DK173671B1 - Fremgangsmåde til selektion af transficerede hvirveldyrceller - Google Patents

Description

i DK 173671 B1

Det almene princip at anvende en værtscelle til produktion af et heterologt protein, dvs. et protein, 5 som almindeligvis ikke produceres af denne celle, er velkendt. Imidlertid er der mange tekniske vanskeligheder ved at opnå rimelige mængder af det heterologe protein ved anvendelse af hvirveldyr-værtsceller, hvilket er ønskeligt på grund af deres egenskaber med hensyn til håndtering af proteinet.

10 Der har været et antal heldige eksempler på inkorporering af genetisk materiale, der koder for heterologe proteiner, i bakterier og opnåelse af udtryk-kelse deraf. F.eks. er der således blevet produceret humant interferon, desdcetyl-thymosin α-l, somatostatin, 15 og humant væksthormon. For nylig har det været muligt at udnytte ikke-bakterielle værter, såsom gærceller (se f.eks. EP of fentli ggølrelsesskri f t nr. 0 060 057) og hvirveldyrcellekulturer (se EP offentliggørelses-skrift nr. 0 073 656), som værter. Anvendelsen af 20 hvirveldyrcellekulturer som værter ved produktionen af pattedyrproteiner er fordelagtig, fordi sådanne systemer har yderligere evner til modifikation, gly-cosylering, tilføjelse af transportsekvenser og anden efterfølgende behandling af det resulterende pep-25 tid, som er produceret i cellen. Medens f.eks. bakterier med held kan transficeres og bringes til at udtrykke "a-thymosin", mangler det producerede poly-peptid N-acetylgruppen hos det "naturlige" a-thymosin, som findes i pattedyrsystemet.

30 ».

2 DK 173671 B1 T almindelighed inkluderer den yenspiejsningsteknik, som er udformet til at gøre det muligt for Uærtsceller at producere heterologe proteiner, fremstillingen af en "udtrykkelsesvektor", som er en DNA-5 sekvens indeholdende (1) en "promotor”, dvs. en sekvens af nucleotider, der styrer og muliggør udtrykkeisen af en kodningssekvens; (2) en sekvens, der forsyner mRNA med et ribosom- 10 bindingssted; (3) et "kodningsområde", dvs. en sekvens af nucleotider, der koder for det ønskede polypeptid; (4) en "afslutningssekvens", som muliggør afslutning af transkriptionen, når hele koden for det ønskede pro- 15 tein er blevet aflæst; og (5) hvis vektoren ikke er direkte indsat i genomet, et "replikon" eller repliceringsorigin, som gør det muligt for hele vektoren at reproduceres, når først den er i cellen.

2 o Ved konstruktionen af vektorer styrer den samme promotor to kodningssekvenser, den ene for et ønsket protein og den anden for et sekundært protein. Transkrip-tionsafslutningen deles også af disse sekvenser. Imidlertid fremstilles proteinerne i adskilt form, fordi de er adskilt af et stop- og start-translationssignal. 1

Almindeligvis hnr de genetiske udtrykkelsesvektorer form af plasmider, som er ekstra chromosomale løkker af dobbeltstrenget DNA. Disse findes i naturlig Form 3 DK 173671 B1 i bakterier, ofte i flere kopier pr- celle. Imidlertid kan der også konstrueres kunstige plasmider (og disse er selvfølgelig de mest nyttige) ved sammensplejsning af de fire nødvendige elementer, 5 skitseret ovenfor, i rigtig rækkefølge under anvendelse af passende"restriktionsenzymer". Restriktionsenzymer er nucleaser, hvis katalytiske aktivitet er begrænset til at lysere ved en bestemt basesekvens, idet hver basesekvens er karakteristisk 10 for et bestemt restriktionsenzym. Ved fagmæssig konstruktion af de terminale ender af de ovenfor skitserede elementer (eller fraktioner deraf) er det muligt at få restriktionsenzymer til at splejse disse elementer sammen til dannelse af en færdig 15 genetisk udtrykkelsesvektor.

Tilbage er derefter at få værtscellen til at inkorporere vektoren (transfektion) og at dyrke værtscellerne på en sådan måde, at der frembringes syntese af de ønskede polypeptid som et ledsagefænomen 20 til normal vækst.

To typiske problemer er forbundet med den ovenfor skitserede procedure. For det første er det ønskeligt i en vektor foruden de fire nødvendige elementer, som er skitseret ovenfor, at have en markør, som 25 vil tillade en direkte selektion for de celler, som faktisk har modtaget den genetiske udtrykkelsesvektor.

