DE4442587A1

DE4442587A1 - Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in höhere eukaryotische Zellen

Info

Publication number: DE4442587A1
Application number: DE19944442587
Authority: DE
Inventors: Matthew Dr Cotten; Adam Baker; Susanna Dr Chiocca
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 1996-08-01

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere zum Einbringen von Fremdmaterial, wie DNA, in die Zellen.

Bedarf an einem effizienten System für das Einführen von Fremdmaterial, insbesondere Nukleinsäure in lebende Zellen besteht vor allem im Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch wirksamer Genprodukte zu erzielen.

Standardmethoden für die Transfektion von Zellen verwenden u. a. Calciumphosphat (für Anwendungen in vitro), kationische Lipide (Felgner et al., 1993) oder Liposomen.

Die bisher am weitesten fortgeschrittenen Technologien im Rahmen der Gentherapie benutzen rekombinante Vektorsysteme (Retroviren oder Adenoviren) für den Transfer von Genen in die Zelle (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769).

Alternativen Strategien für den Gentransfer liegen Mechanismen zugrunde, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient. Ein Beispiel dafür ist der Import von Genen in die Zelle über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (z. B. Wu und Wu, 1987, Wagner et al., 1990, und EP-A1 0388 758).

Übersichten über die Gentherapie im allgemeinen und über nicht-virale Gentransfermethoden im besonderen werden von Mulligan, 1993, bzw. von Cotten und Wagner, 1993, gegeben.

Für den Gentransfer mit DNA/Polykation-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose wurde eine Verbesserung vorgeschlagen, die den Einsatz von Komponenten aufgrund ihrer Fähigkeit vorsieht, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, z. B. Adenoviren oder fusogene Peptide. Der Einsatz der endosomolytischen Komponenten bewirkt eine Steigerung der Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b; WO 93/07283). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die Adenovirus-Polylysin-Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin- Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA-Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den Zielzellen. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Diese Technik, die auch als "Transferrinfektion" bezeichnet wird, weist gegenüber konventionellen viralen Techniken eine erhöhte Sicherheit auf (Cotten et al., 1992).

Mit dem Adenovirus-unterstützten Gentransfer auf der Grundlage der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden zwar transient hohe Expressionswerte erreicht, es ist jedoch bisher aufgrund toxischer Effekte in einigen Zelltypen nicht gelungen, eine Expression über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Diese toxischen Effekte sind auf verschiedene Abwehrantworten der Wirtszelle, bald nach Eintritt des Virus in die Zelle, zurückzuführen. Die Mechanismen, welche die Aktivierung dieser Antworten regeln, sind noch nicht aufgeklärt, Untersuchungen mit replikationsdefizienten Adenovirusmutanten lassen vermuten, daß die Antworten des Wirts sehr früh stattfinden, möglicherweise sogar vor der Virusgenexpression.

Eine Komponente dieser Wirtsantwort ist eine Aktivierung der "Interferon Responsive Genes" (Gene, die auf Interferon ansprechen), höchstwahrscheinlich durch Aktivierung von ISGF3, eines auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktors, dessen Bindungsstellen sich stromaufwärts einer Reihe von auf Interferon ansprechenden Gene befinden. Eines der aktivierten Gene ist die Proteinkinase p68, welche durch doppelsträngige RNA aktiviert wird. p68 wird in einer inaktiven Form synthetisiert und unterliegt in Gegenwart von dsRNA einer autokatalytischen Phosphorylierung, welche die Kinase aktiviert, was zur Phosphorylierung und Inaktivierung des Translations- Initiationsfaktors eIF2a führt, wodurch die Initiierung der Proteintranslation blockiert wird. Außerdem wurde berichtet, daß NF-κB durch dsRNA aktiviert wird (Visvanathan und Goodbourn, 1989), was darauf hindeutet, daß p68 vielleicht direkt IKB phosphoryliert und NF-κB aktiviert.

Die Typ C-Adenoviren besitzen zwei starke Mechanismen, um diesen Translationsarrest durch den Wirt zu verhindern:

Die E1a-Genprodukte können die Aktivierung von ISGF3 direkt stören (Gutch und Reich, 1991; Ackrill et al., 1991).

Ein zweiter, noch direkter wirkender Mechanismus benutzt die VA1-Gene. Das Genprodukt bildet eine stabile Sekundärstruktur, welche an die p68-Kinase binden kann, ohne die Kinase zu aktivieren, und welche die Bindung und Aktivierung durch die eigentlichen Aktivatoren verhindern kann (Manche et al., 1992; Mathews und Shenk, 1991).

Ein weiterer inflammatorischer Reaktionsmechanismus als Folge des Eintritts von Virus dürfte in der Aktivierung des inflammatorischen Transkriptionsfaktors NF-IL-6 und der Sekretion des inflammatorischen Zytokins IL-6 bestehen (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992). Dieser Faktor wiederum aktiviert, oft im Zusammenwirken mit NF-KB, das IL-6-Gen selbst wie auch eine Anzahl weiterer inflammatorischer Response-Gene wie TNF und IL-1. Kürzlich wurde berichtet, daß IL-6 seinerseits den auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktor IRF 1 ("Interferon Response Factor 1") aktivieren kann (Narroch et al., 1994). Dies dürfte entweder für die Interferon-Response auf den Eintritt von Adenovirus verantwortlich sein oder diese verstärken. Da die meisten der frühen Gene von Adenovirus Typ C Bindungsstellen für NF-IL-6 enthalten, könnte man annehmen, daß die Aktivierung von NF-IL-6 durch Adenovirus die Auslösung der Virusgen- Expressionskaskade gewährleistet.

Eine andere Verteidigungslinie der Wirtszelle dürfte die apoptotischen Antwort sein. Es ist lange bekannt, daß Mutationen, die in der E1B 19K-Region kartieren, für den deg-Phänotyp, einen verstärkten zytopathischen Effekt, der vom Abbau der chromosomalen DNA des Wirts begleitet ist (D′Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt und Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984), verantwortlich sind. Jüngere Untersuchungen haben eine Apoptose identifiziert, die durch Expression eines E1A-Wachstumssignals in Abwesenheit von E1B hervorgerufen wird (White und Stillman, 1987; White et al., 1994; Rao et al., 1992); an dieser Apoptose dürfte die durch E1A ausgelöste Freisetzung des Transkriptionsfaktars E2F vom Rb- Protein beteiligt sein (Wu und Levine, 1994). Es wurde gezeigt, daß das E1B 19K-Protein als stark wirksames Analoges des die Apoptose blockierenden Wirtsgens Bcl-2 fungieren kann (Rao et al., 1992; Debbas und White, 1993). Die Expression jedes dieser Proteine kann eine durch verschiedene Signale ausgelöste Apoptose blockieren. Im Zusammenhang mit den Untersuchungen mit Myc wurde festgestellt, daß Wachstumssignale eine Zelle entweder für die Proliferation, wenn die geeigneten Verstärkungssignale, z. B. Ras oder Src, zur Verfügung stehen, oder für die Apoptose, wenn die Myc-Signale allein vorhanden sind (Evan et al., 1992), determinieren. Ein ähnliches Modell für die durch Adenovirus E1 induzierte Transformation wird durch Versuche gestützt, die zeigen, daß die Apoptose durch E1A-Expression in Abwesenheit von E1B 19K ausgelöst wird (White und Stillman, 1987; Rao et al., 1992; Debbas und White, 1993). Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung der Sindbisvirusinfektion hat gezeigt, daß die Expression von Bcl-2 in der Wirtszelle ein ausschlaggebender Faktor für den Ausgang einer Virusinfektion sein kann (Levine et al., 1993): Beim Fehlen von Bcl-2 macht die Zelle eine Apoptose durch, womit die Virusproduktion auf eine kurze akute Phase beschränkt wird. In Gegenwart von Bcl-2-Expression findet eine chronische Virusproduktion statt, weil die apoptotische Antwort auf die Akutphaseninfektion ausbleibt. Anti-apoptotische Aktivitäten wurden ferner im Epstein-Barr Virus (das BHERI-Gen; Pearson et al., 1987), im Baculovirus (das p35-Gen; Sugimoto et al., 1994) und im afrikanischen Schweinefiebervirus (das LMW5-HL-Gen; Neilan et al., 1993) identifiziert. Dies deutet darauf hin, daß die apoptotische Antwort auf die Virusinfektion in vielen Fällen eintritt und Viren Strategien entwickelt haben, um diese Antwort zu blockieren.

Die mit inaktivierten Adenovirus-Kapsiden für den Gentransfer mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose durchgeführten Versuche beruhten zunächst auf der Annahme, daß das Viruskapsid nur als ein die Endosomen aufbrechendes Reagens wirkt, was eine Funktion der Oberflächenproteine des Viruskapsids ist. Es wurden Inaktivierungsmethoden entwickelt, die die Virustranskription und -replikation blockieren, ohne die endosomolytische Aktivität des Kapsids zu verändern (Cotten et al., 1994). Im Zuge weiterer Versuche mit Adenovirus-unterstützten Transfektionen wurde die Kontamination mit Lipopolysaccharid (LPS) als eine Quelle für die Toxizität in Primärzelltransfektionen identifiziert. Diesem Toxizitätsproblem konnte durch sorgfältige Entfernung von LPS von der DNA leicht abgeholfen werden. Obwohl die Inaktivierung des Virus und die Entfernung von LPS zwei Formen von Virus- assoziierter Toxizität beseitigten, gelang nicht in allen Zelltypen Langzeit-Genexpression, auch nicht mit Psoralen/UV-inaktiviertem humanem Adenovirus in Gegenwart von LPS-freier DNA.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Mechanismen aufzuklären, die bei den bei Transfektionen beobachteten Toxizitätseffekten auftreten, um auf der Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse ein neues, verbessertes Verfahren für die Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere das Einführen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäuren, in die Zellen bereitzustellen.

