PT1812076E

PT1812076E - Composições de factor de crescimento derivado de plaquetas e seus métodos de utilização

Info

Publication number: PT1812076E
Application number: PT05803356T
Authority: PT
Inventors: Samuel E Lynch
Original assignee: Biomimetic Therapeutics Inc
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2010-11-18
Also published as: EP3170505A1; JP5137577B2; US20220176021A1; EP2308500B1; AU2005295919A1; EP1812076A4; EP2223698A1; EP2223698B1; JP2008516675A; US11318230B2; AU2005295919B2; US11571497B2; US20070259814A1; KR20070095288A; EP2308501A1; US20170014545A1; AU2009202532A1; AU2009202532B2; NO20071974L; DK1812076T3

Description

ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composições de factor de crescimento derivado de plaquetas e seus métodos de utilização"

Campo do invento 0 presente invento refere-se à cicatrização do osso e tecidos conjuntivos.

Antecedentes do invento

Os factores de crescimento são proteínas que se ligam a receptores presentes numa superfície celular, com o resultado principal de activarem a proliferação e/ou a diferenciação celular. Muitos factores de crescimento são bastante versáteis, estimulando a divisão celular em numerosos tipos de células diferentes, ao passo que outros são específicos para um tipo de célula particular. Os exemplos de factores de crescimento incluem o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF de "Platelet-Derived Growth Factor"), os factores de crescimento análogos à insulina (IGF-I e II de "Insulin-like Growth Factor"), o factor de crescimento transformante beta (TGF-β de "Transforming Growth Factor"), o factor de crescimento epidérmico (EGF de "Epidermal Growth Factor") e o factor de crescimento dos fibroblastos (FGF de "Fibroblast Growth Factor"). 0 PDGF é uma proteína catiónica e estável ao calor encontrada numa variedade de tipos celulares, incluindo os grânulos de plaquetas circulantes, as células do músculo liso vascular, as células endoteliais, os macrófagos e os queratinócitos, e sabe-se que estimula a síntese proteica e a produção de colagénio pelos fibroblastos in vitro. Sabe-se também que actua como um mitogene e um agente quimiotáctico in vitro para os fibroblastos, as células do músculo liso, os osteoblastos e as células da glia.

0 PDGF-BB humano recombinante (rhPDGF-BB) estimula a cicatrização de feridas e a regeneração óssea tanto em animais como nos seres humanos. Ele está aprovado nos Estados Unidos e na Europa para uso humano, em aplicações tópicas, com o intuito de acelerar a cicatrização de feridas no pé diabético crónico. Foi igualmente demonstrado que o factor hPDGF-BB 2 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ recombinante é eficaz quer individualmente quer em combinação com outros factores de crescimento para melhorar a regeneração periodontal, isto é, o recrescimento do osso, do cemento e dos ligamentos à volta dos dentes (ver, por exemplo, Patente U.S. 5,124,316) . A patente US 2002/0082694 descreve composições de esponjas osteogénicas altamente mineralizadas e suas utilizações. As composições incluem um veículo poroso de reabsorção rápida, um esqueleto mineral reabsorvido mais lentamente e um factor osteogénico, preferencialmente uma proteína morfogenética óssea. A patente US 6,180,606 descreve composições com um potencial osteogénico melhorado, métodos para a sua preparação e suas utilizações. As composições compreendem uma matriz porosa ou semiporosa, um factor osteogénico e um agente como, por exemplo, factores de crescimento, factores nutrientes, fármacos, compostos que contêm cálcio, produtos sanguíneos, proteínas de peso molecular elevado ou suas combinações.

Sumário do invento

Demonstrámos agora que uma dose baixa de rhPDGF (—0,1 a 1,0 mg/ml) promove a reparação do osso, do periodonto, do ligamento e da cartilagem. Uma quantidade pequena de rhPDGF pode ser adsorvida em β-TCP (de "TriCalcium Phosphate"; fosfato tricálcico beta), que pode ser implantado no local de reparação, de modo que o factor rhPDGF seja libertado in vivo. Foi demonstrado que a adição de rhPDGF a β-TCP melhora a ligação e a proliferação das células osteoblásticas em comparação com o β-TCP não tratado. O invento refere-se, assim, a um material de implante compreendendo um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta e o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones. 3 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Num primeiro aspecto, o invento apresenta um método para promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero, por exemplo, um ser humano, através da administração de um material de implante contendo factor de crescimento derivado de plaguetas (PDGF) numa concentração inferior a cerca de 1,0 mg/ml, de forma gue o material de implante promova o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem. Numa concretização, o PDGF é administrado numa guantidade inferior ou igual a 0,3 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF é administrado numa quantidade no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e cerca de 1,0 mg/ml. Em várias concretizações, o PDGF é administrado numa quantidade compreendida entre cerca de 0,2 e cerca de 0,75 mg/ml, entre cerca de 0,25 e cerca de 0,6 mg/ml, e entre cerca de 0,25 e cerca de 0,5 mg/ml. Numa concretização, o PDGF é administrado numa quantidade de cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, de preferência 0,3 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF está parcial ou substancialmente purificado. Em outra concretização adicional, o PDGF é isolado ou purificado a partir de outros contaminantes. Numa concretização adicional, o PDGF é libertado a partir do material de implante, após a administração, a uma velocidade média de 0,3 mg/dia. Em outra concretização, o PDGF é libertado a partir do material de implante, após a administração, a uma velocidade média de 300 μρ/άί3. Ainda em outras concretizações adicionais, o PDGF é libertado a partir do material de implante a uma velocidade média inferior a 100 μρ/όί3, inferior a 50 μρ/dia, inferior a 10 μρ/dia ou inferior a 1 μg/dia. De preferência, o PDGF é distribuído ao longo de alguns dias, por exemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25 dias, ou até 28 dias ou mais.

Um segundo aspecto do invento apresenta um método para promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero, por exemplo, um ser humano, através da administração de um material de implante contendo uma quantidade de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) inferior a cerca de 1,0 mg/ml e um veículo farmaceuticamente aceitável, de modo que o material de implante promova o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem, e deixando que o osso, o 4 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ periodonto, ο ligamento ou a cartilagem cresçam. De preferência, o PDGF é igual ou inferior a cerca de 0,3 mg/ml. Numa concretização, o PDGF é administrado num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e 1,0 mg/ml. Em outras concretizações, a quantidade de PDGF é igual a cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferencialmente 0,3 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF está parcial ou substancialmente purificado. Ainda em outra concretização, o PDGF é isolado ou purificado a partir de outros contaminantes. Antes de administrar o material de implante ao mamífero, o método pode incluir adicionalmente a etapa de produção de um retalho cirúrgico de pele para expor o osso, o periodonto, o ligamento ou a cartilagem e, após a etapa de administração, uma etapa de reposição do retalho. Ainda em outra concretização, após produzir o retalhe cirúrgico, mas antes de administrar o material de implante ao osso, ao periodonto, ao ligamento ou à cartilagem, o método pode incluir adicionalmente a etapa de aplainamento do osso ou do periodonto para remover a matéria orgânica do osso ou do periodonto. Em outra concretização ainda, o método promove o crescimento do osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem danificados ou doentes. Ainda em outra concretização, o método promove o crescimento de osso em locais onde é necessária uma formação de osso novo em resultado de intervenções cirúrgicas, tais como, por exemplo, a extracção de um dente, o aumento da cristã, os enxertos estéticos e a elevação do seio maxilar.

Um terceiro aspecto do invento apresenta um material de implante para promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero, por exemplo, um ser humano. O material de implante inclui um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um aglutinante biocompatível, um agente substituto de osso, um líquido ou um gel) e o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), que está presente numa concentração inferior a cerca de 1,0 mg/ml. Preferencialmente, o PDGF está presente no material de implante numa concentração igual ou inferior a cerca de 0,3 mg/ml. Numa concretização, o PDGF é administrado num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e 1,0 mg/ml. Em outras concretizações, a quantidade de PDGF é de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, 5 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ preferencialmente 0,3 mg/ml. Numa concretização, o veiculo farmaceuticamente aceitável do material de implante inclui um esqueleto ou matriz que consiste num aglutinante biocompatível (por exemplo, a carboximetilcelulose) ou num agente substituto de osso (β-TCP), que é capaz de absorver uma solução incluindo PDGF (por exemplo, uma solução contendo PDGF numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml). Em outra concretização, o veiculo farmaceuticamente aceitável é capaz de absorver uma quantidade da solução de PDGF que é igual a pelo menos cerca de 25% do seu próprio peso. Em outras concretizações, o veiculo farmaceuticamente aceitável é capaz de absorver uma quantidade da solução de PDGF que é igual a pelo menos cerca de 50%, 75%, 100%, 200%, 250% ou 300% do seu próprio peso. Numa concretização, o PDGF é absorvido pelo veiculo farmaceuticamente aceitável do material de implante através de imersão do veiculo farmaceuticamente aceitável numa solução contendo PDGF. Preferencialmente, o PDGF está presente na solução numa concentração inferior a cerca de 1,0 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF está presente na solução numa concentração igual ou inferior a cerca de 0,3 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF está presente na solução numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e 1.0 mg/ml. Ainda em outras concretizações, o PDGF está presente na solução numa quantidade de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferencialmente 0,3 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF está parcial ou substancialmente purificado. Ainda numa concretização adicional, o PDGF é isolado ou purificado a partir de outros contaminantes.

Um quarto aspecto do invento apresenta um método de preparação de um material de implante para promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero, por exemplo, um ser humano. O método inclui a etapa de combinação do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) parcialmente purificado ou purificado, numa quantidade inferior a cerca de 1,0 mg/ml, com um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, o PDGF é combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável numa concentração igual ou inferior a cerca de 0,3 mg/ml. Numa concretização, o PDGF é combinado com um veículo 6 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ farmaceuticamente aceitável numa quantidade no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e 1,0 mg/ml. Em outras concretizações, o PDGF é misturado na quantidade de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml. Em outra concretização, o PDGF é misturado na quantidade de 0,3 mg/ml. Em outra concretização ainda, o PDGF é absorvido pelo veiculo farmaceuticamente aceitável para produzir o material de implante.

Um quinto aspecto do invento contempla um frasco de vidro contendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml, num liquido farmaceuticamente aceitável. Numa concretização deste aspecto do invento, o liquido é tampão acetato de sódio estéril. Em outra concretização, o frasco de vidro contém PDGF numa concentração de cerca de 0,3 mg/ml. Ainda em outra concretização preferida, o PDGF é PDGF-BB. Em outras concretizações ainda, o PDGF é estável no tampão acetato de sódio durante pelo menos cerca de 12 meses, preferencialmente pelo menos cerca de 18 meses, mais preferencialmente pelo menos cerca de 24 meses e, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 36 meses, quando armazenado a uma temperatura no intervalo compreendido entre cerca de 22C e 802C.

Um sexto aspecto do invento contempla um material de implante que inclui um fosfato de cálcio poroso no qual está adsorvido um liquido contendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml. Em várias concretizações, a concentração de PDGF é de cerca de 0,3 mg/ml, o fosfato de cálcio é seleccionado entre o fosfato tricálcico, e o PDGF é disponibilizado num liquido estéril, por exemplo, tampão acetato de sódio.

Um sétimo aspecto do invento contempla um método de preparação de um material de implante por saturação de um material de fosfato de cálcio num liquido estéril, que inclui factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml. Em várias concretizações, a concentração de PDGF é de cerca de 0,3 mg/ml, e o fosfato de cálcio é seleccionado entre o fosfato tricálcico. 7 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Numa concretização de todos os aspectos do invento, o factor PDGF inclui os homodímeros e heterodímeros de PDGF, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD e suas combinações e derivados.

Numa concretização de todos os aspectos do invento, o veiculo farmaceuticamente aceitável do material de implante é, ou inclui adicionalmente, um ou mais dos seguintes elementos: um aglutinante biocompatível (por exemplo, um polímero natural ou sintético), um agente substituto de osso, um líquido e um gel. Em outra concretização preferida, o material de implante inclui o PDGF presente num veículo líquido farmaceuticamente aceitável, que é adsorvido por um veículo sólido farmaceuticamente aceitável.

Em outra concretização de todos os aspectos do invento, o material de implante é preparado mediante a combinação de PDGF isolado, parcialmente purificado, substancialmente purificado ou purificado, numa quantidade no intervalo compreendido entre 0,1 e 1,0 mg/ml, mais preferencialmente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, mais preferencialmente ainda 0,3 mg/ml, ou mesmo menos de 0,1 mg/ml, com um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um aglutinante biocompatível, como seja um polímero natural ou sintético (por exemplo, o colagénio, o poli(ácido glicólico) e o poli(ácido láctico)), um agente substituto de osso (por exemplo, um fosfato de cálcio (por exemplo, o fosfato tricálcico ou a hidroxiapatite), sulfato de cálcio ou osso desmineralizado (por exemplo, osso cortical ou canceloso desmineralizado e liofilizado), ou um gel ou líquido comercialmente disponível (isto é, um líquido ou gel viscoso ou inerte).

Em várias concretizações, o veículo do material de implante é, ou inclui adicionalmente, um ou mais aglutinantes biocompatíveis. Um aglutinante biocompatível é um agente que produz ou promove a coesão entre as substâncias combinadas. Exemplos não limitativos de aglutinantes biocompatíveis adequados incluem polímeros seleccionados entre polissacáridos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, proteínas, polipéptidos, poli(α-hidroxiácidos), poli (lactonas), poli(aminoácidos), poli(anidridos), 8 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ poli (ortoésteres), poli(anidrido-co-imidas), poli (ortocarbonatos), poli(a-hidroxialcanoatos) , poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres) , poli(ácido láctico), poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(L-lactida-co-D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-carbonato de trimetileno), poli(ácido glicólico), poli(hidroxibutirato) (PHB), poli (ε-caprolactona), poli (δ-valerolactona) , poli(γ-butirolactona) , poli(caprolactona) , poli(ácido acrílico), ácido policarboxílico, poli (cloridrato de alilamina) , poli (cloreto de dialildimetilamónio), poli(etilenimina), poli(fumarato de propileno), poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, polietileno, poli(metacrilato de metilo), fibras de carbono, poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno), poli (álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), copolímeros de blocos de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno), poli(tereftalato de etileno)poliamida e seus copolímeros e misturas. Os aglutinantes adicionais incluem ácido algínico, goma-arábica, goma de guár, goma xantana, gelatina, quitina, quitosano, acetato de quitosano, lactato de quitosano, sulfato de condroitina, N, O-carboximetilquitosano, um dextrano (por exemplo, a-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina ou sulfato de dextrano sódico), cola de fibrina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato de sódio, uma celulose, (por exemplo, metilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose ou hidroxietilcelulose), uma glucosamina, um proteoglicano, um amido (por exemplo, o hidroxietilamido ou amido solúvel), o ácido láctico, um Pluronic, o glicerofosfato de sódio, o colagénio, o glicogénio, a queratina, a seda e seus derivados e misturas. 0 aglutinante biocompatível é preferencialmente o hialuronato de sódio ou seus derivados. Também preferido, o aglutinante biocompatível é o ácido hialurónico. Numa concretização adicionalmente preferida, o aglutinante biocompatível é seleccionado entre metilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou hidroxietilcelulose, em particular, carboximetilcelulose.

