JP2017121244A - ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド - Google Patents
ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】結合ヌクレオシドの第1の領域であって、前記第1の領域が目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチドが多数の参照ポリペプチド配列から選択される、結合ヌクレオシドの第1の領域と、第1の隣接領域であって、前記参照ポリペプチド配列およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然5’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、第1の隣接領域と、前記第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域でと、結合ヌクレオシドの3’尾部配列と、を含む、第2の隣接領域と、を含む、単離ポリヌクレオチド。
【選択図】なし
Description
本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。M300_PCTSQLST.txtと題される配列表ファイルは、2013年3月9日に作成され、49,417,315バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,742号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,224号、表題「Terminally Optimized Modified RNAs」、2012年12月14日出願の国際出願第PCT/US2012/069610号、表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,862号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮
特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted
Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and
Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear
Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modi
fied Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,961号、表題「Dosing Methods for Modified mRNA」、2012年5月17日出願の米国仮特許出願第61/648,286号、表題「Dosing Methods for Modified mRNA」に対する優先権を主張するものであり、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Secreted Proteins」の代理人整理番号M304.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」の代理人整理番号M305.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modifi
ed Polynucleotides for the Production of
Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」の代理人整理番号M306.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Nuclear Proteins」の代理人整理番号M308.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」の代理人整理番号M309.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」の代理人整理番号M310.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic
Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC1.20(PCT/US13/XXXXX)、および表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC2.20(PCT/US13/XXXXX)を有し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾mRNA分子(mmRNA)の組成、これらの設計、調製、製造、および/または製剤化の方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。
加えて、適切に送達され、かつ宿主ゲノムの損傷も組み込みもないと仮定して、コードされたタンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、DNAは、それがRNA転写される核内に輸送されなければならない。その後、DNAから転写されたRNAは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。投与されたDNAからタンパク質までの複数の処理ステップが機能タンパク質の生成前に時間差を生み出すだけでなく、各ステップは、細胞のエラーおよび損傷の機会にもなる。さらに、DNAが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるDNA発現を達成することが困難であることが知られている。これは、DNAが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。
トシンが免疫刺激作用を低下させたことを示している。
CT/US2010/59305、および国際公開第WO2011071936号として公開された2010年12月7日出願の同第PCT/US2010/59317号;ペンシルベニア大学理事会の国際公開第WO2007024708号として公開された2006年8月21日出願のPCT出願第PCT/US2006/32372号、および米国特許第US20090286852号として公開された2009年3月27日出願の米国特許出願国内段階第11/990,646号;Curevac GMBHの2001年6月5日出願の独国特許出願第DE10 2001 027 283.9号、2001年12月19日出願の同第DE10 2001 062 480.8号、および2006年10月31日出願の同第DE 20 2006 051 516号(これらすべて放棄されている)、2005年3月30日に許可された欧州特許第EP1392341号、および2008年1月2日に許可された欧州特許第EP1458410号、国際公開第WO2002098443号として公開された2002年6月5日出願のPCT出願第PCT/EP2002/06180号、国際公開第WO2003051401号として公開された2002年12月19日出願の同第PCT/EP2002/14577号、国際公開第WO2008052770号として公開された2007年12月31日出願の同第PCT/EP2007/09469号、国際公開第WO2009127230号として公開された2008年4月16日出願の同第PCT/EP2008/03033号、国際公開第WO2006122828号として公開された2005年5月19日出願の同第PCT/EP2006/004784号、国際公開第WO2008083949号として公開された2007年1月9日出願の同第PCT/EP2008/00081号、ならびに米国特許第US20050032730号として公開された2003年12月5日出願の米国特許出願第10/729,830号、米国特許第US20050059624号として公開された2004年6月18日出願の同第10/870,110号、米国特許第US20080267873号として公開された2008年7月7日出願の同第11/914,945号、米国特許第US2010047261号として公開され、現在は放棄されている2009年10月27日出願の同第12/446,912号、米国特許第US20100189729号として公開された2010年1月4日出願の同第12/522,214号、米国特許第US20110077287号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,566号、米国特許第US20100239608号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,755号、米国特許第US20110269950号として公開された2011年7月18日出願の同第13/185,119号、および米国特許第US20110311472号として公開された2011年5月12日出願の同第13/106,548号に記載されており、これらはすべて、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期、および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および/または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供することによって、この必要性に対処する。
日出願の米国仮特許出願第61/470,451号;抗体ポリペプチドの産生のために操作された核酸を教示する2011年4月26日出願の同第61/517,784号;mmRNA技術の獣医学における適用を教示する2011年5月17日出願の同第61/519,158号;mmRNA技術の抗菌剤における適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,537号;mmRNA技術のウイルス適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,554号;mmRNA技術で用いる様々な化学修飾を教示する2011年10月3日出願の同第61/542,533号;mmRNA技術の作製および使用で用いるモバイルデバイスを教示する2011年12月14日出願の同第61/570,690号;救急治療状況下でのmmRNAの使用を教示する2011年12月14日出願の同第61/570,708号;mmRNAの末端修飾構造を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,651号;リピドイドを用いたmmRNAの送達方法を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,705号;mmRNAを用いて器官または組織の生存率を増加させるための方法を教示する2011年12月21日出願の同第61/578,271号;細胞透過性ペプチドをコードするmmRNAを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,322号;mmRNAへの細胞傷害性ヌクレオシドの組み込みを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,352号;および血液脳関門を横断するためにmmRNAを用いる方法を教示する2012年1月10日出願の同61/631,729号に開示されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
むポリヌクレオチドまたは一次RNA構築物を提供することによって従来のmRNA分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾mRNA分子は、「mmRNA」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、2個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT−5meC−G」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ATCG」から「ATCCCG」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「CC」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
本発明のmmRNAは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特徴において野生型mRNAと区別される。
、17、20、25、もしくは30個のアミノ酸のペプチド、または40個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、35、30、25、20、17、15、14、13、12、11、もしくは10個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
定され得る。この実施形態において、ポリA尾部は、ポリA結合タンパク質の少なくとも4個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質の単量体は、一続きの約38個のヌクレオチドに結合する。したがって、約80個のヌクレオチドおよび160個のヌクレオチドのポリA尾部が機能的であることが観察されている。
本発明に従って、一次構築物またはmmRNAは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子間であり得る。
本発明に従って、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介して結合され得る。
化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の一次構築物またはmmRNAは、他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性一次構築物または二機能性mmRNA)である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少なくとも2つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない)か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら2つの機能は、mmRNAおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コード領域は、一次構築物の「第1の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、1個以上の長い非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしくはその部分、低分子核RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
本発明に従って、一次構築物は、1個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基(天然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
らし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。
のうちのいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の変異を含む。
本発明の一次構築物またはmmRNAは、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはいかなる治療指標も特定されていないにもかかわらず、研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これらに限定されないいくつかの標的カテゴリーのうちのいずれかから選択される目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。
86、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、1239、1240、1241、1242、1243、1244、1245、1246、1247、1248、1249、1250、1251、1252、1253、1254、1255、1256、1257、1258、1259、1260、1261、1262、1263、1264、1265、1266、1267、1268、1269、1270、1271、1272、1273、1274、1275、1276、1277、1278、1279、1280、1281、1282、1283、1284、1285、1286、1287、1288、1289、1290、1291、1292、1293、1294、1295、1296、1297、1298、1299、1300、1301、1302、1303、1304、1305、1306、1307、1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315、1316、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、1343、1344、1345、1346、1347、1348、1349、1350、1351、1352、1353、1354、1355、1356、1357、1358、1359、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1366、1367、1368、1369、1370、1371、1372、1373,、1374、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392のうちのいずれかであり得る。
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F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Sch艪・・・秩CJinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb
Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein databese search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の生物製剤をコードし得る。本明細書で使用するとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法によって産生され、かつ重病もしくは命にかかわる疾患または病状を治療、治癒、軽減、予防、または診断するために用いられ得るポリペプチド系分子である。生物製剤には、本発明に従って、アレルゲン抽出物(例えば、アレルギー注射および試験用)、血液成分、遺伝子治療産物、移植に用いられるヒト組織または細胞産物、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、ならびに免疫調節因子等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の抗体またはその断片をコードし得る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体(diabody)、および一本鎖分子)、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリン(Ig)」という用語は、本明細書において「抗体」と同義に使用される。本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異および/または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一であるその集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。
書に組み込まれる、米国特許第8,217,147号に記載の変異形免疫グロブリンFc領域を有する抗体をコードし得る。
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上のワクチンをコードし得る。本明細書で使用するとき、「ワクチン」は、特定の疾患または感染体に対する免疫を高める生物学的調製物である。本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上のワクチンが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の有効なまたは「試験用の」治療用タンパク質またはペプチドをコードし得る。
本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」またはCPPは、分子の細胞取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、1つ以上の検出可能な標識を含有し得る。ポリペプチドは、部分的に標識化され得るか、または完全に全体を通して標識化され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、検出可能な標識を完全にコードし得るか、部分的にコードし得るか、または全くコードし得ない。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を用いて、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。
タンパク質」は、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を持つタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成時に荷電タンパク質に共有結合され得る。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比率は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、または0.9であり得る。
ヒトおよび他の真核細胞は、膜によって多くの機能的にはっきりと異なる区画に細分される。各膜結合型区画、または小器官は、小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。この細胞は、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を用いて、タンパク質を特定の細胞小器官に標的化する。
。
本発明のいくつかの実施形態において、原形質膜のタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、細胞質または細胞骨格タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、細胞内膜結合タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、核タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト疾患に関連したタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、現在未知の治療的機能を有するタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
本発明のいくつかの実施形態において、標的部分を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。これらには、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体が含まれる。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分もしくは生体分子の合成および細胞外局在化を指向することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、ポリペプチドライブラリを生成することができる。これらのライブラリは、それぞれ、様々な構造または化学修飾設計を有する、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団の生成から生じ得る。この実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団は、本明細書に教示されるか、または当技術分野で既知の抗体もしくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および他のポリペプチドを含むが、これらに限定されない複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、その後にコードされたポリペプチドを合成し得る標的細胞または培養物への直接導入に好適であり得るmmRNAを含む本発明の一次構築物である。
、または発現レベル等の生物物理学的特性の点で最善の変異形を決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリは、10、102、103、104、105、106、107、108、109、または109を超える可能な変異形(1個以上の残基の置換、欠失、および1個以上の残基の挿入を含むが、これらに限定されない)を含有し得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1個以上の抗菌性ペプチド(AMP)または抗ウイルス性ペプチド(AVP)をコードするように設計され得る。AMPおよびAVPは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚、および哺乳動物等であるが、これらに限定されない様々な動物から単離され、説明されている(Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009;37(データベース刊行):D933−7)。例えば、抗菌性ポリペプチドは、抗菌性ペプチドデータベース(http://aps.unmc.edu/AP/main.php;Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009;37(データベース刊行):D933−7)、CAMP:Collection of Anti−Microbial Peptides(http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/);Thomas et al.,Nucleic Acids Res.2010;38(データベース刊行):D774−80)、米国特許第US5221732号、同第US5447914号、同第US5519115号、同第US5607914号、同第US5714577号、同第US5734015号、同第US5798336号、同第US5821224号、同第US5849490号、同第US5856127号、同第US5905187号、同第US5994308号、同第US5998374号、同第US6107460号、同第US6191254号、同第US6211148号、同第US6300489号、同第US6329504号、同第US6399370号、同第US6476189号、同第US6478825号、同第US6492328号、同第US6514701号、同第US6573361号、同第US6573361号、同第US6576755号、同第US6605698号、同第US6624140号、同第US6638531号、同第US6642203号、同第US6653280号、同第US6696238号、同第US6727066号、同第US6730659号、同第US6743598号、同第US6743769号、同第US6747007号、同第US6790833号、同第US6794490号、同第US6818407号、同第US6835536号、同第US6835713号、同第US6838435号、同第US6872705号、同第US6875907号、同第US6884776号、同第US6887847号、同第US6906035号、同第US6911524号、同第US6936432号、同第US7001924号、同第US7071293号、同第US7078380号、同第US7091185号、同第US7094759号、同第US7166769号、同第US7244710号、同第US7314858号、および同第US7582301号に記載されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が組み込まれる。
ば、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、HIV−1 gp120またはgp41の膜貫通サブユニットの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。HIV−1 gp120またはgp41のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Kuiken et al.,(2008)“HIV Sequence Compendium,”Los Alamos National Laboratoryに記載される。
抗菌性ポリペプチド(AMP)は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、および腫瘍/癌細胞を含むが、これらに限定されない様々な微生物に対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Zaiou,J Mol Med,2007;85:317を参照のこと)。AMPが広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。
は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的にカチオン性および両親媒性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍または癌細胞)に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、分泌ポリペプチドであり得る。
抗ウイルス性ポリペプチド(AVP)は、様々なウイルスに対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである。例えば、Zaiou,J Mol
Med,2007;85:317を参照されたい。AVP広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、10kDa未満、例えば、8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、または1kDa未満である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約6〜約100個のアミノ酸、例えば、約6〜約75個のアミノ酸、約6〜約50個のアミノ酸、約6〜約25個のアミノ酸、約25〜約100個のアミノ酸、約50〜約100個のアミノ酸、または約75〜約100個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなる。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約15〜約45個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質
的にカチオン性および両親媒性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)細胞傷害性およびに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1個以上の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込み得る。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、例えば、二機能性修飾RNAまたはmRNAに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗癌剤には、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、5−フルオロウラシル、フルダラビン、フロキシウリジン、FTORAFUR(登録商標)(テガフールおよびウラシルの組み合わせ)、テガフール((RS)−5−フルオロ−1−(テトラヒドロフラン−2−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン)、および6−メルカプトプリンが含まれるが、これらに限定されない。
書に組み込まれる。Fujiuによって説明されるこの一連のカペシタビン類似体は、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンのN4アルキルおよびアラルキルカルバミン酸塩を含み、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンをもたらすことを暗示する。
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。
天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
D、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン(Herculin))、内皮細胞(Tie−1、CD36)、骨髄細胞(C/EBP、AML1、G−CSF、GM−CSF、CD11b、MSR、Fr−1、i−NOS)、白血球(CD45、CD18)、脂肪組織(CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)、および肺上皮細胞(SP−A/B/C/D)において可能である。
3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(Adenosine)およびウリジン(Uridine)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen et al,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF−aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーのメンバー、中でも注目すべきHuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNA種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第US2005/0261218号および米国特許公開第US2005/0059005号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロRNAに対応し得、これらの内容は、参照によりこ
れらの全体が本明細書に組み込まれる。
129:1401−1414)。
and Naldini,Tissue Antigens.2012,80:393−403)。加えて、マイクロRNA種部位は、mRNAに組み込まれてある特定の細胞における発現を低下させ得、これは、生物学的改善をもたらす。これについての例は、miR−142部位のUGT1A1発現レンチウイルスベクターへの組み込みである。miR−142種部位の存在が造血細胞での発現を低下させ、結果として抗原提示細胞での発現を低下させ、ウイルスによって発現したUGT1A1に対する免疫応答の不在をもたらした(いずれも参照により全体が本明細書に組み込まれる、Schmitt et al.,Gastroenterology 2010;139:999−1007、Gonzalez−Asequinolaza et al.Gastroenterology 2010,139:726−729)。miR−142部位の修飾mRNAへの組み込みが、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低下させることができただけでなく、mRNAでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低下または無効にすることもできた。miR−142種部位(1つまたは複数)のmRNAへの組み込みは、完全なタンパク質欠乏症を有する患者(I型UGT1A1、LDLR欠損患者、CRIM陰性Pompe患者等)の治療時に重要である。
ク質をアッセイすることができる。マイクロRNA結合部位操作分子を用いたインビボ実験を行って、製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの組織特異的発現の変化を試験することもできる。
mRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を向上させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これは、CBPのポリ(A)結合タンパク質との会合を介して細胞におけるmRNA安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状mRNA種を形成する。このキャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近位のイントロンの除去を支援する。
大麦縞萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(JSRV)、および/または地方病性鼻腫瘍ウイルス(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012129648号を参照のこと)等であるが、これらに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの3’UTRに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパク質産生をトランスフェクション
後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点でアッセイすることができる。
さらに、内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し得るポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスRNAと特定されたIRESは、5’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。IRESは、mRNAの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの1つの役割を果たし得る。2個以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、リボソーム(「多シストロン性核酸分子」)によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにIRESが提供されるとき、第2の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るIRES配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス(例えば、FMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)由来のものが挙げられる。
RNA処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖(ポリA尾部)が、安定性を向上させるためにmRNA分子等のポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後、転写物の3’末端が切断されて3’ヒドロキシルを遊離させ得る。その後、ポリAポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、約100〜250残基長であり得るポリA尾部を付加する。
mRNAの長さに対して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さ(第1もしくは隣接領域等)に基づき得るか、またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAから発現した最終産物の長さに基づき得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
ロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによっても単離され得る。
本発明に従って用いるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、化学合成、一般にインビトロ転写(IVT)と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。RNAを合成する方法は、当技術分野において既知である(例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Gait,M.J.(ed.)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRL Press,1984、およびHerdewijn,P.(ed.)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照のこと)。
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにcDNA鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
目的とするポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域は、選択された核酸(DNAまたはRNA)転写物のオープンリーディングフレーム(ORF)を用いて構築され得る。ORFは、野生型ORF、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、目的とするポリペプチドをコードすることができる核酸配列(DNAまたはRNA)を指すよう意図される。ORFは、多くの場合、開始コドンATGで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
性を高めるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するか、または欠失させること、リボソーム結合部位およびmRNA分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはmRNA内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において既知であり、非限定的な例には、GeneArtのサービス(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)、および/または所有権を有する方法が挙げられる。一実施形態において、ORF配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢が表1に提供される。
表1.コドン選択肢
表2.5’非翻訳領域
表3.3’非翻訳領域
属し得る。これらの遺伝子のうちのいずれのUTRも、同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のUTRと交換されて、新たなキメラ一次転写物を作成し得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する2個以上の目的とするポリペプチドの群を指すために用いられる。
一実施形態において、本発明の一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、TGA、TAA、およびTAGから選択され得る。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンTGAおよびもう1つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう1つの終止コドンは、TAAであり得る。別の実施形態において、本発明の一次構築物は、3つの終止コドンを含む。
一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Invitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprepキット(Carlsbad,CA)を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、InvitrogenのPURELINK(商標)PCR Microキット(Carlsbad,CA)、ならびに強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの標準PURELINK(商標)PCRキット(Carlsbad,CA)を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写(IVT)反応のためのcDNAを生成する。
cDNA鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を経させることによって合成され得る。表4は、本発明のPCR反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、5−メチル−シチジン、2、6−ジ−アミノ−プリン、2’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表4.プライマーおよびプローブ
*UFPはユニバーサル順方向プライマーであり、URPはユニバーサル逆方向プライマーである。
mRNAまたはmmRNA産生のプロセスは、インビトロ転写、cDNA鋳型除去およびRNA浄化、ならびにmRNAキャッピングおよび/またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
先のステップで産生されたcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)、RNase阻害剤、およびポリメラーゼを含む。NTPは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。NTPは、天然および非天然(修飾された)NTPを含む本明細書に記載のNTPから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、および修飾された核酸を組み込むことができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
任意の数のRNAポリメラーゼまたは変異形が本発明の一次構築物の設計において用い
られ得る。
細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれか、および/またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない2つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも2つの領域および/またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、5’UTRは、5〜8個のアデニン塩基を挿入し、その後、5〜8個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例において、5’UTRは、5〜8個のシトシン塩基を挿入し、その後、5〜8個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
限定的な例において、一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、かつ開始コドンの前の領域に1個のグアニン塩基を残すように設計され得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Esvelt et al.Nature(2011)472(7344):499−503を参照のこと)。非限定的な例として、少なくとも5個のヌクレオチドは、転写開始部位の下流および開始コドンの上流の1つの位置に挿入され得、少なくとも5個のヌクレオチドは、同一の塩基型であり得る。
cDNA鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。RNA浄化は、Beckman Coulter(Danvers,MA)のAGENCOURT(登録商標)CLEANSEQ(登録商標)システム;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
一次構築物またはmmRNAは、キャッピングおよび/またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、5’キャップを一次構築物の5’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素(New England Biolabs、Ipswich,MA)の使用が含まれるが、これに限定されない。
一次構築物またはmmRNA精製は、mRNAまたはmmRNA浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。mRNAまたはmmRNA浄化は、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics、Danvers,MA);ポリTビーズ;LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc、Vedbaek,Denmark);または強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたmRNAまたはmmRNA」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも1つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
一次構築物またはmmRNAは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の1つに、シグナル配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれる、それぞれ、約9〜200ヌクレオチド長(3〜60アミノ酸長)のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、1つ以上の分泌経路を通るコードされたポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
表5.シグナル配列
、および同第7,385,034号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明に従って、一次構築物は、少なくとも1つの目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの少なくとも1つの第1の領域を含む。本発明の目的とするポリペプチドまたは「標的」が表6に列記される。目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明に加えて、ENSEMBL転写物配列番号(ENST)、ENSEMBLタンパク質配列番号(ENSP)、および利用可能な場合には、最適化された転写配列番号(OPtim Trans配列番号)または最適化されたオープンリーディングフレーム配列番号(OptimORF配列番号)も表6に示される。任意の特定の遺伝子について、1つ以上の変異形またはアイソフォームが存在し得る。これらが存在する場合、それらも同様に表に示される。当業者であれば、表に開示されるものが可能性のある隣接領域であることを理解する。これらは、各ENST転写物におけるORFまたはコーディング領域の5’(上流)または3’(下流)のいずれかにコードされる。コーディング領域は、ENSP配列を教示することによって断定的かつ具体的に開示される。その結果として、タンパク質をコードする隣接する教示の配列が隣接領域と見なされる。1つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することによって5’および3’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ENST転写物の隣接領域に含有される特徴に注釈を付けており、これらは、当技術分野において利用可能である。
表6.標的
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも1個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、N末端とC末端の真ん中、N末端と中間点との間、中間点とC末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないN末端とC末端との間の任意の空間で、N末端、C末端に位置し得る。
異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンアイソザイム1(SKI−1)およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン9(PCSK9)と呼ばれる非塩基性残基で切断する他の2個のサブチラーゼを含む9個のプロテイナーゼのファミリーである。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非限定的な例が表7に列記される。表7において、「X」は、任意のアミノ酸を指し、「n」は、0、2、4、または6個のアミノ酸であり得、「*」は、タンパク質切断部位を指す。表7において、配列番号21426は、nが4であるときを指し、配列番号21427は、nが6であるときを指す。
表7.タンパク質切断部位配列
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。これらの転写後制御調節因子は、小分子、化合物、および制御配列であり得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、転写後制御は、GEMS(商標)(小分子による遺伝子発現調節(Gene Expression Modulation by Small−Moleclues))スクリーニング技術を用いてPTC Therapeutics Inc.(South Plainfield,NJ)によって特定された小分子を用いて達成され得る。
本明細書におけるポリヌクレオチド(一次構築物またはmRNA分子等)において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、A、G、U、またはCリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する5’末端mRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の20個のアミノ
酸(部分)と比較した修飾を指す。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域、第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域、および第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域を含む。
えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ia)もしくは式(Ia−1):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
整数であり、
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
キニル、または任意に置換されたアリールであり、
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
キニル、または任意に置換されたアリールであり、
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
5のすべてがC1〜6アルキルである。特定の実施形態において、R3もR4もいずれもHであり、R5はC1〜6アルキルである。
(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、各Y3は、独立して、OまたはSである。
メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。なおさらなる実施形態において、各Y1は、独立して、Oまたは−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり(例えば、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)であり)、各Y4は、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。特定の実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uが、−CH2−または−CH−である)。他の実施形態では、R1、R2、R3、R4、およびR5の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各R3およびR4は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R5は、Hまたはヒドロキシであり)、−−−は、一重結合または二重結合である。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uは、−CH2−または−CH−である)。他の実施形態では、R1およびR2 の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在である(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、H、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシである)。特定の実施形態において、R2は、ヒドロキシまたは任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシ、エトキシ、または本明細書に記載のいずれか)である。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uが、−CH2−または−CH−である)。いくつかの実施形態において、R1、R2、およびR3の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか
、または不在である(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、H、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシであり、各R3は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキル)である)。特定の実施形態において、R2は、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ、または本明細書に記載のいずれか)である。特定の実施形態において、R1は、任意に置換されたアルキルであり、R2は、ヒドロキシである。他の実施形態では、R1は、ヒドロキシであり、R2は、任意に置換されたアルキルである。さらなる実施形態において、R3は、任意に置換されたアルキルである。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
のn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
(IIk)〜(IIm):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1’、R1”、R2’、およびR2”の各々が、独立して、H、ハロ、
ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、R2’とR3の組み合わせまたはR2”とR3の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、R3”が、任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)または任意に置換されたヘテロアルキレン(例えば、−CH2NH−、−CH2CH2NH−、−CH2OCH2−、もしくは−CH2CH2OCH2−)である(例えば、R3’がOであり、R3”が任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)である)。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、R3”が、任意に置換されたアルキレン(例え
ば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)または任意に置換されたヘテロアルキレン(例えば、−CH2NH−、−CH2CH2NH−、−CH2OCH2−、もしくは−CH2CH2OCH2−)である(例えば、R3’がOであり、R3”が任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)である)。
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R12a、R12c、T1’、T1”、T2’、T2”、V1、およびV3は、本明細書に記載の通りである。
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa−1):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa−2):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
得る。
本発明は、修飾RNA(mmRNA)分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの調製に有用であり得る。いくつかの実施形態において、ビルディングブロック分子は、式(IIIa)もしくは(IIIa−1):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、置換基は、本明細書に記載のもの(例えば、式(Ia)および(Ia−1))であり、Bが、シトシン、グアニン、ウラシル、およびアデニンから選択される未修飾核酸塩基であるとき、Y1、Y2、またはY3のうちの少なくとも1つは、Oではない。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜
(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、お
よび(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1
つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、各r1およびr2は、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数であり、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数であり、s1は、本明細書に記載の通りである。
リジンである(例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、本明細書に記載のRNAまたはmRNA)に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、ビルディングブロック分子)は、リボ核酸の糖において修飾され得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。2’位での例示の置換には、H、ハロ、任意に置換されたC1〜6アルキル、任意に置換されたC1〜6アルコキシ、任意に置換されたC6〜10アリールオキシ、任意に置換されたC3〜8シクロアルキル、任意に置換されたC3〜8シクロアルコキシ、任意に置換されたC6〜10アリールオキシ、任意に置換されたC6〜10アリール−C1〜6アルコキシ、任意に置換されたC1〜12(ヘテロシクリル)オキシ、糖(例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか)、ポリエチレングリコール(PEG)、−O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(式中、RがHまたは任意に置換されたアルキルであり、nが0〜20(例えば、0〜4、0〜8、0〜10、0〜16、1〜4、1〜8、1〜10、1〜16、1〜20、2〜4、2〜8、2〜10、2〜16、2〜20、4〜8、4〜10、4〜16、および4〜20)の整数である)、2’−ヒドロキシルがC1〜6アルキレンまたはC1〜6ヘテロアルキレン架橋によって同一のリボース糖の4’−炭素に結合される「ロックド」核酸(LNA)(例示の架橋には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる)、本明細書で定義されるアミノアルキル、本明細書で定義されるアミノアルコキシ、本明細書で定義されるアミノ、および本明細書で定義されるアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。概して、RNAは、酸素を有する5員環の糖類リボースを含む。非限定的な例示の修飾ヌクレオチドには、リボースの酸素の(例えば、S、Se、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンとの)置換、二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルと置換するため)、リボースの環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員環を形成するため)、リボースの環拡大(例えば、無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホラミデート骨格も有するモルホリノ等のさらなる炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成するため)、多環式形態(例えば、トリシクロ、および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸(GNA)(例えば、R−GNAまたはS−GNA、リボースがホスホジエステル結合に結合するグリコール単位で置換される部分)、トレオース核酸(TNA、リボースがα−L−トレオフラノシル−(3’→2’)で置換される部分)、ならびにペプチド核酸(PNA、2−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置換する部分)が挙げられる。糖基は、リボースの対応する炭素の立体化学配置とは逆の立体化学配置を有する1個以上の炭素も含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書において「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。修飾ヌクレオチドは、(1個以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるために、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に)本明細書に記載の任意の有用な方法によって合成され得る。
表8
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
が、一重または二重結合であり、
ミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
が、一重または二重結合であり、
シカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
れたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキル(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり(例えば、RVb’が、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキル、例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたものであり)、