Bisherige Bestrebungen zur Verbesserung der Gentransfermethoden konzentrierten sich auf die Verstärkung der Genexpression. So wurde z. B. berichtet, daß die VA1-Expression die Genexpression von co- transfizierten Genen verstärkt, indem sie die Stabilität mRNA oder deren Menge erhöht (Svensson und Akusjärvi, 1984; Stÿker et al., 1989; Svensson und Akusjärvi, 1990; Mathews und Shenk, 1991). Der dafür verantwortliche Mechanismus ist auf molekularer Ebene noch nicht aufgeklärt; ein Zusammenhang mit Toxizitätsproblemen dürfte nicht gegeben sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in höhere eukaryotische Zellen, wobei man außer dem Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten

a) in die Zellen ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren Expressionsprodukte die durch das Einbringen des Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der Wirtszelle zumindest teilweise blockieren, und/oder daß man
b) die inflammatorische Antwort der Zellen zumindest teilweise inhibiert, indem man
- ) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti- inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder
- ii) in die Zellen eine oder mehrere anti- inflammatorische Substanz(en) oder die dafür kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA-Moleküle einbringt.

Die in a) definierten DNA-Moleküle werden im folgenden als "anti-Apoptose-Gene" oder als "DNA-Moleküle mit anti-Apoptose-Wirkung" bezeichnet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in die Zellen außer den Komponenten a) und gegebenenfalls b) ii) das Fremdmaterial und die Transfektionskomponenten eingebracht.

Die Definition des Begriffs "Apoptose" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche toxischen Effekte, die zurückzuführen sind auf a) direkte Aktivierung der apoptotischen Antwort; b) Aktivierung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten, welche direkt oder indirekt Apoptose induzieren; c) Aktivierung der Sekretion von TNF, IL-6 oder eines anderen Zytokins, welche die Lebensfähigkeit der transduzierten Zellen beeinträchtigt; d) überschüssige Aktivierung von NF-KB; e) überschüssige Aktivierung von p53.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren auf die oben angeführte, von Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b sowie in der WO 93/07283 beschriebene Gentransfermethode angewendet, bei der DNA mit Hilfe von Konjugaten aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation unter Mitwirkung von, gegebenenfalls mit einem Polykation konjugierten, Adenovirus als endosomolytischem Mittel in die Zelle eingebracht wird. Diese Veröffentlichungen werden ausdrücklich in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung miteinbezogen. (Diese Methode wird im folgenden als "Adenovirus-unterstützte Transferrinfektion" bezeichnet.)

Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auf sämtliche Methoden zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle, bei denen die oben dargelegten Toxizitätseffekte auftreten, angewendet werden, insbesondere auf Gentransfermethoden, z. B. bei der Verwendung rekombinanter Adenovirusvektoren. Derartige Gentransfermethoden finden Anwendung in vitro sowie bei der Gentherapie sowohl in vivo als auch ex vivo, insbesondere in Fibroblasten, hämatopoetischen Zellen, Endothelzellen oder Lungenepithelzellen.

Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens kann außerdem bei der Behandlung eukaryotischer Zellen sämtliche Anwendungen umfassen, bei denen eine Blockierung einer apoptotischen und/oder inflammatorischen Antwort der Zelle erforderlich oder vorteilhaft ist. Ein Beispiel für eine solche erweiterte Anwendung ist die Transplantation von fremden Zellen, Geweben oder Organen, bei der aufgrund der Immunerkennung eine apoptotische Reaktion der Zellen stattfindet. Durch die Expression von anti- apoptotisch wirksamen Genen in den zu transplantierenden Zellen kann die Apoptose verhindert werden.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das anti-Apoptose-Gen das humane Bcl-2-Gen (Seto et al., 1988).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das anti-Apoptose-Gen das E1B 19K-Gen von Adenovirus Typ 2 oder 5 (White und Cipriani, 1990).

Weitere Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete anti-Apoptose-Gene sind das BHRF1- Gen des Epstein-Barr Virus (Pearson et al., 1987), die Baculovirusgene b35 (Sugimoto et al., 1994) und iap (Clem und Miller, 1994), das LMW5-HL-Gen vom afrikanischen Schweinefiebervirus (Neilan et al., 1993) und das ced-9-Gen von Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al.; 1994).

Diese Genprodukte wirken im Apoptose- Signalübertragungsweg relativ weit stromabwärts, d. h. nahe an den an den Abbauprozessen unmittelbar beteiligten Proteasen. So wird z. B. von Bcl-2 und Bcl-2 ähnlichen Proteinen angenommen, daß sie die Aktivierung der als ICE oder ICE-ähnlich bezeichneten Proteasen blockieren. Da diese Protease(n) offenbar eine ganz entscheidende Funktion für die Apoptose haben, kommt auch ihrer Blockierung eine entscheidende Rolle zu.

Außer den Substanzen mit einem Bcl-2 ähnlichen anti- Apoptosemechanismus kommen auch solche in Betracht, die eine Komponente, die weiter stromaufwärts im Apoptose- Signalübertragungsweg wirkt, blockieren. Eine solche Komponente ist z. B. p53, dessen Aktivierung einen der Signalübertragungswege auslöst, die zur Apoptose führen. Wenn somit die durch den Transfektionsvorgang ausgelöste Apoptose über die Aktivierung von p53 läuft, könnten Substanzen, die p53 inaktivieren, für die Blockierung der Apoptose eingesetzt werden, wobei einerseits zu beachten ist, daß die Blockierung nicht durch einen anderen Signalübertragung, der ebenfalls zur Apoptose führt, umgangen wird, andererseits, daß die Inaktivierung von p53 in dem jeweiligen Zelltyp nicht einen transformierten Zustand hervorruft.

Beispiele für Gene, die p53 inaktivieren, sind E1B 55K von Adenovirus Typ 2 oder Typ 5 (White und Cipriani, 1989) oder E1-Funktionen von anderen Adenovirusstämmen, z. B. Adenovirus 12 oder vom CELO-Virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), das E6-Gen vom humanen Papillomavirus-16 (Levine, 1990), das große T-Antigen von SV 40 (McCarthy et al., 1994), das mdm-2-Gen (Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993; Chen et al., 1994).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine Screening-Methode entwickelt, mit der auf einfache Weise Gene mit anti-apoptotischer Wirkung identifziert werden können. Die Methode besteht darin, Säugetierzellen, z. B. Fibroblasten, mit einem Reporterplasmid, z. B. einem Luciferase-Plasmid, zu transfizieren und die Expression des Reportergens über einen bestimmten Zeitraum zu verfolgen. In Parallelversuchen werden die Zellen unter identischen Bedingungen zusätzlich mit Test-DNA, z. B. genomischen Virus-DNA Fragmenten oder DNA-Molekülen aus einer cDNA- Bibliothek, in geeigneten Expressionsvektoren transfiziert. Gegebenenfalls werden die Zellen in einem weiteren Ansatz zusätzlich mit einer DNA-Sequenz transfiziert, von der bekannt ist, daß sie die gewünschte anti-apoptotische Wirkung hat, z. B. mit E1B 19K oder Bcl-2. In derartigen Versuchen zeigt sich die anti-apoptotische Wirkung einer Test-DNA-Sequenz dadurch, daß bei Co-Transfektion der Zellen mit dieser Sequenz die Expression des Reportergens höher ist als bei Transfektion der Zellen mit dem Reportergen allein. Bei Co-Transfektion mit einem Gen bekannter anti- apoptotischer Wirkung kann die Wirkung des Testgens mit der des bekannten Gens verglichen werden.

Mit Hilfe dieser Screening-Methode wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein anti-apoptotisch wirksames DNA-Molekül des Hühner Adenovirus Typ I (CELO = Chicken Embryo Lethal Orphan) identifiziert.

Dieses DNA-Molekül liegt auf einem SmaI/HindIII- Fragment, das im CELO-Virusgenom im Bereich zwischen ca. 84.3 bis ca. 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist. Von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierten SmaI/HindIII-Fragment wurde die in Fig. 14 dargestellte Nukleotidsequenz ermittelt.

Das SmaI/HindIII-Fragment wurde aus einem EcoRI- Fragment der Bezeichnung 9R1 erhalten, das im Bereich zwischen 81.2 bis 92.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist (s. Fig. 13).

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann das SmaI/HindIII- Fragment als solches als anti-apoptotisches Gen eingesetzt werden.

Alternativ kann das EcoRI-Fragment 9R1, von dem das SmaI/HindIII-Fragment eine Teilsequenz darstellt, als ganzes eingesetzt werden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das zwischen Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 auf dem CELO- Virusgenom lokalisierte HindIII-Fragment der Bezeichnung 7H3 einzusetzen. Die Fragmente 9R1 und 7H3 haben einen Überlappungsbereich von 80%, das SmaI/HindIII-Fragment ist den beiden Fragmenten gemeinsam, es enthält den einzigen großen offenen Leserahmen dieses Bereichs.

