SK46595A3

SK46595A3 - O-alkylated repamycin derivatives, pharmaceutical agent and their use particularly as immunosuppressants

Info

Publication number: SK46595A3
Application number: SK465-95A
Authority: SK
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1995-08-09
Also published as: NL300154I2; ATE272063T1; NO2017067I2; DE122004000033I2; FR04C0012I1; CA2145383C; SK285256B6; NO307053B1; CZ89995A3; FI20001943A; CA2476257A1; DK0867438T3; FI951678A; RO114451B1; GEP20002331B; KR100308598B1; CA2476257C; ATE173736T1; NZ256026A; NO951312D0

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových alkylovaných derivátov rapamycínu, ktoré sú farmaceutický použiteľné, najmä ako imunosupresíva.

Doterajší stav techniky

Rapamycín je známe makrolidové antibiotikum, ktoré produkuje Streptomyces hygroscopicus, so štruktúrou znázornenou vzorcom A:

Viď napríklad McAlpine, J.B. a spol., J.Antibiotics (1991) 44, 688, Schreíber, S.L. a spol., J.Am.Chem.Soc. (1991) 113, 7433, US patent č. 3 929 992. Rapamycín je neobyčajne silné imunosupresívum a preukázalo sa, že má protinádorovú a protiplesňovú účinnosť. Jeho použiteľnosť ako farmaceutického prostriedku je však obmedzená jeho veľmi nízkou a variabilnou biologickou dostupnosťou ako aj jeho vysokou toxicitou. Okrem toho je rapamycín veľmi nerozpustný, čo sťažuje prípravu stabilných liekových foriem.

Podstata vynálezu

Neočakávane sa zistilo, že určité nové deriváty rapamycínu (nové zlúčeniny) majú lepší farmakologický profil než rapamycín, majú lepšiu stabilitu a biologickú dostupnosť a umožňujú jednoduchšiu výrobu liekových foriem. Nové zlúčeniny sú alkylované deriváty rapamycínu so štruktúrou zodpovedajúcou všeobecnému vzorcu I:

v ktorom

X je (H, H) alebo atóm kyslíka,

Y je (H, OH) alebo atóm kyslíka

R¹ a R² sú nezávisle na sebe zvolené z atómu vodíka, alkylovej skupiny, tioalkylovej skupiny, arylalkylovej skupiny, hydroxyalkylovej skupiny, dihydroxyalkylovej skupiny, hydroxyalkylarylalkylovej skupiny, dihydroxyalkylarylalkylovej skupiny, alkoxyalkylove j skupiny, acyloxyalkylovej skupiny, aminoalkylovej skupiny, alkylaminoalkylovej skupiny, alkoxykarbonylaminoalkylovej skupiny, acylaminoalkylovej skupiny, arylsulfonamidoalkylovej skupiny, alylovej skupiny, dihydroxyalkylalylovej skupiny, dioxolanylalylovej skupiny, karbalkoxyalkylovej skupiny a skupiny (R³)₃Si, v ktorej každý substituent R³ je nezávisle zvolený z atómu vodíka, metylovej skupiny, etylovej skupiny, izopropylovej skupiny, terc.butylovej skupiny a fenylovej skupiny, pričom alk- alebo alkyl” predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíku, ktorá môže mať priamy alebo rozvetvený reťazec, s výhodou alkylovú skupinu s 1 až 3 atómami uhlíka, ktorých reťazec sa môže prípadne prerušiť éterovou (-0-) väzbou, a

R⁴ je metylová skupina alebo

R⁴ a R¹ spoločne tvoria alkylénovú skupinu s 2 až 6 atómy uhlí ka, s výhradou, že R^x a R² neznamenajú obaja atóm vodíka a s výhradou, že keď R^x predstavuje skupinu (R³)_aSi alebo karbalkoxyalkylovú skupinu, obidva substituenty X a Y neznamenajú atóm kyslíka.

Výhodné nové zlúčeniny zahŕňajú nasledujúce:

1. 40-0-benzylrapamycín

2. 40-0-(4'-hydroxymetyl)benzylrapamycín

3. 40-0-(4'-(l,2-dihydroxyetyl))benzylrapamycín

4. 40-0-alylrapamycín

5. 40-0-(3'-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4(S)-yl )prop-2 '-én-ľ-yl)rapamycín

6. (2Έ, 4'S)-40-0-(4',5'-dihydroxypent-2'en-1'-yl)rapamycín

7. 40-0-(2-hydroxy)etoxykarbonylmetylrapamycín

8. 40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

9. 40-0-(3-hydroxy)propylrapamycín

10. 40-0-(6-hydroxy)hexylrapamycín

11. 40-0-(2-(2-hydroxy)etoxy)etylrapamycín

12. 40-0-((3S)-2,2-dimetyldioxolan-3-yl)metylrapamycín

13. 40-0-((2S)-2,3-dihydroxyprop-l-yl)rapamycín

14. 40-0-(2-acetoxy)etylrapamycín

15. 40-0-(2-nikotinoyloxy)etylrapamycín

16. 40-0-(2-(N-morfolíno)acetoxy)etylrapamycín

17. 40-0-(2-N-imidazolylacetoxy)etylrapamycín

18. 40-0-(2-(N-metyl-N'-piperazinyl)acetoxy)etylrapamycín

19. 39-O-desmetyl-39,40-0,0-etylénrapamycín

20. (26R)-26-dihydro-40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

21. 28-0-metylrapamycín

22. 40-0-(2-aminoetyl)rapamycín

23. 40-0-(2-acetaminoetyl)rapamycín

24. 40-0-(2-nikotínamidoetyl)rapamycín

25. 40-0-(2-(N-metylimidazo-2'-ylkarbetoxamido)etyl)rapamycín

26. 40-0-(2-etoxykarbonylaminoetyl)rapamycín

27. 40-0-(2-tolylsulfonamidoetyl)rapamycín

28. 40-0-(2-(4',5'-dikarboetoxy-ľ,2',3'-triazol-ľ-y1)etyl)rapamycín

Novými zlúčeninami pre imunosupresívne použitie sú výhodne 40-0-substituované rapamycíny, v ktorých ako X tak Y predstavuje atóm kyslíka, R² znamená atóm vodíka, R⁴ znamená metylovú skupinu a R^x má iný význam ako atóm vodíka, najvýhodnejšie v ktorých R¹ je zvolený z hydroxyalkylovej skupiny, hydroxyalkoxyalkylovej skupiny, acylaminoalkylovej skupiny a aminoalkylovej skupiny, najmä 40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín, 40-0-(3-hydroxy)propylrapamycín, 40-0-(2-(2-hydroxy)etoxy)etylrapamycín a 40-0-(2-acetaminoetyl)rapamycín).

O-substítúcia na C40 alebo 0,0-disubstitúcia na C28 a C40 sa výhodne uskutočňuje nasledujúcim všeobecným postupom: Rapamycín (alebo dihydro- alebo deoxorapamycín) sa nechá reagovať s organickým zvyškom, pripojeným k eliminovanej skupine (napríklad RX, kde R je organický zvyšok, napr. alkylová skupina, alylová skupina alebo benzylová skupina, ktorý je požadovaný ako O-substituent, a X je eliminovaná skupina, napríklad CC1₃C(NH)O alebo CF₃SO₃), za vhodných reakčných podmienok, výhodne kyslých alebo neutrálnych podmienok, napríklad v prítomnosti kyseliny ako kyseliny trifluórmetánsulfónovej, kyseliny gáforsulfónovej, kyseliny p-toluénsulfónovej alebo ich príslušných pyridíniových alebo substituovaných pyridíniových solí, keď X znamená CC1₃C(NH)O, alebo v prítomností zásady ako pyridínu, substituovaného pyridínu, diizopropyletylamínu alebo pentametylpiperidínu, keď X znamená CF₃SO₃. o-substitúcií iba na C28 sa dosahuje rovnakým spôsobom, avšak s predbežným chránením na C40. Do úvahy prichádzajú aj ďalšie modifikácie. Napríklad, keď substituentom je alylová skupina, je izolovaná, monosubstituovaná dvojná väzba alylovej skupiny vysoko prístupná ďalšej modifikácii.

9-deoxorapamycínové zlúčeniny sa výhodne pripravujú redukciou rapamycínu použitím sírovodíka, reakciou rapamycínu s difenyldiselenidom a tributylfosfinom alebo inou vhodnou redukčnou reakciou.

26-dihydrorapamycíny sa pripravujú výhodne redukciou rapamycínov alebo deoxorapamycínov z ketoskupiny na hydroxyskupinu na C26 miernou redukčnou reakciou, napríklad bórohydridovou redukčnou reakciou.

Nové zlúčeniny sú obzvlášť vhodné pre nasledujúce účely:

a) Liečenie a prevencia odhojenia transplantovaných orgánov alebo tkanív, napríklad pre liečenie príjemcov napr. transplantovaného srdca, transplantovaných pľúc, spoločne transplantovaného srdca a pľúc, transplantovanej pečene, obličiek, slinivky brušnej, transplantovanej kože alebo rohovky. Sú tiež indikované pre prevenciu reakcie štepu voči hostiteľo vi, napríklad po transplantácii kostnej drene.

b) Liečenie a prevencia autoimúnneho ochorenia a zápalových stavov, najmä zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimúnnu zložku, ako artritídy (napríklad reumatoídne artritídy, chronické progresívne artritídy a deformujúce artritídy) a reumatických chorôb. Špecifické autoimúnne ochorenia, pre ktoré sa môžu zlúčeniny podľa vynálezu použiť, zahŕňajú autoimúnne hematologické poruchy (včítane napríklad hemolytickej anémie, aphastickej anémie, anémie z nedostatku červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritídu, sklerodermiu, Wegenerovu granulomatózu, dermatomyozitózu, chronickú aktívnu hepatitídu, myasténiu gravis, psoriázu, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatickú sprue, autoimúnne zápalové ochorenie čriev (včítane napr. ulceróznej kolitídy a Crohnovej choroby), endokrinnú oftalmopatiu, Gravesovu chorobu, sarkoidózu, roztrúsenú sklerózu, primárnu biliárnu cirhózu, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typ I), uveitídu (prednú a zadnú), suchú keratokonjunktivitídu, vernálnu keratokonjunktivitídu, intersticiálnu fibrózu pľúc, psoriatickú artritídu, glomerulonefritídu, (s alebo bez nefrotíckého syndrómu), napr. včítane idiopatického nefrotíckého syndrómu alebo nefropatie s minimálnymi zmenami) a juvenilnú dermatomyozitózu.

c) Liečenie a prevencia astmy.

d) Liečenie viacliekovej rezistencie (MDR). Nové zlúčeniny potláčajú P-glykoproteíny (Pgp), čo sú molekuly zúčastňujúce sa na membránovom transporte v spojení s MDR. MDR je obzvlášť problémová u chorých postihnutých rakovinou a AIDS, ktorí nereagujú na obvyklú chemoterapiu, pretože chemoterapeutické liečivá sú z buniek odčerpané Pgp. Nové zlúčeniny sú preto užitočné pre potencovanie iných chemoterapeutických prostridkov pri liečbe a zvládaní stavov viacliekovej rezistencie, ako rakoviny rezistentnej voči kombinovanej chemoterapii alebo AIDS rezistentného voči kombinovanej chemoterapii.

e) Liečenie proliferačných porúch, napr. nádorov, hyΊ perproliferačných kožných chorôb a podobne.

f) Liečenie pliesňových infekcií.

g) Liečenie a prevencia zápalov, najmä potencovaním účinku steroidov.

h) Liečenie a prevencia infekcií, najmä infekcií spôsobených patogénmi s faktormi Mip alebo s faktormi podobnými Mip.

i) Liečenie predávkovania FK-506, rapamycínu, imunosupresívnych nových zlúčenín a iných imunosupresív viažucich makrofilín.

