CN109310738A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗实体癌和血液癌(包括急性骨髓性白血病(AML))的组合物和方法。所述方法包括施用截断的显性负性形式的半乳糖凝集素‑3。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2016年3月14日提交的名称为“用于治疗癌症的组合物和方法”的美国临时专利申请序列号第62/308,045号的优选权，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
半乳糖凝集素是S-型凝集素，其与含有β-半乳糖的糖缀合物结合。自从1975年在动物细胞中发现第一种半乳糖凝集素之后，已经分离出15种哺乳动物半乳糖凝集素，并且已经显示它们参与各种生物过程，例如细胞粘着、生长调节以及程序化细胞死亡。半乳糖凝集素还参与肿瘤的产生和进展，并且显示半乳糖凝集素-3(“Gal-3”)参与癌细胞粘着、转移、血管生成、侵入、生长以及化疗抗性。参见Ebrahim等人，“癌症中的半乳糖凝集素：致癌作用、诊断以及治疗(Galectins in cancer:carcinogenesis,diagnosis and therapy)”，《转化医学年鉴(Ann.Transl.Med.)》2(9)：88(2014)。
与其它半乳糖凝集素一样，Gal-3具有典型的C-端糖识别域(“CRD”)。但是与其它半乳糖凝集素不同，半乳糖凝集素-3还包括可赋予多价特征的氨基端结构域。氨基端结构域容许Gal-3与细胞表面上和细胞外基质中的含糖配体交联，从而调控细胞粘着和信号传导。
Gal-3的C-端CRD不能独自与细胞表面上的含糖配体交联；在没有N-端结构域的情况下，C-端CRD不具有血凝反应活性，缺乏表征完整外源凝集素的协同性结合。已经证明保留C-端CRD但是缺乏氨基端多聚化结构域的重组表达的Gal-3蛋白的N-端截断物充当Gal-3介导的交联的显性负性抑制剂，在体外分析中干扰各种肿瘤相关的特性，并在各种人类癌症的动物模型中抑制肿瘤的生长和转移。因此这种N-端截断蛋白已经被建议用于治疗各种人类癌症。
例如，一种这种截断物“Gal3C”已经被建议用于单独或者与化疗一起治疗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌以及所有实体形式和血液形式的癌症，参见美国专利第6,770,622号；对于与像硼替佐米和卡非佐米这样的蛋白酶体抑制剂一起治疗多发性骨髓瘤，参见美国专利第9,272,014号；对于单独或者与像紫杉醇、卡铂或硼替佐米这样的化疗剂一起治疗卵巢癌，参见美国核准前出版物2015/0157691。美国核准前出版物2015/0216931描述了一小类N-端Gal-3截断蛋白，共同称作“Gal3M”，其与天然人类Gal-3相比含有一种或多种确认的氨基酸改变。预计重组表达的Gal3M蛋白可用来单独或者与蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米和卡非佐米)和其它化疗剂一起治疗实体瘤(包括癌和肉瘤)，以及范围广泛的血液癌(包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓细胞白血病(“AML”)、急性淋巴细胞白血病(“ALL”)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓源性白血病(“CML”)以及骨髓增生异常综合征)。
尽管显性负性的N-端Gal-3截断蛋白具有治疗前景，但是仍需要进一步对Gal-3显性负性的截断蛋白进行优化。并且，尽管显性负性的N-端Gal-3截断蛋白作为动物模型数据在特定的癌症中被广泛接受为预测在特定癌症中的疗效(参见(例如)Mirandola等人，“抗-半乳糖凝集素-3治疗：多发性骨髓瘤和卵巢癌的一个新的机会？(Anti-Galectin-3Therapy:A new Chance for Multiple Myeloma and Ovarian Cancer？)”，《国际免疫学综述(Int.Rev.Immunol.)》，33：417-427(2014)；以及Pena等人，“半乳糖凝集素作为恶性血液肿瘤的治疗靶点：充满希望的甜蜜(Galectins as therapeutic targets forhematological malignancies:a hopeful sweetness)”，《转化医学年鉴(Ann.Transl.Med.)》2(9)：87(2014))，但是基于被认为与另外的癌症共有的少量半乳糖凝集素-3介导的生物途径上的预测，提出显性负性的N-端Gal-3截断蛋白可外推至这些另外的癌症。因此，本领域需要确认N-端截断的Gal-3蛋白最终将会证明有效的所有癌症。
发明内容
在第一方面，提供了新的半乳糖凝集素-3N-端截断蛋白。
在特定的实施例中，所述蛋白质具有氨基酸序列SEQ.ID NO.5(CBPI.001)或SEQ.ID NO.7(CBPI.002/Gal3M1)。
在各种实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基108至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的一个、Gal3M1中存在的取代中的两个、Gal3M1中存在的取代中的三个、或者Gal3M1中存在的取代中的四个。在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基109至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基110至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基111至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基112至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基113至250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在再其它的实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括残基114至250、115至250、116至260、117至250、118至250、119至250、120至250、121至250、122至250、123至250或124至250，其中每个这种实施例任选地以任意组合包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的一个、两个、三个或四个。
在各种实施例中，与天然Gal-3蛋白相比，N-端截断蛋白在残基113、114、118以及248中的一个或多个残基处包括或进一步包括与Gal3M1中存在的那些取代不同的取代。在特定的实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在一些实施例中，与Gal3M1蛋白相比，N-端截断蛋白在残基113、114、118以及248中的一个或多个残基处包括或进一步包括取代。在特定的实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在各种实施例中，与天然Gal-3相比，N-端截断蛋白在除113、114、118以及248之外的残基处包括或进一步包括至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个取代。在某些实施例中，与天然Gal-3相比，N-端截断蛋白在除113、114、118以及248(根据天然Gal-3进行编号)之外的残基处包括或进一步包括至少6个、7个、8个、9个或10个或更多个氨基酸取代。在某些实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在典型的实施例中，N-端截断蛋白与天然Gal-3蛋白具有70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多的序列同一性。在某些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有85％、86％、87％、88％、89％或90％的序列同一性。在一些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性。在一些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在另一方面，提供了编码这种蛋白质的多聚核苷酸，包括核酸载体，包括核酸表达载体，其包含编码新的N-端截断蛋白的多聚核苷酸。
