al menos 200 pares base) de la secuencia nucleótida del ácido nucleico base. Cualquier fragmento dado puede poseer o no una actividad funcional del ácido nucleico base o una proteína o un polipéptido.

[0071] ―Modular‖ tal y como aquí se utiliza, se refiere a un compuesto o agente 30 (incluyendo, pero no limitándose a, proteínas, polipéptidos o fragmentos de ahí derivados, nucleótidos, fragmentos de ácido nucleico, compuestos orgánicos sintéticos, anticuerpos) que son capaces de aumentar o disminuir el nivel y/o actividad de un gen o producto genético identificado por los métodos que aquí se describen. Dichos genes o productos genéticos tienen un efecto beneficioso en el tratamiento del 35 autismo y/o el trastorno de Asperger y/o PDD-NOS. Los expertos en la materia,

basándose en la presente descripción, entenderán que tal modulación puede estar determinada por ensayos y técnicas conocidas para los expertos en la materia, incluyendo como aquí se describe en más detalle.

[0072] ―Diagnóstico‖ se refiere al diagnóstico, pronóstico, seguimiento, caracterización, seleccionar pacientes, incluyendo los participantes en ensayos clínicos e identificar 5 pacientes con riesgo de o que tienen un trastorno concreto o un caso clínico o aquellos con más posibilidad de responder a un tratamiento terapéutico concreto o para valorar o hacer un seguimiento de la respuesta de un paciente a un tratamiento terapéutico concreto.

[0073] Tal y como aquí se emplea ―detectar una secuencia de ácido nucleico diana‖ se 10 refiere a determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra o determinar la cantidad de una secuencia concreta de ácido nucleico diana en una muestra como una indicación de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. La cantidad de una secuencia de ácido nucleico diana que puede medirse o detectarse es preferentemente de 1 molécula a 1020 moléculas, 15 más preferentemente unas 100 moléculas a 1017 moléculas y más preferentemente aproximadamente unas 1000 moléculas a 1014 moléculas. Preferentemente, hay una correlación directa entre la cantidad de la secuencia de ácido nucleico diana y la señal generada por el ácido nucleico detectado.

[0074] Tal y como aquí se emplea, un ―cebo oligonucleótido‖ se refiere a un ADN de 20 cadena sencilla o una molécula de ARN que es hibridizable (por ejemplo, capaz de templar) a una plantilla de ácido nucleico y es capaz de preparar la síntesis enzimática de una segunda hebra de ácido nucleico.

Alternativamente, o además de, los cebos oligonucleótidos, cuando se etiquetan directa o indirectamente (por ejemplo, vinculados a una sonda secundaria etiquetada) 25 que es específica para el primer oligonucleótido) puede utilizarse efectivamente como sondas para detectar la presencia de una ácido nucleico en una muestra. Los cebos oligonucleótidos, útiles aquí, se encuentran entre aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos en longitud, preferentemente aproximadamente de 17-50 nucleótidos de longitud y más preferentemente aproximadamente de 17-40 nucleótidos de largo y 30 más preferentemente aproximadamente de 17-30 nucleótidos de longitud. Las sondas de oligonucleótidos útiles para la formación de la estructura de clivaje están entre aproximadamente 17-40 nucleótidos de longitud, preferentemente aproximadamente 17-30 nucleótidos de longitud y más preferentemente aproximadamente 17-25 nucleótidos de longitud. El término ―cebo‖ puede referirse a más de un cebo y, 35 generalmente, se refiere a un oligonucleótido, ya se produzca de forma natural, como

un compendio de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ADN cuando se templa a una plantilla de ácido nucleico y se sitúa en condiciones donde la síntesis de un producto de extensión de cebo complementario a la plantilla se cataliza. Dichas condiciones incluyen la presencia de cuatro triofosfatos de desoxirribonucleasa diferentes y un 5 agente inductor de polimerización como la ADN polimerasa o transcriptasa inversa, en un tampón adecuado (―tampón‖ incluye sustituyentes que son cofactores o que afectan al pH, fuerza iónica, etc) y a una temperatura adecuada. El cebo es preferentemente de hebra sencilla para una eficacia máxima en la ampliación.

[0075] Tal y como aquí se emplea, ―ampliar‖ se refiere a la generación de copias 10 adicionales de una secuencia del ácido nucleico. Se ha desarrollado una variedad de métodos para ampliar las secuencias del ácido nucleico, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La ampliación de la PCR de una secuencia de ácido nucleico resulta generalmente en la ampliación exponencial de una secuencia de ácido nucleico y los fragmentos derivados. Una molécula de ácido nucleico ―ampliada‖ (o 15 porción de la misma) se refiere al hecho de que se hayan realizado múltiples copias de esa molécula o una molécula de una secuencia con base molecular.

[0076] Por ―homólogo‖ se entiende un ácido nucleico con el mismo sentido que posee un nivel de similitud con el ácido nucleico diana dentro de la razón y de los estándares conocidos y aceptados en la materia. Con respecto al PCR, el término ―homólogo‖ 20 puede utilizarse para referirse a una ampliación que muestra un alto nivel de similitud de ácido nucleico a otro ácido nucleico, por ejemplo, la plantilla de ADNc. Tal y como se entiende en la materia, la trascripción enzimática tiene tasas de error medibles y bien conocidas (según la enzima específica utilizada), por ello, dentro de los límites de la precisión transcripcional, se utilizan los modos aquí descritos, donde un profesional 25 con experiencia entendería que la fidelidad de la síntesis de la hebra complementaria enzimática no es absoluta y que el ácido nucleico ampliado (por ejemplo amplicon) no tiene que ser completamente idéntico en cada nucleótido a la plantilla del ácido nucleico.

[0077] ―Complementario‖ se entiende en su significado reconocido como identificar un 30

nucleótido en una secuencia que hibridiza (templa) a un nucleótido en otra secuencia según la regla A—>T, U y C—>G (y viceversa) y, por tanto ―coincide‖ con su socio para los fines de esta definición. La transcripción enzimática tiene tasas de error medibles y bien conocidas (según el uso específico de la enzima), por eso, dentro de los límites de la precisión transcripcional que utiliza los modos aquí descritos, donde 35 un profesional con experiencia entendería que la fidelidad de la síntesis de la hebra

complementaria enzimática no es absoluta y que el amplicon no necesita coincidir completamente en cada nucleótido con el la plantilla diana de ARN.

[0078] Tal y como aquí se emplea, los términos ―ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebos, sondas y fragmentos de oligómeros a detectar y serán genéricos a los polideoxirribonucleótidos (que contienen 2-deoxi-D-ribosa), a 5 polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y a cualquier tipo de polinucleótido que es un glucósido N de una purina o base pirimidina, o unas bases de pirimidina o purina modificada (incluyendo los emplazamientos básicos). No existe una distinción concebida entre el término "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" y estos términos se utilizarán de manera intercambiable. Estos términos se refieren solo a la 10 estructura primaria de la molécula. Por ello, estos términos incluyen ADN de hebra sencilla y doble, y también ARN de hebra doble y sencilla.

[0079] La técnica de la ―reacción en cadena de la polimerasa (PCR)‖ se muestra en las Patentes U.S. Números 4.683.202, 4.683.195 y 4.800.159. En su forma más simple, la PCR es un método in Vitro para la síntesis enzimática de las secuencias 15 específicas de ADN, utilizando dos cebos oligonucleótidos que hibridizan a hebras opuestas y flanquean la región de interés en el ADN diana. Un serie repetitiva de pasos de reacción que implican la desnaturalización de la plantilla, templando el cebo y la extensión de los cebos templados por la polimerasa del ADN resulta en la acumulación exponencial de un fragmento específico (es decir, un amplicon), cuyos 20 términos están definidos por los extremos 5' de los cebos. Se indica que PCR es capaz de producir un enriquecimiento selectivo de una secuencia de ADN específico por medio de un factor de 109. El método de PCR también se describe en Saiki et al. 1985, Science, 230:1350.

[0080] Tal y como aquí se emplea, el término "sonda" se refiere a un cebo etiquetado 25 de oligonucleótido que forma una estructura duplex con una secuencia en un ácido nucleico diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en la región diana. Dichas secuencias son útiles para la identificación de una secuencia de ácido nucleico diana para EN2.

Los pares de los cebos de ADN de hebra sencilla pueden templarse a las secuencias 30 dentro de una secuencia de ácido nucleico diana o pueden utilizarse como cebo para la síntesis del ADN de una secuencia de ácido nucleico diana.

[0081] Por ―anormalidad genética‖ se entiende cualquier cambio en una secuencia de ácido nucleico que puede predisponer a una persona al autismo, o al trastorno de Asperger o PDD-NOS. El cambio se determina utilizando técnicas estándar en la 35 materia y se hace una comparación con una secuencia conocida obtenida de un

individuo normal conocido por no tener autismo ni Asperger ni PDD-NOS. Dichos cambios pueden incluir mutaciones y pueden ser deleciones, adiciones o sustituciones en al menos un par base de la secuencia.

[0082] kD significa kilodalton.

[0083] Degenerado de código significa que la base de un codón se cambia sin cambiar 5 el aminoácido que codifica el codón.

[0084] Una ―secuencia codificadora‖ o una ―región codificadora‖ de un ácido nucleico para una proteína designada se refiere a una región en una molécula de ARNm que contiene la secuencia base que se traduce en una secuencia de aminoácidos (es decir, que codifica esa secuencia de aminoácido), cubre cualquier secuencia de ADN 10 que es la misma que dicha secuencia de ARNm (salvo que T se utiliza en lugar de U) y, en el caso de una secuencia de ADN que alternan intrones con exones, de forma que la secuencia puede procesarse para crear una molécula de ARNm, ―secuencia codificadora‖ o ―región codificadora‖ que cubre las poblaciones de exones codificadores que determinan la región codificadora del aminoácido de la molécula del 15 ARNm (es decir, que codifica esa secuencia de aminoácido).

[0085] Por medio de ejemplo y sin limitación, los procedimientos que utilizan tales condiciones de estringencia son los siguientes (ver también Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792). Los filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 h a 40ºC en una solución que contiene el 35% de formamida, 20 5X SSC, 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.1% de PVP, 0.1% Ficoll, 1% de BSA y 500µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.

Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.02% de BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, y se utiliza una sonda de 25 5-20 x 106 cpm etiquetado 32P. Los filtros se incuban en una mezcla de hibridación durante 18-20 h a 40º C y luego se lavan durante 1.5 h a 55º C en una solución que contiene 2x SSC, 25mM Tris-HC1(pH 7.4), 5 mM EDTA y 0.1% SDS. La solución de lavado se sustituye con una solución fresca y se incuba una 1.5 h adicional a 60ºC. Los filtros se secan y se exponen para una autorradiografía. Si es necesario, los filtros 30 se lavan una tercera vez a 65-68ºC y vuelven a exponerse a la película. Para los expertos en la materia existen otras condiciones de baja estringencia que puede utilizarse (por ejemplo, tal y como se emplea para hibridaciones de especies cruzadas).

[0086] Los procedimientos que utilizan tales condiciones de estringencia moderada 35 son los siguientes: los filtros que incluyen ADN inmovilizado se tratan previamente

durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene 6X SSC, 5X de solución de Denhart, 0.5% SDS y 100µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se realizan en la misma solución con una sonda de 5-20 x 106 cpm etiquetada con 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55ºC y luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución 5 que contenga 1X SSC y 0.1% SDS. Los filtros se secan y se exponen para la autorradiografía. El lavado de los filtros se hace a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, 0.1% de SDS. En la materia se conocen otras condiciones de la estringencia moderada que puede utilizarse (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Cold Spring Harbor, New York; Ver también, Ausubel et al., eds., en el Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols© 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

[0087] Los procedimientos que utilizan tales condiciones de alta estringencia son los siguientes. La prehibridización de filtros que contienen ADN se realizan durante 8 h. 15 hasta por la noche a 65ºC en un tampón compuesto de 6X SSC, 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.02% de BSA y 500µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridizan durante 48 h a 65ºC en una mezcla de prehibridización que contiene 100µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y una sonda de 5-20 x 610 cpm marcada con 32P. El lavado de 20 los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, 0.01% de PVP, 0.01% de Ficoll y 0.01% de BSA. Esto es seguido por un lavado en 0.01 X SSC a 50ºC durante 45 min. antes de la autorradiografía. Otras condiciones de alta estringencia que pueden utilizarse son bien conocidas en la materia.

[0088] Una secuencia con base ARN (o molécula) es equivalente a una secuencia con 25 base ADN (o molécula) si son idénticas salvo que U en la secuencia base ARN sustituyó a T en la secuencia base de ADN.

[0089] Los siguientes códigos de una letra se emplean para representar aminoácidos: S-serina, T-treonina, N-asparagina, Q-glutamina, K-lisina, R-arginina, H-histidina, E-ácido glutámico, D-ácido aspártico, C-cistina, G-glicina, P-prolina, A-alanina, I-30 isoleucina, L-leucina, M-metionina, F-fenilalanina, W-triptófano, V-valina, Y-tirosina, X-cualquier aminoácido.

[0090] Los siguientes códigos de una letra se utilizan para representar los ácidos nucleicos: A-adenina, C-citosina, G-guanina, T-timidina, R representa A o G, Y representa T o C, N representa a cualquier ácido nucleico. 35

[0091] Un ácido nucleico EN2 o proteína indicada en este documento es humano a menos que se indique otra cosa.

[0092] Una región cromosómica está abarcada por dos secuencias si una secuencia se encuentra en un extremo de la región y la otra secuencia está en el otro extremo de la región. 5

[0093] Una proteína EN2 incluye cualquier proteína o fragmento codificado por el gen EN2, incluyendo cualquier segmento, región o exón.

Descripción general

[0095] Los trastornos del autismo y espectro autista aliado (AS) presentan numerosas 10 anormalidades clínicas, bioquímicas y de comportamiento. Varios estudios han demostrado que AS tiene una base genética. Los estudios de familias han determinado que hay 75 veces más de posibilidades de hermanos que hereden el trastorno que la población general si el hermano o la hermana ya tienen autismo (Bolton et al (1994), J Child Psychol Psychiat 35:877-900). Los estudios sobre gemelos 15 monocigóticos muestran un 75% de concordancia en síntomas en comparación a sólo el 10% en hermanos fraternos (Bailey et at (1998), Brain 121:889-905, Folstein and Rutter (1977), J. Child Psychol Psychiat 18:297-321, Ritvo et al (1985), Am. J. Psychiat 142.74-77).

Esta gran diferencia sugiere que hay múltiples loci implicados, con algunos modelos 20 que predicen más de 15 genes que contribuyen al trastorno (Folstein and Rosen-Sheidley (2001), Nat Rev Genet 2:943-955, Lamb et al (2000) Hum Molec Genet 9:861-868, Risch et at (1999), Am J Hum Genet 65:493-507).