O−保護基で置換されたもの)、またはN−保護基のうちの1つ以上で置換される。いくつかの実施形態において、任意に置換されたアミノアルキルは、任意に置換されたスルホアルキルまたは任意に置換されたアルケニルで置換される。特定の実施形態において、R12aもRVb”もいずれもHである。特定の実施形態において、T1は、O(オキソ)であり、T2は、S(チオ)またはSe(セレノ)である。
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり、R13bとRVcの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体が挙げられ、
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、またはSe(セレノ)を形成し、
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
(b18)〜(b20):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、各V7が、独立して、O、S、N(RVe)nv、またはC(RVe)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVeが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり、
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。他の実施形態では、R25は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。
を有し得、式中、X12は、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、xaは、0〜3の整数であり、R12aおよびT2は、本明細書に記載の通りである。
を有し得、式中、R10’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R11、R12a、T1、およびT2は、本明細書に記載の通りである。
を有し得、式中、R10は、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、任意に置換されたフリル、任意に置換されたチエニル、もしくは任意に置換されたピロリル)、任意に置換されたアリール(例えば、任意に置換されたフェニルもしくは任意に置換されたナフチル)、または本明細書に記載の任意の置換基(例えば、R10のもの)であり、R11(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、R12a(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、T1(例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基)、およびT2(例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基)は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Bは、式(b24):
を有し得、式中、R14’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R13a、R13b、R15、およびT3は、本明細書に記載の通りである。
であり得る。
−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン(1−メチルシュードウリジン(m1ψ)としても既知のもの)、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’‐F‐アラ‐ウリジン、2’‐F‐ウリジン、2’‐OH‐アラ‐ウリジン、5‐(2‐カルボメトキシビニル)ウリジン、および5‐[3‐(1‐E‐プロペニルアミノ)ウリジンが挙げられる。
オニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’−O−triメチル−アデノシン(m6 2Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(ホスフェート)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’‐F‐アラ‐アデノシン、2’‐F‐アデノシン、2’‐OH‐アラ‐アデノシン、およびN6‐(19‐アミノ‐ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
ンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、デアザグアニン、7−デアザグアニン、3−デアザグアニン、デアザアデニン、7−デアザアデニン、3−デアザアデニン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、イミダゾ[1,5−a]1,3,5トリアジノン、9−デアザプリン、イミダゾ[4,5−d]ピラジン、チアゾロ[4,5−d]ピリミジン、ピラジン−2−オン、1,2,4−トリアジン、ピリダジン、および1,3,5トリアジンを含む塩基の天然に存在する合成誘導体も含み得る。ヌクレオチドがA、G、C、T、またはUの略語を用いて示されるとき、各文字は、代表的な塩基および/またはその誘導体を指し、例えば、Aは、アデニン、または、例えば、7−デアザアデニンのようなアデニン類似体を含む。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合(例えば、リン酸骨格)において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの1個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)での置換によっても修飾され得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか1つ以上の修飾を含み得る。例えば、式(Ia)、(Ia−1)〜(Ia−3)、(Ib)〜(If)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr)における本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかは、本明細書に記載の核酸塩基のうちのいずれ(例えば、式(b1)〜(b43)または本明細書に記載の任意の他のもの)とも組み合わせられ得る。
本発明に従って用いるポリペプチド、一次構築物、およびmmRNA分子は、本明細書に記載の任意の有用な技法に従って調製され得る。本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA分子の合成において用いられる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なプロセス条件または好ましいプロセス条件(例えば、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力等)が提供される場合、当業者であれば、さらなるプロセス条件を最適化および開発することができるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順を用いて当業者によって決定され得る。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、ビルディングブロック分子)は、各々が参照によりそれらの全体が組み込まれる、Ogata et al.,J.Org.Chem.74:2585−2588(2009)、Purmal et al.,Nucl.Acids Res.22(1):72−78,(1994)、Fukuhara et al.,Biochemistry,1(4):563−568(1962)、およびXu et al.,Tetrahedron,48(9):1729−1740(1992)に記載の合成方法に従って調製され得る。
(例えば、プリンもしくはピリミジン、またはA、G、U、Cのうちのいずか1つ以上もしくはすべて)は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の既定の配列領域(例えば、図1に表される配列領域のうちの1つ以上)において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド(またはその所与の配列領域)におけるすべてのヌクレオチドXが修飾され、ここでXは、ヌクレオチドA、G、U、Cのうちのいずれか1つ、または組み合わせA+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U、もしくはA+G+Cのうちのいずれか1つであり得る。
0%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%の修飾シトシンまたは修飾シチジン)と置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造(例えば、本明細書に記載の2、3、4つ以上の固有の構造)を有する複数の化合物に置換され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、式(Ia−1):
を有するn個の結合ヌクレオシドを含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)を合成する方法を提供し、この方法は、
a)式(IV−1):
のヌクレオチドを、式(V−1):
のホスホラミダイト化合物と反応させて(式中、Y9が、H、ヒドロキシ、ホスホリル、ピロリン酸塩、硫酸塩、アミノ、チオール、任意に置換されたアミノ酸、またはペプチド(例えば、2〜12個のアミノ酸を含む)であり、各P1、P2、およびP3が、独立して、好適な保護基であり、
が、固体支持体を示す)、
式(VI−1)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを提供することと、
、および
b)式(V)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを酸化または硫化して、式(VII−1)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを産出することと、
、および
c)保護基を除去して、式(Ia)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを産出することとを含む。
、一次構築物、またはmmRNAは、翻訳可能であり得る。
スキーム1
スキーム2
スキーム3
スキーム4
スキーム5
スキーム6
スキーム7
スキーム8
スキーム9
スキーム10
スキーム11
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表9に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明のポリペプチド、一次構築物、またはmmRNAを形成することができる。別途述べられない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の修飾核酸またはmmRNAの天然ヌクレオチドと完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示の修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも1つで部分的に置換され得る(例えば、約0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99.9%)。
表9
表10
約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの組成物および複合体を提供する。薬学的組成物は、任意に、1つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および/または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005において見出され得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、:(1)安定性を増加させ、(2)細胞トランスフェクションを増加させ、(3)(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのデポー製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能にし、(4)生体分布を変化させ(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの標的を特定の組織または細胞型に定める)、(5)コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ/または(6)コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、1つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA(例えば、対象への移植のために)でトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。したがって、本発明の製剤は、1つ以上の賦形剤を含むことができ、各々は一緒にポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAの安定性を増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによる細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および/またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の一次構築物およびmmRNAは、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
ンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内(intrancellular)膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質および/または非ヒト疾患に関連したタンパク質等であるが、これらに限定されないカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾mRNAを含有し得る。一実施形態において、製剤は、少なくとも3つの修飾mRNAがコードするタンパク質を含有する。一実施形態において、製剤は、少なくとも5つの修飾mRNAがコードするタンパク質を含有する
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達に特に適している(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Mahon et al.,Bioconjug Chem.2010 21:1448−1454、Schroeder et al.,J Intern Med.2010 267:9−21、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869、Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011108:12996−3001を参照のこと)。
次構築物、またはmmRNAを送達することにおけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子が調製され得、したがって、局所および/または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注入後に、コードされたタンパク質の産生によって判定するとき、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない、種々の手段によって投与することができる。
17:872−879)。例として、ポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質のアンカー鎖長のわずかな変化が、インビボ有効性に対する大きな効果をもたらし得る。ペンタ[3−(1−ラウリルアミノプロピオニル)]−トリエチレンテトラミン塩酸塩(TETA−5LAP(98N12−5としても知られる)、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Murugaiah et al.,Analytical Biochemistry,401:61(2010)を参照のこと)、C12−200(誘導体および変異形を含む)、およびMD1を含むが、これらに限定されない、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
Acad Sci USA.2010 107:1864−1869(図2を参照のこと)およびLiu and Huang,Molecular Therapy.2010 669−670(図2を参照のこと)によって開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3つもしくは4つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、98N12−5を含むが、これらに限定されず、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEG(C14アルキル鎖長)を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、C12−200を含むが、これらに限定されず、50%リピドイド、10%ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%コレステロール、および1.5%PEG−DMGを含有してもよい。
イドを使用し、50/10/38.5/1.5のC12−200/ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン/コレステロール/PEG−DMGのモル比を有し得、7対1の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの重量比、および80nmの平均粒径を有する静脈内製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを肝細胞に送達するのに有効であり得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869を参照のこと)。別の実施形態において、MD1リピドイド含有製剤を用いて、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを肝細胞に有効に送達し得る。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型、および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。内皮窓(fenestrae)のサイズに起因して、150nm未満の粒径が有効な肝細胞送達のために所望され得るが(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879を参照のこと)、製剤を、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。siRNAをインビボで骨髄細胞および内皮等の他の非肝細胞細胞に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている(各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Leuschner et al.,Nat Biotechnol.2011 29:1005−1010、Cho et al.Adv.Funct.Mater.2009 19:3112−3118、8th International Judah Folkman Conference,Cambridge,MA October 8−9,2010を参照のこと)。単球等の骨髄細胞への有効な送達、リピドイド製剤は、同様の構成成分モル比を有し得る。リピドイドと、ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、コレステロール、およびPEG−DMGを含むが、これらに限定されない他の構成成分との異なる比率を用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの製剤を、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のために最適化し得る。例えば、構成成分モル比は、50%のC12−200、10%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%のコレステロール、および1.5%のPEG−DMGを含み得るが、これらに限定されない(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Leuschner et al.,Nat Biotechnol 2011 29:1005−1010を参照のこと)。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した、核酸の細胞(脂肪細胞および筋肉細胞等であるが、これらに限定されない)への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成成分のすべてを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのみを含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態に
おいて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの薬学的組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞(MLV)、直径50nmよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞(SUV)、および直径50〜500nmであり得る大きい単層小胞(LUV)等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低pHまたは高pHを含有してもよい。
Biotechnol.2005 2:1002−1007、Zimmermann et al.,Nature.2006 441:111−114、Heyes et al.J Contr Rel.2005 107:276−287、Semple et al.Nature Biotech.2010 28:172−176、Judge et al.J Clin Invest.2009 119:661−673、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132を参照のこと)。Wheelerらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法(detergent dialysis method)であり、それは後にJeffsらによって改善され、自発的小胞形成法(spontaneous vesicle formation method)と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3〜4つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Jeffsらによって記載されるように、55%のコレステロール、20%のジ
ステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン(DSPC)、10%のPEG−S−DSG、および15%の1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Heyesらによって記載されるように、48%のコレステロール、20%のDSPC、2%のPEG−c−DMA、および30%のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、1,2−ジステアリルオキシ(distearloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、DODMA、DLin−DMA、または1,2−ジリノレニルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)であり得る。
osa)−17,20−ジエン−9−アミン、(1Z,19Z)−N5N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−8−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチルドコサ−13,16−ジエン−5−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチルヘニコサ−12,15−ジエン−4−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−6−アミン、(15Z,18Z)−N,N−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−7−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−10−アミン、(15Ζ,18Ζ)−Ν,Ν−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−5−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−4−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメチルオクタコサ(dimeihyloctacosa)−19,22−ジエン−9−アミン、(18Z,21 Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−8−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17,20−ジエン−7−アミン、(16Z,19Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−6−アミン、(22Z,25Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22,25−ジエン−10−アミン、(21Z,24Z)−N,N−ジメチルトリアコンタ−21,24−ジエン−9−アミン、(18Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ(dimetylheptacos)−18−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17−エン−9−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメチルオクタコサ−19,22−ジエン−7−アミン、N,N−ジメチルヘプタコサン−10−アミン、(20Z,23Z)−N−エチル−N−メチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、1−[(11Z,14Z)−1−ノニルイコサ−11,14−ジエン−1−イル]ピロリジン、(20Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−20−エン−10−アミン、(15Z)−N,N−ジメチルエプタコサ(eptacos)−15−エン−10−アミン、(14Z)−N,N−ジメチルノナコサ−14−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルノナコサ−17−エン−10−アミン、(24Z)−N,N−ジメチルトリトリアコンタ−24−エン−10−アミン、(20Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20−エン−10−アミン、(22Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22−エン−10−アミン、(16Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16−エン−8−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチル−2−ノニルヘニコサ−12,15−ジエン−1−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチル−3−ノニルドコサ−13,16−ジエン−1−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]エプタデカン(eptadecan)−8−アミン、1−[(1S,2R)−2−ヘキシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、N,N−ジメチル−21−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘニコサン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン−8−アミン、Ν,Ν−ジメチル−[(1R,2S)−2−ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン−5−アミン、N,N−ジメチル−3−{7−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン−1−アミン、1−[(1R,2S)−2−ヘプチルシクロプロピル]−Ν,Ν−ジメチルオクタデカン−9−アミン、1−[(1S,2R)−2−デシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルペンタデカン−6−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ペンタデカン−8−アミン、R−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、S−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオ
キシ]−3−[(5Z)−オクタ−5−エン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘプチルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−(ノニルオキシ)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(9Z)−オクタデカ−9−エン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン;(2S)−N,N−ジメチル−1−[(6Z,9Z,12Z)−オクタデカ−6,9,12−トリエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(ペンチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−3−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−Ν,Ν−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(13Z,16Z)−ドコサ−l3,16−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(9Z)−ヘキサデカ−9−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2R)−N,N−ジメチル−H(1−メトイルオクチル)オキシ]−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2R)−1−[(3,7−ジメチルオクチル)オキシ]−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−(オクチルオキシ)−3−({8−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−{[8−(2−オクチルシクロプロピル)オクチル]オキシ}−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、および(11E,20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−11,20,2−トリエン−10−アミン、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択されてもよい。
5%脂質モル比でPEG−c−DOMGを含有してもよい。
一実施形態において、LNP製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011127255号または同第WO2008103276号に記載の方法によって製剤化されてもよい。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾RNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011127255号および/または同第WO2008103276号に記載されるように、LNP製剤中にカプセル封入されてもよい。
一実施形態において、本明細書に記載のLNP製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第US20050222064号の式1〜60から選択されてもよい。別の実施形態において、ポリカチオン性組成物を含むLNP製剤は、本明細書に記載の修飾RNAのインビボおよび/またはインビトロでの送達に使用されてもよい。
Biotech,Bothell,WA)、中性DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌に対するsiRNA送達(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Landen et al.Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708−1713))、およびヒアルロナンコーティングリポソーム(Quiet Therapeutics,Israel)等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
ogen)オクテニルコハク酸塩、植物グリコーゲンβ−デキストリン、無水物で修飾された植物グリコーゲンβ−デキストリンを含んでもよいが、これらに限定されない。(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012109121号を参照のこと)。
が挙げられる。
および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい10〜200nmよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜(mucosla)組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子(直径200nm〜500nm)は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか4〜6倍低く、粘液を通って拡散した(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Lai et al.PNAS 2007 104(5):1482−487、Lai et al.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158−171)。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定(FRAP)および高解像度多数粒子追跡(MPT)を含むが、これらに限定されない、透過速度および/または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。非限定的な例として、粘膜関門を透過し得る組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,241,670号に記載されるように作製されてもよい。
アクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド−co−カプロラクトン)、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2013012476号に記載の分岐状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー等)、および(ポリ(エチレングリコール)−(ポリ(プロピレンオキシド)−(ポリ(エチレングリコール)トリブロックコポリマー(例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120121718号および米国公開20100003337号ならびに米国特許第8,263,665号を参照のこと)等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる(GRAS)ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングPLGAナノ粒子を含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Yang
et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:2597−2600)。
dom)によるATUPLEX(商標)系、DACC系、DBTC系、および他のsiRNA−リポプレックス技術、STEMGENT(登録商標)(Cambridge,MA)によるSTEMFECT(商標)、ならびにポリエチレンイミン(PEI)またはプロタミンベースの標的を定めたおよび標的を定めない核酸送達等の、リポプレックスとして製剤化される(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Aleku et al.Cancer Res.2008 68:9788−9798、Strumberg et al.Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76−78、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Kaufmann et al.Microvasc Res 2010 80:286−293Weide et al.J
Immunother.2009 32:498−507、Weide et al.J Immunother.2008 31:180−188、Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285−1294、Fotin−Mleczek et al.,2011 J.Immunother.34:1−15、Song et al.,Nature Biotechnol.2005,23:709−717、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 6;104:4095−4100、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132)。
Biotechnol.2005 23:709−717、Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661−673、Kaufmann
et al.,Microvasc Res 2010 80:286−293、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Basha et al.,Mol.Ther.2011 19:2186−2200、Fenske and Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25−44、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、DLin−DMA、DLin−KC2−DMA、およびDLin−MC3−DMAベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Eに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.Mol Ther.2010 18:1357−1364)。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kolhatkar et al.,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197−206、Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388−1412、Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286−298、Patil et al.,Crit Rev Ther
Drug Carrier Syst.2008 25:1−61、Benoit et
al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Zhao et al.,Expert Opin Drug Deliv.2008
5:309−319、Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357−1364、Srinivasan et al.,Methods Mol
Biol.2012 820:105−116、Ben−Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497−507、Peer 2010 J Control Release.20:63−68、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:4095−4100、Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339−353、Subramanya et al.,Mol Ther.2010
18:2028−2037、Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709−717、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。
利なことに、カプセル封入は、蛍光および/または電子顕微鏡写真を用いて、本発明の薬学的組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定されてもよい。例えば、本発明の薬学的組成物または化合物の少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%超が、送達剤中にカプセル封入される。
005721号、同第WO2010005723号、同第WO2012054923号、米国公開第第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、同第US20100068285号、同第US20110274759号、同第US20100068286号、および同第US20120288541、ならびに米国特許第8,206,747号、同第8,293,276号、同第8,318,208号、および同第8,318,211号等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法によって製剤化されてもよい。別の実施形態において、治療的ポリマーナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20120140790号に記載の方法によって特定されてもよい。
またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないポリマーと組み合わせたPEGが含まれてもよい。
て癌を標的としてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011084513号および米国公開第US20110294717号を参照のこと)。
り、本明細書に記載され、かつ/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010138192および米国公開第20100303850号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、天然および/または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、MIRUS(登録商標)Bio(Madison,WI)およびRoche
Madison(Madison,WI)によるDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)(Arrowhead Reasearch Corp.,Pasadena,CA)製剤、制限なく、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PHASERX(登録商標)、Seattle,WA)等のPHASERX(商標)ポリマー製剤、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego,CA)によるVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)ポリマー、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)、ならびにPHASERX(登録商標)(Seattle,WA)等であるが、これらに限定されないpH応答性ブロックコポリマー(co−block polymers)が挙げられる。
肝細胞標的化のため)基の両方がpH感受性結合を介して連結される、膜活性ポリマーが含まれる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887)。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は、低pH環境において解体し、このポリマーがその陽電荷を露出して、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのsiRNAの放出をもたらす。N−アセチルガラクトサミン基の、マンノース基との置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞へと標的合わせを変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞において、EWS−FLI1遺伝子産物の標的を定めたサイレンシングを実証してきており(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Hu−Lieskovan et al.,Cancer Res.2005 65:8984−8982)、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類において耐性が良好であった(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Heidelet al.,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715−21)。これらの送達戦略の両方は、標的を定めた送達機構およびエンドソームからの脱出機構の両方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Sullivan et al.,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433−1446、Convertine et al.,Biomacromolecules.2010 Oct 1、Chu et al.,Acc Chem Res.2012 Jan 13、Manganiello et al.,Biomaterials.2012 33:2301−2309、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Singha
et al.,Nucleic Acid Ther.2011 2:133−147、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125−132、Schaffert and Wagner,Gene Ther.2008 16:1131−1138、Chaturvedi et al.,Expert Opin Drug Deliv.2011 8:1455−1468、Davis、Mol
Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
SEAL(登録商標)(Baxter International,Inc Deerfield,IL)等の手術用シーリング材が含まれ得る。
ト、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
の架橋性ポリエステルを含む。
−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1,
2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチル塩化アンモニウムDODAC)、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
et al.,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748−761、Endres et al.,Biomaterials.2011 32:7721−7731、Su et al.,Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774−87)。非限定的な例として、ナノ粒子は、親水性−疎水性ポリマー(例えば、PEG−PLGA)、疎水性ポリマー(例えば、PEG)、および/または親水性ポリマー等であるが、これらに限定されない複数のポリマーを含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO20120225129号)。
Ther.2012 20:609−615)。この送達系は、siRNAの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
Contr Rel.2006 111:368−370)。
よい。PEG電荷変換型ポリマーは、酸性pHでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、PEG−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる細胞のトランスフェクションを増加させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドである(例えば、すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Car
on et al.,Mol.Ther.3(3):310−8(2001)、Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)、El−Andaloussi et al.,Curr.Pharm.Des.11(28):3597−611(2003)、およびDeshayes et al.,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839−49(2005)を参照のこと)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞内送達を可能にするために、Aileron Therapeutics(Cambridge,MA)およびPermeon Biologics(Cambridge,MA)によるペプチドおよび/またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび/またはタンパク質に複合体形成されてもよい(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Cronican et
al.,ACS Chem.Biol.2010 5:747−752、McNaughton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111−6116、Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3−6、Verdine and Hilinski,Methods
Enzymol.2012;503:3−33)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、エクスビボで細胞中にトランスフェクトすることができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾RNAをウイルス様粒子(VLP)中で送達するためのビロソーム、ならびにMAXCYTE(登録商標)(Gaithersburg,MD)による細胞、およびERYTECH(登録商標)(Lyon,France)による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾RNAを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。mmRNA以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Godfrin et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:127−133、Fang et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:385−389、Hu et
al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:10980−10985、Lund et al.,Pharm Res.2010 27:4
00−420、Huckriede et al.,J Liposome Res.2007;17:39−47、Cusi,Hum Vaccin.2006 2:1−7、de Jonge et al.,Gene Ther.2006 13:400−411)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる(参
照により全体が本明細書に組み込まれる、Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。それらの分散およびトランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに曝露される細胞の数を増加させることができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ/またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン(viron)粒子中にカプセル封入されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006376号を参照のこと)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基(twin bases)を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび/または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも1つのナノチューブに付着または結合され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、立体(steric)力、イオン力、共有結合力、および/または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
ールは、水性媒体中で、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAと混合される。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する)、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA等の複合体を含む。
536号、同第5,272,250号、同第5,292,873号、同第5,317,098号、同第5,371,241号、同第5,391,723号、同第5,416,203号、同第5,451,463号、同第5,510,475号、同第5,512,667号、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号および同第5,688,941号、同第6,294,664号、同第6,320,017号、同第6,576,752号、同第6,783,931号、同第6,900,297号、同第7,037,646号が含まれるが、これらに限定されない。
MAPキナーゼの活性化因子であり得る。
68,490号、同第6,670,461号、同第6,794,499号、同第6,998,484号、同第7,053,207号、同第7,084,125号、および同第7,399,845号が含まれるが、これらに限定されない。
−−として表される]、および上に参照される米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド(polynucletotides)は、上に参照される米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
H2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)を含む。同様の修飾は、他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位で、または2’−5’結合dsRNAにおいて、および5’末端ヌクレオチドの5’位で行われてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、および同第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されない。
核酸自己集合性ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、20nm超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、20〜100nmである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いDNA断片および治療的siRNAのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。DNA断片およびsiRNAは、1ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにDNA/siRNA四面体ナノ粒子を生成した。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Lee et al.,Nature Nanotechnology 2012 7:389−393)。
ポリマーを用いて、ナノ粒子へと自己集合したシートを形成してもよい。これらのナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達してもよい。一実施形態において、これらの自己集合性ナノ粒子は、マイクロスポンジへと自己集合する前に結晶質の「ひだ状」のシートを形成するRNAヘアピンの長いポリマーで形成される、マイクロスポンジであってもよい。これらのマイクロスポンジは、効率的な担体として機能し得、積荷を細胞に送達することが可能であり得る、密に充填されたスポンジ様の微粒子である。マイクロスポンジは、直径1μm〜300nmであり得る。マイクロスポンジは、当技術分野で既知の他の薬剤と複合体形成されて、より大きいマイクロスポンジを形成することができる。非限定的な例として、マイクロスポンジは、ポリカチオンポリエチレンイミン(polyethyleneime)(PEI)等の、細胞取り込みを促進するための外側層を形成する薬剤と複合体形成され得る。この複合体は、高温(150℃)で安定したままであり得る、250nm直径の粒子を形成することができる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Grabow and Jaegar,Nature Materials 2012,11:269−269)。さらにこれらのマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼによる分解からの並外れた保護度を示すことが可能であり得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、無機ナノ粒子中に製剤化されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,2
57,745号)。無機ナノ粒子は、水膨潤性である粘土物質を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から作製される合成スメクタイト粘土を含んでもよい(例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,585,108号および同第8,257,745号を参照のこと)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、半導性または金属性材料を含む水分散性ナノ粒子中に製剤化されるか(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120228565号)、または磁性ナノ粒子中に形成されてもよい(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120265001号および同第20120283503号)。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても親水性ナノ粒子であってもよい。
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のヒドロゲル中にカプセル封入されてもよい。ヒドロゲルは、親水性であり、ときには、水が分散媒体であるコロイド状ゲルとして見出される、ポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルは、高度に吸収性の(それらは、99%超の水を含有することができる)天然または合成ポリマーである。ヒドロゲルは、それらのかなりの含水量のため、天然組織と非常に類似した柔軟度も有する。本明細書に記載のヒドロゲルを用いて、生体適合性、生分解性、かつ/または多孔質である脂質ナノ粒子をカプセル封入してもよい。
を含んでもよい。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012151438号)。
of Controlled Release 2012.157:80−85を参照のこと)。フィブリンゲル、ヒドロゲル、および/または糊の構成成分の濃度は、フィブリンゲル、ヒドロゲル、および/または糊の放出特性を変更すること等であるが、これらに限定されない、ゲル、ヒドロゲル、および/または糊の特性、ネットワークメッシュサイズ、および/または分解特性を変更するように変化させることができる。(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Spicer and Mikos,Journal of Controlled Release 2010.148:49−55、Kidd et al.Journal of Controlled Release 2012.157:80−85、Catelas et al.Tissue Engineering 2008.14:119−128を参照のこと)。この特長は、本明細書に開示の修飾mRNAを送達するために使用されるときに有利であり得る。(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kidd et al.Journal of Controlled Release 2012.157:80−85、Catelas et al.Tissue Engineering
2008.14:119−128を参照のこと)。
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAの製剤は、カチオンまたはアニオンを含んでもよい。一実施形態において、製剤は、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない金属カチオンを含む。非限定的な例として、製剤は、ポリマー、ならびに金属カチオン
と錯化されたポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを含んでもよい(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,265,389号および同第6,555,525号を参照のこと)。
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、ナノ粒子および/または微粒子中に製剤化されてもよい。これらのナノ粒子および/または微粒子は、任意のサイズ形および化学組成へと成形され得る。例として、ナノ粒子および/または微粒子は、LIQUIDA TECHNOLOGIES(登録商標)(Morrisville,NC)によるPRINT(登録商標)技術を用いて作製することができる(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2007024323号を参照のこと)。
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、Keystone Nano(State College,PA)によるナノジャケットおよびナノリポソーム中に製剤化されてもよい。ナノジャケットは、体内で自然に見つけられ、カルシウム、リン酸塩を含み、また少量のケイ酸塩も含み得る、化合物で作製される。ナノジャケットは、サイズが5〜50nmの範囲であり得、これを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNA等であるが、これらに限定されない親水性および疎水性化合物を送達することができる。
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006は、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびこれらの調製のための既知の技法を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図される。
monostearate)、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール)、カルボマー(例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)20]、ポリオキシエチレンソルビタン[TWEENn(登録
