BRPI0516105B1 - material de implante consistindo em fosfato de cálcio poroso ou colágeno e fosfato de cálcio poroso, material de implante consistindo em aloenxerto ou colágeno e aloenxerto, método de preparação dos mesmos, uso de fosfato de cálcio poroso ou colágeno e fosfato de cálcio poroso na preparação do referido material de implante e uso de aloenxerto ou colágeno e aloenxerto na preparação do referido material de implante - Google Patents

Abstract

composições de fator de crescimento derivado de plaqueta e métodos de uso destas. a presente invenção refere-se a um método para promover o crescimento de osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem em um mamífero aplicando-se ao osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem uma composição que compreende fator de crescimento derivado de plaqueta em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável e um veículo sólido farmaceuticamente aceitável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MATERIAL DE IMPLANTE CONSISTINDO EM FOSFATO DE CÁLCIO POROSO OU COLÁGENO E FOSFATO DE CÁLCIO POROSO, MATERIAL DE IMPLANTE CONSISTINDO EM ALOENXERTO OU COLÁGENO E ALOENXERTO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DOS MESMOS, USO DE FOSFATO DE CÁLCIO POROSO OU COLÁGENO E FOSFATO DE CÁLCIO POROSO NA PREPARAÇÃO DO REFERIDO MATERIAL DE IMPLANTE E USO DE ALOENXERTO OU COLÁGENO E ALOENXERTO NA PREPARAÇÃO DO REFERIDO MATERIAL DE IMPLANTE". Campo da Invenção A presente refere-se à cicatrização de tecidos ósseos e/ou conectivos. Antecedentes da Invenção Os fatores de crescimento são proteínas que ligam-se a receptores sobre a superfície celular, com o resultado primário de ativação da proliferação e/ou diferenciação celular. Muitos fatores de crescimento são bastante versáteis, estimulando a divisão celular em numerosos tipos celulares diferentes; enquanto outros são específicos para um tipo celular particular. Exemplos de fatores de crescimento incluem fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fatores de crescimento tipo insulina IGF-I e II), fator beta de crescimento por transformação (TGF-/3), fator de crescimento epidérmico (EGF), e fator de crescimento de fibroblasto (FGF). PDGF é uma proteína estável ao aquecimento, cati-ônica, encontrada em uma variedade de tipos celulares, incluindo os grânulos de plaque-tas circulantes, células de músculo liso vascular, células endoteliais, macrófago, e cerati-nócitos, e é conhecido estimular a síntese de proteína in vitro e produção de colágeno por fibroblastos. Também é conhecido agir como um mitógeno in vitro e agente quimbtático para fibroblastos, células de músculo liso, osteoblastos, e células gliais. PDGF-BB recombinante humano (rhPDGF-BB) foi mostrado estimular a cicatrização de ferimento e regeneração óssea tanto em animais quanto em seres humanos. É aprovado tanto nos Estados Unidos quanto na Europa para uso humano em aplicações tópicas para acelerar a cicatrização de feridas crônicas do pé de diabético. hPDGF-BB recombinante também foi mostrado ser eficaz ou sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento por melhorar regeneração perioden-tal, isto é, recrescimento ósseo, cimento e ligamento em tomo dos dentes (veja, por exemplo, a Patente U. S. n° 5.124.316, incorporado aqui por referência).

Sumário da Invenção Foi demonstrado que uma baixa dose de rhPDGF (~ 0,1 a 1,0 mg/ml_) promove o reparo de osso, periodôntio, ligamento, e cartilagem. Uma baixa quantidade de rhPDGF pode ser adsorvida em β-TCP, que pode ser implantado no sítio de reparo, de modo que o rhPDGF seja liberado in vivo. A adição de rhPDGF a β-TCP foi mostrada realçar a proliferação e ligação de célula de osteoblasto em comparação a β-TCP não tratada.

Em um primeiro aspecto, a invenção caracteriza um método para promover osso, periodôntio, ligamento, crescimento de cartilagem de ou em um mamífero, por exemplo, um ser humano, administrando um implante de material que contém fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) em uma concentração menor do que cerca de 1,0 mg/ml, tal que o material de implante promova o crescimento do osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem. Em uma modalidade, o PDGF é administrado em uma quantidade menor do que ou igual a 0,3 mg/ml. Em outra modalidade o PDGF é administrado em uma quantidade na faixa de cerca de 0,1 a cerca 1,0 mg/ml. Em diversas modalidades, o PDGF é administrado em uma quantidade entre cerca de 0,2 a cerca de 0,75 mg/ml, cerca de 0,25 a cerca 0,6 mg/ml, e cerca de 0,25 a cerca 0,5 mg/ml. Em uma modalidade, o PDGF é administrado em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferivelmente 0,3 mg/mL. Em outra modalidade, o PDGF é parcialmente ou substancialmente purificado. Em ainda uma outra modalidade, o PDGF é isolado ou purificado de outros contaminantes. Em uma outra modalidade, o PDGF é liberado do material de implante em administração em uma taxa média de 0,3 mg/dia. Em outra modalidade, o PDGF é liberado do material de implante em administração em uma taxa média de 300 pg/dia. Em ainda outras modalidades, o PDGF é liberado do material de implante em uma taxa menor do que 100 pg/dia, menor do que 50 pg/dia, menor do que 10 pg/dia ou menor do que 1 pg/dia. Preferivelmente, o PDGF é liberado durante alguns dias, por exemplo, 1,2, 5, 10,15, 20 ou 25 dias ou até 28 dias ou mais.

Um segundo aspecto da invenção caracteriza um método para promover osso, periodôntio, ligamento ou crescimento de cartilagem em um mamífero, por exemplo, um humano, administrando um material de implante que contém uma quantidade de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) menor do que cerca de 1,0 mg/ml e um veículo farmaceuticamente aceitável tal que o material de implante promova o crescimento do osso, pe-riodôntio, ligamento ou cartilagem, e que permite o osso, periodôntio, ligamento, cartilagem, crescer. Preferivelmente, o PDGF é igual a ou menor do que cerca de 0,3 mg/ml. Em uma modalidade, o PDGF é administrado em uma faixa de cerca de 0,1 a 1,0 mg/ml. Em outras modalidades, a quantidade de PDGF é de cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferivelmente 0,3 mg/mL. Em outra modalidade, o PDGF é parcialmente ou substancialmente purificado. Em contudo uma outra modalidade, o PDGF é isolado ou purificado de outros contaminantes. Antes de administrar o material de implante ao mamífero, o método pode adicionalmente incluir a etapa de produção de uma retalho cirúrgico de pele para expor o osso, periodôntio, ligamento, cartilagem, e em seguida à etapa de administração, substituir o retalho. Em contudo outra modalidade, depois de produzir o retalho cirúrgico, porém antes de administrar o material de implante ao osso, periodôntio, ligamento, cartilagem, o método pode também incluir a etapa de aplainar o osso ou periodôntio para remover a matéria orgânica do osso ou periodôntio. Em contudo outra modalidade, o método promove o crescimento de osso, periodontium, ligamento ou cartilagem danificado ou doente. Em contudo outra modalidade, o método promove o crescimento de osso em locais onde nova formação de osso é requerida como resultado de intervenções cirúrgicas, tal como, por exemplo, extração de dente, aumento de sulco, enxerto estético, e levantamento de seio.

Um terceiro aspecto da invenção caracteriza um material de implante para promover o crescimento de osso, periodôntio, ligamento, cartilagem em um mamífero, por exemplo, um humano. O material de implante inclui um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, aglutinante bio-compatível de aglutinante de um, um agente de substituição de osso, um líquido ou um gel) e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) que está presente em uma concentração menor do que cerca de 1,0 mg/mL. Pre- ferivelmente, o PDGF está presente no material de implante em uma concentração igual a ou menor do que cerca de 0,3 mg/ml. Em uma modalidade, o PDGF é administrado em uma faixa de cerca de 0,1 a 1,0 mg/ml. Em outras modalidades, a quantidade de PDGF é de cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferivelmente 0,3 mg/mL. Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável do material de implante inclui um andaime ou matriz que consiste em um aglutinante biocompatível (por exemplo, car-boximetilceiulose) ou um agente de substituição de osso (/3-TCP) que é capaz de absorver uma solução que inclui PDGF (por exemplo, uma solução que contém PDGF em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca 1,0 mg/mL). Em outra modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é capaz de absorver uma quantidade da solução de PDGF que é igual a pelo menos cerca de 25% de seu próprio peso. Em outras modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável é capaz de absorver uma quantia da solução de PDGF que é igual a pelo menos cerca de 50%, 75%, 100%, 200%, 250% ou 300% ou seu próprio peso. Em uma modalidade, o PDGF é absorvido pelo veículo farmaceuticamente aceitável do material de implante embebendo o veículo farmaceuticamente aceitável em uma solução contendo PDGF. Preferivelmente, o PDGF está presente na solução em uma concentração menor do que cerca de 1,0 mg/ml_. Em outra modalidade, o PDGF está presente na solução em uma concentração igual a ou menor do que cerca de 0,3 mg/ml. Em outra modalidade, o PDGF está presente no solução em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 a 1,0 mg/ml. Contudo em outras modalidades, o PDGF está presente na solução em uma quantidade de cerca de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, preferivelmente 0,3 mg/mL. Em outra modalidade, o PDGF é parcialmente ou substancialmente purificado. Contudo, em uma outra modalidade, o PDGF é isolado ou purificado de outros contaminantes.

Um quarto aspecto da invenção caracteriza um método por preparar para um material de implante para promover o crescimento de osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem em um mamífero, por exemplo, um humano. O método inclui a etapa de combinar o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) parcialmente purificado ou purificado em uma quantidade menor do que cerca de 1,0 mg/mL com uma substância veículo farma-ceuticamente aceitável . Preferivelmente, o PDGF é combinado com uma substância veículo farmaceuticamente aceitável em uma concentração aceitável igual a ou menor do que cerca de 0,3 mg/ml. Em uma modalidade, o PDGF é combinado com uma substância veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade na faixa de cerca de 0,1 a 1,0 mg/ml em uma modalidade. Em outras modalidades, o PDGF é misturado na quantidade de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml. Em outra modalidade, PDGF está misturado na quantidade de 0,3 mg/ml. Em ainda outra modalidade, o PDGF é absorvido pelo veículo farmaceuticamente aceitável para produzir o material de implante.

Um quinto aspecto da invenção caracteriza um frasconete que tem fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/ml_ a cerca 1,0 mg/ml_ em um líquido farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade deste aspecto da invenção, o líquido é tampão de acetato de sódio estéril. Em outra modalidade, o frasconete contém PDGF em uma concentração de cerca de 0,3 mg/mL. Em ainda outra modalidade preferida, o PDGF é PDGF-BB. Em ainda outras modalidades, o PDGF é estável no tampão de acetato de sódio durante pelo menos cerca de 12 meses, preferivelmente pelo menos cerca de 18 meses, mais preferivelmente pelo menos cerca de 24 meses, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 36 meses quando.armazenado em uma temperatura na faixa de cerca de 2°C a 80°C.

Um sexto aspecto da invenção caracteriza um material de implante que inclui um fosfato de cálcio poroso tendo absorvido nele um líquido que contém fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL. Em diversas modalidades, a concentração PDGF é de cerca de 0,3 mg/mL, o fosfato de cálcio é selecionado de fosfato de tricálcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pouco cristalina, fosfato de cálcio de amorfo, metafosfato de cálcio, diidrato de fosfato de dicálcio, fosfato de heptacálcio, diidrato de pirofosfato de cál- cio, pirofosfato de cálcio, e fosfato de octacálcio, e o PDGF é fornecido em um líquido estéril, por exemplo, tampão de acetato de sódio.

Um sétimo aspecto da invenção caracteriza um método de preparar um material de implante saturando um material de fosfato de cálcio em um líquido estéril que inclui fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL um de de cerca 1,0 mg/mL. Em diversas modalidades, a concentração PDGF é de cerca de 0,3 mg/mL, e o fosfato de cálcio é selecionado de fosfato de tricál-cio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pouco cristalina, fosfato de cálcio de amor-fo, metafosfato de cálcio, diidrato de fosfato de dicálcio, fosfato de heptacál-cio, diidrato de pirofosfato de cálcio, pirofosfato de cálcio, e fosfato octacálcio.

