JP2719512B2 - ポリシストロン性発現ベクター - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は、脊椎動物細胞培養におけるポリ
ペプチド産生への組換DNA技術の適用に係る。更に詳
しくは、本発明は、脊椎動物細胞培養における外来ポリ
ペプチドの産生を操る際の手段としての第2制御ポリペ
プチドのコード配列の利用に係る。 【0002】異種タンパク質すなわち宿主細胞によって
通常産生されないタンパク質を産生するために宿主細胞
を利用する一般的原理はよく知られている。然しなが
ら、得られるタンパク質の取り扱い易さという観点から
望ましい脊椎動物宿主細胞の利用によりかなりの量の異
種タンパク質を得ることには多くの技術的困難性を伴
う。異種タンパク質をコードする遺伝物質をバクテリア
に組み込んでこれを発現させることに成功した例は沢山
知られている。たとえば、ヒトインターフェロン,デス
アセチル−チモシンα−1,ソマトスタチン及びヒト成
長ホルモンがこのようにして産生された。最近、宿主と
して酵母細胞(例えば本出願人の1981年2月25日
付US特許出願番号第237,913号;EPO出願公開
番号第0060057号参照)及び脊椎動物細胞培養物
(1981年8月31日に出願されたUS特許出願番号
第298,235号;EPO出願公開番号第007365
6号参照)のような非−バクテリア宿主を利用すること
が可能になった。哺乳動物のタンパク質の産生に宿主と
して脊椎動物細胞培養物を利用することは有利である。
なぜならば、そのようなシステムは、修飾,グリコシレ
ーション,輸送配列の付加及び細胞の中で産生されたペ
プチドのその他の後処理に対する付加的な可能性を有し
ているからである。例えば、バクテリアは成功裡にトラ
ンスフェクトされ且つ[αチモシン]を発現し得るが、産
生されるポリペプチドは哺乳動物に見られる「天然の」α
チモシンのN−アセチル基を欠いている。 【0003】一般に、宿主細胞が異種タンパク質を産生
し得るように工夫された遺伝子工学技術にあっては、 (1) 「プロモーター」すなわちコード配列の発現を制御
且つ可能にするヌクレオチド配列; (2) mRNAにリボソーム結合部位を付与する配列; (3) 「コード領域」すなわち所望ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列; (4) 所望タンパク質に対する全コードが解読されたな
らその転写を終止させ得る「終止配列」; (5) ベクターが直接ゲノムに組み込まれない場合の
「レプリコン」すなわちベクターが細胞内にあるなら該全
ベクターの再生を可能にする複製のオリジン; を含むDNA配列すなわち「発現ベクター」を調製しなけ
ればならない。 【0004】本発明のベクター構築に於いては、同一の
プロモーターが二つのコード配列即ち所望のタンパク質
のコード配列と第2タンパク質のコード配列とを制御す
ることになる。転写終止もまたこれらの配列によって行
なわれる。然しながら、タンパク質は分離した形態で産
生される。なぜならば、該タンパク質は翻訳終止及び開
始シグナルによって分離されているからである。 【0005】一般に、遺伝発現ベクターは二本鎖DNA
の染色体外ループであるプラスミドの形態にある。これ
らはバクテリア中に天然の形態で存在するものであり、
しばしば細胞毎に多数コピーとして存在する。然しなが
ら、「制限酵素」を用いて適当な配置で上掲した4つの必
須要素を一緒に切り継ぎ(スプライシング)することによ
り、人工プラスミドを構築することも可能である(もち
ろんこれらは最も有用である)。制限酵素とはその触媒
活性が特定の塩基配列での切断に限定されるヌクレアー
ゼであり、各塩基配列は特定の制限酵素に対して特徴的
である。上掲要素(又はその断片)の末端部位をうまく構
築することにより、制限酵素はこれらの要素を一緒に切
り継ぎして最終遺伝発現ベクターを形成するものである
ことが判る。 【0006】次に宿主細胞を誘発してベクターを取り込
ませ(トランスフェクション)、通常の生育の付随的な結
果として所望のポリペプチドの合成が行なわれるように
該宿主細胞を増殖する。 【0007】上記した方法には2つの重要な問題が残っ
ている。その1つは、ベクター中に、上掲した4つの必
須要素に加えて、実際に遺伝発現ベクターを取り込んだ
細胞を端的に選択し得るようなマーカーを有することが
望ましいことである。宿主としてバクテリアを利用する
場合、しばしば用いられるマーカーはテトラサイクリン
又はアンピシリンの如き抗生物質に対する耐性である。
薬剤耐性の細胞のみが抗生物質含有培地で成長する。そ
れ故に、トランスフェクトさせようとする細胞培養物が
抗生物質含有培地で生育する場合には、現実にトランス
フェクトされた細胞のみがコロニーとして出現する。形
質転換の頻度は極めて低いので(理想的条件下でトラン
スフェクトした場合106個の細胞当り約1個の細胞が
形質転換される)、これは実際問題として先ず第一に必
要な要件である。 【0008】宿主として脊椎動物細胞を用いると、達成
される形質転換率はより高くなる(103につき約1個の
細胞)。然しながら、容易な選択は所望のトランスフェ
クトされた細胞を得る際の重要問題として残る。選択は
重要である。なぜならば、細胞分裂の速度がバクテリア
の場合よりも約50倍低いからである。すなわち、E.
coliは約20〜30分毎に1回細胞分裂するが、ヒト組
織培養細胞は12〜24時間毎に1回細胞分裂するだけ
である。 【0009】本発明は、一面において、例えば、宿主細
胞が欠損している必須酵素の如き第2タンパク質のコー
ド配列の発現を利用することにより、所望タンパク質用
遺伝発現ベクターを取り込んだ脊椎動物細胞を選択する
という問題に指向している。例えば、ジヒドロフォレー
トリダクターゼ(DHFR)をDHFR欠損宿主を用いる
際のマーカーとして利用し得る。 【0010】外来宿主に於けるポリペプチド産生の第2
の問題は、満足的量のタンパク質を回収するということ
である。所望の異種ポリペプチド産生を調整し好ましく
は該産生量を高めるべく或るメカニズムを採用すること
は望ましいことである。本発明の別の一面に於いては、
外部制御パラメータによって影響され得る第2のコード
配列を利用し、これらのパラメータを制御することによ
り発現を制御する。更に、2つの配列をそれ自身ポリシ
ストロンとして配置することにより、第1配列の高い発
現レベルを有する形質転換体の選択が可能となる。 【0011】DHFRコード配列が、哺乳動物細胞中に
取り込まれ、発現され且つ増幅され得ることは既に示さ
れている。メトトレキセート耐性チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞からのゲノムDNAがマウス細胞に
取り込まれ、これまたメトトレキセート耐性である形質
転換体が得られている(後記文献1参照)。マウス細胞に
於いてメトトレキセート(MTX)耐性が得られるメカニ
ズムは次の3つによるものと思われる:DHFRコード
配列遺伝子増幅(文献2,3,4参照);X摂取の低下(文献
5,6参照)及び産生されたDHFRのMTXに対する親
和力の低下(文献7参照)。 【0012】MTX曝露によるDHFR遺伝子の増幅は
同時にトランスフェクトされた遺伝子配列の増幅を同時
に生起するものと思われる。B型肝炎DNA配列を含む
プラスミド及びMTX耐性DHFRの突然変異遺伝子を
含むハムスター細胞系(セルライン)からのゲノムDNA
の両者でトランスフェクトされたマウス線維芽細胞は、
DHFR配列増幅を刺激すべくMTXが使用された場
合、培地中に増加された量のB型肝炎表面抗原(HBsA
g)を分泌することが示されている(後記文献8参照)。更
に、E.coliタンパク質XGPRTをコードするmRN
Aは、MTXの存在下で、別個のプロモーターによる制
御下にあるDHFR及びXGPRT遺伝子配列で同時に
トランスフェクトされたCHO細胞中で増幅される(文
献9参照)。また、MTXの存在下でDHFR/SV4
0プラスミド組み合せ中のプロモーター固有の配列発現
もまた増加されることが示された(文献10参照)。 【0013】本発明は、同一のプロモーターの制御下に
ある第2の遺伝コード配列を含む所望ポリペプチドの遺
伝発現ベクターで形質転換された脊椎動物細胞宿主に於
いて、この第2の配列が、一般的に形質転換体に対して
の便利な選択マーカーとなるのみならず、第1の配列に
対し制御デバイスとして作用すると共に第1配列の高い
発現レベルを示す形質転換体に対しても簡便なスクリー
