ES2834102T3 - Variantes de alfa-amilasa - Google Patents

Variantes de alfa-amilasa Download PDF

Info

Publication number
ES2834102T3
ES2834102T3 ES18183123T ES18183123T ES2834102T3 ES 2834102 T3 ES2834102 T3 ES 2834102T3 ES 18183123 T ES18183123 T ES 18183123T ES 18183123 T ES18183123 T ES 18183123T ES 2834102 T3 ES2834102 T3 ES 2834102T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
variant
amylase
alpha
seq
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18183123T
Other languages
English (en)
Inventor
Svend Kaasgaard
Jens Oebro
Signe Larsen
Allan Svendsen
Annette Johansen
Michael Skjoet
Carsten Andersen
Lars Beier
Esben Friis
Miguel Toscano
Mads Bjoernvad
Frank W Rasmussen
Liv S Christiansen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes AS filed Critical Novozymes AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2834102T3 publication Critical patent/ES2834102T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405Glucanases
    • C12N9/2408Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411Amylases
    • C12N9/2414Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405Glucanases
    • C12N9/2408Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411Amylases
    • C12N9/2414Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001Alpha-amylase (3.2.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Variante aislada de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido manduro de SEQ ID NO1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO:1, seleccionadas del grupo consistente en: **(Ver fórmula)**