Em uma modalidade de todos os aspectos da invenção, o PDGF inclui homo- e heterodímeros de PDGF, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, e PDGF-DD, combinações e derivados destes.

Em uma modalidade de todos os aspectos da invenção, a substância veículo farmaceuticamente aceitável do material de implante é ou adicionalmente inclui um ou mais do seguinte: um aglutinante biocompatível (por exemplo, um polímero natural ou sintético), um agente de substituição de osso, um líquido, e um gel. Em outra modalidade preferida, o material de implante inclui PDGF presente em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável que é adsorvido por um veículo sólido farmaceuticamente aceitável.

Em outra modalidade de todos os aspectos da invenção, o material de implante é preparado combinando-se PDGF isolado, parcialmente purificado, substancialmente purificado ou purificado em uma quantidade na faixa de 0,1 a 1,0 mg/ml, mais preferivelmente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ou 1,0 mg/ml, mais preferivelmente 0,3 mg/ml ou até mesmo menos de 0,1 mg/ml, com uma substância veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, a-glutinante biocompatível, tal como um polímero natural ou sintético (por e-xemplo, colágeno, ácido poliglicólico, e ácido polilático), um agente de substituição de osso (por exemplo, um fosfato de cálcio (por exemplo, fosfato de tricálcio ou hidroxiapatita), sulfato de cálcio ou osso desmineralizado (por exemplo, osso gradeado ou cortical secado por congelamento desmineralizado) ou um gel ou líquido comercialmente disponível (isto é, um ou líquido viscoso ou inerte).

Em várias modalidades, a substância veículo do material de implante é ou adicionalmente inclui, um ou mais aglutinantes biocompatíveis. Um aglutinante biocompatível é um agente que produz ou promove a coesão entre as substâncias combinadas. Exemplos não-limitantes de aglutinantes biocompatíveis adequados incluem polímeros selecionados de polissacarí-deosm ácidos nucléicos, carboidratos, proteínas, polipeptídeos, poli(ácidos de α-hidróxi), poli(lactonas) poli(aminoácidos), poli(anidridos), po-li(ortoésteres), poli(Anidrido-co-imidas), poli(ortocarbonatos), poli(alcanoatos de a-hidróxi), poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres), ácido polilático, poli(L-lactídeo) (PLGA), poli(L-lactídeo-co-D, L-lactídeo), poli(carbonato de D,L-lactídeo-co-trimetileno), ácido poliglicólico, poliidroxibutirato (PHB), poli(s-caprolactona), poli( δ-valerolactona), poli( γ-butirolactona), poli(caprolactona), ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli(cloridrato de alilamina), po-li(cloreto de dialildimetilamônio), poli(etilenoimina), fumarato de polipropileno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbono, poli(etileno glicol), poli(etileno oxido), poli(vinil álcool), po-li(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), copolímeros de bloco de poli(etileno óxido)-co-poli(propileno óxido), poli(etileno tereftalato)poliamida, e copolímeros e misturas destes. Aglutinantes adicionais incluem ácido algínico, goma arábica, goma guar, goma xantam, gelatina,quitina, quitosana, acetato de quitosana, lactato de quitosana, sulfato de condroitina, quitosana de Ν,Ο-carboximetila, uma dextrana (por exemplo, a-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina ou sulfato de dextrana de sódio), cola de fibrina, glicerol, ácido hialurônico, hialuronato de sódio, uma celulose (por exemplo, metilcelulose, carbóxi metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose ou hidroxietil celulose), uma glucosamina, um proteoglicano, um amido (por exemplo, amido de hidroxieti-la ou amido solúvel) ácido lático, um plurônicos, glicerofosfato de sódio, co-lágeno, glicogênio, uma ceratina, seda, e derivados e misturas destes. Em algumas modalidades, o aglutinante biocompatível é solúvel em água. Um aglutinante solúvel em água dissolve do material de implante imediatamente após seu implante in vivo, desse modo introduzindo macroporosidade no material de implante. Esta macroporosidade aumenta a osteocondutividade do material de implante realçando o acesso e, Conseqüentemente, a atividade de remodelagem dos osteoclastos e osteoblastos no sítio de implante. O aglutinante biocompatível pode ser adicionado ao material de implante em quantidades variáveis e em uma variedade de estágios durante a preparação da composição. Aqueles versados na técnica serão capazes de determinar a quantidade de aglutinante e o método de inclusão requeridos para uma determinada aplicação.

Em uma modalidade, a substâncias veículo é ou inclui um líquido selecionado de água, um tampão, e um meio de cultura celular. O líquido pode ser usado em qualquer faixa de pH, porém mais freqüentemente será usado na faixa de pH 5,0 a pH 8,0. Em uma modalidade, o pH será compatível com a estabilidade prolongada e eficácia do PDGF presente no material de implante ou com a estabilidade prolongada e eficácia de outro agente biologicamente ativo desejado. Na maioria das modalidades, o pH do líquido será na faixa de pH 5,5 a pH 7,4. Aglutinantes adequados incluem, porém não estão limitados a, carbonatos, fosfatos (por exemplo, salina tamponadas por Fosfato), e tampões orgânicos tais como Tris, HEPES, e MOPS. Mais freqüentemente, o tampão será selecionado quanto a sua biocompatibilidade com os tecidos hospedeiros e sua compatibilidade com o agente biologicamente ativo. Para a maioria das aplicações em que os ácidos nucléicos, peptídeos ou antibióticos são incluídos no material de implante, uma salina tamponada por fosfato simples bastará.

Em outra modalidade de todos os aspectos da invenção, a substâncias veículo do material de implante é ou adicionalmente inclui, um ou mais agentes de substituição de osso. Um agente de substituição de osso é aquele que pode ser empregado para permanentemente ou temporariamente substituir o osso. Em seguida ao implante, o agente de substituição do osso pode ser mantido pelo corpo ou ele pode ser reabsorvido pelo corpo e substituído com o osso. Agente de substituição de osso exemplar inclui, por exemplo, um fosfato de cálcio (por exemplo, fosfato de tricálcio (por exemplo, β-TCP), hidroxiapatita, hidroxiapatita pouco cristalina, fosfato de cálcio amorfo, metafosfato de cálcio, diidrato de fosfato de dicálcio, fosfato de hep-tacálcio, diidrato de pirofosfato de cálcio, pirofosfato de cálcio, e fosfato de octacálcio), sulfato de cálcio ou osso desmineralizado (por exemplo, osso gradeado ou cortical seco por congelamento desmineralizado)). Em uma modalidade, a substância veículo é biorreabsorvível. Em outra modalidade, o agente de substituição óssea é fornecido como uma matriz de partículas de tamanho mícron ou submícron, por exemplo, partículas de tamanho nano. As partículas podem ser na faixa de cerca de 100 pm a cerca de 5000 pm em tamanho, mais preferivelmente na faixa de cerca de 200 pm a cerca de 3000 pm, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 250 pm a cerca de 2000 pm ou as partículas podem ser na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 1000 nm, preferivelmente menos do que cerca de 500 nm, e mais preferivelmente menos do que cerca de 250 nm. Em outra modalidade, o agente de substituição de osso uma composição porosa. A porosidade da composição visto que ela facilita a migração e infiltração celular na composição de modo que as células possam secretar a matriz óssea extracelular. Ela também fornece acesso para vascularização. A porosidade também fornece uma área de superfície elevada para reabsorção realçada e liberação de substâncias ativas, bem como interação de matriz celular aumentada. Preferivelmente, a composição tem uma porosidade maior do que 40%, mais preferivelmente maior que 65%, e o mais preferido maior do que 90%. A composição pode ser fornecida em uma forma adequada para implante (por exemplo, uma esfera, um cilindro ou um bloco) ou que possa ser classificado por tamanho e modelado antes do uso. Em uma modalidade preferida, o a-gente de substituição de osso é um fosfato de cálcio (por exemplo, β-TCP). O agente de substituição de osso pode também ser fornecido como uma pasta moldável, fluível ou mastique. Preferivelmente, o agente de substituição de osso é uma pasta de fosfato de cálcio que auto-endurece para formar um fosfato de cálcio endurecido antes ou após o implante in vi- vo. O componente de fosfato de cálcio da invenção pode ser qualquer material de fosfato de cálcio biocompatível conhecido na técnica. O material de fosfato de cálcio pode ser produzidos por qualquer um de uma variedade de métodos e empregando quaisquer componentes de partida adequados. Por exemplo, o material de fosfato de cálcio pode incluir fosfato de cálcio apatíti-co, amorfo. O material de fosfato de cálcio pode ser produzidos por reação de base-ácido em estado sólido de reagentes de fosfato de cálcio cristalino para formar sólidos de hidroxiapatita cristalinos. Outros métodos de preparar materiais de fosfato de cálcio são conhecidos na arte, alguns dos quais são descritos abaixo. O material de fosfato de cálcio pode ser hidroxiapatita (HA) ou fosfato de cálcio apatítico pouco cristalino (PCA). O material de PCA é descrito nos pedidos de Patente U. S. nos 5.650.176, 5.783.217, 6.027.742, 6.214.368, 6.287.341, 6.331.312, e 6.541.037 todos os quais são incorporados aqui por referência. HA é descrito, por exemplo, nas Patentes U. S. noS Re. 33.221 e Re. 33.161. Estas patentes ensinam a preparação de composições de remineralização de fosfato de cálcio e de um material veículo de hidroxiapatita gradualmente reabsorvível, de não-cerâmica, finamente cristalino com base na mesma composição de fosfato de cálcio. Um sistema de fosfato de cálcio similar, que consiste em fosfato de tetracálcio (TTCP) e fosfato de monocálcio (MCP) ou sua forma de monoidrato (MCPM), é descrito nos Patentes U. S. noS 5.053.212 e 5.129.905. Este material de fosfato de cálcio é produzido por reação de base de ácido em estado sólido de reagentes de fosfato de cálcio cristalinos para formar sólidos de hidroxiapatita cristalinos.

Materiais de HA cristalinos (geralmente referidos como dahllite) podem ser preparados de modo que eles sejam fluíveis, moldáveis, e capazes de endurecer in situ (veja Patente U. S. n° 5.962.028). Estes materiais de HA (geralmente referidos como hidroxiapatita carbonatada) podem ser formados combinando os reagentes com um líquido não-aquoso para fornecer uma mistura substancialmente uniforme, moldando a mistura como a-propriado, e deixando a mistura endurecer na presença de água (por exem- pio, antes ou após o implante). Durante o endurecimento, a mistura cristaliza em uma estrutura de apatítica sólida e essencialmente monolítica.

Os reagentes geralmente consistirão em uma fonte de fosfato, por exemplo, ácido fosfórico ou sais de fosfato, substancialmente livres de água, um metal alcalino terroso, particularmente cálcio, fonte, núcleos opcionalmente cristalinos, particularmente hidroxiapatita ou cristais de fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, e um lubrificante fisiologicamente aceitável, tal como quaisquer dos líquidos não-aquosos descrito aqui. Os ingredientes secos podem ser pré-preparados como uma mistura e subseqüentemente combinados ou com os ingredientes líquidos não-aquosos sob condições onde ocorre mistura substancialmente uniforme.

Material de fosfato de cálcio é caracterizado por sua capacidade de reabsorção, biocompatibilidade, e sua cristalinidade mínima. Seu caráter cristalino é substancialmente o mesmo do osso natural. Preferivelmente, o material de fosfato de cálcio endurece em menos do que cinco horas, e substancialmente endurece em cerca de uma a cinco horas, sob condições fisiológicas. Preferivelmente, o material é substancialmente endurecido dentro de cerca de 10 a 30 minutos. A taxa de endurecimento sob condições fisiológicas, pode ser variada de acordo com a necessidade terapêutica modificando alguns parâmetros simples como descrito na Patente U. S. n° 6.027.742, que é incorporado aqui por referência.

Em uma modalidade, o material de fosfato de cálcio biorreabsor-vível resultante será "deficiente de cálcio", com uma relação molar de cálcio para fosfato menor do que cerca de 1,6 quando comparado ao valor este-quiométricos ideal de aproximadamente 1,67 para hidroxiapatita.

