JP6104845B2 - ２’−分枝ヌクレオシドおよびフラビウイルス科ウイルス突然変異 - Google Patents

２’−分枝ヌクレオシドおよびフラビウイルス科ウイルス突然変異 Download PDF

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Description

（関連出願の記載）
本出願は、２００２年１１月１５日出願の米国特許仮出願第６０／４２６，６７５号に対して優先権を主張するものである。前記仮出願の開示は、本明細書に参照として組込まれる。
本発明は、フラビウイルス科ウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）におけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性の塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、治療が必要なヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療方法である。本発明は、インターフェロンと併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性の塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、治療が必要なヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療方法も包含する。本発明は、フラビウイルス科ウイルスの突然変異株を検出する方法、この治療方法、ならびにこうした検出のためのキットおよび材料も包含する。
ウイルスのフラビウイルス科は、少なくとも３つの異なる属を含む：ウシおよびブタの病気の原因となるペスチウイルス属（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）；デング熱および黄熱病などの疾病の主因であるフラビウイルス属（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）；およびこの唯一の構成員がＨＣＶであるヘパシウイルス属（ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）。フラビウイルス属は、血清学的関連概念を基にしてグループ分けされた６８を越える構成員を包含する（Ｃａｌｉｓｈｅｒら，Ｊ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７０，３７−４３）。臨床症状は様々であり、発熱、脳炎および出血熱が挙げられる（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，編者：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ ３１，９３１−９５９）。ヒトの疾病に関係する、世界的に懸念されているフラビウイルスには、デング出血熱ウイルス（ＤＨＦ）、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、ショック症候群および日本脳炎ウイルスが挙げられる（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９８４，６，２５１−２６４；Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４７６−４８１，１９８８； Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ，１９８８，３１９，６４１−６４３）。
ペスチウイルス属は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ、ブタコレラウイルスとも呼ばれる）およびヒツジのボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）を包含する（Ｍｏｅｎｎｉｇ，Ｖ．ら，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２，４１，５３−９８）。家畜（ウシ、ブタおよびヒツジ）のペスチウイルス感染は、世界的に有意な経済的損失の原因となっている。ＢＶＤＶは、ウシの粘膜病の原因となり、家畜産業には経済的に極めて重要である（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｔｈｉｅｌ，Ｈ．−Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，４７，５３−１１８； Ｍｏｅｎｎｉｇ Ｖ．ら，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２，４１，５３−９８）。ヒトペスチウイルスは、動物ペスチウイルスほど広範に特性付けされていない。しかし、血清学的調査は、ヒトにおける少なからぬペスチウイルス暴露を示している。
フラビウイルス科の中で、ペスチウイルス属およびヘパシウイルス属は、密接に関連したウイルス群である。この科の中の他の密接に関連したウイルスには、ＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様因子、ＧＢウイルス−ＢおよびＧＢウイルス−Ｃ（Ｇ型肝炎ウイルス、ＨＧＶとも呼ばれる）が挙げられる。ヘパシウイルス群（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ）は、密接に関連しているが、遺伝子型で区別できる、ヒトに感染する多数のウイルスから成る。約６のＨＣＶ遺伝子型および５０を越えるサブタイプが存在する。世界的に、ＨＣＶは、肝炎の主因である。殆どのＨＣＶ感染は持続性であり、約７５％のケースで慢性肝疾患が発現する。慢性ＨＣＶ感染は、硬変、肝細胞癌および肝不全の発現を導き得る。細胞培養で効率的に増殖する能力がヘパシウイルスには乏しいことと併せ、ペスチウイルスとヘパシウイルスの間の類似性のため、多くの場合、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）がＨＣＶウイルスを研究するための代用物として使用される。
ペスチウイルスとヘパシウイルスの遺伝子構成は、非常に類似している。これらのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要なウイルス蛋白をすべてコードしている単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。これらの蛋白質は、ポリ蛋白質として発現され、このポリ蛋白質が、細胞のプロテイナーゼとウイルスにコードされたプロテイナーゼの両方によって共翻訳および後翻訳処理されて、成熟ウイルス蛋白が生じる。ウイルスゲノムＲＮＡの複製の要因であるウイルス蛋白は、ＯＲＦのカルボキシ末端約三分の二の範囲内に位置し、非構造（ＮＳ）蛋白質と呼ばれる。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスに関するＯＲＦの非構造蛋白質部分の遺伝子構成およびポリ蛋白質処理は、非常に類似している。ペスチウイルスとヘパシウイルスの両方の成熟非構造（ＮＳ）蛋白質が、非構造蛋白質コドン領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端への配列順で、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂから成る。
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ蛋白質は、特定の蛋白質機能に特有のものである配列ドメインを共有している。例えば、両方の群のウイルスのＮＳ３蛋白質が、セリンプロテイナーゼおよびヘリカーゼに特有のアミノ酸配列モチーフを有する（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３３：２２；Ｂａｚａｎ ａｎｄ Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ（１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：６３７−６３９； Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７．３８８９−３８９７）。同様に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂ蛋白質は、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼに特有のモチーフを有する（Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．ａｎｄ Ｄｏｌｊａ，Ｖ．Ｖ．（１９９３） Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８：３７５−４３０）。
さらに、ウイルスの寿命に関するペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ蛋白の実際の役割および機能は、まさに類似している。両方のケースにおいて、ＮＳ３セリンプロテイナーゼが、ＯＲＦ内の自身の位置の下流にあるポリ蛋白質前駆体のすべての蛋白質分解処理に関与している（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：３４１−３５０； Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３８３５−３８４４； Ｅｃｋａｒｔら，（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９２：３９９−４０６； Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２８３２−２８４３； Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０５８３−１０５８７； Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４６６５−４６７５；Ｔｏｍｅら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４０１７−４０２６）。ＮＳ４Ａは、両方のケースにおいて、補因子として、ＮＳ３セリンプロテアーゼと共に作用する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，（１９９４） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５０４５−５０５５； Ｆａｉｌｌａら，（１９９４） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３７５３−３７６０； Ｌｉｎら，（１９９４）６８：８１４７−８１５７； Ｘｕら，（１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５３１２−５３２２）。両ウイルスのＮＳ３蛋白質は、ヘリカーゼとしても機能する（Ｋｉｍら，（１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１５：１６０−１６６； Ｊｉｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ （１９９５） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２３：４７−５３； Ｗａｒｒｅｎｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９５） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７２０−１７２６）。最後に、ペスチウイルスおよびヘパチウイルスのＮＳ５Ｂ蛋白質は、予測ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する（Ｂｅｈｒｅｎｓら，（１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１２−２２； Ｌｃｈｍａｎｎｅｔら，（１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４１６−８４２８； Ｙｕａｎら，（１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３２：２３１−２３５； Ｈａｇｅｄｏｒｎ，ＰＣＴ国際公開公報第９７／１２０３３号； Ｚｈｏｎｇら，（１９９８） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２．９３６５−９３６９）。
フラビウイルス科のウイルスに対して活性と特定された抗ウイルス剤の例には、次のものが挙げられる：
（１）インターフェロン
インターフェロン（ＩＦＮ）は、１０年近くにわたって慢性肝炎の治療用に市販されている。ＩＦＮは、ウイルス感染に反応して免疫細胞が生産する糖蛋白である。ＩＦＮは、ＨＣＶを含む多くのウイルスのウイルス複製を阻害し、Ｃ型肝炎感染のために単独治療薬として使用された場合、検出不能レベルまで血清ＨＣＶ−ＲＮＡを抑制する。加えて、ＩＦＮは、血清アミノトランスフェラーゼレベルを正常にする。残念なことに、ＩＦＮの効果は一時的であり、ＨＣＶに慢性感染している患者の８％から９％にしか持続的な反応は生じない（Ｇａｒｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。
多数の特許が、インターフェロン利用療法を用いるＨＣＶ治療を開示している。例えば、Ｂｌａｔｔらの米国特許第５，９８０，８８４号は、コンセンサスインターフェロンを使用するＨＣＶ罹患患者の再治療方法を開示している。Ｂａｚｅｒらの米国特許第５，９４２，２２３号は、ヒツジまたはウシインターフェロン−タウを使用する抗ＨＣＶ療法を開示している。Ａｌｂｅｒらの米国特許第５，９２８，６３６号は、ＨＣＶを含む感染症を治療するためのインターロイキン−１２とインターフェロンアルファの併用療法を開示している。Ｇｌｕｅらの米国特許第５，９０８，６２１号は、ＨＣＶを治療するためのポリエチレングリコール修飾インターフェロンの使用を開示している。Ｃｈｒｅｔｉｅｎらの米国特許第５，８４９，６９６号は、ＨＣＶを治療するためのサイモシンの単独使用またはインターフェロンとの併用を開示している。Ｖａｌｔｕｅｎａらの米国特許第５，８３０，４５５号は、インターフェロンと遊離ラジカルスカベンジャーを利用する併用ＨＣＶ療法を開示している。Ｉｍａｋａｗａの米国特許第５，７３８，８４５号は、ＨＣＶを治療するためのヒトインターフェロンタウ蛋白質の使用を開示している。ＨＣＶのための他のインターフェロン利用療法は、Ｔｅｓｔａらの米国特許第５，６７６，９４２号、Ｂｌａｔｔらの米国特許第５，３７２，８０８号、および米国特許第５，８４９，６９６号に開示されている。
（２）リバビリン（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２０００，．３４，４８７−４９４）； Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，Ｍ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．，１９９８，３（Ｓｕｐｐｌ．３），１２５−１３６）。
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、合成非インターフェロン誘発性広スペクトル抗ウイルスヌクレオシド類似体である。それは、商品名Ｖｉｒａｚｏｌｅ（商標）（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，第１１版，編者：Ｂｕｄａｖａｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ｐｌ３０４，１９８９）；Ｒｅｂｅｔｏｌ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）およびＣｏ−Ｐｅｇａｓｕｓ（Ｒｏｃｈｅ）で販売されている。米国特許第３，７９８，２０９号および米国特許再発行番号第２９，８３５号（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、リバビリンを開示し、特許請求の範囲に記載している。リバビリンは、構造的にグアノシンに類似しており、フラビウイルス科ウイルスを含む幾つかのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスに対してインビトロ活性を有する（Ｇａｒｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。米国特許第４，２１１，７７１号（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのもの）は、抗ウイルス薬としてのリバビリンの使用を開示している。リバビリンは、患者の４０％において血清アミノトランスフェラーゼレベルを正常値に低下させるが、ＨＣＶ−ＲＮＡの血清レベルは低下させない（Ｇａｒｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。従って、リバビリン単独では、ウイルスＲＮＡレベルの低下に有効ではない。加えて、リバビリンは、有意な毒性を有し、また貧血を誘発することが知られている。
インターフェロンとリバビリンの併用
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈは、ＨＣＶと共に患者に投与するためのＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標）カプセル（２００ｍｇ）としてリバビリンを販売している。米国食品薬品局は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇのアルファインターフェロン−２ｂ製品Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）ＡおよびＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（商標）と併用で慢性ＨＣＶ感染を治療するＲｅｂｅｔｏｌカプセルを認可している。レベトールカプセルは、単独療法（すなわち、Ｉｎｔｏｒｎ（登録商標）ＡまたはＰＥＢ−Ｉｎｔｒｏｎに依存しない投与）用には認可されていないが、ＩｎｔｒｏｎＡおよびＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎは、単独療法（すなわち、リバビリンなしでの投与）用に認可されている。Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅは、欧州および米国においてＣｏ−Ｐｅｇａｓｕｓという名でリバビリンを販売しており、これも、ＨＣＶの治療のためにインターフェロンと併用するためのものである。現在、ＨＣＶ単独療法用にＦＤＡの認可を受けている他のアルファインターフェロン製品には、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ、正式にはＡｍｇｅｎの製品）およびＷｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）が挙げられる。ＨＣＶ用に現在開発中のインターフェロン製品には、次のものが挙げられる：ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるＯｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、Ａｍａｒｉｌｌｏ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＯｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ。
ＨＣＶ感染を治療するためのＩＦＮとリバビリンの併用は、ＩＦＮ未経験患者の治療において有効であると報告されている（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３４：４８７−４９４，２０００）。併用治療は、肝炎発現前にも、組織学的疾患が存在するときにも有効である（Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，Ｍ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．３（Ｓｕｐｐｌ．３）：１２５−１３６，１９９８）。現在、ＨＣＶの最も有効な療法は、ポリエチレングリコール化インターフェロンとリバビリンの併用療法である（２００２ ＮＩＨ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）。しかし、併用療法の副作用は有意であり得、こうした副作用には、溶血反応、インフルエンザ様症状、貧血および疲労が挙げられる（Ｇａｒｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：Ｓ １０４−Ｓ １１４，２０００）。
（３）アルファケトアミドおよびヒドラジウレアを含む基質型ＮＳ３阻害剤（例えば、Ａｔｔｗｏｏｄら，抗ウイルスペプチド誘導体（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ），ＰＣＴ国際公開公報第９８／２２４９６号，１９９８； Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９９，１０，２５９−２７３； Ａｔｔｗｏｏｄら，抗ウイルス薬としてのアミノ酸誘導体の調製および使用（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ），ドイツ特許公開第１９９１４４７４号； Ｔｕｎｇら，セリンプロテアーゼ、特にＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ），ＰＣＴ国際公開公報第９８／１７６７９号）、およびボロン酸またはリン酸塩などの求電子試薬を末端に有する阻害剤（Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，Ｃ型肝炎阻害剤ペプチド類似体（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ），ＰＣＴ国際公開公報第９９／０７７３４号）。
（４）非基質型阻害剤、例えば、２，４，６−トリヒドロキシ−３−ニトロ−ベンズアミド誘導体（Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９７，２３８，６４３−６４７ ； Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，９，１８６）。ＲＤ３−４０８２およびＲＤ３−４０８７を含む。前のものは、炭素数１４の炭素鎖でアミドが置換されており、後のものは、ｐ−フェノキシフェニル基を処理する。
（５）ＮＳ３／４Ａ融合蛋白質およびＮＳ５Ａ／５Ｂ基質での逆相ＨＰＬＣアッセイにおいて適切な阻害を示すチアゾリジン誘導体（例えば、Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，３２，９−１８）、特に、ＲＤ−１−６２５０（長いアルキル鎖で置換された融合シンナモイル部分を有する）、ＲＤ４ ６２０５およびＲＤ４ ６１９３。
（６）チアゾリジンおよびベンズアニリド（例えば、Ｋａｋｉｕｃｈｉ Ｎ．ら，Ｊ．ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２１，２１７−２２０；およびＴａｋｅｓｈｉｔａ Ｎ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，２４７，２４２−２４６）。
（７）ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、例えば、Ｓｃｈ ６８６３１（Ｃｈｕ Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９６，３７，７２２９−７２３２）、およびチンチレーション近接アッセイにおいて活性を示す、真菌ペニシリウム・グリスコフルーム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｃｏｆｕｌｕｕｍ）から単離されたＳＣＨ３５１６３３（Ｃｈｕ Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９，１９４９−１９５２）、の発酵ブロスから単離された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにおいてプロテアーゼに対して活性を有するフェナントレンキノン。
（８）選択的ＮＳ３阻害剤、例えば、ヒルから単離された高分子エルジンＣ（ｅｌｇｉｎ ｃ）に基づくもの（Ｑａｓｉｍ Ｍ． Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６，１５９８−１６０７）。
（９）ヘリカーゼ阻害剤（例えば、Ｄｉａｎａ Ｇ．Ｄ．ら，Ｃ型肝炎治療のための化合物、組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ），米国特許第５，６３３，３５８号； Ｄｉａｎａ Ｇ．Ｄ．ら，ピペリジン誘導体、これらの医薬組成物、およびＣ型肝炎の治療におけるこれらの使用（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ），ＰＣＴ国際公開公報第９７／３６５５４号）。
（１０）ポリメラーゼ阻害剤、例えばヌクレオチド類似体、グリオトキシン（Ｆｅｒｒａｒｉ Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，７３，１６４９−１６５４）、および天然産物セルレニン（Ｌｏｈｍａｎｎ Ｖ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２４９，１０８−１１８）。
（１１）ウイルスの５’非コドン領域（ＮＣＲ）内の配列伸長に相補的なアンチセンスホスホロチオエート型オリゴデオキシヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）（Ａｌｔ Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９５，２２，７０７−７１７）、またはＨＣＶ ＲＮＡのＮＣＲの３’末端を含む第３２６位−第３４８位ヌクレオチドおよびコアコドン領域内に位置する第３７１位−第３８８位ヌクレオチド（Ａｌｔ Ｍ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１４２，５８９−５９９； Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ Ｕ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１８１，２５１−２５７）。
（１２）ＩＲＥＳ依存性翻訳の阻害剤（Ｉｋｅｄａ Ｎら，Ｃ型肝炎の予防および治療用薬剤（Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ），特開平０８−２６８８９０； Ｋａｉ Ｙ．ら，ウイルス性疾患の予防および治療（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ），特開平１０−１０１５９１）。
（１３）ヌクレアーゼ耐性リボザイム（例えば、Ｍａｃｃｊａｋ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９，３０，ａｂｓｔｒａｃｔ ９９５）。
（１４）ヌクレオシド類似体も、フラビウイルス科ウイルス感染の治療のために開発されている。
Ｉｄｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．は、米国特許公開第２００３／００５０２２９号Ａ１および米国特許公開第２００３／００６０４００号（これらは、国際公開公報第０１／９０１２１および同第０１／９２２８２号に対応する）において、分枝ヌクレオシドならびにＨＣＶおよびフラビウイルスおよびペスチウイルスの治療におけるこれらの使用を開示している。単独または併用で投与される、場合により医薬適合性担体中の、生物活性１’，２’，３’もしくは４’−分枝β−Ｄもしくはβ−Ｌヌクレオシドまたはその医薬適合性の塩もしくはプロドラッグの有効量の投与を含む、ヒトおよび他の宿主動物のＣ型肝炎感染（ならびにフラビウイルスおよびペスチウイルス）の治療法が、Ｉｄｅｎｉｘの出版物に開示されている。
Ｃ型肝炎ウイルスを治療するための一定のヌクレオシド類似体の使用を開示している他の特許出願には、次のものが挙げられる：国際特許公開公報第０１／３２１５３号（ＰＣＴ／ＣＡ００／０１３１６、出願日２０００年１１月３日）および同第０１／６０３１５号（ＰＣＴ／ＣＡ０１／００１９７、出願日２００１年２月１９日）、出願人ＢｉｏＣｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（現、Ｓｈｉｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）； 米国特許公開第２００２／０１４７１６０号ならびにその対応国際特許公開公報第０２／０５７４２５号（ＰＣＴ／ＵＳ０２／０１５３１、出願日２００２年１月１８日）および同第０２／０５７２８７号（ＰＣＴ／ＵＳ０２／０３０８６、出願日２００２年１月１８日）、出願人Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．； 米国特許公開第２００３／０８３３０７号Ａ１および同第２００３／００８８４１号Ａ１ならびにその対応国際特許公開公報第０２／１８４０４号（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０９６３３、発行日２００１年８月２１日）、同第０２／１００４１５号および同第０２／０９４２８９号、出願人Ｈｏｆｆｉｎａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ； 米国特許公開第２００３／０２８０１３号Ａ１ならびにその対応国際特許公開公報第０３／０６２２５５号および同第０３／０６１３８５号、出願人Ｒｉｂａｐｈａｒｍ；ならびに国際特許公開公報第０１／７９２４６および同第０２／３２９２０号、出願人Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ。
（１５）１−アミノ−アルキルシクロヘキサン（Ｇｏｌｄらの米国特許第６，０３４，１３４号）、アルキル脂質（Ｃｈｏｊｋｉｅｒらの米国特許第５，９２２，７５７号）、ビタミンＥおよび他の酸化防止剤（Ｃｈｏｊｋｉｅｒらの米国特許第５，９２２，７５７号）、スクアレン、アマンタジン、胆汁酸（Ｏｚｅｋｉらの米国特許第５，８４６，９６４号）、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（Ｄｉａｎａらの米国特許第５，８３０，９０５号）、ベンゼンジカルボキサミド（Ｄｉａｎａの米国特許第５，６３３，３８８号）、ポリアデニル酸誘導体（Ｗａｎｇらの米国特許第５，４９６，５４６号）、２’，３’−ジデオキシイノシン（Ｙａｒｃｈｏａｎらの米国特許第５，０２６，６８７号）、およびベンズイミダゾール（Ｃｏｌａｃｉｎｏらの米国特許第５，８９１，８７４号）を含む、その他の化合物。
（１６）Ｃ型肝炎ウイルスの治療のために現在臨床開発中の他の化合物には次のものが挙げられる： Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈによるＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０、ＩｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎによるＩＰ−５０１、ＶｅｒｔｅｘによるＭｅｒｉｍｅｂｏｄｉｂ ＶＸ−４９７、Ｅｎｄｏ Ｌａｂｓ ＳｏｌｖａｙによるＡＭＡＮＴＡＤＩＮＥ（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）、ＲＰＩによるＨＥＰＴＡＺＹＭＥ、Ｉｄｕｍ ＰｈａｒｍａによるＩＤＮ−６５５６、ＸＴＬによるＸＴＬ−００２、ＣｈｉｒｏｎによるＨＣＶ／ＭＦ５９、ＮＡＢＩによるＣＩＶＡＣＩＲ、ＩＣＮによるＬＥＶＯＶＩＲＩＮ、ＩＣＮによるＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ、Ｓｃｉ ＣｌｏｎｅによるＺＡＤＡＸＩＮ（チモシンアルファ−１）、ＭａｘｉｍによるＣＥＰＬＥＮＥ（二塩酸ヒスタミン）、Ｖｅｒｔｅｘ／Ｅｌｉ ＬｉｌｌｌｙによるＶＸ ９５０／ＬＹ ５７０３１０、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／ＥｌａｎによるＩＳＩＳ １４８０３、Ｉｄｕｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＩＤＮ−６５５６、およびＡＫＲＯＳ ＰｈａｒｍａによるＪＴＫ ００３。
ウイルスの薬物耐性変異体は、抗ウイルス薬での長期治療後に出現し得る。最も典型的には、薬物耐性は、ウイルス複製に用いられる酵素、および例えば、ＨＩＶの場合、逆転写酵素、プロテアーゼまたはＤＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子の突然変異によって発生する。ウイルス感染に対する薬物の効能は、このウイルスとの戦いに有効である第二の、おそらく第三の抗ウイルス化合物と併用または交代で本化合物を投与することによって延長、増大または回復できることが示された。本薬物の薬物動態、生体内分布または他のパラメータは、こうした併用または交代療法などによって変えることができる。一般に、併用療法は、交代療法より概して好ましい。ウイルスに対して同時に多重のプレッシャーをかけることができるからである。しかし、所与の薬物によってウイルスゲノムにどのような突然変異が誘発されるのか、この突然変異は、永続的であるのか一過性であるのかあるいは突然変異したウイルス配列を有するかまたは有さない感染細胞が併用または交代で他の薬剤を用いる療法にどのように反応するのかは、予測できない。最新の抗ウイルス薬で治療した長期細胞培養物における薬物耐性の動態に関するデータが不足しているという事実が、これを悪化させている。
米国特許第５，９８０，８８４号明細書 米国特許第５，９４２，２２３号明細書 米国特許第５，９２８，６３６号明細書 米国特許第５，９０８，６２１号明細書 米国特許第５，８４９，６９６号明細書 米国特許第５，８３０，４５５号明細書 米国特許第５，７３８，８４５号明細書 米国特許第５，６７６，９４２号明細書 米国特許第５，３７２，８０８号明細書 米国特許第３，７９８，２０９号明細書 米国再発行特許発明第２９，８３５号明細書 米国特許第４，２１１，７７１号明細書 独国特許出願公開第１９９１４４７４号明細書 国際公開第９８／１７６７９号 国際公開第９９／０７７３４号 国際公開第９８／２２４９６号 米国特許第５，６３３，３５８号明細書 国際公開第９７／３６５５４号 特開平０８−２６８８９０号公報 特開平１０−１０１５９１号公報 米国特許出願公開第２００３／００５０２２９号明細書 米国特許出願公開第２００３／００６０４００号明細書 国際公開第０１／３２１５３号 国際公開第０１／６０３１５号 米国特許出願公開第２００２／０１４７１６０号明細書 米国特許出願公開第２００３／０８３３０７号明細書 米国特許出願公開第２００３／００８８４１号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２８０１３号明細書 国際公開第０１／７９２４６号 国際公開第０２／３２９２０号 米国特許第６，０３４，１３４号明細書 米国特許第５，９２２，７５７号明細書 米国特許第５，８４６，９６４号明細書 米国特許第５，８３０，９０５号明細書 米国特許第５，６３３，３８８号明細書 米国特許第５，４９６，５４６号明細書 米国特許第５，０２６，６８７号明細書 米国特許第５，８９１，８７４号明細書
Ｃａｌｉｓｈｅｒら，Ｊ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７０，３７−４３ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，編者：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ ３１，９３１−９５９ Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９８４，６，２５１−２６４ Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４７６−４８１，１９８８ Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ，１９８８，３１９，６４１−６４３ Ｍｏｅｎｎｉｇ，Ｖ．ら，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２，４１，５３−９８ Ｍｅｙｅｒｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｔｈｉｅｌ，Ｈ．−Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，４７，５３−１１８ Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３３：２２ Ｂａｚａｎ ａｎｄ Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ（１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：６３７−６３９ Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７．３８８９−３８９７ Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．ａｎｄ Ｄｏｌｊａ，Ｖ．Ｖ．（１９９３） Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８：３７５−４３０ Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：３４１−３５０ Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３８３５−３８４４ Ｅｃｋａｒｔら，（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９２：３９９−４０６ Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２８３２−２８４３ Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０５８３−１０５８７ Ｈｉｊｉｋａｔａら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４６６５−４６７５ Ｔｏｍｅら，（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４０１７−４０２６ Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，（１９９４） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５０４５−５０５５ Ｆａｉｌｌａら，（１９９４） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３７５３−３７６０ Ｌｉｎら，（１９９４）６８：８１４７−８１５７ Ｘｕら，（１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５３１２−５３２２ Ｋｉｍら，（１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１５：１６０−１６６ Ｊｉｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ （１９９５） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２３：４７−５３ Ｗａｒｒｅｎｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９５） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７２０−１７２６ Ｂｅｈｒｅｎｓら，（１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１２−２２ Ｌｃｈｍａｎｎｅｔら，（１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４１６−８４２８ Ｙｕａｎら，（１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３２：２３１−２３５ Ｚｈｏｎｇら，（１９９８） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２．９３６５−９３６９ Ｇａｒｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００ Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２０００，．３４，４８７−４９４ Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，Ｍ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．，１９９８，３（Ｓｕｐｐｌ．３），１２５−１３６ Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，第１１版，編者：Ｂｕｄａｖａｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ｐｌ３０４，１９８９） Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９９，１０，２５９−２７３ Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９７，２３８，６４３−６４７ Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，９，１８６ Ｓｕｄｏ Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，３２，９−１８ Ｋａｋｉｕｃｈｉ Ｎ．ら，Ｊ．ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２１，２１７−２２０ Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｎ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，２４７，２４２−２４６ Ｃｈｕ Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９６，３７，７２２９−７２３２ Ｃｈｕ Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９，１９４９−１９５２ Ｑａｓｉｍ Ｍ． Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６，１５９８−１６０７ Ｆｅｒｒａｒｉ Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，７３，１６４９−１６５４ Ｌｏｈｍａｎｎ Ｖ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２４９，１０８−１１８ Ａｌｔ Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９５，２２，７０７−７１７ Ａｌｔ Ｍ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１４２，５８９−５９９ Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ Ｕ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１８１，２５１−２５７ Ｍａｃｃｊａｋ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９９，３０，ａｂｓｔｒａｃｔ ９９５