Description

ES 2 834 102 T3
DESCRIPCIÓN
Variantes de alfa-amilasa
Referencia a un listado de secuencias
[0001] Esta patente contiene un listado de secuencias.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
[0002] La presente invención se refiere a variantes de una alfa-amilasa, polinucleótidos que codifican las variantes, constructos de ácido nucleico, vectores de expresión, células hospedadoras y métodos para producir las variantes.
Descripción de la técnica relacionada
[0003] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas, que cataliza la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-gluosídicos lineales y ramificados.
[0004] Hay una larga historia de uso industrial de alfa-amilasas en diferentes aplicaciones conocidas tales como detergentes, panadería, elaboración de cerveza, licuefacción y sacarificación de almidón, por ejemplo, en la preparación de jarabes con alto contenido de fructosa o como parte de la producción de etanol a partir de almidón. Estas y otras aplicaciones de las alfa-amilasas se conocen y utilizan alfa-amilasas derivadas de microorganismos, en particular alfaamilasas bacterianas.
[0005] Entre las primeras alfa-amilasas bacterianas en ser usadas se encontraba una alfa-amilasa de B. licheniformis, conocida también como Termamyl que se ha caracterizado extensivamente y se ha determinado la estructura cristalina para esta enzima. Las amilasas alcalinas, tales como la AA560, forman un grupo particular de alfa-amilasas que han hallado uso en detergentes. Muchas de estas amilasas bacterianas conocidas se han modificado para mejorar su funcionalidad en una aplicación particular.
[0006] Los métodos para aumentar la termoestabilidad de alfa-amilasas han sido bien estudiados. Suzuki et al. (1989) revelan alfa-amilasas quiméricas, en las que se han sustituido regiones específicas de una alfa-amilasa de B." amyloliquefaciens por las regiones correspondientes de una alfa-amilasa de B. licheniformis. Las alfa-amilasas quiméricas se construyeron con el fin de identificar regiones responsables de la termoestabilidad. Se descubrió que tales regiones incluían los residuos aminoacídicos 177-186 y los residuos aminoacídicos 255-270 de la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens. Igarashi et al. 1998 muestran que la termoestabilidad de amilasas de tipo AmyS se puede aumentar mediante la deleción de dos residuos aminoacídicos, R179-G180, (numeración de AmyS) de un bucle (F 178 a A184). Sin embargo, Shiau et al. (2003) mostraron que una enzima AmyS con deleción en el mismo bucle tiene una actividad específica para la hidrólisis de almidón de maíz a alta temperatura menor que la enzima parental, refutando una de las ventajas principales de las amilasas AmyS.
[0007] Debido a cuestiones medioambientales ha aumentado la importancia de disminuir la temperatura en los procesos de lavado, de lavado de vajillas y/o de limpieza. Sin embargo, la mayoría de enzimas incluidas las amilasas tienen una temperatura óptima que supera la temperatura usada normalmente en el lavado a baja temperatura. La alfa-amilasa es una enzima clave para el uso en composiciones detergentes y su uso se ha vuelto cada vez más importante para la eliminación de manchas amiláceas durante el lavado de ropa o de vajillas. Por lo tanto, resulta importante encontrar variantes de alfa-amilasa que retengan su rendimiento de lavado, efecto de eliminación de manchas y/o actividad cuando se reduce la temperatura. Sin embargo, a pesar de la eficiencia de las composiciones detergentes con enzimas actuales, hay muchas manchas que son difíciles de eliminar completamente. Estos problemas se agravan con el mayor uso de temperaturas de lavado bajas (por ejemplo, agua fría) y ciclos de lavado más cortos. Así, es deseable tener enzimas amilolíticas que puedan funcionar a baja temperatura y al mismo tiempo conservar o aumentar otras propiedades deseables tales como la actividad específica (actividad amilolítica), estabilidad y/o rendimiento de lavado.
ES 2 834 102 T3
[0008] La WO 2001/66712A2 divulga una variante de alfa amilasa (SEQ ID NO: 12) con un 87% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 en la misma. La SEQ ID NO: 12 comprende las modificaciones D134E y E260N. Además, se identifican variantes adicionales que comprenden una o más mutaciones adicionales de una lista de residuos que incluye W189R y W439R.
[0009] La US 2001/039253A1 divulga mutantes de alfa amilasa que comprenden modificaciones en residuos específicos incluido el W189 de la SEQ ID NO: 2 que mejorarían la termoestabilidad.
[0010] La EP 2,308,980A2 divulga la SEQ ID NO: 4 que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 1 de la presente invención y divulga además una variante que comprende una sustitución en la posición D134.
[0011] Así, es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de alfa-amilasa que podrían usarse en procesos de lavado, lavado de vajillas y/o limpieza a baja temperatura, tales como temperaturas de 5-35°C. Otro objeto de la presente invención es proporcionar variantes de alfa-amilasa que tienen un rendimiento de lavado a baja temperatura mejorado en comparación con la alfa-amilasa parental o en comparación con la alfa-amilasa de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 o 12.
Resumen de la invención
[0012] La presente invención se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F,
N195F+V206Y+Y243F+W284D,
W140F+R181H,
N195F+V206Y+E260R+G273D,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,
D134E+G476E,
K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,
N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,
W189E N195F V206Y Y243F,
W140Y N195F V206Y Y243F W284D,
N195F V206Y Y243F G477R,
N195F V206Y Y243F G477M,
W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,
W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,
Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,
G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G,
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E,
T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,
T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,
T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,
W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,
N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,
ES 2 834 102 T3
N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y
N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.
[0013] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; constructos de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que incluyen los polinucleótidos; y métodos para producir las variantes.
Descripción detallada de la invención
[0014] La presente invención se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F,
N195F+V206Y+Y243F+W284D,
W140F+R181H,
N195F+V206Y+E260R+G273D,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,
D134E+G476E,
K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,
N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,
W189E N195F V206Y Y243F,
W140Y N195F V206Y Y243F W284D,
N195F V206Y Y243F G477R,
N195F V206Y Y243F G477M,
W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,
W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,
Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,
G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G, G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E, T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,
T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,
T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,
W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,
N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,
N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y
N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.
Definiciones
[0015] Actividad de alfa-amilasa: el término "actividad alfa-amilasa" se refiere a la actividad de alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1, que constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-gluosídicos lineales y ramificados.
ES 2 834 102 T3
[0016] Variante: el término "variante" se refiere a un polipéptido con actividad de alfa-amilasa que incluye una modificación, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere a una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.
[0017] Mutante: el término "mutante" se refiere a un polinucleótido que codifica una variante.
[0018] Enzima de tipo salvaje: el término alfa-amilasa "de tipo salvaje" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tales como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrados en la naturaleza.
[0019] Progenitor o alfa-amilasa parental: el término "progenitor" o "alfa-amilasa parental" se refiere a una alfaamilasa a la que se le hace una modificación para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido de origen natural (de tipo salvaje) o una variante de la misma.
[0020] Variante aislada: el término "variante aislada" se refiere a una variante que está modificada por la mano del hombre. En un aspecto, la variante es al menos un 1% pura, por ejemplo, al menos un 5% pura, al menos un 10% pura, al menos un 20% pura, al menos un 40% pura, al menos un 60% pura, al menos un 80% pura y al menos un 90% pura, como se determina por SDS-PAGE.
[0021] Variante sustancialmente pura: el término "variante sustancialmente pura" se refiere a una preparación que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polipeptídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Preferiblemente, la variante es al menos un 92% pura, por ejemplo, al menos un 94% pura, al menos un 95% pura, al menos un 96% pura, al menos un 97% pura, al menos un 98% pura, al menos un 99%, al menos un 99,5% pura y el 100% pura en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Las variantes de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto puede conseguirse, por ejemplo, preparando la variante por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos tradicionales de purificación.
[0022] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesado del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc.
[0023] Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad de alfa-amilasa.
[0024] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe con el parámetro "identidad de secuencia".
[0025] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)
[0026] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como
ES 2 834 102 T3
"identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)
[0027] Fragmento: el término "fragmento" se refiere a un polipéptido con uno o más (varios) aminoácidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de alfa-amilasa.
[0028] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido con uno o más (varios) nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de alfa-amilasa.
[0029] Variante alélica: el término "variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0030] Polinucleótido aislado: el término "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que está modificado por la mano del hombre. En un aspecto, el polinucleótido aislado es al menos un 1% puro, por ejemplo, al menos un 5% puro, al menos un 10% puro, al menos un 20% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro, al menos un 90% puro y al menos un 95% puro, como se determina por electroforesis de agarosa. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.
[0031] Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para el uso en sistemas de producción de polipéptidos genéticamente modificados. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir, no obstante, regiones 5'- y 3'- no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos un 90% puro, por ejemplo, al menos un 92% puro, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99% puro y al menos un 99,5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura.
[0032] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de terminación tal como, TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un polinucleótido de ADN, ADNc, sintético o recombinante.
[0033] ADNc: el término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y empalmada, obtenida de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
[0034] Constructo de ácido nucleico: el término "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenario, que se aísla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
ES 2 834 102 T3
[0035] Secuencias de control: el término "secuencias de control" se refiere a todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exógena al polinucleótido que codifica la variante o nativa o exógena entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
[0036] Operativamente unido: el término "operativamente unido" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
[0037] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de la variante incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.
[0038] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente unido a nucleótidos adicionales que proveen a su expresión.
[0039] Célula hospedadora: el término "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo celular que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.
[0040] Proceso de eliminación de almidón: la expresión "proceso de eliminación de almidón" se refiere a cualquier tipo de proceso por el cual se elimina (o convierte) el almidón tal como en procesos de lavado donde el almidón se elimina de tejidos, por ejemplo, limpieza textil tal como lavado de ropa. Un proceso de eliminación de almidón podría ser también la limpieza de superficies duras tal como lavado de vajillas o podría consistir en procesos de limpieza en general tales como la limpieza industrial o institucional. La expresión también comprende otros procesos de eliminación o conversión de almidón, producción de etanol, licuefacción de almidón, desaprestado textil, producción de papel y pulpa, fabricación de cerveza y detergentes en general.
[0041] Propiedad mejorada: el término "propiedad mejorada" se refiere a una característica asociada a una variante que se ha mejorado en comparación con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, actividad térmica, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad por sustrato/cofactor, propiedades superficiales mejoradas, especificidad por el producto, estabilidad aumentada o solubilidad en presencia de biomasa pretratada, estabilidad mejorada en condiciones de almacenamiento y estabilidad química.
[0042] Rendimiento de lavado: en el presente contexto el término "rendimiento de lavado" se usa como la capacidad de una enzima para eliminar almidón o manchas que contienen almidón presentes en el objeto que va a limpiarse durante, por ejemplo, el lavado de ropa o la limpieza de superficies duras, tal como el lavado de vajillas. El rendimiento de lavado se puede cuantificar calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en la descripción de AMSA o en la prueba de rendimiento de lavado de vaso de precipitados en la sección Métodos de más adelante.
[0043] Rendimiento de lavado mej orado: el término "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente como una enzima variante que exhibe una modificación del rendimiento de lavado de una variante de amilasa con respecto al rendimiento de lavado de la amilasa parental o con respecto a una alfa-amilasa con la secuencia de aminoácidos idéntica a dicha variante pero sin la deleción en una o más de las posiciones específicas o con respecto a la actividad de una alfa-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 4, por ejemplo, con una mayor eliminación de manchas. El término "rendimiento de lavado" incluye limpiezas en general, por ejemplo, limpieza de superficies duras como en el lavado de vajillas, pero también rendimiento de lavado en tejidos tales como lavado de ropa, y también limpieza industrial e institucional.
[0044] Baj a temperatura: "baja temperatura" es una temperatura de 5-35°C, preferiblemente 5-30°C, más preferiblemente 5-25°C, más preferiblemente 5-20°C, de la forma más preferible 5-15°C y en particular 5-10°C. En una
ES 2 834 102 T3
forma de realización preferida, "baja temperatura" es una temperatura de 10-35°C, preferiblemente 10-30°C, más preferiblemente 10-25°C, de la forma más preferible 10-20°C y en particular 10-15°C.
Convenciones para la designación de variantes
[0045] Para los fines de la presente invención, el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1 se usa para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa. La secuencia de aminoácidos de otra alfa-amilasa se alinea con el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y en base al alineamiento, el número de posición aminoacídica que corresponde con cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.
16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior.
[0046] La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa se puede confirmar con un alineamiento de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando "ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947­ 2948).
[0047] Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de manera tal que la comparación tradicional de secuencias no consigue detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencia por pares. Se puede lograr una sensibilidad superior en la búsqueda de secuencias utilizando programas de búsqueda que utilicen representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda reiterativa en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede conseguir incluso una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructura de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de la superfamilia presentes en la base de datos de SCOP. Estos alineamientos pueden usarse sucesivamente para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos se pueden evaluar para determinar su exactitud utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.
[0048] Para proteínas de estructura conocida, hay disponibles diferentes herramientas y recursos para recuperación y generación de alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas de SCOP han sido estructuralmente alineadas, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineamiento de distancias (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
[0049] Al describir las variantes de alfa-amilasa de la presente invención, la nomenclatura descrita más adelante se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de una o tres letras de los aminoácidos aceptadas por la IUPAC.
[0050] Sustituciones. Para una sustitución aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina por alanina en la posición 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411 Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.
[0051] Deleciones. Para una deleción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición*. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".
ES 2 834 102 T3
[0052] Inserciones. Para una inserción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción aminoacídica múltiple se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n.01, aminoácido insertado n.02; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".
[0053] En tales casos el/los residuo(s) de aminoácido insertado(s) se numera(n) mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al/a los residuo(s) de aminoácido insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:
Figure imgf000009_0001
[0054] Modificaciones múltiples. Las variantes que comprenden modificaciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" representan una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.
[0055] Sustituciones diferentes. Cuando se puedan introducir sustituciones diferentes en una posición, las sustituciones diferentes se separan con una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina por tirosina o ácido glutámico en la posición 170. Así, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167AIa+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".
Alfa-amilasas parentales
[0056] La alfa-amilasa parental puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
[0057] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en no más de diez aminoácidos, por ejemplo, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
[0058] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
[0059] En otra forma de realización, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
[0060] El progenitor puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en la presente en relación con una fuente dada significará que el progenitor codificado por un polinucleótido lo produce una fuente o una célula en la que se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, el progenitor es secretado extracelularmente.
[0061] El progenitor puede ser una alfa-amilasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido bacteriano grampositivo tal como una alfa-amilasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus o Streptomyces, o un polipéptido bacteriano gramnegativo tal como una alfa-amilasa de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma.
[0062] En un aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus
ES 2 834 102 T3
licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.
[0063] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0064] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans.
[0065] El progenitor puede ser una alfa-amilasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de levadura tal como una alfa-amilasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de hongos filamentosos tal como una alfa-amilasa de Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophylum, Scytalidium, Talaromyces, Termoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
[0066] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.
[0067] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0068] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus sp., por ejemplo, la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
[0069] Se entiende que, para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.