商標)60]、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)80]、モノパルミチン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)40]、モノステアリン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)60]、トリステアリン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)65]、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)80])、ポリオキシエチレンエステル(例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン[MYRJ(登録商標)45]、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化(polyethoxylated)ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびSOLUTOL(登録商標))、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、PLUORINC(登録商標)F 68、POLOXAMER(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および/またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および/またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、GLYDANT PLUS(登録商標)、PHENONIP(登録商標)、メチルパラベン、GERMALL(登録商標)115、GERMABEN(登録商標)II、NEOLONE(商標)、KATHON(商標)、および/またはEUXYL(登録商標)が含まれるが、これらに限定されない。
甘味剤、香味剤、ならびに/または芳香剤等の賦形剤が、組成物中に存在し得る。
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を用いずにポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ/または修飾されていない場合があるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳の中へ)、脳室内(脳室の中へ)、皮膚上(皮膚上への適用)、皮内、(皮膚自体の中へ)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈の中へ)、動脈内(動脈の中へ)、筋肉内(筋肉の中へ)、心臓内(心臓の中へ)、骨内輸注(骨髄の中へ)、髄腔内(脊柱管の中へ)、腹腔内(腹腔の中への輸注または注入)、膀胱内輸注、硝子体内(眼を介して)、空洞内注入(陰茎基部の中へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚(intact
skin)を介した拡散)、経粘膜(粘膜を介した拡散)、ガス注入(鼻からの吸引)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのための非限定的な投与経路が以下に記載される。
非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマル
ション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができるる。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定
されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒等、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
の多様なドレッシング(例えば、創傷ドレッシング)または包帯(例えば、粘着包帯)を提供する。典型的に、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象(複数可)の複数の治療を行うことを可能にするために、本明細書に記載の十分な量の薬学的組成物および/またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAを含むことができる。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織(「標的組織」)が、投与のための標的とされる。
%)において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物が提供される。
薬学的組成物は、?腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、
かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5nm〜約7nmまたは約1nm〜約6nmの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ/または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および/もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒/粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも98重量%が0.5nm超の直径を有し、粒子の少なくとも95%(数量)が7nm未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも95重量%は、1nm超の直径を有し、粒子の少なくとも90%(数量)は、6nm未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
はmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,257,685号に記載の方法によって肺送達のために製剤化されてもよい。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
薬学的組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、0.1/1.0w/w%の活性成分の溶液および/または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および/または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう1つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび/またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および/または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。眼および/または包囲組織への送達のために、多層薄膜デバイスが、薬学的組成物を含有するように調製されてもよい。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、物質(「ペイロード」)の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法(BLI)、磁気共鳴画像法(MRI)、ポジトロン放出断層撮影法
(PET)、電子顕微鏡法、X線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング/染色/画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
スキーム12
細胞内で追跡することができる。他の例としては、細胞内への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
、コバルト、イットリウム90、サマリウム153、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルダカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン(CC−1065)、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(かつてはダウノマイシン)およびdオキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(かつてはアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド)が含まれるが、これらに限定されない。
l))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミン(1:1)(IR144)との化合物;5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イリデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(CIBACRON(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD 700;IRD 800;Alexa 647;La Jolta Blue;フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが含まれる。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ/または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、1つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび/または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および/もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ/またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、核酸またはmmRNAは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,964,571号において、リポポリマーとともにインターロイキン−12をコードするDNAプラスミドを含む薬学的組成物を使用し、また少なくとも1つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の核酸およびmmRNAは、リポポリマーとともに薬学的組成物中にあってもよい(例えば、抗増殖性分子をコードするDNAプラスミドおよびリポポリマーを含む薬学的組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20110218231号を参照のこと)、それ
は少なくとも1つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
本発明は、本発明に従う修飾mRNAおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および/または状態(例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および/または状態)の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総1日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度;用いられる特定の化合物の活性;用いられる特定の組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活;投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度;治療の持続期間;用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物;医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
実施形態において、本発明のmmRNAは、分割用量で対象に投与される。mmRNAは、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化されてもよい。
本明細書に記載の薬学的組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および/または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および/またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ/または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注入用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌され得る。長活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。その後、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの遅延吸収は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって遂行され得る。注入用デポー形態は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAとポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が挙げられるが、これらに限定されない。デポー注入用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製されても
よい。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分(複数可)のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
本明細書に記載の薬学的組成物は、生物学的利用能、治療域、および/または分布量のうちの1つ以上によって特徴付けられ得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、生物学的利用能の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、変化していない形態の化合物の曲線下面積(AUC)または最大血清または血漿濃度(Cmax)を測定することによって評価され得る。AUCは、縦座標(Y軸)に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標(X軸)に沿った時間に対してプロットした曲線下面積の決定である。
一般に、特定の化合物のAUCは、当業者に既知の方法、および参照により全体が本明細書に組み込まれるG.S.Banker,Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,v.72,Marcel Dekker,New York,Inc.,1996に記載の方法を用いて算出され得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域と比較して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療上活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの治療域は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%増加し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、分布量(Vdist)の改善、例えば、低減または標的化を呈し得る。分布量(Vdist)は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書で使用されるとき、「分布量」という用語は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度で体内の薬物の総量を含有するよう要求される液量を指し、Vdistは、体内の薬物の量/血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量10mgおよび血漿濃度10mg/Lの場合、分布量は、1リットルである。分布量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布量は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Vdistを用いて負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの分布量は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、
少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%減少し得る。
一実施形態において、動物に送達される修飾mRNAの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類され得る。タンパク質発現は、本発明の修飾mRNAを投与した哺乳動物から収集された生体試料を分析することによって決定され得る。一実施形態において、哺乳動物に投与される修飾mRNAによってコードされた少なくとも50pg/mLの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達される修飾mRNAによってコードされるタンパク質の50〜200pg/mLの発現タンパク質が、哺乳動物における治療上有効量のタンパク質と見なされ得る。
質量分析(MS)は、分子のイオン変換後の分子の構造質量および分子量/濃度情報を提供することができる分析的技法である。分子は、最初に、イオン化されて正電荷または負電荷を得て、次いで、それらは、質量分析器を通って移動して、それらの質量/電荷(m/z)比に従って検出器の異なる領域に到達する。
8:2339−2349、Kuhn et al.,Clin Chem 2009 55:1108−1117、Lopez et al.,Clin Chem 2010
56:281−290)。バイオマーカー発見の研究で頻繁に用いられる標的化されていない質量分析とは異なり、標的化されたMS方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十〜何百もの選択されたペプチドに集中させるMSのペプチド配列に基づくモードである。検出および断片化を目的とするタンパク質に由来するペプチドのみに制限することによって、感受性および再現性は、発見モードのMS方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析に基づく多重反応監視(MRM)定量化方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカーの発見および定量化に劇的に影響を与えることができる。
TOFリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器が含まれ得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、好ましい実施形態において、免疫応答および/もしくは分解経路等の有害な生体応答の回避(avoidance)もしくは回避(evasion)、発現の閾値の克服および/もしくはタンパク質産生能力の改善、改善された発現率もしくは翻訳効率、改善された薬物もしくはタンパク質半減期および/もしくはタンパク質濃度、最適化されたタンパク質局在化を提供して、組織内の安定性および/もしくはクリアランス、受容体による取り込みおよび/もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、分泌効率(該当する場合)、血液循環への到達可能性、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの1つ以上を改善するように設計される。
治療剤
本明細書に記載される、修飾核酸および修飾RNA等の本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、インビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、治療、または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAを含有する細胞、またはポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAから翻訳されるポリペプチドを含む。
、組み合わせ治療薬が本明細書に提供される。例えば、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードする1つ以上の核酸を含有する治療薬が本明細書に提供される。具体的には、そのような組み合わせ治療薬は、トラスツズマブへの誘導耐性を発達するHer2+乳癌患者において有用である。(例えば、Albrecht,Immunotherapy.2(6):795−8(2010)を参照のこと)。
胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、内因性タンパク質の突然変異が変化した活性または局在化をもたらすことに起因して、対象に有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される生体部分の活性に、直接的または間接的に拮抗する。拮抗対象の生体部分の例としては、脂質(例えば、コレステロール)、リポタンパク質(例えば、低比重リポタンパク質)、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素等のタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素等の小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗対象の生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性等の望ましくない活性を示す内因性タンパク質である場合がある。
嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子のナンセンス突然変異変異形が挙げられる。
s.Nature2010;466:714−721)。
もよい。本発明の化学修飾されたmRNA内でコードされ得るポリペプチドの非限定的な例としては、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,226,999号、同第7,498,305号、同第6,630,138号に教示されるものが挙げられる。これらの特許は、プロテインC様分子、変異形、および誘導体を教示し、これらのうちのいずれも、本発明の化学修飾された分子内でコードされ得る。
進行性家族性肝内胆汁うっ滞症(PFIC)
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物ま
たはmmRNAを用いて進行性家族性肝内胆汁うっ滞症(PFIC)を治療し得る。本明細書に使用される「進行性家族性肝内胆汁うっ滞症」または「PFIC」という用語は、肝不全を来たし得る肝障害を指す。PFICは常染色体劣性の胆汁生成欠陥および肝細胞性胆汁うっ滞を特徴とする。本明細書に使用される「肝細胞性」は肝臓細胞(肝細胞とも呼ばれる)に影響を及ぼすかこれに関連する事柄を記載するために使用される用語である。本明細書に使用される「胆汁うっ滞(症)」という用語は、肝臓からの胆汁の流れが遅くなったり妨げられたりすることを特徴とする病態を指す。本明細書に使用される「胆汁」という用語は、肝臓によって生成され、水、胆汁酸塩、粘液、脂肪、無機塩およびコレステロールを含み、食餌脂肪の乳化および消化を助ける液状物質を指す。
輸送体の機能に影響を及ぼす変異によって引き起こされる。ABC、サブファミリーB、メンバー11(ABCB11)輸送体は、タウロコール酸をはじめとするコール酸結合化合物を肝細胞から胆汁中に輸送することによって胆汁生成を補助する。ABCB11機能に欠陥があるとPFIC−2を来たす。ABC、サブファミリーB、メンバー4(ABCB4)はリン脂質、好ましくはホスファチジルコリンを胆汁中に取り込ませるために肝細胞膜を横切って輸送する。ABCB4の機能不全もたらす遺伝子変異がPFIC−3の原因となる(Davit−Spraulら,Progressive familial intrahepatic cholestasis.Orphanet J Rare
Dis.2009 Jan 8;4:1;Degiorgio,D.ら,Molecular characterization and structural implications of 25 new ABCB4 mutations in Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3(PFIC3).Eur J Hum Genet.2007 Dec;15(12):1230−8;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物ま
たはmmRNAを用いて家族性高コレステロール血症(FH)を治療し得る。本明細書に使用される「家族性高コレステロール血症」または「FH」という用語は、血漿中の低密度リポタンパク質(LDL)関連コレステロールの濃度上昇を特徴とする遺伝性障害を指す。FHの患者または対象では、若年で心血管疾患のリスクが増大し得る。いくつかの実施形態では、このような個体の血中LDL濃度の上昇は、LDL受容体をコードする遺伝子の変異に起因し得る。決して限定されるわけではないが、LDL受容体が循環血中のLDLと結合し、その受容体を発現する細胞内へのLDLのエンドサイトーシスを促進すると考えられている。この受容体が機能不全に陥ると、循環血中LDL濃度が上昇したままになり、アテローム性動脈硬化症の発現が促進される。FHの個体は、FH関連遺伝子変異がヘテロ接合型でもホモ接合型でもあり得る。ホモ接合型の個体の症状の方が重症となり得る。黄色腫(脂肪を多量に含む皮膚の成長)を明らかにする理学検査を含めた当該技術分野で公知の方法によって、小児期または青年期に診断することが可能である。家族歴および遺伝子の分析により比較的早い段階でFHを診断することができる(Sjouke,B.ら,Familial hypercholesterolemia:present and future management.Curr Cardiol Rep.2011 Dec;13(6):527−36;Avis,H.J.ら,A systematic review and meta−analysis of statin therapy in children with familial hypercholesterolemia.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2007 Aug;27(8):1803−10;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)を治療し得る。本明細書に使用される「オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症」または「OTCDという用語は、酵素オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードする遺伝子の変異に起因する尿素合成の遺伝性障害を指す。このような変異は高アンモニア血症、神経学的問題および死亡率の上昇をもたらし得る。OTCは尿素回路の重要な要素であり、カルバモイルリン酸およびオルニチンからのシトルリン生成を触媒する。この過程は、体から過剰なアンモニアを除去するのに極めて重要である。OTCの遺伝子はX染色体上にあるため、OTCDはX連鎖性障害である。ほとんどのX連鎖性障害と同じように、OTCDは主として雄が罹患し、雌は保因者となる。OTCDの重症度は遺伝子の変異の性質に左右される。非機能的OTCをもたらす遺伝子変異があると、その個体は通常、生後1か月以内に死亡する。このような変異は、OTCDに罹患している疑いのある個体の遺伝子解析によって発見することができる。様々な程度の酵素機能をもたらす遺伝子変異のある個体では、比較的生存期間が長く、疾患の作用を軽減する治療が奏効する場合がある。症状を観察し、尿中に高濃度のアンモニアおよびオロト酸を検出した後にOTCDの診断を下すことができる(Brunetti−Pierri,N.ら,Phenotypic correction of ornithine transcarbamylase deficiency using low dose helper−dependent adenoviral vectors.J Gene Med.2008
Aug;10(8):890−6;Wilmslow,U.K.,Ornithine
transcarbamylase deficiency:a urea cycle defect.Eur J Paediatr Neurol.2003;7(3):115−21;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてクリグラー・ナジャー症候群を治療し得る。本明細書に使用される「クリグラー・ナジャー症候群」という用語は、酵素ビリルビン−ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼの1A1アイソフォーム(UGT1A1)の機能に影響を及ぼす先天異常を指す。UGT1A1は有毒なヘム分解副生成物、疎水性ビリルビンの解毒作用に極めて重要である。UGT1A1は、疎水性ビリルビンとグルコロン酸(glucoronic acid)とを結合させ胆汁中に排泄することによって機能すると考えられている。クリグラー・ナジャー症候群に罹患している個体には、非抱合型高ビリルビン血症(または循環血中の過剰な疎水性ビリルビン)が発現して神経学的障害を来たし、患者の加齢とともに効果が低下する定期的な光線療法が必要となる場合がある。クリグラー・ナジャー症候群の診断は通常、幼児の黄疸の観察から始まり、次いで当該技術分野
で公知の酵素および肝臓のアッセイによって酵素機能が評価され得る(Lysy,P.A.ら,Liver cell transplantation for Crigler−Najjar syndrome type I:update and perspectives.World J Gastroenterol.2008 Jun 14;14(22):3464−70;Sugatani,J.,Function,genetic polymorphism,and transcriptional regulation of human UDP−glucuronosyltransferase(UGT)1A1.Drug Metab Pharmacokinet.2012 Oct 23.[印刷前電子出版];それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて無セルロプラスミン血症を治療し得る。本明細書に使用される「無セルロプラスミン血症」という用語は、セルロプラスミン(CP)遺伝子の遺伝子変異によりCPに欠陥があり、かつ/またはCPが機能不全に陥っている疾患を指す。CPは鉄を細胞から毛細血管内に輸送することに関与する輸送タンパク質であると考えられている。鉄は毛細血管内に入るとフェリチン結合することができ、血流に入る。機能するCPがないと、細胞内に鉄が蓄積し、血清中フェリチン濃度が上昇する(Ogimoto,M.ら,Criteria for early identification of aceruloplasminemia.Intern Med.2011;50(13):1415−8;Miyajima,H.,Aceruloplasminemia.GeneReviews[インターネット].Seattle(WA):University of Washington,Seattle;2003 Aug 12[2011年2月17日更新];それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
限定されないがCPなどのペプチド、タンパク質またはそのフラグメントをコードするものであり得る。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてα−マンノース症を治療し得る。本明細書に使用される「α−マンノース症」という用語は、欠陥のあるおよび/または機能不全に陥ったα−D−マンノシダーゼ酵素活性を原因とし、リソソーム蓄積症を引き起こす障害を指す。MAN2B1遺伝子(α−D−マンノシダーゼをコードする)の遺伝的欠陥により生じるα−マンノース症は常染色体劣性障害である。α−マンノース症に罹患している者の特徴としては、特に限定されないが、免疫不全、顔面および骨格の異常、聴覚障害および知的障害が挙げられる。診断は、特に限定されないが表現型の特徴ならびに肝および脾機能不全の解析を含めた当該技術分野で公知の方法を用いて、幼児期という早期に下すことができる。比較的軽症の疾患であれば小児期および青年期の間にも診断されない場合がある。疾患の診断は通常、全血液細胞のα−D−マンノシダーゼ酵素活性の測定によって確定される(Malm,D.ら,Alpha−mannosidosis.Orphanet J Rare
Dis.2008 Jul 23;3:21;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてチロシン血症を治療し得る。本明細書に使用される「チロシン血症」という用語は、血中チロシンおよび/またはチロシン副生成物の濃度の上昇を特徴とする障害および/または病態を指す。いくつかの実施形態では、チロシン血症は、チロシン分解に必要な酵素の欠陥および/または機能不全をもたらす遺伝子変異を原因とする。症状としては、特に限定されないが、成長障害、下痢、嘔吐、黄疸、鼻出血傾向の増大、小頭症、振戦、運動失調、自傷行為、微細協調運動障害、言語障害、痙攣および/またはキャベツ様臭が挙げられる(Nakamura,K.ら,Animal models
of tyrosinemia.J Nutr.2007 Jun;137(6 Suppl 1):1556S−1560S;discussion 1573S−1575S;Bergeron,A.ら,Hereditary tyrosinemia:an endoplasmic reticulum stress disorder? Med Sci(Paris).2003 Oct;19(10):976−80;Mehere,P.ら,Tyrosine aminotransferase:biochemical and structural properties and molecular dynamics simulations.Protein Cell.2010 Nov;1(11):1023−32;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてヘモクロマトーシスを治療し得る。本明細書に使用される「ヘモクロマトーシス」という用語は、遺伝的欠陥に起因し得る鉄過剰症を特徴とする障害または病態を指す。ヘモクロマトーシスの症状としては、特に限定されないが、肝硬変、色素沈着過剰、下垂体機能低下、糖尿病および/または関節炎が挙げられる。ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的欠陥を用いて疾患の型を特徴付ける。ヘモクロマトーシス1型はHFE遺伝子の遺伝子変異を原因とするものである。2A型および2B型は、それぞれH
FE2遺伝子およびHAMP遺伝子の変異によるものである。ヘモクロマトーシス1型の症状が通常、成人期までみられるのに対して、ヘモクロマトーシス2A型および2B型の症状は通常、小児期にみられる(Papanikolaou,G.ら,Hepcidin
in iron overload disorders.Blood.2005 May 15;105(10):4103−5;Nandar,W.ら,HFE gene
variants affect iron in the brain.J Nutr.2011 Apr 1;141(4):729S−739S;Wallace,D.F.ら,Non−HFE haemochromatosis.World J Gastroenterol.2007 Sep 21;13(35):4690−8;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてIV型糖原病を治療し得る。本明細書に使用される「糖原病」または「GSD」という用語は、グリコーゲンの合成および/または分解の欠陥を特徴とする生物の障害を指す。いくつかの実施形態では、GSDとして、特に限定されないが、アンダーソン病としても知られる4型GSD、分枝酵素欠損症、アミロペクチン症およびグリコーゲン分枝酵素欠損症が挙げられる。IV型GSDはGBE1遺伝子によってコードされるグリコーゲン分枝酵素(GBE)の欠損に起因し、細胞傷害性になり得る異常なグ
リコーゲンの生成を引き起こす。組織特異的アイソフォームの発現による変動が存在するものの、古典的な肝IV型GSDの患者は出生時に健常に見えるが、生後間もなく肝硬変が生じ、通常、生後5か月までに肝不全を来たす(Ozen,H.,Glycogen storage diseases:new perspectives.World J Gastroenterol.2007 May 14;13(18):2541−53;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では,本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてファンコニシスチン症を治療し得る。本明細書に使用される「シスチン症」という用語は、リソソーム内へのシスチンの異常な蓄積を特徴とする疾患を指す。代謝産物の血流中への再吸収を阻害し、代わりに尿中へ通過させる腎疾患がファンコニ症候群の最もよくみられる原因である。シスチンは2つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して生成される。リソソームは加水分解によってタンパク質が消化される部位であり、リソソーム内へのシスチン蓄積はシスチンを放出する輸送体仲介による輸送に依存している。CTNS遺伝子によってコードされるシスチノシンは、リソソーム内でシスチンと結合する7回膜貫通タンパク質であり、他のタンパク質と協働してリソソームからのシスチン除去を促進する。シスチノシン機能に重度の欠陥のある個体は生後6か月から12か月の間に罹患し、水分および電解質の喪失をはじめとする腎および代謝合併症を来たす。通常、10歳までに腎不全がみられる。現在用いられている治療法は、シスチン分子を切断してリソソームから除去することができる薬物、システアミンを用いるものである(Kalatzis,V.ら,Cystinosis:from gene to disease.Nephrol Dial Transplant.2002 Nov;17(11):1883−6;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
mRNAを少なくとも1つ含む本発明の組成物を投与することによってファンコニシスチン症を治療し得る。
一実施形態では、本発明の稀な肝疾患または肝障害のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いてファーバー脂肪肉芽腫症を治療し得る。本明細書に使用される「ファーバー脂肪肉芽腫症(Farber lipogranulomatosis、Farber’s lipogranulomatosis)」または「ファーバー病」は、1957年にSidney Farberによって同定されたリソソーム蓄積症を指す。この疾患は、N−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素(酸性セラミダーゼ)1(ASAH1)遺伝子によってコードされる酵素、酸性セラミンダーゼ(ceramindase)の欠陥を原因とする。この酵素が欠損すると、細胞内のセラミドが正常にスフィンゴシンと脂肪酸に分解されず、セラミドの異常な蓄積が起こり、疾患症状を来たす。症状は通常、幼児期の早期にみられるが、それ以降ににみられる場合もある。この疾患の典型的な型では、生後数週間以内に症状が発現し、関節の奇形、皮下小結節の存在および嗄声がみられる。患者にはこのほか、神経学的障害が認められる場合があり、通常、幼児期に死亡する。軽度の神経学的障害がある患者は40代まで生存する場合がある。現時点でファーバー脂肪肉芽腫症に用いることができる治療法はない(Ekici,B.ら,Farber disease:A clinical diagnosis.J Pediatr Neurosci.2012 May;7(2):154−5;Farber,S.ら,Lipogranulomatosis;a new lipo−glycoprotein storage disease.J Mt Sinai Hosp N Y.1957 Nov−Dec;24(6):816−37;それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、創傷治療、例えば、治癒の遅延を呈する創傷の治療に使用されてもよい。創傷の治療を管理するためにポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの投与を含む方法が本明細書に提供される。本明細書における方法は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの投与の前、それと同時、またはその後のいずれかに行われるステップをさらに含んでもよい。例えば、創傷床は、創傷治癒を容易にし、望ましくは創傷の閉鎖を得るために、清浄にされ、準備される必要があり得る。創傷治癒を促進し、創傷閉鎖を達成するために、次のものを含むが、これらに限定されない、いくつかの戦略が使用され得る:(i)壊死組織除去(任意に反復される)、鋭利な壊死組織除去(死滅または感染組織の創傷からの外科的除去)
、任意に、壊死組織を除去するための酵素等の化学的壊死組織除去剤、(ii)創傷に湿潤した温暖な環境を提供し、組織修復および治癒を促進するための創傷ドレッシング。
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、抗体およびそのような抗体の断片をコードし得る。これらは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか1つによって産生されてもよい。抗体は、IgA、IgG、もしくはIgM等であるが、これらに限定されない、免疫グロブリンの異なるサブクラスまたはアイソタイプのうちのいずれか、または他のサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明に従って調製され得る例示の抗体分子および断片には、免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有し得る免疫グロブリン分子の部分が含まれるが、これらに限定されない。パラトープを含有し得る抗体のそのような部分には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(v)および当技術分野で既知の部分が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを投与することによって、対象において、微生物感染(例えば、細菌感染)および/または微生物またはウイルス感染に関連した疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を治療するまたは予防するための方法が提供される。該投与は、抗菌性薬剤(例えば、抗細菌剤)、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドまたは小分子抗菌性化合物と組み合わせられてもよい。抗菌性薬剤には、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫薬剤、抗寄生虫剤、および抗プリオン剤が含まれるが、これらに限定されない。
細菌感染に関連し得る疾患、障害、または状態には、膿瘍、放線菌症、急性前立腺炎、エロモナス・ハイドロフィラ、一年生草ライグラス中毒、炭疽病、桿菌性紫斑症、菌血症、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、細菌関連皮膚状態、バルトネラ症、BCG腫、ボトリオミセス症、ボツリヌス症、ブラジル紫斑熱、ブローディー膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂窩織炎、クラミジア感染、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、歯周−歯内病変(combined periodontic−endodontic lesions)、牛肺疫、ジフテリア、ジフテリア性口内炎、エーリキア症、丹毒、喉頭蓋炎(piglottitis)、丹毒、フィッツ・ヒュー・カーチス症候群、ノミ媒介性斑点熱、腐蹄症(感染性足皮膚炎)、Garre硬化性骨髄炎、淋病、鼠径肉芽腫、ヒト顆粒球性アナプラズマ症、ヒト単球向性エーリキ
ア症、百日咳(hundred days’cough)、膿痂疹、晩期先天性梅毒性眼病、レジオネラ症、レミエール症候群、ライ病(ハンセン病)、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染、マイコバクテリウム複合体(MAI)、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、水癌(noma)(水癌(cancrum
oris)または壊疽性口内炎)、臍炎、眼窩蜂巣炎、骨髄炎、脾臓摘出後重症感染(OPSI)、ヒツジブルセラ症、パスツレラ病、眼窩周囲蜂巣炎、百日咳(pertussis)(百日咳(whooping cough))、ペスト、肺炎球菌肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Q熱、再帰熱(回帰熱)、リウマチ熱、ロッキー山斑点熱(RMSF)、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染、細菌性赤痢、南部ダニ紅斑病(southern tick−associated rash illness)、ブドウ球菌性皮膚剥脱症候群、連鎖球菌咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒素性ショック症候群(TSS)、トラコーマ、塹壕熱、熱帯性潰瘍、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路性器結核、尿路感染、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染、ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群、偽性結核(エルシニア)症、およびエルシニア症のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。細菌感染に関連した他の疾患、障害、および/または状態は、例えば、アルツハイマー病、神経性食欲不振症、喘息、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自己免疫疾患、双極性障害、癌(例えば、結腸直腸癌、胆嚢癌、肺癌、膵臓癌、および胃癌)、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、冠動脈心疾患、認知症、うつ病、ギラン・バレー症候群、内臓脂肪症候群、多発性硬化症、心筋梗塞、肥満、強迫障害、パニック障害、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、脳卒中、閉塞性血栓血管炎(バージャー病)、およびトゥレット症候群を含むことができる。
本明細書に記載の細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。細菌性病原体には、アシネトバクター・バウマンニ、バチルス・アントラシス、バチルス・スブチリス、ボルデテラ・パータシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジアトラコーマtis、クラミドフィラ・シタッシ、クロストリジウムボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウムテタニ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、コリネバクテリウムジフテリア、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸内毒素原性大腸菌(ETEC)、腸管病原性大腸菌、大腸菌O157:H7、エンテロバクター種、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インテロガンス、リステリア・モノサイトゲネス、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarralis)、マイコバクテリウム・レプレ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレー、ナイセリア・メニンギティディス、プレテウス・ミラビリス(Preteus mirabilis)、プロテウス属、シュードモナス・エルジノーサ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセセンス(Serratia marcesens)、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ソネイ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、トレポネーマー・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌性病原体は、耐性菌感染を引き起こす細菌、例えば、クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシル、フルオロキノロン耐性
クロストリジウム・ディフィシル、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)、多剤耐性エンテロコッカス・フェカリス、多剤耐性エンテロコッカス・フェシウム、多剤耐性シュードモナス・エルジノーサ、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、およびバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(VRSA)も含み得る。
一実施形態において、本発明の修飾mRNAは、1つ以上の抗生物質と組み合わせて投与され得る。これらには、アクニロックス、アムビゾーム、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン、アベロックス、アジスロマイシン、バクトロバン、ベタジン、ベトノベート、ブレファミド(Blephamide)、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフェピム、セフィックス(Cefix)、セフィキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフロキシム、セフジル(Cefzil)、セファレキシン、セファゾリン(Cephazolin)、セプタズ(Ceptaz)、クロラムフェニコール、クロルヘキシジン、クロロマイセチン、クローシグ(Chlorsig)、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダゲル(Clindagel)、クリンダマイシン、クリンダテック(Clindatech)、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ジクロシル(Diclocil)、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、デュリセフ(Duricef)、エリスロマイシン、フラマジン(Flamazine)、フロキシン(Floxin)、フラミセチン、フシジン(Fucidin)、フラダンチン、フシジック(Fusidic)、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲミフロキサシン、イロソン、ヨード、ラバキン(Levaquin)、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マクサクイン(Maxaquin)、メフォキシン、メロネム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ミヤンブトール(Myambutol)、マイコスタチン、ネオスポリン、ネトロマイシン(Netromycin)、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、ノリレット(Norilet)、フロキサシン、オムニカフ(Omnicef)、オスパモックス(Ospamox)、オキシテトラサイクリン、パラキシン(Paraxin)、ペニシリン、ニューモバックス、ポリファックス(Polyfax)、ポビドン、リファジン、リファンピン、リファキシミン、リファナフ(Rifinah)、リマクタン、ロセフィン、ロキシスロマイシン、セロマイシン、ソフラマイシン(Soframycin)、スパルフロキサシン、スタフレックス(Staphlex)、タゴシッド、テトラサイクリン、テトラドックス(Tetradox)、テトラリサル(Tetralysal)、トブラマイシン(tobramycin)、トブラマイシン(Tobramycin)、トレケーター(Trecator)、タイガシル、バンコシン、ベロセフ(Velosef)、ビブラマイシン、キファサン(Xifaxan)、ザガム(Zagam)、ジトロテク(Zitrotek)、ゾデルム(Zoderm)、ジマー(Zymar)、およびザイボックスが挙げられるが、これらに限定されない。
例示の抗細菌剤には、アミノグリコシド(例えば、アミカシン(AMIKIN(登録商標))、ゲンタマイシン(GARAMYCIN(登録商標))、カナマイシン(KANTREX(登録商標))、ネオマイシン(MYCIFRADIN(登録商標))、ネチルマイシン(NETROMYCIN(登録商標))、トブラマイシン(NEBCIN(登録商標))、パロモマイシン(HUMATIN(登録商標))、アンサマイシン(例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン)、カルバセフェム(例えば、ロラカルベフ(LORABID(登録商標))、カルバペネム(例えば、エルタペネム(INVANZ(登録商標))、ドリペネム(DORIBAX(登録商標))、イミペネム/シラスタチン(PRIMAXIN(登録商標))、メロペネム(MERREM(登録商標))、セファロスポリン類(第1世代)(例えば、セファドロキシル(DURICEF(登録商標))、セファゾリン(ANCEF(登録商標))、セファロチンまたはセファロチン(cefalot
hin)(KEFLIN(登録商標))、セファレキシン(KEFLEX(登録商標))、セファロスポリン類(第2世代)(例えば、セファクロル(CECLOR(登録商標))、セファマンドール(MANDOL(登録商標))、セフォキシチン(MEFOXIN(登録商標))、セフプロジル(CEFZIL(登録商標))、セフロキシム(CEFTIN(登録商標)、ZINNAT(登録商標))、セファロスポリン類(第3世代)(例えば、セフィキシム(SUPRAX(登録商標))、セフジニル(OMNICEF(登録商標)、CEFDIEL(登録商標))、セフジトレン(SPECTRACEF(登録商標))、セフォペラゾン(CEFOBID(登録商標))、セフォタキシム(CLAFORAN(登録商標))、セフポドキシム(VANTIN(登録商標))、セフタジジム(FORTAZ(登録商標))、セフチブテン(CEDAX(登録商標))、セフチゾキシム(CEFIZOX(登録商標))、セフトリアクソン(ROCEPHIN(登録商標))、セファロスポリン類(第4世代)(例えば、セフェピム(MAXIPIME(登録商標))、セファロスポリン類(第5世代)(例えば、セフトビプロール(ZEFTERA(登録商標))、グリコペプチド(例えば、テイコプラニン(TARGOCID(登録商標))、バンコマイシン(VANCOCIN(登録商標))、テラバンシン(VIBATIV(登録商標))、リンコサミド系(例えば、クリンダマイシン(CLEOCIN(登録商標))、リンコマイシン(LINCOCIN(登録商標))、リポペプチド(例えば、ダプトマイシン(CUBICIN(登録商標))、マクロライド系(例えば、アジスロマイシン(ZITHROMAX(登録商標)、SUMAMED(登録商標)、ZITROCIN(登録商標))、クラリスロマイシン(BIAXIN(登録商標))、ジリスロマイシン(DYNABAC(登録商標))、エリトロマイシン(ERYTHOCIN(登録商標)、ERYTHROPED(登録商標))、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン(TAO(登録商標))、テリスロマイシン(KETEK(登録商標))、スペクチノマイシン(TROBICIN(登録商標))、モノバクタム系(例えば、アズトレオナム(AZACTAM(登録商標))、ニトロフラン(例えば、フラゾリドン(FUROXONE(登録商標))、ニトロフラントイン(MACRODANTIN(登録商標)、MACROBID(登録商標))、ペニシリン系(例えば、アモキシシリン(NOVAMOX(登録商標)、AMOXIL(登録商標))、アンピシリン(PRINCIPEN(登録商標))、アズロシリン、カルベニシリン(GEOCILLIN(登録商標))、クロキサシリン(TEGOPEN(登録商標))、ジクロキサシリン(DYNAPEN(登録商標))、フルクロキサシリン(FLOXAPEN(登録商標))、メズロシリン(MEZLIN(登録商標))、メチシリン(STAPHCILLIN(登録商標))、ナフシリン(UNIPEN(登録商標))、オキサシリン(PROSTAPHLIN(登録商標))、ペニシリンG(PENTIDS(登録商標))、ペニシリンV(PEN−VEE−K(登録商標))、ピペラシリン(PIPRACIL(登録商標))、テモシリン(NEGABAN(登録商標))、チカルシリン(TICAR(登録商標))、ペニシリンの組合せ(例えば、アモキシシリン/クラブラン酸(AUGMENTIN(登録商標))、アンピシリン/スルバクタム(UNASYN(登録商標))、ピペラシリン/タゾバクタム(ZOSYN(登録商標))、チカルシリン/クラブラネート(TIMENTIN(登録商標))、ポリペプチド(例えば、バシトラシン、コリスチン(COLY−MYCIN−S(登録商標))、ポリミキシンB、キノロン系(例えば、シプロフロキサシン(CIPRO(登録商標)、CIPROXIN(登録商標)、CIPROBAY(登録商標))、エノキサシン(PENETREX(登録商標))、ガチフロキサシン(TEQUIN(登録商標))、レボフロキサシン(LEVAQUIN(登録商標))、ロメフロキサシン(MAXAQUIN(登録商標))、モキシフロキサシン(AVELOX(登録商標))、ナリジクス酸(NEGGRAM(登録商標))、ノルフロキサシン(NOROXIN(登録商標))、オフロキサシン(FLOXIN(登録商標)、OCUFLOX(登録商標))、トロバフロキサシン(TROVAN(登録商標))、グレパフロキサシン(RAXAR(登録商標))、スパルフロキサシン(ZAGAM(登録商標))、テマフロキサシン(OMNIFLOX(登録商標))、スルホンアミド類(例えば、マフェニド(SULF
AMYLON(登録商標))、スルホンアミドクリソイジン(PRONTOSIL(登録商標))、スルファセタミド(SULAMYD(登録商標)、BLEPH−10(登録商標))、スルファジアジン(MICRO−SULFON(登録商標))、スルファジアジン銀(SILVADENE(登録商標))、スルファメチゾール(THIOSULFIL
FORTE(登録商標))、スルファメトキサゾール(GANTANOL(登録商標))、スルファニルイミド(sulfanilimide)、スルファサラジン(AZULFIDINE(登録商標))、スルファフラゾール(GANTRISIN(登録商標))、トリメトプリム(PROLOPRIM(登録商標))、TRIMPEX(登録商標))、トリメトプリム−スルファメトキサゾール(コトリモキサゾール)(TMP−SMX)(BACTRIM(登録商標)、SEPTRA(登録商標))、テトラサイクリン系(例えば、デメクロサイクリン(DECLOMYCIN(登録商標))、ドキシサイクリン(VIBRAMYCIN(登録商標))、ミノサイクリン(MINOCIN(登録商標))、オキシテトラサイクリン(TERRAMYCIN(登録商標))、テトラサイクリン(SUMYCIN(登録商標)、ACHROMYCIN(登録商標)V、STECLIN(登録商標))、マイコバクテリアに対する薬物(例えば、クロファジミン(LAMPRENE(登録商標))、ダプソン(AVLOSULFON(登録商標))、カプレオマイシン(CAPASTAT(登録商標))、サイクロセリン(SEROMYCIN(登録商標))、エタンブトール(MYAMBUTOL(登録商標))、エチオナミド(TRECATOR(登録商標))、イソニアジド(I.N.H.(登録商標))、ピラジナミド(ALDINAMIDE(登録商標))、リファンピン(RIFADIN(登録商標)、RIMACTANE(登録商標))、リファブチン(MYCOBUTIN(登録商標))、リファペンチン(PRIFTIN(登録商標))、ストレプトマイシン)、ならびにその他(例えば、アルスフェナミン(SALVARSAN(登録商標))、クロラムフェニコール(CHLOROMYCETIN(登録商標))、ホスホマイシン(MONUROL(登録商標))、フシジン酸(FUCIDIN(登録商標))、リネゾリド(ZYVOX(登録商標))、メトロニダゾール(FLAGYL(登録商標))、ムピロシン(BACTROBAN(登録商標))、プラテンシマイシン、キヌプリスチン/ダルホプリスチン(SYNERCID(登録商標))、リファキシミン(XIFAXAN(登録商標))、チアンフェニコール、チゲサイクリン(TIGACYL(登録商標))、チニダゾール(TINDAMAX(登録商標)、FASIGYN(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、抗ウイルス剤、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドまたは小分子抗ウイルス剤と組み合わせて、一次構築物をコードするポリヌクレオチド、またはmmRNA抗ウイルス性ポリペプチド、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドを投与することによって、対象において、ウイルス感染および/もしくはウイルス感染に関連した疾患、障害、または状態、またはそれらの症状を治療するか、または予防する方法が提供される。
、肺炎を伴う重症細気管支炎、ドイツ麻疹、先天性風疹、水痘およびヘルペス帯状疱疹が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルス性病原体には、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザ、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、および黄熱病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性病原体は、耐性ウイルス感染を引き起こすウイルスも含む。
例示の抗ウイルス剤には、アバカビル(ZIAGEN(登録商標))、アバカビル/ラミブジン/ジドブジン(trizivir(登録商標))、アシクロビル(aciclovir)またはアシクロビル(acyclovir)(CYCLOVIR(登録商標)、HERPEX(登録商標)、ACIVIR(登録商標)、ACIVIRAX(登録商標)、ZOVIRAX(登録商標)、ZOVIR(登録商標))、アデフォビル(Preveon(登録商標)、Hepsera(登録商標))、アマンタジン(SYMMETREL(登録商標))、アンプレナビル(AGENERASE(登録商標))、アンプリゲン(ampligen)、アルビドール、アタザナビル(REYATAZ(登録商標))、ボセプレビル、シドフォビル、ダルナビル(PREZISTA(登録商標))、デラビルジン(RESCRIPTOR(登録商標))、ジダノシン(VIDEX(登録商標))、ドコサノール(ABREVA(登録商標))、エドクスジン、エファビレンツ(SUSTIVA(登録商標)、STOCRIN(登録商標))、エムトリシタビン(EMTRIVA(登録商標))、エムトリシタビン/テノホビル/エファビレンツ(ATRIPLA(登録商標))、エンフビルチド(FUZEON(登録商標))、エンテカビル(BARACLUDE(登録商標)、ENTAVIR(登録商標))、ファムシクロビル(FAMVIR(登録商標))、ホミビルセン(VITRAVENE(登録商標))、ホスアンプレナビル(LEXIVA(登録商標)、TELZIR(登録商標))、ホスカルネット(FOSCAVIR(登録商標))、ホスホネット、ガンシクロビル(CYTOVENE(登録商標)、CYMEVENE(登録商標)、VITRASERT(登録商標))、GS9137(ELVITEGRAVIR(登録商標))、イミキモド(ALDARA(登録商標)、ZYCLARA(登録商標)、BESELNA(登録商標))、インジナビル(CRIXIVAN(登録商標))、イノシン、イノシンプラノベクス(IMUNOVIR(登録商標))、I型インターフェロン、II型インターフェロン、III型インターフェロン、クタプレシン(kutapressin)(NEXAVIR(登録商標))、ラミブジン(ZEFFIX(登録商標)、HEPTOVIR(登録商標)、EPIVIR(登録商標))、ラミブジン/ジドブジン(COMBIVIR(登録商標))、ロピナビル、ロビライド(loviride)、マラビロク(SELZENTRY(登録商標)、CELSENTRI(登録商標))、メチサゾン、MK−2048、モロキシジン、ネルフィナビル(VIRACEPT(登録商標))、ネビラピン(VIRAMUNE(登録商標))、オセルタミビル(TAMIFLU(登録商標))、ペグインターフェロンα−2a(PEGASYS(登録商標))、ペンシクロビル(DENAVIR(登録商標))、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン(CONDYLOX(登録商標))、ラルテグラビル(ISENTRESS(登録商標))、リバビリン(COPEGUs(登録商標)、REBETOL(登録商標)、RIBASPHERE(登録商標)、VILONA(登録商標)ANDVIRAZOLE(登録商標))、リマンタジン(FLUMADINE(登録商標))、リトナビル(NORVIR(登録商標))、ピラミジン(pyramid
ine)、サクイナビル(INVIRASE(登録商標)、FORTOVASE(登録商標))、スタブジン、ティーツリーオイル(メラレウカ(melaleuca)油)、テノホビル(VIREAD(登録商標))、テノホビル/エムトリシタビン(TRUVADA(登録商標))、チプラナビル(APTIVUS(登録商標))、トリフルリジン(VIROPTIC(登録商標))、トロマンタジン(VIRU−MERZ(登録商標))、バラシクロビル(VALTREX(登録商標))、バルガンシクロビル(VALCYTE(登録商標))、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン(viramidine)、ザルシタビン、ザナミビル(RELENZA(登録商標))、ならびにジドブジン(アジドミジン(AZT)、RETROVIR(登録商標)、RETROVIS(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
真菌感染に関連した疾患、障害、または状態には、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、および足白癬が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、免疫不全を有する人は、アスペルギルス、カンジダ、クリプトコッカス(Cryptoccocus)、ヒストプラズマ、およびニューモシスチス等の真菌属による疾患に特に罹患しやすい。他の真菌は眼、爪、髪、および特に皮膚を攻撃し得る、いわゆる皮膚糸状真菌(dermatophytic fungi)および好角質性真菌と呼ばれ、それは足部白癬等の環蠕虫が一般的である多様な状態を引き起こす。菌類胞子もまた、アレルギーの主要な原因であり、異なる分類群からの幅広い真菌が、一部の人々にアレルギー反応を誘起し得る。
真菌性病原体には、子嚢菌門(例えば、フザリウムオキシスポルム、ニューモシスチス・ジロベシ、アスペルギルス属、コクシジオイデス・イミチス/ポサダシ、カンジダ・アルビカンス)、担子菌門(例えば、フィロバジエラ・ネオフォルマンス、トリコスポロン)、微胞子虫門(例えば、エンセファリトゾーン・クニクリ、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ)、およびケカビ亜門(例えば、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、リゾプス・オリーゼ、Lichtheimia corymbifera)が挙げられるが、これらに限定されない。