[0096] Además, el cerebelo a menudo presenta malformaciones en los individuos autistas. 21 de cada 22 estudios de autopsia han demostrado que las anormalidades 25 del cerebelo incluyen la pérdida de la célula Purkinje. Estos defectos ocurren en ausencia de cualquier signo obvio de la degeneración que sugiere que el autismo está causado, en su lugar, por defectos de desarrollo (Bailey et at (1998) Brain 121:889-905, Bauman and Kemper (1985), Neurology 35:866-874, Bauman and Kempter (1986), Neurology 36 (suppl.1): 190, Bauman and Kemper (1994) en The Neurobiology 30 of Autism. Baltimore: John Hopkins University Press páginas 119-145, Courchesne (1997), Learn Mem 4:1-35, Kemper and Bauman (1993), Behav Neuro 11:175-187, Ritvo et at (1996) Am J Psychiatry 143:862-866). Además, los estudios de imágenes han demostrado también la hipoplasia cerebelar (Courchesne et at (1998), New Eng J Med 318:1349-1354, Courchesne (1997) Curr Opin Neurobiol 7:269-278, Gaffney et al 35 (1987), Br J Psychiatry 151:831-833, Hashimoto et at (1995), J Autism Dev Discord

25:1-18, Kleiman et at (1992), Neurology 42:753-760, Murakami et al (1989), Arch Neurol 46:589-694). Un informe reciente de imágenes muestra patrones de crecimiento anormal de cerebelo después del nacimiento. El crecimiento se acelera inicialmente seguido por un decrecimiento después de los seis años (Courchesne et al (2001), Neurology 57:245-254). Estos estudios indican que el desarrollo del cerebelo 5 se perturba en el autismo. Es interesante que recientes estudios de fMRI indican que el cerebelo está activo durante las tareas que son defectivas en el autismo, incluyendo el lenguaje y la atención (Akshoomoff et al (1997), Int Rev Neurobiol 41:575-98, Allen et at (1997), Science 275-1940-1943, Allen and Courchesne (2003), Am J Psychiatry 160:262-73, Courchesne et at (1994), Behavioral Neuroscience 108:848-865, 10 Courchesne and Allen (1997), Learn mem 4:1-35, Gao et al (1996), Science 272:545-547). Por ello, estos defectos anatómicos pueden contribuir directamente con las anormalidades de comportamiento asociadas con el autismo.

[0097] La genética del ratón ha identificado un gran número de genes que funcionan durante el desarrollo del cerebelo (Hatten and Heintz (1995), Annu Rev Neurosci 15 18:385-408, Hatten et al. (1997), Curr Opin Neurobiol 7(l):40-47). Dicho gen es ENGRAILED 22, un factor de trascripción de caja homeo que es ortóloga a ENGRAILED 2 de la mosca del vinagre. En el ratón, hay dos genes ENGRAILED 2, En1 y En2. Los estudios con genes desactivados han demostrado que En1 funciona durante la modelización A-P temprano del tubo neuronal mientras que En2 se exige 20 específicamente para un desarrollo postnatal normal del cerebelo ((Millen et al (1994), Development 120:695-706; Hanks et al (1995), Science 269:679-682, Millen et al. (1995), Development 121:3935-45; Liu and Joyner (2001), Annu Rev Neurosci 24:869-896). El mutante En2-/- muestra una hipoplasia del cerebelo que es debida en parte a la reducción en todos los principales tipos celulares del cerebelo incluyendo las células 25 de Purkinje (Millen et al. (1994), Development 120:695-706; Millen et al (1995), 10 Development 121:3935-45; Kuemede et al (1997), J Neurosci 17:7881-9). Es interesante que el EN2 humano traza el mapa distal al cromosoma 7, una región que muestra unión a AS en dos estudios separados (Liu et al (2001), Annu Rev Neurosci 24:869-896, Auranen et al (2002), Am J Hum Genet 71:777-790). Por estas razones, 30 EN2 fue sometido a ensayo como un locus de susceptibilidad para AS por medio de la realización de un análisis de asociación basado en familias.

[0098] La investigación sugiere que el diagnóstico precoz de autismo o trastornos relacionados con el autismo como el de Asperger o PDD-NOS puede estar asociado con resultados drásticamente mejores. Cuanto antes se diagnostique a un niño, antes 35 podrá beneficiarse de uno de los muchos tratamientos de intervención especializada.

[0099] Dado que el diagnóstico del autismo basado en el comportamiento resulta difícil, especialmente en pacientes jóvenes, sería valioso disponer de un ensayo de análisis genético para ayudar en el diagnóstico. Además, dicho ensayo puede utilizarse para aconsejar a los padres potenciales sobre sus posibilidades de tener un hijo autista. 5

[0100] Sin embargo, hasta la publicación de la presente invención, no ha habido un marcador genético disponible que sea indicativo de una susceptibilidad del sujeto al autismo, o una enfermedad relacionada con ello, como el trastorno de Asperger o PDD-NOS. También es necesario el desarrollo de fármacos potenciales o agentes que tengan aplicaciones en el tratamiento del autismo o una enfermedad o trastorno 10 relacionado, tal como el trastorno de Asperger o PDD-NOS.

[0101] Se describe una molécula aislada del ácido nucleico (SEC. ID. Nº:1), que codifica el EN2 humano y la secuencia de aminoácido del humano EN2 (SEC. ID. Nº:2). La posición de EN2 en el cromosoma 7 está entre la posición 154552000 y la posición 154560000. Más concretamente, se describen métodos para determinar la 15 susceptibilidad de un sujeto al autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello, tal como el trastorno de Asperger o PDD-NOS utilizando un alelo variante del gen ENGRAILED 2 (EN2), que traza el mapa al cromosoma 7, en concreto, a 7q36.3. Además, los ensayos de transmisión/desequilibrios (TDT), que se realizaron para dos polimorfismo de nucleótido sencillo (rs1861972 y rs1861973), revelaron una 20 sobretransmisión significativa del alelo A de rs1861972 y el alelo C de rs1861973 (rs1861972P=0.0009; rs1861973 P=0.0006). El rs1861972 SNP, que se localiza en la posición 154670848, resulta en una transición de guanina a adenina, mientras que rs1861973, localizado en la posición 154671000, resulta en una transición de timina a citosina. El análisis de haplotipo indicó que el haplotipo A, C se sobretransmite 25 específicamente en individuos autistas (P=0.000062). La detección de tal alelo variante en el genoma de un sujeto puede ser indicativa de la susceptibilidad del sujeto al autismo. Además, un alelo variante del gen ENGRAILED 2 también puede utilizarse para probar fármacos y agentes para el uso potencial en el tratamiento del autismo o una enfermedad o trastorno relacionado con ello, tal como el trastorno de Asperger o 30 PDD-NOS.

[0102] Se describe la identificación de polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) concretos, que muestran una relevancia estadística en términos de ser marcadores de susceptibilidad al autismo y trastornos relacionados con el autismo. En concreto, los dos SNPs se han encontrado en el cromosoma 7, en el gen que codifica para el factor 35 de trascripción EN2.

[0103] En concreto, el factor de transcripción de la caja homeo, ENGRAILED 2 (EN2), se investigó para su asociación con el trastorno del espectro autista (AS) realizando ensayos de transmisión/desequilibrios (TDT) para dos SNPs (rs1861972 y rs1861973).

Inicialmente, el TDT se realizó utilizando 137 tríadas de individuos autistas y sus padres y una sobretransmisión importante del alelo A de rs1861972 y se observó el 5 alelo C de rs1861973 (rs1861973 P=0.0009, rs1861973 P=0.0006; haplotipo A,C P=0.000062). El análisis se extendió posteriormente para incluir otros hermanos afectados y no afectados y también otras 29 familias adicionales. La asociación significativa se observa para ambos SPNs bajo los dos esquemas de diagnósticos amplios y reducidos (rs1861972; reducido P=0.0106, ancho P=0.0050; rs1861973: 10 reducido P=0.0033, amplio P=0.0063, Haplotipo A,C: reducido P=0.0007, amplio P=0.0009). Los procedimientos utilizados para los análisis en estos estudios son conocidos para los expertos en la materia (Martin, E.R. et al (2000), Am. J. Hum.Genet 67: 146-154; Terwilliger, J.D. (1995), Am. J. Hum. Genet 56:777-787; Ye, S.et al, (2001), Nucleic Acids Res. 29: E88-8; Clayton, D. (1999), Ant J. Hum. Genet 65:1170-15 1177; Strachan, T. and Read, A., Human Molecular Genetics 2, Wiley Liss, New York, NY (1999)). En resumen, estos resultados identifican EN2 como un locus idóneamente susceptible para el autismo y los trastornos relacionados de AS.

Criterios actuales de diagnóstico para la identificación del autismo y el trastorno 20 de Asperger

[0104] Los comportamientos característicos de los trastornos del espectro autista pueden o pueden no ser aparentes en la infancia (de 18 a 24 meses), pero normalmente se vuelven obvios durante la infancia temprana (de los 24 meses a los 6 años). 25

[0105] Aunque no existe un ensayo de comunicaciones o de comportamiento que pueda detectar el autismo, se han desarrollado varios instrumentos de análisis que ahora se utilizan para diagnosticar el autismo.

[0106] El sistema de calificación CARS (Escala de clasificación de autismo en niños), desarrollado por Eric Schopler a principios de los años 70, está basado en un 30 comportamiento observado. Utilizando una escala de 15 puntos, los profesionales evalúan la relación de un niño con las personas, el uso del cuerpo, adaptación al cambio, respuesta auditiva y comunicación verbal.

[0107] La lista de comprobaciones en Toddlers (CHAT) se utiliza para analizar el autismo a los 18 meses de edad. Lo desarrolló Simon Baron-Cohen a principios de los 35 años noventa para ver si el autismo podría detectarse en niños que tuvieran tan solo

18 meses de edad. La herramienta del análisis utiliza un breve cuestionario con dos secciones, una preparada por los padres y la otra por el médico de familia o pediatra del menor.

[0108] El Cuestionario de análisis del autismo es una escala de análisis de 40 puntos que se ha utilizado con los niños de cuatro años y mayores para ayudar a evaluar las 5 habilidades de comunicación y el funcionamiento social.

[0109] El Ensayo de análisis de autismo para niños de dos años de edad, desarrollado por Wendy Stone at Vanderbilt utiliza observaciones directas para estudiar las funciones de comportamiento en niños menores de dos años. Ha identificado tres áreas de capacidad: juego, imitación motora y atención conjunta, que parecen indicar 10 autismo.

[0110] Los criterios de diagnóstico para el trastorno de Asperger son los siguientes:

Una discapacidad cualitativa en la interacción social, tal y como se manifiesta por al menos dos de los siguientes:

1. Discapacidades marcadas en el uso de múltiples comportamientos no verbales 15 como la mirada de contacto con los ojos, expresión facial, posturas corporales y gestos para regular la interacción social.

2. El fallo a la hora de desarrollar las relaciones adecuadas al nivel de desarrollo.

3. Una falta de búsqueda espontánea de diversión, intereses o consecuciones con otras personas (por ejemplo, por la falta de mostrar, traer o señalar objetos 20 de interés a otras personas).

4. Una falta de reciprocidad social o emocional.

[0111] Patrones restrictivos estereotipados y repetitivos de comportamiento, intereses y actividades tal y como se manifiesta por al menos uno de lo siguiente:

1. Abarcar preocupación con uno o más patrones estereotipados y restringidos de 25 interés que sea anormal ya sea por su intensidad o enfoque.

2. Adherencia aparentemente inflexible a rutinas específicas no funcionales o rituales

3. Gestos motores estereotipados y repetitivos (por ejemplo girar y agitar los dedos o las manos o movimientos complejos de todo el cuerpo). 30

4. Preocupación persistente con partes de objetos

[0112] El trastorno provoca una discapacidad clínicamente importante en el ámbito social, ocupacional y otras áreas importantes de funcionamiento.

[0013] No hay un retraso significativamente importante en el lenguaje (por ejemplo, palabras sencillas utilizadas antes de los 2 años, frases comunicativas utilizadas antes 35 de los 3 años).

[0114] No hay un retraso clínicamente significativo en el desarrollo cognitivo o en el desarrollo de habilidades de autoayuda apropiadas a la edad, comportamiento de adaptación (salvo la interacción social) y la curiosidad por el entorno en la infancia.

[0115] Los criterios no se cumplen para otros Trastornos Generalizados del Desarrollo o Esquizofrenia. 5

[0116] Dado que el diagnóstico basado en el comportamiento del autismo es difícil, especialmente en pacientes jóvenes, sería valioso tener un ensayo de análisis genético en el diagnóstico. Además, dicho ensayo puede utilizarse para avisar a los potenciales padres sobre sus posibilidades de tener un hijo autista.

[0117] Sin embargo, hasta la publicación de la presente invención, no ha habido un 10 marcador genético disponible que sea indicativo de la susceptibilidad de un sujeto al autismo o una enfermedad relacionada con ello, como el trastorno de Asperger o PDD-NOS.

Obtener las proteínas

[0118] Para utilizar aquí la proteína EN2 puede estar aislada y purificada según las 15 técnicas conocidas en la materia.

[0119] La proteína puede realizarse por métodos conocidos de síntesis química, o expresada.

La descripción de más abajo proporciona ejemplos de materiales y métodos para hacerlo, pero no está concebida para ser limitadora ni exclusiva. 20

Expresión de las proteínas

[0120] La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína (proporcionada aquí) o fragmento antigénico, derivado o análogo suyo, o un derivado activo funcionalmente, incluyendo una proteína quimérica suya, puede insertarse en un vector adecuado de 25 expresión, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y translación de la secuencia insertada de la proteína-codificadora. Dichos elementos se definen aquí como "promotor". Por ello, el ácido nucleico que codifica la Proteína EN2 de la proteína que aquí se describe se asocia operativamente con un promotor en el vector de expresión. Ambas secuencias de ADNc y genómicas 30 pueden clonarse y expresarse bajo el control de dichas secuencias regulatorias. Un vector de expresión también incluye preferiblemente un origen de replicación.

[0121] Las señales necesarias transcripcionales y transnacionales pueden proporcionarse en un vector de expresión recombinante, o pueden suministrarlo el gen nativo que codifica la proteína EN2 y/o sus regiones flanqueadoras. Las proteínas 35

quiméricas que incluyen la proteína EN2 también pueden producirse como se describe.

[0122] Los sistemas potenciales del vector hospedador incluyen, pero no se limitan a, sistemas celulares de mamíferos con virus infectado (por ejemplo, el virus Vaccinia, adenovirus, etc), los sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, 5 baculoviridae); microorganismos como la levadura que contiene vectores de la levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plásmido o ADN cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus fortalezas y especificidades. Según el sistema del vector hospedador utilizado, puede utilizarse cualquier número de elementos de transcripción y translación. 10

[0123] A este respecto, cualquier número de sistemas de ampliación puede utilizarse para conseguir altos niveles de expresión genética estable.

[0124] La célula que contiene el vector de expresión recombinante se cultiva en un medio de cultivo celular adecuado bajo las condiciones que proporcionan la expresión de la proteína por la célula. 15

[0125] Cualquiera de los métodos descritos anteriormente para la inserción de los fragmentos de ADN en un vector de clonación puede utilizarse para construir vectores de expresión que contienen un gen consistente en señales de control adecuadas trasncripcionales/transnacionales y las secuencias de codificación de la proteína. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in Vitro y técnicas sintéticas y la 20 recombinación in vivo (recombinación genética).

[0126] La expresión puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la materia, pero estos elementos regulatorios deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión del gen EN2 incluyen, pero no están limitados a la región 25 de promoción temprana SV40 (Benoist and Chambon, Nature, 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en el terminal largo 3N repite del virus sarcoma Rous (Yamamoto et al, Cell, 22:787-797) (1980), el herpes promotor de kinasa timidina (Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1441-1445 (1981)), las secuencias regulatorias del gen metalotineino (Brinster et al. Nature, 296:39-42) (1982)), los vectores de expresión 30 prolcarioticos como el promotor 3-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731 (1978)), o el promotor tac (DeBoer, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25) (1983)); ver también ―Scientific American, 242:74-94 (1980); elementos promotores de la levadura u otros hongos como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol dehidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol kinasa), el 35 promotor de la fosfatasa alcalina y las regiones de control transcripcional animal, que

muestran la especificad de los tejidos se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen I elastasa que es activa en las células acinosas pancreáticas (Swift et al., Cell, 38:639-646 (1984)); (Omitz et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409(1986); (MacDonald, Hepatology, 7:425-515 (1987)), la región de control del gen de la insulina que está activo en las células beta pancreáticas 5 (Hanahan, Nature, 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de la inmunoglobulina que está activo en las células linfoides (Grosscheld et. al., Cell, 38:647-658 (1984)); (Adames et al., Nature, 318:533-538 (1985)); (Alexander et al. Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444 (1987)), región de control del virus tumoral mamario en ratones, que es activo en células testiculares, del pecho, linfoides y células principales 10 (Leder et al, Cell, 45:485-495 (1986)), región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinket et al. Genes and Devel, 1:268-276 (1987)), región de control del gen alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell, Biol, 5:1639-1648 (1985)); (Hammer et al. Science, 235:53-58 (1987)), región de control del gen alfa 1-antitripsin que es activo en el hígado (Kelsey et al. Genes and 15 Devel, 1:161-171 (1987)), región de control del gen beta-globina que es activo en las células mieloides (Mogram et al. Nature, 315:338-340 (1985)); (Kollias et al., Cell, 46:89-94 (1986)), la región de control del gen de la proteína básica mielina que es activa en las células oligodentrocitas en el cerebro (Readhead et al, Cell, 48:703-712 (1987)), la región de control del gen de cadena ligera de miosina II que es activo en el 20 músculo esquelético (Sani, Nature, 314:283-286 (1985)), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al. Science, 234:1372-1378 (1986)).