[0070] Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0071] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes, que incluyen microorganismos asilados de la naturaleza (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. Puede obtenerse entonces de forma similar un polinucleótido que codifique un progenitor cribando una genoteca de ADNc o genómica de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez ha sido detectado con una(s) sonda(s) un polinucleótido que codifica un progenitor, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que conocen los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
ES 2 834 102 T3
[0072] El progenitor puede ser un polipéptido híbrido en el cual se fusiona una porción de un polipéptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de una porción de otro polipéptido.
[0073] El progenitor también puede ser un polipéptido fusionado o polipéptido de fusión escindible en el cual se fusiona un polipéptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de otro polipéptido. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de un polinucleótido que codifica un polipéptido con un polinucleótido que codifica otro polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estas estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador. Las proteínas de fusión también se pueden construirse usando tecnología de inteína en la cual las fusiones se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-7799).
[0074] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Cuando se secreta la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568­ 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488­ 3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Preparación de variantes
[0075] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprenden: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una modificación en dos o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 140, 181, 189, 134, 195, 206, 243, 260, 262, 284, 304, 347, 439, 469, 476 y 477 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.
[0076] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprenden: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una modificación en dos o más (varias) posiciones correspondientes a W140, R181, W189, D134, N195, V206, Y243, E260, F262, W284, G304, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.
[0077] La modificación introducida puede ser una sustitución.
[0078] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una sustitución en dos o más (varias) posiciones correspondientes a G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR, W347HFY, W439RG, G476EQRK, G477EQKMR del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración está según SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.
[0079] Las sustituciones introducidas pueden ser dos o más de G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK, G477EKMR. Las sustituciones introducidas pueden ser G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY y G476EQRK. El método para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa comprende: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental sustituciones de G304R, W140Y, E260G y G476K en cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.
[0080] Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida, construcción de gen sintético, construcción de gen semisintético, mutagénesis aleatoria, recombinación aleatoria, etc.
ES 2 834 102 T3
[0081] La mutagénesis dirigida es una técnica en la que una o más (varias) mutaciones se crean en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el progenitor.
[0082] La mutagénesis dirigida se puede realizar in vitro mediante PCR empleando cebadores oligonucleótidos con la mutación deseada. La mutagénesis dirigida también puede realizarse in vitro mediante mutagénesis de casete, que implica la escisión por una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y el ligamiento posterior de un oligonucleótido con la mutación con el polinucleótido. Normalmente la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo que los extremos cohesivos del plásmido y del inserto se enlacen uno con otro. Véase, por ejemplo, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.
[0083] La mutagénesis dirigida al sitio también puede realizarse in"vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett.43: 15-16.
[0084] Se puede usar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida en la presente invención. Hay muchos kits comerciales disponibles que pueden utilizarse para preparar variantes.
[0085] La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis génica se puede realizar utilizando varias técnicas, tales como la tecnología con microchip de síntesis múltiple descrita por Tian et al. (004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y se ensamblan en chips microfluídicos fotoprogramables.
[0086] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicas o múltiples se pueden realizar y evaluar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o recombinación aleatoria, seguido de un procedimiento de cribado pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0087] Los métodos de mutagénesis/recombinación aleatoria pueden combinarse con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de residuos de aminoácidos individuales de un polipéptido.
[0088] La construcción de genes semisintéticos se realiza combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida al sitio, y/o mutagénesis aleatoria, y/o recombinación aleatoria. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que son sintetizados, en combinación con técnicas de PCR. Regiones definidas de genes se pueden sintetizar así de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores de mutagénesis dirigida al sitio, mientras que otras regiones más se pueden someter a amplificación por PCR propensa a errores o no propensa a errores. Las subsecuencias de polinucleótido pueden entonces recombinarse.
Variantes
[0089] La presente invención también proporciona variantes de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F,
N195F+V206Y+Y243F+W284D,
W140F+R181H,
ES 2 834 102 T3
N195F+V206Y+E260R+G273D,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,
D134E+G476E,
K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,
N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,
W189E N195F V206Y Y243F,
W140Y N195F V206Y Y243F W284D,
N195F V206Y Y243F G477R,
N195F V206Y Y243F G477M,
W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,
W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,
Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,
G109A+W140Y+E194D+N195 F+V206Y+Y243F+ E260G, G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E, T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,
T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,
T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,
W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,
N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,
N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y
N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.
[0090] En una forma de realización, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental.
[0091] En otra forma de realización, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
[0092] En un aspecto, el número de modificaciones en las variantes de la presente invención es de 2-20, por ejemplo, 2-10 y 2-5, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones.
[0093] Las variantes pueden comprender además una modificación en una o más (varias) posiciones distintas. Por ejemplo, las variantes pueden comprender una modificación en una posición que corresponde con las posiciones G182*+D183* o D183*+G184*.
[0094] Los aminoácidos esenciales en un progenitor se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula, y se determina la actividad de alfa-amilasa de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la alfa-amilasa u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del posible sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver
ES 2 834 102 T3
et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de análisis de identidad con polipéptidos relacionados con el progenitor.
Polinucleótidos
[0095] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.
Constructos de ácido nucleico
[0096] La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican variantes de la invención. La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente unido a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0097] Un polinucleótido se puede manipular en una variedad de maneras para proveer a la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria en función del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen en la técnica.
[0098] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o bien heterólogos a la célula hospedadora.
[0099] Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el operón lac de E. coli, el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21­ 25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.
[0100] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora de hongo filamentoso son los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en medio ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus orizae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado incluyendo un gen que codifica una alfa-amilasa neutra de Aspergilli en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida de un gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados incluyendo el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus"niger en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en el Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.
[0101] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), deshidrogenasa de alcohol
ES 2 834 102 T3
dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y cinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0102] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que es reconocida por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente unida al extremo 3'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.
[0103] Los terminadores preferidos para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0104] Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.
[0105] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción en la célula hospedadora. La secuencia líder está operativamente unida al extremo 5'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedadora.
[0106] Las secuencias líderes preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0107] Las secuencias líderes adecuadas para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[0108] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3'-terminal de la secuencia codificante de la variante y, cuando se transcribe, la célula hospedadora la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.
[0109] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxisporum.
[0110] Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0111] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N-terminal de una variante y dirige la variante a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener intrínsecamente una región codificante del péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es exógena a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal exógena puede requerirse donde la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante del péptido señal. Alternativamente, la región codificante del péptido señal exógena puede reemplazar simplemente la región codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, puede utilizarse cualquier región codificante del péptido señal que dirija la variante expresada a la vía secretora de una célula hospedadora.
[0112] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes de la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837,
ES 2 834 102 T3
subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis prsA. Se describen péptidos señal adicionales en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0113] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
[0114] Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras secuencias codificantes del péptido señal útiles en Romanos et al., 1992, supra.
[0115] La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido desde el propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), la proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), la lacasa de Myceliophthora thermofila (WO 95/33836), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0116] Cuando tanto el péptido señal como las regiones de propéptido están presentes en el extremo N-terminal de una variante, la región de propéptido se sitúa junto al extremo N-terminal de la variante y la región del péptido señal se sitúa junto al extremo N-terminal de la región de propéptido.
[0117] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causa que la expresión del gen se active o se desactive en respuesta a una sustancia química o un estímulo físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, puede utilizarse el sistema ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus orizae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
[0118] La presente invención se refiere a vectores de expresión que comprenden el polinucleótido de la presente invención. La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleótidos y de control se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que pueden incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar mediante la inserción del polinucleótido o de un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector, de modo que la secuencia codificante está operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0119] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que el vector va a introducirse. El vector puede ser un plásmido lineal o cerrado circular.
[0120] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula
ES 2 834 102 T3
hospedadora, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma(s) en el que se ha integrado. Además, se pueden utilizar un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.
[0121] El vector contiene preferiblemente uno o más (varios) marcadores seleccionares que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia vírica o a biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similar.
[0122] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o tetraciclina. Marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus se prefieren para uso en una célula de Aspergillus.
[0123] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.
[0124] Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias nucleótídicas adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación(es) precisa(s) en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integradores pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integradores pueden ser secuencias nucleotídicas codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora por recombinación nohomóloga.
[0125] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse autónomamente en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa una secuencia nucleotídica que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
[0126] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMV1 que permiten la replicación en Bacillus.
[0127] Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula hospedadora de levadura son los orígenes de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
[0128] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden conseguirse según los métodos descritos en WO 00/24883.
[0129] Se pueden insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula hospedadora para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, así, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
ES 2 834 102 T3
[0130] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obtener variantes sustancialmente puras.
Células hospedadoras
[0131] La presente invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden el polinucleótido de la invención. La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativamente unido a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora de modo que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se autorreplica como se ha descrito anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurran durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran parte del gen codificante de la variante y su fuente.
[0132] La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.
[0133] La célula hospedadora procariótica puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
[0134] La célula hospedadora bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.
[0135] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0136] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
[0137] La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol.
56: 209-221), por electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o por conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127­ 6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos y electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede, por ejemplo, efectuarse por electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51­ 57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede, por ejemplo, ser efectuada por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, por electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev.
45: 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.
ES 2 834 102 T3
[0138] La célula hospedadora también puede ser un eucariota, tal como un mamífero, un insecto, una planta o una célula fúngica.
[0139] La célula hospedadora puede ser una célula fúngica. Los "hongos" como se utilizan en la presente incluyen los filos de Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como los hongos Oomycota y todos los mitospóricos (como se definen en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
[0140] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. La "levadura" como se utiliza en la presente incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporógena y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0141] La célula hospedadora de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
[0142] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por crecimiento hifal y el catabolismo de carbono es aeróbico estricto. En cambio, el crecimiento vegetativo de las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por gemación de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0143] La célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.
[0144] Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0145] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformar levadura utilizando los procedimientos descritos en Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
ES 2 834 102 T3
Métodos de producción
[0146] La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprende: (a) el cultivo de una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) la recuperación de la variante.
[0147] Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en frascos en agitación o mediante fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentación en continuo, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan que se exprese y/o se aísle el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se segrega en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se segrega, se puede recuperar de lisados celulares.
[0148] La variante se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.
[0149] La variante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
[0150] La variante se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero de forma no limitativa, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), Sd S-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.
[0151] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante se usa como fuente de la variante.
Composiciones
[0152] Se describen composiciones que comprenden una variante de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal variante. El término "enriquecido" se refiere a que la actividad de alfa-amilasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1.1.
[0153] La composición puede comprender una variante como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La enzima(s) adicional puede ser producida, por ejemplo, por un microorganismo del género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, por ejemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, por ejemplo, Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
ES 2 834 102 T3
[0154] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o de una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La variante se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.
[0155] Según la invención, las variantes de alfa-amilasa anteriores pueden típicamente ser un componente en una composición de limpieza, tal como una composición detergente, por ejemplo, una composición de detergente para ropa 0 una composición de detergente de lavado de vajillas. Se prefiere especialmente una composición líquida de detergente para ropa.
[0156] Tales composiciones de limpieza comprenden un complemento de limpieza/detergente, preferiblemente una mezcla de componentes. Típicamente, el complemento de limpieza estará presente en la composición en una cantidad de 0,001 a 99,9% en peso, más típicamente de 0,01 a 80% en peso del complemento de limpieza.
[0157] En otro aspecto preferido, la composición comprende uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos, incluyendo semipolares, y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos y/o anfolítico y/o semipolar y/o mezclas derivadas. Los tensioactivos están presentes típicamente en una proporción de un 0,1% a un 60% en peso o de un 0,5 a un 50% en peso o de un 1 a un 40% en peso de la composición.
Usos
[0158] Se describen también métodos para utilizar las variantes de alfa-amilasa de la invención.
Las variantes de alfa-amilasa de la invención son útiles en composiciones detergentes, lavado de ropa, lavado de vajillas y/o procesos de limpieza a bajas temperaturas.
EJEMPLOS
Ensayo pNP-G7 para la determinación de la actividad de alfa-amilasa
