DE69535592T2

DE69535592T2 - Verbesserung der effektivität von arzneimitteln duren deuterierung

Info

Publication number: DE69535592T2
Application number: DE69535592T
Authority: DE
Inventors: Robert R. Edmonton FOSTER; Richard Edmonton LEWANCZUK; Gilles Outremont CAILLE
Original assignee: Isotechnika Inc
Current assignee: Isotechnika Inc
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2015-03-28
Also published as: BR9507200A; ES2293638T3; WO1995026325A2; KR100477070B1; WO1995026325A3; DE69535592D1; CN1087725C; KR20040068613A; MX9604309A; JP3696884B2; EP0751926A1; CA2186371A1; ATE372966T1; JPH09510717A; EP0751926B1; AU707748B2; CN1148843A; US5846514A; AU1944195A

Description

VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNG
Dies ist eine Teilfortführung unserer gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/217,897, eingereicht am 25. März 1994, die in ihrer Gesamtheit hierin mit einbezogen wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbessern der Wirksamkeit bekannter Pharmazeutika oder Arzneimittel, und die so hergestellten verbesserten Arzneimittel, durch Ändern der Isotopenform der Molekularstruktur des bekannten Arzneimittels. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Modifikation der Molekularstruktur bekannter Arzneimittel, die ein oder mehr Wasserstoffatome enthalten, durch Deuterieren eines oder mehrerer der Wasserstoffatome zu Deuteriumatomen. Das resultierende Arzneimittel ist signifikant verändert und hat eine stark verbesserte Wirksamkeit gegenüber dem bekannten Arzneimittel. Ganz besonders betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Deuterieren eines Dihydropyridins (z.B. Nifedipin), wodurch das deuterierte Nifedipin in niedrigeren Konzentrationen, als dies bei Nifedipin der Fall ist, eine erhöhte blutdrucksenkende Wirkung und eine erhöhte Wirkdauer bei Säugetieren hat.
Wenn Pharmazeutika synthetisiert werden, wird ein Kohlenstoffgerüst hergestellt, das verschiedene Substituenten einschließlich Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff etc. aufweist. Pharmazeutika wurden bisher auf verschiedene Arten wie zum Beispiel zufällige und molekulare Modifikation entwickelt und synthetisiert. Diese und andere Verfahren haben im Lauf der Zeit zu einer riesigen Anzahl von Arzneimitteln geführt. Da diese Modifikationen einzelnen Firmen einen Konkurrenzvorsprung auf dem Markt verschafft haben, wird seitens der Industrie ein bedeutender Teil an Zeit und Ressourcen darauf verwendet, nach neuen Mitteln innerhalb bestimmter pharmakologischer Klassifikationen zu suchen, z.B. auf dem Gebiet der blutdrucksenkenden Mittel. Diese neuen Mittel haben oft eine andere Wirksamkeit als die Prototypen, so dass die für ihre Entwicklung ausgegebenen Gelder gerechtfertigt sind.

