JPH11514531A - イミダゾリノン除草剤に耐性なサトウダイコン植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 イミダゾリノン除草剤に耐性であるサトウダイコン植物を開示する。このサトウダイコン植物は、感受性細胞から、除草剤による突然変異イミダゾリノン耐性細胞を選択することによって誘導される。細胞から誘導された耐性植物は、イミダゾリノンが雑草防除のために用いられている畑で栽培されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 イミダゾリノン除草剤に耐性なサトウダイコン植物発明の背景 （１）発明の概要 本発明は、雑草の防除に用いられるイミダゾリノン除草剤に耐性であるサトウ ダイコン植物（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の作製方法に関する。特に 、本発明は、培地中の細胞と共にこの除草剤を用いて、アセトヒドロキシ酸シン ターゼ（ＡＨＡＳ）としても知られるアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）を コードする遺伝子の突然変異を選択することによって、感受性サトウダイコンか ら誘導されるサトウダイコン植物に関する。 （２）関連技術の説明 先行技術は、Ｂｅｄｂｒｏｏｋ等への米国特許第５，０１３，６５９号；第５ ，１４１，８７０号及び第５，３７８，８２４号に記載されているような組換え 手段によるアセトラクテートシンターゼ遺伝子の遺伝的変化を述べている。結果 は、除草剤耐性に関して正確に繁殖する植物の作製において決して満足できるも のではなかった。 種々な耐性植物が作製され、交雑された。Ｓａｕｎｄｅｒｓ等も、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２：１３５７〜１３６０（１９９２）において、除草剤を含 有する培地における突然変異細胞を選択することによる感受性の自家受精可能な クローン（ＲＥＬ−１）からの、スルホニル尿素に耐性であるサトウダイコン植 物（ＣＲ１−Ｂ）の作製を述べている。種々な耐性植物が作製され、交雑された 。Ｈａｒｔ等（Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：３７８〜３８３（１９９２）；及びＷ ｅｅｄ Ｓｃｉ．４１：３１７〜３２４（１９９３））はさらに、耐性系統を特 徴付けて、耐性が変化したＡＬＳ活性によるものであり、他のＡＬＳ阻害性除草 剤に対する交差耐性を示さず、単一の半優生遺伝子によってコードされると結論 した。 サトウダイコン植物におけるＡＬＳ又はＡＨＡＳを修飾することによって得ら れるイミダゾリノン耐性を述べている刊行物は存在しない。この耐性を有する種 々なトウモロコシ系統が、Ｎｅｗｈｏｕｓ等の，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎ ｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｃｔｉｃｓ，８３：６５〜７０(１９９１)によって 述べられているように、開発されている。 作物保護の商業的ルートは例えばヨーロッパ特許第３７５，８７５号に述べら れているような、“安定剤(safener)”の使用である。この方法は他の化学物質( chemical)を土壌中に導入する。好ましい方法は、イミダゾリノン除草剤に耐性 であるサトウダイコン植物を開発することである。目的 それ故、サトウダイコン植物にイミダゾリノン除草剤に対する耐性を、この耐 性をコードするアセトラクテートシンターゼ遺伝子の突然変異によって与える方 法を提供することが本発明の目的である。さらに、この除草剤に対して耐性であ るサトウダイコン植物を提供することが、本発明の目的である。これらの目的及 び他の目的は以下の説明と図面とを参照することによってますます明らかになる であろう。図面の簡単な説明 図１は、イミダゾリノンに耐性なサトウダイコン植物を作製するための本発明 の方法の概略図である。Ｒ＝耐性；ＩＭ＝イミダゾリノン；Ｓ＝感受性；ＳＵ＝ スルホニル尿素；Ｓｕｒ＝ＳＵ−Ｒ、ＴＰ−Ｒ及びＩＭ−Ｓに関して優生なＡＬ Ｓ対立遺伝子；ＳＩＲ−１３＝ＳＵ−Ｓ、ＴＰ−Ｓ及びＩＭ−Ｒに関して優生な ＡＬＳ対立遺伝子；ＴＰ＝トリアゾロピリミジン。ＲＥＬ−１はイミダゾリノン 耐性を得るための出発物質であった。 図２は、突然変異サトウダイコン植物の作製における詳細な工程を示すフロー ダイヤグラムである。 図３は、サトウダイコン植物への発芽後噴霧施用に対するイマゼタピル(imaze thapyr)耐性を示すグラフである。 図４は、細胞培養におけるＡＬＳアッセイにおけるイマゼタピル耐性を示すグ ラフである。好ましい実施態様の説明 本発明は、シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝 子を有する突然変異細胞から成るサトウダイコン植物材料であって、該突然変異 細胞がイミダゾリノン除草剤に対する耐性を有し、該耐性が細胞から作製される 植物の慣用的な交雑によって伝えられる上記サトウダイコン植物材料に関する。 