[0159] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar por un método que utiliza el sustrato G7-pNP. El G7-pNP, que es una abreviatura para 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-a,D-maltoheptaósido, es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit continúa digiriendo el sustrato hidrolizado para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y así se puede medir por espectrofometría visible a A = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato G7-pNP y alfa-glucosidasa están fabricados por Roche/Hitachi (N.0 cat. 11876473).
REACTIVOS:
[0160] El sustrato G7-pNP de este kit contiene 22 mM de 4,6-etilideno- G7-pNP y 52,4 mM de HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico), pH 7,0).
[0161] El reactivo de alfa-glucosidasa contiene 52,4 mM de HEPES, 87 mM de NaCl, 12,6 mM de MgCl2, 0,075 mM CaCl2, { 4 kU/L de alfa-glucosidasa).
[0162] La solución de trabajo del sustrato se prepara mediante la mezcla de 1 mL del reactivo de alfa-glucosidasa con 0,2 mL del sustrato G7-pNP. Esta solución de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes de usarla.
[0163] El tampón de dilución: 50 mM de MOPS, 0,05% de Tritón de X100 (p/v) (éter de p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilo de polietilenglicol (C14H220(C2H40)n (n = 9-10))), 1 mM CaCl2; pH 8,0.
PROCEDIMIENTO:
[0164] La muestra de amilasa que se iba a analizar se diluyó en el tampón de dilución para asegurar que el pH en la muestra diluida era 7. El ensayo se realizó transfiriendo 20 } l de muestras de enzima diluida a una placa de microtitulación de 96 pocillos y añadiendo 80 } l de solución de trabajo del sustrato. La solución se mezcló y preincubó 1 minuto a temperatura ambiente y la absorción se midió cada 20 s. durante 5 minutos a una DO de 405 nm.
ES 2 834 102 T3
[0165] La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción en función del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto de condiciones dado. La muestra de amilasa debería diluirse a una cantidad donde la pendiente sea inferior a 0,4 unidades de absorbancia por minuto.
Ensayo automático de tensión mecánica (AMSA) para lavado de ropa
[0166] Para valorar el rendimiento de lavado en el lavado de ropa se realizan experimentos, utilizando el ensayo automático de tensión mecánica (AMSA). Con el AMSA, se puede evaluar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de volúmenes pequeños de soluciones detergentes con enzima. La placa AMSA tiene un número de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que presiona firmemente la muestra de lavado de ropa, el tejido que se va a lavar, contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el tejido y la tapa se agitan enérgicamente para poner la solución de ensayo en contacto con el tejido y aplicar tensión mecánica de una manera regular, con oscilación periódica. Para una descripción adicional véase W002/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24.
Descripción general de rendimiento de lavado
[0167] Se prepara una solución de ensayo que comprende agua (10°dH), detergente, por ejemplo, 5,1 g/L de detergente líquido europeo como se describe a continuación y la enzima de la invención, por ejemplo, en una concentración de 0, 0,8 y/o 1,2 mg de proteína enzimática/L Se añaden tejidos manchados con almidón (por ejemplo, CS-28 del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Bajos) y se lavan durante 20 minutos a 20°C. Tras enjuagar a fondo con agua del grifo corriente y secar a oscuras, la intensidad de luz o los valores de reflectancia de los tejidos manchados se miden posteriormente como medida del rendimiento de lavado. El ensayo con 0 mg de proteína enzimática/L se usa como blanco para obtener un valor de remisión delta. Se aplica preferiblemente acción mecánica durante la etapa de lavado, por ejemplo, agitando, rotando o removiendo la solución de lavado con los tejidos. Los experimentos de rendimiento de lavado AMSA se realizaron en las condiciones experimentales especificadas a continuación:
Tabla 1: condiciones experimentales AMSA
Figure imgf000022_0001
[0168] El tampón de dilución de amilasa: la amilasa se diluyó en agua ultrapura (agua MilliQ) con una concentración pequeña de calcio (0,1 mM) para estabilizar la amilasa durante el almacenamiento y 0,01 % de Tritón X-100 para reducir el riesgo de adsorción de proteína enzimática a los recipientes y las pipetas.
[0169] La dureza del agua se ajustó a 10°dH por adición de CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+:HC03- = 3:1:4,5) al sistema de ensayo. Después de lavar los tejidos se enjuagaron en agua del grifo y se secaron.
[0170] El rendimiento de lavado se mide como la luminosidad del color del tejido lavado. La luminosidad puede también expresarse como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es inferior a la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede utilizarse para medir el rendimiento de lavado.
ES 2 834 102 T3
[0171] Las mediciones de color se realizan con un escáner plano profesional (Kodak ¡Qsmart, Kodak, Midtager 29; DK-2605 Brondby, Dinamarca), que se utiliza para capturar una imagen del tejido lavado.
[0172] Para extraer un valor de la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, valores de 24 bits por píxel de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula añadiendo los valores RGB juntos como vectores y luego obteniendo la longitud del vector resultante:
Figure imgf000023_0001
[0173] Tejidos: la muestra textil CS-28 (almidón de arroz en algodón) se obtiene del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos.
Los resultados del ensayo AMSA de lavado de ropa con diferentes variantes se muestran en la Tabla 3. En el resultado, el índice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental se le asigna el valor 100 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Rendimiento de lavado AMSA
[0174] El rendimiento de lavado de las variantes y las alfa-amilasas parentales correspondientes se evaluaron con el método de ensayo AMSA como se describe en la sección de métodos. Los resultados se dan como (el rendimiento de la variante menos el rendimiento del blanco) dividido por (el rendimiento del progenitor menos el rendimiento de del blanco) multiplicados por 100, donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante el lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfa-amilasa. Por último, se calcularon las medias de rendimiento relativo a las dos concentraciones 0,8 y 1,2 Mg/L. Los resultados se presentan en la Tabla 3.
Ensayo de lavado Tera-O-tometer PTOMQ
[0175] El Tergo-To-Meter (TOM) es un sistema de lavado modelo a media escala que se puede aplicar para evaluar 12 condiciones de lavado diferentes simultáneamente. Un TOM es básicamente un gran baño de agua con control de temperatura con hasta 12 vasos de precipitados metálicos abiertos sumergidos en él. Cada vaso de precipitados constituye una lavadora pequeña del tipo de carga superior y, durante un experimento, cada una de ellas contendrá una solución de un sistema específico de detergente/enzima y los tejidos sucios y limpios en los que se evalúa su rendimiento. La tensión mecánica se consigue con un brazo de agitación rotativa, que remueve el líquido dentro de cada vaso de precipitados. Debido a que los vasos de precipitados del TOM no tienen tapa, es posible retirar muestras durante un experimento TOM y evaluar la información en línea durante el lavado.
[0176] El sistema de lavado del modelo TOM se usa principalmente en ensayos a media escala de detergentes y enzimas en los EE. UU. o en condiciones de lavado LA/AP. En un experimento TOM, se pueden variar los factores tales como la proporción entre carga y suciedad y la proporción entre tejido y licor de lavado. Por lo tanto, el TOM proporciona la conexión entre los experimentos a pequeña escala, tales como AMSA y mini lavado, y los experimentos de mayor duración a escala real en lavadoras de carga superior.
[0177] Equipo: el baño de agua con 12 vasos de precipitados de acero y 1 brazo rotativo por vaso de precipitados con capacidad de 500 o 1200 mL de solución detergente. La temperatura varía de 5 a 80°C. El baño de agua tiene que llenarse con agua desionizada. La velocidad de rotación se puede ajustar de 70 a 120 rpm/min.
Rendimiento de lavado TOM
[0178] La dureza del agua se ajustó a la fuerza descrita a continuación por adición de CaCl2, MgCl2 y NAHC03. Las soluciones de lavado se prepararon con la cantidad deseada de detergente, temperatura y dureza del agua en un cubo como se describe más adelante. El detergente se disolvió mediante agitación magnética durante 10 min. (La solución de lavado se usó de 30 a 60 min después de la preparación).
[0179] La temperatura y la rotación (rpm) en el baño de agua en el Terg-O-Tometer se fijaron según los ajustes indicados más adelante. Cuando la temperatura se fijó según los ajustes (la tolerancia es /- 0,5°C) se añadió la solución de lavado al vaso de precipitados TOM según la cantidad descrita más adelante.
ES 2 834 102 T3
[0180] La agitación en el vaso de precipitados fue de 120 rpm.2 muestras de almidón de arroz (CS-28) y carga de tierra se añadieron a cada uno de los vasos de precipitados y el lavado se realizó según el tiempo declarado más adelante. Las muestras se enjuagaron en agua del grifo fría durante 5 min. Las muestras se dejaron secar a oscuras durante la noche.
[0181] Tejido: la muestra de tejido CS-28 (almidón de arroz en algodón) se obtuvo del Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, el Países Bajos.
[0182] Carga de suciedad: algodón/poliéster manchado de almidón de arroz (EMPA 162) se obtuvo del Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos. La salsa de carne Bistro (063KC), el batido de chocolate Frij, los espaguetis Heinz (113KC), el chocolate doble Herseys se obtuvieron de Warwick Equest Ltd, Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham, DH86BN Reino Unido
[0183] Los resultados del ensayo de lavado TOM de diferentes variantes se muestran en la Tabla 3. En el resultado el índice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental (SEQ ID NO: 7) se le asigna el valor 100 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Tabla 2: condiciones experimentales
Figure imgf000024_0001
Los detergentes y materiales de ensayo fueron los siguientes:
Figure imgf000024_0002
[0184] El rendimiento de lavado se midió como la luminosidad del color del tejido lavado expresado en valores de remisión. Las mediciones de remisión se realizaron utilizando un espectrofotómetro Macbeth 7000 Color Eye. Se midieron cada una de las muestras secas. Como existe un riesgo de interferencia con el fondo, las muestras se colocaron encima de 4 capas de tejido durante la medición de la remisión. La remisión se midió a 460 nm. El filtro UV no se incluyó. Se calculó un resultado medio de la remisión de las muestras.
Ejemplo 1
Rendimiento de lavado de las alfa-amilasas en detergente líquido europeo (EU) (ejemplo 1A) y estadounidense (ejemplo 1B) (EE. UU.)
[0185] El rendimiento de lavado de la variante evaluada y la alfa-amilasa parental correspondiente (SEQ ID NO: 7) se evaluaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados se dan como (rendimiento de la variante menos
ES 2 834 102 T3
rendimiento del blanco) dividido entre (rendimiento del progenitor menos rendimiento del blanco) multiplicado por 100; donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfaamilasa.
Ejemplo 1A: composición de detergente europeo para ropa Heavv Dutv Liauid
[0186]
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 1B: composición de detergente estadounidense para ropa Heavv Dutv Liauid
[0187]
Figure imgf000025_0002
ES 2 834 102 T3
Figure imgf000026_0001
Tabla 3: Rendimiento de lavado
Figure imgf000026_0002
ES 2 834 102 T3
Figure imgf000027_0001
[0188] Los resultados del ensayo de rendimiento de lavado demuestran claramente que los rendimientos de las variantes han mejorado respecto a su molécula parental respectiva (SEQ ID NO 7) a las temperaturas evaluadas.
Ejemplo 2
Evaluación de rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.
I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo
[0189] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en el ejemplo 1A de detergente liquido. Se preparó una base de detergente a partir del ejemplo 1A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.
[0190] Se prepararon las siguientes cuatro formulaciones de detergente:
Tabla 4:
Figure imgf000027_0002
II. Tejidos de ensayo
[0191] Tres manchas sensibles a la amilasa; CS-28 almidón de arroz, PCS-28 almidón de arroz y CS-29 almidón de tapioca, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrados por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; salsa barbacoa y batido de chocolate Frijj, 2,5 cm de diámetro, se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) con cada formulación de ensayo.
Tabla 5:
Figure imgf000027_0003
ES 2 834 102 T3
Figure imgf000028_0001
III. Procedimiento de ensayo de lavado
[0192] El método implica el uso de lavadoras Hotpoint de Europa occidental, modelo Aquarius WF541. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de carga sucia y limpia como se ha descrito anteriormente.
[0193] Lavadoras con 6 g/L de formulación de ensayo, 13 L de agua con 10° Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15°C en un ciclo rápido de lavado de algodón de 1 hora y 15 minutos de duración. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.
[0194] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.
[0195] El índice de eliminación de manchas (SRI) (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.
[0196] El índice de rendimiento se midió también calculando (rendimiento del ejemplo C o ejemplo D menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.
IV. Comparación de las muestras.
[0197]
Tabla 6: SRI medio de 5 manchas 8 réplicas de cada mancha
Figure imgf000028_0002
Tabla 7: Indice de rendimiento para CS-29 almidón de tapioca (8 réplicas]
Figure imgf000028_0003
ES 2 834 102 T3
[0198] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C y D (que contienen las variantes 1 y 2 respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.
[0199] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C y D (que contienen las variantes 1 y 2 respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que ambas variantes 1 y 2 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que la Natalase®.
Ejemplo 3
Evaluación del rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.
I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo
[0200] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en el detergente liquido del ejemplo 1B anterior. Se preparó una base de detergente a partir del ejemplo 1B, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.
[0201] Se prepararon las siguientes cuatro formulaciones:
Tabla 8:
Figure imgf000029_0001
II. Tejidos de ensayo
[0202] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, PS-28 almidón de arroz y CS-26 almidón de maíz, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; salsa barbacoa y alimento infantil de pudin de chocolate, 2,5 cm de diámetro, se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) con cada formulación.
Tabla 9:
Figure imgf000029_0002
ES 2 834 102 T3
Figure imgf000030_0001
III. Procedimiento de lavado de ensayo
[0203] El método implica el uso de una lavadora estadounidense Kenmore modelo de la serie 600. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de suciedad y carga limpia como se ha descrito anteriormente.
[0204] Lavadoras con 0,78 g/L de formulación de ensayo, 64 L de agua con 6o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un superlavado de 12 minutos con un aclarado. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.
[0205] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.
[0206] El índice de eliminación de manchas (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.
[0207] El índice de rendimiento también se midió calculando (rendimiento del ejemplo C o ejemplo D menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.
IV. Comparación de las muestras.
[0208]
Tabla 10: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)
Figure imgf000030_0002
Tabla 11: Indice de rendimiento para CS-26 almidón de maíz (8 réplicas]
Figure imgf000030_0003
ES 2 834 102 T3
[0209] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C y D (que contienen las variantes 3 y 4, respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.
[0210] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C y D (que contienen las variantes 3 y 4 respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que ambas variantes 3 y 4 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que Natalase®.
Ejemplo 4
Evaluación del rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.
I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo
[0211] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en la formulación de detergente liquido 4A de más adelante. Se preparó una base de detergente a partir de la formulación 4A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.
Tabla 12; Formulación 4A: Composición de detergente para ropa Heavy Duty Liquid
Figure imgf000031_0002
[0212] Se prepararon las siguientes siete formulaciones detergentes:
Tabla 13
Figure imgf000031_0001
ES 2 834 102 T3
Figure imgf000032_0001
II. Tejidos de ensayo
[0213] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, CS-128 almidón de arroz envejecido y CS-26 almidón de maíz, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; chili con carne y espaguetis Heinz, 2,5 cm de diámetro se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) se usaron para cada formulación de ensayo.
Tabla 14
Figure imgf000032_0002
III. Procedimiento de lavado de ensayo
[0214] El método implica el uso de lavadoras Hotpoint de Europa occidental, modelo Aquarius WF541. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de carga sucia y limpia como se ha descrito anteriormente.
ES 2 834 102 T3
[0215] Lavadoras con 6 g/L de formulación de ensayo, 13 L de agua con 10o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un ciclo rápido de lavado de algodón de 1 hora y 15 minutos de duración. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.
[0216] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.
[0217] El índice de eliminación de manchas (SRI) (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.
[0218] El índice de rendimiento se midió también calculando (rendimiento del ejemplo C, D, E, F o G menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.
IV. Comparación de las muestras.
[0219]
Tabla 15: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)
Figure imgf000033_0001
Tabla 16: Indice de rendimiento para chili con carne (8 réplicas]
Figure imgf000033_0002
[0220] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C, D, E, F y G (que contienen las variantes 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.
[0221] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C, D, E, F y G (que contienen las variantes 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que las variantes 5, 6, 7, 8 y 9 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que Natalase®.
ES 2 834 102 T3
Ejemplo 5
Evaluación del rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.
I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo
[0222] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en la formulación 5A de detergente liquido. Se preparó una base de detergente a partir de la formulación 5A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.
Tabla 17: Formulación 5A Composición de detergente para ropa Heavy Duty Liquid
Figure imgf000034_0001
Tabla 18
Figure imgf000034_0002
[0223] Se prepararon las siguientes seis formulaciones:
*Añadida como proteína enzimática activa
1Natalase® es suministrada por Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca como 'Natalase 200L'.
2La variante 7 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones T51I, S52Q, N54K, G109A, W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G y G476E. También referidas como SP722 D183* G184* T511 S52Q N54K G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E.
3La variante 8 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones W140Y, N195F, V206y , Y243F, E260G, G304R y G476K. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G G304R G476K.
ES 2 834 102 T3
4La variante 9 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284R y G477K. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G W284R G477K.
5La variante 10 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones w 140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284F y G477R. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G W284F G477R.
II. Tejidos de ensayo
[0224] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, PS-28 almidón de arroz y CS-29 almidón de tapioca, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Una mancha sensible a la amilasa; espaguetis Heinz, 2,5 cm de diámetro, se fijó a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Una mancha sensible a la amilasa; salsa, 2,5 cm de diámetro, se fijó a 25 cm x 24 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Accurate Product Development, Fairfield, Ohio, EE. UU.). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) para cada formulación de ensayo.
Tabla 19
Figure imgf000035_0001
III. Procedimiento de lavado de ensayo
[0225] El método implica el uso de una lavadora estadounidense Kenmore modelo de la serie 600. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de suciedad y carga limpia como se ha descrito anteriormente.
[0226] Lavadoras con 0,78 g/L de formulación de ensayo, 64 L de agua con 6o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un superlavado de 12 minutos con un aclarado. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior. El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.
[0227] El índice de eliminación de manchas (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar)) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.
[0228] El índice de rendimiento también se midió calculando (rendimiento del ejemplo C, D, E o F menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.
IV. Comparación de las muestras.
[0229]
Tabla 20: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)
Figure imgf000035_0002