本発明の目的は、ＨＣＶ感染の治療を最適化することである。
さらなる目的は、フラビウイルス科ウイルス感染を治療するための２’−分枝ヌクレオシド、特に２’−分枝ピリミジンヌクレオシドの最適な投与を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、２’−分枝ピリミジンヌクレオシド単独の投与に勝る利点、すなわち改善された薬物動態、生体内分布、代謝、耐性または他のパラメータを示す、ペスチウイルス、フラビウイルスまたはヘパシウイルスに感染している患者を治療するための２’−分枝ヌクレオシドを含む方法および組成物を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、２’−分枝ヌクレオシド、特に２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを、ウイルスに対して２’−分枝ピリミジンヌクレオシドと相乗的にまたは２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを伴って有利に作用する１つ以上の化合物と併用および／または交代で投与する、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法および組成物を提供することである。
本発明の尚もう一つの目的は、ペスチウイルス、フラビウイルスまたはヘパシウイルスの薬物耐性形に感染している患者を治療するための方法および組成物を提供することである。
本発明の目的は、フラビウイルス科ウイルスの突然変異株を同定するための方法およびキットを提供することでもある。
（発明の要約）
２’−分枝ヌクレオシド、例えば下に示す２’−分枝ヌクレオシド、特に、２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなど）または２’−分枝プリンヌクレオシド（化合物β−Ｄ−ＣＨ３−リボアデノシンまたはβ−２’−分枝リボ−６−Ｎ−メチルアミノアデノシンを含む）の長期使用は、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンをコードしているヌクレオチド（図１１）における突然変異を伴い、この突然変異に起因して、前記アミノ酸残基セリンが、別のアミノ酸、例えばトレオニンに変化する。このドメインは、ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域ならびに他のフラビウイルスのゲノムにおいて見出させる。この領域は、ヘパシウイルスゲノム、ペスチウイルスゲノムおよびフラビウイルスゲノムすべての間で高度に保存されている（図１１、Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３，１０１２９−３６）。
本発明の一つの実施態様において、２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えられるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上により場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２であり；および
塩基は、本明細書でさらに説明するようなプリンまたはピリミジンである。）
ものまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩である。
第二の実施態様において、２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
塩基は、本明細書で定義するようなプリンまたはピリミジン塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩を含む）；直鎖、分枝鎖または環状アルキル（低級アルキルを含む）；アシル（低級アシルを含む）；ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上により場合により置換されているベンジル；アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ６は、アルキル（低級アルキルおよびハロゲン化アルキルを含む）、ＣＨ３、ＣＦ３、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、２−Ｂｒ−エチル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、ＣＦ３、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；
Ｒ７は、水素、ＯＲ３、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＣＨ２であり、
塩基は、本明細書でさらに説明するようなプリンまたはピリミジンである。）
のものまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩である。
本発明の第三の実施態様において、２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
塩基は、本明細書で定義するようなプリンまたはピリミジン塩基であり；
Ｒ６は、アルキル（低級アルキルおよびハロゲン化アルキルを含む）、ＣＨ３、ＣＦ３、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、２−Ｂｒ−エチル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、ＣＦ３、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；
Ｒ７は、ＯＲ２、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、ハロ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり、
Ｒ９は、水素、ＯＲ３、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル（低級アルキルを含む）、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩を含む）；直鎖、分枝鎖または環状アルキル（低級アルキルを含む）；アシル（低級アシルを含む）；ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上により場合により置換されているベンジル；アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＣＨ２である。）
のものである。
ＢＶＤＶ感染の場合、２’−分枝ヌクレオシド、特に、化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼの第１２１４位残基におけるグアニン（Ｇ）からシチジン（Ｃ）への突然変異を誘発し、それに起因して前記酵素の第４０５位におけるアミノ酸残基セリンがチオニンへと変化する。このセリン残基は、ＲＮＡポリメラーゼのドメインＢの保存コンセンサス配列（ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ）（図５および１１）内に位置し、それは突然変異分析によって同定されている（Ｌａｉ Ｖ．Ｃ．，Ｋａｏ Ｃ．Ｃ．，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｅ．，Ｐａｒｋ Ｊ．，Ｕｓｓ Ａ．Ｓ．，Ｗｒｉｇｈｔ−Ｍｉｎｏｇｕｅ Ｊ．，Ｈｏｎｇ Ｚ．，ａｎｄ Ｊ．Ｙ．Ｌａｕ．「ウシウイルス性下痢ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの突然変異分析（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３，１０１２９−３６）。
ＨＣＶ感染の場合、２’−分枝ヌクレオシド、特に、化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内におけるセリン２８２をコードしているヌクレオチド（図１１）において突然変異を誘発し、それに起因してセリンがトレオニンなどの別のアミノ酸に変化する。
さらに、２’−分枝ヌクレオシドおよびインターフェロンが相乗的に作用して、フラビウイルス科ウイルスを阻害することを発見している。特に、併用および／または交代で投与された化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドまたは化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノアデノシンなどの２’−分枝プリンヌクレオシドと、インターフェロンアルファ−２ｂは、相乗的に作用して、フラビウイルス科ウイルスを阻害する。さらに、２’−分枝ヌクレオシド治療後、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ治療後に出現する耐性ウイルス集団は、インターフェロンでのその後の治療に対して感受性増大を示すことを発見した。従って、２’−分枝ヌクレオシドとインターフェロンの逐次および／または併用療法は、フラビウイルス科ウイルス感染を実質的に低下させることができる。
本発明の一つの側面は、フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシド、例えば２’−分枝ピリミジンヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の治療有効量を、こうした療法が必要なヒトなどの宿主に投与することにより、フラビウイルス科ウイルス感染を治療する方法を提供する。この高保存セリン残基は、ＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸に対応する。これは、ＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位アミノ酸にも対応する（図１１、Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）。
本発明のもう一つの側面は、インターフェロンの治療有効量を投与することによる、フラビウイルス科ウイルスの保存セリン残基（図１１）、例えばＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼの第２８２位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。特定の実施態様では、インターフェロンアルファ−２ｂを投与して、突然変異フラビウイルス科ウイルスに起因する感染を治療する、および／または実質的に治癒させる。
本明細書において開示する本発明は、少なくとも次の実施態様も最小限含む。
（ｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外、例えば、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチド（ＧからＣ）もしくは第４０５位ＳｅｒからＴｈｒ、またはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチド（ＧからＣ）、またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位ＳｅｒからＴｈｒ以外の位置（図１１；Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、２’−分枝ヌクレオシド、例えば、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、またはこの医薬適合性の塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な医薬組成物。
（ｉｉ）インターフェロンと併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な医薬組成物。インターフェロンには、次のものが挙げられる：ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるオメガインターフェロン（Ｏｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、アマリロバイオサイエンス（Ａｍａｒｉｌｌｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による経口インターフェロンアルファ（Ｏｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ）、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−１ｂ）。
（ｉｉｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグを含むプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグを含むプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドの２’、３’および／または５’−プロドラッグあるいはその医薬適合性の塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な医薬組成物。
（ｉｖ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域の高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外、例えば、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチド（ＧからＣ）または第４０５位ＳｅｒからＴｈｒ、またはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチド（ＧからＣ）、またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位ＳｅｒからＴｈｒ以外の位置（図１１；Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／または塩の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトなどの宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療するための方法。
（ｖ）インターフェロンと併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）のような２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の有効量を宿主に投与することを含む、ヒトなどの宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療するための方法。インターフェロンには、次のものが挙げられる：ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるオメガインターフェロン（Ｏｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、アマリロバイオサイエンス（Ａｍａｒｉｌｌｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による経口インターフェロンアルファ（Ｏｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ）、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−１ｂ）。
（ｖｉ）場合によりウイルス量を実質的に消去する方式で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、インターフェロンの有効量を投与することを含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性の塩に対して耐性であるフラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｉｖ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドの２’、３’および／または５’−プロドラッグあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与することを含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｖ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を患者に投与すること、
（ｂ）この患者の血液をアッセイして、野生型ウイルスから突然変異ウイルスへの血清変換ついて検査すること、
（ｃ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、インターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｖｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンをコードしているコドン（図１１）に相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｂ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、および
（ｃ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルをアッセイする方法。
（ｖｉｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｂ）このプローブをその配列にハイブリダイズさせること、および
（ｃ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへのこのプローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、または３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルをアッセイする方法。
（ｖｉｉｉ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｂ）この患者からウイルスサンプルを得ること、
（ｃ）このウイルスの複製適性を決定すること、
（ｄ）このサンプルにおけるウイルスの複製適性が、野生型ウイルスの複製適性より低い（これは、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対する耐性を示す。）かどうか決定すること、
（ｅ）β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｉｘ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、または３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｂ）この患者からウイルス培養サンプルを得ること、
（ｃ）このサンプルを培養し、このサンプルと野生型ウイルスの間でプラーク成長を比較すること、
（ｄ）このサンプルのプラーク成長が、野生型のプラーク成長ようり小さい（これは、２’−分枝ヌクレオシドに対する耐性を示す。）かどうか決定すること、および
（ｅ）β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｘ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むと推測されるサンプルを得ること、
（ｂ）フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンをコードしているコドン（図１１）と相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとこのサンプルを接触させること、
（ｃ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズすること、および
（ｄ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出して、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を決定することを
を含む、患者体内の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を診断するための方法。
（ｘｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むと推測されるサンプルを得ること、
（ｂ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとこのサンプルを接触させること、
（ｃ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、および
（ｄ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへのこのプローブのハイブリダイゼーションを検出して、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、あるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を決定すること
を含む、患者体内の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、あるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を診断するための方法。
開示する併用および／または交代治療方式は、ＢＶＤＶ、ＢＤＶ、ＣＳＦＶ、ＤＨＦ、黄熱病ウイルス、ショック症候群、日本脳炎ウイルスおよびＨＣＶを含むフラビウイルス科ウイルス感染の予防および治療に有用である。
加えて、２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応診断用のフラビウイルス科ウイルスマーカーの対応するアミノ酸配列は、フラビウイルス科ウイルスヌクレオチド配列例から決定することができる。
２’−分枝ヌクレオシドの失敗に関係するフラビウイルス科ウイルス株の同定を目的とするウイルスマーカーの同定に加えて、本発明は、２’−分枝ヌクレオシド療法に反応するフラビウイルス科ウイルス株の同定にも利用することができる。この関連で、２’−分枝ヌクレオシド療法と相関するウイルスマーカーの不在を利用して、２’−分枝ヌクレオシド療法の失敗と相関するウイルスマーカーを欠くフラビウイルス科ウイルスを保有する個体ためのモダリティーとして２’−分枝ヌクレオシドを含む治療コースを処方することができる。
もう一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一つの実施態様において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１４ヌクレオチドの長さであり、それを、療法の失敗に相関するマーカーを含むヌクレオチド配列に、配列特異的でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせる。
プライマーのハイブリダイズ領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列は、プローブのハイブリダイズ領域としても使用することができる。プローブとしての使用に対するプライマー配列の適性は、このプライマーのハイブリダイゼーション特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用することができる。
加えて、本発明は、２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応を予測させるアミノ酸（本明細書に広範に記載されているようなもの）を含有する蛋白質、ペプチドもしくはペプチドフラグメント、またはこうした蛋白質、ペプチドもしくはペプチドフラグメントの抗体を検出する方法、材料およびキットを提供する。宿主の血清または組織は、便宜およびおそらく診断材料の濃度に依存して、蛋白質もしくはペプチド、または蛋白質もしくはペプチドの抗体のいずれについて検査してもよい。
蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントは、例えばウエスタンブロット法を用い、抗体、好ましくはモノクローナル抗体との反応により確認することができる。また、蛋白質またはペプチドは、２Ｄ ＰＡＧＥを含むこの分野において公知のいずれかの手段によって、単離および配列または別様に同定することができる。一つの実施態様において、反応性抗体は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内、例えばＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位またはＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位に、セリンではなくトレオニンを含むフラビウイルス科ウイルス蛋白質またはペプチド配列に結合する。
もう一つの実施態様において、反応性抗体は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内に、例えばＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位またはＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位に、セリンではなくトレオニンを含む（これは、療法の失敗に相関するフラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の特異的点突然変異を象徴する。）ペプチド配列に、特異的に結合する。
特定の実施態様において、配列番号１から３１の核酸配列によりコードされた少なくとも一つのペプチドまたはペプチドフラグメントに結合する抗体を使用する。
特定の実施態様において、配列番号３２から６４の核酸配列によりコードされた少なくとも一つのペプチドまたはペプチドフラグメントに結合する抗体を使用する。
未処置のＢＶＤＶからのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶの出現を示す図である。 （Ａ）野生型（ｗｔ）ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）および（Ｂ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ）による病巣形成の表現型を説明する図である。 野生型ＢＶＤＶ Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓおよびこのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性突然変異体、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ（耐性突然変異体）の成長速度を示す図である。 新規感染ＭＤＢＫ細胞において生じたウイルスに対するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの効果を示す図（図中、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓは、ＢＶＤＶであり、耐性突然変異体は、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ（β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶ）である）である。 突然変異分析（Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｖ．Ｂ．ａｎｄ Ｒ．Ｏ．Ｄｏｎｉｓ．（２０００）「ウシウイルス性下痢ウイルス誘発アポトーシスは、細胞内ウイルスＲＮＡ蓄積増加と相関する（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）」，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６９（２）：９５−１０７）に基づく、提案機能ドメインを示すＢＶＤＶ ＮＳ５Ｂ領域の略図である。大矢印は、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶのＮＳ５Ｂ領域で見出される唯一のアミノ酸変化の位置（第４０５位Ｓｅｒから第４０５位Ｔｈｒ）を示している。 新規感染ＭＤＢＫ細胞（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ：ＢＶＤＶ；Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ：β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶ（耐性突然変異体）である）におけるウイルス収量に対するインターフェロンアルファ−ｂの効果を示す図である。 持続感染ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）力価に対するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣおよびインターフェロン−２ｂの効果を示す図である。 持続感染ＭＤＢＫ細胞における野生型ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）力価に対するインターフェロンアルファ−２ｂと併用でのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの効果を証明する図である。 持続感染ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ（ＮＹ−１株）力価に対するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣおよびインターフェロンアルファ−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）の効果を示す図である。 持続感染ＭＤＢＫ細胞における野生型ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）力価に対するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣおよびインターフェロン−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）の効果を示す図である。 様々なフラビウイルス科ウイルスのドメインＢにおけるＲＮＡポリメラーゼの配列を示す図である。字体が大きい太字は、１００％保存アミノ酸を示し、下線を引いたセリンアミノ酸残基は、２’−分枝ヌクレオシドでの処置後にトレオニンに突然変異し得るものである。［１００％保存セリン残基にも下線が引かれており、これは、２’−分枝ヌクレオシドでの処置後にトレオニンに突然変異するアミノ酸を表す（ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域のＳｅｒ４０５；ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域のＳｅｒ２８２）。Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３，１０１２９−３６参照］。
（発明の詳細な説明）
２’−分枝ヌクレオシド、例えば下に示す２’−分枝ヌクレオシド、特に化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドの延長使用は、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域（図１１）のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内にセリンをコードしているヌクレオチドにおける突然変異に関連し、この突然変異に起因してアミノ酸残基セリンは、別のアミノ酸、例えばトレオニンに変化することを発見した。このドメインは、ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域、ならびに他のフラビウイルスのゲノムにおいて見出される。このドメインは、ヘパシウイルスゲノム、ペスチウイルスゲノムおよびフラビウイルスゲノムすべての間で高度に保存されている（図１１、Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３，１０１２９−３６）。
ＢＶＤＶ感染の場合、２’−分枝ヌクレオシド、特に化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位残基におけるグアニン（Ｇ）からシチジン（Ｃ）への突然変異を誘発し、それに起因して、この酵素の第４０５位におけるアミノ酸残基セリンがトレオニンに変化する。このセリン残基は、ＲＮＡポリメラーゼドのメインＢの保存コンセンサス配列（ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ）内に位置し（図５および１１）、それは突然変異分析（Ｌａｉ Ｖ．Ｃ．，Ｋａｏ Ｃ．Ｃ．，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｅ．，Ｐａｒｋ Ｊ．，Ｕｓｓ Ａ．Ｓ．，Ｗｒｉｇｈｔ−Ｍｉｎｏｇｕｅ Ｊ．，Ｈｏｎｇ Ｚ．，ａｎｄ Ｊ．Ｙ．Ｌａｕ．「ウシウイルス性下痢ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの突然変異分析（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３，１０１２９−３６）によって同定される。
ＨＣＶ感染の場合、２’−分枝ヌクレオシド、特に化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴにおけるセリン２８２（図１１）をコードしているヌクレオチドにおける突然変異を誘発し、セリンからトレオニンなどの別のアミノ酸に変化をもたらす。
さらに、２’−分枝ヌクレオシドとインターフェロンが相乗的に作用して、フラビウイルス科ウイルスを阻害することを発見した。詳細には、併用および／または交代で投与された化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドとインターフェロンアルファ−２ｂは、相乗的に作用して、フラビウイルス科ウイルスを阻害する。さらに、２’−分枝ヌクレオシド治療、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ治療後に出現する耐性ウイルス集団は、インターフェロンでのその後の治療に対する感受性増大を示すことを発見した。従って、２’−分枝ヌクレオシドとインターフェロンの逐次および／または併用療法によって、フラビウイルス科ウイルス感染を実質的に低下させることができる。
本発明の一つの側面は、フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシド、例えば２’−分枝ピリミジンヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の治療有効量を、こうした療法が必要なヒトなどの宿主に投与することにより、フラビウイルス科ウイルス感染を治療する方法を提供する。この高保存セリン残基は、ＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸に対応する。これは、ＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位アミノ酸にも対応する（図１１、Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）。
本発明のもう一つの側面は、インターフェロンの治療有効量を投与することによる、フラビウイルス科ウイルスの保存セリン残基（図１１）、例えばＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼの第２８２位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。特定の実施態様では、インターフェロンアルファ−２ｂを投与して、突然変異フラビウイルス科ウイルスに起因する感染を治療する、および／または実質的に治癒させる。
本明細書において開示する本発明は、少なくとも次の実施態様も最小限含む：
（ｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外、例えば、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチド（ＧからＣ）もしくは第４０５位ＳｅｒからＴｈｒ、またはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチド（ＧからＣ）、またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位ＳｅｒからＴｈｒ以外の位置（図１１；Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、２’−分枝ヌクレオシド、例えば、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、またはその医薬適合性の塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な医薬組成物。
（ｉｉ）インターフェロンと併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な組成物。インターフェロンには、次のものが挙げられる：ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるオメガインターフェロン（Ｏｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、アマリロバイオサイエンス（Ａｍａｒｉｌｌｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による経口インターフェロンアルファ（Ｏｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ）、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−１ｂ）。
（ｉｉｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併せて、場合により医薬適合性担体または希釈剤中に、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグを含むプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグを含むプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドの２’、３’および／または５’−プロドラッグあるいはその医薬適合性の塩の有効量を含む、ヒトなどの宿主におけるフラビウイルス科ウイルス感染の治療に有効な医薬組成物。
（ｉｖ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域の高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外、例えば、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチド（ＧからＣ）または第４０５位ＳｅｒからＴｈｒ、またはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチド（ＧからＣ）、またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位ＳｅｒからＴｈｒ以外の位置（図１１；Ｌａｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／または塩の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトなどの宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療するための方法。
