ES2454841T3

ES2454841T3 - Composiciones de factor de crecimiento derivado de las plaquetas y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2454841T3
Application number: ES11152879.0T
Authority: ES
Inventors: Samuel E. Lynch
Original assignee: Biomimetic Therapeutics LLC
Current assignee: Biomimetic Therapeutics LLC
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2014-04-11
Anticipated expiration: 2025-10-12
Also published as: WO2006044334A2; US20090074753A1; DK1812076T3; US20170072108A1; CA2583823A1; EP2308500B1; IL182480A; EP2308501B1; AU2009202532B2; US20060084602A1; IL182480A0; EP2308500A1; AU2009202532A1; US20170014482A1; EP3170505A1; US20070259814A1; NO20071974L; ATE476985T1; US20160310639A1; US7473678B2

Abstract

Un material de implante que comprende un hueso desmineralizado poroso que tiene incorporado en el mismo un líquido que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en un rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/ mL, donde el hueso desmineralizado comprende partículas en un rango de aproximadamente 100 micrones a aproximadamente 500 micrones de tamaño.

Description

Composiciones de factor de crecimiento derivado de las plaquetas y métodos de uso de las mismas

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la curación de huesos y tejidos conectivos.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento son proteínas que se enlazan a receptores sobre una superficie celular, con el resultado principal de activar la proliferación y/o diferenciación celular. Muchos factores del crecimiento son bastante versátiles, estimulando la división celular en numerosos tipos de células; mientras otros son específicos de un tipo de célula particular. Ejemplos de factores del crecimiento incluyen factor de crecimiento derivado de la plaquetas (FCDP), factores de crecimiento insulínicos (FCI-I y II), factor de crecimiento transformante beta (FCT-�), factor de crecimiento epidérmico (FCE) y factor de crecimiento de fibroblastos (FCF). FCDP es una proteína catiónica estable al calor encontrada en una variedad de tipos de células, incluyendo los gránulos de plaquetas circulantes, céulas de músculos lisos vasculares, células endoteliales, macrófago y queratinocitos y es conocida por estimular in vivo la síntesis de proteínas y la producción de colágenos por fibroblastos. También se conoce por actuar como un mitógeno in vitro y agente quimiotáctico para fibroblastos, céulas de músculos lisis, osteoblastos y células gliales.

FCDP-BB humano recombinante (FCDP-BBhr) ha demostrado estimular la curación de heridas la regeneración ósea tanto en animales como en humanos. Tanto en Estados Unidos como en Europa se ha aprobado para uso humano en aplicaciones tópicas para acelerar la curación de úlceras en los pies en diabéticos crónicos. FCDP-BBh recombinante también ha demostrado ser efectivo solo o en combinación con otros factores del crecimiento para mejorar la regeneración periodontal, esto es, renacimiento de huesos, cemento dental o ligamento alrededor de los dientes (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.124.316.

La patente US 6180606 desvela una composición osteogénica que comprende una matriz porosa o semiporosa; partículas óseas desmineralizadas; y, al menos un factor de crecimiento tal como PMO o FCT beta.

Resumen de la invención

Ahora hemos demostrado que una dosis baja de FCDPhr (~0,1 a 1,0 mg/mL) promueve la reparación de hueso, periodonto, ligamento y cartílago. Una cantidad baja de FCDPhr. Una cantidad baja de FCDPhr puede adsorberse por FCT-�, que puede implementarse en el sitio de la reparación, de tal manera que el FCDPhr se libere in vivo. La adición de FCDPhr a FCT-� ha demostrado mejorar la unión celular de osteoblastos y la proliferación en comparación con FCT-� no tratado.

La presente invención se refiere a un material de implante que comprende un hueso desmineralizado poroso que tiene incorporado en el mismo un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL, donde le hueso desmineralizado comprende partículas en un rango de aproximadamente 100 micrones a aproximadamente 500 micrones en tamaño.

La invención también presenta un método para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano, mediante la administración de un material de implante que contiene factor de crecimiento derivado de plaqueta (FCDP) en una concentración inferior a 1,0 mg/ml, de tal manera que el material de implante promueva el crecimiento del hueso, periodonto, ligamento o cartílago. En una realización, el FCDP se administra en una cantidad inferior o igual a 0,3 mg/ml. En otra realización, el FCDP se administra en una cantidad en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 mg/ml. En varias realizaciones, el FCDP se administra en una cantidad de entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,75 mg/ml, aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,6 mg/ml, y aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 mg/ml. En una realización, el FCDP se administra en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferentemente 0,3 mg/mL. En otra realización, el FCDP se purifica parcialmente o sustancialmente. En otra realización más, el FCDP se aísla o purifica de otros contaminantes. En una realización más, el FCDP se libera del material de implante tras la administración a una velocidad media de 0,3 mg/día. En otra realización, el FCDP se libera del material de implante tras la administración a una velocidad media de 300 μg/día. Aún en otra realización más, el FCDP se libera del material de implante a una velocidad media inferior a 100 μg/día, inferior a 50 μg/día, inferior a 10 μg/día o inferior a 1 μg/día. Preferentemente, el FCDP se administra durante unos pocos días, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 20 ó 25 días, hasta 28 días o más.

La divulgación también proporciona un método para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano, administrando un material de implante que contiene una cantidad de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (FCDP) inferior a aproximadamente 1,0 mg/ml y una transportador farmacéuticamente aceptable de tal manera que el material de implante promueva el crecimiento del hueso, periodonto, ligamento o cartílago y permitiendo que el hueso, periodonto, ligamento o cartílago crezcan. Preferentemente, el FCDP es igual o inferior a 0,3 mg/ml. En una realización, el FCDP se administra en un rango de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras realizaciones, la cantidad de FCDP es aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferentemente 0,3 mg/mL. En otra realización, el FCDP se purifica parcialmente o sustancialmente. En otra realización más, el FCDP se aísla o purifica de otros contaminantes. Antes de administrar el material de implante al mamífero, el método puede incluir adicionalmente la etapa de producir un colgajo quirúrgico de piel para exponer el hueso, periodonto, ligamento o cartílago y, después de la etapa de administración, sustituir el colgajo. En otra realización más, después de producir el colgajo quirúrgico, pero antes de administrar el material de implante al hueso, periodonto, ligamento o cartílago, el método puede incluir adicionalmente la etapa de limpieza del hueso o periodonto para eliminar materia orgánica del hueso o periodonto. En otra realización más, el método promueve el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago dañado o enfermo. En otra realización más, el método promueve el crecimiento de hueso en localizaciones donde se requiere la formación de hueso nuevo como resultado de intervenciones quirúrgicas, tales como, por ejemplo, extracción de dientes, aumento de reborde, injerto estético y elevación sinusal.

También se proporciona un material de implante para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento

o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano. El material de implante incluye un transportador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un aglutinante biocompatible, un agente sustituto de hueso, un líquido o un gel) y un factor de crecimiento derivado de las plaquetas (FCDP), que está presente en una concentración inferior a aproximadamente 1,0 mg/ml. Preferentemente, el FCDP está presente en el material de implante en una concentración es igual o inferior a 0,3 mg/ml. En una realización, el FCDP se administra en un rango de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras realizaciones, la cantidad de FCDP es aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferentemente 0,3 mg/mL. En una realización, el transportador farmacéuticamente aceptable del material de implante incluye un armazón o matriz consistente en un aglutinante biocompatible (por ejemplo, carboximetilcelulosa) o un agente sustituto de hueso ( -TCP) que es capaz de absorber una solución que incluye FCDP (por ejemplo, una solución que contiene FCDP en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL). En otra realización, el transportador farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad del FCDP que es igual a al menos aproximadamente 25% de su propio peso. En otras realizaciones, el transportador farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad de la solución de FCDP que es igual o al menos aproximadamente 50%, 75%, 100%, 200%, 250% o 300% o su propio peso. En una realización, el FCDP se absorbe por el transportador farmacéuticamente aceptable del material de implante al impregnar el transportador farmacéuticamente aceptable en una solución que contiene FCDP. Preferentemente, el FCDP está presente en una solución en una concentración inferior a aproximadamente 1,0 mg/mL. En otra realización, el FCDP está presente en la solución en una concentración igual o inferior a aproximadamente 0,3 mg/ml. En otra realización, el FCDP está presente en la solución en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otra realización más, el FCDP está presente en la solución en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferentemente 0,3 mg/mL. En otra realización, el FCDP se purifica parcialmente o sustancialmente. En otra realización más, el FCDP se aísla o purifica de otros contaminantes.

La divulgación también proporciona un método para preparar un material de implante para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano. El método incluye la etapa de combinar factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) purificado o parcialmente purificado en una cantidad inferior a aproximadamente 1,0 mg/mL con una sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el FCDP se combina con una sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable en una concentración igual o inferior a aproximadamente 0,3 mg/ml. En una realización, el FCDP se combina con una sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable en una cantidad en el rango de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras realizaciones, FCDP se mezcla en una cantidad de 0,1 mg/ml a 0,3 mg/ml, o 1,0 mg/ml. En otra realización, FCDP se mezcla en la cantidad 0,3 mg/ml. En otra realización más, el FCDP el transportador farmacéuticamente aceptable absorbe el FCDP para producir el material de implante.

La divulgación también proporciona un vial que tiene el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL en un líquido farmacéuticamente aceptable. En una realización de este aspecto de la invención, el líquido es tampón de acetato de sodio estéril. En otra realización, el vial contiene FCDP en una concentración de aproximadamente 0,3 mg/mL. En otra realización más, el FCDP es FCDP-BB. En otra realización más, el FCDP es estable en el tampón de acetato de sodio durante al menos aproximadamente 12 meses, preferentemente al menos aproximadamente 18 meses, más preferentemente al menos aproximadamente 24 meses, y más preferentemente al menos aproximadamente 36 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 ºC a 80 ºC.

La divulgación también proporciona un material de implante que incluye un fosfato cálcico poroso habiendo adsorbido en el mismo un líquido que contiene factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL. La concentración de FCDP puede ser aproximadamente 0,3 mg/mL, el fosfato cálcico puede seleccionarse de fosfato tricálcico, hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico y el FCDP puede proporcionarse en un líquido estéril, por ejemplo, tampón de acetato de sodio.

También se proporciona un método para preparar un material de implante saturando un material de fosfato cálcico en un líquido estéril que incluye factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL. La concentración de FCDP puede ser aproximadamente 0,3 mg/mL, el fosfato cálcico puede seleccionarse de fosfato tricálcico, hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico.

En una realización de todos los aspectos de la invención, FCDP incluye homo- y heterodímeros de FCDP, por ejemplo, FCDP-AA, FCDP-BB, FCDP-AB, FCDP-CC y FCDP-DD y combinaciones y derivados de los mismos.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable del material de implante es o adicionalmente incluye uno o más de los siguientes: un aglutinante biocompatible (por ejemplo, un polímero natural o sintético), un agente sustituto de hueso, un líquido y un gel. En una realización preferente, el material de implante incluye FCDP presente en un transportador líquido farmacéuticamente aceptable que se absorbe por un transportador sólido farmacéuticamente aceptable.

El material de implante de la presente divulgación puede prepararse combinando FCDP aislado, parcialmente purificado, sustancialmente purificado o purificado en una cantidad en el rango de 0,1 a 1,0 mg/ml, más preferentemente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, más preferentemente 0,3 mg/ml, o incluso menos de 0,1 mg/ml, con una sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un aglutinante biocompatible, tal como un polímero natural o sintético (por ejemplo, colágeno, ácido poliglicólico y ácido poliláctico), un agente sustituto de hueso (por ejemplo, fosfato cálcico (por ejemplo, fosfato tricálcico o hidroxiapatita), sulfato cálcico o hueso desmineralizado (por ejemplo, hueso cortical o esponjoso liofilizado desmineralizado) o gel o líquido disponible en el mercado (esto es, un gel o líquido viscoso o inerte).

En varias realizaciones, la sustancia transportadora del material de implante es, o adicionalmente incluye, uno

o más aglutinantes biocompatibles. Un aglutinante biocompatible es un agente que produce o promueve la cohesión entre las sustancias combinadas. Ejemplos no limitativos de aglutinantes biocompatibles adecuados incluyen polímeros seleccionados de polisacáridos, ácidos nucleicos, carbohidratos, proteínas, polipéptidos, poli(ácidos ahidroxi), poli(lactonas), poli(aminoácidos), poi(anhídridos), poli(ortoésteres), poli(anhídrido-co-imidas), poli(ortocarbonatos), poli(a-hidroxi alcanoatos), poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres), ácido poliláctico, pol(L-láctido) (PLLA), poli(D,L-láctido), (PDLLA), poliglicólido (PGA), poli(láctido-co-glicólido (PLGA), poli(L-láctido-co-D, L-láctido), poli(D,L-láctido-co-carbonato trimetileno), ácido poliglicólico, polihidroxibutirato (PHB), poli(£-caprolactona), poli(5valerolactona), poli(y-butirolactona), poli(caprolactona), ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli(hidrocloruro de alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(etilenoimina), fumarato de polipropileno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidiona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbono, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poliI(alcohol de vinilo), poli(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), copolímeros de bloque poli(óxido de etileno)-copoli(óxido de propileno), poli(teraftalato de etileno)poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos. Los aglutinantes adicionales incluyen ácido algínico, goma arábiga, goma guar, goma xantana, gelatina, quitina, quitosano, acetato de quitosano, lactato de quitosano, sulfato de condroitina, N-O-carboximetil quitosano, un dextrano (por ejemplo, a-ciclodextrina, �-ciclodextrina, y-ciclodextrina, o sulfato de dextrano sódico), pegamento de fibrina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato sódico, una celulosa (por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o hidroxietilcelulosa), una glucosamina, un proteoglicano, un almidón (por ejemplo, almidón de hidroxietilo o almidón soluble), ácido láctico, un plurónico, glicerofosfato sódico, colágeno, glicógeno, una queratina, seda y derivados y mezclas de los mismos. Un aglutinante soluble en agua se disuelve del material de implante poco después de su implantación in vivo, introduciendo de este modo macroporosidad en el material de implante. Esta macroporosidad aumenta la osteoconductividad del material de implante aumentando el acceso y, como consecuencia, la actividad remodeladora de osteoclastos y osteoblastos en el sitio del implante.

