EP0767840A2 - Verfahren zum einbringen von fremdmaterial in höhere eukaryotische zellen - Google Patents

Verfahren zum einbringen von fremdmaterial in höhere eukaryotische zellen

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EP0767840A2
EP0767840A2 EP95920887A EP95920887A EP0767840A2 EP 0767840 A2 EP0767840 A2 EP 0767840A2 EP 95920887 A EP95920887 A EP 95920887A EP 95920887 A EP95920887 A EP 95920887A EP 0767840 A2 EP0767840 A2 EP 0767840A2
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EP
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dna
cells
cell
gene
adenovirus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95920887A
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English (en)
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Matthew Cotten
Adam Baker
Susanna Chiocca
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Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a
  • Standard methods for transfecting cells include Calcium phosphate (for in vitro applications), cationic lipids (Feigner et al., 1993) or liposomes.
  • Vector systems for the transfer of genes into the cell (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769).
  • Adenoviruses or fusogenic peptides are used to increase the efficiency of the gene transfer by breaking down the DNA complexes internalized into the cell in the
  • Lysosomes are avoided (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b;
  • Adenovirus-polylysine conjugates can be conjugated with transferrin-polylysine conjugates with DNA
  • Adenovirus mutants suggest that host responses are very early, possibly even before viral gene expression.
  • One component of this host response is one
  • interferon responsive genes genes that respond to interferon
  • ISGF3 interferon responsive transcription factor
  • Binding sites are located upstream of a series of genes responsive to interferon.
  • One of the activated genes is the protein kinase p68, which is activated by double-stranded RNA.
  • p68 is synthesized in an inactive form and is autocatalytic in the presence of dsRNA
  • NF-KB has also been reported to be activated by dsRNA
  • p68 may directly phosphorylate IKB and activate NF- ⁇ B.
  • the type C adenoviruses have two strong mechanisms to address this translation arrest by the host
  • the Ela gene products can directly interfere with the activation of ISGF3 (Gutch and Reich, 1991; Ackrill et al., 1991).
  • a second, more direct-acting mechanism uses the VA1 genes.
  • the gene product forms a stable secondary structure which can bind to the p68 kinase without activating the kinase and which can prevent binding and activation by the actual activators (Manche et al., 1992;
  • Another inflammatory reaction mechanism as a result of the entry of virus is likely to be the activation of the inflammatory transcription factor NF-IL-6 and the secretion of the inflammatory cytokine IL-6 (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992).
  • This factor in turn, often in conjunction with NF- ⁇ B, activates the IL-6 gene itself as well as a number of other inflammatory response genes such as TNF and IL-1.
  • IRF 1 Interferon Response Factor 1
  • Adenovirus ensures the triggering of the virus gene expression cascade.
  • Another line of defense of the host cell is the apoptotic response. It has long been known that mutations that map in the EIB 19K region for the deg phenotype, an enhanced cytopathic effect that is accompanied by degradation of the host's chromosomal DNA (D'Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt and Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984). Younger ones
  • Virus infection can be (Levine et al., 1993): In the absence of Bcl-2, the cell undergoes apoptosis, which limits virus production to a short, acute phase. Chronic virus production takes place in the presence of Bei-2 expression because the apoptotic response to the acute phase infection is absent. Anti-apoptotic activities were also undertaken in the Epstein-Barr virus (the BHER1 gene; Pearson et al.,, 1987), in the baculovirus (the p35 gene; Sugimoto et al., 1994) and in the African swine fever virus (the LMW5-HL gene; Neilan et al ., 1993). This indicates that the apoptotic response to the virus infection occurs in many cases and virus strategies have been developed to block this response.
  • the viral capsid acts only as a reagent that breaks the endosomes, which is a function of the surface proteins of the viral capsid. Inactivation methods have been developed which
  • LPS lipopolysaccharide
  • the object of the present invention was to elucidate the mechanisms involved in the
  • the present invention relates to a method for treating higher eukaryotic cells
  • a) introduces one or more nucleic acid molecules, in particular DNA molecules, into the cells, the expression products of which by introducing the
  • Block at least partially apoptosis of the host cell triggered by foreign material, and / or that b) at least partially inhibit the inflammatory response of the cells by
  • the cells are treated externally with one or more anti-inflammatory substance (s) and / or
  • DNA molecules encoding nucleic acid, especially DNA molecules.
  • the DNA molecules defined in a) are referred to below as “anti-apoptosis genes” or as “DNA molecules with anti-apoptosis activity”.
  • the cells in addition to components a) and optionally b) ii)
  • apoptosis encompasses all toxic effects which are attributable to a) direct activation of the apoptotic response; b) activation of reactive oxygen metabolites which directly or indirectly induce apoptosis; c) Activation of the secretion of TNF, IL-6 or another cytokine, which the
  • Adenovirus that is introduced into the cell. This
  • Toxicity effects occur are applied, in particular to gene transfer methods, e.g. when using recombinant adenovirus vectors.
  • gene transfer methods are used in vitro and in gene therapy both in vivo and ex vivo, in particular in fibroblasts, hematopoietic cells, endothelial cells or lung epithelial cells.
  • the use of the method according to the invention can also include all applications in the treatment of eukaryotic cells in which one
  • the transplanting cells can prevent apoptosis.
  • the anti-apoptosis gene is the human Bcl-2 gene (Seto et al., 1988).
  • the anti-apoptosis gene is the EIB 19K gene of adenovirus type 2 or 5 (White and Cipriani, 1990).
  • Anti-apoptosis genes suitable for the invention are the BHRF1 gene of the Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and ia
  • African swine fever virus (Neilan et al., 1993) and the ced-9 gene from Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al .; 1994).
  • proteases involved proteins similar to Bei-2 and Bei-2 are believed to block activation of the proteases designated ICE or ICE-like. Since these protease (s) obviously have a crucial function for apoptosis, their blocking also plays a crucial role.
  • a component which acts further upstream in the apoptosis signal transmission path is, for example, p53, the activation of which triggers one of the signal transmission paths which lead to apoptosis.
  • genes that inactivate p53 are EIB 55K from adenovirus type 2 or type 5 (White and Cipriani, 1989) or El functions from other strains of adenovirus, e.g. Adenovirus 12 or from CELO virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), the E6 gene from human
  • Papillomavirus-16 (Levine, 1990), SV 40's large T antigen (McCarthy et al., 1994), the mdm-2 gene
  • Mammalian cells e.g. Fibroblasts, with a
  • Reporter plasmid e.g. a luciferase plasmid to transfect and monitor expression of the reporter gene over a period of time.
  • test DNA e.g. genomic virus DNA fragments or DNA molecules from a cDNA library
  • suitable expression vectors e.g.
  • the cells are optionally additionally transfected with a DNA sequence which is known to be the
  • the anti-apoptotic effect of a test DNA sequence is shown by the fact that when the cells are co-transfected with it Sequence the expression of the reporter gene is higher than when transfecting the cells with the reporter gene alone.
  • the effect of the test gene can be compared with that of the known gene.
  • an anti-apoptotic DNA molecule of the chicken adenovirus type I was first used in the context of the present invention
  • CELO Chicken Embryo Lethal Orphan
  • This DNA molecule lies on a Smal / Hindlll fragment which is located in the CELO virus genome in the range between approximately 84.3 to approximately 88.7 mapping units.
  • the nucleotide sequence shown in FIG. 14 was determined from the Smal / HindiII fragment isolated in the context of the present invention (SEQ ID NO: 1).
  • the Smal / HindiII fragment was obtained from an EcoRI fragment called 9R1, which ranged from 81.2 to 92.7 mapping units
  • all of the CELO virus fragments obtained which have the anti-apoptotic effect such as e.g. the
  • the EcoRI fragment 9R1 of which the Smal / HindIII fragment is a partial sequence, can be used as a whole.
  • a further possibility consists in the HindiII fragment of the located between mapping units 77.8 and 88.7 on the CELO virus genome
  • Fragments 9R1 and 7H3 have an 80% overlap area that
  • the size of the DNA molecule in the area or in the vicinity of the specified fragment areas is not critical.
  • the DNA which essentially consists only of the open reading frame, is preferably used.
  • This DNA can optionally be shortened to the sections responsible for the anti-apoptotic function, or mutants can be constructed with a view to enhancing the activity.
  • the selection of suitable mutants can be carried out by testing correspondingly mutated DNA sequences, as described in the examples, for their ability to increase gene expression.
  • Reading frame is by screening the mutated DNA sections for anti-apoptotic effects. A number of deletion mutants were constructed for this. It turned out that all those constructions by which
  • GAM-1 the amino acid sequence is given in SEQ ID NO: 2 also showed a series of seven leucine residues. This motif is known to fold into a structure (called “leucine zipper”) that is often a site of protein-protein interactions (Busch and Sassone-Corsi, 1990; Lumb and Kim, 1995) assumed that the
  • Leucine-zipper dimersization domain works as an alpha-helical structure, the introduction of amino acids such as proline, which destroy alpha-helices, can thus impair zipper dimerization. It was
  • GAM-1 therefore either functions as a homodimer or there are other binding partners for GAM-1.
  • GAM-1 has no homologies with any of the known anti-apoptical proteins, including members of the Bcl-2 family, adenovirus 5 EIB 19K, the Bax family, the baculovirus IAP family, the
  • Nematode protein Ced-3 (Furthermore, the complete sequence of the CELO virus genome showed that the CELO virus has no genes that are homologous to the Ad2 / 5 EIB 19K region. It could therefore be that the CELO virus has no EIB 19K region and hence the GAM-1 gene function used as an anti-apoptotic gene.)
  • the invention thus relates to a DNA molecule containing the ones in FIG. 14 or SEQ ID NO: 1 shown nucleotide sequence or a partial sequence thereof coding for a functional gene product with anti-apoptotic effect.
  • a DNA molecule with the sequence of the open one shown in FIG. 14 or SEQ ID N0: 1 is preferred
  • Reading frame including degenerate variants of it, or mutants for a functional
  • the invention relates to those derived from the DNA molecules according to the invention
  • Polypeptides in particular the protein of the designation GAM-1 (SEQ ID NO: 2) encoded by the open reading frame, and functional derivatives thereof.
  • Mechanism may be one
  • Fibroblasts were transfected on the one hand with a luciferase reporter gene and on the other hand with test plasmids which contained different fragments of GAM-1. Two days later, the cells were trypsinized and a defined number of cells were plated on polyHEMA-coated cell culture plates. Seven days later, the adherent and non-adherent cells were harvested and examined for luciferase activity. It was found that the
  • Plasmid encoding EIB 19 K, Bcl-2 or GAM-1 transfected Two days after the transfection, a defined number of cells were placed on a series of cell culture plates with a PolyHEMA coating
  • Bei-2 should have a stronger effect than EIB 19 K or GAM-1; the one obtained without PolyHEMA
  • Luciferase expression remained unchanged at Bei-2 even at the highest PolyHEMA concentrations.
  • Identified DNA molecules coding for GAM-1 can also be mutated if the mutations either do not result in a change in the amino acid sequence or the changes do not affect any amino acids which are essential for the function.
  • Transfer infection is based on the anti-apoptosis gene simply in the form of a plasmid together with the plasmid containing the DNA sequence, the expression of which in the cell is said to achieve the desired effect (hereinafter referred to as "effective DNA”), for example a
  • Adenovirus polylysine The molar ratio of active gene and anti-apoptosis gene can be determined using
  • Titration can be determined by measuring the expression of the active gene at different proportions of the anti-apoptosis gene under otherwise identical conditions over a longer period of time. In the context of the present invention, a ratio of 5: 1 was chosen, which has proven to be favorable. Since the gene products of some anti-apoptosis genes show a very strong effect, smaller proportions can also be used. An upper limit due to any toxicity can also be determined by titration.
  • the molar ratio of the two genes is 1: 1 if they are each present on the plasmid in a copy .
  • transcription factors namely NF-IL-6 and NF- ⁇ B. This created the prerequisite for activating these transcription factors in response to the occurrence of adenovirus or
  • Substances come, for example, treatment with retinoic acid ("Retinoic acid”) or other retinoids, which have been reported to inhibit IL-1-induced IL-6 production by lung fibroblasts (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994).
  • Retinoic acid retinoic acid
  • other retinoids which have been reported to inhibit IL-1-induced IL-6 production by lung fibroblasts (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994).
  • Mode of action of this class of substances is likely to be that they control the concentration of the IL-6 mRNA.
  • Another class of substances for inhibiting the inflammatory host response are:
  • Glucocorticoids that have been shown to inhibit the production of IL-6 and / or IL-8 in response to inflammatory stimuli (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993).
  • Dexamethasone acts on the activation of the enzyme
  • This enzyme is used in response to numerous other organs.
  • Another group of anti-inflammatory substances that can be used in the context of the present invention are inhibitors of arachidonic acid metabolism.
  • Arachidonic acid is metabolized to proinflammatory prostaglandins and thromboxanes via the cyclooxygenase pathway. This path, which is shown schematically in Fig. 12, can be done by the
  • Cyclooxygenase inhibitors aspirin acetylsalicylic acid
  • Ibuprofen acetylsalicylic acid
  • indomethacin Flower et al., 1985
  • Arachidonic acid runs through the 5-lipoxygenase processing, whereby leukotrienes are formed.
  • 5-Lipoxygenase can be obtained by NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart and Kolb, 1993; Cifone et al., 1993;
  • the cells can also be treated with anti-inflammatory polypeptides such as IL-10 or TGF- ⁇ .
  • anti-inflammatory polypeptides such as IL-10 or TGF- ⁇ .
  • the anti-inflammatory substance is expediently added to the medium.
  • step b) ii) the anti-inflammatory substance as such or in a preferred one
  • Embodiment in the form of the DNA coding therefor introduced into the cell e.g. in the form of a plasmid which contains a sequence coding for an anti-inflammatory protein such as IL-10 (Moore et al., 1990) or TGF- ⁇ (Massague et al., 1987).
  • an anti-inflammatory protein such as IL-10 (Moore et al., 1990) or TGF- ⁇ (Massague et al., 1987).
  • a preferred anti-inflammatory substance used in the context of the present invention is VA1.
  • Adenovirus VA1-RNA is a small RNA molecule synthesized by RNA polymerase III, which is necessary for the efficient expression of the virus genome
  • Transfection can be used to modulate the activation of NF- ⁇ B that is triggered by the transfection process.
  • VA1 expression inhibits the activation of inflammatory cytokines may be due to a phenomenon that is independent of the increase in the stability of the mRNA or its amount, as reported for the calcium phosphate method. Inhibition of p68 kinase activation may play a key role in this phenomenon.
  • the VA1 can be imported into the cell as an RNA molecule or, in a preferred embodiment, in the form of the VA1 DNA.
  • Transfection complexes are integrated. It is also possible to combine two of the three sequences, or all three, on a single plasmid.
  • a DNA containing the factor VIII sequence as therapeutically effective DNA an anti-apoptosis gene such as in-2 or EIB 19K and the VA1 DNA.
  • genes can be used which have an effect corresponding to VA1, e.g. EBER of the Epstein Barr virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) or the TAR-RNA from the HIV virus (Gunnery et al., 1990).
  • the invention relates to a transfection complex containing a nucleic acid molecule to be expressed in the cell, which is complexed with a polycation, optionally conjugated with a ligand for the target cell, and
  • Adenovirus or an adenovirus-polycation conjugate wherein the complex also contains a DNA molecule with anti-apoptosis activity and / or a DNA molecule coding for a substance with anti-inflammatory activity.
  • the invention also relates to a
  • compositions containing such a transfection complex in which the nucleic acid molecule to be expressed in the cell is a therapeutically or gene-therapeutically effective DNA molecule.
  • the pharmaceutical preparation contains the usual additives, such as nutrients, etc., for use on cells.
