DE69034117T2

DE69034117T2 - Zwei-Photonen molekulare Anregung in einem Laserrastermikroskop

Info

Publication number: DE69034117T2
Application number: DE69034117T
Authority: DE
Inventors: Winfried Denk; James P. Ithaca Strickler; Watt W. Ithaca WEBB
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1989-11-14
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2010-11-14
Also published as: ES2123501T5; US5034613A; DE69032621T3; ES2123501T3; DK0807814T3; JPH05503149A; DE69032621T2; JP2848952B2; EP0500717B1; EP0500717A1; EP0807814B1; ES2210414T3; ATE253727T1; EP0500717A4; ATE170636T1; HK1010411A1; EP0807814A1; DE69032621D1; DE69034117D1; EP0500717B2

Description

Diese Erfindung erhielt staatliche Unterstützung unter den Nummern P41 RR04224 von den National Institutes of Health; NSF-BBS-8714069 von der National Science Foundation; und NSF-DMB-8609084 von der National Science Foundation. Die amerikanische Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
Obwohl das Prinzip eines "Flying-Spot-Scanners" (Lichtpunktabtasters) schon seit vielen Jahren bekannt ist, florierte seine Anwendung in der Mikroskopie erst in den letzten Jahren, als die dazu notwendige Technik entwickelt wurde. Stabile Laserlichtquellen und schnelle elektronische Bilderzeugungs- und -speichertechniken sind notwendige Bestandteile eines Rastermikroskops. Während die Abbildungseigenschaften eines nicht konfokalen Rastermikroskops jenen herkömmlicher Mikroskope stark ähneln, eröffnen konfokale Rastermikroskope ein völlig neues Gebiet. Die durch solche Vorrichtungen erzielte Auflösung wird nur geringfügig erhöht, doch ihre stark verbesserte Tiefenauflösung ermöglicht die Erzeugung dreidimensionaler Bilder ohne komplizierte Dekonvolutionsalgorithmen. Die Tiefenauflösung reduziert den Hintergrund, und dies – gemeinsam mit der Verwendung eines einzelnen hochqualitativen Detektors, wie z. B. eines Photomultipliers – ermöglicht quantitative Studien mit hoher räumlicher Auflösung.
Die Auflösung entlang der Sehachse eines konfokalen Rastermikroskops bietet ein brauchbares Auflösungsvermögen gegen Hintergrundstreuung oder Fluoreszenz, die oberhalb und unterhalb der Fokusebene in einem transparenten Objekt auftreten. Ferner ist sie bei der Erzeugung dreidimensionaler fluoreszierender Bilder aus einer Reihe von Schnitten und bei der Verwendung quantitativer Fluoreszenzindikatoren oder zur Kartierung fluoreszierender Marker von Zelloberflächenrezeptoren auf nichtplanaren Oberflächen von großem Nutzen. Solche Vorrichtungen liefern eine etwas bessere seitliche Auflösung, eine viel bessere Tiefenschärfenauflösung und eine Hintergrundauflösung, die unter idealen Bedingungen um Größenordnungen besser ist als bei früheren Vorrichtungen unter idealen Bedingungen.
Das Abtasten kann durchgeführt werden, indem entweder die Probenplattform unter einem stationären Strahl bewegt wird oder indem ein präzise synchronisiertes optisches Abtasten der Aufhellungs- und der Fluoreszenzreaktionssignale erfolgt. Obwohl die Lösung mit der beweglichen Plattform vom optischen Standpunkt aus vorzuziehen ist, schränkt sie den Zugang und das Montieren der Probe, die Verwendung von Umgebungskammern und die elektrische Aufzeichnung mit Mikroelektroden ein. Demzufolge wird oft dem "Moving Spot"-Ansatz der Vorzug gegeben. Ein solcher Moving Spot kann durch Verwendung von Spiegeln produziert werden, die auf Galvanometerscannern montiert sind, obwohl dies die erreichbare Bildfrequenz einschränkt. Die Verwendung akustisch-optischer Deflektoren beeinträchtigt das konfokale räumliche Filtern in der Fluoreszenzmikroskopie aufgrund ihrer starken Dispersion. Obwohl polygonale Spiegel schneller als Galvanometerscanner sind, ermöglicht ein einzelner keine Vektorfunktionsweise.
Eine herkömmliche Bogenlichtquelle kann für viele Anwendungen eines konfokalen Rastermikroskops verwendet werden; dabei kommt ein rotierender Scheibenbeleuchter zum Einsatz, doch offensichtlich schränken die unausweichlichen Intensitätsmodulationen den Einsatz für quantitative Anwendungen ein. In solchen Vorrichtungen wird das Bild entweder durch ein Doppelset konfokaler Stiftlöcher in der Scheibe oder – in neueren Versionen – durch die Beleuchtungsstiftlöcher selbst gebildet.