Eur. J. Med. Chem., Bd. 28, Nr. 3, 1993, 259-263, offenbart bestimmte deuterierte Analoga von Verapamil und Nifedipin und behandelt deren Synthese sowie deren biologische Wirksamkeit bei Anwendung als blutdrucksenkendes Mittel in Form eines pharmazeutischen Präparats bei spontan hypertensiven Ratten.
Chem. Abstr. 1977-1981, Chem. Subst. Ind. in Spalte 1 auf Seite 46167CS, Chem. Abstr. 1982-1986, Chem. Subst. Ind. in Spalte 1 auf Seite 58923CS und Chem. Abstr. 1987-1991, Chem. Subst. Ind. in Spalte 3 auf Seite 79669CS haben alle über eine Anzahl von Dihydropyridinderivaten berichtet, wobei mindestens eines der Wasserstoffatome durch ein Deuteriumatom ersetzt ist.
Anal. Chim. Acta, Bd. 247, Nr. 2, 1991, 871-875, FR-A-2 673 291 und WO-A-89/094486 offenbaren ein Verfahren zum Vergleichen zweier Proben einer chemischen Verbindung, z.B. einer pharmazeutischen Verbindung, indem diese Proben einer Gaschromatographie-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie unterzogen werden, um anhand einer Isotopenveränderung in ihrer Molekularstruktur festzustellen, ob die beiden Proben denselben oder einen anderen Ursprung haben oder nicht.
Biochem. Pharmacology, Bd. 18, Nr. 23, Seiten 4213-16 (1989), offenbart ein deuteriertes Nifedipin.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass praktisch alle heute auf dem Markt erhältlichen Arzneimittel eine Anzahl von Wasserstoffatomen enthalten, die jeweils eine Molekularmasse von 1 haben. Es wurde nun festgestellt, dass bei Modifikation eines oder mehrerer der Wasserstoffatome auf einem Arzneimittel zu einer Molekularmasse von 2 die Wirksamkeit des Arzneimittels signifikant verändert und sogar stark verbessert wird. So hat zum Beispiel die Isotopenmodifikation eines Dihydropyridins, wie z.B. Nifedipin, zu einer unerwarteten Änderung in der hypotensiven (blutdrucksenkenden) Wirkung bei Säugetieren im Vergleich zu Nifedipin per se geführt, und diese Wirkungen dürften auch bei Menschen erreicht werden.
Nifedipin wird weltweit als wichtiges Arzneimittel zur Behandlung von Angina und Bluthochdruck vermarktet. Es hat folgende Struktur:
Durch Modifizieren von Nifedipin, indem ein oder mehr Wasserstoffe der Methylgruppen durch Deuterium ersetzt werden oder indem ein oder mehr der Methylgruppen durch CD₃ ersetzt werden, können die therapeutischen Eigenschaften von Nifedipin verändert und sogar signifikant verbessert werden. Durch Modifizieren von Nifedipin, indem die zwei Methylgruppen in Position 2 und 6 an dem Ring durch zwei deuterierte Gruppen (CD₃) ersetzt werden, d.h. indem 6 Wasserstoffatome durch sechs Deuteriumatome ersetzt werden, erhält man zum Beispiel die folgende Struktur des deuterierten Nifedipins:
Die obigen Moleküle sind beide Nifedipin, und die letztere Struktur ist eine Isotopenform der ersteren.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Dihydropyridinverbindungen, die aus der aus deuteriertem Nicardipin bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome einer oder beider Methylgruppen in Position 2 und 6 durch ein Deuteriumatom ersetzt sind, und Verbindungen mit der folgenden Formel:
wobei:
X = H,
R¹ = CH₃, wobei jedes H-Atom durch ein D-Atom ersetzt werden kann, und
R² = CH₃, wobei höchstens 5 der insgesamt 6 H-Atome durch ein D-Atom ersetzt werden können, und
wobei mindestens eines von R¹ und R² zusammen ein D-Atom enthält.
Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen 2 bis 30 beschrieben, die hierin mit einbezogen sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird besser verständlich anhand der Zeichnungen; darin zeigen:
1 zeigt die blutdrucksenkende Wirkung der verschiedenen Konzentrationen der deuterierten Nifedipine bei den behandelten Ratten im Vergleich zu Nifedipin per se;
2 und 3 zeigen die gebrauchsabhängige Hemmung von Kontrollnifedipin (Nifedipin B) und deuteriertem Nifedipin (Nifedipin D) bei Calciumkanälen vom T-Typ;
4 zeigt den Einfluss von Kontrollnifedipin und deuteriertem Nifedipin auf die Calciumstromhemmung in Abhängigkeit von der Impulsfrequenz;
5 zeigt den Einfluss von Kontrollnifedipin und deuteriertem Nifedipin auf die Gebrauchsabhängigkeit;
6(a) und (b) zeigen den Einfluss von deuteriertem Nifedipin und Kontrollnifedipin auf den mittleren arteriellen Druck;
7(a) und (b) zeigen die Beziehung zwischen Konzentration und Wirkung für Kontrollnifedipin (7a) und deuteriertes Nifedipin (7b) anhand eines asymmetrischen S-förmigen Modells;
8(a) und (b) zeigen die Beziehung zwischen Konzentration und Wirkung für Kontrollnifedipin (8a) und deuteriertes Nifedipin (8b) anhand eines logistischen Dosis-Wirkung-Modells;
9a und 9b zeigen die Dosis-Wirkung-Beziehung für Kontrollnicardipin und deuteriertes (Test)nicardipin;
10 zeigt, dass die Wirkdauer bei deuteriertem Nicardipin größer war als bei Kontrollnicardipin;
11 zeigt die blutdrucksenkende Wirkung der verschiedenen Konzentrationen von deuteriertem Verapamil bei den behandelten Ratten im Vergleich zu Verapamil per se;
12 zeigt, dass die Wirkdauer bei deuteriertem Verapamil größer war als bei Kontrollverapamil;
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine solche Modifikation von Nifedipin (und anderen Dihydropyridinen wie zum Beispiel Nicardipin, Nimodipin, Niludipin, Nisoldipin, Nitrendipin, Felodipin, Ifradipin und Amlodipin) kann erreicht werden, indem das Nifedipin in einem Deuterierröhrchen in einer Mischung von Deuterochloroform und Deuteriumoxid gelöst wird und dann eine geringe Menge Trifluoressigsäureanhydrid und Deuteroaceton zugegeben und damit vermischt wird. Die Lösung wird dann in dem Röhrchen eingefroren, vorzugsweise indem das Röhrchen in flüssigen Stickstoff getaucht und dann verschlossen wird. Das verschlossene Röhrchen wird dann auf eine Temperatur im Bereich von etwa 50°C bis etwa 65°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 55°C bis etwa 60°C, erwärmt und für eine Zeit, die ausreicht, um die Methylgruppe in Position 2 und 6 an dem Nifedipin zu CD₃ zu deuterieren, auf dieser Temperatur gehalten. Eine Zeit von etwa 150 bis etwa 180 Stunden ist wirksam, um die Reaktion durchzuführen, wobei eine Zeit von etwa 160 bis 170 Stunden bevorzugt wird.
Deuteriertes Nifedipin wurde auf folgende Weise synthetisiert:
BEISPIEL I
80 mg Nifedipin in Pulverform wurden in ein spezielles Deuterierröhrchen gegeben und darin in einer Mischung von 2 ml Deuterochloroform und 0,5 ml Deuteriumoxid gelöst, woraufhin 0,2 ml Trifluoressigsäureanhydrid und 2 ml Deuteroaceton zugegeben und damit vermischt wurden. Die Lösung wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, und das Röhrchen wurde unter Stickstoff flammversiegelt. Das Röhrchen wurde dann 168 Stunden auf 57°C erwärmt und danach abgekühlt und geöffnet. Der Inhalt des Röhrchens wurde in einen Rundkolben geleitet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Alle Maßnahmen wurde unter verminderter Lichtstärke durchgeführt. Mittels herkömmlicher ¹H magnetischer Kernresonanz (NMR) wurde errechnet, dass die Deuteriumsubstitution 95% der oben gezeigten C2- und C6-Methylgruppen beträgt.
Der Einfluss von deuteriertem Nifedipin auf den Blutdruck bei Ratten wurde dann wie folgt ermittelt:
BEISPIEL II
Spontan hypertensive Ratten (SHR) wurden mit Pentobarbital (65 mg/kg, intraperitoneal) narkotisiert, und es wurde eine Kanüle in die Karotisarterie und die Jugularvene gelegt. Über die Kanüle in der Karotisarterie wurde der Blutdruck kontinuierlich überwacht. Nifedipinproben, sowohl deuteriert als auch nichtdeuteriert, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), wurden in Kochsalzlösung verdünnt, so dass die injizierte Endkonzentration von DMSO weniger als 0,025 Vol.-% betrug. Aliquote Teile der entsprechenden Verdünnungen wurden dann intravenös in die SHR injiziert, und der Einfluss auf den Blutdruck wurde für mindestens zwei Stunden im Anschluss an die Injektion überwacht. Als Dosis wurden 0,00001, 0,00002, 0,000025 und 0,00005 Millimol pro Ratte in der Kontrollgruppe und in der Testgruppe verwendet. Alle Ratten waren im Bereich von 25 Gramm Körpergewicht voneinander verschieden.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Bei den drei niedrigeren Konzentrationen war die blutdrucksenkende Wirkung von deuteriertem Nifedipin größer als bei normalem Nifedipin (p = 0,08 nach dem Rangsummentest von Wilcoxon). Die wirksamen Dosen von 50% der Ratten (ED₅₀) wurden aufgrund der Ergebnisse mit den obigen Dosen berechnet, und man erhielt folgende Ergebnisse: (1) Log ED₅₀ bei deuteriertem Nifedipin: -4,48 (-4,53 bis -4,43, 95% Vertrauensbereich); und (2) Log ED₅₀ bei normalem Nifedipin: -4,36 (-4,40 bis -4,31, 95% Vertrauensbereich). Da sich die Vertrauensbereiche nicht überlappen, gibt es einen statistischen Unterschied in der Potenz der beiden Nifedipinprodukte, wobei das deuterierte Nifedipin unerwarteterweise die größte Potenz hat.
Der Einfluss von deuteriertem Nifedipin auf die den Calciumkanal blockierende Wirksamkeit wurde untersucht, und die Studien wurden wie folgt unter Verwendung der Ganzzellenversion des Patch-Clamp-Verfahrens durchgeführt:
BEISPIEL III
Es wurden NIE-115-Zellen (Neuroblastomzelllinie) verwendet, und diese Zellen wurden mit herkömmlichen Gewebekulturverfahren gezüchtet. Für die Untersuchung wurden die Zellen sechs bis acht Stunden nach der Trypsinisierung und nach dem erneuten Ausplattieren verwendet. In diesem Zustand war der vorwiegend exprimierte Calciumkanal der Kanal vom T-Typ, der für die aktuellen Untersuchungen herangezogen wurde.
Das Patch-Clamp-Verfahren wurde unter Verwendung der folgenden äußerlichen und innerlichen Lösungen durchgeführt: Äußerliche Lösung (in mM): BaCl₂ 20, Tris 105, KCl 5, CsCl 5, HEPES 20, Glucose 20 und Tetrodotoxin 0,0005. Innerliche Lösungen (in mM): CsCl 130, ATP-Na₂ 2, HEPES 20, Glucose 5, MGCl₂ 5, cAMP 0,25 und EGTA 10. Die Osmolarität aller Lösungen wurde auf 310-320 mOsm eingestellt, und der pH-Wert wurde nach Bedarf mit HCl, NaOH, CsOH oder Ba(OH)₂ auf 7,4 eingestellt. Die Petrischale mit den Zellen wurde auf dem Objektträger eines umgekehrten Phasenkontrastmikroskops montiert. Pipetten aus dünnwandigem Borsilicatglas, die die innerliche Lösung enthielten, wurden mit einem Mikromanipulator zu der ausgewählten Zelloberfläche vorgeschoben. Ansaugen erleichterte die Bildung eines Membran-Patch mit einem Widerstand im Bereich von 20-30 Gigaohm. Testimpulse wurden in Inkrementen von 10 mV für 200 ms angelegt, wobei zwischen den Impulsen mindestens 5 Sekunden für die Wiederherstellung des Kanals gewartet wurde. Die Wirksamkeit des Basalkanals wurde anhand der maximalen Einwärtsströme gemessen. Nach Zugabe der Nifedipinlösungen bis zur entsprechenden Konzentration wurde 3 Minuten gewartet, bis das Arzneimittel Gleichgewichtskonzentrationen erreichte. Nach dieser Zeit wurden die Strom-Spannung-Beziehungen erneut getestet und die Ergebnisse als Prozentsatz des erhaltenen Kontrollstroms ausgedrückt (d.h. 100% besagt, dass keine kanalblockierende Wirksamkeit vorliegt).
