DE69032621T3

DE69032621T3 - Zweiwellenlängenlaserabtastmikroskop

Info

Publication number: DE69032621T3
Application number: DE69032621T
Authority: DE
Inventors: Winfried Berkley Heights DENK; James P. Ithaca STRICKLER; Watt W. Ithaca WEBB
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1989-11-14
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2010-11-14
Also published as: ES2123501T5; ES2210414T3; ATE170636T1; JPH05503149A; DE69032621D1; JP2848952B2; DE69034117T2; ATE253727T1; EP0500717B1; ES2123501T3; HK1010411A1; EP0500717A1; EP0807814B1; DK0807814T3; US5034613A; DE69034117D1; WO1991007651A1; EP0807814A1; DE69032621T2; EP0500717A4

Description

Die vorliegende Erfindung erhielt die folgenden staatlichen Unterstützungen: Zuschuß Nr. P41RR04224 von den National Institutes of Health; NSF-BBS-8714069 von der National Science Foundation und NSF-DMB-8609084 von der National Science Foundation. Die amerikanische Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
Obwohl das Prinzip eines "Flying Spot-Scanners" (Lichtpunktabtasters) schon seit vielen Jahren bekannt ist, florierte seine Anwendung in der Mikroskopie erst in den letzten Jahren, als die dazu notwendige Technik entwickelt wurde. Stabile Laserlichtquellen und schnelle elektronische Bilderzeugungs- und -speichertechniken sind notwendige Bestandteile eines Rastermikroskops. Während die Abbildungseigenschaften eines nichtkonfokalen Rastermikroskops jenen herkömmlicher Mikroskope stark ähneln, eröffnen konfokale Rastermikroskope ein völlig neues Gebiet. Die durch solche Vorrichtungen erzielte Auflösung wird nur gering erhöht, doch ihre stark verbesserte Tiefenauflösung ermöglicht die Erzeugung dreidimensionaler Bilder ohne komplizierte Dekonvolutionsalgorithmen. Die Tiefenauflösung reduziert den Hintergrund und dies – gemeinsam mit der Verwendung eines einzelnen hochqualitativen Detektors wie z. B. eines Photovervielfachers – ermöglicht quantitative Studien mit hoher räumlicher Auflösung.
Die Auflösung entlang der optischen Achse eines konfokalen Rastermikroskops bietet ein brauchbares Auflösungsvermögen gegen Hintergrundstreuung oder Fluoreszenz, die oberhalb und unterhalb der Fokusebene in einem transparenten Objekt auftreten. Ferner ist sie bei der Erzeugung dreidimensionaler fluoreszierender Bilder aus einer Reihe von Schnitten und bei der Verwendung quantitativer Fluoreszenzindikatoren oder zur Kartierung fluoreszierender Marken von Zelloberflächenrezeptoren auf nichtplanaren Oberflächen von großem Nutzen. Solche Vorrichtungen liefern eine etwas bessere seitliche Auflösung, eine viel bessere Tiefenschärfenauflösung und eine Hintergrundauflösung unter idealen Bedingungen, die um Größenordnungen besser ist als bei früheren Vorrichtungen unter idealen Bedingungen.
Das Abtasten kann durchgeführt werden, indem entweder die Probenplattform unter einem stationären Strahl bewegt wird oder indem ein präzise synchronisiertes optisches Abtasten der Beleuchtung und der Fluoreszenzreaktinnssignale erfolgt. Obwohl die Lösung mit der beweglichen Plattform vom optischen Standpunkt aus vorzuziehen ist, schränkt sie den Zugang und das Montieren der Probe, die Verwendung von Umgebungskammern und die elektrische Aufzeichnung mit Mikroelektroden ein. Demzufolge wird oft dem "Moving-Spot"-Ansatz der Vorzug gegeben. Ein solcher Moviny Spot kann durch Verwendung von Spiegeln produziert werden, die auf Galvanometerscannern montiert sind, obwohl dies die verfügbare Bildfrequenz einschränkt. Die Verwendung akustisch-optischer Deflektoren beeinträchtigt das konfokale räumliche Filtern in der Fluoreszenzmikroskopie aufgrund ihrer starken Dispersion. Obwohl polygonale Spiegel schneller als Galvanometerscanner sind, ermöglicht ein einzelner keine Vektorfunktionsweise.
Eine herkömmliche Bogenlichtquelle kann für viele Anwendungen eines konfokalen Rastermikroskops verwendet werden; dabei kommt ein rotierender Scheibenbeleuchter zum Einsatz, doch offensichtlich schränken die unausweichlichen Intensitätsmodulationen den Einsatz für quantitative Anwendungen ein. In solchen Vorrichtungen wird das Bild entweder durch ein Doppelset konfokaler Stiftlöcher in der Scheibe oder – in neueren Versionen – durch die Beleuchiungsstiftlöcher selbst gebildet.