[0127] Los vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína EN2 pueden identificarse por cuatro acercamientos bien conocidos: (a) 25 ampliación del PCR del ADN plásmido deseado o ARNm específico, (b) hibridización del ácido nucleico, (c) presencia o ausencia de las funciones del gen marcador de la selección y (d) expresión de secuencias insertadas.

[0128] Una gran variedad de combinaciones del vector hospedador/de expresión pueden emplearse en expresar el gen EN2 o los fragmentos. Los vectores de 30 expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los vectores idóneos incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacteriales conocidos, por ejemplo, plásmidos E. coli, col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., Gene, 67:31-40 (1988)), pMB9 y sus derivados, plásmidos como RP4; ADNs del fago, por ejemplo, los numerosos 35 derivados del fago 8, por ejemplo, NM989 y otro ADN del fago, por ejemplo, M13 y

ADN del fago de hebra sencilla filamentosa; plásmidos de la levadura como el 2: plásmido o sus derivados; vectores útiles en las células eucatóricas, como vectores útiles en las células mamarias o de insectos, vectores derivados de las combinaciones e plásmidos y ADNs del fago, como los plásmidos que se han modificado para utilizar el ADN del fago u otras secuencias de control de la expresión y similares. 5

[0129] Por ejemplo, en sistemas de expresión baculoviridae, los vectores de transferencia sin fusión, como pero no limitados a VL941 (Summers), pVL1393 (Invitrogen), pVL1392 (Summers y Invitrogen) y pBlneBacIII (Invitrogen) y los vectores de transferencia de fusión, tal como pero no limitado a pAc700 (Summers), pAc701 y pAc702, pAc360 (Invitrogen) y pBlueBacHisA, B, C (Invitrogen). 10

[0130] Los vectores de expresión mamífera contemplados para el uso incluyen vectores con promotores inducibles, como el promotor de la dihidrofolata reductasa (DHFR), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un vector de expresión DHFR, cualquier vector de expresión con un vector de expresión DHFR o un vector de coampliación DHFR/metotrexato, como pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI y el 15 emplazamiento de clonación EcoRI, con el vector que expresa el gen clonado y DHFR; ver Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Alternativamente, un vector de co-amplificación de la glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, como Pee14 (Celltech). Puede utilizarse un vector que dirige la expresión episomal bajo el control del Virus de Epstein-Barr (EBV), como un pREP4 (Invitrogen), pCEP4 20 (Invitrogen), pMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen) y pEBVHis (Invitrogen). Los vectores de expresión mamífera seleccionable incluyen pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen) y otros. Los vectores de expresión mamífera del virus Vaccinia (ver Kaufman, 1991, anteriormente) incluye, pero no está limitado a pSC11 y pMJ601. 25

[0131] Los sistemas de expresión de la levadura también pueden utilizarse. Pueden utilizarse, por ejemplo, el vector de no fusión pYEN2 (Invitrogen) o la fusión pYESH es A, B,C, (Invitrogen) por mencionar dos.

[0132] Cuando una molécula particular del ADN recombinante se identifica y se aísla, varios métodos conocidos en la materia pueden utilizarlo para propagarlo. Cuando el 30 sistema hospedador adecuado y las condiciones de crecimiento se establecen, los vectores de expresión recombinante pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se explicó anteriormente, los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen, pero no están limitados a los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales como el virus Vaccinia o adenovirus; virus de insectos como el 35

baculovirus; los vectores de la levadura, los vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y los vectores del ADN plásmido y cósmido, por nombrar algunos.

[0133] Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto genético de la forma específica deseada. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos 5 específicos y características para la modificación y proceso transnacional y post-translacional (por ejemplo, glicosilación, clivaje, por ejemplo, de secuencia de señal) de proteínas. Las líneas celulares adecuadas o sistemas hospedadores pueden elegirse para asegurar la modificación deseada y el proceso de la proteína foránea expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano puede utilizarse para 10 producir un producto proteico con núcleo no glicosilado.

[0134] Los vectores se introducen en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE, dextrano, precipitado de fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosoma), uso de una pistola genética, o un transportador del vector de 15 ADN (ver, por ejemplo, Wu et al, J. Biol Chem, 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al, Solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentado el 15 de marzo de 1990).

Purificación de las proteínas 20

[0135] La purificación de la Proteína EN2 puede lograrse por un número de procedimientos que abarcan una gran variedad de pasos de purificación conocidos. Los expertos en la materia sabrán referirse a las referencias, tales como las series de Métodos de Enzimología, para conocerlo más a fondo. Los pasos iniciales para purificar las proteínas incluyen la solubilización o insolubilización, tal como los 25 fraccionamientos con sulfato amónico; los fraccionamientos por exclusión de solvente, por ejemplo, un precipitado con etanol; extracciones con detergente a las proteínas unidas a las membranas libres que utilizan tales detergentes como Triton X-100, Tween-20, etc; o altas extracciones de sal. La solubilización de proteínas también puede conseguirse utilizando solventes apróticos como el dimetil sulfóxido y la 30 hexametilfosforamida. Además, puede utilizarse un centrifugado a alta velocidad o bien sólo o junto con otras técnicas de extracción. Un método útil marca la proteína con hexa-histidina mediante cromatografía Ni+ (Coligan, et al. Current Protocols in Protein Science, vol. 1 (John Wiley and Sons, New York, 1995); Methods in Enzymology (M.P. Deutscher, ed.) vol. 185 Guide to Protein Purification (Academic 35

Press, San Diego, California 1990); Crowe, et al. 1994 Methods Mol. Biol. 31:371-387); Schmitt, et al. 1993 Molecular Biology Reports 18:223-230).

[0136] Generalmente, los pasos para la purificación o un buen aislamiento secundario incluyen la absorción en fase sólida utilizando un gel de fosfato cálcico o hidroxiapatita, o una fase sólida vinculante. La fase sólida vinculante puede realizarse a través de 5 una unión iónica, bien con un cambiador de aniones, como el dietilaminoetilo (DEAE) o dietilo [2-hidroxi propilo] amino etilo (QAE) Sephadex o celulosa, o con un cambiador de cationes como el carboximetilo (CM) o sulfopropilo (SP) Sephadex o celulosa. Los medios alternativos de la fase sólida vinculante incluye la explotación de interacciones hidrofóbicas, por ejemplo, el uso de un soporte sólido cómo un fenilsefarosa y un 10 tampón de alto contenido en sal; la unión de la afinidad, vinculado a un soporte activado; la inmunounión, utilizando, por ejemplo, un anticuerpo de la proteína EN2 vinculado a un soporte activado; al igual que otros soportes con base sólida que incluyan aquéllos que contienen colorantes específicos o lectinas etc. Otra técnica de soporte de fase sólida que a menudo se utiliza al final del procedimiento de 15 purificación recae en la exclusión del tamaño, tal como los geles Sephadex y Sepharose, técnicas de membranas centrífugas o presurizadas, utilizando los filtros de membrana de exclusión de tamaño.

[0137] Las separaciones de soporte de fase sólida generalmente se realizan mediante lotes con centrifugados a baja velocidad o por una cromatografía en columna. La 20 cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), incluyendo las técnicas relacionadas como la FPLC, es en la actualidad el medio más común para realizar la cromatografía líquida. Las técnicas de cromatografía de exclusión de tamaño también pueden conseguirse con la ayuda de un centrifugado de baja velocidad.

[0138] Pueden emplearse las técnicas de permeación de tamaño como las técnicas 25 electroforéticas de gel. Estas técnicas generalmente se realizan en tubos, losas o mediante la electroforesis capilar.

[0139] Casi todos los pasos que implican la purificación de proteínas emplean un tampón biológico a un pH cercano al pKa de ese tampón. Los tampones típicos pueden adquirirse en la mayoría de los catálogos bioquímicos e incluyen los tampones 30 clásicos como Tris, pirofosfato, monofosfato y bifosfato o los tampones Good (Good, N.E., et al, Biochemistry, 5:5467 (1966); Good, N.E. and Izawa, S., Meth. Enzymol., 24, Parte B, 53 (1972); y Fergunson, W.J. and Good, N.E., Anal. Biochem., 104-300 (1980)) tal como Mes, Hepes, Mops, tricine and Ches.

[0140] Los materiales para realizar todas estas técnicas están disponibles a partir de 35 una variedad de recursos como Sigma Chemical Company in St. Louis, Missouri.

Obtener los anticuerpos

[0141] Los anticuerpos pueden producirse según las técnicas conocidas en la material. La descripción de más abajo proporciona ejemplos de materiales y métodos para hacerlo así, pero no está concebido ni para limitar ni para ser excluyente. 5

[0142] La proteína EN2 puede producirse de forma recombinante o por medio de una síntesis química tal y como se describe anteriormente y los fragmentos u otros derivados o análogos suyos, incluyendo las proteínas de fusión, pueden utilizarse como un inmunógeno para generar anticuerpos que reconozcan el polipéptido de la proteína. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos policlonal, 10 monoclonal, quimérico, de cadena sencilla, fragmentos y un banco de expresión Fab. Los anticuerpos de la proteína anti-EN2 puede ser con reacción cruzada, por ejemplo, pueden reconocer la proteína EN2 de diferentes especies. Los anticuerpos policlonales tienen mayor posibilidad de reactividad cruzada. Alternativamente, un anticuerpo puede ser específico para una forma sencilla de proteína EN2, como la 15 proteína EN2 murina. Preferentemente, tal anticuerpo es específico para la Proteína EN2 humana.

[0143] Varios procedimientos conocidos en la materia pueden utilizarse para la producción de anticuerpos policlonales para la Proteína EN2. Para la producción de un anticuerpo, varios animales hospedadores pueden inmunizarse por medio de la 20 inyección con la Proteína EN2, incluyendo, pero no limitándose a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. Su proteína EN2 puede conjugarse para un portador inmunogénico, por ejemplo, la albúmina del suero bovino (BSA) o la hemocianina extraída del molusco (KLH). Varios adyuvantes pueden utilizarse para aumentar la respuesta inmunológica, según las especies de hospedadores, incluyendo, pero no 25 limitándose a los de Freund (completo e incompleto), geles minerales como el hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie, como la lisolecticina, poliolos plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina extraída del molusco, dinitrofenol y los adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. 30

[0144] Para la preparación de anticuerpos monoclonales hacia la Proteína EN2, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por las continuas líneas celulares en el cultivo. Estas incluyen, pero no están limitadas a la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (Nature 256:495-497 (1975)) y también la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de la 35 célula-B humana (Kozhor et al, Imnunology Today 4:72 1983); Cote et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 80.2026-2030 (1983)) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al. en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., páginas 77-96 (1985)).

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en animales sin gérmenes utilizando la tecnología actual (PCT/US90/02545). De hecho, pueden utilizarse las técnicas 5 desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., J. Bacteriol 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)), ensamblando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para la Proteína EN2 junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de la actividad biológica adecuada. 10

Dichos anticuerpos quiméricos humanos o humanizados se prefieren para utilizarlos en la terapia o enfermedades o trastornos humanos (descritos más abajo), dado que los anticuerpos humanos o humanizados tienen menos posibilidades que los anticuerpos xenogénicos a inducir una respuesta inmune, en concreto, una respuesta alérgica, por sí solos. 15

[0145] Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patentes US Números 5.476.786 y 5.132.405 a Huston; Patente U.S. 4.946.778) puede adaptarse para producir los anticuerpos de cadena sencilla específicos de la Proteína EN2.

Las técnicas descritas para la construcción de los bancos de expresión Fab (Huse et 20 al, Science 246:127-1281 (1989)) permiten una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para la Proteína EN2. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula del anticuerpo pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no están limitados a: el fragmento F(abN)2 que puede producirse por la digestión 25 de pepsina de la molécula del anticuerpo; los fragmentos FabN que pueden generarse reduciendo los puentes de disulfuro del fragmento F(abN)2 , y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula del anticuerpo con papaína y un agente reductor.

[0146] En la producción de anticuerpos, en análisis del anticuerpo deseado puede 30 conseguirse empleando las técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, el radioinmunoensayo, ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos ―sándwich‖, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando el oro coloidal, marcas de radioisótopos o enzimas, por ejemplo), borrones de Western, 35 reacciones de precipitado, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de

aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complementos, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de la proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. La unión del anticuerpo puede detectarse detectando una etiqueta en el anticuerpo primario, o el anticuerpo primario puede detectarse detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al primer anticuerpo. 5 También, el segundo anticuerpo puede etiquetarse. En la materia se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo.

Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconozcan en un epitopo específico de la proteína EN2, se pueden probar hibridomas generados para un producto que se unan a un fragmento de la proteína EN2 que contienen dicho epitopo. Para la 10 selección de un anticuerpo específico a una proteína EN2 de una especie concreta de un animal, se puede seleccionar basándose en la unión positiva con la proteína EN2 expresada por o aislada de células de esa especie de animal.

[0147] Los siguientes anticuerpos pueden utilizarse en métodos conocidos en la materia relativos a la localización y actividad de la proteína EN2, por ejemplo, los 15 borrones de Wester, imaginando la proteína EN2 in situ, midiendo sus niveles en una muestra fisiológica adecuada, etc. utilizando cualquier técnica de detección mencionada anteriormente o conocida en la materia.

[0148] En un ejemplo específico, pueden generarse anticuerpos que agonizan o antagonizan la actividad de la Proteína EN2. Dichos anticuerpos pueden someterse a 20 ensayo utilizando los ensayos descritos más abajo para identificar ligandos.

[0149] En un inmunoensayo, una cantidad de control de sus antagonistas o anticuerpos, o similares, pueden prepararse y marcarse con una enzima, un socio de unión específica y/o un elemento radioactivo, y luego puede introducirse en una muestra celular. Una vez etiquetado el material o que su socio vinculante haya tenido 25 la oportunidad de reaccionar con sitios dentro de la muestra, la masa resultante puede examinarse por medio de técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza de la marca unida.

[0150] En caso donde una etiqueta radioactiva, como los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125L, 131L y 186Re se utilicen, pueden emplearse 30 procedimientos de conteo conocidos y actualmente disponibles. En el caso donde una etiqueta sea una enzima, la detección puede conseguirse mediante cualquiera de las técnicas utilizadas en la actualidad colorimétricas, espectrofométicas, fluorospectrofométicas, amperométricas o gasométricas conocidas en la materia.