在另一方面，提供了用于治疗癌症的方法。所述方法包含给患有癌症的受试者施用治疗有效量的包含新的Gal-3N-端截断蛋白的药物组合物。
在一些实施例中，所用量可有效降低癌细胞中肿瘤生长或存活所需的至少一个信号转导途径的活性。
在特定的实施例中，所述信号转导途径选自由以下组成的群组：Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径。
在某些实施例中，所述信号转导途径为β-连环蛋白信号转导途径。在一些实施例中，所述信号转导途径为CD44信号传导途径。
在各种实施例中，所述癌症为恶性血液肿瘤。在一些实施例中，所述恶性血液肿瘤选自由以下组成的群组：T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴母细胞白血病、慢性髓源性白血病以及急性骨髓性白血病(AML)。
在特定的实施例中，所述恶性血液肿瘤为AML。在某些实施例中，Gal-3N-端截断蛋白与权利要求4的药物组合物至少一种AML诱导化疗剂一起施用。在精选的实施例中，诱导化疗剂为伊达比星(idarubicin)。在某些实施例中，诱导化疗剂为阿糖胞苷(cytarabine)。
在一些实施例中，癌症为恶性实体肿瘤。在特定的实施例中，癌症选自由以下组成的群组：乳腺癌、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌以及肾细胞癌。在这些实施例的子集合中，Gal-3N-端截断蛋白与至少一种抗肿瘤化疗剂或生物剂一起施用。在特定的实施例中，至少一种另外的药剂选自由以下组成的群组：硼化合物、烷基化剂、抗代谢药物、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂以及皮质类固醇。
在另一方面，提供了与Gal-3N-端截断蛋白Gal3C一起治疗癌症的方法。所述方法包含施用治疗有效量的具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白，其中所用量可有效降低癌细胞中肿瘤生长或存活所需的至少一个信号转导途径的活性，其中所述途径选自由以下组成的群组：Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径，并且其中所述癌症不是多发性骨髓瘤或卵巢癌。
附图说明
本专利或专利申请文件包含至少一个彩制附图。应请求并在缴纳必需的费用之后，官方将提供具有彩色附图的本专利或者专利申请的副本。
图1-提供天然半乳糖凝集素-3、Gal3C以及Gal3M1的结构域结构的示意图。
图2-MTT分析结果示意性地说明CBPI1和CBPI2在卵巢癌中的作用。区块A)显示与仅使用Pax相比，CBPI1和CBPI2与紫杉醇(Pax)一起组合治疗均会显著增加SKOV3细胞的细胞凋亡速率。区块B)显示与对照细胞相比，仅使用CBPI1和CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的细胞存活率。
图3-MTT分析结果示意性地说明CBPI1和CBPI2在多发性骨髓瘤中的作用。区块A)显示与仅使用Bor相比，CBPI2与硼替佐米(Bor)一起组合治疗会显著增加U266细胞的细胞凋亡速率。区块B)显示仅使用CBPI1和CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图4-MTT分析结果示意性地说明CBPI1和CBPI2在乳腺癌中的作用。区块A)显示与对照细胞相比，仅使用CBPI2会显著增加MCF7细胞的细胞凋亡速率。区块B)显示仅使用CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图5-MTT分析结果示意性地说明CBPI1和CBPI2在急性单核细胞性白血病中的作用。区块A)显示与对照细胞相比，CBPI1和CBPI2与Ara-C一起会显著增加THP1细胞的细胞凋亡速率。区块B)显示仅使用CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图6–显示点图，其代表对本文所分析的每个细胞系的细胞凋亡分析的结果：区块A)SKOV3；区块B)U266；区块C)THP1。
具体实施方式
5.1.定义
权利要求书和说明书中所用的术语如下所述进行定义，除非另行规定。
术语“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物，全部为它们的D和L立体异构体，除非另外指出，如果它们的结构容许这种立体异构形式。
天然氨基酸是丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天门冬酰胺(Asn或N)、天门冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯基丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)以及缬氨酸(Val或V)。
非天然氨基酸包括(但不限于)氮杂环丁烷甲酸，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸(“tBuG”)、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天门冬酰胺、高脯氨酸(“hPro”或“homoP”)、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸(“3Hyp”)、4-羟基脯氨酸(“4Hyp”)、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸(“MeAla”或“Nime”)、N烷基甘氨酸(“NAG”)(包括N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸)、N-烷基戊基甘氨酸(“NAPG”)(包括N-甲基戊基甘氨酸)、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸(“Norval”)、正亮氨酸(“Norleu”)、辛基甘氨酸(“OctG”)、鸟氨酸(“Orn”)、戊基甘氨酸(“pG”或“PGly”)、哌可酸、硫脯氨酸(“ThioP”或“tPro”)、高赖氨酸(“hLys”)以及高精氨酸(“hArg”)。
术语“氨基酸类似物”是指一种天然或非天然的氨基酸，其中C-端羧基、N-端氨基以及侧链官能团中的一个或多个已经被可逆或不可逆地化学封闭，或者被修饰为另一种官能团。例如，天门冬氨酸-(β-甲酯)是天门冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物；或者，丙氨酸酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。其它氨基酸类似物包括蛋氨酸亚砜、蛋氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜以及S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。如本文所使用，术语“肽”是指一种通过肽键连接在一起的氨基酸短聚合物。与其它氨基酸聚合物(例如蛋白质、多肽等)相比，肽在长度上具有约50个氨基酸或更少。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及/或者修饰的氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白质或非天然(合成)序列的子序列。