Konfokale Rastermikroskope, bei denen ein einzelner, durch einen Laser beleuchteter Punkt über das sich Bewegende Objekt abgetastet wird, funktionieren bei niedrigen Ahtastgeschwindigkeiten recht gut, wobei gute Laserrastermikrographen unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern, die sichtbares Licht absorbieren und ausstrahlen, erhalten wurden. Konfokale Rasterbilder mit Fluorophoren und fluoreszierenden chemischen Indikatoren, die durch den ultravioletten Teil des Spektrums angeregt werden, standen jedoch bislang nicht zur Verfügung – vor allem auffgrund eines Mangels geeigneter Mikroskoplinsen, die chromatisch korrigiert und sowohl für Absorptions- als auch für Emissionswellenlängen transparent sein müssen, aller auch aufgrund des Schadens, den UV-Licht lebenden Zellen zufügt. Außerdem haben die Beschränkungen von UV-Lasern solche Anwendungen verhindert. Die Fluoreszenzmikroskopie ist außerdem in allen ihren Erscheinungsformen durch das "Photohleaching" (Photoausbleichen) von Fluorophoren im Zielmaterial eingeschränkt, da das anregende Licht die Fluorophoren langsam photobleicht, während es Fluoreszenz anregt. Selbst in der konfokalen Laserraster-Fluoreszenzmikroskopie wird im wesentlichen das gleiche Photoausbleichen hervorgerufen wie in der Breitfeldmikroskopie, da das fokussierte anregende Licht nach wie vor die volle Tiefe der Zielprobe einheitlich in einem Zeitdurchschnitt beleuchtet, während es die Fokusebene abtastet. Das Photoausbleichen ist besonders in einer dreidimensionalen Bildrekonstruktion problematisch, da zahlreiche zweidimensionale Bilder für diesen Zweck erforderlich sind und die Erzeugung jedes zweidimensionalen Bilds in der gesamten Probe Photoausbleichen hervorruft.
Zwei-Photonen-Anregung ist ein bekanntes Phänomen. Es wird z. B. in Zusammenhang mit der Spektroskopie ausführlich in Demptröder, Laser Spectroscopy, 1982, S. 423– 441, behandelt. Sheppard et al. besprechen in Applied Optics 17, (1978), 5.2879–82, ein optisches Resonanzrastermikroskop, in dem nichtlineare Interaktionen auftreten können. Die Zwei-Photonen-Fluoreszenz ist eine solche Interaktion. Antonov et al. besprechen in Picosecond Phenomena, 1982, S. 310–313, die Mehr-Photonen-Anregung in der Photochemie unter Verwendung von Impulsen mit einer Dauer von Pikosekunden.
Die vorliegende Erfindung wendet die Zwei-Photonen-Ntolekularanregung von Fluoreszenz in der Laserrastermikroskopie an. Die Zwei-Photonen-Anregung wird gemäß der Erfindung durch folgende Kombination ermöglicht: (a) die sehr hohe, lokale, momentane Intensität aufgrund der in einem Laserrastermikroskop erzielbaren engen Fokussierung, worin der Laser auf eine beugungsbegrennztes Engstelle mit einem Durchmesser von weniger als 1 μm fokussiert werden kann, und (b) die vorübergehende Konzentration eines gepulsten Lasers. Eine monochrome Lichtquelle hoher Intensität und langer Wellenlänge, die auf die Beugungsgrenze fokussierbar ist, z. B. ein "colliding-pulse" phasenverriegelter Farbstofflaser, erzeugt einen Impulsstrom, wobei jeder Impuls eine Dauer von etwa 100 Femtosekunden (100 × 10^–13 Sekunden) bei einer Wiederholrate von etwa 80 MHz hat. Diese Impulse im Subpikosekunden-Bereich werden dem Mikroskop zugeführt, z. B. mittels eines dichroitischen Spiegels, und durch die Mikroskopoptik auf eine Probe, d. h. ein Zielmaterial, gerichtet, das sich auf der Objektebene des Mikroskops befindet. Aufgrund der hohen Momentanleistung, die durch die intensiven, auf die Beugungsgrenze fokussierten Impulse sehr kurzer Dauer erzeugt wird, besteht die relativ große Wahrscheinlichkeit, daß ein Fluorophor (ein fluoreszierender Farbstoff), der im Zielmaterial enthalten ist und normalerweise durch ein einzelnes energiereiches Photon mit kurzer Wellenlänge, typischerweise im UV-Bereich, anregbar ist, zwei Photonen langer Wellenlänge aus der Laserquelle gleichzeitig absorbiert. Diese Absorption kombiniert die Energie der zwei Photonen im Fluorophormolekül, wodurch der Fluorophor in seinen angeregten Zustand gehoben wird. Wenn der Fluorophor in seinen normalen Zustand zurückkehrt, strahlt es Licht aus, das durch die Mikroskopoptik zurück zu einem geeigneten Detektor gelangt.