さらに、本発明は、サトウダイコン植物に除草剤耐性を生じる方法であって、 培地中でサトウダイコンの第１細胞が感受性であるイミダゾリノン除草剤に該第 １細胞を暴露させる工程と；除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程とを含 み、該耐性を第２細胞を含む植物の交雑によって伝えることができる上記方法に 関する。 最後に本発明は、サトウダイコン植物に除草剤耐性を与える方法であって、培 地中でサトウダイコンの第１細胞が感受性であるイミダゾリノン除草剤に該第１ 細胞を暴露させる工程と；除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と；該第 ２細胞から第１植物を、該植物が除草剤耐性を有するように、生長させる工程と ；第１植物を第２植物と交雑させて、この除草剤に対する耐性を有する交雑植物 (crossed plant)を作製する工程とを含む上記方法に関する。 サトウダイコン植物ＲＥＬ−１（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｌａ ｎｓｉｎｇ−１）は、Ｄｒ．Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，研究遺伝学者、 合衆国農業省（ミシガン州，Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）から入手可能であり、 １９８７年に放出された。これは無料で入手可能である。ＲＥＬ−１は図１に示 すようにイミダゾリノン（ＩＭ−Ｓ）、スルホニル尿素（ＳＵ−Ｓ）及びトリア ゾロピリミジンスルホンアニリド（ＴＰ−Ｓ）除草剤に対して感受性（Ｓ）であ る。 カルス培養物と懸濁培養物とを用いて、イミダゾリノン耐性（ＩＭ−Ｒ）に関 してヘテロ(heterozygous)である系統を発生させた。この細胞系統（種子）はブ タペスト条約の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎに１９９６年５月６日にＡＴＣＣ９７５３４として寄託されており、 本明細書ではＳｉｒ−１３と呼ぶ。この細胞系統は名称と数によって請求すれば 入手可能であるが、このような寄託のためにライセンスは授与されない。選りす ぐったサトウダイコン植物系統、特にＢｅｔａ Ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．（特に 商業的に有用な、耐性サトウダイコン植物）を作製することができる。伝統的な 育種方法を用いて、イミダゾリノン耐性を例えばレッドビートのような、他のビ ートに移すことができる。 イミダゾリノン除草剤（特にイマゼタピル）に耐性なサトウダイコン植物は、 サトウダイコン栽培領域におけるこの除草剤の使用からの土壌残留物問題を解決 する。現在、除草剤の使用とサトウダイコン植物を栽培するためのその畑の次の 使用との間には、４０か月の待機期間が存在する。第二に、高レベルのイミダゾ リノン除草剤耐性は、サトウダイコン中の雑草防除のためのイミダゾリノン除草 剤の使用を可能にする。 下記実施例は、新規なサトウダイコン植物（Ｓｉｒ−１３）の単離と育種とを 示す。 実施例１ １．イミダゾリノン耐性サトウダイコン変異体（Ｓｉｒ−１３）の選択材料の説明 Ｒｅｌ−１：（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ−１） は、イミダゾリノンに対する除草剤耐性な突然変異体に関して最初の細胞を選択 するために用いられる、高度に再生可能な、雄性の繁殖可能な(male fertile)サ トウダイコン系統であり、大抵の実験に感受性対照として用いられる。 Ｓｉｒ−１３：このサトウダイコン単離物は、イマゼタピル含有培地上でＲｅ ｌ−１細胞をプレーティング(plating)することによって、開発された。この変 異体はイミダゾリノン耐性であるが、スルホニル尿素に対して交差耐性ではない 。 Ｓｉｒ−３０：繁殖不能になる傾向がある、典型的な選択された単離物。こ れは細胞培養操作の異常な結果であった。 ａ．植物は、高いサイトキニン条件（Ｂ１培地中）下でカルスを形成し、カル スから苗条を再生する植物の能力に基づくソマクローナル(somaclonal)選択に関 して、供給源材料として選択した。Ｂ１培地のプロトコール ３０ｇ／ｌのスクロース １００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール １．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃ １．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃ ０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄ ６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃ １６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ １０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ ０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ ２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｍｇ／ｌのチアミン ０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン ０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン ｐＨ ５．９５ Ｂ１固体培地を９ｇ／ｌの植物培養寒天と共にオートクレーブ処理し(autoclave d)、選択スキームのための必要に応じて、フィルター滅菌した除草剤ストック溶 液によって改変した。寒天培地を１５ｘ１００ｍｍ使い捨て式プラスチックペト リ皿に注入した。 Ｂ１液体培地を４０ｍｌアリコート中で、１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラス コに加えて、液体懸濁培養に用いるためにオートクレーブ処理した。 イミダゾリノン耐性変異体（Ｓｉｒ−１３）を選択するために、供給源材料は Ｒｃｌ−１であった。 ｂ．イミダゾリノン耐性変異体を選択するために、図２に示すような方法に従 った。 供給源植物の迅速に伸長する葉から、葉ディスク外植体を製造した。これらの 葉を、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｔ−９２８０，Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍ．Ｃｏ．，ミズーリ州，セントルイス）を加えた１５％市販ブリーチによ る連続２回の２０分間洗浄によって表面滅菌した（工程１）。葉を無菌脱イオン 水によって２回すすぎ洗いした。葉ディスクを火炎滅菌した＃３コルク穴あけ器 を用いて切断した。 葉ディスクを無菌で固体Ｂ１培地に載せた（工程２）。葉ディスクから砕けや すい白色カルス組織が増殖するまで、ディスクを暗所で３０℃において４〜８週 間インキュベートした。カルス組織をピンセットで機械的に分離させ、次に、４ ０ｍｌの液体Ｂ１培地を含有する１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移し た（工程３）。低い強度の蛍光照明（３０μＥ／ｍ²ｓ）下で、フラスコを旋回 運動シェーカー(gyratory shaker)に５０Ｈｚにおいて載せた。１週間後に、液 体培養物を新たなＢ１培地によって継代培養した。 液体培養の開始後２週間目に、細胞塊を６０メッシュスクリーンを備えた細胞 解離シーブ（Ｓｉｇｍａ ＣＤ−１）を用いて分離させた。細胞沈降後に液体培 地の約２／３を除去した。工程４では、細胞を残留する培地中に再懸濁させ、１ ｍｌのアリコートを５０ｎＭイマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ，ニュージャージー州，Ｗａｙｎｅ）除草剤を補充した固体Ｂ １培地上に均一に散布した。薄暗い蛍光（５〜１０μＥ／ｍ²ｓ）中で、プレー トを覆って、 ８〜１２週間インキュベートした。 ｃ．５０ｎＭイマゼタピル濃度では、全ての感受性細胞は死亡した。この濃度 において生存し、生長した細胞塊を可能な耐性変異体として同定した。工程５で は、これらの細胞塊（直径１〜３ｍｍ）を除草剤を含まない新たなＢ１固体培地 に移して、弱い光（１０〜２０μＥ／ｍ²ｓ）下で生長させた。各推定上の耐性 変異体を個別に同定し、別々に維持した。 ｄ．工程６では、カルスから個々の苗条（単数又は複数）が生長するまで、白 色の砕けやすいカルスを４〜６週間毎に新たなＢ１固体培地にさらに小分けした 。これらの苗条を苗条維持培地（Ｍ２０）に次のように移した：Ｍ２０培地のプロトコール ３０ｇ／ｌのスクロース １００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール １．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃ １．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃ ０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄ ６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃ １６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ １０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ ０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ ２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｍｇ／ｌのチアミン ０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン ０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸０．２５ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン ｐＨ ５．９５ Ｍ２０固体培地を９ｇ／ｌの植物培養寒天と共にオートクレーブ処理し、選択ス キームのための必要に応じて、フィルター滅菌した除草剤ストック溶液によって 改変した。寒天培地を２０ｘ１００ｍｍ使い捨て式プラスチックペトリ皿に注入 した。 苗条培養物を１０〜２０μＥ／ｍ²ｓの蛍光照明下に維持し、外科用メスによ って苗条培養物を切断することによって増殖させた。候補の苗条培養物を増殖さ せ、以下で述べるように耐性レベルに関して評価した。 ２．苗条培養物におけるイミダゾリノン耐性のレベル 工程７では、１ｎＭ〜０．１ｍＭの範囲内の対数的に増加する濃度のイミダゾ リノン除草剤を補充したＭ２０培地の各プレート上に３個の小さい、一致したサ イズの苗条切片(shoot cuttings)を載せることによって、苗条培養物を除草剤耐 性に関して評価した。Ｓｉｒ−１３培養物反応を感受性対照（Ｒｅ１−１）の苗 条培養物の反応と比較した。苗条培養物を２０μＥ／ｍ²ｓの光強度に２５℃に おいて３週間維持した。選択培地(selective media)に移した後３週間目に苗条 損傷と新たな重量とを評価することによって、苗条培養物反応を測定した。耐性 Ｉ₅₀値（５０％損傷を惹起する除草剤濃度）の感受性Ｉ₅₀値に対する比率によっ て、除草剤耐性の大きさを評価した。 各変異体の交差耐性特徴を上記方法で、培地に用いた除草剤を変えることによ って測定した。苗条培養において、表１に示すように、Ｓｉｒ−１３はイマゼタ ピルに対して２２０倍の耐性レベルを示したが、スルホニル尿素除草剤、クロル スルフロン又はトリアゾロピリミジンスルホンアニリド除草剤、フルメツラムに 対しては交差耐性を示さなかった。 １ イミダゾリノン（Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｃｙａｎａｍｉｄ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ ）２ スルホニル尿素＝Ｇｌｅａｎ（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄ Ｅ）３ トリアゾロピリミジンスルホンアニリド（ＢＲＯＡＤＳＴＲＩＫＥ，Ｄ ｏｗ Ｆｌａｎｃｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ） ４．Ｒ／Ｓ＝試験される特定の除草剤に対する耐性Ｉ₅₀値の感受性Ｉ₅₀値に対す る比率 ５．Ｉ₅₀は、苗条培養物に５０％損傷を惹起するために必要な除草剤の濃度であ る。 ３．植物再生と繁殖 工程８では、Ｓｉｒ−１３の苗条培養物を同様な方法で完全な植物に再生させ た。先行する苗条継代培養後２週間目に、Ｓｉｒ−１３苗条を、４０ｍｌのＮ３ 発根培地(rooting media)を含有する１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに 移した。Ｎ３培地のプロトコール ３０ｇ／ｌのスクロース １００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール １．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃ １．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃ ０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄ ６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃ １６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ １０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ ０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ ２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｍｇ／ｌのチアミン ０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン ０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸３ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸 ｐＨ ５．