Os fosfatos de cálcio desejáveis são capazes de endurecer em um ambiente duro, em ou em torno da temperatura corporal em menos do que 5 horas e preferivelmente dentro de 10 a 30 minutos. Os materiais desejáveis são aqueles que, quando implantados como um pélete de 1 a 5 g, são pelo menos 80% reabsorvidos dentro de um ano. Preferivelmente, o material pode ser totalmente reabsorvido.

Em diversas modalidades de todos os aspectos da invenção, o material de implante adicionalmente pode incluir um ou mais agentes biologicamente ativos. Os agentes biologicamente ativos que podem ser incorporados nos materiais de implante da invenção incluem, sem limitação, moléculas orgânicas, materiais inorgânicos, proteínas, peptídeos, ácidos nucléi-cos (por exemplo, fragmentos de gene, sequências reguladoras de gene, e moléculas anti-sentido), nucleoproteínas, polissacarídeos, glicoproteínas, e lipoproteínas. Classes de compostos biologicamente ativos que podem ser incorporados nos materiais de implante da invenção incluem, sem limitação, agentes anticâncer, antibióticos, analgésicos, agentes antiinflamatórios, imu-nossupressores, inibidores de enzima, anti-histaminas, anticonvulsivantes, hormônios, relaxantes musculares, antiespasmódicos, agentes oftálmicos, prostaglandinas, antidepressivos, substâncias antipsicóticas, fatores tráficos, proteínas osteoindutivas, fatores de crescimento e vacinas.

Agentes anticâncer incluem agentes de alquilação, agentes de platina, antimetabólitos, inibidores de topoisomerase, antibióticos antitumor, agentes antimitóticos, inibidores de aromatase, inibidores de timidilato síntese, antagonistas de DNA, inibidores de farnesiltransferase, inibidores de bomba, inibidores de acetiltransferase de histona, inibidores de metalopro-teinase, inibidores de ribonucleosídeo redutase, agonistas/antagonistas de TNF alfa, antagonistas de receptor de endotelina A, agonistas de receptor de ácido retinóico, imunomoduladores, agentes hormonais e anti-hormonais, agentes fotodinâmicos, e inibidores de tirosina cinase.

Qualquer dos agentes biologicamente ativos listados na Tabela 1 pode ser empregado.

Tabela 1.

Os antibióticos incluem aminoglicosídeos (por exemplo, genta-micina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amicacina, neomicina), baci-tracina, corbapenems (por exemplo, imipenem/cislastatina), cefalosporinas, colistina, metecamina, monobactams (por exemplo, aztreonam), penicilinase (por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, natcilina, oxacilina, cloxa-cilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperaci-lina, mezlocilina, azlocilina), polimixina B, quinolonas, e vancomicina; e agentes bacteriostáticos, tais como cloranfenicol, clindanian, macrolídeos (por exemplo, eritromicina, azitromicina, claritromicina), lincomian, nitrofuran-toína, sulfonamidas, tetraciclinas (por exemplo, tetraciclina, doxiciclina, mi-nociclina, demeclocilina) e trimetoprim. São também incluídos metronidazol, fluoroquinolonas, e ritampina.

Inibidores de enzima são substâncias que inibem uma reação enzimática. Exemplos de inibidores de enzima incluem cloreto de edofônio, N-metilfisostigmina, brometo de neostigmina, sulfato de fisostigmina, tacrina, maleato de 1-hidróxi, iodotubercidina, p-bromotetramisol, cloridrato 10-(alfa-dietilaminopropionil)-fentiazina, cloreto de calmidazólio, hemicolínio-3, 3,5-dinitrocatecol, inibidor I de cinase de diacilglicerol, inibidor II de cinase de diacilglicero, 3-fenilpropargilamina, acetato de N6-monometil-L-arginina, car-bidopa, 3-hidroxibenzilidrazina, hidralazina, clorgilina, deprenila, hidroxilami-na, fosfato de iproniazid, 6-MeO-tetraidro-H-pirido-indol, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbazida, tranilcipromina, cloridrato de Ν,Ν-dietilaminoetil-2,2-difenilvalerato, 3-isobutii-1-metilxantna, papaverina, indometacind, cloridrato de 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina, 2,3-dicloro-1-metilbenzilamina (DCMB), cloridrato de 8,9-dicloro-2,3,4,5-tetraidro-1H-2-benzazepina, p-aminoglutetimida, tartarato de p-aminoglutetimida, 3-iodotirosina, alfa-metiltirosina, acetazola-mida, diclorfenamida, 6-hidróxi-2-benzotiazolsulfonamida, e alopurinol.

Antihistaminas incluem pirilamina, clorfeniramina e tetraidrozoli-na, entre outros.

Agentes antiinflamatórios incluem corticosteróides, drogas antiin-flamatórias não esteroidais (por exemplo, aspirina, fenilbutazona, indometa-cina, sulindac, tolmetin, ibuprofeno, piroxicam, e fenamatos), acetamino- phen, fenacetina, sais de ouro, cloroquina, D-Penicilamina, colquicina de metotrexato, alopurinol, probenecid, e sulfinpirazona.

Relaxantes musculares incluem mefenesina, metocarbomal, clo-ridrato de ciclobenzaprina, cloridrato de triexilfenidila, levodopa/carbidopa, e biperiden.

Antiespasmódicos incluem atropina, escopolamina, oxifenônio, e papaverina.

Analgésicos incluem aspirina, fenilbutazona, idometacina, sulin-dac, tolmetic, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofeno, fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina, nalorfina, opióides (por exemplo, sulfato de codeína, citrato de fentanila, bitartarato de hidrocodona, loperamida, sulfato de morfina, noscapina, norcodeína, normorfina, tebaína, nor-binaltorfimina, burprenorfina, clornaltrexamina, funaltrexamiona, nalbufi-na, nalorfina, naloxona, naloxonazina, naltrexona e naltrindol), procaína, li-docaína, tetracaína e dibucaína.

Agentes oftálmicos incluem fluoresceína de sódio, rose Bengal, metacolina, adrenalina, cocaína, atropina, alfa-quimiotripsina, hialuronidase, betaxalol, pilocarpina, timolol, sais de timolol, e combinações destes.

Prostaglandinas são reconhecidos na técnica e são uma classe de ácidos graxos de hidróxi de cadeia longa, quimicamente relacionados, de ocorrência natural que têm uma variedade de efeitos biológicos.

Antidepressivos são substâncias capazes de prevenir ou aliviar a depressão. Exemplos de antidepressivos incluem imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tra-nilcipromina, fenelzina e isocarboxazida.

Fatores de crescimento são fatores cuja presença continuada melhora a viabilidade ou longevidade de uma célula. Os fatores tráficos incluem, sem limitação, proteína de ativação de neutrófilo, proteína quimioa-traente de monócito, proteína inflamatória de macrófago, fator de plaqueta, proteína básica de plaqueta, e atividade de estimulação do crescimento de melanoma; fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento por transformação (alfa), fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento de célula endotelial derivada de plaqueta, fator de crescimento semelhantes à insulina (IGF, por exemplo, IGF-I ou IGF-II), fator neurotrófico de crescimento derivado de glial, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento de nervo, fator indutor de cartilagem/crescimento ósseo (alfa e beta), proteínas morfo-genéticas óssea (BMPs), interleucinas (por exemplo, inibidores de interleuci-na ou receptores de Interleucina, incluindo Interleucina 1 até Interleucina 10), interferons (por exemplo, interferon alfa, beta e gama), fatores hematopoiéti-cos, incluindo eritropoietina, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de estimulação de colônia de macrófago e fator de estimulação de colônia de macrófago-granulócido; fatores de necrose de tumor, fatores de crescimento por transformação (beta), incluindo, beta-1, beta-2, beta-3, fatores de crescimento por transformação (alfa), inibina, e ativina; e proteínas morfogenéticas óssea tais como OP-1, BMP-2 e BMP-7.

Os hormônios incluem estrogênios (por exemplo, estradiol, es-trona, estriol, dietilestibestrol, quinestrol, clorotrianiseno, estradiol de etinila, mestranol), antiestrogênios (por exemplo, clomifeno, tamoxifeno), progesti-nas (por exemplo, medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), antiprogestina (mifepristona), androgênios (por exemplo, cipiona-to de testosterone, fluoximesterona, danazol, testolactona), antiandrogênios (por exemplo, acetato de ciprosterona, flutamida), hormônios de tireóide (por exemplo, triiodotirona, tiroxina, propiltiouracila, metimazol, e iodixoda), e hormônios de pituitária (por exemplo, corticotropina, sumutotropina, oxitocina, e vasopressina). Hormônios são geralmente empregados em terapia de substituição de hormônio e/ou para os propósitos de controle de nascimento. Hormônios esteróides, tais como prednisona, são também empregados como imunossupressores e antiinflamatórios. O agente biologicamente ativo é também desejavelmente selecionado da família de proteínas conhecidas como a superfamília de proteínas dos fatores-beta de crescimento por transformação (TGF-β), que inclui as ativinas, inibinas, e proteínas morfogenéticas óssea (BMPs). Em uma modalidade, o agente ativo inclui pelo menos uma proteína selecionada da subclasse de proteínas conhecidas geralmente como BMPs, que foram des- critas terem atividade osteogênica, e outras atividades tipo crescimento e diferenciação. Estas BMPs incluem as proteínas BMP, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 e BMP-7, descritas por exemplo nas Patentes U. S. noS 5.108.922, 5.013.649, 5.116.738, 5.106.748, 5.187.076; e 5.141.905; BMP-8, descrita na publicação PCT WO 91/18098; e BMP-9, descrita na publicação PCT WO 93/00432, BMP-10, descrita no pedido PCT WO 94/26893, BMP-11, descrita no pedido PCT WO 94/26892 ou BMP-12 ou BMP-13, descrita no pedido PCT WO 95/16035, BMP14, BMP-15, descrita na Patente U. S. n° 5.635.372 ou BMP-16, descrita na Patente U. S. n° 5.965.403. Outras proteínas TGF-β que podem ser úteis como o agente ativo nas composições de fosfato de cálcio da invenção incluem Vgr-2, Jones e outros, Mol. Endocrinol. 6: 1961 (1992), e quaisquer dos fatores de crescimento e diferenciação (GDFs), incluindo aqueles descritos nos pedidos PCT WO 94/15965; WO 94/15949; WO 95/01801, WO 95/01802, WO 94/21681, WO 94/15966, WO 95/10539, WO 96/01845, WO 96/02559 e outros. Também úteis na invenção podem ser BIP, descrito na WO 94/01557, HP 00269, descrito na Publicação JP número: 7-250688, e MP52, descrito no pedido PCT WO 93/16099. As descrições de todos os pedidos acima são incorporadas aqui por referência. Um subgrupo de BMPs que pode ser usado na invenção inclui BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, BMP-14, e MP52. O agente ativo é mais preferivelmente BMP-2, a seqüên-cia da qual é descrita na Patente U: S. n° 5.013.649, a descrição da qual é incorporado aqui por referência. Outros agentes osteogênicos conhecidos na técnica podem também ser empregados, tais como teriparatida (Forteo®), Chrysalin®, prostag landi na E2, proteína LIM, osteogenina ou matriz óssea desmineralizada (DBM), entre outros. O agente biologicamente ativo pode ser sintetizado quimicamen-te, recombinantemente produzidos ou purificado de uma fonte em que o a-gente biologicamente ativo é naturalmente encontrado. O agente ativo, se uma TGF-β, tal como BMPs (por exemplo, um heterodímero composto de um monômero cada de BMP-2 e BMP-6) ou com outros membros da super-família TGF-β, tal como activinas, inibinas e TGF-βΙ (por exemplo, um hete- rodímero composto de um monômero cada de uma BMP e um membro relacionado da superfamília TGF-β). Exemplos de tais proteínas heterodiméricas são descritos por exemplo no Pedido de Patente PCT Publicado WO 93/09229, a especificação do qual é incorporado aqui por referência.