El aglutinante biocompatible puede añadirse al material de implante en varias cantidades y en una variedad de fases durante la preparación de la composición. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de determinar la cantidad de aglutinante y el método de inclusión requerido para una aplicación dada.

En una realización, la sustancia transportadora es, o incluye, un líquido seleccionado de agua, un tampón, y un medio de cultivo celular. El líquido puede usarse en cualquier rango de pH, pero se usará con más frecuencia en el rango de pH 5,0 a pH 8,0. En una realización, el pH será compatible con la estabilidad y eficacia prolongadas del FCDP presente en el material de implante, o con la estabilidad y eficacia prolongadas de otro agente biológicamente activo. En la mayoría de las realizaciones, el pH del líquido estará en el rango de pH 55 a pH 7,4. Los tampones adecuados incluyen, aunque no se limitan a, carbonatos, fosfatos (por ejemplo, tampón fosfato salino), y tampones orgánicos tales como Tris, HEPES y MOPS. Con más frecuencia, el tampón se seleccionará por su biocompatibilidad con los tejidos huéspedes y su compatibilidad con el agente biológicamente activo. Para la mayoría de las aplicaciones en las que se incluyen ácidos nucleicos, péptidos o antibióticos en el material de implante, un tampón fosfato salino simple será suficiente.

En otra realización de todos los aspectos de la invención, la sustancia transportadora del material de implante es, o adicionalmente incluyen, uno o más agentes sustitutos de hueso. Un agente sustituto de hueso es uno que puede usarse para sustituir un hueso permanentemente o temporalmente. Después del implante, el cuerpo puede retener el agente sustituto de hueso o el cuerpo puede absorberlo y sustituirlo por el hueso. Los agentes sustitutos de hueso ejemplares incluyen, por ejemplo, fosfato cálcico (por ejemplo, fosfato tricálcico (por ejemplo �-TCP), hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico), sulfato cálcico, hueso desmineralizado (por ejemplo, hueso cortical o esponjoso liofilizado desmineralizado)). En una realización, la sustancia transportadora e biorreabsorbible. En otra realización, el agente sustituto de hueso se proporciona como una matriz de partículas del tamaño de micrón o submicrón, por ejemplo, partículas de tamaño nano. Las partículas pueden estar en el rango de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 500 μm en tamaño, más preferentemente en el rango de aproximadamente 200 μm a aproximadamente 3000 μm, y más preferentemente en el rango de aproximadamente 250 μm a aproximadamente 2000 μm, o las partículas pueden estar en el rango de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 10000 nm, preferentemente menos de aproximadamente 500 nm, y más preferentemente menos de aproximadamente 250 nm. En otra realización, el agente sustituto de hueso tiene una composición porosa. La porosidad de la composición e una característica deseable ya que facilita la migración y la infiltración celular en la composición para que las células puedan secretar matriz ósea extracelular. También proporciona acceso a la vascularización. La porosidad también proporciona una elevada área de superficie para una mejor reabsorción y liberación de sustancias activas, así como una mayor interacción célula-matriz. Preferentemente, la composición tiene una porosidad superior a 40%, más preferentemente superior a 65% y más preferentemente superior a 90%. La composición puede proporcionarse en una forma adecuada para su implantación (por ejemplo, una esfera, un cilindro o un bloque) o se le puede dar el tamaño y forma antes de su uso.

El agente sustituto de hueso también puede proporcionarse como una pasta o masilla fluida y moldeable. El agente sustituto de hueso puede ser una pasta de fosfato cálcico que se auto-endurece para formar un fosfato cálcico endurecido antes de o después de su implantación in vivo. El componente de fosfato cálcico puede ser cualquier material de fosfato cálcico biocompatible conocido en la técnica. El material de fosfato cálcico puede producirse mediante una variedad de métodos y usando cualquier componente inicial adecuado. Por ejemplo, el material de fosfato cálcico puede incluir fosfato cálcico amorfo, apatítico. El material de fosfato cálcico puede producirse mediante una reacción ácido-base en estado sólido de reactivos de fosfato cálcico cristalino para formar sólidos de hidroxiapatatita cristalina. Otros métodos para hacer materiales de fosfato cálcico son conocidos en la técnica, y algunos de los cuales se describen más abajo.

El material de fosfato cálcico puede ser fosfato cálcico apatítico poco cristalino (APC) o hidroxiapataita (HA). El material APC se describe en la solicitud de los números de patente de Estados Unidos 5.650.176; 5.783.217; 6.027.742; 6.214.368; 6.287.341; 6.331.312 y 6.541.037. HA se describe, por ejemplo, en los números de patente de Estados Unidos Re. 33.221 y Re. 33.161. Estas patentes muestran la preparación de composiciones de remineralización de fosfato cálcico y de material transportador de hidroxiapatita reabsorbible gradualmente, finamente cristalino y no cerámico en base a la misma composición de fosfato cálcico. Un sistema similar de fosfato cálcico, que consiste en tetracalcio fosfato (TTCF) y monocalcio fosfato (MCF) o su forma monohidrato (MCFM), se describe en los números de patente de Estados Unidos 5.053.212 y 5.129.905. Este material de fosfato de calcio se produce mediante reacción ácido-base en estado sólido de reactivos de fosfato cálcico cristalino para formar sólidos de hidroxiapatatita cristalina.

Los materiales HA cristalinos (comúnmente referidos como dalita) pueden prepararse de tal manera que sean fluidos, moldeables y capaces de endurecerse in situ (véase número de patente de Estados Unidos 5.962.028). Estos materiales HA (comúnmente referidos como hidroxiapatita carbonatada) pueden formarse combinando los reactivos con un líquido no acuoso para proporcionar una mezcla sustancialmente uniforme, dando forma a la mezcla como sea apropiado, y permitiendo que la mezcla se endurezca en presencia de agua (por ejemplo, antes o después del implante). Durante el endurecimiento, la mezcla cristaliza en una estructura sólida y esencialmente monolítica apatítica.

Los reactivos generalmente consistirán en una fuente de fosfato, por ejemplo, ácido fosfórico o sales de fosfato, sustancialmente libres de agua, un metal de tierra álcali, particularmente calcio, fuente, opcionalmente núcleos cristalinos, particularmente cristales de fosfato cálcico o hidroxiapatita, carbonato cálcico y lubricante fisiológicamente aceptable, tal como cualquiera de los líquidos no acuosos aquí descritos. Los ingredientes secos pueden prepararse previamente como una mezcla y posteriormente combinarse con los ingredientes líquidos no acuosos bajo condiciones donde ocurra una mezcla sustancialmente uniforme.

El material de fosfato cálcico se caracteriza por su reabsorbilidad biológica, biocompatibilidad y su mínima cristalinidad. Su carácter cristalino es sustancialmente igual que el del hueso natural. Preferentemente, el material de fosfato cálcico se endurece en menos de cinco horas, y sustancialmente se endurece en aproximadamente una a cinco horas, bajo condiciones fisiológicas. Preferentemente, el material se endurece sustancialmente en aproximadamente 10-30 minutos. La velocidad de endurecimiento bajo condiciones fisiológicas puede variar de acuerdo con la necesidad terapéutica al modificar unos pocos parámetros simples como se describe en la patente de Estados Unidos nº 6.027.742.

En una realización, el material de fosfato cálcico biorreabsorbible resultante será “deficiente de calcio”, con una proporción molar calcio a fosfato inferior a aproximadamente 1,6 en comapracion con el valor estequiométrico ideal de aproximadamente 1,67 para hidroxiapatatia.

Los fosfatos cálcicos deseables son capaces de endurecerse en un medio húmedo, en o alrededor de la temperatura corporal en menos de 5 horas y preferentemente en 10-30 minutos. Los materiales deseables son aquellos que, cuando se implantan como una bolita de 1-5 g, al menos el 80% se reabsorbe en un año. Preferentemente, el material puede reabsorberse por completo.

En varias realizaciones de todos los aspectos de la invención, el material de implante puede incluir adicionalmente uno o más agentes biológicamente activos. Los agentes biológicamente activos que pueden incorporarse a los materiales de implante de la invención incluyen, sin limitación, moléculas orgánicas, materiales inorgánicos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, genes, fragmentos de genes, secuencias reguladoras de genes y moléculas antisentido), nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas y lipoproteínas. Las clases de compuestos biológicamente activos que pueden incorporarse a los materiales de implante de la invención incluyen, sin limitación, agentes anti-cáncer, antibióticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, inmunosupresores, inhibidores de enzima, antihistamínicos, anti-convulsivos, hormonas, relajantes musculares, sustancias antiespasmódicas, agentes oftalmológicos, prostaglandinas, anti-depresivos, sustancias anti-psicóticas, factores tróficos, proteínas osteoinductoras, factores del crecimiento y vacunas.

Los agentes anti-cáncer incluyen agentes alquilantes, agentes de platino, antimetabolitos, inhibidores de topoisomerasa, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, inhibidores de aromatasa, inhibidores de sintasa de timidilato, antagonistas de ADN, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de bomba, inhibidores de acetiltransferasa de histona, inhibidores de metaloproteinasa, inhibidores de reductasa ribonucleósido, agonistas/antagonistas TNF alfa, antagonistas de receptor A de endotelio, agonistas de receptor de ácido retinoico, inmuno-moduladores, agentes hormonales y antihormonales, agentes fotodinámicos e inhibidores de tirosina quinasa.

Puede usarse cualquiera de los agentes biológicamente activos listados en la Tabla 1

Tabla 1

Agente alquilantes: ciclofosfamida Busulfán ifosfamida melfalán hexametilmelamina tiotepa clorambucil dacarbazina carmustina lomustina procarbazina altretamina fosfato de estramustina mecloretamina estreptozocina temozolamida semustina

Agentes de platino: cisplatino oxaliplatino espiroplatino carboxiftalatoplatino tetraplatino ormiplatino iproplatino carboplatino ZD-0473 (AnorMED) lobaplatino (Aeterna) satraplatino (Johnson Matthey) BBR-3464 (Hoffmann-La Roche) SM-11355 (Sumitomo) AP-5289 (Access)

Antimetabolitos: azacitidina gemcitabina capecitabina 5-flurorouracil Floxuridina 2-clorodeoxiadenosina 6-mercaptopurina 6-tioguanina citarabina 2-fluorodeoxi citidina metotrexato idatrexato tomudex trimetrexato deoxicoformicina fludarabina pentostatina raltitrexed hidroxiurea deciatina (SuperGen) clofarabina (Bioenvision) irofulven (MGI Pharma) DMDC (Hoffmann-La Roche) etinilcitidina (Taiho)

Inhibidores de topoisomerasa: amsacrina epirobicina etoposida terniposida o mitoxantrona irinotecán (CPT-11) 4-etil-10-hidroxi-campotecina Topotecán dexrazoxanet (TopoTarget) pixantrona (Novuspharma) análogo de rebecamicina (Exelixis) BBR-3576 (Novuspharma) rubitecano (SuperGen) exatecan mesilato (Daiichi) quinamed (ChemGenex) gimatcan (Sigma-Tau) diflomotecano (Sigma-Tau) TAS-103 (Taiho) elsamitrucina (Spectrum) J-107088 (Merck & Co) BNP-1350 (BioNumerik) CKD-602 (Chong Kun Dang) KW-2170 (Kyowa Hakko)

Antibióticos antitumor: dactinomicina (actinomicina D) doxorrubicina (adriamicina) doxirubicina valrubicina daunorubicina (daunomicina) epirubicina terarubicina idarubicina rubidazona plicamicina porfiromicina cianomorfolinodoxorubicina mitoxantrona (novantrona) amonafida azonafida antrapirazol oxantrazol losoxantrona sulfato de bleomicina (blenoxano) ácido bleomicínico bleomicina A bleomicina B mitomicina C MEN-10755 (Menarini) GPX-100 (Gem Pharmaceuticals)

Agentes antimitóticos: paclitaxel docetaxel colchicina vinblastina vincristina vinorelbina Vindestina dolastatina 10 (NCI) rizoxina (Fujisawa) mivobulina (Warner-Lambert) cemadotina (BASF) RPR 109881A (Aventis) TXD 258 (Aventis) epotilona B (Novartis) T 900607 (Tularik) T 138067 (Tularik) criptoficina 52 (Eli Lilly) vinflunina (Fabre) auristatina PE (Hormona Teikoku) BMS 247550 (BMS) BMS 184476 (BMS) BMS 188797 (BMS) taxoprexina (Protarga) SB 408075 (GlaxoSmithKline) E7010 (Abbott) PG-TXL (Cell Therapeutics) IDN 5109 (Bayer) A 105972 (Abbott) A 204197 (Abbott) LU 223651 (BASF) D 24851 (ASTAMedica) ER-86526 (Eisai) combretastatina A4 (BMS) isohomohalicondrina-B (PharmaMar) ZD 6126 (AstraZeneca) PEG-paclitaxel (Enzon) AZ10992 (Asahi) IDN-5109 (Indena) AVLB (Prescient NeuroPharma) azaepotilona B (BMS) BNP-7787 (BioNumerik) profármaco CA-4 (OXiGENE) dolastatina-10 (NIH) CA-4 (OXiGENE)

Inhibidores de aromatasa: aminoglutehimida letrozol anastrazol formestano exemestano atamestano (BioMedicines) YM-511 (Yamanouchi)

Inhibiores de timidilato sintasa: pemetrexed (Eli Lilly) ZD-9331 (BTG) nolatrexed (Eximias) CoFactor™ (BioKeys)

Antagonistas de ADN: trabectedina (PharmaMar) glufosfamida (Baxter International) albúmina + 32 P (Isotope Solutions) timectacina (NewBiotics) edotreotide (Novartis) mafosfamida (Baxter International) apaziquona (Spectrum Pharmaceuticals) O6 guanina bencilo (Paligent)

Inhibidores de farnesitransferasa: arglabina (NuOncology Labs) ionafarnib (Schering-Plough) BAY-43-9006 (Bayer) tripifarnib (Johnson & Johnson) alcohol perilil (DOR BioPharma)

Ihhibidores de bomba: CBT-1 (CBA Pharma) Tariquidar (Xenova) MS-209 (Schering AG) tihidrocloruro de zosuquidar (Eli Lilly) biricodar dicitrato (Vertex)

Inhibidores de histona acetiltransferasa: tacedinalina (Pfizer) SAHA (Aton Pharma) MS-275 (Schering AG) Pivaloiloximetil butirato (Titan) depsipéptido (Fujisawa)

Inhibidores de metaloproteinasa: neovastat (Aeterna Laboratories) marimastat (British Biotech) CMT-3 (CollaGenex) BMS-275291 (Celltech)

Inhidores de ribonucleósido reductasa: maltonato de galio (Titan) triapina (Vion) tezacitabina (Aventis) didox (Molecules for Health)

Agonistas/antagonistas TNF alfa: virulicina (Lorus Therapeutics) CDC-394 (Celgene) infliximab (Centocor, Inc.) adalimumab (Abbott Laboratories) revimid (Celgen) entanercept (Immunex Corp.)