  • Fig. 1 Time course of activation of NF-IL-6 and
  • Fig. 2 Blocking the activation of NF-KB by
  • Fig. 3 Blocking the activation of the IL-6 promoter by expression of VA1
  • FIG. 6 Influence of the expression of Bcl-2, EIB 19K, EIA and EIA 13S on the long-term gene expression.
  • FIG. 7 Influence of the transfection on the morphology of fibroblasts
  • Fig. 8 Inhibition of adenovirus or LPS
  • Fig. 11 Effect of dexamethasone, ibuprofen or
  • Fig. 12 Comparison of the enhancement of gene expression by different inhibitors of
  • Fig. 13 Restriction map of the CELO virus genome
  • Fig. 16 Anti-apoptotic effect of various CELO virus fragments
  • Fig. 17 Open reading frame of the EcoRI fragment from
  • Fig. 18 Assignment of the anti-apoptotic effect to the correct reading frame. Comparison of different
  • Fig. 19 Influence of the mutation of the leucine zipper on the anti-apoptotic effect
  • Fig. 20 Effect of the CELO virus gene on the
  • Fig. 21 Comparison of the effect of different anti-apoptotic genes on the
  • Fig. 22 Effect of combinations of different genes with anti-apoptotic effects
  • adenovirus type 5 (nucleotide 1-5778) was obtained by digesting the adenovirus dll014 DNA (Bridge and Ketner, 1989) with Xhol plus Asel. This fragment was made with Klenow Polymerase treated and in the Smal site of the
  • Plasmids pAALM obtained from pSP64 (Boehringer
  • the VA1 expression plasmid pXVAH was constructed by inserting the 5324 bp HindII fragment (nucleotide 6241-11656) of the adenovirus DNA into the HindIII site of pAALM to obtain pHVAH. pHVAH was then cleaved with XBal and religated to obtain pXVAH (this made a large piece from the XBal site in pAALM to the XBal site
  • the clone pXVAH obtained contained the adenovirus sequence of nucleotide 10589-11565. ii) Luciferase reporter plasmid pNF- ⁇ B-Luc
  • the plasmid pNF- ⁇ B-Luc responsive to NF- ⁇ B was developed as a derivative of that described by Boehmelt et al., 1992,
  • plasmid pTK3kbB described constructed. To do this, pTK3kbB was cut with Xhol and Ncol to remove most of the sequence coding for CAT with
  • pCMVE1A The expression plasmids named pCMVE1A, pCMVE1B and pCMV19K were from White and
  • the expression plasmid designated pCMV-Bcl-2, was prepared by the human Bcl-2 cDNA, flanked by two EcoRI sites (Seto et al., 1988), downstream from a CMV immediate early promoter in the
  • Plasmid DNA pCMVL The construction of the plasmid is described in WO 93/07283. viii) plasmid DNA pCMVßgal
  • the E4-deficient adenovirus 5, dll014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown in the complementing cell line W162 (Weinberg and Ketner, 1983). Pellets from infected cells became 2 ml / 2 x 10 7 cells in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF
  • the opalescent virus bands (either 1.31 g / cm 3 immature or 1.34 g / cm 3 mature) were harvested. The biotinylation of the obtained
  • Glycerin was carried out as described in WO 93/07283 or by Wagner et al., 1992, and Cotten et al., 1992, described.
  • the virus samples were quantitatively determined via the protein concentration (Biorad Bradford assay with BSA as standard), the
  • Samples of biotinylated, psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 (8 ⁇ l, 1 ⁇ 10 12 particles / ml) were diluted in 150 ⁇ l HBS and mixed with 1 ⁇ g StpL in 150 ⁇ g HBS for 30 min at room temperature. Aliquots of 6 ⁇ g plasmid DNA (in the case of mixtures of pCMVL-DNA and another plasmid the ratio was 5: 1) were diluted in 100 ⁇ l HBS and then with the
  • the human lung carcinoma cell line A549 (ATCC CCL 185) was used for the production of the clonal cell lines containing the reporter plasmid pNF- ⁇ B-Luc or pIL-6-Luc.
  • the plasmids were co-transfected with the neomycin phosphotransferase expression plasmid called pMuatt (a pUCl9 plasmid containing the TKneo sequence; Grosveld et al., 1982) using the Transfeetam method (Behr et al., 1989) selected for cells that are resistant to 400 ⁇ g / ml G418 (Sigma). Clonal derivatives that expressed luciferase after induction by PMA were identified and expanded.
  • A549 cells containing the expression plasmid for Bcl-2 and EIB 19K were obtained in a similar manner, with the difference that the
  • Neomycin phosphotransferase plasmid pSVneo (Clontech) instead of pMuatt and that pools of G418-resistant clones were used instead of pure populations.
  • pSVneo Neomycin phosphotransferase plasmid pSVneo
  • Glutamine and antibiotics were added and the culture placed in a 37oC incubator. After 10 days it was Medium replaced by DMEM containing 10% FCS. Then the medium was continued twice a week
  • An alternative, preferred method was to transfer the pieces of skin into fresh medium after comminution and to wash them with medium once or twice as required.
  • 5 to 10 pieces of tissue were placed in a T25 tissue culture bottle, the surface of which had been wetted with DMEM plus 10% FCS, and distributed evenly, whereupon the bottle was turned over. This caused the biopsies to hang ("hanging drop configuration"; this method was described by Jones, 1989).
  • the bottles were turned over again and filled with 1 to 2 ml of medium. Fixed biopsies were filled up to 5 ml after 24 h; otherwise the process was repeated.
  • the first fibroblasts grew out after 6 to 10 days, from this point on the medium was changed once a week. Once the cells were confluent, they were placed in a T75 bottle
  • the plates were coated with PolyHEMA (poly (2-hydroxyethyl methacrylate) by adding 200 ⁇ l of a PolyHEMA solution (Sigma, Cat. No. P-3932; 10 mg / ml in 95%
  • Culture plates used were prepared by a method similar to that described by Folkman and Moscona, 1978. For this purpose, normal tissue culture plates (24-well plates) with 200 ⁇ l per well were used
  • the IL-6 ELISA was obtained from R&D Systems, the IL-8 ELISA from Bender MedSystems. k) LPS preparation
  • the preparation was dissolved in 10 mg / ml in LPS-free water and sonicated in LPS-free water for 5 minutes before making serial dilutions (SONOREX bath,
  • Lung epithelial carcinoma cell line A549 generated which as a reporter gene construct pNF-KB-luc or pIL-6-luc
  • Adenovirus / pL / DNA as a stimulus were the A549 NF- ⁇ B cells with 20 ⁇ l transfection complex (4 ⁇ 10 8)
  • Virus particles corresponding to 10 4 viruses / cell and the A549 IL-6 cells with 200 ⁇ l transfection complex treated, which is also 10 4 viruses per cell
  • the time course of the induction is shown in FIG. 1: The IL-6 promoter is fully activated after 12 h and then quickly returns to its initial level while the NF- ⁇ B promoter is activated and
  • Adenovirus / polylysine / DNA is triggered blocked. For this, 4 x 10 4 A549 NF- ⁇ B test cells per
  • Adenovirus VA1 gene (caused by incorporation of the DNA coding for VA1 in the
  • Transfection complex 500 ⁇ l contained 6 ⁇ g pXVAH activation to approx. 1.5 times the basic value (FIG. 2; complex means pSP65, complex / EIB means pCMVE1B, complex / VA1 means pXVAH).
  • the promoter for the human IL-6 gene contains
  • NF-IL-6-luc Contained luciferase gene under the control of the IL-6 promoter (NF-IL-6-luc) (each sample was in a well of a 6-well plate, each containing 4 ⁇ 10 5 cells. Duplicate determinations were made
  • the cells were contained in 200 ⁇ l with PMA (phorbol myristyl acetate; 10 -8 M; sample 2), 10 4 adenovirus particles
  • Transferrin-polylysine / DNA complex which contained pSP65 as DNA (sample 3) or with 10 4 virus particles,
  • Luciferase activity measured as a measure of IL-6 activation. The result of the tests is shown in Fig. 3.
  • Psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 particles treated per cell incorporated in StpL / TfpL / DNA transfection complexes (this corresponded to 2 ⁇ l or 6 ⁇ l transfection complex, the DNA used being either an empty plasmid (pSP65; Boehringer Mannheim) or the plasmid with the designation pXVAH, which is the adenovirus VA1
  • the cells were washed with the transfection complexes in 2% for 4 h
  • Fibroblasts were applied (50 ⁇ l of complex, corresponding to 2.5 ⁇ 10 4 virus particles per cell, were applied to 2 ⁇ 10 4 cells per well of a 24-well plate, whereby triple determinations were carried out.
  • “minus” means pSP65; Test DNA is labeled).
  • Luciferase activity was 48 to 72 h after
  • the E1 region contains two main gene functions, EIA and E1B.
  • the E1A products have the effect of separating E2F from the Rb protein, on the other hand they modulate the transcription activity of many cellular and adenovirus promoters
  • the main transcriptional transactivator function is contained in the 13S gene product.
  • the 1B gene codes for two main functions: the EIB 55K gene product binds p53 and changes its function.
  • the 19K E1B gene product is believed to act below p53 to block the apoptotic response.)
  • the co-expression of plasmids which carried either the complete EIA or the complete E1B region under the control of the CMV promoter was tested.
  • the E1B plasmid showed a 7-fold amplification of the
  • the 19K E1B gene also caused an increase in gene expression (8.6-fold).
  • the E1B 19K protein has recently been shown to be a potent analog of the anti-apoptotic gene Bcl-2 (Rao et al., 1992). Bcl-2 was therefore also tested and found to be a
  • Gene expression is due to a non-specific toxicity caused by the high virus / cell ratio (the experiments were carried out with approximately 50,000 virus particles per cell).
  • transfection complexes containing pCMVL plus the plasmid pSP65, or the plasmids which contained the sequence for Bcl-2, E1A or E1B 19K (the amounts of reporter plasmid pCMVL and respective
  • Test plasmid were, as in the previous example, 5 ⁇ g and 1 ⁇ g, for virus particle numbers of 3 ⁇ 10 4 (FIG. 5A), 10 4 (FIG. 5B) or 3 ⁇ 10 3 (FIG. 5C) per cell on primary Fibroblasts applied and the
  • Luciferase activity measured over time. The transfections were carried out as in the previous examples described, the cells 6, 18 and 60 ul transfection complex per
  • Enhancement in 19K or Bcl-2-treated cells was found, regardless of the virus dose used.
  • Transfection complexes containing 5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g pSP65 or 1 ⁇ g of a plasmid containing E1A, E1A 13S, E1B 19K or Bcl-2 were used. (In these experiments, the cells in one well received 18 ⁇ l transfection complex.) From day 10, the culture medium was replaced with fresh medium daily; This measure was based on the consideration that changing the medium would lower the concentrations of the toxins. The result of these tests is shown in FIG. 6: It showed yourself that the chosen approach is the
  • Reporter plasmid pCMVßgal plus pSP65 or plus pCMV19K transfected (2 x 10 4 fibroblasts per well of a 24-well plate received 18 ⁇ l transfection complex; 500 ⁇ l complex contained either 4 ⁇ g pCMVL plus 2 ⁇ g pSP65 or 4 ⁇ g pCMVL plus 2 ⁇ g pCMV19K. 48 hours after the transfection, the cells were stained with X-gal, as described in WO 93/07283, to determine the morphology of the cells that successfully transfected the DNA
  • Apoptosis trigger LPS with the anti-apoptosis gene Bcl-2 would block cell death. It was found that there was no reduction in toxicity
  • A549 cells were used as control cells as well as A549 19K cells and A549-Bcl-2 cells
  • control cells which were exposed to the adenovirus / pL / DNA complexes were sacrificed as a function of increasing LPS content in the sample (cf. sample 1: no LPS, with samples 2 and 3: 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA).
  • sample 1 no LPS
  • samples 2 and 3 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA.
  • samples 2 and 3 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA.
  • samples expressing either 19K or Bei-2 there was a decrease in toxicity to 39% (sample 2) or 77 or 60% (samples 5 or 8; 19K or Bcl-2).
  • Populations of 19K or Bcl-2 expressing cells are expected to have a higher protective effect (up to 100%).
  • pCMVL / pSP65 or pCMVL / pCMV19K was used in a ratio of 5: 1 each. 4 hours after the transfection, the samples were placed in fresh 10% FCS / DMEM medium or transferred to 10% FCS / DMEM medium containing 3 ⁇ M dexamethasone (Sigma). 24 hours after the transfection, the samples (double determination) were harvested and the
  • Luciferase activity determined. The presence of dexamethasone in the absence of pCMV19K was shown to increase luciferase expression by a factor of 1.65. In the presence of both dexamethasone and pCMV19K, the 5,8,11-eicosatriynonic acid enhancement was 2.71-fold (Table 3).
  • Adenovirus / polylysine / DNA complexes that the
  • luciferase genes transfected with and without co-transfection of the E1B 19K gene, and luciferase activity was monitored over time.
  • the DNA contained 5.5 ⁇ g pCMVL and 0.5 ⁇ g pSP65 (control) or pCMV19K). 2 h after the transfection, the cells were placed in standard medium (DMEM plus 10% FCS)
  • Dexamethasone which indicates that the inhibition of cyclooxygenase is not sufficient to prevent the decline in gene expression. Both substances showed a synergistic effect with the EIB 19K gene in increasing gene expression.
  • CELO Chicken Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolation and cloning of CELO virus genome fragments
  • the CELO virus adenovirus type 1 (ATCC VR-432) was used as starting material.
  • the virus was purified after growth in chicken embryos as described by Cotten et al., 1993.
  • the DNA was prepared from the virus by the proteinase K
  • the entire 42.8 kb CELO virus genome obtained was digested on the one hand with EcoRI and on the other hand with HindIII.
  • the mixture of fragments obtained was separated in a 0.8% agarose gel and purified on 3 mm Whatman paper and then on a Sephadex G-50 column.
  • the restriction map of CELO virus is shown in the upper part of Fig. 13; it is based on the
  • mapping units one
  • Mapping unit is 428 base pairs). The nomenclature of the expression clones and the position of fragments 7H3 (HindIII D fragment) and 9R1 (EcoRI D fragment) are also shown. These are fragments those that showed a positive effect in the gene transfer experiments (cf. the experiments described in b).
  • the fragments obtained were cloned in the expression vector pX described by Superti-Furga et al., 1991, downstream of the CMV immediate early promoter, each fragment being isolated and characterized in both orientations. b) testing of the isolated gene fragments for anti-apoptotic effects
  • Example 5 Transfection experiments were carried out as indicated in Example 5, the test plasmids containing the various CELO virus fragments shown in FIG. 16.
  • the amount of transfection complexes was 15 ⁇ l per 20,000 cells containing 5 ⁇ g luciferase reporter plasmid and 1 ⁇ g of the respective test plasmid (in most cases, clones were containing the fragment in both
  • Expression of the control. 16 shows the relative expression (average value of 3 samples) of the test samples (5 ⁇ g luciferase reporter plasmid and 1 ⁇ g Plasmid pXCELO) against the control samples (5 ⁇ g luciferase reporter plasmid pCMVL and 1 ⁇ g empty vector) on day 14.
  • a protective effect three to eightfold increase in luciferase expression could only be observed with the plasmids which contained the 7H3 and 9R1 fragments ; these two fragments originate from the same region of the CELO virus genome and have an overlapping region of approximately 80% in their sequence (see that shown in FIG. 13)
  • GAM-1 is underlined, encoding, beginning with nucleotide 577, for a protein with 283 amino acids.
  • the corresponding gene product was named GAM-1.
  • Gene expression is not a function of the VA gene. c) Time course of gene expression in the presence of the
  • transfections with the 9R1 fragment, the 7H3 fragment and the Smal / HindIII fragment of 9R1 were carried out and the luciferase expression was monitored over a longer period of time.