[0151] Se describe un sistema de ensayo que puede prepararse en la forma de un kit 35 de ensayo para el análisis cuantitativo del grado de la presencia de la proteína EN2, o

para identificar los fármacos u otros agentes que pueden simular o bloquear su actividad. Alternativamente, la presencia de polimorfismos de nucleótido sencillo puede controlarse utilizando técnicas estándar conocidas en la materia. El sistema o kit de ensayo incluye un componente marcado preparado por una de las técnicas enzimáticas y/o radioactivas aquí comentadas, acoplando una marca al anticuerpo o 5 un agonista y/o antagonista y uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales, al menos uno de los cuales es un ligando libre o inmovilizado, capaz de o bien unirse al componente marcado, su socio de unión, uno de los componentes a determinar o su(s) socio(s) vinculante(s).

Administración de células, genes y proteínas a una persona 10

[0152] Terapia génica: El gen EN2 o fragmentos adecuados del gen (por ejemplo correspondientes a una región eliminada en un paciente individual) puede utilizarse en la terapia génica por los métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, el gen puede introducirse in vivo en un vector viral. Dichos vectores incluye un virus ADN defectivo o atenuado, tal como pero no limitado al virus del Herpes Simplex (HSV), el virus del 15 papiloma, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus asociado al adeno (AAV) y similares. Se prefieren los virus defectivos, que totalmente o casi totalmente carecen de genes virales. El virus defectivo no es infectante después de introducirlo en una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la administración a las células en un área específica, localizada, sin preocuparse si el vector puede infectar otras 20 células. Los ejemplos en vectores concretos incluyen, pero no se limitan a, un vector del virus 1 defectivo del herpes (HSV1) (Kaptitt et al, Molec. Cell Neurosci. 2:320-330 (1991)), en el vector de adenovirus atenuado, como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et at. (J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992), y un vector defectivo del virus asociado al adeno (Samulaki et al. J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulaki et al. J. 25 Virol, 63:3822-3828 (1989)).

[0153] Preferentemente, para la administración in vitro, un tratamiento adecuado inmunoexpresivo se emplea junto con el vector viral, por ejemplo, el vector del adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y las células trasnfectadas. Por ejemplo, las citokinas inmosupresivas, como la interleukina-12 (IL-30 12), interferón-((IFN-0, o el anticuerpo anti-CD4, puede administrase para bloquear las respuestas inmunes celulares o humorales para los vectores virales (ver, por ejemplo, Wilson, Nature Medicine (1995)). Además, es ventajoso emplear un vector viral que está diseñado por ingeniería para expresar un número mínimo de antígenos.

[0154] En otro ejemplo, el gen puede introducirse en vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al. Patente U.S. Nº 5.399.346; Mam et al. 1983, Cell 33:153; Temin et al., Patente US Nº 4.650.764; Temin et al, Patente US Nº 4.980.289;

Markowitz et al, 1988. J. Virol 62:1120; Temin et al; Patente US No. 5.124.263; Publicación de Patente Internacional WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1958 5 por Dougherty et al; y Kno et al, 1993, Sangre 82:345. La liberación de gen marcado se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995.

[0155] De forma alternativa, el vector puede introducirse in vivo mediante lipofección. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden utilizarse para preparar los liposomas para la 10 transfección in vivo de un gen que codifique un marcador (Felger, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84:7412-7417 (1987); ver Mackey, et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85:8027-8031 (1988)). El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos con carga negativa y también promover la fusión con membranas celulares con carga negativa (Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)). Los 15 lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas para el fin de marcar (ver Mackey et. al., supra). Los péptidos marcados, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores y las proteínas como los anticuerpos, o las moléculas no péptidas podrían acoplarse químicamente a los liposomas.

[0156] También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN 20 desnudo. Los vectores de ADN desnudo para la terapia génica pueden introducirse en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, la transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitado de fosfato cálcico, uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vector de ADN (ver, por ejemplo, Wu et al., Biol. Chem. 267:963-967 25 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:1462-14624 (1988); Hartmut et at, Solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

[0157] Un vector de expresión regulable resulta especialmente útil para regular la expresión de un gen EN2 terapéutico. Se contempla la expresión constitutiva del gen EN2, incluso a niveles bajos. Varios genes terapéuticos heterologos pueden insertarse 30 en un vector de terapia génica como, pero no limitándose a, a la deaminasa de adenosina (ADA) para tratar la inmunodeficiencia combinada grave (SCID); los genes marcadores o los genes de linfoquina en la infiltración del tumor (TIL), células T (Kasis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:473 (1990); Culver et al., ibid. 88:3155 (1991)); genes para factores de coagulación como el Factor VIII y el Factor IX para tratar la 35 hemofilia (Dwarki et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1023-1027 (19950); Thompson,

Thromb. and Haemostatis, 66:119-122 (1991)); y otros genes terapéuticos bien conocidos como, pero no limitados a 3-globina, distrofina, insulina, eritropoyetina, la hormona del crecimiento, glucocerebrosidasa, 3-glucuronidasa, V-antitripsina, fenilalamina hidroxilasa, tirosina hiroxilasa, ormithina transcarbamilasa, apolipoproteínas y similares. En general, ver la Patente US Nº 5.399, 346 a Anderson 5 et al.

[0158] Se describe la co-expresión de EN2 y un gen heterologo terapeutico bajo el control de una secuencia de reconocimiento de ADN específico proporcionando un vector de expresión de la terapia génica que incluye un gen codificador EN2 y un gen bajo control de, entre otros, la secuencia regulatoria de EN2. El uso más efectivo de 10 este modo de tratamiento es administrar el vector de expresión de la terapia de gen por métodos conocidos a una mujer embarazada con riesgo de portar un feto afectado. En este contexto, la secuencia regulatoria EN2 marcaría el vector a los tipos de células que están afectadas con el autismo. Por tanto, si el vector marcador del gen se proporciona durante la gestación de un feto, entonces el gen terapeutico y/o el propio 15 gen EN2 se marcarían, por ejemplo, a neuronas que pueden, de otro modo, fallar a la hora de desarrollarse normalmente o en absoluto en el feto.

Estos elementos pueden proporcionarse en vector separados, por ejemplo, como se muestra más abajo. Estos elementos pueden proporcionarse en un vector de expresión sencillo. 20

Composiciones farmacéuticas

[0159] Una proteína EN2 o ácido nucleico puede ser un compuesto terapéutico. También el compuesto terapéutico es un fármaco que aumenta o disminuye, es decir, normaliza (va a niveles normales como se describe anteriormente) el nivel de la Proteína EN2. También se contempla un fármaco que normaliza cualquier efecto 25 deletéreo hacia abajo causado por la presencia de SNPS en el gen EN2. Dichos fármacos también se obtienen mediante ensayos que detectan el aumento o descenso de la proteína EN2 o su expresión o que normaliza la expresión de genes que están hacia abajo del gen EN2.

Un ensayo basado en células donde los compuestos se someten a ensayo para la 30 capacidad de incrementar EN2 en células cultivadas en dicho ensayo. En consecuencia, se describe un fármaco que aumenta la cantidad de la Proteína EN2 producido por las células cultivadas.

[0160] También se describen las composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de esta invención, preferentemente la proteína EN2, anticuerpos o 35 polinucleótido. Dichas composiciones farmacéuticas pueden formularse para la

administración por cualquier medio estándar, como por infección, vía oral, pulmonar, nasal, rectal, etc.

[0161] En general, aquí se incluyen las composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades efectivas de un compuesto, ácido nucleico o proteína junto con los diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservantes, solubilizadores, 5 emulsificantes, adyuvantes y/o portadores. Dichas composiciones incluyen diluyentes de distinto contenido de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y la fuerza iónica; los aditivos como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo Tween 80, Polysorbate 80), antioxidantes (por ejemplo, el ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo Thimersol, alcohol de bencilo) y 10 sustancias de estabilización (por ejemplo, la lactosa, manitol); incorporación del material en preparaciones particulares de compuestos poliméricos como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. El ácido hilaurónico también puede utilizarse.

[0162] Dichos compuestos pueden influir en el estado físico, estabilidad, tasa de 15 liberación in vivo, y la tasa de aclarado in vivo de las presentes proteínas y derivados. Ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18º Edic. (1990, Mack Publishing Co, Easton, PA 18042 páginas 1435-1712.

[0163] Las composiciones pueden prepararse en forma líquida o pueden secarse en polvo seco, como forma liofilizada. Las formas de dosis orales se describen 20 generalmente en el Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18º Edic., 1990 (Mack Publishing Co, Easton, PA 18042) en el capítulo 89. Las formas de dosis sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, pastillas para chupar, cachet o pelets. Las formulaciones para la liberación por vía rectal incluyen fórmulas de supositorio, que pueden ser similares a las preparadas para la liberación oral. También, la 25 encapsulación liposomal o protenoide puede utilizarse para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, las microesferas protenoides publicadas en la Patente U.S. Nº 4.925.673). La encapsulación liposomal puede utilizarse y los liposomas pueden derivarse con varios polímeros (por ejemplo, Patente US Nº 5.013.556). Una descripción de posibles fórmulas de dosis sólidas para la terapéutica 30 la da Marshall, K., In: Modern Pharmaceutics Editado por G.S. Banker and C.T. Rhodes Capítulo 10, 1979.

[0164] En general, la formulación incluirá el componente o componente (o fórmulas químicamente derivadas de ello) e ingredientes inertes que permiten la protección contra el entorno estomacal, y liberación del material activo biológicamente en el 35 intestino. Los compuestos activos pueden modificarse químicamente de manera que la

liberación oral sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un fracción a la propia molécula del componente, donde dicha fracción permita (a) la inhibición de proteolisis; y (b) toma en el torrente sanguíneo del estómago o intestino. También se desea el aumento en la estabilidad global del componente o componentes y el aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. 5 Ejemplos de tales fracciones incluyen: polietileneglicol, copolímeros de etilenoglicol y propilenoglicol, celulosa de carboximetil, dextrano, alcohol de polivinilo, pirrolina de polivinilo y poliprolina.

[0165] Uno puede diluir o aumentar el volumen del terapeutico con un material inerte como carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhídrido, celulosa, 10 sucrosa, dextrano modificado y almidón. Ciertas sales inorgánicas también pueden utilizarse como filtros, incluyendo trifosfato cálcico, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Los materiales utilizados como desintegrantes incluyen, pero no están limitados a, levaduras, incluyendo glicolato sódico de almidón, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramiopectina, alginato sódico, gelatina, piel de 15 naranja, celulosa del ácido carboximetilo, esponja natural y bentonita y resinas de cambio catiónico insoluble y gomas en polvo como desintegrantes y como vinculantes y estas pueden incluir gomas en polvo como agar, Baraya o tragacanto.

El ácido algínico y su sal sódica también son útiles como desintegrantes. Los aglutinantes pueden utilizarse para mantener unido el agente terapéutico para formar 20 un comprimido duro que incluya materiales de productos naturales como la acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulsa (CMC). La pirrolidona de polivinilo (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) podrían utilizarse en soluciones alcohólicas para granular el terapéutico. Puede incluirse un agente antifriccional. Los lubricantes como 25 el ácido esteárico incluyendo su magnesio y las sales de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras, sulfato lauril de sodio, sulfato lauril de magnesio, glicol de polietileno de varios pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000 pueden utilizarse. Los fluidificantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminate hidratado. Puede añadirse un surfactante como humectante. 30

Los surfactantes pueden incluir detergentes aniónicos como sulfato lauril sódico, dodecilsulfato sódico y sulfonato sódico de dioctilo. Los detergentes catiónicos pueden utilizarse y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetomio. Los detergentes aiónicos que pueden incluirse son lauromacrogol 400, polioxilo 40 estearato, aceite de ricino hidrogenado polioxietileno 10, 50 y 60, monoesterato de 35 glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, ester del ácido graso de la sacarosa, metilcelulosa

y carboximetilcelulosa. Los aditivos que potencialmente potencia la toma de proteína son por ejemplo, el ácido oleico de ácidos grasos, el ácido linoleico y el ácido linolenico.

[0166] Puede ser deseable la formulación oral de liberación controlada. También se contempla la liberación pulmonar por métodos conocidos como por ejemplo, los 5 descritos en la Patente US. Nº 5.451.569.

Los vehículos incluyen, pero no están limitados a, nebulizadores, inhaladores de dosis medidos e inhaladores de polvo. Dichos dispositivos exigen el uso de formulaciones adecuadas. Normalmente, cada formulación es específica al tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propulsor adecuado, además de los 10 diluyentes habituales, adyuvantes y/o portadores útiles en la terapia.

También se contemplan los liposomas, las microcápsulas o las microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de portadores.

[0167] La proteína químicamente modificada puede prepararse también en diferentes formulaciones según el tipo de modificación química o el tipo de dispositivo empleado. 15 Las formulaciones para la liberación nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. Para las composiciones inyectables, son idóneas varias formulaciones acuosas estándar.

Métodos de tratamiento 20

[0168] Según lo anterior, los compuestos terapéuticos pueden liberarse por medios estándar incluyendo por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intracerebral, intraventricular, intratecal o rutas de administración subcutánea. Alternativamente, estos compuestos, adecuadamente formulados, pueden administrarse por vía nasal, oral o rectal. Un suministro constante de estos compuesto 25 terapéuticos pueden asegurase proporcionando una dosis terapéuticamente efectiva (es decir, una dosis efectiva para inducir niveles normalizados (es decir, aumentados o reducidos) de la proteína EN2 en un sujeto) en los intervalos necesarios, por ejemplo, diariamente, cada 12 horas, etc. Estos parámetros dependerán de la gravedad del estado de la enfermedad tratada, otras acciones, tal como la modificación de la dieta, 30 que se implementa, el peso, la edad y el sexo del sujeto, y otros criterios, que pueden determinarse según las buenas prácticas médicas estándar por los expertos en la materia. Los niveles normales de la proteína EN2 pueden determinarse tal y como se describe anteriormente. El sujeto puede ser sometido a ensayo para determinar si los niveles están normalizados por, por ejemplo, determinar la cantidad de la proteína EN2 35 en las células o tejidos del sujeto.

La dosis de similitud puede ser titulada durante el tratamiento al determinar si los niveles de la proteína EN2 están aumentando o disminuyendo en comparación con los niveles de EN2 del sujeto antes del tratamiento.

[0169] El compuesto terapéutico puede liberarse en una vesícula, en concreto un liposoma (ver Langer, Science, 249:1527-1533 (1990); Treta et al., in Liposomes in the 5 Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidder (eds.), Liss: New Cork, páginas 353-365 (1989): Lopez-Berestein and Fidder, Ibíd., páginas 317-327: ver, generalmente ibid). El compuesto terapéutico puede liberarse en un sistema de liberación controlado, puede administrarse utilizando la infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas o cualquier otro 10 modo de administración. En un ejemplo, una bomba puede utilizarse (ver Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al, Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al. N. Engl. J. Med, 321:574 (1989)). En otro ejemplo, pueden utilizarse materiales poliméricos (ver Medical Application of Controlled Released, Langer and Wise (eds), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974); 15 Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci Rev. Macromol. Chem, 23:61 (1983); ver también Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol, 25:351 (1989); Howard et al. J. Neurosurg., 71:105 (1989)). En aún otro ejemplo, un sistema de liberación controlada puede colocarse en la 20 proximidad del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, exigiendo sólo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

[0170] Un sujeto en el cual la administración de estos agentes terapéuticos está un régimen terapéutico efectivo es preferiblemente un humano, pero puede ser cualquier 25 animal. La cantidad administrada es una cantidad efectiva para normalizar la cantidad de la proteína EN2 en el sujeto, ya sea incrementado o reduciendo la cantidad de proteína o la expresión de la proteína. Por ello, como podrá apreciar rápidamente cualquier de los habituales expertos en la material, los métodos y las composiciones farmacéuticas descritas se encajan particularmente para la administración a cualquier 30 animal, es decir, para uso médico veterinario.