Em algumas concretizações, o aglutinante biocompatível é solúvel em água. Um aglutinante solúvel em água dissolve-se a 9 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ partir do material de implante pouco depois do seu implante in vivo, introduzindo, desse modo, uma macroporosidade no material de implante. Esta macroporosidade aumenta a osteocondutividade do material de implante ao melhorar o acesso e, por conseguinte, a actividade de remodelação dos osteoclastos e osteoblastos no local de implante. 0 aglutinante biocompatível poderá ser adicionado ao material de implante em quantidades variáveis e numa variedade de etapas durante a preparação da composição. Os peritos na arte serão capazes de determinar a quantidade de aglutinante e o método de inclusão necessário para uma dada aplicação.

Numa concretização, o veiculo é ou inclui um liquido seleccionado entre a água, um tampão e um meio de cultura celular. 0 liquido poderá ser utilizado em qualquer gama de pH, embora seja mais frequentemente utilizado na gama de pH compreendida entre pH 5,0 e pH 8,0. Numa concretização, o pH será compatível com a estabilidade prolongada e a eficácia do PDGF presente no material de implante, ou com a estabilidade prolongada e a eficácia de outro agente biologicamente activo desejado. Na maioria das concretizações, o pH do líquido encontrar-se-á na gama de pH compreendida entre pH 5,5 e pH 7,4. Os tampões adequados incluem, embora não estejam limitados a estes, os carbonatos, os fosfatos (por exemplo, a solução salina tamponada com fosfato) e os tampões orgânicos como Tris, HEPES e MOPS. Mais frequentemente, o tampão será seleccionado pela sua biocompatibilidade com os tecidos do hospedeiro e pela sua compatibilidade com o agente biologicamente activo. Para a maioria das aplicações em que estão incluídos ácidos nucleicos, péptidos ou antibióticos no material de implante, uma simples solução salina tamponada com fosfato será suficiente.

Em outra concretização de todos os aspectos do invento, o veículo do material de implante é, ou inclui adicionalmente, um ou mais agentes substitutos de osso. Um agente substituto de osso é um agente que pode ser utilizado para substituir temporária ou permanentemente o osso. Após o implante, o agente substituto de osso pode ser conservado pelo corpo ou pode ser reabsorvido pelo corpo e substituído por osso. Os 10 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ agentes substitutos de osso incluem um fosfato de cálcio, nomeadamente um fosfato tricálcico, nomeadamente o β-TCP.

Numa concretização, o veículo é biorreabsorvível. Em outra concretização, o agente substituto de osso é disponibilizado como uma matriz de partículas de tamanho micrométrico ou submicrométrico, por exemplo, partículas de dimensões nanométricas. As partículas podem encontrar-se na gama de tamanhos compreendida entre cerca de 100 μιη e cerca de 5000 μιη, mais preferencialmente na gama compreendida entre cerca de 200 μιη e cerca de 3000 μιη, ainda mais preferencialmente na gama compreendida entre cerca de 250 μιη e cerca de 2000 μιη, ou as partículas podem encontrar-se na gama compreendida entre cerca de 1 nm e cerca de 1000 nm, preferencialmente na gama inferior a cerca de 500 nm, mais preferencialmente na gama inferior a cerca de 250 nm. Em outra concretização, o agente substituto de osso possui uma composição porosa. A porosidade da composição é uma característica desejável, uma vez que facilita a migração e a infiltração das células na composição, de modo que as células possam segregar matriz óssea extracelular. Ela também fornece o acesso para a vascularização. A porosidade proporciona igualmente uma área superficial elevada para uma reabsorção e uma libertação melhoradas das substâncias activas, assim como uma maior interacção célula-matriz. Preferencialmente, a composição possui uma porosidade superior a 40%, mais preferencialmente superior a 65%, ainda mais preferencialmente superior a 90%. A composição pode ser disponibilizada sob uma forma apropriada para o implante (por exemplo, uma esfera, um cilindro ou um bloco) ou pode ser dimensionada e adaptada antes da utilização. O agente substituto de osso é um fosfato de cálcio, nomeadamente o β-TCP.

Preferencialmente, o agente substituto de osso é o fosfato tricálcico beta (β-TCP). O β-TCP compreende preferencialmente uma matriz de partículas de tamanho micrométrico ou submicrométrico que, em particular, possuem um tamanho inferior a cerca de 5000 μπι. Preferencialmente, as partículas de β-TCP possuem um tamanho na gama compreendida entre cerca de 100 e cerca de 5000 μιη, mais preferencialmente entre cerca de 100 e cerca de 3000 μιη, ainda mais 11 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ preferencialmente entre cerca de 250 e cerca de 2000 μιη. As partículas de β-TCP são preferencialmente porosas, em particular, possuem uma porosidade superior a 40%, mais preferencialmente uma porosidade superior a 65% e, ainda mais preferencialmente, uma porosidade superior a 90%. O β-TCP pode ser disponibilizado sob uma forma apropriada para o implante, em particular, uma esfera, um cilindro ou um bloco. O agente substituto de osso também pode ser disponibilizado sob a forma de uma pasta ou massa moldável e fluida. Preferencialmente, o agente substituto de osso é uma pasta de fosfato de cálcio gue auto-endurece para formar um fosfato de cálcio endurecido, antes ou após o implante in vivo. Um componente à base de fosfato de cálcio poderá ser gualguer material de fosfato de cálcio biocompatível conhecido na arte. O material de fosfato de cálcio poderá ser produzido por meio de qualguer um de uma variedade de métodos e utilizando quaisquer componentes de partida adequados. Por exemplo, o material de fosfato de cálcio poderá incluir fosfato de cálcio apatítico amorfo. O material de fosfato de cálcio poderá ser produzido através da reacção ácido-base no estado sólido de reagentes de fosfato de cálcio cristalino para formar sólidos de hidroxiapatite cristalina. Outros métodos de preparação de materiais de fosfato de cálcio são conhecidos na arte, alguns dos quais estão descritos abaixo. O material de fosfato de cálcio pode ser o fosfato de cálcio apatítico fracamente cristalino (PCA de "Poorly

Crystalline Apatitic") ou a hidroxiapatite (HA) . O material PCA está descrito nos pedidos de patente U.S. 5,650,176; 5,783,217; 6,027,742; 6,214,368; 6,287,341; 6,331,312 e 6,541,037. A HA está descrita, por exemplo, nas patentes U.S. Re. 33,221 e Re. 33,161. Estas patentes descrevem a preparação de composições de remineralização de fosfato de cálcio e de um veículo de hidroxiapatite gradualmente reabsorvível, não cerâmico e finamente cristalino à base da mesma composição de fosfato de cálcio. Um sistema similar de fosfato de cálcio, que consiste em fosfato tetracálcico (TTCP) e fosfato monocálcico (MCP), ou na sua forma mono-hidratada, está descrito nas patentes U.S. 5,053,212 e 5,129,905. Este material de fosfato de cálcio é produzido por reacção ácido- 12 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ base no estado sólido de reagentes de fosfato de cálcio cristalino para formar sólidos de hidroxiapatite cristalina.

Os materiais de HA cristalina (normalmente designada por "dahllite") poderão ser preparados de modo a serem fluidos, moldáveis e capazes de endurecimento in situ (ver patente U.S. 5,962,028). Estes materiais de HA (habitualmente designados por hidroxiapatite carbonatada) podem ser formados mediante combinação dos reagentes com um líquido não aquoso para fornecer uma mistura substancialmente uniforme, moldagem da mistura conforme apropriado e permissão para que a mistura endureça na presença de água (por exemplo, antes ou após o implante). Durante o endurecimento, a mistura cristaliza numa estrutura apatítica sólida e essencialmente monolítica.

Os reagentes consistirão geralmente numa fonte de fosfato, por exemplo, ácido fosfórico ou sais fosfato, essencialmente isenta de água, uma fonte de um metal alcalino-terroso, particularmente o cálcio, opcionalmente núcleos cristalinos, em particular cristais de hidroxiapatite ou fosfato de cálcio, carbonato de cálcio e um lubrificante fisiologicamente aceitável, como seja qualquer um dos líquidos não aquosos aqui descritos. Os ingredientes secos poderão ser pré-preparados como uma mistura e subsequentemente combinados com os ingredientes líquidos não aquosos, em condições nas quais tem lugar uma mistura substancialmente uniforme. O material de fosfato de cálcio é caracterizado pela sua reabsorvibilidade biológica, a sua biocompatibilidade e a sua cristalinidade mínima. O seu carácter cristalino é substancialmente o mesmo do osso natural. De preferência, o material de fosfato de cálcio endurece em menos de cinco horas e endurece substancialmente em cerca de uma a cinco horas, em condições fisiológicas. Preferencialmente, o material é substancialmente endurecido no período de cerca de 10-30 minutos. A velocidade de endurecimento em condições fisiológicas poderá ser variada de acordo com a necessidade terapêutica, mediante a modificação de alguns parâmetros simples conforme descrito na patente U.S. 6,027,742.

Numa concretização, o material de fosfato de cálcio com biorreabsorvível resultante será "deficiente em cálcio" 13 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ uma razão molar de cálcio para fosfato inferior a cerca de 1,6 em comparação com o valor estequiométrico ideal de aproximadamente 1,67 para a hidroxiapatite.

Os fosfatos de cálcio desejáveis são capazes de endurecer num ambiente húmido, à temperatura corporal ou à volta dela, em menos de 5 horas e, preferencialmente, no período de 10-30 minutos. Os materiais desejáveis são aqueles que, quando são implantados como uma pelete com 1-5 g, são pelo menos 80% reabsorvidos no período de um ano. Preferencialmente, o material pode ser totalmente reabsorvido.

Em várias concretizações de todos os aspectos do invento, o material de implante poderá incluir adicionalmente um ou mais agentes biologicamente activos. Os agentes biologicamente activos que podem ser incorporados nos materiais de implante do invento incluem, sem limitação, moléculas orgânicas, materiais inorgânicos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (por exemplo, genes, fragmentos de genes, sequências reguladoras de genes e moléculas anti-sentido), nucleoproteínas, polissacáridos, glicoproteínas e lipoproteínas. As classes de compostos biologicamente activos que podem ser incorporados nos materiais de implante do invento incluem, sem limitação, agentes anticancerosos, antibióticos, analgésicos, agentes anti-inflamatórios, imunossupressores, inibidores de enzimas, anti-histamínicos, anticonvulsivos, hormonas, relaxantes musculares, antiespasmódicos, agentes oftálmicos, prostaglandinas, antidepressivos, substâncias antipsicóticas, factores tróficos, proteínas osteoindutoras, factores de crescimento e vacinas.

Os agentes anticancerosos incluem agentes alquilantes, agentes de platina, antimetabolitos, inibidores de topoisomerases, antibióticos antitumorais, agentes antimitóticos, inibidores da aromatase, inibidores da timidilato-sintase, antagonistas do ADN, inibidores da farnesil-transferase, inibidores da bomba, inibidores de histona-acetiltransferases, inibidores de metaloproteinases, inibidores da ribonucleósido-redutase, agonistas/ antagonistas de TNF-α, antagonistas do receptor da endotelina A, agonistas do receptor do ácido retinóico, imunomoduladores, agentes 14 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ hormonais e anti-hormonais, agentes fotodinâmicos e inibidores de tirosina-quinases.

Qualquer um dos agentes biologicamente activos enumerados na Tabela 1 pode ser utilizado.

Tabela 1.