Konfokale Rastermikroskope, bei denen ein einzelner, durch einen Laser beleuchteter Punkt über das sich bewegende Objekt abgetastet wird, funktionieren bei niedrigen Abtastgeschwindigkeiten recht gut, wobei gute Laserrastermikrographen unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern, die sichtbares Licht absorbieren und ausstrahlen, erhalten wurden. Konfokale Rasterbilder mit Fluorophoren und fluoreszie renden chemischen Indikatoren, die durch den ultravioletten Teil des Spektrums angeregt werden, standen jedoch bislang nicht zur Verfügung – vor allem aufgrund eines Mangels geeigneter Mikroskoplinsen, die chromatisch korrigiert und sowohl für Absorptions- als auch für Emissionswellenlängen transparent sein müssen, aber auch aufgrund des Schadens, den UV-Licht lebenden Zellen zufügt. Außerdem haben die Beschränkungen von UV-Lasern solche Anwendungen verhindert. Die Fluoreszenzmikroskopie ist außerdem in allen ihren Erscheinungsformen durch das "Photobleaching" (Photoausbleichen) von Fluorophoren im Targetmaterial eingeschränkt, da das anregende Licht die Fluorophore langsam photobleicht, während es Fluoreszenz anregt. Selbst in der konfokalen Laserraster-Fluoreszenzmikroskopie wird im Wesentlichen das gleiche Photoausbleichen hervorgerufen wie in der Breitfeldmikroskopie, da das fokussierte anregende Licht nach wie vor die volle Tiefe der Zielprobe einheitlich in einem Zeitdurchschnitt beleuchtet, während es die Fokusebene abtastet. Das Photoausbleichen ist besonders in einer dreidimensionalen Bildrekonstruktion problematisch, da zahlreiche zweidimensionale Bilder für diesen Zweck erforderlich sind und die Erzeugung jedes zweidimensionalen Bilds in der gesamten Probe Photoausbleichen hervorruft.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die oben genannten Schwierigkeiten werden in der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von molekularer Zwei-Photonen-Anregung in der Laserrastermikroskopie überwunden. Die Zwei-Photonen-Anregung wird gemäß der Erfindung durch die Kombination von (a) der sehr hohen, lokalen, momentanen Intensität aufgrund der in einem Laserrastermikroskop erzielbaren engen Fokussierung, worin der Laser auf eine beugungsbegrenzte Engstelle mit einem Durchmesser von weniger als 1 μm fokussiert werden kann, und (b) der vorübergehenden Konzentration eines gepulsten Lasers ermöglicht. Eine monochromatische Lichtquelle hoher Intensität und langer Wellenlänge, die bis zur Beugungsgrenze fokussierbar ist, z. B. ein "Colliding-pulse"- Farbstofflaser mit fix eingestelltem Betriebsmodus, erzeugt einen Impulsstrom, wobei jeder Impuls eine Dauer von etwa 100 Femtosekunden (100 × 10^–15 Sekunden) bei einer Wiederholrate von etwa 80 MHz hat. Diese Impulse im Subpikosekunden-Bereich werden dem Mikroskop zugeführt, z. B. mittels eines dichromatischen Spiegels, und durch die Mikroskopoptik auf eine Probe, d. h. ein Targetmaterial, gerichtet, das sich auf der Objektebene des Mikroskops befindet. Aufgrund der hohen Momentanleistung, die durch die intensiven, auf die Beugungsgrenze fokussierten Impulse von sehr kurzer Dauer erzeugt wird, besteht relativ hohe Wahrscheinlichkeit, dass das Targetmaterial, das normalerweise durch ein einzelnes hochenergetisches Photon mit kurzer Wellenlänge, typischerweise im UV-Bereich, anregbar ist, zwei Photonen langer Wellenlänge aus der Laserquelle gleichzeitig absorbiert. Diese Absorption kombiniert die Energie der zwei Photonen im Molekül, wodurch das Target in seinen angeregten Zustand gehoben wird. Das Targetmaterial ist eine biologische Zelle oder ein durch Photonen anregbares Reagens.
