BG64235B1

BG64235B1 - Растения на захарно цвекло, устойчиви на имидазолинов хербицид

Info

Publication number: BG64235B1
Application number: BG103075A
Authority: BG
Inventors: Donald Penner; Terry R. Wright
Original assignee: Michigan State University
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2004-06-30
Also published as: US5773702A; EP0944716A1; UA72429C2; TR199900120T2; HUP9903914A2; PL191810B1; WO1998002526A1; EP0944716A4; PT944716E; CZ14699A3; PL331176A1; CN1230218A; BG103075A; CN1109753C; EA003296B1; SK286017B6; HUP9903914A3; SK4499A3; DK0944716T3; DE69737751D1

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за получаване растения на захарно цвекло (Beta vulgaris L.), които са устойчиви на имидазолинонови хербициди, използвани за плевелен контрол. По-специално, изобретението се отнася до растения на захарно цвекло, изведени чрез селекция от възприемчиво захарно цвекло за мутация на ген, предизвикващ ацетолактатна синтаза (ALS), известна също като ацетохидроксикисела синтаза (AHAS), като се използва хербицидът с клетки в културална среда.

Предшестващо състояние на техниката

В известните решения е описано генетичното изменение на гена на ацетолактатната синтаза чрез рекомбинантни средства, както е показано в патенти на US №№ 5 013 659, 5 141 870 и 5 378 824 на Bedbrook et al. Този вид модификация в растения на захарно цвекло е показан чрез пример IV от патент 5 378 824. Резултатите са по-ниски от задоволителни при получените растения, които се отглеждат именно за хербицидна устойчивост.

Получени са различни устойчиви растения и хербициди. Saunders et al., в Crop Science 32: 1357-1360 (1992) също описват получаването на растение на захарно цвекло (CR1-B), което е устойчиво на сулфонилкарбамиди, от възприемчивия самооплождащ се клон (REL-1), чрез селекция на мутантни клетки в културална среда, съдържаща хербицида. Получени са различни устойчиви растения и хибриди. Hart et al. (Weed Sci. 40:378-383 (1992) и Wees Sci. 41:317324 (1993) по-нататък характеризират устойчивата линия и определят, че устойчивостта се дължи на променената ALS активност и показват без хибридизация устойчивост спрямо други ALS-инхибиращи хербициди и са кодирани чрез единичен, полудоминиращ ген.

Това не са публикации, описващи устойчивост на имидазолинон, получена чрез модифициране на ALS или на AHAS в растения на захарно цвекло. Различни царевични линии с такава устойчивост се развиват, както е описано в Newhouse et al. Theoretical and Applied Genetics 83: 65-70 (1991).

Технологичен начин за защита на посева е използването на “safeners”, както са описани в ЕР 375 875. Този метод въвежда друг химикал в почвата. Предпочитан метод е да се развиват растения на захарно цвекло, които са устойчиви спрямо имидазолиноновите хербициди.

Целта на изобретението е да се създаде метод за придаване на устойчивост спрямо имидазолинонови хербициди на растения на захарно цвекло чрез селекция за мутация на ген на ацетолактатна синтаза, предизвикващ устойчивост. Друга цел на изобретението е да се създадат растения на захарно цвекло, които са устойчиви на този хербицид.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 представлява схематичен вид на метода съгласно изобретението за получаване на растения на захарно цвекло, устойчиви на имидазолинон. Приети са следните означения: R = устойчивост, IM = имидазолинон, S = чувствителност, SU = сулфонилкарбамид, Sur = ALS алел, доминиращ за SU-R, TP-R и IM-S, SIR-13 = ALS алел, доминиращ за SU-S, TP-S и IM-R; ТР = триазолопиримидин, REL-1 е изходен материал за получаване на имидазолинонова устойчивост;

Фигура 2 е диаграма на потока, показващ подробно етапите при получаване на растението мутант захарно цвекло;

Фигура 3 показва графично устойчивостта на imazethapyr спрямо растения на захарно цвекло с прилагане на напръскване след поникване;

Фигура 4 показва графично устойчивостта на imazethapyr при ALS проба в клетъчна култура.

Описание на предпочитаните изпълнение

Изобретението се отнася до растителен материал от захарно цвекло, включващ мутирали клетки с мутирал ацетолактатен синтазен ген, предизвикващ синтазата, като мутиралите клетки имат устойчивост спрямо имидазолинонов хербицид и устойчивостта е предаваема чрез конвенционална хибридизация на растения, получени от клетки.