如本文所使用，“保守的氨基酸取代”是指肽或多肽中的氨基酸被具有类似化学特性(例如尺寸或电荷)的另一种氨基酸取代。为了本公开的目的，以下8个群组各自含有互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；
2)天门冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
3)天门冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)以及缬氨酸(V)；
6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)以及色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)。
如本文所使用，“半保守的氨基酸取代”是指肽或多肽中的氨基酸被同一类别中的另一种氨基酸取代。天然存在的残基可基于共同的侧链特性进行分类，例如：极性阳性(组氨酸(H)、赖氨酸(K)以及精氨酸(R))；极性阴性(天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；极性中性(丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))；非极性脂肪族(丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M))；非极性芳香族(苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))；脯氨酸和甘氨酸；以及半胱氨酸。
在一些实施例中，除非另行规定，否则保守的或半保守的氨基酸取代还可包括化学特性与天然残基类似的非天然存在的氨基酸残基。这些非天然残基通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成引入。这些包括(但不限于)肽模拟物和其它反向形式或倒置形式的氨基酸基团。在一些实施例中，本文的实施例可局限于天然氨基酸、非天然氨基酸以及/或者氨基酸类似物。非保守取代可涉及一个类别的成员与另一类别的成员的互换。
“非保守的氨基酸取代”可涉及一个类别的成员与另一类别的成员的互换。
术语“蛋白质”不管长度如何进行使用，并且与术语“多肽”同义使用。
术语“肽模拟物(peptide mimetic)”或“肽模拟物(peptidomimetic)”是指一种类肽分子，其模拟衍生自一种蛋白质或肽的序列。肽模拟物(peptide mimetic)或肽模拟物(peptidomimetic)可含有氨基酸组分和/或非氨基酸组分。肽模拟物的实例包括化学修饰的肽、类肽(侧链添加到肽骨架的氮原子而不是α碳上)、β-肽(氨基与β碳而不是α碳键连)等。
术语“施用(或“给药”)(administration of)”或“施用(或“给药”)(administering)”治疗化合物或组合物是指将化合物或组合物引入需要治疗的受试者的体内。该术语包括将化合物或组合物直接引入受试者的体内，例如通过胃肠外给药，或者将化合物或组合物间接引入受试者的体内，例如通过开处将化合物或组合物引入受试者体内的处方，通过给出将化合物或组合物引入受试者体内的指令，或者通过提供根据指导或建议将化合物或组合物用于受试者。施用(或“给药”)(administrationof)或施用(或“给药”)(administering)包括通过任何给药途径施用(或给药)，包括：口服给药；含服给药；舌下给药；胃肠外施用，包括静脉内给药、肌内给药、皮下给药、腹膜内给药、鞘内给药以及脑室给药；肿瘤内给药；鼻腔给药；肺部给药；直肠给药。
如本文所使用，“受试者”广泛地指任何动物，包括(但不限于)人类和非人类动物。在典型的实施例中，所述受试者为哺乳动物，包括人类。术语“人类”包括任一性别和任何发育阶段(例如胎儿、新生儿、幼儿、少年、青年、成年)的人类受试者。如本文所使用，术语“患者”是指对疾病或状况进行治疗的人类受试者。
术语“有效量”是指主体化合物或组合物的量足以在细胞、组织或生物体中引起期望的生物响应。
术语“治疗有效量”是指主体化合物或组合物的量足以为受试者提供治疗益处或者临床益处。所述治疗益处或者临床益处可包括缓解症状、降低疾病严重程度、减慢疾病进展、终止疾病进展、增加总体存活率、增加无进展生存期、增加其它疗法的功效。
有效量或治疗有效量可以单次或多次给药、单次或多次敷用或者单个或多个剂量施用，并非旨在局限于特定的剂型或给药途径。
如本文所使用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指获得有益结果或者期望的临床结果。所述有益结果或者期望的临床结果可包括缓解症状、降低疾病的严重程度、减慢疾病进展、终止疾病进展、增加总体存活率、增加无进展生存期、增加其它疗法的功效。
如本文所使用，“药学上可接受的”组分是这样的组分：其适合用于受试者(例如人类和/或动物)而不会产生过度的不良副作用(例如毒性、刺激以及过敏反应)，从而与临床益处/风险比相称。
如本文所使用，术语“抗性的”或“顽固性的”当用来指癌症时是指癌细胞对之前的化疗或其它治疗方案(例如放疗)不再响应。术语“使…对…敏感”或“重新使…对…敏感”当用来指癌症时是指癌细胞再次对之前它们已经对其具有抗性或顽固性的化疗或其它治疗方案(例如放疗)产生响应。
如本文所使用，关于肽和多肽的术语“序列同一性”是指两个肽或多肽序列具有相同排列组成的单体子单元的程度。“序列同一性百分比”通过以下计算：(1)将两个最佳排列的序列在较短序列的长度上进行对比；(2)确定含有相同氨基酸的位置的数量，得到匹配位置的数量，(3)将匹配位置的数量除以较短序列中的位置的总数量，以及(4)将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
术语“序列相似性”是指两个肽或多肽序列仅仅相差保守和/或半保守的氨基酸取代的程度，根据上下文而定。“序列相似性百分比”通过以下计算：(1)将两个最佳排列的序列在较短序列的长度上进行对比；(2)确定含有(i)相同单体和(ii)保守和/或半保守取代的位置的数量，根据上下文而定，得到“类似的(similar)”位置的数量；(3)将类似位置的数量除以较短序列中的位置的总数量；以及(4)将结果乘以100，得到序列同一性百分比或序列相似性百分比。
5.2.进一步的解释性规定
除非明确地另行规定，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
每当通过数字确定氨基酸位置时，所述数字是指天然人类Gal-3蛋白中的位置。
如此处和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(a或an)”、“一种(a或an)”以及“所述(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另行规定。
在提供值的范围时，除非明确地另外指出，否则所述范围包括所提及的端点。还应理解，所述范围的下限与上限之间的每个中间值也被明确地公开，以及那些中间值至下限单位的十分之一，除非上下文明确地另外指出。在所提及的范围包括一个或两个界限时，不包括那些包括的界限中的任一个或者两个的范围也包括在本发明中。
本文所讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的申请日之前的公开内容而提供，并通过引用并入本文，以便对所述出版物关于其而被分别提及的方法和/或材料进行公开和描述。应理解，在存在矛盾的情况下本公开取代所并入的出版物的任何公开内容；特别地，在这种出版物给出的术语定义与本公开明确的或隐含的定义相抵触时，以本公开的定义为准。
应理解，本发明并不局限于所描述的特定实施例。在阅读了本公开之后，对本领域技术人员将会显而易见的是，本文描述和说明的每个单独的实施例具有分立的部件和特征，可在不偏离本发明的范围和精神的情况下容易地将其与任一其它几个实施例的特征分开，或者容易地将其与任一其它几个实施例的特征结合。任何提及的方法可以所提及的事件的顺序进行，或者以逻辑上可能的任何其它顺序进行，除非另行规定。
还应理解，本文所用术语仅仅为了描述特定的实施例的目的，并非旨在进行限制，这是由于本发明的范围将仅受到所附权利要求书的限制。