（ｖ）インターフェロンと併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）のような２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の有効量を宿主に投与することを含む、ヒトなどの宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療するための方法。インターフェロンには、次のものが挙げられる：ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるオメガインターフェロン（Ｏｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、アマリロバイオサイエンス（Ａｍａｒｉｌｌｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による経口インターフェロンアルファ（Ｏｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ）、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−１ｂ）。
（ｖｉ）場合によりウイルス量を実質的に消去する方式で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、インターフェロンの有効量を投与することを含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性の塩に対して耐性であるフラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｉｖ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接または間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドの２’、３’および／または５’−プロドラッグあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与することを含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｖ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を患者に投与すること、
（ｂ）前記患者の血液をアッセイして、野生型ウイルスから突然変異ウイルスへの血清変換ついて検査すること、
（ｃ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、インターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｖｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンをコードしているコドン（図１１）に相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｂ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、および
（ｃ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルをアッセイする方法。
（ｖｉｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｂ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、および
（ｃ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへの前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、または３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルをアッセイする方法。
（ｖｉｉｉ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｂ）この患者からウイルスサンプルを得ること、
（ｃ）このウイルスの複製適性を決定すること、
（ｄ）このサンプルにおけるウイルスの複製適性が、野生型ウイルスの複製適性より低い（これは、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対する耐性を示す。）かどうか決定すること、
（ｅ）β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｉｘ）（ａ）場合により医薬適合性担体または希釈剤中の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、または３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｂ）この患者からウイルス培養サンプルを得ること、
（ｃ）このサンプルを培養し、このサンプルと野生型ウイルスの間でプラーク成長を比較すること、
（ｄ）このサンプルのプラーク成長が、野生型のプラーク成長より小さい（これは、２’−分枝ヌクレオシドに対する耐性を示す。）かどうか決定すること、および
（ｅ）β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法。
（ｘ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むと推測されるサンプルを得ること、
（ｂ）フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンをコードしているコドン（図１１）と相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとこのサンプルを接触させること、
（ｃ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズすること、および
（ｄ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出して、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を決定することを
を含む、患者体内の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシドあるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を診断するための方法。
（ｘｉ）（ａ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むと推測されるサンプルを得ること、
（ｂ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとこのサンプルを接触させること、
（ｃ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、および
（ｄ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへのこのプローブのハイブリダイゼーションを検出して、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、あるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を決定すること
を含む、患者体内の、β−Ｄ−２’−分枝ピリミジンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）またはβ−Ｄ−２’−分枝プリンヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＡもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリン、またはこの３’−バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグ）などの２’−分枝ヌクレオシド、あるいはその医薬適合性の塩に対して耐性のフラビウイルス科ウイルスの存在を診断するための方法。
開示する併用および／または交代治療方式は、ＢＶＤＶ、ＢＤＶ、ＣＳＦＶ、ＤＨＦ、黄熱病ウイルス、ショック症候群、日本脳炎ウイルスおよびＨＣＶを含むフラビウイルス科ウイルス感染の予防および治療に有用である。
加えて、２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応診断用のフラビウイルス科ウイルスマーカーの対応するアミノ酸配列は、フラビウイルス科ウイルスヌクレオチド配列例から決定することができる。
２’−分枝ヌクレオシドの失敗に関係するフラビウイルス科ウイルス株の同定を目的とするウイルスマーカーの同定に加えて、本発明は、２’−分枝ヌクレオシド療法に反応するフラビウイルス科ウイルス株の同定にも利用することができる。この関連で、２’−分枝ヌクレオシド療法と相関するウイルスマーカーの不在を利用して、２’−分枝ヌクレオシド療法の失敗と相関するウイルスマーカーを欠くフラビウイルス科ウイルスを保有する個体ためのモダリティーとして２’−分枝ヌクレオシドを含む治療コースを処方することができる。
もう一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一つの実施態様において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１４ヌクレオチドの長さであり、それを、療法の失敗に相関するマーカーを含むヌクレオチド配列に、配列特異的でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせる。
プライマーのハイブリダイズ領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列は、プローブのハイブリダイズ領域としても使用することができる。プローブとしての使用に対するプライマー配列の適性は、このプライマーのハイブリダイゼーション特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用することができる。
加えて、本発明は、２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応を予測させるアミノ酸（本明細書に広範に記載されているようなもの）を含有する蛋白質、ペプチドもしくはペプチドフラグメント、またはこうした蛋白質、ペプチドもしくはペプチドフラグメントの抗体を検出する方法、材料およびキットを提供する。宿主の血清または組織は、便宜およびおそらく診断材料の濃度に依存して、蛋白質もしくはペプチド、または蛋白質もしくはペプチドの抗体のいずれについて検査してもよい。
蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントは、例えばウエスタンブロット法を用い、抗体、好ましくはモノクローナル抗体との反応により確認することができる。また、蛋白質またはペプチドは、２Ｄ ＰＡＧＥを含むこの分野において公知のいずれかの手段によって、単離および配列または別様に同定することができる。一つの実施態様において、反応性抗体は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内、例えばＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位またはＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位に、セリンではなくトレオニンを含むフラビウイルス科ウイルス蛋白質またはペプチド配列に結合する。
もう一つの実施態様において、反応性抗体は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内に、例えばＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位またはＨＣＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位に、セリンではなくトレオニンを含む（これは、療法の失敗に相関するフラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の特異的点突然変異を象徴する。）ペプチド配列に、特異的に結合する。
特定の実施態様において、配列番号１から３１の核酸配列によりコードされた少なくとも一つのペプチドまたはペプチドフラグメントに結合する抗体を使用する。
特定の実施態様において、配列番号３２から６４の核酸配列によりコードされた少なくとも一つのペプチドまたはペプチドフラグメントに結合する抗体を使用する。
Ｉ．定義
ここで用いる用語「耐性ウイルス」は、天然ウイルスと比較して３倍、さらに典型的には５倍またはそれ以上のＥＣ５０の増加を示すウイルスを指す。
用語「アミノ酸」は、天然および合成α、β、γまたはδアミノ酸を包含し、また限定ではないが、蛋白質において見出されるアミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アルパルテート、グルタメート、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを包含する。好ましい実施態様において、アミノ酸は、Ｌ配置であるが、Ｄ配置であってもよい。また、アミノ酸は、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニニル、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、トレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタロイル、リシニル、アルギニニル、ヒスチジニル、β−アラニル、β−バリニル、β−ロイシニル、β−イソロイシニル、β−プロリニル、β−フェニルアラニニル、β−トリプトファニル、β−メチオニニル、β−グリシニル、β−セリニル、β−トレオニニル、β−システイニル、β−チロシニル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル、β−リシニル、β−アルギニニルまたはβ−ヒスチジニルの誘導体であってもよい。
本明細書に使用されているアミノ酸の略記を表１に記す。
Figure 0006104845
Figure 0006104845
「増幅剤」は、選択された増幅手順を実施するために使用される様々なバッファ、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸（従来型と非従来型の両方）およびプライマーを指す。
「増幅すること」または「増幅」は、一般には標的核酸の「指数」増加を指すが、ここでは、核酸の選択標的配列数の線形増加と指数増加の両方を説明するために用いる。
「実質的に結合する」は、オリゴヌクレオチドと標的配列の間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、またこのハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させて、ＰＣＲポリメラーゼに対する望ましいプライミングをまたはハイブリダイゼーションシグナルの検出を達成することにより対処することができる、少数のミスマッチを包含する。
「ハイブリダズする」は、相補塩基対を介する２つの一本鎖核酸の結合を指す。
「核酸」は、１本鎖形または２本鎖形いずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別様に限定されていなければ、天然ヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知類似体を包含する。
「ヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸前駆体からのＤＮＡまたはＲＮＡの合成を触媒することができる酵素を指す。増幅反応において、このポリメラーゼは、テンプレート依存性であり、典型的には生産されるポリマーの３’末端にヌクレオチドを付加させる。このポリメラーゼは、米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号に記載されているように、熱安定性であり得る。
用語「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、検出すべき核酸フラグメント、および核酸対照などの、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシド２つ以上から成る分子を指す。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多数の因子、およびこのオリゴヌクレオチドの根本的な機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限酵素処理、ならびにＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７９，６８：９０−９９のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７９，６８：１０９−１５１のリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８１，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの方法による直接化学合成を含む、あらゆる適切な方法によって調製することができる。
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、適切なバッファ中、適温で４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）が存在する状態で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる、天然のまたは合成の、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、このプライマーの所期の用途に依存するが、典型的には約１４または１５から２５または３０ヌクレオチドの範囲である。一般に、短いプライマー分子ほど、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために要する温度がより低い。プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするために十分相補的でなけらばならない。
用語「プライマー」は、特に、増幅すべき標的領域の一方または両方の末端に関する情報にあるあいまいさがある場合、１つ以上のプライマーを指す。例えば、ある集団においてある領域が有意なレベルの多形性を示す場合、交互配列を増幅することになるプライマー混合物を調製してもよい。所望される場合には、プライマーは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出可能な標識を組み込むことによって、標識することができる。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるようなもの）、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体を利用することができるハプテンおよび蛋白質が挙げられる。標識は、このプライマーを「捕捉」して、固体支持体上のプライマーまたはプライマー伸長産物（増幅ＤＮＡなど）の固定化を助長するために使用することもできる。
「プローブ」は、相補塩基対により標的核酸の副配列に結合するオリゴヌクレオチドを指す。一般に、プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、このプローブ配列との完全相補性を欠く標的配列に実質的に結合することは、当業者に理解されるだろう。好ましくは、プローブは、同位元素などで直接標識するか、ストレプタビジン複合体が後で結合できるビオチンなどで間接的に標識する。プローブの存在または不在についてアッセイすることにより、この標的の存在または不在を検出することができる。
「副配列」は、より長い核酸配列の一部を含む核酸配列を指す。
用語「標的領域」は、分析すべき核酸の領域を指し、多形領域を包含し得る。
ここで用いる用語「アルキル」は、別様に特定しなければ、一般にはＣ１からＣ１０の飽和直鎖、分枝鎖または環状第一、第二または第三級炭化水素を指し、具体的には、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イロプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチルおよび２，３−ジメチルブチルを包含する。この用語は、置換アルキル基と非置換アルキル基の両方を包含し、特にハロゲン化アルキル基、さらにいっそう特にフッ素化アルキル基を包含する。アルキル基を置換することができる部分は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェートまたはホスホネート（これらは非保護であるか、必要な場合には、当業者に公知のとおり、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１において教示されているように保護されている。）から成る群より選択される。前記文献は、本明細書に参照により組込まれる。
ここで用いる用語「低級アルキル」は、別に特定しなければ、Ｃ１からＣ４飽和直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、または適切な場合には、飽和形と不飽和形の両方を含む環状アルキル基（例えば、シクロプロピル）を指す。本出願では、特に別様に述べなければ、アルキル基が適する部分である場合、低級アルキルが好ましい。同様に、アルキルまたは低級アルキルが適する部分である場合、非置換アルキルまたは低級アルキルが好ましい。
用語「アルキルアミノ」または「アリールアミノ」は、それぞれ、１個または２個のアルキルまたはアリール置換基を有するアミノ基を指す。
ここで用いる用語「保護されている」は、別様に定義しなければ、さらなる反応を防止するため、または他の目的で、酸素、窒素またはリン原子に付加させる基を指す。多種多様な酸素および窒素保護基が有機合成技術分野の当業者に公知である。
ここで用いる用語「アリール」は、別様に特定しなければ、フェニル、ビフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルを指す。この用語は、置換部分と非置換部分の両方を包含する。アリール基は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェートまたはホスホネート（これらは非保護であるか、必要な場合には、当業者に公知であるように、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１において教示されているように保護されている。）から成る群より選択される１つ以上の部分で置換されていてもよい。
用語「アルカリール」または「アルキルアリール」は、アリール置換基を有するアルキル基を指す。用語「アラルキル」または「アリールアルキル」は、アルキル置換基を有するアリール基を指す。
ここで用いる用語「ハロ」は、クロロ、ブロモ、ヨードおよびフルオロを包含する。
用語「塩基」は、限定ではないが以下のものを含むあらゆるプリンまたはピリミジン塩基を指す： グアニン、アデニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６−クロロプリン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−アシルプリン（ここにおいて、アシルは、Ｃ（Ｏ）（アルキル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル）である。）、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレン性プリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、チミン、シトシン、５−フルオロシトシン、５−メチルシトシン、６−アザピリミジン（６−アザシトシンを含む）、２−および／または４−メルカプトピリミジン、ウラシル、５−ハロウラシル（５−フルオロウラシルを含む）、Ｃ５−アルキルピリミジン、Ｃ５−ベンジルピリミジン、Ｃ５−ハロピリミジン、Ｃ５−ビニルピリミジン、Ｃ５−アセチレン性ピリミジン、Ｃ５−アシルピリミジン、Ｃ５−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ５−アミドピリミジン、Ｃ５−シアノピリミジン、Ｃ５−ニトロピリミジン、Ｃ５−アミノピリミジン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、５−アザシチジニル、５−アザ−ウラシリル、チアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、ならびに式：
Figure 0006104845
 （式中、
ＧおよびＬは、各々独立して、ＣＨまたはＮであり；
Ｄは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−ＮＯ２、Ｃ−Ｃ１−３アルキル、Ｃ−ＮＨＣＯＮＨ２、Ｃ−ＣＯＮＱ１１Ｑ１１、Ｃ−ＣＳＮＱ１１Ｑ１１、ＣＣＯＯＱ１１、Ｃ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ−ヒドロキシ、Ｃ−Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ−アミノ、Ｃ−Ｃ１−４アルキル−アミノ、Ｃ−ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−（１，３−オキサゾール−２−イル）、Ｃ−（１，３−チアゾール−２−イル）またはＣ−（イミダゾール−２−イル）（この場合のアルキルは、非置換であるか、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびＣ１〜３アルコキシから独立して選択される１から３個の基で置換されている。）
であり；
Ｅは、ＮまたはＣＱ５であり；
Ｗは、Ｏ、ＳまたはＮＲであり；
Ｒは、Ｈ、ＯＨ、アルキルであり；
Ｑ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１〜４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルアミノ、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシまたはＣＦ３であり；
Ｑ５は、Ｈ、Ｃｌ−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−４アルキルアミノ、ＣＦ３、ハロゲン、Ｎ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣＯＮＨ２、ＣＯＮＱ１１Ｑ１１、ＣＳＮＱ１１Ｑ１１、ＣＯＯＱ１１、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ヒドロキシ、Ｃ１−３アルコキシ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ、ハロゲン、１，３−オキサゾール−２−イル、１，３−チアゾール−２−イルまたはイミダゾール−２−イル（アルキルは、非置換であるか、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびＣ１〜３アルコキシから独立して選択される１から３個の基で置換されている。）
であり；
Ｑ７およびＱ１４は、Ｈ、ＣＦ３、ＯＨ、ＳＨ、ＯＲ、ＳＲ、Ｃ１〜４アルキル、アミノ、Ｃ１〜４アルキルアミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルアミノおよびジ（Ｃ１〜４アルキル）アミノから成る群より各々独立して選択され；
Ｑ１１は、独立してＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
Ｑ８は、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、カルボキシ、Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル、Ｎ３、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、（Ｃ１−４アルキル）０−２アミノメチル、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−３アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＣＯＮＱ１１Ｑ１１、ＣＳＮＱ１１Ｑ１１、ＣＯＯＱ１１、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、１，３−オキサゾール−２−イル、１，３−チアゾール−２−イルまたはイミダゾール−２−イル（この場合のアルキルは、非置換であるか、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシおよびＣ１〜３アルコキシから独立して選択される１から３個の基で置換されている。）
である。）
の塩基；
式：
Figure 0006104845
 （式中、
Ｔ１およびＴ２は、Ｎ、ＣＨまたはＣ−Ｑ１６から独立して選択され；
Ｑ１６、ＵおよびＹは、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、シクロアルキル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＯＲ４、ＮＲ４Ｒ５またはＳＲ５、Ｂｒ−ビニル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｏ−アシル、−Ｏ−シクロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ−ジアルキル、ＮＨ−アシル、Ｎ−アリール、Ｎ−アラルキル、ＮＨ−シクロアルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、Ｓ−アシル、Ｓ−アリール、Ｓ−シクロアルキル、Ｓ−アラルキル、ＣＮ、Ｎ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯ２−アルキル、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ−ジアルキル、ＯＨ、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、（ＣＨ２）ｍＯＨ、（ＣＨ２）ｍＮＨ２、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、（ＣＨ２）ｍＣＮ、（ＣＨ２）ｍＮＯ２、（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ２、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ、Ｃ３−６シクロアルキルアミノ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、（Ｃ１−４アルキル）０−２アミノメチルまたは−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５は、水素、アシル（低級アシルを含む）またはアルキル（メチル、エチル、プロピルおよびシクロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない）から独立して選択され；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
Ｚは、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｃ＝ＯまたはＮＱ２０であり；
Ｑ２０は、Ｈまたはアルキルであり；および
Ｖ１およびＶ２は、ＣＨまたはＮから独立して選択される。）
の塩基；および
式：
Figure 0006104845
 （式中、
Ｔ３およびＴ４は、ＮまたはＣＱ２２から独立して選択され；
Ｑ２２は、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、シクロアルキル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＯＲ４、ＮＲ４Ｒ５またはＳＲ５、Ｂｒ−ビニル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｏ−アシル、−Ｏ−シクロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ−ジアルキル、ＮＨ−アシル、Ｎ−アリール、Ｎ−アラルキル、ＮＨ−シクロアルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、Ｓ−アシル、Ｓ−アリール、Ｓ−シクロアルキル、Ｓ−アラルキル、ＣＮ、Ｎ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯ２−アルキル、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ−ジアルキル、ＯＨ、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、（ＣＨ２）ｍＯＨ、（ＣＨ２）ｍＮＨ２、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、（ＣＨ２）ｍＣＮ、（ＣＨ２）ｍＮＯ２、（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ２、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ、Ｃ３−６シクロアルキルアミノ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、（Ｃ１−４アルキル）０−２アミノメチルまたは−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択され；
Ｔ５は、ＮＨであり；
Ｒ４およびＲ５は、水素、アシル（低級アシルを含む）またはアルキル（メチル、エチル、プロピルおよびシクロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない）から独立して選択され；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１およびＴ１２は、ＮまたはＣＨから独立して選択され；
Ｕ２は、Ｈ、直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＯＲ４、ＮＲ４Ｒ５またはＳＲ５であり；
Ｙ２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲまたはＣＱ２４Ｑ２６（ここにおいて、Ｒは、Ｈ、ＯＨまたはアルキルである）であり；
Ｑ２４およびＱ２６は、Ｈ、アルキル、直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＯＲ４、ＮＲ４Ｒ５またはＳＲ５から独立して選択される。）
の塩基。
プリン塩基のさらなる例には、グアニン、アデニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６−クロロプリンおよび６−Ｎ−メチルアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基上の酸素および窒素官能基は、必要な場合、または所望される場合には保護することができる。適する保護基は当業者によく知られており、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルおよびｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基およびアシル基（アセチルおよびプロピオニルなど）、メタンスルホニルならびにｐ−トルエンスルホニルが挙げられる。
用語「アシル」または「Ｏ−結合エステル」は、式Ｃ（Ｏ）Ｒ’の基を指し、この式中のＲ’は、直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル（低級アルキルを含む）、アミノ酸、アリール（フェニルを含む）、アルカリール、アラルキル（ベンジルを含む）、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）、アリールオキシアルキル（フェノキシメチルなど）；または置換アルキル（低級アルキルを含む）、アリール（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、Ｃ１からＣ４アルキルまたはＣ１からＣ４アルコキシで場合により置換されているフェニルを含む）、スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアラルキルスルホニルなど）、一、二もしくは三リン酸エステル、トリチルもしくはモノメトキシトリチル、置換ベンジル、アルカリール、アラルキル（ベンジルを含む）、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）、アリールオキシアルキル（フェノキシメチルなど）である。前記エステル中のアリール基は、最適にはフェニル基を含む。特に、アシル基には、アセチル、トリフルオロアセチル、メチルアセチル、シクロプロピルアセチル、プリピオニル、ブチリル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ネオ−ヘプタノイル、フェニルアセチル、２−アセトキシ−２−フェニルアセチル、ジフェニルアセチル、α−メトキシ−α−トリフルオロメチル−フェニルアセチル、ブロモアセチル、２−ニトロ−ベンゼンアセチル、４−クロロ−ベンゼンアセチル、２−クロロ−２，２−ジフェニルアセチル、２−クロロ−２−フェニルアセチル、トリメチルアセチル、クロロジフルオロアセチル、過フルオロアセチル、フルオロアセチル、ブロモジフルオロアセチル、メトキシアセチル、２−チオフェンアセチル、クロロスルホニルアセチル、３−メトキシフェニルアセチル、フェノキシアセチル、ｔ−ブチルアセチル、トリクロロアセチル、モノクロロ−アセチル、ジクロロアセチル、７Ｈ−ドデカフルオロ−ヘプタノイル、過フルオロ−ヘプタノイル、７Ｈ−ドデカ−フルオロヘプタノイル、７−クロロドデカフルオロ−ヘプタノイル、７−クロロ−ドデカフルオロ−ヘプタノイル、７Ｈ−ドデカフルオロヘプタノイル、７Ｈ−ドデカフルオロ−ヘプタノイル、ノナ−フルオロ−３，６−ジオキサ−ヘプタノイル、ノナフルオロ−３，６−ジオキサヘプタノイル、過フルオロヘプタノイル、メトキシベンゾイル、メチル３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボキシル、３，６−ジクロロ−２−メトキシ−ベンゾイル、４−（１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシ）−ベンゾイル、２−ブロモ−プロピオニル、オメガ−アミノカプリル、デカノイル、ｎ−ペンタデカノイル、ステアリル、３−シクロペンチル−プロピオニル、１−ベンゼン−カルボキシル、Ｏ−アセチルマンデリル、ピバロイルアセチル、１−アダマンタン−カルボキシル、シクロヘキサン−カルボキシル、２，６−ピリミジンジカルボキシル、シクロプロパン−カルボキシル、シクロブタン−カルボキシル、過フルオロシクロヘキシルカルボキシル、４−メチルベンゾイル、クロロメチルイソオキサゾリルカルボニル、過フルオロシクロヘキシルカルボキシル、クロトニル、１−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボニル、２−プロペニル、イソバレリル、１−ピロリジンカルボニル、４−フェニルベンゾイルが挙げられる。
ここで用いる用語「が実質的に無い」または「が実質的に不在の状態」は、このヌクレオシドの指定のエナンチオマーを少なくとも９５重量％から９８重量％、さらにいっそう好ましくは９９重量％から１００重量％含むヌクレオシド組成物を指す。好ましい実施態様において、本発明の方法および化合物における化合物は、複数のエナンチオマーが実質的に無い。
同様に、用語「単離された」は、このヌクレオシドを少なくとも９５重量％から９８重量％、さらにいっそう好ましくは９９重量％から１００重量％含み、残りは他の化学種またはエナンチオマーを含むヌクレオシド組成物を指す。
ここで用いる用語「宿主」は、細胞系および動物、好ましくはヒトを含む、ウイルスが複製できる単細胞または多細胞生物を指す。また、宿主は、複製または機能を本発明の化合物によって修飾することができるフラビウイルス科ウイルスの一部を保有しているのもであってもよい。用語「宿主」は、感染細胞、フラビウイルス科ウイルスゲノムのすべてまたは一部でトランスフェクトされた細胞、ならびに動物、特に霊長類（チンパンジーを含む）およびヒトを指す。本発明の大部分の動物適用では、宿主は、ヒト患者である。しかし、一定の適応症における獣医学的適用は、本発明により明確に予想される（チンパンジーなど）。
ＩＩ．２’−分枝ヌクレオシドおよびこれらのプロドラッグ
最も広い実施態様において、本発明は、２’−分枝ヌクレオシドに対して耐性であるフラビウイルス科ウイルス感染の治療方法を提供する。一つの実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、プリンまたはプリン誘導体（ピロロ−プリンなど）である。好ましい実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、ピリミジンである。他の副次的実施態様には、２’−分枝ウラシルおよび２’−分枝シトシンヌクレオシドを含む、２’−アルキルおよび２’−メチル分枝ピリミジンヌクレオシドが挙げられる。もう一つの実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、プリンである。他の副次的実施態様には、２’−分枝アデノシンヌクレオシドおよび２’−分枝６−Ｎ−メチルアミノプリンヌクレオシドを含む、２’−アルキルおよび２’−メチル分枝プリンヌクレオシドが挙げられる。