Ferner kann eine DNA, die im wesentlichen nur aus dem offenen Leserahmen besteht, eingesetzt werden.

Die Größe des DNA-Moleküls im Bereich bzw. der Umgebung der angegebenen Fragmentbereiche ist nicht kritisch.

Die definitive Zuordnung eines anti-apoptotisch wirksamen Gens zu dem offenen Leserahmen wird mittels gerichteter in vitro ("site specific") Mutagenese vorgenommen, auf diese Weise kann auch festgestellt werden, welcher der für die anti-apoptotische Aktivität minimal erforderliche Leserahmen ist, indem die mutierten DNA-Abschnitte auf anti-apoptotische Wirkung gescreent werden. Entsprechend können die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten DNA-Moleküle auf diejenigen Abschnitte verkürzt werden, die das erwünschte Ausmaß an anti-apoptotischer Wirkung aufweisen.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifizierten CELO-Virus-DNA-Moleküle können auch mutiert werden, sofern die Mutationen entweder keine Änderung der Aminosäuresequenz zur Folge haben bzw. die Änderungen keine für die Funktion essentiellen Aminosäuren betreffen.

In der bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Adenovirus-unterstützte Transferrinfektion wird das anti-Apoptose-Gen auf einfache Weise in Form eines Plasmids zusammen mit dem Plasmid, das die DNA-Sequenz enthält, deren Expression in der Zelle den erwünschten Effekt erzielen soll (im folgenden "wirksame DNA" bezeichnet), z. B. ein therapeutisch wirksames Gen, in die Transfektionskomplexe eingebaut. Es liegt dann gemeinsam mit dem Plasmid, das die wirksame DNA trägt, komplexiert, z. B. mit Transferrin-Polylysin und Adenovirus-Polylysin, vor. Das molare Verhältnis von wirksamem Gen und anti-Apoptose-Gen kann mittels Titration bestimmt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen über einen längeren Zeitraum die Expression des wirksamen Gens bei verschiedenen Anteilen von anti-Apoptose-Gen gemessen wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Verhältnis von 5 : 1 gewählt, daß sich als günstig erwiesen hat. Da die Genprodukte einiger anti-Apoptose-Gene sehr starke Wirkung zeigen, können auch geringere Anteile verwendet werden. Eine durch eine allfällige Toxizität bedingte Obergrenze kann ebenfalls durch Titration ermittelt werden.

Es ist auch möglich, die therapeutisch wirksame DNA- Sequenz und das anti-Apoptose-Gen gemeinsam in ein einziges Plasmid zu integrieren, in diesem Fall beträgt das molare Verhältnis der beiden Gene 1 : 1, wenn sie in jeweils einer Kopie auf dem Plasmid vorliegen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß der Zelltod durch den Eintritt von Adenovirus, und zwar auch in Abwesenheit von viraler Genexpression ausgelöst wird. Die gleichzeitige Einführung einer aktiven Adenovirus-E1-Region sorgte für eine Erleichterung von der Apoptose; Versuche mit Plasmiden, die einzelne E1-Gene trugen, identifizierten E1B 19K als das für die Schutzwirkung verantwortliche Gen. Ferner konnte beim Apoptosis-Phänotyp gezeigt werden, daß die gleichzeitige Einführung des Bcl-2-Gens ebenfalls die Toxizität blockieren kann.

Um die Aktivierung der inflammatorischen Antwort auf den Eintritt von Adenovirus zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwei Zellinien hergestellt, die das Luciferasegen unter der Kontrolle von Promotoren enthalten, die auf zwei der wichtigsten während der Entzündung aktivierten Transkriptionsfaktoren ansprechen, nämlich NF-IL-6 und NF-κB. Damit wurde die Voraussetzung geschaffen, die Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren als Antwort auf den Eintritt von Adenovirus oder des Transfektionskomplexes rasch zu untersuchen. Um die Aktivierung von NF-κB zu testen, wurde ein Konstrukt eingesetzt, das das Luciferasegen unter der Kontrolle einer einfachen TATA-Box und drei NF-1κB- Bindungselementen enthält. Ferner wurde ein auf NF-IL- 6/NF-κB ansprechendes, vom IL-6-Promotor getriebenes Luciferasekonstrukt verwendet. Das Aktivierungsverhalten der beiden Reporterzellinien bestätigte, daß die Promotoren außer auf ihre bereits früher charakterisierten Aktivatoren LPS und PMA auch auf Adenovirus, und zwar sowohl auf nicht-inaktiviertes auch auf Psoralen/UV-inaktiviertes, ansprechen (Tabelle 1). Es zeigte sich, daß die Aktivierung durch Psoralen- inaktiviertes Virus im selben Ausmaß wie mit nicht- inaktiviertem Virus stattfand. Dies stützt die Theorie, daß es nicht die frühe Virusgenexpression ist, die diese Faktoren aktiviert, sondern eher die Bindung und der Eintritt von Adenovirus.

Für die in Schritt b) unter i) definierte Maßnahme der äußerlichen Behandlung mit anti-inflammatorischen Substanzen kommt z. B. die Behandlung mit Retinsäure ("Retinoic acid") oder anderen Retinoiden, in Betracht, von denen berichtet wurde, daß sie die IL-1-induzierte Produktion von IL-6 durch Lungenfibroblasten inhibieren (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994). Die Wirkungsweise dieser Substanzklasse dürfte darin bestehen, daß sie die Konzentration der IL-6-mRNA steuern.

Eine weitere Substanzklasse für die Inhibierung der inflammatorischen Wirtsantwort sind die Glucocorticoide, von denen gezeigt wurde, daß sie die Produktion von IL-6 und/oder IL-8 als Antwort auf inflammatorische Stimuli inhibieren (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß das Glucocorticoid Dexamethason die Genexpression sowohl allein als auch im Zusammenwirken mit dem anti-Apoptose-Gen E1B 19K verstärkt.

Dexamethason wirkt auf die Aktivierung des Enzyms Phosopholipase A2, die als eine der Folgen einer Entzündung (Barnes und Adcock, 1993) stattfindet. Dieses Enzym wird als Reaktion auf zahlreiche inflammatorische Signale aktiviert und führt zur Freisetzung von Arachidonsäure.

Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Gruppe anti-inflammatorischer Substanzen sind Inhibitoren des Arachidonsäure-Metabolismus.

Arachidonsäure wird über den Cyclooxygenaseweg zu pro- inflammatorischen Prostaglandinen und Thromboxanen metabolisiert. Dieser Weg, der schematisch in Fig. 12 dargestellt ist, kann durch die Cyclooxygenaseinhibitoren Aspirin (Acetylsalicylsäure), Ibuprofen oder Indomethacin (Flower et al., 1985) inhibiert werden. Eine weitere Aktivierung durch Arachidonsäure läuft über die 5-Lipoxygenase- Prozessierung, wobei Leukotriene gebildet werden. 5- Lipoxygenase kann durch NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart und Kolb, 1993; Cifone et al., 1993; Conti et al., 1993; Pasquale et al., 1993; Rao et al., 1993) oder durch 5,8,11-Eicosatriynonsäure (5,8,11- Eicosatriynoic Acid; Pace et al., 1993) inhibiert werden. Weitere Inhibitoren der 5-Lipoxygenase wurden von McMillan und Walker, 1992, beschrieben.

Außer durch die genannten anti-inflammatorisch wirkenden Substanzen kann die Behandlung der Zellen auch mit anti-inflammatorisch wirkenden Polypeptiden, wie IL-10 oder TGF-β erfolgen.

Für die äußerliche Behandlung der Zellen wird die anti- inflammatorisch wirkende Substanz zweckmäßig dem Medium beigegeben.

Gemäß Schritt b) ii) wird die anti-inflammatorische Substanz als solche bzw. in einer bevorzugten Ausführungsform in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt, z. B. in Form eines Plasmids, das eine für ein anti-inflammatorisches Protein wie IL-10 (Moore et al., 1990) oder TGF-β (Massague et al., 1987) kodierende Sequenz enthält.

Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete anti-inflammatorisch wirkende Substanz ist VA1. Adenovirus VA1-RNA ist ein kleines, von RNA- Polymerase III synthetisiertes RNA-Molekül, welches für die effiziente Expression des Virusgenoms verantwortlich ist.

Angesichts von Berichten, daß doppelsträngige RNA NF-κB aktiviert (Visvanathan und Goodbourn, 1989) und der bekannten Wirkung VA1-RNA, die Aktivierung der dsRNA- aktivierten Kinase p68 zu blockieren, wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-κB, die durch den Eintritt von Transfektionskomplexen aus Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert.

Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß die Expression des Adenovirus-VA1- Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den Transfektionskomplex) die Aktivierung von NF-κB durch Adenovirus auf das 1.5fache des Grundwerts verringerte. Es kann somit die Expression des Adenovirus VA1-Gens während der Transfektion dazu benutzt werden, die Aktivierung von NF-κB, die durch den Transfektionsprozeß ausgelöst wird, zu modulieren.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachte Beobachtung, daß die VA1-Expression die Aktivierung inflammatorischer Zytokine hemmt, dürfte auf ein von der Erhöhung der Stabilität der mRNA oder deren Menge, wie sie für die Calciumphosphatmethode berichtet wurde, unabhängiges Phänomen zurückzuführen sein. An diesem Phänomen ist möglicherweise die Inhibierung der p68- Kinase-Aktivierung entscheidend beteiligt.