例示の抗真菌剤には、ポリエン抗真菌薬(例えば、ナタマイシン、リモシジン(rimocidin)、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンB、カンジシン(candicin)、ハマイシン)、イミダゾール抗真菌薬(例えば、ミコナゾール(MICATIN(登録商標)、DAKTARIN(登録商標))、ケトコナゾール(NIZORAL(登録商標)、FUNGORAL(登録商標)、SEBIZOLE(登録商標))、クロトリマゾール(LOTRIMIN(登録商標)、LOTRIMIN(登録商標)AF、CANESTEN(登録商標))、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール(ERTACZO(登録商標))、スルコナゾール、チオコナゾール)、トリアゾール抗真菌薬(例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール)、チアゾール抗真菌薬(例えば、アバファンギン(abafungin))、アリルアミン(例えば、テルビナフィン(LAMISIL(登録商標))、ナフチフィン(NAFTIN(登録商標))、ブテナフィン(LOTRIMIN(登録商標)ウルトラ)、エキノキャンディン(例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン)、およびその他(例えば、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート(TINACTIN(登録商標)、DESENEX(登録商標)、AFTATE(登録商標))、ウ
ンデシレン酸、フルシトシンまたは5−フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、炭酸水素ナトリウム、アリシン)が挙げられるが、これらに限定されない。
原虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症(カラアザール)、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎、およびバベシア症が挙げられるが、これらに限定されない。
原虫性病原体には、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫(Giardia lambila)、腟トリコモナス、トリパノソーマ・ブルセイ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、大腸バランチジウム、トキソプラズマ・ゴンディ、プラスモジウム属、およびネズミバベシアが挙げられるが、これらに限定されない。
例示の抗原虫剤には、エフロールニチン、フラゾリドン(FUROXONE(登録商標)、DEPENDAL−M(登録商標))、メラルソプロール、メトロニダゾール(FLAGYL(登録商標))、オルニダゾール、パロモマイシン硫酸塩(HUMATIN(登録商標))、ペンタミジン、ピリメタミン(DARAPRIM(登録商標))、およびチニダゾール(TINDAMAX(登録商標)、FASIGYN(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
寄生虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症(baylisascariasis)、シャガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、施毛虫症、および鞭虫症が挙げられるが、これらに限定されない。
寄生虫性病原体には、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウシバエ、大腸バランチジウム、南京虫、条虫、恙虫、コクリオミイヤ・ホミニボラキス(Cochliomyia hominivorax)、赤痢アメーバ、肝蛭ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、サナダムシ、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、バンクロフト糸状虫が挙げられるが、これらに限定されない。
例示の抗寄生虫剤には、抗線虫薬(antinematodes)(例えば、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン)、抗条虫薬(anticestodes)(例えば、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール)、抗吸虫薬(antitrematodes)(例えば、プラジカンテル)、抗アメーバ薬(antiamoebics)(例えば、リファンピン、アンホテリシンB)、および抗原虫薬(例えば、メラルソプロール、エフロールニチン、メトロニダゾール、チニダゾール)が挙げられるが、これらに限定されない。
プリオン感染に関連した疾患、障害、または状態には、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、医原性クロイツフェルト・ヤコブ病(iCJD)、異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病(fCJD)、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(sCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、クールー病、スクラピー、ウシ海綿状脳症(BSE)、狂牛病、伝達性ミンク脳症(TME)、慢性消耗病(CWD)、ネコ海綿状脳症(FSE)、外来性有蹄類脳症(EUE)、および海綿状脳症が挙げられるが、これらに限定されない。
例示の抗プリオン剤には、フルピルチン、ペントサンポリ硫酸(pentosan polysuphate)、キナクリン、およびテトラ環状化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫応答の回避(avoidance)
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの有用な特長は、細胞の自然免疫応答を低減させるか、逃れるか、または回避する能力である。一態様において、細胞に送達されるとき、参照化合物、例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、または本発明の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAに対応する未修飾ポリヌクレオチドによって誘起される応答と比較して、低減された宿主からの免疫応答をもたらす、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが本明細書に提供される。本明細書で使用されるとき、「参照化合物」は、哺乳動物に投与されるとき、既知の程度、レベル、または量の免疫刺激を有する自然免疫応答をもたらす任意の分子または物質である。参照化合物は、核酸分子である必要はなく、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいずれかである必要もない。よって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる免疫応答の誘起の回避(avoidance)、回避(evasion)、または失敗の測定は、そのような応答を誘起することが知られている任意の化合物または物質と比較することで示され得る。
例えば、CD83、HLA−DR、CD80、およびCD86)の発現を測定すること、または適応免疫応答のアジュバントとして作用する能力を測定すること、が挙げられる。
露の低減において、有益であり得る。最後に、タンパク質産生もしくは免疫刺激可能性のいずれか、またはその両方を調節するmmRNAへの修飾ヌクレオチドの位置的な導入もまた可能である。これらの改善された特性を実証するそのようなmmRNAの能力を、(本明細書に記載のPBMCアッセイ等のアッセイを用いて)インビトロで評価することができ、また、mmRNAでコードされたタンパク質の産生およびサイトカイン等の自然免疫認識のメディエーターの両方の測定を通してインビボで評価することもできる。
さらに、ある特定の修飾ヌクレオシド、またはその組み合わせは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに導入されると、自然免疫応答を活性化する。そのような活性化分子は、ポリペプチドおよび/または他のワクチンと組み合わせられる場合、アジュバントとして有用である。ある特定の実施形態において、活性化分子は、ワクチンとして有用であるポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含有し、このようにして、自己アジュバントとなる能力を提供する。
原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、複数の自然応答経路を誘起するように細胞へ送達され得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006377号を参照のこと)。別の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、脊椎動物に対する免疫原性となるのに十分に大きい投与量で脊椎動物に送達され得る(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006372号および同第WO2012006369号を参照のこと)。
れてもよい。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを用いて、増加した生物学的活性、改善された患者予後、または保護機能等を含む、改善された疾患修飾活性を有する天然に生じるタンパク質の変異形を発現することができる。多くのそのような修飾遺伝子が、哺乳動物において記載されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Nadeau,Current Opinion in Genetics&Development 2003 13:290−295;Hamilton and Yu,PLoS Genet.2012;8:e1002644;Corder et al.,Nature Genetics 1994 7:180−184)。ヒトにおける例には、アポE2タンパク質、アポA−I変異形タンパク質(アポA−I Milano、アポA−I Paris)、機能亢進性第IX因子タンパク質(第IX因子Padua Arg338Lys)、トランスサイレチン変異体(TTR
Thr119Met)が挙げられる。アポE2(cys112、cys158)の発現は、アルツハイマー病および心血管疾患等の可能性のある他の状態に対する易罹患性を低減することによって、他のアポEアイソフォーム(アポE3(cys112、arg158)およびアポE4(arg112、arg158))と比較して保護を与えることが示されている(すべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Corder
et al.,Nature Genetics 1994 7:180−184、Seripa et al.,Rejuvenation Res.2011 14:491−500、Liu et al.Nat Rev Neurol.2013 9:106−118)。アポA−I変異形の発現は、低減されたコレステロールを伴った(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、deGoma and Rader,2011 Nature Rev Cardiol 8:266−271、Nissen et al.,2003 JAMA 290:2292−2300)。ある特定の集団におけるアポA−Iのアミノ酸配列は、アポA−I Milanoにおいて(Arg173がCysに変更された)、およびアポA−I Parisにおいて(Arg151がCys
に変更された)、システインに変更された。位置R338L(FIX Padua)における第IX因子突然変異は、約10倍に増加された活性を有する第IX因子タンパク質をもたらす(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Simioni et al.,N Engl J Med.2009 361:1671−1675、Finn
et al.,Blood.2012 120:4521−4523、Cantore
et al.,Blood.2012 120:4517−20)。位置104または119(Arg104His、Thr119Met)におけるトランスサイレチンの突然変異は、疾患をもたらすVal30Met突然変異も有する患者に保護を提供することも示されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Saraiva,Hum Mutat.2001 17:493−503、DATA BASE ON TRANSTHYRETIN MUTATIONS http://www.ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html)。それぞれ、Met119およびHis104突然変異体を有するポルトガル人および日本人のMet30患者における臨床所見および症状の重症度の差異が、分子にさらなる安定性を与える非病原性変異体によって発現される明らかな保護作用を伴い観察される(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Coelho et al.1996 Neuromuscular
Disorders(Suppl)6:S20、Terazaki et al.1999.Biochem Biophys Res Commun 264:365−370)。これらの保護TTR対立遺伝子をコードする修飾mRNAは、TTRアミロイド症患者において発現され得、それにより病原性変異体TTRタンパク質の効果を低減させる。
本明細書に記載されるように、「主溝相互作用パートナー」という表現は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば結合を通して、RNAリガンドを検出し、それに応答するRNA認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA等の修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むRNAリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、ゆえに、自然免疫応答を減少させる。
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、細菌、酵母、原虫、蠕虫等の病原性微生物または癌細胞等の疾患細胞を標的化するための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるmRNAは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。そのような方法は、血液、精液、卵子、ならびに胚、組織、および器官を含む移植
材料を含む任意の生体材料で見られる病原性生物を除去するか、または疾患細胞を死滅させるのに有用である。
本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質産物収率を向上させるのに有用であり得る。複数の宿主細胞を含有する細胞培養において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの導入は、対応する未修飾核酸と比べて増加したタンパク質産生効率をもたらす。そのような増加したタンパク質産生効率は、例えば、増加した細胞トランスフェクション、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAからの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解、および/または低減された宿主細胞の自然免疫応答を示すことによって実証することができる。タンパク質産生は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定することができ、タンパク質活性は当技術分野で既知の様々な機能的アッセイによって測定することができる。タンパク質産生は、連続的または流加(batch−fed)哺乳類プロセスにおいて生成され得る。
養に好適な周囲条件は、当業者によく知られている。本発明の方法は、タンパク質産生に使用するのに好適な任意の細胞で使用することができる。
リペプチド等の産物の濃度)として測定することができ、mg/Lまたはg/Lで示すことができ、別の方法として、比生産性をpg/細胞/日で示してもよい。SPの増加は、2つの既定の条件下(例えば、修飾mRNA(複数可)で処理されていない対照と比較した場合)で産生される産物の濃度の絶対的または相対的増加を指すことができる。
一実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、細菌性細胞、植物、微生物、藻類および真菌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシ細胞等であるが、これらに限定されない、哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、HeLa、NS0、SP2/0、KEK 293T、Vero、Caco、Caco−2、MDCK、COS−1、COS−7、K562、ジャーカット、CHO−K1、DG44、CHOK1SV、CHO−S、Huvec、CV−1、Huh−7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR−90、MCF−7、U−20S、Per.C6、SF9、SF21、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられるが、これらに限定されない株化細胞に由来し得る。
当業者であれば、培養細胞から目的とするタンパク質を精製または単離するために使用する方法を決定できるはずである。一般に、これは、親和性結合または非親和性精製を使用する捕獲法を通して行われる。目的とするタンパク質が培養細胞によって分泌されない場合、次いで、精製または単離の前に培養細胞の溶解が行われるべきである。本発明中の細胞培養培地構成成分ならびに消泡化合物および他の栄養剤および栄養補助剤等の細胞培養添加物、細胞、細胞残屑、宿主細胞タンパク質、DNA、ウイルス等とともに目的とするタンパク質を含有する清浄にされていない細胞培養液を用いてもよい。プロセスは、バイオリアクター自体において行われ得る。流体は、pH、温度、もしくは他の刺激特徴等の所望の刺激に予め調整されるか、もしくは流体は、ポリマー(複数可)の添加に応じて調整されるかのいずれかであってもよく、またはポリマー(複数可)が、ポリマーを流体中で可溶化するために必要とされる刺激条件に必要なパラメータに適正に調整された担体液体に添加されてもよい。流体を用いてポリマーを完全に循環させることができ、次いで、刺激を適用し(pH、温度、塩濃度等の変化)、所望のタンパク質およびポリマー(複数可)沈殿物を溶液中から取り出すことができる。ポリマーおよび所望のタンパク質(複数可)を残りの流体から分離することができ、任意に1回以上洗浄し、任意の捕捉された、または緩く結合された混入物質を除去してもよい。次いで、所望のタンパク質が、例え
ば溶出等によってポリマー(複数可)から回収される。好ましくは、溶出は、所望のタンパク質の選択された溶出中、ポリマーがその沈殿形態中に残存し、任意の不純物をそこに保持するような条件下で行われ得る。ポリマーおよびタンパク質ならびに任意の不純物は、水または緩衝液等の新たな流体中に可溶化されてもよく、タンパク質は、ポリマーまたは不純物のものを上回るタンパク質の優先性および選択性を有する親和性、イオン交換、疎水性、またはいくつかの他の種類のクロマトグラフィー等によって回収され得る。次いで、溶出されたタンパク質が回収され、適切な場合、バッチ様(batch like)ステップまたは連続フロースルーステップのいずれかのさらなるプロセシングステップに供され得る。
目的とするタンパク質は、好ましくは、分泌されるポリペプチドとして培養培地から回収され得るか、または分泌シグナルを伴わずに発現される場合、宿主細胞ライセートから回収され得る。目的とするタンパク質の実質的に均一の調節物が得られる方法で、目的とするタンパク質を他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質から精製しなければならない場合がある。細胞および/または粒状細胞残屑は、培養培地またはライセートから除去され得る。次いで、例えば、免疫親和性またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相HPLC(RP−HPLC)、SEPHADEX(登録商標)クロマトグラフィー、シリカ上またはDEAE等のカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーによって、目的とする産物を混入物質可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸から精製することができる。宿主細胞によって非相同的に発現されるタンパク質の精製方法は、当技術分野でよく知られている。
L,Na S,Sedgwich JD(2006)Cur.Opin.Immunol.18(6):670−5)。別の実施形態において、核酸は、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードする。ケモカイン受容体CXCR−4およびCCR−5が、HIVが宿主細胞内に進入するために必要とされる(Arenzana−Seisdedos F et al,(1996)Nature.Oct 3;383(6599):400)。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞集団における1つ以上の標的遺伝子の発現を発現停止させる(すなわち、予防するか、または大幅に低減させる)ために有用である。配列特異的ヒストンH3メチル化を指示することができる目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが、ポリペプチドが翻訳され、ヒストンH3メチル化および続ヘテロクロマチン形成を介して標的遺伝子の遺伝子転写が低減されるような条件下の集団における細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、サイレンシング機構は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で行われる。非限定的な例として、有用な標的遺伝子は、その中で哺乳類対象が、異常なキナーゼ活性の結果である骨髄増殖性疾患から被る変異体標的遺伝子を発現する、変異ヤヌスキナーゼ−2ファミリーメンバーである。
細胞内に導入される急速翻訳ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、標的生体経路を調節する所望の機構を提供する。そのような調節には、所与の経路のアンタゴニズムまたはアゴニズムが含まれる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAが細胞内に局在化され、ポリペプチドが、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAから細胞内で翻訳されることができ、そのポリペプチドが、生体経路におけるポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、細胞を目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含む有効量の組成物と接触させることによって、細胞内の生体経路を拮抗するための方法が、提供される。例示の生体経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、狼瘡エリテマトーデス、強直性脊椎炎、大腸炎、またはクローン病等の自己免疫または炎症性障害において欠損しているものである。特に、IL−12およびIL−23シグナル伝達経路のアンタゴニズムは、特に有用性がある(Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwick
JD(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6):670−5)を参照のこと)。
本明細書に記載のいくつかの態様および態様の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、細胞の表面上(例えば、ホーミング部分)でリガンドまたはリガンド受容体を発現することができる。細胞表面に結合されるリガンドまたはリガンド受容体部分は、細胞がインビボで組織または薬剤との所望の生物相互作用を有することを可能にする。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、
ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、受容体、例えば細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療剤、薬物、グリコサミノグリカン、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、リガンドは、癌細胞特異的抗原を認識する抗体であってもよく、腫瘍細胞と優先的に相互作用することができる細胞を与え、修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする。好ましいリガンドは治療される組織の外側の面で標的分子と相互作用することができるため、リガンドは、細胞組成物の治療される組織内で蓄積する能力を与えることができる。他の組織との制限された交差反応性を有するリガンドが、一般的に好ましい。
標的哺乳類細胞における細胞運命の変化を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆体細胞であってもよく、変化は分化を系譜内に推進すること、またはそのような分化を遮断することを含み得る。あるいは、標的哺乳類細胞は分化細胞であってもよく、細胞運命変化は、脱分化を多能性前駆体細胞内に推進すること、または癌幹細胞への癌細胞の脱分化等のそのような脱分化を遮断することを含む。細胞運命の変化が望まれる状況において、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のmRNAが、細胞運命の変化
が誘導されるような条件下で標的細胞に導入される。いくつかの実施形態において、修飾mRNAは、第1の表現型から第2の表現型へ細胞の亜集団を再プログラムするのに有用である。そのような再プログラミングは、一時的または永久的であってもよい。任意に、再プログラミングは、中間表現型を装うように標的細胞を誘導する。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物を用いて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド、またはこれらの組み合わせの発現を増加させることによって、細胞(例えば、癌細胞)内のアポトーシスを誘導することができる。この方法は、任意の所望の細胞における細胞死を誘導するために使用することができ、細胞が天然のアポトーシスシグナルを逃れる癌の治療において特に有用性を有する。
に関しては、それらは、細胞死受容体と結合するための三量体と競合することによって、抗アポトーシス性薬剤として役立ち得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、美容的状態の治療、寛解、または予防に使用され得る。そのような状態には、挫瘡、酒さ、瘢痕、皺、湿疹、帯状疱疹、乾癬、加齢によるシミ、母斑、乾燥肌、たこ、発疹(例えば、おむつかぶれ、あせも)、疥癬、蕁麻疹、疣贅、虫刺され、白斑、フケ、そばかす、および老化の一般的な兆候が挙げられる。
キット
本発明は、好都合におよび/または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の(複数可)複数の治療を実施する、および/または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および/または数の構成成分を含む。
明細書で開示される食塩水、緩衝液、リピドイド(lipidoid)、または任意の送達剤を含んでもよい。
本発明は、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中にポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。そのような目的とするポリペプチドの非限定的な例としては、創傷治癒のための成長因子および/または血管形成刺激因子、感染制御を容易にするためのペプチド抗細菌剤、ならびに新たに確認されたウイルスに対する免疫応答を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
試料ブロックは、好ましくは、試料容器およびその構成要素を約−20℃〜+100℃を超える温度に加熱および/または冷却することができるような加熱モジュールである、加熱モジュールを含む。デバイス基部は、電池または外部電圧源等の電圧源と通信している。デバイスは、RNA合成のための材料を貯蔵および分配するための手段も含む。
参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Dekkerによると、0〜1mmの露出された高さを持つ放出口を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、それが0.3mm〜2mmの深さで物質を送達することによって、薬物動態およびバイオアベイラビリティを改善する。
itsztaによると、少なくとも1つの中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、0.025mm〜2mmの深さでワクチンを対象の皮膚に送達する。
ー内に位置する複数の中空針がデバイス内に組み込まれ、ローラーが回転すると、針を通してリザーバ内の内容物を送達する。
カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明のmmRNAを投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明のmmRNAを送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
る。そのカテーテルは体内ルーメン内に位置し、そのルーメンを取り囲む組織内に透過させるためのその針電極が続く。次いでデバイスは、その針電極のうちの少なくとも1つを通して薬剤を導入し、その針電極で電界をかけ、その薬剤が細胞膜を通して治療部位の細胞内へ通過することを可能にする。
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「C1−6アルキル」という用語は、メチル、エチル、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、およびC6アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
L−17、IL−18、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω、またはIFNτ、TNFαおよびTNFβ、TNFγ、TRAIL等の腫瘍壊死因子(TNF);G−CSF、GM−CSF、M−CSF、MCP−1、およびVEGF等のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
る。
つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する、2〜20個の炭素(例えば、2〜6または2〜10個の炭素)の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エテニル、1−プロペニル、2−プロペニル、2−メチル−1−プロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル等により例として示される。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)から独立して選択される1、2、3、もしくは4個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
−C1−6アルキル、C1−10アルコキシ−C1−10アルキル、またはC1−20アルコキシ−C1−20アルキル等の、2〜12または2〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例
えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル(aryloyl)置換基をもたらすことができる。
は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
るアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基(例えば、CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される))でさらに置換され得る。
オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)C2−20アルケニル;ならびに(27)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
1の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出され、Rは、本明細書に定義されるアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、またはアルクヘテロシクリル(例えば、アルクヘテロアリール)である。
;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−
6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C6−10アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)C2−20アルケニル;ならびに(28)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
ル(例えば、−CF3)、−CHF2、−CH2F、−CCl3、−CH2CH2Br、−CH2CH(CH2CH2Br)CH3、および−CHICH3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
ソ−1H−ピラゾリル);2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−1H−イミダゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−5−メチル−5−フェニル−1H−イミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−1,3,4−オキサジアゾリル(例えば、2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−5−フェニル−1,3,4−オキサジアゾリル);4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1H−トリアゾリル(例えば、4,5−ジヒドロ−3−メチル−4−アミノ5−オキソ−1H−トリアゾリル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3,3−ジエチルピリジニル);2,6−ジオキソ−ピペリジニル(例えば、2,6−ジオキソ−3−エチル−3−フェニルピペリジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソピリジミニル;1,6−ジヒドロ−4−オキソピリミジニル(例えば、2−(メチルチオ)−1,6−ジヒドロ−4−オキソ−5−メチルピリミジン−1−イル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリミジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3−エチルピリミジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−ピリダジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−6−オキソ−3−エチルピリダジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−5−イソプロピル−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリル(例えば、3,3−ジメチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリルおよび2,3−ジヒドロ−2−オキソ−3,3’−スピロプロパン−1H−インドール−1−イル);1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−イソ−インドリル;1,3−ジヒドロ−1,3−ジオキソ−2H−イソ−インドリル;1H−ベンゾピラゾリル(例えば、1−(エトキシカルボニル)−1H−ベンゾピラゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル(例えば、3−エチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル(例えば、5−クロロ−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル;2−オキソ−2H−ベンゾピラニル;1,4−ベンゾジオキサニル;1,3−ベンゾジオキサニル;2,3−ジヒドロ−3−オキソ,4H−1,3−ベンゾチアジニル;3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル(例えば、2−メチル−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル(例えば、1−エチル−1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−7H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−1,3−ジメチル−2,6−ジオキソ−7H−プリニル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−1H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−3,7−ジメチル−2,6−ジオキソ−1H−プリニル);2−オキソベンズ[c,d]インドリル;1,1−ジオキソ−2H−ナフト[1,8−c,d]イソチアゾリル;および1,8−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、3,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロ−ピロlo[3,4−b]ピロl−(2H)−イル、および2,5−ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン−2−イル、ホモピペラジニル(またはジアゼパニル)、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式:
の基も含み、式中、
シクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)アリールアルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)(C1−12ヘテロシクリル)イミノ;(28)C2−20アルケニル;ならびに(29)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
ルホニル、p−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基;ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1−(p−ビフェニルyl)−1−メチルエトキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−9−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいN保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
化合物:本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
ウムが含まれる。
Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford
University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M
Stockton Press,New York,1991に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、MeyersおよびMiller(CABIOS,1989,4:11−17)のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはPAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いてALIGNプログラム(第2.0版)に組み込まれている。2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用するGCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるCarillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。2つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、GCGプログラムパッケージ、Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.、215、403(1990))が含まれるが、これらに限定されない。
超、約97%超、約98%超、約99%超、または約99%超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の構成成分が実質的にない場合、「純粋」である。実質的に単離される:「実質的に単離される」とは、化合物が、それが形成されたまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物を豊富に含んだ組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、または少なくとも約99重量%の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野で通例である。
:ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(第二)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋結合ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微小結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、およびキシリトール。
和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に耐性がある。例えば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または沈殿によって、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から調製されてもよい。好適な溶媒の例としては、エタノール、水(例えば、一、二、および三水和物)、N−メチルピロリジノン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N’−ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン(DMEU)、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2−(1H)−ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等が挙げられる。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は、「水和物」と称される。
それらの全体が本明細書に組み込まれる、T.Higuchi and V.Stella,“Pro−drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Seriesに、およびBioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical
Association and Pergamon Press,1987で論じられている。
指す。試料には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
しくは状態であると診断されているか、または疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状を呈する。
性化または抑制によって、DNAのRNAへの転写を調節する、DNA結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写の調節を単独でもたらす一方で、他の転写因子は、他のタンパク質と協働して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した、特定の標的配列(単数または複数)に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子と複合して調節し得る。
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
本発明に従う修飾mRNA(mmRNA)は、標準的な実験室方法および材料を用いて作製することができる。目的とする遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)は、ポリA尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る5’非翻訳領域(UTR)および/またはオリゴ(dT)配列を含み得るα−グロビン3’UTRに隣接し得る。修飾mRNAは、細胞の自然免疫応答を低減させるように修飾され得る。細胞の応答を低減させる修飾には、シュードウリジン(ψ)および5−メチル−シチジン(5meC、5mc、またはm5C)が含まれ得る(それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kariko K et al.Immunity 23:165−75(2005)、Kariko K et al.Mol Ther 16:1833−40(2008)、Anderson BR et al.NAR(2010)を参照のこと)。
1 氷上のNEB 5−αコンピテント大腸菌細胞の管を10分間解凍する。
2 1pg〜100ngのプラスミドDNAを含有する1〜5μLを細胞混合物に添加する。管を慎重に4〜5回振り、細胞とDNAを混合する。ボルテックスしないこと。
3 混合物を30分間氷上に置く。混ぜないこと。
4 42℃で正確に30秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
5 5分間氷上に置く。混ぜないこと。
6 室温のSOCを950μLピペットで混合物に入れる。
7 37℃で60分間置く。激しく振盪させる(250rpm)か、または回転させる。
8 選択プレートを37℃に温める。
9 管を振り、逆さにすることによって完全に細胞を混合する。
表11.G−CSFの配列
cDNAの調製のためのPCR手順を、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2×KAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを用いて行う。このシステムには、2×KAPA ReadyMix12.5μL、順方向プライマー(10uM)0.75μL、逆方向プライマー(10uM)0.75μL、鋳型cDNA100ng、および25.0μLに希釈したdH20が含まれる。反応条件は、95℃で5分間、98℃で20秒間を25サイクル、その後58℃で15秒間、続いて72℃で45秒間、次いで72℃で5分間、次いで4℃で終了までである。
インビトロ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾RNAを含有するmRNAを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然および非天然のNTPを用いてで自家作製したものである。
1 鋳型cDNA 1.0μg
2 10倍転写緩衝液(400mM Tris−HCl pH8.0、190mM MgCl2、50mM DTT、10mMスペルミジン) 2.0μL
3 カスタムNTP(25mMずつ) 7.2μL
4 RNase阻害剤 20U
5 T7 RNAポリメラーゼ 3000U
6 dH20 最大20.0μL
7 37℃で3時間〜5時間のインキュベーション。
mRNAのキャッピングを、次のように行い、混合物には、IVT RNAが60μg〜180μgおよびdH20が最大72μL含まれる。混合物を、65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
cDNAにポリTがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリAテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μL)、RNase阻害剤(20U)、10倍テーリング緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μL)、20mM ATP(6.0μL)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH20最大123.5μLを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行う。ポリA尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接AmbionのMEGACLEAR(商標)kit(Austin,TX)(最大500μg)での浄化に進んでもよい。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
修飾RNAの5’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的RNAキャップ類似体を用いたインビトロ転写反応の際に付随して完了し得、5’グアノシンキャップ構造が生成される:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ]、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)を生成し得る。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2’−Oメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルが得られる。キャップ2構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から3番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ1構造から生成され得る。キャップ3構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から4番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ2構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
A.タンパク質発現アッセイ
ARCA(3’O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G)キャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号16099に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたmRNA配列は配列番号21438に示され、約160ヌクレオチド(nucletoidie)長のポリA尾部は配列内には示されない)を、等濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたG−CSFの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベル
のG−CSFを分泌する合成mRNAは、より高度は翻訳的にコンピテントなキャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造の粗製合成産物を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号16099に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたmRNA配列は配列番号21438に示され、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)を、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成mRNAは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成mRNAと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のHPLCピークを有する合成mRNAもより高い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なmRNA集団が得られる。
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号16099に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は配列番号21438に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は配列内に示されない)を、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたTNF−αおよびIFN−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成mRNAは、免疫活性化キャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号16099に示される、5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は各シトシンにおける配列番号21438に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は、配列内に示されない)を、キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理の後に、LC−MSによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理により、LC−MSによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた5’−5−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。LC−MSスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全mRNAの割合として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、LC−MSにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
個々の修飾RNA(20μL体積中200〜400ng)または逆転写されたPCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA)のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間泳動させる。
TE緩衝液(1μL)中の修飾RNAを、Nanodrop UV吸光読み取りに使用して、インビトロ転写反応からの各RNAの収率を定量化する。
修飾mRNA(mmRNA)を、細胞に添加する前に、設定された比率でmmRNAとリピドイドとを混合することによってインビトロでの実験用に製剤化する。インビボ製剤は、身体全体への循環を促進するために、追加の成分の添加を要する場合がある。インビボでの働きに好適な粒子を形成するこれらのリピドイドの能力を試験するために、siRNA−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを、起始点として使用した。初期mmRNA−リピドイド製剤は、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEGから構成される粒子からなり得、比率のさらなる最適化が可能である。粒子の形成後にmmRNAを添加し、複合体と一体化させる。カプセル封入効率を、標準的な色素排除アッセイを用いて判定する。
A.脂質合成
6つの脂質、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、およびDLin−MC3−DMAを、修飾RNAとともに製剤化するために、当技術分野で概説される方法によって合成した。DLin−DMAおよび前駆体を、Heyes et.al,J.Control Release,2005,107,276−287に記載されるように合成した。DLin−K−DMAおよびDLin−KC2−DMA、ならびに前駆体を、Semple et.al,Nature Biotechnology,2010,28,172−176に記載されるように合成した。98N12−5および前駆体を、Akinc et.al,Nature
Biotechnology,2008,26,561−569に記載されるように合成した。
合成脂質、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、コレステロール(Sigma−Aldrich,Taufkirchen,Germany)、およびα−[3’−(1,2−ジミリストイル−3−プロパノキシ)−カルボキサミド−プロピル]−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン(PEG−c−DOMG)(NOF,Bouwelv
en,Belgium)の溶液を、エタノール中50mMの濃度で調製し、−20℃で保管した。脂質を合わせて、50:10:38.5:1.5(脂質:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)のモル比を得、25mMの最終脂質濃度までエタノールで希釈した。水中1〜2mg/mLの濃度の修飾mRNAの溶液を、pH3で50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液中に希釈して、修飾mRNAのストック溶液を形成した。合成脂質溶液と修飾mRNA溶液を、10:1、15:1、20:1、および30:1の総脂質対修飾mRNAの重量比で合わせることによって、脂質および修飾mRNAの製剤を調製した。脂質エタノール溶液を、修飾mRNA水溶液に迅速に注入して、33%のエタノールを含有する懸濁液を得た。溶液は、手動(MI)またはシリンジポンプ(SP)を用いてのいずれかで注入した(Harvard Pump 33 Dual Syringe
Pump Harvard Apparatus Holliston,MA)。
。
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を使用して、修飾mRNAナノ粒子の粒径、多分散指標(PDI)、およびゼータ電位を、粒径の判定時は1倍PBS中、およびゼータ電位の判定時は15mMのPBS中において、判定した。
ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)および肝細胞癌上皮(HepG2)細胞(LGC standards GmbH,Wesel,Germany)を、96−ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種し、HEK293細胞のプレートは1型コラーゲンで事前コーティングされていた。100μLの細胞培養培地中、HEK293は1ウェル当たり30,000細胞の密度で播種し、HepG2は35,000細胞の密度で播種した。HEK293については、細胞培養培地は、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1x非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germany)、ならびに1.2mg/mLの重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,Germany)を添加した、DMEM、10%FCSであり、HepG2については、培養培地は、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、および1x非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germanyを添加した、MEM(Gibco Life Technologies,Darmstadt,Germany)、10%FCSであった。mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、細胞を播種した直後に四重に添加し、インキュベートした。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するmCherry cDNAを、配列番号21440に示す。mCherry mRNAを、各シトシンにおける5meCおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で修飾した。
HEK293およびHepG2においてDLin−KC2−DMAおよび98N12−5のナノ粒子製剤を試験し、平均蛍光強度(MFI)が脂質と修飾RNAの比、および/または精製に依存するかどうかを判定した。DLin−KC2−DMAの3つの製剤と98N12−5の2つの製剤を、シリンジポンプを用いて表12に記載される仕様に生成した。精製試料は、SEPHADEX(商標)G−25 DNAグレード(GE Healthcare,Sweden)によって精製した。精製の前および後(aP)の各製剤を、24ウェルプレートにおいて、1ウェル当たり250ngの修飾RNAの濃度で試験した。各製剤およびバックグラウンド試料についてフローサイトメーターによって分析したときにFL4チャネルのマーカーが陽性である細胞の割合(FL4陽性%)、ならびに各製剤およびバックグラウンド試料についてのFL4チャネルのマーカーのMFIを、表13に示す。精製されている製剤は、精製前に試験した製剤よりもわずかに高いMFIを有した。
表12.製剤
表13.HEK293およびHepG2、24ウェル、250ngの修飾RNA/ウェル
98N12−5(NPA−005)およびDLin−KC2−DMA(NPA−003)のナノ粒子製剤を、種々の濃度で試験して、広範な濃度にわたり、FL4またはmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシ
ュードウリジンで完全に修飾)のMFIを判定した。試験した製剤を表14に概要説明する。98N12−5のナノ粒子製剤の最適な濃度を判定するために、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり100ng、10ng、1.0ng、0.1ng、および0.01ng)を、24ウェルプレートのHEK293において試験し、各用量のFL4 MFIの結果を表15に示す。同様に、DLin−KC2−DMAのナノ粒子製剤の最適な濃度を判定するために、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり250ng 100ng、10ng、1.0ng、0.1ng、および0.01ng)を、24ウェルプレートのHEK293において試験し、各用量のFL4 MFIの結果を表16に示す。DLin−KC2−DMAのナノ粒子製剤も、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり250ng、100ng、および30ng)で24ウェルプレートのHEK293において試験し、FL4 MFIの結果を表17に示す。98N12−5については1ng/ウェルの用量、およびDLin−KC2−DMAについては10ng/ウェルの用量が、バックグランドのFL4 MFIに類似していることがわかった。
表14.製剤
表15.HEK293、NPA−005、24ウェル、n=4
表16.HEK293、NPA−003、24ウェル、n=4
表17.HEK293、NPA−003、24ウェル、n=4
表18.濃度およびMFI
DLin−KC2−DMAおよび98N12−5の2つの製剤を、手動注入(MI)およびシリンジポンプ注入(SP)によって調製し、バックグラウンド試料とともに分析して、異なる製剤のmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)のMFIを比較した。表19は、シリンジポンプ製剤が、同じ脂質および脂質/RNA比の手動注入製剤と比較して、高いMFIを有したことを示す。
表19.製剤およびMFI
DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、およびDLin−MC3−DMAの製剤を、HEK293のプレートでは60ng/ウェルまたは62.5ng/ウェルの濃度で、HepG2細胞のプレートでは62.5ng/ウェルの濃度で、24時間インキュベートして、各製剤についてmCherry(配列は配列番号21439;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)のMFIを判定した。試験した製剤を、以下の表20に概略説明する。60ng/ウェルについては表21に、62.5ng/ウェルについては表22、23、24、および25に示されるように、NPA−003およびNPA−018の製剤が、最も高いmCherry MFIを有し、NPA−008、NPA−010、およびNPA−013の製剤は、バックグラウンド試料のmCherry MFI値に最も類似している。
表20.製剤
表21.HEK293、96ウェル、60ngの修飾RNA/ウェル
表22.HEK293、62.5ng/ウェル
表23.HEK293、62.5ng/ウェル
表24.HepG2、62.5ng/ウェル
表25.epG2、62.5ng/ウェル
齧歯動物(n=5)に、修飾mRNAおよび脂質を含有する製剤の単回用量を、静脈内、皮下、または筋肉内投与する。齧歯動物に投与する修飾mRNAは、G−CSF(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、エリスロポエチン(EPO)(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、第IX因子(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、またはmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)から選択される。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するエリスロポエチンcDNAを、配列番号21441および配列番号21442に示す。
齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、投与した製剤のタンパク質発現の経時変化を研究する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、各製剤の用量応答を判定する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。さらに、齧歯動物を屠殺して、修飾mRNA製剤の内部組織への作用を分析する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、各製剤の毒性を研究する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。さらに、齧歯動物を屠殺して、修飾mRNA製剤の内部組織への作用を分析する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
PLGAマイクロスフェアの製剤化に使用されるパラメータの最適化により、マイクロスフェアにカプセル封入された修飾RNAの完全性を維持すると同時に、調整可能な放出速度および高いカプセル封入効率を可能にすることができる。粒径、回収率、およびカプセル封入効率等であるがこれらに限定されないパラメータを最適化して、最適な製剤を達成することができる。
ポリ乳酸グリコール酸(PLGA)マイクロスフェアを、PLGA(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、0.1mLの水(W1)を、PLGAの濃度範囲50〜200mg/mLで、ジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度4(約15,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax Homogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを100〜200mLの0.3〜1%のPVA(W2)に添加し、種々の速度で1分間均質化させた。製剤をそのまま3時間撹拌させ、次いで、遠心分離により洗浄した(20〜25分間、4,000rpm、4℃)。上清を廃棄し、PLGAのペレットを5〜10mLの水に再懸濁させ、これを2回繰り返した。各製剤の平均粒径(20〜30個の粒子を表す)を、洗浄後の顕微鏡検査により判定した。表26は、PLGA濃度の増加が、より大きな粒径のマイクロスフェアをもたらしたことを示す。200mg/mLのPLGA濃度は、14.8μmの平均粒径をもたらし、100mg/mLでは8.7μmであり、50mg/mLのPLGAでは4.0μmの平均粒径をもたらした。
表26.PLGA濃度の変化
表27.均質化速度の変化
00:1に増加させること)により、平均粒径がわずかに減少したことを示す。0.3から1重量%へのPVA濃度の変化は、PLGAマイクロスフェアの大きさにほとんど影響を及ぼさなかった。
表28.W2の体積および濃度の変化
修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、2mg/mL(W3)の濃度で水中に溶解させた。3つのバッチのPLGAマイクロスフェア製剤を、次のパラメータに従って上述のように作製した:2mg/mLで0.1mLのW3、200mg/mLで1.6mLのO1、1%で160mLのW2、ならびに第1のエマルション(W3/O1)は速度3で均質化、および第2のエマルション(W3/O1/W2)は速度5で均質化。遠心分離によって洗浄した後、製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで3日間凍結乾燥させた。製剤のカプセル封入効率を試験するために、凍結乾燥材料を、DCM中で6時間脱製剤化(deformulated)させた後、一晩水中に抽出した。次いで、試料中の修飾RNAの濃度をOD260によって判定した。カプセル封入効率は、修飾RNAの実際の量を取得し、修飾RNAの開始時の量で除すことによって計算した。試験した3つのバッチでは、59.2、49.8、および61.3のカプセル封入効率であった。
修飾第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、種々の濃度で水中に溶解させて(W4)製剤中の充填重量パーセント(mg 修飾RNA/mg PLGA*100)を変化させ、カプセル封入効率を判定した。表29のパラメータを使用して、第1のエマルション(W4/O1)は均質化速度4で、第2のエマルション(W4/O1/W2)は均質化速度5で、4つの異なるバッチのPLGAマイクロスフェア製剤を作製した。
表29.第IX因子PLGAマイクロスフェア製剤のパラメータ
表30.充填重量パーセントおよびカプセル封入効率
D.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAの放出研究
第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)とともに製剤化されたPLGAマイクロスフェアを、上述のように脱製剤化し、抽出された修飾RNAのタンパク質発現をインビトロトランスフェクションアッセイによって判定した。HEK293細胞に、RNAiMAX(Invitrogen)と複合体形成した250ngの第IX因子修飾RNAを、三重に逆トランスフェクトした。
表31.タンパク質発現
第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)とともに製剤化されたPLGAマイクロスフェアを、24mg/mLのPLGAマイクロスフェア濃度まで水中に再懸濁した。再懸濁した後、150μLのPLGAマイクロスフェア懸濁液を、エッペンドルフ管にアリコート化した。試料を、研究過程の間、37℃でインキュベートおよび振盪し続けた。三連の試料を、0.2、1、2、8、14、および21日で取り出した。PLGAマイクロスフェアから放出された修飾RNAの量を判定するために、試料を遠心分離し、上清を除去し、上清中の修飾RNAの濃度をOD260によって判定した。表32に示される放出パーセントは、各試料中の総修飾RNA量に基づいて計算した。31日後、第IX因子修飾RNAの96%が、PLGAマイクロスフェア製剤から放出された。
表32.放出パーセント
3つのバッチの第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)PLGAマイクロスフェアを、表29に示されるバッチDに関して記載のものと同じ条件を用いて作製した(4mg/mLで0.4mLのW4、200mg/mLで2.0mLのO1、1%で200mLのW2、およびW4/O1/W2エマルションは速度5で均質化)。PLGAマイクロスフェア懸濁液の均質性を改善するために、遠心分離の前に濾過を組み込んだ。3時間撹拌した後、遠心分離の前に、すべての製剤化材料を100μmのナイロンメッシュ篩(Fisherbrand Cell Strainer、カタログ番号22−363−549)に通して大きな凝集物を取り除いた。水で洗浄し、再懸濁した後、100〜200μLのPLGAマイクロスフェア試料を、レーザー回折による製剤の粒径測定に使用した(Malvern Mastersizer2000)。試料の粒径を表33に示す。
表33.粒径の要約
緩衝液(TE)もしくは90%血清(Se)中の第IX因子mRNA RNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)、または緩衝液、90%血清、もしくは1%血清中のPLGA中の第IX因子mRNAを、緩衝液、90%血清、または1%血清中において、総体積70μL中50n
g/μLのmRNA濃度でインキュベートした。試料を、0、30、60、または120分で取り出した。25μLの4倍プロテイナーゼK緩衝液(0.4mLの1M TRIS−HCl pH7.5、0.1mLの0.5M EDTA、0.12mLの5M NaCl、および0.4mLの10%SDS)および8μLのプロテイナーゼKを20mg/mLで添加することによって、RNaseを55℃で20分間プロテイナーゼK消化により不活性化した。バイオアナライザーで分析する前に、第IX因子mRNAを、沈殿させた(250μLの95%エタノールを1時間添加し、13krpmで10分間遠心分離し、上清を除去し、200μLの70%エタノールをペレットに添加し、13krpmで5分間再度遠心分離し、上清を除去し、ペレットを70μLの水中に再懸濁させた)か、またはPLGAマイクロスフェアから抽出した(13krpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを1mLの水で洗浄し、13krpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、280μLのジクロロメタンをペレットに添加し、15分間振盪させ、70μLの水を添加し、次いで2時間振盪させ、水相を除去した)。PLGAマイクロスフェアは、2時間にわたり、第IX因子修飾mRNAを90%および1%の血清中での分解から保護する。第IX因子修飾mRNAは、開始時点で90%の血清中で完全に分解される。
G−CSF(インビトロ転写に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するcDNAは配列番号21437に示される。mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)および第IX因子(インビトロ転写に使用される、T7プロモーター、5’UTR、および3’UTRを有するcDNAは配列番号21443に示される。mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)修飾mRNAを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質モル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表34に列挙される製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。
表34.製剤
表35.G−CSFタンパク質発現
表36.第IX因子タンパク質発現
表37.タンパク質産生
G−CSF(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチド(nulceotide)のポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)およびEPO(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)修飾mRNAを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質モル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表38に列挙される製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。
表38.製剤
表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgの単回修飾mRNA用量で、ラット(n=5)に静脈内(IV)、筋肉内(IM)、または皮下(SC)投与した。対照群のラット(n=4)は未処理であった。ラットに、2時間、8時間、24時間、48時間、および96時間、ならびにそれらにG−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した後に採血を行って、ELISAによってタンパク質発現を判定した。EPO修飾mRNAを静脈内投与したラットを7日目にも採血した。
表39.G−CSFおよびEPOのタンパク質発現
表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.5、0.05、または0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、マウス(n=5)に静脈内(IV)投与した。マウスに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した8時間、24時間、72時間、および6日後に採血を行って、ELISAを用いてタンパク質発現を判定した。
表40.タンパク質発現
A.マウスにおけるLNP製剤
表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgまたは0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、マウス(n=4)に静脈内(IV)投与した。未処理の対照マウス群(n=4)も3つ存在した。マウスに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した2時間、8時間、24時間、48時間、および72時間後に採血を行って、タンパク質発現を判定した。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAを用いて判定した。
表41.マウスにおけるタンパク質発現
表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgの単回修飾mRNA用量で、ラット(n=4)に静脈内(IV)投与する。未処理の対照ラット群(n=4)も存在する。ラットに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および14日後に採血を行って、タンパク質発現を判定する。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAを用いて判定する。
表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、哺乳動物に静脈内(IV)、筋肉内(IM)、または皮下(SC)投与する。対照哺乳動物群は未処理である。哺乳動物に、修飾mRNA LNP製剤を投与した5分、10分、20分、30分、45分、1時間、1.5時間、および/または2時間後に、採血を行って、ELISAを用いてタンパク質発現を判定する。さらに、哺乳動物に採血を行い、顆粒球レベルおよび赤血球数等の全血球数を判定する。
表38(上述)に示されるLNP製剤を、必要に応じてシリンジ/abbocathまたはバタフライに取り付けることができる皮下注射針を用いて約30秒間にわたる静脈内ボーラス注入(IV)として非ヒト霊長類(NHP)(カニクイザル)(n=2)に投与した。NHPに、0.5mL/kgの投薬量で、0.05mg/kgのEPOもしくはG−CSF、または0.005mg/kgのEPOの単回修飾mRNA IV用量を投与した。NHPに、修飾mRNA LNP製剤を投薬する5〜6日前に採血を行って、血清中のタンパク質発現およびベースラインの全血球数を判定した。修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、および72時間でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定し
た。投与の24および72時間後には、NHPの全血球数もまた判定した。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現をELISAによって判定した。NHPの尿を、実験の全過程にわたり採取し、分析して臨床的安定性を評価した。NHPにG−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した後に、それらから試料を採取して、ELISAを用いてタンパク質発現を判定した。非ヒト霊長類の臨床化学、血液学、尿検査、およびサイトカインについても分析した。
表42.非ヒト霊長類におけるタンパク質発現
表38(上述)に示されるLNP製剤を、静脈内注入(IV)として、非ヒト霊長類(NHP)(カニクイザル)(n=2)に投与した。NHPに、0.5mL/kgの投薬量で、0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgのG−CSFまたはEPOの単回修飾mRNA IV用量を投与した。NHPに、修飾mRNA LNP製剤を投薬する前に採血を行って、血清中のタンパク質発現およびベースラインの全血球数を判定した。G−CSF修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、および72時間でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定した。EPO修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、72時間、および7日でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定した。
G−CSFまたはEPO製剤の投与前、投与の24時間、3日、7日、14日、および18日後に判定した。
表43.G−CSFタンパク質発現
表44.EPOタンパク質発現
表45.NHPにおけるG−CSF mRNAの薬理学的効果
表46.好中球数に対するEPO mRNAの薬理学的効果
表47.ヘモグロビンに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表48.ヘマトクリットに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表49.赤血球に対するEPO mRNAの薬理学的効果
表50.アラニントランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表51.アスパラギン酸トランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表52.アラニントランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
生理食塩水中に修飾EPO mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)またはG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を含有する製剤を、非ヒト霊長類(カニクイザル)(NHP)に筋肉内(IM)または皮下(SC)投与した。0.05mg/kgまたは0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量は、0.5mL/kgの投薬量でのものであった。非ヒト霊長類に、投薬の5〜6日前に採血を行って、血清タンパク質濃度およびベースラインの全血球数を判定する。修飾mRNA製剤を投与した後、8時間、24時間、48時間、72時間、7日、および14日でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定する。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAによって判定する。投与の24時間、72時間、7日、および14日後に、NHPの全血球数もまた判定する。全実験過程にわたってNHPから尿を採取し、分析して臨床的安定性を評価する。注入部位付近の組織もまた採取し、分析してタンパク質発現を判定する。
修飾mRNAの局在化および/または輸送を判定するために、次のように研究を行うことができる。
修飾mRNAのLNP製剤を、当技術分野で既知および/または本明細書に記載もしくは当技術分野で既知の方法に従って製剤化する。LNP製剤には、G−CSF、EPO、トロンボポエチン等のタンパク質、および/または本明細書に記載の任意のタンパク質をコードし得る、少なくとも1つの修飾mRNAが含まれ得る。少なくとも1つの修飾mRNAには、1、2、3、4、または5つの修飾mRNA分子が含まれ得る。少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤は、単回または複数回の投薬レジメンで、静脈内、筋肉内、または皮下投与することができる。血液および/または血清等であるがこれらに限定されない生体試料を、少なくとも1つの修飾mRNA製剤の投与の前および/後の様々な
時点で採取し、分析することができる。タンパク質をコードする少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を哺乳動物に投与した後、50〜200pg/mLの生体試料における前記タンパク質の発現は、生物学的に有効であると考えられるであろう。
A.PEG LNPの製剤化および特徴付け
脂質ナノ粒子(LNP)を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。LNPを、総脂質と修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)の重量比20:1で製剤化した。製剤のモル比範囲を、表53に示す。
表53.モル比
表54.LNP製剤の特徴付け
B.PEG LNPのインビボスクリーニング
表55.タンパク質発現
A.カチオン性脂質ナノ粒子の製剤化および特徴付け
脂質ナノ粒子(LNP)を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。LNPを、20:1の総脂質と修飾mRNAの重量比で製剤化した。カチオン性脂質、DSPC、コレステロール、およびPEG−c−DOMGの最終的な脂質のモル比範囲を、表56に概略説明する。
表56.モル比
表57.カチオン性脂質製剤の特徴付け
表57に記載されるカチオン性脂質製剤の製剤を、0.5mg/kgの用量で、マウス(n=5)に静脈内投与した。血清を、製剤を投与した2時間、24時間、72時間、および/または7日後にマウスから採取した。血清をELISAによって分析してEPOまたはG−CSFのタンパク質発現を判定し、発現レベルを表58に示す。
表58.タンパク質発現
A.エレクトロスプレーイオン化
対象に投与した修飾RNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、1、2、3、または4個の質量分析器を用いて、エレクトロスプレーイオン化(ESI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。生体試料はまた、タンデムESI質量分析システムを用いて分析することもできる。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質を、所与のタンパク質について既知の対照と比較し、素性を比較により判定する。
対象に投与した修飾RNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。
修飾RNAをによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を、トリプシン酵素で処理して、中に含有されるタンパク質を消化させる。結果として得られるペプチドを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC/MS/MS)によって分析する。ペプチドを断片化して質量分析計に入れ、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列のデータベースとマッチさせることが可能な特徴的なパターンを生成する。消化した試料を希釈して、所与のタンパク質について1ng以下の出発物質を得ることができる。単純な緩衝液のバックグラウンド(例えば、水または揮発性塩)を含有する生体試料は、直接的な溶液中での消化に適しており、より複雑なバックグラウンド(例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール)は、試料分析を容易にするための追加の浄化ステップを要する。
mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号21444に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表59に列挙されるmCherry製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。
表59.mCherry製剤
おいて脾臓において観察できる差は存在しなかった。
mCherry修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化する。LNPは、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化する。mCherry製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付ける。
A.リピドイド製剤を用いたヒト細胞におけるインビトロ発現
インビトロトランスフェクションについて試験するために使用されるmmRNAとリピドイドの比を、異なるリピドイド:mmRNA比で実験的に試験する。siRNAおよびリピドイドを用いた以前の研究では、2.5:1、5:1、10:1、および15:1のリピドイド:siRNAの重量:重量比を用いていた。siRNAと比較してmmRNAの長さがより長いことを考慮すると、より低いリピドイドとmmRNAの重量:重量比が有効であり得る。さらに、比較のために、RNAIMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)またはTRANSIT−mRNA(Mirus Bio,Madison,WI)カチオン性脂質送達ビヒクルを用いたmmRNAもまた製剤化した。
製剤の全身静脈内投与を、98N12−5、C12−200、およびMD1を含むがこれらに限定されない種々の異なるリピドイドを用いて行う。
は肝臓および脾臓といった他の器官の試料において評価する。単回静脈内投与研究の実施は、所望される生成物の発現の規模、用量応答性、および有効期間の評価を可能にするであろう。
mRNAを含むオリゴヌクレオチドを筋肉内注入経路または皮下注入経路を介して送達するためにリピドイド製剤を使用することは、これまでに報告されていないため、評価する必要がある。mmRNAの筋肉内および/または皮下注入を評価して、mmRNA含有リピドイド製剤が、所望されるタンパク質の局所的および全身的発現の両方をもたらすことができるかどうかを判定する。
本明細書に記載の教示および合成方法を使用して、修飾RNAを、二機能性であり、それによって1つ以上の細胞傷害性タンパク質分子をコードし、同様に細胞傷害性ヌクレオシドを用いて合成されるように、設計および合成する。
A.逆トランスフェクション
24ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートで行われる実験については、ケラチノサイトを1×105の細胞密度で播種する。96ウェルのコラーゲンコーティング
組織培養プレートで行われる実験については、ケラチノサイトを0.5×105の細胞密度で播種する。トランスフェクトする各修飾mRNA(mmRNA)のために、記載されるように修飾mRNA:RNAIMAX(商標)を調製し、細胞が組織培養プレートに付着する前に、細胞番種期間内、例えば6時間以内に、マルチウェルプレートで細胞と混合する。
24ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートにおいて、ケラチノサイトを0.7×105の細胞密度で播種する。96ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートについては、ケラチノサイトを0.3×105の細胞密度で播種する。ケラチノサイトを、24時間にわたり、70%を上回るコンフルエンシーに成長させる。トランスフェクトする各修飾mRNA(mmRNA)のために、記載されるように修飾mRNA:RNAIMAX(商標)を調製し、細胞の播種および組織培養プレートへの付着後に、24時間にわたりマルチウェルプレートにおいて細胞にトランスフェクトする。
ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのSupplement S7を有するEPILIFE培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した300ngの化学修飾mRNA(mmRNA)を逆トランスフェクトした。別のセットのケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した300ngの修飾mRNAを順トランスフェクトした。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)の複合体は、まず、RNAを、5倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートすることによって形成する。
D.修飾mRNAの用量および持続期間:G−CSF ELISA
1回で複数の皮下または筋肉内注入部位を用いる研究を設計して実行し、mmRNAの薬物曝露を増加させ、タンパク質産生を改善する手段について調べた。発現したタンパク質産物の検出に加えて、タンパク質の生理学的機能の評価も、試験した動物に由来する試料の分析を介して判定した。
表60.分割用量研究
本発明のmmRNAの数および局在化は、単離エクソソーム中の量(初期、経時、または残留ベースで)を測定することによって判定することができる。この研究では、mmRNAが、典型的にはコドン最適化されており、配列が内因性mRNAとははっきりと異な
るため、mmRNAのレベルを、その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれるGibbingsのPCT/IB2009/005878号の方法を用いて、天然または野生型のmRNAの内因性レベルと比較して定量化する。
この実験により、ヒトケラチノサイト細胞にインビトロでトランスフェクトした、はっきりと異なる修飾mRNAの細胞生存率、細胞傷害性、およびアポトーシスを示す。ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのヒドロコルチゾンを含まないヒトケラチノサイト成長補充物質を有するEPILIFE(登録商標)培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した0ng、46.875ng、93.75ng、187.5ng、375ng、750ng、1500ng、3000ng、または6000ngの修飾mRNAを逆トランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)複合体を形成する。培養培地中に分泌されたヒトG−CSFの濃度を、各修飾mRNAの各濃度について、トランスフェクションの0、6、12、24、および48時間後に三重に測定する。トランスフェクトを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenまたはR&D SystemsからのELISAキットを用いて定量化する。
インビトロでトランスフェクションを行ったヒトケラチノサイト細胞から分泌されるヒト腫瘍壊死因子α(TNF−α)、ヒトインターフェロンβ(IFN−β)、およびヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、細胞の自然免疫応答の検出について試験する。ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのヒドロコルチゾンを含まないヒトケラチノサイト成長補充物質を有するEPILIFE(登録商標)培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。分泌されたTNF−αケラチノサイトに、記載されるように、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した0ng、93.75ng、l87.5ng、375ng、750ng、1500ng、または3000ngの化学修飾mRNA(mmRNA)を、三重に逆トランスフェクトする。培養培地中に分泌されたTNF−αを、製造業者のプロトコルに従ってInvitrogenからのELISAキットを用いて、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの24時間後に測定する。
Fの濃度を、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの24時間後に測定する。トランスフェクションを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenまたはR&D Systems(Minneapolis,MN)からのELISAキットを用いて定量化する。これらのデータは、例示的な1型サイトカインであるTNF−αおよびIFN−βを測定することによって、どの修飾mRNA(mmRNA)が、天然および他の化学修飾ポリヌクレオチドまたは参照化合物と比較して、細胞の自然免疫応答の低下を誘発することができるかを示す。
ヒトケラチノサイトを、InvitrogenからのSupplement S7を有するEPILIFE(登録商標)培地において、24ウェルのコラーゲンコーティングTRANSWELL(登録商標)(Coming,Lowell,MA)共培養組織培養プレート中で、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、記載されるように、InvitrogenからのRNAIMAXと複合体形成した、750ngの示される化学修飾mRNA(mmRNA)を逆トランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX複合体を、記載のように形成する。ケラチノサイトの培地を、トランスフェクションの6〜8時間後に交換する。トランスフェクションの42時間後に、0.4μm細孔の半透過性ポリエステル膜を有する24ウェルのTRANSWELL(登録商標)プレート挿入物を、ヒトG−CSF修飾mRNAをトランスフェクトしたケラチノサイトを含有する培養プレートに入れる。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードする、化学的にはっきりと異なるヌクレオチドから構成される修飾mRNAは、共培養環境においてトランスフェクション非コンピテント細胞の細胞増殖を刺激することができる。共培養には、ヒトケラチノサイト等の高度にトランスフェクト可能な細胞型と、白血球(WBC)等のトランスフェクション非コンピテントな細胞型とが含まれる。G−CSFをコードする修飾mRNAを、高
度にトランスフェクト可能な細胞にトランスフェクトし、G−CSFタンパク質の産生および細胞外環境への分泌を可能にし、ここで、G−CSFは、パラクリン様の方式で、G−CSF受容体を発現する白血球を刺激して増殖させるように作用する。拡大したWBC集団を使用して、免疫が低下した患者を治療するか、または免疫抑制された患者のWBC集団を部分的に再構築し、そうすることで日和見感染症の危険性を低減することができる。別の実施例では、線維芽細胞等の高度にトランスフェクト可能な細胞に、難トランスフェクト性の胚幹細胞または誘導型多能性幹細胞の成長、維持、または分化を支持および刺激する、ある特定の成長因子をトランスフェクトする。
A.ヒトIgG抗体のELISA検出
この実施例は、ヒトIgG修飾mRNA(mmRNA)をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびヒト胎児腎臓(HEK、HER−2陰性)293細胞に由来するヒトIgGのELISAについて説明する。ヒト胎児胎児腎臓(HEK)293を、InvitrogenからのL−グルタミンの補充物質を有するCD293培地において、80〜90%のコンフルエントに達するまで成長させる。CHO細胞を、L−グルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンの補充物質を有するCD CHO培地において成長させる。一態様において、2×106細胞に、7mLの培地中、Corningからの75cm2の培養フラスコにおいて、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した24μgの修飾mRNAをトランスフェクトする。別の態様では、80,000の細胞に、24ウェルプレートにおいて、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した1μgの修飾mRNAをトランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)複合体は、mmRNAを、5倍体積希釈物中、CD293またはCD CHOいずれかの培地とともに室温で10分間バイアルにおいてインキュベートすることによって形成する。第2のバイアルにおいて、RNAIMAX(商標)試薬を、10倍体積希釈物中、CD293培地またはCD CHO培地とともに室温で10分間インキュベートする。次いで、mmRNAのバイアルをRNAIMAX(商標)のバイアルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、滴下方式でCHOまたはHEK細胞に添加する。培養上清を摂氏4度で保管する。24μgのmmRNAトランスフェクションでは、培養培地中に分泌されたヒトIgGの濃度をトランスフェクションの12、24、36時間後に測定し、1μgのmmRNAトランスフェクションは、36時間で測定する。トランスフェクトしたHEK293細胞からのトラスツズマブの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってAbcam(Cambridge,MA)からのELISAキットを用いて定量化する。データは、ヒト化IgG抗体(トラスツズマブ等)のmmRNAがHEK細胞において翻訳され得ること、およびトラスツズマブが細胞から分泌され、細胞外環境に放出されることを示す。さらに、データは、分泌タンパク質の産生のためにトラスツズマブをコードするmmRNAを細胞にトランスフェクトすることが、バイオリアクターまたは大規模な細胞培養条件に拡大可能であることを示す。
ウエスタンブロットのCHO−K1細胞に、トラスツズマブ修飾mRNA(mmRNA)の重鎖および軽鎖をそれぞれ1μgずつ共トランスフェクトする。CHO細胞を、24−ウェルプレートにおいて標準的なプロトコルを用いて増殖させる。細胞上清または細胞ライセートを、トランスフェクションの24時間後に採取し、12%SDS−Pageゲルで分離させ、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるIBOT(登録商標)を用いてニトロセルロース膜上に移す。細胞を、ウサギポリクローナル抗体とDYLIGHT594(ab96904,abcam,Cambridge,MA)に接合されるヒトIgGとの第1の複合体、およびヤギポリクローナル抗体とアルカリホスファターゼと接合されるRb IgGとの第2の複合体とともにインキュベートする。インキュベーションの後、抗体を、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるNo
vex(登録商標)アルカリホスファターゼ発色基質を用いて検出する。
CHO−K1細胞に、トラスツズマブまたはリツキシマブいずれかの重鎖および軽鎖をそれぞれ10ngずつ共トランスフェクトする。細胞を、GIBCO(登録商標)(Grand Island,NY)からのF−12K培地および10%FBSにおいて増殖させる。細胞を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1% Triton X−100で5〜10分間室温で透過性にさせ、細胞を室温のPBSで3回洗浄する。トラスツズマブおよびリツキシマブの染色を、製造業者が推奨する希釈に従ってDYLIGHT(登録商標)594(ab96904,abcam,Cambridge,MA)に接合されたヒトIgGに対するウサギポリクローナル抗体を用いて行う。核DNA染色を、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのDAPI色素を用いて行う。トラスツズマブおよびリツキシマブのタンパク質は、修飾mRNAのトランスフェクション後に翻訳され、細胞質に局在化される。トランスフェクションの13時間後に写真を撮影する。
トラスツズマブおよびリツキシマブを、結合免疫ブロット検出アッセイを用いて検出する。種々の濃度(100ng/μL〜0ng/μL)のErB2ペプチド(ab40048,abeam,Cambridge,MA)、トラスツズマブおよびCD20ペプチドの抗原(ab97360,abeam,Cambridge,MA)、リツキシマブの抗原を、12%SDS−Pageゲル上で泳動させ、InvitrogenからのiBlotを用いて膜に移す。膜を、トラスツズマブまたはリツキシマブいずれかの重鎖および軽鎖をそれぞれ500ngずつ共トランスフェクトしたCHO−K1細胞からの、それぞれの細胞上清とともに1時間インキュベートする。膜を1%BSAでブロッキングし、アルカリホスファターゼ(abcam,Cambridge,MA)と接合した二次抗ヒトIgG抗体を添加する。抗体検出を、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるNOVEXアルカリホスファターゼ発色基質を用いて行う。データは、修飾mRNAから生成されたヒト化IgG抗体が、それらのそれぞれの抗原を認識し、そこに結合することができることを示す。
HER2/neu受容体を過剰発現する、ヒト乳腺癌由来の付着細胞であるSK−BR−3細胞株を使用して、修飾mRNA(mmRNA)により生成されたトラスツズマブの抗増殖特性を比較することができる。修飾mRNAから生成された種々の濃度の精製トラスツズマブおよびトラスツズマブを、細胞培養液に添加し、細胞増殖に及ぼすそれらの作用を、三連の細胞傷害性および生存率アッセイで評価する。
A.カチオン性脂質送達ビヒクル
RNAトランスフェクションを、RNAIMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)またはTRANSIT−mRNA(Mirus Bio,Madison,WI)カチオン性脂質送達ビヒクルを用いて実行する。RNAおよび試薬を、まず、Opti−MEM基本培地(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に希釈する。100ng/μLのRNAを5倍希釈し、RNA1μg当たり5μLのRNAIMaxを10倍希釈する。希釈した成分をプールし、室温で15分間インキュベートした後、培養培地に分注する。TRANSIT−mRNAのトランスフェクションについては、100ng/μLのRNAをOpti−MEM中に10倍希釈し、BOOST試薬を添加し(RNA1μg当たり2μLの濃度で)、TRANSIT−mRNAを添加し(
RNA1μg当たり2μLの濃度で)、次いで、RNA−脂質複合体を、室温で2分間インキュベートした後、培養培地に送達する。RNAのトランスフェクションは、RiPSの誘導についてはNutristem xenofree hES培地(Stemgent,Cambridge,MA)において、ケラチノサイトの実験についてはDermal Cell Basal Medium plus Keratinocyte Growth Kitを加えたDermal Cell Basal培地(ATCC)において、そしてすべての他の実験については2%FBSを加えたOpti−MEMにおいて行う。宿主細胞への修飾mRNA(mmRNA)の導入の成功は、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)等、様々な既知の方法を用いて監視することができる。修飾mRNAのトランスフェクションの成功はまた、例えば、ウエスタンブロットまたは免疫細胞化学により標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを測定することによっても判定することができる。同様の方法が、同様のRNA−脂質複合体比に従って複数リットル(5〜10,000L)の培養形式に拡大した大規模なものにも適用され得る。
エレクトロポレーションのパラメータを、MRC−5線維芽細胞にインビトロ合成修飾mRNA(mmRNA)転写物をトランスフェクトし、特に外因性転写物を検出するように設計されたプライマーを用いた定量的RT−PCRによりトランスフェクト効率を測定することによって、最適化する。2mmのギャップを有する標準的なエレクトロポレーションキュベットにおいて、Fに蓄電した150μFのコンデンサを50μLのOpti−MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に懸濁させた2.5x106の細胞に放電することは、高い生存率(70%超)を維持しながら、標準曲線法を用いて判定される細胞当たり10,000コピーを超える修飾mRNA転写物の反復送達に十分である。さらなる実験により、細胞にmmRNA転写物を効率よくトランスフェクトするために必要な電圧が、エレクトロポレーション時の細胞密度に依存し得ることが明らかになり得る。細胞密度は、1x106細胞l/50μLから2.5x106細胞/50μLの密度まで多様であり、細胞当たりの転写物コピーで測定される同様の効率で細胞をトランスフェクトするには110V〜145Vが必要である。大規模な流動エレクトロポレーション戦略に類似し、上述の制約で説明された方法に類似した大規模な複数リットル(5〜10,000L)のエレクトロポレーションを行うことができる(Li et al.2002、Geng et al.,2010)。
A.ヒトEPO修飾RNAのリポプレックス
100μgの修飾ヒトエリスロポエチンmRNA(mRNAは配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(EPO;完全修飾5−メチルシトシン;N1−メチル−シュードウリジン)を含有する製剤を、50〜70μL中30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成させ(リポプレックス−h−Epo−46;2世代目またはGen2)、4匹のC57/BL6マウスに筋肉内送達した。他の群は、100μgの修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する対照群として機能し、30体積%のRNAiMAX(商標)とリポプレックス形成したリポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)の注入を受容するマウス、または65μLの投薬量で陰性対照として製剤緩衝液の注入を受容するマウスから構成された。筋肉内注入の13時間後、血清を各マウスから採取して、ヒトEPO ELISAによりマウス血清中のヒトEPOタンパク質の量を測定し、結果を表61に示す。
表61.ヒトEPO産生(筋肉内注入経路)
修飾ヒトG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(G−CSF)または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(G−CSF−N1)の2つの形態のうちの1つを100μg含有する製剤を、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成させ、C57/BL6マウスに、150μLを筋肉内(I.M)、150μLを皮下(S.C)、および225μLを静脈内(I.V)送達した。
表62.血清中のヒトG−CSF(I.M.、I.V.、S.C.注入経路)
5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾を有する30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen1−リポプレックス)、生理食塩水中の5mcおよびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen1−生理食塩水)、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成したN1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen2−リポプレックス)、生理食塩水中のN1−5mcおよびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen2−生理食塩水)、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した5mcおよびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼ(Luc−リポプレックス)、または生理食塩水中の5mcおよびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼmRNA(Luc−生理食塩水)のいずれかを100μg含有する製剤を、筋肉内(I.M.)または皮下(S.C.)送達し、各投与方法の対照群には、80μLの用量の製剤緩衝液(F緩衝液)をC57/BL6マウスに与えた。注入の13時間後に、注入部位からの血清および組織をマウスから採取し、G−CSF ELISAによって分析して、ヒトG−CSFタンパク質レベルを比較した。筋肉内投与から得られたマウス血清中のヒトG−CSFタンパク質の結果、および皮下投与の結果を、表63に示す。
表63.マウス血清におけるヒトG−CSFタンパク質
筋肉内および皮下投与
30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)または生理食塩水中の修飾mCherry mRNAのいずれかを100μg含有する製剤を、マウスに筋肉内および皮下送達する。製剤緩衝液も、筋肉内または皮下のいずれかで対照マウス群に投与する。マウスへの注入部位を、切片化のために注入の17時間後に採取して、タンパク質の産生
に関与する細胞型(複数可)を判定する。
RNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA、製剤緩衝液中の修飾mCherry mRNA、RNAMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ルシフェラーゼmRNA、製剤緩衝液中の修飾ルシフェラーゼのいずれかを10μg含有する製剤を、5μL/眼の投薬量でラットに硝子体内注入(IVT)により投与することができる。製剤緩衝液も、5μL/眼の投薬量で対照ラット群にIVTにより投与する。処理を受けたラットの眼を、切片化および溶解のために注入の18時間後に採取して、mmRNAが、インビボで眼に効果的に送達され、タンパク質産生をもたらし得るかどうかを判定し、さらに、インビボでのタンパク質の産生に関与する細胞型(複数可)を判定することができる。
30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA、生理食塩水中の修飾mCherry mRNA、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ルシフェラーゼmRNA、または生理食塩水中の修飾ルシフェラーゼmRNAのいずれかを100μg含有する製剤を、鼻腔内送達する。製剤緩衝液も対照群に鼻腔内投与する。点滴注入の約13時間後に、切片化(mCherry mRNAを受容したものについて)または均質化(ルシフェラーゼmRNAを受容したものについて)のために肺を採取することができる。これらの試料を用いて、mmRNAが、インビボで肺に効果的に送達され、タンパク質産生をもたらし得るかどうかを判定し、さらに、インビボでのタンパク質の産生に関与する細胞型(複数可)を判定することができる。
修飾mRNAを、C57/BL6マウスに送達して、種々の脂質比および結果として得られるタンパク質発現を評価した。10%、30%、もしくは50%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した100μgの修飾ヒトEPO mRNA(mRNAは配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)、10%、30%、もしくは50%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した100μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液の製剤を、単回70μL用量で、マウスに筋肉内投与した。血清を、注入の13時間後に採取し、ヒトEPO ELISAを行って、各マウスにおけるヒトEPOタンパク質レベルを判定した。表64に示されるヒトEPO ELISAの結果は、筋肉内で発現された修飾ヒトEPOが、異なる割合のRNAIMAX(商標)のそれぞれについて、血清中に分泌されることを示す。
表64.マウス血清中のヒトEPOタンパク質(IM注入経路)
製剤緩衝液中に製剤化された修飾ヒトEPO mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、C57/BL6マウスまたはスプラーグドーリーラットのいずれかに送達して、ヒトEPO産生への用量依存性を評価した。ラットに、表65の投薬表に記載されるように、50μLの修飾ヒトEPO mRNA(h−EPO)、修飾ルシフェラーゼmRNA(Luc)(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号121446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内注入した。
表65.ラット研究
表66.マウス研究
製剤緩衝液中に製剤化された修飾ヒトEPO mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、スプラーグドーリーラットに送達して、用量応答の持続期間を判定した。ラットに、表67の投薬表に記載されるように、50μLの修飾ヒトEPO mRNA(h−EPO)、修飾ルシフェラーゼmRNA(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)(Luc)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内注入した。ラットに、筋肉内注入の2、6、12、24、48、および72時間後に採血を行って、所与の時点での血清中のヒトEPOの濃度を判定した。この研究についてのpg/mL単位での平均および幾何平均も表67に示す。
表67.投薬表
さらなる研究を行って、異なる投与経路を使用した投薬について調べた。実施例35に
概説したプロトコルに従って、1群当たり4匹のマウスに、表68に概説される投薬表に従って筋肉内(I.M.)、静脈内(IV)、または皮下(S.C.)投薬を行った。血清を注入の13時間後にすべてのマウスから採取し、組織を筋肉内および皮下投与群の注入部位から採取し、脾臓、肝臓、および腎臓を静脈内群から採取した。筋肉内群および皮下群からの結果を、表69に示す。
表68.投薬表
表69.マウス血清中のヒトEPOタンパク質(I.M.注入経路)
A.修飾RNA reLNPの製剤化
合成脂質、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、コレステロール(Sigma−Aldrich,Taufkirchen,Germany)、およびα−[3’−(1,2−ジミリストイル−3−プロパノキシ)−カルボキサミド−プロピル]−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン(PEG−c−DOMG)(NOF,Bouwelven,Belgium)の溶液を調製し、−20℃で保管する。合成脂質は、内部エステルを有するDLin−DMA、末端エステルを有するDLin−DMA、DLin−MC3−DMA−内部エステル、および末端エステルを有するDLin−MC3−DMAから選択される。reLNPを、50:10:38.5:1.5(reLNP:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)のモル比が得られるように合わせる。脂質溶液と修飾mRNA溶液とを10:1、15:1、20:1、および30:1の総脂質対修飾mRNAの重量比で合わせることによって、reLNPおよび修飾mRNAの製剤を調製する。
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を用いて、修飾mRNAナノ粒子の粒径、多分散指標(PDI)、およびゼータ電位を、粒径の判定時は1倍PBS中、およびゼータ電位の判定時は15mM PBS中において、判定する。
ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)および肝細胞癌上皮(HepG2)細胞(LGC standards GmbH,Wesel,Germany)を、96ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種し、HEK293細胞のプレートを、1型コラーゲンで事前コーティングする。100μLの細胞培養培地中、HEK293は1ウェル当たり約30,000の細胞密度、HepG2は約35,000の細胞密度で、播種する。mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、細胞を播種した直後に添加し、インキュベートする。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するmCherry cDNAを、配列番号21440に示す。
マウスに、修飾mRNAおよびreLNPを含有する製剤の単回用量を静脈内投与する。マウスに投与する修飾mRNAは、G−CSF(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、第IX因子(mRNAは配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、またはmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)から選択される。
ヒト血管内皮成長因子アイソフォームA(VEGF−A)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号1672に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、24マルチウェルプレートにおいて、逆トランスフェクションを介してヒトケラチノサイト細胞にトランスフェクトした。ヒトケラチノサイト細胞を、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのSupplemen
t S7を有するEPILIFE(登録商標)培地において、50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞に、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのRNAIMAX(商標)と複合体形成した、0、46.875、93.75、187.5、375、750、および1500ngのVEGF−Aをコードする修飾mRNA(mmRNA)をトランスフェクトした。RNA:RNAIMAX(商標)複合体は、まず、RNAを、5倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートすることによって形成した。第2のバイアルにおいて、RNAIMAX(商標)試薬を、10倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルをRNAIMAX(商標)のバイアルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、滴下方式で細胞に添加した。
表70.VEGF−Aの投薬およびタンパク質の分泌
製剤緩衝液中に製剤化したヒト第IX因子mmRNA(Gen1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、筋肉内注入を介してマウスに送達した。結果は、投与の13時間後に測定したとき、血清中の第IX因子タンパク質が上昇していたことを示す。
Gen1またはGen2(5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾、G−CSF−Gen1;またはN1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾、G−CSF−Gen2)のいずれかとして修飾された、製剤緩衝液中に製剤化されたヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、筋肉内(IM)または皮下(SC)注入を介してマウスに送達した。3日間(24時間間隔)、1日4用量または2×50μg(2つの部位)の注入を行った。4用量は、血液採取およびCBC分析の6時間前に投与した。対照には、ルシフェラーゼ(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号121446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液(F緩衝液)が含まれた。マウスに、1回目のmRNA注入の72時間後(最後の修飾mRNA投薬の6時間後)に採血を行って、好中球数に対するmRNAにコードされるヒトG−CSFの作用を判定した。投薬レジメンを表71に示し、結果として得られた好中球数も同様に示す(1000単位/μL)。表71において、アスタリスク(*)は、p<0.05での統計的有意性を示す。
表71.投薬レジメン
5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾(Gen1)で修飾されたか、または修飾を有さない、10%リポプレックス(RNAiMax)中に製剤化されたヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、50μgのRNAの用量および100μL体積で静脈内(IV)注入を介して、0、2、および4日目にマウスに送達した。好中球を、1、5、および8日目に測定した。対照には、非特異的哺乳動物RNAまたは製剤緩衝液単独(F緩衝液)が含まれた。マウスに、1、5、および8日目に採血を行って、好中球数を増加させる修飾mRNAによりコードされるヒトG−CSFの作用を判定した。投薬レジメンを表72に示し、結果として得られた好中球数も同様に示す(1000単位/μL、K/μL)。
経路を通じて送達した場合に、生物学的に活性であり得ることを示す。他の細胞サブセットは、有意に変化されなかった。同様に投与された未修飾G−CSF mRNAは、好中球数に対する薬理学的効果を示さなかった。
表72.投薬レジメン
A.タンパク質発現
ヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)とヒトEPO mmRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、G−CSF修飾mRNA(5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)で修飾)とEPO修飾mRNA(N1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾で修飾)を、製剤緩衝液(150mMの塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMのリン酸塩、0.5mMのEDTA、pH6.5で)中で製剤化し、100μgの用量で筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)または製剤緩衝液(F緩衝液)が含まれた。マウスに、注入の13時間後に採血を行って、pg/mL単位で血清中のヒトポリペプチドの濃度を判定した。(G−CSF群では、マウス血清中のヒトG−CSFを測定し、EPO群では、マウス血清中のヒトEPOを測定した)。データを表73に示す。
表73.投薬レジメン
ヒトEPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、製剤緩衝液中に製剤化し、筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
表74.投薬レジメンおよび発現
1回で複数の筋肉内注入部位を用いる研究を設計し、実行した。
表75.複数回用量研究
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードするmmRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の複数の変異体を、修飾ヌクレオチドシュードウリジンおよび5−メチルシトシン(シュード−U/5mC)を用いて合成した。これらの変異体には、野生型N末端分泌シグナルペプチド配列(MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA;配列番号95)、または非分泌シグナルペプチド配列、または他のmRNAから得た分泌シグナルペプチド配列のいずれかをコードするG−CSF構築物が含まれた。これらは、野生型G−CSFシグナルペプチド配列がヒトα−1−抗トリプシン(AAT)(MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA;配列番号94)、ヒト第IX因子(FIX)(MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR;配列番号96)、ヒトプロラクチン(Prolac)(MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP;配列番号97)、またはヒトアルブミン(Alb)(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR;配列番号98)のいずれかのシグナルペプチド配列で置換された配列を含んでいた。
表76.シグナルペプチド交換
A.PBMCの単離および培養
2人のドナーに由来する50mLのヒト血液を、ヘパリンナトリウム管で、Research Blood Components(ロットKP30928およびKP30931)から受容した。各ドナーについて、血液をプールし、DPBS(SAFC Bioscience 59331C、ロット071M8408)で70mLに希釈し、2つの50mLの円錐管に等分した。10mLのFicoll Paque(GE Healthcare 17−5442−03、ロット10074400)を、血液層の下に静かに分注した。管を2000rpmで30分間、低加速および制動で遠心分離した。管を除去し、軟膜PBMC層を、新しい50mLの円錐管に静かに移し、DPBSで洗浄した。管を1450rpmで10分間遠心分離した。
ヒトG−CSFをコードするmmRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)((1)天然のNTP、(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または(3)5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換いずれかを含有、ルシフェラーゼをコードするmmRNA(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は 配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)((1)天然のNTPまたは(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換のいずれかを含有)、ならびにTLRアゴニストR848(Invivogen tlrl−r848)を、最終体積2500μLのOptimem I中、38.4ng/μLに希釈した。
11668−027、ロット1070962)を、13.1mLのOptimem Iで希釈した。96ウェルプレートにおいて、各mmRNA、陽性対照(R−848)、または陰性対照(Optimem I)の9個の135μLアリコートを、135μLの希釈Lipofectamine 2000に添加した。トランスフェクトされる物質を含有するプレートを20分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、1ウェル当たり50μLでそれぞれのヒトPBMCに移した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。2、4、8、20、および44時間で、各プレートをインキュベーターから取り出し、上清を凍結させた。
コードされたタンパク質を産生する未修飾および修飾mRNA(mmRNA)の能力を経時的に評価し(G−CSF産生)、インターフェロンα産生により測定される自然免疫認識を引き起こすmRNAの能力も同様に評価した。インビトロPBMC培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定する一般的な方法である(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)。
表77.G−CSFシグナル
表78.IFN−αシグナル