ニングマーカーとなり、もって所望ポリペプチドの発現
が調整されることになり大抵の場合該発現が高められる
ことになるという発見に基づいている。 【0014】このことは、本発明の方法によれば2つの
タンパク質が成熟形態で別々に産生されるので特に重要
である。融合情報(mRNA)が形成されるように2つの
DNAコード配列は同一の転写プロモーターによって制
御されるが、これらは第1の配列に対する翻訳終止シグ
ナル及び第2の配列に対する翻訳開始シグナルによって
分離されており、それ故に2つの異なったタンパク質が
得られるのである。 【0015】脊椎動物宿主細胞培養システムは動物シス
テムに適当なグリコシレーション,ホスホリレーション
及び脂質会合を生起し得るので(バクテリア宿主ではこ
れが起こらない)しばしば有利であり、このような状況
に合うマーカーシステム及び調整システムが得られると
いうことは重要な意味をもつ。 【0016】したがって、本発明の一面は、第2のタン
パク質及び所望タンパク質をコードする配列を含み、所
望配列及び第2配列の両者が同一のプロモーターによっ
て支配されているポリシストロン性発現ベクターを利用
して、脊椎動物細胞宿主から有用な異種タンパク質を得
る方法にある。コード配列は翻訳停止及び開始シグナル
コドンによって分離されている。第2配列の発現は所望
タンパク質の配列の発現に対して制御作用を及ぼし、第
2タンパク質はトランスフェクトされた細胞の選択に対
するマーカーとして作用する。本発明はこれら作用のい
ずれか一方又は両方を有する第2配列を利用するもので
ある。 【0017】他の面に於いては本発明は、所望の異種ペ
プチドを産生するために脊椎動物細胞をトランスフェク
トするのに適した遺伝発現ベクター,このトランスフェ
クションによって生じた細胞培養物及びこの細胞培養に
よって産生されたポリペプチドに関する。 【0018】A.定 義 本明細書中の「プラスミド」とは、バクテリア中に天然に
存在するプラスミド及び人工的に構築した感情DNA断
片の両方を含む。 【0019】本明細書中の「発現ベクター」とは、宿生細
胞培養に於ける異種ペプチド発現のための上掲した4つ
の必須要素を少なくとも含むプラスミドを意味する。 【0020】本明細書中の「異種タンパク質」とは、宿生
有機体によっては通常産生されないものであるか又はそ
の生存のためには通常要求されないタンパク質又はペプ
チドを意味する。 【0021】本明細書中の「所望タンパク質」とは、本発
明方法で産生しようとする異種タンパク質又はペプチド
を意味する。 【0022】本明細書中の「第2ペプチド」とは、宿生細
胞に於ける発現の第1産物として望ましい異種ペプチド
ではないタンパク質又はペプチドを意味し、このタンパ
ク質自身の性質又はこれをコードしている配列の性質に
よって、発現ベクターによるトランスフェクションのマ
ーカーとなり得及び/又は第1の所望の異種ペプチドの
発現を調整し得る別の異種ペプチドを意味する。 【0023】ペプチド配列は約5個のアミノ酸のように
短いものから約1000のアミノ酸のように長いものま
である。ペプチドという用語とタンパク質という用語の
従来から観念されている相違は本明細書に於いては従来
のように識別されていない。区別されなければならない
場合には、そのように特定する。 【0024】本明細書中の「第1配列」とは、所望ペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列である。 【0025】本明細書中の「第2配列」とは、第2ペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列である。 【0026】本明細書中の宿主細胞の「トランスフェク
ション」とは、何らかのコード配列が実際に発現される
か否かに関わりなく、検知可能なように発現ベクターが
宿主細胞に取り込まれたことを意味する。本発明に於い
ては、成功的トランスフェクションは該宿主細胞中のこ
のベクターの作用の何らかの徴候が認められたなら確認
されたことになる。この意味に於いて成功の種々のレベ
ルが存在することが判る。第1に、ベクターのコード配
列は発現されるかもしれないしされないかもしれない。
しかし、ベクターがプロモーター及びターミネーターを
含んで適切に構築されたなら、発現が生起する確率は高
い。第2に、ベクターとなるプラスミドが細胞中に取り
込まれて発現されていても細胞の正常染色体中に組み込
まれていない場合には、このプラスミドを発現する能力
は数世代後喪失される。一方、ベクターが染色体中に組
み込まれれば、宿主細胞の繰り返し複製を通じて発現は
安定している。また中間の結果となる場合もある。トラ
ンスフェクションがこのように生起し得る方法の詳細は
理解されていないが、宿主培養の数世代に亘る発現の安
定性という意味で一連の成果が実験的に認められている
ことは明らかである。 【0027】B.所望ペプチドの好ましい具体例 好ましい特定の具体例に於いては、例えば、第1の遺伝
子配列はB型肝炎表面抗原(HBsAg)をコードする。こ
のタンパク質はB型肝炎ウィルスから誘導されるもので
あり、ヒトのB型肝炎の感染源である。この病気は衰
弱,肝臓障害,初期癌及び時には死をもたらすものであ
る。この病気は特に多くのアフリカの国々及びアジアの
国々でかなり流行しており、これらの国々では多数の人
々が該病気を潜在的に伝染する慢性的保菌者となってい
る。このウィルス(HBV)は該カプシド更にエンベロー
プで包囲されているDNA分子からなる。該ウィルスに
関連しているタンパク質は表面抗原(HBsAg),コア抗
原及びDNAポリメラーゼ等である。HBsAgは感染し
たヒトに抗体を生じさせることが知られている。感染個
体の血清中に見られるHBsAgは径の平均値が約22nm
であるタンパク質粒子からなり、そのため「22nm粒子」
と呼称されている。したがって、HBsAg粒子がワクチ
ン用の有効な基剤となると思われる。 【0028】C.第2ペプチドの好ましい具体例 或る生育条件下で細胞によって産生される一定量の特定
酵素を制御するのに環境条件がしばしば有効であること
が認められている。本発明の好ましい具体例において
は、ジヒドロフォレートリダクターゼ(DHFR)の阻害
剤であるメトトレキセート(MTX)に対するある種の細
胞の感受性を利用する。DHFRは1つの炭素単位の転
位を含む合成反応に間接的に要求される酵素である。D
HFR活性を欠いていると、その合成に1つの炭素単位
の転位が必要とされる化合物が存在する場合を除いて、
細胞は成長することができない。然しながら、DHFR
を欠く細胞はグリシン,チミジン及びヒポキサンチンが
共に存在すると成育する。 【0029】通常DHFRを産生する細胞は、メトトレ
キセートによって阻害されることが知られている。殆ん
どの場合、適当量のメトトレキセートを正常細胞に添加
すると、細胞の死につながる。しかしながら、或る種の
細胞はDHFRの量を多くすることによってメトトレキ
セート処理に対しても生き残るようであり、この酵素を
阻害するメトトレキセートの能力を超えるものを有して
いる(後記文献2,3,4参照)。このような細胞に於いて
はDHFR配列をコードするメッセンジャーRNAの量
が増加していることが既に示されている。このことはこ
のメッセンジャーRNAをコードする遺伝子物質中のD
NA量が増加していることを仮想することにより説明が
つくものである。実際、メトトレキセートの添加は明ら
かにDHFR遺伝子の遺伝子増幅を生起する。同一のプ
ロモーターによって調整されてはいないが、DHFR配
列に物理的に結合している遺伝子配列もまた増幅される
(文献1,8,9,10参照)。結局、別種のタンパク質(こ
の場合は所望のタンパク質である)に対する遺伝子を付
随的に増幅するために、メトトレキセート処理によって
得られるDHFR遺伝子の増幅を利用することが可能と
なる。 【0030】更に、DHFRに対する第2の配列が取り
込まれる宿主細胞そのものがDHFR欠損であると、D
HFRはまた成功裡にトランスフェクトされた細胞の選
択に対する簡便なマーカーとして作用する。DHFR配
列が所望ペプチドに対する配列に有効に結合している
と、この能力は所望の配列を用いる成功的トランスフェ
クションに対するマーカーとして同様に作用する。 【0031】D.使用したベクター構築技術(物質及び
方法) 下記Fに記載の実施例で構築されたベクターは単離プラ
スミド又はDNA断片の開裂及び結合によって構築され
たものである。 【0032】適当なバッファー中で1種又は複数の制限
酵素で処理する開裂が起こる。一般に、約20μgのプ