Antagonistas de receptor endotelio A: atrasentan (Abbott) ZD-4054 (AstraZeneca) YM-598 (Yamanouchi)

Agonistas de receptor de ácido retinoico: fenretinida (Johnson & Johnson) LGD-1550 (Ligand) alitretinoína (Ligand)

Inmunomoduladores: interferón oncofago (Antigenics) GMK (Progenics) vacuna de adenocarcinomas (Biomira) CTP-37 (AVI BioPharma) IRX-2 (Inmuno-Rx) PEP-005 (Peplin Biotech) vacunas sincrovax (CTL Immuno) vacuna melanoma (CTL Immuno) vacuna p21 RAS (GemVax) terapia con dexosoma (Anosys) Pentrix (Australian Cancer Technology) ISF-154 (Tragen) vacuna de cáncer (Intercell) Norelin (Biostar) BLP-25 (Biomira) MGV (Progenics) �-aletina (Dovetail) terapia CLL (VAsogen)

Agentes hormonales y antihormonalese: estrógenos estrógenos conjugados estradiol de etinilo clortrianiseno idenestrol caproato de hidroxiprogesterona medroxiprogesterona testosterona propionato de testosterona fluoximesterona metiltestoserona dietilestilbestrol megestol tamoxifen toremofina dexametasona prednisona metilprednisona prednisolona aminoglutetimida leuprolida goserelina leuporelina bicalutamida flutamida octreotida nilutamida mitotano P-04 (Novagen) 2-metoxiestradiol (EntreMed) Arzoxifeno (Eli Lilly)

Agentes fotodinámicos: talaporfina (Light Sciences) Theralux (Theratechnologies) gadolinio motexafina (Pharmacyclics) Pd-bacteriofeoforbido (Yeda) texafirina de lutetio (Pharamacyclics) hipercirina

Inhibidores de tirosina quinasa: imatinib (Novartis) leflunomida (Sugen/Pharmacia) ZD1839 (AstraZeneca) erlotinib (Oncogene Science) canertinib (Pfizer) escualamina (Genaera) SU5416 (Pharmacia) SU6668 (Pharmacia) ZD4190 (AstraZeneca) ZD6474(AstraZeneca) vatalanib (Novartis) PKI166 (Novartis) GW2016 (GlaxoSmithKline) EKB-509 (Wyeth) EKB-569 (Wyeth) kahalido F (PharmaMar) CEP-701 (Cephalon) CEP-751 (Cephalon) MLN518 (Millenium) PKC412 (Novartis) fenoxodiol () trastuzumab (Genetech) C225 (ImClone) Ru-Mab (Genentech) MDX-H210 (Medarex) 2C4 (Genentech) MDX-447 (Medarex) ABX-EGF (Abgenix) IMC-1C11 (ImClone)

Los antibióticos incluyen aminoglicósidos (por ejemplo, gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amicacina, neomicina), bacitracina, carbapenemas (por ejemplo imipenem/cilastatina), cefalosporinas, colistina, metenamina, monobactamos (por ejemplo, aztreonam), penicilinas (por ejemplo, penicilina G, peniciclina V, meticilina, natcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina), polimixina B, quinolonas y vancomicina; y agentes bacteriostáticos tales como cloranfenicol, clindanyan, macrólidos (por ejemplo, eritromicina, azitromicina, claritromicina), lincomicina, nitrofurantoína, sulfonamidas, tetraciclinas (por ejemplo, tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclocilina) y trimetoprima. También se incluyen metronidazol, fluoroquinolonas y ritampina.

Los inhibidores de enzima son sustancias que inhiben una reacción enzimática. Los ejemplos de inhibidores de enzima incluyen cloruro de edrofonio, N-metilfisostigmina, bromuro de neostigmina, sulfato fisostigmina, tacrina, tacrina,1-hidroxi maleato, iodotubercidina, p-bromotetramisola, 10-(alfa-dietilaminopropionil)-fenotiacina hidrocloruro, cloruro de calmidazolio, hemicolinio-3,3,5-dinitrocatecol, inhibidor de diacilglicerol quinasa I, inhibidor de diacilglicerol quinasa II, 3-fenilpropargilamina, N6-monometil-L-arginina acetato, carbidopa, 3-hidroxibenilhidracina, hidralacina, clorgilina, deprenil, hidroxilamina, fosfato de iproniazida, 6-MeO-tetrahidro-9H-pirido-indol, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbacida, tranilcipromina, N,N-dietilaminoetil-2,2-difenilvalerato hidrocloruro, 3-isobutil-1metilxantano, papaerina, indometacind, 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina hidrocloruro, 2,32-dicloro-a-metilbencilamina (DCMB), 8,9-dicloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-2-benzacepina hidrocloruro, p-aminoglutetimida, p-aminoglutetimida tartrato, 3-iodotirosina, alfa-metiltirosina, acetazolamida, diclorfenamida, 6-hidroxi-2-benzotiazolosulfonamida y alopurinol.

Los antihistamínicos incluyen pirilamina, clorfeniramina y tetrahidrozolina, entre otros.

Los agentes antiinflamatorios incluyen corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetina, ibuprofeno, piroxicam y fenamatos), acetaminofeno, fenacetina, sales de oro, cloroquina, D-Penicilamina, metotrexato, colchicina, alopurinol, probenecid y sulfinpirazona.

Los relajantes musculares incluyen mefenesina, metocarbomal, hidrocloruro de ciclobenzaprina, hidrocloruro de trihexilfenidil, levodopa/carbidopa y biperideno.

Los anti-espasmódicos incluyen atropina, escopolamina, oxifenonio y papaverina.

Los analgésicos incluyen aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindaco, tolmético, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofeno, fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina, nalorfina, opioides (por ejemplo, sulfato de codeína, citrato de fentanilo, bitartarato de hidrocodona, loperamida, sulfato de morfina, noscapina, norcodeína, normorfina, tebaína, nor-binaltorfimina, buprenorfina, clornaltrexamina, funaltrexamiona, nalfufina, narlofina, naloxina, naloxonazina, naltrexona y naltrindol, procaína, lidocaína, tetracaína y dibucaína.

Los agentes oftalmológicos incluyen fluoresceína de sodio, rosa de bengala, metacolina, adrenalina, cocaína, atropina, alfa-quimotripsina, hialuronidasa, betaxolol, pilocarpina, timolol, sales de timolol y combinaciones de los mismos.

Las prostaglandinas están reconocidas en la técnica y son una clase de ácidos grasos hidroxi de cadena larga que ocurren de manera natural químicamente relacionados.

Los antidepresivos son sustancias capaces de prevenir o liberar depresión. Ejemplos de antidepresivos incluyen imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tranilcipromina, fenelcina e isocarboxazida.

Los factores de crecimiento son factores cuya presencia continuada mejora la viabilidad o longevidad de una célula. Los factores tróficos incluyen, sin limitación, proteína activadora de neutrófilos, proteína quimioatrayente de monocito, proteína inflamatoria de macrófago, factor de plaquetas, proteína básica de plaquetas y actividad estimuladora de crecimiento de melanoma; factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante (alfa), factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de célula endotelial derivado de plaquetas, factor de crecimiento insulínico (FCI, por ejemplo, FCI-I o FCI-II), factor neurotrófico derivado de gliales, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento de nervios, factor inductor de crecimiento hueso/cartílago (alfa y beta), proteínas morfogenéticas óseas (PMOs), interleuquinas (inhibidores de interleuquina o receptores de interleuquina, incluyendo desde interleuquina 1 a interleuquina 10), interferones (por ejemplo, interferón alfa, beta y gama), factores hematopoyéticos, incluyendo eritropoyetina, factor estimulador de colonia de granulocitos, factor estimulador de colonia de macrófagos y factor estimulador de colonia granulocitos-macrófagos; factores de necrosis tumoral, factores de crecimiento transformantes (beta), incluyendo beta-1, beta-2, beta-3, factores de crecimiento transformantes (alfa), inhibina y activina; y proteínas morfogenéticas óseas tales como OP-1, PMO-2 y PMO-7.

Las hormonas incluyen estrógenos (por ejemplo, estradiol, estrona, estriol, dieteilestbestrol, quinestro, clorotrianiseno, etinilestradiol, mestranol), anti-estrógenos (por ejemplo, clomifeno, tamoxifeno), progestinas (por ejemplo, medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), antiprogestina (mifepristona), andrógenos (por ejemplo, cipionato de testosterona, fluoximesterona, danazol, testolactona), anti-andrógenos (por ejemplo, acetato de ciproterona, flutamida), hormonas de tiroides (por ejemplo, triyodotironina, tiroxina, propiltiouracilo, metimazol e iodixoda), y hormonas de pituitaria (por ejemplo, corticotropina, sumutotropina, oxitocina y vasopresina). Las hormonas comúnmente se emplean en terapia de sustitución de hormonas y/o para fines con métodos anticonceptivos. Las hormonas esteroides, tales como prednisona, también se usan como inmunosupresores y antiinflamatorios.

El agente biológicamente activo se selecciona deseablemente de la familia de proteínas conocidas como factores de crecimiento transformante -beta (FCT-) superfamilia de proteínas, que incluye las activinas, inhibinas y proteínas morfogenéticas óseas (PMOs). En una realización, el agente activo incluye al menos una proteína seleccionada de la subclase de proteínas conocidas generalmente como PMO, que han sido descritas por tener actividad osteogénica, y otras actividades de tipo crecimiento y diferenciación. Estas PMOs incluyen proteínas PMO PMO-2, PMO-3, PMO-4, PMO-5, PMO-6 y PMO-7, se describe por ejemplo en la patente de Estados Unidos N º 5.108.922; 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; y 5.141.905; PMO-8, se describe en la publicación PCT WO91/18098, y PMO-9, descrita en la publicación PCT WO93/00432, PMO-10, descrita en la solicitud PCT WO94/26893; PMO-11, descrita en la solicitud PCT WO94/26892, o PMO-12 o PMO-13, descritas en la solicitud PCT WO 95/16035; PMO-14; PMO-15, descrita en la Patente de Estados Unidos N º 5.635.372; o PMO-16, descrita en la Patente de Estados Unidos N º 5.965.403. Otras proteínas FCT-� que pueden ser útiles como agente activo en las composiciones de fosfato cálcico de la invención incluyen Vgr-2, Jones et al., Mol. Endocrinol. 6:1961 (1992), y cualquiera de los factores de crecimiento y diferenciación (FCDs), incluyendo los descritos en las solicitudes PCT WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; WO94/21681; WO94/15966; WO95 / 10539; WO96/01845; WO96/02559 y otros. También útiles en la invención pueden ser BIP, descrito en WO94/01557; HP00269, descrito en JP Número de publicación: 7-250688, y MP52, descrito en la solicitud PCT WO93/16099. Un subconjunto de las PMO que se prefiere actualmente para el uso en la invención incluye PMO-2, PMO-4, PMO-5, PMO-6, PMO-7, PMO-10, PMO-12, PMO-13, PMO-14, y MP52. El agente activo es más preferiblemente PMO-2, cuya secuencia se describe en la patente de Estados UNidos N º 5.013.649. Otros agentes osteogénicos conocidos en la técnica también pueden ser utilizados, tales como teriparatida (Forteo ™), Chrysalin ®, la prostaglandina E2, proteína LIM, osteogenina, o matriz ósea desmineralizada (MOD), entre otros.

El agente biológicamente activo puede sintetizarse químicamente, producirse recombinantemente, o purificarse de una fuente en la que el agente biológicamente activos se encuentra de manera natural. El agente activo, si un FCT-�tal como una PMO, u otra proteína dimérica, puede ser homodimérico, o puede ser heterodimérico con otras PMOs (por ejemplo, un heterodímero compuesto de un monómero de cada uno de PMO-2 y PMO-6) o con otros miembros de la superfamilia de FCT-�, tales como activinas, inhibinas y FCT-�l (por ejemplo, un heterodímero compuesto por un monómero de cada uno de una PMO y un miembro relacionado de la superfamilia de FCT

�). Ejemplos de tales proteínas heterodiméricas se describen por ejemplo en la solicitud publicada de patente PCT WO 93/09229.

Agentes biológicamente activos adicionales incluyen las proteínas Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus y folistatina. Estas familias de proteínas se describen de manera general en Sasai y otros, Cell 79:779-790 (1994) (Chordin); publicación de patente PCT WO94/05800 (Noggin); y Fukui et al, Devel.. Biol. 159:131 (1993) (Folistatina). Las proteínas Hedgehog se describen en WO96/16668; WO96/ 17.924, y WO95/18856. La familia de proteínas Frazzled es una familia recientemente descubierta de proteínas con alta homología con el dominio de unión extracelular de la familia de proteínas del receptor conocida como Frizzled. La familia Frizzled de genes y proteínas se describe en Wang et al., J. Biol. Chem. 271:4468-4476 (1996). El agente activo puede también incluir otros receptores solubles, tales como los receptores solubles truncados descritos en la publicación de patente PCT WO95/07982. A partir de la enseñanza de WO95/07982, un experto en la técnica reconocerá que los receptores solubles truncados pueden prepararse para otras numerosas proteínas receptoras.

La cantidad de proteína biológicamente activa, por ejemplo, una proteína osteogénica, que es efectiva para estimular una actividad deseada, por ejemplo, una mayor actividad osteogénica de células progenitoras presentes o infiltrantes u otras células dependerá del tamaño y naturaleza del defecto que se está tratando, así como del transportador que se está empleando. Generalmente, la cantidad de proteína que se administrará está en un rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg; más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg.