Predmetom vynálezu sú teda tu opísané nové zlúčeniny pre použitie ako nové medziprodukty alebo ako farmaceutické prostriedky, spôsoby liečby alebo prevencie vyššie uvedených porúch podaním účinného množstva novej zlúčeniny chorému, ktorý ju potrebuje, použitie novej zlúčeniny pri výrobe liečiva pre liečbu alebo prevenciu vyššie uvedených porúch a farmaceutické prostriedky obsahujúce novú zlúčeninu v kombinácií alebo v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Väčšina tu opísaných nových zlúčenín je vysoko ímunosupresívna, najmä nové zlúčeniny, ktoré sú O-substituované na C40, a tieto nové zlúčeniny sú obzvlášť užitočné pre indikácie a a b, ale v žiadnom prípade pre indikáciu i. Nové zlúčeniny, ktoré sú menej imunosupresívne, najmä tie, ktoré sú O-substituované len na C28, sú obzvlášť užitočné pre indikácie h a i, ale sú menej vhodné pre indikácie a alebo b.

Nové zlúčeniny sa používajú podaním farmaceutický prijateľnej formy chorému, ktorý potrebuje liečbu. Príslušné dávky nových zlúčenín budú samozrejme rôzne napr. v závislosti na stave, ktorý sa má liečiť (napríklad na type choroby alebo povahe rezistencie), na požadovanom účinku a spôsobe aplikácie.

všeobecne sa však dosahuje vyhovujúcich výsledkov po orálnom podaní dávok rádovo od 0,05 do 5 alebo až do 10 mg/kg/deň, napríklad od 0,1 do 2 alebo do 7,5 mg/kg/deň podaných naraz alebo v rozdelených dávkach 2 až 4x za deň, alebo po parenterálnom podaní, napr. intravenózne, napríklad i.v. infúziou, v dávkach rádovo od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/deň, napríklad od 0,05 alebo 0,1 do 1 mg/kg/deň. Vhodné denné dávkovanie pre chorých je teda radovo 500 mg p.o., radovo 5 až 100 mg p.o., alebo radovo od 0,5 do 125 až 250 mg i.v., napr. radovo 2,5 až 50 mg i.v.

Alternatívne a dokonca výhodne sa dávkovanie upraví pre chorého špecifickým spôsobom tak, aby boli vopred zaistené stanovené najnižšie účinné hladiny v krvi, napr. tak ako sa určí technikou RIA. Dávkovanie chorému sa teda môže upraviť tak, aby sa dosiahlo rovnomerných priebežných najnižších účinných hladín, zmeraných technikou RIA, radovo od 50 alebo 150 do 500 alebo 1000 ng/ml, t.j. analogicky s metódami dávkovania bežne používanými pre cyklosporínovú imunosupresívnu liečbu.

Nové zlúčeniny sa môžu podávať ako jediná účiná zložka alebo spoločne s inými liekmi. Napríklad pri imunosupresívnych aplikáciách ako je prevencia a liečba reakcie štepov voči príjemcovi, odhojenie transplantátu alebo autoimúnne ochorenie sa nové zlúčeniny môžu použiť v kombinácii s cyklosporínom, FK-506 alebo ich imunosupresívnymi derivátmi, kortikosteroidmi, azatioprínom, imunosupresívnymi monoklonálnymi protilátkami, napr. monoklonálnymi protilátkami voči CCD3, CD4, CD25, CD28 alebo CD45 a 7, alebo inými imunomodulačnými zlúčeninami. Pre protizápalové aplikácie sa môžu nové zlúčeniny používať v kombinácii s inými protizápalovými prostriedkami, napr. protivírusovými liekmi a antibiotikami.

Nové zlúčeniny sa aplikujú ľubovoľnou obvyklou cestoou, najmä enterálne, napr. orálne, napríklad formou roztokov na vypitie, tabliet alebo toboliek, alebo parenterálne, napríklad vo forme injekčných roztokov alebo suspenzií. Vhodné formy dávkovacích jednotiek pre orálnu aplikáciu obsahujú napr. 1 až 50 mg zlúčeniny podľa vynálezu, obvykle 1 až 10 mg. Farmaceutické prostriedky obsahujúce nové zlúčeniny sa môžu pripraviť analogicky ako farmaceutické prostriedky obsahujúce rapamycín, napr. ako sa opísalo v EPA 0 041 795, čo bude zrejmé odborníkom v tomto odbore.

Farmakologickú účinnosť nových zlúčenín demonštrujú napr. nasledujúce testy:

1. Reakcia na zmiešané lymfocyty (MLR)

Reakcia na zmiešané lymfocyty sa pôvodne vyvinula v súvislosti s alotransplantátmi, k stanoveniu tkanivovej kompatibility medzi potenciálnymi darcami orgánov a ich príjemcami, a je jedným z najlepšie vypracovaných modelov imunitnej reakcie in vitro. Myší model MLR, napr. ako ho opísali v Immunological Methods, L. Lefkovits a B. Peris, Eds., Acadamic Press, M.Y. str. 227 až 239 (1979), sa používa na demonštrovanie imunosupresívneho účinku nových zlúčenín. Bunky sleziny (0,5 x 10⁶) z myší Balb/c (samica 8 až 10 týždňov) sa inkubujú 5 dní spoločne s 0,5 x 10^e ožiarenými (2000 rad) alebo mitromycínom C spracovanými slezinnými bunkami myši CBA (samica, 8 až 10 týždňov). Ožiarené alogénne bunky vyvolávajú prolíferačnú odpoveď v slezinných bunkách myši Balb/c, ktorá sa môže zmerať inkorporáciou značeného prekurzora do DNA. Pretože stimulátorové bunky sú ožiarené (alebo mitomycínom C spracované), nereagujú na bunky myši Balb/c proliferáciou, ale zachovávajú si svoju antigenicitu. Antiproliferačný účinok nových zlúčenín na bunky myši Balb/c sa meria pri rôznych riedeniach a vypočíta sa koncentrácia, pri ktorej sa dosahuje 50% inhibícia prolíferácíe buniek (IC_so). Inhibičná schopnosť testovanej vzorky sa môže porovnať s rapamycínom a vyjadriť ako relatívne IC_so(t.j. IC_SO testovanej vzorky/IC_so rapamycínu).

2. Proliferácia sprostredkovaná IL-6

Schopnosť nových zlúčenín zasahovať do signálnych ciest v spojitosti s rastovým faktorom sa stanoví s použitím bunkovej línie myšieho hybridómu závislej na interleukíne-6 (IL-6). Pokus sa uskutoční na mikrotitračných doštičkách s 96 jamkami. Kultivuje sa 5000 buniek/jamka v prostredí bez séra (ako ho opísali M. H. Schreier a R. Tees v Immunologícal Methods, I. Lefkovits a B. Pernis, Academic Press 1981, zv. II, str. 263 až 275), doplneného l ng rekombinantného IL-6/ml. Po 66 hodinách inkubácie v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej vzorky sa bunky pulzujúce 1 Ci (3-H)tymidínu/bunka ďalších 6 hodín, odoberú sa a spočítajú kvapalným scintilátorom. Inkorporácia (3-H)tymidínu do DNA je vo vzájomnom vzťahu so zvýšením počtu buniek a je teda meradlom proliferácie buniek. Séria riedenia testovaných vzoriek umožňuje vypočítať koncentráciu, pri ktorej dochádza ku 50% inhibícii proliferácie buniek (IC_so). Inhibičná schopnosť testovanej vzorky sa môže porovnať s rapamycínom a vyjadriť ako relatívne IC_so (t.j. IC_sotestovanej vzorky/IC_so rapamycínu).

3. Skúška na viazanie makrofilínu nechá viazať v prítomnosti vzorky na imobilizovaný

O rapamycíne a štruktúrne príbuznom imunosupresíve FK-506 je známe, že sa viažu in vivo na makrofilín-12 (známy tiež ako proteín viažúci FK-506 alebo FKBP-12) a predpokladá sa, že táto väzba súvisí s imunosupresívnou účinnosťou týchto zlúčenín. Nové zlúčeniny sa tiež silno viažu na makrofílín-12, ako demonštruje kompetitívny test viazania.

Pri tomto teste sa použije FK-506 viazaný na BSA na pokrytie mikrotitračných jamiek. Biotínovaný rekombínantný ľudský makrofilín-12 (biot-MAP) sa alebo neprítomnosti testovanej

FK-506. Po premytí (na odstránenie nešpecifický viazaného makrofilínu) sa viazaný biot-MAP vyhodnotí inkubáciou s konjugátom streptavídínu a alkalickej fosfatázy, nasledované premytím a nasledujúcim prídavkom p-nitrofenylfosfátu ako substrátu. Odpočítaná hodnota je OD pri 405 nm. Väzba testovanej vzorky na biot-MAP má za následok zníženie množstva biot-MAP viazaného na FK-506 a teda zníženie OD405. Séria zriedení testovanej vzorky umožňuje stanoviť koncentráciu poskytujúcu 50% ínhibíciu väzby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 (IC_so). Inhibičná schopnosť testovanej vzorky sa porovná s IC_so voľného FK-506 ako štandardu a vyjadrí sa ako relatívne IC_so (tj- IC_so testovanej vzorky/IC volného FK-506).

4. Lokalizovaná reakcia štepu voči príjemcovi (GvH)

Účinnosť nových zlúčenín in vivo je preukázaná na vhodnom zvieracom modele, ako sa opísalo napr. vo Ford a spol. Transplantation 10 (1970) 258. Bunky sleziny (1 x ÍO⁷) zo 6 týždňov starých potkaních samíc Wistar/Furth (WF) sa aplikujú injekčné subkutánne v deň 0 do ľavej zadnej labky potkaních samíc (F344 x WF)F_i s hmotnosťou približne 100 g. V tejto aplikácii zvieratám sa pokračuje po 4 nasledujúce dní a 7. deň sa im odoberú podkolenné lymfatické uzliny a zvážia. Rozdiel medzi hmotnosťou oboch lymfatických uzlín sa zoberie ako základ pre vyhodnotenie reakcie.