９５ Ｎ３培地を４０ｍｌのアリコート中で１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに 加え、９ｇ／ｌの寒天（０．４５ｇ）を各フラスコに加え、苗条培養物の発根(r ooting)に用いるためにオートクレーブ処理した。次に、培養物を２５℃におけ る中程度光強度（４０〜６０μＥ／ｍ²ｓ）下の２４時間／日照明に移した。根 は一般に６〜８週間後に形成された。 工程９では、発根した苗条（Ｒ₀世代）を次に温室内のＢａｃｃｔｏ（Ｍｉｃ ｈｉｇａｎ Ｐｅａｔ Ｃｏ．，テキサス州 ヒューストン）鉢植え用ミックス (potting mix)に移した。工程１０では、Ｓｉｒ−１３のＲ₀植物を２９３と呼ば れる滑らかな根(smooth-root)のサトウダイコンと交雑させた。これらの交雑か らのＦ₁種子を自家受精させて、Ｆ₂種子を得た。イミダゾリノン耐性が優生又は 半優生の単性特徴(monogenic trait)であることが推定された。Ｆ₂世代植物は、 １ホモ耐性：２ヘテロ耐性：１ホモ感受性の比率で分離 する筈であ る。単性優生特徴としてのＳｉｒ−１３遺伝 この比率を各Ｆ₂植物の子孫検査によって検討した。Ｓｉｒ−１３に関して、 Ｆ₂植物を自家受精させ、各植物から別々に種子を回収した。これらの子孫を温 室内にまき 、２〜４葉段階でイマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ）除草剤 （０．６２５ ｌｂ ａｉ／Ａ ＋ １ ｑｔ／Ａ ＳｕｎＩｔ−ＩＩ（ＡＧＳ ＣＯ Ｆａｒｇｏ） ＋ １ ｑｔ／Ａ ２８％ＵＡＮ（尿素硝酸アンモニウム ））の１／４Ｘ畑施用率(field application rate)を散布した。この率は、感受 性植物からのＳｉｒ−１３対立遺伝子の１又は２コピーを有する植物の識別を可 能にする。 Ｓｉｒ−１３ファミリーの各々はホモ耐性、ヘテロ耐性、又はホモ感受性に、 子孫検査分離に基づいて分類した。これらの結果は、Ｓｉｒ−１３Ｆ₂分離が、 表２に示すように、各カテゴリーに関して１：２：１の比率に適合することを示 した。 これらの結果は、Ｓｉｒ−１３が単相優生特徴であることを示唆する。優生又は 半優生の程度は現在まで決定されていない。 ４．完全植物のイミダゾリノン耐性 ホモ（非分離）Ｓｉｒ−１３Ｆ₂植物を自家受精させて、ホモＳｉｒ−１３Ｆ₃ 種子を作製した。種子を温室内のＢａｃｃｔｏ鉢植え用ミックスにまき、まいた 後の１４日目に１植物／鉢に間引いた。植物に４〜６葉段階に０、０．２６、１ ．１、４．４、１７．５、７０又は２８０ｇの活性成分／ｈａのイマゼタピル（ ＰＵＲＳＵＩＴ）又はＡＣ２９９，２６３（ＲＡＰＴＯＲ）を噴霧した。全ての 処置は２３９リットル／ｈａの量で施用し、下記噴霧添加剤：１容量％のＳｕｎ Ｉｔ−ＩＩと、１容量％の２８％ＵＡＮを含めた。各処置を４回繰り返した。苗 条の新たな重量を処置の２０日間後に測定した。Ｓｉｒ−１３と感受性ビートの 反応を図３に示す。Ｓｉｒ−１３ホモ接合体はイマゼタピルとＡＣ２９９，２６ ３とに対して、それぞれ、１２０倍耐性と９０倍耐性とを示す。 ５．イマゼタピルに対するＡＬＳターゲット酵素反応 温室栽培されたサトウダイコン植物の迅速に伸長する葉からＡＬＳを部分的に 精製するために、標準方法を用いた（Ｈａｒｔ等，Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４０：３７８〜３８３（１９９２））。ホモＳｉｒ−１３Ｆ₃植物と、Ｒｅｌ− １Ｓ₁種子とからの抽出物を、対数的に増加する濃度のイマゼタピルの存在下で のＡＬＳ活性に関して分析した。ＲＥＬ−１及びＳｉｒ−１３サトウダイコン系 統の葉抽出物からＡＬＳ活性を測定した。植物を温室内で上述のように４〜６葉 段階まで栽培した。新鮮な抽出物からのＡＬＳ活性を対数的に増加する濃度のイ マゼタピルの存在下で測定した。用いた方法と操作とは、Ｒａｙ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７５：８２７〜８３１（１９８４））とＳｈａｎｅｒ等（Ｐｌ ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７６：５４５〜５４６（１９８４））とが略述してい るものから変更したものである。１０ｇのサトウダイコン葉を４０ｍｌの冷ホモ ジナイゼーション緩衝剤（０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５、１ｍＭピルビン 酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭ チアミンピロホスフェー ト、１０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド、１０容量％グリセロール） ＋ ２．