Agentes alquilantes ciclofosfamida bussulfano ifosfamida melfalano hexametilmelamina tiotepa clorambucilo dacarbazina carmustina lomustina procarbazina altretamina fosfato de estramustina mecloretamina estreptozocina temozolomida semustina Agentes de platina cisplatina oxaliplatina espiroplatina carboxiftalatoplatina tetraplatina ormiplatina iproplatina carboplatina ZD-0473 (AnorMED) lobaplatina (Aeterna) satraplatina (Johnson Matthey) BBR-3464 (Hoffmann-La Roche) SM-11355 (Sumitomo) AP-5280 (Access) Antimetabolitos azacitidina gemcitabina capecitabina 5- fluorouracilo floxuridina 2-clorodesoxiadenosina 6- mercaptopurina 6-tioguanina citarabina 2-fluorodesoxicitidina metotrexato edatrexato tomudex trimetrexato desoxicoformicina fludarabina pentostatina raltitrexed hidroxiureia decitabina (SuperGen) clofarabina (Bioenvision) irofulveno (MGI Pharma) DMDC (Hoffmann-La Roche) etinilcitidina (Taiho) 15 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Inibidores de tοροίsomerases amsacrina epirrubicina etoposido teniposido ou mitoxantrona irinotecano (CPT-11) 7-etil-l0-hidroxi-camptotecina topotecano dexrazoxano (TopoTarget) pixantrona (Novuspharma) análogo de rebecamicina (Exelixis) BBR-3576 (Novuspharma) rubitecano (SuperGen) mesilato de exatecan (Daiichi) quinamed (ChemGenex) gimatecano (Sigma-Tau) diflomotecano (Beaufour-Ipsen) TAS-103 (Taiho) elsamitrucina (Spectrum) J-107088 (Merck & Co) BNP-1350 (BioNumerik) CKD-602 (Chong Kun Dang) KW-2170 (Kyowa Hakko) Antibióticos antitumorais dactinomicina (actinomicina D) doxorrubicina (adriamicina) desoxirrubicina valrubicina daunorrubicina (daunomicina) epirrubicina terarrubicina idarrubicina rubidazona plicamicina porfiromicina cianomorfolinodoxorrubicina mitoxantrona (novantrone) amonafida azonafida antrapirazol oxantrazol losoxantrona sulfato de bleomicina (blenoxane) ácido bleomicinico bleomicina A bleomicina B mitomicina C MEN-10755 (Menarini) GPX-100 (Gem Pharmaceuticals) 16 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Agentes antimitóticos paclitaxel docetaxel colchicina vinblastina vincristina vinorelbina vindesina dolastatina 10 (NCI) rizoxina (Fujisawa) mivobulina (Warner-Lambert) cemadotina (BASF) RPR 109881A (Aventis) TXD 258 (Aventis) epotilona B (Novartis) T 900607 (Tularik) T 138067 (Tularik) criptoficina 52 (Eli Lilly) vinflunina (Fabre) auristatina PE (Teikoku Hormone) BMS 247550 (BMS) BMS 184476 (BMS) BMS 188797 (BMS) taxoprexine (Protarga) SB 408075 (GlaxoSmithKline) E7010 (Abbott) PG-TXL (Cell Therapeutics) IDN 5109 (Bayer) A 105972 (Abbott) A 204197 (Abbott) LU 223651 (BASF) D 24851 (ASTAMedica) ER-86526 (Eisai) combretastatina A4 (BMS) isohomo-halicondrina B (PharmaMar) ZD 6126 (AstraZeneca) PEG-paclitaxel (Enzon) AZ10992 (Asahi) IDN-5109 (Indena) AVLB (Prescient NeuroPharma) azaepotilona B (BMS) BNP-7787 (BioNumerik) prodroga CA-4 (OXiGENE) dolastatina 10 (NIH) CA-4 (OXiGENE) Inibidores da aromatase aminoglutetimida letrozol anastrazol formestano exemestano atamestano (BioMedicines) YM-511 (Yamanouchi) Inibidores da timidilato- sintase pemetrexed (Eli Lilly) ZD-9331 (BTG) nolatrexed (Eximias) CoFactor™ (BioKeys) Antagonistas do ADN trabectedina (PharmaMar) glufosfamida (Baxter International) albumina + 32P (Isotope Solutions) timectacina (NewBiotics) edotreotide (Novartis) mafosfamida (Baxter International) apaziquone(Spectrum Pharmaceuticals) 06-benzilguanina (Paligent) Inibidores da farnesil-transferase arglabina (NuOncology Labs) lonafarnib (Schering-Plough) BAY-43-9006 (Bayer) tipifarnib (Johnson & Johnson) álcool perililico (DOR BioPharma) 17 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Inibidores da bomba CBT-1 (CBA Pharma) tariquidar (Xenova) MS-209 (Schering AG) tricloridrato de zosuquidar (Eli Lilly) dicitrato de biricodar (Vertex) Inibidores de histona- acetiltransferase tacedinalina (Pfizer) SAHA (Aton Pharma) MS-275 (Schering AG) butirato de pivaloiloximetilo (Titan) depsipéptido (Fujisawa) Inibidores de metaloproteinases Neovastat (Aeterna Laboratories) marimastat (British Biotech) CMT-3 (CollaGenex) BMS-275291 (Celltech) Inibidores da ribonucleósido- redutase maltolato de gálio (Titan) triapina (Vion) tezacitabina (Aventis) didox (Molecules for Health) Agonistas/ antagonistas de TNF-a virulizin (Lorus Therapeutics) CDC-394 (Celgene) infliximab (Centocor, Inc.) adalimumab (Abbott Laboratories) revimid (Celgene) etanercept (Immunex Corp.) Antagonistas do receptor da endotelina A atrasentan (Abbott) ZD-4054 (AstraZeneca) YM-598 (Yamanouchi) Agonistas do receptor do ácido retinóico fenretinide (Johnson & Johnson) LGD-1550 (Ligand) alitretinoina (Ligand) 18 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Imunomoduladores interferão oncophage (Antigenics) GMK (Progénies) vacina de adenocarcinoma (Biomira) CTP-37 (AVI BioPharma) IRX-2 (Immuno-Rx) PEP-005 (Peplin Biotech) vacinas synchrovax (CTL Immuno) vacina do melanoma (CTL Immuno) vacina p21 RAS (GemVax) terapia com dexosomas (Anosys) pentrix (Australian Câncer Technology) ISF-154 (Tragen) vacina do cancro (Intercell) norelin (Biostar) BLP-25 (Biomira) MGV (Progénies) β-alethine (Dovetail) terapia para LLC (Vasogen) Agentes hormonais e anti-hormonais estrogénios estrogénios conjugados etinilestradiol clorotrianiseno dienestrol caproato de hidroxiprogesterona medroxiprogesterona testosterona propionato de testosterona fluoximesterona metiltestosterona dietilestilbestrol megestrol tamoxifeno toremifeno dexametasona prednisona metilprednisolona prednisolona aminoglutetimida leuprolide goserelina leuprorrelina bicalutamida flutamida octreotide nilutamida mitotano P-04 (Novogen) 2-metoxiestradiol (EntreMed) arzoxifeno (Eli Lilly) Agentes fotodinâmicos talaporfina (LightSciences) Theralux (Theratechnologies motexafina gadolinio (Pharmacyclics) Pd-bacteriofeoforbida (Yeda) texafirina de lutécio (Pharmacyclics) hipericina 19 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Inibidores de imatinib (Novartis) kahalide F (PharmaMar) tirosina-quinases leflunomida CEP-701 (Cephalon) (Sugen/Pharmacia) CEP-751 (Cephalon) ZD1839 (AstraZeneca) MLN518 (Millenium) erlotinib (Oncogene PKC412 (Novartis) Science) fenoxodiol canertinib (Pfizer) trastuzumab (Genentech) esqualamina (Genaera) C225 (ImClone) SU5416 (Pharmacia) rhu-Mab (Genentech) SU6668 (Pharmacia) MDX-H210 (Medarex) ZD4190 (AstraZeneca) 2C4 (Genentech) ZD6474 (AstraZeneca) MDX-447 (Medarex) vatalanib (Novartis) ABX-EGF (Abgenix) PKI166 (Novartis) GW2016 (GlaxoSmithKline) EKB-509 (Wyeth) EKB-569 (Wyeth) IMC-1C11 (ImClone)

Os antibióticos incluem os aminoglicósidos (por exemplo, gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amicacina, neomicina), bacitracina, os carbapenemos (por exemplo, imipenem/cilastatina), as cefalosporinas, a colistina, a metenamina, os monobactamos (por exemplo, o aztreonam), as penicilinas (por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina), a polimixina B, as quinolonas e a vancomicina; e os agentes bacteriostáticos como cloranfenicol, clindamicina, os macrólidos (por exemplo, eritromicina, azitromicina, claritromicina), lincomicina, nitrofurantoina, as sulfonamidas, as tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclociclina) e a trimetoprima. Estão também incluídos o metronidazol, as fluoroquinolonas e a rifampicina.

Os inibidores de enzimas são substâncias que inibem uma reacção enzimática. Os exemplos de inibidores de enzimas incluem cloreto de edrofónio, N-metilfisostigmina, brometo de neostigmina, sulfato de fisostigmina, tacrina, maleato de 1-hidroxitacrina, iodotubercidina, p-bromotetramisol, cloridrato de 10-(alfa-dietilamino-propionil)fenotiazina, cloreto de calmidazólio, hemicolínio-3, 3,5-dinitrocatecol, inibidor I da diacilglicerol-quinase, inibidor II da diacilglicerol-quinase, 20 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 3-fenilpropargilamina, acetato de N6-monometil-L-arginina, carbidopa, 3-hidroxibenzil-hidrazina, hidralazina, clorgilina, deprenil, hidroxilamina, fosfato de iproniazida, 6-MeO-tetrahidro-9H-pirido-indol, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbazida, tranilcipromina, cloridrato de N,N-dietilaminoetil-2,2-difenilvalerato, 3-isobutil-1- metilxantina, papaverina, indometacina, cloridrato de 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina, 2, 3-dicloro-a-metilbenzilamina (DCMB), cloridrato de 8,9-dicloro-2,3,4,5-tetra-hidro-lH-2-benzazepina, p-aminoglutetimida, tartarato de p-aminoglutetimida, 3-iodotirosina, alfa-metiltirosina, acetazolamida, diclorfenamida, 6-hidroxi-2- benzotiazolsulfonamida e alopurinol.

Os anti-histamínicos incluem a pirilamina, a clorfeniramina e a tetra-hidrazolina, entre outros.

Os agentes anti-inflamatórios incluem os corticosteróides, os fármacos anti-inflamatórios não esteróides (por exemplo, a aspirina, a fenilbutazona, a indometacina, o sulindac, a tolmetina, o ibuprofeno, o piroxicam e os fenamatos), o acetaminofeno, a fenacetina, os sais de ouro, a cloroquina, a D-penicilamina, o metotrexato, a colchicina, o alopurinol, o probenecid e a sulfinpirazona.

Os relaxantes musculares incluem a mefenesina, o metocarbamol, o cloridrato de ciclobenzaprina, o cloridrato de tri-hexifenidilo, a levodopa/carbidopa e o biperideno.

Os antiespasmódicos incluem a atropina, a escopolamina, o oxifenónio e a papaverina.

Os analgésicos incluem a aspirina, a fenilbutazona, a indometacina, o sulindac, a tolmetina, o ibuprofeno, o piroxicam, os fenamatos, o acetaminofeno, a fenacetina, o sulfato de morfina, o sulfato de codeína, a meperidina, a nalorfina, os opióides (por exemplo, o sulfato de codeína, o citrato de fentanilo, o bitartarato de hidrocodona, a loperamida, o sulfato de morfina, a noscapina, a norcodeína, a normorfina, a tebaína, a nor-binaltorfimina, a buprenorfina, a clornaltrexamina, a funaltrexamiona, a nalbufina, a nalorfina, 21 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ a naloxona, a naloxonazina, a naltrexona e o naltrindol), a procaína, a lidocaína, a tetracaína e a dibucaína.

Os agentes oftálmicos incluem a fluoresceína de sódio, o rosa de bengala, a metacolina, a adrenalina, a cocaína, a atropina, a alfa-quimotripsina, a hialuronidase, o betaxolol, a pilocarpina, o timolol, os sais de timolol e suas combinações.

As prostaglandinas são reconhecidas na arte e são uma classe de ácidos gordos hidroxilados de cadeia longa, quimicamente relacionados e de ocorrência natural que possuem uma variedade de efeitos biológicos.

Os antidepressivos são substâncias capazes de prevenir ou aliviar a depressão. Os exemplos de antidepressivos incluem a imipramina, a amitriptilina, a nortriptilina, a protriptilina, a desipramina, a amoxapina, a doxepina, a maprotilina, a tranilcipromina, a fenelzina e a isocarboxazida.

Os factores de crescimento são factores cuja presença continuada melhora a viabilidade ou a longevidade de uma célula. Os factores tróficos incluem, sem limitação, a proteína activadora de neutrófilos, a proteína quimioatractora de monócitos, a proteína inflamatória de macrófagos, o factor plaquetário, a proteína básica de plaquetas e a actividade estimuladora de crescimento do melanoma; o factor de crescimento epidérmico, o factor de crescimento transformante (alfa), o factor de crescimento dos fibroblastos, o factor de crescimento das células endoteliais derivado de plaquetas, o factor de crescimento análogo à insulina (IGF, por exemplo, IGF-I ou IGF-II), o factor neurotrófico derivado de células da glia, o factor neurotrófico ciliar, o factor de crescimento nervoso, o factor indutor de cartilagem/crescimento ósseo (alfa e beta), as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), as interleucinas (por exemplo, inibidores de interleucinas ou receptores de interleucinas, incluindo a interleucina 1 até à interleucina 10), os interferões (por exemplo, o interferão alfa, beta e gama), os factores hematopoiéticos, incluindo a eritropoietina, o factor estimulante de colónias de granulócitos, o factor estimulante de colónias de macrófagos e o factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos, 22 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ os factores de necrose tumoral, os factores de crescimento transformantes (beta), incluindo beta-1, beta-2 e beta-3, os factores de crescimento transformantes (alfa), a inibina e a activina; e as proteínas morfogenéticas ósseas como OP-1, BMP-2 e BMP-7.

As hormonas incluem os estrogénios (por exemplo, estradiol, estrona, estriol, dietilestilbestrol, quinestrol, clorotrianiseno, etinilestradiol, mestranol), os antiestrogénios (por exemplo, o clomifeno, o tamoxifeno) , as progestinas (por exemplo, medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), uma antiprogestina (mifepristona) , os androgénios (por exemplo, o cipionato de testosterona, a fluoximesterona, o danazol, a testolactona), os antiandrogénios (por exemplo, o acetato de ciproterona, a flutamida), as hormonas tiroideias (por exemplo, a triiodotironina, a tiroxina, o propiltiouracilo, o metimazol e iodixode) e as hormonas pituitárias (por exemplo, a corticotropina, a somatotropina, a oxitocina e a vasopressina). As hormonas são habitualmente empregues em terapia de substituição hormonal e/ou para fins de controlo de natalidade. As hormonas esteróides, como a prednisona, também são utilizadas como imunossupressores e anti-inflamatórios.

0 agente biologicamente activo também é desejavelmente seleccionado entre a família de proteínas conhecida por superfamília de factores de crescimento transformantes beta (TGF-β), que inclui as activinas, as inibinas e as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP). Em uma concretização, o agente activo inclui pelo menos uma proteína seleccionada entre a subclasse de proteínas conhecidas de um modo geral por BMP, cuja actividade osteogénica, além de outras actividades do tipo crescimento e diferenciação foi constatada. Estas BMP incluem as proteínas BMP BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 e BMP-7, descritas, por exemplo, nas patentes U.S. 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076 e 5,141,905; BMP-8, descrita na publicação PCT WO91/18098; e BMP-9, descrita na publicação PCT W093/00432, BMP-10, descrita no pedido PCT W094/26893; BMP-11, descrita no pedido PCT W094/26892 ou BMP-12 ou BMP-13, descritas no pedido PCT WO95/16035; BMP-14; BMP-15, descrita na patente U.S. 5,635,372; ou BMP-16, descrita na patente U.S. 5,965,403. Outras proteínas TGF-β que 23 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ poderão ser úteis como agente activo nas composições de fosfato de cálcio do invento incluem Vgr-2, Jones et al., Mol. Endocrinol. 6:1961 (1992), e qualquer um dos factores de crescimento e diferenciação (GDF de "Growth and Differentiation Factors"), incluindo aqueles descritos nos pedidos PCT W094/15965; W094/15949; W095/01801; W095/01802; W094/21681; W094/15966; WO95/10539; WO96/01845; WO96/02559 e outros. Igualmente úteis no invento poderão ser a proteína BIP, descrita em WO94/01557; a proteína HP00269, descrita na publicação japonesa n.2 7-250688; e a proteína MP52, descrita no pedido PCT WO93/16099.