ラスミド又はDNA断片は200μlのバッファー溶液
中の約1〜5単位の酵素を必要とする(特定の制限酵素
に対する適当なバッファーは製造業者により特定されて
いる)。37℃で約1時間のインキュベーション時間が
実行可能である。インキュベーション後、タンパク質を
フェノール及びクロロホルムで抽出除去し、核酸をエタ
ノールを用いる沈澱により水性画分から回収する。 【0033】平滑末端が要求される場合には、調製物を
10単位のポリメラーゼI(Klenow)を用いて15℃で
15分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱する。 【0034】開裂断片のサイズ分離をD.Goeddel et
al.,Nucleic Acids Res.,8:4057(198
0)に記載されている6%ポリアクリルアミドゲルを用
いて行なう。この文献に記載の内容を本発明書中に含め
るものとする。 【0035】ほぼ等モル量の所望成分を結合するため
に、正しい整合性を提供するべく適当に末端処理し、
0.5μgDNAにつき約10単位のT4DNAリガーゼ
で処理する。 【0036】E.好ましい具体例の詳細な説明 一般に、本発明に好適な発現ベクターは遺伝子スプライ
シング技術の適用により構築される。出発物質は天然の
バクテリアプラスミドであり、必要に応じて予め修飾し
ておく。本発明の好ましい具体例に於いては、M.Lus
ky et al.,Nature.239:79(1981)に記載
の方法により調製された修飾pBR322プラスミドで
あるpMLプラスミドを利用する。これは、サルウィル
スSV40から誘導される唯一のプロモーター並びにD
HFR及びHBsAgに対するコード配列を含有する。 【0037】構築に於いて、プロモーターを(リボソー
ム結合配列と共に)、所望タンパク質をコードするコー
ド配列及び第2タンパク質をコードするコード配列の上
流に位置させる。単一の転写終止配列を両者の下流に位
置させる。上流コード配列の末端部に翻訳終止シグナル
を位置させ、その下流に下流配列の翻訳開始シグナルを
位置する。このようにして、2つのコード配列が単一m
RNA鎖中で発現するが、2つの別々の成熟タンパク質
が発現される。 【0038】特に好ましい具体例に於いては、第2ペプ
チドをコードする配列は所望ペプチドをコードする配列
の下流にある。これらの環境下にあっては、第2ペプチ
ドによって形質転換された細胞を選択しようとする方法
が、所望ペプチドの特に高い産生をも選択する。 【0039】F.実 施 例 下記実施例は本発明を説明するものであって、何ら本発
明を制限するものではない。 【0040】実施例1 HBsAg配列含有ベクターpE
342.HS94.HBV 図1に、HBsAgプラスミドの構築を示す。表面抗原遺
伝子を含む1986 bp EcoRI−BglII断片を、L
iu et al.,DNA.1:213(1982)(本明細書
中に包含する)に記載の如く、pBR322でクローン化
したHBVウィルスゲノムから単離した。この配列をp
MLのEcoRI及びBamHI部位間に結合した。pML
はLusky et al.,Nature,293:79(1981)
(本明細書中に包含する)に記載のように、サル細胞中で
の複製を阻害する配列を欠如しているpBR322誘導
体である。得られたプラスミドの唯一のEcoRI部位
に、ウィルスゲノムのHindIII及びPvuII消化に
よって得、予め修飾して両端をEcoRI制限部位にした
SV40の342pbオリジン断片を挿入してp342E
を得た。p342E(pHBs348−Eとも指称される)
は、Levinson et al.,による1981年12月3日
付出願の米国特許出願第326,980号明細書に記載
されている。該出願を引用して本明細書中に包含する
(欧州特許出願公開第0073656号)。要約すれば、
サルウィルスSV40のオリジンを単離するために、S
V40DNAをHindIIIで消化し、コンバーター(A
GCTGAATTC)を添加してHindIII末端をEco
RI末端に変換した。DNAをPvuIIで切断しRIリ
ンカーを添加した。EcoRIで消化後、オリジンを含む
348bp断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電
気溶出で単離し、pBR322中でクローン化した。H
BV(Animal Virus Genetics(Ch.5)Acad.Pr
es,N.Y.(1980))のEcoRI及びBglIIによる
消化で得られた1986bp断片(これはHBsAgをコー
ドする遺伝子を含んでいる)を、EcoRI部位及びBam
HI部位でプラスミドpML(Lusky et al.,Natur
e.293:79(1981))にクローン化して発現プラ
スミドpHBs348−Eを構築した(pMLは、サル細胞
中でのプラスミド複製を阻害する配列が除去された欠失
を有するpBR322誘導体である)。得られたプラスミ
ド(pRI−Bgl)を次にEcoRIで直線化し、SV40
のオリジン領域を示す348bp断片をpRI−BglのEc
oRI部位に導入した。オリジン断片はいずれの配向で
も挿入され得る。この断片は複製のオリジン以外に初期
及び後期のSV40プロモーターをコードしているの
で、オリジンの配向次第でどちらかのプロモーターが作
用し該プロモーターの制御下でHBV遺伝子が発現し得
た(pHBS348−Eは初期プロモーターの制御下で発
現したHBsを示す)。pE342を修飾するために、pE
342をEcoRIで部分消化し、Klenow DNAポリ
メラーゼIを用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再
結合し、これによりpE342中のSV40オリジンに
先行するEcoRI部位を除去する。得られたプラスミド
即ち、pE342△R1をEcoRIで消化し、Klenow
DNAポリメラーゼIを用いて充填し、BamHIで再度
切断する。アクリルアミドゲル電気泳動後、約3500
bp断片を電気溶出し、フェノール−クロロホルム抽出
し、前記の如くエタノール沈澱させる。EcoRI及びX
baで消化してHBsAgの5'非翻訳リーダー領域を除去
し、肝炎発現プラスミドpHS94(Liu et al.,上
掲)の類似する150bpEcoRI−Xba断片を代わりに
挿入してpE342.HS94.HBVを形成した。 【0041】(Liu et al.,によって記載されている
ようにpHS94は真のHBsAg遺伝子の翻訳開始コド
ンを含むが、5'非翻訳情報配列は全部欠如している。
前記のごときSV40初期プロモーターの制御下で真の
EcoRI−BglII断片とpHS94由来等価物の双方
の発現レベルは同等であり、プラスミドの性能に影響す
ることなく交換可能である。) 【0042】実施例2 DHFR配列含有ベクターpE
342.D22 唯一の発現可能な配列としてDHFRを担持するプラス
ミドpE348.D22の構築を図2に示す。 【0043】DHFR cDNAプラスミド pDHFR
−11(Nunberg et al.,Cell,19:355(198
0)参照)の1600bp PstIインサートをエキソヌク
レアーゼBal31で処理してPstI部位に隣接するポリ
G:C領域を除去し、BglIIで消化し、得られた約6
60bp断片をゲルから単離した。Bal31−BglII消
化cDNAをBglII部位を含有するpBR322プラス
ミド誘導体に結合した(pBR322をHindIIIで消
化した後、プラスミド断片をKlenow DNAポリメラ
ーゼを用いて4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存
在下で充填し、BglIIで再切断した)。得られたプラ
スミドpDHFR−D22は、pBR322とDHFR
cDNAの5'末端との融合部位の29bp上流に位置する
EcoRI部位を有する。次いで、cDNAインサートの
コード配列を含むEcoRI−BglII断片をpDHFR
−D22から切り出し、EcoRI−BamHIで消化した
pE342.HBV(実施例1)に結合してDHFR発現
プラスミドpE342.D22を形成した。 【0044】実施例3 DHFR及びHBsAg配列双方
を含有するベクター 2種のベクター、即ちDHFR遺伝子がHBsAg遺伝子
の下流にあるポリシストロン含有ベクターpE342.
HBV.D22、並びにDHFR及びHBsAg遺伝子が
ポリシストロンになっていないベクター、pE342.