Die Zwei-Photonen-Anregung dieser Targets durch kurze Lichtimpulse hoher Intensität stellt ein allgemeines Mikroskopieverfahren dar, das für verbesserte Hintergrundauflösung sorgt, das Photoausbleichen der Fluorophore reduziert und die Lichtbeschädigung lebender Zellproben minimiert. Der Grund liegt darin, dass die im Mikroskop erzeugte fokussierte Beleuchtung einen konvergierenden Kegel füllt, wenn sie in die Probe gelangt. Das gesamte Licht, das die Fokusebene am Scheitelpunkt des konvergierenden Kegels erreicht, gelangt – mit Ausnahme des winzigen Teils, der im Target absorbiert wird – aus der gegenüberliegenden Seite der Probe durch einen divergierenden Kegel nach außen. Nur im Bereich des Brennpunkts auf der Objektebene an der Engstelle, die durch die konvergierenden und divergierenden Kegel gebildet wird, ist die Intensität ausreichend hoch, um Zwei-Photonen-Absorption in der Probe zu produzieren, und diese Intensitätsabhängigkeit ermöglicht es, dass Licht langer Wellenlänge die Wirkung der kurzwelligen Anregung nur im kleinen lokalen Volumen der Probe um den Brennpunkt herum entfaltet. Diese Absorption wird mittels eines Stroms schneller Impulse hoher Intensität im Femtosekunden-Bereich mit relativ langer Wellenlänge erreicht, die eine moderate durchschnittliche Beleuchtungsintensität von Licht langer Wellenlänge im gesamten restlichen Teil der Probe außerhalb des Bereichs des Brennpunkts aufrechterhält. Das Photoausbleichen des Targets außerhalb der Fokusebene wird somit praktisch ausgeschaltet. Die Ein-Photon-Absorption des Lichts langer Wellenlänge ist vernachlässigbar, und außerhalb der Fokusebene ist die momentane Intensität zu gering für eine deutliche Zwei-Photonen-Absorption und -Anregung, obwohl der Zeitdurchschnitt der Beleuchtung in Wirklichkeit über die gesamte Tiefe der Probe fast einheitlich ist. Dieser Effekt sorgt auch für eine deutliche Verringerung der Schädigung lebender Zellen.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Obige und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren, worin:
1 eine schematische Darstellung eines konfokalen Laserrastermikroskops ist, das gemäß der Erfindung verwendet wird;
1A eine vergrößerte Teilansicht des Bereichs der Objektebene der Vorrichtung aus 1 ist;
2 ein synthetisiertes Stereobildpaar ist, das blaue Fluoreszenz zeigt, die durch Zwei-Photonen-Absorption von rotem Licht angeregt wurde;
3 eine Kurve der durchschnittlichen Intensität von einem Bereich innerhalb einer fluoreszierenden Latexperle über der angelegten durchschnittlichen Laserenergie ist;
4 ein Bild von Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz von Chromosomen lebender kultivierter Schweinenierenzellen ist, die mit einem DNA-Färbemittel eingefärbt sind;
5 ein Bild einer Latexperle ist, aus dem ersichtlich ist, dass das Zwei-Photonen-Photobleichen auf die Fokusebene beschränkt ist; und
6 ein Bild eines Zwei-Photonen-Bleichmusters innerhalb einer fluoreszierend gefärbten Latexperle ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Es folgt eine ausführlichere Beschreibung der vorliegenden Erfindung. In 1 ist in schematischer Form ein herkömmliches Laserrastermikroskop 10 dargestellt, das eine Objektivlinse 12 zum Fokussieren von auftreffendem Licht 14 aus einer Quelle 16, wie z. B. einem Laser, auf eine Objektebene 18 enthält. Wie aus 1A ersichtlich ist, kann die Objektebene auf oder in einem Probestück oder Targetmaterial 20 liegen, das auf einer beweglichen Plattform 22 getragen sein kann. Die durch den auftreffenden Lichtstrahl 14 geschaffene Beleuchtung füllt einen konvergierenden Kegel (allgemein durch 24 gekennzeichnet), der in die Probe 20 führt, um die Fokusebene auf der Objektebene 18 zu erreichen, und bis auf den winzigen Teil des durch die Probe absorbierten Lichts durch einen divergierenden Kegel 25 nach außen gelangt. Das auftreffende Licht bildet eine Engstelle oder einen Brennpunkt 26 auf der Objektebene 18. Der Durchmesser des Brennpunkts 26 ist durch Beugung im Strahlengang eingeschränkt, beträgt jedoch vorzugsweise weniger als 1 μm. Durch Einstellen der Mikroskopoptik kann – wie allgemein bekannt ist – die vertikale Position des Brennpunkts in der Probe 20 ausgewählt werden. Außerdem kann die Plattform 22 in einer horizontalen Ebene beweglich sein, z. B. in einer Rasterbewegung entlang der X- und Y-Achse, um das auftreffende Licht an ausgewählten Stellen in der Probe in der horizontalen Ebene zu positionieren, so dass eine dreidimensionale Abtastung der Probe erzielt werden kann. Da jedoch mechanisch abgetastete Plattformen mit Schwierigkeiten verbunden sind, ist es vorzuziehen, eine stationäre Plattform zu verwenden und den auftreffenden Strahl in der X-Y-Ebene optisch zu scannen, z. B. mittels Abtastspiegeln auf dem Strahlengang des Mikroskops.
Der Strahlengang vom Laser 16 zur Objektebene 18 enthält einen dichromatischen Spiegel 28, auf den das Licht aus dem Laser 16 gerichtet wird. Wie dies weiter unten ausführlich erklärt wird, besteht gemäß der Erfindung der Ausgang aus dem Laser aus kurzen, intensiven Lichtimpulsen mit relativ langer Wellenlänge, vorzugsweise im sichtbaren roten oder nahen Infrarot-Spektralbereich. Der Spiegel 28 lenkt dieses Licht langer Wellenlänge nach unten zu einem Spiegel 30 ab, der seinerseits das Licht mittels gekrümmter Spiegel 36 und 38 zu einem Paar Abtastspiegeln 32 und 34 ablenkt. Die Spiegel 32 und 34 sind um zueinander im rechten Winkel stehende Achsen drehbar, um das auftreffende Licht 14 entlang im rechten Winkel zueinander ste= henden X- und Y-Achsen auf der Objektebene zu bewegen, so dass die stationäre Probe durch den auftreffenden Strahl abgetastet wird. Das Licht aus den Abtastspiegeln gelangt durch das Okular 40 und wird durch die Objektivlinse 12 auf die Objektebene 18 fokussiert.