Agentes biologicamente ativos adicionais incluem as proteínas Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus, e Follistatina. Estas famílias de proteínas são geralmente descritas em Sasai e outro, Cell 79: 779-790 (1994) (Chordin); Publicação de Patente PCT WO 94/05800 (Noggin); e Fukui e outro, Devei. Biol. 159: 131 (1993) (Follistatina). As proteínas Hedgehog são descritas no WO 96/16668; WO 96/17924, e WO 95/18856. A família Frazzled de proteínas é uma família de proteínas recentemente descoberta com alta homologia ao domínio de ligação extracelular da família de proteína receptora conhecida como Frizzled. A família Frizzled de genes e proteínas é descrita em Wang e outro, J. Biol. Chem. 271: 4468-4476 (1996). O agente ativo pode também incluir outros receptores solúveis, tais como os receptores solúveis truncados descritos na publicação de patente PCT WO 95/07982. Dos ensinamentos de WO 95/07982, alguém versado na técnica reconhecerá que os receptores solúveis truncados podem ser preparados para numerosas outras proteínas receptoras. As publicações acima são incorporadas aqui por referência. A quantidade da proteína biologicamente ativa, por exemplo, uma proteína osteogênica, que é eficaz para estimular uma atividade desejada, por exemplo, atividade osteogênica aumentada de células progenitoras presentes ou infiltrantes ou outras, dependerá do tamanho e natureza do defeito que está sendo tratado, bem como o veículo que está sendo empregado. Geralmente, a quantidade de proteína a ser liberada é em uma faixa de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg; preferivelmente cerca de 1 a cerca de 100 mg; mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 80 mg.

Os protocolos padrão e regimes para liberação dos agentes listados acima são conhecidos na técnica. Os agentes biologicamente ativos são introduzidos no material de implante em quantidades que permitem a liberação de uma dosagem apropriada do agente para o sítio de implante.

Na maioria dos casos, as dosagens são determinadas empregando-se normas conhecidas pelos práticos e aplicáveis ao agente particular em questão. A quantidade exemplar de agente biologicamente ativo a ser incluído no material de implante da invenção é provável depender de tais variáveis como o tipo e extensão da condição, o estado de saúde geral do paciente particular, a formulação do agente ativo, e a capacidade de biorreabsorção do veículo liberado usado. Experiências clínicas padrão podem ser empregadas para otimizar a dose e freqüência de dosagem para qualquer agente biologicamente ativo particular.

Em uma modalidade de todos os aspectos da invenção, a composição pode adicionalmente conter extratos de plaqueta autóloga ou medula óssea autóloga.

Em outra modalidade de todos os aspectos acima, o PDGF e/ou outros fatores de crescimento podem ser obtidas de fontes naturais, (por exemplo, plaquetas) ou mais preferivelmente, produzidos por tecnologia de DNA recombinante. Quando obtido de fontes naturais, o PDGF e/ou outros fatores de crescimento podem ser obtidas de um fluido biológico. Um fluido biológico inclui qualquer fluido tratado ou não tratado (incluindo uma suspensão) associada com organismos vivos, particularmente sangue, incluindo sangue total, sangue quente ou frio, e sangue armazenado ou fresco; sangue tratado, tal como sangue diluído com peto menos uma solução fisiológica, incluindo porém não limitado a salina, nutriente, e/ou soluções anticoagu-lantes; componentes sangüíneos, tais como concentrado de plaqueta (PC), plaquetas aferezadas, plasma rico em plaqueta (PRP), plasma pobre em plaqueta (PPP), plasma livre de plaqueta, plasma, soro, plasma congelado fresco (FFP), componentes obtidas de plasma, células vermelhas embaladas (PRC), camada leucocitária (BC); produtos de sangue derivados de sangue ou um componente de sangue ou derivado de medula óssea; células vermelhas separadas de plasma e ressuspensas em fluido fisiológico; e plaquetas separadas de plasma e ressuspensas em fluido fisiológico. O fluido biológico pode ter sido tratado para remover alguns dos leucócitos antes de ser processado de acordo com a invenção. Como aqui empregado, produto de san- gue ou fluido biológico refere-se aos componentes acima descritos, e a produtos de sangue ou fluidos biológicos similares obtidas por outros métodos e com propriedades similares. Em uma modalidade, o PDGF é obtido de plasma rico em plaqueta (PRP). A preparação de PRP é descrita, por exemplo, nas Patentes U. S. noS 6.649.072, 6.641.552, 6.613.566, 6.592.507, 6.558.307, 6.398.972, e 5.599.558, que são incorporadas aqui por referência.

Em uma modalidade de todos os aspectos da invenção, o material de implante libera PDGF no sítio de implante por uma duração de tempo maior do que pelo menos 1 dia. Em diversas modalidades, o material de implante libera PDGF no sítio de implante durante pelo menos 7, 14, 21 ou 28 dias. Preferivelmente, o material de implante libera PDGF no sítio de implante por um tempo entre cerca de 1 dia e 7, 14, 21 ou 28 dias. Em outra modalidade, o material de implante libera PDGF no local de implante por um tempo maior que cerca de um dia porém menor do que cerca de 14 dias.

Por "biorreabsorvível" entende-se a capacidade do material de implante ser reabsorvido ou remodelado in vivo. O processo de reabsorção envolve a degradação e eliminação do material de implante original através da ação dos fluidos corporais, enzimas ou células. O material reabsorvido pode ser empregado pelo hospedeiro na formação de novos tecidos ou podem ser de outra maneira reutilizados pelo hospedeiro ou podem ser excretados.

Por "fator de diferenciação" entende-se um polipeptídeo, incluindo uma cadeia de pelo menos 6 aminoácidos, que estimula a diferenciação de uma ou mais células alvo em células com potencial de formação de cartilagem ou osso.

Por "partícula de tamanho nanometro" entende-se uma partícula de tamanho submícron, geralmente definidos como uma partícula abaixo de 1000 nanômetros. Uma partícula de tamanho nanometro é um material de partícula sólido que está em um estado intermediário entre substâncias moleculares e macrons. Um nanometro é definidos como um bilhão de um metro (1 nanometro = 109 m). O material nanometro é conhecido como o pó, fibra, película ou bloco tendo tamanho de nanoescala.

Por "periodôntio" entende-se os tecidos que circundam e sustentam os dentes. O periodôntio sustenta, protege, e fornece nutrição aos dentes. O periodôntio consiste em osso, cimento, processo alveolar dos maxilares e mandíbula, ligamento periodontal, e gengiva. O cimento é uma camada calcificada, fina de tecido que cobre completamente a dentina da raiz do dente. O cimento é formado durante o desenvolvimento da raiz e durante toda a vida do dente e funciona como uma área de ligação para as fibras de ligamento periodontal. O processo alveolar é a porção óssea do maxilar e mandíbula onde os dentes são embutidos e em que as raízes do dente são sustentadas. O encaixe alveolar é a cavidade dentro do processo alveolar em que a raiz do dente é sustentada pelo ligamento periodontal. O osso que divide um encaixe de outro é chamado o septo interdental. Quando os dentes multienraizados estão presente, o osso é chamado de septo inter-radicular. O processo alveolar inclui a placa cortical, crista alveolar, osso tra-becular e o próprio osso alveolar .

Por "promover o crescimento" entende-se a cicatrização de osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem, e a regeneração de tais tecidos e estruturas. Preferivelmente, o osso, periodôntio, ligamento ou cartilagem é danificado ou ferido e requer a regeneração ou cicatrização.

Por "promover o crescimento do periodôntio" entende-se a regeneração ou cicatrização dos tecidos de sustentação de um dente incluindo o osso alveolar, cimento, e ligamento periodontal interposto, que foi danificado por doença ou trauma.

Por "purificado" entende-se um fator de crescimento ou diferenciação, por exemplo, PDGF, que antes da mistura com uma substâncias veículo, é 95% ou maior em peso, isto é, o fator é substancialmente livre de outras proteínas, lipídeos, e carboidratos com os quais ele está naturalmente associado. O termo "substancialmente purificado" refere-se a uma pureza menor de fator, tendo, por exemplo, apenas 5% - 95% em peso do fator, preferivelmente 65% a 95%. Uma preparação de proteína purificada geralmente produzirá uma única faixa principal em um gel de poliacrilamida. Mais preferivelmente, o fator purificado empregado em materiais de implante da inven- ção é puro como julgado pela análise de seqüência de aminoácido de terminal amino. O termo "parcialmente purificado" refere-se a PDGF que é fornecido no contexto de PRP, PPP, FFP ou qualquer outro produto de sangue que requer a coleta e separação, por exemplo, por centrifugação, para produzir. A título de exemplo, uma solução tendo ~ 1,0 mg/mL de PDGF, quando ~ 50% pura, constitui ~ 2,0 mg/mL da proteína total.

Os materiais de implante desta invenção ajudam na regeneração de periodôntio, pelo menos em parte, promovendo o crescimento de tecido conectivo, osso, e cimento. Os materiais de implante podem ser preparados de modo que eles promovam diretamente o crescimento e a diferenciação de células que produzem tecido conectivo, osso, e cimento. Altemativamen-te, os materiais de implante podem ser preparados de modo que eles ajam indiretamente, por exemplo, atraindo as células que são necessárias para promover o crescimento de tecido conectivo, ósseo, e cimento. A regeneração empregando-se uma composição desta invenção é um tratamento mais eficaz de doenças periodontais ou ferimentos ósseos do que aquele obtido empregando-se antibióticos sistêmicos ou debridamento cirúrgico sozinho. O PDGF, fatores de crescimento de polipeptídeo e fatores de diferenciação podem ser obtidos de tecidos ou células humanos, por exemplo, plaquetas, por síntese de peptídeo de fase sólida ou por tecnologia de DNA recombinante. Desse modo, pelo termo "fator dé crescimento de polipeptídeo" ou "fator de diferenciação," nós queremos dizer tecido ou materiais sintetizados, recombinantes ou derivados de célula. Se o fator for um dímero, por exemplo, PDGF, o fator recombinante pode ser um heterodímero recombinante, feito por inserção em sequências de DNA de células procarióticas ou eucarióticas cultivadas codificando ambas subunidades do fator e em seguida permitindo as subunidades transladadas ser processadas pelas células para formar um heterodímero (por exemplo, PDGF-AB). Alternativamente, DNA codificando apenas uma das subunidades (por exemplo, cadeia A ou cadeia B de PDGF) pode ser inserido em células, que em seguida são cultivadas para produzir o fator de heterodímero (por exemplo, homodímeros de PDGF-AA ou PDGF-BB). PDGF para uso nos métodos da invenção inclui homo e heterodímeros de PDGF, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, e PDGF-DD, e combinações e derivado destes. A concentração de PDGF ou de outros fatores de crescimento da invenção pode ser determinada empregando-se, por exemplo, um imuno-ensaio ligado por enzima, como descrito em, por exemplo, Patente U.S. Ν'*5. 6.221.625, 5.747.273, e 5.290.708, incorporadas aqui por referência ou qualquer outro ensaio conhecido na técnica para determinar a concentração de proteína. Quando fornecido aqui, a concentração molar de PDGF é determinada com base no peso molecular do dímero de PDGF (por exemplo, PDGF-BB; PM= aproximadamente 25 kDa).

Os métodos e materiais de implante da invenção podem ser u-sados empregados para curar feridas ósseas de mamíferos, por exemplo, fraturas, sítios recipientes de implante e sítios de doença periodontal. Os materiais de implante promovem crescimento do tecido conjuntivo e reparo e realça a formação óssea comparada à cicatrização natural (isto é, nenhum agente exógeno adicionado) ou cicatrização suplementada por adição de antibióticos sistêmicos. Ao contrário da cicatrização natural distinta, terapia cirúrgica convencional ou antibióticos, os materiais de implante da invenção sugerem osso aumentado, tecido conjuntivo (por exemplo, cartilagem e ligamento) e formação de cimento quando aplicado aos tecidos danificados e doentes ou aos sítios afetados pela doença periodontal. A restauração destes tecidos leva a um prognóstico melhorado para as áreas afetadas. A capacidade destes fatores estimular a nova formação óssea torna-se aplicável para tratar defeitos ósseos causados por outros tipos de infecção ou trauma cirúrgico ou acidental.