HBV.E400.D22を構築した(図3)。A .クローン化HBV DNA(Liu et al.,上掲)
のEcoRI−TaqI断片を、EcoRI−ClaIで消化し
たpE342.D22に結合してpE342.HBV.D
22を構築した。B . pE342.HBV.D22のBglII部位とD
HFRインサートのClaI部位間にSV40初期プロモ
ーターを融合して更に修飾した。HBVウィルスDNA
は、BglII部位を超えて20bpの位置に唯一のTaqI
部位を含有している。この部位を用いて、表面抗原遺伝
子を含むEcoRI−BglII断片を生成した。即ち、ク
ローン化HBVウィルスDNAをEcoRI及びTaqI消
化すると、表面抗原遺伝子を含み且つEcoRI部位から
1985bp離れている(Liu et al.,上掲)唯一のBg
lII部位を含有する〜2000bpの断片が得られる。
(消化によって生成するDNA断片の末端TaqI及びCl
aIは粘着性であり共に結合する。) 【0045】ClaI部位が再生される。即ち、pE34
2.HBV.D22はBglII及びClaI部位の双方を
含み、これらはDHFRコード配列の直前に位置してい
る。 【0046】SV40DNAをHpaIIで消化し、前記
のように充填し、HindIIIで再切断して、pE34
2.HBV.D22のBglII及びClaI部位に対して
粘着性の制限部位を両端に有するSV40オリジンを構
築した。オリジンを含む440bp断片を単離した。これ
をHindIII及びBamHI消化によって生成する40
00bp pBR322断片並びに、クローン化したHB
VウィルスDNAをEcoRI消化しKlenow DNAポ
リメラーゼIで充填し、BglIIで再消化し、アクリル
アミドゲルで単離して生成した表面抗原遺伝子を含む1
986bp断片と共に三者間結合した。これら3種の断片
の結合は、充填したHpaIIをEcoRIと、2個のHin
dIII部位を互いに、且つBglIIをBamHIと結合
することによってのみ達成し得る。次いで、得られたプ
ラスミドをClaI及びBamHIで制限消化すると、SV
40オリジンを含む470bp断片が得られる。この断片
をpE342.HBV.D22のClaI及びBglII部
位に挿入して、pE342.HBV.E400.D22
を形成する(図3参照)。 【0047】実施例4 宿主細胞のトランスフェクショ
ン 本実施例の宿主細胞は組織培養で増殖させた脊椎動物細
胞である。当業界で公知のように、これらの細胞は単離
した正常細胞から連続トランスファー処理により得ら
れ、永久セルラインとして維持し得る。これらのセルラ
インは、液体媒質中の固体支持体上に維持されるか、又
は支持栄養物を含有する懸濁物中で増殖させることによ
り維持される。 【0048】好ましい実施例では、DHFR活性を欠損
しているCHO細胞を使用した。これらの細胞は、Url
aub and Chasin.Proc.Natl.Acad.Sci.(U
SA),77:4216(1980)(本明細書中に包含す
る)に記載のように製造し増殖させる。 【0049】これらの細胞を上記のように調製された所
望のベクター5mgで、Graham andVan Der Eb.
Virology.55:456(1978)(本明細書中に包含
する)の方法でトランスフェクトする。 【0050】一連のプラスミドが特定宿主細胞と確実に
相互作用するようにし得る方法があり、その結果1個の
プラスミドが細胞に吸収されると他のプラスミドも同様
に吸収される確立が増大する。従って、1次配列及び2
次配列を夫々含む別々のベクターを使用してこれらの配
列を導入してもよいし、両配列を含む単一ベクターを使
用して導入してもよい。 【0051】実施例5 トランスフェクトされた細胞の
増殖及びペプチドの発現 前記のトランスフェクション操作にかけたCHO細胞
を、最初非選択媒地中で2日間増殖させ、次いでグリシ
ン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く媒地中に細胞を
移し、プラスミドDHFRを発現し得る細胞を選択し
た。約1〜2週間後個々のコロニーをクローニングリン
グで単離した。 【0052】60又は100mmの組織培養皿に約0.5
×106細胞/皿で細胞をプレートした。2日間増殖さ
せた後、増殖培地を交換した。24時間後RIA(Ausr
iaII,Abbott)でHBsAgをアッセイした。細胞をカ
ウントし、HBsAg産生を細胞1個当りの基準で標定し
た。このようにして、使用した各ベクターについて10
〜20個のランダムなコロニーを解析した。 【0053】本発明の一実施例で次表の結果が得られ
た。 【表1】 【0054】最高の発現を示すセルラインの数個で20
回以上の移行の間表面抗原の産生をモニターしたところ
安定であった。表面抗原を発現する細胞は基層に無限に
付着したままであり、培地を補充している限りは大量の
表面抗原を分泌し続ける。 【0055】ポリシストロン性遺伝子構築によって高レ
ベルのHBsAgを産生する細胞が単離されることは明ら
かである。pE342.HBV.D22で形質転換され
たコロニーは100%が500mg/106細胞/日以上
を産生したが、非ポリシストロン性プラスミドpE34
2.HBV.E400.D22で形質転換されたコロニ
ーは92%が前記量より少量を産生した。1500ng/
106細胞/日以上のレベルで産生したのはポリシスト
ロン性トランスフェクションを行なった細胞のみであっ
た。 【0056】実施例6 メトトレキセート処理 表面抗原を産生するセルラインは、10nMより高濃度
のメトトレキセート(MTX.DHFRの特異的阻害剤)
によって阻害される。MTXの組織培養細胞に対する影
響に関する従来の研究結果と一致して、約10-5の頻度
で高濃度(50nM)のMTXに耐性のクローンが出現す
る。然しながら、これらのクローンは、MTX耐性クロ
ーン中でHBV配列が増幅するにもかかわらず、最早表
面抗原を産生しない。即ちこの場合、HBV遺伝子は増
幅されるが発現は低下する。これは、表面抗原を更に産
生すると細胞に致死性になることを示す。 【0057】実施例7 所望ペプチドの回収 産生された表面抗原は、ウィルスに感染した患者の血清
で観察される22nm粒子に類似の粒子状である。この抗
原形態は高い免疫原性を有することが示されている。仔
ウシ血清又は他の補足物を欠く培地で細胞を増殖させる
と、培地に含有されるタンパク質の約10%が表面抗原
であり、このタンパク質は当業界に公知の方法で単離さ
れ得る。表面抗原は、SDS−ポリアクリルアミドゲル
上を22nm粒子由来タンパクと共に移動する。 【0058】文 献 1.Wigler,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.77:3567(1980) 2.Schimke,Robert T.et al.,Science 20
2:1051(1978) 3.Biedler,J.L.et al.,Cancer Res.32:
153(1972) 4.Chang,S.E.et al.,Cell 7:391(19
76) 5.Fischer,G.A.,Biochem Pharmacol.11:
1233(1962) 6.Sirotnak,F.M.et al.,Cancer Res.2
8:75(1968) 7.Flintoff,W.F.et al.,Somat.Cell.Gen
et.2:245(1976) 8.Christman,J.et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.79:1815(1982) 9.Ringold,Gordon et al.,J.Molec and A
ppl.Gen.1:165(1981) 10.Kaufman,R.F.et al.,J.Molec.Bio
l.159:601(1982) 11.Perucho,Manual et al.,Cell 22:30
9(1980)
ペプチド産生への組換DNA技術の適用に係る。更に詳
しくは、本発明は、脊椎動物細胞培養における外来ポリ
ペプチドの産生を操る際の手段としての第2制御ポリペ
プチドのコード配列の利用に係る。 【0002】異種タンパク質すなわち宿主細胞によって
通常産生されないタンパク質を産生するために宿主細胞