  • BssHII cuts above the open reading frame from which the activity was suspected. Cutting with BssHII, treatment with Klenow / T4 DNA polymerase to remove the overhanging nucleotides and religion
  • GAM-1 mutant # 6 L258P, L265P
  • luciferase reporter plasmid was, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids (pXCELO), which each contained the fragment shown in FIG. 20 (5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g of the respective test plasmid) transfected. 2 days after the transfection, the cells were trypsinized, counted, and a defined number of cells (20,000 per well) were (3-fold) in 24-well plates which had been coated with PolyHEMA according to Method A. 7 days after plating, the luciferase activity of the entire cell population (non-adherent plus adherent cells) was measured. Each of the values shown in Fig. 20 represents the
  • Primary human fibroblasts were, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids shown in FIG. 22 (5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g of the respective test plasmid in samples 1- 4, in samples 5 and 6 the mixture contained 0.5 .mu.g each of the
  • Test plasmids transfected. 22 is the
  • Luciferase expression was shown 22 days after transfection, with each value averaging 3

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Abstract

Den beim Einbringen von Fremdmaterial in höhere eukaryotische Zellen, insbesondere bei der Transfektion mit DNA, auftretenden Toxizitätsproblemen wird begegnet, indem in der Zelle Genprodukte zur Expression gebracht werden, die die durch den Transfektionsprozeß ausgelöste Apoptose blockieren und/oder indem die Zellen mit anti-inflammatorischen Substanzen behandelt werden. Bevorzugt werden als anti-Apoptose-Gene Bcl-2, E1B 19K oder ein anti-apoptotisch wirksames Gen vom Hühner-Adenovirus CELO, als anti-inflammatorisch wirkende Substanz Adenovirus VA1, das in Form von VA1-DNA in die Zelle eingebracht wird, verwendet. Mit Hilfe dieser Maßnahmen kann eine lang anhaltende Genexpression erzielt werden.

Description

Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in höhere eukaryotische Zellen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere zum Einbringen von Fremdmaterial, wie DNA, in die Zellen.
Bedarf an einem effizienten System für das Einführen von Fremdmaterial, insbesondere Nukleinsäure in lebende Zellen besteht vor allem im Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch wirksamer Genprodukte zu erzielen.
Standardmethoden für die Transfektion von Zellen verwenden u.a. Calciumphosphat (für Anwendungen in vitro), kationische Lipide (Feigner et al., 1993) oder Liposomen.
Die bisher am weitesten fortgeschrittenen Technologien im Rahmen der Gentherapie benutzen rekombinante
Vektorsysteme (Retroviren oder Adenoviren) für den Transfer von Genen in die Zelle (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769).
Alternativen Strategien für den Gentransfer liegen Mechanismen zugrunde, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient. Ein Beispiel dafür ist der Import von Genen in die Zelle über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (z.B. Wu und Wu, 1987, Wagner et al., 1990, und EP-AI 0388 758).
Übersichten über die Gentherapie im allgemeinen und über nicht-virale Gentransfermethoden im besonderen werden von Mulligan, 1993, bzw. von Cotten und Wagner, 1993, gegeben.
Für den Gentransfer mit DNA/Polykation-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose wurde eine Verbesserung vorgeschlagen, die den Einsatz von
Komponenten aufgrund ihrer Fähigkeit vorsieht, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, z.B.
Adenoviren oder fusogene Peptide. Der Einsatz der endosomolytischen Komponenten bewirkt eine Steigerung der Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den
Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b;
WO 93/07283). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die
Adenovirus-Polylysin-Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA
komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin- Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA-Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an
Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den
Zielzellen. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Diese Technik, die auch als "TransferrInfektion" bezeichnet wird, weist gegenüber konventionellen viralen Techniken eine erhöhte Sicherheit auf (Cotten et al., 1992).
Mit dem Adenovirus-unterstützten Gentransfer auf der Grundlage der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden zwar transient hohe Expressionswerte erreicht, es ist jedoch bisher aufgrund toxischer Effekte in einigen Zelltypen nicht gelungen, eine Expression über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Diese toxischen Effekte sind auf verschiedene Abwehrantworten der Wirtszelle, bald nach Eintritt des Virus in die Zelle,
zurückzuführen. Die Mechanismen, welche die Aktivierung dieser Antworten regeln, sind noch nicht aufgeklärt, Untersuchungen mit replikationsdefizienten
Adenovirusmutanten lassen vermuten, daß die Antworten des Wirts sehr früh stattfinden, möglicherweise sogar vor der Virusgenexpression.
Eine Komponente dieser Wirtsantwort ist eine
Aktivierung der "Interferon Responsive Genes" (Gene, die auf Interferon ansprechen), höchstwahrscheinlich durch Aktivierung von ISGF3, eines auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktors, dessen
Bindungsstellen sich stromaufwärts einer Reihe von auf Interferon ansprechenden Gene befinden. Eines der aktivierten Gene ist die Proteinkinase p68, welche durch doppelsträngige RNA aktiviert wird. p68 wird in einer inaktiven Form synthetisiert und unterliegt in Gegenwart von dsRNA einer autokatalytischen
Phosphorylierung, welche die Kinase aktiviert, was zur Phosphorylierung und Inaktivierung des Translations- Initiationsfaktors eIF2a führt, wodurch die Initiierung der Proteintranslation blockiert wird. Außerdem wurde berichtet, daß NF-KB durch dsRNA aktiviert wird
(Visvanathan und Goodbourn, 1989), was darauf
hindeutet, daß p68 vielleicht direkt IKB phosphoryliert und NF-κB aktiviert.
Die Typ C-Adenoviren besitzen zwei starke Mechanismen, um diesen Translationsarrest durch den Wirt zu
verhindern:
Die Ela-Genprodukte können die Aktivierung von ISGF3 direkt stören (Gutch und Reich, 1991; Ackrill et al., 1991). Ein zweiter, noch direkter wirkender Mechanismus benutzt die VA1-Gene. Das Genprodukt bildet eine stabile Sekundärstruktur, welche an die p68-Kinase binden kann, ohne die Kinase zu aktivieren, und welche die Bindung und Aktivierung durch die eigentlichen Aktivatoren verhindern kann (Manche et al., 1992;
Mathews und Shenk, 1991).
Ein weiterer inflammatorischer Reaktionsmechanismus als Folge des Eintritts von Virus dürfte in der Aktivierung des inflammatorischen Transkriptionsfaktors NF-IL-6 und der Sekretion des inflammatorischen Zytokins IL-6 bestehen (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992). Dieser Faktor wiederum aktiviert, oft im Zusammenwirken mit NF-κB, das IL-6-Gen selbst wie auch eine Anzahl weiterer inflammatorischer Response-Gene wie TNF und IL-1. Kürzlich wurde berichtet, daß IL-6 seinerseits den auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktor IRF 1 ("Interferon Response Factor 1") aktivieren kann (Harroch et al., 1994). Dies dürfte entweder für die Interferon-Response auf den Eintritt von Adenovirus verantwortlich sein oder diese verstärken. Da die meisten der frühen Gene von Adenovirus Typ C
Bindungsstellen für NF-IL-6 enthalten, könnte man annehmen, daß die Aktivierung von NF-IL-6 durch
Adenovirus die Auslösung der Virusgen- Expressionskaskade gewährleistet.
Eine andere Verteidigungslinie der Wirtszelle dürfte die apoptotischen Antwort sein. Es ist lange bekannt, daß Mutationen, die in der EIB 19K-Region kartieren, für den deg-Phänotyp, einen verstärkten zytopathischen Effekt, der vom Abbau der chromosomalen DNA des Wirts begleitet ist (D'Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt und Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984), verantwortlich sind. Jüngere
Untersuchungen haben eine Apoptose identifiziert, die durch Expression eines EIA-Wachstumssignals in
Abwesenheit von EIB hervorgerufen wird (White und
Stillman, 1987; White et al., 1994; Rao et al., 1992); an dieser Apoptose dürfte die durch E1A ausgelöste Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F vom Rb- Protein beteiligt sein (Wu und Levine, 1994). Es wurde gezeigt, daß das EIB 19K-Protein als stark wirksames Analoges des die Apoptose blockierenden Wirtsgens Bei-2 fungieren kann (Rao et al., 1992; Debbas und White, 1993). Die Expression jedes dieser Proteine kann eine durch verschiedene Signale ausgelöste Apoptose
blockieren. Im Zusammenhang mit den Untersuchungen mit Myc wurde festgestellt, daß Wachstumssignale eine Zelle entweder für die Proliferation, wenn die geeigneten Verstärkungssignale, z.B. Ras oder Src, zur Verfügung stehen, oder für die Apoptose, wenn die Myc-Signale allein vorhanden sind (Evan et al., 1992),
determinieren. Ein ähnliches Modell für die durch
Adenovirus El induzierte Transformation wird durch Versuche gestützt, die zeigen, daß die Apoptose durch EIA-Expression in Abwesenheit von EIB 19K ausgelöst wird (White und Stillman, 1987; Rao et al., 1992;
Debbas und White, 1993). Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung der Sindbisvirusinfektion hat gezeigt, daß die Expression von Bcl-2 in der Wirtszelle ein
ausschlaggebender Faktor für den Ausgang einer
Virusinfektion sein kann (Levine et al., 1993): Beim Fehlen von Bcl-2 macht die Zelle eine Apoptose durch, womit die Virusproduktion auf eine kurze akute Phase beschränkt wird. In Gegenwart von Bei-2-Expression findet eine chronische Virusproduktion statt, weil die apoptotische Antwort auf die Akutphaseninfektion ausbleibt. Anti-apoptotische Aktivitäten wurden ferner im Epstein-Barr Virus (das BHERl-Gen; Pearson et al., , 1987), im Baculovirus (das p35-Gen; Sugimoto et al., 1994) und im afrikanischen Schweinefiebervirus (das LMW5-HL-Gen; Neilan et al., 1993) identifiziert. Dies deutet darauf hin, daß die apoptotische Antwort auf die Virusinfektion in vielen Fällen eintritt und Viren Strategien entwickelt haben, um diese Antwort zu blockieren.
Die mit inaktivierten Adenovirus-Kapsiden für den
Gentransfer mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose durchgeführten Versuche beruhten zunächst auf der
Annahme, daß das Viruskapsid nur als ein die Endosomen aufbrechendes Reagens wirkt, was eine Funktion der Oberflächenproteine des Viruskapsids ist. Es wurden Inaktivierungsmethoden entwickelt, die die
Virustranskription und -replikation blockieren, ohne die endosomolytische Aktivität des Kapsids zu verändern (Cotten et al., 1994). Im Zuge weiterer Versuche mit Adenovirus-unterstützten Transfektionen wurde die
Kontamination mit Lipopolysaccharid (LPS) als eine Quelle für die Toxizität in Primärzelltransfektionen identifiziert. Diesem Toxizitätsproblem konnte durch sorgfältige Entfernung von LPS von der DNA leicht abgeholfen werden. Obwohl die Inaktivierung des Virus und die Entfernung von LPS zwei Formen von Virus- assoziierter Toxizität beseitigten, gelang nicht in allen Zelltypen Langzeit-Genexpression, auch nicht mit Psoralen/UV-inaktiviertem humanem Adenovirus in
Gegenwart von LPS-freier DNA.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Mechanismen aufzuklären, die bei den bei
Transfektionen beobachteten Toxizitätseffekten
auftreten, um auf der Grundlage der gewonnenen
Erkenntnisse ein neues, verbessertes Verfahren für die Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere das Einführen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäuren, in die Zellen bereitzustellen.
Bisherige Bestrebungen zur Verbesserung der
Gentransfermethoden konzentrierten sich auf die
Verstärkung der Genexpression. So wurde z.B. berichtet, daß die VA1-Expression die Genexpression von co- transfizierten Genen verstärkt, indem sie die
Stabilität mRNA oder deren Menge erhöht (Svensson und Akusjärvi, 1984; Stijker et al., 1989; Svensson und Akusjärvi, 1990; Mathews und Shenk, 1991). Der dafür verantwortliche Mechanismus ist auf molekularer Ebene noch nicht aufgeklärt; ein Zusammenhang mit
Toxizitätsproblemen dürfte nicht gegeben sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen,
insbesondere zum Einbringen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in die Zellen, wobei man außer dem
Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten
a) in die Zellen ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren Expressionsprodukte die durch das Einbringen des
Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der Wirtszelle zumindest teilweise blockieren, und/oder daß man b) die inflammatorische Antwort der Zellen zumindest teilweise inhibiert, indem man
i) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti- inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder
ii) in die Zellen eine oder mehrere anti- inflammatorische Substanz(en) oder die dafür
kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA-Moleküle einbringt. Die in a) definierten DNA-Moleküle werden im folgenden als "anti-Apoptose-Gene" oder als "DNA-Moleküle mit anti-Apoptose-Wirkung" bezeichnet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in seiner
bevorzugten Ausführungsform werden in die Zellen außer den Komponenten a) und gegebenenfalls b) ii) das
Fremdmaterial und die Transfektionskomponenten
eingebracht.
Die Definition des Begriffs "Apoptose" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche toxischen Effekte, die zurückzuführen sind auf a) direkte Aktivierung der apoptotischen Antwort; b) Aktivierung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten, welche direkt oder indirekt Apoptose induzieren; c) Aktivierung der Sekretion von TNF, IL-6 oder eines anderen Zytokins, welche die
Lebensfähigkeit der transduzierten Zellen
beeinträchtigt; d) überschüssige Aktivierung von NF-κB; e) überschüssige Aktivierung von p53.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das
erfindungsgemäße Verfahren auf die oben angeführte, von Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b sowie in der WO 93/07283
beschriebene Gentransfermethode angewendet, bei der DNA mit Hilfe von Konjugaten aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation unter Mitwirkung von, gegebenenfalls mit einem Polykation konjugierten,
Adenovirus, in die Zelle eingebracht wird. Diese
Veröffentlichungen werden ausdrücklich in die
Offenbarung der vorliegenden Erfindung miteinbezogen. (Diese Methode wird im folgenden als "Adenovirus- unterstützte Transferrinfektion" bezeichnet.) Das der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf dieses GentransferSystem zugrundeliegende Prinzip besteht darin, ein transkriptions- und replikationsfreies
Adenovirus einzusetzen, das in seinen genetischen
Funktionen weitgehend auf seine, für die Steigerung der Genexpresssion vorteilhaften, endosomolytischen
Eigenschaften reduziert ist, und die übrigen für den Gentransfer notwendigen bzw. nützlichen Genfunktionen des Adenovirus auf kontrollierte Weise nachträglich wieder hinzuzufügen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auf
sämtliche Methoden zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle, bei denen die oben dargelegten
Toxizitätseffekte auftreten, angewendet werden, insbesondere auf Gentransfermethoden, z.B. bei der Verwendung rekombinanter Adenovirusvektoren. Derartige Gentransfermethoden finden Anwendung in vitro sowie bei der Gentherapie sowohl in vivo als auch ex vivo, insbesondere in Fibroblasten, hämatopoetisehen Zellen, Endothelzellen oder Lungenepithelzellen.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens kann außerdem bei der Behandlung eukaryotischer Zellen sämtliche Anwendungen umfassen, bei denen eine
Blockierung einer apoptotischen und/oder
inflammatorischen Antwort der Zelle erforderlich oder vorteilhaft ist. Ein Beispiel für eine solche
erweiterte Anwendung ist die Transplantation von fremden Zellen, Geweben oder Organen, bei der aufgrund der Immunerkennung eine apoptotische Reaktion der
Zellen stattfindet. Durch die Expression von anti- apoptotisch wirksamen Genen in den zu
transplantierenden Zellen kann die Apoptose verhindert werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das anti-Apoptose-Gen das humane Bcl-2-Gen (Seto et al., 1988).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das anti-Apoptose-Gen das EIB 19K-Gen von Adenovirus Typ 2 oder 5 (White und Cipriani, 1990).