特定の実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドの代表は、式：
Figure 0006104845
 （式中、Ｒ３は、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ３がＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基である。）
によって表される化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣである。
もう一つの特定の実施態様において、前記２’−分枝プリンヌクレオシドの代表は、式：
Figure 0006104845
 （式中、Ｒ３は、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ３がＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基である。）
によって表される化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボ−６−Ｎ−メチルアミノプリンである。
本発明の一つの実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ４は、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２であり；および
塩基は、本明細書でさらに説明するようなプリンまたはピリミジンである。）
ものまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩である。
本発明のもう一つの実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
塩基は、本明細書で定義するようなプリンまたはピリミジン塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩を含む）；直鎖、分枝鎖または環状アルキル（低級アルキルを含む）；アシル（低級アシルを含む）；ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ６は、アルキル（低級アルキルおよびハロゲン化アルキルを含む）、ＣＨ３、ＣＦ３、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、２−Ｂｒ−エチル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、ＣＦ３、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；および
Ｒ７は、水素、ＯＲ３、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、ハロ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり、および
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＣＨ２であり、
塩基は、本明細書でさらに説明するようなプリンまたはピリミジンである。）
のものまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／または塩である。
本発明のさらにもう一つの実施態様において、前記２’−分枝ヌクレオシドは、一般式：
Figure 0006104845
 （式中、
塩基は、本明細書で定義するようなプリンまたはピリミジン塩基であり；
Ｒ６は、アルキル（低級アルキルおよびハロゲン化アルキルを含む）、ＣＨ３、ＣＦ３、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、２−Ｂｒ−エチル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、ＣＦ３、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；
Ｒ７は、ＯＲ２、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、ハロ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり、
Ｒ９は、水素、ＯＲ３、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、塩素、臭素、ヨウ素、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−Ｎ（アシル）２であり；
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル（低級アルキルを含む）、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩を含む）；直鎖、分枝鎖または環状アルキル（低級アルキルを含む）；アシル（低級アシルを含む）；ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＣＯ−アルコキシアルキル、ＣＯ−アリールオキシアルキル、ＣＯ−置換アリール、スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＣＨ２である。）
のものである。
２’−分枝ヌクレオシドの一般合成
１．適切に修飾された糖を用いる核酸塩基のグリコシル化
この方法の重要な出発原料は、適切な脱離基（ＬＧ）、例えばアシル基またはクロロ、ブロモ、フルオロもしくはヨードで適切に置換された、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する糖であり得る。前記糖は、購入することができ、または標準的なエピマー化、置換、酸化および還元法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。次に、この置換された糖を、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−修飾糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー（Ｍｅｅｒｗｉｎ−Ｐｏｎｄｏｒｆ−Ｖｅｒｌｅｙ）試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次に、適切な非プロトン溶媒を用い、適温で、グリニャール試薬、有機リチウム、リチウムジアルキル銅、またはＴＢＡＦ中のＲ４−ＳｉＭｅ３（この場合のＲ４は、下で定義する）などの有機金属炭素求核試薬をこのケトンとカップリングさせることにより、２’−アルキル化糖が生じる。このアルキル化糖は、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、この場合により保護された糖を、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９４のよって教示されているような当業者に周知の方法によって、塩基にカップリングさせることができる。例えば、適切な溶媒中、適温で、四塩化スズ、四塩化チタンまたはトリメチルシリルトリフレートなどのルイス酸を用いて、アシル化糖をシリル化塩基にカップリングさせることができる。また、トリメチルシリルトリフレートの存在で、ハロ−糖をシリル化塩基にカップリングさせることができる。
次いで、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、このヌクレオシドを脱保護することができる。
特定の実施態様では、２’−Ｃ−分枝リボヌクレオシドが望ましい。リボヌクレオシドの合成を図式１に示す。また、デオキシリボヌクレオシドを使用することができる。これらのヌクレオシドを得るために、生成リボヌクレオシドを、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法により、場合により保護し、そして、この２’−ＯＨを適する還元剤で還元することができる。場合により、この２’−ヒドロキシルを活性化して、還元を助長することができる。すなわち、バートン還元にて。
Figure 0006104845
 （図式中、
ＬＧは、脱離基であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上でフェニル基が場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２である。）。
２．既成ヌクレオシドの修飾
この方法のための重要な出発原料は、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する適切に置換されたヌクレオシドであり得る。前記ヌクレオシドは、購入することができ、または標準的なカップリング法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。前記ヌクレオシドは、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１におより教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、この適切に保護されたヌクレオシドを、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−修飾糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次いで、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１において教示されているような当業者に周知の方法によって、このヌクレオシドを脱保護することができる。
特定の実施態様では、２’−Ｃ−分枝リボヌクレオシドが望ましい。リボヌクレオシドの合成を図式２に示す。また、デオキシリボヌクレオシドを使用することができる。これらのヌクレオシドを得るために、生成リボヌクレオシドを、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって場合により保護し、次に、２’−ＯＨを適する還元剤で還元することができる。場合により、この２’−ヒドロキシルを活性化して、還元を助長することができる。すなわち、バートン還元にて。
Figure 0006104845
 （図式中、
Ｒ１およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上でフェニル基が場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２である。）。
２’−分枝ピリミジンヌクレオシドの一般合成
１．適切に修飾された糖を用いるピリミジンのグリコシル化
２’−分枝ピリミジンヌクレオシドの一般的な調製方法の代表を図式３で概説する。この図式は、β−Ｄ−リボ構造の２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを説明するものである。また、当業者は、この一般図式を変形して、２’−β−Ｌ−分枝ピリミジンヌクレオシドを生産することができる。この方法のための重要な出発原料は、適切な脱離基（ＬＧ）、例えばアシル基またはクロロ、ブロモ、フルオロもしくはヨードで適切に置換された、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する糖であり得る。前記糖は、購入することができ、または標準的なエピマー化、置換、酸化および還元法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。次に、この置換された糖を、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−変性糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー（Ｍｅｅｒｗｉｎ−Ｐｏｎｄｏｒｆ−Ｖｅｒｌｅｙ）試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次に、適切な非プロトン溶媒を用い、適温で、グリニャール試薬、有機リチウム、リチウムジアルキル銅、またはＴＢＡＦ中のＲ４−ＳｉＭｅ３などの有機金属炭素求核試薬をこのケトンとカップリングさせることにより、２’−アルキル化糖を生じる。このアルキル化糖は、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、場合により保護された糖を、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９４のよって教示されているような当業者に周知の方法によって、ピリミジン塩基にカップリングさせることができる。例えば、適切な溶媒中、適温で、四塩化スズ、四塩化チタンまたはトリメチルシリルトリフレートなどのルイス酸を用いて、アシル化糖をシチジンなどのシリル化ピリミジンにカップリングさせることができる。また、トリメチルシリルトリフレートを用いて、ハロ−糖をシチジンなどのシリル化ピリミジンにカップリングさせることができる。
Figure 0006104845
 （図式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；フェニル基が本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上で場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２である。）。
２．既成２’−分枝ピリミジンヌクレオシドの修飾
この方法のための重要な出発原料は、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する適切に置換された２’−分枝ピリミジンヌクレオシドであり得る。前記２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、購入することができ、または標準的なカップリング法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。前記２’−分枝ピリミジンヌクレオシドは、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、この適切に保護された２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−修飾糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次いで、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、この２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを脱保護することができる。
特定の実施態様では、２’−Ｃ−分枝リボヌクレオシドが望ましい。リボヌクレオシドの合成を図式４に示す。また、デオキシリボヌクレオシドを使用することができる。これらのヌクレオシドを得るために、生成リボヌクレオシドを、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって場合により保護し、次に、この２’−ＯＨを適する還元剤で還元することができる。場合により、この２’−ヒドロキシルを活性化して、還元を助長することができる。すなわち、バートン還元にて。
Figure 0006104845
 （図式中、
Ｒ１およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上でフェニル基が場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基であり；ならびに
Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、アルキル（低級アルキルを含む）、アジド、シアノ、アルケニル、アルキニル、Ｂｒ−ビニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アシル）、−Ｏ（低級アシル）、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（アルケニル）、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、ＮＯ２、ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−ＮＨ（アシル）、−Ｎ（低級アルキル）２または−Ｎ（アシル）２である。）。
２’−分枝プリンヌクレオシドの一般合成
１．適切に修飾された糖を用いるピリミジンのグリコシル化
２’−分枝プリンヌクレオシドの一般的な調製方法の代表を下の図式５で概説する。この図式は、β−Ｄ−リボ構造の２’−分枝プリンヌクレオシドの合成を説明するものである。また、適切な出発原料を使用してβ−Ｌ−リボ構造を作成できることは、当業者に十分理解される。出発原料は、構造式（ｉ）の３，５−ビス保護アルキルフラノシド（メチルフラノシドなど）である。次に、このＣ−２ヒドロキシル基を、三酸化クロムもしくはクロメート試薬またはデス−マーチンペルヨージナンなどの適する酸化剤で、またはスウェルン酸化によって酸化して、構造式（ｉｉ）のＣ−２ケトンを得る。テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどの適する有機溶媒中、ハロゲン化アルキル、アルケニルもしくはアルキニルマグネシウム（例えば、ＭｅＭｇＢｒ、ＥｔＭｇＢｒ、ビニルＭｇＢｒ、アリルＭｇＢｒおよびエチニルＭｇＢｒ）またはアルキル、アルケニルもしくはアルキニルリチウム（ＭｅＬｉなど）のグリニャール試薬を、（ｉｉ）のカルボニル二重結合を横切って付加させることによって、構造式（ｉｉｉ）のＣ−２第三アルコールが生じる。次に、酢酸中の臭化水素などの適する有機溶媒中のハロゲン化水素での式（ｉｉｉ）のフラノシドの処理により、良好な脱離基（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩなど）をこのフラノース糖誘導体のＣ−１（アノマー）位置に導入して、中間体ハロゲン化フラノシル（ｉｖ）を得る。メタンスルホネート（ＭｅＳＯ２Ｏ−）、トリフルオロメタンスルホネート（ＣＦ３ＳＯ２Ｏ−）またはｐ−トルエンスルホネート（−ＯＴｓ）などのＣ−スルホネートも、グリコシド（ヌクレオシド）結合を発生させるための後続反応において有用な脱離基として役立つ。ヌクレオシド結合は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１−メチル−２−ピロリジノンまたはＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）などの適する無水有機溶媒中、アルカリ水素化物（水素化ナトリウムなど）、アルカリ水酸化物（水酸化カリウムなど）、アルカリ炭酸塩（炭酸カリウムなど）またはアルカリヘキサメチルジシラジド（ＮａＨＭＤＳなど）で処理することによりインサイチュで発生させることができる、適切に置換された４−ハロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンなどの適切に置換された１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ｖ）の金属塩（リチウム、ナトリウムまたはカリウムなど）で、構造式（ｉｖ）の中間体を処理することによって、作ることができる。置換反応は、二相系（固−液または液−液）でのＴＤＡ−１または塩化トリエチルベンジルアンモニウムなどの相転移触媒を用いることにより、触媒することができる。次に、構造式（ｖｉ）の保護ヌクレオシドにおける任意の保護基は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ’ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，Ｐ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９に記載されているものなどの確立された脱保護方法論に従って切断することができる。Ｃ−４位に第一アミン（−ＮＨ２）を生じさせるためにアンモニアアルコール溶液もしくは液体アンモニアなどの適切なアミンで、第二アミン（−ＮＨＲ）を生じさせるためにアルキルアミンで、または第三アミン（−ＮＲＲ’）を生じさせるためにジアルキルアミンで４−ハロ中間体（ｖｉ）を処理することにより、前記ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン核の４位にアミノ酸を場合により導入することができる。７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）オン化合物は、水酸化ナトリウム水溶液などの塩基水溶液での（ｖｉ）の加水分解よって誘導することができる。１−６のアルコール分解（メタノール分解）によってＣ−４アルコキシド（−ＯＲ）が生じ、これに対してアルキルメルカプチドでの処理によってＣ−４アルキルチオ（−ＳＲ）誘導体が生じる。本発明の所望の化合物を得るために、有機／薬品化学技術分野の通常の技術者に周知の後続の化学操作が必要となる場合もある。
Figure 0006104845
 （図式中、
Ｐ１およびＰ２は、独立して保護基であるか、あるいはＰ１とＰ２が一緒になって、環状保護基を形成し；
Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキル基であり；
Ｍは、Ｌｉ、ＮａまたはＫであり；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｒ７、Ｒ８およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたはアルキルである。）。
β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの合成
Figure 0006104845
提供する下記の合成は、化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣを得るための非限定的な段階である。通常の当業者は、公知のあらゆる方法でこの合成を変形して、化合物β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣを得ることができる。
１．適切に修飾された糖を用いる核酸塩基のグリコシル化
この方法の重要な出発原料は、適切な脱離基（ＬＧ）、例えばアシル基またはクロロ、ブロモ、フルオロもしくはヨードで適切に置換された、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する糖であり得る。前記糖は、購入することができ、または標準的なエピマー化、置換、酸化および還元法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。次に、この置換された糖を、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−変性糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー（Ｍｅｅｒｗｉｎ−Ｐｏｎｄｏｒｆ−Ｖｅｒｌｅｙ）試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次に、適切な非プロトン溶媒を用い、適温で、グリニャール試薬、有機リチウム、リチウムジアルキル銅、またはＴＢＡＦ中のＣＨ３−ＳｉＭｅ３などの有機金属炭素求核試薬をこのケトンとカップリングさせることにより、２’−メチルアルキル化糖が生じる。このメチル糖は、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、この場合により保護された糖を、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９４により教示されているような当業者に周知の方法によって、塩基にカップリングさせることができる。例えば、適切な溶媒中、適温で、四塩化スズ、四塩化チタンまたはトリメチルシリルトリフレートなどのルイス酸を用いて、アシル化糖をシリル化塩基にカップリングさせることができる。また、トリメチルシリルトリフレートの存在で、ハロ−糖をシリル化塩基にカップリングさせることができる。
次いで、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によってこの２’−メチル−ヌクレオシドを脱保護することができる。
２’−メチル−ヌクレオシドの合成を図式６に示す。
Figure 0006104845
 （図式中、
ＧＬは、脱離基であり；および
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上でフェニル基が場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基である。）。
２．既成２’−メチルヌクレオシドの修飾
この方法のための重要な出発原料は、２’−ＯＨおよび２’−Ｈを有する適切に置換された２’−メチル−シチジンヌクレオシドであり得る。前記ヌクレオシドは、購入することができ、または標準的なカップリング法を含む公知のあらゆる手段によって調製することができる。前記ヌクレオシドは、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基で、好ましくはアシルまたはシリル基で、場合により保護することができる。
次に、この適切に保護された２’−メチル−シチジンヌクレオシドを、相溶性溶媒中、適温で、適切な酸化剤を用いて酸化して、２’−メチル糖を得ることができる。可能な酸化剤は、ジョーンズ試薬（クロム酸と硫酸の混合物）、コリンズ試薬（ジピリジンＣｒ（ＶＩ）酸化物）、コーリー試薬（クロロクロム酸ピリジニウム）、二クロム酸ピリジニウム、酸性二クロム酸塩、過マンガン酸カリウム、ＭｎＯ２、四酸化ルテニウム、相転移触媒（クロム酸、またはポリマー支持過マンガン酸塩など）、Ｃｌ２−ピリジン、Ｈ２Ｏ２−モリブデン酸アンモニウム、ＮａＢｒＯ２−ＣＡＮ、ＨＯＡｃ中のＮａＯＣｌ、亜クロム酸銅、酸化銅、ラネーニッケル、酢酸パラジウム、メールウィン−ポンドルフ−ベルリー試薬（アルミニウムｔ−ブトキシドと別のケトン）、およびＮ−ブロモスクシンイミドである。
次いで、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によってこのヌクレオシドを脱保護することができる。
２’−メチル−シチジンヌクレオシドの合成を図式７に示す。
Figure 0006104845
 （図式中、
Ｒ１およびＲ３は、独立して、Ｈ、リン酸塩（一、二または三リン酸塩および安定化リン酸塩プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；スルホン酸エステル（メタンスルホニルを含むアルキルまたはアリールアルキルスルホニルを含む）；本明細書で与えるアリールの定義に記載されているような置換基１個以上でフェニル基が場合により置換されているベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペプチド；コレステロール；またはインビボ投与されたとき、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してＨまたはリン酸塩である化合物をもたらす医薬適合性の脱離基である。）。
医薬適合性のプロドラッグ
本明細書を通して、用語「医薬適合性のプロドラッグおよび／または塩」は、患者に投与するとこの親ヌクレオシド化合物をもたらすヌクレオシド化合物のあらゆる医薬適合性形態（エステル、リン酸エステル、エステルの塩または関連の基など）を説明するために用いる。医薬適合性の塩には、医薬適合性の無機塩基および酸または有機塩基または酸から誘導されたものが挙げられる。適する塩には、製薬技術分野において周知の多数の他の酸の中でも、カリウムおよびナトリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属から誘導されたものが挙げられる。医薬適合性のプロドラッグは、宿主体内で代謝、例えば加水分解されて、本発明の化合物を形成する化合物を指す。プロドラッグの典型的な例には、本活性化合物の官能部分に生体不安定性保護基を有する化合物が挙げられる。プロドラッグには、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化を受けて、本活性化合物をもたらすことができる化合物が挙げられる。本発明の化合物は、フラビウイルス科ウイルスに対して抗ウイルス活性を有するか、こうした活性を示す化合物に代謝される。
アシル化またはヌクレオシドプロドラッグとして投与される２’−分枝ヌクレオシド（β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ピリミジンヌクレオシドを含む）または関連化合物は、併用または交代療法において使用することができる。
本明細書に記載するヌクレオシドのいずれかまたはヒドロキシルもしくはアミン官能基を有する他の化合物をヌクレオシドプロドラッグとして投与して、このヌクレオシドの活性、バイオアベイラビリティ、安定性を増大させる、またはこのヌクレオシドの特性を別様に変化させることができる。多数のヌクレオシドプロドラッグリガンドが公知である。一般に、化合物のヒドロキシル基の、またはヌクレオシドの一、二もしくは三リン酸塩のアルキル化、アシル化または他の親油性修飾は、このヌクレオシドの安定性を増大させる。リン酸塩部分またはヒドロキシルの１つ以上の水素を置換することができる置換基の例には、アルキル、アリール、ステロイド、炭水化物（糖を含む）、１，２−ジアシルグリセロールおよびアルコールが挙げられる。Ｒ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｎ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（１９９５）１−１７に多くが記載されている。これらのうちのいずれかを、本開示ヌクレオシドまたは他の化合物と併用して、所望の効果を達成することができる。
活性ヌクレオシドまたは他のヒドロキシル含有化合物は、次の参考文献に記載されているように、エーテル脂質（および特に、ヌクレオシドについての５’−エーテル脂質）として提供することもできる： Ｋｕｃｅｒａ，Ｌ．Ｓ．，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｅ．Ｌｅａｋｅ，Ａ．Ｒａｂｅｎ，Ｍｏｄｅｓｔ Ｅ． Ｋ．，Ｄ．Ｌ．Ｗ．，ａｎｄ Ｃ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ．１９９０．「感染性ＨＩＶ−１の生産を抑制し、欠陥ウイルスの形成を誘導する新規膜相互作用性エーテル脂質（Ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｅｔｈｅｒ ｌｉｐｉｄ ａｎａｌｏｇｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ−１ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ Ｖｉｒｕｓｅｓ．６：４９１−５０１； Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．，Ｊ．Ｍａｒａｓｃｏ Ｃ．Ｊ．，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋｅ，Ｋ．Ｌ．Ｍｅｙｅｒ，Ｆ．Ｇｕｍｕｓ，Ｊ．Ｒ．Ｓｕｒｌｅｓ，Ｋ．Ｓ．Ｉｓｈａｑ，Ｌ．Ｓ．Ｋｕｃｅｒａ，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｗａｌｌｅｎ，Ｓ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，ａｎｄ Ｅ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔ．１９９１．「新規エーテル脂質ヌクレオシドコンジュゲートの合成およびこの抗ＨＩＶ活性についての評価（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｅｔｈｅｒ ｌｉｐｉｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」，Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：１４０８．１４１４； Ｈｏｓｔｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ａ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｔ．ｖａｎ Ｗｉｊｋ，ａｎｄ Ｈ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ．１９９２．「３’−デオキシチミジンの脂質プロドラッグである３’−デオキシチミジン二リン酸ジミリストイルグリセロールによる、ＣＥＭおよびＨＴ４−６Ｃ細胞における１型ヒト免疫不全ウイルスの複製阻害の大いなる向上（Ｇｒｅａｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＥＭ ａｎｄ ＨＴ４−６Ｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ３’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， ａ ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ３，−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）」，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：２０２５．２０２９； Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｂ．Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｈ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ，ａｎｄ Ｄ． Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，１９９０．「アジドチミジンおよび他の抗ウイルスヌクレオシドのリン脂質誘導体の合成および抗レトロウイルス活性（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６１１２７。ヌクレオシドまたは他のヒドロキシルもしくはアミン含有化合物に、好ましくはこのヌクレオシドまたは親油性調製物の５’−ＯＨ位に共有結合で組み込むことができる、適する親油性置換基を開示している米国特許の非限定的な例には、次のものが挙げられる： 米国特許第 ５，１４９，７９４号（１９９２年９月２２日、Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，１９４，６５４号（１９９３年３月１６日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，２２３，２６３号（１９９３年６月２９日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，２５６，６４１号（１９９３年１０月２６日、Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，４１１，９４７号（１９９５年５月２日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，４６３，０９２号（１９９５年１０月３１日、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，５４３，３８９号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，５４３，３９０号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，５４３，３９１号（１９９６年８月６日、Ｙａｔｖｉｎら）、および同第５，５５４，７２８号（１９９６年９月１０日、Ｂａｓａｖａら）。これらの特許はすべて、本明細書に参考として援用されている。本発明のヌクレオシド、または親油性調製物に結合することができる親油性置換基を開示している外国特許出願には、次のものが挙げられる： 国際公開公報第８９／０２７３３号、同第９０／００５５５号、同第９１／１６９２０号、同第９１／１８９１４号、同第９３／００９１０号、同第９４／２６２７３号および同第９６／１５１３２号、欧州特許第０ ３５０ ２８７号および同第９３９１７０５４．４号、ならびに国際公開公報第９１／１９７２１号。
２’−分枝β−Ｄ−ヌクレオシドの２’、３’および５’−プロドラッグ、またはこれらの医薬適合性の塩、またはこれらの化合物を含有する医薬適合性の調合物は、フラビウイルス科ウイルス感染の治療に使用することができる。具体的には、フラビウイルス科ウイルス感染の治療のために、式：
Figure 0006104845
 によって表されるβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’−バリンエステルプロドラッグまたはその医薬適合性の塩を被験者に投与することができる。
一つの実施態様において、２’−分枝β−Ｄヌクレオシド２’−プロドラッグは、２’および／または５’位に生体分解性部分を含む。好ましい部分は、ＤまたはＬ−バリルを含む天然または合成ＤまたはＬアミノ酸エステルであり、好ましくは、Ｌ−バリルなどのＬ−アミノ酸エステル、およびアセチルを含むアルキルエステルである。従って、具体的に、本発明は、いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’−ＤまたはＬ−アミノ酸エステルおよび２’，５’−ＤまたはＬ−アミノ酸エステル、好ましくはＬ−アミノ酸エステル（ここにおいて、その親薬物は、１５マイクロモル濃度未満、さらにいっそう好ましくは１０マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する）； いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’−（アルキルもしくはアリール）エステルまたは２’，５’−ジ（アルキルもしくはアリール）エステル（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）； ならびに（ｉ）２’エステルが、天然または合成ＤまたはＬアミノ酸エステルであり、好ましくはＬ−アミノ酸エステルであり、および５’−エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；（ｉｉ）両方のエステルが、独立して、天然または合成ＤまたはＬ−アミノ酸エステルであり、好ましくは両方ともＬ−アミノ酸エステルであり；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルである；ならびに（ｉｖ）２’エステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルであり、および５’−エステルが、天然または合成ＤまたはＬ−アミノ酸エステルであり、好ましくはＬ−アミノ酸エステルである、２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’，５’−ジエステルのプロドラッグ（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する）を包含する。
本発明の範囲に入るプロドラッグの例は、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの２’−ＤまたはＬ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロシチジンの２’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの２’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの２’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’−アセチルエステル；およびβ−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロシチジン、ウリジンもしくはチミジン）の２’−エステルまたはβ−Ｄ−２’−メチル−シチジンもしくはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の２’−エステル（ここにおいて、（ｉ）２’エステルは、アミノ酸エステルであるか、（ｉｉ）２’エステルは、アルキルもしくはアリールエステルである。）である。
本発明の範囲に入るプロドラッグの追加例は、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン（ジバリル−２’，６−ジＭｅ−Ｌ−ｄＣ）；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの２’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの２’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’，５’−ジアセチルエステル；ならびに（ｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’−エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである、（ｉｉ）両方のエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルもしくはアリールエステルである；または（ｉｖ）２’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、５’−エステルが、アミノ酸エステルである、β−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロ−シチジン、ウリジンもしくはチミジン）の２’，５’−ジエステルまたはβ−Ｄ−２’−メチルシチジンもしくはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の２’，５’−ジエステルである。