Claims (8)

ES 2 834 102 T3REIVIN DICACIONES
1. Variante aislada de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F,
N195F+V206Y+Y243F+W284D,
W140F+R181 H,
N195F+V206Y+E260R+G273D,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,
D134E+G476E,
K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,
N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,
W189E N195F V206Y Y243F,
W140Y N195F V206Y Y243F W284D,
N195F V206Y Y243F G477R,
N195F V206Y Y243F G477M,
W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,
W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,
Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,
W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,
G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G,
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E,
T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,
T511+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,
T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,
W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,
N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,
N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y
N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.
2. Variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95% de identidad, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1.
3. Variante según la reivindicación 1 o 2, que comprende además deleciones en las posiciones correspondientes a las posiciones G182*+D183* o D183*+G184* de SEQ ID NO: 1.
4. Polinucleótido aislado que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.
6. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.
7. Célula hospedadora que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.
ES 2 834 102 T3
8. Método de producción de una variante de una alfa-amilasa parental, que comprende el cultivo de la célula hospedadora según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y la recuperación de la variante.
ES18183123T 2011-06-30 2012-06-29 Variantes de alfa-amilasa Active ES2834102T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11172251 2011-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2834102T3 true ES2834102T3 (es) 2021-06-16

Family

ID=46397293

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18183123T Active ES2834102T3 (es) 2011-06-30 2012-06-29 Variantes de alfa-amilasa
ES12730567.0T Active ES2692544T3 (es) 2011-06-30 2012-06-29 Variantes de alfa-amilasa

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12730567.0T Active ES2692544T3 (es) 2011-06-30 2012-06-29 Variantes de alfa-amilasa

Country Status (13)

Country Link
US (4) US9434932B2 (es)
EP (3) EP3798303A1 (es)
JP (1) JP6204352B2 (es)
KR (1) KR20140056237A (es)
CN (2) CN103649307B (es)
AU (1) AU2012277721B2 (es)
BR (1) BR112013033782B1 (es)
DK (2) DK2726607T3 (es)
ES (2) ES2834102T3 (es)
IN (1) IN2014CN00650A (es)
MX (1) MX353621B (es)
WO (1) WO2013001078A1 (es)
ZA (1) ZA201400678B (es)