Die VA1 kann als RNA-Molekül oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, in Form der VA1-DNA in die Zelle importiert werden. Dabei kann ein Plasmid, das die VA1- Sequenz, gegebenenfalls in Mehrfachkopie, enthält, gemeinsam mit dem Plasmid mit der wirksamen DNA und dem Plasmid mit dem anti-Apoptose-Gen in Transfektionskomplexe integriert werden. Es ist auch möglich, zwei der drei Sequenzen, oder auch alle drei, auf einem einzigen Plasmid zu vereinigen.

Ein Beispiel für eine im Rahmen der Gentherapie anwendbare Dreierkombination wäre eine Kombination aus einer DNA, enthaltend die Faktor VIII-Sequenz als therapeutisch wirksame DNA, einem anti-Apoptose-Gen wie bcl-2 oder E1B 19K und der VA1-DNA.

Alternativ zu VATI-DNA können Gene verwendet werden, die eine VA1 entsprechende Wirkung haben, z. B. EBER des Epstein Barr Virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) oder die TAR-RNA vom HIV-Virus (Gunnery et al., 1990).

Figurenübersicht

Fig. 1 Zeitverlauf der Aktivierung von NF-IL-6 und NF-κB;

Fig. 2 Blockierung der Aktivierung von NF-κB durch Expression von VA1;

Fig. 3 Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1;

Fig. 4 Einfluß der Expression von E1A, E1A 135, E1B, E1B 19K und Bcl-2 auf die Genexpression;

Fig. 5 Einfluß der Expression von E1B 19K, E1A und Bcl-2 auf die Genexpression bei verschiedenen Virusdosen;

Fig. 6 Einfluß der Expression von Bcl-2, E1B 19K, E1A und E1A 13S auf die Langzeitgenexpression;

Fig. 7 Einfluß der Transfektion auf die Morphologie von Fibroblasten;

Fig. 8 Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von E1B 19K und Bcl-2;

Fig. 9 Verstärkung des Gentransfers durch Dexamethason allein oder in Kombination mit E1B 19K;

Fig. 10 Verstärkung des Gentransfers durch Dexamethason oder Aspirin allein oder in Kombination mit E1B 19K;

Fig. 11 Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen oder 5,8,11-Eicosatriynonsäure allein oder in Gegenwart von E1B 19K;

Fig. 12 Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von Arachidonsäure-Metaboliten;

Fig. 13 Restriktionskarte des CELO-Virusgenoms und Karte der offenen Leserahmen des EcoRI- Fragments 9R1;

Fig. 14 Sequenz des SmaI/HindIII-Fragments von 9R1 (9R1S/H3);

Fig. 15 Genexpression in Gegenwart der Fragmente 7H3, 9R1 und 9R1S/H3.

In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:

a) DNA-Plasmide i) Expressionsplasmid für die Adenovirus-VA1-Sequenz

Zunächst wurde die gesamte E1-Region von Adenovirus Typ 5 (Nukleotid 1-5778) erhalten, indem die Adenovirus d11014-DNA (Bridge und Ketner, 1989) mit XhoI plus Ase1 verdaut wurde. Dieses Fragment wurde mit Klenow- Polymerase behandelt und in die SmaI-Stelle des Plasmids pAALM (erhalten aus pSP64 (Boehringer Mannheim), indem dessen kleines EcoRI/PvuII-Fragment (bp 53 - bp 232) ersetzt wurde durch das EcoRI/PvuII- Fragment (bp 59 - bp 104) von pSPT18 (Boehringer Mannheim)) ligiert, wodurch pE1paalm erhalten wurde. Das VA1-Expressionsplasmid pXVAH wurde konstruiert, indem das 5324 bp HindIII-Fragment (Nukleotid 6241- 11656) der Adenovirus-DNA in die HindIII-Stelle von pAALM inseriert wurde, um pHVAH zu erhalten. pHVAH wurde daraufhin mit XBaI gespalten und religiert, um pXVAH zu erhalten (dadurch wurde ein großes Stück, von der XBaI-Stelle in pAALM bis zur XBaI-Stelle bei Position 10589 in der Adenovirussequenz, entfernt). Der erhaltene Klon pXVAH enthielt die Adenovirussequenz von Nukleotid 10589-11565.

ii) Luciferasereporterplasmid pNF-κB-Luc

Das auf NF-κB ansprechende Plasmid pNF-κB-Luc wurde als ein Derivat des von Boehmelt et al., 1992, beschriebenen Plasmids pTK3kbB konstruiert. Dazu wurde pTK3kbB mit XHoI und NcoI geschnitten, um das meiste der für CAT kodierenden Sequenz zu entfernen, mit Klenow-Enzym behandelt und ligiert mit einem Klenow- behandelten HindIII/SspI-Fragment von pRSVL, enthaltend die Luciferasesequenz (De Wet et al., 1987). Dies ergab das Plasmid p3K-Luc, welches eine Dreifachbindungsstelle für den Transkriptionsfaktor NF- κB plus die Luciferasesequenz, getrieben von einer Thymidinkinase (TK) TATA-Box, enthält.

iii) Luciferasekonstrukt pIL-6-Luc

Es wurde das von Matsusaka et al., 1993, beschriebene Konstrukt, das die vom IL-6-Promotor getriebene Luciferasesequenz enthält, verwendet.

iv) Expressionsplasmid für E1A 13S

Es wurde das von Kedinger et al., 1984, beschriebene Expressionsplasmid der Bezeichnung p13S, das den endogenen E1A-Promotor verwendet, um die E1A 13S-cDNA zu treiben, verwendet.

v) Expressionsplasmide für E1A, E1B und E1B 19K

Die verwendeten Expressionsplasmide der Bezeichnung pCMVE1A, pCMVE1B und pCMV19K wurden von White und Cipriani, 1989 und 1990, beschrieben.

vi) Expressionsplasmid für Bcl-2

Das Expressionsplasmid der Bezeichnung pCMV-Bcl-2 wurde hergestellt, indem die humane Bcl-2 cDNA, flankiert von zwei EcoRI-Stellen (Seto et al., 1988), stromabwärts von einem CMV-Immediate-early-Promotor in das Expressionsplasmid pBK-CMV (Stratagene) kloniert wurde.

vii) Plasmid-DNA pCMVL

Die Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07283 beschrieben.

viii) Plasmid-DNA pCMVβgal

Es wurde das von Lim und Chae, 1989, beschriebene Plasmid verwendet.

b) Adenovirus d11014 DNA-Präparation

Das E4-defiziente Adenovirus 5, d11014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 × 10⁷ Zellen in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37°C) unterworfen. Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3.000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VTi50 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm³ CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml .1.45 g/cm³ CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. Die Proben wurden 40 min lang bei 20°C in einem Beckman VTi50 Rotor bei 49.000 rpm zentrifugiert. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm³ (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm³) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63.000 rpm in einem VTi65 Rotor unterworfen. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm³ unreife oder 1.34 g/cm³ reife) wurden geerntet. Die Biotinylierung der erhaltenen Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PD10-Säule, equilibriert mit HBS/40% Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 bzw. von Wagner et al., 1992, und Cotten et al., 1992, beschrieben. Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 × 10¹² Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al., 1980) verwendet wurde.

c) Transferrin-Polylysin-Konjugate (TfpL)

Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die Wagner et al., 1991, beschriebene Methode eingesetzt.

d) Streptavidin-Polylysin-Konjugate (StpL)

Die Konjugate wurden hergestellt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, wobei Polylysin 250 verwendet wurde.

e) Adenovirus/DNA-Komplexe

Proben von biotinyliertem, Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus d11014 (8 µl, 1 × 10¹² Partikel/ml) wurden in 150 µl HBS verdünnt und mit 1 µg StpL in 150 µg HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Aliquots von 6 µg Plasmid-DNA (im Falle von Mischungen von pCMVL-DNA und einem anderen Plasmid betrug das Verhältnis 5 : 1) wurden in 100 µl HBS verdünnt und dann mit der Adenovirus/StpL-Lösung 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Abschließend wurde ein 100 µl Aliquot von HBS, enthaltend 5 µg TfpL, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Aliquots dieser Transfektionskomplexe wurden dann, wie in den jeweiligen Beispielen einzeln beschrieben, auf die Zellen aufgegeben (im allgemeinen 10 bis 30 µl/20.000 Zellen).

f) Reporterzellinien

Für die Herstellung der klonalen Zellinien, enthaltend das Reporterplasmid pNF-KB-Luc oder pIL-6-Luc, wurde von der humanen Lungenkarzinomzellinie A549 (ATCC CCL 185) ausgegangen. Die Plasmide wurden mit dem Neomycin- Phosphotransferase-Expressionsplasmid der Bezeichnung pMuatt (ein pUC19-Plasmid, enthaltend die TKneo- Sequenz; Grosveld et al., 1982) unter Verwendung der Transfectam-Methode (Behr et al., 1989) co-transfiziert und auf Zellen, die resistent gegen 400 µg/ml G418 (Sigma) sind, selektioniert. Klonale Derivate, die Luciferase nach Induktion durch PMA exprimierten, wurden identifiziert und expandiert.