Изобретението се отнася до метод за получаване на хербицидна устойчивост при растението захарно цвекло, който включва: подлагане на първа група клетки от захарно цвекло на въздействието на имидазолинонов хербицид, спрямо който първите клетки са чувствителни в културална среда; селекция на вто ра група клетки, притежаващи хербицидна устойчивост, при което устойчивостта може да бъде предаваема чрез хибридизация на растения, съдържащи вторите клетки.

Изобретението се отнася и до метод за придаване на хербицидна устойчивост в захарно цвекло, който включва: подлагане на първа група клетки от растението захарно цвекло на въздействието на имидазолинонов хербицид спрямо който първите клетки са чувствителни в културална среда; селекция на втора група клетки, притежаващи хербицидна устойчивост, израстване на първо растение от вторите клетки, така че растението да има хербицидна устойчивост; и хибридизация на първите растения с втори растения, за да се получат кръстосани растения, които притежават хербицидна устойчивост.

Растението захарно цвекло REL-1 (Regenerating East Lansing-1) е достъпно от Dr. Joseph Saunders, Research Geneticist, U.S. Department of Agriculture, East Lansing, Michigan и беше освободено през 1987 г. То е достъпно без заплащане. REL-1 е чувствително спрямо имидазолинови (IM-S), сулфонилкарбамидни (SU-S) и триазолопиридин сулфонамидни (TP-S) хербициди, както е показано на фиг. 1.

Като се използва новообразувание (калус) над наранено място на кората и културални суспензии, беше развита хибридна линия за имидазолинонова устойчивост (M-R). Тази клетъчна линия (зародиш) е депозирана в Американската колекция за видовете култури като АТСС 97534 на 06 май 1996 г. съгласно Будапещенския договор и е отбелязана тук като Sir-13. Клетъчната линия е в наличност и може да бъде изискана по име и номер, без да се издава лиценз по депозита. Чрез размножаване с елитни линии от растението захарно цвекло, по-специално Beta vulgaris L., могат да бъдат получени растения на захарно цвекло с изключително полезна технологична устойчивост. Могат да бъдат използвани традиционни размножителни техники за пренасяне на имидазолиноновата устойчивост на други цвекла, като червени цвекла.

Устойчивостта на растения на захарно цвеклови спрямо имидазолинонови хербициди, по-специално imazethapyr, разрешава проблема с остатъка в почвата след използването на този хербицид при площи, предназначени за израстване на захарно цвекло. Обикновено това е 40-месечен период на изчакване между използването на този хербицид и бъдещото използване на това поле за израстване на растения на захарно цвекло. На второ място, високата степен на устойчивост спрямо имидазолинонов хербицид позволява използването на имидазолинон за плевелен контрол при захарни цвекла.

Следващите примери показват изолиране и размножаване на ново растение захарно цвекло (Sir-13).

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1.

1. Селекция на варианти захарно цвекло, устойчиви на имидазолинон (SIR-13)

Описание на материалите

Rel-1 (Regenerating East Lansing-1) е напълно възстановяема мъжка оплождаща линия от захарно цвекло, използвана за първоначална клетъчна селекция за хербицидно устойчив мутант спрямо имидазолинони и е използвана като чувствителен контрол за повечето експерименти.

Sir-13 Този изолат от захарно цвекло е развит чрез посев на клетки Rel-Ι върху среда, съдържаща imazethapyr. Този вариант е устойчивост на имидазолинон, но не е хибрид, устойчив на сулфонилкарбамиди.

Sir-ЗО Представителен избран изолат, който е с тенденция да бъде безплоден. Това е резултат от отклонение от клетъчно културалните процедури.

А. Избират се растения като източник на материали за сомаклонална селекция, базирана на тяхната способност да създадат новообразувание над нараненото място на кората (калус) при силно изразени цитокининови условия (в среда В1) и да възстановяват пускането на пъпки от новообразуванието.