Families Citing this family (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9434932B2 (en) 2011-06-30 2016-09-06 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP2540824A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing
DK3543333T3 (da) 2011-06-30 2022-02-14 Novozymes As Fremgangsmåde til screening af alfa-amylaser
CN104302753A (zh) 2012-05-16 2015-01-21 诺维信公司 包括脂肪酶的组合物及其使用方法
CA2874061A1 (en) 2012-06-08 2014-01-09 Danisco Us Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
WO2013189972A2 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
WO2014029819A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Novozymes A/S Metalloprotease from exiguobacterium
WO2014029821A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Novozymes A/S Metalloproteases from alicyclobacillus sp.
ES2738639T3 (es) 2012-12-07 2020-01-24 Novozymes As Prevención de la adhesión de bacterias
EP2934177B1 (en) 2012-12-21 2017-10-25 Novozymes A/S Polypeptides having protease activiy and polynucleotides encoding same
EP3321360A3 (en) 2013-01-03 2018-06-06 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN110777132B (zh) * 2013-03-11 2024-03-22 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
EP3569611A1 (en) 2013-04-23 2019-11-20 Novozymes A/S Liquid automatic dish washing detergent compositions with stabilised subtilisin
CN105164244B (zh) 2013-05-03 2019-08-20 诺维信公司 洗涤剂酶的微囊化
RU2020101263A (ru) 2013-05-14 2020-02-17 Новозимс А/С Моющие композиции
US20160083703A1 (en) 2013-05-17 2016-03-24 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3004315A2 (en) 2013-06-06 2016-04-13 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20160145596A1 (en) 2013-06-27 2016-05-26 Novozymes A/S Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same
BR112015032524A2 (pt) 2013-06-27 2017-08-29 Novozymes As Variante de subtilase tendo atividade de protease, método para a sua obtenção, composição detergente que a contém e uso da composição detergente em um processo de limpeza
AU2014286135A1 (en) 2013-07-04 2015-12-03 Novozymes A/S Polypeptides with xanthan lyase activity having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same
CN117904081A (zh) 2013-07-29 2024-04-19 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3027747B1 (en) 2013-07-29 2018-02-07 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
EP3453757B1 (en) 2013-12-20 2020-06-17 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20160348035A1 (en) 2014-03-05 2016-12-01 Novozymes A/S Compositions and Methods for Improving Properties of Non-Cellulosic Textile Materials with Xyloglucan Endotransglycosylase
CN106062271A (zh) 2014-03-05 2016-10-26 诺维信公司 用于改进具有木葡聚糖内糖基转移酶的纤维素纺织材料的性质的组合物和方法
WO2015150457A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3722406A1 (en) 2014-04-11 2020-10-14 Novozymes A/S Detergent composition
AR100605A1 (es) 2014-05-27 2016-10-19 Novozymes As Métodos para la producción de lipasas
CN106459939A (zh) 2014-05-27 2017-02-22 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3155097A1 (en) 2014-06-12 2017-04-19 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20170121646A1 (en) 2014-07-03 2017-05-04 Novozymes A/S Improved Stabilization of Non-Protease Enzyme
EP3739029A1 (en) 2014-07-04 2020-11-18 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3327122B1 (en) 2014-07-04 2021-02-17 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
CN107075489A (zh) 2014-11-20 2017-08-18 诺维信公司 脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸
EP3227444B1 (en) 2014-12-04 2020-02-12 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2016087401A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
EP3399031B1 (en) 2014-12-15 2019-10-30 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
EP3233894A1 (en) 2014-12-16 2017-10-25 Novozymes A/S Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity
EP3034591A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034597A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034588B1 (en) 2014-12-17 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034596B2 (en) 2014-12-17 2021-11-10 The Procter & Gamble Company Detergent composition
EP3034592A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034589A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034590A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
ES2813727T3 (es) 2014-12-19 2021-03-24 Novozymes As Variantes de proteasa y polinucleótidos que las codifican
CN107109388A (zh) 2014-12-19 2017-08-29 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
US20180105772A1 (en) 2015-04-10 2018-04-19 Novozymes A/S Detergent composition
WO2016162556A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Novozymes A/S Laundry method, use of dnase and detergent composition
AR104783A1 (es) 2015-05-08 2017-08-16 Novozymes As VARIANTES DE a-AMILASA Y POLINUCLEÓTIDOS QUE LAS CODIFICAN
US10316275B2 (en) 2015-05-08 2019-06-11 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN107835853B (zh) 2015-05-19 2021-04-20 诺维信公司 气味减少
EP3287513A1 (en) 2015-06-04 2018-02-28 The Procter & Gamble Company Hand dishwashing liquid detergent composition
ES2670044T3 (es) 2015-06-04 2018-05-29 The Procter & Gamble Company Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
US10858637B2 (en) 2015-06-16 2020-12-08 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
EP3310688A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 Novozymes A/S Container
EP3106508B1 (en) 2015-06-18 2019-11-20 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
EP3310912B1 (en) 2015-06-18 2021-01-27 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN107922896A (zh) 2015-06-30 2018-04-17 诺维信公司 衣物洗涤剂组合物、用于洗涤的方法和组合物的用途
EP3317407B1 (en) 2015-07-01 2021-05-19 Novozymes A/S Methods of reducing odor
EP3950939A3 (en) 2015-07-06 2022-06-08 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
PL3350303T3 (pl) 2015-09-17 2021-01-25 Henkel Ag & Co. Kgaa Kompozycje detergentowe zawierające polipeptydy mające aktywność rozkładania ksantanu
CN108350443B (zh) 2015-09-17 2022-06-28 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CA2994356A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Novozymes A/S Compositions comprising dnase polypeptides
EP4324919A3 (en) 2015-10-14 2024-05-29 Novozymes A/S Polypeptide variants
BR112018007474A2 (pt) 2015-10-14 2018-10-30 Novozymes A/S ?limpeza de membranas de filtração de água?
EP3362558A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
WO2016203064A2 (en) 2015-10-28 2016-12-22 Novozymes A/S Detergent composition comprising protease and amylase variants
WO2017089366A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3384019B1 (en) 2015-12-01 2020-06-24 Novozymes A/S Methods for producing lipases
JP2018537099A (ja) 2015-12-07 2018-12-20 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ベータ−グルカナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、ならびにクリーニング組成物中でのおよび洗剤組成物中でのこの使用
WO2017117089A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Novozymes Bioag A/S Heat priming of bacterial spores
JP2019504625A (ja) 2016-01-29 2019-02-21 ノボザイムス アクティーゼルスカブ β−グルカナーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド
US20190048291A1 (en) 2016-03-23 2019-02-14 Novozymes A/S Use of Polypeptide Having DNase Activity for Treating Fabrics
EP3440180B1 (en) 2016-04-08 2020-11-11 Novozymes A/S Detergent compositions and uses of the same
BR112018072282A2 (pt) 2016-04-29 2019-02-12 Novozymes A/S composições detergentes e usos das mesmas
US20190218479A1 (en) 2016-05-31 2019-07-18 Novozymes A/S Stabilized Liquid Peroxide Compositions
EP3464582A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3257931A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 The Procter and Gamble Company Detergent composition
US11001787B2 (en) 2016-06-23 2021-05-11 Novozymes A/S Use of enzymes, composition and method for removing soil
CN109563495A (zh) 2016-06-30 2019-04-02 诺维信公司 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
JP6858850B2 (ja) 2016-07-13 2021-04-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーThe Procter & Gamble Company バチルス・シビ(BACILLUS CIBI)DNase変異体及びその使用
WO2018015295A1 (en) 2016-07-18 2018-01-25 Novozymes A/S Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof
EP3284805B1 (en) 2016-08-17 2020-02-19 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising enzymes
CN109996859B (zh) 2016-09-29 2021-11-30 诺维信公司 含孢子的颗粒
WO2018060216A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
WO2018077938A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Novozymes A/S Detergent compositions
US11753605B2 (en) 2016-11-01 2023-09-12 Novozymes A/S Multi-core granules
EP3548615A1 (en) * 2016-11-29 2019-10-09 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
RU2019120191A (ru) 2016-12-01 2021-01-11 Басф Се Стабилизация ферментов в композициях
US20190292493A1 (en) 2016-12-12 2019-09-26 Novozymes A/S Use of polypeptides
JP6899912B2 (ja) * 2017-02-01 2021-07-07 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーThe Procter & Gamble Company アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物
ES2963486T3 (es) * 2017-02-01 2024-03-27 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa
EP3601549A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
CN110651041A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 诺维信公司 具有dna酶活性的多肽
WO2018178061A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having rnase activity
CN110506048A (zh) 2017-04-03 2019-11-26 诺维信公司 回收方法
US20200109352A1 (en) 2017-04-04 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
WO2018185181A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Glycosyl hydrolases
US20200109354A1 (en) 2017-04-04 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides
DK3385361T3 (da) 2017-04-05 2019-06-03 Ab Enzymes Gmbh Detergentsammensætninger omfattende bakterielle mannanaser
EP3385362A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising fungal mannanases
US11352591B2 (en) 2017-04-06 2022-06-07 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018184873A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2018185285A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185269A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
US10968416B2 (en) 2017-04-06 2021-04-06 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018184818A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185267A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185280A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN110651038A (zh) 2017-05-05 2020-01-03 诺维信公司 包含脂肪酶和亚硫酸盐的组合物
WO2018224544A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions
CN111108183A (zh) 2017-06-30 2020-05-05 诺维信公司 酶浆液组合物
MX2020002953A (es) 2017-09-20 2020-07-22 Novozymes As Uso de enzimas para mejorar la absorcion de agua y/o la blancura.
US11414814B2 (en) 2017-09-22 2022-08-16 Novozymes A/S Polypeptides
EP3461892A3 (en) 2017-09-27 2019-06-12 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising lipases
CN117448299A (zh) 2017-09-27 2024-01-26 诺维信公司 脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物
US11746310B2 (en) 2017-10-02 2023-09-05 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
BR112020006621A2 (pt) 2017-10-02 2020-10-06 Novozymes A/S polipeptídeos com atividade de mananase e polinucleotídeos codificando os mesmos
WO2019076834A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S PELLETS WITH LOW DUST CONTENT
WO2019076833A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S PELLETS RELEASING LOW DUST QUANTITY
WO2019076800A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP3701001A1 (en) 2017-10-24 2020-09-02 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having mannanase activity
HUE057471T2 (hu) 2017-10-27 2022-05-28 Procter & Gamble Polipeptid-variánsokat tartalmazó mosószerkészítmények
EP3701016A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Novozymes A/S Dnase variants
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
EP3704220A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Novozymes A/S Methods for cleaning medical devices
US20200291330A1 (en) 2017-11-01 2020-09-17 Novozymes A/S Polypeptides and Compositions Comprising Such Polypeptides
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
BR112020008737A2 (pt) 2017-11-01 2020-10-13 Novozymes A/S polipeptídeos e composições que compreendam tais polipeptídeos
CN111465680A (zh) 2017-11-29 2020-07-28 巴斯夫欧洲公司 组合物、其制备和用途
WO2019110462A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN111868239A (zh) 2018-02-08 2020-10-30 诺维信公司 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物
CN111757930A (zh) 2018-02-08 2020-10-09 诺维信公司 脂肪酶变体及其组合物
US20210002588A1 (en) 2018-03-13 2021-01-07 Novozymes A/S Microencapsulation Using Amino Sugar Oligomers
EP3768835A1 (en) 2018-03-23 2021-01-27 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
WO2019201793A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Novozymes A/S Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric.
EP3781680A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
CN112272701B (zh) 2018-04-19 2024-05-14 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
BR112020021692A2 (pt) 2018-04-26 2021-01-26 Basf Se polipeptídeo tendo atividade de lipase, polipeptídeo híbrido, composição, polinucleotídeo variante, método para fabricar a variante de polipeptídeo, e, uso do polipeptídeo
EP3788145A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Basf Se Amylase enzymes
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
EP3814472A1 (en) 2018-06-28 2021-05-05 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020002608A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020002255A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
WO2020007863A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3818138A1 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3818140A1 (en) 2018-07-06 2021-05-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020070063A2 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020070209A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
WO2020070011A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
WO2020070014A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity
US20220073845A1 (en) 2018-10-02 2022-03-10 Novozymes A/S Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning
WO2020070249A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning compositions
US11993762B2 (en) 2018-10-03 2024-05-28 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
US20210395651A1 (en) 2018-10-05 2021-12-23 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
JP2022512599A (ja) 2018-10-05 2022-02-07 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 液体中のアミラーゼを安定化する化合物
JP2022504229A (ja) 2018-10-05 2022-01-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 液体中のヒドロラーゼを安定化する化合物
EP3864124A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3647398B1 (en) 2018-10-31 2024-05-15 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins v
EP3647397A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins iv
WO2020114965A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Novozymes A/S LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION
EP3891277A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S Powder detergent compositions
WO2020127796A2 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
EP3898919A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novozymes A/S Detergent pouch comprising metalloproteases
EP3927809A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and trace element feed
WO2020169563A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
EP3702452A1 (en) 2019-03-01 2020-09-02 Novozymes A/S Detergent compositions comprising two proteases
AU2020242303A1 (en) 2019-03-21 2021-06-24 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2020193534A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Amylase enzymes
WO2020193532A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Cleaning composition having amylase enzymes
WO2020193535A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Amylase enzymes
EP3947619A1 (en) 2019-04-03 2022-02-09 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
EP3953462A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Novozymes A/S Polypeptide variants
CN113795576A (zh) 2019-04-12 2021-12-14 诺维信公司 稳定化的糖苷水解酶变体
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
EP3983425A1 (en) 2019-06-13 2022-04-20 Basf Se Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation
US20220251528A1 (en) * 2019-06-24 2022-08-11 Novozymes A/S Alpha-Amylase Variants
EP3994255A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
MX2022000253A (es) 2019-07-05 2022-02-03 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para celulas microbianas mediante el uso de un precultivo de alimentacion por lotes.
WO2021009067A1 (en) 2019-07-12 2021-01-21 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
US20220267748A1 (en) 2019-08-22 2022-08-25 Basf Se Amylase variants
EP4022020A1 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Novozymes A/S Composition comprising a lipase
EP4022019A1 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Novozymes A/S Detergent composition
CN114616312A (zh) 2019-09-19 2022-06-10 诺维信公司 洗涤剂组合物
WO2021064068A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
WO2021074430A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Basf Se Storage-stable hydrolase containing liquids
US20210122998A1 (en) * 2019-10-24 2021-04-29 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition comprising an amylase
WO2021105330A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions and polymers useful for such compositions
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
WO2021122117A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning composition coprising a dispersin and a carbohydrase
EP4077656A2 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
US20230048546A1 (en) 2019-12-20 2023-02-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins vi
EP4077617A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Stabilized liquid boron-free enzyme compositions
WO2021122120A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins viii
WO2021151536A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry detergent product
MX2022008955A (es) 2020-01-31 2022-08-15 Novozymes As Variantes de mananasas y polinucleotidos que las codifican.
EP4097226A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
CN115210371A (zh) 2020-04-08 2022-10-18 诺维信公司 碳水化合物结合模块变体
CN115516071A (zh) 2020-04-21 2022-12-23 诺维信公司 包含具有果聚糖降解活性的多肽的清洁组合物
EP3907271A1 (en) 2020-05-07 2021-11-10 Novozymes A/S Cleaning composition, use and method of cleaning
WO2021239818A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
EP4172298A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Novozymes A/S Use of cellulases for removing dust mite from textile
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
WO2022023250A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Unilever Ip Holdings B.V. Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms
BR112023003468A2 (pt) 2020-08-25 2023-04-11 Novozymes As Variantes de uma xiloglucanase da família 44
CA3186910A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Rolf Thomas Lenhard Protease variants with improved solubility
WO2022058322A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Novozymes A/S Animal feed comprising insects or insect meal
WO2022063698A1 (en) 2020-09-22 2022-03-31 Basf Se Liquid composition comprising peptide aldehyde
JP2023544111A (ja) 2020-09-22 2023-10-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 第二の酵素を含む、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害薬との改善された組合せ
EP4225905A2 (en) 2020-10-07 2023-08-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP4232539A2 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
WO2022090320A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Novozymes A/S Use of lipoxygenase
US20240035005A1 (en) 2020-10-29 2024-02-01 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
US20230407209A1 (en) 2020-11-13 2023-12-21 Novozymes A/S Detergent Composition Comprising a Lipase
WO2022106400A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
WO2022106404A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of proteases
EP4015629A1 (en) 2020-12-18 2022-06-22 Basf Se Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
WO2022162043A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Novozymes A/S Lipase with low malodor generation
CN117015592A (zh) 2021-02-12 2023-11-07 诺维信公司 稳定的生物洗涤剂
CN116829709A (zh) 2021-02-12 2023-09-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体