Ved anvendelsen af bakterieceller som værter er hyppigt anvendte markører resistens over for et antibiotikum, såsom tetracyklin eller ampicillin. Kun de 30 celler, som er resistente over for midlet, vil vokse i kulturer indeholdende antibiotieumet. Hvis derfor - cellekulturen, som er søgt transficeret, dyrkes på et medium indeholdende antibiotieumet, vil kun de faktisk transficerede celler vise sig som kolonier. Eftersom 4 DK 173671 B1 t rans format i οηκ Trek vensen er ganske lav (omkring en celle pr. 10 transficeres under ideelle betingelser), er dette i praksis næsten en nødvendig forudsætning.

For hvirveldyrceller som værter er den opnåede trans-5 formationsgrad mere effektiv (omkring en celle pr.

10^). Imidlertid forbliver en bekvem selektion vigtig for opnåelsen af de ønskede transficerede celler. Selektion gøres også vigtig, fordi celledelingshastigheden er omkring 50 gange lavere end i bakterie-10 celler, dvs. medens E. coli deler sig en gang for ca. hver 20-30 minutter, deler humane vævskulturceller sig kun en gang for hver 12-24 timer.

En side af den foreliggende opfindelse løser problemet med at selektere for hvirveldyrceller, som har optaget 15 den genetiske udtrykkelsesvektor for det ønskede protein, ved at udnytte udtrykkeisen af kodningssekvensen for et sekundært protein, som f.eks. et nødvendigt enzym, med hensyn til hvilket værtscellen er deficient. F.eks. kan dihydrofolatreduktase (DHFR) 20 anvendes som markør ved anvendelse af værtsceller, som er deficiente med hensyn til DHFR.

Et andet problem ved produktionen af polypeptider i en fremmed vært er udvindingen af tilfredsstillende mængder af protein. Det ville være ønskeligt at have en 25 eller anden mekanisme til at regulere, og fortrinsvis forhøje, produktionen af det ønskede heterologe poly-peptid. Ifølge en anden side af forbindelsen udnyttes en sekundær kodningssekvens, som kan påvirkes af udefra styrede parametre, til at muliggøre styring af ud-30 trykkeisen ved styring af disse parametre. Endvidere muliggør tilvejebringelsen af begge sekvenser på et pol y-cistron i sig selv selektion af transformanter med høje udtrykkelsesniveauer af den primære sekvens.

5 DK 173671 B1

Det er blevet påvist, at DHFR-kodnlngssekvenser kan indføres i, udtrykkes i Og forstærkes i pattedyrceller.

Genomisk DNA fra methotrexat-resi stente kinesisk hamsterovarie- (CHO)-celler er blevet ind fort i 5 museceller og resulterer i transformanter, som også er resistente over for methotrexat (1). Den mekanisme, hvorved methotrexat-(MTX)-resistens i museceller udvikles, viser sig at være tredobbelt; ved genforstærkning af DHFR-kodningssekvensen (2,3,4), 10 ved sænkning i optagelsen af MTX (5,6) og ved reduktion i den producerede DHFR's affinitet for MTX (7).

Det viser sig, at forstærkning af DHFR-genet ved udsættelse for MTX kan resultere i en ledsagende forstærkning af en medtransficeret gensekvens. Det 15 er også vlevet påvist, at musefibroblaster transfice-ret med både et plasmitj indeholdende hepatitis B DNA-sekvenser og genomisk DNA fra en hamstercellelinie indeholdende et mutantgen for MTX-resistent DHFR, secernerer forøgede mæggder af hepatitis B overflade-20 antigen (HBsAg) i mediet, når der anvendes MTX til at stimulere DHFR-sekvensforstærkning (B). Endvidere forstærkes mRNA, der koder for E. coli proteinet XGPRT, i nærvær af MTX i CHO-celler, der er cotransficeret med DHFR- og XGPRT-gensekvenser under styring af uaf-25 hængige promotorer (9). Endelig er der blevet påvist forøget udtrykkelse af en sekvens endogen for promotoren i en DHFR/SV40-plasmid-kombination i nærvær af MTX (10).

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendel-30 se, at i hvirveldyrscelleværter, hvor den genetiske udtrykkelsesvektor for et ønsket polypeptid indeholder en sekundær genetisk kodningsekvens under styring af den samme promotor, tilvejebringer denne sekundære sekvens, en hensigtsmæssig udvælgelsesmarkør både for 6 DK 173671 B1 trans formenter i almindelighed ng for transformanter, der udviser høje udtrykkelsesniveouer For den primære sekvens, samtidig med at den tjener som en kontrol-indretning, hvorved udtrykkeisen af en ønsket poly-5 peptid kan reguleres, hyppigst forhøjes.

Dette er særlig betydningsfuldt, da de to proteiner ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen produceres separat i moden form. Selv om begge DNA-kodningsse-kvenser styres af den samme transkriptionspromotor, 10 således at der dannes en sammenknyttet mRNA, adskilles de af et translationsstop-signal for den første og et translationsstart-signal for den anden, således at der opstår Lo uafhængige proteiner.