In der Probe 20 produzierte Fluoreszenz (durch gepunktete Pfeile 42 in 1A gekennzeichnet) geht durch das Mikroskop 10 hindurch zurück, wobei sie dabei den Strahlengang des auftreffenden Strahls 14 nachzeichnet, und gelangt somit durch die Objektivlinse 12 und das Okular 40, die Abtastspiegel 34 und 32 und die gekrümmten Spiegel 38 und 36 und wird durch den Spiegel 30 zurück auf den dichromatischen Spiegel 28 reflektiert. Das durch Fluoreszenzmaterial in der Probe emittierte Licht liegt in einer Wellenlänge vor, die für das in der Probe enthaltene Fluorophor spezifisch ist und sich somit von jener des auftreffenden Lichts 14 unterscheidet. Das fluoreszierende Licht kann durch den dichromatischen Spiegel 28 hindurchtreten, anstatt wieder auf den Laser 16 reflektiert zu werden, und folgt dem allgemein mit 44 gekennzeichneten Strahlengang. Das fluoreszierende Licht 42 gelangt somit durch einen Barrierefilter 46 und wird durch flache Spiegel 48, 50 und 52 auf einen geeigneten Detektor wie z. B. ein Photomultiplier-Rohr 54 reflektiert. Gemäß der Erfindung ist ein konfokales Laserrastermikroskop vorzuziehen, weshalb ein derartiges Mikroskop in den Abbildungen veranschaulicht ist. Man beachte jedoch, dass auch andere Laserrastermikroskope in Frage kommen. Im konfokalen Mikroskop 10 ist ein einstellbares konfokales Pinhole 56 in der Sammeloptik 44 vorhanden, um Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, die in den konvergierenden und divergierenden Kegeln 24 und 25 oberhalb und unterhalb der Fokusebene angeregt wird. Das konfokale Pinhole ist nützlich, doch in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung der Erfindung nicht notwendig, da die Anregung im wesentlichen auf den Bereich des Brennpunkts 26 auf der Objektebene beschränkt ist.
Bei Fluoreszenzmikroskopen des Stands der Technik werden die Fluoreszenzphotonen 42 des sichtbaren Lichts durch Moleküle produziert, die durch Absorbieren eines einzelnen Photons vom auftreffenden Licht 14 mit höherer Energie angeregt werden; es handelt sich also um eine kürzere Wellenlänge als die Fluoreszenz 42, die während der Relaxation des Moleküls aus seinem angeregten Zustand erzeugt wird. Die Anzahl an Fluoreszenzphotonen, die pro Molekül in solchen Vorrichtungen des Stands der Technik freigesetzt werden, ist üblicherweise direkt proportional zur Anzahl anregender absorbierter Photonen. Da nur ein einzelnes Photon in solchen Vorrichtungen absorbiert werden muss, kann Photolyse von Molekülen, die das anregende Licht 14 absorbieren, entlang des gesamten Doppelkegelstrahls 24 und 25 innerhalb der Probe 20 auftreten, obwohl dieser Vorgang nicht notwendigerweise linear mit der Intensität abläuft. Da Fluoreszenz entlang des gesamten Doppelkegelstrahls erzeugt wird, ist die Menge an Fluoreszenz, die von jeder Ebene in der Probe oberhalb, unterhalb und innerhalb der Fokusebene des anregenden Lichts 14 freigesetzt wird, zumeist die gleiche, und eine dreidimensionale Auflösung ist nur schwierig zu erhalten. In der Folge führt die hohe Energie des auftreffenden Lichts durch die Probe zumeist zu einer Beschädigung der Proben, was besonders ungünstig ist, wenn lebende Zellen betrachtet werden.
Um eine dreidimensionale Auflösung in der Rastermikroskopie zu erzielen und die Schädigung der Probe in Bereichen außerhalb des Brennpunkts des Mikroskops zu verringern, sieht die Erfindung die Zwei-Photonen-Anregung eines Fluorophors vor, das einen Ein-Photon-Absorptionspeak bei einer Wellenlänge aufweist, die eine Hälfte jenes des anregenden Lichts überlappt. Um dies zu erreichen, produziert der Laser 16 einen sehr kurzen gepulsten Laserstrahl hoher Momentanleistung mit relativ langer Wellenlänge, z. B. im sichtbaren Rot- oder Infrarotbereich. Dieses Licht wird auf eine Probe gelenkt, die ein Fluorophor enthält, das normalerweise durch ein einzelnes Photon kurzer Wellenlänge angeregt wird, z. B. im UV-Bereich, so dass zwei (rote) Photonen geringer Energie ihre Energie kombinieren müssen, um die gleiche Anregung der Probe zu erzielen wie durch ein einzelnes energiereiches (ultraviolettes) Photon. Sowohl die Anregungs- als auch die Fluoreszenzrate in der Probe sind proportional zum Quadrat der Intensität des auftreffenden Lichts. Im fokussierten Anregungslaserstrahl 14 steigt die Intensität des auftreffenden Lichts langer Wellenlänge genug an, um die Fluorophore in der Probe nur im Bereich des Brennpunkts 26 der Mikroskopoptik anzuregen. Dieser Brennpunkt kann einstellbar in der Probe positioniert sein, so dass Fluoreszenz und/oder Photolyse der Probe nur in einem ausgewählten Ellipsoid-Volumen um den Fokus herum entstehen. Gemäß der Erfindung muss nun nur Anregungslicht langer Wellenlänge durch die Probe gelangen, und dieses Licht langer Wellenlänge wird fokussiert, um für ausreichende Intensität zu sorgen, damit Fluoreszenz nur in einem sehr kleinen Bereich angeregt wird. Diese Fluoreszenz wird selbst dann produziert, wenn das Fluorophor normalerweise nur im UV-Bereich absorbiert. Da der Brennpunkt selektiv in der Probe positioniert sein kann, wird dreidimensionale Auflösung sowohl in der Rasterfluoreszenzmikroskopie als auch in der Photolyse ermöglicht, einschließlich in der Photolyse photonenaktivierbarer Reagenzien, die durch Photolyse freigesetzt werden können.