Los protocolos y regímenes estándares para la administración de los agentes anteriormente enumerados son conocidos en la técnica. Los agentes biológicamente activos se introducen en el material de implante en cantidades que permiten la administración de una dosis apropiada del agentes en el sitio del implante. En la mayoría de los casos, las dosis se determinan usando pautas conocidas por los médicos y aplicables al agente particular en cuestión. La cantidad ejemplar de agente biológicamente activo que se incluirá en el material de implante de la invención probablemente dependerá de variables tales como tipo y extensión de la condición, el estado general de salud del paciente particular, la formulación del agente activo y la biorreabsorción del vehículo de administración usado. Los ensayos clínicos estándares pueden usarse para optimizar la dosis y frecuencia de dosis para un agente biológicamente activo particular.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la composición puede además contener médula ósea autóloga o extractos de plaquetas autólogos.

En otra realización de todos los aspectos anteriores, el FCDP y/u otros factores de crecimiento pueden obtenerse de fuentes naturales (por ejemplo, plaquetas), o más preferentemente, producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Cuando se obtiene de fuentes naturales, el FCDP y/u otros factores de crecimiento pueden obtenerse de un fluido biológico. Un fluido biológico incluye cualquier fluido tratado o no tratado (incluyendo una suspensión) asociado con organismos vivos, particularmente sangre, incluyendo sangre total, sangre caliente o fría, y sangre almacenada o fresca; sangre tratada, tal como sangre diluida con al menos una solución fisiológica, incluyendo pero sin limitar solución salina, nutriente y/o soluciones anticoagulantes; componentes de la sangre, tales como concentrado de plaquetas (CP), plaquetas sometidas a aféresis, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma libre de plaquetas, plasma, suero, plasma congelado fresco (PCF), componentes obtenidos del plasma, glóbulos rojos empaquetados (GRE), capa leucocitaria (CL); productos sanguíneos derivados de sangre o un componente de sangre o derivados de médula ósea; glóbulos rojos separados de plasma y resuspendidos en fluido fisiológico; y plaquetas separadas de plasma y resuspendidas en fluido fisiológico. El fluido biológico puede haberse tratado para retirar algunos de los leucocitos antes de procesarse de acuerdo con la invención. Como aquí se usa, el producto sanguíneo o fluido biológico se refiere a los componentes descritos anteriormente, y a productos sanguíneos o fluidos biológicos similares obtenidos mediante otros medios y con propiedades similares. En una realización, el FCDP se obtiene de plasma rico en plaquetas (PRP). La preparación de PRP se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6.649.072, 6.641.552, 6.613.566, 6.592.507, 6.558.307, 6.398.972 y 5.599.558.

En una realización de todos los aspectos de la invención, el material de implante administra FCDP al sitio del implante durante una duración de tiempo superior a al menos 1 día. En varias realizaciones, el material de implante administra FCDP al sitio del implante durante al menos 7, 14, 21 o 28 días. Preferentemente, el material de implante administra FCDP al sitio del implante durante un tiempo entre aproximadamente 1 días y 7, 14, 21 o 28 días. En otra realización, el material de implante administra FCDP al sitio del implante durante un tiempo superior a aproximadamente 1 día, pero inferior a aproximadamente 14 días.

Por “reabsorbible” se entiende la habilidad de que el material del implante a volver a absorberse o remodelarse in vivo. El proceso de reabsorción implica la degradación y eliminación del material de implante original a través de la acción de fluidos corporales, enzimas o células. El huésped puede usar los materiales reabsorbidos en la formación de tejido nuevo, o el huésped puede utilizarlos de otra manera, o pueden excretarse.

Por “factor de diferenciación” se entiende un polipéptido, incluyendo una cadena de al menos 6 aminoácidos, que estimula la diferenciación de una o más células dianas en céulas con potencial de formar cartílago o hueso.

Por “partículas de tamaño nanómetro” se entiende una partícula de tamaño submicrón, generalmente definida como una partícula por debajo de 1000 nanómetros. Una partícula de tamaño nanómetro es un material sólido de partícula que es un estado intermedio entre sustancias moleculares y micrón. Un nanómetro se define como una billonésima parte de un metro (1 nanómetro = 109 m). El material nanómetro es conocido como polvo, fibra, película o bloque tiene tamaño de nanoescala.

Por “periodonto” se entiende los tejidos que rodean y sujetan los dientes. El periodonto sujeta, protege y proporciona nutriente a los dientes. El periodonto consiste en hueso, cemento, proceso alveolar de los maxilares y mandíbula, ligamento periodontal y encía. El cemento es una capa fina, calcificada de tejido que cubre completamente la dentina de la raíz del diente. El cemento se forma durante el desarrollo de la raíz y durante la vida del diente y funciona como un área de unión de las fibras del ligamento periodontal. El proceso alveolar es la parte ósea del maxilar y mandíbula donde los dientes se incrustan y donde se sujetan las raíces de los dientes. El alveolo es la cavidad donde el proceso alveolar en el que la raíz del diente se mantiene mediante el ligamento periodontal. El hueso que divide un alveolo de otro se llama el tabique interdental. Cuando están presentes dientes con múltiples raíces, el hueso se llama tabique interradicular. El proceso alveolar incluye la placa cortical, cresta alveolar, hueso trabecular y el apropiado hueso alveolar.

Por “promover el crecimiento” se entiende la curación del hueso, periodonto, ligamento o cartílago, y regeneración de tales tejidos y estructuras. Preferentemente, el hueso, periodonto, ligamento o cartílago está dañado o herido y requiere regeneración o curación.

Por “promover el crecimiento del periodonto” se entiende la regeneración o curación de los tejidos de apoyo de un diente incluyendo hueso alveolar, cemento y ligamento periodontal interpuesto, que se han dañado por enfermedad o trauma.

Por “purificado” se entiende un factor de crecimiento o diferenciación, por ejemplo, FCDP, que, antes de mezclar con una sustancia transportadora, es 95% o mayor por peso, esto es, el factor está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos y carbohidratos con lo que naturalmente se asocia. El término “sustancialmente purificado” se refiere a una pureza menor de factor, que tiene, por ejemplo, solamente 5%-95% por peso del factor, preferentemente 65-95%. Una preparación de proteína purificada generalmente producirá una única franja principal sobre un gel de poliacrilamida. Más preferentemente, el factor purificado usado en materiales de implante de la invención es puro cuando lo juzga el análisis de secuencia de aminoácido de terminal amino. Los términos “parcialmente purificado” se refire a FCDP que se proporciona en el contexto de PRP, PPP, PCF, o cualquier otro producto sanguíneo que requiera que se produzcan recogida y separación, por ejemplo, mediante centrifugación.

A modo de ejemplo, una solución que tiene ~1,0 mg/mL de FCDP, cuando ~50% es puro, constituye ~2,0 mg/mL de proteína total.

Los materiales de implante de esta invención ayudan en la regeneración del periodonto, al menos en parte, promoviendo el crecimiento de tejido conectivo, hueso y cemento. Los materiales de implante pueden prepararse para que directamente promuevan el crecimiento y diferenciación de células que producen tejido conectivo, hueso y cemento. Alternativamente, los materiales de implante pueden prepararse para que actúen indirectamente, por ejemplo, atrayendo células que son necesarias para promover el crecimiento de tejido conectivo, hueso y cemento. La regeneración que usa una composición de esta invención es un tratamiento más efectivo de enfermedades periodontales o heridas óseas que el que se consigue usando antibióticos sistémicos o solamente desbridamiento quirúrgico.

El FCDP, factores de crecimiento de polipéptido, y factores de diferenciación pueden obtenerse a partir de tejidos o células humanas, por ejemplo, plaquetas, mediante síntesis de péptido en fase sólida, o mediante tecnología de ADN recombinante. De este modo, con los términos “factor de crecimiento de polipéptido” o “factor de diferenciación”, se entiende materiales recombinantes o sintetizados derivados de tejido o células. Si el factor es un dímero, por ejemplo, FCDP, el factor recombinante puede ser un heterodímero recombinante, hecho al insertar en células procariotas o eucariotas secuencias de ADN que codifican ambas subunidades del factor, y después permitiendo que las células procesen las subunidades trasladadas para formar un heterodímero (por ejemplo, FCDP-AB). Alternativamente, el ADN que codifica solamente una de las subunidades (por ejemplo, FCDP cadena B o cadena A) puede insertarse en células, que después se cultivan para producir el factor homodimérico (por ejemplo, homodímeros FCDP-BB o FCDP-AA). FCDP para su uso en los métodos de la invención incluye homo y heterodímeros FCDP, por ejemplo, FCDP-AA, FCDP-BB, FCDP-AB, FCDP-CC y FCDP-DD, y combinación y derivados de los mismos.

La concentración de FCDP y otros factores del crecimiento de la invención puede determinarse usando, por ejemplo, un inmunoensayo enzimático, como se describe, por ejemplo, en las patente de Estados Unidos números 6.221.625, 5.747.273 y 5.290.708 o cualquier otro ensayo conocido en la técnica para determinar concentración de proteínas. Cuando aquí se proporciona, la concentración molar de FCDP se determina en base al peso molecular del dímero de FCDP (por ejemplo, FCDP-BB; PM = aproximadamente 25 KDa).

Los métodos y materiales de implante de la invención pueden usarse para curar heridas óseas de mamíferos, por ejemplo, fracturas, sitios receptores de implantes, y sitios de enfermedad periodontal. Los materiales de implante promueven el crecimiento de tejido conectivo y reparar y mejorar la formación de huesos en comparación con curación natural (esto es, sin agentes exógenos añadidos) o la curación complementada con la adición de antibióticos sistémicos. A diferencia de la curación natural, la terapia quirúrgica convencional o antibióticos, los materiales de implante de la invención provocan una mayor formación de hueso, tejido conectivo (por ejemplo, cartílago o ligamento) y cemento cuando se aplica a tejidos dañados o enfermos o a sitos afectados por enfermedad periodontal. La reparación de estos tejidos lleva a una mejor prognosis para las áreas afectadas. La habilidad de estos factores para estimular formación de nuevos huesos los hace aplicables en el tratamiento de defectos óseos causados por otros tipos de infección o trauma quirúrgico o accidental.

Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones de la misma, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A-1G son fotomicrografías que muestran el efecto en la formación ósea 8 semanas después del tratamiento. La Fig. 1A es una fotomicrografía que muestra el efecto de cirugía sola en la formación ósea. La Fig. 1B es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP solo en la formación ósea. La Fig. 1C es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP + 0,3 mg/mL FCDP en la formación ósea. La Fig. 1D es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP + 1,0 mg/mL FCDP en la formación ósea. La Fig. 1E es una fotomicrografía que muestra el efecto de injerto óseo liofilizado desmineralizado (IOLD) solo en la formación ósea. La Fig. 1F es una fotomicrografía que muestra el efecto de injerto óseo liofilizado desmineralizado (IOLD) + 0,3 mg/mL FCDP en la formación ósea. La Fig. 1G es una fotomicrografía que muestra el efecto de injerto óseo liofilizado desmineralizado (IOLD) + 1,0 mg/mL FCDP en la formación ósea.

Las Figs. 2A-2C son fotomicrografías que muestran el efecto en la formación ósea 16 semanas después del tratamiento. La Fig. 2A es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP solo en la formación ósea. La Fig. 2B es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP + 0,3 mg/mL FCDP en la formación ósea. La Fig. 2C es una fotomicrografía que muestra el efecto de �-TCP + 1,0 mg/mL FCDP en la formación ósea.

Descripción detallada

Ahora describimos varias realizaciones de la invención. Dos ejemplos que demuestran el uso de FCDP como un agente de curación de hueso y periodonto se presentan más abajo.

EJEMPLOS

Ejemplo I: Preparación de FCDP

Se tratan heridas óseas, por ejemplo, después de una enfermedad o trauma periodontal, y el periodonto, incluyendo hueso, cemento y tejido conectivo, se regeneran, de acuerdo con la invención combinando parcialmente FCDP parcialmente purificado o purificado con cualquiera de las sustancias transportadoras farmacéuticamente aceptables descritas anteriormente. El FCDP purificado puede obtenerse a partir de una fuente recombinante de plaquetas humanas. FCDP recombinante disponible en el mercado puede obtenerse de R&D System Inc. (Minneapolis, MN), BD Biosciences (San Jose, CA) y Chemicon, International (Temecula, CA). FCDP parcialmente purificado o purificado puede también prepararse de la siguiente manera:

De quinientas a 1000 unidades de bolitas de plaquetas humanas lavadas se suspenden en 1M NaCl (2 ml por unidad de plaqueta) y se calientan a 100 ºC durante 15 minutos. El sobrenadante se separa después mediante centrifugación y el precipitado se extrae dos veces con el 1m NaCl.

Los extractos se combinan y dializan contra 0,08M NaCl/0,01M tampón de fosfato salino (pH 7,4) y se mezclan durante la noche a 4 ºC con CM-Sephadex C-50 equilibrado con el tampón. La mezcla se vierte después en una columna ( 5 x 100 cm), se lava exhaustivamente con 0,08M NaCl/0,01M tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) y se eluye con 1M NaCl mientras se recogen fracciones de 10 ml.

Las fracciones activas se agrupan y dializan contra 0,3M NaCl / 0,01M tampón de fosfato de sodio (pH 7,4), centrifugan y pasan a 4 ºC a través de una columna de 2,5 x 25 cm de sefarosa azul (Pharamacia) equilibrada con 0,3M NaCl / 0,01M tampón de fosfato salino (pH 7,4). La columna después se lava con el tampón y el FCDP parcialmente purificado se eluye con una solución 1:1 de 1M NaCl y etilenglicol.

Las fracciones de FCDP parcialmente purificado se diluyen (1:1) con 1M NaCl, dializan contra 1M ácido acético, y liofilizan. Las muestras liofilizadas se disuelven en 0,8M NaCl / 0,01M tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) y pasa a través de columnas de 1,2 x 40 cm de CM-Shepadex C-50 equilibradas con el tampón. El FCDP se eluye después con un gradiente de NaCl (0,08 a 1M).

Las fracciones activas se combinan, dializan contra 1M de ácido acético, liofilizan y disuelven en un volumen pequeño de 1M de ácido acético. Se aplican porciones de 0,5 mL a una columna de 1,2 x 100 cm de Biogel P-150 (malla 100 a 200) equilibrada con 1M de ácido acético. El FCDP se eluye después con 1M de ácido acético mientras se recogen fracciones de 2 mL.