5.3.显性阴性的Gal-3N-端截断蛋白
在第一方面，提供了新的显性负性的半乳糖凝集素-3N-端截断蛋白。
5.3.1.天然人类Gal-3蛋白
人类Gal-3由位于染色体14基因座q21至q22的单个基因LGALS3编码。LGALS3基因编码一种250个氨基酸的蛋白质，其具有以下氨基酸序列(基因库(GenBank)登录号CAG33178.1)：
(SEQ ID NO.：1)全长750nt cDNA序列(无终止密码子)具有以下序列(基因库(GenBank)登录号CR542097.1)：
(SEQ ID NO.：2)
图1示出了人类Gal-3蛋白的基本结构域结构。N-端结构域(“NTD”)介导多聚化，并大致从氨基酸1延伸至残基112。C-端糖结合结构域(“CRD”)大致从氨基酸112延伸至残基250。还指出了各种其它功能特征。位于位置6(“S6”)的丝氨酸(其会由CK1磷酸化)对于在细胞暴露于细胞毒性的药物时从核输出至细胞质是必要的(Takenaka等人，《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》24(10)：4395-4406(2004))。从丝氨酸92至丝氨酸96(“S92-S96”)的序列是由GSK3b磷酸化的共有序列(Shimura等人，《癌症研究(Cancer Res.)》65(9)：3535-3537(2005))。糖结构域(“NWGR”)中四个氨基酸的序列NWGR是Bcl-2基序(《癌症研究(Cancer Res.)》57：5272-5276(Akahani等人，《癌症研究(Cancer Res.)》57：5272-5276(1997))。从氨基酸143至250的区域为β-联蛋白和轴蛋白的结合位点(Shimura等人，《癌症研究(Cancer Res.)》64：6363-6367(2004))。
5.3.2.Gal3C蛋白截断
之前已经在体外和在各种人类癌症的动物模型中显示出具有抗癌功效的N-端Gal-3截断蛋白Gal3C是一种143个氨基酸的蛋白质，开始于天然Gal-3蛋白的残基108，并且具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO：3)。除了氨基酸1至107的缺失，Gal3C序列与天然人类Gal-3相同，与人类Gal-3的氨基酸108至250具有100％的序列同一性。
在之前的研究中，Gal3C截断蛋白由以下核酸序列表达：
(SEQ ID NO：4)。
5.3.3.新的N-端截断蛋白
在第一个实施例中，提供了新的Gal-3N-端截断蛋白，称作“CBPI.001”。CBPI.001蛋白具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO.：5)。CBPI.001在顺序上与天然Gal-3氨基酸109至250相同。
在一些实施例中，CBPI.001由以下核酸序列表达。
(SEQ ID NO.：6)。
在另一个实施例中，提供了新的Gal-3N-端截断蛋白，称作“Gal3M1”或“CBPI.002”。Gal-3M1蛋白具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO.7)。
Gal-3M1蛋白缺失天然Gal-3蛋白的氨基酸1至112，并且与天然Gal-3的氨基酸113至250相比包括4个氨基酸取代，包括在Gal3M1蛋白的前两个氨基酸(天然蛋白质的氨基酸113和114)处的取代。以下示出了Gal3M1(CBPI.002)与天然Gal-3的比对，氨基酸取代以下划线表示。
使用天然残基编号，各取代为P113A、L114V、Y118N以及T248N。
在一些实施例中，Gal-3M1(CBPI.002)蛋白由以下核酸序列表达：
(SEQ ID NO.：8)。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基108-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的一个、Gal3M1中存在的取代中的两个、Gal3M1中存在的取代中的三个或者Gal3M1中存在的取代中的四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基109-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基110-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基111-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基112-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在一些实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括天然Gal-3蛋白的残基113-250，以任意组合进一步包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的零个、一个、两个、三个或四个。
在再其它的实施例中，新的N-端Gal-3截断蛋白包括残基114至250、115至250、116至260、117至250、118至250、119至250、120至250、121至250、122至250、123至250或124至250，其中每个这种实施例任选地以任意组合包含Gal3M1(CBPI.002)中存在的取代中的一个、两个、三个或四个。
在各种实施例中，与天然Gal-3蛋白相比，N-端截断蛋白在残基113、114、118以及248中的一个或多个残基处包括或进一步包括与Gal3M1中存在的那些取代不同的取代。在特定的实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在一些实施例中，与Gal3M1蛋白相比，N-端截断蛋白在残基113、114、118以及248中的一个或多个残基处包括或进一步包括取代。在特定的实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在各种实施例中，与天然Gal-3相比，N-端截断蛋白在除113、114、118以及248之外的残基处包括或进一步包括至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个取代。在某些实施例中，与天然Gal-3相比，N-端截断蛋白在除113、114、118以及248(根据天然Gal-3进行编号)之外的残基处包括或进一步包括至少6个、7个、8个、9个或10个或更多个氨基酸取代。在某些实施例中，所述取代为保守取代。在一些实施例中，所述取代为半保守取代。
在典型的实施例中，N-端截断蛋白与天然Gal-3蛋白具有70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、或者95％或更多的序列同一性。在某些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有85％、86％、87％、88％、89％或90％的序列同一性。在一些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性。在一些实施例中，N-端截断蛋白与Gal-3天然蛋白具有96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在某些实施例中，N-端截断蛋白通过在培养物中的宿主细胞中进行表达产生。在这种实施例中，蛋白质可由合适地编码期望的氨基酸序列的任何可表达核酸表达。在特定的实施例中，可表达核酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO.：7的蛋白质。在特定的实施例中，可表达核酸包含具有核酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的核酸。
在各种实施例中，N-端截断蛋白通过化学合成而不是通过重组表达产生。化学合成容许将一种或多种氨基酸类似物结合到蛋白质序列中。在这些实施例中的某些中，一种或多种氨基酸类似物赋予截断蛋白更大的体内稳定性。化学合成还容许在氨基酸之间引入非肽键接，并且在某些实施例中，N-端截断蛋白包括一种或多种非肽键接。在特定的实施例中，非肽键接会赋予截断蛋白更大的体内稳定性。