Протокол за среда В1:
30 g L-	захароза
100 mg L-‘	мио-инозитол
1,65 gL-'	NH₄NO₃
1,90 g L·¹	KNO₃
0,44 g L-¹	CaCl₂.2H₂O
0,37 g L¹	MgSO₄.7H₂O
0,17 g L >	KH₂PO₄
6,2 mg L’¹	H₃BO₃
16,8 mg L-‘	MnSO₄.H₂O
10,6 mg L’¹	ZnSO₄.7H₂O
0,88 mg L‘‘	KI

0,25 mg L-' Na₂MoO₄.2H₂O

0,025 mg L-' CuSO₄.5H₂O

0,025 mg L-¹ CoCl_r6H₂O

37,3 mg L-‘ Na₂EDTA

27,8 mg L·' FeSO₄.7H₂O mg L'¹ тиамин

0,5 mg L·¹ пиридоксин

0,5 mg L·¹ никотинова киселина mg L·¹ бензиламинопурин pH 5,95

Твърдата среда Bl се автоклавира c 9 g L'¹ растителен културален arap и се модифицират със стерилизиран филтър разтворите от хербициден материал, както е необходимо за селекционната схема. Агаровата среда се отлива в пластмасови блюда Петри с размери 15 х 100 mm. Течна среда В1 се добавя към 40 ml аликвотни части в 125 ml ерленмайерови колби и се обработва в автоклав, за да се използва в течните културални суспензии.

При селекция на вариант, устойчив на имидазолинон Sir-13, материалният източник е Rel-Ι.

b. За селекция на вариант, устойчив на имидазолинон, се следва процедурата, както е показана на фиг. 2.

Кръгове от листа от ексрастения се приготвят от бързо експандирани листа от растителния източник. Листата се стерилизират по повърхността (етап 1) чрез две последователни 20-минутни промивки с15% търговско избелващо средство плюс 0,025% Triton Х-100 (Т-9284, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Листата се промиват двукратно със стерилна дейонизирана вода. Кръговете от листа се нарязват, като се използва стерилизиран на пламък тапопробивач #3.

Кръговете от листа се поставят асептично върху твърдата среда В1 (етап 2) и се инкубират на тъмно при 30°С за 4 до 8 седмици, докато ронлива, бяла, новообразувана тъкан пролиферира от листния кръг. Новообразуваната тъкан се отделя механично с пинсета и след това се прехвърля в 125 милилитровите ерленмайерови колби (етап 3), съдържащи 40 ml течна среда В1. Колбите се поставят върху ротационен вибратор при 50 Hz при нисък интензитет на флуоресцентно осветление (30 E/m²s). Течните култури се субкултивират с прясна среда В1 след 1 седмица.

Две седмици след иницииране на течната култура, клетъчните новообразувания се отделят, като се използва клетъчно дисоциационно сито (Sigma CD-I) с решето 60 mesh. Отделя се приблизително дву-трикратен обем от течната среда, последвано от клетъчна седиментаиия. В етап 4 клетките ресуспендират в оставащата среда 1 ml аликвотна част се разстила равномерно върху твърдата среда В1, допълнена с 50 пМ хербицид imazethapyr (PURSUIT, American Cyanamid), Waine, NJ). Платата се опаковат и инкубират при слаба флуоресцентна светлина (5-10 μ E/m²s) за 8-12 седмици.

c. При концентрация 50 пМ imazethapyr всички чувствителни клетки умират. Клетъчните новообразувания, които преживяват и израстват при тази концентрация, са идентифицирани като възможни устойчиви варианти. В етап 5 тези клетъчни групи (1 -3 mm в диаметър) се прехвърлят в прясна твърда среда В1 без хербицид и се оставят да растат при слаба светлина (10-20 μ E/m²s). Всеки устойчив вариант се идентифицира индивидуално и се съхранява отделно.

d. В етап 6 бялото ронливо новообразувание се подразделя всеки 4-6 седмици върху прясна твърда среда В1, докато от новообразуванието израстат индивидуални пъпки (пъпка). Тези пъпки се пренасят върху поддържаща среда ; за пускане на пъпки (М20), както следва:

Протокол за среда М20:

30 g L *	захароза
100 mg L^_l	мио-инозитол
1,65 g L¹	NH₄NO₃
1,90 g L¹	KNO₃
0,44 g L ¹	CaCl₂.2H₂O
0,37 g L ¹	MgSO₄.7H₂O
0,17 g L ¹	KH₂PO₄
6,2 mg L-¹	H₃BO₃
16,8 mg L ‘	MnSO₄.H₂O
10,6 mg L¹	ZnSO₄.7H₂O
0,88 mg L’¹	KI
0,25 mg L’¹	Na₂MoO₄.2H₂O
0,025 mg L-‘	CuSO₄.5H₂O
0,025 mg L-¹	CoC1₂.6H₂O
37,3 mg L-‘	NajEDTA
27,8 mg L’¹	FeSO₄.7H₂O
1 mg L’¹	тиамин
0,5 mg L·¹	пиридоксин
0,5 mg L’¹	никотинова киселина
3 mg L'¹pH 5,95	бензиламинопурин

Твърдата среда М20 се автоклавира с 9 g L·¹ растителен културален агар и се модифицират със стерилизиран филтър разтворите от хербициден материал, както е необходимо за селекционната схема, Агаровата среда се отлива в пластмасови блюда Петри с размери 20 х 100 mm.