Cada fracción activa que contiene de 100 a 200 mg de proteína se liofiliza, disuelve en 100 mL de 0,4% ácido trifluoroacético y se someta a cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa sobre una columna de fenilo Bondapak (Waters). La elución con un gradiente lineal de acetonitrilo (0 a 60%) produce FCDP puro.

FCDP hecho mediante tecnología del ADN recombinante puede preparase de la siguiente manera:

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) derivado de plaquetas humanas contieen dos secuencias de polipéptido (polipéptidos FCDP-B y FCDP-A; Antoniades, H. N. y Hunkapiller, M., Science 220:963965, 1983). FCDP-B está codificado por el gen localizado en el cromosoma 7 (Betsholtz, C. et al., Nature 320:695699) y FCDP-A está codificado por el oncogen sis (Doolittle, R. et al., Science 221:275-277, 1983) localizado en el cromosoma 22 (Dalla-Favera, R., Sciene 218:686-688, 1982). Esta gen sis codifica la proteína transformante del Virus de Sarcoma de Simio (VSS) que está muy relacionado con el polipéptido FCDP-2. C-sis celular humano también codifica la cadena FCDP-A (Rao, C. D., et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 83:2392-2396, 1986). Debido a que dos cadenas de polipéptido de FCDP están codificadas por dos genes diferentes localizados en cromosomas separados, existe la posibilidad de que FCDP humano consista en heterodímero unido a disulfuro de FCDP-B y FCDP-A, una mezcla de los dos homodímeros (homodímero FCDP-BB y homodímero FCDP-AA), o una mezcla del heterodímero y los dos homodímeros.

Las células de mamífero en cultivo infectado con el Virus del Sarcoma de Simio, que contiene el gen que codifica la cadena de FCDP-A, demostraron sintetizar el polipéptido FCDP-A y procesarlo en un homodímero unido a disulfuro (Robbins et al., Nature 305:505-608, 1983). Además, el homodímero FCDP-A reacciona con antisuero elevado contra FCDP humano. Además, las propiedades funcionales del homodímero FCDP-A secretado son similares a los del FCDP derivado de plaquetas en que estimula la síntesis de ADN en fibroblastos cultivados, induce la fosforilación en el residuo de tirosina de una proteína de membrana celular de 185 kD y que es capaz de competir con (125I)-FCDP humano para enlazarse con receptores FCDP de superficie celular específica (Owen A. et al., Science 225:54-56, 1984). Se muestran propiedades similares para producto de gen sis/FCDP-A derivado de céulas humanas normales cultivadas (por ejemplo, células endoteliales arteriales humanas) o de células malignas humanas que expresan el gen sis/FCDP-2 (Antoniades, H. et al., Cancer Cells 3:145-151, 1985).

El homodímero recombinante FCDP-B se obtiene mediante la introducción de clones cADN de gen c-sis/FCDP-B en células de ratón usando un vector de expresión. El clon c-sis/FCDP-B usado para la expresión se obtuvo de células endoteliales humanas normales cultivadas (Collins, T., et al., Nature 216:748-750, 1985).

Uso de FCDP

FCDP solo o en combinación con otros factores de crecimiento es útil para promover la curación de huesos, crecimiento de huesos y regeneración o curación de las estructuras de apoyo de dientes lesionados por trauma o enfermedad. Es también útil para promover la curación de un sitio de extracción de un diente, para aumento de borde mandibular, o sitios de implantes dentales. La curación de huesoso también se mejoraría en sitio de fractura ósea o en área infectadas, por ejemplo, osteomielitis o en sitio de tumor. FCDP es también útil para promover el crecimiento y curación de un ligamento, por ejemplo, el ligamento periodontal y de cemento.

En la práctica, FCDP u otro factor de crecimiento o diferenciación se aplica directamente al área que necesita curación o regeneración. Generalmente, se aplica a un transportador reabsorbible o no reabsorbible como un líquido

o sólido, y el sitio se cubre después con un vendaje o tejido cercano. Una cantidad suficiente para promover el crecimiento de huesos es generalmente entre 500 ng y 5 mg para un área de 1 cm2, pero el límite superior es realmente 1 mg par un área de 1 cm2 siendo una cantidad preferente de FCDP aplicado 0,3 mg/mL.

Ejemplo II: Regeneración periodontal con armazones osteoconductivos tratados con hrFCDP-BB

La efectividad de FCDP en promover el crecimiento de periodonto y hueso se demuestra con el siguiente estudio.

Estudio de perro in vivo

El perro beagle es el modelo animal más usado para testar materiales y procedimientos de regeneración periodontal putativa (Wikesjo et al., J. Clin. Periodontol. 15:73-78, 1988; Wikesjo et al., J. Clin. Periodontol. 16:116119, 1999; Cho et al., J. Periodontol. 66:522-530, 1995; Giannobile eta l., J. Periodontol. 69:129-137, 1998; y Clergeau et al., J. Periodontol. 67:140-149, 1996). La acumulación de placa y sarro puede inducir inflamación gingival que puede llevar a la pérdida de hueso marginal y puede compararse la etiología de periodontitis en huesos y humanos. En cambio, en la enfermedad que ocurre de manera natural, hay una falta de uniformidad entre defectos. Además, como se ha prestado más atención a la salud oral en colonias de criadores caninos, se ha vuelto impracticable obtener animales con enfermedad periodontal natural. Por lo tanto, el modelo de furcación clase II horizontal inducido quirúrgicamente se ha convertido en uno de los modelos más comúnmente usados para investigar curación y regeneración periodontal.

Se trataron perros beagle con defectos furcación clase II horizontal usando composiciones FCDP de la invención. Quince perros beagle adultos aportaron 60 defectos tratados. Cuarenta y dos defectos se sometieron a biopsia dos meses después de tratamiento y quince defectos se sometieron a biopsia cuatro meses después de tratamiento.

Preparación de defecto

Se utilizó el modelo de defecto periodontal “de tamaño crítico” como numerosos investigadores lo describen (véase, por ejemplo, Wikesjo, 1988 y 1999, supra; Giannobile, supra, Cho, supra y Park et al., J. Periodontol. 66:462477, 1995). Se usaron ambos cuadrantes mandibulares en 16 perros beagle machos (2-3 años de edad) sin problemas de salud generales y orales. Un mes antes de la dosis, los animales se sedaron con una inyección subcutánea de atropina (0,02 mg/kg) y acepromacina (0,2 mg/kg) aproximadamente 30 minutos antes de anestesiarse con una inyección IV de sodio de pentobarbital (25 mg/kg). Después de la infiltración local del área quirúrgica con Lidocaína HCl más epinefrina 1:100.000, se reflejaron colgajos mucoperiósticos de grosor completo y se extrajeron el primer y tercer premolar (P1 y P3). Además, se extirpó la parte mesial de la corona del primer molar.

El hueso alveolar se retira después alrededor de la circunferencia complesta de P2 y P3, incluyendo las área de furcación usando cinceles y carburo enfriado en agua y fresas de diamante. Los defectos óseos horizontales se crearon de tal manera que hubo una distancia de 5 mm desde el fórnix de la bifurcación a la cresta del hueso. Los defectos tuvieron una anchura aproximadamente de 1 cm, dependiendo de la anchura del diente. Las raíces de todos los dientes experimentales se limpiaron con curetas e instrumentos ultrasónicos y se trataron con instrumentos con una fresa de diamante estrechada para eliminar el cemento. Después de crear los defectos óseos estandarizados los colgajos de las encías se suturaron para conseguir un cierre principal. A los animales se les alimentó con una dieta blanda y recibieron diariamente enjuagues de clorhexidina durante la duración del estudio.

Aplicación de material de injerto

Se aleatorizaron los defectos periodontales de P2 yP2 en cada cuadrante mandibular de los 15 animales antes del tratamiento usando sobres sellados. Aproximadamente cuatro semanas después de la preparación del defecto, los animales fueron de nuevo anestesiados como se ha descrito anteriormente y se reflejaron colgajos de grosor completo en ambos cuadrantes mandibulares. Se colocó una muesca en las superficies de la raíz del diente en la cresta ósea residual usando una fresa semicircular para servir como un futuro punto de referencia histológico. Los sitios se irrigaron con solución salina estéril y las raíces se trataron con ácido cítrico como se ha descrito previamente con el fin de descontaminar y eliminar la capa de muestra (Véase, por ejemplo, Cho, supra y Park, supra). Durante este periodo se saturó una cantidad de �-TCP o DFDBA suficiente para llenar el defecto periodontal con una solución de solución FCDP-BBhr(0,3 a 1,0 mg/ml) y la mezcla FCDPhr-BB/injerto se dejó asentar sobre una base quirúrgica estéril durante aproximadamente diez minutos. El injerto saturado FCDPhr se empaquetó después en el defecto con suave presión hasta el nivel ideal de regeneración ósea.

Después del implante del material de injerto, los colgajos mucoperiósticos se suturaron aproximadamente al nivel de la unión cemento esmalte (UCE) usando suturas interproximales, de politetrafluoroetileno expandido 4,0 interrumpido (PTFEe). Después de suturar los colgajos se colocó suavemente gel de gluconato de clorhexidina alrededor de los dientes y encías.

Tratamiento y grupos de control

Defectos recibidos:

1.: �-TCP

2.: �-TCP más FCDP-BBhr(0,3 mg/ml FCDPhr-BB)

3.: �-TCP más FCDP-BBhr(1,0 mg/ml FCDPhr-BB)

4.: DFDBA en perro

5.: DFDBA en perro más FCDP-BBhr(0,3 mg/ml FCDPhr-BB)

6.: DFDBA en perro más FCDP-BBhr(1,0 mg/ml FCDPhr-BB)

7.: Cirugía simulación (tratada solamente por desbridamiento de colgajo abierto, sin injerto)

Seis defectos por grupo de tratamiento fueron sometidos a biopsia a los dos meses (42 sitios totales). Además, cinco defectos en grupos de tratamiento 1, 2 y 3 fueron sometidos a biopsia a los cuatro meses (15 sitios totales).

Tabla 2. Diseño experimental

GRUPO Nº: Nº DE SITIOS DE TEST TRATAMIENTO PUNTOS TEMPORALES

1: 11 �-TCP solo 8 y 16 semanas n= 6 para 8 sem n=5 para 16 sem

2: 11 �-TCP + 0,3 mg/ml FCDPhr-BB 8 y 16 semanas n= 6 para 8 sem n=5 para 16 sem

3: 11 �-TCP + 1,0 mg/ml FCDPhr-BB 8 y 16 semanas n= 6 para 8 sem n=5 para 16 sem

4: 6 DFDBA solo 8 semanas

5: 6 DFDBA + 0,3 mg/ml FCDPhr-BB 8 semanas

6
6: DFDBA + 1,0 mg/ml FCDPhr-BB 8 semanas

7: 6 Cirugía, sin injerto 8 semanas

Por consiguiente, a las 8 semanas hay 7 grupos divididos entre 42 sitios en 11 perros. A las 16 semanas, hay 3 grupos divididos entre 15 sitios en 4 perros (un perro recibió cirugías de tratamiento escalonadas ocho semanas más tarde y así aportó dos sitios a cada uno de los puntos temporales de 8 y 16 semanas).

Tratamiento post-quirúrgico

Los sitios quirúrgicos se protegieron alimentando a los perros con una dieta blanda durante las primeras 4 semanas después de la operación. Para asegurar una curación óptima, se proporcionó un tratamiento antibiótico sistémico con penicilina G benzatina durante las dos primeras semanas y el control de placa se mantuvo mediante irrigación diaria con 2% gluconato de clorhexidina a lo largo del experimento. Las suturas se retiraron después de 3 semanas.

Recogida de datos

Fundamentos para los puntos de recogida de datos

Se eligió el punto temporal de 8 semanas porque es el punto temporal más común presentado para este modelo en la literatura y por lo tanto hay sustanciales datos históricos. Por ejemplo, Wikeskjo et al., supra, y Giannobile et al., supra, también eligieron 8 semanas para evaluar el efecto regenerativo de PMO-2 y OP-1, respectivamente, en el mismo modelo. Además, Park et al., supra, evaluó el efecto de FCDP-BBhraplicado directamente a la superficie de raíz condicionada y sin las membranas GTR en el modelo de perro beagle a las 8 semanas. Estos estudios sugieren de manera firme que el periodo de 8 semanas debería ser óptimo para ilustrar los potenciales efectos significativos entre varias modalidades de tratamiento.

Se eligió el punto temporal de 16 semanas para evaluar los efectos a largo plazo del tratamiento con factor de crecimiento. Estudios previos (Park et al., supra) sugieren que, para este momento, hay una sustancial curación espontánea de los defectos óseos. Sin embargo, es posible evaluar si el tratamiento con FCDP-BBhrlleva a una respuesta de tejido inusual o anormal, tal como remodelación ósea alterada, tumorogénesis o reabsorción de raíz.

Biopsias y evaluaciones de tratamiento

En el momento de la biopsia, a los animales se les administró una perfusión con 4% paraformaldehído y se sacrificaron. Después, las mandíbulas se extrajeron y se colocaron en un fijador. Se tomaron radiografías periapicales y los sitios tratados se cortaron en bloques individuales usando una sierra de diamante. Los bloques codificados (ciegos) se envolvieron en gasa, sumergieron en una solución de 4% formaldehído, se procesaron y analizaron.

Durante el procesamiento las biopsias se deshidrataron en etanol e infiltraron e incrustaron en metilmetacrilato. Se obtuvieron secciones descalcificadas de aproximadamente 300 μm de grosor usando una sierra de diamante a baja velocidad con refrigerante. Las secciones se pegaron en cristal acrílico opalescente, se trituraron hasta un grosor final de aproximadamente 80 μm y se tintaron con azul de toluidina y fucsia básico. Se obtuvieron secciones en serie de las etapas en un plano mesiodistal.

Se realizaron análisis histomorfométricos se realizaron sobre los portaobjetos enmascarados. Se evaluaron los siguientes parámetros:

1.: Longitud de Aparato Completo de Unión Nueva (CNAA): Regeneración periodontal medida como la distancia entre el nivel coronal del hueso viejo y le nivel coronal del hueso nuevo, incluyendo solamente aquel hueso nuevo adyacente al cemento nuevo con ligamento periodontal orientado funcionalmente entre el hueso nuevo y el cemento nuevo.