Vorläufige Ergebnisse in Konzentrationen von 1 × 10^-6 und 1 × 10^-5 zeigten keinen statistischen Unterschied zwischen der Kanalleitung bei deuteriertem und nichtdeuteriertem Nifedipin (70% vs. 77% bzw. 35% vs. 43%, p nicht signifikant). Während dieser Untersuchungen wurde jedoch festgestellt, dass zwischen der Kanalaktivierungsabhängigkeit der beiden Nifedipinverbindungen ein Unterschied bestand. Wie gewohnt zeigte normales Nifedipin eine blockierende Wirksamkeit, die vom Aktivierungszustand der Kanäle abhängt (normalerweise kommt es leichter zur Blockierung, wenn die Kanäle "aktiver" sind). Dieser Effekt war bei deuteriertem Nifedipin nicht festzustellen; vielmehr schien es unabhängig vom Kanalstatus eine anhaltende maximale Wirkung zu zeigen. Dies deutet darauf hin, dass die Bindung von deuteriertem Nifedipin an den Calciumkanal verstärkt ist, selbst wenn vielleicht kein Unterschied in der Potenz besteht. In klinischer Hinsicht bedeutet dies, dass deuteriertes Nifedipin eine längere Halbwertszeit des Rezeptors haben kann und/oder dass es eine konstante Wirkung über Blutdruckbereiche haben kann (normalerweise kann man sagen, je höher der Blutdruck, umso größer die blutdrucksenkende Wirkung von Calciumkanalblockern). Es wird erwartet, dass das deuterierte Nifedipin in ähnlicher Weise bei Menschen mit hohem Blutdruck wirkt.
Es wurde zwar festgestellt, dass durch Deuterieren einer oder mehrerer Wasserstoffatome in bekannten pharmazeutischen Verbindungen die Wirksamkeit dieser Verbindungen verstärkt bzw. verändert wird, doch wird angenommen, dass die Wirksamkeit dieser Verbindungen auch dadurch verändert werden kann, dass ein anderes Isotop anstelle eines oder mehrerer der anderen Atome in der Verbindung verwendet wird. Es ist bekannt, dass mehrere Varietäten anderer Atome, wie zum Beispiel Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Zinn, etc. vorliegen, die sich in ihrer atomaren Masse unterscheiden. Diese unterschiedlichen Spezies von Atomen werden als Isotopen bezeichnet und unterscheiden sich nur in der Zahl von Neutronen in dem Kern.
BEISPIEL IV
Gebrauchsabhängigkeit der Calciumkanalhemmung – Durch wiederholte Aktivierung von Calciumkanälen wird der maximale Einwärtsstrom zunehmend reduziert. Eine solche Verringerung der Stromstärke tritt umso deutlicher auf, je größer die Stimulationsfrequenz der Kanäle ist. In Gegenwart eines "gebrauchsabhängigen" Antagonisten wird die Verringerung der Stromstärke bei wiederholter Stimulation verstärkt. Gebrauchsabhängigkeit impliziert, dass sich der Antagonist während der anschließenden Kanalaktivierung in kleinen Inkrementen kumulativ bindet. Nach 2 oder 3 Kanalaktivierungen ist im Falle von Calciumkanälen ein stabiler Zustand der Hemmung erreicht. Die zugrundeliegende Implikation der Gebrauchsabhängigkeit besteht darin, dass sich ein gegebener Antagonist (Arzneimittel) stärker an den aktiven Kanal bindet. Ein Arzneimittel, das eine größere gebrauchsabhängige Kanalhemmung zeigt, hat vermutlich eine größere Affinität für den aktiven Calciumkanal.
In dem folgenden Satz von Beispielen wurden Calciumkanäle mit wiederholten Stromimpulsen in den angegebenen Intervallen depolarisiert. Diese Untersuchungen wurden unter Verwendung der Ganzzellenversion des Patch-Clamp durchgeführt. Die Verringerung des Einwärtsstroms als Funktion des Intervalls zwischen Impulsen in Abwesenheit eines Arzneimittels wurde als Kontrolle herangezogen. Kontrollnifedipin (d.h. nichtdeuteriertes Nifedipin) und deuteriertes Nifedipin wurden dann in einer Konzentration von 5 μmol auf die Zellen aufgebracht. Die Verringerung im Einwärtsstrom als Funktion der Stimulationsfrequenz (d.h. Gebrauchsabhängigkeit) wurde dann zwischen den beiden Nifedipinpräparaten verglichen.
2 zeigt die gebrauchsabhängige Hemmung von Kontrollnifedipin (Nifedipin B) und deuteriertem Nifedipin (Nifedipin D) bei Calciumkanälen vom T-Typ in N1E115-Zellen. Diese Figur zeigt den Einwärtsstromfluss und seine Hemmung durch die Nifedipine. Mit zunehmender Stimulationsfrequenz nimmt der Einwärtsstrom bei wiederholter Stimulation ab (Gebrauchsabhängigkeit). Es zeigt sich, dass Nifedipin den Einwärtsstrom verringert, aber bei einer erhöhten Stimulationsfrequenz ist deuteriertes Nifedipin wirksamer als Kontrollnifedipin (Panel C). Diese Unterschiede sind in 3-5 näher dargestellt.
3 zeigt die hemmende Wirkung der beiden Nifedipine auf den Einwärtscalciumstrom bei wiederholten Impulsen von 1 Sekunde (Depolarisationen). Bei dieser Impulsfrequenz kann deuteriertes Nifedipin den Calciumstrom wirksamer blockieren als Kontrollnifedipin (p < 0,05, aufgrund wiederholter ANOVA-Maßnahmen). Die Nifedipinkonzentration betrug in beiden Fallen 5 μmol.
4 zeigt den Einfluss der beiden Nifedipine auf die Calciumstromhemmung als Funktion der Impulsfrequenz. In Intervallen von 1 und 0,3 Sekunden konnte deuteriertes Nifedipin die Calciumkanäle wirksamer blockieren als Kontrollnifedipin.
5 zeigt den Einfluss der beiden Nifedipine auf die Gebrauchsabhängigkeit. Bei allen Frequenzen zeigte deuteriertes Nifedipin eine stärkere gebrauchsabhängige Calciumkanalhemmung. Diese Hemmung war mit zunehmender Stimulationsfrequenz sogar noch ausgeprägter.
Aufgrund der obigen Daten zeigt sich, dass deuteriertes Nifedipin eine stärkere gebrauchsabhängige Hemmung von Calciumkanälen hat. Das bedeutet, dass deuteriertes Nifedipin die Calciumkanäle mit zunehmender Stimulationsfrequenz wirksamer blockieren kann als normales Nifedipin. Weil die Kanalaktivierung bei pathologischen Beschwerden wie zum Beispiel Bluthochdruck oder Angina stärker ist, wäre zu erwarten, dass deuteriertes Nifedipin bei diesen Störungen wirksamer/potenter ist als normales Nifedipin. Bei nichtpathologischen Beschwerden, wo die Kanalaktivierung nicht so stark ist, käme die Wirksamkeit von deuteriertem Nifedipin jedoch an die von normalem Nifedipin heran. Eine solche Eigenschaft ist äußerst interessant, da dies bedeutet, dass die relative Potenz des Arzneimittels (z.B. deuteriertes Nifedipin) direkt mit der Schwere der Erkrankung variieren würde. So würde das Arzneimittel zum Beispiel scheinbar "wissen", um wieviel der Blutdruck zu senken ist, um einen speziellen Zielwert des Blutdrucks zu erreichen. Derzeit nimmt mit zunehmender Schwere einer Erkrankung (z.B. Bluthochdruck, Angina) die zur Behandlung einer solchen Erkrankung notwendige Nifedipindosis ebenfalls zu. Bei deuteriertem Nifedipin ist dies möglicherweise nicht der Fall.
BEISPIEL V
Einfluss von deuteriertem Nifedipin und Kontrollnifedipin auf den Blutdruck bei normotensiven Sprague-Dawley-Ratten. Kontrollnifedipin und deuteriertes Nifedipin wurden in minimalen Mengen Ethanol gelöst und verdünnt, bis die Endkonzentration von Ethanol weniger als 0,04% betrug. Dosen von jeweils 1 ml der beiden Nifedipine in den angegebenen Konzentrationen wurden dann in mit Pentobarbital narkotisierte Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 Gramm injiziert. Die maximale Änderung im mittleren arteriellen Druck sowie die Dauer der blutdrucksenkenden Wirkung wurden direkt mit Hilfe eines intraarteriellen Katheters gemessen. Jeder Ratte wurde nur eine Arzneimitteldosis verabreicht, und es wurde mindestens 60 Minuten gewartet, bis der Blutdruck wieder zum Basisniveau zurückkehrte. Die Ergebnisse sind in den nachfolgend erläuterten Figuren dargestellt. In jedem Zeitraum war die Wirkdauer bei deuteriertem Nifedipin größer als bei Kontrollnifedipin. Weil die Dauer der Reaktion jedoch von der Größe der Verringerung im Blutdruck abhängig sein könnte, wurden gleich starke Dosen der beiden Formulierungen verglichen. Bei diesem Vergleich wurden Kontrollnifedipin in einer Konzentration von 2 × 10^-3 mol und deuteriertes Nifedipin in einer Konzentration von 1 × 10^-3 mol verglichen (relative Potenzen -45,8 vs. -40,3 mmHg Kontrolle vs. deuteriert, p = NS). Bei diesen Dosen betrug trotz einer äquivalenten Wirkung auf den Blutdruck die Wirkdauer von Kontrollnifedipin 46,5 min, und die Wirkdauer von deuteriertem Nifedipin betrug 62,2 min (p = 0,02). Die Wirkdauer von deuteriertem Nifedipin ist somit größer als die von Kontrollnifedipin, unabhängig von der blutdrucksenkenden Wirksamkeit (d.h. Potenz und Wirkdauer sind verschieden).
6 zeigt den Einfluss von Kontrollnifedipin und deuteriertem Nifedipin auf den mittleren arteriellen Druck: In 6(a) sind die tatsächlichen Werte aufgetragen, 6(b) zeigt durch logistische Dosis-Wirkung-Regression den Daten entsprechende Kurven. Bei jeder Dosis wurden insgesamt sechs Ratten getestet. Wie zu sehen ist, war deuteriertes Nifedipin in allen Dosen stärker als Kontrollnifedipin (p < 0,05, aufgrund wiederholter ANOVA-Maßnahmen). MAP = mittlerer arterieller Druck
7 zeigt Konzentration-Wirkung-Beziehungen für Kontrollnifedipin (7a) und deuteriertes Nifedipin (7b) unter Verwendung eines asymmetrischen S-förmigen Modells. Es sind angepasste Werte plus 95% Vertrauensbereich dargestellt. Aus diesen beiden Graphiken wird, aufgrund mangelnder Überlappung zwischen den Vertrauensbereichen, ersichtlich, dass die Konzentration-Wirkung-Beziehungen für die beiden Nifedipine verschieden sind. Genauer gesagt wurde die Kurvenanpassung mit Hilfe der Gleichung y = a + b(1 – (1 + exp((x + dln(2^1/e – 1) – c)/d))^-e) durchgeführt. Auf dieser Grundlage waren die Parameter a, b und e alle bei p < 0,05 statistisch verschieden.
8 zeigt mit Hilfe eines logistischen Dosis-Wirkung-Modells angepasste Konzentration-Wirkung-Beziehungen für Kontrollnifedipin (8a) und deuteriertes Nifedipin (8b). Es sind angepasste Werte plus 95% Vertrauensbereich dargestellt. Aus diesen beiden Graphiken wird, aufgrund mangelnder Überlappung zwischen den Vertrauensbereichen, ersichtlich, dass die Konzentration-Wirkung-Beziehungen für die beiden Nifedipine verschieden sind. Genauer gesagt wurde die Kurvenanpassung mit Hilfe der Gleichung y = a + b/(1 + (x/c)^d) durchgeführt. Auf dieser Grundlage waren die Parameter a und b alle bei p < 0,05 statistisch verschieden.
BEISPIEL VI
Einfluss von deuteriertem Nicardipin und Kontrollnicardipin auf den Blutdruck bei normotensiven Sprague-Dawley-Ratten. Kontrollnicardipin und deuteriertes Nicardipin (hergestellt, wie oben beschrieben, analog zur Herstellung von deuteriertem Nifedipin) wurden in minimalen Mengen Ethanol gelöst und verdünnt, bis die Endkonzentration von Ethanol weniger als 0,04% betrug. Die angegebenen Dosen der beiden Nicardipine wurden dann in mit Pentobarbital narkotisierte Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 Gramm injiziert. Die maximale Änderung im mittleren arteriellen Druck sowie die Dauer der blutdrucksenkenden Wirkung wurden direkt mit Hilfe eines intraarteriellen Katheters gemessen. Jeder Ratte wurde nur eine Arzneimitteldosis verabreicht, und es wurde mindestens 60 Minuten gewartet, bis der Blutdruck wieder zum Basisniveau zurückkehrte.