Weitere Beispiele für im Rahmen der vorliegenden
Erfindung geeignete anti-Apoptose-Gene sind das BHRF1- Gen des Epstein-Barr Virus (Pearson et al., 1987), die Baculovirusgene p35 (Sugimoto et al., 1994) und iap (Clem und Miller, 1994), das LMW5-HL-Gen vom
afrikanischen Schweinefiebervirus (Neilan et al., 1993) und das ced-9-Gen von Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al.; 1994).
Diese Genprodukte wirken im Apoptose- Signalübertragungsweg relativ weit stromabwärts, d.h. nahe an den an den Abbauprozessen unmittelbar
beteiligten Proteasen. So wird z.B. von Bei-2 und Bei-2 ähnlichen Proteinen angenommen, daß sie die Aktivierung der als ICE oder ICE-ähnlich bezeichneten Proteasen blockieren. Da diese Protease(n) offenbar eine ganz entscheidende Funktion für die Apoptose haben, kommt auch ihrer Blockierung eine entscheidende Rolle zu.
Außer den Substanzen mit einem Bcl-2 ähnlichen anti- Apoptosemechanismus kommen auch solche in Betracht, die eine Komponente, die weiter stromaufwärts im Apoptose- Signalübertragungsweg wirkt, blockieren. Eine solche Komponente ist z.B. p53, dessen Aktivierung einen der Signalübertragungswege auslöst, die zur Apoptose führen. Wenn somit die durch den Transfektionsvorgang ausgelöste Apoptose über die Aktivierung von p53 läuft, könnten Substanzen, die p53 inaktivieren, für die Blockierung der Apoptose eingesetzt werden, wobei einerseits zu beachten ist, daß die Blockierung nicht durch einen anderen Signalübertragung, der ebenfalls zur Apoptose führt, umgangen wird, andererseits, daß die Inaktivierung von p53 in dem jeweiligen Zelltyp nicht einen transformierten Zustand hervorruft.
Beispiele für Gene, die p53 inaktivieren, sind EIB 55K von Adenovirus Typ 2 oder Typ5 (White und Cipriani, 1989) oder El-Funktionen von anderen Adenovirusstämmen, z.B. Adenovirus 12 oder vom CELO-Virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), das E6-Gen vom humanen
Papillomavirus-16 (Levine, 1990), das große T-Antigen von SV 40 (McCarthy et al., 1994), das mdm-2-Gen
(Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993; Chen et al., 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine
Screening-Methode entwickelt, mit der auf einfache Weise Gene mit anti-apoptotischer Wirkung identifziert werden können. Die Methode besteht darin,
Säugetierzellen, z.B. Fibroblasten, mit einem
Reporterplasmid, z.B. einem Luciferase-Plasmid, zu transfizieren und die Expression des Reportergens über einen bestimmten Zeitraum zu verfolgen. In
Parallelversuchen werden die Zellen unter identischen Bedingungen zusätzlich mit Test-DNA, z.B. genomischen Virus-DNA Fragmenten oder DNA-Molekülen aus einer cDNA- Bibliothek, in geeigneten Expressionsvektoren
transfiziert. Gegebenenfalls werden die Zellen in einem weiteren Ansatz zusätzlich mit einer DNA-Sequenz transfiziert, von der bekannt ist, daß sie die
gewünschte anti-apoptotische Wirkung hat, z.B. mit EIB 19K oder Bcl-2. In derartigen Versuchen zeigt sich die anti-apoptotische Wirkung einer Test-DNA-Sequenz dadurch, daß bei Co-Transfektion der Zellen mit dieser Sequenz die Expression des Reportergens höher ist als bei Transfektion der Zellen mit dem Reportergen allein. Bei Co-Transfektion mit einem Gen bekannter anti- apoptotischer Wirkung kann die Wirkung des Testgens mit der des bekannten Gens verglichen werden.
Mit Hilfe dieser Screening-Methode wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung zunächst ein anti-apoptotisch wirkendes DNA-Molekül des Hühner-Adenovirus Typ I
(CELO = Chicken Embryo Lethal Orphan) identifiziert.
Dieses DNA-Molekül liegt auf einem Smal/Hindlll- Fragment, das im CELO-Virusgenom im Bereich zwischen ca. 84.3 bis ca. 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist. Von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierten Smal/HindiII-Fragment wurde die in Fig. 14 dargestellte Nukleotidsequenz ermittelt (SEQ ID NO: 1).
Das Smal/HindiII-Fragment wurde aus einem EcoRI- Fragment der Bezeichnung 9R1 erhalten, das im Bereich zwischen 81.2 bis 92.7 Kartierungseinheiten
lokalisiert ist (s. Fig. 13).
Im erfindungsgemäßen Verfahren können sämtliche der erhaltenen CELO-Virus-Fragmente, die die anti- apoptotische Wirkung aufweisen, wie z.B. das
Smal/Hindlll-Fragment als solches, eingesetzt werden.
Alternativ kann das EcoRI-Fragment 9R1, von dem das Smal/Hindlll-Fragment eine Teilsequenz darstellt, als ganzes eingesetzt werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das zwischen Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 auf dem CELO- Virusgenom lokalisierte HindiII-Fragment der
Bezeichnung 7H3 einzusetzen. Die Fragmente 9R1 und 7H3 haben einen Überlappungsbereich von 80%, das
Smal/Hindlll-Fragment ist den beiden Fragmenten
gemeinsam, es enthält den einzigen großen offenen
Leserahmen dieses Bereichs.
Die Größe des DNA-Moleküls im Bereich bzw. der Umgebung der angegebenen Fragmentbereiche ist nicht kritisch.
Bevorzugt wird die DNA, die im wesentlichen nur aus dem offenen Leserahmen besteht, eingesetzt. Diese DNA kann gegebenenfalls noch auf die für die anti-apoptotische Funktion verantwortlichen Abschnitte verkürzt oder es können Mutanten im Hinblick auf eine Verstärkung der Aktivität konstruiert werden. Die Auswahl geeigneter Mutanten kann erfolgen, indem entsprechend mutierte DNA-Sequenzen, wie in den Beispielen beschrieben, auf ihre Fähigkeit zur Verstärkung der Genexpression getestet werden.
In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung
durchgeführten Versuchen wurde die definitive Zuordnung eines anti-apoptotisch wirksamen Gens zu dem offenen Leserahmen mittels gerichteter in vitro ("site
specific") Mutagenese vorgenommen, auf diese Weise konnte auch festgestellt werden, welcher der für die anti-apoptotische Aktivität minimal erforderliche
Leserahmen ist, indem die mutierten DNA-Abschnitte auf anti-apoptotische Wirkung gescreent werden. Dazu wurde eine Reihe von Deletionsmutanten konstruiert. Es zeigte sich, daß alle jene Konstruktionen, durch die
Stopcodons innerhalb des vermuteten Leserahmens
eingeführt wurden und die daher die erhaltenen Proteine in der Nähe der jeweiligen Restriktionsstellen
verkürzten, die anti-apoptotische Schutzwirkung
beseitigten, während die Einführung von Stopcodons außerhalb des offenen Leserahmens diese Aktivität nicht beeinträchtigte.
Die Analyse der Proteinsequenz des vermuteten offenen Leserahmens (das entsprechende Protein wird im
folgenden als "GAM-1" bezeichnet, die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 angegeben) zeigte außerdem eine Serie von sieben Leucinresten. Von diesem Motiv ist bekannt, daß es in eine Struktur (sog. "Leucin-Zipper) faltet, die häufig eine Stelle von Protein-Protein- Wechselwirkungen ist (Busch und Sassone-Corsi, 1990; Lumb und Kim, 1995). Es wird angenommen, daß die
Leucin-Zipper-Dimersisierungsdomäne als alpha-helikale Struktur funktioniert, die Einführung von Aminosäuren wie Prolin, die alpha-Helices zerstören, kann somit die Zipper-Dimerisierung beeinträchtigen. Es wurde
festgestellt, daß die Einführung von Punktmutationen im Leucin-Zipper die Schutzwirkung von GAM-1 zerstört, was darauf hinweist, daß der GAM-1-Leucin-Zipper wichtig für die Funktion des Proteins ist. GAM-1 funktioniert daher entweder als Homodimer oder es existieren andere Bindungspartner für GAM-1.
GAM-1 weist keine Homologien mit irgendeinem der bekannten anti-apoptischen Proteine auf, einschließlich Mitgliedern der Bcl-2 Familie, Adenovirus 5 EIB 19K, der Bax-Familie, der Baculovirus-IAP-Familie, dem
Nematoden-Protein Ced-3. (Darüberhinaus zeigte die vollständige Sequenz des CELO-Virusgenoms, daß das CELO-Virus keine Gene besitzt, die Homologie mit der Ad2/5 EIB 19K-Region aufweisen. Es könnte daher sein, daß das CELO-Virus keine EIB 19K-Region hat und daher die GAM-1-Genfunktion als anti-Apoptosegen verwendet.)
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt ein DNA-Molekül, enthaltend die in Fig. 14 bzw. SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine für ein funktionelles Genprodukt mit anti-apoptotischer Wirkung kodierende Teilsequenz davon.
Bevorzugt ist ein DNA-Molekül mit der Sequenz des in Fig. 14 bzw. SEQ ID N0:1 dargestellten offenen
Leserahmens, einschließlich degenerierter Varianten davon, oder Mutanten, die für ein funktionelles
Genprodukt mit anti-apopotischer Wirkung kodieren.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen abgeleiteten
Polypeptide, insbesondere das vom offenen Leserahmen kodierte Protein der Bezeichnung GAM-1 (SEQ ID NO:2) sowie funktionelle Derivate davon.
Obwohl die Genprodukte von EIB 19K, Bcl-2 und GAM-1 eine ähnliche Schutzwirkung haben, könnte es sein, daß sie an verschiedenen Stellen des Apoptose-Weges wirken. Um dies festzustellen, wurden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung verschiedene Kombinationen von EIB 19K mit GAM-1 oder Bcl-2 mit GAM-1 mit einem
Luciferase-Reportergen co-transfiziert und das
Überleben der Zellen anhand der Luciferaseexpression im Vergleich zu Zellen, die mit den jeweiligen Genen allein behandelt wurden, bestimmt. Es wurde
festgestellt, daß die Kombination des GAM-1-9R1- Fragments mit EIB 19K gegenüber der Wirkung der
Einzelgene einen verstärkten Schutzeffekt hat, und zwar sowohl vier Tage (s. Fig. 19, Spalten 2, 3, und 4) als auch 22 Tage (s. Fig. 22, Spuren 3, 4 und 6) nach der Transfektion. Für Bcl-2 und GAM-1 wurde am Tag 22 ein Synergismus beobachtet.
Es kann eine Signalübermittlung von der extrazellulären Matrix zur Zelle auftreten. Es hat sich gezeigt, daß die geeignete extrazelluläre Umgebung entscheidend für das Überleben der Zelle ist und daß das Fehlen einer solchen Umgebung ein Todesprogramm aktivieren kann (Meredith et al., 1993; Brooks et al., 1994; Übersicht von Ruoslahti und Reed, 1994). Dieser Mechanismus könnte dafür entscheidend sein, die richtige Lage der Zelle innerhalb des Organismus festzulegen und zu erhalten. Es wurde gezeigt, daß die Verhinderung des Anhaftens von Epithelzellen an das Substrat mittels PolyHEMA (=poly(2-hydroxy-ethyl-Methacrylat; Folkman und Moscona, 1978) zur Apoptose führt und daß die
Expression von Bcl-2 diesbezüglich eine Schutzwirkung ausüben kann. Die nach der Transferrinfektion
beobachtete Abnahme der Genexpression ist
möglicherweise auf eine veränderte Assoziation der Matrix zurückzuführen; der durch GAM-1 ausgelöste
Mechanismus besteht möglicherweise in einer
Verhinderung des Zelltodes, der infolge des Loslösens der Zellen von der Unterlage ("detachment-induced apoptosis") eintritt. Um diese Frage zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung
Fibroblasten einerseits mit einem Luciferase- Reportergen, andererseits mit Testplasmiden, die unterschiedliche Fragmente von GAM-1 enthielten, transfiziert. Zwei Tage danach wurden die Zellen trypsinisiert und eine definierte Anzahl von Zellen auf PolyHEMA-beschichtete Zellkulturplatten ausplattiert. Sieben Tage später wurden die haftenden und die nicht- haftenden Zellen geerntet und auf Luciferaseaktivität untersucht. Es wurde festgestellt, daß die
Schutzwirkung innerhalb der 7H3- und 9R1-Fragmente liegt.
Außerdem wurde ein Vergleich zwischen dem von 9R1 kodierten GAM-1 einerseits und EIB 19 K bzw. Bcl-2 andererseits durchgeführt. Dazu wurden Zellen entweder mit dem Luciferase-Plasmid allein oder mit einem
Plasmid, das für EIB 19 K, Bcl-2 oder GAM-1 kodiert, transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde eine definierte Anzahl von Zellen auf eine Serie von Zellkulturplatten mit einem PolyHEMA-Überzug
abgestufter Konzentration gegeben und nach sieben Tagen die überlebende Zellpopulation durch Messung der verbleibenden Luciferaseexpression bestimmt. Es wurde durch Vergleich mit Kontrollzellen, die nur das
Luciferasegen exprimierten, eine Abnahme der
Luciferaseexpression um das 20fache festgestellt, wenn die Zellen auf Platten mit steigenden PolyHEMA- Konzentrationen aufgebracht wurden. Dabei wurde
beobachtet, daß die Oberflächen, die mit den höchsten PolyHEMA-Konzentrationen überzogen waren, eine
vollständige Ablösung der Zellpopulation hervorriefen. Bei-2 dürfte eine stärkere Wirkung haben als EIB 19 K oder GAM-1; die ohne PolyHEMA erhaltene
Luciferaseexpression blieb mit Bei-2 auch bei den höchsten PolyHEMA-Konzentration unverändert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde
festgestellt, daß EIB 19K, Bcl-2 und GAM-1 eine
Schutzwirkung gegen die durch das Loslösen der Zellen von einer Unterlage ausgelöste Apoptose aufweisen.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung
identifizierten, für GAM-1 kodierenden DNA-Moleküle können auch mutiert werden, sofern die Mutationen entweder keine Änderung der Aminosäuresequenz zur Folge haben bzw. die Änderungen keine für die Funktion essentiellen Aminosäuren betreffen.
In der bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Adenovirus-unterstützte
Transferrinfektion wird das anti-Apoptose-Gen auf einfache Weise in Form eines Plasmids zusammen mit dem Plasmid, das die DNA-Sequenz enthält, deren Expression in der Zelle den erwünschten Effekt erzielen soll ( im folgenden "wirksame DNA" bezeichnet), z.B. ein
therapeutisch wirksames Gen, in die
Transfektionskomplexe eingebaut. Es liegt dann
gemeinsam mit dem Plasmid, das die wirksame DNA trägt, komplexiert, z.B. mit Transferrin-Polylysin und
Adenovirus-Polylysin, vor. Das molare Verhältnis von wirksamem Gen und anti-Apoptose-Gen kann mittels
Titration bestimmt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen über einen längeren Zeitraum die Expression des wirksamen Gens bei verschiedenen Anteilen von anti-Apoptose-Gen gemessen wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Verhältnis von 5: 1 gewählt, das sich als günstig erwiesen hat. Da die Genprodukte einiger anti-Apoptose-Gene sehr starke Wirkung zeigen, können auch geringere Anteile verwendet werden. Eine durch eine allfällige Toxizität bedingte Obergrenze kann ebenfalls durch Titration ermittelt werden.