Um subconjunto de BMP que podem ser utilizadas no invento inclui BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, BMP-14 e MP52. O agente activo é mais preferencialmente BMP-2, cuja sequência está descrita na patente U.S. 5,013,649.

Outros agentes osteogénicos conhecidos na arte também podem ser utilizados, tais como o teriparatide (Forteo™), Chrysalin®, a prostaglandina E2, a proteína LIM, a osteogenina ou a matriz óssea desmineralizada (DBM de "Demineralized Bone Matrix"), entre outros. O agente biologicamente activo poderá ser sintetizado quimicamente, produzido de forma recombinante ou purificado a partir de uma fonte na qual o agente biologicamente activo é naturalmente encontrado. O agente activo, caso seja um TGF-β, tal como uma BMP ou outra proteína dimérica, poderá ser homodimérico ou poderá ser heterodimérico com outras BMP (por exemplo, um heterodímero constituído por um monómero de cada uma das proteínas BMP-2 e BMP-6) ou com outros membros da superfamília TGF-β, como as activinas, as inibinas e o TGF- Pi (por exemplo, um heterodímero constituído por um monómero de uma BMP e um monómero de um membro relacionado da superfamília TGF-β). Exemplos destas proteínas heterodiméricas estão descritos, por exemplo, no pedido de patente PCT publicado WO 93/09229.

Agentes biologicamente activos adicionais incluem as proteínas Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus e Follistatin. Estas famílias de proteínas estão descritas, de 24 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ uma forma geral, em Sasai et al., Cell 79:779-790 (1994) (Chordin); publicação de patente PCT W094/05800 (Noggin) e Fukui et al., Devei. Biol. 159:131 (1993) (Follistatin) . As proteínas Hedgehog estão descritas em W096/16668; W096/17924; e W095/18856. A família de proteínas Frazzled é uma família de proteínas descoberta recentemente, que possui uma homologia elevada com o domínio de ligação extracelular da família de proteínas receptoras conhecida por Frizzled. A família Frizzled de genes e proteínas está descrita em Wang et al., J. Biol. Chem. 271:4468-4476 (1996). O agente activo também poderá incluir outros receptores solúveis, como sejam os receptores solúveis truncados descritos na publicação de patente PCT WO95/07982. A partir dos ensinamentos de WO95/07982, um perito na arte reconhecerá que é possível preparar receptores solúveis truncados para muitas outras proteínas receptoras. As publicações acima referidas estão aqui incorporadas por meio de referência. A quantidade da proteína biologicamente activa, por exemplo, uma proteína osteogénica, que é eficaz para estimular uma actividade desejada, por exemplo, uma maior actividade osteogénica das células progenitoras presentes ou infiltrantes ou de outras células, dependerá do tamanho e da natureza do defeito em tratamento, assim como do veículo empregue. Geralmente, a quantidade de proteína a distribuir encontra-se no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e cerca de 100 mg; preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 100 mg; mais preferencialmente entre cerca de 10 e cerca de 80 mg.

Os protocolos e regimes padrão para distribuição dos agentes acima referidos são conhecidos na arte. Os agentes biologicamente activos são introduzidos no material de implante, em quantidades que permitem a distribuição de uma dose apropriada do agente no local de implante. Na maioria dos casos, as doses são determinadas utilizando directrizes conhecidas pelos médicos e aplicáveis ao agente particular em questão. A quantidade exemplificativa de agente biologicamente activo que será incluída no material de implante do invento depende provavelmente de variáveis como o tipo e a extensão da condição, o estado de saúde geral do doente particular, a formulação do agente activo e a biorreabsorvibilidade do veículo de distribuição utilizado. É possível utilizar ensaios 25 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ clínicos padrão para optimizar a dose e a frequência de doseamento para qualquer agente biologicamente activo particular.

Numa concretização de todos os aspectos do invento, a composição pode conter adicionalmente medula óssea autóloga ou extractos de plaquetas autólogas.

Em outra concretização de todos os aspectos acima, o PDGF e/ou os outros factores de crescimento podem ser obtidos a partir de fontes naturais (por exemplo, as plaquetas) ou, mais preferencialmente, podem ser produzidos por tecnologia de ADN recombinante. Quando obtidos a partir de fontes naturais, o PDGF e/ou os outros factores de crescimento podem ser obtidos a partir de um fluido biológico. Um fluido biológico inclui qualquer fluido tratado ou não tratado (incluindo uma suspensão) associado aos organismos vivos, em particular o sangue, incluindo o sangue completo, o sangue quente ou frio e o sangue fresco ou armazenado; o sangue tratado, como seja o sangue diluído com pelo menos uma solução fisiológica, incluindo, embora não limitada a, solução salina, solução nutriente e/ou solução anticoagulante; os componentes do sangue, tais como o concentrado de plaquetas (CP), as plaquetas de aférese, o plasma rico em plaquetas (PRP), o plasma pobre em plaquetas (PPP), o plasma isento de plaquetas, o plasma, o soro, o plasma fresco congelado (PFC), os componentes obtidos a partir do plasma, o concentrado de glóbulos vermelhos (CGV), a camada leucoplaquetária (CL); os produtos sanguíneos derivados do sangue ou de um componente do sangue ou derivados da medula óssea; os glóbulos vermelhos separados do plasma e ressuspensos em fluido fisiológico; e as plaquetas separadas do plasma e ressuspensas em fluido fisiológico. 0 fluido biológico poderá ter sido tratado para remover alguns dos leucócitos, antes de ser processado de acordo com o invento. Tal como aqui utilizado, o termo produto sanguíneo ou fluido biológico refere-se aos componentes descritos acima e a produtos sanguíneos ou fluidos biológicos similares obtidos por outros meios e com propriedades similares. Em uma concretização, o PDGF é obtido a partir de plasma rico em plaquetas (PRP) . A preparação do PRP está descrita, por exemplo, nas patentes U.S. 6,649,072, 6,641,552, 6, 613, 566, 6, 592,507, 6, 558,307, 6, 398, 972 e 5, 599, 558. 26 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Numa concretização de todos os aspectos do invento, o material de implante distribui PDGF no local de implante durante um período de tempo superior a pelo menos 1 dia. Em várias concretizações, o material de implante distribui PDGF no local de implante durante pelo menos 7, 14, 21 ou 28 dias. Preferencialmente, o material de implante distribui PDGF no local de implante durante um período de tempo compreendido entre cerca de 1 dia e 7, 14, 21 ou 28 dias. Em outra concretização, o material de implante distribui PDGF no local de implante durante um período de tempo superior a cerca de 1 dia, mas inferior a cerca de 14 dias. 0 termo "biorreabsorvível" pretende designar a capacidade do material de implante para ser reabsorvido ou remodelado in vivo. 0 processo de reabsorção envolve a degradação e a eliminação do material de implante original através da acção dos fluidos, enzimas ou células do corpo. Os materiais reabsorvidos poderão ser utilizados pelo hospedeiro na formação de tecido novo, poderão ser reutilizados de outra forma pelo hospedeiro ou poderão ser excretados. 0 termo "factor de diferenciação" pretende designar um polipéptido, incluindo uma cadeia com pelo menos 6 aminoácidos, que estimula a diferenciação de uma ou mais células-alvo em células com potencial para a formação de cartilagem ou osso. 0 termo "partícula de dimensões nanométricas" pretende designar uma partícula de dimensões submicrométricas, geralmente definida como sendo uma partícula inferior a 1000 nanómetros. Uma partícula de dimensões nanométricas é um material do tipo partícula sólida que está num estado intermédio entre uma substância molecular e uma substância macro. Um nanómetro é definido como a milésima milionésima parte de um metro (1 nanómetro = 1CT9 m) . 0 material nanométrico é conhecido como o pó, a fibra, o filme ou o bloco que possui um tamanho à nanoescala. 0 termo "periodonto" pretende designar os tecidos que rodeiam e sustentam os dentes. 0 periodonto sustenta, protege e fornece nutrição aos dentes. 0 periodonto consiste em osso, 27 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ cemento, processo alveolar das maxilas e mandíbula, ligamento periodontal e gengiva. 0 cemento é uma camada fina e calcificada de tecido que cobre completamente a dentina da raiz do dente. 0 cemento é formado durante o desenvolvimento da raiz e ao longo de toda a vida do dente e funciona como uma área de inserção para as fibras do ligamento periodontal. 0 processo alveolar é a porção óssea da maxila e da mandíbula onde os dentes estão implantados e que sustenta as raízes dos dentes. A cavidade alveolar é a cavidade no interior do processo alveolar, na qual a raiz do dente é mantida pelo ligamento periodontal. 0 osso que separa uma cavidade de outra é denominado septo interdentário. Quando estão presentes dentes com raízes múltiplas, o osso é denominado septo inter-radicular. 0 processo alveolar inclui a placa cortical, a cristã alveolar, o osso trabecular e o osso alveolar próprio. 0 termo "promover o crescimento" pretende designar a cicatrização do osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem e a regeneração destes tecidos e estruturas. Preferencialmente, o osso, o periodonto, o ligamento ou a cartilagem estão danificados ou feridos e necessitam de regeneração ou recuperação. 0 termo "promover o crescimento do periodonto" pretende designar a regeneração ou a cicatrização dos tecidos de sustentação de um dente, incluindo o osso alveolar, o cemento e o ligamento periodontal interposto, que foram danificados por doença ou trauma. 0 termo "purificado" pretende designar um factor de crescimento ou de diferenciação, por exemplo, o PDGF, que, antes de ser misturado com um veículo, é 95% ou mais em peso, isto é, o factor está substancialmente isento de outras proteínas, lípidos e hidratos de carbono com os quais está naturalmente associado. 0 termo "substancialmente purificado" refere-se a uma pureza inferior do factor, contendo, por exemplo, apenas 5—95% em peso do factor, de preferência 65-95%. Uma preparação de proteína purificada proporcionará geralmente uma única banda principal num gel de poliacrilamida. Mais preferencialmente, o factor purificado utilizado nos materiais de implante do invento é puro, tal como avaliado por análise da sequência de aminoácidos amino- 28 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ terminais. Ο termo "parcialmente purificado" refere-se a PDGF que é disponibilizado no contexto de PRP, PPP, PIP ou qualquer outro produto sanguíneo que necessite de recolha e separação, por exemplo, por centrifugação, para ser produzido.

Em termos exemplificativos, uma solução possuindo ~1,0 mg/ml de PDGF, quando ele é -50% puro, constitui -2,0 mg/ml de proteína total.

Os materiais de implante deste invento ajudam na regeneração do periodonto, pelo menos em parte, ao promoverem o crescimento do tecido conjuntivo, do osso e do cemento. Os materiais de implante podem ser preparados de modo a promoverem directamente o crescimento e a diferenciação das células que produzem o tecido conjuntivo, o osso e o cemento. Em alternativa, os materiais de implante podem ser preparados de modo a actuarem indirectamente, por exemplo, atraindo as células que são necessárias para promover o crescimento do tecido conjuntivo, do osso e do cemento. A regeneração utilizando uma composição deste invento é um tratamento mais eficaz das doenças periodontais ou dos ferimentos ósseos que aquele obtido utilizando apenas antibióticos sistémicos ou desbridação cirúrgica. O PDGF, os factores de crescimento polipeptídicos e os factores de diferenciação poderão ser obtidos a partir de células ou tecidos humanos, por exemplo, as plaquetas, através de síntese de péptidos em fase sólida ou por meio de tecnologia de ADN recombinante. Assim, o termo "factor de crescimento polipeptídico" ou "factor de diferenciação" designa materiais derivados de células ou tecidos, recombinantes ou sintetizados. Se o factor for um dímero, por exemplo, o PDGF, o factor recombinante pode ser um heterodímero recombinante, preparado por meio da inserção, em células eucarióticas ou procarióticas em cultura, de sequências de ADN que codificam ambas as subunidades do factor e permitindo, depois, que as subunidades traduzidas sejam processadas pelas células para formar um heterodímero (por exemplo, PDGF-AB). Em alternativa, o ADN que codifica apenas uma das subunidades (por exemplo, a cadeia B ou a cadeia A de PDGF) pode ser introduzido nas células, que são depois cultivadas para produzir o factor homodimérico (por exemplo, 29 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ os homodímeros PDGF-BB ou PDGF-AA). 0 PDGF para utilização nos métodos do invento inclui homodímeros e heterodímeros de PDGF, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD e suas combinações e derivados. A concentração de PDGF ou de outros factores de crescimento do invento pode ser determinada utilizando, por exemplo, um imunoensaio ligado a enzima, como descrito, por exemplo, nas patentes U.S. 6,221,625, 5,747,273 e 5,290,708, ou qualquer outro ensaio conhecido na arte para determinar a concentração de proteínas. Quando aqui disponibilizada, a concentração molar de PDGF é determinada com base no peso molecular do dímero de PDGF (por exemplo, PDGF-BB; PM = aproximadamente 25 kDa).

Os métodos e os materiais de implante do invento podem ser utilizados para a cicatrização de ferimentos ósseos dos mamíferos, por exemplo, fracturas, locais receptores de implantes e locais de doença periodontal. Os materiais de implante promovem o crescimento e a reparação do tecido conjuntivo e melhoram a formação de osso em comparação com a cicatrização natural (isto é, sem a adição de agentes exógenos) ou a cicatrização suplementada com a adição de antibióticos sistémicos. Ao contrário da cicatrização natural, da terapia cirúrgica convencional ou dos antibióticos, os materiais de implante do invento induzem um aumento da formação de osso, tecido conjuntivo (por exemplo, cartilagem e ligamento) e cemento quando são aplicados em tecidos danificados ou doentes ou em locais afectados por doença periodontal. A restauração destes tecidos conduz a um prognóstico melhorado para as áreas afectadas. A capacidade destes factores para estimular a formação de osso novo torna-os igualmente aplicáveis no tratamento de defeitos ósseos causados por outros tipos de infecção ou por trauma cirúrgico ou acidental.