Die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren durch kurze Lichtimpulse hoher Intensität stellt ein allgemeines Fluoreszenzverfahren für die Mikroskopie dar, das für verbesserte Hintergrundauflösung sorgt, das Photoausbleichen der Fluorophore reduziert und die Lichtbeschädigung lebender Zellproben minimiert. Der Grund liegt darin, daß die im Mikroskop erzeugte fokussierte Beleuchtung einen konvergierenden Kegel füllt, wenn sie in die Probe gelangt. Das gesamte Licht, das die Fokusebene am Scheitelpunkt des konvergierenden Kegels erreicht, gelangt – mit Ausnahme des winzigen Teils, der im Fluorophor absorbiert wird – aus der gegenüberliegenden Seite der Probe durch einen divergierenden Kegel nach außen. Nur im Fokalvolumen, d. h. im Bereich des Brennpunkts auf der Objektebene an der Engstelle, die durch die konvergierenden und divergierenden Kegel gebildet wird, ist die Intensität ausreichend hoch, um Zwei-Photonen-Absorption im Probefluorophor zu produzieren, und diese Intensitätsabhängigkeit ermöglicht es, daß Licht langer Wellenlänge die Wirkung der kurzwelligen Anregung nur im kleinen lokalen Volumen der Probe um den Brennpunkt herum entfaltet. Diese Absorption wird mittels eines Stroms schneller Impulse hoher Intensität im Femtosekunden-Bereich mit relativ langer Wellenlänge erreicht, die eine moderate durchschnittliche Beleuchtungsintensität von Licht Dinger Wellenlänge im gesamten restlichen Teil der Probe außerhalb des Bereichs des Brennpunkts aufrechterhält. Das Photoausbleichen des Fluorophors außerhalb der Fokusebene wird somit praktisch ausgeschaltet. Die Ein-Photon-Absorption des Lichts langer Wellenlänge ist vernachlässigbar, und außerhalb der Fokusebene ist die momentane Intensität zu gering für eine deutliche Zwei-Photonen-Absorption- und -Anregung, obwohl der Zeitdurchschnitt der Beleuchtung in Wirklichkeit über die gesamte Tiefe der Probe fast einheitlich ist. Dieser Effekt sorgt auch für eine deutliche Verringerung der Schädigung lebender Zellen.
Die Zwei-Photonen-Anregung der Erfindung ermöglicht eine präzise räumliche Auflösung und die Quantifizierung der Fluoreszenz aus kleinen Volumina, deren Position in drei Dimensionen definiert ist, und bietet somit eine Tiefenschärfenauflösung, die mit jener von konfokalen Laserrastermikroskopen vergleichbar ist, ohne jedoch mit den oben beschriebenen Nachteilen konfokaler Mikroskope verbunden zu sein. Dies ist besonders in jenen Fällen wichtig, wo dicke Zellschichten untersucht werden müssen. Außserdem bewirkt die Zwei-Photonen-Anregung auch eine deutliche Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Obige und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen, worin:
1 eine schematische Darstellung eines konfokalen Laserrastermikroskops ist, das gemäß der Erfindung verwendet wird;
1A eine vergrößerte Teilansicht des Bereichs der Objektebene der Vorrichtung von 1 ist;
2 ein synthetisiertes Stereobildpaar ist, das blaue Fluoreszenz zeigt, die durch Zwei-Photonen-Absorption von rotem Licht angeregt wurde;
3 eine Kurve der durchschnittlichen Intensität von einem Bereich innerhalb einer fluoreszierenden Latexperle über der angelegten durchschnittlichen Laserenergie ist;
4 ein Bild von Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz von Chromosomen lebender kultivierter Schweinenierenzellen ist, die mit einem DNA-Färbemittel eingefärbt sind;
5 ein Bild einer Latexperle ist, aus dem ersichtlich ist, daß das Zwei-Photonen-Photobleichen auf die Fokusebene beschränkt ist; und
6 ein Bild eines Zwei-Photonen-Bleichmusters innerhalb einer fluoreszierend gefärbten Latexperle ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Es folgt eine ausführlichere Beschreibung der Erfindung. In 1 sieht man in schematischer Form ein herkömmliches Laserrastermikroskop 10, das eine Objektivlinse 12 zum Fokussieren von auftreffendem Licht 14 aus einer Quelle 16 wie z. B. einem Laser auf eine Objektebene 18 enthält. Wie aus 1A ersichtlich, kann die Objektebene auf oder in einem Probestück bzw. Zielmaterial 20 liegen, das auf einer beweglichen Plattform 22 getragen sein kann. Die durch den auftreffenden Lichtstrahl 14 geschaffene Beleuchtung füllt einen konvergierenden Kegel (allgemein durch 24 gekennzeichnet), der in die Probe 20 führt, um die Fokusebene auf der Objektebene 18 zu erreichen, und bis auf den winzigen Teil des durch die Probe absorbierten Lichts durch einen divergierenden Kegel 25 nach außen gelangt. Das auftreffende Licht bildet eine Engstelle bzw. einen Brennpunkt 26 auf der Objektebene 18. Der Durchmesser des Brennpunkts 26 ist durch Beugung auf dem Lichtweg eingeschränkt, beträgt jedoch vorzugsweise weniger als 1 μm. Durch Einstellen der Mikroskopoptik kann – wie dies allgemein bekannt ist – die vertikale Position des Brennpunkts in der Probe 20 ausgewählt werden. Außerdem kann die Plattform 22 in einer horizontalen Ebene beweglich sein, z. B. in einer Rasterbewegung entlang der X- und Y-Achse, um das auftreffende Licht an ausgewählten Stellen in der Probe in der horizontalen Ebene zu positionieren, sodaß eine dreidimensionale Abtastung der Probe erzielt werden kann. Da jedoch mechanisch abgetastete Plattformen mit Schwierigkeiten verbunden sind, ist es vorzuziehen, eine stationäre Plattform zu verwenden und den auftreffenden Strahl in der X-Z-Ebene optisch abtastend zu führen, z. B. mittels Abtastspiegeln auf dem Lichtweg des Mikroskops.