化学修飾5−メチルシトシンおよびシュードウリジン等であるがこれらに限定されない修飾ヌクレオチドは、哺乳動物細胞において、自然免疫応答を低下させ、RNAの発現を増加させることが示されている。驚くべきことであり、またこれまでに知られていないことには、化学修飾の量が100%未満である場合、化学修飾が呈する効果を滴定することができる。以前は、完全な修飾が、化学修飾の有益な効果を誘発するのに必要かつ十分であり、mRNAの100%未満の修飾は、効果がほとんどないと考えられていた。しかしながら、今では、化学修飾の利益が、完全に満たない修飾により誘導され得、その効果は、標的、濃度、および修飾に依存することが示された。
960ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾されたG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.8μLのLipofectamine 2000を用いて3人の正常な血液ドナー(D1、D2、D3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが50%修飾、25%修飾、10%修飾、5%修飾、1%修飾、もしくは0.1%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であ
るルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードUで完全に修飾)もG−CSF発現について分析した。TNF−αおよびIFN−αの対照試料であるLipofectamine2000、LPS、R−848、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードで完全に修飾)、およびP(I)P(C)も分析した。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現を判定した。G−CSFの発現を表79に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表80に示す。IFN−αおよびTNF−αの発現は、G−CSF mRNAのトランスフェクションによる二次的影響であり得る。表79および80は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSF、IFN−α、およびTNF−αの化学修飾の量を滴定することができ、滴定可能傾向は各対象で同じではないことを示す。
表79.G−CSF発現
表80.IFN−αおよびTNF−αの発現
ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細胞を、100μLの細胞培養培地中、1ウェル当たり30,000細胞の密度で、96ウェルプレートに播種した。RNAiMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて製剤化された250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、ウェルに添加した。G−CSFを、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが75%修飾、50%修飾、もしくは25%修飾を含有するように、5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料(AK 5/2、mCherry(配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードUで完全に修飾)、ならびに未処理)もまた分析した。5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNAの半減期は、約8〜10時間である。上清を16時間後に収集し、分泌されたタンパク質をELISAによって分析する。表81は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSFの化学修飾の量を滴定することができることを示す。
表81.G−CSF発現
修飾RNAを、C57/BL6マウスに筋肉内、皮下、または静脈内送達し、ルシフェラーゼを用いて修飾RNAの生体分布を評価した。すべての送達方法で使用した製剤緩衝液は、150mMの塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMのNa+−リン酸塩(1.4mMの一塩基リン酸ナトリウムおよび0.6mMの二塩基リン酸ナトリウムを含む)、ならびに0.5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有し、水酸化ナトリウムを用いて最終pH6.5に達するように調節した後、濾過して滅菌した。1倍濃度を送達緩衝液として用いた。マウスに送達するリポプレックス化溶液を作製するために、1つのバイアルにおいて、50μgのRNAを室温で10分間送達緩衝液中で平衡化させ、2つ目のバイアルでは10μLのRNAiMAX(商標)を室温で10分間送達緩衝液中で平衡化させた。平衡化の後、バイアルを合わせ、100μLの最終体積に達するまで送達緩衝液を添加し、これを、次いで室温で20分間インキュベートした。ルシフェリンを、150mg/kgで各マウスに腹腔内注入(IP)で投与した後、ルシフェリン曝露曲線のプラトー期の間に撮像し、これは15〜30分間であった。ルシフェリンを作製するために、1gのD−ルシフェリンカリウムまたはナトリウム塩を、Mg2+またはCa2+を含有しない66.6mLの蒸留リン酸緩衝溶液(DPBS)中に溶解して、15mg/mLの溶液を得た。溶液を静かに混合し、0.2μmのシリンジフィルタを通した後、窒素パージを行い、アリコート化し、可能な限り光を遮断しながら−80℃で保管した。投薬の日に、温浴を用いて溶液を解凍し、ルシフェリンが溶解されていなかった場合
は静かに混合し、氷上に保った。
マウスに、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたリポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は 配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、リポプレックス化修飾顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)(リポプレックス−サイトカイン)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について50μLの注入量で50μgの単回修飾RNA用量で右後肢に、50μLの注入量で5μgの単回修飾RNA用量で左後肢に、筋肉内(I.M.)投与した。投薬の2、8、および24時間後の各群のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表82に示す。生物発光は、注入部位において、リポプレックス含有および非含有の5μgおよび50μgの修飾RNA製剤の陽性シグナルを示した。
表82.インビボ生物光子撮像(I.M.注入経路)
マウスに、修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)、リポプレックス化修飾G−CSF mRNA(リポプレックス−G−CSF)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について100μLの注入量で50μgの単回修飾mRNA用量で皮下(S.C.)投与
した。投薬の2、8、および24時間後の各群のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表83に示す。生物発光は、注入部位で、リポプレックス含有および非含有の5μgおよび50μgの修飾mRNA製剤の陽性シグナルを示した。
表83.インビボ生物光子撮像(S.C.注入経路)
マウスに、修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)、リポプレックス化修飾G−CSF mRNA(リポプレックス−G−CSF)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について100μLの注入量で50μgの単回修飾mRNA用量で静脈内(I.V.)投与した。投薬の2時間後の各群からの脾臓のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表84に示す。生物発光は、脾臓において、リポプレックスを含有する50μgの修飾mRNA製剤の陽性シグナルを示した。
表84.インビボ生物光子撮像(I.V.注入経路)
緩衝溶液中のG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;N1−シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)または第IX因子修飾mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;N1−シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)を、表85に記載されるように、50μLの注入量で、ラット1匹当たり200μgの修飾mRNA用量でラットに筋肉内投与する(n=5)。修飾mRNAは、1〜2日間水中で凍結乾燥させる。次いで、以下に列挙される緩衝液中で6mg/mLの目標濃度に再構築する。濃度は、OD 260によって判定する。試料を、投薬前に適切な緩衝液中で4mg/mLに希釈する。
表85.緩衝液投薬群
スプラーグドーリーラット(n=8)に、28日間にわたり8回(週2回)静脈内注入を行う。ラットに、脂質ナノ粒子中に製剤化された0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg、または0.0005mg/kgのルシフェラーゼ修飾mRNAのヒトG−CSF修飾mRNA、生理食塩水中の0.5mg/kgのヒトG−CSF修飾mRNA、脂質ナノ粒子中に製剤化された0.2mg/kgのヒトG−CSFタンパク質Neupogenまたは翻訳可能でないヒトG−CSF修飾mRNAを、注入する。血清を、既定の時間間隔で採取して、G−CSFタンパク質発現(その週の1回目の投薬の8、24、および72時間後)、全血球数および白血球数(その週の1回目の投薬の24
および72時間後)、ならびに臨床化学(その週の1回目の投薬の24および72時間後)を評価する。ラットを、最後の投薬の4日後である29日目に屠殺して、全血球数、白血球数、臨床科学、タンパク質発現を評価し、組織病理学および解剖により主要器官への作用を評価する。さらに、29日目に、マウスに抗体アッセイを行った。
ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPを、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−DMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表86に示されるように、ルシフェラーゼLNP製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。
表86.ルシフェラーゼ製剤
表87.ルシフェラーゼ製剤
表88.ルシフェラーゼ発現
表89.組織のルシフェラーゼ発現
A.PBMCの単離および培養
2人のドナーに由来する50mLのヒト血液を、ヘパリンナトリウム管で、Research Blood Components(ロットKP30928およびKP30931)から受容した。各ドナーについて、血液をプールし、DPBS(SAFC Bioscience 59331C、ロット071M8408)で70mLに希釈し、2つの50mLの円錐管に等分した。10mLのFicoll Paque(GE Healthcare 17−5442−03、ロット10074400)を、血液層の下に静かに分注した。管を2000rpmで30分間、低加速および制動で遠心分離した。管を除去し、軟膜PBMC層を、新しい50mLの円錐管に静かに移し、DPBSで洗浄した。管を1450rpmで10分間遠心分離した。
ェル組織培養処理丸底プレート(Costar 3799)に播種した。30分以内に、トランスフェクション混合物を1ウェル当たり50μLの量で各ウェルに添加した。トランスフェクションの4時間後、培地に10μLのウシ胎児血清(Gibco 10082、ロット1012368)を補充した。
ヒトG−CSFをコードする修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)((1)天然のNTP、(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または(3)5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換のいずれかを含有、ルシフェラーゼをコードするmRNA(IVT cDNA配列は配列番号21445に示される;mRNA配列は配列番号21446に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)((1)天然のNTPまたは(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで100%置換のいずれかを含有)、ならびにTLRアゴニストR848(Invivogen tlrl−r848)を、最終体積2500μLのOptimem I中、38.4ng/μLに希釈した。
11668−027、ロット1070962)を、6.76mLのOptimem Iで希釈した。96ウェルプレートにおいて、各mRNA、陽性対照(R−848)、または陰性対照(Optimem I)の9個の135μLアリコートを、135μLの希釈Lipofectamine 2000に添加した。トランスフェクトされる物質を含有するプレートを20分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、1ウェル当たり50μLでそれぞれのヒトPBMCに移した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。2、4、8、20、および44時間で、各プレートをインキュベーターから取り出し、上清を凍結させた。
コードされたタンパク質を産生する未修飾および修飾mRNAの能力を経時的に評価し(G−CSF産生)、インターフェロンα産生により測定される自然免疫認識を引き起こすmRNAの能力も同様に評価した。インビトロPBMC培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定する一般的な方法である(Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)。
1−メチル−シュードウリジンでの100%置換を含有するG−CSF mRNAで見られることを示した。G−CSFの産生は、5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAの使用により、5−メチルシチジンおよびシュードウリジン修飾mRNAと比較して有意に増加した。
表90.G−CSF
表91.IFN−αおよびTNF−α
表92.G−CSFとサイトカインの比率
480ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾したG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3
)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが75%修飾、50%修飾、もしくは25%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であるルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードUで完全に修飾)もG−CSF発現について分析した。TNF−αおよびIFN−αの対照試料であるLipofectamine2000、LPS、R−848、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードで完全に修飾)、およびP(I)P(C)も分析した。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現を判定した。G−CSFの発現を表93に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表94に示す。IFN−αおよびTNF−αの発現は、G−CSF mRNAのトランスフェクションによる二次的影響であり得る。表93および94は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSF、インターフェロンα(IFN−α)、および腫瘍壊死因子α(TNF−α)の化学修飾の量を滴定することができ、滴定可能傾向は、各対象で同じではないことを示す。
表93.G−CSF発現
表94.IFN−αおよびTNF−αの発現
表95.PC比および修飾率の影響
500ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾したG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが50%修飾、25%修飾、10%修飾、5%修飾、1%修飾、もしくは0.1%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であるmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードウリジンで完全に修飾)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(対照G−CSF)、ならびに未処理対照も、G−CSF、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、およびインターフェロンα(IFN−α)の発現について分析した。上清を、トランスフェクションの6時間後および18時間後に収集し、ELISAを実行してタンパク質発現を判定した。ドナー1のG−CSF、IFN−α、およびTNF−αの発現を表96に示し、ドナー2を表97に示し、ドナー3を表98に示す。
ヒトPBMCドナーにわたり、最も高いタンパク質翻訳(G−CSF)および産生される最も少ない量のサイトカインをもたらした。修飾の量を減少させることにより、より高いサイトカイン産生(IFN−αおよびTNF−α)がもたらされ、したがって、サイトカインを減少させ、タンパク質翻訳を向上させるためには、(本明細書においてG−CSF産生により証明されるように)完全な修飾が重要であることがさらに強調される。
表96.ドナー1
表97.ドナー2
表98.ドナー3
A.単一のトランスフェクション
ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下、37℃で、10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)において増殖させた。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり300,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。キャップ0を有するか、キャップ1を有するか、またはキャップを有さない5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)か、あるいは5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000(Invitrogen、カタログ番号11668−019)を用いてトランスフェクトした。対照試料であるポリI:C(PIC)、Lipofectamine 2000(Lipo)、天然ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、および天然G−CSF mRNAもトランスフェクトした。細胞を18時間後に収集し、全RNAを単離し、製造業者のプロトコルに従ってRNeasyマイクロキット(カタログ番号74004)を用いてDNASE(登録商標)処理した。100ngの全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(カタログ番号4368814)を用いてcDNA合成に使用した。次いで、cDNAを、製造業者のプロトコルに従ってBiorad
CFX 384機器においてSybrGreenを用いた定量的リアルタイムPCRによって自然免疫応答遺伝子の発現について分析した。表99は、ハウスキーピング遺伝子HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシトランスフェラーゼ(hypoxanthine
phosphoribosytransferase))と比較した自然免疫応答転写物の発現レベルを示し、これは、HPRTと比較した倍誘導として表される。この表で、標準的測定基準のパネルには、次のものが含まれる:RIG−Iはレチノイン酸誘導遺伝子1であり、IL6はインターロイキン−6であり、OAS−1はオリゴアデニル酸シンターゼ1であり、IFNbはインターフェロンβであり、AIM2はメラノーマ−2の不在であり、IFIT−1はテトラリコペプチド反復を有するインターフェロン誘導型タン
パク質1であり、PKRはタンパク質キナーゼRであり、TNFaは腫瘍壊死因子αであり、IFNaはインターフェロンαである。
表99.自然免疫応答転写物レベル
ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下、37℃で、10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)において増殖させた。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり300,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。未修飾、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番
号21438に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従って5日間毎日トランスフェクトした。対照試料であるLipofectamine 2000(L2000)およびmCherry mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に修飾)も5日間毎日トランスフェクトした。結果を表100に示す。
表100.サイトカイン応答
インビボタンパク質産生およびインビボサイトカイン応答に対するmRNAの様々な化学修飾の重要性を区別する目的で、雌BALB/Cマウス(n=5)に、5’キャップがキャップ1であるG−CSF mRNA(G−CSF mRNA未修飾)(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された5’キャップありのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1pU)もしくは5’キャップなしのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1 pUキャップなし)、またはR848もしくは5%ショ糖のいずれかである対照を、表101に記載されるように、筋肉内注入する。
表101.投薬表
雌BALB/Cマウス(n=5)に、5’キャップがキャップ1であるG−CSF mRNA(G−CSF mRNA未修飾)(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された5’キャップを有するG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1pU)もしくは5’キャップなしのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1 pUキャップなし)、またはR848もしくは5%ショ糖のいずれかである対照を、表102に記載されるように、筋肉内注入した。血液を投薬の8時間後に採取し、ELISAを用いてG−CSFおよびインターフェロン−α(IFN−α)のタンパク質レベルをELISAによって判定し、表102に示す。
表102.血清中のヒトG−CSFおよびマウスIFN−α
修飾mRNAのタンパク質産生を、修飾G−CSF mRNAまたは修飾第IX因子mRNAを雌スプラーグドーリーラット(n=6)に送達することによって評価した。ラットに、5%ショ糖中の凍結乾燥形態から再構築した、100μL中400μgの5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(G−CSF Gen1)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF Gen2)、または5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(第IX因子Gen1)を注入した。血液を注入の8時間後に採取し、血清中のG−CSFタンパク質レベルをELISAによって測定した。表103は、8時間後の血清中のG−CSFタンパク質レベルを示す。
表103.ラット血清におけるG−CSFタンパク質(I.M.注入経路)
A.PBMCにおけるインビトロスクリーニング
表104および105に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、500ngのG−CSF(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリ
A尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて3人の正常な血液ドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。対照試料であるLPS、R848、P(I)P(C)、およびmCherry(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)もまた分析した。上清を収集し、G−CSFタンパク質発現、ならびにサイトカインインターフェロンα(IFN−α)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)の誘導を判定するためにELISAによって分析するまで凍結保存した。G−CSFのタンパク質発現を表104に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表105に示す。
表104.化学修飾およびG−CSFタンパク質発現
表105.化学修飾およびサイトカイン発現
トランスフェクションの前日に、20,000のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を、5%CO2雰囲気下で一晩、37oGで成長させた。翌日、表106に記載の化学修飾を有する83ngのルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。
た各化学組成を、表106に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy
H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
表106.ルシフェラーゼの相対発光量
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表107に列挙される化学修飾で修飾し、滅菌のヌクレアーゼ不含水中で10μL中250ngの最終量に希釈した。希釈したルシフェラーゼを、40・kの新たに調製したウサギ網状
赤血球ライセートに添加し、インビトロ翻訳反応を、乾式加熱ブロックにおいて30℃で標準的な1.5mLのポリプロピレン反応管(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中で行った。翻訳アッセイを、製造業者の指示に従ってRabbit Reticulocyte Lysate(ヌクレアーゼ処理)キット(Promega,Madison,WI)を用いて行った。反応緩衝液に、提供されたロイシンまたはメチオニンのいずれかが欠けたアミノ酸ストック溶液の1対1混合物を補充し、結果的に両方のアミノ酸を十分な量で含有する反応混合物が効果的なインビトロ翻訳を行えるようにした。
表107.ルシフェラーゼの相対発光量
A.G−CSF修飾mRNAのインビボスクリーニング
Balb−Cマウス(n=4)に、表108に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、各脚に筋肉内注入する。対照であるルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)およびPBS対照もまた試験する。8時間後に血清を採取して、ELISAによりG−CSFタンパク質レベル、サイトカインレベルを判する。
表108.G−CSF
Balb−Cマウス(n=4)に、表109に概説される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された42〜103μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を含有する200μLを皮下注入した。PBS対照もまた試験した。修飾ルシフェラーゼmRNAの投薬量も表109に概略説明する。投薬の8時間後に、マウスを撮像してルシフェラーゼ発現を判定した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。
表109.ルシフェラーゼスクリーニング
Balb−Cマウス(n=4)に、表110に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された100μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を200μL皮下注入した。PBS対照もまた試験した。投薬の8時間後に、マウスを撮像してルシフェラーゼ発現を判定した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。
表110.ルシフェラーゼスクリーニングの組み合わせ
ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下において37℃で10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)で成長させる。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり130,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種する。5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)か、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000(Invitrogen、カタログ番号11668−019)を用いてトランスフェクトする。対照試料であるLipofectamine 2000および未修飾G−CSF mRNA(天然のG−CSF)もトランスフェクトする。細胞は、5日間連続でトランスフェクトする。トランスフェクション複合体を、各回のトランスフェクションの4時間に取り出す。
る。細胞を、初回トランスフェクションの6時間および18時間後に、ならびにその後は1日おきに、CELL TITER GLO(登録商標)(Promega、カタログ番号G7570)用いて生存率について分析する。収集した細胞と同時に、全RNAを単離し、製造業者のプロトコルに従ってRNAEASYマイクロキット(カタログ番号74004)を用いてDNASE(登録商標)で処理する。100ngの全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(Applied Biosystems、カタログ番号4368814)を用いてcDNA合成に使用する。次いで、cDNAを、製造業者のプロトコルに従ってBiorad CFX 384機器においてSybrGreenを用いて定量的リアルタイムPCRによって自然免疫応答遺伝子の発現について分析する。
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)およびG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、前述のように野生型T7ポリメラーゼを用いて表111〜114に列挙される異なる化学組成および化学組成の組み合わせで完全に修飾した。
表111.ルシフェラーゼのインビトロ転写化学組成
表112.ルシフェラーゼ修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
表113.G−CSF修飾mRNAのインビトロ転写化学組成および収量
表114.G−CSF修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)およびG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて表115〜118に列挙される異なる化学組成および化学組成の組み合わせで完全に修飾した。
表115.ルシフェラーゼ修飾mRNAのインビトロ転写化学組成および収量
表116.ルシフェラーゼ修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
表117.G−CSF修飾mRNAインビトロ転写化学組成および収量
表118.G−CSF修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表119の化学組成で完全に修飾された形態として生成し、変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて転写した。2’フルオロ含有mRNAをDurascribe T7を用いて作製したが、2’Oメチル含有mRNAはDurascribe T7を用いて転写することができなかった。
press)。
し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。インビトロ翻訳反応物の量を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える相対発光量(RLU)が検出されなくなるまで調節または希釈し、各化学組成に対するRLUを表120に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約160の相対発光量であった。
表119.HeLa細胞
表120.ウサギ網状ライセート
他の修飾と組み合わせた2’フルオロ修飾mRNAの使用を評価するために、一連のmRNAを、実施例75に記載されるように、野生型T7ポリメラーゼ(フルオロ不含化合物)または変異体T7ポリメラーゼ(フルオロ(fluyoro)含有化合物)のいずれかを用いて転写した。すべての修飾mRNAを、HeLa細胞におけるインビトロトランスフェクションによって試験した。
H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
表121.ルシフェラーゼ
第2のオープンリーディングフレームに関連して、すべての異なる化学修飾の活性を評価するために、ルシフェラーゼmRNA、ヒトG−CSF mRNAを用いて既に行った実験を再現した。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、野生型T7ポリメラーゼ(すべてのフルオロ不含化合物)または変異体T7ポリメラーゼ(すべてのフルオロ含有化合物)を用いて、表122および123の化学組成で完全に修飾した。変異体T7ポリメラーゼは、市販入手した(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)。
表122.G−CSF発現
表123.HeLa細胞における組み合わせ化学組成
以下に列挙される表(表124〜126)は、前述の実施例に提示された様々な化合物を用いたインビトロおよびインビトロのスクリーニングデータの大部分を要約する。良好な相関性が、細胞に基づく翻訳アッセイと細胞不含の翻訳アッセイとの間に存在する。同じ化学置換は、通常、ルシフェラーゼまたはG−CSF mRNAについて試験したかにかかわらず、良好な一致性を示す。最後に、N1−メチル−シュードウリジン含有mRNAは、インビトロおよびインビボで、検出可能なサイトカイン刺激をほとんどまたは全く伴わずに、非常に高いレベルのタンパク質発現を示し、インビトロおよびインビボの両方で、シュードウリジンを含有するmRNAよりも優れている。
e(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて評価した。
表124.天然
表125.非天然
って判定する;G−CSF PBMCに言及する際、「++++」は6,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+++」は3,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「++」は1,500pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+」は300pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+/−」は150〜300pg/mLのG−CSFを意味し、バックグラウンドは約110pg/mLであった;サイトカインPBMCに言及する際、「++++」は1,000pg/mLを上回るインターフェロンα(IFN−α)を意味し、「+++」は600pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「++」は300pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「+」は100pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「−」は100pg/mL未満を意味し、バックグラウンドは約70pg/mLであった;「WT」は野生型T7ポリメラーゼをさし、「MT」は変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を指し、「NT」は未試験を意味する。
表126.組み合わせの化学組成
G−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1に示されない)の自然免疫応答を誘起する能力を、インターフェロン−α(IFN−α)および腫瘍壊死因子−α(TNF−α)産生を測定することによって判定した。インビトロPBMC培養の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激可能性を測定する一般的な方法であり(Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)、トランスフェクション方法を本明細書に記載する。特異的ELISAによって測定した経時的なインターフェロン−α(IFN−α)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)産生の2または3人の別個のPBMCドナーからの平均を表127に示す。対照のR848、P(I)P(C)、LPS、およびLipofectamine 2000(L2000)も分析した。
表127.IFN−αおよびTNF−α
5’非翻訳領域(UTR)は、隣接領域として提供され得る。複数の5’UTRは、隣接領域に含まれ得、同一または異なる配列であり得る。隣接領域の任意の部分(隣接領域を含なまい任意の部分を含む)は、コドン最適化され得、それらのいずれかは、独立して、コドン最適化の前および/または後に1つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。
A.ルシフェラーゼPLGAマイクロスフェアの合成および特徴付け
5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%および5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%修飾されたか、N1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはシュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、1倍TE緩衝液中で再構築し、次いでPLGAマイクロスフェア中で製剤化した。PLGAマイクロスフェアを、PLGAエステルキャップ(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、4mg/mLのTE緩衝液(W1)中の0.4mLのmRNAを、200mg/mLのPLGAの濃度で、ジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax Homogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを250mLの1%のPVA(W2)に添加し、速度5(約19,000rpm)で1分間均質化させた。製剤をそのまま3時間撹拌させ、次いで、100μmのナイロンメッシュ篩(Fisherbrand Cell Strainer、カタログ番号22−363−549)に通し、最後に遠心分離により洗浄した(10分間、9,250rpm、4℃)。上清を廃棄し、PLGAのペレットを5〜10mLの水に再懸濁させ、これを2回繰り返した。水で洗浄し、再懸濁した後、100〜200μlのPLGAマイクロスフェア試料を、レーザー回折による製剤の粒径測定に使用した(Malvern Mastersizer2000)。洗浄した製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで2〜3日間凍結乾燥させた。
表128.PLGA特性
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、83ngの脱製剤化ルシフェラーゼmRNA PLGAマイクロスフェア試料、脱製剤化ルシフェラーゼmRNA対照(脱製剤化対照)、または非製剤化ルシフェラーゼmRNA対照(非製剤化対照)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加した。次いで、プレートを前述のようにインキュベートした。
表129.化学修飾
A.無血清培地
ヒト第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)無血清培地内にトランスフェクトし
た。細胞培養上清を採取し、ペプチドの二次元HPLC分離を経る前にトリプシン消化に供した。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化を使用して、ペプチドを検出した。8個のペプチドが検出され、検出されたペプチドのうちの7個が第IX因子に特有である。この結果は、無血清培地へトランスフェクトしたmRNAが完全長第IX因子タンパク質を発現できたことを示す。
250ngのコドン最適化ヒト第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10%FBSの存在下でDMEMにおいてLipofectamine 2000を用いてHEK293A細胞(150,000細胞/ウェル)内にトランスフェクトした。トランスフェクションの3時間後、トランスフェクション複合体を取り出した。トランスフェクションの3、6、9、12、24、48、および72時間後、細胞を収集した。全RNAを単離し、cDNA合成に使用した。コドン最適化第IX因子特異的プライマーセットを使用して、そのcDNAを定量的リアルタイムPCRによる分析に供した。ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT)レベルを正規化に使用した。データは検出可能なmRNAの割合としてプロットされ、mRNAレベルは3時間時点で100%と見なされる。ヒト胎児腎臓293(HEK293)細胞における5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された第IX因子修飾mRNAの半減期は、約8〜10時間である。
ヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)ならびにヒトEPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、生理食塩水中で製剤化し、100μgの用量で筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
表130.投薬レジメン
mCherry修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21439に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、およびルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、生理食塩水中で製剤化し、表131に記載されるようにラットの硝子体内に送達した。試料を硝子体内に送達された生理食塩水のみの対照に対して比較した。
表131.投薬チャート
5’キャップ、キャップ1で修飾されていないか(未修飾)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンならびに5’キャップ、キャップ1で完全に修飾されたか(Gen1)、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンならびに5’キャップ、キャップ1で完全に修飾されたか(Gen2キャップ)、あるいはキャップがない(Gen2キャップされない)、200μgのG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)をマウスに筋肉内注入した。対照のR−848、5%ショ糖、および未処理のマウスも分析した。8時間後、マウスから血清を採取し、インターフェロン−α(IFN−α)発現について分析した。その結果を表132に示す。
表132.IFN−α発現
HEK293細胞に、表133に示される濃度で、Invitrogen(Carlsbad,CA)のLipofectamine2000を用いて複合体形成している修飾mRNA(mmRNA)VEGF−A(mRNA配列は配列番号1672に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトした。タンパク質発現をELISAによって検出し、そのタンパク質(pg/mL)を表133および図7に示す。
表133.タンパク質発現
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表134に記載の化学修飾を有する、37.5ngまたは75ngの緑色蛍光タンパク質(GFP)修飾RNA(mRNA配列は配列番号21448に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
表134.平均蛍光強度
異なるルシフェラーゼmRNA溶液(表135に記載され、「X」は、その成分を含有する溶液を指す)(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を評価し、異なる溶液の収量パーセント、バイオアナライザーによってmRNAの完全性、ならびにインビトロトランスフェクションによるmRNAのタンパク質発現を試験した。表135に示されるように、水、4mg/mLの1倍TE緩衝液中で、mRNA溶液を調製し、0.8mg/mLの最終mRNA濃度を実現するために、ジクロロメタン(DCM)または200mg/mLのポリ(乳酸
−コ−グリコール酸)(PLGA)(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55−0.75、50:50のLA:GA)を含有するDCMのいずれかに添加した。均質化を必要とする溶液を速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax Homogenizer,T18)。水、ジクロロメタン(dicloromethane)、およびポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)中のmRNA試料は、回収不能(NR)であった。NR試料を除くすべての試料が、バイオアナライザー(Bio−rad Experion)で判定されるようにmRNAの完全性を維持した。
表135.溶液
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表136に概要説明されるように水またはTE緩衝液中に再構築し、次いで、PLGAマイクロスフェア中で製剤化した。PLGAマイクロスフェアを、PLGA(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、水または2〜6mg/mLの濃度のTE緩衝液(W1)中の0.2〜0.6mLのmRNAを、100mg/mLのPLGAの濃度でジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax Homogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを250mLの1%のPVA(W2)に添加し、速度5(約19,000rpm)で1分間均質化させた。
表136.製剤
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表137に記載の化学修飾を有する83ngのルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
表137.化学修飾
PBS(pH7.4)中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびシュードウリジン(5mC/pU)で完全に修飾されたか、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン(5mC/N1mpU)で完全に修飾されたか、シュードウリジン(pU)で完全に修飾されたか、N1−メチル−シュードウリジン(N1mpU)で完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾された(5mC/s2U)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、2.5mg/kgの用量で筋肉内または皮下にBalb−Cマウスに投与した。マウスを、筋肉内送達の場合、2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、および144時間、ならびに皮下送達の場合、2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間時点で撮像した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。筋肉内投与に対する平均全光束(光子/秒)を表138に示し、皮下投与に対する平均全光束(光子/秒)を表139に示す。バックグラウンドシグナルは、3.79E+05(p/s)であった。筋肉内投与に対するピーク発現は、すべての化学組成おいて24時間から48時間の間に見られ、発現は144時間時点でも依然として検出された。皮下送達の場合、ピーク発現は2時間から8時間の間に見られ、発現は72時間時点でも検出された。
表138.筋肉内投与
表139.皮下投与
埋込の前に、浸透圧ポンプ(ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ2001D,DURECT Corp.Cupertino,CA)を0.2mLの1倍PBS(pH7.4)(PBS充填ポンプ)または1倍PBS(pH7.4)中1mg/mLで0.2mLのルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)(ルシフェラーゼ充填ポンプ)に充填し、37℃で一晩、1倍PBS(pH7.4)中でインキュベートする。
表140.ルシフェラーゼ製剤
外部浸透圧ポンプ(ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ2001D、DURECT Corp.Cupertino,CA)を0.2mLの1倍PBS(pH7.4)(PBS充填ポンプ)または1倍PBS(pH7.4)中1mg/mLで0.2mLのルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)(ルシフェラーゼ充填ポ
ンプ)に充填し、37℃で一晩1倍、PBS(pH7.4)中でインキュベートする。
表141.ルシフェラーゼ製剤
Tisseel(Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)等のフィブリンシーラントは、二連式シリンジ中のフィブリノーゲンおよびトロンビンから成る。混合されると、フィブリノーゲンはフィブリンに変換され、約10〜30秒でフィブリン血餅を形成する。この血餅は、身体の天然の凝血機構を模倣することができる。加えて、フィブリンハイドロゲルは、持続放出送達において使用され得る可能性のある三次元構造である。現在、フィブリンシーラントは、縫合、結紮、および焼灼等の従来の外科技法に代わる止血および封着の用途として認められている。
妨げないことが見出され、ルシフェラーゼおよびTisseelの注入は、ルシフェラーゼの発現を示した。
表142.ルシフェラーゼ製剤
表143.全光束
A.修飾mRNAおよび塩化カルシウム
再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を塩化カルシウムに添加する。次いで、その塩化カルシウムを使用して、トロンビンを再構築する。フィブリノーゲンを、製造業者の指示に従って線溶阻害剤溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたトロンビンおよびフィブリノーゲンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンおよび50μLのトロンビンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化される、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を塩化カルシウムに添加する。次いで、その塩化カルシウムを使用して、トロンビンを再構築する。フィブリノーゲンを、製造業者の指示に従って線溶阻害剤溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたトロンビンおよびフィブリノーゲンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含
有する50μLのトロンビンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を線溶阻害剤溶液に添加する。次いで、その線溶阻害剤溶液を使用して、フィブリノーゲンを再構築する。トロンビンを、製造業者の指示に従って塩化カルシウム溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたフィブリノーゲンおよびトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのトロンビンおよび修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を線溶阻害剤溶液に添加する。次いで、その線溶阻害剤溶液を使用して、フィブリノーゲンを再構築する。トロンビンを、製造業者の指示に従って塩化カルシウム溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたフィブリノーゲンおよびトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのトロンビンおよび修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者の指示に従って塩化カルシウムで再構築された後の、その再構築されたトロンビンに添加する。次いで、線溶阻害剤溶液を使用して、製造業者の指示に従ってフィブリノーゲンを再構築する。再構築されたフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含有するトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのトロンビンおよび50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者の指示に従って塩化カルシウムで再構築された後のその再構築されたトロンビンに添加する。次いで、線溶阻害剤溶液を使用して、製造業者の指示に従ってフ
ィブリノーゲンを再構築する。再構築されたフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含有するトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのトロンビンおよび50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表144に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表144.カチオン性脂質製剤
表145.光束
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表146に記載されるように50%のDLin−MC3−DMAまたはDLin−KC2−DMA、38.5%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を静脈内に(I.V.)、0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg、または0.0005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。
表146.製剤
表147.光束
表148.臓器の光束
表149.光束
表150.臓器の光束
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表151に記載されるように50%のDLin−KC2−DMA、385%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を皮下に(S.C.)0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表151.DLin−KC2−DMA製剤
表152.光束
表153.臓器の光束
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、50%のDLin−MC3−DMA、38.5%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化する。製剤を皮下に(S.C.)0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。
リポプレックス形成したルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/N1mpU)、または5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジン(5mC/s2U)で25%修飾した。製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.10mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
in Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の8時間、24時間、および48時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路および化学修飾について測定した。バックグラウンドシグナルは、約3.91E+05p/sであった。撮像の結果を表154に示す。臓器を6時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定した。各臓器に対する対照も分析した。その結果を表155に示す。
表154.光束
表155.臓器に対する光束
5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%(5mC/s2U)修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表156に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表156.カチオン性脂質製剤
表157.光束
5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)をPBS(7.4
のpH)中で製剤化した。その製剤を筋肉内に(I.M.)または皮下に(S.C.)、2.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表158.光束
N4−アセチルシチジンで完全に修飾されたか、5−メトキシウリジンで完全に修飾されたか、N4−アセチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンおよび5−メトキシウリジンで完全に修飾された、PBS(pH7.4)中で製剤化されたルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、筋肉内または皮下に2.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを2時間、8時間、および24時間時点で撮像した。筋肉内投与に対する平均全光束(光子/秒)を表159に示し、皮下投与に対する平均全光束(光子/秒)を表160に示す。バックグラウンドシグナルは、3.84E+05(p/s)であった。筋肉内投与に対するピーク発現は、すべての化学組成において24時間から48時間の間に見られ、発現は120時間時点でも依然として検出された。皮下送達の場合、ピーク発現は2時間から8時間の間に見られ、発現は72時間時点でも検出された。
表159.筋肉内投与
表160.皮下投与
少なくとも1つの化学修飾を含むルシフェラーゼ修飾mRNAをシリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化し、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付ける。
表161.ルシフェラーゼ製剤
5−メチルシトシンおよびシュードウリジン(5mC/pU)、シュードウリジン(pU)、またはN1−メチル−シュードウリジン(N1mpU)で完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を表162に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表162.カチオン性脂質製剤
表163.光束
N4−アセチルシチジン(N4−アセチル)で完全に修飾されたか、5−メトキシウリジン(5meth)で完全に修飾されたか、N4−アセチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジン(N4−アセチル/N1mpU)で完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンおよび5−メトキシウリジン(5mC/5−meth)で完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表164に記載されるようにDLin−MC3−DMA中で製剤化した。
表164.カチオン性脂質製剤
表165.光束
EPO mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチ
ル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、を表166に記載されるようにDLin−MC3−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。1つのmRNAのみを含有する対照LNP製剤も等価用量で投与する。
表166.DLin−MC3−DMA製剤
EPO mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)またはG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)を、表167に記載されるようにDLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。
表167.DLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA製剤
5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたか(VEGF 5mC/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか(VEGF 5mC/N1mpU)、または未修飾の(VEGF unmod)、500ngのVEGF mRNA(mRNA配列は配列番号1672に示される約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、Lipofectamine 2000,0.4ulを用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。細胞はまた、対照として各ドナーに対して処理されなかった。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現およびサイトカイン誘導を判定した。VEGFの発現およびIFN−α誘導を表168ならびに図8Aおよび8Bに示す。
表168.タンパク質およびサイトカインレベル
HEK293細胞に、EPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号1638に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトし、HeLa細胞に、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)修飾mRNA(
mRNA配列は配列番号1668に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を順方向トランスフェクトし、ならびにHepG2細胞に、殺菌性/透過性増強タンパク質(rBPI−21)修飾mRNA(配列番号21449;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトし、それらは、本明細書に記載の手順を使用して、表169、170、および171に示される濃度で、Invitrogen(Carlsbad,CA)のLipofectamine2000を用いて複合体形成していた。タンパク質発現をELISAによって検出し、そのタンパク質(pg/mL)も表169、170、および171に示す。表169において、「>」は、それよりも大きいことを意味する。TGFβの場合、対照の未処理細胞およびLipofectamine2000の偽のトランスフェクションも試験した。
表169.EPOタンパク質発現
表170.TGFβタンパク質発現
表171.rBPI−21タンパク質発現
ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)を96ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種した、HEK293を100μlの細胞培養培地(2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1倍非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germany)、ならびに1.2mg/mLの重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich
,Munich,Germany)を添加したDMEM、10%FCS)中に30,000の密度で播種した、75ngのバイシストロン性修飾mRNA(mCherry−2A−GFP)(配列番号21450;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、mCherry修飾mRNA(mRNA配列番号21439;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、または緑色蛍光タンパク質(GFP)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21448に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を細胞を播種した後に添加し、インキュベートした。対照の未処理細胞も評価した。mCherry−2A−GFPは、mCherryのコード領域、2Aペプチド、およびGFPのコード領域を含む修飾mRNA配列を指す。