もう一つの実施態様において、２’−分枝β−Ｄヌクレオシド３’−プロドラッグは、３’および／または５’位に生体分解性部分を含む。好ましい部分は、バリンなどの天然または合成ＤまたはＬアミノ酸エステルであるが、好ましくは、Ｌ−バリンなどのＬ−アミノ酸、およびアセチルを含むアルキルエステルである。従って、具体的に、本発明は、いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの３’−Ｌ−アミノ酸エステルおよび３’，５’−ＤまたはＬ−ジアミノ酸エステル（ここにおいて、その親薬物は、１５マイクロモル濃度未満、さらにいっそう好ましくは１０マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）； いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの３’−（アルキルもしくはアリール）エステルまたは３’，５’−Ｌ−ジ（アルキルもしくはアリール）エステル（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）； ならびに（ｉ）３’エステルが、天然または合成ＤまたはＬアミノ酸エステルであり、５’−エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；（ｉｉ）両方のエステルが、天然または合成ＤまたはＬ−アミノ酸エステルである；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルである；ならびに（ｉｖ）３’エステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルであり、および５’−エステルが、天然または合成ＤまたはＬ−アミノ酸エステルである、２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの３’，５’−ジエステルのプロドラッグ（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）を包含する。
本発明の範囲に入るプロドラッグの例は、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの３’−ＤまたはＬ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの３’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの３’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの３’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロシチジンの３’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの３’−Ｌ−バリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの３’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの３’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの３’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの３’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの３’−アセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの３’−アセチルエステル；および（ｉ）３’エステルがアミノ酸エステルであるか、（ｉｉ）３’エステルがアルキルもしくはアリールエステルである、β−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロシチジン、ウリジンもしくはチミジン）の３’−エステルまたはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の３’−エステルである。
本発明の範囲に入るプロドラッグの追加例は、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン（ジバル−２’，６−ジＭｅ−Ｌ−ｄＣ）；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの３’，５’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの３’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの３’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの３’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの３’，５’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの３’，５’−ジアセチルエステル；ならびに（ｉ）３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’−エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである、（ｉｉ）両方のエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルもしくはアリールエステルである；または（ｉｖ）３’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、５’−エステルが、アミノ酸エステルである、β−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロ−シチジン、ウリジンもしくはチミジン）の３’，５’−ジエステルまたはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の３’，５’−ジエステルである。
もう一つの実施態様において、２’−分枝β−Ｄヌクレオシドのプロドラッグは、２’、３’および／または５’位に生体分解性部分を含む。好ましい部分は、ＤまたはＬ−バリンを含む天然または合成ＤまたはＬアミノ酸エステルであるが、好ましくは、Ｌ−バリンなどのＬ−アミノ酸エステル、およびアセチルを含むアルキルエステルである。従って、具体的に、本発明は、いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシド、好ましくはＬ−アミノ酸の２’，３’−ＬまたはＤ−ジアミノ酸エステルおよび２’，３’，５’−ＬまたはＤ−トリアミノ酸エステル（ここにおいて、その親薬物は、１５マイクロモル濃度未満、さらにいっそう好ましくは１０マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）； いずれかの望ましいプリンまたはピリミジン塩基を有する２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’，３’−ジ（アルキルもしくはアリール）エステルまたは２’，３’，５’−Ｌ−トリ（アルキルもしくはアリール）エステル（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）； ならびに（ｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’−エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；（ｉｉ）両方のエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルである；ならびに（ｉｖ）２’エステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルであり、３’−エステルが、アミノ酸エステルである、２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’，３’−ジエステルのプロドラッグ（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）を包含する。さらに、（ｉ）３つすべてのエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉ）３つすべてのエステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルである；（ｉｉｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；（ｖｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、５’エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；（ｖ）２’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、３’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである；（ｖｉ）２’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである；（ｖｉｉ）２’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アルキルまたはアリールエステルである；ならびに（ｖｉｉｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アルキルまたはアリールエステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである、２’−分枝β−Ｄまたはβ−Ｌヌクレオシドの２’，３’，５’−トリエステル（ここにおいて、その親薬物は、１０または１５マイクロモル濃度未満のＥＣ５０を場合により有する。）。
本発明の範囲に入るプロドラッグの例には、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン（ジバル−２’，６−ジＭｅ−Ｌ−ｄＣ）；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロシチジンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの２’，３’−Ｌ−ジバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの２’，３’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，３’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，３’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの２’，３’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，３’−ジアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’，３’−ジアセチルエステル；ならびに（ｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである；（ｉｉ）両方のエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉｉ）両方のエステルが、独立してアルキルまたはアリールエステルである；または（ｉｖ）２’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルである、β−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロシチジン、ウリジンもしくはチミジン）の２’，３’−ジエステルまたはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の２’，３’−ジエステルが挙げられる。
本発明の範囲に入るプロドラッグの追加例には、β−Ｄ−２’−メチル−シチジンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジン（トリバル−２’，６−ジＭｅ−Ｌ−ｄＣ）；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−ウリジンの２’，３’，５’−Ｌ−トリバリンエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−シチジンの２’，３’，５’−トリアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−チミジンの２’，３’，５’−トリアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−アデノシンの２’，３’，５’−トリアセチルエステル；β−Ｄ−２’，８−ジメチル−グアノシンの２’，３’，５’−トリアセチルエステル；β−Ｄ−２’，６−ジメチル−５−フルオロ−シチジンの２’，３’，５’−トリアセチルエステル；ならびに（ｉ）３つすべてのエステルが、アミノ酸エステルである；（ｉｉ）３つすべてのエステルが、独立してアルキルもしくはアリールエステルである；（ｉｉｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである；（ｉｖ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、５’−エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである；（ｖ）２’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、３’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである；（ｖｉ）２’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである；（ｖｉｉ）２’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、３’エステルが、アミノ酸エステルであり、５’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルである；および（ｖｉｉｉ）２’エステルが、アミノ酸エステルであり、３’エステルが、アルキルもしくはアリールエステルであり、５’エステルが、アミノ酸エステルである、β−Ｄ−２’，６−ジメチル−（シチジン、５−フルオロ−シチジン、ウリジンもしくはチミジン）の２’，３’，５’−トリエステルまたはβ−Ｄ−２’，８−ジメチル−（グアノシン、アデノシンもしくはイノシン）の２’，３’，５’−トリエステルが挙げられる。
本発明の範囲に入るプロドラッグのさらなる例には、米国特許第６，２８４，７４８号および同第６，３１２，６６２号に開示されているプロドラッグが挙げられる。特に、本発明のプロドラッグには、構造：
Figure 0006104845
 （式中、
Ｖ、ＷおよびＷ’は、−−Ｈ、アルキル、アラルキル、脂環式の基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、１−アルケニルおよび１−アルキニルから成る群より独立して選択され；または
ＶおよびＺは、追加の原子３から５個を介して互いに連結して、リンに結合している両方のＯ基からの３個の原子である炭素原子に結合しているヒドロキシ、アシルオキシ、アルコキシカルボニルオキシまたはアリールオキシカルボニルオキシで置換されている、５から７個の原子を有する、場合により１個のヘテロ原子を含有する環状の基を形成し；または
ＶおよびＺは、追加の原子３から５個を介して互いに連結して、リンに結合しているＯに対してベータおよびガンマ位でアリール基に融合している、場合によりヘテロ原子１個を含有する環状の基を形成する；または
ＶおよびＷは、追加の原子３個を介して互いに連結して、炭素原子６個を含有する、ならびにリンに結合しているＯからの３個の原子である炭素原子のうちの１個に結合するヒドロキシ、アシルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アルキルチオカルボニルオキシおよびアリールオキシカルボニルオキシから成る群より選択された１個の置換基で置換される、場合により置換されている環状の基を形成し；または
ＺおよびＷは、追加の原子３から５個を介して互いに連結して、１個のヘテロ原子を場合により含有する環状の基を形成し、およびＶは、アリール、置換アリール、ヘテロアリールもしくは置換へテロアリールでなければならず；
ＷおよびＷ’は、追加の原子２から５個を介して互いに連結して、０から２個のヘテロ原子を場合により含有する環状の基を形成し、およびＶは、アリール、置換アリール、ヘテロアリールもしくはへテロアリールでなければならず；
Ｚは、−ＣＨＲ２ＯＨ、−ＣＨＲ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−ＣＨＲ２ＯＣ（Ｓ）Ｒ３、−ＣＨＲ２ＯＣ（Ｓ）ＯＲ３、−ＣＨＲ２ＯＣ（Ｏ）ＳＲ３、−ＣＨＲ２ＯＣＯ２Ｒ３、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−ＣＨＲ２Ｎ３、−ＣＨ２アリール、−ＣＨ（アリール）ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ＝ＣＲ２ ２）ＯＨ、−ＣＨ（Ｃ≡ＣＲ２）ＯＨ、−Ｒ２、−ＮＲ２ ２、−ＯＣＯＲ３、−ＯＣＯ２Ｒ３、−ＳＣＯＲ３、−ＳＣＯ２Ｒ３、−ＮＨＣＯＲ２、−ＮＨＣＯ２Ｒ３、−ＣＨ２ＮＨアリール、−（ＣＨ２）ｐ−ＯＲ１２および−（ＣＨ２）ｐ−ＳＲ１２から成る群より選択され；
ｐは、整数２または３であり；
Ｒ２は、Ｒ．ｓｕｐ．３および−−Ｈから成る群より選択され；
Ｒ３は、アルキル、アリール、脂環式の基およびアラルキルから成る群より選択され；
Ｒ１２は、−−Ｈおよび低級アシルから成る群より選択され；
Ｍは、２’−分枝ヌクレオシドであるＰＯ３ ２−、Ｐ２Ｏ６ ３−またはＰ３Ｏ９ ４−に結合している基から選択され、および炭素、酸素、硫黄または窒素原子を介してリンに結合している。）
の化合物が挙げられる。
１つの非限定的な例において、プロドラッグは、下記化合物におけるがごとくヌクレオシドに結合している：
Figure 0006104845
２’および／または３’−プロドラッグの一般合成
この方法のための重要な出発原料は、適切に置換された２’−分枝ヌクレオシドである。前記２’−分枝ヌクレオシドは、購入することができ、または本明細書で開示する技法を含む公知のいずれかの手段によって調製することができる。前記２’−分枝ヌクレオシドは、Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１により教示されているような当業者に周知の方法によって、適する保護基、好ましくはシリル基で場合により保護することができる。次に、適切なプロトンまたは非プロトン溶媒を用い、適温で、この保護分枝ヌクレオシドを塩化アシルおよび／またはアシル無水物などの適するアシルドナーとカップリングさせて、２’−分枝β−Ｄヌクレオシドの２’および／または３’プロドラッグを得ることができる。また、次に、適切な非プロトン溶媒を用い、適温で、場合により適するカップリング剤を用いて、この保護分枝ヌクレオシドをアルカノール酸および／またはアミノ酸残基などのカルボン酸のような適するアシルとカップリングさせて、２’−分枝β−Ｄヌクレオシドの２’および／または３’プロドラッグを得ることができる。可能なカップリング剤は、トリフェニルホスフィンまたは様々なカルボジイミドを伴うミツノブ試薬（例えば、アゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびアゾジカルボン酸ジエチル）を含む（しかし、これらに限定されない）、カップリングを促進するあらゆる試薬である。
例えば、アセトニトリル−ベンゼン混合物を還流させながら酸塩化物を使用して単純アミノアルコールをエステル化することができる（下の図式８：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７８，８（５），３２７−３３３参照。この文献は、本明細書に参考として援用されている）。また、エステル化は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１（２４），５６６１−５６６４に記載されているように、無水物を使用して達成することができる。
Figure 0006104845
ＩＩＩ．フラビウイルス科ウイルスゲノムにおけるβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ誘発突然変異の検出
一つの実施態様において、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性を同定すること、
（ｉｉｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、１つ以上の薬物の有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法を提供する。
もう一つの実施態様において、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性を同定すること、
（ｉｉｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内の第２８２位におけるセリンからトレオニンなどの別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物の有効量を投与すること
を含む、ＨＣＶに感染している患者を治療するための方法を提供する。
一つの実施態様において、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性を同定すること、
（ｉｉｉ）フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内の第４０５位におけるセリンからトレオニンなどの別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物の有効量を投与すること
を含む、ＢＶＤＶに感染している患者を治療するための方法を提供する。
もう一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性を同定すること、
（ｉｉｉ）インターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法を提供する。
一定の実施態様において、患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性の特定は、ウイルスプラーク成長の表現型分析によって決定することができる。もう一つの実施態様において、患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性の特定は、このウイルスの複製適性によって決定することができる。さらなる実施態様において、患者のβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対するウイルス耐性の特定は、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンの存在を検出することによって決定することができる。
一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者からウイルス培養サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）このサンプルを培養し、このサンプルと野生型ウイルスの間でプラーク成長を比較すること、
（ｉｖ）このサンプルのプラーク成長が、野生型のプラーク成長より小さい（これは、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対する耐性を示す。）かどうか決定すること、
（ｖ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法を含む。
もう一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者からウイルスサンプルを得ること、
（ｉｉｉ）このウイルスの複製適性を決定すること、
（ｉｖ）このサンプルのウイルスの複製適性が、野生型ウイルスの複製適性より低い（これは、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対する耐性を示す。）かどうか決定すること、
（ｖ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対して耐性である患者にインターフェロンの有効量を投与すること
を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法を提供する。
一つの実施態様において、ウイルスプラーク成長および／またはウイルス複製適性は、ウイルスプラークアッセイによって定量することができる。別の実施態様において、感染中心アッセイ、ウイルス誘発性レポーターアッセイ、形質転換アッセイおよび終点希釈アッセイなどの他のアッセイ、またはＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、ウイルス力価を定量することができる（Ｆｌｉｎｔら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ）第２章； Ｗａｇｎｅｒ ＆ Ｈｅｗｌｅｔｔ．Ｂａｓｉｃ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ），Ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ＆ １０）。
プラークアッセイを行って、ウイルスプラーク成長および／またはウイルス複製適性を定量することができる。宿主細胞の単層が入っている培養皿に、ウイルスの希釈溶液を塗布することができる。これらの細胞に半固体層（粘性培地、例えば寒天など）をかぶせて、１つの感染細胞から別の細胞へのウイルスの拡散を防止することができる。インキュベーション後、「プラーク」を識別することができ、この有機懸濁液中の感染ウイルス粒子数を概算することができる。プラークを識別する１つの方法は、単層内の感染細胞中のウイルス抗原を検出するための抗体染色法の使用による。次に、ウイルス特異的抗体に対しての色原体または蛍光標識を用いてこれらの感染細胞を視覚化することができる。プラークは、表現型分析のために観察してもよいし、および／またはカウントしてウイルス力価を決定してもよい。ウイルス力価は、次の方程式：ＴＦＦＵ／ｍＬ＝Ｎｘ５ｘＤ（式中、Ｔは、ウイルス力価（単位：ＦＦＵ／ｍＬ）であり；Ｎは、ウエルあたりのプラーク数であり；Ｄは、対応するウイルスサンプルについての希釈率である）を用いて、病巣形成単位（ＦＦＵ）／ｍＬで計算することができる。（例えば、ウイルスサンプルのうちの１０−５希釈に対応するウエルにおいて１２のプラークが見出された場合には、Ｔ＝１２ｘ５ｘ１０５＝６ｘ１０６ ＰＦＵ／ｍＬ）。次に、被定義宿主環境において感染後代を生産する総合的複製能力であるウイルス複製適性を決定することができる。
本発明のもう一つの側面は、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドＧからＣへの突然変異の存在（第４０５位アミノ酸においてセリンからトレオニンへの突然変異をもたらす）を決定するための方法である。Ｓｅｒ４０５、ＢＶＤＶ推定機能性ＮＳ５Ｂ領域のアミノ酸位置が、ヘパシウイルスゲノム、ペスチウイルスゲノムおよびフラビウイルスゲノムすべての間で高度に保存されていること（図１１； Ｌａｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）が認められているので、突然変異を受ける他のフラビウイルス科ウイルスの推定機能性ＮＳ５ＢドメインＢの対応するセリン残基は、本発明の実施態様に従って検出することができる。例えば、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼドメインのＳｅｒ４０５は、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼドメインのＳｅｒ２８２に対応する。従って、本発明の実施態様は、ＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチド（ＢＶＤＶ ＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドに対応する。）のＧからＣへの突然変異も包含する。
一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスゲノムの区画に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、および次に、このオリゴヌクレオチドがこのウイルス核酸にハイブリダイズするかどうかを決定することを含む、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性を示す突然変異を検出するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、
（ｉ）β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣもしくはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの３’バリンエステルプロドラッグなどのプロドラッグまたはその医薬適合性の塩の有効量を投与すること、
（ｉｉ）この患者の血液をアッセイして、野生型ウイルスから突然変異ウイルスへの血清変換について検査すること、
（ｉｉｉ）インターフェロンの有効量を投与すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスに感染している患者を治療するための方法を提供する。
さらにもう一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むサンプルと、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンまたはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｉｉ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、
（ｉｉｉ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドまたはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへのこのプローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性フラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルをアッセイするための方法を提供する。
さらなる実施態様において、本発明は、
（ｉ）フラビウイルス科ウイルス核酸配列を含むと推測されるサンプルと、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のＳｅｒの位置にＴｈｒがコードされているコドンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｉｉ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、
（ｉｉｉ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のＳｅｒの代わりにＴｈｒを含有する（これは、そのウイルスがインターフェロン治療に対して過敏であることを示す。）と推測されるサンプルをアッセイするための方法を提供する。
もう一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）ＢＶＤＶ核酸配列を含むと推測されるサンプルと、ＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｉｉ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、
（ｉｉｉ）ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンへの前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸におけるセリンまたは第１２１４位ヌクレオチドにおけるシチジンの代わりにＴｈｒを含有する（これは、そのウイルスがインターフェロン治療に対して過敏であることを示す。）と推測されるサンプルをアッセイするための方法を提供する。
もう一つの実施態様において、本発明は、
（ｉ）ＨＣＶ核酸配列を含むと推測されるサンプルと、第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンに相補的な配列を有する検出可能なヌクレオチドプローブとを接触させること、
（ｉｉ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること、
（ｉｉｉ）ＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンへの前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、ＨＣＶゲノムの第２８２位アミノ酸または第８４４３位ヌクレオチドにおいて高度に保存されているＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のＳｅｒの代わりにＴｈｒを含有する（これは、そのウイルスがインターフェロン治療に対して過敏であることを示す。）と推測されるサンプルをアッセイするための方法を提供する。
オリゴヌクレオチドプローブ
フラビウイルス科ウイルスの２’−分枝ピリミジンヌクレオシド誘発突然変異の存在を検出することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。本プローブは、突然変異を含むウイルス核酸配列に相補的である。これらのプローブは、方法およびキットに使用することができる。本オリゴヌクレオチドプローブは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドもしくはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第８４４３位ヌクレオチドにおけるヌクレオチドシチジン、またはフラビウイルス科ウイルスゲノム内のＲＮＡポリメラーゼのドメインＢの保存セリンをコードしているフラビウイルス科ウイルスの他のヌクレオチド（図１１）を検出することができる。
本オリゴヌクレオチドプローブの長さは、好ましくは少なくとも１４ヌクレオチド、好ましい実施態様では、少なくとも１５、２０、２５または３０ヌクレオチドである。長さが約２５または３０ヌクレオチドより長いプローブの使用は、一般には好ましくない。一つの実施態様において、本オリゴヌクレオチドは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるグアニンからシチジンへの塩基変化を特定するように設計することができる。もう一つの実施態様において、本オリゴヌクレオチドプローブは、ＨＣＶの第８４４３位ヌクレオチドにおけるグアニンからシチジンへの塩基変化を特定するように設計することができる。本オリゴヌクレオチドプローブは、突然変異領域が、被ハイブリダイズセグメント内部の区画に位置するか、あるいは被ハイブリダイズセグメントの３’または５’末端いずれかにあることができるように設計することができる。突然変異領域は、十分なハイブリダイゼーションを可能ならしめるように、このプローブの中央付近に位置することが好ましい。
下の表２は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のヌクレオチド第１２１４位（また、ヌクレオチド第１１，１３６位と呼ばれる。参照： ゲンバンク・アクセッション番号ＡＪ１３３７３９；Ｖａｓｓｉｌｅｖ ａｎｄ Ｄｏｎｉｓ（２０００）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ６９（２）９５−１０７）を含むＢＶＤＶヌクレオチド配列の実例となる実施態様を提供するものである。これらの配列を与えれば、通常の技術者は、標準的なアルゴリズムを使用して、下のヌクレオチド配列に相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを構成することができる。相補的対合に関する法則は周知の： シチジン（「Ｃ」）は、グアニン（「Ｇ」）と常に対合し、チミン（「Ｔ」）またはウラシル（「Ｕ」）は、アデニン（「Ａ」）と常に対合する。プローブは、このプローブが十分にハイブリダイズし、診断用ヌクレオチドを識別することができさえすれば、標的核酸配列に１００％相補的である必要はない。ある程度の塩基対ミス対合は、一般に許容され得る。
Figure 0006104845
従って、一つの実施態様において、本オリゴヌクレオチドは、フラビウイルス科ウイルスヌクレオチド配列に対する相補性に関して１、２、３、４、５または６のミス対合を有する。
本発明の他の側面は、フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴにおいてセリンからトレオニンへ変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシド、例えば２’−分枝ピリミジンヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の治療有効量を治療が必要なヒトに投与することによって、フラビウイルス科ウイルス感染を治療する方法を提供する。トレオニンをコードしているコドンＡＣＡ、ＡＣＧまたはＡＣＵを上の表２中のコドンＡＣＣ（太字）の代わりに用いて、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢにおけるトレオニンの存在を検出することができる。
本発明のもう一つの側面は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主において、インターフェロンの治療有効量を投与することによりフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。従って、本発明の別の実施態様においては、例えば、トレオニンをコードしているコドンＡＣＡ、ＡＣＧまたはＡＣＵを上の表２中のコドンＡＣＣ（太字）の代わりに用いて、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位残基におけるトレオニンの存在を検出することができる。
下の表３は、ＨＣＶゲノムのヌクレオチド第８４４３位（ゲンバンク・アクセッション番号ＡＪ２３８７９９； Ｌｏｈｍａｎｎら，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５２５４）１１０−１１３）を含むＨＣＶヌクレオチド配列の例となる実施態様を提供するものである。ＨＣＶゲノムのヌクレオチド第８４４３位は、ＢＶＤＶゲノムのヌクレオチド第１１，１３６位に対応し、またβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣでの治療によって突然変異させられるフラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の保存セリン残基（ＢＶＤＶゲノムのＳｅｒ４０５、これは、ＨＣＶのＳｅｒ２８２に対応する（図１１）。）を表す。上で述べたように、これらの配列を与えられると、通常の技術者は、標準的なアルゴリズムを使用して、下のヌクレオチド配列に相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを構成することができる。
Figure 0006104845
従って、一つの実施態様において、本オリゴヌクレオチドは、フラビウイルス科ウイルスヌクレオチド配列に対する相補性に関して１、２、３、４、５または６のミス対合を有する。
本発明の他の側面は、フラビウイルス科ウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴにおいてセリンからトレオニンへの変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシド、例えば、２’−分枝ピリミジンヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ、またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の治療有効量を治療が必要なヒトに投与することによって、フラビウイルス科ウイルス感染を治療する方法を提供する。前と同様、例えば、トレオニンもコードしているコドンＡＣＡ、ＡＣＧまたはＡＣＵを表３のコドンＡＣＣ（太字）の代わりに用いて、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢにおけるトレオニンの存在を検出することができる。
本発明のもう一つの側面は、ＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主において、インターフェロンの治療有効量を投与することによりフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。例えば、上のように、トレオニンもコードしているコドンＡＣＡ、ＡＣＧまたはＡＣＵを表３のコドンＡＣＣ（太字）の代わりに用いて、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位残基におけるトレオニンの存在を検出することができる。
もう一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。一つの実施態様において、本ヌクレオチドの長さは、少なくとも１４ヌクレオチドであり、また突然変異を有するヌクレオチド配列に、配列特異的でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