５ｇのポリビニルポリピロリドン中でホモジナイズした。ホモジネート を８層のチーズクロスに通して濾過して、２７，０００ｇにおいて２０分間遠心 分離した。上澄み液を取り出し、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄によって５０％飽和させた。 この溶液を０℃に１時間維持してから、１８，０００ｇにおいて１５分間遠心分 離し、ペレットを１ｍｌの再懸濁緩衝剤（０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５、 ２０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中に再溶解して、Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社，Ｐｌａ ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で脱塩した。この酵素抽出物を直ちに分析した。 ０．２ｍｌの酵素標本(enzyme preparation)（再懸濁緩衝剤によって３：１に 希釈したもの）を１．３ｍｌの反応緩衝剤（２５ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０ 、０．６２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．６２５ｍ Ｍチアミンピロホスフェート、１．２５μＭフラビンアデニンジヌクレオチド） に加えて、３５℃において１時間インキュベートすることによって、ＡＬＳ活性 を測定した。反応混合物は最終濃度の０、４、４０、４００、４０００、４００ ００、４０００００若しくは４００００００ｎＭのイマセタピル又は０、０．９ 、９、９０、９００、９０００、９００００ｎＭクロルスルフロンを含有した。 ５０μｌの６Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を加えて、６０℃において１５分間インキュベートす ることによって、反応を停止させた。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄが述べている（Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６：４９５〜５０２（１９４５））この操作はまた、 ＡＬＳ酵素生成物、アセトラクテートを脱炭酸して、アセトインを形成する。２ ．５Ｎ ＮａＯＨ中の２．５重量％α−ナフトールと０．２５重量％のクレアチ ン，１ｍｌを加えて、６０℃において１５分間インキュベートすることによって 、着色したアセトイン複合体が形成された。 購入したアセトインを比色反応の基準として用いた。５３０ｎｍにおける反応 溶液の吸収を測定することによって、アセトイン濃度を決定した。各除草剤によ る実験を各々において３回の反復実験で繰り返した。抽出物のタンパク質濃度は Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４（ １９７６））によって、標準曲線のためにウシ血清アルブミンを用いて測定した 。 実験は２回行って、処置は３回繰り返した。図４はＳｉｒ−１３ホモ接合体 と感受性Ｒｅｌ−１とからのＡＬＳ抽出物の反応を示す。Ｓｉｒ−１３は酵素レ ベルのイマゼタピルに対して１５０倍レベルの耐性を示す（耐性系統と感受性系 統とのＩ₅₀の比率によって算出）。図３は上述の様に完全植物に対して４４倍の 耐性を示す。 ６．ＡＬＳ遺伝子コピー数 サザン・ブロット分析を行って、感受性サトウダイコン中に存在するＡＬＳ遺 伝子コピー数を測定した。ゲノムＤＮＡをオリジナルＳｉｒ−１３突然変異体に 由来する感受性Ｆ₃植物から単離して、一般に行われる方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌ ｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９１））を用いて分析した。同様 に、市販のサトウダイコン系統(variety)からのゲノムＤＮＡを分析した。両方 のサトウダイコン系統において、ＡＬＳ遺伝子の単一コピーが検出された。この データは、ホモ突然変異体型サトウダイコンの全てのＡＬＳ酵素活性が耐性酵素 形から成ることを実証すると考えられる。 ７．ＡＬＳ遺伝子突然変異 ＡＬＳ酵素耐性の分子的根拠を知るために、以前に報告された除草剤耐性突然 変異の全てが生じている、ＡＬＳ遺伝子の２領域を配列決定するために、標準方 法を用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９ １））。