Da et hvirveldyr-værtscelle-kultursystem ofte er for-15 delagtigt, fordi det er i stand til glycosylering, phosphorylering og lipid associering passende til dyresystemer (medens bakterieværter ikke er det), er det betydningsfuldt, at markørsystemer og reguleringssystemer kan tilvejebringes i denne sammenhæng.

20 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en fremgangsmåde til selektion af hvirveldyrceller, som er blevet transficeret med en ekspressionsvektor der er I stand til at udtrykke et ønsket protein, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at (a) cellerne behandles med en vektor Indeholdende kodesekvenser Por både det 25 ønskede protein og et sekundært protein, hvis tilstedeværelse kræves for væksten af værtscellerne under selektive dyrkningsbetingelser, idet begge kodesekvenser er operabelt forbundet med den samme promotorsekvens, men adskilt af translationsstop- og -start-kodoner, og 30 (b) cellerne dyrkes under de selektive dyrkningsbetingelser.

DK 173671 B1 7 . På tegningerne viser fig. 1 konstruktionen af en udtrykkelsesvektor for 5 HBsAg, pE342.HS94.HBV; fig. 2 konstruktionen af en udtrykkelsesvektor for DHFR, pE342.D22; og fig. 3 konstruktionen af udtrykkelsesvektorer for DHFR og HBsAg, fiE342.HBV.D22 og pE342.HBV.E400.D22.

10 A. Definitioner I denne beskrivelse med krav inkluderer "plasmider" både naturligt forekommende plasmider i bakterier og kunstigt konstruerede cirkulære DNA-fragmenter.

"Udtrykkelsesvektor1' betyder et plasmid, som indeholder mindst de fire nødvendige elementer som anført ovenfor til udtrykkelse af det heterologe peptid i en værtscellekultur.

"Heterologt protein" betyder et protein eller peptid, som ikke normalt produceres af eller kræves for levedygtigheden af værtsorganismen.

20 "Ønsket protein" betyder et heterologt protein eller peptid, som fremgangsmåden ifølge opfindelsen er udformet til at producere.

25 8 DK 173671 B1 "Sekundært peptid" betyder det protein eller peptid, som ikke er det heterologe peptid, der ønskes som det primære produkt af udtrykkeisen i uærtscellen, men snarere et andet heterologt peptid, som på grund af 5 dets egne egenskaber eller på grund af egenskaberne ved den sekvens, der koder for det er i stand til at "markere" transfektion af udtrykkelsesvektoren og/eller regulere udtrykkeisen af det primært ønskede heterologe peptid.

10 Peptidsekvensen kan være enten lang eller kort i området fra omkring fem aminosyrer til omkring 1000 aminosyrer. Den konventionelle skelnen mellem ordene peptid og protein følges ikke rutinemæssigt i beskrivelsen af opfindelsen. Hvis der skal skelnes, 15 vil det blive anført.

"Primær sekvens" er nucleotic|sekvensen, der koder for det ønskede peptid, og "sekundær sekvens" betyder en sekvens af nucleotider, der koder for det sekundære peptid.

20 "Transfektion" af en værtscelle betyder, at udtrykkelsesvektoren er blevet optaget af værtscellen på en sporbar måde, hvad enten der faktisk udtrykkes nogen kodningssekvenser eller ej. I opfindelsens sammenhæng vil heldig transfektion blive anerkendt, når der fore-25 kommer nogen som helst indikation af denne vektors virkning i værtscellen. Det erkendes, at der er forskellige niveauer af held i denne sammenhæng. For det første kan vektorens kodningssekvens udtrykkes eller ikke udtrykkes.

Hvis vektoren er rigtigt konstrueret med inklusion af 30 promotor og terminator, er det imidlertid stærkt sandsynligt, at der vil ske udtrykkelse. For det andet, hvis plasmidet, der repræsenterer vektoren, optages af cellen og udtrykkes, men ikke inkorporeres i cellens 9 DK 173671 B1 normale chromosomalc materiale, vil evnen til at udtrykke dette plasmid blive tabt efter noyle Få generationer. Hvis på den anden side vektoren optages i chromosomet, frbliver udtrykkeisen stabil igen-5 nem gentagne replikationer af værtscellen..Der kan også være et mellemresultat. De præcise detaljer ved den måde, hvorpå der således kan ske transfektion, er ikke forstået, men det er klart, at der eksperimentelt findes et kontinuum af resultater med hensyn 10 til udtrykkeisens stabilitet over flere generationer af værtskulturen.