Der Lichtweg vom Laser 16 zur Objektebene 18 enthält einen dichroitischen Spiegel 28, auf den das Licht aus dem Laser 16 gerichtet wird. Wie dies weiter unten ausführlich erklärt wird, besteht gemäß der Erfindung der Ausgang aus dem Laser aus kurzen, intensiven Lichtimpulsen mit relativ langer Wellenlänge, vorzugsweise im sichtbaren roten oder mittleren Infrarot-Spektralbereich. Der Spiegel 28 lenkt dieses Licht langer Wellenlänge nach unten zu einem Spiegel 30 ab, der seinerseits das Licht mittels gekrümmter Spiegel 36 und 38 zu einem Paar Abtastspiegeln 32 und 34 ablenkt. Die Spiegel 32 und 34 sind um zueinander im rechten Winkel stehende Achsen drehbar, um das auftreffende Licht 14 entlang im rechten Winkel zueinander stehenden X- und Y-Achsen auf der Objektebene zu bewegen, sodaß die stationäre Probe durch den auftreffenden Strahl abgetastet wird. Das Licht aus den Abtastspiegeln gelangt durch das Okular 40 und wird durch die Objektivlinse 12 auf die Objektebene 18 fokussiert.
In der Probe 20 produzierte Fluoreszenz (durch gepunktete Pfeile 42 in 1A gekennzeichnet) geht durch das Mikroskop 10 hindurch zurück, wobei sie dabei den Lichtweg des auftreffenden Strahls 14 nachzeichnet, und gelangt somit durch die Objektivlinse 12 und das Okular 40, die Abtastspiegel 34 und 32 und die gekrümmten Spiegel 38 und 36 und wird durch den Spiegel 30 zurück auf den dichroitischen Spiegel 28 reflektiert. Das durch Fluoreszenzmaterial in der Probe ausgestrahlte Licht liegt in einer Wellenlänge vor, die für das in der Probe enthaltene Fluorophor spezifisch ist und sich somit von jener des auftreffenden Lichts 14 unterscheidet. Das fluoreszierende Licht kann durch den dichroitischen Spiegel 28 gelangen, anstatt wieder auf den Laser 16 reflektiert zu werden, und folgt dem allgemein mit 44 gekennzeichneten Lichtweg.
Das fluoreszierende Licht 42 gelangt somit durch einen Barrierenfilter 46 und wird durch flache Spiegel 48, 50 und 52 auf einen geeigneten Detektor wie z. B. ein Photo-Vervielfacher-Rohr 54 reflektiert. Gemäß der Erfindung ist ein konfokales Laserrastermikroskop vorzuziehen, weshalb ein derartiges Mikroskop in den Abbildungen veranschaulicht ist. Man beachte jedoch, daß auch andere Laserrastermikroskope in Frage kommen. Im konfokalen Mikroskop 10 ist ein einstellbares konfokales Stiftloch 56 in der Sammeloptik 44 vorhanden, um Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, die in den konvergierenden und divergierenden Kegeln 24 und 25 oberhalb und unterhalb der Fokusebene erregt wird. Das konfokale Stiftloch ist nützlich, doch in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzerregung der Erfindung nicht notwendig, da die Anregung im wesentlichen auf den Bereich des Brennpunkts 26 auf der Objektebene beschränkt ist.
Bei Fluoreszenzmikroskopen des Stands der Technik werden die Fluoreszenzphotonen 42 des sichtbaren Lichts durch Moleküle produziert, die durch Absorbieren eines einzelnen Photons aus auftreffendem Licht 14 mit höherer Energie angeregt werden; es handelt sich also um eine kürzere Wellenlänge als die Fluoreszenz 42, die während der Relaxation des Moleküls aus seinem angeregten Zustand erzeugt wird. Die Anzahl an Fluoreszenzphotonen, die pro Molekül in solchen Vorrichtungen des Stands der Technik freigesetzt werden, ist üblicherweise linear proportional zur Anzahl absorbierter anregender Photonen. Da nur ein einzelnes Photon in solchen Vorrichtungen absorbiert werden muß, kann Photolyse von Molekülen, die das anregende Licht 14 absorbieren, entlang des gesamten Doppelkegelstrahls 24 und 25 innerhalb der Probe auftreten, obwohl dieser Vorgang nicht notwendigerweise linear mit der Intensität abläuft. Da Fluoreszenz entlang des gesamten Doppelkegelstrahls erzeugt wird, ist die Menge an Fluoreszenz, die von jeder Ebene in der Probe oberhalb, unterhalb und innerhalb der Fokusebene des anregenden Lichts 14 freigesetzt wird, zumeist die gleiche, und eine dreidimensionale Auflösung ist nur schwierig zu erhalten. In der Fulge führt dich hohe Energie des auftreffenden Lichts durch die Probe zumeist zu einer Beschädigung der Proben, was besonders ungünstig ist, wenn lebende Zellen beobachtet werden.