Outras características e vantagens do invento serão evidentes a partir da descrição que se segue das suas concretizações e a partir das reivindicações. 30 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Breve descrição das figuras

As Figs. 1A-1G são fotomicrografias que ilustram o efeito sobre a formação óssea 8 semanas após o tratamento. A Fig. IA é uma fotomicrografia ilustrando o efeito somente de cirurgia na formação óssea. A Fig. 1B é uma fotomicrografia mostrando o efeito de β-TCP sozinho na formação óssea. A Fig. 1C é uma fotomicrografia representando o efeito de β-TCP + PDGF 0,3 mg/ml na formação óssea. A Fig. 1D é uma f otomicrograf ia ilustrando o efeito de β-TCP + PDGF 1,0 mg/ml na formação óssea. A Fig. 1E é uma fotomicrografia mostrando o efeito apenas de aloenxerto ósseo desmineralizado e liofilizado (DFDBA de "Demineralized Freeze-Dried Bone Allograft") na formação óssea. A Fig. 1F é uma fotomicrografia representando o efeito de aloenxerto ósseo desmineralizado e liofilizado (DFDBA) + PDGF 0,3 mg/ml na formação óssea. A Fig. 1G é uma fotomicrografia ilustrando o efeito de aloenxerto ósseo desmineralizado e liofilizado (DFDBA) + PDGF 1,0 mg/ml na formação óssea.

As Figs. 2A-2C são fotomicrografias que ilustram o efeito sobre a formação óssea 16 semanas após o tratamento. A Fig. 2A é uma fotomicrografia mostrando o efeito de β-TCP sozinho na formação óssea. A Fig. 2B é uma fotomicrografia representando o efeito de β-TCP + PDGF 0,3 mg/ml na formação óssea. A Fig. 2C é uma fotomicrografia ilustrando o efeito de β-TCP + PDGF 1,0 mg/ml na formação óssea.

Descrição detalhada

Descrevemos agora várias concretizações do invento. Dois exemplos que demonstram a utilização de PDGF como agente de cicatrização do osso e do periodonto estão apresentados abaixo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de PDGF

As feridas ósseas, por exemplo, após doença periodontal ou trauma, são tratadas, e o periodonto, incluindo o osso, o cemento e o tecido conjuntivo, são regenerados, de acordo com 31 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ ο invento, mediante a combinação de PDGF parcialmente purificado ou purificado com qualquer um dos veículos farmaceuticamente aceitáveis descritos acima. 0 PDGF purificado pode ser obtido a partir de uma fonte recombinante ou de plaquetas humanas. 0 PDGF recombinante disponível comercialmente pode ser obtido de R&D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota), BD Biosciences (San Jose, Califórnia) e Chemicon International (Temecula, Califórnia). 0 PDGF parcialmente purificado e purificado também pode ser preparado da forma que se segue.

Quinhentas a mil unidades de depósitos de plaquetas humanas lavadas são suspensas em NaCl 1M (2 ml por unidade de plaquetas) e aquecidas a 1002C durante 15 minutos. 0 sobrenadante é depois separado por centrifugação, e o precipitado é extraído duas vezes com NaCl 1M.

Os extractos são combinados, dialisados contra NaCl Ο,ΟδΜ/tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 7,4) e misturados durante a noite, a 42C, com CM-Sephadex C-50 equilibrado com o tampão. A mistura é depois vertida numa coluna (5 x 100 cm), lavada extensamente com NaCl 0,08M/tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 7,4) e eluída com NaCl 1M, enquanto são recolhidas fracções de 10 ml.

As fracções activas são combinadas e dialisadas contra NaCl 0,3M/tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 7,4), centrifugadas e passadas, a 42C, através de uma coluna de dimensões 2,5 x 25 cm de sepharose azul (Pharmacia) equilibrada com NaCl 0,3M/tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 7,4) . A coluna é depois lavada com o tampão, e o PDGF parcialmente purificado é eluído com uma solução 1:1 de NaCl 1M e etilenoglicol.

As fracções de PDGF parcialmente purificado são diluídas (1:1) com NaCl 1M, dialisadas contra ácido acético 1M e liofilizadas. As amostras liofilizadas são dissolvidas em NaCl 0,8M/tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 7,4) e passadas através de uma coluna de dimensões 1,2 x 40 cm de CM-Sephadex C-50 equilibrado com o tampão. O PDGF é depois eluído com um gradiente de NaCl (0,08 a 1M) . 32 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

As fracções activas são combinadas, dialisadas contra ácido acético 1M, liofilizadas e dissolvidas num pequeno volume de ácido acético 1M. Aplicam-se porções de 0,5 ml a uma coluna de dimensões 1,2 x 100 cm de Biogel P-150 (malha 100 a 200) equilibrado com ácido acético 1M. O PDGF é depois eluído com ácido acético 1M, enquanto são recolhidas fracções de 2 ml.

Cada fracção activa contendo 100 a 200 mg de proteína é liofilizada, dissolvida em 100 ml de ácido trifluoroacético a 0,4% e submetida a cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa numa coluna Bondapak Phenyl (Waters). A eluição com um gradiente linear de acetonitrilo (0 a 60%) fornece PDGF puro. O PDGF produzido por tecnologia de ADN recombinante pode ser preparado da forma que se segue. O factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) derivado de plaquetas humanas contém duas sequências polipeptídicas (polipéptidos PDGF-B e PDGF-A; Antoniades, H.N. & Hunkapiller, M., Science 220:963-965, 1983). O polipéptido PDGF-B é codificado por um gene localizado no cromossoma 7 (Betsholtz, C. et al., Nature 320:695-699), e o polipéptido PDGF-A é codificado pelo oncogene sis (Doolittle, R. et al., Science 221:275-277, 1983) localizado no cromossoma 22 (Dalla-Favera, R., Science 218:686-688, 1982). O gene sis codifica a proteína transformante do vírus do sarcoma de símios (SSV de "Simian Sarcoma Vírus"), que é muito próxima do polipéptido PDGF-2. O gene c-sis celular humano também codifica a cadeia PDGF-A (Rao, C.D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2392-2396, 1986) . Como as duas cadeias polipept ídicas do PDGF são codificadas por dois genes diferentes localizados em cromossomas separados, há a possibilidade de o PDGF humano consistir num heterodímero de PDGF-B e PDGF-A ligados por meio de ligações dissulfureto, ou numa mistura dos dois homodímeros (homodímero PDGF-BB e homodímero PDGF-AA), ou numa mistura do heterodímero e dos dois homodímeros. Células de mamífero em cultura infectadas com o vírus do sarcoma de símios, que contém o gene que codifica a cadeia PDGF-A, sintetizaram o polipéptido PDGF-A e processaram-no num 33 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ homodímero ligado por meio de ligações dissulfureto (Robbins et al., Nature 305:605-608, 1983). Adicionalmente, o homodímero de PDGF-A reage com anti-soros produzidos contra o PDGF humano. Além disso, as propriedades funcionais do homodímero de PDGF-A segregado são semelhantes aquelas do PDGF derivado de plaquetas, na medida em que estimula a síntese de ADN em fibroblastos em cultura, induz a fosforilação ao nível do resíduo de tirosina de uma proteína da membrana celular de 185 kD e é capaz de competir com o (125I)-PDGF humano pela ligação a receptores de PDGF específicos da superfície celular (Owen, A. et al., Science 225:54-56, 1984). Demonstraram-se propriedades similares para o produto génico sis/PDGF-A derivado de células humanas normais em cultura (por exemplo, células endoteliais arteriais humanas) ou de células malignas humanas que expressam o gene sis/PDGF-2 (Antoniades, H. et al., Câncer Cells 3:145-151, 1985). O homodímero de PDGF-B recombinante é obtido por meio da introdução de clones de ADNc do gene c-sis/PDGF-B em células de ratinho, utilizando um vector de expressão. O clone c-sis/PDGF-B utilizado para a expressão foi obtido de células endoteliais humanas normais em cultura (Collins, T. et al., Nature 216:748-750, 1985).

Utilização de PDGF 0 PDGF isolado ou em combinação com outros factores de crescimento é útil para promover a cicatrização óssea, o crescimento e a regeneração ósseos ou a cicatrização das estruturas de suporte dos dentes que foram lesionadas por trauma ou doença. Ele é igualmente útil para promover a cicatrização do local de extracção de um dente, para o aumento da cristã mandibular ou nos locais de implante de um dente. A cicatrização óssea também seria melhorada nos locais de fractura óssea ou em áreas infectadas, por exemplo, osteomielite, ou nos locais de tumores. O PDGF também é útil para promover o crescimento e a cicatrização de um ligamento, por exemplo, o ligamento periodontal, e do cemento.

Aquando da utilização, o PDGF ou outro factor de crescimento ou diferenciação é aplicado directamente na área que necessita de cicatrização ou regeneração. Geralmente, ele 34 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ é aplicado num veículo reabsorvível ou não reabsorvível como um líquido ou sólido, e o local é depois coberto com uma ligadura ou tecido vizinho. Uma quantidade suficiente para promover o crescimento ósseo está geralmente compreendida entre 500 ng e 5 mg para uma área de 1 cm2, mas o limite superior é na realidade de 1 mg para uma área de 1 cm2, em que uma quantidade preferida de PDGF aplicada é igual a 0,3 mg/ml.

Exemplo II: Regeneração periodontal com armações

osteocondutoras tratadas com rhPDGF-BB A eficácia do PDGF na promoção do crescimento do periodonto e do osso é demonstrada pelo estudo que se segue.

Estudo in vivo em cães 0 cão beagle é o modelo animal mais amplamente utilizado para testar procedimentos e materiais putativos de regeneração periodontal (Wikesjo et al., J. Clin. Periodontol. 15:73-78, 1988; Wikesjo et al., J. Clin. Periodontol. 16:116-119, 1999;

Cho et al., J. Periodontol. 66:522-530, 1995; Giannobile et al., J. Periodontol. 69:129-137, 1998; e Clergeau et al., J.

Periodontol. 67:140-149, 1996). A acumulação de placa e de cálculos pode induzir uma inflamação gengival que poderá conduzir a perda óssea marginal, e a etiologia da periodontite nos cães e nos seres humanos pode ser comparada. Na doença de ocorrência natural, há, contudo, uma ausência de uniformidade entre os defeitos. Adicionalmente, dado que se tem prestado mais atenção à saúde oral nas colónias de criadores de cães, tornou-se impraticável obter animais com doença periodontal natural. Assim, o modelo de furca de Classe III horizontal, induzida por via cirúrgica, tornou-se um dos modelos mais habitualmente utilizados para investigar a cicatrização e a regeneração periodontais. Cães beagle com defeitos de furca de Classe III horizontal foram tratados utilizando as composições de PDGF do invento. Quinze cães beagle adultos contribuíram com 60 defeitos tratados. Quarenta e dois defeitos foram sujeitos a biopsia dois meses após o tratamento, e quinze defeitos foram sujeitos a biopsia quatro meses após o tratamento. 35 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Preparação dos defeitos

Utilizou-se o modelo de defeitos periodontais de "tamanho critico" tal como descrito por numerosos investigadores (ver, por exemplo, Wikesjo, 1988 & 1999, acima; Giannobile, acima; Cho, acima e Park et al., J. Periodontol. 66:462-477, 1995). Utilizaram-se ambos os quadrantes mandibulares em 16 cães beagle machos (2-3 anos de idade) sem problemas de saúde geral e oral. Um mês antes do doseamento, os animais foram sedados com uma injecção subcutânea de atropina (0,02 mg/kg) e acepromazina (0,2 mg/kg), aproximadamente 30 minutos antes de serem anestesiados com uma injecção IV de pentobarbital de sódio (25 mg/kg). Após uma infiltração local da área cirúrgica com cloridrato de lidocaina mais epinefrina 1:100 000, levantaram-se retalhos mucoperiostais de espessura total, e o primeiro e o terceiro pré-molares (PI e P3) foram extraídos. Adicionalmente, a porção mesial da coroa do primeiro molar foi submetida a ressecção. O osso alveolar foi depois removido à volta de toda a circunferência de P2 e P4, incluindo as áreas de furca, utilizando escopros e brocas de diamante e carboneto refrigeradas por meio de água. Os defeitos ósseos horizontais foram criados de modo a existir uma distância de 5 mm desde o tecto da furca até à cristã do osso. Os defeitos tinham aproximadamente 1 cm de largura, dependendo da largura do dente. As raízes de todos os dentes experimentais foram raspadas e alisadas com curetas e instrumentos de ultra-sons e equipadas com uma broca de diamante cónica para remover o cemento. Após a criação dos defeitos ósseos padronizados, os retalhos gengivais foram suturados para obter uma oclusão primária. Os animais foram alimentados com uma dieta mole e receberam lavagens diárias com clorhexidina durante o período de duração do estudo.

Aplicação do material de enxerto

Os defeitos periodontais de P2 e P4 em cada quadrante mandibular dos 15 animais foram randomizados antes do tratamento, utilizando envelopes selados. Cerca de quatro semanas após a preparação dos defeitos, os animais foram reanestesiados como descrito acima e levantaram-se retalhos de 36 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ espessura total em ambos os quadrantes mandibulares. Efectuou-se um entalhe nas superfícies da raiz do dente ao nível da cristã óssea residual, utilizando uma broca redonda de ^ polegadas, para actuar como futuro ponto de referência histológico. Os locais foram irrigados com solução salina estéril, e as raízes foram tratadas com ácido cítrico conforme previamente descrito, com o objectivo de descontaminar e remover a camada de manchas (ver, por exemplo, Cho, acima; e Park, acima). Durante este período, uma quantidade de β-TCP ou de DFDBA (aloenxerto) suficiente para preencher o defeito periodontal foi saturada com uma solução de rhPDGF (0,3 ou 1,0 mg/ml), e a mistura rhPDGF-BB/enxerto foi deixada em repouso na bancada cirúrgica estéril durante cerca de dez minutos. O enxerto saturado com rhPDGF-BB foi depois comprimido no defeito, utilizando uma pressão suave, até ao nivel ideal de regeneração óssea.