8. En foretrukken udførelsesform af det ønskede peptid I en foretrukken specifik udførelsesform af opfindelsen koder den primære genetiske sekvens for hepa-15 titis-B-overfladeantigen (HBsAg). Dette protein afledes fra hepatitis B virus, det infektive agens for hepatitis B hos mennesk’pr. Denne sygdom er karakte- t riseret af svækkelse, }éverbeskadigelge, primær carcinoma og ofte død. Sygdommen er ret udbredt, især i 20 mange afrikanske og asiatiske lande, hvor mange mennesker er kroniske bærer'e Med evne til at overføre sygdommen pandemisk. Viruset (HBV) består af et DNA-molekyle omgivet af et nucleært capsid, som igen er omgivet af en kappe. Proteiner, som er forbundet med 25 dette virus, inkluderer overfladeantigenet (HBsAg), et kerneantigen og en DNA-polymerase. HBsAg vides at frembringe antistoffer hos inficerede mennesker. HBsAg, som findes i serummet hos inficerede individer, består af proteinpartikler med en gennemsnitsdiameter på ca.

30 22 nm og kaldes derfor "22 nm partikler". I overens stemmelse hermed antages det, at HBsAg-partiklen ville være en effektiv basis for en vaccine.

10 DK 173671 B1 C. En foretrukken udferelsesform af det sekundære peptid

Det er blevet erkendt, at miljøbetingelser oFte er effektive til styring af mængden af bestemte enzymer, som produceres af celler under visse vækstbetin-5 gelser. I den foretrukne udførelsesform af opfindelsen drages der.fordel af visse cellers følsomhed for methotrexat (MTX), som er en inhibitor for dihydro-folatreductase (DHFR). DHFR er et enzym, som kræves indirekte ved syntesereaktioner, der involverer over-10 førsel af en-carbon-enheder. Mangel på DHFR-aktivitet resulterer i cellers manglende evne til at vokse, undtagen i nærvær af de forbindelser, som ellers kræver overførsel af en-carbon-enheder for deres syntese.

Celler, der mangler DHFR, vil imidlertid vokse i nær-15 vær af en kombination af glycin, thymidin og hyposan-thin.

Celler, som normale producerer DHFR, vides at inhi-beres af methotrexat. Oftest vil tilsætning af passende mængder methotrexat til normale celler resul-20 tere i cellernes død. Imidlertid synes visse celler at overleve methotrexat-behandlingen ved at fremstille forøgede mængder DHFR og således overskride methotrexatets kapacitet til at inhibere dette enzym (2,3,4). Det er tidligere blevet vist, at der i sådanne 25 celler er en forøget mængde m-RNA, der koder for DHFR-sekvensen. Dette forklares ved antagelse af en forøgelse i mængden af DNA i det genetiske materiale, som koder for denne m-RNA. Genetisk forårsager tilsætningen af methotrexat øjensynligt genforstærkning af 50 DHFR-genet. Genetiske sekvenser, som er fysisk forbundne med DHFR-sekvensen, selv om de ikke reguleres af den samme promotor, forstærkes også (1,8,9,10). Som følge heraf er det muligt at anvende forstærkningen af DHFR-genet, som sker ved methotrexatbehandling, til DK 173671 B1

i J

samtidigt at forstærke genet for et andet protein, i dette tilfælde det ønskede peptid.

Hvis endvidere de værtsceller, hvori den sekundære sekvens for DHFR indføres, i sig selv er DHFR-de-5 ficiente, tjener DHFR også som en hensigtsmæssig markør for selektion af celler, der er transficeret med held. Hvis DHFR-sekvensen effektivt forbindes med sekvensen for det ønskede peptid, tjener denne evne ligeledes som markør for heldig transfektion — 10 med den ønskede sekvens.

D. Anvendt vektorkonstruktionsteknik (materialer og metoder)____

De vektorer, som konstrueres i i afsnit E anførte eksempler, konstrueres ved spaltning og ligering af iso-15 lerede plasmider eller DNA-fragmenter.

Spaltning gennemføres véd behandling med restriktionsenzym (eller -enzymer) i en egnet puffer. I almindelighed jeræver omkring 20 ^ug plasmid eller DNA-frag-menter omkring 1-5 enheder enzym i 200 ^ul puffer-20 opløsning. (Passende puffere for bestemte restriktionsenzymer specificeres af producenten). Inkubationstider på omkring 1 ti(ne ved 37 °C er praktiske.

Efter inkubationer fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og nucleinsyren udvindes fra den 25 vandige fraktion ved fældning med ethanol.

Hvis der kræves stumpe ender, behandles præparatet i 15 minutter ved 15 “C med 10 enheder Polymerase I (Klenou/), phenol-chloroform-ekstraheres og ethanol-fældes.

12 DK 173671 B1 5tørrclsesseparalion aF de spaltede Fragmenter gennemføres under anvendelse aT 6 % polyacrylamidgel som beskrevet af Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res J3:4057 (1980), der betragtes som inkorporeret 5 i denne beskrivelse ved denne reference.