Es ist auch möglich, die therapeutisch wirksame DNA- Sequenz und das anti-Apoptose-Gen gemeinsam in ein einziges Plasmid zu integrieren, in diesem Fall beträgt das molare Verhältnis der beiden Gene 1:1, wenn sie in jeweils einer Kopie auf dem Plasmid vorliegen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde
festgestellt, daß der Zelltod durch den Eintritt von Adenovirus, und zwar auch in Abwesenheit von viraler Genexpression ausgelöst wird. Die gleichzeitige
Einführung einer aktiven Adenovirus-E1-Region sorgte für eine Erleichterung von der Apoptose; Versuche mit Plasmiden, die einzelne El-Gene trugen, identifizierten EIB 19K als das für die Schutzwirkung verantwortliche Gen. Ferner konnte beim Apoptosis-Phänotyp gezeigt werden, daß die gleichzeitige Einführung des Bei-2-Gens ebenfalls die Toxizität blockieren kann.
Um die Aktivierung der inflammatorischen Antwort auf den Eintritt von Adenovirus zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwei Zellinien hergestellt, die das Luciferasegen unter der Kontrolle von Promotoren enthalten, die auf zwei der wichtigsten während der Entzündung aktivierten
Transkriptionsfaktoren ansprechen, nämlich NF-IL-6 und NF-κB. Damit wurde die Voraussetzung geschaffen, die Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren als Antwort auf den Eintritt von Adenovirus oder des
Transfektionskomplexes rasch zu untersuchen. Um die Aktivierung von NF-KB zu testen, wurde ein Konstrukt eingesetzt, das das Luciferasegen unter der Kontrolle einer einfachen TATA-Box und drei NF-κB- Bindungselementen enthält. Ferner wurde ein auf
NF-IL-6/NF-κB ansprechendes, vom IL-6-Promotor
getriebenes Luciferasekonstrukt verwendet. Das
Aktivierungsverhalten der beiden Reporterzellinien bestätigte, daß die Promotoren außer auf ihre bereits früher charakterisierten Aktivatoren LPS und PMA auch auf Adenovirus, und zwar sowohl auf nicht-inaktiviertes auch auf Psoralen/UV-inaktiviertes, ansprechen (Tabelle 1). Es zeigte sich, daß die Aktivierung durch Psoralen- inaktiviertes Virus im selben Ausmaß wie mit nicht- inaktiviertem Virus stattfand. Dies stützt die Theorie, daß es nicht die frühe Virusgenexpression ist, die diese Faktoren aktiviert, sondern eher die Bindung und der Eintritt von Adenovirus.
Für die in Schritt b) unter i) definierte Maßnahme der äußerlichen Behandlung mit anti-inflammatorischen
Substanzen kommt z.B. die Behandlung mit Retinsäure ("Retinoic acid") oder anderen Retinoiden, in Betracht, von denen berichtet wurde, daß sie die IL-1-induzierte Produktion von IL-6 durch Lungenfibroblasten inhibieren (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994). Die
Wirkungsweise dieser Substanzklasse dürfte darin bestehen, daß sie die Konzentration der IL-6-mRNA steuern.
Eine weitere Substanzklasse für die Inhibierung der inflammatorischen Wirtsantwort sind die
Glucocorticoide, von denen gezeigt wurde, daß sie die Produktion von IL-6 und/oder IL-8 als Antwort auf inflammatorische Stimuli inhibieren (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß das Glucocorticoid Dexamethason die
Genexpression sowohl allein als auch im Zusammenwirken mit dem anti-Apoptose-Gen EIB 19K verstärkt.
Dexamethason wirkt auf die Aktivierung des Enzyms
Phosopholipase A2, die als eine der Folgen einer
Entzündung (Barnes und Adcock, 1993) stattfindet.
Dieses Enzym wird als Reaktion auf zahlreiche
inflammatorische Signale aktiviert und führt zur
Freisetzung von Arachidonsäure.
Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Gruppe anti-inflammatorischer Substanzen sind Inhibitoren des Arachidonsäure-Metabolismus.
Arachidonsäure wird über den Cyclooxygenaseweg zu proinflammatorischen Prostaglandinen und Thromboxanen metabolisiert. Dieser Weg, der schematisch in Fig. 12 dargestellt ist, kann durch die
Cyclooxygenaseinhibitoren Aspirin (Acetylsalicylsäure), Ibuprofen oder Indomethacin (Flower et al., 1985) inhibiert werden. Eine weitere Aktivierung durch
Arachidonsäure läuft über die 5-Lipoxygenase- Prozessierung, wobei Leukotriene gebildet werden.
5-Lipoxygenase kann durch NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart und Kolb, 1993; Cifone et al., 1993;
Conti et al., 1993; Pasquale et al., 1993; Rao et al., 1993) oder durch 5,8,11-Eicosatriynonsäure (5,8,11- Eicosatriynoic Acid; Pace et al., 1993) inhibiert werden. Weitere Inhibitoren der 5-Lipoxygenase wurden von McMillan und Walker, 1992, beschrieben.
Außer durch die genannten anti-inflammatorisch
wirkenden Substanzen kann die Behandlung der Zellen auch mit anti-inflammatorisch wirkenden Polypeptiden, wie IL-10 oder TGF-ß erfolgen.
Für die äußerliche Behandlung der Zellen wird die anti- inflammatorisch wirkende Substanz zweckmäßig dem Medium beigegeben.
Gemäß Schritt b) ii) wird die anti-inflammatorische Substanz als solche bzw. in einer bevorzugten
Ausführungsform in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt, z.B. in Form eines Plasmids, das eine für ein anti-inflammatorisches Protein wie IL-10 (Moore et al., 1990) oder TGF-ß (Massague et al., 1987) kodierende Sequenz enthält.
Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete anti-inflammatorisch wirkende Substanz ist VA1. Adenovirus VA1-RNA ist ein kleines, von RNA- Polymerase III synthetisiertes RNA-Molekül, welches für die effiziente Expression des Virusgenoms
verantwortlich ist. Angesichts von Berichten, daß doppelsträngige RNA NF-κB aktiviert (Visvanathan und Goodbourn, 1989) und der bekannten Wirkung VA1-RNA, die Aktivierung der dsRNA- aktivierten Kinase p68 zu blockieren, wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-κB, die durch den Eintritt von
Transfektionskomplexen aus Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert.
Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung
festgestellt, daß die Expression des Adenovirus-VA1- Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den Transfektionskomplex) die
Aktivierung von NF-KB durch Adenovirus auf das 1.5fache des Grundwerts verringerte. Es kann somit die
Expression des Adenovirus VA1-Gens während der
Transfektion dazu benutzt werden, die Aktivierung von NF-κB, die durch den Transfektionsprozeß ausgelöst wird, zu modulieren.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachte
Beobachtung, daß die VA1-Expression die Aktivierung inflammatorischer Zytokine hemmt, dürfte auf ein von der Erhöhung der Stabilität der mRNA oder deren Menge, wie sie für die Calciumphosphatmethode berichtet wurde, unabhängiges Phänomen zurückzuführen sein. An diesem Phänomen ist möglicherweise die Inhibierung der p68- Kinase-Aktivierung entscheidend beteiligt.
Die VA1 kann als RNA-Molekül oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, in Form der VA1-DNA in die Zelle importiert werden. Dabei kann ein Plasmid, das die VA1- Sequenz, gegebenenfalls in Mehrfachkopie, enthält, gemeinsam mit dem Plasmid mit der wirksamen DNA und dem Plasmid mit dem anti-Apoptose-Gen in
Transfektionskomplexe integriert werden. Es ist auch möglich, zwei der drei Sequenzen, oder auch alle drei, auf einem einzigen Plasmid zu vereinigen.
Ein Beispiel für eine im Rahmen der Gentherapie
anwendbare Dreierkombination wäre eine Kombination aus einer DNA, enthaltend die Faktor VIII-Sequenz als therapeutisch wirksame DNA, einem anti-Apoptose-Gen wie bei-2 oder EIB 19K und der VA1-DNA.
Alternativ zu VA1-DNA können Gene verwendet werden, die eine VA1 entsprechende Wirkung haben, z.B. EBER des Epstein Barr Virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) oder die TAR-RNA vom HIV-Virus (Gunnery et al., 1990).
Die Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf einen Transfektionskomplex, enthaltend ein in der Zelle zu exprimierendes Nukleinsäuremolekül, das mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie
Adenovirus oder ein Adenovirus-Polykation-Konjugat, wobei der Komplex außerdem ein DNA-Molekül mit Anti- Apoptose-Wirkung und/oder ein DNA-Molekül, kodierend für eine Substanz mit anti-inflammatorischer Wirkung, enthält.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine
pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen solchen Transfektionskomplex, in dem das in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäuremolekül ein therapeutisch oder gentherapeutisch wirksames DNA-Molekül ist. Neben dem Transfektionskomplex enthält die pharmazeutische Zubereitung die für die Anwendung auf Zellen üblichen Zusätze, wie Nährstoffe, etc. Figurenübersicht
Fig. 1: Zeitverlauf der Aktivierung von NF-IL-6 und
NF-κB
Fig. 2: Blockierung der Aktivierung von NF-KB durch
Expression von VA1
Fig. 3: Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1
Fig. 4: Einfluß der Expression von EIA, EIA 13S, EIB,
EIB 19K und Bcl-2 auf die Genexpression
Fig. 5: Einfluß der Expression von EIB 19K, EIA und
Bei-2 auf die Genexpression bei verschiedenen
Virusdosen
Fig. 6: Einfluß der Expression von Bcl-2, EIB 19K, EIA und EIA 13S auf die Langzeitgenexpression Fig. 7: Einfluß der Transfektion auf die Morphologie von Fibroblasten
Fig. 8: Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS
hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von EIB 19K und Bcl-2
Fig. 9: Verstärkung des Gentransfers durch
Dexamethason allein oder in Kombination mit
EIB 19K
Fig. 10: Verstärkung des Gentransfers durch
Dexamethason oder Aspirin allein oder in
Kombination mit EIB 19K
Fig. 11: Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen oder
5,8,11-Eicosatriynonsäure allein oder in
Gegenwart von EIB 19K
Fig. 12: Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von
Arachidonsäure-Metaboliten
Fig. 13: Restriktionskarte des CELO-Virusgenoms und
Karte der offenen Leserahmen des EcoRI-
Fragments 9R1 Fig. 14: Sequenz des CELO-Virus-Smal/Hindlll-Fragments von 9R1 (9R1S/H3)
Fig. 15: Genexpression in Gegenwart der Fragmente 7H3,
9R1 und 9R1S/H3
Fig. 16: Anti-apoptotische Wirkung verschiedener CELO- Virus-Fragmente
Fig. 17: Offene Leserahmen des EcoRI-Fragments von
CELO-Virus
Fig. 18: Zuordnung der anti-apoptotischen Wirkung zum richtigen Leserahmen. Vergleich verschiedender
Mutanten
Fig. 19: Einfluß der Mutation des Leucin-Zippers auf die anti-apoptotische Wirkung
Fig. 20: Wirkung des CELO-Virus-Gens auf die durch
Loslösen der Zellen von der Unterlage ausgelöste Apoptose
Fig. 21: Vergleich der Wirkung verschiedener anti- apoptotisch wirkender Gene auf die durch
Loslösen der Zellen von der Unterlage ausgelöste Apoptose
Fig. 22: Wirkung der Kombinationen verschiedener Gene mit anti-apoptotischer Wirkung
In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet: a) DNA-Plasmide i) Expressionsplasmid für die Adenovirus-VA1-Sequenz
Zunächst wurde die gesamte El-Region von Adenovirus Typ 5 (Nukleotid 1-5778) erhalten, indem die Adenovirus dll014-DNA (Bridge und Ketner, 1989) mit Xhol plus Asel verdaut wurde. Dieses Fragment wurde mit Klenow- Polymerase behandelt und in die Smal-Stelle des
Plasmids pAALM (erhalten aus pSP64 (Boehringer
Mannheim), indem dessen kleines EcoRI/PvuII-Fragment (bp 53 - bp 232) ersetzt wurde durch das EcoRI/PvuII- Fragment (bp 59 - bp 104) von pSPT18 (Boehringer
Mannheim)) ligiert, wodurch pElpaalm erhalten wurde. Das VA1-Expressionsplasmid pXVAH wurde konstruiert, indem das 5324 bp HindiII-Fragment (Nukleotid 6241- 11656) der Adenovirus-DNA in die Hindlll-Stelle von pAALM inseriert wurde, um pHVAH zu erhalten. pHVAH wurde daraufhin mit XBal gespalten und religiert, um pXVAH zu erhalten (dadurch wurde ein großes Stück, von der XBal-Stelle in pAALM bis zur XBal-Stelle bei
Position 10589 in der Adenovirussequenz, entfernt). Der erhaltene Klon pXVAH enthielt die Adenovirussequenz von Nukleotid 10589-11565. ii) Luciferasereporterplasmid pNF-κB-Luc
Das auf NF-κB ansprechende Plasmid pNF-κB-Luc wurde als ein Derivat des von Boehmelt et al., 1992,
beschriebenen Plasmids pTK3kbB konstruiert. Dazu wurde pTK3kbB mit Xhol und Ncol geschnitten, um das meiste der für CAT kodierenden Sequenz zu entfernen, mit
Klenow-Enzym behandelt und ligiert mit einem Klenow- behandelten Hindlll/Sspl-Fragment von pRSVL, enthaltend die Luciferasesequenz (De Wet et al., 1987). Dies ergab das Plasmid p3K-Luc, welches eine
Dreifachbindungsstelle für den Transkriptionsfaktor NF-κB plus die Luciferasesequenz, getrieben von einer Thymidinkinase (TK) TATA-Box, enthält. iii) Luciferasekonstrukt pIL-6-Luc Es wurde das von Matsusaka et al., 1993, beschriebene Konstrukt, das die vom IL-6-Promotor getriebene
Luciferasesequenz enthält, verwendet. iv) Expressionsplasmid für EIA 13S
Es wurde das von Kedinger et al., 1984, beschriebene Expressionsplasmid der Bezeichnung pl3S, das den endogenen EIA-Promotor verwendet, um die EIA 13S-CDNA zu treiben, verwendet. v) Expressionsplasmide für EIA, EIB und EIB 19K
Die verwendeten Expressionsplasmide der Bezeichnung pCMVE1A, pCMVE1B und pCMV19K wurden von White und
Cipriani, 1989 und 1990, beschrieben. vi) Expressionsplasmid für Bel-2
Das Expressionsplasmid der Bezeichnung pCMV-Bcl-2 wurde hergestellt, indem die humane Bcl-2 cDNA, flankiert von zwei EcoRI-Stellen (Seto et al., 1988), stromabwärts von einem CMV-Immediate-early-Promotor in das
Expressionsplasmid pBK-CMV (Stratagene) kloniert wurde. vii) Plasmid-DNA pCMVL ie Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07283 beschrieben. viii) Plasmid-DNA pCMVßgal
Es wurde das von Lim und Chae, 1989, beschriebene
Plasmid verwendet. b) Adenovirus d11014 DNA-Präparation
Das E4-defiziente Adenovirus 5, dll014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 x 107 Zellen in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF
(Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37ºC) unterworfen. Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3.000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde
aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VT150 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm3 CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml 1.45 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. Die Proben wurden 40 min lang bei 20ºC in einem Beckman VTi50 Rotor bei 49.000 rpm
zentrifugiert. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm3 (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm3) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63.000 rpm in einem VT165 Rotor
unterworfen. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm3 unreife oder 1.34 g/cm3 reife) wurden geerntet. Die Biotinylierung der erhaltenen
Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PD10-Säule, equilibriert mit HBS/40 %
Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 bzw. von Wagner et al., 1992, und Cotten et al., 1992, beschrieben. Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die
Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 x 1012
Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al., 1980) verwendet wurde. c) Transferrin-Polylysin-Konjugate (TfpL)
Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und
Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die Wagner et al., 1991, beschriebene Methode eingesetzt. d) Streptavidin-Polylysin-Konjugate (StpL)
Die Konjugate wurden hergestellt, wie in der WO
93/07283 beschrieben, wobei Polylysin 250 verwendet wurde. e) Adenovirus/DNA-Komplexe
Proben von biotinyliertem, Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus d11014 (8 μl, 1 x 1012 Partikel/ml) wurden in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg StpL in 150 μg HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Aliquots von 6 μg Plasmid-DNA (im Falle von Mischungen von pCMVL-DNA und einem anderen Plasmid betrug das Verhältnis 5:1) wurden in 100 μl HBS verdünnt und dann mit der
Adenovirus/StpL-Lösung 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Abschließend wurde ein 100 μl Aliquot von HBS, enthaltend 5 μg TfpL, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Aliquots dieser Transfektionskomplexe wurden dann, wie in den jeweiligen Beispielen einzeln beschrieben, auf die Zellen aufgegeben (im allgemeinen 10 bis 30
μl/20.000 Zellen). f) Reporterzellinien
Für die Herstellung der klonalen Zellinien, enthaltend das Reporterplasmid pNF-κB-Luc oder pIL-6-Luc, wurde von der humanen Lungenkarzinomzellinie A549 (ATCC CCL 185) ausgegangen. Die Plasmide wurden mit dem Neomycin- Phosphotransferase-Expressionsplasmid der Bezeichnung pMuatt (ein pUCl9-Plasmid, enthaltend die TKneo- Sequenz; Grosveld et al., 1982) unter Verwendung der Transfeetam-Methode (Behr et al., 1989) co-transfiziert und auf Zellen, die resistent gegen 400 μg/ml G418 (Sigma) sind, selektioniert. Klonale Derivate, die Luciferase nach Induktion durch PMA exprimierten, wurden identifiziert und expandiert.