Após o implante do material de enxerto, os retalhos mucoperiostais foram suturados aproximadamente ao nível da junção cemento-esmalte, utilizando suturas interrompidas de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) 4.0 interproximais. Após a sutura dos retalhos, aplicou-se cuidadosamente gel de gluconato de clorhexidina à volta dos dentes e das gengivas.

Grupos de tratamento e de controlo Os defeitos receberam:

1. β-TCP 2. β-TCP mais rhPDGF-BB (rhPDGF-BB 0,3 mg/ml) 3. β-TCP mais rhPDGF-BB (rhPDGF-BB 1,0 mg/ml) 4. DFDBA canino 5. DFDBA canino + rhPDGF-BB (rhPDGF-BB 0,3 mg/ml) 6. DFDBA canino + rhPDGF-BB (rhPDGF-BB 1,0 mg/ml) 7. Cirurgia simulada (tratado apenas por desbridação do retalho aberto, nenhum enxerto)

Seis defeitos por grupo de tratamento foram sujeitos a biopsia aos dois meses (total de 42 locais). Adicionalmente, cinco defeitos nos grupos de tratamento 1, 2 e 3 foram sujeitos a biopsia aos quatro meses (total de 15 locais). 37 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 37 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ Tabela 2. Concepção experimental N.2 DO GRUPO N.a LOCAIS DE TESTE TRATAMENTO PONTOS TEMPORAIS 1 11 apenas β-TCP 8 e 16 semanas n=6 para 8 semanas n=5 para 16 semanas 2 11 β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 8 e 16 semanas n=6 para 8 semanas n=5 para 16 semanas 3 11 β-TCP + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 8 e 16 semanas n=6 para 8 semanas n=5 para 16 semanas 4 6 apenas DFDBA 8 semanas 5 6 DFDBA + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 8 semanas 6 6 DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 8 semanas 7 6 cirurgia, nenhum enxerto 8 semanas

Por conseguinte, às 8 semanas, há 7 grupos divididos entre 42 locais em 11 cães. Às 16 semanas, há 3 grupos divididos entre 15 locais em 4 cães (um cão recebeu duas cirurgias de tratamento efectuadas com oito semanas de intervalo e, deste modo, contribuiu com dois locais para cada um dos pontos temporais às 8 e 16 semanas).

Tratamento pós-cirúrgico

Os locais cirúrgicos foram protegidos mediante alimentação dos cães com uma dieta mole durante as primeiras quatro semanas de pós-operatório. De modo a garantir uma recuperação óptima, foi fornecido um tratamento de antibiótico sistémico com penicilina G benzatina durante as duas primeiras semanas, e o controlo da placa foi mantido por meio de irrigação diária com gluconato de clorhexidina a 2% ao longo de toda a experiência. As suturas foram removidas após 3 semanas.

Recolha de dados

Fundamentaçao para os pontos de recolha de dados por 0 ponto temporal às oito semanas foi escolhido porque este é o ponto temporal mais comum referido na literatura para este modelo e, por conseguinte, há dados históricos 38 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ substanciais. Por exemplo, Wikesjo et al., acima, e Giannobile et al., acima, também escolheram as 8 semanas para avaliar os efeitos regenerativos de BMP-2 e OP-1, respectivamente, no mesmo modelo. Adicionalmente, Park et al., acima, avaliaram o efeito de rhPDGF-BB aplicado directamente na superfície da raiz condicionada, com e sem membranas GTR, no modelo do cão beagle às 8 semanas. Estes estudos sugerem vivamente que o período de 8 semanas deverá ser óptimo para ilustrar os potenciais efeitos significativos entre as várias modalidades de tratamento. 0 ponto temporal às dezasseis semanas foi escolhido para avaliar os efeitos a longo prazo do tratamento com o factor de crescimento. Estudos anteriores (Park et al., acima) sugerem que, por essa altura, há uma cicatrização espontânea substancial dos defeitos ósseos. No entanto, é possível avaliar se o tratamento com rhPDGF-BB conduz ou não a qualquer resposta tecidual invulgar ou anormal, como seja uma remodelação óssea alterada, tumorigénese ou uma reabsorção da raiz .

Biópsias e avaliações dos tratamentos

No momento da biopsia, os animais foram submetidos a perfusão com paraformaldeído a 4% e sacrificados. As mandíbulas foram depois removidas e colocadas em fixador. Efectuaram-se radiografias periapicais, e os locais tratados foram cortados em blocos individuais utilizando uma serra de diamante. Os blocos codificados (cegos) foram envolvidos em gaze, imersos numa solução de formaldeído a 4%, processados e analisados.

Durante o processamento, as biópsias foram desidratadas em etanol e infiltradas e embutidas em metacrilato de metilo. Obtiveram-se secções não descalcifiçadas com uma espessura de aproximadamente 300 μιη, utilizando uma serra de diamante de baixa velocidade com líquido de refrigeração. As secções foram coladas sobre vidro acrílico opalescente, trituradas até uma espessura final de aproximadamente 80 |±m e coradas com azul de toluidina e fucsina básica. Obtiveram-se secções em série graduais num plano mesio-distal. 39 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

As análises histomorfométricas foram efectuadas nas lamelas codificadas. Avaliaram-se os seguintes parâmetros: 1. Comprimento da nova inserção completa (CNAA de "Complete New Attachment Apparatus"): Regeneração periodontal medida como a distância entre o nivel coronal do osso antigo e o nivel coronal do osso novo, incluindo apenas aquele osso novo adjacente ao cemento novo com ligamento periodontal orientado funcionalmente entre o osso novo e o cemento novo. 2. Preenchimento ósseo novo (NB de "New Bone") : Medido como a área de secção transversal de osso novo formado no interior da furca. 3. Preenchimento com tecido conjuntivo (CT de "Connective Tissue"): Medido como a área no interior da furca ocupada por tecido conjuntivo gengival. 4. Vazio (VO de "Void") : A área de recessão em que há uma ausência de tecido.

Resultados A. Observações clinicas

Clinicamente, todos os locais cicatrizaram bem. Houve a impressão de que os locais tratados com rhPDGF-BB cicatrizaram mais rapidamente, tal como indicado pela presença de gengivas cor-de-rosa firmes no período de uma semana pós-operatória. Não se verificaram eventos adversos em nenhum grupo de tratamento conforme avaliado por inspecção visual dos locais tratados. Pareceu existir uma maior recessão gengival nos grupos que receberam só β-TCP ou só DFDBA. B. Observações radiográficas

Radiograficamente, houve sinais de uma maior formação óssea aos dois meses conforme avaliado por uma radiopacidade acrescida nos Grupos 2, 3 (β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 e 1,0 mg/ml, respectivamente) e 6 (DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml) em comparação com os outros grupos (Figuras 1A-G). Aos quatro meses, houve indicios de uma maior formação óssea em todos os 40 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ grupos em comparação com o ponto temporal aos dois meses. Não se obteve nenhuma evidência radiográfica de gualguer remodelação óssea anormal, reabsorção da raiz ou ancilose em nenhum dos grupos.

Tabela 3. Resultados radiográficos. Ordem classificativa. AVALIAÇÃO QUALITATIVA DO PREENCHIMENTO ÓSSEO ÀS S SEMANAS* TRATAMENTO 6 apenas β-TCP 1 β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 2 β-TCP + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 7 apenas DFDBA 5 DFDBA + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 3 DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 4 cirurgia, nenhum enxerto *1 = mais preenchimento; 7 = menos preenchimento C. Análises histomorfométricas A avaliação histomorfométrica do comprimento do cemento novo, osso novo e ligamento periodontal novo (CNAA) , assim como do preenchimento ósseo novo, preenchimento com tecido conjuntivo e espaço vazio foi efectuada e está expressa em percentagens. No caso de CNAA, os valores para cada grupo de teste representam as medidas CNAA (comprimento em mm)/comprimento CNAA disponível total (em mm) x 100%. O preenchimento ósseo, o preenchimento com tecido conjuntivo e o espaço vazio foram avaliados e estão expressos como percentagens da área total do defeito da furca. A análise de variância a um factor (ANOVA) foi utilizada para testar a existência de diferenças globais entre os grupos de tratamento, e o teste t de Student foi usado para efectuar comparações emparelhadas. Encontraram-se diferenças significativas entre os grupos após análises das lamelas codificadas. A Tabela 4 apresenta os resultados aos dois meses. 41 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Tabela 4. Análises histométricas aos dois meses N. 2 GRUPO TRATAMENTO % CNAA REGENERAÇÃO PERIODONTAL % PREENCHIMENTO ÓSSEO % PREENCHIMENTO COM TECIDO CONJUNTIVO % VAZIO 1 apenas β-TCP 37,0 ± 22,8 * * 28,0 ± 29,5 36,0 ± 21,5 12,0 ± 17,9 2 β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 59,0 ± 19,1 84,0 ± 35,8 + ,* 0,0 ± 0,0 8,0 ± 17,9 3 β-TCP + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 46,0 ± 12,3 * 74,2 ± 31,7 Φ 0,0 ± 0,0 0,0 + 0,0 4 apenas DFDBA 13,4+12,0 6, 0 ± 8,9 26, 0 + 19,5 30,0 + 27,4 5 DFDBA + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml 21,5 ± 13,3 20,0 ± 18,7 36,0 ± 13,4 18,0 ± 21,7 6 DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml 29,9 ± 12,4 46,0 ± 23,0 Φ 26,0 ± 5,48 8,0 ± 13,04 7 cirurgia, nenhum enxerto 27,4 ± 15,0 34,0 ± 27,0 48,0 ± 35,64 10,0 + 22,4 * Grupos 2 e 3 significativamente maiores (p<0,05) que Grupos 4 e 7. ** Grupo 1 significativamente maior (p<0,05) que Grupo 4. t Grupo 2 significativamente maior (p<0,05) que Grupo 5. Φ Grupos 2 e 3 significativamente maiores que Grupos 1, 4 e 7. Φ Grupo 6 significativamente maior que Grupo 4. A regeneração periodontal (CNAA) percentual média nos grupos de cirurgia sem enxertos e cirurgia mais β-TCP sozinho foi de 27% e 37%, respectivamente. Em contraste, os grupos de β-TCP contendo rhPDGF-BB mostraram uma regeneração periodontal significativamente maior (p<0,05) que a cirurgia sem enxertos ou com DFDBA sozinho (59% e 46%, respectivamente, para as concentrações de 0,3 e 1,0 mg/ml versus 27% para a cirurgia apenas e 13% para o DFDBA sozinho) . Finalmente, o grupo de β-TCP contendo rhPDGF-BB 0,3 mg/ml apresentou uma regeneração periodontal significativamente maior (p<0,05) que a mesma concentração de rhPDGF-BB combinado com aloenxerto (59% versus 21%) . O preenchimento ósseo foi significativamente maior (p<0,05) nos grupos de β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml (84,0%) e 42 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ de β-TCP + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml (74,2%) que nos grupos de tratamento com apenas β-TCP (28,0%), apenas cirurgia (34%) ou apenas DFDBA (6%). Verificou-se também um preenchimento ósseo significativamente maior (p<0,05) para o grupo de β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml em comparação com o grupo de DFDBA + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml (84% e 20%, respectivamente). O grupo de análises que examinou os resultados às 8 semanas para os grupos de DFDBA e para o grupo tratado apenas com cirurgia (Grupos 4, 5, 6 e 7) não demonstrou quaisquer diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de DFDBA e o grupo apenas de cirurgia quanto à regeneração periodontal (CNAA). Houve uma tendência no sentido de uma maior regeneração para aqueles locais tratados com DFDBA melhorado com rhPDGF-BB 1,0 mg/ml em comparação com DFDBA sozinho. Verificou-se um preenchimento ósseo significativamente maior (p<0,05) para os locais tratados com DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml versus DFDBA sozinho (46% e 6%, respectivamente). Constatou-se uma tendência no sentido de um maior preenchimento ósseo para os locais tratados com DFDBA contendo rhPDGF-BB 0,3 mg/ml em comparação com DFDBA sozinho ou cirurgia sozinha. Contudo, os locais tratados apenas com DFDBA demonstraram menos preenchimento ósseo no defeito que a cirurgia sozinha (6% e 34%, respectivamente), sendo que a maior parte do defeito está desprovida de qualquer preenchimento ou preenchimento consistindo em tecido conjuntivo gengival (mole).

Aos quatro meses após o tratamento, permaneceram diferenças significativas ao nível da regeneração periodontal. O β-TCP sozinho, devido a ancilose extensa, resultou numa regeneração de 36%, ao passo que os locais tratados com β-TCP contendo rhPDGF-BB apresentaram uma regeneração média de 58% e 49% às concentrações de 0,3 e 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. Observou-se um preenchimento ósseo substancial na totalidade dos três grupos de tratamento. O β-TCP sozinho resultou num preenchimento ósseo de 70%, o β-TCP mais rhPDGF-BB 0,3 mg/ml originou um preenchimento de 100%, enquanto o grupo de rhPDGF-BB 1,0 mg/ml teve um preenchimento de 75%. 43 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ D. Avaliação histológica A avaliação histológica foi efectuada para todas as biópsias com a excepção de uma, em que a avaliação não foi possível devido a dificuldades encontradas durante o processamento.

As fotomicrografias representativas estão apresentadas nas Figuras 1A-G e 2A-C. A Figura IA ilustra os resultados de um local tratado apenas com cirurgia (sem enxertos) . Este espécime demonstra uma regeneração periodontal limitada (osso novo (NB), cemento novo (NC) e ligamento periodontal (PDL)), como evidenciada na área dos entalhes e que se estende apenas uma curta distância coronalmente. A área da furca está ocupada principalmente por tecido conjuntivo mole denso (CT) com uma formação óssea nova (NB) mínima.

Para os locais tratados apenas com β-TCP (Figura 1B) , existe regeneração periodontal, semelhante aquela observada para o espécime tratado apenas com cirurgia, que se estende desde a base dos entalhes por uma curta distância coronalmente. Tal como se observou nos espécimes tratados apenas com cirurgia, verificou-se muito pouca formação óssea nova, sendo a maior parte da área da furca ocupada por tecido conjuntivo mole.