Gemäß der Erfindung wird die notwendige Anregungsintensität am Brennpunkt des Mikroskops 10 von einer Lichtquelle 16 erzeugt, die z. B. ein "Colliding-pulse"-Farbstofflaser mit fix eingestelltem Betriebsmodus sein kann, der Lichtimpulse mit einer Wellenlänge im roten Bereich des Spektrums erzeugt, z. B. etwa 630 nm, wobei die Impulse eine Dauer von weniger als etwa 100 Femtosekunden bei einer Wiederholrate von etwa 80 MHz aufweisen. Andere helle gepulste Laser können auch dazu verwendet werden, um Licht mit unterschiedlichen relativ langen Wellenlängen im Infrarot- oder sichtbaren Rotbereich des Spektrums zu erzeugen, beispielsweise um die notwendigen Anregungsphotonenenergien zu erzeugen, die sich zum geeigneten Absorptionsenergieband zusammensetzen, das die Fluorophore in der Probe benötigen, die normalerweise durch Absorption eines einzigen Photons im Spektralbereich mit Wellenlängen von etwa der Hälfte der Wellenlänge des auftreffenden Lichts angeregt würden. Zwei Photonen im sichtbaren roten Bereich bei 630 nm würden sich z. B. kombinieren, um ein Fluorophor anzuregen, das normalerweise Licht im UV-Bereich bei 315 nm absorbiert, während zwei Photonen im Infrarotbereich von z. B. 1070 nm ein Fluorophor anregen würden, das bei 535 nm im sichtbaren Lichtbereich absorbiert.
In einer modifizierten Form der Erfindung kann die Lichtquelle 16 mit einzelner Wellenlänge durch Laserquellen mit zwei unterschiedlich langen Wellenlängen ersetzt werden, so dass der auftreffende Lichtstrahl 14 aus zwei überlagerten gepulsten Lichtstrahlen hoher Momentanleistung mit unterschiedlichen Wellenlängen besteht. Die Wellenlängen des auftreffenden Strahls sind ausgewählt, um ein Fluorophor anzuregen, das bei einer kurzen Wellenlänge absorbiert, die folgendermaßen dargestellt werden kann: 1/λabs = 1/λ1 + 1/λ2 worin λ_abs die kurze Wellenlänge des Absorbers ist und λ₁, λ₂ die auftreffenden Laserstrahlwellenlängen sind.
Bei der Zwei-Photonen-Anregung mit einem typischen Zwei-Photonen-Querschnitt δ von: δ = 10–58 m4s/Photon (Gleichung 1)und mit den oben angeführten Impulsparametern (100-Femtosekunden-Impulse bei einer Wiederholrate von 80 MHz) sowie mit dem Strahl, der durch eine Linse mit numerischer Apertur A = 1,4 fokussiert wird, sättigt die durchschnittliche auftreffende Laserenergie (p_o) von etwa 50 mW die Fluoreszenzleistung eines Fluorophors an der Grenze eines absorbierten Photons pro Impuls pro Fluorophor. Die Anzahl n_a an Photonen, die pro Fluorophor pro Impuls absorbiert werden, hängt von der folgenden Beziehung ab:
worin: τ die Impulsdauer ist;
f die Repetitionsrate ist;
P_o die durchschnittliche auftreffende Laserenergie ist;
δ der Photonenabsorptions-Querschnitt ist;
ħ das Plancksche Wirkungsquantum ist;
c die Lichtgeschwindigkeit ist; und
A die numerische Apertur der Fokussierlinse ist.
Die Fluoreszenzemission könnte jedoch gesteigert werden, indem die Impulswiederholfrequenz bis zur inversen Fluoreszenz-Lebensdauer erhöht wird, die typischerweise folgendermaßen ausgedrückt wird: τf –1 = 109s–1 (Gleichung 3)
Zum Vergleich: Ein-Photon-Fluoreszenzsättigung tritt bei auftreffenden Energien von etwa 3 mW auf.