を利用する一般的原理はよく知られている。然しなが
ら、得られるタンパク質の取り扱い易さという観点から
望ましい脊椎動物宿主細胞の利用によりかなりの量の異
種タンパク質を得ることには多くの技術的困難性を伴
う。異種タンパク質をコードする遺伝物質をバクテリア
に組み込んでこれを発現させることに成功した例は沢山
知られている。たとえば、ヒトインターフェロン,デス
アセチル−チモシンα−1,ソマトスタチン及びヒト成
長ホルモンがこのようにして産生された。最近、宿主と
して酵母細胞(例えば本出願人の1981年2月25日
付US特許出願番号第237,913号;EPO出願公開
番号第0060057号参照)及び脊椎動物細胞培養物
(1981年8月31日に出願されたUS特許出願番号
第298,235号;EPO出願公開番号第007365
6号参照)のような非−バクテリア宿主を利用すること
が可能になった。哺乳動物のタンパク質の産生に宿主と
して脊椎動物細胞培養物を利用することは有利である。
なぜならば、そのようなシステムは、修飾,グリコシレ
ーション,輸送配列の付加及び細胞の中で産生されたペ
プチドのその他の後処理に対する付加的な可能性を有し
ているからである。例えば、バクテリアは成功裡にトラ
ンスフェクトされ且つ[αチモシン]を発現し得るが、産
生されるポリペプチドは哺乳動物に見られる「天然の」α
チモシンのN−アセチル基を欠いている。 【0003】一般に、宿主細胞が異種タンパク質を産生
し得るように工夫された遺伝子工学技術にあっては、 (1) 「プロモーター」すなわちコード配列の発現を制御
且つ可能にするヌクレオチド配列; (2) mRNAにリボソーム結合部位を付与する配列; (3) 「コード領域」すなわち所望ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列; (4) 所望タンパク質に対する全コードが解読されたな
らその転写を終止させ得る「終止配列」; (5) ベクターが直接ゲノムに組み込まれない場合の
「レプリコン」すなわちベクターが細胞内にあるなら該全
ベクターの再生を可能にする複製のオリジン; を含むDNA配列すなわち「発現ベクター」を調製しなけ
ればならない。 【0004】本発明のベクター構築に於いては、同一の
プロモーターが二つのコード配列即ち所望のタンパク質
のコード配列と第2タンパク質のコード配列とを制御す
ることになる。転写終止もまたこれらの配列によって行
なわれる。然しながら、タンパク質は分離した形態で産
生される。なぜならば、該タンパク質は翻訳終止及び開
始シグナルによって分離されているからである。 【0005】一般に、遺伝発現ベクターは二本鎖DNA
の染色体外ループであるプラスミドの形態にある。これ
らはバクテリア中に天然の形態で存在するものであり、
しばしば細胞毎に多数コピーとして存在する。然しなが
ら、「制限酵素」を用いて適当な配置で上掲した4つの必
須要素を一緒に切り継ぎ(スプライシング)することによ
り、人工プラスミドを構築することも可能である(もち
ろんこれらは最も有用である)。制限酵素とはその触媒
活性が特定の塩基配列での切断に限定されるヌクレアー
ゼであり、各塩基配列は特定の制限酵素に対して特徴的
である。上掲要素(又はその断片)の末端部位をうまく構
築することにより、制限酵素はこれらの要素を一緒に切
り継ぎして最終遺伝発現ベクターを形成するものである
ことが判る。 【0006】次に宿主細胞を誘発してベクターを取り込
ませ(トランスフェクション)、通常の生育の付随的な結
果として所望のポリペプチドの合成が行なわれるように
該宿主細胞を増殖する。 【0007】上記した方法には2つの重要な問題が残っ
ている。その1つは、ベクター中に、上掲した4つの必
須要素に加えて、実際に遺伝発現ベクターを取り込んだ
細胞を端的に選択し得るようなマーカーを有することが
望ましいことである。宿主としてバクテリアを利用する
場合、しばしば用いられるマーカーはテトラサイクリン
又はアンピシリンの如き抗生物質に対する耐性である。
薬剤耐性の細胞のみが抗生物質含有培地で成長する。そ
れ故に、トランスフェクトさせようとする細胞培養物が
抗生物質含有培地で生育する場合には、現実にトランス
フェクトされた細胞のみがコロニーとして出現する。形
質転換の頻度は極めて低いので(理想的条件下でトラン
スフェクトした場合106個の細胞当り約1個の細胞が
形質転換される)、これは実際問題として先ず第一に必
要な要件である。 【0008】宿主として脊椎動物細胞を用いると、達成
される形質転換率はより高くなる(103につき約1個の
細胞)。然しながら、容易な選択は所望のトランスフェ
クトされた細胞を得る際の重要問題として残る。選択は
重要である。なぜならば、細胞分裂の速度がバクテリア
の場合よりも約50倍低いからである。すなわち、E.
coliは約20〜30分毎に1回細胞分裂するが、ヒト組
織培養細胞は12〜24時間毎に1回細胞分裂するだけ
である。 【0009】本発明は、一面において、例えば、宿主細
胞が欠損している必須酵素の如き第2タンパク質のコー
ド配列の発現を利用することにより、所望タンパク質用
遺伝発現ベクターを取り込んだ脊椎動物細胞を選択する
という問題に指向している。例えば、ジヒドロフォレー
トリダクターゼ(DHFR)をDHFR欠損宿主を用いる
際のマーカーとして利用し得る。 【0010】外来宿主に於けるポリペプチド産生の第2
の問題は、満足的量のタンパク質を回収するということ
である。所望の異種ポリペプチド産生を調整し好ましく
は該産生量を高めるべく或るメカニズムを採用すること
は望ましいことである。本発明の別の一面に於いては、
外部制御パラメータによって影響され得る第2のコード
配列を利用し、これらのパラメータを制御することによ
り発現を制御する。更に、2つの配列をそれ自身ポリシ
ストロンとして配置することにより、第1配列の高い発
現レベルを有する形質転換体の選択が可能となる。 【0011】DHFRコード配列が、哺乳動物細胞中に
取り込まれ、発現され且つ増幅され得ることは既に示さ
れている。メトトレキセート耐性チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞からのゲノムDNAがマウス細胞に
取り込まれ、これまたメトトレキセート耐性である形質
転換体が得られている(後記文献1参照)。マウス細胞に
於いてメトトレキセート(MTX)耐性が得られるメカニ
ズムは次の3つによるものと思われる:DHFRコード
配列遺伝子増幅(文献2,3,4参照);X摂取の低下(文献
5,6参照)及び産生されたDHFRのMTXに対する親
和力の低下(文献7参照)。 【0012】MTX曝露によるDHFR遺伝子の増幅は
同時にトランスフェクトされた遺伝子配列の増幅を同時
に生起するものと思われる。B型肝炎DNA配列を含む
プラスミド及びMTX耐性DHFRの突然変異遺伝子を
含むハムスター細胞系(セルライン)からのゲノムDNA
の両者でトランスフェクトされたマウス線維芽細胞は、
DHFR配列増幅を刺激すべくMTXが使用された場
合、培地中に増加された量のB型肝炎表面抗原(HBsA
g)を分泌することが示されている(後記文献8参照)。更
に、E.coliタンパク質XGPRTをコードするmRN
Aは、MTXの存在下で、別個のプロモーターによる制
御下にあるDHFR及びXGPRT遺伝子配列で同時に
トランスフェクトされたCHO細胞中で増幅される(文
献9参照)。また、MTXの存在下でDHFR/SV4
0プラスミド組み合せ中のプロモーター固有の配列発現
もまた増加されることが示された(文献10参照)。 【0013】本発明は、同一のプロモーターの制御下に
ある第2の遺伝コード配列を含む所望ポリペプチドの遺
伝発現ベクターで形質転換された脊椎動物細胞宿主に於
いて、この第2の配列が、一般的に形質転換体に対して
の便利な選択マーカーとなるのみならず、第1の配列に
対し制御デバイスとして作用すると共に第1配列の高い
発現レベルを示す形質転換体に対しても簡便なスクリー
ニングマーカーとなり、もって所望ポリペプチドの発現
が調整されることになり大抵の場合該発現が高められる
ことになるという発見に基づいている。 【0014】このことは、本発明の方法によれば2つの
タンパク質が成熟形態で別々に産生されるので特に重要
である。融合情報(mRNA)が形成されるように2つの
DNAコード配列は同一の転写プロモーターによって制