プライマーのハイブリダイズ領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列は、プローブのハイブリダイズ領域としても使用することができる。プローブとしての使用に適するプライマー配列は、このプライマーのハイブリダイゼーション特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、プライマーとしても使用することができる。
これらの実施態様の提供により、特異的プライマーおよびプローブが、例えば、この５’末端または３’末端いずれかに、標的配列に相補的である、または標的配列に相補的でないヌクレオチドを付加させることによって作成できることは、当業者には明らかであろう。プライマー組成物が、標的配列の伸長の開始点としての役割を果たす限り、ならびにプライマーおよびプローブが、例示する実施態様の範囲内に含まれる少なくとも１４の連続的ヌクレオチドを含む限り、こうした組成物は、本発明の範囲内である。
本明細書におけるプローブは、排他的または確定的とはみなされない次の非限定的な基準によって選択することができる：（１）本プローブは、突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスゲノムの領域から選択される；（２）本プローブは、検査の信頼性を落とすと予想されるあらゆるウイルスゲノム配列との相同性がない；および（３）本プローブは、例えばクレノウフラグメントと呼ばれるＤＮＡポリメラーゼの部分のような大腸菌ＤＮＡポリメラーゼなどの増幅酵素によって核酸伸長に干渉し得る、被増幅核酸の二次構造形成がない。二次構造形成の防止は、増幅培地中、約１５重量％以下、好ましくは５から１０重量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用すること、および／または増幅温度を３０から４０℃に上昇させることによって達成することができる。
さらに、本プローブは、約５０％のグアニンおよびシチジン含量率を有することができ、ならびにプライマーの３’末端に多数の連続的アデニンおよびチミン残基（これらは、安定性が劣るハイブリッドを生じる原因となり得る。）を有さないものとする。
本発明のプローブの長さは、約１０から３０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１４、１５、２０、２５または３０ヌクレオチドである。本発明で用いるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびイノシンなどの修飾ヌクレオチド、すなわちこれらのハイブリダイゼーション特性を本質的に変化させない修飾基を有するヌクレオチドであり得る。本明細書を通して、プローブ配列は、５’末端から３’末端までの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして表す。いずれのプローブも、それ自体で使用することができ、またはこれらの相補形またはこれらのＲＮＡ形（ここにおいて、Ｔは、Ｕにより置換される）で使用することができる。
本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組み換えプラスミドのクローニングによって、また場合により、適切なヌクレアーゼの使用によるこのクローン化プラスミドからの前者の切断、および例えば分子量に応じた分画によるこれらの回収によって、作成することができる。本発明のプローブは、例えば従来的なリン酸トリエステルまたはリン酸ジエステル法またはこれらの自動型実施態様により、化学合成することもできる。こうした自動型実施態様の１つでは、ジエチルホスホロアミダイトを出発原料として使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８１），２２：１８５９−１８６２が記載したように合成することができる。修飾固体支持体を用いるオリゴヌクレオチドの１つの合成法が、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。生物学的供給源から単離されたプライマー（制限エンドヌクレアーゼ消化物など）の使用も可能である。
プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチエート（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら，１９６７）、アルキルホスホロチエート（Ｍｉｌｌｅｒら，１９７９）、ペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１； Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９３）、モルホリノ核酸、ロックト核酸、偽環状オリゴ核酸塩基、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋核酸などのヌクレオチド類似体も含むことができ、または介在物質（Ａｓｓｅｌｉｎら，１９８４）を含有することができる。
所望の特性を有するプローブを設計するために、当業者には公知である次の有用なガイドラインを適用することができる。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は、多数の因子による影響を受けるため、これらの因子の１つ以上を操作することによって、特定のプローブの正確な感受性および特異性、この標的に完璧に相補的であるか否かを決定することになる。本明細書でさらに例示する様々なアッセイ条件の重要性および効果は、当業者には公知である。
標的核酸ハイブリッドに対するプローブの安定性は、これらのアッセイ条件に適合するように選択するべきである。これは、長い高ＡＴ型配列を避けること、このハイブリッドをＧＣ塩基対で終わらせること、および適切なＴｍを有するプローブを設計することによって達成することができる。プローブの始点と終点は、この長さと％ＧＣに起因して、Ｔｍが最終アッセイ実施温度より約２から１０℃高くなるように選択すべきである。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対と比較すると、追加の水素結合のために大きな熱安定性を示すので、プローブの塩基組成は重要である。従って、関与する相補的核酸のＧ−Ｃ含有率が高いハイブリダイゼーションほど、高い温度で安定となる。イオン強度、およびプローブが使用されることとなるインキュベーション温度などの条件も、プローブ設計時に考慮しなければならない。ハイブリダイゼーションが、この反応混合物のイオン強度が増大するにつれて増加し得ること、およびハイブリッドの熱安定性が、イオン強度の増大に伴って増加し得ることは、公知である。一方、水素結合を崩壊するホルムアミド、尿素、ＤＩＶＩＳＯおよびアルコールなどの化学試薬は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大させ得る。こうした試薬による水素結合の不安定化は、Ｔｍを大いに低下させ得る。一般に、長さ１０から５０塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブに最適なハイブリダイゼーションは、所定のデュプレックスについての融解温度より約５℃低い温度で発生する。最適より低い温度でのインキュベーションは、ミス対合塩基配列のハイブリダイズを可能に得、従って、特異性を低下させ得る。高相補的核酸ハイブリッドのみが形成され、および／または相補度が十分でないハイブリッドは形成されない高度ストリンジェンシー条件下でのみハイブリダイズするプローブを有することが望ましい。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーが、ハイブリッドを形成する２本の核酸鎖間に必要な相補度を決める。ストリンジェンシーの程度は、例えば、標的核酸とで形成されたハイブリッドと非標的核酸とで形成されたハイブリッドの間の安定性の差を最大化するように選択する。この場合、単一の塩基対の変化を検出する必要があり、それには非常に高いストリンジェンシー条件が求められる。
標的核酸配列の長さおよびプローブ配列の長さも考慮すべきである。１つの特定領域からの、位置および長さが異なる幾つかの配列が存在し、これらによって所望のハイブリダイゼーション特性が生じ得る場合もある。またある配列が、一つの塩基が異なるだけの別の配列より、有意に良好であり得る場合もある。
完璧には相補的ではない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完璧に相補的な塩基配列の最長伸長によって、通常はハイブリッドの安定性が決まる。長さおよび塩基組成が異なるオリゴヌクレオチドプローブを使用できるが、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基数１４と３０の間の長さであり、標的核酸配列に完璧に相補的である十分な配列長を場合によりさらに有する。
ハイブリダイゼーション抑制性の強力な内部構造を形成することが知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡ内の領域は、あまり好ましくない。一つの実施態様では、広範囲にわたる自己相補性を有するプローブを避ける。上で説明したように、ハイブリダイゼーションは、水素結合された２本鎖を形成するように、相補的な２本の核酸１本鎖が会合することである。これら２本の鎖のうちの１本が、あるハイブリッドに全面的にまたは部分的に関係している場合、これはこの鎖が新しいハイブリッドの形成にほとんど参加できないであろうことを当然意味する。十分な自己相補性がある場合、単一プローブの分の中で分子内および分子間ハイブリッドが形成されることもある。こうした構造は、注意深いプローブ設計によって回避することができる。関心のある配列の実質的な部分が１本鎖であるようにプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大いに増大させることができする。このタイプの相互作用の調査にはコンピュータプログラムを利用することができる。しかし、ある場合には、このタイプの相互作用を回避できないことがある。
特異的プライマーおよび配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ウイルスゲノム配列の増幅および検出を可能にするポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。
本発明の一つの側面は、特異的オリゴヌクレオチドプライマーに関する。本発明は、フラビウイルス科ウイルスの突然変異からの核酸配列の増幅に適するフラビウイルス科ウイルス核酸増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物を提供する。例えば、このプライマーは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドにおけるＧからＣへのヌクレオチド変化を検出することができる。もう一つの例では、このプライマーは、ＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるＧからＣへのヌクレオチド変化を検出することができる。
フラビウイルス科ウイルス突然変異の増幅および検出
本発明のもう一つの側面は、フラビウイルス科ウイルス突然変異を増幅する方法およびフラビウイルス科ウイルス突然変異の存在を検出する方法に関する。
ＤＮＡまたはＲＮＡは、この分野において公知の様々な技法により、血液または組織材料（肝臓など）などの身体サンプルから抽出することができる。未精製サンプル、例えば血漿、血清または血液から採ったサンプルは、増幅前に、サンプルの細胞、液、組織、ウイルスカプシドまたは動物細胞膜を開くために、ならびに核酸（複数を含む）の鎖（複数を含む）を露出させおよび／または分離するために有効な試薬の一定量で処理してもよい。これらの鎖を露出させおよび分離するためのこの溶解段階および核酸変性段階によって、増幅をさらにずっと容易に起こすことができるだろう。
一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス核酸配列（複数を含む）を含むと推測されるサンプルを増幅させ；この増幅配列を、突然変異のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと接触させ；プローブをこの配列にハイブリダイズさせることにより、この配列を検出する、突然変異の検出方法を提供する。一つの実施態様において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法の使用により達成される。もう一つの実施態様において、突然変異は、ＢＶＤＶゲノムのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位におけるＧからＣへのヌクレオチド変化である。さらにもう一つの実施態様において、突然変異は、ＨＣＶゲノムの第８４４３位におけるＧからＣへのヌクレオチド変化である。
増幅
使用する増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら，１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｌａｎｄｇｒｅｎら，１９８８；Ｗｕ ＆ Ｗａｌｌａｃｅ，１９８９；Ｂａｒａｎｙ，１９９１）、核酸増幅反応法（ＮＡＳＢＡ；Ｂｕａｔｅｌｌｉら，１９９０；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１）、転写ベースの増幅方式（ＴＡＳ；Ｋｗｏｈら，１９８９）、鎖置換増幅（ＳＤＳ；Ｄｕｃｋ，１９９０；Ｗａｌｋｅｒら，１９９２）、Ｑ９レプリカーゼによる増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら，１９８８；Ｌｏｍｅｌｉら，１９８９）、またはこの分野において知られている核酸分子の増幅に適する他のあらゆる方法であり得る。
ポリメラーゼ連鎖反応
増幅のためのＰＣＲ法は、この分野において一般によく知られている（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，６８３，１９４号参照）。この増幅プロセスは、関与した反応ステップの数に対して指数量で、特定の核酸配列を調製するための酵素的連鎖反応を、所望の配列の末端がこの配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを合成できるようにおよびこの配列の少量が連鎖反応を開始するために入手できるように十分詳細に知られていることを条件として、含み得る。一方のプライマーは負（−）鎖に相補性であり、他方のプライマーは正（＋）鎖に相補性である。変性された核酸にこのプライマーをアニールし、次にＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）などの酵素およびヌクレオチドで伸長することにより、標的配列を含む（＋）および（−）鎖が新たに合成されることになる。これらの新たな合成配列は、プライマーのテンプレートでもあるため、変性サイクルの反復、プライマーのアニーリング、伸長の結果、プライマーによって定義された領域の指数蓄積がもたらされる。この連鎖反応の産物は、利用した特異的プライマーの末端に対応する末端を有する別個の核酸２本鎖になる。
いかなる特定の拡散配列もこのプロセスによって生産することができる。必要なことは、一方のプライマーから合成した伸長生成物が定義長の核酸への他方のプライマーの伸長のテンプレートとして、このテンプレート（相補体）から切り離されたとき、役割を果たすよう、所望の配列の別の鎖にこの配列に沿った相対位置でハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができるように、配列の両末端にある十分な数の塩基が十分詳細にわかっていることのみである。この配列の両末端の塩基についての知識が多いほど、標的核酸配列に対するプライマーの特異性が高くなり得、従って、この方法の効率が高くなり得る。以後用いるプライマーという語は、特に増幅されるフラグメントの末端配列に関する情報が多少あいまいである場合、１つ以上のプライマーを指す。例えば、ある核酸配列が、蛋白質配列情報から推論される場合、この遺伝子コードの縮重を基に可能なすべてのコドン変異を表す配列を含むプライマーのコレクションを、各鎖に対して用いることができる。このコレクションからの１つのプライマーを、増幅すべき所望の配列の末端とともに実質的に保存することができる。
特定の核酸配列は、テンプレートとしてこの配列を含有する診断用マーカー核酸の使用により、作成することができる。このサンプルの標的核酸配列が２つの鎖を含む場合、これらをテンプレートとして使用する前に、単独の段階としてまたはプライマー伸長産物の合成と同時に、核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含むあらゆる適する変性技法（ここで用いる「変性」という語は、こうした手段すべてを包含する）を用いて達成することができる。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は、変性されるまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は、約１から１０分の範囲の時間、約８０から１５０℃の範囲の温度を必要とし得る。鎖の分離は、ＤＮＡを変性することが公知のリボＡＴＰの存在下で、ヘリカーゼとして公知の酵素類からの酵素またはヘリカーゼ活性を有する酵素ＲｅｃＡにより誘導される。ヘリカーゼでの核酸の鎖の分離に適する反応条件は、Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ，ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３：６３（１９７８）により記載されており、ＲｅｃＡを使用するための技法は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７（１９８２）に総説されている。
増幅すべき配列を含有する元の核酸が１本鎖である場合、その相補体は、この一本鎖に１つまたは２つのオリゴヌクレオチドプライマーを付加させることによって合成する。適切な単一のプライマーを付加させる場合、プライマー伸長産物は、このプライマー、重合剤、および下に記載する４つのヌクレオシド三リン酸の存在下で合成する。この産物は、１本鎖核酸に一部相補的であり、またこの核酸鎖とハイブリダイズして、不等長鎖のデュプレックスを形成し、次に、これらを上に記載したように１本鎖に分離して、２本の分離した相補的１本鎖を作ることができるだろう。また、２つの適切なプライマーを１本鎖核酸に付加させて、反応を行うことができる。
元の核酸が増幅すべき配列を構成する場合、生産されるプライマー伸長産物は、元の核酸の鎖に相補的または実質的に完全に相補的であり、またこれらとハイブリダイズして、１本鎖分子に分離することができる等長鎖のデュプレックスを形成するだろう。
この核酸（１つまたは複数）の相補鎖を分離するとき、この核酸が、元々２本鎖であろうと、１本鎖であろうと、これらの鎖は、追加の核酸鎖を合成するためのテンプレートとしてすぐに使用できるようになっている。この合成は、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを起こさせることができる条件下で行われる。一般に、それは、例えば７から９のｐＨ範囲を達成するように緩衝水溶液中で起こる。モル濃度過剰（ゲノム核酸については、通常、プライマー：テンプレート＝約１０８：１）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、分離されたテンプレート鎖を含有する緩衝液に添加してもよい。しかし、診断用途に本方法を使用する場合、相補鎖の量がわかっているはずはなく、このため、確信を持って相補鎖の量に対するプライマーの量を決めることができないことは、理解される。しかし、実質的な問題として、一般に、添加されるプライマーの量は、増幅すべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含まれているときには相補鎖（テンプレート）の量よりモル濃度が過剰であろう。本方法の効率の向上には、モル濃度大過剰が好ましい。
デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰも、別々にまたはプライマーと一緒に適切な量で合成混合物に添加し、得られた溶液を約１から１０分間、例えば約１から４分間、約９０から１００℃に加熱する。この加熱時間の後、この溶液を放置して、プライマーハイブリダイゼーションに好適である室温に冷却する。この冷却混合物に、プライマー延長反応を果たすために適する薬剤（本明細書では「重合剤」と呼ぶ）を添加し、この分野において公知の条件下で反応を起こさせる。重合剤は、他の試薬（それが熱安定性である場合）と一緒に添加することもできる。この合成反応は、室温から、それより高いとこの重合剤がもはや機能しなくなる温度まで、行うことができる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを重合剤として使用する場合、この温度は、一般に、約４０℃以下である。最も適便には、この反応は、室温で行う。
重合剤は、酵素を含む、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能することができるあらゆる化合物または系であり得る。このために適する酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、および熱安定性酵素（すなわち、変性を起こさせるために十分上昇させた温度に付された後、プライマー伸長を行う酵素）を含む他の酵素が挙げられ、これらは、各々の核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するために妥当な方式でヌクレオチドの組み合わせを促進することができる。一般に、この合成は、各プライマーの３’末端で開始し、合成が終わるまでテンプレート鎖に沿って５’方向に進行し、それによって長さが異なる分子が生成することになる。また、上の記載と同じ方法を用いて、５’末端で合成を開始させ、３’末端の方向に進行する重合剤を使用することができる。
新たに合成された鎖およびこの相補的核酸鎖は、標的配列が存在する場合、上に記載したハイブリダイゼーション条件下で２本鎖分子を形成するであろう。このハイブリッドをこの方法の次の段階で使用する。次の段階では、ハイブリダイゼーション条件下で処理されたサンプルを、上に記載した手順のいずれかを用いる変性条件に付して、標的配列が存在する場合には１本鎖分子を得る。
１本鎖分子を用いて、新たな核酸を合成する。上で指示した条件下で反応を進行させるために必要な場合には、追加の重合剤、ヌクレオシドおよびプライマーを添加してもよい。重ねて、この合成は、各オリゴヌクレオチドプライマーの一方の末端で開始し、このテンプレートの１本鎖に沿って進行してさらなる核酸を生産する。この段階の後、この伸長産物の半分は、２つのプライマーが結合した特定の核酸配列から成るだろう。
変性および伸長産物の合成段階は、検出に必要な程度まで標的核酸配列を増幅するために必要なだけ繰り返すことができる。下でさらに詳細に説明するように、生産される特定の核酸配列の量は、指数方式で蓄積することになる。
最初の核酸または核酸混合物から１つ以上の特定の核酸配列を生産することが望ましい場合には、適切な数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。例えば、２つの異なる特定の核酸配列を生産すべき場合、４つのプライマーを利用する。これらのプライマーのうちの２つは、この特定の核酸配列の一方に対して特異的であり、残りの２つのプライマーは、もう一方の特定の核酸配列に対して特異的である。この要領で、本方法により２つの異なる特定の配列の各々を指数的に生産することができる。
本発明は、各段階の後に新たな試薬を添加する段階的方式で、または同時に、すなわちすべての試薬を最初の段階で添加する１段階方式で、または所定の段階数の後に新たな試薬を添加する一部段階的、一部同時的方式で行うことができる。変性法、例えば、熱不安定酵素の場合のような重合剤を不活性化し得る加熱法を用いる場合には、各鎖分離段階後に重合剤を補充する必要がある。酵素手段を鎖分離段階に用いる場合には、同時法を用いることができる。この同時手順では、反応混合物は、所望の配列を有する核酸鎖（複数を含む）に加えて、鎖分離酵素（例えば、ヘリカーゼ）、この鎖分離酵素のための適切なエネルギー源（例えば、ｒＡＴＰ）、４つのヌクレオシド三リン酸、モル濃度過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、および重合剤（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント）を含有する。
同時法における変性に熱を用いる場合、高温で機能するであろう熱安定ポリメラーゼなどの熱安定性薬剤を利用することができ、この場合の高温とは、例えば、この薬剤に依存して約５０から１０５℃であり、この温度では、核酸が、平衡状態の１本鎖および２本鎖から成るであろう。より短い核酸には、約４０から５０℃の低い温度を用いることができる。高い方の温度範囲は、酵素が分解するであろう温度、またはそれより高いと不十分なレベルのプライマーハイブリダイゼーションが起こる温度に依存するであろう。こうした熱安定酵素は、例えば、Ａ．Ｓ．Ｋａｌｅｄｉｎら，Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，４５，６４４−６５１（１９８０）によって記載されている。この定温反応が成功させるために、プライマーは、互いに６から８の塩基対の範囲内の３’末端を有する。この方法の各段階は、最初にすべての試薬が存在するにもかかわらず逐次的に起こる。必要な場合には、追加の材料を添加してもよい。望ましい量の特異的核酸配列を作成するために適する長さの時間が経過した後、公知のいずれかの方法によりこの酵素を不活性化することにより、またはこの反応の成分を分離することにより、反応を停止させることができる。
増幅は、熱安定酵素を使用して伸長、アニーリングおよび変性を可能ならしめるように温度を段階的に上昇させる温度サイクリング反応を用いて行うこともできる。
本発明の方法は、継続的に行うことができる。自動型方法の一つの実施態様では、反応は、変性域、試薬添加域、および反応域を通して循環させることができる。もう一つの実施態様において、プライマー伸長産物の合成に使用する酵素をカラム内に固定することができる。他の反応成分は、ポンプによりこのカラムおよび直列に配置された加熱コイルに通して継続的に循環させることができ、従って、生産された核酸を不活性化させることなく、繰り返し変性することができる。
ＰＣＲ法を用いるフラビウイルス科ウイルスの遺伝子型決定法は、この分野において一般に知られている。さらに、フラビウイルス科ウイルスを含有すると推測されるサンプルを用いてＰＣＲを行った後、このフラビウイルス科ウイルスゲノムを配列決定することができる。
プローブと標的配列のハイブリダイゼーションの検出
サンプル中のプローブと標的核酸配列の間で形成されたハイブリッドの検出に適するアッセイ様式は、この分野において知られている（Ｓｍｂｒｏｏｋら，１９８５）。ハイブリダイゼーションの検出は、この核酸が増幅されていようと、いなかろうと、達成することができる。
１つの検出法は、増幅されていない核酸または増幅された核酸とハイブリダイズすることができる標識プローブの使用、およびこのプローブがハイブリダイズしたかどうかの決定によるものである。こうしたプローブは、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼの第１２１４位またはＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドなどの、突然変異したと推測されるヌクレオチドを必須として含む。
オリゴヌクレオチドは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出可能な標識を組み込むことによって標識することができる。有用な標識には、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるようなもの）、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体を利用することができるハプテンおよび蛋白質が挙げられる。
核酸は、放射性プローブを用いる、または用いないノーザンブロットまたはサザンブロットによってそれを分析することにより検出することができる。一つの実施態様において、例えばフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測される末梢血からの少量のＤＮＡサンプルを、オリゴヌクレオチドプローブを用いるサザンブロット法によって分析して、特定の核酸ウイルスマーカーを検出する。もう一つの実施態様では、例えばフラビウイルス科ウイルスを含有すると推測される末梢血からの少量のＤＮＡサンプルを先ず増幅し、次に、オリゴヌクレオチドプローブを用いるサザンブロット法によって分析して、特異的核酸ウイルスマーカーを検出する。
もう一つの方法は、オリゴマー制限法（米国特許第４，６８３，１９４号に記載されているものなど）を含む。この手順では、増幅された核酸を変性して、溶液状態で標識オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ、この標識オリゴヌクレオチドプローブが、標的配列に特異的にハイブリダイズし（すなわち、プライマーに含まれる特定の保存領域におよぶ）、関心のある制限部位の少なくともひとつにおよぶ。標的とプローブの間で形成されたデュプレックスは、制限部位を再形成し、例えばＢｇｌＩ、ＰｖｕＩＩまたはＨｉｆＩなどの制限酵素で切断すると標識プローブフラグメントを放出し、このフラグメントは、ゲル電気泳動法によって完全長プローブから分割することができる。次に、この得られたゲルをオートラジオグラフィーに付す。この方法による増幅産物の分析は、迅速、すなわち数時間の範囲内であり得る。
増幅産物を分析するために用いることができるもう一つの方法は、ドット・ブロット法である。ドット・ブロット法では、増幅された標的ＤＮＡをナイロン膜などの固体支持体上に固定する。この膜−標的複合体を適するハイブリダイゼーション条件下で標識プローブと共にインキュベートし、ハイブリダイズされなかったプローブを適するストリンジェント条件下で洗浄することにより除去して、この膜を、結合したプローブの存在についてモニターする。
代替様式は、増幅された標的ＤＮＡを標識し、プローブをナイロン膜などの固体支持体上に固定する「逆」ドット・ブロット様式である（Ｓａｉｋｉら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０、およびＰＣＴ特許国際公開公報第８９／１１５４８号参照）。典型的には、標的ＤＮＡは、１つ以上の標識プライマーの組み込みにより、増幅中に標識する。一方のプライマーを標識してもよいし、両方のプライマーを標識してもよい。膜−プローブ複合体をこの増幅され標識された標的ＤＮＡと共に適するハイブリダイゼーション条件下でインキュベートして、ハイブリダイズされなかった標的ＤＮＡを適するストリンジェント条件下で洗浄し、次に、このフィルタを、結合した標的ＤＮＡの存在についてモニターする。
また、逆ドット・ブロットアッセイは、多数のプローブハイブリダイゼーション部位またはウエルを有する固体支持体を使用して行うことができる。例えば、マイクロウエルプレートは、本方法の大規模臨床適用に特に有用である。プローブは、受動的結合により、またはマイクロウエルプレートに付着するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの蛋白質中間体を通して、マイクロウエルプレートに固定することができる。マイクロウエルプレートで行われる逆ドット・ブロット法は、米国特許第５，２３２，８２９号、およびＬｏｅｆｆｅｌｈｏｌｚら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（１１）：２８４７−２８５１に記載されている。本発明のもう一つの実施態様において、逆ドット・ブロットアッセイは、マイクロウエルプレートを使用して行い、プライマーは、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９８９，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）９９−１１２頁に記載されているようにビオチンで標識する。プローブをＢＳＡと複合させ（Ｔｕｎｇら，１９９１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２：４６４−４６５参照。これは本明細書に参照により組込まれる）、マイクロウエルプレートに固定する。標識プライマーを使用して増幅し、固定化プローブとハイブリダイズさせた後、増幅核酸は、先ず、アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａ−ＨＲＰ）またはストレプタビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡＨＲＰ）にビオチンを結合させることにより検出し、次に、ＨＲＰが色原体の色変化を触媒する反応を行うことにより検出する。
検出のためにハイブリダイゼーションデュプレックスを固定する別法では、ＢＳＡ複合プローブを磁気微粒子に結合させる。この結合プローブを標識増幅産物に溶液状態でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、プローブ−標的デュプレックスをこの溶液から磁気的に除去し、次に、この磁気固定化ハイブリダイゼーションデュプレックスを検出する。
もう一つの検出法は、５’ヌクレアーゼアッセイと呼ばれ、このアッセイでは、標識検出プローブをＰＣＲ増幅プロセス中に付加させる。前記プローブは、これらがＤＮＡ合成用プライマーとして作用することを防止するように変性されている。各合成段階中、すなわちプライマー伸長中に標的ＤＮＡにハイブリダイズするあらゆるプローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。次に、このプローブからの分解産物を検出する。従って、プローブ破壊産物の存在は、発生したプローブ−標的ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションと発生した増幅反応の両方を示す。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号も参照のこと。
上に記載したアッセイ様式は、典型的に、標識オリゴヌクレオチドを利用してハイブリッドデュプレックスの検出を可能にする。オリゴヌクレオチドは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段による検出可能な標識の組み込みなど、前に言及した技法のいずれによっても標識することができる。有用な標識には、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるようなもの）、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体を利用することができるハプテンおよび蛋白質が挙げられる。
フラビウイルス科ウイルスの核酸の増幅を検出するための別法は、反応混合物中の２本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることによる方法である（Ｈｉｇｕｃｈｉら，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７； Ｈｉｇｕｃｈｉら，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０；および欧州特許公開第４８７，２１８号および同第５１２，３３４号に記載されているような方法）。２本鎖の標的ＤＮＡの検出は、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）および他のＤＮＡ結合標識が、２本鎖ＤＮＡに結合したときに示す蛍光の増加に基づく。標的配列の合成によってもたらされる２本鎖ＤＮＡの増加に起因して、検出可能な蛍光の増加が生じる。
フラビウイルス科ウイルスの突然変異の検出に有用なさらにもう一つの方法は、逆ハイブリダイゼーションアッセイによる方法である。これは、複数のプローブを必要とする場合に特に有用である。一つの実施態様では、選択されたプローブセットを、わかっている別個の位置で固体支持体に固定する（点、線または他の形）。もう一つの実施態様では、選択されたプローブセットを膜ストリップに線状に固定することができる。前記プローブは、固体支持体上の描写した位置に個々にまたは混合物として固定することができる。特定の実施態様にでは、線プローブアッセイを用いて、本発明の突然変異を含むフラビウイルス科ウイルス遺伝子型をスクリーニングすることができる。前記線プローブアッセイには、膜上に平行線状に固定された複数のプローブが必要であり、そこで増幅核酸フラグメントの逆ハイブリダイゼーションを行う。次に、このハイブリッドは、非放射性発色系とカップリングするビオチン−ストレプタビジンにより検出することができる。例えば、国際公開公報第９７／４０１９３号参照。
フラビウイルス科ウイルス遺伝子型判決定法を用いて、フラビウイルス科ウイルスの突然変異の存在を分析することもできる。例えば、配列ベースの系統発生分析、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、ＰＣＲまたは制限断片長多型を用いることができる。
フラビウイルス科ウイルス蛋白質／ペプチドマーカーの検出
もう一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス感染に対する長期２’−分枝ヌクレオシド療法の失敗について診断するためのウイルスマーカー検出方法を提供し、この方法では、フラビウイルス科ウイルス蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントを含有するサンプルをこうしたウイルスマーカーについて分析する。療法の失敗と相関する蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントは、ウエスタンブロット、二次元ゲル電気泳動法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、高感度ケミルミネッセンス法（ＥＣＬ）、免疫組織化学法、ＥＬＩ−Ｓｐｏｔアッセイ、ペプチド配列決定法または抗体利用プロテインアレイ法を含むこの分野において公知の一般に適用可能なあらゆる蛋白質検出法によって検出することができる。例えば、２’−分枝ヌクレオシド治療について診断するためのフラビウイルス科ウイルスマーカーの蛋白質発現は、古典的な免疫組織学的方法で分析することができる。これらにおいて、具体的な識別は、特異的ウイルスマーカー対する一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって達成されるが、二次検出系には、蛍光、酵素または他の接合二次抗体を利用することができる。結果として、病理試験のためのフラビウイルス科ウイルス感染組織切片の免疫組織学的染色が達成される。
２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応について診断するための蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントのもう一つの検出方法は、ウエスタンブロットである。簡単に言うと、フラビウイルス科ウイルス蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントを含有するサンプルを電気泳動ゲルによって分離する。次に、これらの分離蛋白質をニトロセルロースなどの培地に移入する。次に、２’−分枝ヌクレオシドの失敗に相関する特異的フラビウイルス科ウイルスアミノ酸配列に対して反応性のストレプタビジン−アルカリホスファターゼなどの検出可能な標識を有する抗体を、フラビウイルス科ウイルスアミノ酸配列を含有するニトロセルロース媒体を被覆する。反応性抗体は、対応するフラビウイルス科ウイルスアミノ酸配列と結合することになり、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）などの試薬を使用して検出することができる。例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．，ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと。
また、フラビウイルス科ウイルス保有者の血清中に存在する反応性抗体を利用して、２’−分枝ヌクレオシド治療診断用のフラビウイルス科ウイルスマーカーの存在を検出することができる。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を含む当業者に公知のあらゆる公知抗体アッセイ法を用いることができる。例えば、一つの実施態様において、フラビウイルス科ウイルス特異的抗体を有するフラビウイルス科ウイルス保有者からのサンプルを、２’−分枝ヌクレオシド療法の成功および／または失敗と相関する特異的フラビウイルス科ウイルスペプチドを含む固体支持体アレイと接触させる。次に、これらの反応性抗体を、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼで標識されたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体と、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を含有する試薬とを使用し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸に暴露することによって検出する。