表172.修飾mRNAのMFI
ハーセプチン重鎖(HC)mRNA(mRNA配列は配列番号21451に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)ならびにハーセプチン軽鎖(LC)(mRNA配列は配列番号21452に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)を、表173に記載されるようにDLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V)0.500、0.050、および0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。
表173.DLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA製剤
ピリミジンヌクレオシドシュードウリジンへの最近の注目に伴い、一連の構造活性研究は、シュードウリジンまたはN1−メチル−シュードウリジン(pseudourdine)への修飾を含むmRNAを研究するように設計された。
表174.シュードウリジンおよびN1−メチルシュードウリジンSAR
表175.シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンSAR
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。これらの例を表176および177に示す。ある特定の市販のヌクレオシドトリホスフェート(NTP)を本発明のポリヌクレオチド中で研究する。これらの選択肢を表176に示す。次いで、結果として得られるmRNAを、タンパク質を産生する、サイトカインを誘導する、および/または治療的成果を生じるその能力について検査する。
表176.天然および非天然ヌクレオシド
表177.非天然ヌクレオシドトリホスフェート
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。核酸塩基および炭水化物(糖)の両方に対する修飾を有する市販のヌクレオシドおよびNTPを、mRNA内に組み込まれ、タンパク質を産生し、サイトカインを誘導し、かつ/または治療的成果を生み出すその能力について検査する。これらのヌクレオシドの例を表178および179に示す。
表178.組み合わせ修飾
表179.天然に生じる組み合わせ
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechno
logies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表180に記載の化学修飾を有する250ngの血管内皮成長因子(VEGF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号1672に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。また上述の手順に従って、VEGF mRNAで第2の組のHeLa細胞も評価した。第1の組のHeLa細胞に対して、対照の未処理細胞およびlipofecatamine 2000でのみ処理された細胞も分析した。
表180.タンパク質産生
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル
細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表181に記載の化学修飾を有する250ngの血管内皮成長因子(VEGF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号1672に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。対照の未処理細胞も分析した。
表181.タンパク質産生
リポプレックス形成した血管内皮成長因子(VEGF)mRNA(mRNA配列は配列番号1672に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、修飾しなかったか、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾たか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/1mpU)、5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾したか(5mC/s2U)、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾したか(1mpU)、またはシュードウリジン(pU)で完全に修飾した。その製剤を、静脈内に1マウス当たり2μgのmRNAの用量でマウスに投与した。対照として、マウスの1群を未処理とした。マウスからの血清を、投与の3時間後にVEGFタンパク質発現について特異的VEGF ELISAによって測定する。その結果を表182および図10に示す。
表182.タンパク質産生
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表183に記載の化学修飾を有する250ngの顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号21438に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。対照の未処理細胞およびlipofecatamine 2000でのみ処理された細胞も分析した。
表183.タンパク質産生
5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)mRNA(配列番号21438で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(5mC/s2U)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)。製剤をマウス1匹当たりmRNA
2ugおよびLipofectamine 2000(L2000)2ulの投与量でマウス(CD1)(n=3)に静脈内投与した。対照として1グループのマウスを未処置とした。投与6時間後、特異的G−CSF ELISAによりマウス血清をG−CSFタンパク質発現について測定した。その結果を表184および図12に示す。
表184.タンパク質生成
トランスフェクションの前日に、15,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのイーグル最小必須培地(EMEM)(1
0%ウシ胎仔血清(FCS)および1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾させたか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(5mC/1mpU)、5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾されたか(s2U/5mC)、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾さたか(1mpU)、またはシュードウリジンで完全に修飾された(pU)、250ngの第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号1622に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM(登録商標)中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。未処理の対照も分析した。
表185.タンパク質産生
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)20,000個を
収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリポタンパク質A−I野生型(APOA1wt)修飾RNA(配列番号21453で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリプロプロテイン(apoliproprotein)A1 Paris(APOA1 Paris)修飾RNA(配列番号21454で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)または5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリプロプロテイン(apoliproprotein)A1 Milano(APOA1
Milano)修飾RNA(配列番号21455で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine
2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEM(登録商標)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。ほかにも、lipofecatamine 2000のみで処理した細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリプロプロテイン(Apoliproprotein)A−I(APOA1)野生型mRNA(配列番号21453で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
.5mlエッペンドルフ管に合わせて入れた。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリプロプロテイン(Apoliproprotein)(APOA1)Paris mRNA(配列番号21454で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
するRIPA緩衝液、10×還元剤4ulおよび4×SDSローディング緩衝液10ul(ともにLife Technologies社(Grand Island、NY))が含まれていた。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルに負荷した。標準設定は製造業者によって選択されたものであり、200V、120mAおよび最大25Wであった。泳動時間は60分間とし、これは泳動染色剤がゲルの下端に達するよりも長い時間ではなかった。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアポリプロプロテイン(Apoliproprotein)(APOA1)Milano mRNA(配列番号21455で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
パク質のHeLa細胞溶解物におけるウエスタンブロット検出の結果を図17に示す。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたフィブリノーゲンA(FGA)mRNA(配列番号21456で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
が含まれていた。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルに負荷した。標準設定は製造業者によって選択されたものであり、200V、120mAおよび最大25Wであった。泳動時間は60分間とし、これは泳動染色剤がゲルの下端に達するよりも長い時間ではなかった。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)20,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたプラスミノーゲン修飾RNA(配列番号21457で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand
Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、エリスロポエチン(EPO)修飾mRNA(配列番号1638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)の対照および未処置細胞を分析した。
図19に示す。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたプラスミノーゲンmRNA(配列番号21457で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
もの)に溶かした。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(GALT)mRNA(配列番号21458で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。 室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間
インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
を5%BSAを含有する1×TBSで1:1000〜1:5000に希釈し、室温で3時間インキュベートした。図21の四角で囲まれた部分に示される通り、GALTのウエスタンブロット検出の結果は約42kdであった。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアルギニノスクシナーゼ酸リアーゼ(ASL)mRNA(配列番号21459で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
に調製した。この試料には、体積可変のタンパク質可溶化液25ug、体積を26ulにするRIPA緩衝液、10×還元剤4ulおよび4×SDSローディング緩衝液10ul(ともにLife Technologies社(Grand Island、NY))が含まれていた。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルに負荷した。標準設定は製造業者によって選択されたものであり、200V、120mAおよび最大25Wであった。泳動時間は60分間とし、これは泳動染色剤がゲルの下端に達するよりも長い時間ではなかった。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたチロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)mRNA(配列番号21460で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
.5mlエッペンドルフ管に合わせて入れた。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された1,4−α−グルカン−分枝酵素(GBE1)mRNA(配列番号21461で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)20,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたプロトロンビン修飾RNA(配列番号21462で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、エリスロポエチン(EPO)修飾mRNA(配列番号1638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)の対照および未処置細胞を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたプロトロンビン修飾RNA(配列番号21462で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同RNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(pU)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEM(登録商標)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたセルロプラスミン(CPまたはCLP)mRNA(配列番号1621で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)20,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたトランスフォーミング成長因子β1(TGF−β1)修飾RNA(配列番号1668で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)83ng、250ngまたは750ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフ
ェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、lipofecatmine 2000処置細胞の対照(L2000)および未処置細胞を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたオルニチントランスカルバモイラーゼ(OTC)mRNA(配列番号1659で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
低密度リポタンパク質(LDL)受容体(LDLR)mRNA(配列番号21463で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャ
ップ、キャップ1;配列中に示されない160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)8.0ugとダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)とを混合して最終体積0.2mLにすることにより、同mRNAとLipofectamine 2000との複合体を形成させた。
標準的な方法に従って、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMにHEK293細胞を500,000細胞/6ウェルプレートの密度で播き、細胞を一晩培養した。翌日、UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)mRNA(配列番号21464で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)800ngを至適緩衝液0.3mLで希釈し、同様にLipofectamine 2000の試料4.0uLを至適緩衝液0.3mLで希釈し、この2つの溶液を混合することによってmRNAとLipofectamine 2000との複合体を形成させた。
LDLR−/−マウスを用いてLDLR mmRNAのin vivo発現を試験する。LDLR−/−マウスにLDL mmRNAを注射により投与する。LDLR発現につ
いてマウスの組織を検討した。マウス組織のウエスタンブロット解析を実施し、LDLR
mmRNA投与の結果生じたLDLRタンパク質発現の有無を調べる。マウス組織にリアルタイムRT−PCRを実施し、LDLR遺伝子発現の有無を調べる。
オルニチントランスカルバモイラーゼ(OTC)は核ゲノム内にコードされるミトコンドリアタンパク質である。OTCの欠損はアンモニアの毒性蓄積を特徴とし、尿素回路障害を来たす。
1型コラーゲンでプレコートした24ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH、Frickenhausen、Germany)にヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を播く。HEK293は細胞培養培地100ulに約100,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞を播種した後、第XI因子mRNA(modRNA FXI)(配列番号1625で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)350ngまたは750ngを含有する製剤を直接加え、インキュベートする。このほか、未処置細胞の対照を評価した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアクアポリン−5 mRNA(配列番号1617で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)
、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。 Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を評価した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表191に記載される化学修飾を有する第VII因子修飾RNA(配列番号1623で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたインスリングラルギン修飾RNA(配列番号21465で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同RNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(pU)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。(登録商標)。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置の対照を分析した。
意味する。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表193に記載される化学修飾を有する組織因子(因子3)修飾RNA(配列番号21466で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表194に記載される化学修飾を有する第XI因子修飾RNA(配列番号1625で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)20,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された第XI因子修飾RNA(配列番号1625で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine
2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、エリスロポエチン(EPO)修飾mRNA(配列番号1638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)および未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表196に記載される化学修飾を有するインスリンアスパルト修飾RNA(配列番号21467で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表197に記載される化学修飾を有するインスリンリスプロ修飾RNA(配列番号21468で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表198に記載される化学修飾を有するインスリングルリジン修飾RNA(配列番号21469で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ
1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、表199に記載される化学修飾を有するヒト成長ホルモン(hGH)修飾RNA(配列番号1648で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine
2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を分析した。
CD1マウス(Harlan Laboratories、South Easton、MA)に5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたリポプレックス化腫瘍タンパク質53(TP53またはp53)mRNA(配列番号1670で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)を静脈内投与した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)2ulと複合体を形成したmRNA 2ugを滅菌DMEM基本培地(w/o添加剤、LifeTechnologies、Grand Island、NY)100ulに溶かしたものをマウスに投与した。
に回転させた。細胞をPBS 500ulに再懸濁させ、記載される通りに回転させた。
り、各化学反応について評価した2つの試料にそれぞれ予測サイズ53kd前後のタンパク質が検出された。
ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)を96ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH、Frickenhausen、Germany)に播き、HEK293細胞用のプレートは1型コラーゲンでプレコートしたものであった。HEK293を細胞培養培地(DMEM、10%FCS、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび1×非必須アミノ酸(Biochrom AG、Berlin、Germany)ならびに1.2mg/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、Munich、Germany)を添加)100ul中35,000個の密度で播いた。
CD1マウス(Harlan Laboratories、South Easton、MA)に5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたリポプレックス化ガラクトキナーゼ1(GALK1)mRNA(配列番号21470で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)を静脈投与した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand
Island、NY)2ulと複合体を形成したmRNA 2ugを滅菌DMEM基本培地(w/o添加剤、LifeTechnologies、Grand Island、NY)100ulに溶かしたものをマウスに投与した。
によりセルストレーナーに細胞を通過させ、下にある12ウェル培養皿に回収した。PBS 1mlを浮遊している脾細胞とともにエッペンドルフ管に移し、2000rpmで5分間回転させた。PBSを捨て、細胞ペレットと新たなPBS 500ulとを合わせた。2000rpmで5分間、短時間ボルテックスすることにより、脾細胞を再懸濁させた。PBSを捨て、細胞ペレットにBD Pharmlyse 1mlを加えた。短時間のボルテックスにより脾細胞を再懸濁させた。細胞を室温で3分間インキュベートした後、200rpmで5分間回転させた。細胞をPBS 500ulで2回洗浄し、上記の通りに回転させた。細胞をPBS 500ulに再懸濁させ、記載される通りに回転させた。
s社(Minneapolis、MD)から購入した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたデフェンシング(defensing)、β103A(DEFB103A)mRNA(配列番号1631で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)1250ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。このほか、未処置細胞の対照を評価した。
ンパク質を希釈緩衝液ではなくRIPA緩衝液(細胞溶解物作製について記載されているもの)に溶かした。
ペプチドの素性を確認するため、液体クロマトグラフィー質量分析と質量分析(LC−MS/MS)を連動させて用いる定量的LC多重反応モニタリング(MRM)によりタンパク質を評価することができる。
5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)とともに37℃で1時間インキュベートすることにより、溶解緩衝液中の各試料中のタンパク質を還元する。暗所、室温下で30分間、10mMヨードアセトアミドを用いてアルキル化を実施する。トリプシン(シークエンスグレード、PromegaCorporation、Madison、WI)をプロテアーゼとタンパク質の比1:50で用いて、タンパク質をペプチドに消化する。消化は37℃で一晩実施する(総消化時間を12時間とする)。製造業者の指示書に従いC18スピンカラム(The Nest Group、Southborough、MA)を用いて質量分析を実施するためにペプチドをクリーンアップする。ペプチドを完全に乾燥させ、LC溶媒A(1%アセトニトリル、0.1%ギ酸(FA))に再懸濁させる。溶媒はすべてSIGMA−ALDRICH(登録商標)社(St.Louis、MO)のHPLCグレードのものとし、化学製品はすべて、特に明記されない限りSIGMA−ALDRICH(登録商標)社(St.Louis、MO)から購入する。
いずれの質量分析でもProxeon Easy nLCナノ液体クロマトグラフィーシステムの充填C18カラム(Magic AQ、粒子径3um、細孔径200Å、Michrom Bioresources、Inc(Auburn、CA);カラム長11cm、内径75um、New Objective(Woburn、MA))にペプチドを注入する。LC溶媒をA:0.1%FAを含有する1%アセトニトリル水溶液;B:0.1%FAを含有する3%水アセトニトリル溶液とする。ショットガン分析のLC勾配は、5〜35%の溶媒Bで120分間、次いで35〜100%の溶媒Bで2分間、100%の溶媒Bで8分間(勾配時間は計130分)とする。標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたThermo Scientific(Thermo Fisher Scientific)(Billerica、MA)Q Exactive質量分析計でペプチド発見のためのLC−MS/MSショットガン分析を実施する。LC−MRMのLC勾配は、5〜35%の溶媒Bで30分間、次いで35〜100%の溶媒Bで2分間、100%の溶媒Bで8分間(勾配時間は計40分)とする。Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific)(Billerica、MA)TSQ Vantage三連四重極型質量分析計は標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたものである。再校正の非スケジュール化MRMモードでは、それを1遷移当たり20msの滞留時間で作動させる。試料間のペプチドの相対定量では、TSQ Vantageを取得ウィンドウ長4分のスケジュール化MRMモードで作動させる。LC溶離液を1.9kVでエレクトロスプレーし、Q1ピーク幅0.7Daを用いてMRM分析を実施する。業者の仕様書に従って直線回帰により、TSQ Vantageの衝突エネルギーを計算する。
LC−MRMアッセイの作成には、LC−MS/MS分析で得られる最も強い12のフラグメントイオンを非スケジュール化LC−MRMモードで測定し、mProphet(Reiterら,mProphet:Automated data processing and statistical validation for large−scale SRM experiments,Nature Methods,2011(8),430−435;その内容が参照により本明細書に組み込まれる)のスコアリング部分、MQUEST(登録商標)(Cluetec、Karlsruhe、Germany)を用いてデータを処理した。手動でアッセイの有効性を検証し、正確なフラグメント強度を決定し、iRT(インデックス化された保持時間)をBiognosys社のiRT−ペプチド(Escherら,Using iRT,a normalized retention time for more targeted measurement of peptides,Proteomics,2012(12),1111−1121;その内容が参照により本明細書に組み込まれる)に対して割り当てる。
低密度リポタンパク質受容体(LDLR)修飾mRNA(配列番号21463で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(OTC)修飾mRNA(配列番号1659で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)、野生型アポリポタンパク質A−I(APOA1wt)修飾mRNA(配列番号21453で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)、ヘプシジン(HEPC)修飾mRNA(配列番号21471で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾)、ヘモクロマトーシス2型(HFE2)修飾mRNA(配列番号21472で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾)またはフマリルアセト酢酸加水分解酵素(FAH)修飾mRNA(配列番号21473で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾)から生成したタンパク質を含有する細胞溶解物を、実施例157に記載される通りにLC−MS/MSを用いて定量的LC−MRMで評価した。評価したタンパク質で同定されたペプチドフラグメントを表200に示す。いずれのペプチドも親タンパク質に特異的であり、LDLRおよびHFE2は親タンパク質とそのアイソフォームに特異的であった。表200では、「Uniprot ID」は、ペプチドフラグメント配列をデータベース内の全閲覧タンパク質に対してblast検索したときのUniProtのタンパク質識別子を指す。細胞溶解物中のタンパク質の評価に用いたハウスキーピングタンパク質を表201に示す。
5−メチルシトシンおよびメチルプソイドウリジンで完全に修飾された細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA4)修飾mRNA(配列番号21521で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードA(α−1抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン)、メンバー1(セルピナ1)修飾mRNA(配列番号21522で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1(SMPD1)修飾mRNA(配列番号21523で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT1)修飾mRNA(配列番号21524で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPD)修飾mRNA(配列番号21525で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、骨形成タンパク質−7(BMP7)修飾mRNA(配列番号21526で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT
)修飾mRNA(配列番号21527で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、アポトーシス誘導因子ショートアイソフォーム1(AIFsh)修飾mRNA(配列番号21528で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、腫瘍タンパク質53(TP53またはP53)修飾mRNA(配列番号1670で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、アルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)修飾mRNA(配列番号21529で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、KITリガンド/幹細胞因子(KITLG)修飾mRNA(配列番号21530で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、ニューレグリン1、β2aアイソフォーム(NRG1)修飾mRNA(配列番号21531で示されるcDNA配列;配列中に示されるin vitro転写(IVT)で用いられるT7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)および3’UTR)、血管作動性腸ペプチド(VIP)修飾mRNA(配列番号21532で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、アリールスルファターゼB(ARSB)修飾mRNA(配列番号1618で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、6−ピロボイルテトラヒドロプテリン(6−pyrovoyltetrahydropterin)合成酵素(PTS)修飾mRNA(配列番号1609で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、フィブロネクチンIII型ドメイン含有タンパク質5(FNDC5またはイリシン)修飾mRNA(配列番号21533で示されるcDNA配列;配列中に示されるin vitro転写(IVT)で用いられるT7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)および3’UTR)、アメロゲニン(AMELY)修飾mRNA(配列番号1613で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、アルドラーゼA(ALDOA)修飾mRNA(配列番号21534で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、神経成長因子(NGF)修飾mRNA(配列番号21535で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、グリコーゲン合成酵素2(GYS2)修飾mRNA(配列番号21536で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、GTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)修飾mRNA(配列番号1649で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、肝細胞成長因子(HGF)修飾mRNA(配列番号21537で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、エクトジスプラシンA(EDA)修飾mRNA(配列番号1636で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、アルギナーゼ(ARG1)修飾mRNA(配列番号21538で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、血清アミロイドP(APCS)修飾mRNA(配列番号21539で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、ホスホリラーゼキナーゼ、γ2(PHKG2)修飾mRNA(配列番号21540で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、685エオキシリボヌクレアーゼ(eoxyribonuclease)I(DNASE1)修飾mRNA(配列番号1632で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、エクセナチド修飾mRNA(配列番号21541で示されるmRNA配列
;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、グリコゲニン1(PYGL)修飾mRNA(配列番号21542で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、α−ガラクトシダーゼ(GLA)修飾mRNA(配列番号1640で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、α−L−イズロニダーゼ(IDUA)修飾mRNA(配列番号1652で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたガラクトキナーゼ1(GALK1)修飾mRNA(配列番号21470で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mCおよびpU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mCおよび1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)から生成したタンパク質を含有する細胞溶解物を、実施例157に記載される通りにLC−MS/MSを用いて定量的LC−MRMで評価した。評価したタンパク質で同定されたペプチドフラグメントを表202に示す。
液体クロマトグラフィー(LC)−質量分析(MS)分析、LC−MS/MSトリプシンペプチドマッピング/シークエンシング分析および二次元蛍光ディファレンシャルゲル電気泳動(2−D DIGE)を実施し、2−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(OTC)修飾mRNA(配列番号1659で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)または5−メチルシトシンおよびシュードウリジン又は1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたUDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)修飾mRNA(配列番号21464で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1でトランスフェクトしたHeLa細胞における各転写産物の発現を確認した。以下の材料を用いた:HPLCグレードの水(EM
D Chemicals Inc.、Gibbstown、NJ);ギ酸(90%)(J.T.Baker、Phillipsburg、NJ);ヨードアセトアミド(Sigma Aldrich、St.Louis、MO);メタノール(EMD Chemicals Inc.、Gibbstown、NJ);トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液(TCEP)、0.5M(Sigma Aldrich、St.Louis、MO);トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝物質(トリス緩衝液)、pH8.0(Fluka−Sigma Aldrich、St.Louis、MO);無水塩化カルシウムACS試薬(CaCl2)(Sigma Aldrich、St.Louis、MO);OTC参照タンパク質[精製組み換え完全長ヒトOTCタンパク質(Abcam、Cambridge、MA)];UGT1A1参照タンパク質[精製組み換えヒトUGT1A1タンパク質(OriGene Technologies、Rockville、MD)。
トリプシン消化産物と比較した。消化細胞ペレットおよび上清のペプチドマッチングの参照ペプチドとして組み換えタンパク質の消化産物を用いた。このほか、LC−MSおよびLC−MS/MSのデータをマッピングし、HeLa細胞由来タンパク質の特異的トリプシン消化産物に対して配列決定した。LC−MS/MSによる産物イオンスペクトルに基づいてトリプシンペプチのペプチド配列を確認した。
5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたカテリシジン抗菌性ペプチド(CAMP)修飾mRNA(配列番号1621で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、CAP18修飾mRNA(配列番号21638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)修飾mRNA(配列番号21639で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、卵胞刺激ホルモン、βポリペプチド(FSHB)修飾mRNA(配列番号21640で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、インターフェロン、α2(IFNA2)修飾mRNA(配列番号1654で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、インターフェロン、β1、線維芽細胞(IFNB1)修飾mRNA(配列番号1655で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、メチルマロニルCoAムターゼ、ミトコンドリア(MUTA)修飾mRNA(配列番号1658で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、ガレクチン3(LEG3)修飾mRNA(配列番号21641で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、トランスフォーミング成長因子β−3(TGFB3)修飾mRNA(配列番号21642で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)またはタフテリン(TUFT1)修飾mRNA(配列番号1669で示されるmRNA配
列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mCおよびpU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mCおよび1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)から生成したタンパク質を含有する細胞溶解物を、実施例157に記載される通りにLC−MS/MSを用いて定量的LC−MRMで評価した。評価したタンパク質で同定されたペプチドフラグメントを表205に示す。表205では、「Uniprot ID」は、ペプチドフラグメント配列をデータベース内の全閲覧タンパク質に対してblast検索したときのUniProtデータベースのタンパク質識別子を指す。
A.HeLa細胞のトランスフェクション
24ウェルディッシュ(Corning Life Sciences、Tewksbury、MA)(7.5×104細胞/ウェル)の10%ウシ胎仔血清(FCS、Life Technologies、Grand Island、NY)および1×glutamax試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)を添加したイーグル最小必須培地(EMEM、Life Technologies、Grand Island、NY)にHeLa細胞を播き、標準的な細胞培養条件下で一晩培養した。第一の管で5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された低密度リポタンパク質受容体(LDLR)修飾mRNA(配列番号21463で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、mCherry修飾mRNA(配列番号21439で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)またはルシフェラーゼ修飾mRNA(配列番号21446で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)250ngとOpti−MEM試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)50μlとを組み合わせ、第二の管でL2000トランスフェクション試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)1μlとOpti−MEM 50μlとを組み合わせることによって、処置の対象となる各ウェルに対してトランスフェクション溶液を調製した。調製後、第一および第二の管を室温で5分間インキュベートした後、それぞれの内容物を組み合わせた。組み合わせたトランスフェクション溶液を室温で15分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション溶液100μlを各ウェルに加えた。細胞をさらに16時間培養した後、分析を進めた。
トランスフェクション後、培地を細胞から除去し、各ウェルに0.25%トリプシン(Life Technologies、Grand Island、NY)60μlを加えた。細胞をトリプシンで2分間処理した後、240μl/ウェルのトリプシン阻害剤(Life Technologies、Grand Island、NY)を加えた。得られた細胞溶液を96ウェルプレート(Corning Life Sciences、Tewksbury、MA)に移し、遠心分離(800×重力で5分間)により細胞をペレット化し、上清を捨てた。細胞ペレットをPBSで洗浄し、Foxp3固定/透過処理液(eBioscience、San Diego、CA)に45分間再懸濁させた。細胞を遠心分離(800×重力で5分間)により再びペレット化し、透過処理緩衝液(eBiosciences、San Diego、CA)に10分間再懸濁させた。細胞を遠心分離(800×重力で5分間)により再びペレット化し、透過処理緩衝液で洗浄した。次いで、細胞をLDLRに対する一次抗体、次いでフィコエリトリン標識二次抗体で処理した。次いで、標識細胞をFACS緩衝液(1%ウシ血清アルブミンおよび0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)と組み合わせ、クラスター管に移した。図47に示される通り、次いでBD Accuri(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いたフローサイトメトリーにより標識細胞を分析した。
トランスフェクト細胞をPBSで洗浄し、室温で20分間、固定液(4%ホルムアルデヒドを含有するPBS)で処理した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、透過処理/ブロッキング液(5%ウシ血清アルブミンおよび0.1%Tween−20を含有するトリス緩衝生理食塩水)で処理した。細胞を室温で2時間、穏やかに攪拌しながらインキュベート
した後、0.05%Tween−20を含有するPBSで3回洗浄した。次いで、細胞を室温で2時間、一次抗体(ヤギ抗LDLR、R&D Systems、Minneapolis、MN)で処理するか、同一次抗体なしで処理するか、通常のIgG対照で処理し、0.05%Tween−20を含有するPBSで3回洗浄し、蛍光標識した1:200希釈のロバ抗ヤギIgG(R&D Systems、Minneapolis、MN)を含有する二次抗体溶液で処理した。0.05%Tween−20を含有するPBSで細胞を再び洗浄し、蛍光顕微鏡イメージングにより観察した。ルシフェラーゼまたはmCherryを一過性に発現する細胞を蛍光免疫染色せずに蛍光顕微鏡法により観察した。
A.HeLa細胞のトランスフェクション
24ウェルディッシュ(Corning Life Sciences、Tewksbury、MA)(7.5×104細胞/ウェル)の10%ウシ胎仔血清(FCS、Life Technologies、Grand Island、NY)および1×glutamax試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)を添加したイーグル最小必須培地(EMEM、Life Technologies、Grand Island、NY)にHeLa細胞を播き、標準的な細胞培養条件下で一晩培養した。第一の管でデフェンシン、β103A(DEFB103A)修飾mRNA(配列番号1631で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)またはmCherry修飾mRNA(配列番号21439で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngとOpti−MEM試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)50ulとを組み合わせ、第二の管でL2000トランスフェクション試薬(Life Technologies、Grand Island、NY)1ulとOpti−MEM 50ulとを組み合わせることによって、処置の対象となる各ウェルに対してトランスフェクション溶液を調製した。調製後、第一および第二の管を室温で5分間インキュベートした後、それぞれの内容物を組み合わせた。組み合わせたトランスフェクション溶液を室温で15分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション溶液100ulを各ウェルに加えた。細胞をさらに16時間培養した後、分析を進めた。
トランスフェクト細胞をPBSで洗浄し、室温で20分間、固定液(4%ホルムアルデヒドを含有するPBS)で処理した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、透過処理/ブロッキング液(5%ウシ血清アルブミンおよび0.1%Tween−20を含有するトリス緩衝生理食塩水)で処理した。細胞を室温で2時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした後、0.05%Tween−20を含有するPBSで3回洗浄した。次いで、細胞を室温で2時間、一次抗体で処理せずにおくか、抗DEFB103A一次抗体(ウサギ抗DEFB103A、Abcam、Cambridge、MA)で処理するか、通常のIgG対照抗体で処理し、0.05%Tween−20を含有するPBSで3回洗浄し、赤色で蛍光標識した1:200希釈のロバ抗ヤギIgG(R&D Systems、Minneapolis、MN)を含有する二次抗体溶液で処理した。0.05%Tween−20を含有するPBSで細胞を再び洗浄し、蛍光顕微鏡イメージングにより観察した。mCherryをコードする修飾mRNAでトランスフェクトした細胞を免疫蛍光染色を実施せずに可視化した。
タンパク質の発現および発現したタンパク質の長さを確認するため、表205に記載されるタンパク質をコードする5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された修飾mRNA(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリ
ジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)を蛍光および/またはウエスタンブロットにより分析した。修飾mRNA(配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)またはcDNA(配列中に示されるin vitro転写(IVT)に用いられるT7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)および3’UTR)の配列、評価した化学修飾および明らかになっている場合は長さ(塩基対数)を表205に記載する。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)100,000個を収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された血管内皮成長因子(VEGF)修飾RNA(配列番号1672で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)または修飾を含まない同RN
A(未修飾)62ng、250ng、750ngまたは1500ngをトランスフェクション補助剤としてのLipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)2ulと混合し、二重反復で細胞に加えた。
24時間のインキュベーション後、VEGFを発現している細胞の細胞培養上清を回収し、10.000rcfで2分間遠心分離した。次いで、清澄化した上清をVEGF−特異的ELISAキット(R & D Systems、Minneapolis、MN)で製造業者の指示書に従い分析した。決定値がELISA標準曲線の直線範囲内に収まるまで全試料を希釈した。このほか、未処置細胞、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された緑色蛍光タンパク質(GFP)修飾mRNA(配列番号1672で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)または修飾を含まない同mRNA(未修飾)62ngまたは750ngにより二重反復で処置した細胞の対照およびmCherry修飾mRNA(配列番号21439で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngの対照を分析した。生成したVEGFの量(pg/ml)を表206および図48に示す。図48では、「eGFP」は緑色蛍光タンパク質修飾mRNAを指し、「MC」はmCherry修飾mRNAを指し、「UNT−1」は未処置細胞を指し、「G0」は修飾mRNAが修飾を含まないことを意味し、「G1」は5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味し、「G1」は5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味し、「G5」は1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味する。
24時間のインキュベーション後、培地を除去し、1ウェル当たり200ulのCell Titer Glo(CTG)アッセイ試薬(Promega Corporation、Madison、WI)で細胞を溶解した。室温で15分間インキュベートした後
、各可溶化液10ulを2組ずつ白色不透明のポリスチレン製96ウェルプレート(Corning、Tewksbury、MA)に移した。細胞溶解物の各アリコートに再びCell Titer Gloアッセイ試薬100ulを加えた。総体積110ulの試薬混合物をBioTek Synergy H1プレートリーダーで一般的な発光プログラムを用いて分析した。未処置HeLa細胞を参照として二重反復測定の平均値をグラフにプロットした(1.0=生存能100%)。このほか、二重反復の未処置細胞およびmCherry修飾mRNA(配列番号1672で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)250ngで処置した細胞の対照を評価した。正規化したATP量/細胞生存能を表207および図49に示す。図49では、「MC」はmCherry修飾mRNAを指し、「UNT−1」および「UNT−2」は未処置細胞を指し、「G0」は修飾mRNAが修飾を含まないことを意味し、「G1」は5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味し、「G1」は5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味し、「G5」は1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾されていることを意味し、「*」はデータ点が1つのみ得られたことを意味する。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)100,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたエリスロポエチン(EPO)修飾RNA(配列番号1638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同RNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologie
s、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、lipofecatmine 2000で処置した細胞(L2000)および未処置細胞の対照を分析した。
Invitrogen社(Carlsbad、CA)のLipofectamine 2000と複合体を形成させた5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたインスリンアスパルト修飾mRNA(配列番号21468で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)で表209に示される濃度にて細胞をトランスフェクトした。96ウェル当たりのトランスフェクション混合物の総体積を50ulとし、それぞれ2つの25ulアリコートに分けた。一方の25ulアリコートには各mmRNA 1ulとOpti−MEM 24ulとが含まれ、他方の25ulアリコートにはLipofectamine2000 0.4ulとOpti−MEM 24.6ulとが含まれていた。必要に応じて、修飾mRNAとOpti−MEMとを含有するアリコートをOpti−MEMで連続希釈した。両アリコートを室温で15分間、別々にインキュベートした。次いで、両アリコートを混合し、室温でさらに20分間インキュベートした後、最後にトランスフェクション混合物計50ulを細胞培養培地100ulとHEK293細胞35000個とを含む96ウェルに移した。次い
で、加湿した37℃/5%CO2細胞培養インキュベーター内で細胞を24時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集するか、細胞溶解物を調製した。タンパク質発現をELISAにより検出し、タンパク質(pg/ml)を図50および表209に示す。表209では、「>」は上回ることを意味する。
Invitrogen社(Carlsbad、CA)のLipofectamine 2000と複合体を形成させた5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたインスリングラルギン修飾mRNA(配列番号21465で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)で表210に示される濃度にて細胞をトランスフェクトした。96ウェル当たりのトランスフェクション混合物の総体積を50ulとし、それぞれ2つの25ulアリコートに分けた。一方の25ulアリコートには各mmRNA 1ulとOpti−MEM 24ulとが含まれ、他方の25ulアリコートにはLipofectamine2000 0.4ulとOpti−MEM 24.6ulとが含まれていた。必要に応じて、修飾mRNAとOpti−MEMとを含有するアリコートをOpti−MEMで連続希釈した。両アリコートを室温で15分間、別々にインキュベートした。次いで、両アリコートを混合し、室温でさらに20分間インキュベートした後、最後にトランスフェクション混合物計50ulを細胞培養培地100ulとHEK293細胞35000個とを含む96ウェルに移した。次いで、加湿した37℃/5%CO2細胞培養インキュベーター内で細胞を24時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集するか、細胞溶解物を調製した。タンパク質発現をELISAにより検出し、タンパク質(pg/ml)を図51および表210に示す。
Invitrogen社(Carlsbad、CA)のLipofectamine
2000と複合体を形成させた5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたインスリングルリジン修飾mRNA(配列番号21469で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ,Cap)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)で表211に示される濃度にて細胞をトランスフェクトした。96ウェル当たりのトランスフェクション混合物の総体積を50ulとし、それぞれ2つの25ulアリコートに分けた。一方の25ulアリコートには各mmRNA 1ulとOpti−MEM 24ulとが含まれ、他方の25ulアリコートにはLipofectamine2000 0.4ulとOpti−MEM 24.6ulとが含まれていた。必要に応じて、修飾mRNAとOpti−MEMとを含有するアリコートをOpti−MEMで連続希釈した。両アリコートを室温で15分間、別々にインキュベートした。次いで、両アリコートを混合し、室温でさらに20分間インキュベートした後、最後にトランスフェクション混合物計50ulを細胞培養培地100ulとHEK293細胞35000個とを含む96ウェルに移した。次いで、加湿した37℃/5%CO2細胞培養インキュベーター内で細胞を24時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集するか、細胞溶解物を調製した。タンパク質発現をELISAにより検出し、タンパク質(pg/ml)を図52および表211に示す。表211では、「>」は上回ることを意味する。
用量反応傾向、注射部位の影響および注射のタイミングの影響を明らかにするため、実施例35で概説したプロトコルに従って試験を実施する。この試験では、1ug、5ug、10ug、25ug、50ugおよびその間の値の様々な量を用いて用量反応の結果を明らかにする。合計用量100ugの分割投与には1.6ug、4.2ug、8.3ug、16.6ugまたは値が3用量もしくは6用量含まれ、合計用量は選択される合計用量の投与量に等しい。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番
号CCL−2;Manassas、VA)100,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたトランスフォーミング成長因子β1(TGFB1)修飾RNA(配列番号1668で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同RNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、lipofecatmine 2000で処置した細胞(L2000)および未処置細胞の対照を分析した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)100,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイ
ドウリジンで完全に修飾されたトランスフォーミング成長因子β1(TGFB1)修飾RNA(配列番号1668で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(5mC/1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同RNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同RNA(1mpU)250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか、lipofecatmine 2000で処置した細胞(L2000)および未処置細胞の対照を分析した。
5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)修飾mRNA(配列番号21678で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、活性依存性神経保護因子(ADNP)修飾mRNA(配列番号21679で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、セプチン−4(ARTS)修飾mRNA(配列番号21680で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、骨形成タンパク質2(BMP2)修飾mRNA(配列番号21681で示されるmRNA配列;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、セルロプラスミン(CP)修飾mRNA(