EP4294917A1 (en) 2021-02-22 2023-12-27 Basf Se Amylase variants
EP4047088A1 (en) 2021-02-22 2022-08-24 Basf Se Amylase variants
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20240060061A1 (en) 2021-03-15 2024-02-22 Novozymes A/S Dnase variants
WO2022199418A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Novozymes A/S Detergent composition with reduced polymer content
WO2022268885A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
CA3238839A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Home care composition
US20230265358A1 (en) * 2021-12-16 2023-08-24 The Procter & Gamble Company Home care composition comprising an amylase
WO2023116569A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Novozymes A/S Composition comprising a lipase and a booster
WO2023117986A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Basf Se Environmental attributes for a curable composition
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
EP4234664A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 Evonik Operations GmbH Composition comprising glucolipids and enzymes
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023165950A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Novozymes A/S Dnase variants and compositions
WO2023194204A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Novozymes A/S Hexosaminidase variants and compositions
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2023233025A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Unilever Ip Holdings B.V. Liquid detergent product
WO2023247348A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2023247664A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
WO2024012894A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Basf Se Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations
WO2024033135A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033136A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024094735A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094733A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094732A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024121057A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S A composition for removing body grime
WO2024121070A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (198)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (es) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
US3912590A (en) 1973-01-03 1975-10-14 Novo Industri As Procedure for liquefying starch
US4105827A (en) 1973-04-20 1978-08-08 Interox Particulate peroxygen compounds coated with sodium sesquicarbonate or Na2 SO4 mNa2 CO3
FR2226460B1 (es) 1973-04-20 1976-12-17 Interox
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
US4316956A (en) 1980-02-06 1982-02-23 Novo Industri A/S Fermentation process
US4335208A (en) 1980-03-11 1982-06-15 Novo Industri A/S Saccharification of starch hydrolysates
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
FR2498783B1 (fr) 1981-01-23 1988-03-04 Decis Mario Dispositif de controle automatique de presence
JPS57174089A (en) 1981-04-20 1982-10-26 Novo Industri As Chain dividing enzyme product
FR2543181B1 (fr) 1983-03-22 1985-07-26 Ugine Kuhlmann Procede ameliore de desencollage-blanchiment simultane des tissus
US4519934A (en) 1983-04-19 1985-05-28 Novo Industri A/S Liquid enzyme concentrates containing alpha-amylase
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4689297A (en) 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4933287A (en) 1985-08-09 1990-06-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
DK311186D0 (da) 1986-06-30 1986-06-30 Novo Industri As Enzymer
ES2052565T3 (es) 1986-07-09 1994-07-16 Novo Nordisk As Un procedimiento para licuar una suspension de almidon o granos amilaceos.
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
PT89702B (pt) 1988-02-11 1994-04-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE3909096A1 (de) 1989-03-20 1990-09-27 Garabed Antranikian Alpha-amylase
DK198089D0 (da) 1989-04-24 1989-04-24 Danske Spritfabrikker Dna-materialer og anvendelse deraf
CA2030554C (en) 1989-06-29 2001-08-28 Wilhelmus J. Quax Mutant microbial .alpha.-amylases with increased thermal, acid, and/or alkaline stability
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
ES2055601T3 (es) 1990-04-14 1994-08-16 Kali Chemie Ag Lipasas alcalinas de bacillus, secuencias de adn que las codifican, asi como bacilli que producen estas lipasas.
AU639570B2 (en) 1990-05-09 1993-07-29 Novozymes A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
US5814501A (en) 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
ATE169671T1 (de) 1990-09-13 1998-08-15 Novo Nordisk As Lipase-varianten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
WO1992006221A1 (en) 1990-10-05 1992-04-16 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
US5180669A (en) 1991-03-27 1993-01-19 Genencor International, Inc. Liquefaction of granular-starch slurries using alpha-amylase in the presence of carbonate ion
GB9108136D0 (en) 1991-04-17 1991-06-05 Unilever Plc Concentrated detergent powder compositions
DK0583420T3 (da) 1991-04-30 1996-07-29 Procter & Gamble Builderholdige flydende detergenter med borsyre-polyol-kompleks til inhibering af proteolytisk enzym
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
DK0583339T3 (da) 1991-05-01 1999-04-19 Novo Nordisk As Stabiliserede enzymer og detergentsammensætninger
US5231017A (en) 1991-05-17 1993-07-27 Solvay Enzymes, Inc. Process for producing ethanol
DK0877077T3 (da) 1991-06-11 2010-09-06 Genencor Int Vaskemiddel-sammensætning indeholdende cellulase-sammensætninger, som er fattige for CBH I-type-bestanddele
US5324649A (en) 1991-10-07 1994-06-28 Genencor International, Inc. Enzyme-containing granules coated with hydrolyzed polyvinyl alcohol or copolymer thereof
DK0610358T3 (da) 1991-10-31 1998-02-02 Genencor Int Forflydning af opslæmninger af tørt formalede stivelseskorn
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
ATE444356T1 (de) 1992-07-23 2009-10-15 Novozymes As Mutierte -g(a)-amylase, waschmittel und geschirrspülmittel
EP0867504B2 (en) * 1993-02-11 2011-05-18 Genencor International, Inc. Oxidation-stable alpha-amylase
DK39093D0 (da) 1993-04-01 1993-04-01 Novo Nordisk As Enzym
US5576281A (en) 1993-04-05 1996-11-19 Olin Corporation Biogradable low foaming surfactants as a rinse aid for autodish applications
CA2138519C (en) 1993-04-27 2007-06-12 Jan Metske Van Der Laan New lipase variants for use in detergent applications
DK52393D0 (es) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
ATE163191T1 (de) 1993-05-08 1998-02-15 Henkel Kgaa Silberkorrosionsschutzmittel i
CZ287850B6 (en) 1993-05-08 2001-02-14 Henkel Kgaa Use of organic redox-active substances in dishwashing preparations and slightly alkaline preparation for machine washing of dishes
US5888954A (en) 1993-05-08 1999-03-30 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Corrosion inhibitors for silver
US5698504A (en) 1993-07-01 1997-12-16 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing composition containing oxygen bleach and paraffin oil and benzotriazole compound silver tarnishing inhibitors
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
BR9407767A (pt) 1993-10-08 1997-03-18 Novo Nordisk As Variante de enzima &-amilase uso da mesma construção de DNA vetor de express o recombinante célula processos para produzir uma &-amilase hibrida e para preparar uma variante de uma &-amilase aditivo detergente e composições detergentes
DE69434635D1 (en) 1993-10-08 2006-04-27 Novo Nordisk As Amylasevarianten
KR100338786B1 (ko) 1993-10-13 2002-12-02 노보자임스 에이/에스 H2o2-안정한퍼록시다제변이체
CN1082999C (zh) 1993-10-14 2002-04-17 普罗格特-甘布尔公司 含蛋白酶的洗涤组合物
DK131193D0 (es) 1993-11-23 1993-11-23 Novo Nordisk As
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
MY111537A (en) 1994-02-02 2000-07-31 Novo Nordisk As A combined desizing and bleaching process.
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
BR9506861A (pt) 1994-02-22 1997-09-23 Novo Nordisk As Processo para preparar e produzir uma variante de uma enzima lipolítica originária variante de enzima liplítica construção de dna vetor célula hospedeira aditivo detergente e composição detergente
DE69534464T2 (de) 1994-03-29 2006-09-28 Novozymes A/S Alkalische amylase aus bacellus
US5453216A (en) 1994-04-28 1995-09-26 Creative Products Resource, Inc. Delayed-release encapsulated warewashing composition and process of use
US6017866A (en) 1994-05-04 2000-01-25 Genencor International, Inc. Lipases with improved surfactant resistance
DE69523052T2 (de) 1994-06-03 2002-06-20 Novo Nordisk Biotech Inc Gereinigte myceliophthora laccasen und nukleinsäuren dafür kodierend
DK0772684T3 (da) 1994-06-17 2005-12-12 Genencor Int Amylolytiske enzymer afledt fra B. Licheniformis alpha-amylasen med forbedrede karakteristika
AU2884595A (en) 1994-06-20 1996-01-15 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000292A1 (en) 1994-06-23 1996-01-04 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
ATE294871T1 (de) 1994-06-30 2005-05-15 Novozymes Biotech Inc Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht- pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren
GB9413419D0 (en) 1994-07-04 1994-08-24 Danisco Amylase enzyme
GB2291058B (en) 1994-07-14 1998-12-23 Solvay Acid-stable and thermo-stable alpha-amylases derived from sufolobus species
EP0775201A2 (en) 1994-08-11 1997-05-28 Genencor International Inc. An improved cleaning composition
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
AU3697995A (en) 1994-10-26 1996-05-23 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
US6440716B1 (en) 1995-02-03 2002-08-27 Novozymes A/S α-amylase mutants
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
CN101381712A (zh) * 1995-02-03 2009-03-11 诺维信公司 淀粉酶变体
US7115409B1 (en) 1995-02-03 2006-10-03 Novozymes A/S α-amylase mutants
DE69637940D1 (de) 1995-02-03 2009-07-09 Novozymes As Eine methode zum entwurf von alpha-amylase mutanten mit vorbestimmten eigenschaften
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
KR19980702782A (ko) 1995-03-09 1998-08-05 혼 마가렛 에이. 녹말 액화 방법
CA2216316A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 Genencor International, Inc. An improved laundry detergent composition comprising amylase
US5652127A (en) 1995-06-02 1997-07-29 Genencor International, Inc. Method for liquefying starch
US5736499A (en) 1995-06-06 1998-04-07 Genencor International, Inc. Mutant A-amylase
JP3025627B2 (ja) 1995-06-14 2000-03-27 花王株式会社 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子
EP0839186B1 (en) 1995-07-14 2004-11-10 Novozymes A/S A modified enzyme with lipolytic activity
DE69632538T2 (de) 1995-08-11 2005-05-19 Novozymes A/S Neuartige lipolytische enzyme
ES2432519T3 (es) 1996-04-30 2013-12-04 Novozymes A/S Mutantes de alfa-amilasa
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
US6211134B1 (en) 1996-05-14 2001-04-03 Genecor International, Inc. Mutant α-amylase
IL128316A0 (en) 1996-08-01 2000-01-31 Procter & Gamble Detergent compositions comprising improved amylase for dingy fabric clean-up
WO1998015257A1 (en) 1996-10-08 1998-04-16 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
JP4044143B2 (ja) 1996-11-04 2008-02-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ズブチラーゼ変異体及び組成物
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
AU733082B2 (en) 1996-11-26 2001-05-03 Genencor International, Inc. Chemically modified enzymes
WO1998034946A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis
WO1999006270A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Marine Shuttle Operations As Method and transporter for installation or removal of an offshore platform topsides
US6599871B2 (en) 1997-08-02 2003-07-29 The Procter & Gamble Company Detergent tablet
GB2327947A (en) 1997-08-02 1999-02-10 Procter & Gamble Detergent tablet
US6080568A (en) 1997-08-19 2000-06-27 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis
DK2206768T3 (en) 1997-10-13 2015-06-29 Novozymes As Alfa-amylasemutanter
US6361989B1 (en) 1997-10-13 2002-03-26 Novozymes A/S α-amylase and α-amylase variants
MA25044A1 (fr) 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
US6204232B1 (en) * 1997-10-30 2001-03-20 Novo Nordisk A/S α-amlase mutants
US6562612B2 (en) 1997-11-19 2003-05-13 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
US6773907B2 (en) 1997-11-21 2004-08-10 Peter Kamp Hansen Subtilase enzymes
ES2321043T3 (es) 1997-11-26 2009-06-01 Novozymes A/S Glucoamilasa termoestable.
AU2411699A (en) 1998-02-18 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Alkaline bacillus amylase
CN1295443A (zh) 1998-04-01 2001-05-16 Dsm公司 肌醇六磷酸酶在具有低含量肌醇六磷酸酯的饲料中的应用
CN100402645C (zh) 1998-07-15 2008-07-16 诺维信公司 葡糖淀粉酶变体
DE69932345T2 (de) 1998-10-26 2007-07-19 Novozymes A/S Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
US6197565B1 (en) 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
US6403355B1 (en) 1998-12-21 2002-06-11 Kao Corporation Amylases
CN1526820B (zh) 1999-03-22 2010-05-26 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
US6410295B1 (en) 1999-03-30 2002-06-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
WO2000060059A2 (en) 1999-03-30 2000-10-12 NovozymesA/S Alpha-amylase variants
WO2000060060A2 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
EP1169434B1 (en) 1999-03-31 2009-02-11 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
US6623948B1 (en) 1999-03-31 2003-09-23 Novozymes A/S Nucleic acid sequences encoding alkaline alpha-amylases
CN100510067C (zh) 1999-07-09 2009-07-08 诺维信公司 葡糖淀粉酶变体
MXPA02001447A (es) 1999-08-13 2003-07-21 The Victoria University Of Manchester Enzimas de fitasa, acidos nucleicos que codifican para enzimas de fitasa y vectores y celulas hospedadoras que incorporan las mismas.
ATE356868T1 (de) 1999-08-20 2007-04-15 Novozymes As Alkalische amylase aus bacillus
US6995125B2 (en) 2000-02-17 2006-02-07 The Procter & Gamble Company Detergent product
AU3724801A (en) 2000-03-03 2001-09-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
CN100482790C (zh) * 2000-03-08 2009-04-29 诺维信公司 具有改变的特性的变体
AU2001280606A1 (en) 2000-07-19 2002-01-30 The Procter And Gamble Company Gel form automatic dishwashing compositions, methods of preparation and use thereof
GB2365018A (en) 2000-07-24 2002-02-13 Procter & Gamble Water soluble pouches
BR0112778A (pt) 2000-07-28 2003-07-01 Henkel Kommanditgellschaft Auf Enzima amilolìtica de bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) bem como detergente e agente de limpeza com esta enzima amilolìtica
US20020155574A1 (en) * 2000-08-01 2002-10-24 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
CA2702204C (en) * 2000-08-01 2011-09-06 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
US20020182734A1 (en) 2000-08-11 2002-12-05 Diaz-Torres Maria R. Bacillus transformation, transformants and mutant libraries
JP4426716B2 (ja) 2000-10-11 2010-03-03 花王株式会社 高生産性α−アミラーゼ
AU2002210380A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
US7125828B2 (en) 2000-11-27 2006-10-24 The Procter & Gamble Company Detergent products, methods and manufacture
CA2429418A1 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Novozymes A/S Automated mechanical stress assay for screening cleaning ingredients
WO2002042400A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 The Procter & Gamble Company Dishwashing method
ATE340850T1 (de) 2000-11-27 2006-10-15 Procter & Gamble Geschirrspülverfahren
US20020169091A1 (en) 2001-02-14 2002-11-14 Clare Jonathan Richard Automatic dishwashing compositions comprising blooming perfume and base masking ingredients
US20020183226A1 (en) 2001-02-28 2002-12-05 Chandrika Kasturi Liquid detergent composition exhibiting enhanced alpha-amylase enzyme stability
EP2159279A3 (en) 2001-05-15 2010-05-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
GB0114847D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Unilever Plc Water soluble package and liquid contents thereof
AU2002319696B2 (en) 2001-07-27 2007-11-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides
ATE435272T1 (de) 2001-11-14 2009-07-15 Procter & Gamble Maschinelle geschirrspülmittel in form einer einmaldosis enthaltend ein verkrustung inhibierendes polymer
US7888093B2 (en) 2002-11-06 2011-02-15 Novozymes A/S Subtilase variants
CN1751116A (zh) 2003-02-18 2006-03-22 诺和酶股份有限公司 洗涤剂组合物
DE60319347T2 (de) 2003-05-23 2009-02-19 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Waschmittelzusammensetzung zum Gebrauch in einer Textilwasch- oder Geschirrspülmaschine
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
CA2546451A1 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Genencor International, Inc. Serine proteases, nucleic acids encoding serine enzymes and vectors and host cells incorporating same
DE102004020082A1 (de) 2004-04-24 2005-05-19 Henkel Kgaa Verfahren zur Herstellung von Wasch- und/oder Reinigungsmitteln
GB2414958A (en) 2004-06-11 2005-12-14 Reckitt Benckiser Nv A process for preparing a water soluble article.
EP4269684A3 (en) 2004-07-05 2024-02-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
DE102004047777B4 (de) * 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE102004047776B4 (de) * 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
GB0423139D0 (en) 2004-10-18 2004-11-17 Danisco Enzymes
RU2394101C2 (ru) 2004-11-30 2010-07-10 Джененкор Интернэшнл, Инк. Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи
AU2006247779A1 (en) 2005-05-13 2006-11-23 The Procter & Gamble Company Functionalized films
US7562841B2 (en) 2005-07-15 2009-07-21 Sonoco Development, Inc. Textile carrier having identification feature and method for manufacturing the same
DK2390321T3 (en) 2005-10-12 2015-02-23 Procter & Gamble The use and manufacture of a storage stable neutral metalloprotease
US20070191248A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Souter Philip F Detergent compositions
BRPI0706730A2 (pt) 2006-01-23 2011-04-05 Procter & Gamble composições detergentes
BRPI0706728A2 (pt) 2006-01-23 2011-04-05 Procter & Gamble composições detergentes
US20070184855A1 (en) 2006-02-03 2007-08-09 Research In Motion Limited Visual representation of contact location
US8071345B2 (en) 2006-03-31 2011-12-06 Novozymes A/S Stabilized subtilisin composition
DE102006022224A1 (de) 2006-05-11 2007-11-15 Henkel Kgaa Subtilisin aus Bacillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin
DE102006022216A1 (de) 2006-05-11 2007-11-15 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
JP2010501024A (ja) 2006-06-05 2010-01-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 酵素安定剤
PT2032698E (pt) 2006-06-23 2012-09-24 Danisco Us Inc Avaliação sistemática de relações entre sequência e actividade utilizando bibliotecas de avaliação de locais em relação a múltiplas propriedades de engenharia
KR20150115023A (ko) 2006-07-18 2015-10-13 다니스코 유에스 인크. 광범위한 온도에 걸쳐 활성인 프로테아제 변이형
US20080220498A1 (en) 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
MX2009013084A (es) 2007-06-06 2010-01-18 Danisco Us Inc Genencor Div Metodos para mejorar las propiedades de la proteina.
GB0718944D0 (en) 2007-09-28 2007-11-07 Reckitt Benckiser Nv Detergent composition
AR069168A1 (es) 2007-11-05 2010-01-06 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de alfa -amilasas con propiedades alteradas
AR069167A1 (es) 2007-11-05 2010-01-06 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de alfa- amilasa de bacillus licheniformis con termoestabilidad aumentada y/o dependencia de calcio disminuida
EP2085070A1 (en) * 2008-01-11 2009-08-05 Procter & Gamble International Operations SA. Cleaning and/or treatment compositions
US20090209447A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
US20090233830A1 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Penny Sue Dirr Automatic detergent dishwashing composition
EP2100948A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
AU2009256280B2 (en) 2008-06-06 2013-03-07 Danisco Us Inc. Geobacillus stearothermophilus alpha-amylase (AmyS) variants with improved properties
EP2414514B1 (en) * 2009-04-01 2015-05-27 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties
CN102869759B (zh) 2010-02-10 2015-07-15 诺维信公司 在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物
EP2357220A1 (en) * 2010-02-10 2011-08-17 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent
US9434932B2 (en) 2011-06-30 2016-09-06 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP2540824A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing
DK3543333T3 (da) 2011-06-30 2022-02-14 Novozymes As Fremgangsmåde til screening af alfa-amylaser
EP3301145A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-04 The Procter & Gamble Company Low ph laundry detergent composition