5. Reakcia obličkového alotransplantátu v potkanovi

Jedna oblička zo samice potkana fisher 344 sa transplantuje do obličkovej cievy potkanieho príjemcu WF po jednostrannej (ľavostrannej) nefrektómii koncom ku koncu. Spojenie močovodu je tiež koncom ku koncu. Liečba začína v deň transplantácie a pokračuje 14 dní. Sedem dní po transplantácii sa urobí kontralaterálna nefrektómia, tak že príjemca transplantovanej obličky zostáva výhradne na funkcii tejto obličky. Prežitie príjemcu štepu sa berie za kritérium funkčnosti štepu.

6. Experimentálne vyvolaná alergická encefalomyelítída (EAE) u krýs

Účinnosť nových zlúčenín pri EAE sa zmeria napr. postupom opísaným v Levine and Wenk, Amer. J. Path 47 (1965) 61, McFarlin a spol. J. Immunol. 113 (1974) 712, Borel, Transplant. and Clin. Immunol. 13 (1981) 3. EAE je široko zavedený model pre roztrúsenú sklerózu. Samcom krýs Wistar sa podá injekčné do zadných labiek zmes hovädzej miechy a kompletného Freundovho adjuvans. Symptómy choroby (ochrnutie chvosta a oboch zadných nôh) sa obvykle vyvinú počas 16 dní. Zaznamená sa počet zvierat, ktoré ochoreli ako aj doba začiatku choroby.

7. Artritída vyvolaná pomocou Freundovho adjuvans

Účinnosť proti experimentálne vyvolanej artritíde sa demonštruje s použitím postupu opísaného napr. vo Winter and Nuss. Arthtritis and Rheumatism 9 (1966) 394, Billingham and

Davies, Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane and Ferreira Eds. Springer-Verlag, Berlín) 50/11 (1979) 108 až 144. Krysám

OFA a Wistar (samci alebo samice, 150 g telesnej hmotností) sa podá podkožnou injekciou do koreňa chvosta alebo zadnej labky 0,1 ml minerálneho oleja obsahujúceho 0,6 mg lyofilizovaných, teplom usmrtených Mycobacterií smegmatis. Pri vyvíjaní modelu artritídy sa s liečbou začne ihneď po injekcii adjuvans (1. až 18. deň), v už rozvinutom modele artritídy sa s liečbou začne 14. deň, keď je dobre vyvinutý sekundárny zápal (14. až

20. deň). Na konci pokusu sa odmeria opuch kĺbov pomocou posuvného mikromeradla. ED_so je orálna dávka v mg/kg, ktorá zmenšuje opuch (primárny alebo sekundárny) na polovicu oproti kontrolám.

8. Účinnosť protinádorová a proti MDR

Protinádorová účinnosť nových zlúčenín a ich schopnosť zvýšiť funkciu protinádorových prostriedkov zmenšením viaclíekovej rezistencie je demonštrovaná napr. aplikáciou protinádo· rového prostriedku, napr. kolchicínu alebo etoposidu, viacliekovo rezistentným bunkám a bunkám citlivým na lieky in vitro alebo zvieratám, ktoré majú nádory alebo infekcie rezistentné proti kombinovanej chemoterapii, s alebo bez spoločnej aplikácie nových zlúčenín, ktoré sa majú testovať, a aplikáciou samotnej novej zlúčeniny.

Pri realizácii týchto testov sa používa ľubovoľná vhodná bunková línia a kontrolná (parenterálna) bunková línia, vytvorená napr., ako opísali Ling a spol., J. Celí. Physiol. 83, 103 až 116 (1974) a Bech-Hansen a spol. J.Celí. Physiol. 88, 23 až 32 (1976). Konkrétnymi zvolenými klonmi sú línie CHR (subklon C553.2), rezistentný voči viacerým liekom (napr. rezistentný voči kolchicínu) a parentálna, senzitívna línia AUX BI (subklon ABI Sll).

Protinádorová účinnosť a účinnosť proti MDR in vivo sa demonštruje napr. u myši injekčnou aplikáciou rakovinových buniek rezistentných voči viacerým liekom a rakovinových buniek senzitívnych na lieky. Sublínia Ehrlichovho ascitického karcinómu (EA) rezistentná voči liečivej substancii DR, VC, AM, ET, TE alebo CC sa vyvinú sekvenčným transferom buniek EA na nasledujúce generácie hostiteľskej myši BALB/c metódami opísanými v Slater a spol., J. Clin. Invest. 70, 1131 (1982).

Podobné výsledky sa môžu dosiahnuť použitím testovacích modelov nových zlúčenín porovnateľného typu, napr. in vitro, alebo použitím testovacích zvierat infikovaných vírusovými kmeňmi rezistentnými voči liekom a vírusovými kmeňmi senzitívnymi na lieky, bakteriálnymi kmeňmi rezistentnými na antibiotiká (napr. penicilín) a bakteriálnymi kmeňmi senzitívnymi na antibiotiká, plesňovými kmeňmi antimykoticky rezistentnými a senzitívnymi ako aj protozoálnymi kmeňmi rezistentnými voči liekom, napr. Plasmodíálnymí kmeňmi, napríklad v prírode sa vyskytujúcimi podkmeňmi Plasmodia falciparum, ktoré majú získanú rezistenciu voči chemoterapeutíckým, antímalaríckým líe kom.

9. Viazanie FKBP

Niektoré z nových zlúčenín nie sú imunosupresívne, najmä tie, ktoré sú 0-substituované iba C28, ako napríklad 28-0-metylrapamycín. To sa môže demonštrovať štandardnými testami in vitro v porovnaní s FK-506 a rapamycínom. Napríklad o FK-506 je známe, že je silným inhibítorom transkripcie IL-2, ako sa môže demonštrovať testom pomocou IL-2 reportér génu. Rapamycín, hoci nie je aktívny v teste pomocou IL-2 reportér génu, pôsobí silno inhibične na proliferáciu T buniek závislej na IL-6. Obidve zlúčeniny sú veľmi silnými ínhibítormi reakcie zmiešaných lymfocytov. Neimunosupresivíta sa môže tiež demonštrovať na hore uvedených modeloch in vivo 1 až 7. Aj tie nové zlúčeniny, ktoré nie sú imunosupresívne, sa však viažu na makrofilín, ktorý má určité použitia, pre ktoré je neimunosupresivíta výhodná.

Tie nové zlúčeniny, ktoré sa viažu silno na makrofilín a ktoré samé o sebe nie sú imunosupresívne, sa môžu používať pri liečbe predávkovania imunosupresívami viažucimi makrofilín, ako je FK-506, rapamycín a imunosupresívne nové zlúčeniny.

10. Potencíovanie steroidov

Schopnosť nových zlúčenín viazať makrofilín ich tiež robí užitočnými pre potencíovanie účinku kortikosteroidov. Kombinovnou liečbou zlúčeninami podľa vynálezu a kortikosteroidmi, ako dexametazónom, sa dosiahne veľmi zvýšená steroidná účinnosť. Môže sa to demonštrovať testom pomocou MMTV-CAT (vírus nádoru myšej prsnej žľazy - chloramfenikolacetyltransferáza) reportér génu, napr. ako je opísaný v NING A SPOL., J. Biol. Chem. (1993) 268, 6073. Tento synergický účinok umožňuje znížiť dávky kortikosteroidov, čím sa zníži nebezpečie vedľajších účinkov v niektorých prípadoch.

11. Inhibícia faktorov Míp a faktorov podobných Mip

Nové zlúčeniny ďalej viažu a blokujú rad faktorov Mip (potenciátor infekčnosti makrofágu) a faktorov podobných Mip, ktoré sú štruktúrne podobné s makrof ilínom. Faktory Mip a im podobné faktory sú virulentné faktory produkované širokou paletou patogénov včítane tých z rodu Chlamidia, napr. Chlamidía trachomatís, Neisseria, napr. Neisseria meningitidis, a Legionella, napr. Legionella pneumophilia, a tiež obligátne parazitickými členmi radu Ríckettsiales. Tieto faktory hrajú kritickú úlohu pri vývine intracelulárnej infekcie. Účinnosť nových zlúčenín pri znížení infekčnosti patogénov, ktoré produkujú faktory Mip alebo im podobné faktory, sa môže znázorniť porovnaním infekčnosti patogénov v bunkovej kultúre v prítomnosti alebo v neprítomnosti makrolidov, napr ných v Lundmose a spol., Mol. Mikrobiol neimunosupresívnym zlúčeninám podľa vynálezu sa dáva prednosť pri použití pre túto indikáciu z toho dôvodu, že nie sú ímunosupresívne, tak že neohrozujú prirodzenú imunitnú obranu tela proti patogénom.

použitím metód opísa(1993), 7, 777. Týmto

Nové zlúčeniny sú tiež užitočné pri pokusoch zistiť prítomnosť alebo množstvo zlúčenín viažúcich makrofilín, napr. v konkurenčných pokusoch pre diagnostické alebo skríningové účely. Predmetom vynálezu je teda tiež použitie nových zlúčenín ako skríningového prostriedku k zisteniu prítomnosti zlúčenín viažúcich makrofilín v testovanom roztoku, napr. krvi, krvnom sére alebo skúšobnej živnej pôde, ktorá sa má skontrolovať. S výhodou sa nová zlúčenina imobilizuje v mikrotitračných jamkách a potom sa nechá naviazať v prítomností alebo neprítomnosti testovacieho roztoku na značený makrofílín-12 (FKBP-12). Alternatívne sa v mikrotitračných jamkách imobilizuje FKBP-12 a nechá sa viazať v prítomnosti a neprítomností testovaného roztoku na novú zlúčeninu, ktorá sa značila, napríklad fluórom, enzymaticky alebo rádioaktívnym izotopom, napríklad na novú zlúčeninu, ktorá sa O-substituovala na C-40 alebo/a C28 značiacou skupinou. Doštičky sa omyjú a odmeria sa množstvo viazanej značenej zlúčeniny. Množstvo látky viažucej makrofilín v testovanom roztoku je zhruba nepriamo úmerné množstvu viazanej značenej zlúčeniny. Pre kvantitatívnu analýzu sa zostrojí štandardná väzobná krivka s použitím známych koncentrácií zlúčeniny viazanej na makrofilín.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch sa uvádzajú charakteristické spektroskopické údaje pre uľahčenie identifikácie. Piky, ktoré sa významne nelíšia od rapamycínu, nie sú zahrnuté. Biologické údaje sú vyjadrené ako relatívne IC_5Q v porovnaní s rapamycínom v prípade testov reakcie na zmiešané lymfocyty (MLR) a proliferácie závislej na IL-6 a v porovnaní s FK-506 v teste na viazanie makrofilínu (MBA). Vyššie IC_so zodpovedá nižšej väzobnej afinite.