Auf ähnliche Weise wurden A549-Zellen erhalten, die das Expressionsplasmid für Bcl-2 bzw. EIB 19K enthalten, mit dem Unterschied, daß das
Neomycinphosphotransferase-Plasmid pSVneo (Clontech) statt pMuatt und daß statt reinen Populationen Pools von G418-resistenten Klonen verwendet wurden. g) Humanfibroblasten
Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4ºC DMEM, enthaltend 10 % hitzeinaktiviertes FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren
Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM
Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37ºC Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich
gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert.
Eine alternative, bevorzugte Methode bestand darin, die Hautstücke nach der Zerkleinerung in frisches Medium zu überführen und nach Bedarf 1 bis 2 x mit Medium zu waschen. 5 bis 10 Gewebestücke wurden in eine T25- Gewebekulturflasche, deren Oberfläche mit DMEM plus 10 % FCS benetzt worden war, gegeben und gleichmäßig verteilt, worauf die Flasche umgedreht wurde. Dies bewirkte, daß die Biopsien herunterhängen ( "hanging drop configuration"; diese Methode wurde von Jones, 1989, beschrieben). Nach 1 bis 3 h im Brutschrank wurden die Flaschen wieder umgedreht und mit 1 bis 2 ml Medium befüllt. Festsitzende Biopsien wurden nach 24 h auf 5 ml aufgefüllt; andernfalls wurde der Vorgang wiederholt. Nach 6 bis 10 Tagen wuchsen die ersten Fibroblasten aus, von diesem Zeitpunkt an wurde einmal wöchentlich das Medium gewechselt. Sobald die Zellen konfluent waren, wurden sie in eine T75-Flasche
passagiert. h) Kultur von Fibroblasten auf PolyHEMA-überzogenen Zellkulturplatten
Die Platten wurden mit PolyHEMA (poly(2-hydroxy-ethyl- Methacrylat) überzogen, indem 200 μl einer PolyHEMA- Lösung (Sigma, Kat.Nr. P-3932; 10 mg/ml in 95 %
Ethanol) pro Vertiefung einer 24-Lochplatte gegeben wurden. Der Alkohol wurde über Nacht bei 37ºC
verdampfen gelassen, dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Nach dem Trocknen des zweiten Überzugs wurden die Platten zweimal mit HBS und einmal mit
Medium gewaschen, bevor die Zellen aufgebracht wurden (Methode A).
Die für die in Fig. 6 dargestellten Versuche
verwendeten Kulturplatten wurden nach einer Methode hergestellt, ähnlich wie von Folkman und Moscona, 1978, beschrieben. Dazu wurden normale Gewebekulturplatten (24-Lochplatten) mit 200 μl pro Vertiefung mit
PolyHEMA-Lösung in Alkohol überzogen. Nach Verdampfen des Alkohols über Nacht bei 37ºC wurde der Vorgang wiederholt. Die in der Fig. angegebenen Werte (10-1, 10-2, 10-3) geben die Verdünnungen der ursprünglichen PolyHEMA-Stammlösung (6 g PolyHEMA in 50 ml 95 %
Ethanol) an (Methode B). i) Luciferase-Assay
Die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurde
durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben. j) Zytokin-ELISAs
Der IL-6-ELISA wurde von R&D Systems, der IL-8-ELISA von Bender MedSystems bezogen. k) LPS-Präparat
Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. Das
Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad,
360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert. Beispiel 1
Aktivierung von NF-IL-6 und NF-κB durch den Eintritt von Adenovirus
Es wurden stabile Klone der
Lungenepithelkarzinomzellinie A549 erzeugt, die als Reportergenkonstrukt pNF-KB-luc bzw. pIL-6-luc
enthielten. Mit diesen beiden Zellinien (im folgenden auch als "A549 NF-κB-Zellen" oder "A549 IL-6-Zellen" bezeichnet) wurde das stimulatorische Verhalten
verschiedener Agentien auf die folgende Weise getestet: Eine definierte Anzahl von Zellen wurde jeweils
ausplattiert (4 x 104 Zellen pro Vertiefung einer
Platte mit 24 Vertiefungen für die A549-NF-κB-Zellen; 4 x 105 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6
Vertiefungen für die A549-IL-6-Zellen) und 24 bis 48 h später den Testagentien 4 h lang in 2 %
Pferdeserum/DMEM ausgesetzt. Die Zellen wurden dann in frisches Medium gegeben (10 % FCS/DMEM) und für die Luciferaseanalyse (Dreifachbestimmung) zu den in
Tabelle 1 angegebenen Zeiten geerntet (Inhalt von 2 bis 3 Vertiefungen pro Probe). Die Kontrollzellen, zu denselben Zeitpunkten geerntet, wurden denselben
Mediumwechseln ausgesetzt mit dem Unterschied, daß die Testagentien fehlten.
Das Aktivierungsverhalten jeder dieser Reporterzellen sowie die Konzentration der Testsubstanzen ist in
Tabelle 1 dargestellt (bei der Behandlung mit
Adenovirus/pL/DNA als Stimulus wurden die A549 NF-κB- Zellen mit 20 μl Transfektionskomplex (4 x 108
Viruspartikel entsprechend 104 Viren/Zelle) und die A549 IL-6-Zellen mit 200 μl Transfektionskomplex behandelt, was ebenfalls 104 Viren pro Zelle
entsprach).
Um den Zeitverlauf der NF-IL-6- und NF-κB-Aktivierung zu bestimmen, wurden die Zellen der beiden Zellinien, die sich in den oben angegebenen Mengen in einer 24- Well-Platte bzw. 6-Well-Platte befanden, wurden mit jeweils 104 Adenovirus dll014 Viruspartikeln pro Zelle behandelt (das entsprach 4 x 108 Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 NF-κB-Zellen bzw. 4 x 109 Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 IL-6- Zellen). Der Zeitverlauf der Induktion ist in Fig. 1 gezeigt: Der IL-6-Promotor ist nach 12 h voll aktiviert und kehrt dann rasch auf sein Ausgangsniveau zurück, während der NF-κB-Promotor aktiviert wird und
wenigstens 50 h lang aktiv bleibt. Letzterer Befund steht im Gegensatz zum publizierten Aktivierungsprofil von NF-κB selbst, welcher, nach seiner Aktivierung, nach 6 bis 12 h aufgrund der Aktivierung der IKB- Synthese auf das Ausgangsniveau zurückkehrt (Sun et al., 1993; Scott et al., 1993; Chiao et al., 1994). (Eine dafür mögliche Erklärung ist, daß dem verwendeten synthetischen NF-κB-Promotor die geeigneten
inhibitorischen Elemente fehlen, die die
Herunterregulierung gewährleisten, während der IL-6- Promotor, eine natürliche Sequenz, die Sequenzen besitzt, die das Funktionieren der normalen
Kontrollfunktionen zulassen.)
Beispiel 2
Blockierung der Aktivierung von NF-κB durch Expression von VA1 In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-κB, die durch den Eintritt von Transfektionskomplexen aus
Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert. Dazu wurden 4 x 104 A549 NF-κB Testzellen pro
Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 4 x 108
Psoralen/UV-inaktivierten Adenoviren dl1014,
entsprechend 104 Viruspartikeln pro Zelle, oder mit der entsprechenden Anzahl von Viren als Bestandteil der Transfektionskomplexe, entsprechend 20 μl
Transfektionskomplex, behandelt und gefunden, daß eine ähnliche Aktivierung von NF-KB hervorgerufen wird (bis zu 6 bis 7fach nach 72 h). Der Einbau einer für E1B kodierenden DNA in den Transfektionskomplex (500 μl der Komplexmischung enthielten 6 μg pCMVElB-DNA) hatte keine Wirkung auf die Inaktivierung von NF-κB. Im
Gegensatz dazu verringerte die Expression des
Adenovirus-VA1-Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den
Transfektionskomplex; 500 μl enthielten 6 μg pXVAH) die Aktivierung auf das ca. 1.5fache des Grundwertes (Fig. 2; Komplex bedeutet pSP65, Komplex/EIB bedeutet pCMVE1B, Komplex/VA1 bedeutet pXVAH).
Beispiel 3
Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1
Der Promotor für das humane IL-6-Gen enthält
Bindungssequenzen für die Transkriptionsfaktoren NF-IL- 6 und NF-κB, welche bei der Aktivierung dieses
Promotors zusammenwirken (Matsusaka et al., 1993; Betts et al., 1993). Es wurden A549 IL-6 Zellen verwendet, die das
Luciferasegen unter der Kontrolle des IL-6-Promotors (NF-IL-6-luc) enthalten (jede Probe befand sich in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, enthaltend je 4 x 105 Zellen. Es wurden Doppelbestimmungen
durchgeführt). Außer den Kontrollproben, bei denen nur Mediumwechsel vorgenommen wurden (Probe 1 ) wurden die Zellen mit PMA (Phorbolmyristylacetat; 10-8M; Probe 2), 104 Adenoviruspartikeln, enthalten in 200 μl
Transferrin-Polylysin/DNA-Komplex, der als DNA pSP65 enthielt (Probe 3), oder mit 104 Virusteilchen,
enthalten in 200 μl TfpL/DNA-Komplex, der als DNA pXVAH enthielt (Probe 4), behandelt und nach 10 h die
Luciferaseaktivität als Maß für die IL-6-Aktivierung gemessen. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 4
Teilweise Inhibierung der durch den Eintritt von
Adenovirus stimulierten Sekretion von IL-6 und IL-8 in humanen Hautfibroblasten durch Expression von VA1
Nachdem sich gezeigt hatte, daß der Eintritt von Virus sowohl einen auf NF-κB ansprechenden Promotor als auch den auf NF-KB/NF-IL-6 ansprechenden IL-6 Promotor stimuliert (Tabelle 1, Fig. 1, 2 und 3), wurde die Produktion von IL-6 bzw. IL-8 durch transfizierte primäre Fibroblasten als ein Maß für die Aktivierung der beiden endogenen Gene, die auf NF-KB/NF-IL-6 ansprechen, analysiert.
Dazu wurden primäre humane Fibroblasten (2 x 104 Zellen pro Vertiefung) entweder mit 103 oder 3 x 103
Psoralen/UV-inaktivierten Adenovirus d11014-Partikeln pro Zelle, eingebaut in StpL/TfpL/DNA- Transfektionskomplexe, behandelt (dies entsprach 2 μl oder 6 μl Transfektionskomplex, wobei die verwendete DNA entweder ein leeres Plasmid war (pSP65; Boehringer Mannheim) oder das Plasmid der Bezeichnung pXVAH, das die Adenovirus VA1-Sequenz enthält. Die Zellen wurden 4 h mit den Transfektionskomplexen in 2 %
Pferdeserum/DMEM behandelt, danach wurde das Medium entfernt und durch 10 % FCS/DMEM ersetzt. Nach 24 h (für IL-6) bzw. 48 h (für IL-8) wurden Aliquots des Mediums entfernt und mittels ELISA auf ihren Gehalt an IL-6 bzw. IL-8 untersucht. Es wurde gefunden, daß die Behandlung mit den Transfektionskomplexen sowohl die IL-6- als auch die IL-8-Sekretion durch diese Zellen stimuliert (Tabelle 2). In allen Fällen verringerte der Einbau des VA1-Gens in die Transfektionskomp axe die Menge an produziertem Zytokin um ca. 35 %. Die
anfängliche Stimulation der Zytokinproduktion
(Viruseintritt) muß stattfinden, bevor das Gen mit der Schutzwirkung eingeführt wird und in aktive RNA
transkribiert wird. Daher wurden Messungen der
Zytokinproduktion zu späteren Zeitpunkten nach der Transfektion durchgeführt, um zu bestimmen, ob die VA1-transfizierten Zellen zu späteren Zeitpunkten, wenn höhere Konzentrationen von VA1-RNA gebildet worden sind, eine ausgeprägtere Unterdrückung der
Zytokinproduktion zeigen.
Beispiel 5
Abnahme der Genexpression durch Expression der
Adenovirusgene EIA und E1A13S. Verstärkung des
Gentransfers durch Expression von EIB, EIB 19K und Bei-2 Zunächst wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, mit denen festgestellt werden sollte, ob die Expression bestimmter Adenovirusgene dazu geeignet ist, die
Genexpression nach Transferrinfektion zu verstärken. Eine definierte Menge des Luciferase- Expressionsplasmids pCMVL (5 μg) wurde mit
verschiedener Plasmid-DNA (jeweils 1 μg) gemischt, in TfpL/StpL/Adenovirus-Transfektionskomplexe eingebaut (Gesamtvolumen 500 μl) und auf primäre humane
Fibroblasten aufgebracht (es wurden auf 2 x 104 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte 50 μl Komplex, entsprechend 2.5 x 104 Virusteilchen pro Zelle, aufgebracht, wobei Dreifachbestimmungen vorgenommen wurden. In Fig. 4 bedeutet "minus" pSP65; die Test-DNA ist jeweils bezeichnet). Die erhaltene
Luciferaseaktivität wurde 48 bis 72 h nach der
Transfektion gemessen. Der Einbau gereinigter Gesamt- DNA des E4-negativen, El-positiven Adenovirus d11014 erzeugte eine zweifache Verstärkung der Genexpression (Fig. 4). Es wurde angenommen, daß die Verstärkung auf die E1-Expression zurückzuführen ist. Daraufhin wurde ein E1-Expressionsplasmid (pE1pAALM) gemeinsam mit dem Reporterplasmid in die Zellen eingebracht und gefunden, daß auch dieses eine Steigerung der Genexpression
(3fach) hervorruft. Die E1-Region enthält zwei Haupt- Genfunktionen, EIA und E1B. (Die E1A-Produkte haben die Wirkung, E2F vom Rb-Protein abzutrennen, andererseits modulieren sie die Transkriptionsaktivität vieler zellulärer und Adenovirus-Promotoren. Die
hauptsächliche Transkriptions-Transaktivatorfunktion ist im 13S-Genprodukt enthalten. Das 1B-Gen kodiert für zwei Hauptfunktionen: das EIB 55K-Genprodukt bindet p53 und ändert dessen Funktion. Vom 19K E1B-Genprodukt wird angenommen, daß es unterhalb von p53 wirkt, um die apoptotische Antwort zu blockieren.) Es wurde die Co-Expression von Plasmiden getestet, die entweder die komplette EIA- oder die komplette E1B- Region unter der Kontrolle des CMV-Promotors trugen. Das E1B-Plasmid ergab eine 7fache Verstärkung der
Genexpression. Im Gegensatz dazu erzeugte das E1A- Plasmid eine Inhibierung der Genexpression (das
0.3fache der Kontrollprobe). Auch das 19K E1B-Gen rief eine Verstärkung der Genexpression hervor (8.6fach).