Potenz – In 9a und 9b ist die Dosis-Wirkung-Beziehung für Kontrollnicardipin und deuteriertes Nicardipin (Testnicardipin) dargestellt. Wenngleich sich die Vertrauensbereiche der Kurven in Bereichen überlappen, zeigte ein statistischer Vergleich von ED₁₆, ED₅₀ und ED₈₄ die folgenden Unterschiede:

ED₁₆ Kontrolle Deuteriert	6,11 × 10^-6 mmol 46,2 × 10^-6 mmol	95% Vb: 2,2-16,8 × 10^-6 37,3-57,2 × 10^-6
ED₅₀ Kontrolle Deuteriert	2,54 × 10^-3 mmol 2,11 × 10^-3 mmol	95% Vb: 1,53-4,20 × 10^-3 1,48-3,00 × 10^-3
ED₈₄ Kontrolle Deuteriert	1,06 mmol 0,09 mmol	95% Vb: 0,38-2,91 0,077-0,119
95% Vb = 95% Vertrauensbereich

Aus der obigen Tabelle geht hervor, dass die Vertrauensbereiche sowohl für ED₁₆ als auch für ED₈₄ ausschließend sind. Dies zeigt, dass die Art der Dosis-Wirkung-Beziehungen verschieden ist. Dies wird bestätigt durch unterschiedliche Gefällfunktionen von 416 für Kontrollnicardipin und 46 für deuteriertes Nicardipin (berechnet nach dem Litchfield-Wilcoxon-Verfahren). Die Potenzen der beiden Formulierungen sind also verschieden.
Eine Zweiweg-Varianzanalyse unter Verwendung von Dosis und Formulierung als unabhängige Größen und der Verringerung im mittleren arteriellen Druck als abgängige Größe ergab die folgende ANOVA-Tabelle:

Faktorwert d.f. Quadratsumme Mittleres Abweichungsquadrat F p-

Arzneimittel 1 323 323 3,11 0,082

Dosis 17 5531 3255 30,8 0,0001

Arzneimittel × Dosis 17 6464 380 3,6 0,0001
Wenngleich es auf einem Niveau von p < 0,05 bezüglich der Arzneimittelunterschiede keinen Unterschied gibt (bei 0,1 besteht jedoch ein Unterschied), ist der mangelnde Unterschied vermutlich darauf zurückzuführen, dass die vielen Dosen um ED₅₀ herum gehäuft sind, wo die Kurven nicht differieren. Es besteht jedoch eine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen Arzneimittel und Dosis, was einen Unterschied in der Art der Dosis-Wirkung-Kurven impliziert.
Wirkdauer – In den meisten Zeiträumen war die Wirkdauer bei deuteriertem Nicardipin größer als bei Kontrollnicardipin (10). Weil die Dauer der Reaktion jedoch vom Ausmaß der Verringerung im Blutdruck abhängig sein könnte, wurden gleich starke Dosen der beiden Formulierungen verglichen. Bei diesem Vergleich wurden Kontrollnicardipin in einer Dosis von 1 × 10^-9 mol und deuteriertes Nicardipin in einer Konzentration von 3 × 10^-9 mol verglichen (relative Potenzen -13,8 vs. -13,8 mmHg Kontrolle vs. deuteriert, p = NS). Bei diesen Dosen betrug die Wirkdauer von Kontrollnicardipin trotz einer äquivalenten Wirkung auf den Blutdruck 5,4 + 3,8 (SD) min, und die Wirkdauer von deuteriertem Nicardipin betrug 15,0 + 6,4 (SD) min (p = 0,049 nach dem U-Test von Mann-Whitney). Die Wirkdauer von deuteriertem Nicardipin ist also größer als die von Kontrollnicardipin, unabhängig von der blutdrucksenkenden Wirksamkeit.
Ein Vergleich der Wirkdauer mittels Zweiweg-ANOVA unter Verwendung von Dosis und Formulierung als unabhängige Größen und der Wirkdauer als abhängige Größe ergab die folgende ANOVA-Tabelle:

Faktorwert d.f. Quadratsumme Mittleres Abweichungsquadrat F p-

Arzneimittel 1 5697 5697 24,0 0,0001

Dosis 14 68292 4878 20,6 0,0001

Arzneimittel × Dosis 14 10678 237 3,2 0,0002
Diese Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Wirkdauer der beiden Arzneimittel und implizieren einen Unterschied in der Art der Dosis-Wirkdauer-Beziehung.
Aufgrund der obigen Daten unterscheidet sich deuteriertes Nicardipin von Kontrollnicardipin sowohl in der Art der blutdrucksenkenden Dosis-Wirkung-Beziehung als auch in der Wirkdauer.
BEISPIEL VII
Herstellung von deuteriertem Nicardipin. Eine solche Modifikation von Nicardipin (und anderen Dihydropyridinen) kann erreicht werden durch Lösen des Nicardipins in einem Deuterrierröhrchen in einer Mischung von Deuterochloroform und Deuteriumoxid und dann durch Zugabe einer geringen Menge Trifluoressigsäureanhydrid und Deuteroaceton und Vermischen damit. Die Lösung wird dann in dem Röhrchen eingefroren, vorzugsweise indem das Röhrchen in flüssigen Stickstoff getaucht und dann verschlossen wird. Das verschlossene Röhrchen wird dann auf eine Temperatur im Bereich von etwa 50°C bis etwa 65°C und vorzugsweise im Bereich von etwa 55°C bis etwa 60°C erwärmt und für eine Zeit, die ausreicht, um die Methylgruppe in Position 2 und 6 an dem Nicardipin zu CD₃ zu deuterieren, auf dieser Temperatur gehalten. Eine Zeit von etwa 150 bis etwa 180 Stunden ist wirksam, um die Reaktion durchzuführen, wobei eine Zeit von etwa 160 bis 170 Stunden bevorzugt wird.
Deuteriertes Nicardipin wurde auf folgende Weise synthetisiert: 80 mg Nicardipin in Pulverform wurden in ein spezielles Deuterierröhrchen gegeben und darin in einer Mischung von 2 ml Deuterochloroform und 0,5 ml Deuteriumoxid gelöst, woraufhin 0,2 ml Trifluoressigsäureanhydrid und 2 ml Deuteroaceton zugegeben und damit vermischt wurden. Die Lösung wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, und das Röhrchen wurde unter Stickstoff flammversiegelt. Das Röhrchen wurde dann 168 Stunden auf 57°C erwärmt und danach abgekühlt und geöffnet. Der Inhalt des Röhrchens wurde in einen Rundkolben geleitet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Alle Maßnahmen wurde unter verminderter Lichtstärke durchgeführt. Mittels herkömmlicher ¹H magnetischer Kernresonanz (NMR) wurde errechnet, dass die Deuteriumsubstitution 95% der oben gezeigten C2- und C6-Methylgruppen beträgt.
Angesichts der tiefgreifenden Wirkungen der Substitution von Deuterium für Wasserstoff in den in Position 2 und 6 des Dihydropyridinrings angelagerten Methylgruppen und angesichts der Tatsache, dass alle Calciumkanalblocker in Form von Dihydropyridin mindestens eine Methylgruppe in diesen Positionen haben (tatsächlich haben alle Dihydropyridine 2 Methylgruppen mit Ausnahme von Amlodipin, das von den beiden Methylgruppen nur eine Methylsubstitution in Position 6 mit CH₂OCH₂CH₂NH₂ hat, was die Wirkdauer dieses Dihydropyridins drastisch erhöht). Es wäre zu erwarten, dass die Deuterierung dieser Gruppen bei jedem anderen Dihydropyridin dieselbe Wirkung hat wie bei Nifedipin.
VERGLEICHSBEISPIEL
Einfluss von deuteriertem Verapamil und Kontrollverapamil auf den Blutdruck bei normotensiven Sprague-Dawley-Ratten.
Deuterierung von Veranamil – Verapamilhydrochlorid wurde einer Lösung von 25% deuterierter Schwefelsäure in deuteriertem Wasser (v/v) und deuteriertem Methanol zugesetzt. Die Lösung wurde 140 Stunden bei 90°C gerührt. Der pH-Wert wurde auf 12,0 eingestellt, und die Mischung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten Ethylacetatextrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem viskosen Öl verdampft. Dieses Öl wurde in Ether gelöst und etherisches Hydrochlorid wurde zugesetzt, um das Hydrochloridsalz auszufällen. Das Salz wurde durch Filtration gesammelt und aus Ethylacetat auskristallisiert, um deuteriertes Verapamil als weißen Feststoff zu erhalten.
Kontrollverapamil und deuteriertes Verapamil (wobei die Aromatenpositionen von Verapamil (ein Phenylalkylamin) deuteriert wurden) wurden in minimalen Mengen Ethanol gelöst und verdünnt, bis die Endkonzentration von Ethanol weniger als 0,04% betrug. Die angegebenen Dosen der beiden Verapamile wurden dann in mit Pentobarbital narkotisierte Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 Gramm injiziert. Die maximale Änderung im mittleren arteriellen Druck sowie die Dauer der blutdrucksenkenden Wirkung wurden direkt mit Hilfe eines intraarteriellen Katheters gemessen. Jeder Ratte wurde nur eine Arzneimitteldosis verabreicht, und es wurde mindestens 60 Minuten gewartet, bis der Blutdruck wieder zum Basisniveau zurückkehrte. Die Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt.
Bei jeder Dosis war die Wirkung (Potenz) von deuteriertem Verapamil geringer als bei Kontrollverapamil (siehe 11). Was die Dosisreaktion angeht, so betrug bei ungefähr -90 mmHg als maximaler Reaktion das ED₅₀ für Kontrollverapamil 2,89 × 10^-4 mM und 2,16 × 10^-3 mM für deuteriertes Verapamil. Dieser Unterschied sowie die Unterschiede in der gesamten Dosis-Wirkung-Kurve waren laut Litchfield-Wilcoxon-Analyse verschieden. Das nach diesem Verfahren ermittelte Potenzverhältnis betrug in der Tat 0,133 deuteriert vs. Kontrolle (95% Vertrauensbereich 0,07 bis 0,25, p < 0,001). Das deuterierte Verapamil war also weniger potent als Kontrollverapamil.
Was jedoch die Wirkdauer angeht, so hatte das deuterierte Verapamil laut Litchfield-Wilcoxon-Analyse eine längere Wirkdauer (siehe 12). Außerdem waren die Dosis-Dauer-Kurven ebenfalls signifikant verschieden, was ein Potenzverhältnis von 4,95 für deuteriert vs. Kontrolle ergab (95% Vertrauensbereich 2,3 bis 10,7, p < 0,01). Um den Vergleich noch anders durchzuführen, betrug die Wirkdauer bei gleich starken Dosen (0,3 × 10^-4 mM für Kontrollverapamil, 0,3 × 10^-3 mM für deuteriertes Verapamil; Blutdrucksenkung -52,8 bzw. -57,0 mmHg) für deuteriertes Verapamil vs. Kontrollverapamil 12,5 vs. 6 Minuten (p < 0,01).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Potenz und Wirkdauer durch Deuterierung verändert werden. Wie bei den Dihydropyridinen wurde die Wirkdauer durch Deuterierung verlängert, die Potenz wurde aber, im Gegensatz zu den Dihydropyridinen, herabgesetzt. Je nach dem Ort der Deuterierung konnte die Potenz jedoch möglicherweise erhöht werden.
Angesichts der obigen Ausführungen wird (1) die Wirkdauer durch Deuterierung verlängert (bei allen getesteten Arzneimitteln); (2) die Potenz wird durch Deuterierung beeinflusst: bei Dihydropyridinen wird sie erhöht und bei Verapamil (einem Phenylalkylamin) herabgesetzt; und (3) die Gebrauchsabhängigkeit wird bei Dihydropyridinen verändert (für Verapamil wurde sie nicht getestet).
Verlängerung der Wirkdauer von Arzneimitteln mit Hilfe von Isotopen. Einführung:
Arzneimittelhersteller geben oft mehrere Millionen für die Entwicklung von Arzneimitteln aus, die eine lange Wirkdauer haben. Die Suche nach Arzneimitteln mit einer längeren Wirkdauer hat mehrere Gründe, wie zum Beispiel: Verlängerung der nützlichen therapeutischen Wirkung; Schutz des Marktanteils des Arzneimittels durch neue Patente für die neue Arzneimitteldosisformulierung; und zunehmende Patienten-Compliance (einmal täglich einzunehmende Formulierung ist leichter einzunehmen als eine drei- oder viermal täglich einzunehmende Formulierung).
Jedes der drei getesteten Arzneimittel (d.h. Nifedipin, Nicardipin und Verapamil) wird derzeit bei der Behandlung von Hypertonie (Bluthochdruck) eingesetzt. Da kardiovaskuläre Erkrankungen in Nordamerika eine führende Todesursache sind und Hypertonie ein signifikanter Risikofaktor ist, ist es wichtig, dass Patienten, die diese Medikamente brauchen, in ihrem Blutkreislauf eine Arzneimittelkonzentration haben, die sie 24 Stunden am Tag vor diesen Auswirkungen eines hohen Blutdrucks schützt. Wenngleich einige Hersteller eine zwei-, drei- oder viermal tägliche Dosierung anbieten, gibt es doch mehrere Hersteller, die durch Änderung der Dosisformulierung Arzneimittel mit einer längeren Wirkdauer (längeren Halbwertszeit) herstellen. Zu diesen Änderungen der Dosisformulierung gehören zum Beispiel die Aufnahme von Trägersubstanzen, die die Freisetzung des Arzneimittels verlangsamen, der Überzug von Formulierungen, neuere Formulierungen (z.B. osmotische Pumpen) und Dragees. Viele dieser Modifikationen der Dosisformulierung sind extrem teuer in der Entwicklung und Herstellung.