За да пускат пъпки, културите се държат под флуоресцентно осветление 10-20 μ E/m^{1 2 3}s и 5 се размножават чрез дисекция на културите, пуснали пъпки, със скалпел за листа. Потенциалните култури за пускане на пъпки се размножават и оценяват за ниво на устойчивост, както е описано по-долу. 10

2. Ниво на имидазолинонова устойчивост при култура, пуснала пъпка.

В етап 7 културите, пуснали пъпки, се оценяват за хербицидна устойчивост чрез разполагане на три малки, последователно номе- 15 рирани, пуснали пъпки калеми, като върху всеки се посява среда М20, допълнена с логаритмично нарастващи концентрации на хербицида imazethapyr, вариращи от 1 пМ до 0,1 тМ. Чувствителната култура Sir-13 се сравнява 20 спрямо тези култури, които са пуснали пъпки, за контрол на чувствителността (Rel-Ι). Пус налите пъпки култури се държат при светлина с интензивност 20 μ E/m²s при 25°С за 3 седмици. Чувствителността на културата, която е пуснала пъпки, се определя чрез оценка на увредената пусната пъпка и новото тегло 3 седмици след прехвърляне в селективна среда. Размерът на хербицидната устойчивост се определя чрез съотношението на устойчивост към стойностите на чувствителност I_J0 (хербицидната концентрация, причиняваща50% увреждане).

Характеристиките на устойчивост на хибрида за всеки вариант се определят по горния начин чрез заместване на хербицида, използван в средата. В култура Sir-13, която е пуснала пъпка, е показано при извиване 220, ниво на устойчивост спрямо хербицида imazethapyr и не е показана устойчивост на хибрида спрямо хербицида сулфонилкарбамид, хлорсулфурон, или хербицида триазолпиримидин сулфонанилид, флуметсулам, както е показано в таблица 1.

Таблица 1.

Размер на културата, пуснала пъпка, устойчивост на ALS и устойчивост на хибрида

Клон	Imazethapyr	Imazamethabenz	Imazaquin	АС299.263¹	CHorsulfuron²	Humetsulam*
Rel-1	Култура c пъпка b ALSIso	18 nM 2.7 μΜ	8COnM 430 пМ (киселиа)	40 пМ	30 ПМ	2.5 пМ 10 пМ	28 пМ 150 пМ
Sir- 13	Култура c пъпка Iso	3,9 μΜ	>100 μΜ	3 μΜ	3,5 μΜ	3,0 ПМ	20 ПМ
	R/S⁴ ALS iso⁵ R/S	220X 400 μΜ 150X	>125 X	75 X	120Х	I X II ПМ	1 X

¹ - Имидазолинон (American Cyanamid, Waine, NJ) ² - Сулфонилкарбамид = Glean (Duporr, Wilmington, DE) ³ - Триазолопиримидин сулфонамид (BROADSTRIKE, Dow Elanco, Indianapolis, IN) ⁴ - R/S = съотношение на устойчивост към стойността I_J0 при контрола за чувствителност за специфичния хербицид, който ще бъде изследван ⁵ - I_J0 е концентрацията на хербицида, необходим за да причини 50% увреждане на културата, пуснала пъпка

3. Генериране и размножаване на расте- нията.

В етап 8 културите, пуснали пъпки от Sir-13, се регенерират до цели растения по следния начин. Следващите две седмици субкултурата пуска пъпки. Sir-13 пуснали пъпки се прехвърлят в 125 ml ерленмайерови колби, съдържащи 40 ml вкореняваща среда N 3.