Til ligering behandles omkring ækvimolære mængder af de ønskede komponenter, forsynet med passende hale i enderne til at give korrekt tilpasning, med omkring de enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 ^ug DNA.

10 ,E. Detaljeret beskrivelse af en foretrukken udførel- ses f orm______ I almindelighed konstrueres udtrykkelsesvektoren beregnet for den foreliggende opfindelse ved tilpasning af genspiejsningsteknik. Udgangsmaterialet er 15 et naturligt forekommende bakterielt plasmid, om ønsket modificeret i forvejen. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen anvendes et pML plasmid, som er et modificeret pBR 322 plasmid Fremstillet ifølge Lusky, M. et al., Nature 239:79 (1981), der 20 forsynes med en enkelt promotor afledt fra abeviruset 5V-40 og med kodningssekvensen for DHFR og for HBsAg.

Ved konstruktionen anbringes promotoren (såvel som en ribosombindingssekvens) oven for kodningssekvensen, der koder for et ønsket protein og en sekvens, der ko-25 der for et sekundært protein. En enkelt transkriptions-afslutningssekvens er anbragt neden for begge. Ved enden af den øverste kodningssekvens anbringes et translationsstop-signal, og et translationsstart-signal begynder den nederste sekvens. Således resulterer ud-30 trykkeisen af de to kodningssekvenser i en enkelt mRNA-streng, men to separate modne proteiner.

13 DK 173671 B1 I en særlig fore trukken udførelsesfonn er sekvensen, der koder for det sekundære peptid, neden for den, der koder for det ønskede peptid. Under disse omstændigheder vil procedurer udformet til at selek-3 tere for cellerne transformeret med det sekundære peptid også selektere for særlig forhøjet produktion af det ønskede peptid.

F. Eksempler

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning 10 af opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Vektor indeholdende HBpAq-sekvensen, pE342.HS94.HBV Fig. 1 viser konstruktionen af HBsAg-plasmidet.

i · ·1.

Det 1986 bp EcoRl-BglI|', fragment, som spænder over 15 overfladeantigen-genet blev isoleret fra HBV-viral- genomet klonet med pBR3.22 som beskrevet af Liu et al., DNA 1:213 (1982), def betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning. Denne sekvens blev ligeret mellem EcoRl- og BamHI-stederne i pML, 20 et pBR322-derivat, som mangler sekvenser, der er in- hiberende for dets replikation i abeceller, som beskrevet af Lusky et al., Nature 293;79 (1981), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning. I det resulterende plasmids enkelte EcoRI-25 sted indsattes 342 bp originfragmentet SV40 opnået ved HindlII-PvulI nedbrydning af virusgenomet, som var blevet modificeret til at være afgrænset af EcoRI-restrik-tionssteder resulterende i p342E (også betegnet som pHBs348-E) som beskrevet af Levinson et al. i EP of-30 fentliggørelsesskrift nr. 0 073 656, der betragtes som 14 DK 173671 B1 inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

(Kort fortalt blev originet fra abeviruset SV4D isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hindlll og omdannelse af Hindi I I-enderne til EcoRI-ender 5 ved tilføjelse af en omdanner (AGCTGAATTC) .. Denne DNA blev klippet med PvuII, og der blev tilføjet RI-bindeled. Efter nedbrydning med EcoRI blev 348 bp fragmentet, som spænder over originet, isoleret ved polyacrylamidgel-elektroforese og elektroelue-10 ring og klonet i pBR322. Udtrykkelsesplasmidet pHBs348-E blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet fra EcoRI- og BglII-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press. N.Y.

(1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAg) 15 ind i plasmidet pML (Lusky et al.,Nature 293:79, 1981) ved EcoRI- og BamHI-stederne. (pML er et derivat af pBR322, som har en slettelse, der fjerner sekvensen, som er inhiberende for plasmid-replikat ion i abeceller). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev der-20 på lineariseret med EcoRI, og 34B bp fragmentet repræsenterende SV40-originområdet blev indført i EcoRI-stedet i pRI-Bgl. Originfragmentet kan indsættes i valgfri orientering. Da dette fragment koder for både den tidlige og den sene SV40-promotor foruden 25 repliceringsoriginet, kunne HBV-gener udtrykkes under styring af den ene eller den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBS348-E repræsenterer HBs udtrykt under styring af den tidlige promotor). pE342 modificeres ved delvis nedbrydning med EcoRI, udfyld-30 ning i det spaltede sted under anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og sammenligering af plasmidet igen, hvorved EcoRI-stedet forud for SV40-origi net i pE342 fjernes. Det resulterende plasmid, betegnet pE342 ARIτ nedbrydes med EcoRI, udfyldes ved anvendelse af Klenow 35 DNA-polymerase I og underdeles med BamHI. Efter elek-troforese på acrylamidgel elektroelueres fragmentet på 15 DK 173671 B1 ca. 3 5Q0 bp, abstraheres med phenol-chloroform og fælde3 med ethonol som ovenfor). Det 5’-utransla-terede lederområde i HBsAg blev fjernet ved behandling med EcoRI og med Xba, og det analoge 150 bp 5 EcoRI-Xba fragment fra et hepatitis-udtrykkelses- plasmid pHS94 (Liu et al., ovenfor) blev indsat i dets sted til dannelse af pE342.HS94.HBV.