Detección de deleciones, adiciones, sustituciones y cualquier otra mutación

[0171] En general, la identificación de una mutación que implique tan poco como un nucleótido puede conseguirse observando la mutación a través de un análisis de 35 secuencia de nucleótidos o un cambio en un aminoácido a través de un análisis de

secuencia de aminoácido utilizando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, utilizar sondas desarrolladas de la secuencia EN2 que aquí se indica, o cebos PCR que aquí se indican, un gen mutante sospechoso puede obtenerse de células o tejido utilizando las técnicas conocidas. El gen puede entonces ser secuenciado por métodos estándar, y la mutación observarse comparando las secuencias. O el gen 5 puede expresare en un vector de expresión, otra vez utilizando protocoles estándar, y la proteína aislada resultante y secuenciada para proporcionar una comparación de la secuencia. Un ejemplo de un método del análisis mutante es el análisis de mutación del polimorfismo de hebra sencilla (SSPC), que emplea un protocolo basado en PCR para conseguir el análisis de la mutación. Tal y como se comentó anteriormente, una 10 mutación puede incluir una o más deleciones, adiciones o sustituciones de nucleótidos. La mutación puede ser en una región codificadora, que afectaría la secuencia de la proteína resultante. La mutación también puede ser en la región no codificadora 5' o 3', que afectaría la expresión de la proteína, mediante, por ejemplo, afectar al promotor o potenciador, o afectando el 3' UTR (afectando la estabilidad del 15 ARN). Una mutación puede ser tan pequeña como un nucleótido, o tan grande como el gen completo.

Sondas de hibridización

[0172] La SEC. ID. Nº: 1, establecida más abajo, es la secuencia codificadora del ADN 20 EN2. La SEC ID Nº: 2, también establecida más abajo, es la secuencia completa de una proteína EN2 humana. Las secuencias de ADN, sus segmentos y secuencias complementarias en la secuencia base a dichas secuencias y segmentos son sondas de hibridización presentes en ensayos para los niveles de ARN. Las sondas frente a las secuencias de intrón EN2, obtenibles de los resultados de Proyecto del Genoma 25 Humano 1, también pueden utilizarse para las sondas específicas del gen EN2.

[0173] Las sondas para las regiones de los segmentos del gen EN2 o ARNm pueden aislarse, por ejemplo, mediante la clonación del gen EN2 o ADNc y utilizando PCR para ampliar las regiones deseadas del ácido nucleico clonado para crear una población de sondas. 30

[0174] Los ensayos de hibridización se realizan bajo condiciones donde una sonda complementaria a un segmento del ácido nucleico EN2 se vinculará preferentemente a ese ácido nucleico, tal y como se compara con otro ácido nucleico. Existe mucha literatura sobre varias condiciones de hibridización adecuada para conseguir tal especificidad. [0175] La hibridización puede realizarse mediante distintos métodos. La 35 composición óptima del solvente, el tamaño de la sonda y la temperatura dependerán

de si el ácido nucleico diana está, por ejemplo, en la solución, en un soporte sólido (por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa) en la solución y o en una célula. También dependerá de si la sonda está en una solución o en un soporte sólido (por ejemplo, en un experimento del chip genético). Las condiciones de la hibridización descritas para los experimentos de borrones Northern más abajo son ilustrativas de las posibles 5 condiciones de la hibridización. Las personas relacionadas con la material apreciarán qué condiciones son óptimas para los distintos tipos posibles de experimentos de hibridización.

[0176] Las mutaciones de base sencilla pueden, por ejemplo, pueden detectarse por medio de la secuenciación del ácido nucleico por medio de SSCP, o por hibridización 10 con pequeñas sondas que exigen una secuencia diana perfectamente complementaria para hibridizar.

[0177] Los resultados de los distintos ensayos pueden analizarse para determinar si un gen o los dos tienen la deleción. Por ejemplo, si el análisis de gel eletroforético Southern de los compendios de restricción del ADN celular revela la presencia de la 15 mitad intacta del gen EN2 de ADN como una persona normal (en lo que se refiere al gen EN2) tiene, que indicará que sólo falta una de las dos copias de genes. También la hibridización a cromosomas in situ o en preparaciones cromosómicas, utilizando fluorescente en hibridización in situ u otras técnicas de hibridización pueden mostrar si la deleción de un gen está en uno o en dos cromosomas de un par cromosómico. Un 20 análisis del gel también puede revelar cualquier alteración en el patrón de bandas de una muestra de ADN normal. Por ejemplo, una deleción moverá sus dos regiones flanqueadoras que contiene los emplazamientos de restricción a cada una, resultando en fragmentos de diferentes tamaños que el ADN normal cuando se expuso a la misma enzima de restricción. 25

Demostración de defectos de EN2 utilizando el análisis de proteína

[0178] En algunos ejemplos de los métodos diagnósticos y kits, la proteína se aísla de un paciente para fines de determinar los niveles subnormales de proteína, especialmente la proteína EN2. 30

La proteína puede aislarse de la célula, tejido o muestras de sangre utilizando métodos conocidos del aislamiento de la proteína de estos materiales. En concreto, una proteína dada como EN2 puede aislarse utilizando anticuerpos. Una vez aislada, la proteína puede ser secuenciada por métodos conocidos para determinar si es una proteína mutante. (Ver, por ejemplo, Vladimirov, et al. 1996 Eur. J. Biochem, 239:144-35

149; Wang and Chait 1997 Methods Mol. Biol. 64:175-182; Hines et al. 1998 J Protein Chemistry 17:525-526).

Demostración de los defectos de EN2 utilizando sondas de anticuerpos

[0179] En ejemplos concretos de los métodos diagnósticos y kits, una sonda de 5 anticuerpo se utiliza en un ensayo para fines de demostrar los niveles subnormales de la proteína, especialmente la proteína EN2. Los anticuerpos pueden obtenerse como se describe anteriormente. También los anticuerpos que reacción con la proteína EN2 han sido comunicados (Ericson, et al. (1992), Science 256:1555-1560; Ericson, et al. (1997), Cell 90:169-180). El tamaño y la cantidad pueden determinarse por el análisis 10 de borrones de Western.

Autismo

[0180] El autismo incluye cualquier forma de autismo. Dichas enfermedades actualmente denominadas autismo, un trastorno del espectro autista que incluye el 15 Síndrome de Asperger y Trastorno Generalizado del Desarrollo (PDD-NOS).

[0181] Los criterios ―DSM-IV‖ para el trastorno autista son los establecidos en el Diagnóstico de la Asociación Americana de Psiquiatría y el Manual Estadístico de Trastornos Mentales, 4ª Edición, Washington DC, 199, páginas 70-71. El diagnóstico está basado en la presencia de 7 o más criterios de diagnóstico a partir de tres Grupos 20 posibles, 1, 2 y 3, con al menos dos de los criterios pertenecientes al Grupo 1, al menos uno del Grupo 2 y al menos uno del Grupo 3.

Los tres grupos corresponden a los tres síntomas centrales:

Grupo 1 – Discapacidad cualitativa en la interacción social.

Grupo 2 – Discapacidad cualitativa en la comunicación. 25

Grupo 3 – Patrones limitados repetitivos y estereotipados de comportamiento, intereses y actividades.

[0182] Los cuatro criterios de diagnósticos en el Grupo 1 son: (i) discapacidad marcada en múltiples comportamientos no verbales (por ejemplo el contacto con los ojos, expresión facial, posturas corporales y gestos para desarrollar la interacción 30 social);

(ii) fallo a la hora de desarrollar las relaciones con sus iguales adecuado al nivel de desarrollo;

(iii) ausencia de la búsqueda espontánea para compartir la diversión, intereses o logros con otros (por ejemplo, falta de mostrar, traer, o señalar objetos de interés); y 35 (iv) ausencia de reciprocidad emocional o social.

[0183] Los cuatro criterios de diagnóstico en el Grupo 2 son:

(i) retraso en, o total ausencia del desarrollo del lenguaje hablado (sin intento de compensar a través de modos alternativos de comunicación como gestos o mímica);

(ii) discurso adecuado pero una marcada discapacidad en la capacidad para iniciar o mantener una conversación con otros; (c) uso estereotipado y repetitivo del lenguaje o 5 lenguaje idiosincrático; y (iv) ausencia de juego espontáneo de fantasía o juegos de imitación social adecuado al nivel de desarrollo.

[0184] Los cuatro criterios de diagnósticos en el Grupo 3 son: (i) abarcar la preocupación con uno o más patrones estereotipados o restringidos de interés que sea anormal o bien en intensidad o en enfoque: (ii) adherencia inflexible a rutinas no 10 funcionales específicas o rituales, estereotipados y gestos motores repetitivos (por ejemplo girar o mover la manos o los dedos o movimientos complejos de todo el cuerpo); y (iv) preocupación persistente con partes de objetos.

[0185] El diagnóstico del autismo utilizando los criterios DSM-IV, seguido por la confirmación del diagnóstico por el Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R) 15 proporciona buenos resultados. El ADI-R es un proceso de revisión bien conocido para establecer el autismo (ver, por ejemplo Lord et al., 1994 J. Autism Dev Disord. 2:659-85; y Le Couteur, et al. 1989 J Autism Dev Disord. 19:363-87).

[0186] En los ejemplos que aquí se describen, el diagnóstico clínico se determinó por los criterios DSM-IV y luego cada individuo se sometió al Autism Diagnostic Intervine- 20 Revised (ADI-R). Los individuos autistas fueron identificados por tener al menos seis de los puntos descritos anteriormente.

Modulación de los genes hacia abajo.

[0187] Se describen los genes que están regulados directamente por EN2 también. 25 Las mutaciones en EN2 pueden resultar en el aumento o descenso de la expresión de estos genes. Dichos genes hacia abajo pueden expresarse en niveles incrementados o reducidos cuando EN2 se regula hacia abajo, y este es un medio de aislar tales genes utilizando métodos conocidos.

Por ejemplo, el esbozo cerebelar (e10.5) podría analizarse del ratón genéticamente 30 deficiente EN2-/- y otros salvajes en su ARNm aislado para determinar cuáles son las expresadas a niveles más bajos.

Por ejemplo, el ARNm podría hibridizarse frente a biochips que contengan todos los genes del genoma del ratón.

Los genes regulados directamente por EN2 como PCP2 (L7) (Sanlioglu et al (1998) J Neurobiol. 36:559-71) pueden expresarse a niveles más altos o más bajos que los otros.

EJEMPLOS 5

[0188] Los siguientes ejemplos se muestran para proporcionar a los expertos en la materia una muestra completa y descripción de cómo practicar la invención y no están concebidos para limitar el ámbito de qué inventores según su invención.

Ejemplo 1

[0189] Para estos estudios de utilizaron a familias recopiladas del Intercambio de 10 Recursos Genéticos del Autismo (Autism Genetic Resource Exchange o AGRE). AGRE es un repositorio central de muestras de ADN de familias creado por la fundación The Cure Autism Now (CAN) y el Human Biological Data Interchange (Intercambio de Datos Biológicos Humanos). Los criterios de selección exigen que al menos dos miembros de la familia tengan un diagnóstico del autismo, el Síndrome de 15 Asperger o PPD-NOS. El diagnóstico y las características de estas familias se describen en detalle en cualquier otra parte (Geschwind et al (2001), Am J Hum Genet. 69:463-6; Liu et al (2001), Annu Rev Neurosci 24:869-896). Para nuestro análisis, se define un breve diagnóstico sólo como autismo, mientras que un diagnóstico más amplio incluye individuos afectado con autismo, el Síndrome de Asperger o PPD-NOS. 20 En este estudio, 137 triadas (tríos de padres y sus hijos) bajo el diagnostico reducido se evaluaron inicialmente. Esto luego se extendió a un total de 166 pedigríes que incluían 310 tríadas y 168 hermanos fenotípicos discordantes (DSP) bajo un amplio diagnóstico (740 sujetos totales). Para el diagnóstico reducido, se analizaron 163 pedigríes con 250 tríadas y 134 DSP (n=672). [0190] EN2 abarca 8Kb del genoma y 25 está codificado por dos exones separados por un intrón sencillo. Los SNPs dentro del gen EN2 se identificaron inicialmente a través de los navegadores del genoma. Dos SNPs (rs1861972 y rs1861973) localizados 152 bp separados en el intrón se verificaron inicialmente por el análisis de secuencia del ADN de 24 individuos.

30

Tabla 1. Resultados de TDT para rs1861972 y rs1861973 en familias tríadas.

DbSNP No.

Polimorfismoa Frecuenciab Tc Uc Valord P GRRe PARf

rs1867972

A/G 0.297 77 41 0.0009 1.88 62%

rsl861973

C/T 0.292 70 35 0.0006 2.00 66%

a-Segundo alelo es alelo raro.

b- frecuencia del alelo raro.

c- T= número de veces que el alelo frecuente se transmitió y U=número de veces que el alelo frecuente no se transmitió de padres heterocigotos. 5

d-Valor P de dos lados (1df) correspondiente a X2 generado por TRANSMIT.

e-Riesgo relativo del genotipo estimado por el ratio de transmisión (T/U) asumiendo un modelo multiplicador.

f- Riesgo atribuible a la población calculado como PAR=(X-1)/X; donde X=(l-f)2 + 2f(l-f)y + f2y2 y y=GRR. 10

[0191] La estrategia ARMS-PCR del tetra-cebo se utilizó entonces en los miembros de la familia del genotipo (Ye et al. (2001), Nucleic Acids REN29:E88-8). Los cebos se seleccionaron utilizando un programa de software web y se determinaron unas condiciones PCR que permitieron la ampliación específica de todos los genotipos posibles. Los genotipos para ambos SNPS se determinaron para las 137 tríadas 15 iniciales que mostraron sólo el diagnóstico reducido y se verificaron para estar en el equilibrio de Hardy Weinberg. Las frecuencias para los alelos A y G alelos de rsl861972 son 70.3 y 29.7 respectivamente (Tabla 1). Se observan valores similares para rsl861973 (C=70.8 y T=29.2) (Tabla 1). Existe un importante positive desequilibrio de ligando (LD) entre los alelos de estos marcadores (delta = 0.82, delta-x2= 227.96, df 20 = 1, P <0.00001) (Hill and Weir (1994), Am. J. Hum. Genet, 54: 705-714).

[0192] Se valoraron las distorsiones de transmisiones alélicas para cada SNP por el ensayo del desequilibrio de transmisión (TDT) (Spielman et al. (1993), Am J Hum Genet 52: 506-516), utilizando el programa TRANSMIT (Clayton (1999), Am J Hum Genet 65: 1170-1177). Se observó la transmisión en exceso del alelo-A rs1861972 a la 25 descendencia afectada, con 77 de 118 padres heterocigotos (65%) transmisores del alelo-A y sólo 41 transmitían el alelo Ge (McNemar's x2=10.98, df=l, P=0.0009) (Tabla 1). Bajo un modelo multiplicativo, el ratio de transmisión Transmitido/No transmitido (T/U) es un estimador del riesgo relativo del genotipo (GRR) (Altshuler et al. (2000), Nature Genet 26: 76-80). El GRR atribuible al alelo A del rsl861972 SNP se estima en 30 ser 1.88 que a su vez corresponde a una población con riesgo atribuible (PAR) (Altshuler et al. (2000), Nature Genet 26: 76-80) de aproximadamente 62%. En otras palabras, estos datos indican que si la población fuera monomórfica para el alelo G (protectivo) la prevalencia del autismo sería un 62% inferior. Dado que el GRR y PAR están calculados a partir de una población de muestra determinada para múltiples 35

hermanos afectados, las estimaciones de riesgo actual pueden ser diferentes en la población AS general.

[0193] Una distorsión similar de las transmisiones se observó para rsl861973 SNP con 70 a 105 padres heterocigotos (67%) que transmitían preferentemente el alelo C a sus hijos autistas (McNemar's X2=l 1.67, df=1, P=0.0006) (Tabla 1). El alelo C del 5 rs1861973 SNP proporciona un GRR de 2.00 con el correspondiente PAR de 66%.