２’−分枝ヌクレオシド療法に対するフラビウイルス科ウイルス保有者の長期反応について診断するための蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントのもう一つの検出方法は、通常の当業者に公知の技法を用いてこの蛋白質、ペプチドまたはペプチドフラグメントを配列することによる方法である（例えば、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１００３５−１００３８，（１９８７）； Ｓａｌｉｎｏｖｉｃｈ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｌａｎｏ，Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：３４１，（１９８６）； Ｔａｒｒ，Ｇ．Ｅ．：Ｍａｎｕａｌ Ｅｄｍａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎ：Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．，（ｅｄ．） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９８６，ｐｐ．１５５−１９４；およびＦｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｌ．ａｎｄ Ｍｉｓｃｈｅ，Ｓ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１１２−１１７，（１９９４）参照）。例えば、エドマン法を用いて、ペプチドのアミノ酸配列を決定してもよい。簡単に言うと、エドマン化学は、配列内の蛋白質／ペプチドのＮ末端から１度に１つずつアミノ酸残基を除去する。各アミノ酸残基の除去に必要なエドマン化学の各サイクルは、次の３段階から成る：弱アルカリ条件下でフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）とカップリングさせて、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）−ペプチドを形成する段階；分解して、第一の残基をこのアニリノチアゾリノン（ＡＴＺ）−アミノ酸誘導体として放出させる段階；このＡＴＺ誘導体をさらに安定なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸誘導体に転化させる段階。エドマン分解の各サイクルで除去されるＰＴＨ−アミノ酸残基は、スモールまたはマイクロボアＲＰ−ＨＰＬＣによって同定される。この方法および起こり得る落とし穴についての十分な説明は、Ｔａｒｒ，Ｇ．Ｅ．：Ｍａｎｕａｌ Ｅｄｍａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎ：Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．，（ｅｄ．） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９８６，ｐｐ．１５５−１９４によって与えられている。また、サンプルが、Ｎ末端配列を発生させない場合、Ｎ末端残基をブロックし、調製手順中に分解するか、立体的な理由のためにエドマン化学の試薬に利用できない場合には、ペプチドを分画し、次に、分析する制御型特異的蛋白質分解にこのサンプルを付すことができる。この分画アプローチは、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｌ．ａｎｄ Ｍｉｓｃｈｅ，Ｓ．： 内部配列分析のための二フッ化ポリビニリデン結合蛋白質についての改善された酵素的消化手順（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１１２−１１７，１９９４によって記載されている。
アレイ
本発明のもう一つの側面は、フラビウイルス科ウイルス核酸ウイルスマーカーを検出するためのＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアレイの使用を提供する。こうしたアレイには、ＤＮＡマクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイおよびＤＮＡマイクロチップが挙げられる。ＤＮＡアレイは、例えば、米国特許第５，８３７，８３２号、同第５，８０７，５２２号、同第６，００７，９８７号、および同第６，１１０，４２６号、国際公開公報第９９／０５３２４号、同第９９／０５５９１号、同第００／５８５１６号、同第９５／１１９９５号、同第９５／３５５０５号Ａ１、および同第９９／４２８１３号、特開平１０−５０３８４１号Ｔ２、ギリシャ特許第３０３０４３０号Ｔ３、スペイン特許第２１３４４８１号Ｔ３、欧州特許第８０４７３１号Ｂ１、ドイツ特許第６９５０９９２５号Ｃ０、カナダ特許第２１９２０９５号ＡＡ、オーストラリア特許第２８６２９９５号Ａ１、同第７０９２７６号Ｂ２、オーストリア特許第１８０５７０号、欧州特許第１０６６５０６号、ならびにオーストラリア特許第２７８０４９９号に記載されている。こうしたアレイは、例えば、ＰＣＴ国際公開公報第９９／０５５７４号，ならびに米国特許第５，７５４，５２４号、同第６，２２８，５７５号、同第５，５９３，８３９号および同第５，８５６，１０１号に記載されているように、作成したサンプルヌクレオチドとこれらのアレイを接触させたときのハイブリダイゼーションの結果のコンピュータ解析法に組み込むことができる。病原マーカーについてのスクリーニング方法も、例えば、米国特許第６，２２８，５８６号、同第６，１６０，１０４号、同第６，０８３，６９８号、同第６，２６８，３９８号、同第６，２２８，５７８号および同第６，２６５，１７４号に記載されているように、この分野において公知である。ＤＮＡアレイ法のさらなる記載は、例えば、次の文献において見出すことができる： Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ Ｄ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ４０９（６８２２）：９２２−９２７（２００１）； Ｋａｎｅ Ｍ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８ （２２）：４５５２−７（２０００）； Ｔａｔｏｎ ＴＡら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８９（５４８５）：１７５７−６０（２０００）； Ｊｏｒｇ Ｒｅｉｃｈｅｒｔら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（２４）：６０２５−６０２９（２０００）； Ｒｅｉｎｋｅ Ｖ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６（３）：６０５−１６（２０００）； Ｍａｒｘ Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１６７０−１６７２（２０００）； Ｌｏｃｋｈａｒｔ Ｄ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ４０５（６７８８）：８２７−８３６（２０００）； Ｃｏｒｔｅｓｅ Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １４［１７］：２５（２０００）； Ｃｏｒｔｅｓｅ Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １４［１１］：２６（２０００）； Ｆｒｉｔｚ Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８８（５４６４）：３１６−８（２０００）； Ｍａｒｋ Ｓｃｈｅｎａ（Ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＴｅｌｅＣｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ； Ｓｃｈｅｒｆ Ｕ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２４（３）：２３６−４４（２０００）； Ｒｏｓｓ Ｄ．Ｔ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２４（３）：２２７−３５（２０００）； Ｗａｌｔ Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：４５１−４５２（２０００）； Ａｆｓｈａｒｉ Ｃ．Ａ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９（１９）：４７５９−６０（１９９９）； Ｇｗｙｎｎｅ Ｐ．ａｎｄ Ｐａｇｅ Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９ Ａｕｇｕｓｔ ６．（広告特集版。マイクロアレイ関連会社のリストを掲載（ｓｐｅｃｉａｌ ａｄｖｅｒｔｉｓｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ｈａｓ ａ ｌｉｓｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐａｎｉｅｓ））； Ｂａｌｄｗｉｎ Ｄ．ら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ２（２）：９６−１０３（１９９９）； Ｐｏｌｌａｃｋ Ｊ．Ｒ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３（１）：４１−６（１９９９）； Ｋｈａｎ Ｊ．ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０（２）：２２３−９（１９９９）； Ｇｅｒｈｏｌｄ Ｄ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２４（５）：１６８−７３（１９９９）； Ｅｋｉｎｓ Ｒ．ａｎｄ Ｃｈｕ Ｆ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：２１７−２１８（１９９９）； Ｎｕｗａｙｓｉｒ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：１５３−１５９ （１９９９）； Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｂ．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１３（１１）：１８−２０（１９９９）； Ｔｈｅ Ｃｈｉｐｐｉｎｇ Ｆｏｒｅｃａｓｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊａｎｕａｒｙ １９９９ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）； Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｇｅｎｅｓ，Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃｈｉｐｓ．Ｉｎ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（編者 Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９９；Ｍａｒｔｏｎ Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔ Ｍｅｄ．４（１１）：１２９３−３０１（１９９８）； Ｗａｎｇ Ｄ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０（５３６６）：１０７７−８２（１９９８）； Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ．Ｐａｒａｌｌｅｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｉｐｓ．ｉｎ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（編者 Ｍ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８； Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ４：２７７−２８９（１９９８）； Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６３０１−３０６（１９９８）； Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３８８）：３９６−３９９（１９９８）； Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３８８）：３９９−４０１（１９９８）； Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５１３（１９９８）； Ｈｏｕｓｍａｎ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６（６）：４９２−４９３（１９９８）； Ｒａｍｓａｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６（１）：４０−４４（１９９８）； Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６（１）：２７−３１（１９９８）； Ｋｏｎｏｎｅｎ Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（７）：８４４−８４７（１９９９８）； Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．（１９９８）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ Ａｒｒａｙｓ；ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１１１−１２３，編者 Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ Ｄ．ら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５９（１）：３４−４１（１９９８）； Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｊ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１（３）：３１３−２４（１９９８）； Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ ３：３８４−３８９（１９９８）； Ｃｏｖａｃｃｉ，Ａ．ら，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１：１８０−１９２（１９９７）； Ｆｏｒｏｚａｎ，Ｆ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３：４０５−４０９（１９９７）； Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．＆ Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６４９（１９９６）； Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．ら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １１：６８７−６９０（１９９６）； ＤｅＲｉｓｉ Ｊ．ら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １４（４）：４５７−６０（１９９６）； Ｓｈａｌｏｎ Ｄ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ６（７）：６３９−４５（１９９６）； Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３（２０）：１０６１４−９（１９９６）；およびＳｃｈｅｎａ Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０（５２３５）：４６７−７０ （１９９５）。
アレイ上のプローブは、長さ約１０から３０ヌクレオチドほどもの短さ、または数キロベースまでになることもある全フラビウイルス科ウイルス遺伝子もしくはフラビウイルス科ウイルスクローンほどもの長さを含む（しかし、これらに限定されない）様々な長さのものであり得る。加えて、表２および３（配列番号１から６２）に記載したもののような様々な長さの配列をプローブとして使用することができる。このアレイは、このアレイ上のすべてのプローブがこれらの対応する遺伝子にほぼ同じハイブリダイゼーションストリンジェンシーでハイブリダイズすることができるように、設計することができる。アレイ用のプローブは、用いられるハイブリダイゼーションストリンジェンシーに対して一意的であるべきである。一意的プローブは、１つの標的につき１つタイプの核酸としかハイブリダイズすることができない。プローブは、用いられるハイブリダイゼーションストリンジェンシーで２つの異なる遺伝子、すなわち関連遺伝子から誘導された核酸、または非相同配列とハイブリダイズする場合、一意的ではない。遺伝子に対するプローブの配列の相同性および用いられるハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、選択されたサンプルを検査する際にプローブが一意的であるか否かを決定するために役立つ。プローブは、同じ遺伝子から誘導された異なる核酸、すなわちスプライス変異体ともハイブリダイズしてはならない。関心のあるスプライス変異体は判っているので、１つのアレイに対して幾つかの異なるプローブ配列を、各プローブがスプライス変異体のうちの１つから誘導された核酸にしかハイブリダイズしないように、関心のある標的配列から選択することができる。一つの実施態様において、配列番号１から６２を含むアレイが、選択的ハイブリダイゼーションを可能ならしめるハイブリダイゼーション条件下で使用される。選択的ハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、ただ１つの同定配列からの核酸としかハイブリダイズしない。もう一つの実施態様において、関心のあるいずれかのフラビウイルス科ウイルス配列を含むアレイが、選択的ハイブリダイゼーションを可能ならしめるハイブリダイゼーション条件下で使用される。選択的ハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、ただ１つの同定配列からの核酸としかハイブリダイズしない。
一つの実施態様において、マイクロアレイの使用には、先ず、ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡの逆転写などによる関心のある遺伝子の増幅、次に、この分野において公知の方法を利用するポリメラーゼ連鎖反応が必要である。核酸をコピーする場合、この分野において公知の検出法および定量法で使用することができる標識を用いてそれを標識する。核酸は、放射性または非放射性標識で標識することができるが、好ましくは蛍光標識を含む。関心のある配列プローブを含むマイクロアレイに標識核酸を導入し、一定時間、反応させる。次に、この支持体を洗浄して異物を除去し、固定されたプローブ分子に結合した標的上にこれらの核酸を残して、オートラジオグラフィー、液体シンチレーションカウント法、および／または蛍光などのこの分野において公知の方法による検出および定量に備える。ハイブリダイゼーション法および検出法に改善を施す場合、通常の当業者はこれらを容易に応用することができる。この分野において周知であるように、プローブ分子と標的分子が２分子間に強い非共有結合を形成することによりハイブリダイズする場合、このプローブと標的核酸は、このアニーリング段階および洗浄段階を高度ストリンジェンシー条件下で行うならば、本質的に完全に相補的であると合理的に仮定することができる。この検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションが起こったか否かを決定するための手段にもなる。オートラジオグラフィー、液体シンチレーションカウント法または蛍光などのこの分野において公知の検出および定量法でこのアレイの画像を得ることにより、このアレイの特定の位置での強度と比較してどの程度フラビウイルス科ウイルス遺伝子配列が存在するかを決定することができる。高定量シグナルは、特定の配列が調製したサンプル中に存在することを示し、定量シグナル不在は、特定の配列が存在しないことを示す。２’−分枝ヌクレオシド治療の前および２’−分枝ヌクレオシド治療中など、異なる条件下での様々な遺伝子配列の存在を直接比較することができる。同様に、２’−分枝ヌクレオシドなどの一定の刺激に応じて如何なる配列が存在するかを決定することができる。
一つの実施態様において、患者のフラビウイルス科ウイルス配列のプロフィールを、ＤＮＡアレイ法を利用して経時的に追跡することができる。別の実施態様において、理学療法として２’−分枝ヌクレオシドを受けている、または他の抗フラビウイルス科ウイルス理学療法を受けているフラビウイルス科ウイルス保有患者を、この治療に応じての上述のフラビウイルス科ウイルスゲノム配列の変化について経時的にモニターすることができる。
配列番号１から６２または他の被同定フラビウイルス科ウイルス配列を含むアレイは、スポット法または光リリソグラフィーによる固相合成などのこの分野において公知のいずれかのアレイ合成法によって作成することができる。アレイは、固体支持体、例えば、顕微鏡用スライドガラスに印刷することもできる。印刷前に、この分野において公知であるように、結合用の支持体を提供すべくスライドガラスを準備する。アレイは、この分野において公知のいずれかの印刷技法および機械を使用して印刷することができる。印刷は、この分野において公知のとおり、この支持体上へのプローブの配置、この支持体へのプローブの取り付け、および非特異的ハイブリダイゼーションを防止するためのこの支持体のブロックを含む。好ましくは、本発明のアレイは、光リソグラフィーと無作為配列化学を併用する固相合成によって合成する。プローブの選択およびアレイの設計に関する重要な要素の一部は、すべてのアレイの生産に共通している。例えば、プローブハイブリダイゼーションを最適化する戦略は、プローブ選択の過程に必ず含まれる。特定のｐＨ、塩および温度条件下でのハイブリダイゼーションは、融解温度を考慮に入れることおよび望ましいハイブリダイゼーション挙動と相関する経験則を用いることによって最適化することができる（本明細書に参照により組込まれ参考として援用されている、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ（１９８７） ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１６９−１７０に記載されているとおり。）。プローブハイブリダイゼーションの強度および濃度依存性の予測にはコンピュータモデルを使用することができる。
ハイブリダイゼーションのための中等度から高度のストリンジェンシー条件は、この分野において公知である。ブロットのための高度ストリンジェンシー条件の一例は、５ｘＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／０．１％ ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイジング、および０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、室温での洗浄である。中等度ストリンジェンシー条件の一例は、５ｘＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／０．１％ ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイゼーション、および３ｘＳＳＣ中、４２℃での洗浄である。温度および塩濃度のパラメータを変化させて、プローブと核酸の間の望ましい配列同一性レベルを達成することができる。ハイブリダイゼーション条件のさらなるガイダンスについては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。融解温度は、次の式（Ｂｅｌｔｚ，Ｇ．Ａ．ら，［１９８３］ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ［Ｅｄｓ．］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００：２６６−２８５）によって表すことがことができる。融解温度＝８１．５℃．＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（＋Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／（塩基対におけるデュプレックスの長さ）。
本発明に有用な核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって作ることができる。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法によって確認することができる。ＰＣＲは、核酸配列の反復型酵素的プライム合成である。この手順はよく知られており、当業者がよく用いる（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９； Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０１３５０−１３５４（１９８５）参照）。ＰＣＲは、標的配列の反対の鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを両端に有する関心のあるＤＮＡフラグメントを酵素により増幅するために用いられる。これらのプライマーは、３’末端を互いの方向に向けて配向する。テンプレートの熱変性サイクルの反復、プライマーのこれらの相補配列へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼでのこのアニールされたプライマーの伸長によって、ＰＣＲプライマーの５’末端により定義されるセグメントが増幅されることになる。各プライマーの伸長産物は他のプライマーのテンプレートとしての役割を果たすことができるので、各サイクルが、前のサイクルで生産されたＤＮＡテンプレートの量を本質的に倍にする。これは、数時間で数百万倍までの特定の標的配列の指数蓄積をもたらす。高温細菌サームス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されるＴａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用により、この増幅プロセスを完全に自動化することができる。使用することができる他の酵素は、当業者には公知である。
また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で作ったプローブを、オリゴヌクレオチドで作ったプローブの代用として上記と同じ用途に用いることができる。オリゴヌクレオチドについてのＰＮＡでの代用は、この分野において周知である。既成モノマーによるペプチド核酸の合成は、例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開公報第９２／２０７０２号および同第９２／２０７０３号に記載されている。合成、構造、生物学的特性およびＰＮＡの使用に関する最近の進歩も報告されている。例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開公報第９３／１２１２９号、Ｎｅｉｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．らの米国特許第６６１７４２２号、Ｃｏｏｋらの米国特許第５，５３９，０８３号、米国特許出願第２００３００５９７８９号Ａ１、Ｋｌｅｉｂｅｒらの米国特許第６４７５７２１号、Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ：３６５，５６６−５６８（１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）、およびＥｇｈｏｌｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５−１８９７（１９９２）を参照のこと。
キット
本発明の一つの側面による方法論を用いる２’−分枝ヌクレオシドに対するフラビウイルス科ウイルスサンプルの耐性状態を決定するためのアッセイでの使用に適する検査キットは、（１）野生型ＤＮＡ配列（もしくはこの対応するＲＮＡ）の一領域または本明細書に記載するような突然変異ＤＮＡ配列の一領域に相補的であるオリゴヌクレオチド、（２）このオリゴヌクレオチドの３’末端からの核酸の重合に必要な材料、および（３）オリゴヌクレオチドプライマー伸長産物の存在を決定するための手段を具備する。重合材料には、適切な酵素、バッファ、洗浄溶液、標識、および必要な場合にはこの標識の支持体が挙げられる。ＰＣＲを用いて核酸を増幅する場合には、野生型ＤＮＡ配列（もしくはこの対応するＲＮＡ）の一領域または本明細書に記載するような突然変異ＤＮＡ配列の一領域を増幅することになる適切なオリゴヌクレオチドプライマー、およびｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）などの追加材料を含めるべきである。このアッセイを行うための説明も含めることができる。
本発明のもう一つの側面による方法論を用いるインターフェロンに対するフラビウイルス科ウイルスの感受性を決定するためのアッセイでの使用に適する検査キットは、野生型ＤＮＡ配列（もしくはこの対応するＲＮＡ）の一領域または突然変異ＤＮＡ配列の該当領域に相補的なオリゴヌクレオチドと共に、ハイブリダイゼーションを可能ならしめるために必要な材料を具備する。こうした材料には、適切なバッファ、洗浄溶液、標識、および必要な場合にはこのこれらの標識の支持体が挙げられる。一つの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドを標識する。ＰＣＲを用いて、ハイブリダイゼーション前に核酸を増幅する場合には、野生型ＤＮＡ配列（もしくはこの対応するＲＮＡ）の一領域または突然変異体ＤＮＡ配列の一領域を増幅することになる適切なオリゴヌクレオチドプライマー、適切な酵素およびｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）などの追加材料を含めるべきである。このアッセイを行うための説明も含めることができる。
もう一つの実施態様において、本発明は、フラビウイルス科ウイルス感染の長期２’−分枝ヌクレオシド治療に対する耐性のマーカーを検出するためのキットを提供する。このキットは、この診断用マーカーを含むフラビウイルス科ウイルスの核酸配列に実質的に結合しているオリゴヌクレオチドプローブを含む区画を含むことができる。また、このキットは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または他のアンチセンス擬似プローブをオリゴヌクレオチドの代わりに含む。このキットは、フラビウイルス科ウイルス核酸ウイルスマーカーへのこのプローブのハイブリダイゼーションを検出する試薬も含む。本発明はフラビウイルス科ウイルス核酸のＰＣＲ増幅用のプライマーを含むことができるキットも包含する。あるキットは、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸プローブなどの、増幅されたフラビウイルス科ウイルス核酸検出するための手段も含むことができる。場合によっては、プローブは、適切な支持膜に固定されている。このキットの他の任意の構成要素には、例えば、プライマー伸長産物の合成を触媒する薬剤、基質ヌクレオシド三リン酸、標識に用いる手段（例えば、この標識がビオチンである場合にはアビジン−酵素コンジュゲートおよび酵素基質ならびに色原体）、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応に適するバッファ、および本方法を実施するための説明が挙げられる。
加えて、本キットは、治療の失敗と相関するフラビウイルス科ウイルスゲノムの配列を有する１つ以上の核酸を含有する正の対照を含む容器、および／またはこうした核酸を有さない負の対照を含む容器を有することができる。さらに、本キットは、プローブの配列に含まれる部位で標的配列含有核酸を切断することができる制限酵素のための容器を有することができる。
本発明は、生体サンプル中に存在し得る、療法の失敗と相関するフラビウイルス科ウイルスの１つ以上のウイルスマーカーを検出および／または遺伝分析するためのキットも提供し、このキットは、次の構成要素を具備する：（ｉ）適切な場合、サンプル中に存在する核酸を放出、単離または濃縮するための手段；（ｉｉ）適切な場合、少なくとも一つの適するプライマー対；（ｉｉｉ）おそらく固体支持体に固定されている、上で定義したようなプローブ少なくとも二つ；（ｉｖ）ハイブリダイゼーションバッファ、または前記バッファを製造するために必要な成分；（ｖ）洗浄溶液、または前記溶液を製造するために必要な成分；（ｖｉ）適切な場合、前のハイブリダイゼーションから得られたハイブッドを検出するための手段；（ｖｉｉ）適切な場合、固体支持体上の既知の位置に前記プローブを取り付けるための手段；および／または（ｖｉｉｉ）本方法を実施するための説明。
さらに、本発明は、サンプル中の反応性抗体の存在を検出するためのイムノアッセイに使用することができる、２’−分枝ヌクレオシド療法の失敗に相関するウイルスマーカーに反応するペプチドまたはペプチドフラグメントを含むキットも提供する。前記ペプチドは、安定させた溶液の状態であってもよいし、凍結乾燥させた状態であってもよい。こうしたキットは、凍結乾燥ペプチドを加水分解するための適切な溶液を含む。このキットは、前述のペプチドをブロットするための適切な固体媒体も含む。このキットは、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体などの、このペプチドに対して反応性の抗体の存在の検出するための適切な試薬も含むことができる。さらに、このキットは、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）などの検出試薬を含むことができる。
また、このキットは、２’−分枝ヌクレオシド療法に関連した特異的ペプチド配列に対して反応性の抗体を含むことができる。
ＩＶ．フラビウイルス科ウイルス感染の治療
抗フラビウイルス科ウイルス薬での併用または交代治療
フラビウイルス科ウイルスの薬物耐性変異体は、抗ウイルス薬での長期治療後に出現し得る。最も一般的には、薬物耐性は、ウイルス複製に使用される酵素をコードしている遺伝子の突然変異によって発生する。フラビウイルス科ウイルス感染に対する薬物の効能は、この化合物を、主薬に起因するものとは異なる突然変異を誘発する第二の、おそらく第三の抗ウイルス化合物と併用または交代で投与することにより、延長、増強または回復させることができる。併用療法は、ウイルスに対して同時に複数のストレスを誘発する。薬物動態、生体分布またはこの薬物の他のパラメータを、こうした併用または交代療法によって変えることができる。
本発明は、治療が必要なヒトに、ウイルスゲノムにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴにおいてセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオシドの突然変異以外の位置で、突然変異を直接もしくは間接的に誘発する１つ以上の薬物および／またはこうした突然変異に関係する１つ以上の薬物と併用および／または交代で、２’−分枝ヌクレオシドまたはこの医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩を投与することにより、フラビウイルス科ウイルス感染の最適な治療を達成する方法を提供する。
突然変異フラビウイルス科ウイルス感染のインターフェロン治療
本発明のもう一つの側面は、フラビウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの保存セリンアミノ酸残基（図１１）におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主において、インターフェロンの治療有効量を投与することによりフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。一つの実施態様において、インターフェロンの治療有効量を投与することにより、ＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むＢＶＤＶ感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。もう一つの実施態様において、インターフェロンの治療有効量を投与することにより、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むＨＣＶ感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。特定の実施態様では、インターフェロンアルファ−２ｂを投与して、フラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる。
さらなる実施態様において、（ｉ）宿主からウイルスサンプルを得ること、（ｉｉ）このサンプル中のフラビウイルス科ウイルスが、ＲＮＡポリメラーゼの第４０５位アミノ酸残基にトレオニンを有するか否かを同定すること、および（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を含むフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主にインターフェロンの有効量を投与することを含む、ＢＶＤＶに感染していると推測される宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。
もう一つの実施態様において、（ｉ）宿主からウイルスサンプルを得ること、（ｉｉ）このサンプル中のフラビウイルス科ウイルスが、ＲＮＡポリメラーゼの第２８２位アミノ酸残基にトレオニンを有するか否かを同定すること、および（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異を有するフラビウイルス科ウイルスに感染している宿主にインターフェロンの有効量を投与することを含む、ＨＣＶに感染していると推測される宿主においてフラビウイルス科ウイルス感染を治療および／または実質的に治癒させる方法を提供する。
インターフェロンには、次のものが挙げられる：ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇによるＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲｏｃｈｅによるＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（インターフェロンアルファ−２ａ）、ＲｏｃｈｅによるＰＥＧＡＳＹＳ（ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａ）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＶｉｒａｇｅｎによるＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−ＳｅｒｏｎｏによるＲＥＢＩＦ（インターフェロンベータ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅによるオメガインターフェロン（Ｏｍｅｇａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、アマリロバイオサイエンス（Ａｍａｒｉｌｌｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による経口インターフェロンアルファ（Ｏｒａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ）、およびＩｎｔｅｒＭｕｎｅによるインターフェロンガンマ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−１ｂ）。
ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位アミノ酸またはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位アミノ酸におけるセリンからトレオニンへの突然変異の同定は、セリンからトレオニンへのアミノ酸変化を可能ならしめるフラビウイルス科ウイルスゲノムの突然変異の存在を検出することにより達成することができる。一つの実施態様では、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチド（ここにおいて、このＲＮＡポリメラーゼ領域の第１２１４位ヌクレオチドは、ＢＶＤＶゲノムの第１１，１３６位ヌクレオチドに対応する）におけるシチジンの存在を利用して、このアミノ酸変化を検出することができる。他の実施態様では、次の二重突然変異を検出することができる：第１２１４位（ＧからＣ）と第１２１５位（ＣからＡ）；第１２１４位（ＧからＣ）と第１２１５位（ＣからＧ）；または第１２１４位（ＧからＣ）と第１２１５位（ＣからＵ）。これらに起因して、ＢＶＤＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第４０５位におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸変化が生じる。もう一つの実施態様では、ＨＣＶゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるシチジンの存在を利用して、このアミノ酸変化を検出することができる。他の実施態様では、次の二重突然変異を検出することができる：第８４４３位（ＧからＣ）と第８４４４位（ＣからＡ）；第８４４３位（ＧからＣ）と第８４４４位（ＣからＧ）；または第８４４３位（ＧからＣ）と第８４４４位（ＣからＵ）。これらに起因して、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼ領域の第２８２位におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸変化が生じる。これらの突然変異は、標識プローブ、逆ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット、または当業者に公知の他のあらゆる検出法などの上に記載した検出法のいずれかを用いて検出することができる。
Ｖ．医薬組成物の調製