Anhand der hierin offenbarten deuterierten Arzneimittel haben wir gezeigt, dass wir Arzneimittel unterschiedlicher Klassen (z.B. 1-4-Dihydrophydridine und Phenylalkylamine) modifizieren können, und glauben, dass unsere Modifikation auf alle Arzneimittel anwendbar ist, da das zugrundeliegende Prinzip unabhängig von dem Arzneimittel dasselbe ist. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, haben wir durch Deuterieren von Arzneimitteln vermutlich zwei Wirkungen erzielt: Erhöhung der Lipophilie des Moleküls und Schaffung einer thermodynamisch stabileren C-H-Bindung durch Substitution des -D (Deuteriumatom) für das -H. Der erstgenannte Punkt kann dazu führen, dass sich das Arzneimittel in "tiefere" Gewebedepots (wie zum Beispiel Fettgewebe) hinein verteilen kann und für eine längere Zeit im Körper bleiben kann. Der letztgenannte Punkt ist jedoch der Punkt, der sorgfältiger betrachtet werden sollte. Indem der Wasserstoff durch ein Deuteriumatom ersetzt wird, wird die resultierende Kohlenstoff(C)-Deuterium(D)-Bindung stärker. Durch Erhöhen der Masse an Wasserstoff (H) um eine atomare Masseeinheit und durch Schaffung eines D, werden daher die C-D-Bindungen vermutlich stärker. Dazu wird D als nichtradioaktives stabilies Isotop von H verwendet. Da die C-D-Bindung thermodynamisch stabiler ist als die C-H-Bindung, wird sie interessanterweise durch Stoffwechselprozesse (destruktive Prozesse) weniger leicht gespalten. Die Eliminierungshalbwertszeit des Arzneimittels wird daher verlängert, und die therapeutischen Wirkungen des Arzneimittels werden erhöht. Wenngleich wir außerdem festgestellt haben, dass es Änderungen in der Potenz des Arzneimittels geben kann, ist die Verlängerung der Wirkung des Arzneimittels besonders bemerkenswert.
Durch einfaches Substituieren eines D für H in den drei bisher untersuchten Molekülen haben wir daher im Wesentlichen über die Erhöhung der Dauer der Wirksamkeit ein neues Arzneimittel mit "modifizierter Freisetzung" geschaffen. Außerdem besteht ein klarer Vorteil dieses Verfahrens darin, dass es bei diesem Verfahren nicht mehr notwendig ist, mehrere möglicherweise toxische Trägersubstanzen aufzunehmen, die derzeit in den von den Erneuerern dieses Arzneimittels hergestellten Formulierungen mit modifizierter Freisetzung enthalten sind. Qualitätsunterschiede können mit Verunreinigungen oder Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung des Arzneimittelmoleküls zusammenhängen, wobei diese Unterschiede mit herkömmlichen Testvefahren nicht festzustellen sind, sondern mit Hilfe der GC-IRMS (nachfolgend beschrieben) zur Ermittlung der Molekularstruktur des Arzneimittelmoleküls nachgewiesen werden.
Aus den obigen Ausführungen geht ganz klar hervor, dass pharmazeutische Präparate, die identische Mengen eines Arzneimittels enthalten, möglicherweise nicht bioäquivalent sind. Diese mangelnde Äquivalenz kann ganz und gar auf die Isotopenmischung aller Elemente zurückzuführen sein, die in einem bestimmten Arzneimittel enthalten sind. Solche Isotopenunterschiede zwischen einem Generikum und einem Arzneimittel eines bekannten Herstellers, das nach den Rechten des Erneuerers dieses Arzneimittels hergestellt wurde, könnten zu einer versehentlichen Über- oder Unterdosierung führen, wenn eine Formulierung durch eine andere ersetzt wird. Dies kann zum Beispiel bedeuten, dass bisher gut zu behandelnde Angina oder Hypertonie nach dem Ersatz einer Formulierung durch eine andere nicht mehr zu behandeln ist, so dass ein Arzt nicht versteht, warum das Arzneimittel nicht mehr in der erwarteten Weise wirkt. Patienten, die bisher keine nachteiligen Wirkungen des Arzneimittels erfahren haben, können dagegen bei der neuen Formulierung plötzlich Nebenwirkungen entwickeln. Außerdem kann die Dauer der klinischen Wirkung zwischen zwei unterschiedlichen Formulierungen differieren. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung kann ein auf dem Markt auftauchendes neues Arzneimittel, das als Äquivalent eines bereits auf dem Markt befindlichen bekannten und von einem Hersteller hergestellten Arzneimittels verkauft wird, ohne weiteres auf seine Bioäquivalenz mit dem bekannten Arzneimittel analysiert werden.
GRUNDLAGE DES IRMS-VERFAHRENS
Die Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) ist ein höchst präzises Analyseverfahren, das kleine Proben (geringe Mengen im Nanogrammbereich) messen kann. Das ¹³C/¹²C-Verhältnis wird zum Beispiel an einem Monokohlenstoffmolekül, CO₂-Gas, ermittelt. Organischer Kohlenstoff muss daher durch Verbrennung über Kupfer(I)-oxid (CuO, Online-Verbrennungsofen oder Elementaranalysegerät) in CO₂ umgewandelt und kryogenisch oder chromatographisch gereinigt werden. Das CO₂-Gas kann dann sofort mittels Durchfluss-IRMS (auch als CF-IRMS bezeichnet) in das Spektrometer eingeleitet werden.
Die statistische Kombination der Isotope von Kohlenstoff (¹²C und ¹³C) und Sauerstoff (¹⁶O, ¹⁷O, ¹⁸O), um die CO₂-Moleküle zu erzeugen, führt zur Bildung verschiedener Isotopomere, deren Molekulargewicht 44, 45 bzw. 46 beträgt. Zum Messen der Kohlenstoffisotopenverhältnisse werden somit bei dem IRMS drei Ionenstrahlen erzeugt und aufgezeichnet, die den Massen der verschiedenen CO₂-Isotopomere entsprechen.
Um hohe Präzision und Genauigkeit zu erhalten, werden Referenzgase einer absolut bekannten Isotopenzusammensetzung verwendet, und ein zweifaches Einlasssystem erlaubt die alternative Einleitung von Probengas und Referenzgas in die Ionisationsquelle über ein Gasumschaltventil. Die Messung der verschiedenen Ionenstrahlen ermöglicht die Berechnung der ¹³C-Anreicherung der Probe. Der Wert dieser Berechnung wird mit der Notation δ¹³C(‰) versehen. Die Häufigkeit von ¹³C wird ausgedrückt als δ¹³C(‰) gemäß der folgenden Gleichung: δ13C(‰) = ([(13C/12C)Probe/(13C/12C)PDB] – 1) × 1000
Dieser Wert δ¹³C(‰) misst die Abweichungen des Kohlenstoffisotopenverhältnisses vom Standard in Teilen pro Tausend. Für Kohlenstoff wurde PDB als internationale Bezugsgröße gewählt. PDB ist Pee Dee Belemnitella (ein Fossil aus der geologischen Formation Pee Dee in South Carolina). Das ¹³C/¹²C-Verhältnis aus dem Calciumcarbonat dieses Fossils beträgt 0,011237. Verglichen mit PDB, zeigen die meisten natürlichen Verbindungen einen negativen Deltawert. In der obigen Gleichung bezieht sich ¹³C/¹²C auf die Isotopomere.
Die Messung der verschiedenen Ionenstrahlen für ¹⁵N wird mit der Notation δ¹⁵N(‰) versehen. Die Häufigkeit von ¹⁵N wird ausgedrückt als δ¹⁵N(‰) gemäß der folgenden Gleichung: δ15N(‰)= [(15N/14N Probe) – (15N/14N Standard)/(15N/14N)Standard] × 1000
Dieser Wert δ¹⁵N(‰) misst die Abweichungen des Stickstoffisotopenverhältnisses vom Standard in Teilen pro Tausend. Für Stickstoff wurde Luft als internationale Bezugsgröße gewählt.
Die Messung der verschiedenen Ionenstrahlen für ¹⁸O wird mit der Notation δ¹⁸O(‰) versehen. Die Häufigkeit von ¹⁸O wird ausgedrückt als δ¹⁸O(‰) gemäß der folgenden Gleichung: δ18O(‰) = ([(18O/16O Probe)/(18O/16O Standard)/(18O/16O)Standard] × 1000
Der Wert δ¹⁸O(‰) misst die Abweichungen des Sauerstoffisotopenverhältnisses, d.h. von CO₂ hergeleiteter Sauerstoff, vom Standard in Teilen pro Tausend. Für Sauerstoff wurde CO₂ als internationale Bezugsgröße gewählt.
IRMS-GERÄTE, EINSTELLUNGEN
Das Isotopenverhältnis-Massenspektrometer war ein Finnigan MAT 252 (Bremen, Deutschland), ausgestattet mit einem Doppeleinlass und einem Elementaranalysegerät zum Einleiten von Nichtgasproben. Die Proben wurden abgewogen, so dass jede ungefähr 10-20 μg enthielt, und in Zinnkapseln geleitet. Die geschlossene Zinnkapsel wurde in dem automatischen Einleitungssystem (Elementaranalysegerät, Modell NA1500 NC, Fisons, UK) angeordnet. Die Proben wurden bei 1080°C mit Sauerstoff und Oxidationskatalysatoren (CrO + CuO) verbrannt. Das gereinigte CO₂ wurde mittels Durchfluss-IRMS analysiert. Der CO₂-Standard war ¹³C Oztech-CO₂ (dC(PDB) = -36,49 ‰; dO(PDB) = -25,56 ‰; dO(SMOW) = +15,06 ‰) von der Oztech Trading Corporation, Dallas, Texas, USA. Weitere benutzte Standards waren Atropin (C, 70,56%, H, 8,01%; N, 4,84%; O, 16,59%) und Phenanthren (C, 93,556%; H, 5,615%; N, 0,180%; S, 0,456%). Der gereinigte Stickstoff wurde mittels Durchfluss-IRMS analysiert. Der N-Standard war ¹⁵N Oztech-Stickstoff (dN(LUFT) = -1,89 ‰); bezogen von der Oztech Trading Corporation, Dallas, Texas, USA.
Die Geräteeinstellungen waren folgende: Hochspannung, 10 kV; Kathode, 5,74 A; Emission, 1,473 mA; Trap-Emission, 0,937 mA; Elektronenenergie, 75,0 V; Trap, 50,1 V.
ANWENDUNG DER ISOTOPENVERHALTNIS-MASSENSPEKTROMETRIE ZUR HERSTELLUNG EINES FINGERPRINT
Eine Anzahl von Pharmazeutika, einschließlich Nifedipin, Ciprofloxacin, Ketoprofen, Zopiclon und Acebutolol wurden mit einem Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS) zwecks Ermittlung ihrer Produktionsquelle untersucht. Dieses Verfahren zur Herstellung eines "Fingerprint" basiert zum Beispiel auf ¹³C/¹²C-Verhältnissen, die aus CO₂-Gas ermittelt werden; Sauerstoff- und Stickstoffisotopenverhältnisse können ebenfalls zur Herstellung eines Fingerprint verwendet werden. Der organische Kohlenstoff in dem Arzneimittel wird durch Verbrennung über Kupfer(I)-oxid zu CO₂ umgewandelt und kryogenisch oder chromatographisch gereinigt. Das resultierende CO₂ wird im Durchflussverfahren über eine Verbindungsleitung zu dem IRMS direkt zu dem Spektrometer geleitet.
Um ein hohes Maß an Präzision für die Messung der CO₂-Isotopen aufrechtzuerhalten, wird ein Referenzgas von absolut bekannter Isotopenzusammensetzung über ein doppeltes Einlasssystem, das die abwechselnde Einleitung sowohl eines Probengases (aus dem Arzneimittel) als auch eines Referenzgases erlaubt, dem IRMS zugeführt. Die Analyse liefert ein ¹³C/¹²C-Verhältnis (δ ‰), das wie folgt ausgedrückt wird: δ ‰ = ((RProbe – RStandard)/RStandard) × 1000
Dieser Wert δ ‰ (Delta Promille) misst die Abweichungen des Kohlenstoffisotopenverhältnisses vom Standard in Teilen pro Tausend. Dieser Wert wird bei der Herstellung des Fingerprint von Pharmazeutika verwendet.