Outros aspectos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da seguinte descrição das modalidades desta, e das reivindicações. Breve Descrição dos Desenhos As Figuras 1A-1G são fotomicrografias que mostram o efeito sobre a formação de osso 8 semanas depois do tratamento. Figura 1A é uma fotomicrografia que mostra o efeito de cirurgia apenas na formação do osso. Figura 1B é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP apenas na formação do osso. Figura 1C é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP + 0,3 mg/mL de PDGF sobre a formação do osso. Figura 1D é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP + 1,0 mg/mL de PDGF sobre a formação do osso. Figura 1E é uma fotomicrografia que mostra o efeito do aloenxerto de osso seco por congelamento desmineralizado (DFDBA) apenas na formação do osso. Figura 1F é uma fotomicrografia que mostra o e-feito de aloenxerto de osso seco por congelamento desmineralizado (DFDBA) + 0,3 mg/mL de PDGF sobre a formação do osso. Figura 1G é uma fotomicrografia que mostra o efeito de aloenxerto de osso seco por congelamento desmineralizado (DFDBA) + 1,0 mg/mL sobre a formação do osso.

As Figuras 2A-2C são fotomicrografias que mostram o efeito sobre a formação do osso 16 semanas depois do tratamento. Figura 2A é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP apenas sobre a formação do osso. Figura 2B é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP + 0,3 mg/mL de PDGF sobre a formação do osso. Figura 2C é uma fotomicrografia que mostra o efeito de β-TCP + 1,0 mg/mL de PDGF sobre a formação do osso.

Descrição Detalhada Foram descritas várias modalidades da invenção agora. Dois exemplos que demonstram o uso de PDGF como um agente de cicatrização do periodonto e osso são apresentados abaixo.

Exemplos Exemplo I: Preparação de PDGF

Feridas ósseas, por exemplo, seguindo trauma ou doença perio-dontal, são tratadas e o periodonto, incluindo osso, cimento e tecido conjun-tivo, são regenerados, de acordo com a invenção combinando-se PDGF purificado ou parcialmente purificado com quaisquer das substâncias de veículo farmaceuticamente aceitável descritas acima. PDGF purificado pode ser obtido de uma fonte recombinante ou de plaquetas humanas. PDGF recom-binante comercialmente disponível pode ser obtido de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN), BD Biosciences (San Jose, CA), e Chemicon, Internacional (Temecula, CA). PDGF parcialmente purificado e purificado pode da mesma forma ser preparado como segue: Quinhentas a 1000 unidades de péletes de plaqueta humanas lavadas são suspensas em 1M de NaCI (2 ml por unidade de plaqueta) e aquecidas a 100°C durante 15 minutos. O sobrenadante é em seguida separado por centrifugação e o precipitado extraído duas vezes com 1 m de NaCI.

Os extratos são combinados e dialisados contra 0,08M de NaCI/ 0,01 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4) e misturado durante a noite às 4°C com CM-Sephadex C-50 equilibrada com tampão. A mistura é em seguida derramada em uma coluna (5 x 100 cm), lavada extensivamente com 0,08M de NaCI/0,01M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4), e eluída com 1M de NaCI enquanto frações de 10 ml são coletadas.

As frações são agrupadas e dialisadas contra 0,3M de NaCI/0,01 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4), centrifugadas, e passadas a 4°C através de uma coluna de 2,5 x 25 cm de sefarose azul (Pharmacia) equilibrada com 0,3M de NaCI/0,01 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4). A coluna é em seguida lavada com o tampão e PDGF parcialmente purificado eluído com uma solução de 1: 1 de 1M de NaCI e etileno glicol.

As frações de PDGF parcialmente purificado são diluídas (1:1) com 1M de NaCI, dialisadas contra 1M de ácido acético e liofilizadas. As amostras liofilizadas são dissolvidas em 0,8M de NaCI/0,01 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4) e passadas através de uma coluna de 1,2 x 40 cm de Cm-Sephadex C-50 equilibrada com o tampão. PDGF é em seguida eluído com um gradiente de NaCI (0,08 a 1M).

As frações ativas são combinadas, dialisadas contra 1M de ácido acético, liofilizadas, e dissolvidas em um volume pequeno de 1M de ácido acético. Porções de 0,5 ml são aplicadas a uma coluna de 1,2 x 100 cm de Biogel P-150 (100 a 200 malhas) equilibrada com 1M de ácido acético. O PDGF é em seguida eluído com de 1M de ácido acético enquanto frações de 2 mL são coletadas.

Cada fração ativa contendo 100 a 200 mg de proteína é liofiliza-da, dissolvida em 100 mL de ácido trifluoroacético a 0,4%, e submetida à cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa em uma coluna Bondapak (Waters). A eluição com um gradiente de acetonitrilo linear (0 a 60%) produz o PDGF puro. PDGF Feito Por Tecnologia de DNA Recombinante Pode Ser Preparado Como Segue: Fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) derivado de plaquetas humanas contém duas seqüências de polipeptídeo (polipeptídeos de PDGF-A e PDGF-B; Antoniades, H.N. e Hunkapiller, M., Science 220:963-965, 1983). PDGF-B é codificado por um gene localizado no cromossomo 7 (Betsholtz, C. e outros, Nature 320:695-699), e PDGF-A é codificado pelo oncogene sis (Doolittle, R. e outros, Science 221:275-277, 1983) localizado no cromossomo 22 (Dalla-Favera, R., Science 218:686-688, 1982). O gene sis codifica a proteína transformadora do Vírus de Sarcoma de Símio (SSV) que é estritamente referido ao polipeptídeo de PDGF-2. O c-sis celular humano da mesma forma codifica a cadeia de PDGF-A (Rao, C. D. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2392-2396, 1986). Porque as duas cadeias de polipeptídeo de PDGF são codificadas por dois genes diferentes localizados em cromossomos separados, existe a possibilidade que PDGF humano consiste em um heterodímero ligado por dissulfeto de PDGF-B e PDGF-A ou uma mistura de dois homodímeros (homodímero de PDGF-BB e homo-dímero de PDGF-AA) ou uma mistura do heterodímero e de dois homodímeros. Células mamíferas na cultura infetada com o Vírus de Sarcoma de Símio que contêm o gene que codifica a cadeia de PDGF-A, foram mostrado para sintetizar o polipeptídeo de PDGF-A e processá-lo em um homodímero ligado por dissulfeto (Robbins e outros, Nature 305:605-608, 1983). Além disso, o homodímero de PDGF-A reage com anti-soros construídos contra PDGF humano. Além disso, as propriedades funcionais do homodímero de PDGF-A segregado são similares aquelas de PDGF derivado de plaqueta desde que estimule a síntese de DNA em fibroblastos cultivados, induzem a fosforilação no resíduo de tirosina de uma proteína de membrana celular de 185 kD, e são capazes de competir com (125I)-PDGF humano para ligar-se a receptores de PDGF de superfície celular específica (Owen, A. e outros, Science 225:54-56, 1984). Propriedades similares foram mostradas para o produto de gene de sis/PDGF-A derivado de células humanas normais cultivadas (por exemplo, células endoteliais arteriais humanas) ou de células malignas humanas que expressam o gene de sis/PDGF-2 (Antonia-des, H. e outros, Câncer Cells 3:145-151, 1985). O homodímero de PDGF-B recombinante é obtido pela introdução de clones de cDNA de gene de c-sis/PDGF-B em células de camundon-go empregando um vetor de expressão. O clone de c-sis/PDGF-B empregado para a expressão foi obtido de células endoteliais cultivadas humanas normais (Collins, T, e outros, Nature 216:748-750, 1985).

Uso de PDGF PDGF sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento é útil para promover a cicatrização do osso, crescimento e regeneração do osso ou cicatrização das estruturas de suporte dos dentes prejudicados por trauma ou doença. É da mesma forma útil promover a cicatrização de um sítio de extração de um dente, para aumento da crista mandibular ou em sítios de implante de dente. A cicatrização do osso da mesma forma seria realçada em sítios de fratura óssea ou em áreas infectadas, por exemplo, osteomielite ou em sítios de tumor. PDGF é da mesma forma útil para promover o crescimento e cicatrização de um ligamento, por exemplo, o ligamento periodontal e do cimento.

No uso, o PDGF ou outro fator de diferenciação ou crescimento é diretamente aplicado à área que necessita de cicatrização ou regeneração. Geralmente, é aplicado em um veículo reabsorvível ou não reabsorvível como um líquido ou sólido, e o sítio em seguida revestido com uma bandagem ou tecido próximo. Uma quantidade suficiente para promover o crescimento do osso está geralmente entre 500 ng e 5 mg para uma área de 1 cm2, mas o limite superior é realmente 1 mg para uma área de 1 cm2, com uma quantidade preferida de PDGF aplicado sendo 0,3 mg/mL.

Exemplo II: Regeneração Peridental Com Andaimes Osteocondutivos Tratados com rhPDGF-BB A eficácia de PDGF na promoção do periodonto e crescimento ósseo é demonstrada pelo seguinte estudo.

Estudo em Cachorro In Vivo O cachorro beagle é o modelo de animal mais amplamente empregado para testar procedimentos e materiais de regeneração periodontal putativos (Wikesjo e outros, J Clin. Periodontal. 15:73 - 78, 1988; Wikesjo e outros, J. Clin. Periodontal. 16:116-119, 1999; Cho e outros, J. Periodontol. 66:522-530, 1995; Giannobile e outros, J Periodontal. 69:129-137, 1998; e Clergeau e outros, J. Periodontol. 67:140-149, 1996). O acúmulo de cálculo e placa pode induzir a inflamação gengival que pode levar à perda óssea marginal e a etiologia de periodontite em cachorros e humanos pode ser comparada. Em doença de ocorrência natural, entretanto, há uma falta de uniformidade entre os defeitos. Adicionalmente, como mais atenção foi dada à saúde oral em colônias de criador caninas, tomou-se não prático obter animais com doença periodontal natural. Portanto, o modelo de bifurcação de Classe II horizontal cirurgicamente induzida III tomou-se um dos modelos mais geralmente empregados para investigar a regeneração e cicatrização periodontal.

Cachorros beagle com defeitos de bifurcação de Classe III horizontal foram tratados empregando as composições de PDGF da invenção. Quinze cachorros beagle adultos contribuíram 60 defeitos tratados. Quarenta e dois defeitos passam por biópsia dois meses depois do tratamento e quinze defeitos passaram por biópsia quatro meses depois do tratamento. Preparação do Defeito O modelo de defeito periodontal de "tamanho crítico" como descrito por numerosos investigadores foi utilizado (veja, por exemplo, Wikesjo, 1988 e 1999, supra; Giannobile, supra, Cho, supra, e Park e outros, J. Periodontal 66:462-477, 1995). Ambos quadrantes mandibulares em 16 cachorros beagle machos (2-3 anos de idade) sem os problemas de saúde orais e gerais são empregados. Um mês antes da dosagem, os animais foram sedados com uma injeção subcutânea de atropina (0,02 mg/kg) e acepromazi-na (0,2 mg/kg) aproximadamente 30 minutos antes de ser anestesiados com uma injeção IV de pentobarbital sódico (25 mg/kg). Seguindo a infiltração local da área cirúrgica com HCI de Lidocaína mais epinefrina 1: 100,000, retalhos mucoperiosteais de espessura ampla foram refletidas e os primeiros e terceiros pré-molares (P1 e P3) foram extraídos. Adicionalmente, a porção proximal da coroa do 1o molar foi ressecada.

Osso alveolar foi em seguida removido ao redor da circunferência inteira de P2 e P4, incluindo as áreas de bifurcação empregando cinzéis e brocas de diamante e carboneto resfriado com água. Defeitos ósseos horizontais foram criados tal que havia uma distância de 5 mm do fórnice da bifurcação à crista do osso. Os defeitos foram de aproximadamente 1 cm de largura, dependendo da largura do dente. As raízes de todos os dentes experimentais foram aplanadas com curetas e instrumentos ultra-sônicos e instrumentadas com uma broca de diamante afilada para remover o cimento. Depois que os defeitos ósseos padronizados foram criados, os retalhos gen-givais foram suturadas para obter o fechamento primário. Os animais foram alimentados com uma dieta branda e receberam enxágües de clorexidina diariamente durante a duração do estudo.