御されるが、これらは第1の配列に対する翻訳終止シグ
ナル及び第2の配列に対する翻訳開始シグナルによって
分離されており、それ故に2つの異なったタンパク質が
得られるのである。 【0015】脊椎動物宿主細胞培養システムは動物シス
テムに適当なグリコシレーション,ホスホリレーション
及び脂質会合を生起し得るので(バクテリア宿主ではこ
れが起こらない)しばしば有利であり、このような状況
に合うマーカーシステム及び調整システムが得られると
いうことは重要な意味をもつ。 【0016】したがって、本発明の一面は、第2のタン
パク質及び所望タンパク質をコードする配列を含み、所
望配列及び第2配列の両者が同一のプロモーターによっ
て支配されているポリシストロン性発現ベクターを利用
して、脊椎動物細胞宿主から有用な異種タンパク質を得
る方法にある。コード配列は翻訳停止及び開始シグナル
コドンによって分離されている。第2配列の発現は所望
タンパク質の配列の発現に対して制御作用を及ぼし、第
2タンパク質はトランスフェクトされた細胞の選択に対
するマーカーとして作用する。本発明はこれら作用のい
ずれか一方又は両方を有する第2配列を利用するもので
ある。 【0017】他の面に於いては本発明は、所望の異種ペ
プチドを産生するために脊椎動物細胞をトランスフェク
トするのに適した遺伝発現ベクター,このトランスフェ
クションによって生じた細胞培養物及びこの細胞培養に
よって産生されたポリペプチドに関する。 【0018】A.定 義 本明細書中の「プラスミド」とは、バクテリア中に天然に
存在するプラスミド及び人工的に構築した感情DNA断
片の両方を含む。 【0019】本明細書中の「発現ベクター」とは、宿生細
胞培養に於ける異種ペプチド発現のための上掲した4つ
の必須要素を少なくとも含むプラスミドを意味する。 【0020】本明細書中の「異種タンパク質」とは、宿生
有機体によっては通常産生されないものであるか又はそ
の生存のためには通常要求されないタンパク質又はペプ
チドを意味する。 【0021】本明細書中の「所望タンパク質」とは、本発
明方法で産生しようとする異種タンパク質又はペプチド
を意味する。 【0022】本明細書中の「第2ペプチド」とは、宿生細
胞に於ける発現の第1産物として望ましい異種ペプチド
ではないタンパク質又はペプチドを意味し、このタンパ
ク質自身の性質又はこれをコードしている配列の性質に
よって、発現ベクターによるトランスフェクションのマ
ーカーとなり得及び/又は第1の所望の異種ペプチドの
発現を調整し得る別の異種ペプチドを意味する。 【0023】ペプチド配列は約5個のアミノ酸のように
短いものから約1000のアミノ酸のように長いものま
である。ペプチドという用語とタンパク質という用語の
従来から観念されている相違は本明細書に於いては従来
のように識別されていない。区別されなければならない
場合には、そのように特定する。 【0024】本明細書中の「第1配列」とは、所望ペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列である。 【0025】本明細書中の「第2配列」とは、第2ペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列である。 【0026】本明細書中の宿主細胞の「トランスフェク
ション」とは、何らかのコード配列が実際に発現される
か否かに関わりなく、検知可能なように発現ベクターが
宿主細胞に取り込まれたことを意味する。本発明に於い
ては、成功的トランスフェクションは該宿主細胞中のこ
のベクターの作用の何らかの徴候が認められたなら確認
されたことになる。この意味に於いて成功の種々のレベ
ルが存在することが判る。第1に、ベクターのコード配
列は発現されるかもしれないしされないかもしれない。
しかし、ベクターがプロモーター及びターミネーターを
含んで適切に構築されたなら、発現が生起する確率は高
い。第2に、ベクターとなるプラスミドが細胞中に取り
込まれて発現されていても細胞の正常染色体中に組み込
まれていない場合には、このプラスミドを発現する能力
は数世代後喪失される。一方、ベクターが染色体中に組
み込まれれば、宿主細胞の繰り返し複製を通じて発現は
安定している。また中間の結果となる場合もある。トラ
ンスフェクションがこのように生起し得る方法の詳細は
理解されていないが、宿主培養の数世代に亘る発現の安
定性という意味で一連の成果が実験的に認められている
ことは明らかである。 【0027】B.所望ペプチドの好ましい具体例 好ましい特定の具体例に於いては、例えば、第1の遺伝
子配列はB型肝炎表面抗原(HBsAg)をコードする。こ
のタンパク質はB型肝炎ウィルスから誘導されるもので
あり、ヒトのB型肝炎の感染源である。この病気は衰
弱,肝臓障害,初期癌及び時には死をもたらすものであ
る。この病気は特に多くのアフリカの国々及びアジアの
国々でかなり流行しており、これらの国々では多数の人
々が該病気を潜在的に伝染する慢性的保菌者となってい
る。このウィルス(HBV)は該カプシド更にエンベロー
プで包囲されているDNA分子からなる。該ウィルスに
関連しているタンパク質は表面抗原(HBsAg),コア抗
原及びDNAポリメラーゼ等である。HBsAgは感染し
たヒトに抗体を生じさせることが知られている。感染個
体の血清中に見られるHBsAgは径の平均値が約22nm
であるタンパク質粒子からなり、そのため「22nm粒子」
と呼称されている。したがって、HBsAg粒子がワクチ
ン用の有効な基剤となると思われる。 【0028】C.第2ペプチドの好ましい具体例 或る生育条件下で細胞によって産生される一定量の特定
酵素を制御するのに環境条件がしばしば有効であること
が認められている。本発明の好ましい具体例において
は、ジヒドロフォレートリダクターゼ(DHFR)の阻害
剤であるメトトレキセート(MTX)に対するある種の細
胞の感受性を利用する。DHFRは1つの炭素単位の転
位を含む合成反応に間接的に要求される酵素である。D
HFR活性を欠いていると、その合成に1つの炭素単位
の転位が必要とされる化合物が存在する場合を除いて、
細胞は成長することができない。然しながら、DHFR
を欠く細胞はグリシン,チミジン及びヒポキサンチンが
共に存在すると成育する。 【0029】通常DHFRを産生する細胞は、メトトレ
キセートによって阻害されることが知られている。殆ん
どの場合、適当量のメトトレキセートを正常細胞に添加
すると、細胞の死につながる。しかしながら、或る種の
細胞はDHFRの量を多くすることによってメトトレキ
セート処理に対しても生き残るようであり、この酵素を
阻害するメトトレキセートの能力を超えるものを有して
いる(後記文献2,3,4参照)。このような細胞に於いて
はDHFR配列をコードするメッセンジャーRNAの量
が増加していることが既に示されている。このことはこ
のメッセンジャーRNAをコードする遺伝子物質中のD
NA量が増加していることを仮想することにより説明が
つくものである。実際、メトトレキセートの添加は明ら
かにDHFR遺伝子の遺伝子増幅を生起する。同一のプ
ロモーターによって調整されてはいないが、DHFR配
列に物理的に結合している遺伝子配列もまた増幅される
(文献1,8,9,10参照)。結局、別種のタンパク質(こ
の場合は所望のタンパク質である)に対する遺伝子を付
随的に増幅するために、メトトレキセート処理によって
得られるDHFR遺伝子の増幅を利用することが可能と
なる。 【0030】更に、DHFRに対する第2の配列が取り
込まれる宿主細胞そのものがDHFR欠損であると、D
HFRはまた成功裡にトランスフェクトされた細胞の選
択に対する簡便なマーカーとして作用する。DHFR配
列が所望ペプチドに対する配列に有効に結合している
と、この能力は所望の配列を用いる成功的トランスフェ
クションに対するマーカーとして同様に作用する。 【0031】D.使用したベクター構築技術(物質及び
方法) 下記Fに記載の実施例で構築されたベクターは単離プラ
スミド又はDNA断片の開裂及び結合によって構築され
たものである。 【0032】適当なバッファー中で1種又は複数の制限
酵素で処理する開裂が起こる。一般に、約20μgのプ
ラスミド又はDNA断片は200μlのバッファー溶液
中の約1〜5単位の酵素を必要とする(特定の制限酵素
に対する適当なバッファーは製造業者により特定されて