Also Published As

Publication number Publication date
CN103649307A (zh) 2014-03-19
US20200339969A1 (en) 2020-10-29
ES2692544T3 (es) 2018-12-04
DK2726607T3 (en) 2018-11-05
MX2014000065A (es) 2014-02-17
AU2012277721B2 (en) 2017-06-22
KR20140056237A (ko) 2014-05-09
US10167458B2 (en) 2019-01-01
AU2012277721A1 (en) 2014-01-16
EP2726607B1 (en) 2018-08-08
IN2014CN00650A (es) 2015-04-03
CN109097347A (zh) 2018-12-28
US9434932B2 (en) 2016-09-06
JP6204352B2 (ja) 2017-09-27
CN103649307B (zh) 2020-03-27
US20160326506A1 (en) 2016-11-10
DK3421595T3 (da) 2020-10-26
MX353621B (es) 2018-01-22
EP3798303A1 (en) 2021-03-31
BR112013033782B1 (pt) 2021-06-15
ZA201400678B (en) 2015-08-26
EP3421595B1 (en) 2020-10-07
JP2014520516A (ja) 2014-08-25
US10752889B2 (en) 2020-08-25
BR112013033782A2 (pt) 2017-02-07
US11091748B2 (en) 2021-08-17
EP2726607A1 (en) 2014-05-07
WO2013001078A1 (en) 2013-01-03
EP3421595A1 (en) 2019-01-02
US20210355470A1 (en) 2021-11-18
US20200172887A1 (en) 2020-06-04
US20140141489A1 (en) 2014-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2834102T3 (es) Variantes de alfa-amilasa
US11718840B2 (en) Method for screening alpha-amylases
ES2963486T3 (es) Variantes de alfa-amilasa
CN107267485A (zh) 稳定化的α‑淀粉酶变体及其用途
JP2019505204A (ja) 酵素変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド
US12012623B2 (en) Alpha-amylase variants
JP2019515679A (ja) 向上した性能を有する変異体ポリペプチドおよびその使用
WO2020260223A1 (en) Alpha-amylase variants