Aplicação de Material de Enxerto Os defeitos periodontais de P2 e P4 em cada quadrante mandi-bular dos 15 animais foram aleatorizados antes do tratamento empregando envelopes lacrados. Cerca de quatro semanas depois da preparação de defeito, os animais foram reanestesiados como descrito acima e retalhos com espessura ampla foram refletidas em ambos os quadrantes mandibulares. Uma incisura foi colocada nas superfícies da raiz do dente na crista óssea residual empregando uma broca redonda de 1/2 para servir como um ponto de referência histológico futuro. Os sítios foram irrigados com solução salina estéril e as raízes foram tratadas com ácido cítrico como previamente descrito com a finalidade de desinfecção e remoção da camada de esfregaço (Veja, por exemplo, Cho, supra, e Park, supra). Durante este período, uma quantidade de β-TCP ou DFDBA suficiente para preencher o defeito perio-dontal foi saturada com uma solução de solução de rhPDGF-BB (0,3 ou 1,0 mg/ml) e a mistura de enxerto/rhPDGF-BB foi permitida assentar no ponto cirúrgico estéril durante cerca de dez minutos. O enxerto saturado de rhPDGF-BB foi em seguida embalado no defeito com pressão suave ao nível ideal de regeneração óssea.

Depois de implantação do material de enxerto, os retalhos mu-coperiosteais foram suturados aproximadamente no nível da junção esmal-todentinária (CEJ) empregando suturas de põlitetrafluoroetileno expandida (ePTFE) de 4.0 interrompidas, interproximais. Seguindo a suturação dos retalhos, gel de gliconato de clorexidina foi colocado suavemente ao redor dos dentes e gengivas.

Grupos de Tratamento e Controle Os defeitos receberam qualquer destes: 1. β-TCP 2. β -TCP mais rhPDGF-BB (0,3 mg/ml de rhPDGF-BB) 3. β-TCP mais rhPDGF-BB (1,0 mg/ml de rhPDGF-BB) 4. Cão DF DBA 5. Cão DFDBA mais rhPDGF-BB (0,3 mg/ml de rhPDGF-BB) 6. Cão DFDBA mais rhPDGF-BB (1,0 mg/ml de rhPDGF-BB) 7. Cirurgia simulada (tratada por debridamento de ponta aberta, nenhum enxerto) Seis defeitos por grupo de tratamento foram biopsiados em dois meses (42 sítios totais). Além disso, cinco defeitos nos grupos de tratamento 1,2, e 3 foram biopsiados em quatro meses (15 sítios totais).

Tabela 2. Planejamento Experimental Conseqüentemente, em 8 semanas existem 7 grupos divididos entre 42 sítios em 11 cães. Em 16 semanas, existem 3 grupos divididos entre 15 sítios em 4 cães (um cão recebeu duas cirurgias de tratamento alternadas oito semanas de espaçamento e desse modo contribuiu dois sítios a cada 8 e 16 semanas pontos de tempo de semana).

Tratamento Pós-Cirúrqico Os sítios cirúrgicos foram protegidos alimentando-se os cães com uma dieta macia durante as 4 primeiras semanas pós-operativas. Para garantir o tratamento antibiótico sistêmico curativo ideal, com benzatina de penicilina G foi fornecido durante as duas primeiras semanas e o controle de placa foi mantido por irrigação diariamente com 2% de gliconato de clorexi-dina em toda a experiência. As suturas foram removidas depois de 3 semanas.

Coleta de dados Fundamento Lógico para Pontos de Coleta de Dados O ponto de tempo de oito semanas foi escolhido porque este é o ponto de tempo mais comum reportado para este modelo na literatura e portanto há dados históricos substanciais. Por exemplo, Wikesjo e outros, supra, e Giannobile e outros, supra, também escolheram 8 semanas para avaliar os efeitos regenerativos de BMP-2 e OP-I, respectivamente, no mesmo modelo. Adicionalmente, Park e outros, supra, avaliou o efeito ou rhPDGF-BB aplicado diretamente à superfície da raiz condicionada com e sem membranas de GTR no modelo de cão bigle de 8 semanas. Estes estudos, fortemente sugerem que o período de 8 semanas deveria ser ideal para ilustrar os efeitos significantes potenciais entre as várias modalidades de tratamento. O ponto de tempo de dezesseis semanas foi escolhido para avaliar efeitos em longo prazo de tratamento de fator de crescimento. Estudos anteriores (Park e outros, supra) sugerem que neste tempo há cura espontânea substancial dos defeitos ósseos. Não obstante, é possível avaliar se o tratamento de rhPDGF-BB conduz a qualquer resposta de tecido anormal ou incomum, tal como osso remodelagem óssea alterada, tumorigênese ou re-absorção radicular.

Avaliações do Tratamento e Biópsias Na hora da biópsia, os animais foram perfundidos com 4% de paraformaldeído e sacrificados. As mandíbulas foram então removidas e colocadas no fixador. As radiografias periapicais foram tiradas e os sítios tratados foram cortados em blocos individuais empregando um serra a diamantes. Os blocos codificados (fechados) foram embrulhados em gaze, imersos em uma solução de 4% de formaldeído, processados, e analisados.

Durante o processamento as biópsias foram desidratadas em etanol que e infiltradas que e incluídas em metilmetacrilato. As seções não calcificadas de aproximadamente 300 pm em espessura foram obtidas empregando uma serra a diamante de baixa velocidade com refrigeração. As seções foram coladas sobre o vidro acrílico opalescente, moído para uma espessura final de aproximadamente 80 pm, e manchado com azul toluidina e fucsina básica. As seções seriais da etapa foram obtidas em um plano me-sodistal.

As análises histomorfométricas foram realizadas nas lâminas cobertas. Os seguintes parâmetros foram avaliados: 1. Comprimento do Aparato de Ligação Novo Completo (CNAA): Regeneração periodontal medida como a distância entre o nível de coronal do osso velho e o nível coronal do osso novo, incluindo somente aquele osso novo adjacente ao cimento novo com ligamento periodontal funcionalmente orientado entre o osso novo e o cimento novo. 2. Enchimento do Osso Novo (NB): Medida como a área em seção transversal do osso novo formado na bifurcação. 3. Enchimento de Tecido Conjuntivo (CT): Medido como a área na bifurcação ocupada pelos tecido conjuntivo gengival. 4. Nulo (VO): A área de recessão onde há uma ausência de tecido. Resultados A. Observações Clínicas Clinicamente, todos os sítios curaram bem. Houve uma impressão que os sítios tratados com rhPDGF-BB curaram mais rapidamente, como indicado pela presença de gengivas rosas, firmes em uma semana pós- operativamente. Não houve nenhum evento adverso experimentado em qualquer grupo de tratamento como avaliado por inspeção visual dos sítios tratados. Pareceu ser aumentada a recessão gengival nos grupos que receberam β-TCP ou DFDBA apenas. B. Observações Radioqráficas Radiograficamente, houve evidência de formação óssea aumentada em dois meses como julgado pela radiopacidade aumentada nos Grupos 2, 3 (β-TCP + rhPDGF-BB 0,3 e 1,0 mg/ml, respectivamente) e 6 (DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml) comparado com os outros grupos (Figuras 1A-G). Em quatro meses, houve evidência de formação óssea aumentada em todos os grupos comparados com o ponto de tempo de dois meses. Não houve nenhuma evidência radiográfica de qualquer remodelagem óssea anormal, reabsorção radicular ou ancilose em qualquer grupo.

Tabela 3. Resultados Radioqráficos. Ordem de classificação.________________ * 1= mais enchimento; 7= menos enchimento C. Análises Histomorfométricas: A avaliação histomorfométrica do comprimento do cimento novo, osso novo, e ligamento periodontal novo (CNAA) bem como enchimento ósseo novo, enchimento de tecido conjuntivo, e espaço vazio foram avaliados e são expressos como porcentagens. No caso de CNAA, os valores para cada grupo de teste representam as medições de CNAA (comprimento em mm)/comprimento de CNAA disponível total (em mm) x 100%. O enchimento ósseo, enchimento de tecido conjuntivo e espaço vazio foram avaliados e são expressos como porcentagens da área de defeito de bifurcação total. A análise unidirecional de variação (ANOVA) foi empregada para testar quanto às diferenças globais entre os grupos de tratamento, e comparações em pares foram feitas empregando o teste t de Student. Diferenças significantes entre os grupos foram constatadas sob análises das lâminas codificadas.

Tabela 4. Análise histomérica de dois meses. * Grupos 2 e 3 significantemente maiores (p < 0,05) do que os Grupos 4 e 7. * * Grupo 1 significantemente maior (p < 0,05) do que o Grupo 4. f Grupo 2 significantemente maior (p < 0,05) do que o Grupo 5. $ Grupos 2 e 3 significantemente maiores do que os Grupos 1,4 e 7. Φ Grupo 6 significantemente maior do que o Grupo 4.

As porcentagens médias da regeneração periodontal (CNAA) na cirurgia sem enxertos e cirurgia mais grupos de β-TCP sozinho foram 27% e 37%, respectivamente. Em contraste, os grupos de β-TCP contendo rhPDGF-BB exibiram regeneração periodontal significantemente maior (p < 0,05) do que a cirurgia sem enxertos ou DFDBA sozinho (59% e 46% respectivamente para as concentrações de 0,3 e 1,0 mg/ml contra 27% para cirurgia sozinha e 13% para DFDBA sozinho). Finalmente, o grupo de β-TCP que contém 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB demonstrou regeneração periodontal significantemente maior (p < 0,05) do que a mesma concentração de rhPDGF-BB combinado com aloenxerto (59% versus 21 %). O enchimento ósseo foi significantemente maior (p < 0,05) nos grupos de β-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB (84,0%) e β-TCP + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (74,2%) do que nos grupos de tratamento de β-TCP sozinho (28,0%), cirurgia sozinha (34%) ou DFDBA sozinho (6%). Também houve enchimento ósseo significantemente maior (p < 0,05) para o grupo de β-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB comparado com o grupo de DFDBA + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB (84% e 20% respectivamente). O grupo de análises examinando os dados de 8 semanas dos grupos de DFDBA e do grupo de cirurgia sozinha (Grupos 4, 5, 6, e 7) não demonstrou nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos de DFDBA e cirurgia sozinha para regeneração periodontal (CNAA). Houve uma tendência de maior regeneração para aqueles sítios tratados com DFDBA realçado com 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB versus DFDBA sozinho. Houve enchimento ósseo significantemente maior (p < 0,05) para os sítios tratados com DFDBA + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB do que DFDBA sozinho (46 e 6% respectivamente). Houve uma tendência ao maior enchimento ósseo para sítios tratados com DFDBA contendo 0,3 mg/ml de rhPDGF - BB comparado com DFDBA sozinho ou cirurgia sozinha. Entretanto, os sítios tratados com DFDBA sozinho demonstraram menos enchimento ósseo no defeito do que a cirurgia sozinha (6 e 34%, respectivamente), com a maioria do defeito sendo destituída de qualquer enchimento ou enchimento consistindo em tecido conjuntivo gengival (mole).

Em quatro meses seguintes ao tratamento, as diferenças signifi-cantes permaneceram na regeneração periodontal. O β-TCP sozinho, como resultado de ancilose extensa, resultou em 36% de regeneração, ao mesmo tempo em que os sítios tratados β-TCP contendo rhPDGF-BB tiveram uma regeneração média de 58% e 49% nas concentrações de o 0,3 e 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. O enchimento ósseo substanciai esteve presente em todos os três grupos de tratamento. O β-TCP sozinho resultou em 70% de enchimento ósseo, β-TCP mais 0,3 mg/ml de rhPDGF produziu 100% de enchimento ao mesmo tempo em que o grupo de 1,0 mg/ml de rhPDGF teve 75% de enchimento. D, Avaliação Histolóqica A avaliação histológica foi realizada para todas as biópsias exceto uma, na qual a avaliação não foi possível devido às dificuldades encontradas durante o processamento.

As fotomicrografias representativas são mostradas nas Figuras 1A-G e 2A-C. A Figura 1A mostra os resultados de um local tratado com cirurgia sozinha (nenhum enxerto). Este espécime demonstra a regeneração periodontal limitada (osso novo (NB), cimento novo (NC), e ligamento perio-dontal (PDL)) como comprovado na área das chanfraduras e prolongando somente uma distância curta coronariamente. A área da bifurcação é principalmente ocupada pelo tecido conjuntivo (CT) mole denso com mínima formação do osso novo (NB).