Príklad 1

40-O-benzylrapamycín

K miešanému roztoku 183 mg - (0,200 mmol) rapamycínu v 2,1 ml zmesi cyklohexánu s metylénchloridom v pomere 2 : i sa pridá 75 ^ul (0,402 mmol) benzyltrichlóracetimidátu, nasledovanej 2,6 ^ul (29 /Umol, 15 mol %) kyseliny trifluórmetánsulfónovej, pričom zmes ihneď zožltne. Po 3 hodinách sa zmes zriedi etylacetátom a rýchlo sa ochladí 10% vodným roztokom uhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje 10% roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí pri zníženom tlaku. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 50 : 50 ako elučného činidla, čím sa získa 40-0-benzylrapamycín vo forme bieleho amorfného produktu:

^XH NMR (CDC1₃) <f 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s),

3,12 (4H, s a m), 3,33 (3H,S), 3,49 (3H, s), 4,15 (1H, šd),

4,65 (1H, d), 4,71 (1H, d), 7,22-7,38 (5H, m); MS (FAB) m/z 1026 ((M+Na*)), 972 ((M-OCHJ*), 954 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 1,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 10

MLR (rel. IC50) 110

Príklad 2

40-0-(4'-hydroxymetyl)benzylrapamycín

a) 40-0-(4'-(terc.butyldimetylsilyl)oxymetyl)benzylrapamycín

Do miešaného roztoku 345 ^ul (2,0 mmol) anhydridu kyseliny triflovej v 5 ml metylénchloridu, chladeného na -78 °C, sa pridá roztok 504 mg (2,0 mmol) 4-(terc.butyldimetylsilyl)oxometylbenzylalkoholu a 820 mg (4,0 mmol) 2,6-dí-terc.butyl-4-metylpyridínu v 5 ml metylénchloridu. Výsledná zmes sa zohreje na -20 °C a v miešaní sa pokračuje pri tejto teplote 0,5 hodiny. Zmes sa potom ochladí opäť na -78 °C a pridá sa roztok 914 mg (1,0 mmol) rapamycínu v 5 ml metylénchloridu. Táto zmes sa nechá cez noc zohriať na izbovú teplotu a potom sa prudko ochladí 10% roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje nasýtenou solankou, vysuší sa nad síranom sodným, prefiltruje sa pri zníženom tlaku a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 50 : 50 ako elučného činidla, čím sa získa 40-O-(4'-(terc.butyldimetylsilyl)oxymetyl)benzylrapamycín vo forme bielej peny:

MS (FAB) m/Z 1170 ((M+Na)*), 1098 ((M-(OCH₃+H_aO))*).

b) 40-0-(4'-hydroxymetyl)benzylrapamycín

Do miešaného roztoku 98 mg (0,093 mmol) zlúčeniny, získanej v príklade 2, v 2 ml acetonitrilu, chladeného na 0 °C, sa pridá 0,2 ml HF-pyridínu. Výsledná zmes sa mieša 2 hodiny a ochladí sa prudko roztokom hydrogénuhličitanu sodného, načo sa extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa premyje solankou, vysuší sa nad síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 20 : 80 ako elučného činidla, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bielej peny:

¹H NMR (CDC1J cT 0,73 (1H, 3,22 (1H, m), 4,67 (4H, m),

MS (FAB) m/z 1056 ((M+Na)*)

H₂0))*), 966 ((M-(OCH₃+2H₂O) MBA (rel. IC50)

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) MLR (rel. IC50) dd), 1,65 (3H, S), 1,74 (3H, s),

7,35 (4H, m);

1002 ((M-OCHJ*), 984 ((M-(OCH₃+ *), 934 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

2,7

3,9

Príklad 3

40-0-(4'-(1,2-dihydroxyetyl)benzylrapamycín

a) 40-0-(4'-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4-yl))benzylrapamycín

V 10 ml zmesi cyklohexánu s metylénchloridom v pomere : 1 sa rozpustí 452 mg (1,24 mmol) 4-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4-yl)benzyltrichlóracetamidátu, nasledovanej 0,14 ml (0,64 mmol) 2,6-di-terc.butylpyridínu a 56 1 (0,64 mmol) kyseliny trifluórmetánsulfónovej. K tejto zmesi sa pridá roztok 587 mg (0,64 mmol) rapamycínu v 2 ml metylénchloridu. Reakčná zmes sa mieša cez noc pri izbovej teplote a prudko sa ochladí roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje nasýtenou solankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 50 : 50 ako elučného činidla, čím sa získa 40-0-(4'-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4-yl))benzylrapamycín vo forme bieleho, amorfného, pevného produktu:

^XH NMR (CDC1₃) cf 0,73 (1H, dd), 1,48 (3H, s), 1,55 (3H, s),

1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,67 (3H, m), 4,28 (1H, dd), 4,62 (1H, d), 4>69 (1H, d), 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m);

MS (FAB) m/Z 1126 ((M+Na)*), 1072 ((M-OCHJ*), 1054 ((M-(0CH₃+ H₂O))*), 1014 ((M-(OCH₃+CH₃COCH₃))*), 996 ((M-(OCH₃+H₂O+

CH₃COCH₃))*), 978 ((M-(OCH₃+2H_O+CH₃COCH₃))*).

b) 40-0-(4'-(1,2-dihydroxyetyl)benzylrapamycín

K roztoku 90,7 mg (0,08 mmol) 40-0-(4'-(2,2-dimetyl-1,3-dioxolan-4-yl)benzylrapamycínu v 4 ml metanolu sa pridá 1 ml IN vodnej HCI. Po dvoch hodinách sa zmes prudko ochladí vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a extrahuje sa dvakrát etylacetátom. Organický roztok sa premyje soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným a odparí sa. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím etylacetátu ako elučného činidla. Získa sa tak v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bielej peny:

^XH NMR (CDC1₃) cf 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s),

3,70 (4H, m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d), 4,80 (1H, dd), 7,33 (4H, m);

MS (FAB) m/z 1086 ((M+Na)*), 1032 ((M-OCHJ*), 1014 ((M-(OCH₃+ H₂0))*), 996 ((M-(0CH₃+2H₂0))*).

MBA (rel. IC50) 0,92

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 10,5

MLR (rel. IC50) 22

Príklad 4

40-0-alylrapamycín

K miešaného roztoku 0,33 ml (2,01 mmol) anhydridu kyseliny triflovej v 10 ml metylénchloridu, chladenému na -78 °C, sa pomaly pridá roztok 0,14 ml (2,06 mmol) alylalkoholu a 0,42 g (2,04 mmol) 2,6-di-terc.butyl-4-metylpyridínu v 5 ml metylénchloridu. Výsledný zelenkastý roztok sa mieša po dobu

1,5 hodiny a pridá sa roztok 915 mg (1,00 mmol) rapamycínu a 0,42 g (2,04 mmol) 2,6-di-terc.butyl-4-metylpyridínu v 5 ml metylénchloridu. V miešaní sa pokračuje 0,5 hodiny pri -78 °C a potom sa zmes zohreje na izbovú teplotu. Za ďalšiu 1 hodinu sa zmes prudko ochladí vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vrstvy sa oddelia. Vodná vrstva sa extrahuje etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Výsledný zelený olej sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 60 : 40, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bezfarebného amorfného pevného produktu:

¹H NMR (CDC1₃) cT0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, S), 1,74 (3H, s),

3,05 (1H, m), 4,13 (2H, šd), 5,14 (2H, m), 5,27 (2H, m), 5,92 (2H, m);

MS (FAB) m/Z 976 ((M+Na)*), 922 ((M-OCH₃)*), 904 ((M-(OCH₃+

H₂0))*), 886 ((M-(0CH₃+2H_0))*), 872 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 854 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

Príklad 5

40-0-(3'-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4(S)-yl-prop-2'-én-1'-yl)rapamycín

K miešaného roztoku 0,64 g (4,00 mmol) E-(4S)-4,5-0,0-ízopropylídénpent-2-én-l,4,5-tritolu a 1,26 g (6,00 mmol)

2,6-di-terc.butyl-4-metylpyridínu v 20 ml metylénchloridu, chladeného na -78 °C, sa pridá 0,82 ml (5 mmol) anhydridu kyseliny triflovej. Výsledná zmes sa pri tejto teplote mieša po dobu 2 hodín a pridá sa roztok 1,82 g (2,00 mmol) rapamycínu a 1,26 g (6,00 mmol) 2,6-di-terc.butyl-4-metylpyridínu v 5 ml metylénchloridu. Zmes sa nechá cez noc postupne zohriať na izbovú teplotu a potom sa prudko ochladí vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje trikrát etylacetátom. Organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 40 : 60, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forijie bieleho pevného produktu: ^XH NMR (CĎC1₃) ςΓ0,72 (1H, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 (3H, s),

1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,58 (2H, m), 4,08 (1H, dd), 4,15 (2H, m), 4,52 (1H, šdd), 5,72 (1H, m), 5,88 (1H, m);

MS (FAB) m/z 1076 ((M+Na)‘), 1022 ((M-OCH_a)~), 1004 ((M-(OCH₃+ H₂0))*), 964 ((M-(OCH₃+CH₃COCH₃))*), 946 ((M-(0CH₃+2H₂0+ CH COCH ))*).

MBA (rel. IC50) 0,64

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 11

MLR (rel. IC50)

Príklad 6 (2 Έ,4'S)-40-0-(4',5'-dihydroxypent-2'-én-1'-yl)rapamycín

Podmienky opísané v príklade 3, stupeň b), aplikované na zlúčeninu získanú v predchádzajúcom príklade, nasledované čistením stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi etylacetátu s metanolom ako elučného činidla, poskytujú v nadpise uvedenú zlúčeninu vo forme bielej peny:

^XH NMR (CDC1₃) «/-0,68 (1H, dd) , 3,04 (1H, m), 4,18 (5H, m),

5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m);

MS (FAB) m/z 1036 ((M+Na)*), 1013 (M*), 995 ((M-H^O)*), 982 ((M-OCH₃)*), 964 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 946 ((M-(0CH₃+2H_0))*),

832 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 914 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 1,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 12

MLR (rel. IC50) 3,5

Príklad 7

40-0-(2-hydroxy)etoxykarbonylmetylrapamycín

a) 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)etoxykarbonylmetylrapamycín

K miešanému roztoku 2,74 g (3,00 mmol) rapamycínu a 30 mg (0,06 mmol) dihydrátu octanu rhodnatého v 30 ml metylénchloridu sa pridá roztok 0,38 ml (3,60 mmol) 2-(terc.butyldimetylsilyl )oxyetyldiazoacetátu v 10 ml metylénchloridu v priebehu 5 hodín. Po ukončenom pridávaní sa pokračuje v miešaní ďalšiu jednu hodinu, načo sa reakcia ukončí IN vodným roztokom HC1. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 40 : 60 ako elučného činidla, čím sa získa 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)etoxykarbonylmetylrapamycín:

¹H NMR (CDC1₃) cf 0,06 (6H, s), 0,68 (1H dd), 0,88 (9H, s), 1,64 (3H, S), 1,73 (3H, S), 3,12 (5H, S a m), 3,81 (2H, dd), 4,19 (2H, dd), 4,32 (2H, s);

MS (FAB) m/z 1152 ((M+Na)*), 1080 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

b) 40-0-(2-hydroxy)etoxykarbonylmetylrapamycín

K miešanému roztoku 81 mg (0,07 mmol) 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl ) oxy )etoxykarbonylmetylrapamycínu v 1,5 ml acetonitrilu, chladenému na 0 °C, sa pridá 0,15 ml HF-pyridínu.