サトウダイコンＡＬＳ遺伝子は以前に配列決定されており（米国特許第 ５，３７８，８２４号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、植物 除草剤耐性の以前に報告されたケースの原因である遺伝子の２領域を増幅するよ うに設計した。耐性（Ｓｉｒ−１３）と感受性（Ｒｅｌ−１）サトウダイコンか らの配列データの比較は、サトウダイコンＡＬＳアミノ酸配列の位置１１３にお けるアラニンに代わるトレオニン置換を生じる、ヌクレオチド配列の位置３３７ におけるグアニンからアデニンへの単一ヌクレオチド変化を実証した。この部位 は今までに、オナモミ(cocklebur)におけるイミダゾリノン耐性（Ｂｅｒｎａｓ ｃｏｎｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１７３８１〜１７３８５（１９ ９５））と酵母におけるスルホニル尿素耐性（米国特許第５，３７８，８２４号 ）とに関連づけられている。試験したＡＬＳ遺伝子の２領域における野生型ヌク レオチド配列からの他の塩基変化は観察されなかった。 上記説明が本発明の例示に過ぎないこと、及び本発明が以下の添付請求の範囲 によってのみ限定されることが意図される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年１月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヌクレオチドが位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されて いる、シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子を有 する突然変異細胞から成るサトウダイコン植物材料であって、該突然変異細胞が イミダゾリノン除草剤に対する耐性を有し、該耐性が細胞から作製された植物の 慣用的な交雑によって伝達可能であり、かつ該細胞が植物に再生可能である上記 サトウダイコン植物材料。 ２．ＲＥＬ−１と名付けられ、ＡＴＣＣ９７８８５として寄託された、除草 剤耐性を有さない親サトウダイコン植物の感受性細胞から、該感受性細胞を該除 草剤を含む培地中で培養して、突然変異細胞を選択することによって、誘導され たものである、請求項１記載の材料。 ３．ＡＴＣＣ９７５３４（ＳＩＲ−１３）と名付けられた種子として寄託さ れている、請求項１記載の材料。 ４．種子又は種子の胎芽としての、請求項１記載の植物材料。 ５．サトウダイコン植物に除草剤耐性を生じる方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコンの第１細胞が感受性であるイミダゾリノン除草 剤に該第１細胞を暴露させる工程と； （ｂ）ヌクレオチドが位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されて いる、シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子によ って除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と を含み、該耐性が第２細胞を含有する植物の交雑によって伝達されうる上記方法 。 ６．第２細胞が、ＲＥＬ−１と名付けられ、ＡＴＣＣ９７８８５として寄託 された、サトウダイコン植物の第１細胞から誘導される、請求項５記載の方法。 ７．第２細胞が、ＡＴＣＣ９７５３４（ＳＩＲ−１３）と名付けられた種子 として寄託されている、請求項５記載の方法。 ８．サトウダイコンに除草剤耐性を与える方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコン植物の第１細胞が感受性であるイミダゾリノン 除草剤に該第 １細胞を暴露させる工程と； （ｂ）除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と； （ｃ）該第２細胞から第１植物を生長させる工程であって、該植物が、ヌクレ オチドが位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている、シンター ゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子によって、これらの 除草剤に対して耐性を有する上記工程と； （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、除草剤耐性を有する交雑植物を作製 する工程と を含む上記方法。 ９．