[0194] Los ensayos de desequilibrio/transmisión de calotipos se realizaron de nuevo utilizando el software TRANSMIT. En nuestra población, el haplotipo A, C tiene una frecuencia observada de 67.6%. Este haplotipo se sobretransmite específicamente (80 transmitido frente a 36 no transmitidos) a individuos afectados (X2=16.07, df=l, 10 P=.000062) (Tabla 2). Los haplotipos G, T, A, T y G, G se infratransmiten (Tabla 2). El ensayo global X2 basado en haplotipos comunes, A,C y G,T (frecuencia > 5%) se calculó para ser X2==18.90 (df=2), con un valor P correspondiente de 0.000079 (Tabla 2). Estos ensayos se reiteraron 50000 veces por un procedimiento de simulación de cebador para controlar los haplotipos ambiguos. Se obtuvieron los valores-P empíricos 15 similares como antes (P=0.00012)(Tabla 2). El GRR atribuible al haplotipo A, C resultó ser 2.19 con un PAR correspondiente del 69%. Juntos, este análisis demuestra que el haplotipo A, C de EN2 se sobretransmite y es un haplotipo de alto riesgo en individuos autistas.

20

Tabla 2. Análisis TDT de haplotipo en tríadas

Haplotipo

Frecuencia T U Valora-P

A,Cb

0.676 79 36 0.000062

A, T

0.032 4 12 0.0455

G,C

0.028 3 10 0.0525

G, T

0.262 39 67 0.0065

Globalc

0.000079

Globald

0.00012

a – Valor-P de dos lados correspondiente a X2 generado por TRANSMIT.

b-GRR=2.19, PAR=69%.

c- Ensayo Global X2 test basado en haplotipos comunes combinados, 25 frecuencia mayor que 5% (2df).

d-Simulación de cebador del ensayo x2 global (50000 reiteraciones).

[0195] Para determinar si estos hallazgos pueden extenderse a una muestra mayor, se analizaron hermanos afectados y no afectados de las 137 tríadas originales y 29 familias adicionales. La herencia de cada SNP se valoró en estos pedigríes extendidos utilizando el Ensayo de Desequilibrio del Pedigrí (PDT) (Martin et al. (2000), Am J Hum Genet 67: 146-154). Este programa se utilizó en lugar de TRANSMIT para el análisis 5 de los pedigríes extendidos ya que la no independencia inevitables de hermanos afectados daría el análisis conducido utilizando TRANSMIT y otros programas similares como ensayos no válidos de asociación aunque pueden permanecer adecuados para el análisis de ligando.

PDT se ha diseñado específicamente para superar esta limitación permitiendo el uso 10 de datos de tríadas relacionadas y descendencias discordantes de familias extendidas cuando fueron sometidas a ensayo para el LD.

[0196] Para rs1861972, el alelo A se transmite de nuevo de padres heterocigotos cuando los individuos bajo un diagnóstico amplio o reducido se incluyen en el análisis (reducido: 120 transmitido frente a 82 no transmitido; y amplio: 150 transmitido vs. 107 15 no transmitido). El alelo A también se sobre-representa en hermanos afectados de DSPs (definidos por ambos genotipos y la discordancia fenotípica) bajo ambos diagnósticos (reducido: 67 alelos en hermanos afectados y 50 en hermanos no afectados de 44 DSPs genotípicos; amplio: 89 en afectados y 63 en no afectados de 57 DSPs genotípicos). Estos resultados son significativos cuando son analizados por 20 PDT (reducido P=0.0106, amplio P=0.0050 (Tabla 3).

Tabla 3. Análisis PDT de rsl867972 y rsl867973 en los pedigríes extendidos.

Parental

Transmisiones DSPa

dbSNP Nº

Diagnóstico T U A UA Total Valorb-P

rsl867972

reducido 120 82 67 50 44 0.0106

rsl867972

amplio 150 107 89 63 57 0.0050

rsl867973

reducido 108 69 59 40 37 0.0033

Rs1867973

amplio 129 90 73 50 46 0.0063

a – Conteos de hermanos discordantes: A= Número total del alelo común en los 25 hermanos afectados y UA= número total del alelo común en hermanos no afectados de los DSPs discordantes genotípicos,

Total = número total de DPSs discordantes genotípicos.

b- Valor-P generado por PDT.

30

[0197] El análisis para el rs1861973 SNP reveló un patrón similar. El alelo C vuelve a sobretransmitirse a individuos afectados (reducido: 108 transmitidos frente a 68 no transmitidos, amplio: 129 transmitidos frente a 90 no transmitidos) y sobrerrepresentados en los hermanos afectados con DSPs (reducido: 59 en afectado y 40 en no afectados de 37 DSPs genotípicos; amplio: 73 frente a 50 en hermanos 5 afectados y no afectados respectivamente de 46 DSPs genotípicos). El patrón de herencia es significativo bajo el diagnóstico amplio y reducido cuando se analiza por PDT (reducido P=0.0033, amplio P= 0.0063) (Tabla 3). Por tanto, rsl861972 y rsl861973 demuestran una asociación significativa al autismo y a los trastornos AS relacionados. 10

[0198] Posteriormente se realizaron los análisis de haplotipos en los pedigríes extendidos. Dado que los dos SNPs están en un LD tenso y solo 152 bp separados de entre ellos, resulta extremadamente improbable que se produzca un evento de recombinación entre ellos en una muestra de este tamaño. En ausencia de recombinación, los haplotipos no ambiguos podrían asignarse a todos los individuos 15 en 160 de 166 pedigríes. Sólo 6 familias de la fase de haplotipo parental no pudieron distinguirse. Estos pedigríes se emitieron para un análisis posterior. Cada haplotipo se recodificó como un alelo individual. Al recodificar los haplotipos como un locus individual, las transmisiones podrían haberse analizado por PDT. El haplotipo A, C vuelve a sobretransmitirse bajo las clasificaciones de diagnóstico (reducido: 120 20 transmitidos frente a 66 no transmitidos, amplio: 143 transmitidos frente a 86 no transmitidos) y sobrerrepresentado en los hermanos afectados de DSPs (reducido: 64 frente a 45 de 44 DSPs genotípicos; amplio: 76 frente a 53 de 52 DSPs genotípicos) a niveles significativos (reducido P= 0.0007, amplio P= 0.0009) (Tabla 4). A la inversa, los haplotipos A,T, G,C y G,T están infratransmitidos. Los ensayos x2 globales para 25 todos los haplotipos también dieron valores-P significativos (reducido P=0.0003, amplio P= 0.0005) (Tabla 4). Estos resultados demostraron una asociación significativa entre EN2 y los trastornos del espectro autista.

Tabla 4. Análisis de haplotipo del pedigrí extendido.

Parental

Transmisiones DSPa

Haplotipoa

Diagnóstico T U A UA Total Valorb-P

A,C

reducido 120 66 64 45 44 0.0007

A,T

reducido 7 21 1 3 4 0.0136

G,C

reducido 7 20 3 5 8 0.0997

G,T

reducido 69 96 17 30 35 0.0299

Global

reducido 0.0003

Parental

Transmisiones DSPa

A,C

amplio 143 86 76 53 52 0.0009

A,T

amplio 10 25 1 3 4 0.0195

G,C

amplio 9 26 4 5 9 0.0587

G,T

amplio 92 117 20 40 43 0.0634

Global

amplio 0.0005

a- Haplotipos recodificados como alelos antes del análisis PDT.

b- Valor-P generado por PDT.

[0199] Las transmisiones de haplotipos también se investigaron para conocer el origen 5 y las diferencias de sexo utilizando ETDT (Sham and Curtis (1995), Ann Hum Genet 59: 323-336) y software TRANSMIT respectivamente. Cuando las transmisiones maternales y paternales se investigaron por separado, no se observó ningún ratio de diferencias de los padres en la transmisión (no se incluyen datos). Los individuos afectados masculino y femenino tienen las mismas posibilidades de heredar el 10 haplotipo A, C (no se incluyen datos). Por eso, estos datos no apoyan un padre significativo de efectos de origen o vinculados al sexo.

[0200] Los programas informáticos de predicción indican que estos polimorfismos no introducen nuevos aceptadores de uniones o ubicaciones de donantes. Los análisis similares han determinado que los alelos A y G de rsl861972 no alteran ninguna 15 ubicación vinculante de factor de transcripción putativo en el intrón. Sin embargo, el alelo C para rs1861973 genera un sitio vinculante de consenso para el factor de transcripción general, Spl. Esta diferencia potencial en la unión del factor de transcripción puede alterar la regulación transcripcional del EN2 y conferir un riesgo para el autismo. 20

Resultados

[0201] Estos datos representan la asociación genética más importante publicada para los trastornos de AS. La sobretransmisión de los alelos A y C de ambos SNPs indican que o bien están causando riesgos o estos SNPs están en desequilibrio de ligandos 25 con otros polimorfismos que contribuyen al autismo.

[0202] Los resultados de nuestro estudio de asociación junto con las similitudes en el fenotipo del cerebelo observado en el ratón con gen desactivado y los individuos autistas hacen que EN2 sean un excelente candidato para el locus de la susceptibilidad al autismo. Utilizando los datos de transmisión observados en nuestra 30

muestra, hemos estimado un riesgo relativo de genotipo de 2.19 y un riesgo atribuible de población del 69% para el haplotipo de predisposición A,C. En otras palabras, estos datos indican que si la población fuera monomórfica para los alelos G y T (protectivos) la prevalencia del autismo sería un 69% inferior. Estos datos sugieren una función significativamente importante para la variación en este locus en la etiología de AS. 5 Dado que GRR y PAR se calculan a partir de una población de muestra determinada para múltiples hermanos afectados, las estimaciones de riesgo real pueden ser diferentes en la población general AS. Las estimaciones de GRR en hermanos multiplex comparados con familias de un hijo se consideran distorsionado según la heredabilidad de origen (modelo multilocus del trastorno). Se espera, de hecho, que el 10 GRR se desinfle a un ritmo que sea proporcional a un aumento en la heredabilidad de origen y más precisamente estimada en situaciones de una heredabilidad de origen baja (Risch N (2001) Theor Popul Biol 60:215-220). Dado el modelo poligénico complejo de herencia con cualquier sitio entre 3-15 loci de interactuación que se han propuesto para AS, no está claro si cualquier efecto del verdadero modelo en nuestra 15 muestra ha estado en nuestras estimaciones de riesgo. Otros estudios en otra población o conjunto de datos basados en familia determinada individual deben confirmar el verdadero impacto de este locus.

[0203] En2 funciona en las modelizaciones del cerebelo durante el desarrollo. Aunque En2 se expresa tan pronto como el día embrionario 9.5 durante el desarrollo del 20 cerebelo del ratón, se considera que es redundante al En1 en una modelización anterior-posterior del tubo neuronal necesario para formar el cerebelo (Hanks et at (1995), Science 269:679-682; Liu and Joyner (2001), Annu Rev Neurosci 24:869-896). Con el gen desactivado se ha demostrado que En2 es esencial para el desarrollo del cerebelo postnatal normal (Millen et at (1994), Development 120:695-706; Millen et al 25 (1995), Development 121:3935-45; Kuemerle et ' al (1997), J Neurosci 17:7881-9). Aunque el cerebelo a menudo destaca por su estructura uniforme, estudios anatómicos y bioquímicos han determinado que el cerebelo es altamente estampado. Un número de genes incluyendo el En2 están expresados en rayas en el cerebelo postnatal. Se considera que estos genes coordinan la proliferación diferencial que es 30 potencialmente responsable de la adecuada foliación cerebelar y también el mapeo topográfico de los aferentes espinocerebelares y olivocerebelares (Hawkes and Eisenmann (1997), Perspect Dev Neurobiol 5:95-105). En la desactivación del En2, este modelización postnatal se interrumpe como se muestra la expresión anormal de genes, foliación y encaminamiento de aferentes (Vogel et al (1996), Brain Res Dev 35 Brain Res 96:210-218; Kuemerle et al (1997), J Neurosci 17:7881-9). Esta

modelización anormal podría o bien afectar la función del cerebelo o perturbar de manera indirecta las estructuras del cerebro anterior que media las capacidades sociales, de lenguaje y cognitivas observadas en el autismo. Futuros estudios determinarán si los polimorfismos en EN2 humano afectan los mismos procesos de desarrollo. 5

Ejemplo 2

[204] Para investigar si los hallazgos del Ejemplo 1 podrían replicarse en las poblaciones adicionales, se analizaron otras 239 familias de AGRE y 141 familias autistas de una recopilación separada fundada por el Instituto Nacional de Salud Mental (Nacional Institute of Mental Health o NIMH) y determinado por el grupo en la 10 Universidad de Stanford (Risch et al (1999) Am J Hum Genetics 65:493-507). La Tabla 5 enumera el número de familias, tríadas y DSPs analizadas para cada población. Estas muestras adicionales fueron genotipadas para rs1861972 y rsl 861973 y las pruebas para asociación con ASD se examinaron en estas poblaciones.

[205] El análisis de desequilibrio de la transmisión en el estudio original de 167 15 familias AGRE reveló que el alelo A de rsl861972 y el alelo C de rsl861973 fueron sobretransmitidos de padres heterocigotos y se sobrerrepresentaron en hermanos afectados comparados con los hermanos no afectados de DSPs (Gharani et al (2004) Mol Psychiatry 9:474-484). La asociación rsl861972 y rsl861973 se sometió a ensayo ahora en los conjuntos de datos recientemente adquiridos (Tabla 5) utilizando el 20 programa PDTPHASE (versión 2.404) (Dudbridge (2003) Genetic Epidim. 25:115-121), que es una modificación del ensayo de desequilibrio de la transmisión PDT basado en el pedigrí (Martin et al (2000) Am J Hum Genetics 67:146-154). PDTPHASE tiene un número de ventajas sobre el programa PDT. Primero, puede manejar los datos que faltan de los padres. PDT sólo incluye tríadas de familias para cuyos datos de genotipo 25 están disponibles de los dos padres. Hay 63 de 547 familias a las que les falta un padre en el conjunto total de familias (AGRE y NIMH). Estas familias fueron excluídas del análisis por el PDT que resultaba en una pérdida de poder. Segundo, PDTPHASE es capaz de realizar análisis multilocus. Además, PDTPHASE incluye un algoritmo EM que calcula las máximas posibles frecuencias gaméticas bajo las hipótesis nulas que 30 permiten la inclusión de haplotipos con fase incierta. En el Ejemplo 1, el análisis del haplotipo se dirigió conduciendo el programa PDT. Dado que el PDT está diseñado para un análisis de locus sencillo, cada haplotipo no ambiguo (construido utilizando la versión 2.86 de SIMWALK) se retiró como un alelo sencillo para permitir el ensayo de transmisión de haplotipo. Por ello, se utilizaron todas las familias en el análisis 35 incluyendo aquéllas que podrían excluirse por el método anterior (basándose en los

datos de los padres que faltan y haplotipos ambiguos) otra vez aumentan el poder estadístico del análisis.

Tabla 5 Número de familias, triadas y Pares sib discordantes (DSPs) analizados

Población

Diagnóstico Familiasc Triadasc DSPsc

AGREa

reducido amplio 227 238 371 467 270 320

NIMH

reducido amplio 142 144 253 264 75 77

AGRE TOTALc

reducido amplio 391 404 633 792 408 492

NIMH + AGRE

reducido amplio 533 548 886 1056 483 569

a - La población está comprendida por 239 familias AGRE adicionales. 5

b- Las 167 familias AGRE adicionales y las 239 familias AGRE recientemente obtenidas son referidas como AGRE TOTAL

c-Número de familias, tríadas y DSPs utilizadas por el programa PDTPHASE.