Po 2 hodinách sa reakcia ukončí vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa premyje soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí chromatograficky s použitím etylacetátu ako elučného činidla, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu :

^XH NMR (CDC1₃) J~0,70 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, S),

3,13 (5H, s a m), 3,85 (3H, m), 4,25 (5H, m);

MS (FAB) m/z 1038 ((M+Na)*), 984 ((M-OCH₃)*), 966 ((M-(OCH₃+

H 0))*), 948 ((M-(0CH +2H 0))*).

MBA (rel, IL-6 dep.

IC50) prol. (rel. IC50)

MLR (rel. IC50)

9,7

2,1

Príklad 8

40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

a) 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycín

Roztok 9,14 g (10 mmol) rapamycínu a 4,7 ml (40 mmol)

2,6-lutidínu v 30 ml toluénu sa zohreje na 60 °C a pridá sa k nemu roztok 6,17 g (20 mmol) 2-(terc.butyldimetylsilyl)oxyetyltriflátu a 2,35 ml (20 mmol) 2,6-lutidínu v 20 ml toluénu. Táto zmes sa mieša po dobu 1,5 hodiny. Potom sa v intervale

1,5 hodiny pridajú dve dávky roztoku 3,08 g (10 mmol) triflátu a 1,2 ml (10 mmol) 2,6-lutidínu v 10 ml toluénu. Po pridaní poslednej dávky sa pokračuje po dobu 2 hodín v miešaní pri 60 °C a výsledná hnedá suspenzia sa prefiltruje. Filtrát sa zriedi etylacetátom a premyje sa vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou. Organický roztok sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 40 : 60 ako elučným činidlom, čím sa získa 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycín vo forme bieleho pevného produktu:

^XH NMR (CDC1₃) cT 0,06 (6H, s), 0,72 (lHdd), 0,90 (9H, S),

1,65 (3Η, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m);

MS (FAB) m/z 1094 ((M+Na)*), 1022 ((M-(OCH₃+H_O))*).

b) 40—O—(2—hydroxy)etylrapamycín

K miešanému roztoku 4,5 g (4,2 mmol) 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycínu v 20 ml metanolu, chladenému na 0 °C, sa pridajú 2 ml IN HCl. Tento roztok sa mieša 2 hodiny a zneutralizuje sa vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje tromi dielmi etylacetátu. Organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefíltruje sa a odparí. Po vyčistení stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím etylacetátu ako elučného činidla sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu: ^XH NMR (CDC1J ď 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s),

3,13 (5H, s a m), 3,52 - 3,91 (8H, m);

MS (FAB) m/z 980 ((M+Na)*), 926 ((M-OCHJ*), 908 ((M-(OCH₃+

H_a0))*), 890 ((M-(OCH₃+2H₂O))*), 876 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 858 ((M-(OCH^+-CH__iOH+2H__>O))*).

2,2 2,8 3,4

IC50) prol. (rel. IC50)

MBA (rel, IL-6 dep.

MLR (rel. IC50)

Príklad 9

40-0-(3-hydroxy)propylrapamycín

a) 40-0-(3-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)propylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 8, stupeň a), použitím 3-(terc.butyldimetylsilyl)oxyprop-l-yltriflátu sa získa 40-0-(3-(terc.butylmetylsílyl)oxy)propylrapamycín:

^XH NMR (CDC1₃) cT0,05 (6H, s), 0,72 (1H dd), 0,90 (9H, s) ,

1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 1,77 (2H, m), 3,03 (1H, m), 3,52 3,73 (7H, m);

MS (FAB) m/z 1108 ((M+Na)*), 1036 ((M-(OCH₃+H_O))*).

b) 40-0-(3-hydroxy)propylrapamycín

Spracovaním zlúčeniny pripravenej v stupni a) v podmienkach opísaných v príklade 8, stupeň b), sa získa v nadpise uvedená zlúčenina:

^ΧΗ NMR (CDC1₃) cT0,72 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s),

1,80 (2H, m), 3,05 (1H, m), 3,55 - 3,91 (8H, m);

MS (FAB) m/Z 994 ((M+Na)*), 940 ((M-OCHJ*), 922 ((M-(OCH_a+

H.O))*), 904 ((M-(0CH₃+2H_0))*), 872 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*). MBA (rel. IC50) 1,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 2,7

MLR (rel. IC50) 11

Príklad 10

40-0-(6-hydroxy)hexylrapamycín

a) 40-0-(6-(terc.butyldimetylsilyl)oxy)hexylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 8, stupeň a), použitím 6-(terc.butyldimetylsilyl)oxyhex-l-yltriflátu sa získa 40-0-(6-(terc.butyImetylsilyl)oxy)hexylrapamycín:

MS (FAB) m/z 1150 ((M+Na)*).

b) 40-0-(6-hydroxy)hexylrapamycín

¹H NMR (CDC1₃) J“ 0,72 (1H dd), 1,38 (2H, m), 1,57 (4H, m),

1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,49 - 3,72 (8H, m); MS (FAB) m/Z 1036 ((M+Na)*), 982 ((M-OCHJ*), 964 ((M-(OCH_a+

H_O))*), 946 ((M-(OCH₃+2H₂O))*), 914 ((M-(0CH₃+CH₃OH+2H₂0))*). MBA (rel. IC50) 0,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 8,5

MLR (rel. IC50) 18

Príklad 11

40-0-(2-(2-hydroxy)etoxy)etylrapamycín

a) 40-0-(2—(terc.butyldimetylsilyl)oxyetoxy)etylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 8, stupeň

a), použitím 2-(2-(terc.butyldimetylsílyl)oxyetoxy)etyltríflátu sa získa 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxyetoxy)etylrapamycín:

^XH NMR (CDC1₃) cT 0,06 (6H, s), 0,71 (1H, dd), 0,88 (9H, s),

1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,51 - 3,79 (11H, m); MS (FAB) m/z 1138 ((M+Na)*), 1015 (M*), 1097 ((M-H^O)*), 1084 ((M-0CH₃)*), 1066 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 1048 ((M-(OCH₃+2H₂O))*),

1034 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 1016 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

b) 40-0-(2-(2-hydroxy)etoxy)etylrapamycín

¹H NMR (CDCl_a) cT 0,72 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s),

3,05 (1H, m), 3,51 - 3,77 (11H, m);

MS (FAB) m/z 1024 ((M+Na)*), 1001 (M*), 983 ((M-H₂0)*), 970 ((M-OCH₃)*), 952 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 934 ((M-(OCH₃+2H₂O))*),

920 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 902 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 3,2

MLR (rel. IC50) 2

Príklad 12

40-0-((3S)—2,2-dimétyldioxolan-3-yl)metylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 8, stupeň a), sa použitím triflátu glycerolacetonidu získa v nadpise uvedená zlúčenina:

^XH NMR	(CDC1₃) cT0,72 (1H,	dd), .	1,36	(3H,
1,65 (3H	, s), 1,75 (3H, s),	3,06	(1H,	m) ,
(3H, m),	4,06 (1H, dd), 4,26	(1H, m	) i
MS (FAB)	m/z 1050 ((M+Na)*)	, 996	((M-	OCH ) 3 '

s), 1,42 (3Η, s), 3,55 (2H, m) 3,69

*), 978 ((M-(OCH₃+

Η_ζ0))-), 960 ((Μ-(OCH₃+2H₂O)) * ).

MBA (rel.	IC50)	0,9
IL-6 dep.	prol. (rel. IC50)	8
MLR (rel.	IC50)	290

Príklad 13

40-0-((2S)-2,3-dihydroxyprop-l-yl)rapamycín

Spracovaním zlúčeniny pripravenej v predchádzajúcom príklade v podmienkach opísaných v príklade 3 sa získa v nadpise uvedená zlúčenina:

^XH NMR (CDC1₃) cf 0,72 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,75

3,07 (1H, m), 3,68 (8H, m);

MS (FAB) m/Z 1010 ((M+Na)*), 956 ( (M-OCHJ

HO))*), 920 ((M-(OCH +2H O)) (3H, s),

938 ((M-(OCH₃+ ),888 ((M-(0CH₃+CH₃0H+2H_a0))*) 0,67 9

MBA (rel. IL-6 dep.

IC50) prol. (rel. IC50)

MLR (rel. IC50)

Príklad 14

40-0-(2-acetoxy)etylrapamycín

K miešanému roztoku 53 mg (0,055 mmol) 40-0-hydroxyetylrapamycínu v 2 ml metylénchloridu, chladenému na O °C, sa pridá 0,2 ml pyridínu, nasledované 0,02 ml (0,281 mmol) acetylchlorídu. Zmes sa mieša 3 hodiny a zriedi sa etylacetátom, načo sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, studenou IN HCl a opäť vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Organický roztok sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesí hexánu s etylacetátom v pomere 30 : 70, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu:

^XH NMR (CDCl_a) cT0,72 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s),

2,08 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,78 (2H, dd), 4,20 (2H, dd);

MS (FAB) m/z 1022 ((M+Na)*), 999 (M*), 982 ((M-OH)*), 968 ((M-OCH₃)‘), 950 ((M-(OCH₃+H₂O))‘), 932 ((M-(OCH₃+2H₂O))*),

918 ((M-(2CH₃0H+0H))*), 900 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 7,6

MLR (rel. IC50) 3,6

Príklad 15

40-0-(2-nikotinoyloxy)etylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v predchádzajúcom príklade, s použitím nikotinoylchlorid-hydrochloridu sa získa v nadpise uvedená zlúčenina:

^XH NMR (CDC1₃) cT 0,72 (1H dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s),

3,07 (1H, m), 3,94 (2H, dd), 4,49 (2H, t) 7,39 (1H, dd), 8,31 (1H, ddd) 8,78 (1H, ddd), 9,24 (1H, dd);

MS (FAB) m/z 1085 ((M+Na)*), 1063 ((M+H)*), 1045

1031 ((M-OCH +H 0) )*.