因此，在各种实施例中，截断蛋白包含一种或多种氨基酸类似物。在某些实施例中，蛋白包括N-端修饰和/或C-端修饰，以保护蛋白质免于蛋白质降解。
在某些实施例中，进一步的蛋白质序列与截断蛋白的N-端融合或缀合。在典型的或者优选的实施例中，另外的蛋白质序列不会赋予融合蛋白二聚化或多聚化特性。在各种实施例中，融合的氨基酸序列会赋予截断蛋白有利的药动学特性，例如血清半衰期的增加。在某些实施例中，融合的序列除了其糖结合特异性之外还会赋予截断蛋白第二种结合特异性。在各种实施例中，融合的氨基酸序列含有被抗体识别的表位，例如单克隆抗体、双特异性抗体、BiTE、scFv、Fab、Nanobody、单结构域抗体，包括与毒素缀合的抗体(抗体-药物缀合物，“ADC”)。
在一些实施例中，N-端截断蛋白为肽模拟物。
4.3.4.编码N-端截断蛋白的多聚核苷酸
在另一方面，提供了编码本文所述的N-端截断蛋白的多聚核苷酸。在一些实施例中，所述多聚核苷酸为DNA。在一些实施例中，所述多聚核苷酸为RNA。
在特定的实施例中，多聚核苷酸对包含具有氨基序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的区域的蛋白质进行编码。在某些实施例中，多聚核苷酸对具有氨基序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的蛋白质进行编码。在某些实施例中，多聚核苷酸包含具有多聚核苷酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的编码区域。
在各种实施例中，编码截断蛋白的多聚核苷酸适合在培养物中的宿主细胞中表达截断蛋白。
在某些优选的实施例中，进行编码的多聚核苷酸序列被优化，例如密码子优化，以便在期望的宿主细胞中进行表达。在某些实施例中，进行编码的多聚核苷酸序列被优化，例如密码子优化，以便在哺乳动物细胞中进行表达，例如CHO细胞。在某些实施例中，进行编码的多聚核苷酸序列被优化，例如密码子优化，以便在酵母细胞中进行表达，例如发面酵母、粟酒裂殖酵母或毕赤酵母。在一些实施例中，进行编码的多聚核苷酸序列被优化，例如密码子优化，以便在昆虫细胞中进行表达。在再其它的实施例中，进行编码的多聚核苷酸序列被优化，例如密码子优化，以便在植物细胞中进行表达。
在各种实施例中，编码截断蛋白的可表达多聚核苷酸可操作地与宿主细胞表达所需的多聚核苷酸元素连接。在一些实施例中，宿主细胞表达所需的可表达多聚核苷酸和多聚核苷酸元素被整合到宿主细胞的核基因组中。在一些实施例中，宿主细胞表达所需的可表达多聚核苷酸和多聚核苷酸元素维持在宿主细胞的细胞质中。
在各种实施例中，可表达多聚核苷酸被结合到含有宿主细胞表达所需的多聚核苷酸元素的表达载体中。
在一些实施例中，所述表达载体适合将可表达多聚核苷酸递送到宿主细胞中，以便在培养物中进行表达。在某些实施例中，所述表达载体适合将可表达多聚核苷酸离体或体内递送到人类受试者的细胞中。
5.4.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物，其包含如上文4.3部分所述的新的显性负性Gal-3N-端截断蛋白，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、缓冲剂、等张剂(isotonifier)、载剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、非离子清洁剂、抗氧化剂及其组合。
在各种实施例中，所述药物组合物为适合胃肠外施用的液体组合物。在各种实施例中，所述液体组合物适合静脉内给药。在一些实施例中，所述液体组合物适合肌内给药。在某些实施例中，所述液体组合物适合皮下给药。
在一些实施例中，所述药物组合物包含浓度为至少1mg/mL、至少5mg/mL或至少10mg/mL、25mg/mL或至少50mg/mL的Gal-3N-端截断蛋白。在一些实施例中，所述药物组合物包含浓度为至少75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL或更大的Gal-3N-端截断蛋白。在某些实施例中，所述药物组合物包含浓度不大于150mg/mL、不大于125mg/mL或不大于100mg/mL的Gal-3N-端截断蛋白。在一些实施例中，所述药物组合物包含浓度不大于75mg/mL或不大于50mg/mL的Gal-3N-端截断蛋白。
在各种实施例中，所述药物组合物具有5.0至8.0，5.5至7.5，或6.0至7.0的pH。
在一些实施例中，所述药物组合物包含缓冲试剂，以维持组合物的pH在期望的pH范围内。在各种实施例中，所述缓冲试剂以2mM至50mM的浓度存在，例如2至40mM、2至30mM、2至20mM、2至10mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM、10至20mM、20至50mM、20至40mM、20至30mM、或者40至50mM。例如，一种或多种缓冲试剂可以2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的浓度存在。可根据本公开使用的缓冲试剂包括有机酸和无机酸，以及它们的盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、丁二酸盐缓冲液(例如丁二酸-丁二酸一钠混合物、丁二酸-氢氧化钠混合物、丁二酸-丁二酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)、以及乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，还可使用膦酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液以及像Tris这样的三甲基胺盐。
在某些实施例中，所述药物组合物是等渗的。在某些实施例中，所述药物组合物是高渗的。在一些实施例中，所述药物组合物是低渗的。
在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含第二种治疗剂。在这种实施例中，所述另外的治疗剂通常是一种抗肿瘤化疗剂。在特定的实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的群组：蛋白酶体抑制剂，例如选择性的和不可逆的蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米、卡非佐米、双硫醒、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、Salinosporamide A、蛋白酶体抑制剂环氧酶素(epoxomicin)、乳胞素、MG132、ONX 0912、CEP-18770以及/或者MLN9708。在某些实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的群组：硼化合物、烷基化剂、抗代谢药物、蒽环霉素类、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇及其任意组合。
5.5.治疗方法
在另一方面，提供了治疗癌症的方法。所述方法包含给患有癌症的受试者施用治疗有效量的如本文所述的Gal-3N-端截断蛋白。在典型的实施例中，所述截断蛋白在一种药物组合物中，并且所述方法包含给患有癌症的受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的Gal-3N-端截断蛋白的药物组合物。
在某些实施例中，Gal-3N-端截断蛋白为Gal3C。在其它实施例中，Gal-3N-端截断蛋白为如本文所述的新的截断蛋白。在特定的实施例中，Gal-3N-端截断蛋白为Gal3M1或CBPI.001。在一个实施例中，Gal-3N-端截断蛋白为Gal3M1。在另一个实施例中，Gal-3N-端截断蛋白为CBPI.001。