[206] Resultados de los análisis del marcador sencillo están presentes en la Tabla 6. 10 El análisis de rsl861972 en las familias AGRE recién adquiridas falla a la hora de proporcionar una asociación significativa bajo un diagnóstico reducido (P=0.1229) (Tabla 6). Cuando los miembros de las familias adicionales bajo el amplio diagnóstico se añadieron al análisis, se observó una asociación nominalmente significativa de rsl861972 con ASD (P=0.041) (Tabla 6). Para rsl861973, se obtuvieron resultados 15 similares. Bajo diagnóstico reducido, no se observó la asociación significativa. (P=0.0575) (Tabla 6). Sin embargo, al igual que rsl861972, cuando los individuos adicionales diagnosticados bajo un amplio criterio se añadieron al análisis, se obtuvo la asociación significativa (P=0.02) (Tabla 6).

20

Tabla 6. Resultados de la replicación rs1861972 y rsl861973 en pedigris extendidos.

Transmisionesc Parentales DSPd

Población

SNP Diagnóstico T U A UA χ2e Valorf-P

AGREa

rs1861972 reducido 479 451 387 374 2.175 0.1403

Amplio 599 559 463 443 3.939 0.0471

rs1861973

reducido 474 438 381 362 3.805 0.0511

Transmisionesc Parentales DSPd

Población

SNP Diagnóstico T U A UA χ2e Valorf-P

amplio 590 546 457 430 5.357 0.0206

NIMH

rs1861972 reducido 240 224 119 113 2.327 0.1272

amplio 246 230 121 115 2.241 0.1344

rs1861973

reducido 245 227 117 110 3.141 0.0764

amplio 252 233 119 111 3.522 0.0606

AGRE INSGESAMT

rs1861972 reducido 860 806 597 567 5.929 0.0149

amplio 1069 1001 724 677 8.93 0.0028

rs1861973

reducido 845 777 588 553 9.091 0.0026

amplio 1042 967 707 658 10.71 0.0011

NIHM+AGRE TOTAL

rs1861972 reducido 1100 1030 716 680 8.037 0.0046

amplio 1315 1231 845 792 11.06 0.0009

rs1861973

reducido 1090 1004 705 663 11.994 0.0005

amplio 1294 1200 826 769 13.878 0.0002

a – La población está compuesta por 239 familias AGRE adicionales.

b- Las 167 familias adicionales AGRE y las 239 familias AGRE recientemente obtenidas son denominadas AGRE TOTAL

c- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces 5 que el alelo frecuente no se transmite de los padres.

d – Conteos de hermanos discordante: A= número total del alelo común en hermanos afectados; UA= número total del alelo común en hermanos no afectados de DSPs.

e- Valores X2 globales calculados por PDTPHASEsum 10

f - Valor-P generado por PDTPHASEsum (1df).

[207] El mismo ensayo de desequilibrio del pedigrí se realizó entonces en el conjunto de datos NIMH (Tabla 6). No se obtuvo ninguna prueba para la asociación para el SNP intrónico bajo el diagnóstico reducido y el amplio (rs1861972-reducido: P=0.1272, 15 amplio: P=0.1344; rs1861973-reducido: P= 0.0764s amplio: P= 0.0606) (Tabla 6).

[208] Dado que se han empleado criterios adicionales para obtener todos los pedigríes AGRE, el conjunto de datos AGRE 167 previamente probado se combinó con las familias AGRE recientemente adquiridas y volvió a probarse la evidencia para asociación de los marcadores intrónicos. Al combinar estos conjuntos de datos se 20 observó una asociación más significativa para rsl861972 y rsl861973 bajo los

diagnósticos reducidos y amplios que en cualquier conjunto de datos individualmente (rs1861972-reducido: P=0.0130, amplio: P=0.0028; rsl861973-reducido: P=0.0025, amplio: P=0.0009) (Tabla 6). A continuación, para investigar si el conjunto de datos NIMH también puede añadir al desequilibrio de la transmisión, los pedigríes de las tres poblaciones se combinaron y se analizaron por PDTPHASE. Una vez más, se observó 5 un asociación más significativa bajo los criterios de diagnóstico que en cualquier población individualmente o en un conjunto de datos AGRE entero (rsl861972-reducido: P=0.0046, amplio: P=0.0009; rsl861973-reducido: P=0.0005, amplio: P= 0.0002) (Tabla 6). Por ello, la evidencia para la asociación de rs1861972 y rs1861973 con ASD se observa en las tres poblaciones. 10

[209] Como se estableció en el Ejemplo 1, rsl861972 y rsl861973 muestran un LD significativo con cada uno. La relación significativa de LD también se observa en las 239 familias adicionales (DM).967) y las 141 familias NIMH (D’=0.977). Las frecuencias de alelos para rsl861972 y rsl861973 en las dos nuevas poblaciones también son casi idénticas a cada uno y a lo que se publicó anteriormente (239 AGRE: 15 rsl861972 G alelo-0.29, rsl861973 C alelo-0.31; 141 NIMH: rsl861972 G alelo -0.29, rs1861973 C alelo-0.30).

[210] La similitud en la fuerza LD del inter-marcador y las frecuencias de los alelos SNP entre los tres conjuntos de datos indica que es posible que se deriven de la misma población y, por tanto, es probable que compartan una relación LD similar con 20 el variante etiológico putativo. Para investigar esto más a fondo, se examinaron los haplotipos rsl861972-rsl861973 en cada una de las poblaciones bajo los diagnósticos reducidos y amplios utilizando PDTPHASE. En los 239 pedigríes AGRE adquiridos recientemente, la transmisión del exceso significativo del haplotipo A-C rsl861972-rsl861973 a la descendencia afectada se observó bajo los criterios de los diagnósticos 25 reducidos y amplios (reducido: P=0.033; amplio: P=0.011) (Tabla 7). Los haplotipos A-T, G-C y G-T estaban todos infra-transmitidos (Tabla 7) y los ensayos X2 globales para todos los haplotipos produjeron valores-P importantes (reducido: P=0.0093; amplio: P=0.0028).

30

Tabla 7. Resultados de la replicación del haplotipo rsl861972-rsl861973 en pedigríes extendidos.

Transmisiones parentalesc DSPd

Población

Haplotipo Diagnóstico T U A UA X2c Valorf-P

AGREa

A-C reducido 470 429 381 362 0.03367

A-T 4 16 2 5 -

Transmisiones parentalesc DSPd

G-C 2 8 0 0 -

G-T 176 199 145 161 0.1552

global 9.339 0.00938

A-C amplio 584 533 457 430 0.01104

A-T 6 18 2 6

G-C 2 11 0 0

G-T 226 256 167 190 0.07547

global 11.69 0.0029

NIMH

A-C reducido 239 222 117 110 0.09611

A-T 1 2 0 1 -

G-C 6 5 0 0 -

G-T 88 105 29 35 0.2891

global 3.688 0.1582

A- C amplio 245 228 119 111 0.09118

A-T 1 2 0 2 -

G-C 7 5 0 0 -

G-T 91 109 31 37 0.09126

Global 3.839 0.1467

AGRE TOTALb

A-C Reducido 837 755 584 549 0.00077

A-T 12 39 7 9 -

G-C 6 21 4 4 -

G-T 285 325 197 230 0.02966

global 20.19 0.0000412

A-C amplio 1031 940 703 654 0.00027

A-T 17 44 7 10 -

G-C 7 25 4 4 -

G-T 365 411 236 282 0.0138

global 22.5 0.0000163

Transmisiones parentalesc DSPd

Población

Haplotipo Diagnóstico T U A UA X2c Valorf-P

NIMH+

A-C 1076 977 701 659 0.00018

AGRE

A-T 13 41 7 10 -

TOTAL

G-C 12 26 4 4 -

G-T 373 430 226 265 0.00833

global 23.05 0.00000985

A-C Amplio 1276 1168 822 765 0.0000607

A-T 18 46 7 12 -

G-C 14 30 4 4 -

G-T 456 520 267 319 0.00371

Global 24.89 0.00000392

a -La población está comprendida por 239 familias AGRE adicionales.

b- Las 167 familias AGRE adicionales y las 239 familias AGRE recientemente obtenidas son referidas como AGRE TOTAL.

c- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces 5 que el alelo frecuente no se transmite de los padres.

d – Conteos de hermanos discordantes: A= Número total de alelo común en hermanos afectados; UA= número total de alelo común en hermanos no afectados con DSPs.

e- Valores X2 globales calculados por PDTPHASEsum, limitado a los haplotipos 10 comunes con la frecuencia superior al 5%.

f- Valor-P generado por PDTPHASEsum (1df para un haplotipo sencillo y 3df para los ensayos globales).

[0211] Se examinaron transmisiones de haplotipos para el conjunto de datos NIMH y no se observaron muestras de sobretransmisión bajo los diagnósticos reducido y 15 amplios para cualquiera de los haplotipos A-C, A-Ts G-C y G-T (Tabla 7). El ensayo X2 global también produjo valores-P no significativos bajo el criterio del diagnóstico amplio

(reducido: P = 0.1582; amplio: P = 0.1467)(Tabla 7).

[0212] A continuación, los 167 pedigríes AGRE se combinaron con las 239 familias AGRE recientemente adquiridas y las transmisiones de haplotipos se analizaron para 20 las muestras totales de AGRE. Como para los análisis de SNP individuales, se observó una mayor importancia de asociación para el haplotipo A-C ahora en el conjunto de datos combinado que en cualquier población individualmente (reducido:

P=0.0007; amplio: P= 0.00026) (Tabla 7). Los haplotipos A-T, G-C y G-T estaban todos infra-transmitidos a los individuos afectados y los ensayos X2 globales para todos los haplotipos produjeron valores-P muy importantes bajo los diagnósticos reducido y amplio (reducido: P=0.0000412; amplio: P=0.00000162) (Tabla 7). Por último, cuando se combinaron las 3 poblaciones, los valores P más significativos se 5 observaron para los haplotipos A-C (reducido: P=0.00018; amplio: P=0.00000607) (Tabla 7) y el X2 global (reducido: P=0.00000985; amplio: P=0.00000392). Coherente con el análisis del marcador individual, las pruebas para la asociación del haplotipo rsl861972-rsl861973 con ASD se observó en las tres poblaciones.

Población

Transmisiones a: reducido amplio

Tb UTb Valorc-P Tb UTb Valorc-P

AGRE

Descendencia masculina A-C 826 753 0.0004 971 898 0.0009

TOTALa & NIMH

A-T 10 32 0.0019 11 36 0.0005

G-C 11 23 0.05 13 26 0.063

G-T 295 334 0.024 357 392 0.049

global 0.000036 0.000047

Descendencia femenina A-C 250 224 0.049 305 270 0.02

A-T 3 9 0.18 7 10 0.52

G-C 1 3 0.16 1 4 0.08

G-T 78 96 0.13 99 128 0.045

global 0.0585 0.0227

10

[0213] Dado el poder aumentado de este conjunto de datos mayor, las transmisiones de haplotipos rsl861972-rsl861973 volvieron a examinarse para ver las diferencias de sexos y los efectos del padre de origen. Anteriormente, 138 tríadas de las 167 familias AGRE se analizaron y no existen pruebas de una tendencia por sexo ni se observó un efecto de un padre de origen. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la muestra, 15 estos análisis estratificados eran probables de tener poca potencia. En las 547 familias que incluyen el conjunto de datos total, existen 194 y 694 mujeres y hombres afectados respectivamente bajo un diagnóstico reducido y 237 mujeres afectadas y 816 hombres afectados bajo el análisis amplio. Cuando las transmisiones del haplotipo rs1861972-rsl861973 se analizaron por sexo de la descendencia, los valores-P 20 obtenidos para las transmisiones a la descendencia masculina (reducido: P=0.00040;

amplio: P=0.00092) fueron más significativos que los obtenidos para las transmisiones a la descendencia femenina (reducido: P=0.049; amplio: P=0.021) (Tabla 8A). Valorar si esto se debe al mayor número de varones afectados que de mujeres en el conjunto de datos, se utilizaron 2 por 2 tablas de contingencia y el ensayo exacto de Fisher para comparar las transmisiones del haplotipo A-C rsl861972-rsl861973 a la descendencia 5 masculina y femenina bajo el diagnóstico reducido y amplio. No se observó diferencia significativa entre los ratios de transmisión bajo los dos planes de diagnóstico (reducido: un lado exacto de Fisher P=0.455; amplio: un lado exacto de Fisher P=0.340), que indica que los individuos masculinos y femeninos afectados tienen las mismas posibilidades de heredar el haplotipo A-C rsl861972-rsl861973. 10

Tabla 8A: Análisis del haplotipo por tendencia del sexo rsl861972-rsl861973

Población

Transmisiones a: reducido amplio

Tb UTb Valorc-P Tb UTb Valorc-P

AGRE

Descendencia masculina A-C 826 753 0.0004 971 898 0.0009

TOTALa & NIMH

A-T 10 32 0.0019 11 36 0.0005

G-C 11 23 0.05 13 26 0.063

G-T 295 334 0.024 357 392 0.049

global 0.000036 0.000047

Descendencia femenina A-C 250 224 0.049 305 270 0.02

A-T 3 9 0.18 7 10 0.52

G-C 1 3 0.16 1 4 0.08

G-T 78 96 0.13 99 128 0.045

global 0.0585 0.0227

a- Las 167 familias adicionales AGRE y las 239 familias AGRE recientemente obtenidas son denominadas AGRE TOTAL 15

b- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces que el alelo frecuente no se transmite de los padres.

c- Valor-P generado por PDTPHASE (1df para un haplotipo sencillo y 3df para los ensayos globales).

20

[0214] Para investigar los posibles efectos de padre de origen, las transmisiones maternales y paternales para todo el conjunto de datos se analizaron por separado utilizando TDTPHASE (versión 2.404) y se incluyeron las transmisiones para los padres heterocigotos a un único descendiente afectado por familia. Los datos de transmisión maternal y paternal se compararon entre sí y con las transmisiones de los 5 padres combinadas bajo los dos esquemas de diagnósticos (Tabla 8B). Bajo un diagnóstico reducido, había 336 padres A-C/- heterocigoto de los cuales 172 eran padres heterocigotos y 164 eran madres heterocigotos. El análisis de datos de los padres combinados demostraron que 204 de los 336 padres heterocigotos (60.7%) transmitieron el haplotipo A-C y la distorsión de la transmisión del haplotipo global 10 resultó ser altamente significativa (P=0.000072). El análisis por sexo del padre reveló que ambos padres sobretransmitieron de manera significativa el haplotipo A-C a la descendencia afectada (transmisiones paternales P=0.021, transmisiones maternales P=0.00025) (Tabla 8B). Las transmisiones maternales demostraron una mayor distorsión del ratio de transmisión de expectativa del 50% que las transmisiones 15 paternales (ratio de transmisión maternal 64.6% frente al 57% paternal).