2 zeigt die Tiefenauflösung, die durch das Zwei-Photonen-Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt wird. Ein Stereobildpaar 60 und 62 wurde aus einem Stapel von Bildern eines Clusters fluoreszierender Latexperlen mit einem Durchmesser von 9 μm erzeugt, die normalerweise durch UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 365 nm angeregt werden. Diese Bilder wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Laserrastermikroskops erhalten, wobei allerdings sein Dauerstrich-Argon-Ion-Laserilluminator 16 mit einem 25-mW-"colliding pulse" Farbstofflaser mit fix eingestelltem Betriebsmodus ersetzt wurde, der Ausgangsimpulse mit einer Wellenlänge von etwa 630 nm erzeugt. Messungen auf dem Mikroskop 10 ergaben, dass etwa 3 mW die Objektebene erreichte. Ein Emissionsfilter, der Wellenlängen von 380 bis 445 nm durchlässt, wurde als Barrierefilter 46 bereitgestellt, und die Detektorapertur 54 wurde bis an ihre Grenze geöffnet, um den optischen Zerlegungseffekt zu vermeiden, der aus einer kleinen konfokalen Apertur resultieren würde.
Die Intensität des auftreffenden Strahls 14 aus dem Laser 16 wurde eingestellt, indem Filter neutraler Dichte im Anregungsstrahl zwischen dem Laser 16 und dem dichromatischen Spiegel 28 angeordnet wurden, und die durch die einzelnen Latexperlen produzierte blaue Fluoreszenz wurde gemessen. Wie in 3 durch Graph 64 ersichtlich, nahm die detektierte Intensität der Fluoreszenz aus den Latexperlen, die die Probe ausmachten, mit dem Quadrat der Anregungslaserenergie zu, was deutlich auf Zwei-Photonen-Anregung in den Perlen hinweist. Der Anregungsquerschnitt der Perlen, die "Fluoresbrite BB"-Perlen der Firma Polysciences Corporation waren, wurde auf 5 × 10^–58 m⁴s/Photon geschätzt (Genauigkeit innerhalb eines Faktors 3), indem die Farbstoffkonzentration in den Perlen, der optische Durchsatz des Laserrastermikroskops, die Impulsdauer, die Wiederholrate, die numerische Apertur und die auftreffende Energie berücksichtigt wurden. Dieser Wert erwies sich als vergleichbar mit früher gemessenen Werten für ähnliche Farbstoffe.
4 ist ein abgetastetes Bild von Chromosomen in sich teilenden Zellen (LLC-PK1; ATTC); unter Verwendung von zellulärer DNA-Markierung mit einem UV-anregbaren Fluoreszenzfarbstoff (33258; Hoechst) war die Bilderzeugungszeit von 13 Sekunden im Vergleich zur Ausbleichzeit von mehreren Minuten kurz. Außerdem stellte man in diesen lebenden Zellen selbst nach Beleuchtung durch den Abtastlaser über mehrere Minuten keine Verschlechterung fest.
Das Photoausbleichen während eines langen Abtastvorgangs einer fluoreszierenden Perle trat nur in einem etwa 2 μm dicken Abschnitt um die Fokalebene auf, wie dies durch den horizontalen Schnitt 70 geringerer Helligkeit ersichtlich ist, der aus der Perle 72 ausgebleicht ist (siehe 5). Diese Perle wurde 6 Minuten lang bei einer konstanten Fokalebenenposition abgetastet. Eine ähnliche Lokalisierung des Ausbleichens wurde in den fluoreszierend angefärbten Zellkernen festgestellt. Diese Lokalisierung stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber der Verwendung der Ein-Photon-Anregung dar, wo die gesamte Probe gebleicht wird, selbst wenn nur eine einzelne Ebene abgebildet wird. Der Grund besteht darin, dass bei der Ein-Photon-Anregung das Ausbleichen sowohl bei der Raster- als auch der Breitfeldmikroskopie von der zeitgemittelten Anregungsintensität abhängt, die entlang der axialen bzw. in Z-Richtung in 1 nicht variiert. Bei der Zwei-Photonen-Anregung hingegen hängt das Ausbleichen vom zeitgemittelten Quadrat der Intensität ab, das oberhalb und unterhalb der Fokusebene stark abfällt.
Die Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals vom Quadrat der Anregungsintensität ist für einen weiteren Vorteil der Zwei-Photonen-Anregung verantwortlich: Eine solche Anregung bietet einen optischen Zerlegungseffekt durch die Probe hindurch, selbst wenn ein Detektor wie z. B. eine CCD-Anordnung zum Einsatz kommt, die das gesamte Feld betrachtet, ohne dass ein als Raumfilter dienendes Pinhole verwendet würde. Dieser in 5 veranschaulichte Zerlegungseffekt überwindet die großen Probleme in Zusammenhang mit chromatischer Aberration in der Objektivlinse und einige der Durchsatzverluste in herkömmlichen konfokalen Laserrastermikroskopen.