Um eine dreidimensionale Auflösung in der Rastermikroskopie zu erzielen und die Beschädigung der Probe in Bereichen außerhalb des Brennpunkts des Mikroskops zu verringern, sieht die Erfindung die Zwei-Photonen-Anregung eines Fluorophors vor, das eine Ein-Photon-Absorptionspitze bei einer Wellenlänge afweist, die eine Hälfte jener des anredenden Lichts überlappt. Um dies zu erreichen, produziert der Laser 16 einen sehr kurzen gepulsten Laserstrahl hoher Momentanleistung mit relativ langer Wellenlänge, z. B. in, sichbaren Rot- oder Infrarotbereich. Dieses Licht wird zu einer Probe gelenkt, die einen Fluorophor enthält, der normalerweise durch ein einzelnes Photon in der kurzen Wellenlänge angeregt wird, z. B. im UV-Bereich, sodaß zwei (rote) Photonen geringer Energie ihre Energie kombinieren müssen, um die gleiche Anregung der Probe zu erzielen wie durch ein einzelnes energiereiches (ultraviolettes) Photon. Sowohl die Anregungs- als auch die Fluoreszenzrate in der Probe sind proportional zum Quadrat der Intensität des auftreffenden Lichts. Im fokussierten Anregungslaserstrahl 14 steigt die Intensität des auftreffenden Lichts langer Wellenlänge genug an, um die Fluorophore in der Probe nur im Bereich des Brennpunkts 26 der Mikroskopoptik anzuregen. Dieser Brennpunkt kann einstellbar in der Probe positioniert sein, sodaß Fluoreszenz und/oder Photolyse der Probe nur in einem ausgewählten ellipsoidischen Volumen um den Fokus herum entstehen. Gemäß der Erfindung muß nur Anregungslicht langer Wellenlänge durch die Probe gelangen, und dieses Licht langer Wellenlänge wird fokussiert, um für ausreichende Intensität zu sorgen, damit Fluoreszenz nur in einem sehr kleinen Bereich angeregt wird. Diese Fluoreszenz wird selbst dann produziert, wenn der Fluorophor normalerweise nur im UV-Bereich absorbiert. Da der Brennpunkt selektiv in der Probe positioniert sein kann, wird dreidimensionale Auflösung sowohl in der Rasterfluoreszenzmikroskopie als auch in der Photolyse ermöglicht, einschließlich in der Photolyse photonenaktivierbarer Reagentien, die durch Photolyse freigesetzt werden können.
Gemäß der Erfindung wird die notwendige Anregungsintensität am Brennpunkt des Mikroskops 10 von einer Lichtquelle 16 erzeugt, die z. B. ein "colliding pulse" phasenvrriegelter Farbstofflaser sein kann, der Lichtimplse mit einer Wellenlänge im roten Bereich des Spektrums erzeugt, z. B. etwa 630 nm, wobei die Impulse eine Dauer von weniger als etwa 100 Femtosekunden bei einer Wiederholrate von etwa 80 MHz aufweisen. Andere helle gepulste Laser können auch dazu verwendet werden, um Licht mit unterschiedlichen relativ langen Wellenlängen im Infrarot- oder sichtbaren Rotbereich des Spektrums zu erzeugen, beispielsweise um die notwendigen Anregungsphotonenenergien zu erzeugen, die sich zum geeigneten Absorptionsenergieband zusammensetzen, das die Fluorophore in der Probe benötigen, die normalerweise durch Absorption eines einzigen Photons im Spekralbereich mit Wellenlängen von etwa der Hälfte der Wellenlänge des auftreffenden Lichts angeregt würden. Zwei Photonen im sichtbaren roten Bereich bei 630 nm würden sich z. B. kombinieren, um einen Fluorophor anzuregen, das normalerwesie Licht im UV-Bereich bei 315 nm absorbiert, während zwei Photonen im Infrarotbereich von z. B. 1070 nm ein Fluorophor anregen würden, der bei 535 nm im sichtbaren Lichtbereich absorbiert.
In einer modifizierten Form der Erfindung kann die Lichtquelle 16 mit einzelner Wellenlänge durch Laserquellen mit zwei unterschiedlich langen Wellenlängen ersetzt werden, sodaß der auftreffende Lichtstrahl 14 aus zwei überlagerten gepulsten Lichtstrahlen hoher Momentanleistung mit unterschiedlichen Wellenlängen besteht. Die Wellenlängen des auftreffenden Strahls sind ausgewählt, um einen Fluorophor anzuerregen, der bei einer kurzen Wellenlänge absorbiert, die folgendermaßen dargestellt werden kann: 1/λabs = 1/λ1 + 1 /λ2 worin λ_abs die kurze Wellenlänge des Absorbers ist und λ₁, λ₂ die auftreffenden Laserstrahlwellenlängen sind.