Tabla 8B: Análisis del haplotipo padre de origen rs1861972-rs1861973

Población

reducido amplio

Tb UTb Valorc -P Tb UTb Valorc -P

AGRE TOTALa & NIMH

Transmisiones Parentales A-C A-T G-C G-T global 204 4 5 135 132 19 11 186 0.00068 0.0011 0.1289 0.013 0.000072 215 8 6 140 140 18 11 200 0.00054 0.05489 0.2218 0.0047 0.0019

Transmisiones maternales A-C A-T G-C G-T global 106 2 3 59 58 11 5 96 0.00016 0.0088 0.4772 0.0028 0.00025 109 4 4 64 65 11 5 100 0.00079 0.06532 0.7386 0.0047 0.00446

Transmisiones paternales A-C A-T G-C G-T global 98 2 2 76 74 8 6 90 0.0668 0.049 0.148 0.2769 0.0495 106 4 2 76 75 7 6 100 0.021 0.3627 0.148 0.07 0.075

a- Las 167 familias AGRE adicionales y las 239 familias AGRE recientemente 20 obtenidas son denominadas AGRE TOTAL

b- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces que el alelo frecuente no se transmite de los padres.

c- Valor-P generado por TDTPHASE (1df para un haplotipo sencillo y 3df para los ensayos globales). 25

[0215] Un patrón similar de ratios de transmisión se observó bajo el amplio diagnóstico con 215 de 355 padres heterocigotos A-C (60.6%) que transmitían el haplotipo A-C. 106 de 181 (58.7%) eran transmisiones paternales y 109 de 174 (62.6%) eran transmisiones maternales, todas ellas produjeron significativos valores-P globales (de 5 los padres combinados P=0.00063; paternal P=0.034; maternal P=0.0045) (Tabla 8B). Estos datos indican que los individuos afectados con ASD tienen más probabilidades de heredar el haplotipo maternal A-C rs1861972-rsl861973 que el haplotipo paternal, sugiriendo un efecto de padre de origen. Dado que los efectos padre de origen son indicativos de una marcación genómica y dado que la marcación genómica está 10 regulado por un mecanismo epigenético como metilación (Delaval and Feil (2004) Curr Opin Genet Dev 14: 188-195; Kaneda et al (2004) Nature 429: 900-903), estos resultados sugieren que EN2 puede ser marcarse genómicamente y la disregulación epigenética de EN2 puede contribuir a ASD.

[216] Para determinar si otros polimorfismos EN2 también muestran asociación con 15 ASD, otros cinco polimorfismos (rs6150410, rsl345514, rs3735653, rs3824068 y rs2361689) que abarcan la mayoría del gen EN2 han sido sometidos a ensayo para la asociación en el conjunto original de 167 pedigríes nucleares AGRE. El rs3824068 SNP está localizado en el intrón 495bp hacia arriba del rsl861972. El rs3735653 SNP está localizado en el exon 1,2560 bp 5' de rs18619729 y altera un Phe por un Leu. El 20 rs2361689 SNP está localizado en el exón 2, 1187 bp 3' de rsl861973 y cambia el uso del codón por Leu. Los polimorfismos rs6150410 y rsl345514 están localizados en el promotor, 1799bp y 265bp 5' del emplazamiento de inicio transcripcional respectivamente (la Figura 5, que muestra una representación esquemática del gen humano ENGRAILED 2 con la ubicación y nombre de los polimorfismos sometidos a 25 ensayo para la asociación con ASD). La frecuencia del alelo raro para cada uno de estos polimorfismos se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9. Características de EN2 SNP

dbSNP No.

Posición Polimorfismob Frecuenciac

rs6150410

Promotor CGCATCCCC/- 0.347

rsl345514

Promotor C/T 0.345

rs3735653a

Exón l C/T 0.489

rs3824068

Intrón C/T 0.375

rsl861972a

Intrón C/T 0.281

rsl861973a

Intrón C/T 0.287

dbSNP No.

Posición Polimorfismob Frecuenciac

rs2361689a

Exón 2 T/C 0.320

a- Frecuencia de alelos indicados anteriormente (Gharani et al (2004) Mol Psychiatry 9:474-484)

b- El segundo alelo es un alelo raro.

c- Frecuencia de alelo raro. 5

[217] Cuando se comprobó que los genotipos estaban en el equilibrio Hardy-Weinberg, se valoraron para cada polimorfismo las transmisiones alélicas mediante la versión PDT 4.0 o por el programa 2.404 de la versión PDTPHASE (Dudbridge (2003) Genetic Epidim. 25:115-121). 10

Bajo diagnóstico reducido, se observó una tendencia hacia la sobretransmisión a los individuos afectados y la sobrerepresentación en DSPs del alelo A raro para rs3824068, pero esto no fue estadísticamente importante (P=0.065) y no se observó bajo un amplio diagnóstico (P=0.157) (Tabla 10). No se observó ninguna evidencia de asociación para rs6150410, rsl345514, rs3735653 o rs2361689 bajo los diagnósticos 15 reducido o amplio (rs6150410-reducido: P=0.887, amplio: P= 0.902; rsl345514-reducido: P=0.581 amplio: P=0.389)(Tabla 10).

Tabla 10. Resultados de rs6150410, rsl345514, rsl345514, rs3824068 o rs2361689 PDT y PDTPHASE en los pedigríes AGRE iniciales. 20

Transmisiones Parentalesb DSPc

Población

SNP Diagnóstico T U A UA χ2d Valore- P

AGREa

rs6150410 rs1345514 rs3735653 rs3824068 rs2361689 reducido amplio reducido amplio reducido amplio reducido amplio reducido amplio 319 398 271 333 118 150 282 362 119 146 317 393 279 334 137 165 313 386 114 153 191 241 165 211 111 144 160 209 143 172 194 245 170 217 97 97 170 219 115 117 0.0022 0.0017 0.2692 0.0477 1.23 0.89 3.424 2 0.02 0.39 0.9623 0.9668 0.6039 0.8271 0.2685 0.3444 0.0642 0.1573 0.8877 0.5323

a- Las 167 familias AGRE iniciales.

b- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces que el alelo frecuente no se transmite de los padres heterocigotos. 25

c – Conteos de hermanos discordante: A= Número total de alelo común en hermanos afectados; UA= número total de alelo común en hermanos no afectados con DSPs.

d- Valores X2 globales calculados por PDTsum para rs3735653 y rs2361689 y por PDTPHASEsum para rs6150410, rsl345514 y rs3824068. 5

e- Valor-P generado por PDT (ldf) por rs3735653 y rs2361689 y por PDTPHASE (ldf) para rs6150410, rsl345514 y rs3824068.

[0218] Se determinaron entonces relaciones LD del intermarcador para los 7 polimorfismos que se han estudiado (Figura 6 y Tabla 11). Tal y como se mencionó anteriormente, rsl861972 y rsl861973 están en un LD tenso con cada uno (D'=0.902). 10 Este análisis demuestra que rs3824068 también es fuerte en LD con rsl861972 (D'=0.899) y rsl861973 (D'=0.909)

Los polimorfismos del promotor, rs6150410 y rsl345514, no están en LD con rsl861972 (D'=0.092) y rs1861973 (D'=0.041) sino que están en el LD fuerte con cada uno (D'=0.949) (Figura 6 y Tabla 11). Por último, los SNPs exónicos, rs3735653 y 15 rs2361689 muestran los valores intermedios D’ para los polimorfismos del promotor y también para rsl861972 y rsl861973. Estos datos indican que los dos bloques LD separados, uno en el promotor y otro en el intrón, existen para EN2 (Figura 6 y Tabla 11). La Figura 6 muestra una ilustración esquemática para los valores del desequilibrio de ligando para los siete polimorfismos sometidos a ensayo para la asociación del gen 20 EN2. Cada polimorfismo está representado por los siguientes números: 1= rs6150410; 2= rsl345514; J= rs3735653; 4= rs3824068; 5= rsl861972; 6= rsl861973; 7=rs2361689. La posición de los polimorfismos en EN2 se dibuja a escala. El código de color para la fuerza del LD (D') se muestra a la derecha, variando de 0.04 para el LD débil a 1 para el LD fuerte. 25

Tabla 11. Valores LD del intermarcador para los polimorfismos EN2

M1a

M2a χ2b Valorc -P D’d

1 1 1 1 1 1 1 2 2

2 3 4 5 6 7 3 4 5 449.20 100.39 63.54 0.52 0.12 33.65 94.59 54.14 0.75 <0.00001 <0.00001 <0.00001 0.47212 0.72877 <0.00001 <0.00001 <0.00001 0.38569 0.949 0.694 0.486 0.092 0.041 0.657 0.694 0.472 0.123

M1a

M2a χ2b Valorc -P D’d

2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 6

6 7 4 5 6 7 5 6 7 6 7 7 0.37 22.57 156.67 18.21 23.05 45.49 72.07 84.12 133.02 364.64 24.75 26.92 0.54090 <0.00001 <0.00001 0.00002 <0.00001 <0.00001 <0.00001 <0.00001 <0.00001 <0.00001 <0.00001 <0.00001 0.078 0.585 0.781 0.394 0.421 0.536 0.899 0.909 1.000 0.902 0.634 0.605

a - El nombre de los polimorfismos está representado por los siguientes numerales: 1-rs6150410; 2-rsl345514; 3-rs3735653; 4-rs3824068; 5-rsl861972; 6-rsl861973; 7-rs2361689

b- Valores X2 calculados por el programa GOLD (1999-2001) 5

c- Valores P calculados por el programa GOLD (1999-2001)

d- Valores D' LD calculados por el programa GOLD (1999-2001)

[0219] Por último, el análisis de haplotipo multi-SNP 3,4 y 5 se realizó para investigar si el haplotipo A-C rsl86l972-r186l973 se asoció de manera consistente con ASD. Este 10 análisis falló a la hora de proporcionar una evidencia significativa de asociación de cualquier haplotipo específico con ASD bajo los criterios de diagnóstico. Dado que rs3824068 está en el LD fuerte con rsl861972 y rsl861973 y muestra una tendencia hacia la asociación bajo un diagnóstico reducido, este SNP ahora se incluyó en el análisis del haplotipo multi-SNP. En un análisis de tres haplotipos SNP con rsl861972 15 y rsl861973, siete de los ocho diferentes haplotipos se observaron en la población, pero ninguno de ellos está significativamente asociado con ASD bajo los criterios de diagnóstico. Dos haplotipos contienen el haplotipo A-C central asociado rsl861972-rsl861973. El haplotipo T-A-C está mínimamente asociado con ASD bajo los criterios de diagnóstico reducido pero no bajo el diagnóstico amplio (reducido: P=0.037; amplio: 20 P=0.123) mientras que el C-A-C no esté asociado con ASD bajo ambos criterios de diagnóstico (reducido: P=0.736; amplio: P=0.404) (Tabla 12).

25

Tabla 12. Análisis del haplotipo rs3824068-rsl861972-rsl861973: resultados PDTUNPHASE bajo los diagnósticos reducido y amplio.

Transmisiones parentalesb DSPc

Población

Haplotipo Diagnóstico T U A UA χ2d Valore-P

AGREa

C-T-C C-T-T C-C-C C-C-T T-T-C T-T-T T-C-T Global C-T-C C-T-T C-C-C C-C-T T-T-C T-T-T T-C-T Global reducido amplio 160 5 4 105 192 3 3 205 8 5 132 224 3 3 158 17 9 124 158 5 1 196 20 10 149 197 5 3 91 3 4 51 106 2 1 116 3 4 69 123 2 1 86 0 4 69 95 2 0 105 0 4 91 114 2 1 7,514 6,289 0.7356 - - 0.5258 0.0366 - - 0.0572 0.4043 - - 0.0816 0.123 - - 0.0983

a- Las 167 familias AGRE iniciales 5

b- T= número de veces que se transmite el alelo frecuente; U= número de veces que el alelo frecuente no se transmite de los padres heterocigotos.

c – Conteos de hermanos discordante: A= Número total de alelo común en hermanos afectados; UA= número total de alelo común en hermanos no afectados con DSPs. 10

d- Valores X2 globales calculados por PDTPHASEsum

e- Valor-P generado por PDTPHASEsum (1df para un haplotipo sencillo y 3df para los ensayos globales).

Estos datos proporcionaron pruebas de que el haplotipo A-C rsl861972-rsl861973 no 15 está siempre asociado con ASD. Cuatro análisis del haplotipo SNP para rs3735653-rsl861972-rsl861973-rs2361689 confirma que el haplotipo A-C rsl861972-rsl861973 no siempre está asociado con ASD (Tabla 13). Juntos, todos nuestros datos indican que los alelos A y C de rsl861972 y rsl861973 no parecen ser funcionales y que el variante putativo etiológico está en un LD fuerte con rsl861972 y rsl861973. Otro trazado de LD 20 y análisis de asociación de otros variantes en la región trazarán el mapa e identificarán el variante etiológico.

Tabla 13. Resultados PDT del haplotipo rs37356539, rsl867972, rsl867973 y rs2361689 en 446 pedigríes analizados bajo los diagnósticos amplios y reducidos.

Transmisiones parentalesb DSPc

Haplotipoa

Diagnóstico T U A UA χ 2d Valore-P

C-A-C-T T-A-C-T T-G-C-T C-A-T-T T-A-T-T C-G-T-T T-G-T-T C-A-C-C T-A-C-C C-G-C-C C-A-T-C C-G-T-C T-G-T-C Global C-A-C-T T-A-C-T T-G-C-T C-A-T-T T-A-T-T C-G-T-T T-G-T-T C-A-C-C T-A-C-C C-G-C-C C-A-T-C C-G-T-C T-G-T-C Global

reducido amplio 45 119 3 1 1 53 19 72 32 1 1 11 1 57 137 3 3 2 67 25 88 43 1 1 15 1 34 86 6 5 5 63 29 78 23 4 6 12 1 42 112 9 10 5 77 37 95 29 5 7 14 1 23 65 2 1 2 28 9 47 13 1 1 3 1 33 70 2 1 2 34 12 56 21 1 1 6 1 21 45 2 0 1 27 10 36 10 0 1 6 1 21 46 2 0 1 27 11 36 10 0 1 6 1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 17.63 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 16.76 0.3800 0.0402 0.1573 0.0896 0.2059 0.2004 0.2050 0.8658 0.3402 0.4142 0.2253 0.5791 0.3173 0.1276 0.2924 0.1532 0.1573 0.1573 0.4054 0.2322 0.1228 0.8383 0.1093 0.3173 0.1797 0.7456 0.3173 0.1587

5

a – Haplotipos recodificados como alelos antes del análisis PDT.

b – Transmisiones de los padres: T= número de veces que el alelo común transmitió y U= número de veces que el alelo común no se transmitió de padres heterocigotos.

Un total de 271 tríadas se incluyeron en este análisis. 10

c - Conteos de hermanos discordantes. A= Número total de alelo común en hermanos afectados y UA = número total del alelo común en hermanos no afectados del DSPs discordante genotípico. Un total de 151 DSPs se incluyeron en el análisis.

d –Valores X2 globales calculados por PDTsum (26). 15

e – Valor-P generado por PDT (1df para los valores-P del haplotipo sencillo y 12df para el ensayo global).

<110> Universidad de Medicina y Odontología de New Jersey

Rutgers, Universidad Estatal de Nueva Jersey

Millonig, James H. 5

Brzustowics, Linda

Gharani, Neda

<120> Genes como herramientas diagnósticas para el autismo

<130> CABM – 03 – 16 –PCT

<140> Nueva aplicación de PCT 10

<141> 2004-06-02

<150> 60/484, 633

<151> 2003-07-03

<160> 12

<170> Versión de patente 3.2 15

<210> 1

<211> 10088

<212> DNS

<213> Homo Sapiens

<400>1 20

03-16 PCT.ST25.txt

03-16 PCT.ST25.txt

03-16 PCT.ST25.txt

03-16 PCT.ST25.txt

03-16 PCT.ST25.txt

03-16 PCT.ST25.txt

210> 3

<211> 24 5

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebo exterior delantero para intrón 1 A/G umkehren 10

<400> 3

tgaagctggg gccagatgct ccta

<210> 4 15

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5

03-16 PCT.ST25.txt

<223> Cebo exterior trasero para intrón 1 A/G

5

03-16 PCT.ST25.txt

Claims (1)

1. Un método de diagnóstico in Vitro para determinar la predisposición, el comienzo o presencia del trastorno del espectro autista en una persona. Dicho método incluye detectar en esa persona la existencia de un cambio en un segmento intrónico del 5 genoma, cuyo segmento está localizado al menos dentro de la porción del cromosoma 7 tal y como se establece en la SEC. ID. Nº: 1 y en donde dicho cambio incluye una transición de G a A en la posición 5579 y/o una transición de T a C en la posición 5731 de la SEC. ID. Nº 1.

10