Vom E1B 19K-Protein wurde kürzlich gezeigt, daß es ein stark wirksames Analoges des anti-apoptotischen Gens Bcl-2 ist (Rao et al., 1992). Es wurde daher Bcl-2 ebenfalls getestet und festgestellt, daß es eine
5.5fache Verstärkung der Genexpression hervorruft.
Beispiel 6
Untersuchung der Toxizität auf Spezifität
Als nächstes wurde getestet, ob die Abnahme der
Genexpression auf eine nicht-spezifische Toxizität, die durch die hohen Virus/Zell-Verhältnisse verursacht wird, zurückzuführen ist (die Versuche wurden mit ca. 50.000 Viruspartikeln pro Zelle durchgeführt).
Dazu wurden Transfektionskomplexe, enthaltend pCMVL plus das Plasmid pSP65, bzw. die Plasmide, die die Sequenz für Bcl-2, E1A oder E1B 19K enthielten (die Mengen an Reporterplasmid pCMVL und jeweiligen
Testplasmid betrugen, wie im vorigen Beissiel, 5 μg bzw. 1 μg), bei Viruspartikelzahlen von 3 x 104 (Fig. 5A), 104 (Fig. 5B) oder 3 x 103 (Fig. 5C) pro Zelle auf primäre Fibroblasten aufgebracht und die
Luciferaseaktivität über einige Zeit gemessen. Die Transfektionen wurden durchgeführt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, wobei den Zellen 6, 18 bzw. 60 μl Transfektionskomplex pro
Vertiefung, die 2 x 104 Fibroblasten enthielt,
aufgegeben wurde. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 5 dargestellt: Es wurden ähnliche
Genexpressionsmuster wie in den vorangegangenen
Beispielen (Abnahme bei ElA-behandelten Zellen,
Verstärkung bei 19K- bzw. Bcl-2-behandelten Zellen) festgestellt, und zwar unabhängig von der verwendeten Virusdosis.
Im vorangegangenen Beispiel hat sich sogar bei den mit 19K oder Bcl-2 transfizierten Zellen ein Verlust an Expressionsaktivität zu späteren Zeitpunkten,
insbesondere nach 6 Tagen, gezeigt. Es wurde daher in Betracht gezogen, ob nicht ein zweites Phänomen, das in Beziehung mit der inflammatorischen Antwort steht, wie sie sich im vorangegangenen Beispiel gezeigt hat, die Gesundheit der transfizierten Kultur beeinträchtigt. Wenn die transfizierten Zellen aufgrund des
Transfektionsvorganges eine Aktivierung der
Immunantwort zeigen, könnte die Sekretion von Zytokinen oder Toxinen von den Zellen die Lebenserwartung der Kultur beschränken.
Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden Versuche zum Zeitverlauf der Transfektion aufgestellt, indem
Transfektionskomplexe, enthaltend 5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 oder 1 μg eines Plasmids, enthaltend E1A, E1A 13S, E1B 19K oder Bcl-2, verwendet wurden. (In diesen Versuchen erhielten die Zellen einer Vertiefung 18 μl Transfektionskomplex.) Ab Tag 10 wurde das Kulturmedium täglich durch frisches Medium ersetzt; dieser Maßnahme lag die Überlegung zugrunde, daß der Mediumwechsel die Konzentrationen der Toxine senken würde. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 6 dargestellt: Es zeigte sich, daß die gewählte Vorgehensweise die
Langzeitgenexpression der Kulturen verstärkte, wenn pSP65, Bcl-2- oder 19K-Plasmide verwendet wurden. Im Gegensatz dazu nahm die Expression der E1A- und E1A 13S-Kulturen in ähnlichem Maß ab wie bei den nicht- gewaschenen Kulturen der vorangegangenen Experimente. Die Gegenwart von 19K zeigte noch nach 21 Tagen eine Verbesserung der Genexpression um eine Zehnerpotenz, was auf eine Rolle der Apoptose hinweist.
Beispiel 7
Untersuchung der Morphologie von transfizierten Zellen
Primäre humane Fibroblasten wurden mit dem
Reporterplasmid pCMVßgal plus pSP65 oder plus pCMV19K transfiziert (2 x 104 Fibroblasten pro Vertiefung einer 24-Well-Platte erhielten 18 μl Transfektionskomplex; 500 μl Komplex enthielten entweder 4 μg pCMVL plus 2 μg pSP65 oder 4 μg pCMVL plus 2 μg pCMV19K). 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit X-gal gefärbt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, um die Morphologie der Zellen, die die transfizierte DNA mit Erfolg
aufgenommen und exprimiert hatten, zu untersuchen. Es zeigte sich, daß zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Transfektion die beiden Zellpopulationen die
transfizierten Zellen innerhalb einer Größenordnung exprimieren. Während jedoch die β-gal exprimierenden Zellen in Abwesenheit von pCMV19K eine vorwiegend abgerundete und teilweise abgelöste Morphologie zeigen (Fig. 7, linke Tafel), die mit einem apoptotischen Phänotyp übereinstimmt, zeigten die mit pCMV19K co- transfizierten Zellen eine vorwiegend flache und adhärente Morphologie (Fig. 7, rechte Tafel). Die veränderte Morphologie dürfte auf die ausgedehntere und verstärkte Genexpression, die mit 19K erhalten wird, zusammenhängen.
Beispiel 8
Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS
hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von E1B 19K und Bcl -2
Im Zuge von Vorversuchen, in denen die Zellen LPS in Gegenwart von Adenovirus ausgesetzt worden waren, wurde festgestellt, daß die rasch auftretende Toxizität in diesen Zellen eine Morphologie der sterbenden Zellen hervorruft, die der Apoptose ähnlich ist (z.B.
fragmentierte Kerne, Kondensation). Darauf wurde angenommen, daß das Eindringen von LPS in die Zelle während des Eintritts von Adenovirus eine apoptotische Antwort hervorruft.
Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden
Transfektionskomplexe mit einem Gehalt an LPS plus entweder E1B 19K-Gen oder Bcl-2-Gen hergestellt, um festzustellen, ob die gesamte Einführung des
Apoptoseauslösers LPS mit dem anti-Apoptosegen Bcl-2 den Zelltod blockieren würden. Es wurde festgestellt, daß keine Verringerung der Toxizität eintritt,
vermutlich weil die Geschwindigkeit der toxischen
Antwort, die 4 h nach der Behandlung bemerkbar wird, es nicht zuläßt, daß genügend 19K- oder Bei-2-Genprodukt akkumuliert wird. Aufgrund dieser Beobachtung wurde eine alternative Methode zur Feststellung, ob 19K oder Bcl-2 einen Schutz gegen die LPS-induzierte Toxizität gewähren können, entwickelt: Es wurden stabile
Zellinien, die entweder das 19K- oder das Bcl-2-Gen trugen, mit den LPS/Adenovirus-Komplexen in Berührung gebracht. Dazu wurden A549-Zellen als Kontrollzellen sowie A549 19K-Zellen und A549-Bcl-2-Zellen zu je
4 x 104 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte ausplattiert und mit 50 μl Transfektionskomplex, enthaltend 6 μg pCMVL pro 100 μl Komplex und entweder 0, 10 oder 100 ng LPS pro 6 μg DNA, behandelt. Die Erwartung, daß die vorangehende Expression jedes dieser Proteine einen Schutzeffekt haben sollte, wurde
erfüllt: Wie in Fig. 8 gezeigt, wurden Kontrollzellen, die den Adenovirus/pL/DNA-Komplexen ausgesetzt waren, als Funktion von zunehmendem LPS-Gehalt in der Probe getötet (vgl. Probe 1: kein LPS, mit Proben 2 und 3: 10 und 100 ng LPS/6μg DNA). In Zellen, die entweder 19K oder Bei-2 exprimieren, trat eine Verringerung in der Toxizität auf 39 % (Probe 2) bzw. 77 oder 60 % auf (Proben 5 oder 8; 19K oder Bcl-2). Bei der Bewertung dieser Ergebnisse ist zu beachten, daß die in diesem Versuch ausgewerteten Zellen noch Pools von stabil exprimierenden Zellen darstellten; von reinen
Populationen von 19K oder Bcl-2 exprimierenden Zellen ist zu erwarten, daß ein höherer Schutzeffekt (bis zu 100 %) erhalten wird.
Beispiel 9
Verstärkung des Gentransfers durch das Glucocorticoid Dexamethason allein oder in Kombination mit einem anti- Apoptose-Gen
Primäre humane Fibroblasten wurden mit
Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen transfiziert, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei als DNA entweder
pCMVL/pSP65 oder pCMVL/pCMV19K im Verhältnis von jeweils 5:1 eingesetzt wurde. 4 h nach der Transfektion wurden die Proben in frisches 10 % FCS/DMEM-Medium oder in 10 % FCS/DMEM-Medium, enthaltend 3 μM Dexamethason (Sigma), überführt. 24 h nach der Transfektion wurden die Proben (Doppelbestimmung) geerntet und die
Luciferaseaktivitat bestimmt. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von Dexamethason in Abwesenheit von pCMV19K die Luciferaseexpression um einen Faktor 1.65 erhöht. In Gegenwart von sowohl Dexamethason als auch pCMV19K war die Verstärkung 5,8,11-Eicosatriynonsäure 2.71fach (Tabelle 3).
Der weitere Zeitverlauf über 7 Tage ist in Fig. 9 dargestellt; das Dexamethason enthaltende Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Zu jedem der angegebenen Zeitpunkte wurden Doppelbestimmungen der
Luciferaseaktivitat vorgenommen.
Beispiel 10
Untersuchung des Einflusses von Inhibitoren von
Arachidonsäure-Metaboliten auf die Genexpression
Um festzustellen, ob Arachidonsäure-Metaboliten an der Verringerung der Genexpression in transfizierten Zellen beteiligt sind, wurden, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, primäre Hautfibroblasten mit
Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen, die das
Luciferasegen enthielten, transfiziert, und zwar mit und ohne Co-Transfektion des E1B 19K-Gens, und es wurde die Luciferaseaktivität über die Zeit verfolgt. (Die DNA enthielt 5.5μg pCMVL und 0.5μg pSP65 (Kontrolle) oder pCMV19K). 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen in Standardmedium (DMEM plus 10 % FCS)
enthaltend, wo in Fig. 10 angegeben, 10 uM Dexamethason oder 2 mM Aspirin, überführt. Es wurden
Dreifachbestimmungen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 10 dargestellt. Es zeigte sich, daß sowohl Dexamethason als auch Aspirin eine Zunahme der Genexpression sowohl in Gegenwart als auch bei Abwesenheit von EIB 19K bewirken. Die Wirkung von
Aspirin war weniger ausgeprägt als die von
Dexamethason, was darauf hindeutet, daß die Inhibierung der Cyklooxygenase nicht ausreicht, den Abfall der Genexpression zu verhindern. Beide Substanzen zeigten hinsichtlich der Steigerung der Genexpression einen synergistischen Effekt mit dem EIB 19K-Gen.
Beispiel 11
Vergleich der Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen und 5,8,11-Eicosatriynonsäure in Gegenwart oder bei
Abwesenheit von EIB 19K
Analog wie im vorigen Beispiel beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die Luciferaseexpression gemessen. 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen auch in diesem Versuch in Standardmedium gegeben, das, wo in Fig. 11 angegeben, 10 uM Dexamethason, den
Cyclooxygenaseinhibitor Ibuprofen (100 μM) oder den 5- Lipoxygenaseinhibitor 5,8, 11-Eicosatriynonsäure (30 μM) enthielt; die optimalen Konzentrationen der Inhibitoren waren jeweils durch Titration in Vorversuchen ermittelt worden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 11 dargestellt. Es zeigte sich, daß von den drei
untersuchten anti-inflammatorischen Substanzen nur Dexamethason eine wesentliche Verbesserung der
Genexpression in Abwesenheit von EIB 19K bewirkt. In Gegenwart von EIB 19K zeigte sich ein synergistischer Effekt von Dexamethason und 5,8,11-Eicosatriynonsäure. Beispiel 12
Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von Arachidonsäure-Metaboliten
Analog wie in den vorigen Beispielen beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die
Luciferaseexpression gemessen. Als Inhibitoren wurden Dexamethason (10 μM), 5, 8, 11-Eicosatriynonsäure
(30 μM), NDGA (10 μM), Ibuprofen (30 uM) und Aspirin (2 mM) verwendet. In Fig. 12 sind links der
Arachidonsäureweg eingezeichnet, in der Mitte die
Inhibitoren an den jeweiligen Stellen ihrer Wirkung und rechts die erhaltenen Expressionswerte. Während alle untersuchten Inhibitoren eine gewisse Verbesserung der Genexpression zeigten, die möglicherweise auf eine Verbesserung des Zustandes der Zellen insgesamt
zurückzuführen ist, konnte die deutlichste Verbesserung bei der Dexamethasonbehandlung festgestellt werden. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß dieses Glucocorticoid an mehreren Stellen angreift
(Dexamethason kann die Genexpression von
inflammatorischen Zytokinen blockieren, indem es als negativer Transkriptionsmodulator wirkt (z.B. um das IL-6-Gen zu blockieren); es kann auch wirken, indem es die Phospholipase mRNA-Konzentration verringert oder die Lipocortinkonzentrationen erhöht (Barnes und
Adcock, 1993).
Beispiel 13
Identifizierung eines anti-apoptotischen Gens von
Hühner Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolierung und Klonierung von CELO-Virus- Genomfragmenten
Als Ausgangsmaterial wurde das CELO Virus Adenovirus Typ 1 (ATCC VR-432) verwendet. Das Virus wurde nach Wachstum in Hühnerembryos gereinigt, wie von Cotten et al., 1993, beschrieben. Die DNA wurde aus dem Virus präpariert, indem das Virus mit Proteinase K
(0.3 mg/ml) in HBS/0.1 % SDS 45 min lang bei 56 ºC inkubiert wurde. Dann wurde CsCl beigegeben
(28.5 g/26 ml Lösung), daraufhin Ethidiumbromid
(0.1 mg/ml), und die Probe wurde 18 h lang in einem Vti 65 Rotor (Beckman, 20ºC) zentrifugiert. Die DNA (deutlich sichtbare gefärbte Bande) wurde gesammelt, das Ethidiumbromid durch Extraktion mit CsCl- gesättigtem Isopropanol bis zum Verschwinden der
Rosafärbung extrahiert und das CsCl mittels
Gelfiltration entfernt.
Das erhaltene gesamte 42.8 kb große CELO-Virusgenom wurde einerseits mit EcoRI, andererseits mit Hindlll verdaut. Die erhaltene Mischung von Fragmenten wurde in einem 0.8 % Agarosegel aufgetrennt und auf einem 3 mm Whatmanpapier und anschließend über eine Sephadex G-50 Säule gereinigt.
Die Restriktionskarte von CELO-Virus ist im oberen Teil von Fig.13 dargestellt; sie basiert auf den
Restriktionskartierungen von Cai und Weber, 1993;
Aleström et al., 1982, und Li et al., 1984. In der Fig. ist die Lage der Hindlll- und der EcoRI-Stellen
angegeben (in Kartierungseinheiten, wobei eine
Kartierungseinheit 428 Basenpaare beträgt). Ferner sind die Nomenklatur der Expressionsklone sowie die Lage der Fragmente 7H3 (Hindlll D-Fragment) und 9R1 (EcoRI D- Fragment) eingezeichnet. Diese Fragmente sind diejenigen, die in den Gentransferexperimenten einen positiven Effekt zeigten (vgl. die in b) beschriebenen Versuche).