Die Zwei-Photonen-Photolyse kann auch für die schnelle und lokalisierte Freisetzung biologisch aktiver Materialien wie z. B. von eingesperrtem Ca++, H+, Nukleotiden und Neurotransmittern verwendet werden. Wenn beispielsweise eingesperrte Neurotransmitter durch einen Abtaststrahl freigesetzt werden, kann der so produzierte transmembrane Vollzellstrom als konstrasterzeugender Mechanismus verwendet werden, um die Verteilung von Rezeptoraktivität für diese Transmitter auf der Zelloberfläche zu kartieren. Die Durchführbarkeit der Zwei-Photonen-Käfig-Photolyse wurde gemäß der Erfindung aufgezeigt, indem in DMNPE inkorporiertes ATP (33 mM) [von Molecular Probes, Eugene, Oregon] durch den "Colliding-pulse"-Farbstofflaser mit fix eingestelltem Betriebsmodus 16 bestrahlt wurde, der auf einen Strahlbrennpunktdurchmesser auf der Objektebene von etwa 10 μm fokussiert war. Photolyse-Ausbeuten von etwa 10^–11 mol ATP wurden unter Anwendung eines Luciferin-Biolumineszenzassays von Calbiochem, San Diego, CA, gemessen. Typischerweise wurden etwa 10% des eingesperrten ATPs in einem aliquoten Volumen von etwa 10⁷ (μm)³ im Beleuchtungsvolumen von etwa 10⁴ (μm)³ während eines Zeitraums von etwa 600 Sekunden photolysiert.
Da die Zwei-Photonen-Anregung gemäß der Erfindung den Zugang zu Anregungsenergien, die der Ein-Photon-UV-Anregung entsprechen, durch sichtbares Licht ermöglicht, wird eine gänzlich neue Klasse von Fluorophoren und Fluoreszenzindikatoren für die dreidimensional aufgelöste Laserrastermikroskopie zugänglich. Solche Indikatoren sind z. B. Indo-1 für Ca⁺², Mag-Indo-1 für Mg⁺², ABF1 für Na⁺ und PBFI für K⁺. Obwohl Zwei-Photonen-Querschnitte für viele dieser Verbindungen noch nicht bekannt sind und unterschiedliche Auswahlregeln für die Zwei-Photonen-Absorption gelten, ermöglicht die molekulare Asymmetrie oft sowohl Ein-Photon- als auch Zwei-Photonen-Übergänge in den gleichen angeregten Zustand. Sichtbare Fluoreszenz wurde mit 10 mM Lösungen von Indo-1, FURA-2, Hoechst 33258, Hoechst 33342, DANSYL Hydrazin [Molecular Probes], Stilbene 420[Exciton Chem. Co., Dayton, OH] und verschiedenen Cumarin-Farbstoffen bei Anregung durch ein CMP beobachtet, das schwach auf eine Engstelle mit einem Durchmesser von 25 μm fokussiert war, und es wurden durch zwei Photonen angeregte LSM-Fluoreszenzbilder von Mikrokristallen von DANSYL und Cumarin 440 aufgezeichnet.
Es wurde somit ein praktisches Zwei-Photonen-Laserraster-Mikroskop für biologische und andere Anwendungen beschrieben und veranschaulicht. Das Mikroskop ermöglicht auch eine scharfe Lokalisierung photochemischer Prozesse wie z. B. Photolyse und Photoaktivierung innerhalb des Fokusvolumens. Die Erfindung wird solcherart beschrieben, dass zwei Photonen aus einem einzelnen Laser verwendet werden, doch es ist zu beachten, dass die Anregung des Targetmaterials auch durch zwei Photonen aus zwei Quellen möglich ist, sofern zwei unterschiedliche Wellenlängen insgesamt die Anregungswellenlänge des Targetmaterials ergeben. Somit kann man z. B. zwei unterschiedliche Laserquellen verwenden, deren Ausgangsstrahlen koaxial in den Strahlengang des Mikroskops gerichtet sind. Alternativ dazu können zwei unterschiedliche Wellenlängen aus einer einzelnen Quelle stammen, z. B. mittels eines Frequenzverdopplers.
Obwohl die vorliegenden Erfindung anhand von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung natürlich Variationen und Modifikationen daran vornehmen.

Claims

Lasermikroskop (1) zum Induzieren molekularer Anregung in einem Targetmaterial (20), wobei das Mikroskop Folgendes umfasst: eine Objektebene (18); Mittel (22), die ein biologisches Targetmaterial (20) auf dieser Objektebene tragen, wobei das Targetmaterial bei Absorption eines Photons mit einer bekannten charakteristischen Energie molekulare Anregung erfährt und eine biologische Zelle oder ein durch Photonen aktivierbares Reagens ist; Mittel (16), die kohärente Lichtimpulse im Sub-Picosekundenbereich bereitstellen, wobei die Lichtimpulse aus Photonen mit einer Energie bestehen, die geringer als die charakteristische Energie ist; Fokussiermittel (40, 12), die so positioniert sind, dass sie das Licht auf das biologische Targetmaterial (20) lenken; Mittel (36, 38), welche die Lichtimpulse aus Photonen einen optischen Weg entlang lenken, der die Fokussiermittel (40, 12) einschließt, damit die Photonen auf das Targetmaterial (20) auftreffen, wobei die Fokussiermittel (40, 12) die Photonen auf ein Brennvolumen (26) innerhalb des Targetmaterials fokussieren, so dass zwei aufeinander treffende Photonen mit weniger als der charakteristischen Energie gleichzeitig absorbiert und kombiniert werden, um in dem Brennvolumen ausreichend Energie zu erzeugen, um die molekulare Anregung im Targetmaterial zu induzieren.