Auf ähnliche Weise wurden A549-Zellen erhalten, die das Expressionsplasmid für Bcl-2 bzw. E1B 19K enthalten, mit dem Unterschied, daß das Neomycinphosphotransferase-Plasmid pSVneo (Clontech) statt pMuatt und daß statt reinen Populationen Pools von G418-resistenten Klonen verwendet wurden.

g) Humanfibroblasten

Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4°C DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37°C Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10% FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 × wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert.

Eine alternative, bevorzugte Methode bestand darin, die Hautstücke nach der Zerkleinerung in frisches Medium zu überführen und nach Bedarf 1 bis 2 × mit Medium zu waschen. 5 bis 10 Gewebestücke wurden in eine T25- Gewebekulturflasche, deren Oberfläche mit DMEM plus 10% FCS benetzt worden war, gegeben und gleichmäßig verteilt, worauf die Flasche umgedreht wurde. Dies bewirkte, daß die Biopsien herunterhängen ("hanging drop configuration"; diese Methode wurde von Jones, 1989, beschrieben). Nach 1 bis 3 h im Brutschrank wurden die Flaschen wieder umgedreht und mit 1 bis 2 ml Medium befüllt. Festsitzende Biopsien wurden nach 24 h auf 5 ml aufgefüllt; andernfalls wurde der Vorgang wiederholt. Nach 6 bis 10 Tagen wuchsen die ersten Fibroblasten aus, von diesem Zeitpunkt an wurde einmal wöchentlich das Medium gewechselt. Sobald die Zellen konfluent waren, wurden sie in eine T75-Flasche passagiert.

h) Luciferase-Assay

Die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurde durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben.

i) Zytokin-ELISAs

Der IL-6-ELISA wurde von R Systems, der IL-8-ELISA von Bender MedSystems bezogen.

j) LPS-Präparat

Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. Das Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad, 360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert.

Beispiel 1 Aktivierung von NF-IL-6 und NF-κB durch den Eintritt von Adenovirus

Es wurden stabile Klone der Lungenepithelkarzinomzellinie A549 erzeugt, die als Reportergenkonstrukt pNF-κB-luc bzw. pIL-6-luc enthielten. Mit diesen beiden Zellinien (im folgenden auch als "A549 NF-κB-Zellen" oder "A549 IL-6-Zellen" bezeichnet) wurde das stimulatorische Verhalten verschiedener Agentien auf die folgende Weise getestet: Eine definierte Anzahl von Zellen wurde jeweils ausplattiert (4 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen für die A549-NF-κB-Zellen; 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen für die A549-IL-6-Zellen) und 24 bis 48 h später den Testagentien 4 h lang in 2% Pferdeserum/DMEM ausgesetzt. Die Zellen wurden dann in frisches Medium gegeben (10% FCS/DMEM) und für die Luciferaseanalyse (Dreifachbestimmung) zu den in Tabelle 1 angegebenen Zeiten geerntet (Inhalt von 2 bis 3 Vertiefungen pro Probe). Die Kontrollzellen, zu denselben Zeitpunkten geerntet, wurden denselben Mediumwechseln ausgesetzt mit dem Unterschied, daß die Testagentien fehlten.

Das Aktivierungsverhalten jeder dieser Reporterzellen sowie die Konzentration der Testsubstanzen ist in Tabelle 1 dargestellt (bei der Behandlung mit Adenovirus/pL/DNA als Stimulus wurden die A549 NF-κB- Zellen mit 20 µl Transfektionskomplex (4 × 10⁸ Viruspartikel entsprechend 10⁴ Viren/Zelle) und die A549 IL-6-Zellen mit 200 µl Transfektionskomplex behandelt, was ebenfalls 10⁴ Viren pro Zelle entsprach).

Um den Zeitverlauf der NF-IL-6- und NF-κB-Aktivierung zu bestimmen, wurden die Zellen der beiden Zellinien, die sich in den oben angegebenen Mengen in einer 24- Well-Platte bzw. 6-Well-Platte befanden, wurden mit jeweils 10⁴ Adenovirus d11014 Viruspartikeln pro Zelle behandelt (das entsprach 4 × 10⁸ Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 NF-κB-Zellen bzw. 4 × 10⁹ Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 IL-6- Zellen). Der Zeitverlauf der Induktion ist in Fig. 1 gezeigt: Der IL-6-Promotor ist nach 12 h voll aktiviert und kehrt dann rasch auf sein Ausgangsniveau zurück, während der NF-κB-Promotor aktiviert wird und wenigstens 50 h lang aktiv bleibt. Letzterer Befund steht im Gegensatz zum publizierten Aktivierungsprofil von NF-κB selbst, welcher, nach seiner Aktivierung, nach 6 bis 12 h aufgrund der Aktivierung der IκB- Synthese auf das Ausgangsniveau zurückkehrt (Sun et al., 1993; Scott et al., 1993; Chiao et al., 1994). (Eine dafür mögliche Erklärung ist, daß dem verwendeten synthetischen NF-κB-Promotor die geeigneten inhibitorischen Elemente fehlen, die die Herunterregulierung gewährleisten, während der IL-6- Promotor, eine riatürliche Sequenz, die Sequenzen besitzt, die das Funktionieren der normalen Kontrollfunktionen zulassen.)

Beispiel 2 Blockierung der Aktivierung von NF-KB durch Expression von VA1

In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-KB, die durch den Eintritt von Transfektionskomplexen aus Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert. Dazu wurden 4 × 10⁴ A549 NF-κB Testzellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 4 × 10⁸ Psoralen/UV-inaktivierten Adenoviren d11014, entsprechend 10⁴ Viruspartikeln pro Zelle, oder mit der entsprechenden Anzahl von Viren als Bestandteil der Transfektionskomplexe, entsprechend 20 µl Transfektionskomplex, behandelt und gefunden, daß eine ähnliche Aktivierung von NF-KB hervorgerufen wird (bis zu 6 bis 7fach nach 72 h). Der Einbau einer für E1B kodierenden DNA in den Transfektionskomplex (500 µl der Komplexmischung enthielten 6 µg pCMVE1B-DNA) hatte keine Wirkung auf die Inaktivierung von NF-κB. Im Gegensatz dazu verringerte die Expression des Adenovirus-VA1-Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den Transfektionskomplex; 500 µl enthielten 6 µg pXVAH) die Aktivierung auf das ca. 1.5fache des Grundwertes (Fig. 2; Komplex bedeutet pSP65, Komplex/E1B bedeutet pCMVE1B, Komplex/VA1 bedeutet pXVAH).

Beispiel 3 Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1

Der Promotor für das humane IL-6-Gen enthält Bindungssequenzen für die Transkriptionsfaktoren NF-IL- 6 und NF-κB, welche bei der Aktivierung dieses Promotors zusammenwirken (Matsusaka et al., 1993; Betts et al., 1993).

Es wurden A549 IL-6 Zellen verwendet, die das Luciferasegen unter der Kontrolle des IL-6-Promotors (NF-IL-6-luc) enthalten (jede Probe befand sich in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, enthaltend je 4 × 10⁵ Zellen. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt). Außer den Kontrollproben, bei denen nur Mediumwechsel vorgenommen wurden (Probe I) wurden die Zellen mit PMA (Phorbolmyristylacetat; 10^-8M; Probe 2), 10⁴ Adenoviruspartikeln, enthalten in 200 µl Transferrin- Polylysin/DNA-Komplex, der als DNA pSP65 enthielt (Probe 3), oder mit 10⁴ Virusteilchen, enthalten in 200 µl TfpL/DNA-Komplex, der als DNA pXVAH enthielt (Probe 4), behandelt und nach 10 h die Luciferaseaktivität als Maß für die IL-6-Aktivierung gemessen. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 4 Teilweise Inhibierung der durch den Eintritt von Adenovirus stimulierten Sekretion von IL-6 und IL-8 in humanen Hautfibroblasten durch Expression von VA1

Nachdem sich gezeigt hatte, daß der Eintritt von Virus sowohl einen auf NF-κB ansprechenden Promotor als auch den auf NF-κB/NF-IL-6 ansprechenden IL-6 Promotor stimuliert (Tabelle 1, Fig. 1, 2 und 3), wurde die Produktion von IL-6 bzw. IL-8 durch transfizierte primäre Fibroblasten als ein Maß für die Aktivierung der beiden endogenen Gene, die auf NF-κB/NF-IL-6 ansprechen, analysiert.