2.: Relleno de Hueso Nuevo (HN): Medido como el área en sección transversal de hueso nuevo formado dentro de la furcación.

3.: Relleno de Tejido Conectivo (TC): Medido como el área dentro de la furcación ocupada por el tejido conectivo gingival.

4.: Vacío (VA): El área de recesión donde hay ausencia de tejido

Resultados

A. Observaciones clínicas

Clínicamente, todos los sitios se curaron bien. Hubo una impresión de que los sitios trataos con FCDP-BBhrse curaron más rápido, como lo indicó la presencia de una encía firme y rosa al de una semana del post-operatorio. No se experimentó ningún hecho adverso en ningún grupo de tratamiento como cuando se evaluó mediante inspección visual de los sitios tratados. Pareció haber una mayor recesión gingival en grupos que recibieron �-TCP o DFDBA.

B. observaciones radiográficas

Radiográficamente, hubo una evidencia de mayora formación ósea a los dos meses como lo juzgó la mayor radiopacidad en los Grupos 2, 3 (�-TCP + FCDP-BBhr0,3 y 1,0 mg/ml, respectivamente) y 6 (DFDBA + FCDPBBhr1,0 mg/ml) en comparación con los otros grupos (Figuras 1A-G). A los cuatro meses, hubo evidencia de una mayor formación ósea en todos los grupos en comparación con el punto temporal de dos meses. No hubo evidencia radiográfica de ninguna remodelación ósea anormal, reabsorción de raíz o anquilosis en ningún grupo.

Tabla 3. Resultados radiográficos. Orden de clasificación.

EVALUACIÓN CUALITATIVA DE RELLENO ÓSEO A LAS 8 SEMANAS*: TRATAMIENTO

6: �-TCP solo

4: �-TCP + 0,3 mg/ml FCDPhr

2: �-TCP + 1,0 mg/ml FCDPhr

7: DFDBA solo

5: DFDBA + 0,3 mg/ml FCDPhr

3: DFDBA + 1,0 mg/ml FCDPhr

4: Cirugía, sin injerto

* 1= más relleno; 7= menos relleno

C. Análisis histomorfométricos

La valoración histomorfométrica de la longitud de cemento nuevo, hueso nuevo y ligamento periodontal nuevo (CNAA) así como relleno óseo nuevo, relleno de tejido conectivo y espacio vació se evaluó y expresó como porcentajes. En el caso de CNAA, los valores para cada grupo del test representan las mediciones CNAA (longitud en m/m)/longitud CNAA total disponible (en mm) x 100%. El relleno óseo, relleno de tejido conectivo y el espacio vacío se evaluaron y expresaron como porcentajes del área total de defecto de furcación.

El análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) se usó para testar las diferencias generales entre grupos de tratamiento, y se hicieron comparaciones en parejas usando el test t de estudiante. Se encontraron diferentes significativas entre grupos después de análisis de los portaobjetos codificados. La Tabla 4 muestra los resultados a los dos meses.

Tabla 4. Análisis histométricos a los dos meses

GRUPO Nº: TRATAMIENTO %CNAA REGENERACIÓN PERIODONTAL % RELLENO ÓSEO % RELLLENO TEJIDO CONECTIVO % VACÍO

1: �-TCP solo 37,0 ± 22,8 ** 28,0 ± 29,5 36,0 ± 21,5 12,0 ± 17,9

2: �-TCP + 0,3 mg/ml FCDPhr 59,0 ± 19,1 *, Ɩ 84,0 ± 35,8 0,0 ± 0,0 8,0 ± 17,9

3: �-TCP + 1,0 mg/ml FCDPhr 46,0 ± 12,3 * 74,2 ± 31,7 ƖƖ 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

4: DFDBA solo 13,4 ± 12,0 6,0 ± 8,9 26,0 ± 19,5 30,0 ± 27,4

5: DFDBA + 0,3 mg/ml FCDPhr 21,5 ± 13,3 20,0 ± 18,7 36,0 ± 13,4 18,0 ± 21,7

6: DFDBA + 1,0 mg/ml FCDPhr 29,9 ± 12,4 46,0 ± 23,0 f 26,0 ± 5,48 8,0 ± 13,04

7: Simulación de irugía, sin injerto 27,4 ± 15,0 34,0 ± 27,0 48,0 ± 35,64 10,0 ± 22,4

* Grupos 2 y 3 significativamente mayores (p<0,05) que Grupos 4 y 7 ** Grupo 1 significativamente mayor (p<0,05) que Grupo 4 t Grupo 2 significativamente mayor (p<0,05) que Grupo 5 t t Grupos 2 y 3 significativamente mayores que Grupos 1, 4 y 7 f Grupo 6 significativamente mayor que Grupo 4

La regeneración periodontal porcentual media (CNAA) en los grupos de cirugía sin injertos más la cirugía más

�-TCP solo fue 27% y 37%, respectivamente. Sin embargo, los grupos �-TCP que contenía FCDP-BBhr mostraron de manera significativa una mayor regeneración periodontal (p<0,05) que la cirugía con injertos o DFDBA solo (59% y 46% respectivamente para las concentraciones 0,3 y 1,0 mg/ml contra 27% para cirugía solo y 13% para DFDBA solo). Finalmente, el grupo �-TCP que contenía 0,3 mg/ml FCDP-BBhr demostró de manera significativa una mayor regeneración periodontal (p>0,05) que la misma concentración de FCDP-BBhr combinado con injerto (59% contra 21%).

El relleno óseo fue significativamente mayor (p>0,0,5) en los grupos de �-TCP + 0,3 mg/ml FCDP-BBhr(84,0%) y �-TCP + 1,0 mg/ml FCDP-BBhr(74,2%) que en los grupos de tratamiento de �-TCP solo (28,0%), cirugía solo (34%) o DFDBA solo (6%). También hubo significativamente un mayor relleno óseo (p>0,05) para el grupo �-TCP + 0,3 mg/ml FCDP-BBhr en comparación con el grupo DFDBA + 0,3 mg/ml FCDP-BBhr(84% y 20% respectivamente).

El grupo de análisis que examinó los datos de 8 semanas de los grupos DFDBA y el grupo de cirugía solo (Grupos 4, 5, 6 y 7) no demostró diferencia estadísticamente significativas entre los grupos DFDBA y cirugía solo para regeneración periodontal (CNNA). Hubo una tendencia a una mayor regeneración para aquellos sitios tratados con DFDBA mejorado con 1,0 mg/ml FCDP-BBhr contra DFDBA solo. Hubo un relleno óseo significativamente mejoró (p>0,05) para sitios tratados con DFDBA + 1,0 mg/ml FCDP-BBhr que DFDBA solo (46 y 6% respectivamente). Hubo una tendencia a mayor relleno óseo para sitios tratados con DBDBA que contenía 0,3 mg/ml FCDP-BBhr en comparación con DFDBA solo o cirugía solo. Sin embargo, sitios tratados con DFDBA solo demostraron menor relleno óseo en el defecto que cirugía solo (6 y 34%, respectivamente), faltando la mayor parte del defecto de cualquier relleno o relleno consistente en tejido conectivo gingival (blando).

A los cuatro meses después del tratamiento, quedaron diferencias significativas en regeneración periodontal. �-TCP solo, como resultado de extensiva anquilosis, dio como resultado un 36% de regeneración, mientras que los sitios tratados con �-TCP que contenía FCDP-BBhr tuvo una regeneración media de 58% y 49% en las concentraciones de 0,3 y 1,0 mg/ml FCDPhr-BB. Hubo presente un sustancial relleno óseo en los tres grupos de tratamiento. �-TCP solo dio como resultado un 70% de relleno óseo, �-TCP más 0,3 mg/ml FCDP produjo 100% de relleno óseo mientras que el grupo de 1,0 mg/ml FCDP tuvo 75% de relleno.

D. Evaluación Histológica

La evaluación histológica se realizó para todas las biopsias excepto una, en la que la evaluación no fue posible debido a dificultades encontradas durante el procesamiento.

Se muestran fotomicrografías representativas en las Figuras 1A-G y 2A-C. la Figura 1A muestra resultados de un sitio tratado solamente con cirugía (sin injertos). Este espécimen demuestra limitada regeneración periodontal (hueso nuevo (HN), cemento nuevo (CN), y ligamento periodontal (LP)) como se demuestra en el área de las muescas y que se extiende solamente una distancia corta coronalmente. El área de la furcación está principalmente ocupada por tejido conectivo blando denso (TC) con mínima formación de hueso nuevo (HN).

Para sitios tratados con �-TCP solo (Figura 1B), hay regeneración periodontal, similar a la observada para el espécimen de cirugía solo, que se extiende desde la base de las muescas durante una distancia corta coronalmente. Como se vio en el espécimen de cirugía solo, hubo muy poca formación de hueso nuevo con la mayor área de la furcación ocupada por tejido conectivo blando.

Sin embargo, la Figura 1C ilustra los resultados obtenidos para sitios tratados con �-TCP + 0,3 mg/ml FCDPhr-BB. Se muestra una significativa regeneración periodontal con hueso nuevo, cemento nuevo y ligamento periodontal que se extiende a lo largo de toda la superficie de la furcación. Además, el área de la furcación está llena de hueso nuevo que se extiende por toda la altura de la furcación hasta el fórnix.

En la Figura 1D se muestran resultados representativos para sitios tratados con �-TCP + 1,0 mg/ml FCDPhr-BB. Mientras hay una significativa regeneración periodontal en la furcación, no se extiende a lo largo de la superficie completa de la furcación. Hay formación de hueso nuevo presente a lo largo del tejido conectivo blando que se observa en la parte coronal del defecto junto con un espacio pequeño que está vacío de cualquier tejido (VA) en el fórnix de la furcación.

Las Figuras 2A, 2B y 2C ilustran resultados obtenidos para los grupos con tratamiento de injerto. Los resultados representativos para el grupo de DFDBA solo (Figura 2A) muestra una pobre regeneración periodontal que se limita al área de las muesca que se extiende solamente ligeramente en una dirección coronal. La formación de hueso nuevo está limitada y consiste en pequeñas cantidades de formación ósea a lo largo de la superficie de material de injerto DFDBA residual (tinte rojo oscuro a lo largo de islas rosas más claras). Además, el hueso nuevo está rodeado por tejido conectivo blando extensivo que se extiende coronalmente para llenar un área significativa en la furcación. Finalmente, un gran espacio vacío se extiende desde la extensión coronal del tejido conectivo blando al fórnix de la furcación.

Los resultados histológicos para DFDBA + 0,3 y 1,0 mg/ml FCDP-BBhrse muestran en las Figuras 2B y 2C, respectivamente. Ambos grupos demuestran una mayor regeneración periodontal en comparación con DFDBA solo con un nuevo aparato de unión (hueso nuevo, cemento nuevo y ligamento periodontal nuevo) que se extiende desde la base de las muescas en la raíces durante un distancia corta coronalmente (flechas9. También tuvieron una mayor relleno óseo en el área de la furcación, anquen hubo un significativo relleno de la furcación con tejido conectivo blando.

Conclusiones

En base a los resultados del estudio, el tratamiento de un defecto periodontal que usa FCDP-BBhr en 0,3 mg/mL o 1,0 mg/mL en combinación con un material transportador adecuado (por ejemplo, �-TCP) da como resultado una mayor regeneración periodontal que los productos o procedimientos actuales, tales como injertos con

�-TCP o injerto óseo solo, o cirugía periodontal sin injertos.

El tratamiento con las concentraciones 0,3 mg/mL y 1,0 mg/mL de FCDPhr dio como resultado una regeneración periodontal. La concentración 0,3 ml/mL de FCDPhr demostró una mayor regeneración periodontal y porcentaje de relleno óseo en comparación con la concentración 1,0 mg/ml de FCDPhr cuando se mezcló con �-TCP.

�-TCP fue más efectivo que el injerto cuando se mezcló con FCDP-BBhr en cualquier concentración. El hueso nuevo maduró (remodelado) normalmente con el paso del tiempo (0, 8 y 16 semanas) en todos los grupos. No hubo un incremento de anquilosis o reabsorción de raíz en los grupos FCDPhr. De hecho, los sitios que recibieron FCDP-BBhr tendieron a tener menos anquilosis que los sitios de control. Este hallazgo puede ser el resultado del hecho de que FCDP-BBhr es mitogénico y quimiotáctico para células de ligamento periodontal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales utilizados: Artículos de test y control

El �-TCP utilizó un tamaño de partícula (0,25 mm – 1,0 mm) que se optimizó para uso periodontal. En base a estudios que usan un modelo canino, el �-TCP administrado es reabsorbido ~80% en tres meses y es sustituido por hueso autólogo durante el proceso de curación.

El DFDBA lo suministró la Fundación de Transplante Musculoesquelético (FTM). El material fue aloinjerto de perro, hecho de huesos de un perro al que se mató después de la finalización de otro estudio que testó un procedimiento quirúrgico que fue considerado para no tener efecto en tejidos esqueléticos.

FCDPh-BB recombinante lo suministró BioMimetic Pharmaceuticals y se fabricó por Chiron, Inc, el único proveedor de FCDP-BBhr para uso humano aprobado por AAF. La AAF aprobó este FCDP-BBhr como un producto curador de heridas bajo el nombre comercial Regranex®

Se prepararon jeringas de un ml que contenían 0,5 ml de FCDP-BBhr estéril en dos concentraciones de acuerdo con los estándares de AAF para materiales humanos y de acuerdo con los actuales Proceso de Buena Fabricación aplicables (APBF). Las concentraciones testadas incluyeron 0,3 mg/ml y 1,0 mg/ml.

�-TCP se proporcionó en viales que contenían 0,5 cc de partículas estériles.

DFDBA se proporcionó en jeringas de 2,0 ml que contenían 1,0 cc de aloinjerto de hueso de perro liofilizado, desmineralizado y estéril.

Preparación de material

En el momento del procedimiento quirúrgico, los injertos implantados finales se prepararon mezclando la solución FCDP-BBhr con los materiales matrices. En resumen, una cantidad de TCP o aloinjerto suficiente para llenar por completo el defecto óseo se colocó en un plato estéril. La solución de FCDP-BBhr suficiente para empapar por completo la matriz se añadió después, los materiales se mezclaron y se dejaron asentar sobre la bandeja quirúrgica durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente antes de colocaras en el defecto óseo.