フラビウイルス科ウイルスに起因する感染を示す、ヒトを含むあらゆる宿主は、ウイルスゲノムにおいて、このＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内のセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で突然変異を誘発する薬物と併用または交代で、本明細書に詳細に記載するいずれの指示または投与方式についても医薬適合性の担体または希釈剤の存在下、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣまたはこの３’バリンエステルプロドラッグなどの、２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩の有効量を患者に投与することにより治療することができる。β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣなどの２’−分枝ヌクレオシド、またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩は、単独で投与してもよいし、または本明細書に記載する他の抗ウイルス薬と併用または交代で投与してもよい。活性材料は、液体形態または固体形態で、あらゆる適切な経路により、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下または局所的に投与することができる。
化合物の好ましい用量は、１日につき受容者の体重のｋｇあたり約１から５０ｍｇ、好ましくは１から２０ｍｇ、さらに一般的には０．１から約１００ｍｇの範囲であろう。その医薬適合性の塩およびプロドラッグの有効投薬範囲は、送達される親ヌクレオシドの重量を基に計算することができる。このプロドラッグおよび／または塩が本質的に活性を示す場合、有効投薬量は、このプロドラッグおよび／もしくは塩の重量を用いて、または当業者に公知の他の手段によって概算することができる。
化合物は、単位剤形あたり７から３０００ｍｇ、好ましくは７０から１４００ｍｇの活性成分を含有するものを含むが、これらに限定されないあらゆる適する剤形単位で適便に投与することができる。例えば、活性成分５０から１０００ｍｇの経口投薬量が、通常適便である。
理想的には、活性成分は、約０．２から７０μＭ、好ましくは約０．１から１０μＭの活性化合物のピーク血漿中濃度を達成するように投与すべきである。これは、例えば、場合により生理食塩水中の、活性成分の０．１から５％溶液の静脈内注射により達成することができ、または活性成分のボーラスとして投与することができる。
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、この薬物の吸収、不活性化および排泄速度、ならびに当業者に公知の他の因子に依存するであろう。投薬量の値は、緩和すべき状態の重症度によっても変わることに注意しなければならない。さらに、いずれの特定の被験者についても、具体的な薬剤投与計画は、個々の必要性、およびこれらの組成物を投与する人またはこれらの組成物の投与を管理する人の専門的な判断に従って調整すべきであり、本明細書に記載する濃度範囲は、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲または実施の単なる例であり、これらを制限するためのものではないことは、理解することができる。活性成分は、１回で投与してもよいし、様々な時間間隔で投与できるように多数の、より小さな用量に分割してもよい。
活性化合物の好ましい投与方式は、経口方式である。経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮される。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と配合して、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることができる。医薬適合性の結合剤および／または補助材料を、本組成物の一部として含めてもよい。
錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、次の成分のうちのいずれか、または似たような性質の化合物を含有してもよい：微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの潤滑剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーなどの着香剤。投薬単位形がカプセルである場合、上のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含むことができる。加えて、投薬単位形は、この投薬単位の物理的形状を修正する他の様々な材料、例えば糖衣、シェラックまたは他の腸溶性物質を含むことができる。
本化合物は、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、チューインガムなどの成分として投与することができる。シロップは、活性化合物に加えて、スクロース（甘味剤および一定の保存薬として）、色素および着色剤ならびに芳香薬を含有することができる。
本化合物またはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩は、所望の作用を損なわせない他の活性材料と、または抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬もしくは他の抗ウイルス薬（他のヌクレオシド化合物を含む）などの、所望の作用を補足する材料と混合することもできる。非経口適用、皮内適用、皮下適用または局所適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分を含むことができる：注射用蒸留水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調節剤。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回使用バイアル内に封入することができる。
静脈内投与する場合、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
好ましい実施態様において、本活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出調合物などの身体からの急速な放出からこの化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン−酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生体分解性生体適合性ポリマーを用いることができる。こうした調合物の調製法は、当業者には明らかであろう。これらの材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入することもできる。
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に有する細胞をターゲットにしたリポソームを含む）も医薬適合性の担体として好ましい。これらは、例えば米国特許第４，５５２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。前記特許は、この全文が本明細書に参考として援用されている。例えば、リポソーム調合物は、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールなどの適切な脂質（複数を含む）を有機溶媒に溶解すること、次に、この溶媒を蒸発させ、容器の表面に所望の脂質の薄膜を残すことによって調製することができる。本活性化合物またはこの一リン酸、二リン酸および／もしくは三リン酸誘導体の水溶液をこの容器に導入する。この容器を手で渦攪拌して容器の側面から脂質材料を除去し、脂質凝集物を分散させ、それによってリポソーム懸濁液を作る。
活性化合物（複数を含む）は、治療する患者に深刻な毒性作用をもたらすことなくインビボでのウイルス複製、特にフラビウイルス科ウイルスの複製を阻害するように、化合物の治療有効量を患者に送達するために十分な量で、医薬適合性の担体または希釈剤に含まれる。「阻害量」とは、例えば本明細書に記載するものなどのアッセイによって測定されるような、阻害効果を発揮するために十分な活性成分の量を意味する。
制御放出調合物
生体分解性ポリマーの分野は、ポリ乳酸の合成および生体分解性が１９９６年にＫｕｌｋａｒｎｉら（「外科移植材のためのポリ乳酸（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｍｐｌａｎｔｓ）」，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，９３：８３９）によって報告されて以来、急速に発展した。送達装置用のマトリックス材料として有用と報告されている他のポリマーの例には、ポリ無水物；ポリグリコリドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリドなどのポリエステル；ポリリシンなどのポリアミノ酸；ポリエチレンオキシド、アクリル酸末端のポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアクリロニトリルおよびポリホスファゼンのポリマーおよびコポリマーが挙げられる。例えば、Ｌａｎｇｅｒらの米国特許第４，８９１，２２５号および同第４，９０６，４７４号（ポリ無水物）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎの米国特許第４，７６７，６２８号（ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド酸）、ならびにＴｉｃｅらの米国特許第４，５３０，８４０号（ポリラクチド、ポリグリコリド、およびコポリマー）を参照のこと。組織接触材料および制御放出担体としての光重合性生体分解性ヒドロゲル（重合および架橋可能なエンドキャップ型モノマーまたはオリゴマーである、生体分解性モノマーまたはオリゴマー延長部を有する親水性オリゴマーを含む重合および架橋型マクロマーのヒドロゲル）を記載しているＨｕｂｂｅｌｌらの米国特許第５，６２６，８６３号；ならびに薬物送達用制御放出剤および組織治療薬として使用するためのマルチブロック生体分解性ヒドロゲルに関するＦｏｃａｌらの国際公開公報第９７／０５１８５号も参照のこと。
架橋ゼラチンなどの生物由来の分解性材料は、周知である。ヒアルロン酸は、架橋しており、分解性膨潤性ポリマーとして生物医学的用途に使用されている（Ｄｅｌｌａ Ｖａｌｌｅらの米国特許第４，９５７，７４４号；（１９９１）「トロンボゲン形成低減のための高分子生体材料の表面変性（Ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」，Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ，６２：７３１−７３５））。
現在、多くの分散系が、物質、特に生物活性化合物の担体として使用されており、または使用のために調査されている。医薬および化粧品の調合に使用される分散系は、懸濁剤または乳剤のいずれかとして分類されている。懸濁剤は、懸濁化剤を使用して液体媒体に分散させた、粒径数ナノメートルから数百マイクロメートルの範囲の固体粒子と定義される。固体粒子には、マイクロスフェア、マイクロカプセルおよびナノスフェアが挙げられる。乳剤は、界面活性剤および脂質などの乳化剤の界面膜によって安定化させた、ある液体を別の液体に分散させたものと定義される。乳剤調合物には、油中水型および水中油形乳剤、多層乳剤、マイクロエマルジョン、マイクロドロップレット、およびリポソームが挙げられる。マイクロドロップレットは、Ｈａｙｎｅｓに対して発行された米国特許第４，６２２，２１９号および同第４，７２５，４４２号において定義されているような、内側に油相を有する球状脂質層から成る単層リン脂質小胞である。リポソームは、水不溶性極性脂質と水溶液を混合することにより調製されるリン脂質小胞である。水中でこの不溶性脂質を混合することにより生じた不利なエントロピーによって、水溶液が閉じ込められたリン脂質の同心包囲膜の非常に規則正しいアセンブリが生成する。
Ｄｕｎｎらの米国特許第４，９３８，７６３号は、非反応性水不溶性熱可塑性ポリマーを生体適合性水溶性溶媒に溶解して液体を形成すること、この液体を体内に配置すること、および溶媒を散逸させて固体インプラントを作ることによってインサイチュでインプラントを形成することによる、さらにもう一つの薬物送達法を開示している。前記ポリマー溶液は、注射器によって体内に配置することができる。前記インプラントは、この周囲の腔の形状を呈することができる。別の実施態様では、前記インプラントは、反応性液体オリゴマー性ポリマーから成り、前記ポリマーは、溶媒を含有せず、通常は硬化触媒を添加して、固体を形成するように所定の位置で硬化させる。
多数の特許が、ウイルスゲノムにおけるＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴにおけるセリンから別のアミノ酸への変化をもたらすヌクレオチドの突然変異以外の位置で突然変異を誘発する薬物と併用および／または交代で２’−分枝ヌクレオシドまたはその医薬適合性のプロドラッグおよび／もしくは塩を投与するために使用することができる薬物送達系を開示している。米国特許第５，７４９，８４７号は、電気泳動による生体へのヌクレオチドの送達法を開示している。米国特許第５，７１８，９２１号は、ポリマーを含むマイクロスフェアおよび送達系としてこの中に分散させた薬物の使用を開示している。米国特許第５，６２９，００９号は、生物活性因子の制御放出のための送達系を開示している。米国特許第５，５７８，３２５号は、薬物送達用の非線状親水性疎水性マルチブロックコポリマーのナノ粒子およびミクロ粒子の使用を開示している。米国特許第５，５４５，４０９号は、生物活性因子の制御放出のための送達系を開示している。米国特許第５，４９４，６８２号は、薬物送達系としてイオン架橋型高分子マイクロカプセルの使用を開示している。
Ａｎｄｒｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，７２８，４０２号は、ヒドロゲル形成剤との混合物で活性薬物、その塩またはプロドラッグを含む内相および胃での溶解に耐える皮膜を含む外相を備える制御放出調合物を記載している。Ａｎｄｒｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，７３６，１５９号は、インサイチュで通路が形成される、ほとんど水に溶解しない薬物についての制御放出調合物を開示している。Ａｎｄｒｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，５６７，４４１号は、１日１回用制御放出調合物を開示している。米国特許第５，５０８，０４０号は、多粒子状拍動性薬物送達系を開示している。米国特許第５，４７２，７０８号は、拍動性粒子ベース薬物送達系を開示している。米国特許第５，４５８，８８８号は、薬物を含有する内相および重量平均分子量が３，０００から１０，０００のポリエチレングリコールポリマーを含む外相を有するブレンドを使用することができる制御放出錠剤調合物を記載している。米国特許第５，４１９，９１７号は、ヒドロゲルからの薬物の放出速度を変更するための方法を開示しており、この方法は、実質的にゼロ次のヒドロゲルからの薬物の放出速度をもたらすことができる医薬適合性イオン性化合物の有効量の使用に基づく。米国特許第５，４５８，８８８号は、制御放出錠剤調合物を開示している。
Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｌｃの米国特許第５，６４１，７４５号は、生体分解性ポリマー中に活性薬物を含んで、マイクロスフェアまたはナノスフェアを形成している制御放出医薬調合物を開示している。この生体分解性ポリマーは、適切にはポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドまたはポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドとポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリドのブレンドである。Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｌｃの米国特許第５，６１６，３４５号は、有機酸と会合している活性化合物、ならびにこのコアを包囲し、医薬適合性被膜形成性水不溶性合成ポリマーの主集団および医薬適合性被膜形成性水溶性合成ポリマーの副集団を含む多層膜を含む、１日１回投与するための制御吸収調合物を開示している。米国特許第６，４５１，５１５号は、生体分解性ナノ粒子に基づく制御放出調合物を開示している。米国特許第５，６３７，３２０号は、１日１回投与するための制御吸収調合物を開示している。米国特許第５，５８０，５８０号および同第５，５４０，９３８号は、神経疾患を治療する際の調合物およびこれらの使用に関する。米国特許第５，５３３，９９５号は、薬物送達を制御する受動型経皮式装置に関する。米国特許第５，５０５，９６２号は、制御放出医薬調合物を記載している。
以下の実施例は、本発明の様々な実施態様を説明するものであり、如何なる点でも制限するためのものではない。
（実施例）
β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性ＢＶＤＶの単離
非細胞障害性（ｎｃｐ）ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株； ネブラスカ州（ＮＥ）、リンカーンのＤｒ．Ｒ．Ｄｏｎｉｓ，Ｕ．）でのナイーブ細胞のインビトロ感染により、ＭＤＢＫ細胞系（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，カタログ番号：ＣＣＬ−２２）においてＢＶＤＶ持続感染を成立させた。感染多重度（ＭＯＩ）は、０．０１であった。病巣アッセイによって決定して、安定した高レベルの感染（１ｍＬあたり１０６から１０７の病巣形成単位（ＦＦＵ））が達成されるまで、細胞を週に２回継代した（分裂比 １：１５）。次に、８μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ（Ｉｎｄｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が入っている、または入っていない６ウエル培養プレート内で、これらの持続感染細胞を増殖させた。細胞培養物を、分裂比が１：１５から１：２０になるまで、３日から４日ごとに継代した。８回の継代後、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣの存在下で増殖させた細胞培養物をＴ−７５培養フラスコに拡張し、２回凍解して、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶのウイルスストックとしてその後の特性付けに用いた。細胞培養物におけるウイルス力価は、各継代終了時にウイルス病巣アッセイによりモニターした。
ウイルス病巣アッセイを行うために、１ウエルあたり２ｘ１０５の細胞が入っている６ウエルプレートにＭＤＢＫ細胞を接種し、使用前に少なくとも５時間、３７℃／５％ ＣＯ２で増殖させた。試験サンプル（細胞単層と併せた培養上清）を２回凍解し、培地中１０倍に系列希釈して、６ウエルプレート内の試験細胞に１ウエルあたり０．２ｍＬで接種するために使用した。１時間吸着させた後、接種材料を除去し、完全増殖培地（１Ｘ ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、８％ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足したもの）中０．５％のアガロース３ｍＬをこれらの細胞にかぶせた。３７℃／５％ ＣＯ２で３日間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中７．４％のホルムアルデヒド３ｍＬで１時間固定し、ＰＢＳで洗浄した。細胞単層を１ウエルあたり１ｍＬのＰＢＳ−０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にし、０．５ｍＬのヤギ抗ＢＶＤＶ抗血清（ＶＭＤＲ，Ｉｎｃ．；ＰＢＳ−０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１：１０００希釈したもの）と共に１時間インキュベートした。次に、この抗血清を除去して、細胞単層をＰＢＳで洗浄し（１５分間で２回）、０．５ｍＬのペルオキシダーゼ−ロバ抗ヤギ抗体コンジュゲート（ＰＢＳ−０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１：１０００希釈したもの）と共にさらに１時間インキュベートした。抗体を除去した後、細胞単層をＰＢＳで洗浄し（１５分間で２回）、ウイルス病巣が見えるようになるまで（約１５分）室温で０．５ｍＬのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。すべてのインキュベーションは、前後に揺り動かしながら行った。水で洗浄することにより着色を停止させ、プレートを放置して空気乾燥させた。ウイルス力価は、次の方程式を用い、ＦＦＵ／ｍＬで計算した。ＴＦＦＵ／ｍＬ＝Ｎｘ５ｘＤ（式中、Ｔは、ウイルス力価（単位：ＦＦＵ／ｍＬ）であり、Ｎは、１ウエルあたりの病巣の数であり、Ｄは、対応するウイルスサンプルの希釈率である）。（例えば、ウイルスサンプルの１０−５希釈に対応するウエルにおいて１２の病巣が見出された場合には、Ｔ＝１２ｘ５ｘ１０５＝６ｘ１０６ ＰＦＵ／ｍＬ）。
一般に、ウイルス力価は、２から３回の継代後、１０６から１０７ ＦＦＵ／ｍＬに達し、少なくとも２ヶ月にわたってさらに継代した後も有意には変化しなかった。このような持続感染細胞系を８μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣで治療したとき、ウイルス力価は急速に低下し、２回の継代後、ウイルスは、もはや検出できなかった（図１）。しかし、阻害剤の存在下でのさらなる継代の後、ウイルスが培地に再び出現し（一般に、３から５回継代した時点）、ウイルス力価は、未治療の培養物のものより約１０倍低い１０５ ＦＦＵ／ｍＬでプラトーに達した（図１）。ウイルス力価におけるこの１０倍の差は、治療から２８日後でさえ観察された。この実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。再出現したウイルスの表現型は、初期野生型ウイルスとは著しく異なり、野生型ウイルスのものよりずっと小さい、一般には直径で３から１０倍小さい病床をもたらした（図２）。この表現型は、少なくとも７２日間、阻害剤の存在下での長期継代培養後も変化しなかったが、治療を中止すると急速に野生型の表現型（大病巣）に戻った。
考え合わせると、これらのデータは、野生型ウイルスが治療後に細胞培養物から姿を消すこと、およびβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性ウイルス変異体が組織培養において複製適性をあまり示さないことを示している。
ウイルス増殖動態
野生型ＢＶＤＶとβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性ＢＶＤＶ、両方の増殖動態を比較した。ＭＤＢＫ細胞を６ウエルプレートに接種し（１ウエルあたり細胞数２ｘ１０５）、３７℃／５％ ＣＯ２で一晩増殖させた。細胞を感染多重度０．１でＢＶＤＶ Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓまたはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性突然変異体、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒに感染させた。１時間吸着させた後、接種材料を除去して、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、細胞に２ｍＬの新しい増殖培地をかぶせた。ＢＶＤＶ、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒについて、８μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣが存在する状態または不在の状態の二重重複ウエルを用意した。細胞培養物を３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートした。感染後、０（吸着時間終了時）、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２時間の時点で、培養物を２回凍解し、上に記載したような病巣アッセイによりウイルス力価を定量した。
感染後１２時間で、野生型ウイルスの後代は、１０４ ＦＦＵ／ｍＬを超える有意なレベルに達した。これは、８から１４時間であるＢＶＤＶの完全寿命と一致する。対照的に、耐性ウイルス変異体の後代は、この時点ではまた検出できなかった（図３）。耐性ウイルスの複製は、感染後２４時間で初めて検出された。感染後３６時間で、耐性ウイルスの複製は、野生型ウイルスのものよりまだ約１００倍効率が低かった。これらのデータは、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶの複製が、特に感染初期段階では、野生型ウイルスより有意に遅いことを明確に示している。これらのデータは、図１および２で提示した結果とも一致する。
β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対する耐性の評価
選択したＢＶＤＶ変異体（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ）は、野生型ＢＶＤＶよりβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣに対して耐性である。前記変異体が、表現型もウイルス力価レベルも変化させずに、長期間（少なくとも７２日間）、前記化合物の存在下で、ＭＤＢＫ細胞中、適度に高いレベルまで安定的に複製できるからである。この耐性を定量するために、野生型ウイルスと変異体ウイルスの両方を使用して、ウイルス収量低下検定を行った。
ウイルス収量低下検定を行うために、ＭＤＢＫ細胞を２４ウエルプレートに接種し（１ウエルあたり細胞数１ｘ１０５）、３７℃／５％ ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞を感染多重度０．１でＢＶＤＶに感染させた。１時間吸着させた後、接種材料を除去して、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、試験化合物の系列２倍希釈物（β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣについては０から３２μＭ、Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａについては０から８００ ＩＵ／ｍＬ）を含有する１ｍＬの新しい増殖培地をこれらの細胞にかぶせた。３７℃／５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、プレートを−７０℃で２回凍解して細胞培養物を溶解した。この細胞培養でのウイルス力価を上に記載した病巣アッセイにより定量した。試験化合物についての５０％、９０％および４−ｌｏｇ有効濃度（平均値±標準偏差）は、二重重複ウエルに基づくものである。ＥＣ５０、ＥＣ９０およびＥＣ４−ｌｏｇ値は、ＸＬＦｉｔソフトウエアを用いる曲線当てはめによって導出した。ＥＣ５０、ＥＣ９０およびＥＣ４−ｌｏｇは、ウイルス力価をそれぞれ５０％、９０％および９９．９９％低下させる試験化合物の濃度である。
感染性野生型ＢＶＤＶ粒子の生成は、それぞれ０．５９±０．１２μＭおよび１．４９±０．２８μＭのＥＣ５０値およびＥＣ９０値を有するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣによって非常に有効に抑制された（図４および表４）。７．１４±１．２６μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ濃度で野生型ウイルスの収量は４ ｌｏｇ低下し、１６μＭでウイルス力価は検出限界下（＜１０ ＦＦＵ／ｍＬ）に低下した。対照的に、試験した最高β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ濃度（３２μＭ）で、耐性ウイルス収量に対する影響は観察されなかった。従って、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒウイルスは、ウイルス収量低下検定によって得られたＥＣ５０値を基に、野生型ウイルスよりこの阻害剤に対する耐性が少なくとも５４倍高かった（０．５９±０．１２μＭに対して＞３２μＭ）。
Figure 0006104845
核酸配列分析：β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性表現型の原因である遺伝子突然変異の同定
阻害剤、すなわちヌクレオシド類似体の性質を基に、ウイルスポリメラーゼを尤もらしい分子標的とみなした。従って、本発明者らは、野生型とβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶ、両方のＮＳ５Ｂ領域の配列から始めた。β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣを用いて、または用いずに８継代の治療（図１）を行った後、組織培養溶解産物からウイルスＲＮＡを抽出し、全ＮＳ５Ｂ領域をＲＴ−ＰＣＲ付し、配列した。ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標） Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をこの製造業者のプロトコルに従って使用して、細胞培養物から抽出した。全ＮＳ５Ｂ領域を転写し、ＱＵＩＡＧＥＮ（登録商標） ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを使用して増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、Ｔｕｆｔｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡにおいて自動ＡＢＩ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプロトコルを使用して配列決定した。
少なくとも２つの独立したＲＴ−ＰＣＲ産物を使用して、各領域を両方向に配列決定した。以前に発表されたＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）全長ゲノム配列（Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｖ．Ｂ．ａｎｄ Ｒ．Ｏ．Ｄｏｎｉｓ．（２０００）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６９（２）：９５−１０７）と比較したとき、前記野生型ウイルスには突然変異は見出せなかった。ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）誘発アポトーシスは、細胞内ウイルスＲＮＡ蓄積の増加と相関している。ただ１つのヌクレオチドの置換が、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒウイルスにおいて見出された。第１２１４位ＣからＧ（その結果、第４０５位においてアミノ酸残基ＳｅｒがＴｈｒに変化する）。興味深いことに、このアミノ酸の位置は、突然変異分析（Ｌａｉ Ｖ．Ｃ．，Ｋａｏ Ｃ．Ｃ．，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｅ．，Ｐａｒｋ Ｊ．，Ｕｓｓ Ａ．Ｓ．，Ｗｒｉｇｈｔ−Ｍｉｎｏｇｕｅ Ｊ．，Ｈｏｎｇ Ｚ．，ａｎｄ Ｊ．Ｙ．Ｌａｕ．「ウシウイルス性下痢ウイルスＲＮＡ依存性ＴＮＡポリメラーゼの突然変異分析（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，１０１２９−３６）によって同定したところ、推定機能性ＮＳ５ＢドメインＢ（図５）に位置する。このドメインは、ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域ならびに他のフラビウイルスのゲノムにおいても見出される。さらに、アミノ酸位置Ｓｅｒ４０５は、すべてのペスチウイルスゲノムおよびフラビウイルスゲノムの間で高度に保存されている。
Ｉｎｔｒｏｎ Ａに対する過敏性
上に記載したウイルス収量低下検定を用いて、デノボ感染ＭＤＢＫ細胞におけるＩｎｔｒｏｎ Ａに対する感受性についての野生型Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓウイルスとＩ−Ｎ−ｄＩｎｓ β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ変異体の比較を行った。再び本発明者らは、これら２つウイルスの間に著しい違いを見出した。この野生型ウイルスは、Ｉｎｔｒｏｎ Ａにより中等度に阻害され、ＥＣ９０値は、１１９±３４．１μＭ、および試験した最高薬物濃度でのウイルス収量の低下は約１．５ ｌｏｇであった（図６）。対照的に、Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−Ｒ変異体は、ＥＣ９０値が３．１５±０．７２μＭ、ウイルス収量の最大低下がほぼ４ ｌｏｇであって（図６）、Ｉｎｔｏｒｏｎ Ａに対する感受性がそれより大幅に高いことがわかった。ＥＣ９０値の比較を基に、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ耐性ウイルスは、野生型ＢＶＤＶより、Ｉｎｔｒｏｎ Ａに対して約４０倍感受性が高かった。
β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣおよびＩｎｔｒｏｎ Ａの併用治療
野生型ＢＶＤＶに対するＩｎｔｒｏｎ Ａの単独でのまたはβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣと併用での効果をＭＤＢＫ持続感染細胞でさらに研究した。一つの実験設定では、幾つかの阻害剤濃度で１回または２回治療した７日後（２継代）、ウイルス力価を測定した。この実験の結果（表５Ａおよび５Ｂならびにまた図７および８に提示する）は、次のようにまとめることができる。記載の実験条件下、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣは、単独で、ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）増殖を用量依存的に強く阻害した。８μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣでの治療により、ウイルス力価は６．２ ｌｏｇ低下した（図７）。インターフェロンα−２ｂは、単独で、最小の効果を及ぼす（０．１ ｌｏｇのウイルス力価低下）。２μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣまたは２０００ ＩＵ／ｍＬのインターフェロンα−２ｂでの１回の治療によって、ウイルス力価は、それぞれ１．６１ ｌｏｇおよび０．１ ｌｏｇ低下した。同濃度での併用治療の効果は、２．２２ ｌｏｇであり、これは、加算した効果（１．７１ ｌｏｇ）より０．５１ ｌｏｇ高かった。４μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣまたは２０００ ＩＵ／ｍＬのインターフェロンα−２ｂでの１回の治療によって、ウイルス力価は、それぞれ２．０６ ｌｏｇおよび０．１ ｌｏｇ低下した（表５Ｂ、図８）。同濃度での併用治療の効果は、４．５６ ｌｏｇであり、これは、加算した効果（２．１６ ｌｏｇ）より２．４ ｌｏｇ高かった。このように、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣおよびインターフェロンアルファ−２ｂは、特にβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣを４μＭの濃度で使用した場合、相乗的に作用してＢＶＤＶを阻害した。
Figure 0006104845
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もう一つの実験設定では、治療時間を１０日に延長し、各継代（３から４日ごと）後にウイルス力価（ＮＹ−１株）をモニターした。再び、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣとインターフェロンアルファ−２ｂの同様の相乗阻害効果が観察された（図９）。特に、８μＭのβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣと２００ ＩＵ／ｍＬのＩｎｔｒｏｎ Ａとを併用して細胞培養物を治療した場合、ウイルスは、治療の７日後には検出不能となり、少なくとも２７日間はさらに継代しても再出現しなかった。これらのデータは、持続感染細胞の処理後に出現するβ−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣ−耐性ＢＶＤＶ異性体は、Ｉｎｔｒｏｎ Ａに対して感受性であるという、前に記載した本発明者らの発見と一致する。考え合わせると、これらのデータは、β−Ｄ−２’−ＣＨ３−リボＣでのウイルス持続感染の治療後に出現する耐性ウイルス集団をＩｎｔｒｏｎ Ａでのその後の治療によって排除できることを、さらに示唆している。
特定の実施態様を参照しながら本発明を説明した。本発明の変型および変法は、上記の本発明の詳細な説明から当業者には明らかであろう。

Claims (11)

  1. ２’−Ｃ−メチル分枝ヌクレオシド耐性のＣ型肝炎ウイルスに感染した宿主における２’−Ｃ−メチル分枝ヌクレオシド耐性のＣ型肝炎ウイルスを特定する方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの第８４４３位ヌクレオチドにおけるＧからＣへの突然変異の存在を検出することを含む、方法。
  2. 耐性ウイルスの特定が、宿主からのウイルス培養サンプルからのウイルスプラーク成長の表現型分析をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 表現型分析が、
    （ｉ）宿主からウイルス培養サンプルを得ること；
    （ｉｉ）サンプルを培養して、前記サンプルと野生型ウイルスの間でプラーク成長を比較すること；および
    （ｉｉｉ）前記サンプルのプラーク成長が、野生型ウイルスのプラーク成長よりも小さいかどうかを判定すること、
    を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 耐性ウイルスの特定が、ウイルスの複製適性の判定をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. ウイルスの複製適性の判定が、
    （ｉ）宿主からウイルス培養サンプルを得ること；
    （ｉｉ）サンプルウイルスの複製適性を判定すること；および
    （ｉｉｉ）サンプルウイルスの複製適性が野生型の複製適性よりも低いかどうかを判定すること、
    を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 耐性ウイルスの特定が、
    （ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスの核酸配列を含むサンプルを、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンの代わりにトレオニンをコードするコドンに相補的な配列を有する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；
    （ｉｉ）前記プローブを前記配列にハイブリダイズさせること；および
    （ｉｉｉ）前記プローブの前記配列へのハイブリダイゼーションを検出すること、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 段階（ｉ）のオリゴヌクレオチドプローブが、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の第８４４３位ヌクレオチドでシチジンを特定するよう設計されている、請求項６に記載の方法。
  8. ２’−Ｃ−メチル分枝ヌクレオシド耐性のＣ型肝炎ウイルスを特定するアレイであって、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンの代わりにトレオニンをコードするコドンに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む、アレイ。
  9. オリゴヌクレオチドプローブが、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の第８４４３位ヌクレオチドでシチジンを特定するよう設計されている、請求項８に記載のアレイ。
  10. ２’−Ｃ−メチル分枝ヌクレオシド耐性のＣ型肝炎ウイルスに感染した宿主における２’−Ｃ−メチル分枝ヌクレオシド耐性のＣ型肝炎を特定するキットであって、
    （ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域のドメインＢの高保存コンセンサス配列ＸＲＸＳＧＸＸＸＴ内においてセリンの代わりにトレオニンをコードするコドンに相補的なオリゴヌクレオチド；
    （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’末端からの核酸の重合に必要とされる材料；および
    （ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマー伸長産物の存在を判定する手段、
    を含むキット。
  11. オリゴヌクレオチドが、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ領域の第８４４３位ヌクレオチドでシチジンを特定するよう設計されている、請求項１０に記載のキット。
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