Em contraste, a Figura 1C ilustra os resultados obtidos para os locais tratados com β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 mg/ml. Está ilustrada a existência de uma regeneração periodontal significativa com novo osso, novo cemento e ligamento periodontal prolongando-se ao longo de toda a superfície da furca. Adicionalmente, a área da furca está preenchida com osso novo que se estende por toda a altura da furca até ao tecto.

Os resultados representativos para os locais tratados com β-TCP + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml estão ilustrados na Figura 1D. Embora exista uma regeneração periodontal significativa na furca, ela não se estende ao longo de toda a superfície da furca. Há formação óssea nova presente, juntamente com tecido conjuntivo mole, que é observada ao nível da porção coronal do 44 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ defeito, juntamente com um pequeno espaço que está desprovido de qualquer tecido (VO) no tecto da furca.

As Figuras 2A, 2B e 2C ilustram os resultados obtidos para os grupos de tratamento com o aloenxerto. Os resultados representativos para o grupo de apenas DFDBA (Figura 2A) mostram uma regeneração periodontal muito fraca que está limitada à área dos entalhes, prolongando-se apenas ligeiramente numa direcção coronal. A formação óssea nova está limitada e consiste em pequenas quantidades de formação óssea ao longo da superfície do material de enxerto DFDBA residual (coloração vermelha escura ao longo de ilhas cor-de-rosa mais claras). Adicionalmente, o osso novo está rodeado por extenso tecido conjuntivo mole, que se prolonga coronalmente para preencher uma área significativa no interior da furca. Finalmente, um grande espaço vazio estende-se desde a dimensão coronal do tecido conjuntivo mole até ao tecto da furca.

Os resultados histológicos para DFDBA + rhPDGF-BB 0,3 e 1,0 mg/ml estão apresentados nas Figuras 2B e 2C, respectivamente. Ambos os grupos demonstram maior regeneração periodontal em comparação com o DFDBA sozinho, com uma nova inserção completa (osso novo, cemento novo e ligamento periodontal) que se estende desde a base dos entalhes nas raízes por uma curta distância coronalmente (setas). Eles também apresentaram maior preenchimento ósseo no interior da área da furca, embora existisse um preenchimento significativo da furca com tecido conjuntivo mole.

Com base nos resultados do estudo, o tratamento de um defeito periodontal utilizando rhPDGF-BB numa concentração de 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, em combinação com um veículo adequado, isto é, β-TCP, resulta numa maior regeneração periodontal que os actuais produtos ou procedimentos, como sejam os enxertos apenas com β-TCP ou aloenxerto ósseo, ou a cirurgia periodontal sem enxertos.

O tratamento com rhPDGF numa concentração de 0,3 mg/ml e de 1,0 mg/ml resultou em regeneração periodontal. A concentração de 0,3 mg/ml de rhPDGF demonstrou maior regeneração periodontal e uma maior percentagem de 45 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ preenchimento ósseo em comparação com a concentração de 1,0 mg/ml de rhPDGF, quando misturado com β-TCP. O β-TCP foi mais eficaz que o aloenxerto quando misturado com o rhPDGF-BB em qualquer concentração. O osso novo maturou (sofreu remodelação) normalmente com o tempo (0, 8 e 16 semanas) em todos os grupos. Não houve qualquer aumento de ancilose ou de reabsorção da raiz nos grupos de rhPDGF. Na verdade, os locais que receberam rhPDGF-BB tiveram tendência para ter menos ancilose que os locais de controlo. Esta constatação poderá resultar do facto de o rhPDGF-BB ser mitogénico e quimiotáctico para as células do ligamento periodontal.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais utilizados: Artigos de teste e de controlo O β-TCP utilizado tinha um tamanho de partícula (0,25 mm -1,0 mm) que foi optimizado para uso periodontal. Com base em estudos que utilizaram um modelo canino, o β-TCP administrado é -80% reabsorvido no período de três meses e é substituído por osso autólogo durante o processo de cicatrização. O DFDBA foi fornecido pela Fundação de Transplantes Músculo-Esqueléticos (MTF). O material consistiu em aloenxerto canino, preparado a partir dos ossos de um cão que foi morto após o final de outro estudo que testou um procedimento cirúrgico sem nenhum efeito sobre os tecidos esqueléticos. O hPDGF-BB recombinante foi fornecido por BioMimetic Pharmaceuticals e foi produzido por Chiron, Inc., o único fornecedor de rhPDGF-BB aprovado pela FDA para uso humano. Este rhPDGF-BB foi aprovado pela FDA como um produto para cicatrização de feridas, sob a marca registada Regranex®.

Seringas de 1 ml contendo 0,5 ml de rhPDGF-BB estéril em duas concentrações separadas, preparado em conformidade com as normas da FDA para materiais humanos e de acordo com as actuais boas práticas de manufactura aplicáveis (cGMP). As concentrações testadas incluíram 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml. 46 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ Ο β-TCP foi fornecido em frascos de vidro contendo 0,5 cm3 de partículas estéreis. O DFDBA foi disponibilizado em seringas de 2,0 ml contendo 1,0 cm3 de aloenxerto de osso canino desmineralizado, estéril e liofilizado.

Preparação do material

No momento do procedimento cirúrgico, os enxertos implantados finais foram preparados por mistura da solução de rhPDGF-BB com os materiais da matriz. Resumidamente, uma quantidade de TCP ou de aloenxerto suficiente para preencher completamente o defeito ósseo foi colocada num prato estéril. A solução de rhPDGF-BB suficiente para saturar totalmente a matriz foi depois adicionada, e os materiais foram misturados e deixados em repouso no tabuleiro cirúrgico durante cerca de 10 minutos, à temperatura ambiente, antes de serem colocados no defeito ósseo.

Um período de incubação de 10 minutos com o material β-TCP é suficiente para obter uma adsorção máxima do factor de crescimento (ver Apêndice A) . Esta é também uma quantidade apropriada de tempo para os cirurgiões num ambiente clínico terem, antes da colocação do produto no defeito periodontal. De forma similar, num mercado comercial, o rhPDGF-BB e o material da matriz podem ser fornecidos em recipientes separados num kit, e os materiais podem ser misturados directamente antes da colocação. Este conceito de kit simplificaria grandemente as considerações sobre tempo de armazenamento/estabilidade do produto.

Exemplo III: Utilização de PDGF para o tratamento de defeitos ósseos periodontais em seres humanos O PDGF-BB humano recombinante (rhPDGF-BB) foi testado quanto ao seu efeito na regeneração de osso periodontal em sujeitos humanos. Dois grupos de teste receberam rhPDGF-BB numa concentração de 0,3 mg/ml (Grupo I) ou de 1,0 mg/ml (Grupo II). O rhPDGF-BB foi preparado em tampão acetato de sódio e administrado num veículo de fosfato tricálcico beta (β-TCP). O grupo de controlo, Grupo III, recebeu apenas β-TCP em tampão acetato de sódio. 47 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ Ο objectivo do estudo clínico consistiu em avaliar a segurança e a eficácia de material de enxerto compreendendo β-TCP e rhPDGF-BB, numa concentração de 0,3 mg/ml ou de 1,0 mg/ml, no controlo de defeitos periodontais intra-ósseos em uma (1) a três (3) paredes e em estimar a sua capacidade regenerativa no osso e no tecido mole.

Concepção do estudo e duração do tratamento O estudo foi um ensaio clínico multicêntrico, paralelo, aleatorizado, prospectivo, controlado e duplamente cego em sujeitos gue necessitavam de uma intervenção cirúrgica para tratar um defeito ósseo adjacente à dentição natural. Os sujeitos foram aleatorizados em iguais proporções para resultar em três (3) grupos de tratamento, cada um deles com aproximadamente 60 sujeitos (total de 180). A duração do estudo foi de seis (6) meses após o implante do dispositivo em estudo. O estudo envolveu 180 sujeitos.

Diagnóstico e principais critérios de participação

Sujeitos do sexo masculino e feminino, com idades entre os 25-75 anos, com doença periodontal avançada em pelo menos um local requerendo tratamento cirúrgico para corrigir um defeito ósseo, foram admitidos no estudo. Outros critérios de inclusão incluíram: 1) uma profundidade de sondagem da bolsa medindo 7 mm ou mais na visita inicial; 2) após desbridação cirúrgica, defeito ósseo (BD de "Bone Defect") vertical com 4 mm ou mais e pelo menos 1 parede óssea; 3) tecido queratinizado suficiente para permitir um revestimento tecidual completo do defeito; e 4) base radiográfica do defeito pelo menos 3 mm coronal em relação ao vértice do dente. Os sujeitos que fumavam até 1 maço de cigarros por dia e que tinham dentes com envolvimento da furca de Classe I e II foram especificamente autorizados a participar.

Dose e modo de administração

Todos os kits de tratamento continham 0,25 g de β-TCP (um controlo activo) e ou apenas 0,5 ml de solução tampão acetato de sódio (Grupo III), ou rhPDGF-BB 0,3 mg/ml (Grupo I) ou rhPDGF-BB 1,0 mg/ml (Grupo II) . 48 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Após uma desbridação e alisamento minuciosos da raiz, a solução de teste foi misturada com β-TCP num recipiente estéril, de modo a saturar completamente o β-TCP. As superfícies da raiz foram condicionadas utilizando tetraciclina, EDTA ou ácido citrico. 0 enxerto hidratado foi depois comprimido no interior do defeito ósseo, e os retalhos de tecido foram fixados com suturas interdentais para obter uma cobertura completa do local cirúrgico.

Medida da eficácia A medida de eficácia principal incluiu a variação do nivel de inserção clinica (CAL de "Clinicai Attachment Levei") entre a linha de base e os seis meses pós-cirurgia (Grupo I versus Grupo III). As medidas de eficácia secundárias consistiram nos seguintes resultados: 1) crescimento ósseo linear (LBG de "Linear Bone Growth") e percentagem de preenchimento ósseo (%BF de "Bone Fill") desde a linha de base até aos seis meses pós-cirurgia com base nas avaliações radiográficas (Grupo I e Grupo II versus Grupo III); 2) variação do CAL entre a linha de base e os seis meses pós-cirurgia (Grupo II versus Grupo III); 3) redução da profundidade de sondagem da bolsa (PDR de "Probing Depth Reduction") entre a linha de base e os seis meses pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II versus Grupo III); 4) recessão gengival (GR de "Gengival Recession") entre a linha de base e os seis meses pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II versus Grupo III); 5) cicatrização da ferida (WH de "Wound Healing") do local cirúrgico durante as primeiras três semanas pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II versus Grupo III) ; 6) área sob a curva para a variação do CAL entre a linha de base e os três (3) e os seis (6) meses (Grupo I e Grupo II versus Grupo III); 7) o limite inferior do intervalo de confiança a 95% (LCB de "Lower Confidence Bound") para a %BF aos seis (6) meses pós-cirurgia (Grupos I, II e III versus aloenxerto ósseo desmineralizado e liofilizado (DFDBA) como publicado na literatura; Parashis et al., J. Periodontol. 69:751-758, 1998); 8) o LCB a 95% para o crescimento ósseo linear aos seis (6) meses pós-cirurgia (Grupos I, II e III versus aloenxerto ósseo desmineralizado e liofilizado (DFDBA) como publicado na literatura; Persson et al., J. Clin. Periodontol. 27:104-108, 2000); 9) o LCB a 95% 49 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ para a variação do CAL entre a linha de base e os seis (6) meses (Grupos I, II e III versus EMDOGAIN® - PMA P930021, 1996); e 10) o LCB a 95% para a variação do CAL entre a linha de base e os seis (6) meses (Grupos I, II e III versus PEPGEN P-15™ - PMA P990033, 1999). Métodos estatísticos

Os dados de segurança e eficácia foram examinados e resumidos através de estatística descritiva. As medidas categóricas foram apresentadas como contagens e percentagens, e as variáveis continuas foram apresentadas como médias, medianas, desvios padrão e intervalos. As comparações estatísticas entre os grupos de tratamento com o produto de teste (Grupos I e II) e o controlo (Grupo III) foram efectuadas utilizando o teste do qui-quadrado e o teste exacto de Fisher para as variáveis categóricas, e testes t ou métodos de análise da variância (ANOVA) para as variáveis contínuas. As comparações entre os grupos de tratamento para as variáveis ordinais foram realizadas utilizando os testes de Cochran-Mantel-Haenszel. Um valor p < 0,05 (unilateral) foi considerado estatisticamente significativo para CAL, LBG e %BF .

Os dados de segurança foram apreciados através da frequência e gravidade dos eventos adversos, conforme avaliação clínica e radiográfica. Não houve diferenças significativas entre os três grupos de tratamento na linha de base. Também não se observaram diferenças estatisticamente significativas na incidência de eventos adversos (AE de "Adverse Events"; todas as causas) entre os três grupos de tratamento. A análise de segurança não identificou qualquer risco acrescido para o sujeito devido ao implante do material de enxerto.

Resumo dos resultados de eficácia

Os resultados das análises estatísticas revelaram benefícios significativos, tanto clínica como estatisticamente, para os dois grupos de tratamento (Grupos I e II) em comparação com o controlo activo de apenas β-TCP 50 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ (Grupo III) e os controlos históricos que incluem DFDBA, EMDOGAIN® e PEPGEN P-15™.

Aos três meses pós-cirurgia, observou-se um ganho de CAL estatisticamente significativo desde a linha de base em favor do Grupo I face ao Grupo III (p=0,041), indicando que há benefícios precoces significativos do PDGF no ganho de CAL. Aos seis meses pós-cirurgia, esta tendência continuou a favorecer o Grupo I relativamente ao Grupo III, embora esta diferença não fosse estatisticamente significativa (p=0,200). A análise da área sob a curva (AUC de "Area Under the Curve") que representa o efeito cumulativo (isto é, a velocidade) para o ganho de CAL entre a linha de base e os seis meses aproximou-se de uma significância estatística, favorecendo o Grupo I em comparação com o Grupo III (p=0,054). Adicionalmente, as análises do limite inferior do intervalo de confiança a 95% (LCB) para todos os grupos de tratamento fundamentaram a eficácia dos Grupos I e II em comparação com os ganhos de CAL observados aos seis (6) meses para EMDOGAIN® e PEPGEN P-15™.