Para os sítios tratados com β-TCP sozinho (Figura 1B) há regeneração periodontal, similar àquela observada para o espécime de cirurgia sozinha, que se estende da base das chanfraduras para uma distância coronariamente curta. Gomo foi visto nos espécimes de cirurgia sozinha, houve pouquíssima formação de osso novo com a maior área da bifurcação sendo ocupada pelo tecido conjuntivo mole.

Em contraste, a Figure 1C ilustra os resultados obtidos para os sítios tratados com β-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB. A regeneração periodontal significante é mostrada com osso novo, cimento novo, e ligamento periodontal que se estende ao longo da superfície inteira da bifurcação. Adicionalmente, a área da bifurcação é carregada com osso novo que estende a altura inteira da bifurcação ao fórnix.

Os resultados representativos para sítios tratados com β-TCP + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB são mostrados na Figura 1D. Ao mesmo tempo em que há regeneração periodontal significante na bifurcação, ela não se estende ao longo da superfície inteira da bifurcação. Há formação de osso novo presente junto com o tecido conjuntivo mole que é observado na porção coronal do defeito junto com um espaço pequeno que está sem qualquer tecido (VO) no fórnix da bifurcação.

As Figuras 2A, 2B, e 2C ilustram os resultados obtidos para os grupos de tratamento de aloenxerto. Os resultados representativos para o grupo de DFDBA sozinho (Figura 2A) mostram regeneração periodontal muito pobre que é limitada à área das chanfraduras estendendo-se somente ligeiramente em uma direção coronal. A formação de osso novo é limitada e consiste em quantidades pequenas de formação de osso ao longo da superfície de material de enxerto de DFDBA residual (manchamento vermelho escuro ao longo das ilhas rosas mais claras). Adicionalmente, o osso novo é rodeado por tecido conjuntivo mole extenso que se estende coronariamente para carregar uma área significante na bifurcação. Finalmente, um grande espaço vazio estende-se da extensão coronal do tecido conjuntivo mole para o fórnix da bifurcação.

Os resultados histológicos o DFDBA + 0,3 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB são mostrados nas Figuras 2B e 2C, respectiva mente. Ambos os grupos demonstram maior regeneração periodontal comparado com DFDBA sozinho com um aparato de ligação novo completo (osso novo, cimento novo, e ligamento periodontal) estendendo-se da base das chanfraduras nas raízes para uma distância coronariamente curta (setas). Eles também tiveram maior enchimento ósseo na área da bifurcação, embora houvesse enchimento significante da bifurcação com tecido conjuntivo mole. Conclusões Com base nos resultados do estudo, o tratamento de um defeito periodontal empregando rhPDGF-BB em ou 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL em combinação com um material veículo adequado (por exemplo, β-TCP) resulta em maior regeneração periodontal do que os procedimentos ou produtos atuais, tal como enxertos com β-TCP ou aloenxerto ósseo sozinho ou cirurgia periodontal sem enxertos. O tratamento com ο 0,3 mg/mL e 1,0 mg/mL de concentração de rhPDGF resultou na regeneração periodontal. A concentração de 0,3 mg/ml de rhPDGF demonstrou maior regeneração periodontal e porcentagem de enchimento ósseo quando comparada com a concentração de 1,0 mg/ml de rhPDGF quando misturado com /3-TCP. β-TCP foi mais efetivo do que o aloenxerto quando misturado com rhPDGF-BB em qualquer concentração. O osso novo amadureceu (remodelou) normalmente com o passar do tempo (0, 8, e 16 semanas) em todos os grupos. Não houve nenhum aumento em ancilose ou reabsorção ra-dicular nos grupos de rhPDGF. Na realidade, os sítios recebendo rhPDGF-BB tenderam a ter menos ancilose do que os sítios de controle. Esta descoberta pode resultar do fato que rhPDGF-BB é quimiotático e mitogênico para células de ligamento periodontais.

Materiais e Métodos Materiais Utilizados: Artigos de Controle e Teste O β-TCP utilizado teve um tamanho de partícula (0,25 mm—1,0 mm) que foi otimizado para uso periodontal. Com base nos estudos que empregando um modelo canino, o β-TCP administrado é 80% reabsorvido dentro de três meses e é substituído pelo osso autólogo durante o processo curativo. O DFDBA foi fornecido por Musculoskeletal Transplant Foundation (MTF). O material foi aloenxerto de cachorro, feito dos ossos de um cachorro que foi morto seguinte à conclusão de outro estudo que testou um procedimento cirúrgico que foi julgado não ter nenhum efeito em tecidos do esqueleto. O hPDGF-BB recombinante foi fornecido por BioMimetic Phar-maceuticals e foi fabricado por Chiron, Inc, o único fornecedor de rhPDGF-BB aprovado por FDA para uso humano. Este rhPDGF-BB foi aprovado pelo FDA como um produto de cura de ferida sob o nome comercial de Regra-nex .

Seringas de um ml contendo 0,5 ml de rhPDGF-BB estéril em duas concentrações separadas preparadas em conformidade com padrões de FDA para materiais humanos e de acordo com o Bom Processo de Fabricação aplicável atual (cGMP). As concentrações testadas incluíram 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml. β-TCP foi fornecido em frascos contendo 0,5 cc de partículas estéreis. DFDBA foi fornecido em seringas de 2,0 ml contendo 1,0 cc de aloenxerto de osso de cão estéril, desmineralizado liofilizado.

Preparação do Material Na hora do procedimento cirúrgico, os enxertos implantados finais foram preparados misturando-se a solução de rhPDGF-BB com os materiais de matriz. Resumidamente, uma quantidade de TCP ou aloenxerto suficiente para carregar completamente o defeito ósseo foi colocada em um prato estéril. A solução de rhPDGF-BB suficiente para completamente saturar a matriz foi em seguida adicionada, os materiais foram misturados e permitidos assentar-se na bandeja cirúrgica durante cerca de 10 minutos a temperatura ambiente antes de serem colocados no defeito ósseo.

Um tempo de incubação de 10 minutos com o material de β-TCP é suficiente para obter absorção máximo do fator de crescimento (veja A-pêndice A). Para cirurgiões em um quadro clínico, esta é também uma quantidade apropriada de tempo para se ter antes da colocação do produto no defeito periodontal. Similarmente, em um mercado comercial, o rhPDGF-BB e o material de matriz podem ser fornecidos em recipientes separados em um kit e estes materiais podem ser misturados diretamente antes da colocação. Este conceito de kit grandemente simplificaria as considerações de estabilidade/ vida de prateleira do produto.

Exemplo III: Uso de PDGF para O Tratamento De Defeitos de Osso Periodontal em Humanos O PDGF-BB recombinante humano (rhPDGF-BB) foi testado quanto ao seu efeito na regeneração de osso periodontal em indivíduos humanos. Dois grupos de teste foram administrados com rhPDGF-BB em 0,3 mg/mL (Grupo I) ou 1,0 mg/mL (Grupo II). O rhPDGF-BB foi preparado em tampão de acetato de sódio e administrado em um veículo de beta-fosfato de tricálcio (β-TCP). O grupo de controle, Grupo III, foi administrado com β-TCP em tampão de acetato de sódio somente. O objetivo do estudo clínico foi avaliar a segurança e eficácia do material de enxerto compreendendo β-TCP e rhPDGF-BB em 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL na manipulação de um (1) a três (3) defeitos periodontais de parede intra-ósseos e para avaliar sua capacidade regenerativa no osso e tecido mole.

Designação do Estudo e Duração do Tratamento O estudo foi uma experiência clínica de multicentro designada paralela, aleatorizada, prospectíva, controlada, dupío-cego em indivíduos que requereram intervenção cirúrgica para tratar um defeito ósseo adjacente à dentição natural. Os indivíduos foram aleatorizados em proporções iguais para resultar em três (3) grupos de tratamento de aproximadamente 60 indivíduos cada (180 total). A duração do estudo foi seis (6) meses após o implante do dispositivo de estudo. O estudo inscreveu 180 indivíduos.

Diaanose e Critérios de Entrada Principais Os indivíduos machos e fêmeas, 25-75 anos de idade, com doença periodontal avançada em pelo menos um sítio requerendo tratamento cirúrgico para corrigir um defeito do osso, foram admitidos para o estudo. Outros critérios de inclusão incluíram: 1) uma profundidade de bolsa de sonda medindo 7 mm ou maior na visita de valor de referência; 2) após o debri-damento cirúrgico, o defeito de osso vertical de 4 mm ou maior (BD) com pelo menos 1 parede óssea; 3) tecido ceratinizado suficiente para permitir a cobertura de tecido completa do defeito; e, 4) base radiográfica do defeito pelo menos 3 mm coronal ao ápice do dente. Os indivíduos que fumaram até 1 pacote por dia e que tinham dentes com envolvimento de bifurcação de Classe I & II foram especificamente admitidos.

Dose e Modo de Administração Todos os kits de tratamento contiveram 0,25 g de β-TCP (um controle ativo) e ou 0,5 mL de solução de tampão de acetato de sódio sozinha (Grupo III), 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB (Grupo I) ou 1,0 mg/mL de rhPDGF-BB (Grupo II).

Seguinte o debridamento completo e planejamento da raiz, a solução de teste foi misturada com β-TCP em um recipiente estéril, tal que o β-TCP fosse completamente saturado. As superfícies da raiz foram condicionadas empregando ou tetraciclina, EDTA ou ácido cítrico. O enxerto hidratado foi então embalado no defeito ósseo e as pontas de tecido foram presas com suturas interdentais para obter cobertura completa do sítio cirúrgico. Medição da Eficácia A medição da eficácia principal incluiu a alteração em nível de ligação clínica (CAL) entre o valor de referência e os seis meses pós-cirurgia (Grupo I vs. Grupo III). As medições de eficácia secundária consistiram nos seguintes resultados: 1) crescimento ósseo linear (LBG) e % de enchimento ósseo (% de BF) do valor de referência em seis meses pós-cirurgia com base nas avaliações radiográficas (Grupo I e Grupo II vs. Grupo III); 2) alteração em CAL entre o valor de referência e seis meses pós-cirurgia (Grupo II vs Grupo III); 3) redução da profundidade da bolsa de sonda (PDR) entre o valor de referência e seis meses pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II vs Grupo III); 4) recessão gengival (GR) entre o valor de referência e seis meses pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II vs Grupo III); 5) cura da ferida (WH) do sítio cirúrgico durante as primeiras três semanas pós-cirurgia (Grupo I e Grupo II vs Grupo III); 6) área sob a curva para a alteração em CAL entre o valor de referência e três (3) e seis (6) meses (Grupo I e Grupo II vs Grupo lll); 7) a ligação de menor confidência a 95% (LCB) para % de BF em seis (6) meses pós-cirurgia (Grupo I, II, lll vs. aloenxerto ósseo iiofilizado desmineralizado (DFDBA) como publicado na literatura; Parashis e outros, J. Periodontal. 69:751-758, 1998); 8) o LCB a 95% para crescimento ósseo linear em seis (6) meses pós-cirurgia (Grupos I, II, e lll vs aloenxerto ósseo Iiofilizado desmineralizado (DFDBA) como publicado na literatura; Persson e outros, J. Clin. Periodontal. 27:104-108, 2000); 9) o LCB a 95% para a alteração em CAL entre o valor de referência e seis (6) meses pós-cirurgia (Grupo I, II, e II vs. EMDOGAIN® - PMA P930021, 1996); e 10) o LCB a 95% para a alteração em CAL entre o valor de referência e seis (6) meses (Grupos I, II e lll vs PEPGEN P-15® - PMA P990033, 1999). Métodos Estatísticos Os dados de segurança e eficácia foram examinados e resumidos por estatísticas descritivas. As medições categóricas foram exibidas como contagens e percentuais, e variáveis contínuas foram exibidas como meios, médias, desvios padrão e faixas. As comparações estatísticas entre os grupos de tratamento de produto de teste (Grupos I e II) e do controle (Grupo III) foram feitas empregando os provas do qui quadrado e Exata de Fisher para variáveis categóricas e testes t ou Análise de Métodos de Variação (ANOVA) para variáveis contínuas. As comparações entre grupos de tratamento para variáveis ordinais foram feitas empregando os métodos Co-chran-Mantel-Haenszel. Um p < 0,05 (um lado) foi considerado ser estatisticamente significante para CAL, LBG e % de BF.