Bei der Zwei-Photonen-Anregung mit einem typischen Zwei-Photonen-Querschnitt δ von: δ = 10–58 m4s/Photon (Gleichung 1)und mit den oben angeführten Impulsparametern (100 Femtosekunden-Impulse bei einer Wiederholrate von 80 MHz) sowie mit dem Strahl, der durch eine Linse mit numerischer Apertur A = 1,4 fokussiert wird, sättigt die durchschnittliche auftreffende Laserleistung(p₀) von etwa 50 mW die Fluoreszenzleistung eines Fluorophors an der Grenze eines absorbierten Photons pro Impuls pro Fluorophor. Die Zahl n, von Photonen, die pro Fluorophor pro Impuls absorbiert werden, hängt von der folgenden Beziehung ab:
worin: τ die Impulsdauer ist;
f die Repetitionsrate ist;
p_o, die durchschnittliche auftreffende Laserenergie ist; δ der Photonenabsorptions-Querschnitt ist;

das Plancksche Wirkungsquantum ist;
c die Lichtgeschwindigkeit ist; und
A die numerische Öffnung der Fokussierlinse ist.
Die Fluoreszenzemission könnte jedoch gesteigert werden, indem die Impulswiederholfrequenz bis zur inversen Fluoreszenz-Lebensdauer erhöht wird, die typischerweise folgendermaßen ausgedrückt wird: Ʈ1f = 109 s–1 (Gleichung 3)
Zum Vergleich: Ein-Photon-Fluoreszenzsättigung tritt bei auftreffenden Energien von etwa 3 mW auf.
2 zeigt die Tiefenauflösung, die durch das Zwei-Photonen-Verfahren der Erfindung erzielt wird. Ein Stereobildpaar 60 und 62 wurde aus einem Stapel von Bildern eines Clusters fluoreszierender Latexperlen mit einem Durchmesser von 9 μm erzeugt, die normalerweise durch UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 365 nm angeregt werden. Diese Bilder wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Laserrastermikroskops erhalten, wobei allerdings sein Dauerstrich-Argon-Ion-Laserilluminator 16 durch einen 25 mW-"colliding pulse"-phasenverriegelten Farbstofflaser ersetzt wurde, der Ausgangsimpulse mit einer Wellenlänge von etwa 630 nm erzeugt. Messungen auf dem Mikroskop 10 ergaben, daß etwa 3 mW die Objektebene erreichte. Ein Emissionsfilter, der Wellenlängen von 380 bis 445 nm durchläßt, wurde als Barrierefilter 46 bereitgestellt, und die Detektoröffnung 54 wurde bis an ihre Grenze geöffnet, um den optischen Zerlegungseffekt zu vermeiden, der aus einer kleinen konfokalen Öffnung resultieren würde.
Die Intensität des auftreffenden Strahls 14 aus dem Laser 16 wurde eingestellt, indem Filter neutraler Dichte im Anregungsstrahl zwischen dem Laser 16 und dem dichroitischen Spiegel 28 angeordnet wurden und indem die durch die einzelnen Latexperlen produzierte blaue Fluoreszenz gemessen wurde. Wie in 3 durch Graph 64 ersichtlich, nahm die detektierte Intensität der Fluoreszenz aus den Latexperlen, die die Probe ausmachten, mit dem Quadrat der Anregungslaserleistung zu, was deutlich auf Zwei-Photonen-Anregung in den Perlen hinweist. Der Anregungsquerschnitt der Perlen, die "Fluoresbrite BB"-Perlen der Firma Polysciences Corporation waren, wurde auf 5 × 10^–58 m⁴s/Photon geschätzt (Genauigkeit innerhalb eines Faktors 3), indem die Farbstoffkonzentration in den Perlen, der optische Durchsatz des Laserrastermikroskops, die Impulsdauer, die Wiederholrate, die numerische Apertur und die auftreffende Energie berücksichtigt wurden. Dieser Wert erwies sich als vergleichbar mit früher gemessenen Werten für ähnliche Farbstoffe.
4 ist ein abgetastetes Bild von Chromosomen in sich teilenden Zellen (LLC-PK1; ATTC); unter Verwendung von zellulärer DNA-Markierung mit einem UV-anregbaren Fluoreszenzfarbstoff (33258; Hoechst) war die Bilderzeugungszeit von 13 Sekunden im Vergleich zur Ausbleichzeit von mehreren Minuten kurz. Außerdem stellte man in diesen lebenden Zellen selbst nach Beleuchtung durch den Abtastlaser [ber mehrere Minuten keine Verschlechterung fest.