Lasermikroskop nach Anspruch 1, worin die Fokussiermittel die beiden aufeinander treffenden Photonen auf eine einzige Objektebene fokussieren.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Fokussiermittel (40, 12) so eingestellt werden können, dass Brennvolumen (26) in unterschiedlicher Tiefe innerhalb des Targetmaterials (20) auswählbar sind.
Mikroskop nach Anspruch 3, das außerdem ein Abtastmittel (32, 34) zum Bewegen des Brennvolumens (26) relativ zum biologischen Targetmaterial (20) umfasst.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Laserquelle und der Strahlengang so angepasst sind, dass sie ein Targetmaterial abtasten, das im Brennpunkt auf die Anregung so anspricht, dass eine örtlich begrenzte Freisetzung von biologisch aktiven Chemikalien herbeigeführt wird.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Targetmaterial auf die induzierte molekulare Anregung so anspricht, dass eine biologisch aktive Chemikalie freigesetzt wird.
Mikroskop nach Anspruch 6, worin die induzierte molekulare Anregung eine entsprechende Fluoreszenz im Targetmaterial bewirkt, wobei das Mikroskop außerdem Folgendes umfasst: Abtastmittel zum Bewegen des Brennvolumens im Targetmaterial; und Detektormittel, die auf die Fluoreszenz so ansprechen, dass die Fluoreszenzaktivität im Targetmaterial aufgezeichnet wird.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Targetmaterial auf Anregung durch einzelne Photonen mittels ultravioletten Lichts anspricht und worin die Lichtimpulse aus sichtbarem Licht bestehen.
Mikroskop nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Mittel zur Bereitstellung der Lichtimpulse im Sub-Picosekundenbereich zumindest eine Laserquelle umfasst.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Mittel zur Bereitstellung kohärenter Lichtimpulse im Sub-Picosekundenbereich Impulse mit zumindest zwei ver schiedenen Wellenlängen erzeugt, wobei jede Wellenlänge Photonen mit weniger als der bekannten charakteristischen Energie umfasst.
Mikroskop nach Anspruch 10 in Abhängigkeit von Anspruch 2, worin das Mittel zur Bereitstellung kohärenter Lichtimpulse im Sub-Picosekundenbereich zwei unterschiedliche Laserquellen umfasst, wobei der Output der Laserquellen koaxial in den Strahlengang des Mikroskops gerichtet ist.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder Anspruch 7, worin das Targetmaterial ein biologisch aktives Material ist.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder Anspruch 7, das außerdem Mittel zum Bewegen des Brennvolumens im Targetmaterial umfasst, um räumlich aufgelöste molekulare Anregung des Targetmaterials zu induzieren.
Verfahren zum Herbeiführen von molekularer Anregung eines Targetmaterials (20) in einem Lasermikroskop, wobei das Targetmaterial Moleküle enthält, die ein Photon mit einer bekannten charakteristischen Energie absorbieren und dadurch anregbar sind, und eine biologische Zelle oder ein durch Photonen aktivierbares Reagens ist; mit folgenden Schritten: Beleuchten des Materials (20) mit einem Strahl aus intensiven Laserlichtimpulsen im Sub-Picosekundenbereich, die Photonen mit einer Energie umfassen, die geringer als die charakteristische Energie ist; und das Fokussieren der Beleuchtung auf ein kleines Brennvolumen (26) innerhalb des Materials (20), um eine Beleuchtungsintensität zu erzeugen, die nur im Brennvolumen ausreichend hoch ist, um die molekulare Anregung durch gleichzeitige Absorption von zwei der auftreffenden Beleuchtungs-Photonen herbeizuführen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das kleine Brennvolumen auf einer einzigen Objektebene liegt.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die auftreffenden Photonen nur eine halb so hohe Energie wie die charakteristische Energie aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14, 15 oder 16, worin das Material (20) biologisch aktive Moleküle in einem Käfig umfasst, wobei die Beleuchtungsintensität im Brennvolumen (26) ausreicht, um biologisch aktive Verbindungen im Käfig durch gleichzeitige Absorption von auftreffenden Photonen freizusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin das Targetmaterial eine biologische Zelle umfasst, die auf die Anregung unter Erzeugung von Fluoreszenz anspricht, und das außerdem das Messen der Fluoreszenz beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin die Beleuchtung des Materials von einem einzigen Strahl aus kohärenten Lichtimpulsen im Sub-Picosekundenbereich herrührt.
Lasermikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die molekulare Anregung durch einen einzigen Strahl aus kohärenten Lichtimpulsen im Sub-Picosekundenbereich induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Laserlicht monochromatisch ist.
Lasermikroskop nach Anspruch 20, worin das Laserlicht monochromatisch ist.