いる)。37℃で約1時間のインキュベーション時間が
実行可能である。インキュベーション後、タンパク質を
フェノール及びクロロホルムで抽出除去し、核酸をエタ
ノールを用いる沈澱により水性画分から回収する。 【0033】平滑末端が要求される場合には、調製物を
10単位のポリメラーゼI(Klenow)を用いて15℃で
15分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱する。 【0034】開裂断片のサイズ分離をD.Goeddel et
al.,Nucleic Acids Res.,8:4057(198
0)に記載されている6%ポリアクリルアミドゲルを用
いて行なう。この文献に記載の内容を本発明書中に含め
るものとする。 【0035】ほぼ等モル量の所望成分を結合するため
に、正しい整合性を提供するべく適当に末端処理し、
0.5μgDNAにつき約10単位のT4DNAリガーゼ
で処理する。 【0036】E.好ましい具体例の詳細な説明 一般に、本発明に好適な発現ベクターは遺伝子スプライ
シング技術の適用により構築される。出発物質は天然の
バクテリアプラスミドであり、必要に応じて予め修飾し
ておく。本発明の好ましい具体例に於いては、M.Lus
ky et al.,Nature.239:79(1981)に記載
の方法により調製された修飾pBR322プラスミドで
あるpMLプラスミドを利用する。これは、サルウィル
スSV40から誘導される唯一のプロモーター並びにD
HFR及びHBsAgに対するコード配列を含有する。 【0037】構築に於いて、プロモーターを(リボソー
ム結合配列と共に)、所望タンパク質をコードするコー
ド配列及び第2タンパク質をコードするコード配列の上
流に位置させる。単一の転写終止配列を両者の下流に位
置させる。上流コード配列の末端部に翻訳終止シグナル
を位置させ、その下流に下流配列の翻訳開始シグナルを
位置する。このようにして、2つのコード配列が単一m
RNA鎖中で発現するが、2つの別々の成熟タンパク質
が発現される。 【0038】特に好ましい具体例に於いては、第2ペプ
チドをコードする配列は所望ペプチドをコードする配列
の下流にある。これらの環境下にあっては、第2ペプチ
ドによって形質転換された細胞を選択しようとする方法
が、所望ペプチドの特に高い産生をも選択する。 【0039】F.実 施 例 下記実施例は本発明を説明するものであって、何ら本発
明を制限するものではない。 【0040】実施例1 HBsAg配列含有ベクターpE
342.HS94.HBV 図1に、HBsAgプラスミドの構築を示す。表面抗原遺
伝子を含む1986 bp EcoRI−BglII断片を、L
iu et al.,DNA.1:213(1982)(本明細書
中に包含する)に記載の如く、pBR322でクローン化
したHBVウィルスゲノムから単離した。この配列をp
MLのEcoRI及びBamHI部位間に結合した。pML
はLusky et al.,Nature,293:79(1981)
(本明細書中に包含する)に記載のように、サル細胞中で
の複製を阻害する配列を欠如しているpBR322誘導
体である。得られたプラスミドの唯一のEcoRI部位
に、ウィルスゲノムのHindIII及びPvuII消化に
よって得、予め修飾して両端をEcoRI制限部位にした
SV40の342pbオリジン断片を挿入してp342E
を得た。p342E(pHBs348−Eとも指称される)
は、Levinson et al.,による1981年12月3日
付出願の米国特許出願第326,980号明細書に記載
されている。該出願を引用して本明細書中に包含する
(欧州特許出願公開第0073656号)。要約すれば、
サルウィルスSV40のオリジンを単離するために、S
V40DNAをHindIIIで消化し、コンバーター(A
GCTGAATTC)を添加してHindIII末端をEco
RI末端に変換した。DNAをPvuIIで切断しRIリ
ンカーを添加した。EcoRIで消化後、オリジンを含む
348bp断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電
気溶出で単離し、pBR322中でクローン化した。H
BV(Animal Virus Genetics(Ch.5)Acad.Pr
es,N.Y.(1980))のEcoRI及びBglIIによる
消化で得られた1986bp断片(これはHBsAgをコー
ドする遺伝子を含んでいる)を、EcoRI部位及びBam
HI部位でプラスミドpML(Lusky et al.,Natur
e.293:79(1981))にクローン化して発現プラ
スミドpHBs348−Eを構築した(pMLは、サル細胞
中でのプラスミド複製を阻害する配列が除去された欠失
を有するpBR322誘導体である)。得られたプラスミ
ド(pRI−Bgl)を次にEcoRIで直線化し、SV40
のオリジン領域を示す348bp断片をpRI−BglのEc
oRI部位に導入した。オリジン断片はいずれの配向で
も挿入され得る。この断片は複製のオリジン以外に初期
及び後期のSV40プロモーターをコードしているの
で、オリジンの配向次第でどちらかのプロモーターが作
用し該プロモーターの制御下でHBV遺伝子が発現し得
た(pHBS348−Eは初期プロモーターの制御下で発
現したHBsを示す)。pE342を修飾するために、pE
342をEcoRIで部分消化し、Klenow DNAポリ
メラーゼIを用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再
結合し、これによりpE342中のSV40オリジンに
先行するEcoRI部位を除去する。得られたプラスミド
即ち、pE342△R1をEcoRIで消化し、Klenow
DNAポリメラーゼIを用いて充填し、BamHIで再度
切断する。アクリルアミドゲル電気泳動後、約3500
bp断片を電気溶出し、フェノール−クロロホルム抽出
し、前記の如くエタノール沈澱させる。EcoRI及びX
baで消化してHBsAgの5'非翻訳リーダー領域を除去
し、肝炎発現プラスミドpHS94(Liu et al.,上
掲)の類似する150bpEcoRI−Xba断片を代わりに
挿入してpE342.HS94.HBVを形成した。 【0041】(Liu et al.,によって記載されている
ようにpHS94は真のHBsAg遺伝子の翻訳開始コド
ンを含むが、5'非翻訳情報配列は全部欠如している。
前記のごときSV40初期プロモーターの制御下で真の
EcoRI−BglII断片とpHS94由来等価物の双方
の発現レベルは同等であり、プラスミドの性能に影響す
ることなく交換可能である。) 【0042】実施例2 DHFR配列含有ベクターpE
342.D22 唯一の発現可能な配列としてDHFRを担持するプラス
ミドpE348.D22の構築を図2に示す。 【0043】DHFR cDNAプラスミド pDHFR
−11(Nunberg et al.,Cell,19:355(198
0)参照)の1600bp PstIインサートをエキソヌク
レアーゼBal31で処理してPstI部位に隣接するポリ
G:C領域を除去し、BglIIで消化し、得られた約6
60bp断片をゲルから単離した。Bal31−BglII消
化cDNAをBglII部位を含有するpBR322プラス
ミド誘導体に結合した(pBR322をHindIIIで消
化した後、プラスミド断片をKlenow DNAポリメラ
ーゼを用いて4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存
在下で充填し、BglIIで再切断した)。得られたプラ
スミドpDHFR−D22は、pBR322とDHFR
cDNAの5'末端との融合部位の29bp上流に位置する
EcoRI部位を有する。次いで、cDNAインサートの
コード配列を含むEcoRI−BglII断片をpDHFR
−D22から切り出し、EcoRI−BamHIで消化した
pE342.HBV(実施例1)に結合してDHFR発現
プラスミドpE342.D22を形成した。 【0044】実施例3 DHFR及びHBsAg配列双方
を含有するベクター 2種のベクター、即ちDHFR遺伝子がHBsAg遺伝子
の下流にあるポリシストロン含有ベクターpE342.
HBV.D22、並びにDHFR及びHBsAg遺伝子が
ポリシストロンになっていないベクター、pE342.