Die erhaltenen Fragmente wurden in den von Superti- Furga et al., 1991, beschriebenen Expressionsvektor pX stromabwärts vom CMV Immediate Early Promotor kloniert, wobei jedes Fragment in beiden Orientierungen isoliert und charakterisiert wurde. b) Testung der isolierten Genfragmente auf anti- apoptotische Wirkung
Um festzustellen, ob die Expression der erhaltenen Genfragmente dazu geeignet ist, die bei der
Transferrinfektion auftretende Abnahme der
Genexpression zu verringern, wurden
Transfektionsversuche durchgeführt, wie in Beispiel 5 angegeben, wobei die Testplasmide die diversen, in Fig. 16 angegebenen CELO-Virusfragmente enthielten. Die Menge an Transfektionskomplexen betrug 15 μl pro 20.000 Zellen, enthaltend 5 μg Luciferase-Reporterplasmid und 1 μg des jeweiligen Testplasmids (in den meisten Fällen wurden Klone, enhaltend das Fragment in beiden
Richtungen relativ zum Promotor, getestet). Die für die diversen Klone erhaltenen Werte für die Genexpression (es wurde nach 24 h und dann an den Tagen 4, 7, 14 und 21 gemessen ) im Verhältnis zum Kontrollwert sind in Fig. 16 angegeben, wobei die HindIII-Fragmente mit "H3" und die EcoRI-Fragmente mit "Rl" bezeichnet sind.
In allen Fällen war die Luciferaseexpression nach 24 h ähnlich; am 4. Tag zeigte sich eine Abnahme der
Expression der Kontrolle. Fig. 16 zeigt die relative Expression (Durchschnittswert von 3 Proben) der Test- Proben (5 μg Luciferase-Reporterplasmid und 1 μg Plasmid pXCELO) gegenüber den Kontrollproben ( 5 μg Luciferase-Reporterplasmid pCMVL und 1 μg Leervektor) am Tag 14. Eine Schutzwirkung (drei- bis achtfache Verstärkung der Luciferaseexpression) konnte nur bei den Plasmiden beobachtet werden, die die 7H3- und 9R1- Fragmente enthielten; diese beiden Fragmente stammen aus derselben Region des CELO-Virusgenoms und weisen in ihrer Sequenz einen überlappenden Bereich von etwa 80 % auf (siehe die in Fig. 13 dargestellte
Restriktionskarte).
Die DNA-Sequenzen der Fragmente 9R1 und 7H3, die eine Schutzwirkung gezeigt hatten, wurden nach
Standardmethoden bestimmt. Dazu wurden DNA-Fragmente in pBSII (Stratagene) subkloniert, durch die Kombination von Exo III- und Sl-Nukleasen Deletionen von einer Richtung aus vorgenommen, Klone isoliert und unter Anwendung des "Taq-Dye-Deoxy Terminator Cycle
Sequencing" Systems (ABI) auf einem ABI 373- Sequenzanalysegeräts sequenziert. Klone in umgekehrter Orientierung wurden unter Verwendung synthetisierter Primer sequenziert.
Die Analyse der von den beiden Fragmenten 9R1 und 7H3 kodierten offenen Leserahmen ergab einen einzigen größeren offenen Leserahmen, der den beiden Fragmenten gemeinsam ist (in Fig. 13 unten dargestellt; der mit * bezeichnete offene Leserahmen bezeichnet den 9R1 und 7H3 gemeinsamen großen offenen Leserahmen). Dieser offene Leserahmen, dessen Sequenz in Fig. 14
unterstrichen ist, kodiert, beginnend beim Nukleotid 577, für ein für Protein mit 283 Aminosäuren. Das entsprechende Genprodukt wurde als GAM-1 bezeichnet.
Fig. 17 zeigt die nach Sequenzananalyse mittels
automatischer Fluoreszenz-Didesoxy-Methode ermittelten offenen Leserahmen, die größer als 200 Basenpaare sind, als schwarze Balken; vom Smal/HindIII-Fragment, von dem die relvanten, nur einmal vorkommenden
Restriktionsstellen dargestellt sind, erwies sich in den im folgenden Beispiel dargestellten Versuchen, daß es volle Aktivität aufwies).
Von Larson et al., 1986, wurde im CELO-Virus ein VA-Gen im Genfragment zwischen den Kartierungseinheiten 88.7 und 92.7 identifiziert. Von diesem VA-Gen (in der 9R1- Sequenz von Nukleotid 4286-4184) wurde berichtet, daß es in geringem Ausmaß die Genexpression von cotransfizierten Genen verstärkt. Da dieses Gen zwar im 9R1-Fragment enthalten ist, jedoch außerhalb des 7H3- Fragments liegt, ist nicht anzunehmen, daß es zu der in den vorliegenden Versuchen beobachteten, in dieser Region gelegenen verstärkenden Wirkung auf die
Genexpression beiträgt. Um festzustellen, ob diese Verstärkerwirkung eine neue Funktion des offenen
Leserahmens von 9R1 ist und nicht im Zusammenhang mit der vorbeschriebenen VA-Funktion steht, wurde ein
Smal/HindiII-Restriktionsfragment von 9R1 hergestellt, das den offenen Leserahmen von 9R1, nicht jedoch das VA-Gen besitzt. Es wurden daher analog den
Transfektionen mit den 7H3- und den 9R1-Fragmenten auch Transfektionen mit diesem Restriktionsfragment
(9R1S/H3) durchgeführt, das ebenfalls in den pX Vektor kloniert worden war. Die Ergebnisse dieser
Transfektionen zeigten, daß die festgestellte
verstärkende Wirkung des Fragments auf die
Genexpression nicht eine Funktion des VA-Gens ist. c) Zeitverlauf der Genexpression in Gegenwart der
Fragmente 7H3, 9R1 und 9R1S/H3 Um eine genauere Untersuchung der
Genexpressionsverstärkung durchzuführen, wurden
Transfektionen mit dem 9R1-Fragment, dem 7H3-Fragment und dem Smal/HindIII-Fragment von 9R1 durchgeführt und die Luciferaseexpression über einen längeren Zeitraum verfolgt. (Die Transfektionskomplexe enthielten 5 μg pCMVL und entweder 1 μg pSP65 als Kontrolle oder 1 μg des Vektors pX mit dem jeweiligen Fragment). Es wurde gefunden, daß die Aufrechterhaltung der Genexpression mit den Fragmenten 9R1, 7H3 und dem 9RlS/H3-Konstrukt vergleichbar ist, was darauf schließen läßt, daß die Schutzwirkung von 9R1 und 7H3 zur Gänze in dem
Smal/Hindlll-Fragment von 9R1 enthalten ist. Diese Versuche deuten darauf hin, daß das aktive Gen durch den offenen Leserahmen dieser Region definiert wird. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 15
dargestellt. d) Auswirkung von Mutationen auf die anti-apoptotische Wirkung von GAM-1
Es wurden primäre humane Fibroblasten, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, transfiziert, und zwar mit einem Luciferase-Plasmid und dem Leervektor pX (Kontrolle) oder den verschiedenen Testplasmiden
(5.5 μg pCMVL plus 0.5 μg Testplasmid), wobei die
Testplasmide die jeweils mutierten Sequenzen
enthielten.
Aufgrund der Restriktionskarte des 9R1-Fragments und aufgrund der Beobachtung, daß die expressionssteigernde Aktivität sowohl bei 9R1 und 7H3 auftritt, war
anzunehmen, daß diese Aktivität links von der einzigen Hindlll-Stelle des 9R1-Fragments gelegen sein muß. Ein Smal/Hindlll-Restriktionsfragment enthält den größten offenen Leserahmen links von der Hindlll-Stelle. Als dieses Fragment in einen Vektor subkloniert wurde, zeigte sich, daß es die volle Aktivität des 9R1- Fragments aufweist (Fig. 18, Spalte 4).
BssHII schneidet oberhalb des offenen Leserahmens, von dem die Aktivität vermutet wurde. Schneiden mit BssHII, Behandlung mit Klenow/T4-DNA-Polymerase zum Entfernen der überhängenden Nukleotide und Religieren des
Smal/Hindlll-Fragments führt ein Stopcodon oberhalb dieses Leserahmens ein und sollte daher die Aktivität des erhaltenen Gens nicht verändern. Diese Annahme wurde bestätigt (Fig. 18, Spalte 4); somit liegt die Aktivität offensichtlich außerhalb der BssHII-Region. Ähnliche Behandlungen (Restriktionsverdau/Klenow/T4- DNA-Polymerase und Religieren) an drei anderen
Restriktionsstellen (SacII, SphI und Bglll) des
vermuteten offen Leserahmens zerstörten die
Schutzwirkung (Fig. 18, Spalten 5, 6, 7): sämtliche dieser Behandlungen führen Stopcodons innerhalb des vermuteten Leserahmens ein und würden daher die
erhaltenen Proteine in der Nähe der jeweiligen
Restriktionsstellen verkürzen (die genauen
Proteinsequenzen (im Einbuchstabencode) und die
Aktivität der Mutanten sind in Tabelle 4 angegeben).
Um die Auswirkung von Mutationen im Leucin-Zipper zu testen, wurden zwei der Leucinreste im GAM-1-Zipper mittels PCR in Prolinreste mutiert (GAM-1-Mutante #6; L258P, L265P). Primäre humane Fibroblasten wurden wiederum transfiziert, wie oben beschrieben, und zwar mit 5 μg pCMVL plus 1 μg des in Fig. 19 angegebenen Testplasmids, außer bei Probe 4, wo je 0.5 μg EIB 19 K und 0.5 μg p9Rl S/H3 (= Smal/Hindlll-Fragment von 9R1) verwendet wurden. Die Luciferaseexpression wurde 4 Tage nach der Transfektion gemessen. Es zeigte sich, daß die Einführung dieser Punktmutationen die Schutzwirkung von GAM-1 zerstört (Fig. 19, Spalte 5).
Beispiel 14
Wirkung von GAM-1 auf den durch Ablösung der Zellen von der Unterlage bewirkten Zelltod ("detachment-induced apoptosis") a) Wirkung verschiedener GAM-1-Fragmente
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen Testplasmiden (pXCELO), die das jeweils in Fig.20 angegebene Fragment enthielten, (5 μg pCMVL plus 1 μg des jeweiligen Testplasmids) transfiziert. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, gezählt, und eine definierte Zellzahl (20.000 pro Vertiefung) wurden (3fach) in 24- Lochplatten, die nach Methode A mit PolyHEMA überzogen worden waren. 7 Tage nach dem Ausplattieren wurde die Luciferaseaktivität der gesamten Zellpopulation (nicht anhaftende plus anhaftende Zellen) gemessen. Jeder der in Fig. 20 dargestellten Werte stellt den
Durchschnittswert von 3 Transfektionen dar. b) Vergleich der Wirkung von GAM-1 mit EIB 19 K und Bei-2
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen Testplasmiden (5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 oder pElB 19K, pBCL-2 oder p9R1 S/H3 ) transfiziert. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, gezählt und und eine definierte Zellzahl (20.000 pro Vertiefung) wurden (3fach) entweder in normale 24-Lochplatten oder in nach Methode B mit PolyHEMA überzogenen 24-Lochplatten ausplattiert. Fig. 21 gibt die Verdünnung des für die Beschichtung verwendeten PolyHEMA an. 7 Tage nach dem Ausplattieren wurde die Luciferaseaktivität der gesamten
Zellpopulation (nicht anhaftende plus anhaftende
Zellen) gemessen. Jeder der in Fig. 21 dargestellten Werte stellt den Durchschnittswert von 3 Transfektionen dar.
Beispiel 15
Wirkung der Kombination von GAM-1 mit EIB 19K oder mit Bei-2
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen in Fig.22 angegebenen Testplasmiden (5 μg pCMVL plus 1 μg des jeweiligen Testplasmids in den Proben 1-4, in den Proben 5 und 6 enthielt die Mischung neben dem Reporterplasmid je 0.5 μg des
Testplasmids) transfiziert. In Fig. 22 ist die
Luciferaseexpression 22 Tage nach der Transfektion gezeigt, wobei jeder Wert den Durchschnitt von 3
Transfektionen darstellt.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere zum Einbringen von
Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in die Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man außer dem
Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten a) in die Zelle ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren Expressionsprodukte die durch das Einbringen des Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der
Wirtszelle zumindest teilweise blockieren,
und/oder daß man
b) die inflammatorische Antwort der Zellen
zumindest teilweise inhibiert, indem man
i) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti-inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder
ii) in die Zellen eine oder mehrere anti- inflammatorische Substanz(en) oder die dafür kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA- Moleküle einbringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial DNA ist, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die
Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, und daß der DNA-Komplex in Gegenwart von Adenovirus oder Adenovirus-Polykation-Konjugat in die Zellen eingebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für humanes Bcl- 2 kodiert.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für Adenovirus EIB 19K kodiert.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung für ein Genprodukt kodiert, das p53 inaktiviert.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül ein Smal/Hindlll-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen ca. 84.3 bis 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist, oder eine DNA-Sequenz, die dieses Fragment
enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül die in SEQ ID NO: 1
dargestellte Nukleotidsequenz oder eine
Teilsequenz davon aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein EcoRI-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen den
Kartierungseinheiten 81.2 bis 92.7 lokalisiert ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein HindIII-Fragment ist, das im Bereich zwischen den Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 lokalisiert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül den in der Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 enthaltenen offenen Leserahmen aufweist oder für ein Genprodukt kodiert, das ein
funktionelles Derivat des durch diesen Leserahmen definierten Genprodukts ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykation-Komplexes vorliegt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die in die Zelle
einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung auf getrennten Plasmiden
vorliegen.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die in die Zelle
einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Adenovirus VA1 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 2, 14 und 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die VA1-DNA gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykation-Komplexes vorliegt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch
gekennzeichnet, daß der Komplex außerdem das in a) definierte DNA-Molekül enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle auf getrennten
Plasmiden vorliegen.
19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Zelle ein DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung einbringt und die Zellen
äußerlich mit einer anti-inflammatorisch wirkenden Substanz behandelt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorisch wirkende Substanz die Aktivierung von
Phospholipase A2 inhibiert.
22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz ein Glucocorticoid ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, daß das Glucocorticoid
Dexamethason ist.
24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz einen Metaboliten der Arachidonsäure inhibiert.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Ibuprofen ist.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Acetylsalicylsäure ist.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA) ist.
28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz 5,8,11-Eicosatriynonsäure ist.
29. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Indomethacin ist.
30. DNA-Molekül, enthaltend die in SEQ ID NO: 1
dargestellte Nukleotidsequenz oder eine für ein funktionelles Genprodukt mit anti-apoptotischer Wirkung kodierende Teilsequenz davon.
31. DNA-Molekül nach Anspruch 30, dadurch
gekennzeichnet, daß es den in der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthaltenen offenen Leserahmen
aufweist, einschließlich degenerierter Varianten, oder Mutanten, die für ein funktionelles
Genprodukt mit anti-apopotischer Wirkung kodieren.
32. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz
aufweist.
33. Transfektionskomplex, enthaltend ein in der Zelle zu exprimierendes Nukleinsäuremolekül, das mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie Adenovirus oder ein Adenovirus- Polykation-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem ein DNA-Molekül mit Anti-Apoptose- Wirkung und/oder ein DNA-Molekül, kodierend für eine Substanz mit anti-inflammatorischer Wirkung, enthält.
34. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen
Transfektionskomplex nach Anspruch 33, in dem das in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäuremolekül ein therapeutisch oder gentherapeutisch wirksames DNA-Molekül ist.
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