Dazu wurden primäre humane Fibroblasten (2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) entweder mit 10³ oder 3 × 10³ Psoralen/UV-inaktivierten Adenovirus d11014-Partikeln pro Zelle, eingebaut in StpL/TfpL/DNA- Transfektionskomplexe, behandelt (dies entsprach 2 µl oder 6 µl Transfektionskomplex, wobei die verwendete DNA entweder ein leeres Plasmid war (pSP65; Boehringer Mannheim) oder das Plasmid der Bezeichnung pXVAH, das die Adenovirus VA1-Sequenz enthält. Die Zellen wurden 4 h mit den Transfektionskomplexen in 2% Pferdeserum/DMEM behandelt, danach wurde das Medium entfernt und durch 10% FCS/DMEM ersetzt. Nach 24 h (für IL-6) bzw. 48 h (für IL-8) wurden Aliquots des Mediums entfernt und mittels ELISA auf ihren Gehalt an IL-6 bzw. IL-8 untersucht. Es wurde gefunden, daß die Behandlung mit den Transfektionskomplexen sowohl die IL-6- als auch die IL-8-Sekretion durch diese Zellen stimuliert (Tabelle 2). In allen Fällen verringerte der Einbau des VA1-Gens in die Transfektionskomplexe die Menge an produziertem Zytokin um ca. 35%. Die anfängliche Stimulation der Zytokinproduktion (Viruseintritt) muß stattfinden, bevor das Gen mit der Schutzwirkung eingeführt wird und in aktive RNA transkribiert wird. Daher wurden Messungen der Zytokinproduktion zu späteren Zeitpunkten nach der Transfektion durchgeführt, um zu bestimmen, ob die VA1- transfizierten Zellen zu späteren Zeitpunkten, wenn höhere Konzentrationen von VA1-RNA gebildet worden sind, eine ausgeprägtere Unterdrückung der Zytokinproduktion zeigen.

Beispiel 5 Abnahme der Genexpression durch Expression der Adenovirusgene E1A und E1A13S. Verstärkung des Gentransfers durch Expression von E1B, E1B 19K und Bcl-2

Zunächst wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, mit denen festgestellt werden sollte, ob die Expression bestimmter Adenovirusgene dazu geeignet ist, die Genexpression nach Transferrinfektion zu verstärken.

Eine definierte Menge des Luciferase- Expressionsplasmids pCMVL (5 µg) wurde mit verschiedener Plasmid-DNA (jeweils 1 µg) gemischt, in TfpL/StpL/Adenovirus-Transfektionskomplexe eingebaut (Gesamtvolumen 500 µl) und auf primäre humane Fibroblasten aufgebracht (es wurden auf 2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte 50 µl Komplex, entsprechend 2.5 × 10⁴ Virusteilchen pro Zelle, aufgebracht, wobei Dreifachbestimmungen vorgenommen wurden. In Fig. 4 bedeutet "minus" pSP65; die Test-DNA ist jeweils bezeichnet). Die erhaltene Luciferaseaktivität wurde 48 bis 72 h nach der Transfektion gemessen. Der Einbau gereinigter Gesamt- DNA des E4-negativen, E1-positiven Adenovirus d11014 erzeugte eine zweifache Verstärkung der Genexpression (Fig. 4). Es wurde angenommen, daß die Verstärkung auf die E1-Expression zurückzuführen ist. Daraufhin wurde ein E1-Expressionsplasmid (pE1pAALM) gemeinsam mit dem Reporterplasmid in die Zellen eingebracht und gefunden, daß auch dieses eine Steigerung der Genexpression (3fach) hervorruft. Die E1-Region enthält zwei Haupt- Genfunktionen, E1A und E1B. (Die E1A-Produkte haben die Wirkung, E2F vom Rb-Protein abzutrennen, andererseits modulieren sie die Transkriptionsaktivität vieler zellulärer und Adenovirus-Promotoren. Die hauptsächliche Transkriptions-Transaktivatorfunktion ist im 13S-Genprodukt enthalten. Das 1B-Gen kodiert für zwei Hauptfunktionen: das E1B 55K-Genprodukt bindet p53 und ändert dessen Funktion. Vom 19K E1B-Genprodukt wird angenommen, daß es unterhalb von p53 wirkt, um die apoptotische Antwort zu blockieren.)

Es wurde die Co-Expression von Plasmiden getestet, die entweder die komplette E1A- oder die komplette E1B- Region unter der Kontrolle des CMV-Promotors trugen. Das E1B-Plasmid ergab eine 7fache Verstärkung der Genexpression. Im Gegensatz dazu erzeugte das E1A- Plasmid eine Inhibierung der Genexpression (das 0.3fache der Kontrollprobe). Auch das 19K E1B-Gen rief eine Verstärkung der Genexpression hervor (8.6fach).

Vom E1B 19K-Protein wurde kürzlich gezeigt, daß es ein stark wirksames Analoges des anti-apoptotischen Gens Bcl-2 ist (Rao et al., 1992). Es wurde daher Bcl-2 ebenfalls getestet und festgestellt, daß es eine 5.5fache Verstärkung der Genexpression hervorruft.

Beispiel 6 Untersuchung der Toxizität auf Spezifität

Als nächstes wurde getestet, ob die Abnahme der Genexpression auf eine nicht-spezifische Toxizität, die durch die hohen Virus/Zell-Verhältnisse verursacht wird, zurückzuführen ist (die Versuche wurden mit ca. 50.000 Viruspartikeln pro Zelle durchgeführt).

Dazu wurden Transfektionskomplexe, enthaltend pCMVL plus das Plasmid pSP65, bzw. die Plasmide, die die Sequenz für Bcl-2, E1A oder E1B 19K enthielten (die Mengen an Reporterplasmid pCMVL und jeweiligen Testplasmid betrugen, wie im vorigen Beispiel, 5 µg bzw. 1 µg), bei Viruspartikelzahlen von 3 × 10⁴ (Fig. 5A), 10⁴ (Fig. 5B) oder 3 × 10³ (Fig. 5C) pro Zelle auf primäre Fibroblasten aufgebracht und die Luciferaseaktivität über einige Zeit gemessen. Die Transfektionen wurden durchgeführt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, wobei den Zellen 6, 18 bzw. 60 µl Transfektionskomplex pro Vertiefung, die 2 × 10⁴ Fibroblasten enthielt, aufgegeben wurde. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 5 dargestellt: Es wurden ähnliche Genexpressionsmuster wie in den vorangegangenen Beispielen (Abnahme bei E1A- behandelten Zellen, Verstärkung bei 19K- bzw. Bcl-2- behandelten Zellen) festgestellt, und zwar unabhängig von der verwendeten Virusdosis.

Im vorangegangenen Beispiel hat sich sogar bei den mit 19K oder Bcl-2 transfizierten Zellen ein Verlust an Expressionsaktivität zu späteren Zeitpunkten, insbesondere nach 6 Tagen, gezeigt. Es wurde daher in Betracht gezogen, ob nicht ein zweites Phänomen, das in Beziehung mit der inflammatorischen Antwort steht, wie sie sich im vorangegangenen Beispiel gezeigt hat, die Gesundheit der transfizierten Kultur beeinträchtigt. Wenn die transfizierten Zellen aufgrund des Transfektionsvorganges eine Aktivierung der Immunantwort zeigen, könnte die Sekretion von Zytokinen oder Toxinen von den Zellen die Lebenserwartung der Kultur beschränken.

Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden Versuche zum Zeitverlauf der Transfektion aufgestellt, indem Transfektionskomplexe, enthaltend 5 µg pCMVL plus 1 µg pSP65 oder 1 µg eines Plasmids, enthaltend E1A, E1A 135, E1B 19K oder Bcl-2, verwendet wurden. (In diesen Versuchen erhielten die Zellen einer Vertiefung 18 µl Transfektionskomplex.) Ab Tag 10 wurde das Kulturmedium täglich durch frisches Medium ersetzt; dieser Maßnahme lag die Überlegung zugrunde, daß der Mediumwechsel die Konzentrationen der Toxine senken würde. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 6 dargestellt: Es zeigte sich, daß die gewählte Vorgehensweise die Langzeitgenexpression der Kulturen verstärkte, wenn pSP65, Bcl-2- oder 19K-Plasmide verwendet wurden. Im Gegensatz dazu nahm die Expression der E1A- und E1A 13S-Kulturen in ähnlichem Maß ab wie bei den nicht-gewaschenen Kulturen der vorangegangenen Experimente. Die Gegenwart von 19K zeigte noch nach 21 Tagen eine Verbesserung der Genexpression um eine Zehnerpotenz, was auf eine Rolle der Apoptose hinweist.

Beispiel 7 Untersuchung der Morphologie von transfizierten Zellen

Primäre humane Fibroblasten wurden mit dem Reporterplasmid pCMVβgal plus pSP65 oder plus pCMV19K transfiziert (2 × 10⁴ Fibroblasten pro Vertiefung einer 24-Well-Platte erhielten 18 µl Transfektionskomplex; 500 µl Komplex enthielten entweder 4 ug pCMVL plus 2 µg pSP65 oder 4 µg pCMVL plus 2 µg pCMV19K). 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit X-gal gefärbt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, um die Morphologie der Zellen, die die transfizierte DNA mit Erfolg aufgenommen und exprimiert hatten, zu untersuchen. Es zeigte sich, daß zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Transfektion die beiden Zellpopulationen die transfizierten Zellen innerhalb einer Größenordnung exprimieren. Während jedoch die β-gal exprimierenden Zellen in Abwesenheit von pCMV19K eine vorwiegend abgerundete und teilweise abgelöste Morphologie zeigen (Fig. 7, linke Tafel), die mit einem apoptotischen Phänotyp übereinstimmt, zeigten die mit pCMV19K co-transfizierten Zellen eine vorwiegend flache und adhärente Morphologie (Fig. 7, rechte Tafel). Die veränderte Morphologie dürfte auf die ausgedehntere und verstärkte Genexpression, die mit 19K erhalten wird, zusammenhängen.