((M-OH)*),

MBA (rel. IL-6 dep. MLR (rel.

IC50) prol. (rel, IC50)

IC50)

6,9

Príklad 16

40-0-(2-(N-morfolíno)acetoxy)etylrapamycín

a) 40-0-(2-brómacetoxy)etylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 14, s použitím brómacetylchloridu sa získa 40-0-(2-brómacetoxy)etylrapamycín :

^XH NMR (CDC1₃) cT0,72 (lHdd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s),

3,03 (IH, m), 3,82 (2H, m), 3,87 (2H, s) 4,31 (2H, m);

MS (FAB) m/z 1100, 1102 ((M+Na)*), 1077 (M*), 1061 ((M-H.,0)*), 1046, 1048 ((M-OCH_a)*), 1028, 1030 ((M-(OCH^I^O))*), 1012 ((M-(OCH +H O))*), 996 ((M-(2CH OH+OH))*), 980 ((M-(OCH+ CH OH+2H O))*) .

b) 40-0-(2-(N-morfolíno)acetoxy)etylrapamycín

K miešanému roztoku 54 mg (0,05 mmol) 40-0-(2-brómacetoxy)etylrapamycínu v 0,2 N,N-dimetylformamidu, ochladenému na -45 °C, sa pridá roztok 0,022 ml (0,25 mmol) morfolínu v 0,2 ml N,N-dimetylformamidu a výsledná zmes sa mieša pri tejto teplote po dobu 1 hodiny, načo sa pridá vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného. Táto zmes sa extrahuje trikrát etylacetátom. Organický roztok sa premyje soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi etylacetátu s metanolom v pomere 95 : 5 ako elučného činidla, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme amorfného bieleho produktu:

^ΧΗ NMR (CDC1₃) cT 0,72 (IH dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 2,60 (3H, m), 3,07 (IH, m), 3,24 (2H, s), 3,78 (8H, m), 4,27 (2H, t) ;

MS (FAB) m/z 1107 ((M+Na)*), 1085 ((M+H)*), 1067 ((M-OH)*),

1053 ((M-OCH₃)*), 1035 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 1,3

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 4

MLR (rel. IC50) 3,5

Príklad 17

40-0-(2-N-imidazolylacetoxy)etylrapamycín

Rovnakým spôsobom, aký sa opísal v príklade 16, stupeň b), sa s použitím imidazolu získa v nadpise uvedená zlúčenina: ^XH NMR (CDC1₃) cT 0,72 (IH dd), 1,67 (3H, s), 1,78 (3H, S), 3,06 (IH, m), 3,80 (2H, m), 4,32 (2H, m), 4,73 (2H, s), 6,97 (IH, dd), 7,09 (IH, dd), 7,52 (IH, dd);

MS (FAB) m/z 1066 ((M+H)*), 1016 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

MBA (rel. IC50)

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) MLR (rel. IC50)

1048 ((M-OH)*), 1034 ((M-OCH₃)*),

7,6

3,4

Príklad 18

40-0-(2-(N-metyl-N'-piperazinyl)acetoxy)etylrapamycín

Rovnakým postupom, aký sa opísal v príklade 16, stupeň

b), s použitím N-metylpiperazínu sa získa v nadpise uvedená zlúčenina:

^XH NMR (CDC1₃) cT 0,72 (1H dd), 1,67 (3H, s), 1,77 (3H, s),

2,78 (4H, s a m), 3,02 (4H, šs), 3,08 (1H, m), 3,32 (2H, S),

3,80 (2H, dd), 4,27 (2H, t);

MS (FAB) m/z 1098 ((M+H)*), 1066 ((M-OCH₃)*).

MBA (rel. IC50) 2,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 10,3

MLR (rel. IC50) 5

Príklad 19

39-O-desmetyl-39,40-0,O-etylénrapamycín

K miešanému roztoku 48 mg (0,05 mmol) 40-O-hydroxyetylrapamycínu a 0,023 ml (0,20 mmol) 2,6-lutídínu v 0,5 ml metylénchloridu, ochladenému na -20 °C, sa pridá 0,008 ml (0,05 mmol) anhydridu kyseliny triflovej. Zmes sa mieša pri tejto teplote 2 hodiny, nato sa nechá zohriať na izbovú teplotu a mieša sa ďalšiu hodinu. Reakcia sa ukončí prídavkom vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a výsledná zmes sa extrahuje tromi dielni etylacetátu. Organický roztok sa premyje solankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na sílikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 30 : 70 ako elučného činidla, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu:

¹H NMR (CDC1₃) cTl,66 (3H, s), 1,75 3,35 (3H, s), 3,76 (4H, s);

MS (FAB) m/z 948 ((M+Na)*), 925 ((M-OCH )*), 876 ((M-(OCH+HO))·), (3H, s), 3,14 (3H, s), (M*), 908 ((M-OH)*), 894 858 ((M-(OCH +2H O))*) ,

844 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 826 ((M-(0CH₃+CH₃0H+2H_0))*). MBA (rel. IC50) 1,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 22,9

MLR (rel. IC50) 16

Príklad 20 (26R)-26-dihydro-40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

a) (26R)-26-dihydro-40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyloxy))etylrapamycín

V 4,5 ml zmesi acetonitrilu s kyselinou octovou v pomere 2 : l sa rozpustí 315 mg (1,2 mmol) tetrametylamóniumtriacetoxybórohydridu. Výsledný roztok sa mieša 1 hodinu pri izbovej teplote a ochladí sa na -35 °C, nato sa pridá 161 mg (0,15 mmol) 40-0-(2-(terc.butyldimetylsilyl)oxy))etylrapamycínu. Výsledná zmes sa mieša cez noc pri rovnakej teplote a reakcia sa ukončí prídavkom vodného roztoku hydrogénuhličitanú sodného. Zmes sa extrahuje tromi dielmi etylacetátu. Organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanú sodného, dvomi dávkami 30% vodného roztoku Rochellovej soli a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silíkagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 40 : 60 ako elučného činidla, čím sa získa v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu:

^XH NMR (CDC1₃) cT0,06 (6H, s), 0,73 (1H, dd), 0,90 (9H, s),

1,64 (3H, s), 1,67 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,15 (1H, s), 3,64 (3H, m), 3,71 (2H, dd), 3,91 (1H, s);

MS (FAB) m/z 1096 ((M+Na)*), 1041 ((M-HOCH₃)*), 1024 (M-(OCH₃+ H₂O))*), 1006 ((M-(0CH₃+2H₂0))*), 74 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O))*).

b) (26R)-26-dihydro-40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

Spracovaním zlúčeniny pripravenej v stupni a) v podmienkach opísaných v príklade 8, stupeň b) sa získa v nadpise uvedená zlúčenina:

’Ή NMR (CDC1₃) cJ~0,75 (1H, dd) , 1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s),

3,18 (1H, m), 3,52 - 3,84 (7H, m);

MS (FAB) m/z 982 ((M+Na)‘), 928 ((M-OCH₃)~), 910 ((M-(0CH₃+

H₂0))^w), 892 ((M-(OCH₃+2H₂O))*).

MBA (rel. IC50) 3,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) MLR (rel. IC50)

Príklad 21

28-O-metylrapamycín

K miešanému roztoku 103 mg (0,1 mmol) 40-0-TBS-rapamycínu (získaného silyláciou rapamycínu 1 ekvivalentom TBS-triflátu v metylénchloride v prítomnosti 2 ekvivalentov 2,6-lutidlnu pri 0 °C) v 0,5 ml metylénchloridu sa pridá 85,8 mg (0,40 mmol) protónovej huby, nasledovanej 44 mg (0,30 mmol) trimetyloxóniumtetrafluórborátu. Výsledná hnedá heterogénna zmes sa mieša cez noc, reakcia sa ukončí prídavkom vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a extrahuje sa etylacetátom. Organický roztok sa premyje IN HCI, vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného soľankou, nato sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle s použitím zmesi hexánu s etylacetátom v pomere 60 : 40 ako elučného činidla, čím sa získa 40-O-terc.butyldimetylsilyl-28-O-metylrapamycín. Táto zlúčenina sa dísilyluje v podmienkach opísaných v príklade 10, stupeň b), čím sa získa po PTLC s etylacetátom v nadpise uvedená zlúčenina vo forme bieleho pevného produktu:

¹H NMR (CDC1₃) ď 0,70 (1H, dd), 1,68 (6H, 2s), 2,95 (1H, m),

3,13 (3H, S), 3,14 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,41 (3H, s);

MS (FAB) m/z 950 ((M+Na)*), 927 (M*), 909 ((M-H^O)*), 896 ((M-OCH₃)*), 878 ((M-(0CH₃+H₂0))*), 864 ((M-(OCH₃+CH₃OH))*),

846 ((M-(2CH₃0H+0H))*), ((M-(3CH₃0H+0H)*).

MBA (rel. IC50)

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) MLR (rel. IC50)

832 ((M-(0CH₃+2CH₃0H))*),

1,58

1240

1300

814

Príklad 22

40-0-(2-aminoetyl)rapamycín

a) 40-0-(2-brómetyl)rapamycín

Roztok 914 mg rapamycínu v 5 ml toluénu# obsahujúci 0,64 ml 2,6-lutidínu a 1,28 g 2-brómetyltriflátu, sa zahrieva 18 hodín na 65 °C. Reakčná zmes sa potom ochladí na izbovú teplotu, vyleje na 20 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a extrahuje 3 x 20 ml etylacetátu. Organické fázy sa •vysušia nad uhličitanom sodným a rozpúšťadlo sa oddestiluje pri zníženom tlaku na rotačnej odparke. Odparok sa chromatograf u je na 100 g silikagélu, pričom sa eluuje zmesou hexánu s etylacetátom v pomere 3:2. Získa sa tak 40-0-(2-brómetyl)rapamycín vo forme amorfného pevného produktu:

MS (FAB) m/z 1044 a 1042 (100 %, M+Na); 972 a 970 (55 %,

M-(MeOH+H_zO)).

b) 40-0-(2-azidoetyl)rapamycín

Roztok 2,4 g 40-0-(2-brómetyl)rapamycínu v 40 ml N,N-dimetylformamidu sa nechá reagovať s 0,19 g azidu sodného pri izbovej teplote. Po 2 hodinách sa zmes vleje na 100 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a extrahuje sa 3 x 20 ml etylacetátu. Organické fázy sa spoja, vysušia sa nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa oddestiluje pri zníženom tlaku. Surový produkt sa vyčistí chromatograficky na silikagéle, pričom sa eluuje zmesou hexánu s etylacetátom. Získa sa tak 40-0-(2-azidoetyl)rapamycín:

MS (FAB): 1005 (100 %, M+Na); 951 (24 %, M-MeOH); 933 (57 %,

M-(MeOH+H_aO)).

c) 40-0-(2-aminoetyl)rapamycín

K roztoku 230 mg 40-0-(2-azidoetyl)rapamycínu v 3 ml zmesi tetrahydrofuránu s vodou v pomere 5 : 1 sa pri izbovej teplote pridá 307 mg trifenylfosfínu. Reakčná zmes zožltne. Po 7 hodinách sa reakčná zmes chromatografuje na silikagéli, pričom sa eluuje zmesou etylacetátu, metanolu a kyseliny octovej v pomere 50 : 50 : 0,5. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt vo forme acetátu:

MS (FAB) m/Z 979 (45 %, M+Na); 957 (100 %, MH) ; 925 (63 %,

M-MeOH); 907 (25 %, M-(MeOH+H^O)).