HBV.E400.D22を構築した(図3)。A .クローン化HBV DNA(Liu et al.,上掲)
のEcoRI−TaqI断片を、EcoRI−ClaIで消化し
たpE342.D22に結合してpE342.HBV.D
22を構築した。B . pE342.HBV.D22のBglII部位とD
HFRインサートのClaI部位間にSV40初期プロモ
ーターを融合して更に修飾した。HBVウィルスDNA
は、BglII部位を超えて20bpの位置に唯一のTaqI
部位を含有している。この部位を用いて、表面抗原遺伝
子を含むEcoRI−BglII断片を生成した。即ち、ク
ローン化HBVウィルスDNAをEcoRI及びTaqI消
化すると、表面抗原遺伝子を含み且つEcoRI部位から
1985bp離れている(Liu et al.,上掲)唯一のBg
lII部位を含有する〜2000bpの断片が得られる。
(消化によって生成するDNA断片の末端TaqI及びCl
aIは粘着性であり共に結合する。) 【0045】ClaI部位が再生される。即ち、pE34
2.HBV.D22はBglII及びClaI部位の双方を
含み、これらはDHFRコード配列の直前に位置してい
る。 【0046】SV40DNAをHpaIIで消化し、前記
のように充填し、HindIIIで再切断して、pE34
2.HBV.D22のBglII及びClaI部位に対して
粘着性の制限部位を両端に有するSV40オリジンを構
築した。オリジンを含む440bp断片を単離した。これ
をHindIII及びBamHI消化によって生成する40
00bp pBR322断片並びに、クローン化したHB
VウィルスDNAをEcoRI消化しKlenow DNAポ
リメラーゼIで充填し、BglIIで再消化し、アクリル
アミドゲルで単離して生成した表面抗原遺伝子を含む1
986bp断片と共に三者間結合した。これら3種の断片
の結合は、充填したHpaIIをEcoRIと、2個のHin
dIII部位を互いに、且つBglIIをBamHIと結合
することによってのみ達成し得る。次いで、得られたプ
ラスミドをClaI及びBamHIで制限消化すると、SV
40オリジンを含む470bp断片が得られる。この断片
をpE342.HBV.D22のClaI及びBglII部
位に挿入して、pE342.HBV.E400.D22
を形成する(図3参照)。 【0047】実施例4 宿主細胞のトランスフェクショ
ン 本実施例の宿主細胞は組織培養で増殖させた脊椎動物細
胞である。当業界で公知のように、これらの細胞は単離
した正常細胞から連続トランスファー処理により得ら
れ、永久セルラインとして維持し得る。これらのセルラ
インは、液体媒質中の固体支持体上に維持されるか、又
は支持栄養物を含有する懸濁物中で増殖させることによ
り維持される。 【0048】好ましい実施例では、DHFR活性を欠損
しているCHO細胞を使用した。これらの細胞は、Url
aub and Chasin.Proc.Natl.Acad.Sci.(U
SA),77:4216(1980)(本明細書中に包含す
る)に記載のように製造し増殖させる。 【0049】これらの細胞を上記のように調製された所
望のベクター5mgで、Graham andVan Der Eb.
Virology.55:456(1978)(本明細書中に包含
する)の方法でトランスフェクトする。 【0050】一連のプラスミドが特定宿主細胞と確実に
相互作用するようにし得る方法があり、その結果1個の
プラスミドが細胞に吸収されると他のプラスミドも同様
に吸収される確立が増大する。従って、1次配列及び2
次配列を夫々含む別々のベクターを使用してこれらの配
列を導入してもよいし、両配列を含む単一ベクターを使
用して導入してもよい。 【0051】実施例5 トランスフェクトされた細胞の
増殖及びペプチドの発現 前記のトランスフェクション操作にかけたCHO細胞
を、最初非選択媒地中で2日間増殖させ、次いでグリシ
ン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く媒地中に細胞を
移し、プラスミドDHFRを発現し得る細胞を選択し
た。約1〜2週間後個々のコロニーをクローニングリン
グで単離した。 【0052】60又は100mmの組織培養皿に約0.5
×106細胞/皿で細胞をプレートした。2日間増殖さ
せた後、増殖培地を交換した。24時間後RIA(Ausr
iaII,Abbott)でHBsAgをアッセイした。細胞をカ
ウントし、HBsAg産生を細胞1個当りの基準で標定し
た。このようにして、使用した各ベクターについて10
〜20個のランダムなコロニーを解析した。 【0053】本発明の一実施例で次表の結果が得られ
た。 【表1】 【0054】最高の発現を示すセルラインの数個で20
回以上の移行の間表面抗原の産生をモニターしたところ
安定であった。表面抗原を発現する細胞は基層に無限に
付着したままであり、培地を補充している限りは大量の
表面抗原を分泌し続ける。 【0055】ポリシストロン性遺伝子構築によって高レ
ベルのHBsAgを産生する細胞が単離されることは明ら
かである。pE342.HBV.D22で形質転換され
たコロニーは100%が500mg/106細胞/日以上
を産生したが、非ポリシストロン性プラスミドpE34
2.HBV.E400.D22で形質転換されたコロニ
ーは92%が前記量より少量を産生した。1500ng/
106細胞/日以上のレベルで産生したのはポリシスト
ロン性トランスフェクションを行なった細胞のみであっ
た。 【0056】実施例6 メトトレキセート処理 表面抗原を産生するセルラインは、10nMより高濃度
のメトトレキセート(MTX.DHFRの特異的阻害剤)
によって阻害される。MTXの組織培養細胞に対する影
響に関する従来の研究結果と一致して、約10-5の頻度
で高濃度(50nM)のMTXに耐性のクローンが出現す
る。然しながら、これらのクローンは、MTX耐性クロ
ーン中でHBV配列が増幅するにもかかわらず、最早表
面抗原を産生しない。即ちこの場合、HBV遺伝子は増
幅されるが発現は低下する。これは、表面抗原を更に産
生すると細胞に致死性になることを示す。 【0057】実施例7 所望ペプチドの回収 産生された表面抗原は、ウィルスに感染した患者の血清
で観察される22nm粒子に類似の粒子状である。この抗
原形態は高い免疫原性を有することが示されている。仔
ウシ血清又は他の補足物を欠く培地で細胞を増殖させる
と、培地に含有されるタンパク質の約10%が表面抗原
であり、このタンパク質は当業界に公知の方法で単離さ
れ得る。表面抗原は、SDS−ポリアクリルアミドゲル
上を22nm粒子由来タンパクと共に移動する。 【0058】文 献 1.Wigler,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.77:3567(1980) 2.Schimke,Robert T.et al.,Science 20
2:1051(1978) 3.Biedler,J.L.et al.,Cancer Res.32:
153(1972) 4.Chang,S.E.et al.,Cell 7:391(19
76) 5.Fischer,G.A.,Biochem Pharmacol.11:
1233(1962) 6.Sirotnak,F.M.et al.,Cancer Res.2
8:75(1968) 7.Flintoff,W.F.et al.,Somat.Cell.Gen
et.2:245(1976) 8.Christman,J.et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.79:1815(1982) 9.Ringold,Gordon et al.,J.Molec and A
ppl.Gen.1:165(1981) 10.Kaufman,R.F.et al.,J.Molec.Bio
l.159:601(1982) 11.Perucho,Manual et al.,Cell 22:30
9(1980)
【図面の簡単な説明】
【図1】 HBsAg発現ベクターpE342.HS9
4.HBVの構築法を表す模式図である。 【図2】 DHFR発現ベクターpE342.D22の
構築法を表す模式図である。 【図3】 DHFR及びHBsAg発現ベクターpE34
2.HBV.D22及びpE342.HBV.E40
0.D22の構築法を表す模式図である。
4.HBVの構築法を表す模式図である。 【図2】 DHFR発現ベクターpE342.D22の
構築法を表す模式図である。 【図3】 DHFR及びHBsAg発現ベクターpE34
2.HBV.D22及びpE342.HBV.E40
0.D22の構築法を表す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 MOLECULAR AND CEL
LULAR BIOLOGY,VOL.
1,NO.9,P.854−864(1981)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.所望タンパク質をコードするDNA配列と第2タン
パク質をコードするDNA配列とを含み、両DNA配列
が同一のプロモーター配列に機能可能に結合し且つ翻訳
終止コドン及び翻訳開始コドンによって分離されており
(ただし、いかなる介在スプライス部位も存在しない)、
脊椎動物宿主細胞中で所望タンパク質及び第2タンパク
質を発現し得る発現ベクター。 2.第2タンパク質のコード配列がDHFRをコードし
ていることを特徴とする請求項1に記載の発現ベクタ
ー。 3.プロモーター配列がSV40に由来する初期プロモ
ーターであることを特徴とする請求項1に記載の発現ベ
クター。 4. pE342.HBV.D22であることを特徴とす
る請求項3に記載の発現ベクター。 5.所望タンパク質をコードするDNA配列と第2タン
パク質をコードするDNA配列とを含み、両DNA配列
が同一のプロモーター配列に機能可能に結合し且つ翻訳
終止コドン及び翻訳開始コドンによって分離されており
(ただし、いかなる介在スプライス部位も存在しない)、
脊椎動物宿主細胞中で所望タンパク質及び第2タンパク
質を発現し得る発現ベクターで形質転換された脊椎動物
細胞。
Applications Claiming Priority (2)
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