在各种实施例中，所述药物组合物以可有效降低癌细胞中肿瘤生长或存活所需的至少一个信号转导途径的活性的量施用。在某些实施例中，显性负性的Gal-3N-端截断蛋白以可有效降低Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径中的一种或多种的活性的量施用。
在一些实施例中，所述药物组合物以可有效降低Ras信号传导途径的活性的量施用。在特定的实施例中，所述药物组合物以可有效降低K-Ras信号传导途径的活性的量施用。Gal-3会通过一种疏水袋抑制激活的K-Ras从质膜解离，所述疏水袋可容纳K-Ras的尾部。Gal-3多聚化对于K-Ras的激活具有重要意义，因此N-端截断蛋白会抑制由半乳糖凝集素-3介导的K-Ras的激活。
在一些实施例中，所述药物组合物以可有效抑制癌细胞中的β-连环蛋白信号传导途径的量施用。β-连环蛋白对于癌细胞的存活具有重要意义。N-端截断蛋白会保留与β-连环蛋白和轴蛋白的结合，但是未被GSK3b磷酸化，这是由于它们缺乏N-端结构域，其含有GSK3b共有序列S92-XXX-S96。参见图1。N-端截断蛋白跟Gal-3竞争与β-连环蛋白/轴蛋白复合物的结合，从而增强β-连环蛋白的磷酸化，这是由于与Gal-3不同，复合物中的N-端截断蛋白未被磷酸化。另外，N-端截断蛋白会降低激活的β-连环蛋白的核活性，这是由于全长半乳糖凝集素-3是β-连环蛋白的结合配偶体，对于β-联蛋白刺激细胞周期蛋白D1和c-myc的表达是必要的。
在一些实施例中，所述药物组合物以可有效降低癌细胞中的Akt信号传导途径的活性的量施用。N-端截断蛋白会干扰Gal3-介导的通过PI3K对AKT的激活，从而引起β-连环蛋白信号传导的下调和癌细胞存活率的降低。
在一些实施例中，所述药物组合物以可有效降低癌细胞中的ERK/JNK途径的活性的量施用。在CK1将S6磷酸化之后，响应于促细胞凋亡药物的Gal-3介导的抗-细胞凋亡作用(阻断内源性途径)需要Gal-3的核输出。用于核定位和核输出的序列位于本文所述的N-端截断蛋白中保留的CRD中。这些N-端截断蛋白充当显性负性的抑制剂，与磷酸化的Gal-3竞争输出。这种竞争会阻碍CKl-激活的Gal-3的输出，并具有ERK/JNK途径。
在一些实施例中，所述药物组合物以可有效降低癌细胞中的CD44信号传导的量施用。Gal-3对于CD44信号传导具有重要意义。CD44的表达在癌症中具有重要意义，并且靶向CD44会通过干扰骨髓的归巢消除癌干细胞。CD44充当内吞作用的受体，而内吞作用则会触发充当转录因子的细胞内结构域的切割，从而增强CREB-介导的转录。CD44细胞内结构域通过γ分泌酶复合物从细胞膜释放，所述复合物是在Notch信号传导的激活中起作用的相同蛋白酶。在激活的Notch进行内吞作用之后，γ分泌酶在核内体中是活性的。因此，Gal-3N-端截断蛋白通过防止形成半乳糖凝集素-3五聚体干扰CD44的内吞作用，并随后干扰CD44游离的胞内结构域的产生。五聚的Gal-3通过与CD44本身结合并与膜鞘糖脂结合介导CD44的内吞作用。N-端截断蛋白会干扰这一过程，从而减少CD44的内吞作用和癌细胞中的CREB信号传导。
在各种实施例中，对于存活和/或对治疗的抗性，癌症依赖于选自由以下组成的群组的一种或多种信号转导途径：Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径。在一些实施例中，所述癌症对治疗具有抗性或顽固性，单独施用Gal-3N-端截断蛋白足以进行治疗。在一些实施例中，所述癌症对治疗具有抗性或顽固性，并且所述方法使得癌症重新对之前所述癌症已经对其具有抗性或顽固性的化疗或其它治疗方案(例如放疗)具有敏感性。
因此在某些实施例中，N-端截断蛋白与一种或多种另外的化疗剂和/或生物剂组合施用。当N-端截断蛋白和一种或多种另外的化疗剂和/或生物剂在治疗上有效的邻近时间施用时被看作是组合给药。在一些组合实施例中，所述一种或多种另外的药剂与N-端截断蛋白同时施用。在一些组合实施例中，所述一种或多种另外的药剂在N-端截断蛋白之前施用。在一些组合实施例中，所述一种或多种另外的药剂在N-端截断蛋白之后施用。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的化疗剂选自由以下组成的群组：选择性的和不可逆的蛋白酶体抑制剂，包括(但不限于)硼替佐米、卡非佐米、双硫醒、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、Salinosporamide A、蛋白酶体抑制剂环氧酶素(epoxomicin)、乳胞素、MG132、ONX 0912、CEP-18770以及/或者MLN9708。在某些实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的群组：硼化合物、烷基化剂、抗代谢药物、蒽环霉素类、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇及其任意组合。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的化疗剂选自由以下组成的群组：烷基化剂、抗代谢药物、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的化疗剂选自由以下组成的群组：venetoclax、地西他滨、LY573636、阿地白介素、硼替佐米、ixazomib、替吡法尼、帕比司他、pracinostat、克罗拉滨、alvocidib、来那度胺、达沙替尼、volasertib、索拉非尼、CP-351、vosaroxin、依托泊苷、米托蒽醌、瓜德希他滨、吉妥单抗、奥佐米星、SGN-CD33A、BI836858、AGS67E、三氧化二砷、伏立诺他、贝美替尼、曲美替尼、BVD-523、E6201、vyxeos、AZD1775、8-氯-腺甙、克拉屈滨、氟达拉滨、卡培他滨、pomalidomide、erwinaze、曲奥舒凡、alisertib、gedatolisib、鲁索替尼、LY2606368、OXi4503、gliteritinib、舒尼替尼、来他替尼、米哚妥林、quizartinib、crenolanib、pacritinib、AKN-028、FLX925以及E6201。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的化疗剂选自由以下组成的群组：FMS-相关的酪氨酸激酶-3抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、CD-33抑制剂、MEK抑制剂、嘌呤类似物、天门冬酰胺酶(例如聚乙二醇化的天门冬酰胺酶)、mTOR抑制剂以及Aurora激酶抑制剂。
在一些实施例中，所述一种或多种化疗剂或生物剂选自由以下组成的群组：激酶抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂、VEGFR2抑制剂、PDGFR抑制剂、Src家族激酶抑制剂、Hedgehog抑制剂、维甲酸X受体激活剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、BCL2抑制剂、AKT抑制剂、CXCR4抑制剂、mTOR抑制剂、Mdm2拮抗剂、Mdm2抑制剂、CD25抑制剂、CD47抑制剂、IL-3R抑制剂、BCR-Ab1抑制剂、HSP90抑制剂、HGF抑制剂、MET抑制剂以及溴结构域和额外末端结构域(BET)抑制剂以及BRD4抑制剂。
在一些实施例中，所述一种或多种化疗剂或生物剂为克唑替尼、seliciclib、阿法替尼、阿地白介素、阿仑单抗；阿西替尼、贝利司他、伯舒替尼、布妥昔单抗、卡非佐米、色瑞替尼、达拉非尼、达沙替尼、依维莫司、替伊莫单抗、依鲁替尼、索拉非尼、idelalisib、易普利姆玛、尼罗替尼、阿托珠单抗、奥法木单抗、帕尼突单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、帕纳替尼、雷莫芦单抗、瑞格非尼、罗米地辛、sipuleucel、特姆莫司、托西莫单抗、曲美替尼、凡德他尼、威罗菲尼、维莫德吉、伏立诺他、阿柏西普、卡博替尼、selinexor、PF-4449913、erismodegib、GO-203-2C、甲硫达嗪、纳武单抗、蓓萨罗丁、EPZ-5676、ABT-199、GSK2141795、entospletinib、TAK-659、CPI-613、Bl-8040、LY2510924、普乐沙福、mozobil、OCV-501、帕克替尼、伊屈泼帕、艾曲波帕、返利凝、尼达尼布、vargatef、雷帕霉素、MEN1112、普利姆玛、idasanutlin、R06839921、AMG-232、ADCT-301、KHK2823、CWP232291、SL-401、CC-90002、GSK2879552、lirilumab、BGB324、OTX-015、TEN-010、1-BET762、CPI-203、CPI-0610、AG-120、AG-221或IDH305。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的化疗剂为博莱霉素、长春新碱、氢化泼尼松或硝酸镓。