MBA (rel. IC50) 0,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 10

Príklad 23

40-0-(2-acetaminoetyl)rapamycín

K roztoku 101 mg acetátu 40-0-(2-aminoetyl)rapamycínu v 2 ml tetrahydrofuránu sa pridá 0,02 pyridinu a 0,07 ml acetylchloridu. Reakčná zmes sa udržiava 18 hodín na izbovej teplote a potom sa vleje na 7 ml nasýteného roztoku hydrogénuhlíčitanu sodného. Vodná fáza sa extrahuje trikrát 5 ml etylacetátu, organické fázy sa spoja a vysušia nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odparí a odparok sa chromatografuje na 10 g silikagélu, pričom sa eluuje najskôr etylacetátom a potom zmesou etylacetátu, metanolu a kyseliny octovej v pomere 50 : 50 :

0,5. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt:

MS (FAB) m/Z 1021 (20 %, M+Na); 967 (28 %, M-MeOH); 949 (100 %, M-(MeOH+H_aO)).

H-NMR (CDC1₃) d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz) ; 1,98 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,44 (3H, s); 4,75 (1H, s);

MBA (rel. IC50) 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 2,3

Príklad 24

40-0-(2-nikotínamidoetyl)rapamycín

101 mg acetátu 40-0-(2-aminoetyl)rapamycínu sa rozpustí v 5 ml etylacetátu a extrahuje sa dvakrát nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Organická fáza sa vysuší nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa oddestiluje. Odparok sa rozpustí v 2 ml tetrahydrofuránu a nechá sa reagovať s 22 mg Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu a 15 mg kyseliny nikotínovej.

Po 15 hodinách pri izbovej teplote sa reakčná zmes odparí a odparok sa chromatografuje na silikagéle, pričom sa eluuje etylacetátom nasledovaný zmesou etylacetátu s metanolom v Získa sa tak v nadpise uvedený produkt:

1084 (80 %, M+Na); 1062 (40 %,MH); 1038 (100 %,

M-MeOH); 1012 (50 %, M-(MeOH+H₂O) ) .

H-NMR (CDCl_a) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,37 (3H, s); 7,39 (1H, dd, J=6 Hz, J=8 Hz); 8,19 (1H, d, J=8 Hz); 8,75 (1H, d, J=6 Hz); 9,04 (1H, široký s).

MBA (rel. IC50) 1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 2,8 pomere 9 : 1 MS (FAB) m/z

Príklad 25

40-0-(2-(N-metylimidazo-2'-ylkarbetoxamido)etyl)rapamycín

K roztoku 30 mg kyseliny N-metylimidazol-2-karboxylovej v 1 ml dimetylformamidu sa pridá 58 mg N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu a 58 mg hydroxybenztriazolu. Po 2 hodinách sa pridá 150 mg 40-0-(2-aminoetyl)rapamycínu a reakčná zmes sa mieša 18 hodín pri izbovej teplote. Suspenzia sa potom prefiltruje, filtrát sa zriedi 5 ml etylacetátu a premyje sa dvakrát 2 ml nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného. Organická fáza sa vysuší nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí pri zníženom tlaku. Odparok sa chromatografuje na silikagéle, pričom sa eluuje zmesou hexánu s etylacetátom v pomere 1 : 4 a potom etylacetátom. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt :

MS (FAB) m/z 1087 (36 %, M+Na); 1065 (57 %,MH); 1033 (100 %,

M-MeOH); 1015 (46 %, M-(MeOH+H₂O)).

H-NMR (CDC1₃) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,46 (3H, s); 4,03 (3H, s); 6,93 (1H, široký s);

7,78 (1H, m).

MBA (rel. IC50)

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)

1,1

Príklad 26

40-0-(2-etoxykarbonylaminoetyl)rapamycín

Roztok 200 mg 40-0-(2-azidoetyl)rapamycínu v 3 ml zmesi tetrahydrofuránu s vodou v pomere 5 : 1 sa nechá reagovať s 267 mg trifenylfosfínu 7 hodín pri izbovej teplote. Potom sa pridá 0,4 ml pyridínu nasledovaného 194 ^ul etylchlórmravčanu. Po 2 hodinách sa reakčná zmes vleje na 5 ml etylacetátu a premyje sa postupne 10 ml nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného, 5 ml vody a 5 ml 10%-nej kyseliny citrónovej . Organická fáza sa vysuší nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa oddestiluje. Odparok sa chromatografuje nad 20 g silikagélu, pričom sa eluuje etylacetátom a potom zmesou etylacetátu s metanolom v pomere 9:1. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1051 (35 %, M+Na); 997 (30 %, M-MeOH); 979 (100 %, M-(MeOH+H_aO)).

H-NMR (CDC1₃) d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,24 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,43 (3H, s); 4,10 (2H, q, J=8

Hz); 5,48 (1H, m).

MBA (rel. IC50) 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 1,7

Príklad 27

40-0-(2-tolylsulfonamidoetyl)rapamycín

Roztok 200 mg 40-0-(2-aminoetyl)rapamycínu v 3 ml tetrahydrofuránu sa nechá reagovať s 0,4 ml pyridínu a 390 mg tosylchloridu, pričom sa reakčná zmes mieša 12 hodín pri izbovej teplote. Roztok sa potom vleje na 5 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu a vodná fáza sa extrahuje dvakrát 5 ml etylacetátu. Spojené organické fázy sa premyjú 5 ml 10%-nej kyseliny citrónovej a 5 ml vody. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo oddestiluje a odparok sa chromatografuje na 20 g silikagélu, pričom sa ako elučné činidlo použije zmes hexánu s etylacetátom v pomere 1:1. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt vo forme bielej peny:

MS (FAB) m/z 1133 (100 %, M+Na); 1078 (25 %, M-MeOH); 1061 (85 %, M-(MeOH+H_zO)).

H-NMR (CDCl_a) d: 0,68 (1H, q, J=12 Hz); 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,35 (3H, s); 3,41 (3H, s); 4,76 (1H, s); 5,85 (1H, t, J=6 Hz); 7,30 (2H, d, J=8 Hz); 7,75 (2H, d, J=8 Hz).

MBA (rel. IC50) 15,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 14

Príklad 28

40-0-(2-(4',5'-dikarboetoxy-ľ,2',3'-triazol-1'-yl)etyl)rapamycín mg 40-0-(2-azidoetyl)rapamycínu a 32 mg dietylacetylendikarboxylátu sa suspenduje v 0,5 ml toluénu a zahrieva sa 5 hodín na 65 °C. Reakčná zmes sa potom ochladí na izbovú teplotu, vnesie sa na 10 g silikagélu a eluuje sa zmesou hexánu s etylacetátom v pomere 1 : 1. Získa sa tak v nadpise uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1175 (20 %, M+Na); 1121 (15 %, M-MeOH); 1103 (60 %, M-(MeOH+H^O)).

H-NMR (CDC1₃) d: 0,62 (1H, q, J=12 Hz); 1,40 (3H, t, J=8 Hz); 1,42 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,25 (3H, s); 3,33 (3H,

s) ;

MBA (rel. IC50) 2,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 12

Predchádzajúce príklady sa môžu tiež realizovať tak, že sa ako východiskový materiál použije miesto rapamycínu 9-deoxorapamycín, 26-dihydrorapamycín alebo 9-deoxo-, 26-dihydrorapamycín. Alternatívne a s výhodou, ako sa opísalo napr.

v príklade 20, sa rapamycínové zlúčeniny z vyššie uvedených príkladov môžu hydrogenovať alebo redukovať, prípadne s použitím vhodných chrániacich skupín. Ďalej sú opísané nové spôsoby redukcie ketoskupiny na C9 alebo hydrogenácie ketoskupiny na C26:

Príklad 29

Odstránenie ketoskupiny na C9

Pri izbovej teplote sa vedie prúd sírovodíka miešaným roztokom 3,2 g (3,5 mmol) rapamycínu v 50 ml pyridinu a 2,5 ml N,N-dimetylformamidu. Pôvodne bezfarebný roztok zožltne. Po dvoch hodinách sa prívod sírovodíka zastaví a v miešaní sa pokračuje päť dni. Počas tejto doby roztok postupne zoranžovie. Chromatografia na tenkej vrstve a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia potvrdzujú úplné spotrebovanie východiskového materiálu a prítomnosť jedinej novej zlúčeniny. Roztok sa 1 hodinu premýva dusíkom a odparí sa pri zníženom tlaku. Odparok sa vyberie do etylacetátu, premyje sa trikrát studeným roztokom IN HC1, nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a nasýtenou soľankou. Organická vrstva sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí pri zníženom tlaku. Odparok sa vyberie do éteru a vyzrážaná síra sa odfiltruje. Po odparení éterového roztoku, nasledovaného chromatografiou na silikagéle (10 : 4 : 1 CH₂Cl₂/i-Pr₂O/MeOH) sa získa 9-deoxorapamycín vo forme bezfarebnej peny. Identitu produktu potvrdzuje nukleárna magnetická rezonančná spektroskopia (NMR), hmotnostná spektrometria (MS) alebo/a infračervená spektroskopia (IČ). U 9-deoxorapamycínu sa zistili nasledujúce charakteristické fyzikálne hodnoty:

¹H NMR (CDC1₃) cT 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH₃), 1,76 (3H, d, J=1,2 Hz, C29-CH₃), 2,42 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 2,74 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 3,13 (3H, s, C16-0CH₃), 3,5 (3H, s, C27-0CH₃), 3,40 (3H, s, C39-OCH.J, 5,40 (1H, d, J=10 Hz, H-30), 5,57 (1H, dd, J_i=8,6 Hz, J₂=15 Hz, H-22), 5,96 (1H, d, J=9 Hz,. H-18), 6,09 (1H, d, J=1,7 Hz, 10-OH), 6,15 (1H, DD, σ_χ=10 Hz, J₂=15 Hz, H-21), 6,37 (1H, dd, ^=1,5 Hz, J₂=5 Hz,