Das Photoausbleichen während eines langen Abtastvorgangs einer fluoreszierenden Perle trat nur in einem etwa 2 μm dicken Abschnitt um die Fokalebene auf, wie dies durch den horizontalen Schnitt 70 geringerer Helligkeit ersichtlich ist, der aus der Perle 72 ausgebleicht ist (siehe 5). Diese Perle wurde 6 Minuten lang bei einer konstanten Fokalebenenposition abgetastet. Eine ähnliche Lokalisierung des Ausbleichens wurde in den fluoreszierend angefärbten Zellkernen testgestellt. Diese Lokalisierung stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber der Verwendung der Ein-Photon-Anregung dar, wo die gesamte Probe gebleicht wird, selbst wenn nur eine Ebene abgebildet wird. Der Grund besteht darin, daß bei der Ein-Photon-Anregung das Ausbleichen sowohl bei der Raster- als auch der Breitfeldmikroskopie von der zeitgemittelten Anregungsintensität abhängt, die entlang der axialen bzw. Z-Richtung in 1 nicht variiert. Bei der Zwei-Photonen-Anregung hingegen hängt das Ausbleichen von zeitgemittelten Quadrat der Intensität ab, das oberhalb und unterhalb der Fokalebene stark abfällt.
Die Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals vom Quadrat der Anregungsintensität ist verantwortlich für einen weiteren Vorteil der Zwei-Photonen-Anregung: Eine solche Anregung bietet einen optischen Zerlegungseffekt durch die Probe hindurch, selbst wenn ein Detektor wie z. B. eine CCD-Anordnung zum Einsatz kommt, die das gesamte Feld betrachtet, ohne daß ein als Raumfilter dienendes Stiftloch verwendet würde. Dieser in 5 veranschaulichte Zerlegungseffekt überwindet die großen Probleme in Zusammenhang mit chromatischer Aberration in der Objektivlinse und einige der Durchsatzverluste in herkömmlichen konfokalen Laserrastermikroskopen.
Die Zwei-Photonen-Photolyse kann auch für die schnelle und lokalisierte Freisetzung biologisch aktiver Materialien wie z. B. von Käfig-Ca++, H+, Nukleotiden und Neurotransmittern verwendet werden. Wenn beispielsweise Käfig-Neurotransmitter durch einen Abtaststrahl freigesetzt werden, kann der so produzierte transmembrane Vollzellstrom als konstrasterzeugender Mechanismus verwendet werden, um die Verteilung von Rezeptoraktivität für diese Transmitter auf der Zelloberfläche zu kartieren. Die Durchführbarkeit der Zwei-Photonen-Käfig-Photolyse wurde gemäß der Erfindung aufgezeigt, indem DMNPE-Käfig-ATP (33 mM) [von Molecular Probes, Eugene, Oregon] durch den "colliding pulse" phasenverriegelten Farbstofflaser 16 bestrahlt wurde, der auf einen Strahlbrennpunktdurchmesser auf der Objektebene von etwa 10 μm fokussiert war. Photolyse-Ausbeuten von etwa 10^–11 Mo ATP wurden unter Anwendung eines Luciferin-Biolumineszenzassay von Calbiochem, San Diego, CA gemessen. Typischerweise wurden etwa 10% des Käfig-ATP in einem aliquoten Volumen von etwa 10⁷ (μm)³ im Beleuchtungsvolumen von etwa 10⁴ (μm)³ während eines Zeitraums von etwa 600 Sekunden photolysiert.
Da die Zwei-Photonen-Anregung gemäß der Erfindung den Zugang zu Anregungsenergien, die der Ein-Photon-UV-Anregung entsprechen, durch sichtbares Licht ermöglicht, wird eine gänzlich neue Klasse an Fluorophoren und Fluoreszenzindikatoren für die dreidimensional aufgelöste Laserrastermikroskopie zugänglich. Solche Indikatoren sind z. B. Indo-1 für Ca⁺², Mag-Indo-1 für Mg⁺², ABF1 für Na⁺ und PBFI für K⁺. Obwohl Zwei-Photonen-Querschnitte für viele dieser Verbindungen noch nicht bekannt sind und unterschiedliche Auswahlregeln für die Zwei-Photonen-Absorption gelten, ermöglicht die molekulare Asymmetrie oft sowohl Ein-Photon- als auch Zwei-Photonen-Übergänge in den gleichen angeregten Zustand. Sichtbare Fluoreszenz wurde mit 10 mM-Lösungen von Indo-1, FURA-2, Hoechst 33258, Hoechst 33342, DANSYL Hydrazin [Molecular Probes], Stilbene 420 [Exciton Chem. Co., Dayton, OH] und verschiedenen Cumarin-Farbstoffen bei Anregung durch ein CMP beobachtet, das schwach auf eine Engstelle mit einem Durchmesser von 25 μm fokussiert war, und es wurden durch zwei Photonen angeregte LSM-Fluoreszenzbilder von Mikrokristallen von DANSYL und Coumarin 440 aufgezeichnet.
Es wurde somit ein praktisches Zwei-Photonen-Laserraster-Fluoreszenzmikroskop für biologische und andere Anwendungen beschrieben und veranschaulicht. Das Zwei-Photonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskop bietet eine inhärente dreidimensionale Auflösung mit einer Tiefenschärfe, die man mit jener konfokaler Laserrastermikroskope vergleichen kann. Die Verwendung eines konfokalen Stiftlochs in Verbindung mit dieser Zwei-Photonen-Anregung sorgt für eine weitere Verbesserung der Auflösung entlang aller drei Achsen.