Beispiel 8 Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von E1B 19K und Bcl-2

Im Zuge von Vorversuchen, in denen die Zellen LPS in Gegenwart von Adenovirus ausgesetzt worden waren, wurde festgestellt, daß die rasch auftretende Toxizität in diesen Zellen eine Morphologie der sterbenden Zellen hervorruft, die der Apoptose ähnlich ist (z. B. fragmentierte Kerne, Kondensation). Darauf wurde angenommen, daß das Eindringen von LPS in die Zelle während des Eintritts von Adenovirus eine apoptotische Antwort hervorruft.

Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden Transfektionskomplexe mit einem Gehalt an LPS plus entweder E1B 19K-Gen oder Bcl-2-Gen hergestellt, um festzustellen, ob die gesamte Einführung des Apoptoseauslösers LPS mit dem anti-Apoptosegen Bcl-2 den Zelltod blockieren würden. Es wurde festgestellt, daß keine Verringerung der Toxizität eintritt, vermutlich weil die Geschwindigkeit der toxischen Antwort, die 4 h nach der Behandlung bemerkbar wird, es nicht zuläßt, daß genügend 19K- oder Bcl-2-Genprodukt akkumuliert wird. Aufgrund dieser Beobachtung wurde eine alternative Methode zur Feststellung, ob 19K oder Bcl-2 einen Schutz gegen die LPS-induzierte Toxizität gewähren können, entwickelt: Es wurden stabile Zellinien, die entweder das 19K- oder das Bcl-2-Gen trugen, mit den LPS/Adenovirus-Komplexen in Berührung gebracht. Dazu wurden A549-Zellen als Kontrollzellen sowie A549 19K-Zellen und A549-Bcl-2-Zellen zu je 4 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte ausplattiert und mit 50 µl Transfektionskomplex, enthaltend 6 µg pCMVL pro 100 µl Komplex und entweder 0, 10 oder 100 ng LPS pro 6 µg DNA, behandelt. Die Erwartung, daß die vorangehende Expression jedes dieser Proteine einen Schutzeffekt haben sollte, wurde erfüllt: Wie in Fig. 8 gezeigt, wurden Kontrollzellen, die den Adenovirus/pL/DNA-Komplexen ausgesetzt waren, als Funktion von zunehmenden LPS-Gehalt in der Probe getötet (vgl. Probe 1: kein LPS, mit Proben 2 und 3: 10 und 100 ng LPS/6 µg DNA). In Zellen, die entweder 19K oder Bcl-2 exprimieren, trat eine Verringerung in der Toxizität auf 39% (Probe 2) bzw. 77 oder 60% auf (Proben 5 oder 8; 19K oder Bcl-2). Bei der Bewertung dieser Ergebnisse ist zu beachten, daß die in diesem Versuch ausgewerteten Zellen noch Pools von stabil exprimierenden Zellen darstellen; von reinen Populationen von 19K oder Bcl-2 exprimierenden Zellen ist zu erwarten, daß ein höherer Schutzeffekt (bis zu 100%) erhalten wird.

Beispiel 9 Verstärkung des Gentransfers durch das Glucocorticoid Dexamethason allein oder in Kombination mit einem anti- Apotose-Gen

Primäre humane Fibrolasten wurden mit Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen transfiziert, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei als DNA entweder pCMVL/pSP65 oder pCMVL/pCMV19K im Verhältnis von jeweils 5 : 1 eingesetzt wurde. 4 h nach der Transfektion wurden die Proben in frisches 10% FCS/DMEM-Medium oder in 10% FCS/DMEM-Medium, enthaltend 3 µM Dexamethason (Sigma), überführt. 24 h nach der Transfektion wurden die Proben (Doppelbestimmung) geerntet und die Luciferaseaktivität bestimmt. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von Dexamethason in Abwesenheit von pCMV19K die Luciferaseexpression um einen Faktor 1.65 erhöht. In Gegenwart von sowohl Dexamethason als auch pCMV19K war die Verstärkung 5,8,11-Eicosatriynonsäure 2.71fach (Tabelle 3).

Der weitere Zeitverlauf über 7 Tage ist in Fig. 9 dargestellt; das Dexamethason enthaltende Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Zu jedem der angegebenen Zeitpunkte wurden Doppelbestimmungen der Luciferaseaktivität vorgenommen.

Beispiel 10 Untersuchung des Einflusses von Inhibitoren von Arachidonsäure-Metaboliten auf die Genexpression

Um festzustellen, ob Arachidonsäure-Metaboliten an der Verringerung der Genexpression in transfizierten Zellen beteiligt sind, wurden, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, primäre Hautfibroblasten mit Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen, die das Luciferasegen enthielten, transfiziert, und zwar mit und ohne Co-Transfektion des E1B 19K-Gens, und es wurde die Luciferaseaktivität über die Zeit verfolgt. (Die DNA enthielt 5.5 µg pCMVL und 0.5 µg pSP65 (Kontrolle) oder pCMV19K). 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen in Standardmedium (DMEM plus 10% FCS) enthaltend, wo in Fig. 10 angegeben, 10 µM Dexamethason oder 2 mM Aspirin, überführt. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 10 dargestellt. Es zeigte sich, daß sowohl Dexamethason als auch Aspirin eine Zunahme der Genexpression sowohl in Gegenwart als auch bei Abwesenheit von E1B 19K bewirken. Die Wirkung von Aspirin war weniger ausgeprägt als die von Dexamethason, was darauf hindeutet, daß die Inhibierung der Cyklooxygenase nicht ausreicht, den Abfall der Genexpression zu verhindern. Beide Substanzen zeigten hinsichtlich der Steigerung der Genexpression einen synergistischen Effekt mit dem E1B 19K-Gen.

Beispiel 11 Vergleich der Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen und 5,8,11-Eicosatriynonsäure in Gegenwart oder bei Abwesenheit von E1B 19K

Analog wie im vorigen Beispiel beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die Luciferaseexpression gemessen. 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen auch in diesem Versuch in Standardmedium gegeben, das, wo in Fig. 11 angegeben, 10 µM Dexamethason, den Cyclooxygenaseinhibitor Ibuprofen (100 µM) oder den 5- Lipoxygenaseinhibitor 5,8,11-Eicosatriynonsäure (30 µM) enthielt; die optimalen Konzentrationen der Inhibitoren waren jeweils durch Titration in Vorversuchen ermittelt worden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 11 dargestellt. Es zeigte sich, daß von den drei untersuchten anti-inflammatorischen Substanzen nur Dexamethason eine wesentliche Verbesserung der Genexpression in Abwesenheit von E1B 19K bewirkt. In Gegenwart von E1B 19K zeigte sich ein synergistischer Effekt von Dexamethason und 5,8,11-Eicosatriynonsäure.

Beispiel 12 Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von Arachidonsäure-Metaboliten

Analog wie in den vorigen Beispielen beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die Luciferaseexpression gemessen. Als Inhibitoren wurden Dexamethason (10 µM), 5,8,11-Eicosatriynonsäure (30 µM), NDGA (10 µM), Ibuprofen (30 µM) und Aspirin (2 mM) verwendet. In Fig. 12 sind links der Arachidonsäureweg eingezeichnet, in der Mitte die Inhibitoren an den jeweiligen Stellen ihrer Wirkung und rechts die erhaltenen Expressionswerte. Während alle untersuchten Inhibitoren eine gewisse Verbesserung der Genexpression zeigten, die möglicherweise auf eine Verbesserung des Zustandes der Zellen insgesamt zurückzuführen ist, konnte die deutlichste Verbesserung bei der Dexamethasonbehandlung festgestellt werden. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß dieses Glucocorticoid an mehreren Stellen angreift (Dexamethason kann die Genexpression von inflammatorischen Zytokinen blockieren, indem es als negativer Transkriptionsmodulator wirkt (z. B. um das IL-6-Gen zu blockieren); es kann auch wirken, indem es die Phospholipase mRNA-Konzentration verringert oder die Lipocortinkonzentrationen erhöht (Barnes und Adcock, 1993).

Beispiel 13 Identifizierung eines anti-apoptotischen Gens von Hühner Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolierung und Klonierung von CELO-Virus- Genomfragmenten

Als Ausgangsmaterial wurde das CELO Virus Adenovirus Typ I (ATCC VR-432) verwendet. Das Virus wurde nach Wachstum in Hühnerembryos gereinigt, wie von Cotten et al., 1993, beschrieben. Die DNA wurde aus dem Virus präpariert, indem das Virus mit Proteinase K (0.3 mg/ml) in HBS/0.1% SDS 45 min lang bei 56°C inkubiert wurde. Dann wurde CsCl beigegeben (28.5 g/26 ml Lösung), daraufhin Ethidiumbromid (0.1 mg/ml), und die Probe wurde 18 h lang in einem Vti 65 Rotor (Beckman, 20°C) zentrifugiert. Die DNA (deutlich sichtbare gefärbte Bande) wurde gesammelt, das Ethidiumbromid durch Extraktion mit CsCl-gesättigtem Isopropanol bis zum Verschwinden der Rosafärbung extrahiert und das CsCl mittels Gelfiltration entfernt.