配列番号1620で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、COMMドメイン含有タンパク質1(COMMD1)修飾mRNA(配列番号21682で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、diablo、IAP結合ミトコンドリアタンパク質(DIABLOまたはSMAC)修飾mRNA(配列番号21683で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、凝固第XIII因子α(F13A1)修飾mRNA(配列番号21684で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、ヘプシジン(HEPC)修飾mRNA(配列番号21471で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、IgM重鎖修飾mRNA(配列番号21685で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、インターロイキン−21(IL21)修飾mRNA(配列番号21686で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)、N−アセチルグルタミン酸合成酵素(NAGS)修飾mRNA(配列番号21687で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)またはE3ユビキチン−タンパク質リガーゼ(XIAP)修飾mRNA(配列番号21688で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)(5mCおよびpU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mCおよび1mpU)、ウリジンの25%が2−チオウリジンで修飾されシトシンの25%が5−メチルシトシンで修飾されて修飾された同mRNA(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)または1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)から生成したタンパク質を含有する細胞溶解物を、実施例157に記載される通りにLC−MS/MSを用いて定量的LC−MRMで評価した。評価したタンパク質で同定されたペプチドフラグメントを表214に示す。
タンパク質の発現および発現したタンパク質の長さを確認するため、表215に記載されるタンパク質をコードする5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された修飾mRNA(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(5mC/1mpU)、シトシンの25%が5−メチルシトシンで置換されウリジンの25%が2−チオウリジンで置換されて修飾された同mRNA(s2U/5mC)、1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(1mpU)またはプソイドウリジンで完全に修飾された同mRNA(pU)を蛍光および/またはウエスタンブロットにより評価した。修飾mRNA(配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)の配列、評価した化学修飾および明らかになっている場合は長さ(塩基対数)を表215に記載する。
1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−LNP−KC2)、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−LNP−KC2)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表216に記載されるようにカチオン性脂質ナノ粒子(LNP−KC2)中で製剤化した。
表216.製剤
表217.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−リポプレックス)、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−リポプレックス)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、第1のステップが、G5またはG2修飾ルシフェラーゼmRNAを3mg/mLから16.6μLに108.5μLのDMEM中への希釈することであり、第2のステップが、100μLのLF2000を25μLのDMEM中に希釈し、次いで両方を共に静かに混合して、合計250μLのミキサーを作製することであった、2ステップにおいてリポプレックス形成し、それは注入の前に脂質−mRNA複合体を形成するように室温で5〜10分インキュベートされた。1−メチルシュードウリジンまた
は1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された両方のルシフェラーゼmRNAからのリポプレックスを、鼻腔内に(I.N.)0.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表218.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
PBS(pH7.4)中で製剤化された、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−緩衝液(PBS))、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−緩衝液(PBS))、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号21446に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、鼻腔内に(I.N.)7.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
表219.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
24マルチウェルプレートのヒトケラチノサイト細胞内にインターロイキン7(IL7)修飾mRNA(配列番号1656で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)をリバーストランスフェクションによりトランスフェクトした。Invitrogen社(Carlsbad、CA)のSupplement S7添加EPILIFE(登録商標)培地でヒトケラチノサイト細胞を50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞にInvitrogen社(Carlsbad、CA)のRNAIMAX(商標)と複合体を形成させたIL−7をコードする修飾mRNA(mmRNA)0ng、46.875ng、93.75ng、187.5ng、375ngおよび750ngをトランスフェクトした。最初にRNAを室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに5倍体積希釈で10分間インキュベートすることによりRNA:RNAIMAX(商標)複合体を形成させた。第二のバイアルでは、RNAIMAX(商標)試薬を室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに10倍体積希釈で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルとRNAIMAX(商標)のバイアルとを混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、細胞に滴加した。
24マルチウェルプレートのヒトケラチノサイト細胞内にエリスロポエチン(EPO)修飾mRNA(配列番号1638で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)をリバーストランスフェクションによりトランスフェクトした。Invitrogen社(Carlsbad、CA)のSupplement S7添加EPILIFE(登録商標)培地でヒトケラチノサイト細胞を50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞にInvitrogen社(Carlsbad、CA)のRNAIMAX(商標)と複合体を形成させたEPOをコードする修飾mRNA(mmRNA)46.875ng、93.75ng、187.5ng、375ngおよび750ngをトランスフェクトした。最初にRNAを室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに5倍体積希釈で10分間インキュベートすることによりRNA:RNAIMAX(商標)複合体を
形成させた。第二のバイアルでは、RNAIMAX(商標)試薬を室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに10倍体積希釈で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルとRNAIMAX(商標)のバイアルとを混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、細胞に滴加した。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたリソソーム酸リパーゼ(LAL)mRNA(配列番号1657で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)750ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand
Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたグルコセレブロシダーゼmRNA(配列番号1645で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)750ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Isl
and、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
Western Breeze、Invitrogen)を西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、一次抗体と結合する。5%BSAを含有する1×TBSで二次抗体を1:1000〜1:5000に希釈し、室温で3時間インキュベートした。図56に示される通り、グルコセレブロシダーゼのウエスタンブロット検出が59.7kDa付近に見られた。図56では、レーン1および2は修飾mRNAを示し、レーン3および4は投与溶媒のみを示している。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたイズロン酸−2−スルファターゼmRNA(配列番号1652で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)750ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand
Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
え、泳動を助けるMOPS緩衝液を入れたNuPage SDS−PAGEシステム(泳動槽および電源)(以上、Life Technologies社(Grand Island、NY))にタンパク質可溶化液を負荷した。各可溶化液試料を最終体積40ulに調製した。この試料には、体積可変のタンパク質可溶化液25ug、体積を26ulにするRIPA緩衝液、10×還元剤4ulおよび4×SDSローディング緩衝液10ul(ともにLife Technologies社(Grand Island、NY))が含まれていた。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルに負荷した。標準設定は製造業者によって選択されたものであり、200V、120mAおよび最大25Wであった。泳動時間は60分間とし、これは泳動染色剤がゲルの下端に達するよりも長い時間ではなかった。
トランスフェクション前日、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)750,000個を収集し、6ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積3mlのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼmRNA(配列番号21446で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)750ngを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、5.5ulを最終体積250ulのOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液500ulをHeLa細胞を含有する細胞培養培地3mlに加えた。次いで、上に記載した通りにプレートをインキュベートした。
ハーセプチン重鎖(HC)修飾mRNA(配列番号21451;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾)およびハーセプチン軽鎖(LC)修飾mRNA(配列番号21452;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾)を表220に記載される通りにDLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMAで製剤化した。
トランスフェクション前日、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies、Grand Island、NY)による処理によりHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas、VA)15,000個を収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、Manassas、VA)の1ウェル当たり総体積100ulのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxを添加)に播いた。細胞を5%CO2雰囲気下、37℃で一晩培養した。翌日、ハーセプチン重鎖(HC)mRNA(配列番号21451;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプスエドウリジン(methylpsuedouridine)で完全に修飾)150ngまたはハーセプチン軽鎖(LC)(配列番号21452;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプスエドウリジン(methylpsuedouridine)で完全に修飾された)75ngまたはハーセプチンHC 500ng/ハーセプチンLC 250ngを最終体積10ulのOPTI−MEM(LifeTechnologies、Grand Island、NY)で希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、Grand Island、NY)をトランスフェクション試薬として使用し、Lipofectamine 2000 0.2ulを最終体積10ulのOPTI−MEMで希釈した。室温で5分間インキュベートした後、両溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、合わせた溶液20ulをHeLa細胞を含有
する細胞培養培地100ulに加え、室温でインキュベートした。このほか対照として、組み換えヒトIgG(Hu IgG対照)、アッセイ緩衝液およびアッセイ緩衝液が存在する未処置ウェルの培養培地(アッセイ緩衝液+対照培地)を分析した。
vitroの抗体生成の確認
HeLa細胞を血清の非存在下、実施例185に記載される通りにハーセプチン重鎖および軽鎖mRNA(ハーセプチン重鎖(HC)mRNA(配列番号21451;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプスエドウリジン(methylpsuedouridine)で完全に修飾)、ハーセプチン軽鎖(LC)(配列番号21452;配列中に示されない約140個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプスエドウリジン(methylpsuedouridine)完全に修飾)またはハーセプチンHC/LC(H&L))を用いてin vitroでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、上清を回収して濃縮し、還元剤の存在下(図61のレーン1〜5)および非存在下(図61のレーン6〜10)、4〜12%MOPS NuPAGEゲルの各レーンにタンパク質4ugを負荷して電気泳動分離を実施した。次いで、タンパク質をPVDF膜に転写し、抗体を用いた探索によりIg重鎖とIg軽鎖を同時に検出した。
をコードする化学的に修飾されたmRNAをHeLa細胞にトランスフェクトしたときに生成する両タンパク質の分子的素性を裏付けている。
A.グルコセレブロシダーゼの酵素活性
HEK293細胞にRNAiMAX(Invitrogen)と複合体を形成したグルコセレブロシダーゼ修飾mRNA(配列番号1645で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)0ng、625ng、125ng、250ng、500ng、1000ngまたは2000ngをトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、12時間後、24時間後および48時間後に細胞をPBSで洗浄した。次いで、0.54%タウロデオキシコール酸ナトリウムおよび1%Triton X−100を含有する100mMクエン酸塩−リン酸塩緩衝液(pH5.4)に細胞を溶解した。次いで、細胞溶解物を4−メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトピラノシド(4−MUG)基質0.5mMの存在下、37℃で1時間インキュベートした。1時間後、等体積の200mM水酸化ナトリウムで反応を停止させた。プレートリーダー(Ex=370nm;Em=460nm)で4−MUの変換を測定した。図62は、RNAiMAX(Invitrogen)と複合体を形成したmRNA対照トランスフェクション(イズロン酸−2−スルファターゼ(配列番号1652で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)に対して正規化した百分率で表した酵素活性を示している。
HEK293細胞にRNAiMAX(Invitrogen)と複合体を形成したリソソーム酸リパーゼ修飾mRNA(配列番号1657で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)0ng、625ng、125ng、250ng、500ng、1000ngまたは2000ngをトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、12時間後、24時間後および48時間後に細胞をPBSで洗浄した。次いで、0.54%タウロデオキシコール酸ナトリウムおよび1%Triton X−100を含有する100mMクエン酸塩−リン酸塩緩衝液(pH5.4)に細胞を溶解した。次いで、細胞溶解物を4−メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトピラノシド(4−MUG)基質0.5mMの存在下、37℃で1時間インキュベートした。1時間後、等体積の200mM水酸化ナトリウムで反応を停止させた。プレートリーダー(Ex=370nm;Em=460nm)で4−MUの変換を測定した。図63は、RNAiMAX(Invitrogen)と複合体を形成したmRNA対照トランスフェクション(イズロン酸−2−スルファターゼ(配列番号1652で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾)に対して正規化した百分率で表した酵素活性を示している。
24マルチウェルプレートのHepG2細胞内に第VIII因子修飾mRNA(配列番号1623で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)をリバーストランスフェクションによりトラ
ンスフェクトした。Invitrogen社(Carlsbad、CA)のSupplement S7添加EPILIFE(登録商標)培地でHepG2細胞を50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞にInvitrogen社(Carlsbad、CA)のRNAIMAX(商標)と複合体を形成させた第VIII因子をコードする修飾mRNA(mmRNA)0ng、250ng、500ng、750ng、1000ngをトランスフェクトした。最初にRNAを室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに5倍体積希釈で10分間インキュベートすることにより、RNA:RNAIMAX(商標)複合体を形成させた。第二のバイアルでは、RNAIMAX(商標)試薬を室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに10倍体積希釈で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルとRNAIMAX(商標)のバイアルとを混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、細胞に滴加した。
24マルチウェルプレートのHepG2細胞内に第VIII因子修飾mRNA(配列番号1623で示されるmRNA配列;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール;5’キャップ、キャップ1)をリバーストランスフェクションによりトランスフェクトした。Invitrogen社(Carlsbad、CA)のSupplement S7添加EPILIFE(登録商標)培地でHepG2細胞を50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞にInvitrogen社(Carlsbad、CA)のRNAIMAX(商標)と複合体を形成させた第VIII因子をコードする修飾mRNA(mmRNA)0ng、250ng、500ng、750ng、1000ngをトランスフェクトした。最初にRNAを室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに5倍体積希釈で10分間インキュベートすることにより、RNA:RNAIMAX(商標)複合体を形成させた。第二のバイアルでは、RNAIMAX(商標)試薬を室温でSupplement無添加EPILIFE(登録商標)培地とともに10倍体積希釈で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルとRNAIMAX(商標)のバイアルとを混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、細胞に滴加した。
あった。細胞に第VIII因子をコードするmmRNAをトランスフェクトした。第VIII因子がトロンビンによって活性化されると、第IXa因子、リン脂質およびカルシウムとともに酵素複合体を形成し、これが第X因子から第Xa因子に活性化し、これが一定濃度で過剰にアッセイに添加された第X因子を第Xa因子に活性化する。この活性は第VIII因子の量と直接関係がある。
A.in vitroのLDLR発現
ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)細胞(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を6ウェルプレート(BD Biosciences、San Jose、USA)に播く。HEK293は細胞培養培地3mLに約500,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞播種後、LDLR mRNA(配列番号21463で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))または対照のG−CSF mRNA(配列番号21438で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)を含有する製剤を1ウェル当たり4000ng、800ng、400ng、40ngおよび4ngの量で直接加え、インキュベートする。対照として、G−CSF mRNAをトランスフェクトした細胞を抗LDLR抗体で処理し、LDLRをトランスフェクトした1組の細胞を通常のヤギIgGで処理した。PE標識二次抗体で処理した後、結合した一次抗体をFACS解析により検出した。
ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)細胞(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を6ウェルプレート(BD Biosciences、San Jose、USA)に播く。HEK293は細胞培養培地3mLに約500,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞播種後、LDLR mRNA(配列番号21463で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))または対照のG−CSF mRNA(配列番号21438で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)配列番号21438を含有する製剤を1ウェルごとに直接加え、インキュベートする。15時間後、トランスフェクション培地を完全培地に交換する。培地交換の0時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、48時間後および72時間後にトランスフェクト細胞を収集する。トランスフェクトした細胞をフィコエリトリン(PE)とコンジュゲートした抗LDLR抗体で処理し、対照として、LDLRでトランスフェクトした1組の細胞をPEとコンジュゲートした通常のヤギIgGで処理した。結合した一次抗体を上記の通りにFACS解析により検出した。
発現したLDLRが機能的であるかどうかを検討するため、BODIPY(登録商標)標識LDLを用いた。HEK293細胞をLDLR修飾mRNA(配列番号21463で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約16個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))またはG−CSF修飾mRNA(配列番号21438で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)で一晩トランスフェクトし、細胞を洗浄し、BODIPY−LDLの量を漸増させてインキュベートした。37℃で1.0時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、FACSによりBODIPY−LDLの結合を評価した。図66Cに示される通り、BODIPY−LDLとLDLR mRNAをトランスフェクトした細胞との結合は親和性が高く(Kd約60ng/mL)、飽和性であった。
A.in vitroのUGT1A1発現
ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)細胞(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を6ウェルプレート(BD Biosciences、San Jose、USA)に播く。HEK293は細胞培養培地3mLに約500,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞播種後、UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)mRNA(配列番号21463で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))または対照のG−CSF mRNA(配列番号21438で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)を含有する製剤を1ウェル当たり4000ng、800ng、400ng、40ngおよび4ngの量で直接加え、インキュベートする。対照として、G−CSF mRNAをトランスフェクトした細胞を抗UGT1A1抗体で処理し、UGT1A1をトランスフェクトした1組の細胞を通常のヤギIgで処理した。PE標識二次抗体で処理した後、結合した一次抗体をFACS解析により検出した。
ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)細胞(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を6ウェルプレート(BD Biosciences、San Jose、USA)に播く。HEK293は細胞培養培地3mLに約500,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞播種後、UGT1A1 mRNA(配列番号2146で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))または対照のG−CSF mRNA(配列番号21438で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)を含有する製剤を1ウェルごとに直接加え、インキュベートする。15時間後、トランスフェクション培地を完全培地に交換する。培地交換の0時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、48時間後および72時間後にトランスフェクト細胞を収集する。トランスフェクトした細胞をフィコエリトリン(PE)とコンジュゲートした抗UGT1A1抗体で処理し、対照として、UGT1A1でトランスフェクトした1組の細胞をPEとコンジュゲートした通常のヤギIgGで処理した。結合した一次抗体を上記の通りにFACS解析により検出した。
げた条件下では、UGT1A1 mRNAの見かけの半減期は約40.0時間であった。
[0001882]HEK293 ヒト胎児腎上皮細胞(HEK293)細胞(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)を6ウェルプレート(BD Biosciences、San Jose、USA)に播く。HEK293は細胞培養培地2.4mLに約500,000細胞/ウェルの密度で播く。細胞播種後、UGT1A1 mRNA(配列番号21464で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1、約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール(配列中に示されていない))またはOTC mRNA(配列番号1659で示されるmRNA;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全に修飾;5’キャップ、キャップ1;配列中に示されない約160個のヌクレオチドのポリ−Aテール)を含有する製剤を1ウェル当たり800ngの量で直接加え、16時間インキュベートする。PBS 500uLで細胞を洗浄し、細胞を擦り取ってPBS 500uL中に収集した。細胞を200×gで5分間遠心分離し、プロテアーゼ阻害剤を添加したRIPA緩衝液250uLに再懸濁させた。管を14,000×gで10分間遠心分離した。上清をcentrificon濃縮カラムに移し、14,000×gで30分間遠心分離し、可溶化液を濃縮した。BCAタンパク質アッセイ(Thermo
Fisher Scientific Inc、Rockford、USA)により可溶化液を定量化した。
液では抗UGT1A1 IgGによりUGT1A1が約60kDaのバンドとして検出されたが(レーン4)、OTC mRNAをトランスフェクトした細胞では検出されなかった(レーン3)。同じ可溶化液を用いて、OTC mRNAをトランスフェクトした細胞の可溶化液では抗OTC IgGによりOTCが約39kDaのバンドとして検出されたが(レーン7)、UGT1A1 mRNAをトランスフェクトした細胞では検出されなかった(レーン8)。以上のデータは、外来性のUGT1A1 mRNAおよびOTC mRNAが哺乳動物細胞で同族タンパク質合成を指令することが可能であることを裏付けるものである。
A.HEK293細胞、マウス筋芽細胞およびラット筋芽細胞のトランスフェクション
HEK293(LGC standards GmbH、Wesel、Germany)、C2C12マウス筋芽細胞系(ATCC)およびL6ラット筋芽細胞系(ATCC)を24ウェルディッシュ(BD Biosciences、San Jose、USA)の10%ウシ胎仔血清(ATCC)添加DMEM(ATCC)に播いた(1.5×105細胞/ウェル)。
トランスフェクション後、培地を細胞から除去し、各ウェルに0.25%トリプシン(Life Technologies、Grand Island、NY)60ulを加えた。細胞をトリプシンで2分間処理した後、240ul/ウェルのトリプシン阻害剤(Life Technologies、Grand Island、NY)を加えた。得られた細胞溶液を96ウェルプレート(Corning Life Sciences、Tewksbury、MA)に移し、遠心分離(800×重力で5分間)により細胞をペレット化し、上清を捨てた。細胞ペレットをPBSで洗浄し、Foxp3固定/透過処理液(eBioscience、San Diego、CA)に45分間再懸濁させた。細胞を遠心分離(800×重力で5分間)により再びペレット化し、透過処理緩衝液(eBiosciences、San Diego、CA)に10分間再懸濁させた。細胞を遠心分離(800×重力で5分間)により再びペレット化し、透過処理緩衝液で洗浄した。PAHをトランスフェクトした細胞をフィコエリトリン(PE)とコンジュゲートした抗PAH抗体で処理した。染色対照として、PAHをトランスフェクトした1組の細胞をPEとコンジュゲートした通常のヤギIgGで処理した。トランスフェクション対照として、G−CSFをトランスフェクトした1組の細胞をフィコエリトリン(PE)とコンジュ
ゲートした抗PAH抗体で処理した。結合した一次抗体を上記の通りにFACS解析により検出した。次いで、標識細胞をFACS緩衝液(1%ウシ血清アルブミンおよび0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)と組み合わせ、クラスター管に移した後、BD Accuri(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いてフローサイトメトリーにより標識細胞を解析した。図70に示される通り、PAHをトランスフェクトしたHEK293細胞の11.9%PAHの発現が検出され、UGT1A1をトランスフェクトしたHEK293細胞の58.6%にUGT1A1の発現が検出された。各mRNAについて、ラットまたはマウス筋芽細胞を用いても、陽性細胞のパーセントはHEK293細胞で得られた結果とほぼ同じであった。
HEK293細胞にUGT1A1 mRNAをトランスフェクトし、上記の通りに細胞溶解物を調製した。Simple Simon Westernシステム(Protein Simple)を用いてウエスタン解析を実施した。図71に示される通り、UGT1A1 mRNAをトランスフェクトした細胞の可溶化液ではUGT1A1(約60kDaのバンド)が抗UGT1A1 IgGにより検出されたが(レーン1、4および6)、同一濃度の非免疫IgGによっては検出されなかった(レーン2および5)。同様に、同量の非トランスフェクトHep3b細胞の細胞溶解物(レーン3)を用いても、OTC mRNAをトランスフェクトしたHEK293細胞の可溶化液(レーン7)でも、UGT1A1は検出されなかった。
これが任意のそのような詳細もしくは実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるべきであるようには意図されず、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の可能な限り広範な解釈を提供し、それにより本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
Claims (92)
- 単離ポリヌクレオチドであって、
(a)結合ヌクレオシドの第1の領域であって、前記第1の領域が目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチドが配列番号769〜1392からなる群から選択される、結合ヌクレオシドの第1の領域と、
(b)前記第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域であって、
(i)配列番号769〜1392、配列番号1〜4、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然5’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
(ii)少なくとも1つの5’末端キャップと
を含む、第1の隣接領域と、
(c)前記第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域であって、
(i’)配列番号769〜1392、配列番号5〜21、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
(ii’)結合ヌクレオシドの3’尾部配列と
を含む、第2の隣接領域と
を含む、単離ポリヌクレオチド。 - 前記結合ヌクレオシドの第1の領域が核酸配列の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列が配列番号1393〜21423、21435〜21438、21442〜21433、21449、21451〜21473、21521〜21542、21639〜21642、21671〜21679、21681、21682、21684、21686、21687、21724〜21726、21728および21730〜21738からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記結合ヌクレオシドの3’尾部配列が、約160個のヌクレオチドのポリA尾部およびポリA〜G四重項からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 精製される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記結合ヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、A、G、U、またはCリボヌクレオチドの化学構造と比較して、少なくとも1つの修飾を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの前記修飾がヌクレオシド塩基および/または糖部分に位置する、請求項6に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、式(Ia):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
が、一重または二重結合であり、
が、一重結合であるか、または不在であり、
R1’、R2’、R1”、R2”、R3、R4、およびR5の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、R3と、R1’、R1”、R2’、R2”、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、R5と、R1’、R1”、R2’、またはR2”のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、R4と、R1’、R1”、R2’、R2”、R3、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル
、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基であり、BとR1’の組み合わせ、BとR2’の組み合わせ、BとR1”の組み合わせ、もしくはBとR2”の組み合わせが、それらが結合する炭素と一緒になって、二環式基を任意に形成し得るか、またはBとR1”とR3の組み合わせもしくはBとR2”とR3の組み合わせが、三環式もしくは四環式基を任意に形成し得る、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - Bが、シュードウリジン(ψ)でも5−メチル−シチジン(m5C)でもない、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。
- Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
R1、R1’、R1”、R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
R3およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、Oまたは任意に置換されたアルキレンであり、
nが、10〜10,000の整数である、
請求項8または9に記載の単離ポリヌクレオチド。 - R1、R1’、およびR1”の各々が、存在する場合、Hである、請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド。
- R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド。
- R2、R2’、およびR2”の各々が、存在する場合、Hである、請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド。
- R1、R1’、およびR1”の各々が、存在する場合、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項13に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、式(IIa):
を有するn個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIb)もしくは(IIc)を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記第1の領域が、式(IId):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIe)もしくは(IIf)を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項17に記載の単離ポリペプチド。
- 前記第1の領域が、n個の結合ヌクレオチドであって、前記結合ヌクレオチドの各々が、独立して、式(IIg)〜(IIj):
のうちの1つを有するn個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIk):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIl):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項20に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIm):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
R1’、R1”、R2’、およびR2”の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、R2’とR3の組み合わせまたはR2”とR3の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る、請求項20に記載の単離ポリヌクレオチド。 - Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
R1およびR2の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
R3およびR4の各々が、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、Oまたは任意に置換されたアルキレンであり、
nが、10〜10,000の整数である、
請求項11〜22のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記第1の領域が、式(IIn):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、1〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
R1およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
R3”が、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、10〜10,000の整数である、
請求項8に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記n個のBにおいて、各Bが、独立して、式(b1)〜(b5):
から選択される式、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
式(b1)における、V1とV2を連結する
が、一重または二重結合であり、
T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせもしくはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、
V1およびV2の各々が、独立して、O、S、N(RVb)nv、またはC(RVb)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVbが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
R10が、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、
R12aが、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
R12cが、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項8〜24のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b6)〜(b9):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
が、一重または二重結合であり、
T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせもしくはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、
W1およびW2の各々が、独立して、N(RWa)nwまたはC(RWa)nwであり、式中、nwが、0〜2の整数であり、各RWaが、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、
各V3が、独立して、O、S、N(RVa)nv、またはC(RVa)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVaが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、RVaおよびR12cが、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、
R12bが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノ酸であり、R12bとT1’の組み合わせまたはR12bとR12cの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
R12cが、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項8〜25のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - R12a、R12b、R12c、もしくはRVaが、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、R’が、HもしくはC1〜20アルキルであるか、または−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、各RN1が、独立して、水素もしくは任意に置換されたC1〜6アルキルである、
請求項26に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b10)〜(b14):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
T3’およびT3”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT3’とT3”の組み合わせが一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、
各V4が、独立して、O、S、N(RVc)nv、またはC(RVc)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVcが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、R13bとRVcの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各R14が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノアルキルで
あり、
R15およびR16の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、請求項8〜27のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b15)〜(b17):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
T4’、T4”、T5’、T5”、T6’、およびT6”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、T4’とT4”の組み合わせまたはT5’とT5”の組み合わせまたはT6’とT6”の組み合わせが一緒になって、O、S、またはSeを形成し、
V5およびV6の各々が、独立して、O、S、N(RVd)nv、またはC(RVd)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVdが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
R17、R18、R19a、R19b、R21、R22、R23、およびR24の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアミノ酸である、
請求項7〜27のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b18)〜(b20):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
各V7が、独立して、O、S、N(RVe)nv、またはC(RVe)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVeが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
各R25が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
R26aおよびR26bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、または任意に置換されたアルコキシであり、
各R27が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各R28が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各R29が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノである、請求項8〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 - R26a、R26b、またはR29が、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、R’が、HもしくはC1〜20アルキル)であるか、または−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1で置換され、式中、s1が、1〜10の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10の整数であり、各RN1が、独立して、水素もしくは任意に置換されたC1〜6アルキルである、請求項30に記載の単離ポリヌクレオチド。
- n個のBが、式(b21):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、X12が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、xaが、0〜3の整数であり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T2が、O、S、またはSeである、請求項8〜31のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b22):
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、R10’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T1およびT2の各々が、独立して、O、S、またはSeである、請求項8〜32のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b23):
を有し、式中、R10が、任意に置換されたヘテロシクリルまたは任意に置換されたアリールであり、R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R12aが、H、任
意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、T1およびT2の各々が、独立して、O、S、またはSeである、請求項8〜33のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - n個のBが、式(b24):
を有し、式中、
T3が、O、S、またはSeであり、
R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
R14’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
各R15が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、
請求項8〜34のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 標的部分をさらに含み、前記標的部分が前記ポリヌクレオチドに共有結合される、請求項1〜35のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記標的部分が、抗体、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣物、またはアプタマーである、請求項36に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 前記賦形剤が、溶媒、水性溶媒、非水溶媒、分散媒、希釈剤、分散剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、脂質、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、コアシェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックスペプチド、タンパク質、細胞、
ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物から選択される、請求項39に記載の薬学的組成物。 - 前記薬学的組成物が脂質を含み、前記脂質が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、およびPEG化脂質、ならびにこれらの混合物から選択される、請求項40に記載の薬学的組成物。
- 哺乳類細胞、組織、または生物体において目的とするポリペプチドを産生する方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項1〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項38〜41のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
- 前記単離ポリヌクレオチドが製剤化される、請求項42に記載の方法。
- 前記製剤が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、PEG化脂質、およびこれらの混合物または組み合わせのうちの1つから選択される脂質を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記単離ポリヌクレオチドが1μg〜150μgの総1日用量で投与される、請求項44に記載の方法。
- 投与が注入による、請求項45に記載の方法。
- 投与が、皮内もしくは皮下または筋肉内または硝子体内である、請求項46に記載の方法。
- 前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも2時間後、少なくとも50pg/mLである、請求項45に記載の方法。
- 前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも72時間後、50pg/mLを超えたままである、請求項45に記載の方法。
- 前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも72時間後、60pg/mLを超えたままである、請求項49に記載の方法。
- 結果として生じるポリヌクレオチド製剤が、80nm〜160nmの平均粒径、0.02〜0.20のPDI、および10〜20の脂質:ポリヌクレオチド比(重量/重量)を有する、請求項44に記載の方法。
- 哺乳類細胞、組織、または生物体において配列番号769〜1392からなる群から選択される増加した濃度の目的とするポリペプチドを産生するための方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項4〜37のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項38〜41のいずれか一項に記載の薬学的組成物の総1日用量を2回以上に均等または不均等に分割された用量で投与することを含む、方法。
- 前記投与に応答して産生されたポリペプチドの濃度が、同一の総1日用量の前記単離ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物を単回投与で投与することによって産生される濃度よりも高い、請求項52に記載の方法。
- 前記哺乳類生物体は、増加した濃度の前記目的とするポリペプチドを必要とするヒト患者である、請求項52に記載の方法。
- 前記増加した濃度の前記目的とするポリペプチドが、前記患者の体液中で検出可能である、請求項54に記載の方法。
- 前記体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、ならびに臍帯血からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
- 前記体液が血清であり、単位薬物当たり(PUD)の前記ポリペプチドが1を超える、請求項56に記載の方法。
- 用量分割因子(DSF)が4を超える、請求項57に記載の方法。
- 投与が経皮である、請求項55に記載の方法。
- 経皮投与が、パッチ、クリーム、軟膏、機械デバイス、針、スポンジ、デポー、および織物からなる群から選択される1つ以上の要素の利用を含む、請求項59に記載の方法。
- 投与が、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年間にわたって行われる投薬レジメンに従う、請求項59に記載の方法。
- 前記2回以上に分割された用量が、T1時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第1の用量と、その後のT2時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第2の用量と、を含み、前記T1時点および前記T2時点が、1分より長く隔てられることはなく、前記第1の用量および前記第2の用量が、前記目的とするポリペプチドをもたらす量のポリヌクレオチドまたは薬学的組成物が単回単位用量で一度に投与された場合よりも高い濃度の前記目的とするポリペプチドをもたらす前記量で前記対象に投与される、請求項52に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の複数の用量をTn時点でNx回投与することをさらに含み、式中、xおよびnが、3〜約1000から独立して選択され、TnとTn+1との間の時間が、10秒より長い増分で隔てられることはない、請求項62に記載の方法。
- 投与が直接注入により行われる、請求項63に記載の方法。
- 直接注入が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、および硝子体内からなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記第1の用量が前記第2の用量または複数の用量に対して近位に投与される、請求項64に記載の方法。
- 前記第1の用量が前記第2の用量または複数の用量に対して遠位に投与される、請求項64に記載の方法。
- 前記第1の用量の注入部位と第2の用量または複数の用量のうちのいずれかの注入部位との間の距離が約1mm〜約10cmである、請求項64に記載の方法。
- 注入が0.1mm〜約1cmの深度で行われる、請求項64に記載の方法。
- 直接注入が、多針注入システム、カテーテルまたは管腔システム、および超音波、電気、または放射線に基づくシステムから選択される1つ以上のデバイスを用いることによって達成される、請求項65に記載の方法。
- 任意の用量において投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の量が実質的に等しい、請求項63に記載の方法。
- T1時点およびT2時点が、30秒より長く隔てられることはない、請求項63に記載の方法。
- T1時点およびT2時点が、10秒より長く隔てられることはない、請求項63に記載の方法。
- 前記第1の用量、前記第2の用量、および複数の用量のうちのいずれも、実質的に同時に投与される、請求項63に記載の方法。
- 前記単回単位用量が約10mg/kg〜約500mg/kgである、請求項63に記載の方法。
- 前記単回単位用量が約1.0mg/kg〜約10mg/kgである、請求項63に記載の方法。
- 前記単回単位用量が約0.001mg/kg〜約1.0mg/kgである、請求項63に記載の方法。
- 目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤を調製する方法であって、第1のエタノール溶液を第2の水溶液中に迅速に注入することを含み、
(a)前記第1のエタノール溶液が、50:10:38.5:1.5のモル比をもたらし、かつ約25mMの最終脂質濃度を有する脂質:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMGの混合物を含み、
(b)前記第2の水溶液が、1〜2mg/mLの濃度および約3のpHを有する前記目的とするポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドのクエン酸ナトリウム緩衝液を含み、
前記迅速な注入が、33%のエタノールを含有し、かつ少なくとも10:1の総脂質:ポリヌクレオチドの重量比の懸濁液をもたらす、方法。 - 前記迅速な注入が、手動(MI)で、またはシリンジポンプ(SP)を用いてのいずれかで行われる、請求項78に記載の方法。
- 結果として生じる懸濁液をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析することをさらに含む、請求項79に記載の方法。
- 透析が2回以上行われる、請求項80に記載の方法。
- 前記透析した懸濁液を0.2μmの滅菌フィルターを通して濾過することをさらに含む、請求項81に記載の方法。
- 前記脂質が、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、DODMA、DSDMA、DLenDMA、reLNP、PLGA、およびPEG化脂質からなる群から選択される、請求項78〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、請求項1〜37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項78〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項78〜84のいずれか一項に記載の方法によって産生され、かつ80nm〜160nmの粒径、0.02〜0.20のPDI、および10〜30の脂質:ポリヌクレオチド比(重量/重量)を有する、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤。
- 前記ポリヌクレオチドが、請求項1〜37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項85に記載の脂質ナノ粒子製剤。
- ポリヌクレオチドのreLNP製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、reLNP製剤。
- 前記ポリヌクレオチドが請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項87に記載のreLNP製剤。
- ポリヌクレオチドの持続放出製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、持続放出製剤。
- 前記ポリヌクレオチドが請求項1〜36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項89に記載の持続放出製剤。
- 融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質が第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む、ポリヌクレオチド。
- 前記第1のポリペプチドが、Fc受容体、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、IgAドメイン、IgDドメイン、IgEドメイン、IgDドメイン、IgMドメイン、IgVドメイン、IgC1ドメイン、IgC2ドメイン、およびIgIドメインからなる群から選択され、前記第2のポリペプチドが、目的とするポリペプチドである、請求項91に記載のポリヌクレオチド。
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