在某些实施例中，所述癌症为多发性骨髓瘤。在精选的实施例中，N-端截断蛋白与蛋白酶体抑制剂一起组合施用。
在一些实施例中，所述癌症为卵巢癌。
在一些实施例中，所述癌症为急性髓源性白血病(“AML”，还称作急性骨髓性白血病)，并且Gal-3N-端截断蛋白以可有效治疗AML的量施用。在一些实施例中，Gal-3N-端截断蛋白与一种或多种另外的化疗剂一起组合施用。在一些实施例中，所述另外的化疗剂用来进行诱导治疗。在精选的实施例中，另外的化疗剂为伊达比星和阿糖胞苷。
在一些实施例中，N-端截断蛋白与放疗一起组合施用。
在各种实施例中，所述待治疗的癌症是一种实体癌或血液癌。在一些实施例中，所述癌症是晚期的和/或顽固性的恶性实体肿瘤或恶性血液肿瘤。这种癌症可包括(例如)恶性实体肿瘤，包括乳腺癌、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾细胞癌或其任意组合。这种癌症还可包括(例如)恶性血液肿瘤，包括T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴母细胞白血病、慢性髓源性白血病或其任意组合。另外，在一些情况下，主体方法包括对患有癌症并且需要治疗癌症的受试者进行确定的预备步骤。
在各种实施例中，所述方法可有效引起对以上所述转导途径之一的激活的10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或100％的抑制。
在另一方面，提供了治疗癌症的方法，其包含给患有癌症的受试者施用治疗有效量的对一种或多种本文所公开的截断蛋白进行表达的多聚核苷酸载体。在某些这种实施例中，载体通过肿瘤内注射施用。
5.6.试剂盒
还提供了用于实施一种或多种以上所述方法的试剂盒。所述试剂盒可被配置为用于使用截断的显性负性形式的半乳糖凝集素-3治疗癌症，包括急性骨髓性白血病(AML)。
在一些实施例中，所述试剂盒包括用于本文所述方法的蛋白质、组合物(例如药物组合物)、载体以及/或者药剂中的一种或多种。
主体试剂盒可包括两种或更多种(例如多种、三种、四种、五种、八种、十种等)根据任一本文所述实施例的组合物或其任意组合。所述试剂盒还可包括多种(例如两种、三种、五种或更多种、十种或更多种、十二种或更多种、多组)组合物，其中一组组合物是执行一次本文所述方法所需的某一量的每种组合物。
试剂盒还可包括一个或多个容器，例如在任一所述方法过程中或者在执行所述方法之前或之后用来储存和/或转移本文所述的一种或多种组合物的容器。在一些实施例中，所述试剂盒还包括包装，例如用来寄送组合物和/或容器而不会破碎的包装。
在某些实施例中，所述试剂盒包括说明书，例如使用主体组合物和/或执行主体方法的说明书。在一些方面，说明书记载在合适的记载介质上。例如，说明书可印在基体上，例如纸或塑料等。照此，说明书可在试剂盒中作为包装插入件存在，或者存在于试剂盒或其组件的容器的标签中，例如与包装或分包装等相关的标签。在其它实施例中，说明书作为存在于合适的电脑可读储存介质(例如便携式闪存驱动器、CD-ROM、软盘等)中的电子储存数据文件存在。说明书可包括如何使用系统或装置的完整说明。说明书还可包括网络地址，通过该网址可获得张贴在万维网上的说明书。
5.7.实例
5.7.1.试验方法和结果
5.7.1.1.细胞和治疗
人类多发性骨髓瘤细胞系U266、卵巢癌细胞系SKOV3以及急性单核细胞性白血病细胞系THP1在具有10％FBS的RPMI1640中培养。乳腺癌细胞系MCF7在具有10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。药物从默克密理博公司(Merck Millipore)购买，并以以下浓度使用：硼替佐米(Bor)5nM；阿糖胞苷(Ara-c)3.87pM；雷帕霉素(Rapa)100nM；紫杉醇(Pax)100nM。
5.7.1.2.MTT分析
一式四份以体积为100μL的细胞悬浮液/孔将细胞接种到96孔板中。SKOV3和MCF7细胞以100,000个细胞/mL的密度接种。THP1细胞以200,000个细胞/mL的密度接种；而E1266细胞则以300,000个细胞/mL的密度接种。然后将细胞用20μg/mL的CBPI1或CBPI2处理48小时。对于最后24小时，添加适当的药物。随后在用0.6mg/mL的MTT((3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物；西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))孵育48小时之后对细胞存活率分析4小时。将甲腊晶体溶于100mL 0.01N的HCL/异丙醇中。在570nm测量吸光系数，将690nm的背景扣除。
5.7.1.3.细胞凋亡的检测
将细胞以相同的浓度接种到48孔中，以便进行MTT分析。将细胞用20μg/mL的CBPI1或CBPI2处理48小时。对于最后24小时，添加适当的药物。48小时之后，将细胞用冷的1X PBS洗涤，重悬于“结合缓冲液1X”(即HEPES 0.01M；NaCl 0.14M；以及CaCl22.5mM)中，并在黑暗中用膜联蛋白V(Annexin-V)FITC(屋宇署生物科学(BD Biosciences))+碘化丙锭(最终为2.5μg/mL；西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))孵育15分钟。最后，向管中添加400μL结合缓冲液1X，对样品进行处理，并使用BDFACSVerseTM系统(屋宇署生物科学(BD Biosciences))进行分析。
5.7.1.4.统计学分析
数据表示为至少三(3)个独立试验的平均值±SD。***＝P<0.001；**＝P<0.01；*＝P<0.05。
5.7.2.数据结果
图1-提供天然半乳糖凝集素-3、Gal3C以及Gal3M1的结构域结构的示意图。
图2-CBPI1和CBPI2在卵巢癌中的作用。图2在区块A)中显示CBPI2在卵巢癌细胞中可有效引起细胞凋亡。另外，与单独使用紫杉醇相比，CBPI1和CBPI2与基于紫杉烷的化疗剂紫杉醇(Pax)一起组合治疗均会显著增加SKOV3细胞的细胞凋亡速率。区块B)显示MTT分析结果，其显示与对照细胞相比，仅使用CBPI1和CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。应注意，CBPI1/CBPI2与Pax的组合效果与仅使用紫杉醇相比通过MTT分析并不明显，这是由于它测量的是代谢活性的细胞的活性，包括细胞凋亡早期的那些。
图3-CBPI1和CBPI2在多发性骨髓瘤中的作用。图3显示区块A)与仅使用Bor相比，CBPI2与硼替佐米(Bor)一起组合治疗会显著增加U266细胞的细胞凋亡速率。区块B)MTT分析显示仅使用CBPI1和CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图4-CBPI1和CBPI2在乳腺癌中的作用。图4显示区块A)与对照细胞相比，仅使用CBPI2会显著增加MCF7细胞的细胞凋亡速率。区块B)MTT分析显示仅使用CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图5.-CBPI1和CBPI2在急性单核细胞性白血病中的作用。该图显示区块A)与对照细胞相比，CBPI1和CBPI2与Ara-C一起施用会显著增加THP1细胞的细胞凋亡速率。区块B)MTT分析显示仅使用CBPI2会显著降低代谢活性的细胞的存活率。