Os dados de segurança foram avaliados pela freqüência gravidade dos eventos adversos quando avaliados radiograficamente e clinicamente. Não houve nenhuma diferença significante entre os três grupos de tratamento no valor de referência. Não houve também nenhuma diferença estatisticamente significante observada na incidência de eventos adversos (AEs; todas as causas) entre os três grupos de tratamento. A análise de segurança não identifica qualquer risco aumentado para o indivíduo devido ao implante do material de enxerto.

Sumário dos Resultados da Eficácia Os resultados das análises estatísticas revelaram ambos benefícios clinicamente e estatisticamente significantes para os dois grupos de tratamento (Grupos I e II), comparados com o controle ativo de β-TCP sozinho (Grupo III) e controles históricos incluindo DFDBA, EMDOGAIN®, e PEPGEN P-15® Em três meses pós-cirurgia, um ganho de CAL estatisticamente significante do valor de referência foi observado em favor do Grupo I vs. Grupo III (p = 0,041), indicando que há benefícios precoces significantes'de PDGF no ganho de CAL. Em seis meses pós-cirurgia, esta tendência continuou favorecendo o Grupo I sobre o Grupo III, embora esta diferença não tenha sido estatisticamente significante (p = 0,200). A análise da área sob a curva (AUC) que representa o efeito cumulativo (isto é, velocidade) para ganho de CAL entre o valor de referência e seis meses, se aproximou da signi-ficância estatística que favorece o Grupo I em comparação com o Grupo III (p=0,054). Além disso, a análise da ligação de menor confidência a 95% (LCB) para todos os grupos de tratamento substanciou a eficácia dos Grupos I e II comparado com os ganhos de CAL observados em seis (6) meses para EMDOGAIN® e PEPGEN P-15®.

Além dos benefícios clínicos observados de CAL, as análises radiográficas que incluem Crescimento Ósseo Linear (LBG) e Percentagem de Enchimento Ósseo (% de BF), estatisticamente revelaram melhora signi-ficante em ganho ósseo para os Grupos I e II vs Grupo III. O % de BF foi definido como a porcentagem do defeito ósseo original enchido com osso novo como radiograficamente medido. LBG mostrou melhora significante no Grupo I (2,5 mm) quando comparado com o Grupo III (0,9 mm, p < 0,001). LBG também foi significante para o Grupo II (1,5 mm) quando comparado com o Grupo III (p= 0,021). A porcentagem de enchimento ósseo (% de BF) foi aumentada significantemente em seis meses pós-cirúrgico no Grupo I (56%) e Grupo II (34%) quando comparada com o Grupo III (18%), para um p <0,001 e p= 0,019, respectivamente. A ligação menor a 95% do intervalo de confidência em seis meses pós-cirurgia, para ambos crescimento ósseo linear e % de enchimento ósseo, substanciou a eficácia dos Grupos I e II comparada com os resultados radiográficos publicados para DFDBA, o material empregado mais amplamente para procedimentos de enxertos periodontais.

Em três meses, houve significantemente menos Recessão Gen-gival (GR) (p=0,041) para o Grupo I comparado com o Grupo III de acordo com o efeito benéfico observado com CAL. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada em PDR e GR em seis meses. A análise descritiva do número de sítios que exibem cura de ferida completa (WH) em três semanas revelou melhoras no Grupo I (72%) vs. Grupo II (60%) e Grupo III (55%), indicando uma tendência melhorada à cura.

Para avaliar o efeito benéfico cumulativo para resultados radio-gráficos clínicos, uma análise da eficácia do compósito foi realizada para determinar a porcentagem de pacientes com um resultado bem sucedido como definido por CAL > 2,7mm e LBG > 1,1 mm em seis (6) meses. Os pontos de referência de CAL e LBG de sucesso foram estabelecidos pelos níveis médios alcançados por estes parâmetros pelos enxertos implantados, como identificado na seção "Medição da Eficácia" acima. Os resultados mostraram que 61,7% dos pacientes do Grupo I e 37,9% dos pacientes do Grupo II alcançaram ou excederam o ponto de referência do compósito para sucesso comparado com 30,4% dos pacientes do Grupo III, resultando em um benefício estatisticamente significante do Grupo I vs. Grupo III (p<0,001). O % de BF revelou benefícios similares para o Grupo I (70,0%) vs. Grupo III (44,6%) para valor p de 0,003.

Em resumo, o Grupo I obteve resultados estatisticamente benéficos para CAL e GR em três (3) meses bem como LBG e % de BF em seis (6) meses, comparado com o grupo de controle ativo de β-TCP sozinho (Grupo III). A significância clínica destes resultados é também confirmada por comparação para controles históricos. É concluído que o material de enxerto contendo PDGF foi mostrado alcançar eficácia clínica e radiográfica por seis meses para o tratamento de defeitos ósseos periodontais.

Tabela 5: Sumário da Eficácia do Enxerto de PDGF O material de enxerto (isto é, β-TCP) contendo PDGF em 0,3 mg/mL e em 1,0 mg/mL foi mostrado ser seguro e eficaz ria restauração de osso alveolar e ligamento clínico ao redor dos dentes com periodontite moderada a avançada em uma grande experiência clínica aleatorizada que envolve 180 indivíduos estudados durante até 6 meses. Estas conclusões são com base em medições radiográficas e clínicas validadas como resumido abaixo.

De acordo com os dados de biocompatibiiidade do material de enxerto contendo PDGF, descrito acima, e o uso seguro histórico de cada componente individual (isto é, β-TCP sozinho ou PDGF sozinho), o estudo não revelou nenhuma evidência de efeitos adversos ou sistêmicos ou locais. Não houve nenhum resultado adverso atribuível ao material de enxerto, que descobriu-se ser seguro.

Conclusão Descobriu-se que o implante de β-TCP contendo PDGF em 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL é um tratamento eficaz para a restauração do nível de ligação de osso e tecido mole como mostrado por CAL significantemente melhorado em 3 meses comparado com o controle ativo. Nossas descobertas também são de acordo com a análise de AUC que mostrou uma melhora no ganho de CAL entre o valor de referência e seis meses. Descobriu-se também que o implante de β-TCP que contém PDGF em ou 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL é um tratamento eficaz com base no % de BF e LBG significantemente melhorado comparado com o controle ativo. Os resultados clínicos significantemente melhorados como mostrado pela análise do compósito de ambas medições de tecido mole e duro também comparados com o controle ativo de β-TCP sozinho também demonstram a eficácia do protocolo de tratamento descrito acima. Finalmente, descobriu-se que os resultados da administração de β-TCP contendo PDGF em ou 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL excedem os níveis estabelecidos de eficácia tanto clinicamente quanto radio-graficamente.

Os resultados desta experiência junto com os dados confirmado-res e extensos de estudos com humanos e animais in vitro, demonstram que o material de enxerto contendo PDGF estimula a regeneração do tecido duro e mole em defeitos periodontais, embora os efeitos fossem mais significan-tes quando PDGF na faixa de 0,1 a 1,0 mg/mL (por exemplo, 0,1 mg/mL, 0,3 mg/mL ou 1,0 mg/mL) fosse administrado no material de enxerto. Além disso, o PDGF administrado no material de enxerto na quantidade de 0,3 mg/mL regenerou eficazmente o osso e tecido mole.

Outras modalidades incluem-se nas seguintes reivindicações.

Claims (23)

1. Material de implante, caracterizado pelo fato de que consiste em: i) fosfato de cálcio poroso, ou ii) colágeno e fosfato de cálcio poroso; tendo incorporado no mesmo um líquido consistindo em fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em uma concentração na faixa de cerca de 0,1mg/ml_ a cerca de 1,0mg/ml_, em tampão, em que o fosfato de cálcio apresenta poros inter-conectados, porosidade maior que 40%, e consiste em partículas na faixa de cerca de 100 mícrons a cerca de 5.000 mícrons de tamanho.

2. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio é capaz de absorver uma quantidade do líquido consistindo em PDGF que é igual a pelo menos cerca de 25% do próprio peso do fosfato de cálcio.

3. Material de implante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a concentração de PDGF é igual ou inferior que cerca de 0,3mg/ml_.

4. Material de implante de acordo com qualquer uma das reiivndica-ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que PDGF tem uma concentração de cerca de 0,3mg/ml_, em tampão, em que o fosfato de cálcio é capaz de absorver uma quantidade do líquido consistindo em PDGF que é igual a pelo menos cerca de 25% do próprio peso do fosfato de cálcio.

5. Material de implante de acordo com qualquer uma das reiivndica-ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material de implante consiste de fosfato de cálcio poroso.

6. Material de implante de acordo com qualquer uma das reiivndica-ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material de implante consiste de colágeno e fosfato de cálcio poroso.

7. Material de implante de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio é β-fosfato de tricálcio.

8. Material de implante de acordo com qualquer uma das reiivndica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que PDGF é PDGF humano recombinante.

9. Material de implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que PDGF tem concentração na faixa de cerca de 0,2mg/mL a cerca de 0,75mg/ml_.

10. Material de implante de acordo com qualquer uma das reiivndica-ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio compreende partículas na faixa de cerca de 250 mícrons a cerca de 2.000 mícrons de tamanho.

11. Uso de fosfato de cálcio poroso, caracterizado pelo fato de que é na preparação de material de implante para a promoção do crescimento dos ossos, periodôntio, ligamento ou cartilagem em mamíferos, em que o referido fosfato de cálcio poroso tem incorporado no mesmo um líquido consistindo em fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em uma concentração na faixa de cerca de 0,1mg/ml_ a cerca de 1,0mg/ml_, em tampão, apresenta poros interconectados e consiste em partículas na faixa de cerca de 100 mícrons a cerca de 5.000 mícrons de tamanho.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio tem porosidade maior que 40%.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio tem poros interconectados.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reiivndicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o fosfato de cálcio compreende β-TCP com tamanho de partícula de cerca de 250 mícrons a cerca de 2.000 mícrons.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reiivndicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colágeno.

16. Material de implante, caracterizado pelo fato de que consiste em: i) aloenxerto, ou ii) colágeno e aloenxerto; tendo incorporado no mesmo um líquido consistindo em fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em uma concentração na faixa de cerca de 0,1mg/ml_ a cerca de 1,0mg/ml_, em tampão, em que o aloenxerto apresenta poros interconectados, porosidade maior que 40%, e consiste em partículas na faixa de cerca de 100 mícrons a cerca de 5.000 mícrons de tamanho.

17. Material de implante de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o aloenxerto é capaz de absorver uma quantidade do líquido consistindo em PDGF que é igual a pelo menos cerca de 25% do próprio peso do aloenxerto.

18, Material de implante de acordo oom a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que PDGF tem uma concentração que é igual ou inferior que cerca de 0,3mgãnL, em tampão, em que o aloenxerto apresenta poros interco-nectados,

19, Uso de aloenxerto, caracterizado pelo fato de que é na preparação de material de implante para a promoção do crescimento dos ossos, periodôntio, ligamento ou cartilagem em mamíferos, em que o referido aloenxerto tem incorporado no mesmo um líquido consistindo em fator de crescimento derivado de plaque-ta (PDGF}, em uma concentração na faixa de cerca de 0,1mg/mL a cerca de 1,0mg/mL, em tampão, apresenta poros interconectados e consiste em partículas na faixa de cerca de 100 mícrons a cerca de 5 000 mícrons de tamanho.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o aloenxerto tem porosidade maior que 40%.

21, Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o aloenxerto consiste em partículas na faixa de cerca de 250 mícrons a cerca de 2.000 mícrons de tamanho.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colágeno.

23. Método de preparação de material de implante, caracterizado pelo fato de que compreende saturar material de implante poroso em líquido estéril consistindo em fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1,0mg/mL, em tampão, em que o material de implante consiste em (i) fosfato de cálcio poroso, (ii) colágeno e fosfato de cálcio poroso, (iii) aloenxerto ou (iv) colágeno e aloenxerto, e em que o fosfato de cálcio poroso ou o aloenxerto apresenta poros interconectados, tem porosidade maior que 40% e consiste em partículas na faixa de cerca de 100 mícrons a cerca de 5.000 mícrons de tamanho.