Un tiempo de incubación de 10 minutos con el material �-TCP es suficiente para obtener la máxima adsorción del factor de crecimiento (véase Apéndice A). Es también una cantidad de tiempo apropiada para los cirujanos en un contexto clínico antes de la colocación del producto en el defecto periodontal. Similarmente, en un mercado comercial, el FCDP-BBhr y el material matriz pueden suministrarse en recipientes separados en un kit y los materiales pueden mezclarse directamente antes de su colocación. Este concepto de kit simplificaría en gran medida las consideraciones de vida útil/estabilidad del producto.

Ejemplo III. Uso de FCDP para el tratamiento de defectos óseos periodontales en humanos

Se testó FCDP-BB humano recombinante (FCDP-BBhr) para su efecto en la regeneración de hueso periodontal en sujetos humanos. A dos grupos de test se les administró FCDP-BBhr en 0,3 mg/mL (Grupo I) o 1,0 mg/mL (Grupo II). FCDP-BBhr se preparó en tampón de acetato de sodio y se administró en un vehículo de fosfato beta-tricalcio (�-TCP). Al grupo de control, Grupo III, se le administró �-TCP en acetato de sodio solamente.

El objetivo del estudio clínico fuer evaluar la seguridad y efectividad del material de injerto que comprende �-TCP y FCDP-BBhr en 0,3 mg/mL o 1,0 mg/mL en el tratamiento de uno (1) a tres (3) defectos periodontales intraóseos y para evaluar su capacidad regenerativa en tejido óseo y blando.

Diseño de estudio y duración de tratamiento

El estudio fuer un ensayo clínico doble ciego, controlado, prospectivo, aleatorizado, diseñado en paralelo y multi-centro en sujetos que requirieron intervención quirúrgica para tratar un defecto óseo adyacente a la dentición natural. Los sujetos fueron aleatorizados en proporciones iguales para dar como resultado tres (3) grupos de tratamiento de aproximadamente 60 sujetos cada uno (180 en total). La duración del estudio fue seis (6) meses después de la implantación del dispositivo de estudio. El estudio enroló a 180 sujetos.

Diagnóstico y criterio de entrada principal

En el estudio se admitieron sujetos machos y hembras, de 25-75 años de edad, con avanzada enfermedad periodontal en al menos un sitio que requería tratamiento quirúrgico para corregir un defecto óseo. Otros criterios de inclusión incluyeron: 1) una profundidad de bolsillo de sondeo que media 7 mm o más en la visita de referencia; 2) después de desbridamiento quirúrgico, un defecto óseo (DO) vertical de 4 mm o mayor con al menos 1 pared ósea; 3) suficiente tejido queratinizado para permitir la completa cobertura de tejido del defecto; y 4) base radiográfica del defecto al menos 3 mm coronal al ápex del diente. Se permitió específicamente la participación de sujetos que fumaban hasta 1 paquete al día y que tenían dientes con furcación Clase I y II.

Dosis y modo de administración

Todos los kits de tratamiento contenían 0,25 g de �-TCP (un control activo) y 0,5 mL de solución de acetato de sodio solo (Grupo III), 0,3 mg/mL FCDP-BBhr (Grupo I), o 1,0 mg/mL FCDP-BBhr (Grupo II):

Después de un minucioso desbridamiento y limpieza de raíz, la solución del test se mezcló con �-TCP en un recipiente estéril, de tal manera que el �-TCP se saturó por completo. Las superficies de la raíz se condicionaron usando tetraciclina, EDTA o ácido cítrico. El injerto hidratado se empaquetó después en el defecto óseo y los colgajos de tejido se aseguraron con suturas interdentales para conseguir una cobertura completa del sitio quirúrgico.

Medición de efectividad

La principal medición de efectividad incluyó el cambio en el nivel de unión clínica (NUC) entre la referencia y seis meses después de la cirugía (Grupo I vs. Grupo III). Las mediciones secundarias de efectividad consistieron en los siguientes resultados: 1) crecimiento óseo lineal (COL) y % de relleno óseo (%RO) desde la referencia a seis meses después de la cirugía en base a las evaluaciones radiográficas (Grupo I y Grupo II vs. Grupo III; 2) cambio en NUC entre la referencia y seis meses después de la cirugía (Grupo II vs. Grupo II); 3) reducción de profundidad de bolsillo de sondeo (PBS) entre la referencia y seis meses después de la cirugía (Grupo I y Grupo II vs. Grupo III); 4) recesión gingival (RG) entre la referencia y seis meses después de la cirugía (Grupo I y Grupo II vs. Grupo III); 5) curación de herida (CH) del sitio quirúrgico durante las primeras tres semanas después de la cirugía (Grupo I y Grupo II vs. Grupo III); 6) área bajo la curva para el cambio en NUC entre la referencia y tres (3) y seis (6) meses (Grupo I y Grupo II vs. Grupo II); 7) el 95% de menor confianza unida (MCU) para %RO a los seis (6) meses después de la cirugía (Grupos I, II y II vs. aloinjerto óseo liofilizado desmineralizado (DFDBA) como se publica en la bibliografía; Parashis et al., J. Periodontol. 69:751-758, 1998); 8) el 95% MCU para crecimiento óseo lineal a los seis

(6) meses después de la cirugía (Grupos I, II y III vs. aloinjerto óseo liofilizado desmineralizado (DFDBA) como se publica en la bibliografía; Persson et al., J. Clin. Periodontol. 27:104-108, 2000); 9) el 95% MCU para el cambio en NUC entre referencia y seis (6) meses (Grupos I, II y II vs. EMDOGAIN® - PMA P930021, 1996); y 10) el 95% MCU para el cambio en NUC entre referencia y seis (6) meses (Grupos I, II y II vs. PEPGEN P-15™ - PMA P990033, 1999).

Métodos estadísticos

Los datos de seguridad y efectividad se examinaron y resumieron mediante estadística descriptiva. Las mediciones categóricas se mostraron como totales y porcientos, y las variables continuas se mostraron como medias, medianas, desviaciones estándares y rangos. Las comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento del producto de test (Grupos I y II) y el control (Grupo III) se hicieron usando los el test de chi-cuadrado y el test exacto de Fisher para variables categóricas y tests t o métodos de análisis de varianza (ANOVA) para variables continuas. Las comparaciones entre grupos de tratamiento para variables ordinales se hicieron usando métodos Cochran-Mantel-Haenszel. Un p<0,05 (unilateral) se consideró ser estadísticamente significativo para NUC, COL y %RO.

Los datos de seguridad se evaluaron por la frecuencia y severidad de hechos adversos como los evaluados clínicamente y radiográficamente. Tampoco hubo diferencias estadísticamente significativas observadas en la incidencia de hechos adversos (HA; todas la causas) entre los tres grupos de tratamiento. Los análisis de seguridad no identificaron ningún mayor riesgo para el sujeto debido a la implantación del material de injerto.

Resumen de resultados de efectividad

Los resultados de los análisis estadísticos revelaron beneficios clínicamente y estadísticamente significativos para los dos grupos de tratamiento (Grupos I y II) en comparación con el control activo de el �-TCP solo (Grupo III) y los controles históricos que incluyen DFDBA, EMDOGAIN® y PEPGEN P-15™.

A los tres meses después de la cirugía, se observó un aumento de NUC estadísticamente significativo desde la referencia a favor del Grupo I versus Grupo III (P = 0,041), lo que indica que hay beneficios significativamente tempranos de FCDP en el aumento en NUC. A los seis meses después de la cirugía, esta tendencia continuó a favor del Grupo I sobre el Grupo III, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,200). El análisis del área bajo la curva (ABC) que representa el efecto cumulativo (esto es, velocidad) para el aumento de NUC entre la referencia y seis meses se aproximó a un significado estadístico a favor del Grupo I en comparación con el Grupo III (p=0,054). Además, los análisis del 95% de menor confianza unida (MCU) para todos los grupos de tratamiento confirmo la efectividad de Grupos I y II en comparación con los aumentos de NUC observados a los seis (6) meses para EMDOGAIN® y PEPGEN P-15™.

Además de los beneficios clínicos observados para NUC, los análisis radiográficos que incluyen CrecimientoÓseo Lineal (COL) y Porcentaje de Relleno Óseo (%RO), revelaron una mejora significativamente mejorada en el aumento de hueso para Grupos I y II vs. Grupo III. %RO se definió como el porcentaje del defecto óseo original relleno con hueso nuevo como se mide radiográficamente. COL mostró una mejora significativa en el Grupo I (2,5 mm) cuando se compara con el Grupo III (0,9 mm, p<0,001). COL también fue significativo para el Grupo II (1,5 mm) cuando se comparó con el Grupo III (p=0,021).

El Porcentaje de Relleno Óseo (%RO) aumentó de manera significativa a los seis meses después de la cirugía en el Grupo I (56%) y Grupo II (34%) cuando se comparó con el Grupo III (18%), para un p<0,001 y p=0,019, respectivamente. El 95% de menor confianza unida en el intervalo de seis meses después de la cirugía, para crecimiento óseo lineal y % de relleno óseo confirmó la efectividad de los Grupos I y II en comparación con los resultados radiográficos publicados para DFDBA, el material más ampliamente usado para procedimientos de injerto periodontal.

A los tres meses, hubo significativamente menos Recesión Gingival (RG) (p=0,041) para el Grupo I en comparación con el Grupo III consistente con el efecto beneficioso observado con NUC. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en PDR y RG a los seis meses. Los análisis descriptivos del número de sitios que muestran una completa curación de herida (CH) a los tres meses revelaron mejoras en el Grupo I (72%) vs. Grupo II (60%) y Grupo III (55%), lo que indica una tendencia hacia una mejor curación.

Para evaluar el efecto beneficioso acumulativo para resultados clínicos y radiográficos, se realizó un análisis compuesto de efectividad para determinar el porcentaje de paciente con un resultado bueno como lo define NUC > 2,7 mm y COL > 1,1 mm a los seis (6) meses. Los puntos de referencia de NUC y COL de éxito se establecieron para estos parámetros mediante los injertos implantados, como se identifica en la sección anterior “Medidas de efectividad”. Los resultados mostraron que el 61,7% de los pacientes del Grupo I y el 37,9% de pacientes del Grupo II cumplieron o excedieron el punto de referencia compuesto para existo en comparación con el 30,4% de pacientes del Grupo III, dando como resultado un beneficio estadísticamente significativo del Grupo I vs. Grupo II (p<0,001). %RO reveló beneficios similares para el Grupo I (70,0%) vs. Grupo III (44,6) para el valor p de 0,003.

En resumen, el Grupo I consiguió resultados estadísticamente beneficiosos para NUC y RG a los tres (3) meses así como COL y %RO a los seis (6) meses, en comparación con el grupo de control activo de �-TCP solo (Grupo III). El significado clínico de estos resultados se confirma además por la comparación con controles históricos. Se concluye que el material de injerto que contiene FCDP demostró conseguir efectividad clínica y radiográfica durante seis meses mediante el tratamiento de defectos óseos periodontales.

Tabla 5. Resumen de efectividad de injerto de FCDP

PUNTO FINAL: GRUPO I GRUPO II GRUPO III

Aumento de NUC (mm): 3 meses: 3,8 (p=0,04) 3,4 (p=0,40) 3,3

NUC: Análisis ABC (mm x sem): 67,5 (p=0,05) 61,8 (p=0,35) 60,1

NUC (mm): 95% MCU 6 meses (vs 2,7 mm para EMDOGAIN & 1 mm para PEPGEN): 3,3 3,2 3,1

RG (mm): 3 meses: 0,5 (p=0,04) 0,7 (p=0,46) 0,9

COL (mm): 6 meses: 2,5 (p<0,001) 1,5 (p=0,02) 0,9

%RO: 6 meses: 56,0 (p<0,001) 33,9 (p=0,02) 17,9

Análisis compuesto (%Éxito): NUC-COL 61,7% (p<0,001) 37,9% (p=0,20) 30,4%

NUC-%RO
NUC-%RO: 70,0% (p=0,003) 44,6%

El material de injerto (esto es, �-TCP) que contiene FCDP en 0,3 mg/mL y 1,0 mg/mL demostró ser seguro y efectivo en la restauración de hueso alveolar y unión clínica alrededor de dientes con periodontitis de moderada a avanzada en un ensayo clínico grande aleatorizado que incluyó 180 sujetos estudiados durante 6 meses. Estas conclusiones se basan en mediciones radiográficas y clínicas validadas como se ha resumido anteriormente.

Consistente con los datos de biocompatibilidad del material de injerto que contiene FCDP, analizados anteriormente, y el uso seguro histórico de cada componente individual (esto es, �-TCP solo o FCDP solo), el estudio no reveló ninguna evidencia de sus efectos adversos locales o sistémicos. No hubo resultados adversos atribuibles al material de injerto, que resultó ser seguro.

Conclusión

La implantación de FCDP que contiene �-TCP en 0,3 mg/mL o 1,0 mg/mL resultó ser un tratamiento efectivo para la restauración de nivel de unión de tejido blando y hueso como lo demuestra el NUC significativamente mejorado a los 3 meses en comparación con el control activo. Nuestros hallazgos también fueron consistentes con el análisis de ABC que demostró una mejora en el aumento de NUC entre la referencia y seis meses. La implantación de FCDP que contiene �-TCP en 0,3 mg/mL o 1,0 mg/mL también resultó ser un tratamiento efectivo basado en un COL y %CO significativamente mejorados en comparación con el control activo. Los resultados clínicos significativamente mejorados demostrados por el análisis compuesto de mediciones de tejido blando y duro en comparación con el control activo de �-TCP solo también demostraron la efectividad del protocolo de tratamiento descrito anteriormente. Finalmente, los resultados de la administración de FCDP que contiene �-TCP en 0,3 mg/mL

o 1,0 mg/mL resultaron exceder los puntos de referencia establecidos de efectividad tanto clínicamente como radiográficamente.