Es wurden Rohmaterialien (Wirkstoffe) sowie Fertigprodukte (z.B. Tabletten) analysiert. Die Ergebnisse für die verarbeiteten Pharmazeutika lauten wie folgt: IRMS-ERGEBNISSE BEI DER HERSTELLUNG EINES FINGERPRINT FÜR ROHMATERIALIEN UND FERTIGPRODUKTE

MOLEKÜL	BEZEICHNUNG/CHARGE	δ ‰ (MITTEL)	STANDARD-ABWEICHUNG	ROHMATERIAL ODER FERTIGPRODUKT
Acebutolol	ABC-191-MP	-30,67	0,10	RM
Acebutolol	4435910222	-28,84	0,08	RM
Acebutolol	J57	-30,65	0,06	RM
Zopiclon	M-23078 9321500 RPR	-30,42	0,05	RM
Zopiclon	M-23149 9332900 RPR	-33,93	0,04	RM
Zopiclon	M-23077 9322900	-31,43	0,08	RM
Zopiclon	62H4023	-33,20	0,05	RM
Nifedipin	OEHS SA Sanofi	-26,67	0,10	RM
Nifedipin	39163032	-32,07	0,04	RM
Nifedipin	1838H8 Siegfried	-29,41	0,11	RM
Nifedipin	7113-Sumika	-39,69	0,03	RM
Nifedipin	038-1016B-Seloc AG	-30,35	0,14	RM
Nifedipin	NF-19010 Quimicha Aimar	-35,92	0,07	RM
Nifedipin	C.F.M. Milanese	-19,61	0,07	RM
Nifedipin	795019	-36,67	0,24	RM
Nifedipin	PT240563H, Bayer AG	-30,03	0,15	RM
Nifedipin	PT257982A, Bayer AG	-30,50	0,10	RM
Nifedipin	PT257981B, Bayer AG	-30,59	0,09	RM
Nifedipin	PT249877D, Bayer AG	-31,17	0,15	RM
Nifedipin	PT257980D, Bayer AG	-30,66	0,09	RM
Nifedipin	898556A, Bayer AG	-30,09	0,13	RM
Nifedipin	899612A, Bayer AG	-30,51	0,09	RM
Nifedipin	898552S, Bayer AG	-30,45	0,13	RM
Nifedipin	898553K, Bayer AG	-30,32	0,10	RM
Nifedipin	898555C, Bayer AG	-30,21	0,14	RM

MOLEKÜL	BEZEICHNUNG/CHARGE	δ ‰ (MITTEL)	STANDARD-ABWEICHUNG	ROHMATERIAL ODER FERTIGPRODUKT
Nifedipin	2704 Dexxon Israel	-29,67	0,08	RM
Nifedipin	NI-S-891101 China	-34,33	0,06	RM
Nifedipin	50-OEHS SA Sanofi	-28,75	0,08	RM
Nifedipin	038.1016B Seloc AG Schweiz	-30,05	0,20	RM
Nifedipin	150 Cipla Bombay	-28,40	0,05	RM
Nifedipin	208143 Sumika Japan	-35,67	0,21	RM
Nifedipin	K8192400 Klinge Pharma GmbH, Deutschland	-28,14	0,14	RM
Nifedipin	5486 MI/01102 Zambon Gruppe, Italien	-33,46	0,15	RM
Ciprofloxacin	43/93 Union Quimico Farmaceutica, Spanien	-34,62	0,09	RM
Ciprofloxacin	92/18 Fako, Istanbul	-35,84	0,07	RM
Ciprofloxacin	930501, Shanghai	-30,02	0,17	RM
Ciprofloxacin	F30394 Cipla Bombay	-34,22	0,06	RM
Ketoprofen	BP E1344-11507191	-27,66	0,29	RM
Nifedipin (Allotop L10)	92001	-32,3 -32,1	**	FP
Nifedipin (Atenerate L20)	202	-34,0 -33,9	**	FP

MOLEKÜL	BEZEICHNUNG/CHARGE	δ ‰ (MITTEL)	STANDARD-ABWEICHUNG	ROHMATERIAL ODER FERTIGPRODUKT
Nifedipin (Cardioluft L10)	2FC	-33,9 -34,6	**	FP
Nifedipin (Casanmil S10)	BABP	-32,3 -32,1	**	FP
Nifedipin Corinael L10)	CF109D	-32,5 -32,7	**	FP
Nifedipin (Adalat L10)	B533	-28,6 -28,9	**	FP
** Es wurden nur zwei Ermittlungen durchgeführt. Angabe einer Standardabweichung daher nicht angebracht.