H-19), 6,38 (1H, J=9,5 Hz, H-20) ¹³C NMR (CDC1₃) cT38,5 (C-9), 998,0 (C-10), 170,7 (C—1), 173,0 (C-8), 208,8 (C-32), 216,9 (C-26)

MS (FAB) m/z 922 ((M+Na)‘), 899 (M*), 881 ((M-H_O)*), 868 ((M-OCH₃)*), 850 ((M-(H_O+OCH₃))*)

1086, 1193, 1453, 1616, 1717,

14

IC (hlavné piky) (cm ) 987, 1739, 3443 MBA (rel. IC50)

MLR (rel. IC50)

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)

Príklad 30

Dihydrogenácia ketoskupíny na C26

K miešanému roztoku 421 mg (1,6 mmol) tetrametylamóniumtriacetoxybórohydridu v 2 ml acetonitrilu sa pridajú 2 ml kyseliny octovej. Výsledná zmes sa mieša 30 minút pri izbovej teplote a ochladí sa na -35 °C. Pri tejto teplote sa pridá roztok 180 mg (0,2 mmol) 9-deoxorapamycínu v 1 ml acetonitrilu a výsledná zmes sa mieša 24 hodín. K zmesi sa pridá nasýtený vodný roztok vínanu sodnodraselného a nechá sa zohriať na izbovú teplotu. V miešaní sa pokračuje, až sú obidve vrstvy číre, načo sa pridá etylacetát. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Výsledný organický roztok sa raz premyje 10% roztokom hydrogénuhličitanu sodného a dvakrát nasýtenou soľankou, načo sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí pri zníženom tlaku. Odparok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéle (90 : 10

AcOEt-hexán). Východiskovým materiálom v tomto prípade bol 9-deoxorapamycín, výslednou zlúčeninou je deoxorapamycín, 26-dihydrorapamycín sa získa vo forme bezfarebnej peny s nasledujúcimi charakteristickými spektroskopickými hodnotami:

^XH NMR (CDC1₃) (hlavný izomér) J“ 9 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃), 0,93 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃) , 1,00 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCHJ, 1,07 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃) , 1,17 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH.J, 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH ), 1,73 (3H, d, J=1,2 Hz, C2939

CH₃), 2,43 (1H,	dd,	J=4,l a	16,0 Hz, H-33), 2,46 (1H, d, J=
13,8 Hz, H-9), 2	,58	(1H, m,	H-25), 2,77 (1H, d, J=13,8 Hz,
H-9), 2,82 (1H,	dd,	J=8,3 ,	a 16,0 HZ, H-33), 3,17 (1H, dd,
J=4,1 a 9,2 Hz,	H-27), 3,61	(2H, m, H-14 a H-28), 5,19 (1H,
ddd, J=4,l, 4,6 a	8,3	Hz, H-34), 5,49 (1H, široký d, J-5,0 Hz,
H-2), 5,56 (1H,	d,	J=9,1	Hz, H-30), 5,75 (1H, dd, J=6,9
a 14,7 Hz, H-22)	, 5	,76 (1H,	s, 10-OH), 5,99 (1H, široký d,
J=9,2 HZ, H-18) a H-20);	, 6	,10 (1H	, m, H-21), 6,36 (2H, m, H-19
MS (FAB) m/Z 924 ((M+Na)*), MBA (rel. IC50) MLR (rel. IC50)	852 ((M-(H₂O+CH₃O))*); 47 134
IL-6 dep. prol. (rel.	IC50)	78

26-dihydrorapamycín sa pripraví rovnakým spôsobom použitím rapamycínu miesto 9-deoxorapamycínu. Tento produkt má nasledujúce charakteristické hodnoty:

¹³C-NMR (CDC1₃) (hlavný izomér) d = 208,3 (C-32), 194,0 (C-9), 169,3 (C-l), 166,6 (C-8), 140,9 (C-22), 136,5 (C-29), 136,2 (C-17), 133,5 (C-20), 129,1 (C-21), 128,7 (C-18), 126,2 (C—30), 125,3 (C-19), 98,6 81,6 (C-27), 75,4 (C-34), (C-14), 59,1 (C-10), 84,4 (C-39), 83,9 (C-16), 74,3 (C-28), 73,9 (C-40), 72,9 (27-OCH ), 56,6 (39-OCH ), 55,9

39,5 (C-24), 38,8 (C-38), 33,5 (C-ll),

31,3 (C-41), 30,9 (C-26), 67,4 (16-0CH₃), 51,3 (C-2), 46,8 (C-31), 44,3 (C-6), 40,4 (C-33),

40.4 (C-25), (C-23), 34,2

31.5 (C-42), (C-3), 25,2 (C-5), 21,4 (23-CH^), 20,7

16,1 (31-CH₃), 15,9

10,3 (17-CH₃).

MS (FAB) m/z: 884 (M-OCH₃848 (M-(0CH₃+2H₂0), 40 %)

MBA (rel. IC50) 1,7

MLR (rel. IC50) 1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 7,5 (35-CH₃), 14 (C-15), 38,0 (C-36), 34,3

33,3 (C-37), 33,2 (C-35), (C-13), 27,1 (C-12), 27,0 (C-4), 17,3 (11-CH₃), (25-CH₃), 14,2 (29-CHJ, ),

%), 866 (M-(OCH₃+H₂O), 100

Claims

O-alkylované deriváty rapamycínu všeobecného vzorca I v ktorom X je (H, H) alebo atóm kyslíka, Y je (H, OH) alebo atóm kyslíka, R1 a R2 sú nezávisle na sebe zvolené z atómu vodíka, alkylovej skupiny, arylalkylovej skupiny, hydroxyalkylovej skupiny, dihydroxyalkylovej skupiny, hydroxyalkylarylalkylovej skupiny, díhydroxyalkylarylalkylovej skupiny, alkoxyalkylovej skupiny, acyloxyalkylovej skupiny, aminoalkylovej skupiny, alkylaminoalkylovej skupiny, alkoxykarbonylaminoalkylovej skupiny, acylaminoalkylovej skupiny, arylsulfonamidoalkylovej skupiny, alylovej skupiny, dihydroxyalkylalylovej sku41 piny, dioxolanylalylovej skupiny a hydroxyalkoxyalkylovej skupiny, pričom alk- alebo alkyl” predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, ktorá môže mať priamy alebo rozvetvený reťazec, s výhodou alkylovú skupinu s 1 až 3 atómami uhlíka, a R4 je metylová skupina alebo , R4 a R1 11 spoločne tvoria alkylénovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlí ka, > s výhradou, že R1 a R2 neznamenajú obaja atóm vodíka a s výhradou, že alkoxyalkylová skupina alebo hydroxyalkoxyalkylová skupina má iný význam ako alkoxymetylová skupina alebo hydroxyalkoxymetylová akupina.

1. 40-0-benzylrapamycín

2. 40-0-(4'-hydroxymetyl)benzylrapamycín

2. O-alkylované deriváty rapamycínu podľa nároku 1, zvolené z nasledujúcich zlúčenín:

3. Zlúčeniny podľa nároku 1, v ktorých ako X tak Y predstavuje atóm kyslíka, R² znamená atóm vodíka, R⁴ je metylová skupina a R¹ má iný význam ako atóm vodíka.

3. 40-0-(4'-(1,2-dihydroxyetyl))benzylrapamycín

4. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorá je 40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín.

4. 40-0-alylrapamycín

,, 5. Spôsob výroby zlúčenín podľa nárokov 1 až 4, vyznačený tým, že pozostáva z (i) reakcie rapamycínu, c deoxorapamycínu alebo dihydrorapamycínu (prípadne v 0-chránenej forme) s organickým zvyškom (R¹ alebo R² vo význame definovanom v nároku 1, prípadne v chránenej forme) pripojeným k eliminovanej skupine (X) tak, že (a) X je CC1₃(NH)O- a reakcia prebieha v prítomnosti kyseliny alebo (b) X je CF₃S0₃~ a reakcia prebieha v prítomnosti zásady, a (ii) prípadnej redukcie alebo/a (pokiaľ je to potrebné) odstránenie chrániacej skupiny z produktu.

5. 40-0-(3'-(2,2-dimetyl-l,3-dioxolan-4(S)-yl)prop-2'-én-ľ-yl)rapamycín

6. Zlúčenina podľa nárokov 1 až 5 pre použitie ako farmaceutický prostriedok.

6. (2Έ, 4'S)-40-0-(4',5'-dihydroxypent-2'-én-1'-yl)rapamycín

7. Farmaceutický prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje zlúčeninu podía nárokov 1 až 5 spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

7. 40-0-(2-hydroxy)etoxykarbonylmetylrapamycín

8. 40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

9. 40-0-(3-hydroxy)propylrapamycín

10. 40-0-(6-hydroxy)hexylrapamycín

11. 40-0-(2-(2-hydroxy)etoxy)etylrapamycín

12. 40-0-((3S)-2,2-dimetyldioxolan-3-yl)metylrapamycín

13. 40-0-((2S)-2,3-dihydroxyprop-l-yl)rapamycín

14. 40-0-(2-acetoxy)etylrapamycín

15. 40-0-(2-nikotinoyloxy)etylrapamycín

16. 40-0-(2-(N-morfolíno)acetoxy)etylrapamycín

17. 40-0-(2-N-imidazolylacetoxy)etylrapamycín

18. 40-0-(2-(N-metyl-N'-píperazínyl)acetoxy)etylrapamycín

19. 39-0-desmetyl-39,40-0,0-etylénrapamycín

20. (26R)-26-dihydro-40-0-(2-hydroxy)etylrapamycín

21. 28-0-metylrapamycín

22. 40-0-(2-aminoetyl)rapamycín

23. 40-0-(2-acetaminoetyl)rapamycín

24. 40-0-(2-nikotínamidoetyl)rapamycín

25. 40-0-(2-(N-metylimidazo-2'-ylkarbetoxamido)etyl)rapamycín

26. 40-0-(2-etoxykarbonylaminoetyl)rapamycín

27. 40-0-(2-tolylsulfonamidoetyl)rapamycín . 28. 40—0-(2-(4',5'-dikarboetoxy-1',2',3'-triazol-1'-yl)etyl)rapamycín

F

8. Použitie zlúčeniny podľa nárokov 1 až 5 pri výrobe liečiva na liečbu alebo prevenciu nasledujúcich stavov:

(i) autoimúnne ochorenie, (ii) odhojenie alotransplantátu, (iíi) reakcia štepu voči hostiteľovi, (iv) astma, (v) viaclieková rezistencia, (vi) nádory alebo hyperproliferačné poruchy alebo (vii) plesňové infekcie, (vili) zápal, (ix) infekcia patogénmi s faktormi Mip alebo s faktormi podobnými Mip alebo (x) predávkovanie imunosupresívami viažúcimi makrofilín.