Los resultados de este ensayo junto con los datos extensivos y confirmatorios de estudios con animales y humanos in vivo demuestra que el material de injerto que contiene FCDP estimular la regeneración de tejido blando y duro en defectos periodontales, aunque los efectos fueron más significativos cuando FCDP en el rango de 0,1 a 1,0 mg/mL (por ejemplo, 0,1 mg/mL, 0,3 mg/mL o 1,0 mg/mL) se administró en el material de injerto. Además, FCDP administrado en el material de injerto en la cantidad de 0,3 mg/mL regeneró de manera significativa el tejido blando y el hueso.

A continuación se describen más realizaciones de la presente divulgación.

1.: Un método para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago de un mamífero que comprende la administración a dicho mamífero de un material de implante que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL en un transportador líquido farmacéuticamente aceptable y un transportador sólido farmacéuticamente aceptable, donde dicho material de implante promueve el crecimiento de dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago.

2.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP tiene una concentración de aproximadamente 0,3 mg/mL.

3.: El método de la realización 2, donde dicho FCDP tiene una concentración de 0,3 mg/mL.

4.: El método de la realización 1, donde dicho transportador sólido farmacéuticamente aceptable comprende uno de los siguientes: un aglutinante biocompatible, un agente sustituto de hueso o un gel.

5.: El método de la realización 4, donde dicho aglutinante biocompatible es un polímero natural o sintético.

6.: El método de la realización 5, donde dicho polímero natural o sintético se selecciona de polisacáridos, ácidos nucleicos, carbohidratos, proteínas, polipéptidos, colágeno, poli(ácidos a-hidroxi), poli(lactonas), poli(aminoácidos), poi(anhídridos), poli(ortoésteres), poli(anhídrido-co-imidas), poli(ortocarbonatos), poli(ahidroxi alcanoatos), poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres), ácido poliláctico, poli(L-láctido) (PLLA), poli(D,Lláctido), (PDLLA), ácido poliglicólico, poliglicólido (PGA), poli(láctido-co-glicólido (PLGA), poli(L-láctido-co-D, L-láctido), poli(D,L-láctido-co-carbonato trimetileno), polihidroxibutirato (PHB), poli(£-caprolactona), poli(5valerolactona), poli(y-butirolactona), poli(caprolactona), ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli(hidrocloruro de alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(etilenoimina), fumarato de polipropileno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidiona, poli(etiloxazolina), copolímeros de bloque poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno), poli(teraftalato de etileno)poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos.

7.: El método de la realización 5, donde dicho polímero natural o sintético se selecciona de colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico y polimetilmetacrilato.

8.: El método de la realización 4, donde dicho aglutinante biocompatible se selecciona de ácido algínico, goma arábiga, goma guar, goma xantana, gelatina, quitina, quitosano, acetato de quitosano, lactato de quitosano, sulfato de condroitina, N-O-carboximetil quitosano, un dextrano, pegamento de fibrina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato sódico, una celulosa, una glucosamina, un proteoglicano, un almidón, ácido láctico, un plurónico, glicerofosfato sódico, colágeno, glicógeno, una queratina, seda y derivados y mezclas de los mismos.

9.: El método de la realización 4, donde dicho aglutinante biocompatible se es hialuronato sódico o derivados del mismo.

10.: El método de la realización 9, donde dicho aglutinante biocompatible es ácido hialurónico.

11.: El método de la realización 4, donde dicho aglutinante biocompatible se selecciona de metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

12.: El método de la realización 10, donde dicho aglutinante biocompatible es carboximetilcelulosa.

13.: El método de la realización 8, donde dicho dextrano es a-ciclodextrina, �-ciclodextrina, y-ciclodextrina, o sulfato de dextrano sódico.

14.: El método de la realización 8, donde dicho almidón es almidón de hidroxietilo o almidón soluble.

15.: El método de la realización 4, donde dicho agente sustituto de hueso se selecciona de fosfato de calcio, sulfato de calcio o hueso desmineralizado.

16.: El método de la realización 15, donde dicho fosfato de calcio se selecciona de fosfato tricálcico, hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico.

17.: El método de la realización 15, donde dicho fosfato de calcio se proporciona como una pasta o masilla que forma un fosfato de calcio endurecido después de la administración in vivo.

18.: El método de la realización 15, donde dicho fosfato de calcio se proporciona como un fosfato de calcio endurecido.

19.: El método de la realización 15, donde dicho fosfato de calcio es biorreabsorbible.

20.: El método de la realización 16, donde dicho fosfato tricálcico es �-fosfato tricálcico (� -TCP).

21.: El método de la realización 20, donde dicho �-TCP comprende una matriz de partículas de tamaño micrón

o submicrón.

22.: El método de la realización 21, donde dichas partículas de �-TCP tienen un tamaño inferior a 5000 μm.

23.: El método de la realización 21, donde dichas partículas de �-TCP tienen un tamaño de partícula en el rango de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 μm.

24.: El método de la realización 23, donde dichas partículas de �-TCP tienen un tamaño de partícula en el rango de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 μm.

25.: El método de la realización 24, donde dichas partículas de �-TCP tienen un tamaño de partícula en el

rango de aproximadamente 250 a aproximadamente 2000 μm.

26.: El método de la realización 21, donde dichas partículas de �-TCP son porosas.

27.: El método de la realización 26, donde dichas partículas de �-TCP tienen una porosidad superior a 40%.

28.: El método de la realización 27, donde dichas partículas de �-TCP tienen una porosidad superior a 65%.

29.: El método de la realización 28, donde dichas partículas de �-TCP tienen una porosidad superior a 90%.

30.: El método de la realización 20, donde dicho �-TCP se proporciona en una forma adecuada para su implantación.

31.: El método de la realización 30, donde dicha forma se selecciona de una esfera, un cilindro y un bloque.

32.: El método de la realización 15, donde dicho hueso desmineralizado es hueso cortical o esponjoso.

33.: El método de la realización 1, donde dicho transportador líquido farmacéuticamente aceptable se selecciona de gua, un tampón fisiológicamente aceptable o un medio de cultivo celular.

34.: El método de la realización 33, donde dicho tampón fisiológicamente aceptable es tampón de acetato de sodio.

35.: El método de la realización 1, donde dicha composición comprende además un agente biológicamente activo.

36.: El método de la realización 35, donde dicho agente biológicamente activo se selecciona de un anticuerpo, un antibiótico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, un agente anti-cáncer, un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio y una vacuna.

37.: El método de la realización 36, donde dicha proteína es una proteína osteogénica.

38.: El método de la realización 37, donde dicha proteínas osteogénica se selecciona de factor de crecimiento

insulínico I (FCI-I), de factor de crecimiento insulínico II (FCI-II), factor de crecimiento transformante-�2 (FCT- �2), factor de crecimiento transformante-a (FCT-a), una proteína morfogenética ósea (PMO) o osteogénicas.

39.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante comprende además médula ósea autóloga o extractos de plaquetas autólogas.

40.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP está parcialmente o sustancialmente purificado.

41.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se obtiene a partir de una fuente natural o una fuente recombinante.

42.: El método de la realización 41, donde dicha fuente natural comprende sangre, plaquetas, suero, concentrado de plaquetas, pasma rico en plasma (PRP) o médula ósea.

43.: El método de la realización 41, donde dicha fuente natural es plasma rico en plaquetas (PRP).

44.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante entrega dicho FCDP a dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago durante al menos un días después de la administración.

45.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante entrega dicho FCDP a dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago durante menos de aproximadamente 28 días después de la administración.

46.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante entrega dicho FCDP a dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago durante menos de aproximadamente 21 días después de la administración.

47.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante entrega dicho FCDP a dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago durante menos de aproximadamente 14 días después de la administración.

48.: El método de la realización 1, donde dicho material de implante entrega dicho FCDP a dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 14 días después de la administración.

49.: El método de la realización 1, donde dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago está dañado.

50.: El método de la realización 1 que además comprende la etapa de permitir que dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago crezca.

51.: El método de la realización 50 que además comprende las etapas de exponer dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago produciendo un colgajo quirúrgico de piel antes de administrar dicho material de implante, y sustituyendo dicho colgajo después de administrar dicho material de implante.

52.: El método de la realización 51 que además comprende, después de la etapa de producir un colgajo quirúrgico de piel para exponer dicho hueso, periodonto o ligamento, pero antes de la etapa (a), la etapa de limpiar dicho hueso o periodonto para eliminar materia orgánica de dicho hueso o periodonto.

53.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se libera del material de implante después de la administración a una velocidad media inferior o igual a 300 μg/día.

54.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se libera del material de implante después de la administración a una velocidad media inferior a 100 μg/día.

55.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se libera del material de implante después de la administración a una velocidad media inferior a 50 μg/día.

56.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se libera del material de implante después de la administración a una velocidad media inferior a 10 μg/día.

57.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP se libera del material de implante después de la administración a una velocidad media inferior a 1 μg/día.

58.: El método de la realización 1, donde dicho transportador farmacéuticamente aceptable es estéril.

59.: El método de la realización 1, donde dicho FCDP es FCDP AA, FCDP BB, FCDP CC o FCDP DD o combinaciones o derivados de los mismos.

60.: El método de la realización 59, donde dicho FCDP es FCDP-BB.

61.: El método de la realización 59, donde dicho FCDP es FCDP-AB.

62.: Un método para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago de un mamífero que

comprende (a) administrar a dicho mamífero un material de implante que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de menos o igual a 0,3 mg/mL en un transportador líquido farmacéuticamente aceptable y un transportador sólido farmacéuticamente aceptable, donde dicho material de implante promueve el crecimiento de dicho hueso, periodonto, ligamento o cartílago.

63.: Un vial que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 1,0 mg/mL en una transportador farmacéuticamente aceptable.

64.: El vial de la realización 63, donde dicho liquido es tampón de acetato de sodio estéril.

65.: El vial de la realización 63 que comprende FCDP en una concentración de aproximadamente 0,3 mg/mL.

66.: El vial de la realización 63, donde dicho FCDP es FCDP-BB.

67.: El vial de la realización 64, donde dicho FCDP es estable en dicho tampón durante al menos 36 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ºC a 80 ºC.

68.: El vial de la realización 64, donde dicho FCDP es estable en dicho tampón durante al menos 24 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ºC a 80 ºC.

69.: El vial de la realización 64, donde dicho FCDP es estable en dicho tampón durante al menos 18 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ºC a 80 ºC.

70.: El vial de la realización 64, donde dicho FCDP es estable en dicho tampón durante al menos 12 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ºC a 80 ºC.

71.: Un material de implante que comprende fosfato cálcico poroso habiendo adsorbido un liquido que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL.

72.: El material de implante de la realización 71, donde la concentración de FCDP es aproximadamente 0,3 mg/mL.

73.: El material de implante de la realización 71, donde dicho fosfato de calcio se selecciona de fosfato tricálcico, hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico.

74.: El material de implante de la realización 71, donde dicho FCDP se proporciona en un líquido estéril.

75.: El material de implante de la realización 71, donde dicho líquido es tampón de acetato de sodio.

76.: Un método para preparar un material de implante que comprende empapar un material un material de fosfato de calcio en un líquido estéril que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en el rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL.

77.: El método de la realización 76, donde la concentración de FCDP es aproximadamente 0,3 mg/mL.

78.: El método de la realización 76, donde dicho fosfato de calcio se selecciona de fosfato tricálcico, hidroxiapatita, hidroxiapatita poco cristalina, fosfato cálcico amorfo, metafosfato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato heptacálcico, dihidrato de pirofosfato cálcico, pirofosfato cálcico y fosfato octacálcico.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un material de implante que comprende un hueso desmineralizado poroso que tiene incorporado en el mismo un líquido que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) en una concentración en un rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL, donde el hueso desmineralizado comprende partículas en un rango de aproximadamente 100 micrones a aproximadamente 500 micrones de tamaño.
2.

El material de implante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el material de implante consiste en hueso desmineralizado poroso que tiene incorporado en el mismo un líquido que consiste en FCDP en una concentración en un rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL en un tampón, donde el hueso desmineralizado consiste en partículas en un rango de aproximadamente 100 micrones a aproximadamente 500 micrones de tamaño.
3.

El material de implante de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende colágeno.
4.

El material de implante de acuerdo con la reivindicación 3, donde el material de implante consiste en colágeno y un hueso desmineralizado poroso que tiene incorporado en el mismo un líquido que consiste en FCDP en una concentración en un rango de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL en un tampón, donde el hueso desmineralizado consiste en partículas en un rango de aproximadamente 100 micrones a aproximadamente 500 micrones de tamaño.
5.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el hueso desmineralizado:

a) tiene una porosidad superior a 40%; y/o b) es capaz de absorber una cantidad del líquido que es igual a al menos aproximadamente el 25% del propio peso del hueso desmineralizado, preferentemente al menos aproximadamente el 50% del propio peso del hueso desmineralizado, más preferentemente al menos aproximadamente el 2000% del propio peso del hueso desmineralizado; y en particular al menos aproximadamente el 2000% del propio peso del hueso desmineralizado.
6.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el material de implante comprende macroporosidad después de su implantación in vivo.
7.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, done el FCDP comprende FCDP-BB, particularmente FCDP-BB humano recombinante.
8.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el FCDP está presente en el líquido en una concentración de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,75 mg/ml, preferentemente aproximadamente 0,25 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, en particular aproximadamente 0,3 mg/ml.
9.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el líquido incorporado se adsorbe o absorbe al hueso desmineralizado.
10.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición es una pasta o masilla fluida.
11.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el hueso desmineralizado consiste en partículas en un rango de aproximadamente 200 micrones a aproximadamente 3000 micrones en tamaño.
12.

El material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el hueso desmineralizado consiste en partículas en un rango de aproximadamente 250 micrones a aproximadamente 2000 micrones en tamaño.
13.

Un material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para promover el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.
14.

Un material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para el tratamiento de un sitio de extracción de diente, una fractura de hueso, un sitio receptor de implante, un sitio de enfermedad periodontal, un defecto óseo causado por una infección o un trauma quirúrgico o accidental, una estructura de apoyo de un diente lesionado por enfermedad o trauma, un sitio de un implante dental, osteomielitis o un sitio de tumor óseo, o para uso en un aumento de bore, aumento de borde mandibular, injerto estético o procedimiento de elevación sinusal.
15.

Un método para preparar un material de implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprende empapar el hueso desmineralizado poroso con el líquido.

FIGURA 2