Além dos benefícios clínicos do CAL observados, as análises radiográficas incluindo o crescimento ósseo linear (LBG) e a percentagem de preenchimento ósseo (%BF) revelaram uma melhoria estatisticamente significativa do ganho ósseo para os Grupos I e II em relação ao Grupo III. A %BF foi definida como sendo a percentagem do defeito ósseo original preenchida com osso novo, conforme medida radiograficamente. O LBG mostrou uma melhoria significativa no Grupo I (2,5 mm) em comparação com o Grupo III (0,9 mm; p<0,001). O LBG também foi significativo para o Grupo II (1,5 mm) em comparação com o Grupo III (p=0,021) A percentagem de preenchimento ósseo (%BF) sofreu um aumento significativo aos seis meses pós-cirurgia no Grupo I (56%) e no Grupo II (34%) em comparação com o Grupo III (18%), para um p<0,001 e p=0,019, respectivamente. 0 limite inferior do intervalo de confiança a 95% aos seis meses pós-cirurgia, tanto para o crescimento ósseo linear como para a % de preenchimento ósseo, documentou a eficácia dos Grupos I e II em comparação com os resultados radiográficos publicados para 51 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ ο DFDBA, ο material para procedimentos de enxerto periodontal mais amplamente utilizado.

Aos três meses, verificou-se significativamente menos recessão gengival (GR) (p=0,041) para o Grupo I em comparação com o Grupo III, o que é consistente com o efeito benéfico observado para o CAL. Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na PDR e na GR aos seis meses. A análise descritiva do número de locais que exibem uma cicatrização completa da ferida (WH) às três semanas revelou melhorias no Grupo I (72%) em relação ao Grupo II (60%) e ao Grupo III (55%) , indicando uma tendência no sentido de uma cicatrização melhorada.

De modo a avaliar o efeito benéfico cumulativo para os resultados clínicos e radiográficos, efectuou-se uma análise de eficácia compósita para determinar a percentagem de doentes com um resultado bem sucedido, tal como definido por um valor de CAL > 2,7 mm e um valor de LBG > 1,1 mm aos seis (6) meses. Os pontos de referência de sucesso para CAL e LBG foram estabelecidos pelos níveis médios alcançados para estes parâmetros pelos enxertos implantados, como identificado na secção "Medidas de eficácia" acima. Os resultados mostraram que 61,7% dos doentes do Grupo I e 37,9% dos doentes do Grupo II satisfizeram ou ultrapassaram o ponto de referência compósito de sucesso em comparação com 30,4% dos doentes do Grupo III, o que resulta num benefício estatisticamente significativo do Grupo I versus Grupo III (p<0,001). A %BF revelou benefícios similares para o Grupo I (70,0%) em relação ao Grupo III (44,6%) para um valor de p de 0,003.

Em resumo, o Grupo I alcançou resultados estatisticamente benéficos para o CAL e a GR aos três (3) meses, assim como para o LBG e a %BF aos seis (6) meses, em comparação com o grupo de controlo activo de apenas β-TCP (Grupo III). A significância clínica destes resultados é adicionalmente confirmada pela comparação com os controlos históricos. Conclui-se que o material de enxerto contendo PDGF alcançou eficácia clínica e radiográfica aos seis meses para o tratamento de defeitos ósseos periodontais. 52 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ

Tabela 5: Resumo da eficácia do enxerto de PDGF PONTO FINAL GRUPO I GRUPO II GRUPO III Ganho CAL (mm): 3 meses 3, 8 (p=0,04) 3,4 (P=0,40) 3, 3 CAL: Análise AUC (mm x semana) 67,5 (p=0,05) 61,8 (P=0,35) 60,1 CAL (mm): LCB 95% 6 meses (vs 2,7 mm para EMDOGAIN e 1,1 mm para PEPGEN) 3, 3 3, 2 3,1 GR (mm): 3 meses 0, 5 (p=0,04) 0,7 (p=0,46) 0, 9 LBG (mm): 6 meses 2, 5 (p<0,001) 1,5 (p=0,02) 0,9 %BF: 6 meses 56, 0 (p<0,001) 33, 9 (p=0,02) 17, 9 Análise compósita (% sucesso) CAL-LBG 61, 7% (p<0,001) 37, 9% (p=0,20) 30, 4% CAL-%BF 70, 0% (p=0,003) 55, 2% (p=0,13) 44, 6% 0 material de enxerto (isto é, β-TCP) contendo PDGF a 0,3 mg/ml e a 1,0 mg/ml revelou-se seguro e eficaz na restauração do osso alveolar e da inserção clinica à volta de dentes com uma periodontite moderada a avançada, num ensaio clinico grande e aleatorizado envolvendo 180 sujeitos acompanhados durante um período de até 6 meses. Estas conclusões baseiam-se em medidas radiográficas e clínicas validadas, tal como resumido abaixo.

De modo consistente com os dados de biocompatibilidade do material de enxerto contendo PDGF, discutidos acima, e a utilização segura histórica de cada componente individual (isto é, β-TCP sozinho ou PDGF sozinho), o estudo não revelou quaisquer sinais de efeitos adversos quer locais quer sistémicos. Não se observaram resultados adversos atribuíveis ao material de enxerto, que se verificou ser seguro.

Conclusão O implante de β-TCP contendo PDGF numa concentração quer de 0,3 mg/ml quer de 1,0 mg/ml é um tratamento eficaz para a restauração do nível de inserção do tecido mole e do osso, 53 ΕΡ 1 812 076/ΡΤ conforme demonstrado pelo valor de CAL significativamente melhorado aos 3 meses em comparação com o controlo activo. As nossas constatações também são consistentes com a análise AUC, que revelou uma melhoria do ganho de CAL entre a linha de base e os seis meses. 0 implante de β-TCP contendo PDGF numa concentração quer de 0,3 mg/ml quer de 1,0 mg/ml revelou igualmente ser um tratamento eficaz, com base em valores de LBG e de %BF significativamente melhores em comparação com o controlo activo. Os resultados clínicos significativamente

melhorados, como demonstrado pela análise compósita das medidas de ambos os tecidos duros e moles em comparação com o controlo activo de apenas β-TCP, também demonstram a eficácia do protocolo de tratamento descrito acima. Finalmente, verificou-se que os resultados da administração de β-TCP contendo PDGF numa concentração quer de 0,3 mg/ml quer de 1.0 mg/ml excedem, tanto clínica como radiograficamente, os pontos de referência de eficácia estabelecidos.

Os resultados deste ensaio, juntamente com extensos resultados confirmatórios de estudos in vitro, em animais e em seres humanos, demonstram que o material de enxerto contendo PDGF estimula a regeneração dos tecidos moles e duros em defeitos periodontais, embora os efeitos tenham sido mais significativos quando foi administrado PDGF na gama de 0,1 a 1.0 mg/ml (por exemplo, 0,1 mg/ml; 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml) no material de enxerto. Adicionalmente, o PDGF administrado no material de enxerto na quantidade de 0,3 mg/ml regenerou eficazmente o tecido mole e o osso.

Outras concretizações encontram-se no âmbito das reivindicações que se seguem.

Lisboa, 2010-11-11

Claims

ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Material de implante compreendendo um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um liquido compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mq/ml e cerca de 1,0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta e o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
2. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
3. Material de implante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreendendo adicionalmente colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico).
4. Material de implante de acordo com a reivindicação 2, consistindo num fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
5. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, consistindo num fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio consiste em ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 2/9 partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
6. Material de implante de acordo com a reivindicação 2 ou 3, consistindo em colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico) e um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
7. Material de implante de acordo com a reivindicação 1 ou 3, consistindo em colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico) e um fosfato de cálcio no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o material de implante é poroso e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
8. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o PDGF é PDGF humano recombinante.
9. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o liquido compreende PDGF numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,2 mg/ml e cerca de 0,75 mg/ml, preferencialmente numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,25 mg/ml e cerca de 0,5 mg/ml e, em particular, numa concentração de cerca de 0,3 mg/ml.
10. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta. ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 3/9
11. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, em particular de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 200 mícrones e cerca de 3000 mícrones e, preferencialmente, de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 250 mícrones e cerca de 2000 mícrones.
12. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o material de implante é reabsorvível, de modo que pelo menos 80% do fosfato de cálcio é reabsorvido no período de um ano após ser implantado sob a forma de uma pelete com 1-5 g.
13. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, 5 ou 7, em que o material de implante compreende partículas de fosfato de cálcio poroso possuindo uma porosidade superior a 40%.
14. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o PDGF é PDGF-BB e o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta.
15. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o líquido incorporado está absorvido no fosfato de cálcio.
16. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 8 a 15, compreendendo adicionalmente um agente biologicamente activo, em que o agente biologicamente activo é um anticorpo, um antibiótico, um polinucleótido, um polipéptido, uma proteína, um agente anticanceroso, um factor de crescimento, um agente anti-inflamatório ou uma vacina, e em que a proteína é preferencialmente uma proteína osteogénica e, em particular, o factor de crescimento análogo à insulina I (IGF-I), o factor de crescimento análogo à insulina II (IGF-II), o factor de crescimento transformante Pi (TGF- PD, o factor de crescimento transformante β2 (TGF~P2) , o factor de crescimento transf ormante α (TGF-oc) , uma proteína morf ogenét ica óssea (BMP) ou osteogenina. ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 4/9
17. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5 e 7, em que a porosidade do material de implante após o seu implante in vivo é uma macroporosidade.
18. Material de implante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o PDGF é PDGF-BB.
19. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, consistindo num fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um liquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml, em que o material de implante é poroso, em que o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 micrones e cerca de 5000 micrones e em que o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta.
20. Utilização de um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um liquido compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta e o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 micrones e cerca de 5000 micrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero.
21. Utilização de um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1.0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta e o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 micrones e cerca de 5000 micrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero. ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 5/9
22. Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que o material de implante compreende adicionalmente colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico).
23. Utilização de acordo com a reivindicação 20 de um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um liquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero.
24. Utilização de acordo com a reivindicação 21 de um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero.
25. Utilização de acordo com a reivindicação 20 de colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico) e de um fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio possui uma porosidade superior a 40% e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero.
26. Utilização de acordo com a reivindicação 21 de colagénio, poli(ácido glicólico) ou poli(ácido láctico) e de ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 6/9 um fosfato de cálcio no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o material de implante é poroso e o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamífero.
27. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, em que o PDGF é PDGF humano recombinante.
28. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, em que o líquido compreende PDGF numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,2 mg/ml e cerca de 0,75 mg/ml, preferencialmente numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,25 mg/ml e cerca de 0,5 mg/ml e, em particular, numa concentração de cerca de 0,3 mg/ml.
29. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, em que o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta.
30. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29, em que o fosfato de cálcio compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, em particular de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 200 mícrones e cerca de 3000 mícrones e, preferencialmente, de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 250 mícrones e cerca de 2000 mícrones.
31. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 30, em que o material de implante é reabsorvível, de modo que pelo menos 80% do fosfato de cálcio é reabsorvido no período de um ano após ser implantado sob a forma de uma pelete com 1-5 g. ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 7/9
32. Utilização de acordo com a reivindicação 21, 24 ou 26, em que a referida porosidade compreende partículas de fosfato de cálcio poroso possuindo uma porosidade superior a 40%.
33. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 32, em que o PDGF é PDGF-BB e o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico.
34. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 33, em que o líquido incorporado está absorvido no fosfato de cálcio.
35. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22 ou 27 a 34, compreendendo adicionalmente um agente biologicamente activo, em que o agente biologicamente activo é um anticorpo, um antibiótico, um polinucleótido, um polipéptido, uma proteína, um agente anticanceroso, um factor de crescimento, um agente anti-inflamatório ou uma vacina, em que a referida proteína é preferencialmente uma proteína osteogénica e, em particular, o factor de crescimento análogo à insulina I (IGF-I), o factor de crescimento análogo à insulina II (IGF-II), o factor de crescimento transformante βΐ (TGF-βΐ), o factor de crescimento transformante β2 (TGF^2), o factor de crescimento transf ormante oc (TGF-α) , uma proteína morf ogenét ica óssea (BMP) ou osteogenina.
36. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, 24 e 26, em que a porosidade do material de implante após o seu implante in vivo é uma macroporosidade.
37. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 36, em que o PDGF é PDGF-BB.
38. Utilização de acordo com a reivindicação 21 de um fosfato de cálcio no qual está incorporado um líquido consistindo em factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração num intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 8/9 5000 mícrones, e em que o fosfato de cálcio consiste em fosfato tricálcico beta, para o fabrico de um material de implante destinado a promover o crescimento de osso, do periodonto, do ligamento ou da cartilagem num mamifero.
39. Método de preparação de um material de implante de acordo com a reivindicação 1, que compreende saturar um material de fosfato de cálcio poroso ou de osso desmineralizado num liquido estéril compreendendo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml, em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta e o fosfato de cálcio poroso compreende partículas num intervalo compreendido entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o material de implante preparado consiste no material de fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado o líquido estéril consistindo em PDGF numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio poroso consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones.
41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, em que a concentração de PDGF é de cerca de 0,3 mg/ml.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, em que o referido fosfato de cálcio é seleccionado entre fosfato tricálcico, hidroxiapatite, hidroxiapatite fracamente cristalina, fosfato de cálcio amorfo, metafosfato de cálcio, fosfato dicálcico di-hidratado, fosfato heptacálcico, pirofosfato de cálcio di-hidratado, pirofosfafo de cálcio e fosfato octacálcico.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, em que o fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta.
44. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o material de implante preparado compreende fosfato de cálcio ΕΡ 1 812 076/ΡΤ 9/9 poroso no qual está incorporado o líquido estéril compreendendo PDGF numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio poroso compreende partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, e em que o fosfato de cálcio compreende fosfato tricálcico beta.
45. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o material de implante preparado consiste em fosfato de cálcio poroso no qual está incorporado o líquido estéril consistindo em PDGF numa concentração no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 1,0 mg/ml num tampão, em que o fosfato de cálcio poroso consiste em partículas de tamanho compreendido num intervalo entre cerca de 100 mícrones e cerca de 5000 mícrones, e em que o fosfato de cálcio consiste em fosfato tricálcico beta. Lisboa, 2010-11-11