Hintergrundfluoreszenz kann durch skalierte Subtraktion von Bildern eliminiert werden, die bei unterschiedlichen Eingangsleistungen aufgezeichnet werden. Mit dem vorliegenden Verfahren können das Photoausbleichen sowie photodynamischer Schaden auf die Nähe der Fokusebene begrenzt werden, wodurch sich ein beträchtlicher Vorteil gegenüber konfokaler Laserrastermikroskopie wie auch der Flächendetektorabbildung bei der Erfassung von Daten für dreidimensionale Rekonstruktionen ergibt, da UV-Schäden von Zellen und Fluorophoren auf das Volumen beschränkt werden, aus dem die Information tatsächlich stammt. Dies ermöglicht auch eine scharfe Lokalisierung photochemischer Prozesse wich z. B. Photolyse und Photoaktivierung innerhalb des Fokusvolumens. Die Erfindung wird solcherart beschrieben, daß zwei Photonen aus einem einzelnen Laser verwendet werden, doch es ist zu beachten, daß die Anregung des Zielmaterials auch durch zwei Photonen aus zwei Quellen möglich ist, sofern zwei unterschiedliche Wellenlängen insgesamt die Anregungswellenlänge des Zielmaterials ergeben. Somit kann kann z. B. zwei unterschiedliche Laserquellen verwenden, deren Ausgangsstrahlen koaxial in den Lichtweg des Mikroskops gerichtet sind. Alternativ dazu können zwei unterschiedliche Wellenlängen aus einer einzelnen Quelle stammen, z. B. mittels eines Frequenzverdopplers.

Claims

Vorrichtung (10) für die Laserabtastfluoreszenzmikroskopie eines Zielmaterials (20), wobei die Vorrichtung umfaßt: Plattformmittel (22), die Zielmaterial (20) tragen, das eine fluoreszierende Komponente umfaßt, die auf Erregung durch ein Photon mit einer charakteristischen Energie so anspricht, daß sie ein Fluoreszenzphoton erzeugt; Fokussierungsmittel (40, 12), die so angeordnet sind, daß sie Licht zur Plattform lenken und eine Objektebene (18) im Zielmaterial (20) auf dem Plattformmittel (22) haben; eine repetitive Quelle (16) für monochrome kohärente Lichtimpulse im Sub-Pikosekundenbereich, bestehend aus Photonen mit einer Energie, die geringer als die charakteristische Energie ist; Detektormittel zum Detektieren der Fluoreszenzphotonen (54); Mittel, die die kohärenten Lichtimpulse einen optischen Weg entlang lenken, der die Fokussierungsmittel (40, 12) umfaßt, wobei die Fokussierungsmittel (40, 12) die Lichtimpulse in einem Fokalvolumen (26) auf der Objektebene (18) fokussieren, so daß sie auf das Zielmaterial (20) auf dem Plattformmittel (22) auftreffen, so daß Zwei-Photonen-Erregung die Fluoreszenzphotonen in der fluoreszierenden Komponente hervorruft; und Mittel, um die Fluoreszenzphotonen vom Fokalvolumen (2G) zu den Detektormitteln (54) zu lenken.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Licht von der Quelle (16) vom Fokussierungsmittel (40, 12) fokussiert wird, um das Fokalvolumen (26) mit einem Durchmesser im Sub-μm-Bereich zu bilden.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Fokussierungsmittel (40, 12) das Licht mit dieser Wellenlänge in eine konische Konfiguration fokussiert, wodurch an gegenüberliegenden Seiten der Objektebene (18) konvergierendes und divergierendes Licht erzeugt wird, wodurch das Licht am Fokalvolumen (26) auf der Ebene (18) konzentriert wird.
Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die relativen Positionen von Fokalvolumen (26) und Plattformmittel (22) variabel sind.
Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Fokussierungsmittel (40, 12) das Licht im Fokalvolumen (26) in das Zielmaterial (20) fokussiert, um eine Lichtintensität zu erzeugen, die Fluoreszenz in einem begrenzten ellipsoidischen Volumen hervorruft.
Verfahren zur Laserabtastfluoreszenzmikroskopie durch eine Zweiphotonen-Erregungstechnik eines Zielmaterials (20), das eine Fluoreszenzkomponente enthält, die durch ein Photon mit einer charakteristischen Energie erregbar ist, so daß ein Fluoreszenzphoton erzeugt wird; mit folgenden Schritten: das wiederholte Beleuchten des Materials (20) mit einem Strahl aus intensiven monochromen kohärenten Laserlichtimpulsen im Sub-Pikosekundenbereich, die Photonen mit einer Energie umfassen, die geringer als die charakteristische Energie ist; und das Fokussieren der Beleuchtung auf ein kleines Fokalvolumen (26) innerhalb des Materials (20), um eine Beleuchtungsintensität zu erzeugen, die nur am Fokalvolumen ausreichend hoch ist, um molekulare Erregung durch gleichzeitige Absorption von zwei der einfallenden beleuchtenden Photonen zu erzeugen, um in der fluoreszierenden Komponente Fluoreszenz hervorzurufen, und das Detektieren der hervorgerufenen Fluoreszenz.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Energie der einfallenden Photonen halb so groß wie die charakteristische Energie ist.