(Som beskrevet af Liu et al. indeholder pH594 transla tions-start-codonen fra det autentiske HBsAg-gen, 10 men mangler alle 5'-utranslaterede budbringersekvenser. Udtrykkelsesniveauerne af både det autentiske EcoRI-BgIII og det pHS94-afledte ækvivalent under styring af den tidlige SV40-promotor som beskrevet ovenfor er ækvivalente og er udskiftelige uden på-15 virkning af plasmidets opførsel).

EKSEMPEL 2

Vektor indeholdende DHFR-sekvensen pE342.D22

Et plasmid bærende DHFR som den eneste udtrykkelige sekvens er pE348.D22, hvis konstruktion er vist i fig. 2.

t i 20 1 600 bp PstI-indsætningen i DHFR-cDNA-plasmidet DHFR-11 (Nunberg et al., Cell 1_9:355, 1980) blev behandlet med exonucleasén Bal31 for at fjerne poly-G:C-området op til Pst I-stederne, blev nedbrudt med Bglll, og de resulterende fragmenter på omkring 660 bp 25 blev isoleret fra gelerne. Den Bal31-BglIl-nedbrudte cDNA blev ligeret ind i et pBR322-plasmid-derivat indeholdende et Bglll-stcd. (Efter nedbrydning af pBR322 med Hind III blev plasmidfragmentet fyldt ved anvendelse af Klenow DNA-polymerase i nærvær af de fire deoxynu-cleotidtriphosphater og underdelt med Bglll). Den re-30 suiterende plasmid, pDHFR-D22, har et EcoRI-sted belig- 16 DK 173671 B1 gende 29 bp ovenfor sammenknytningsstedet mellpm pBR322 og 5'-enden af DHFR-cDNA'en. EcoRI-Bglll-fragmentet, som indeslutter kodningssekvenserne af cONA-indsætningen, blev derpå udskåret fra 5 pDHFR-D22 og ligeret til EcoRI-BamHI-nedbrudt pE342.HBV (eksempel 1) til dannelse af DHFR-udtryk-kelsesplasmidet pE342.D22.

EKSEMPEL 3

Vektorer indeholdende både DHFR- og HBsAq-sekvenser 10 Der blev konstrueret to sådanne v.ektorer, pE342.HBV.D22 indeholdende et polycistron, hvori DHFR-genet er nedenfor HBsAg-genet, og pE342.HBV.E400.D22, (fig. 3), hvori generne, der koder for DHFR og HBsAg, ikke er polycistroniske.

15 A. pE342.HBV.D22 blev konstrueret ved ligering af

EcoRI-Taql-fragmentct fra klonet HBV-DNA (Liu et al., ovenfor) til EcoRI-Clal-nedbrudt pE342.D22.

B. Dette plasmid blev yderligere modificeret ved tilknytning af en yderligere tidlig SV40-promotor mellem 20 Bglll-stedet og Clal-stedet i DHFR-indsætningen i pE342.HBV.D22 til dannelse af pE342.HBV.E400.D22.

Viral HBV-DNA indeholder et enkelt Taql-sted 20 bp uden for BglII-stedet, der blev anvendt til at skabe EcoRI-BgllI-fragmentet, der indeslutter overfladeanti-25 gen-genet. Således resulterer EcoRI- og Taql-nedbrydning af klonet viral HBV-DNA i et Fragment på ca. 2 000 bp, der spænder over overfladeantigen-genet og indeholder et enkelt Bglll-sted (1985 bp fra EcoRI-stedet (Liu et al., ovenfor)). (Taql- og Clal-enderne af DNA-30 fragmenter dannet ved nedbrydning er kohæsive og vil ligere sammen).

17 DK 173671 B1

Clal-stfcdet gendannes; således indeholder pE342.HBV.D22 både et. Bglll- og Clal-sted, der er beliggende umiddelbart foran DHFR-kodningssekvenserne.