Das erhaltene gesamte 42.8 kb große CELO-Virusgenom wurde einerseits mit EcoRI, andererseits mit HindIII verdaut. Die erhaltene Mischung von Fragmenten wurde in einem 0.8% Agarosegel aufgetrennt und auf einem 3 mm Whatmanpapier und anschließend über eine Sephadex G-50 Säule gereinigt.

Die Restriktionskarte von CELO-Virus ist im oberen Teil von Fig. 13 dargestellt; sie basiert auf den Restriktionskartierungen von Cai und Weber, 1993; Aleström et al., 1982, und Li et al., 1984. In der Figur ist die Lage der HindIII- und der EcoRI-Stellen angegeben (in Kartierungseinheiten, wobei eine Kartierungseinheit 428 Basenpaare beträgt). Ferner sind die Nomenklatur der Expressionsklone sowie die Lage der Fragmente 7H3 (HindIII D-Fragment) und 9R1 (EcoRI D- Fragment) eingezeichnet. Diese Fragmente sind diejenigen, die in den Gentransferexperimenten einen positiven Effekt zeigten (vgl. die in b) beschriebenen Versuche).

Die erhaltenen Fragmente wurden in den von Superti- Furga et al., 1991, beschriebenen Expressionsvektor pX stromabwärts vom CMV Immediate Early Promotor kloniert, wobei jedes Fragment in beiden Orientierungen isoliert und charakterisiert wurde.

b) Testung der isolierten Genfragmente auf antiapoptotische Wirkung

Um festzustellen, ob die Expression der erhaltenen Genfragmente dazu geeignet ist, die bei der Transferrinfektion auftretende Abnahme der Genexpression zu verringern, wurden Transfektionsversuche durchgeführt, wie in Beispiel 5 angegeben, wobei als Testplasmide die die diversen CELO-Virusfragmente enthaltenden Vektoren verwendet wurden. Die Menge an Transfektionskomplexen betrug 15 µl pro 20.000 Zellen. Die für die diversen Klone erhaltenen Werte für die Genexpression im Verhältnis zum Kontrollwert sind in Tabelle 4 angegeben, wobei die HindIII-Fragmente mit "H3" und die EcoRI-Fragmente mit "R1" bezeichnet sind. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Fragment aus der EcoRI-Bibliothek (9R1) und ein Fragment aus der HindIII-Bibliothek (7H3) an den Tagen 4 bis 14 eine Verstärkung der Genexpression im Vergleich zu den Kontrolltransfektionen bewirkten. Diese beiden Fragmente stammen aus derselben Region des CELO-Virusgenoms und weisen in ihrer Sequenz einen überlappenden Bereich von etwa 80% auf (siehe die in Fig. 13 dargestellte Restriktionskarte).

Die DNA-Sequenzen der Fragmente 9R1 und 7H3, die eine Schutzwirkung gezeigt hatten, wurden nach Standardmethoden bestimmt. Dazu wurden DNA-Fragmente in pBSII (Stratagene) subkloniert, durch die Kombination von Exo III- und S1-Nukleasen Deletionen von einer Richtung aus vorgenommen, Klone isoliert und unter Anwendung des "Taq-Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencing" Systems (ABI) auf einem ABI 373- Sequenzanalysegeräts sequenziert. Klone in umgekehrter Orientierung wurden unter Verwendung synthetisierter Primer sequenziert.

Die Analyse der von den beiden Fragmenten 9R1 und 7H3 kodierten offenen Leserahmen ergab einen einzigen größeren offenen Leserahmen, der den beiden Fragmenten gemeinsam ist (in Fig. 13 unten dargestellt; der mit * bezeichnete offene Leserahmen bezeichnet den 9R1 und 7H3 gemeinsamen großen offenen Leserahmen). Dieser offene Leserahmen, dessen Sequenz in Fig. 14 unterstrichen ist, kodiert, beginnend beim Nukleotid 577, für ein für Protein mit 283 Aminosäuren.

Von Larson et al., 1986, wurde im CELO-Virus ein VA-Gen im Genfragment zwischen den Kartierungseinheiten 88.7 und 92.7 identifiziert. Von diesem VA-Gen (in der 9R1- Sequenz von Nukleotid 4286-4184) wurde berichtet, daß es in geringem Ausmaß die Genexpression von cotransfizierten Genen verstärkt. Da dieses Gen zwar im 9R1-Fragment enthalten ist, jedoch außerhalb des 7H3- Fragments liegt, ist nicht anzunehmen, daß es zu der in den vorliegenden Versuchen beobachteten, in dieser Region gelegenen verstärkenden Wirkung auf die Genexpression beiträgt. Um festzustellen, ob diese Verstärkerwirkung eine neue Funktion des offenen Leserahmens von 9R1 ist und nicht im Zusammenhang mit der vorbeschriebenen VA-Funktion steht, wurde ein SmaI/HindIII-Restriktionsfragment von 9R1 hergestellt, das den offenen Leserahmen von 9R1, nicht jedoch das VA-Gen besitzt. Es wurden daher analog den Transfektionen mit den 7H3- und den 9R1-Fragmenten auch Transfektionen mit diesem Restriktionsfragment (9R1S/H3) durchgeführt, das ebenfalls in den pX Vektor kloniert worden war. Die Ergebnisse dieser Transfektionen sind in den letzten vier Zeilen von Tabelle 4 dargestellt; sie zeigen, daß die festgestellte verstärkende Wirkung des Fragments auf die Genexpression nicht eine Funktion des VA-Gens ist.

c) Zeitverlauf der Genexpression in Gegenwart der Fragmente 7H3, 9R1 und 9R1S/H3

Um eine genauere Untersuchung der Genexpressionsverstärkung durchzuführen, wurden Transfektionen mit dem 9R1-Fragment, dem 7H3-Fragment und dem SmaI/HindIII-Fragment von 9R1 durchgeführt und die Luciferaseexpression über einen längeren Zeitraum verfolgt. (Die Transfektionskomplexe enthielten 5 µg pCMVL und entweder 1 µg pSP65 als Kontrolle oder 1 µg des Vektors pX mit dem jeweiligen Fragment). Es wurde gefunden, daß die Aufrechterhaltung der Genexpression mit den Fragmenten 9R1, 7H3 und dem 9R1S/H3-Konstrukt vergleichbar ist, was darauf schließen läßt, daß die Schutzwirkung von 9R1 und 7H3 zur Gänze in dem SmaI/HindIII-Fragment von 9R1 enthalten ist. Diese Versuche deuten darauf hin, daß das aktive Gen durch den offenen Leserahmen dieser Region definiert wird. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 15 dargestellt.

Bedingungen
fache Induktion
pCMVL/pSP65
1.0
pCMVL/pSP65/Dexamethason	1.65
pCMVL/pCMV19K	1.0
pCMVL/pCMV19K/Dexamethason	2.71

Tabelle 4

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Claims

1. Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in höhere eukaryotische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man außer dem Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten

a) in die Zelle ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren- Expressionsprodukte die durch das Einbringen des Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der Wirtszelle zumindest teilweise blockieren, und/oder daß man
b) die inflammatorische Antwort der Zellen zumindest teilweise inhibiert, indem man
- i) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti-inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder
- ii) in die Zellen eine oder mehrere antiinflammatorische Substanz(en) oder die dafür kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA- Moleküle einbringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial DNA ist, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, und daß der DNA-Komplex in Gegenwart von Adenovirus oder Adenovirus-Polykation-Konjugat in die Zellen eingebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für humanes Bcl- 2 kodiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für Adenovirus E1B 19K kodiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung für ein Genprodukt kodiert, das p53 inaktiviert.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül ein SmaI/HindIII-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen ca. 84.3 bis 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist, oder eine DNA-Sequenz, die dieses Fragment enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül die in Fig. 14 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein EcoRI-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen den Kartierungseinheiten 81.2 bis 92.7 lokalisiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein HindIII-Fragment ist, das im Bereich zwischen den Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 lokalisiert ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül einen offenen Leserahmen enthält, der für ein funktionelles Derivat des Genproduktes kodiert, der vom in Anspruch 7 definierten offenen Leserahmen kodiert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykationen-Komplexes vorliegt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Zelle einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung auf getrennten Plasmiden vorliegen.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Zelle einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Adenovirus VA1 ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 2, 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die VA1-DNA gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykationen-Komplexes vorliegt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex außerdem das DNA- Molekül enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle auf getrennten Plasmiden vorliegen.

19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Zelle ein DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung einbringt und die Zellen äußerlich mit einer anti-inflammatorisch wirkenden Substanz behandelt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorisch wirkende Substanz die Aktivierung von Phospholipase A2 inhibiert.

22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz ein Glucocorticoid ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucocorticoid Dexamethason ist.

24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorisch wirkende Substanz einen Metaboliten der Arachidonsäure inhibiert.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Ibuprofen ist.

26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Acetylsalicylsäure ist.

27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA) ist.

28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz 5,8,11-Eicosatriynonsäure ist.

29. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Indomethacin ist.

30. Transfektionskomplex, enthaltend DNA, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie Adenovirus oder ein Adenovirus- Polykation-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem ein DNA-Molekül mit Anti-Apoptose- Wirkung und/oder ein DNA-Molekül, kodierend für eine Substanz mit anti-inflammatorischer Wirkung, enthält.