他のビートに除草剤耐性を与える方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコン植物の第１細胞が感受性であるイミダゾリノン 除草剤に該第１細胞を暴露させる工程と； （ｂ）除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と； （ｃ）該第２細胞から第１植物を生長させる工程であって、該植物が、ヌクレ オチドが位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている、シンター ゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子によって、これらの 除草剤に対して耐性を有する上記工程と； （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、除草剤耐性を有する交雑植物を作製 する工程と を含む上記方法。 １０．工程（ａ）における第１細胞が、ＲＥＬ−１と名付けられ、ＡＴＣＣ ９７８８５として寄託されたたサトウダイコンから誘導される、請求項８記載の 方法。 １１．第２細胞がＡＴＣＣ９７５３４（ＳＩＲ−１３）と名付けられた種子 として寄託されている、請求項８記載の方法。 １２．サトウダイコン植物と共に生長する雑草を防除する方法であって、 （ａ）ヌクレオチドが位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されて いる、シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子を有 する細胞を含有するサトウダイコン種子を畑にまく工程であって、該突然変異細 胞がイミダゾリノン除草剤に対する耐性を有し、該耐性が、サトウダイコン植物 を作製するための、該細胞から作製された植物の慣用的な交雑によって伝えられ る上記工程と； （ｂ）畑の植物に対してイミダゾリノン除草剤を用いて、雑草を防除する工程 と を含む上記方法。 １３．植物が、ＲＥＬ−１と名付けられ、ＡＴＣＣ９７８８５として寄託さ れた、イミダゾリノン除草剤耐性を有さない親サトウダイコン植物の感受性細胞 から、該感受性細胞をイミダゾリノン除草剤を含む培地中で培養して、突然変異 細胞を選択することによって、誘導される、請求項１２記載の方法。 １４．植物がＡＴＣＣ９７５３４（ＳＩＲ−１３）として寄託された種子に 由来する、請求項１２記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子を 有する突然変異細胞から成るサトウダイコン植物材料であって、該突然変異細胞 がイミダゾリノン除草剤に対する耐性を有し、該耐性が細胞から作製された植物 の慣用的な交雑によって伝達される上記サトウダイコン植物材料。 ２．ＲＥＬ−１と名付けられ、除草剤に対する耐性を有さない親サトウダイ コン植物の感受性細胞から、該感受性細胞を除草剤を含む培地中で培養して、突 然変異細胞を選択することによって、誘導されたものである、請求項１記載の材 料。 ３．ＡＴＣＣ９７５３４（Ｓｉｒ−１３）と名付けられた種子として寄託さ れている、請求項１記載の材料。 ４．種子又は種子の胎芽としての、請求項１又は２に記載の植物材料。 ５．サトウダイコン植物に除草剤耐性を生じる方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコンの第１細胞が感受性であるイミダゾリノン除草 剤に該第１細胞を暴露させる工程と； （ｂ）除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と を含み、該耐性が第２細胞を含む植物の交雑によって伝えられることができる上 記方法。 ６．第２細胞が、ＲＥＬ−１と名付けられたサトウダイコン植物の第１細胞 から誘導される、請求項５記載の方法。 ７．第２細胞が、ＡＴＣＣ９７５３４（ＳＩＲ−１３）と名付けられた種子 として寄託されている、請求項５記載の方法。 ８．サトウダイコンに除草剤耐性を与える方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコン植物の第１細胞が感受性であるイミダゾリノン 除草剤に該第１細胞を暴露させる工程と； （ｂ）除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と； （ｃ）該第２細胞から、植物が除草剤耐性を有するように、第１植物を生長さ せる工程と； （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、除草剤耐性を有する交雑植物を作製 する工程と を含む上記方法。 ９．他のビートに除草剤耐性を与える方法であって、 （ａ）培地中でサトウダイコン植物の第１細胞が感受性であるイミダゾリノン 除草剤に該第１細胞を暴露させる工程と； （ｂ）除草剤耐性を有する第２細胞を選択する工程と； （ｃ）該第２細胞から、植物が除草剤耐性を有するように、第１植物を生長さ せる工程と； （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、除草剤耐性を有する交雑植物を作製 する工程と を含む上記方法。 １０．工程（ａ）における第１細胞が、ＲＥＬ−１と名付けられたサトウダ イコンに由来する、請求項８記載の方法。 １１．第２細胞がＡＴＣＣ９７５３４（Ｓｉｒ−１３）と名付けられた種子 として寄託されている、請求項８記載の方法。