Et SV40-origin bundet ved restriktionssteder, der er 5 kohæsive med Bglll- og Clal-stederne i pE342.HBV.D22, blev konstrueret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hpall, udfyldning som beskrevet ovenfor og underdeling med Hindlll. Et 440 bp fragment, der spænder over originet, blev isoleret. Dette blev ligeret ved 10 en treparts-ligering til 4 000 bp pBR322-fragmentet skabt ved Hindlll- og BamHI-nedbrydning og til 1 986 bp fragmentet, der spænder over overfladeantigen-genet, skabt ved nedbrydning af den klonede virale HBV-DNA med EcoRI, udfyldning med Klenow DNA-polyme-15 rase I, undernedbrydning med Bglll og isolering på en acrylamidgel. Ligering af alle tre fragmenter kan kun opnås ved sammenføjning af det udfyldte Hpall-sted med EcoRI-stedet, de to Hind 111-steder med hinanden og Bglll-stedet med BamHIrsjtedet. Når det resulterende 20 plasmid restriktionsbehandles med Clal og BamHI, opnås således et 470 bp fragment, som indeholder SV40-originet. Dette fragment indsættes i Clal- og Bglll-stederne i pE342.HBV.b22 (afsnit A) til dannelse af pE342.HBV.E400.D22 (fig. 3).

25 EKSEMPEL 4

Transfektion af værtsceller

De her anvendte værtsceller er hvirveldyrceller dyrket i vævskultur. Disse celler kan, sorn kendt inden for faget, holdes som permanente cellelinier fremstillet 30 ved successive rækkéoverførsier fra isolerede normale celler. Disse cellelinier opretholdes enten på en fast bærer i flydende medium eller ved vækst i suspensioner indeholdende understøttende næringsstoffer.

18 DK 173671 B1 I den foretrukne udforelsesfarm anvendes CHO-celler, som er deficiente med hensyn til DHFR-aktivitet.

Disse celler fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 5 ΎΤ_'Λ216 (1980), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

Cellerne transficerés med 5 mg ønsket vektor som fremstillet ovenfor under anvendelse af den metode, som er beskrevet af Graham and Van Der Eb, Virology 10 52:456 (1978), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

Metoden sikrer indvirkning af en samling plasmider på en bestemt værtscelle, hvorved sandsynligheden forøges for, at hvis et plasmid absorberes af en celle, 15 vil yderligere plasmider også absorberes. I overensstemmelse hermed er det praktisk at indføre både de primære og de sekundære kodningssekvenser under anvendelse af separate vektorer for hver såvel som ved anvendelse af en enkelt vektor indeholdende begge sekven-20 ser.

EKSEMPEL 5 Vækst af transficerede celler og udtrykkelse af peptider CHO-cellerne som blev underkastet transfection som anført ovenfor, blev først dyrket i 2 dage i ikke-selektivt 25 medium, hvorpå cellerne blev overført til medium, der mangler glycin, hypoxanthin og thymidin, således at der selekteres for celler, som er i stand til at udtrykke plasmid-DHFR et. Efter omkring 1-2 uger blev individuelle kolonier isoleret med kloningsringe.

19 DK 173671 B1

Celler blev/ udpladet i 60 eller 100 mm vævskulturskåle med omkring 0,5 x 10° celler/skål. Efter to dages vækst blev vækstmediet ændret. HBsAg blev prøvet 24 timer senere ved RIA (Ausria II, Abbott).

5 Celler blev talt, og HBsAg-produktion standardiseret, på en pr.-celle-basis. 10-20 tilfældige kolonier blev analyseret på denne måde for hver anvendt vektor.

I et eksempel på udøvelsen af opfindelsen blev der 10 opnået følgende resultater: DK 173671 B1

2 G

.

O O -H O lA O

o <r iA 1—t Λ o o cn in CO »—(

Ό I O Ή O 1Λ CO

V. o lA

U O <D lA rH

i~l O

ω ό o o »<o o

Li LA

NO El O <—I O O CO

O O O CM lA

r-1 O "— CD .—C

σ> c c >

H

» ΟΌ

C C O

O ID H

•ri I O rH O O f-' -U ·<-! O IA r-i J* -H Ό U T> 0)

0 H

Ch C O

ion 1 >—I I O Ή O O Ν' D> O O LA Ή c r* .

to co o? o i—i o σ o X — o o

<—I

·*-> ^ 0) Li

-u ro •Η -H

> c

ri O

i-} I-I

o

0) X

_____- u_ Λ Bi Lt Li

ID Dl DJ CM

C Ή Ή »

O ri H LA O O O O

•H (DO) fA il <t CM r-i

+J O O Oi ^ IA iA

0* I 0) CAO

Cl- Li- o CO -C r-i C O \ ro co U ti- 3 v— ro \ -3·

ON

uo cm

X CM

• O

CM » o- O DA CM CO UJ N <t CL Q Id <r + · * CM CN CM 0= >

CM OO CM CD CD

Q 0C Q OO or

Li · · · · *

O CM CM CM CM CM

-U <J- <t <fr <i

ri IA IA tA JA IA

ro ui uj uj lu uj > α cl α. α cl 21 DK 173671 B1

Produktionen aT overfladeantigen i flere af de højst udtrykkende cellelinier er blevet kontrolleret For mere end 20 passager og er stabil. Cellerne, der udtrykker overfladeantigen, forbliver knyttet til 5 substratet i uendelighed og vil fortsætte med at secernere de store mængder overfladeantigen, så længe mediet efterfyldes.