Die obige Information bestätigt, dass es mit IRMS möglich ist, "Fingerprints" von Pharmazeutika aus verschiedenen Produktionsquellen herzustellen. Anhand dieser Information kann die Herkunft von Arzneimitteln festgestellt werden, ob es sich dabei nun um Rohmaterialien (Wirkstoffe) oder um Fertigprodukte handelt.
13 zeigt einen dreidimensionalen "Fingerprint" von sieben Nifedipinpräparaten. Alle diese Präparate sind signifikant voneinander verschieden. Diese Art von dreidimensionalem "Fingerprint" würde typischerweise hergestellt, um den feinsten "Fingerprint" eines Arzneimittels oder einer sonstigen Substanz bereitzustellen.
14 zeigt einen zweidimensionalen "Fingerprint" von neun Nifedipinpräparaten. Die Fehlerlinien sind 95% Vertrauensbereiche; somit sind alle Präparate signifikant voneinander verschieden. Wenngleich die Herstellung dreidimensionaler "Fingerprints" einen präziseren "Fingerprint" liefert, ist es in der Praxis normalerweise ausreichend, zweidimensionale "Fingerprints" herzustellen, um Materialien zu differenzieren.
15 zeigt einen zweidimensionalen (Sauerstoff vs. Kohlenstoff) "Fingerprint" von rohen Solatoltabletten. Die meisten Tabletten können mit dem zweidimensionalen Verfahren voneinander unterschieden werden, auch wenn die Herstellung zweidimensionaler Kohlenstoff-Sauerstoff-"Fingerprints" weniger präzise ist als die Herstellung von Kohlenstoff-Stickstoff-"Fingerprints".
16 zeigt "Fingerprints" von drei verschiedenen Haarproben von drei verschiedenen Leuten. Bei dem ersten Patienten (Pt. 1) wurde eine Woche später eine zweite Probe genommen und mit der ersten verglichen. Dieser Vergleich ergab einen mit der ersten Probe statistisch identischen Wert, woraus ersichtlich wurde, dass dieses Verfahren reproduzierbar ist und zum Identifizieren von Haarproben geeignet ist.
Weitere Variationen und Modifikationen der vorstehenden Ausführungen werden für den Fachmann offensichtlich sein, und diese Variationen und Modifikationen sollen von den hier beigefügten Ansprüchen umfasst sein.

Claims

Dihydropyridinverbindung, die ausgewählt ist aus der aus deuteriertem Nicardipin bestehenden Gruppe, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome von mindestens einer der beiden Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch ein Deuteriumatom und Verbindungen mit der folgenden Formel ersetzt sind:
wobei: X = H, R¹ = CH₃, wobei jedes H-Atom durch ein D-Atom ersetzt werden kann, und R² = CH₃, wobei höchstens 5 der insgesamt 611 Atome durch ein D-Atom ersetzt werden können, und wobei mindestens eines von R¹ und R² zusammen ein D-Atom enthält.
Dihydropyridin nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Methylgruppen in Stellung 2,6 CD₃ ist.
Dihydropyridin nach Anspruch 1, wobei X = H, R¹ = CD₃ und R² = CH₃ der Formel
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als Medikament.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Behandlung von Bluthochdruck.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament, die ein oder mehr Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Wirkstoff und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Medikaments mit blutdrucksenkender Wirkung.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Lösen eines Dihydropyridins in einer Mischung von Deuterochloroform und Deuteriumoxid, um eine Lösung zu bilden, Zugabe von Trifluoressigsäureanhydrid und Deuteroaceton zu der Lösung, Einfrieren und Verschließen der Lösung in einem Gefäß, Erwärmen der Lösung auf eine Temperatur und für eine Zeit, die ausreicht, um alle Wasserstoffatome in den Methylgruppen in Stellung 2 und 6 an dem Dihydropyridin zu deuterieren, und Gewinnen des deuterierten Dihydropyridins.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Lösen von 80 mg Nifedipin oder Nicardipin in einer Mischung von etwa 2 ml Deuterochloroform und etwa 0,5 ml Deuteriumoxid, um eine Lösung zu bilden, Zugabe von etwa 0,5 ml Trifluoressigsäureanhydrid und etwa 2 ml Deuteroaceton zu der Lösung und Mischen mit derselben, Einfrieren und Verschließen der Lösung in einem Gefäß, Erwärmen der Lösung auf eine Temperatur von etwa 50°C bis etwa 65°C für eine Dauer von etwa 150 bis 180 Stunden, Abkühlen der erwärmten Lösung und Gewinnen des deuterierten Nifedipins oder Nicardipins.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Temperatur etwa 55°C bis etwa 60°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zeitdauer von etwa 160 bis 170 Stunden beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Temperatur etwa 57°C und die Zeitdauer etwa 168 Stunden beträgt.
Den Calciumkanal blockierende Verbindung, die aus der Verbindung nach Anspruch 1 besteht und im Vergleich zu einem nicht deuterierten Analogon der Verbindung nach Anspruch 1 eine verlängerte Wirkdauer besitzt.
Verbindung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass alle Wasserstoffatome der Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch Deuteriumatome ersetzt sind.
Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung als Medikament mit einer verlängerten Wirkdauer.
Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung bei der Behandlung von Bluthochdruck und mit einer verlängerten Wirkdauer.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament mit einer verlängerten Wirkdauer, die ein oder mehr Verbindungen nach Anspruch 13 oder 14 als Wirkstoff und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen nach Anspruch 13 oder 14 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments mit blutdrucksenkender Wirkung und verlängerter Wirkdauer.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 13, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome von mindestens einer der beiden Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch ein Deuteriumatom ersetzt sind, zur Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung einer länger andauernden Calciumkanalblockierung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung einer länger andauernden Calciumkanalblockierung.
Den Calciumkanal blockierende Verbindung, die aus der 1,4-Dihydropyridinverbindung nach Anspruch 1 besteht und im Vergleich zu einem nicht deuterierten Analogon der Verbindung nach Anspruch 1 eine verbesserte Gebrauchsabhängigkeit besitzt.
Dihydropyridinverbindung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass alle Wasserstoffatome der Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch Deuteriumatome ersetzt sind.
Verbindung nach Anspruch 21 oder 22 zur Verwendung als Medikament mit einer verbesserten Gebrauchsabhängigkeit.
Verbindung nach Anspruch 21 oder 22 zur Verwendung bei der Behandlung von Bluthochdruck und mit einer verbesserten Gebrauchsabhängigkeit.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament mit einer verbesserten Gebrauchsabhängigkeit, die ein oder mehr Verbindungen nach Anspruch 21 oder 22 als Wirkstoff und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen nach Anspruch 21 oder 22 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 25 zur Herstellung eines Medikaments mit blutdrucksenkender Wirkung und einer verbesserten Gebrauchsabhängigkeit.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 21, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome von mindestens einer der beiden Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch ein Deuteriumatom ersetzt sind, zur Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung einer Calciumkanalblockierung mit einer verbesserten Gebrauchsabhängigkeit.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei alle Wasserstoffatome der Methylgruppen in Stellung 2 und 6 in der undeuterierten 1,4-Dihydropyridinverbindung durch Deuteriumatome ersetzt sind.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 21, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome von mindestens einer der beiden Methylgruppen in Stellung 2 und 6 durch ein Deuteriumatom ersetzt sind, zur Herstellung eines Medikaments, das Calciumkanalblockierung und eine im Vergleich zu einem nicht deuterierten Analogon der Verbindung nach Anspruch 21 modifizierte Dosis-Wirkung-Beziehung bereitstellt.
Verwendung einer Dihydropyridinverbindung nach Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung einer Calciumkanalblockierung.