图6-在所指示的处理之后，通过流式细胞术对细胞分析细胞凋亡。该图表示绿色通道(FL1，水平轴)和红色通道(FL2，竖轴)的相对荧光强度。细胞凋亡检测器膜联蛋白V与绿色荧光分子(FITC)连接，并在FL1通道中产生荧光信号。处于细胞凋亡晚期的细胞不能够将碘化丙锭(PI)从细胞质排出，因此产生红色荧光。因此红色荧光被流式细胞仪的FL2通道获取。每个点代表被流式细胞仪检测到的一个荧光信号(细胞)。每个点图被分成4个象限。它们从左侧底部按逆时针往前为Q1、Q2、Q3以及Q4。Q1中的细胞是非细胞凋亡的(存活的)，这是由于它们对于PI和膜联蛋白V均为阴性。Q2中的细胞处于早期细胞凋亡阶段，这是由于它们对于膜联蛋白V为阳性但对于PI则是阴性。Q3中的细胞对于PI和膜联蛋白V均为阳性，因此处于晚期细胞凋亡阶段。Q4中的细胞对于PI为阳性但是对于膜联蛋白X则为阴性，因此被看作坏死细胞。
5.8.序列概括
SEQ ID NO：1 天然人类Gal-3蛋白序列
SEQ ID NO：2 天然人类Gal-3cDNA多聚核苷酸序列
SEQ ID NO：3 Gal-3C蛋白序列
SEQ ID NO：4 Gal-3C多聚核苷酸序列
SEQ ID NO：5 CBPI.001蛋白序列
SEQ ID NO：6 CBPI.001多聚核苷酸
SEQ ID NO：7 CBPI.002/Gal3M1蛋白序列
SEQ ID NO：8 CBPI.002/Gal3M1多聚核苷酸序列
虽然为了清楚地理解本发明，以说明和实例的方式一定程度地详细描述了上述发明，但是对于本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的教导可在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其进行某些改动和修改。还应理解，本文所用的术语仅仅为了描述特定的实施例的目的，并非旨在进行限制，本发明的范围将仅受到所附权利要求书的限制。
因此，以上内容仅仅说明了本发明的原理。应理解本领域技术人员将能够设计出各种方案，所述各种方案尽管未明确地在本文中描述或者显示，但是可体现本发明的原理，并且包括在它的精神和范围内。此外，本文提及的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而提供的概念，并且应理解为并不局限于这些具体提及的实例和条件。另外，提及本发明的原理、方面以及实施例以及其特定的实例的所有陈述旨在包括其结构等价物和功能等价物。另外，这种等价物旨在包括目前已知的等价物和将来开发的等价物，即所开发的可执行相同功能的任何元素，不管其结构如何。因此，本发明的范围并非旨在局限于本文所示和所述的示范性实施例。本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。

Claims (26)

1.一种蛋白质，其具有氨基酸序列SEQ.ID NO.5或SEQ.ID NO.7。
2.一种蛋白质，其在序列上与SEQ.ID NO.5或SEQ.ID NO.7至少95％一致，其中各自与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7不一致的所有残基与SEQ ID NO.1相比均为保守取代，条件是所述蛋白质不具有序列SEQ ID NO.：3。
3.一种组合物，其包含：根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质。
4.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质，以及
药学上可接受的载剂。
5.一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含具有序列SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8的区域。
7.一种核酸载体，所述载体包含根据权利要求5或权利要求6所述的多聚核苷酸。
8.根据权利要求7所述的核酸载体，其中所述多聚核苷酸包含具有所述核酸序列SEQID NO：6或SEQ ID NO：8的区域。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的核酸载体，其进一步包含表达控制元件。
10.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包含：
给患有癌症的受试者施用治疗有效量的根据权利要求4所述的药物组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所用量可有效降低癌细胞中为肿瘤生长或存活所必需的至少一种信号转导途径的活性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述信号转导途径选自由以下组成的群组：Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述信号转导途径为所述β-连环蛋白信号转导途径。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述信号转导途径为所述CD44信号传导途径。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述癌症为恶性血液肿瘤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述恶性血液肿瘤选自由以下组成的群组：T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴母细胞白血病、慢性髓源性白血病以及急性骨髓性白血病(AML)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述恶性血液肿瘤为AML。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包含：
与根据权利要求4所述的药物组合物组合施用至少一种AML诱导化疗剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种诱导化疗剂中的至少一种为伊达比星。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述至少一种诱导化疗剂中的至少一种为阿糖胞苷。
21.根据权利要求17所述的方法，其进一步包含：
与根据权利要求4所述的药物组合物组合施用至少一种AML巩固性化疗剂。
22.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述癌症为恶性实体肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：乳腺癌、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌以及肾细胞癌。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包含：与根据权利要求4所述的药物组合物组合施用至少一种抗肿瘤化疗剂或生物剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述化疗剂选自由以下组成的群组：硼化合物、烷基化剂、抗代谢药物、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂以及皮质类固醇。
26.一种治疗癌症的方法，其包含：
施用治疗有效量的具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质，
其中所述量可有效降低癌细胞中为肿瘤生长或存活所必需的至少一种信号转导途径的活性，其中所述途径选自由以下组成的群组：Ras、β-连环蛋白、Akt、胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)以及CD44信号传导途径，并且
其中所述癌症不是多发性骨髓瘤或卵巢癌。
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