Det er klart, at den polycistroniske genkonstruktion resulterer i isolering af de celler, der producerer 10 de højeste niveauer af HBsAg. 100¾ af kolonierne transformeret med pE342.H8V.D22 producerede over 500 ng/10^ celler/dag, medens 92 % af dem, der blev . transformeret med de ikke-polycistroniske plasmid pE342.HBV.E400.D22 producerede mindre end den mængde.

15 Kun celler fra den polycistroniske transfektion udviste produktionsniveauer på mere end 1500 ng/10^ celler/dag.

EKSEMPEL 6

Behandling med methotrexét I 1 20 De overfladeantigen-udtrykkende cellelinier inhiberes af methotrexat (MTX), en specifik inhibitor for DHFR ved koncentrationer på over 10 nM. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser af virkningerne af MTX på vævskulturceller opstår der af og til kloner, 25 som er resistente over for hojere koncentrationer (50 nm) af MTX flied en hyppighed af omkring 10~*\ Imidlertid producerer disse kloner ikke længere overfladeantigen trods forstærkningen af HBV-sekvenser i de MTX-resistente kloner. Således forstærkes KBV-genet, selv om 30 udtrykkeisen falder bort i dette tilfælde. Dette antyder, at yderligere produktion af overfladeantigen kan være dødelig for cellen.

22 DK 173671 B1 EKSEMPEL 7

Udvinding af det ønskede peptid

Det producerede overfladeantigen er i form.af en partikel analog med den 22 nm partikel, der iagttages i 5 serumet hos patienter inficeret med viruset. Denne form af antigen er blevet påvist at være højimmuno-gen. Når cellerne dyrkes i medium, der mangler kalveserum eller andre supplementer, er omkring 10 % af det i mediet indeholdte protein overfladeantigen, og 10 -dette protein kan isoleres ved velkendte metoder inden for faget. Overfladeantigenet vandrer på SDS-polyacrylamid-geler sammen med det fra 22 nm partiklen afledte protein.

REFERENCER

15 1. Wigler, M. aK, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567 (1980) 2. Schimke, Robert T. et aK, Science 202:1051 (1978) 3. Biedler, J.L. et al., Cancer Res. 32:153 (1972) 4. Chang, S.E. et al., Cell 7:391 (1976) 5. Fischer, G.A., Biochem Pharmacol. 11:1233 (1962) 20 6. Sirotnak, F.M. et a/L, Cancer Res. 28:75 (1968) 7. Flintoff, W.F. et al_., Somat. Cell. Genet. 2:245 (1976) 8. Christman, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79:1815 (1982) 9. Ringold, Gordon et al., J. Molec and Appl. Gen. 1:165 (1981) 10. Kaufman, R.F. et al., J. Molec. Biol. 159:601 (1982) 25 11. Perucho, Manuel et^ al_., Cell 22:309 (1980)

Claims (4)

23 DK 173671 B1 Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til selektion af hvirveldyrceller, som 5 er blevet transficeret med en ekspressionsvektor der er i stand til at udtrykke et ønsket protein, kendetegnet ved, at (a) cellerne behandles med en vektor indeholdende kodese-10 kvenser for både det ønskede protein og et sekundært protein, hvis tilstedeværelse kræves for væksten af værtscellerne under selektive dyrkningsbetingelser, idet begge kodesekvenser er operabelt forbundet med den samme promotorsekvens, men adskilt af translations-stop- og -start- 15 kodoner, og (b) cellerne dyrkes under de selektive dyrkningsbetingelser.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det sekundære protein er DHFR.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de selektive dyrkningsbetingelser omfatter et me- 25 dium, som mangler glycin, hypoxanthin og thymidin.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav til selektion af hvirveldyrceller, som producerer høje niveauer af et ønsket heterologt protein, 30 kendetegnet ved, at (a) cellerne behandles med en vektor indeholdende kodesekvenserne for et sekundært protein, hvis tilstedeværelse tjener som selektionsmarkør for de transficerede celler, 35 neden for kodesekvensen for det ønskede protein, idet begge kodesekvenser er operabelt forbundet med den samme 24 DK 173671 B1 promotorsekvens, men adskilt af translations-stop- og -start-signaler, og (b) cellerne dyrkes under selektive dyrkningsbetingelser. 5