Протокол за среда N 3:

g L¹

100 mg L·'

1,65 g L'¹

1,90 g L ‘

0,44 g L¹

0,37 g L

0,17 g Lзахароза мио-инозитол NH₄NO₃KNO₃CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O KH₂PO₄

6,2 mg L'¹	H₃BO₃
16,8 mg L·¹	MnSO₄.H₂O
10,6 mg L·¹	ZnSO₄.7H₂O
0,88 mg L·'	KI
0,25 mg L’¹	Na₂MoO₄.2H₂O	5
0,025 mg L·¹	CuSO₄.5H,O
0,025 mg L'¹	CoC1₂.6H,O
37,3 mg L·¹	Na,EDTA
27,8 mg L·¹	FeSO₄.7H₂O
1 mg L·¹	тиамин	10
0,5 mg L’¹	пиридоксин
0,5 mg L·'	никотинова киселина
3 mg L ‘	нафтален оцетна киселина
pH 5,95		15

Среда N3 се добавя към 40 ml аликвотни части в 125 ml ерленмайерови колби, към всяка колба се добавят 9 g L¹ arap (0,45 g) и се обработва в автоклав, за да се използва при вкореняване на култури, пуснали пъпки. След 20 това културите се прехвърлят за 24 h на дневна светлина при средна интензивност (40/60 μ E/m²s) при 25’С. Обикновено корени се образуват 6/8 седмици след това.

В етап 9 вкоренените растения пускат 25 пъпки (генерация R_o) и след това се прехвърлят в заливаща смес Baccto (Michigan Peat Co., Houston, TX) в оранжерия. В етап 10 растенията R_o на Sir-13 се кръстосват със захарно цвек ло с гладък корен, означено 293. Зародиш R! от тези хибриди се самоопрашва, за да се получи зародиш F₂. Това предполага, че имидазолиноновата устойчивост е доминираща или полудоминираща моногенна характерна черта. Растения от поколение F₂ биха могли да се разделят в съотношение 1 хомозиготно устойчиво : 2 хибридно устойчиви : 1 хомозиготно чувствително, за имидазолинонова устойчивост.

Това съотношение беше изследвано чрез тестване на потомство от всяко от растенията F₂. За Sir-13 растенията F₂ се оставят да се самоопрашват и семената от всяко растение се събират отделно. Това потомство се засажда в оранжерията и полето се пръска на етап 2-4 листа с 1/4Х, като се прилага следната норма: хербицид imazethapyr (PURSUIT) (0,0625 lb ai/A + 1 qt/A Sunlt-II (AGSCO Fargo) + 1 qt/A 28% UAN (карбамиден амониев нитрат). Това съотношение се пренебрегва за растения, които имат едно или две копия от Sir-13 алел от чувствителни растения.

Всяка от фамилиите Sir-13 се категоризира за хомозиготна устойчивост, хибридна устойчивост или хомозиготна чувствителност, базирани на теста за разделяне на потомството. Резултатите ясно показват, че разделянето на Sir13 F₂ става при съотношение 1:2:1 за съответните категории, както е показано в таблица 2.

Таблица 2.

Родителско обозначение	Разделяне на потомство Съотношение	Номер на F_z родители
Хомозигозна устойчивост	All R	12
Хибридна устойчивост	3R : IS	35
Хомозигозна чувствителност	AIIS	15

Тези резултати показват, че Sir-13 е моногенна доминираща черта. Степента на доминиране или полудоминиране не е определена с данни.

4. Имидазолинонова устойчивост на цяло растение

Хомозиготни (неразделящи се) Sir-13 растения се самоопрашват, за да се получат хомозиготни Sir-13 F₃ семена. Клонове Rel-Ι се оставят да се самоопрашват, за да се получат чувствителни семена S,. Семената се засаждат в смес Baccto и се съхраняват в буркани в оранжерията и се разреждат до едно растение 45 в буркан 14 дни след засаждане. Растенията се напръскват на етап 4-6 листа с 0, 0,26, 1,1, 4,4, 17,5, 70 или 280 g активен компонент/ha imazethapyr (PIRSUIT) или АС 299 263 (RAPTOR). Всички обработки се прила50 гат в обем 239 L/ha и включват следните адитиви за пръскане: Sunlt-II при 1 % обемен и 28% UAN при 1% об. Всяко обработване се възпроизвежда четири пъти. Теглата на свежо пуснатите пъпки се определят 20 дни след обработване. Sir-13 и откликналите чувствителни цвекла са показани на фиг. 3. Хомозиготните Sir-13 показват устойчивост на извиване 120 и 90 съответно спрямо imazethapyr и АС 299 263.

5. Ензимен отговор на обекта ALS спрямо imazethapyr

Използват се стандартни процедури, за да се пречистят частично ALS от бързо образуващите се листа при растения на захарно цвекло, растящи в оранжерия (Hart, et al., Weed Science 40:378-383 (1992)). Екстракти от xoмозиготни растения Sir-13 F₃ и семена Rel-1 S_|се анализират за ALS активност в присъствието на логаритмично увеличаващи се концентрации на imazethapyr. ALS активността се определя от екстракти на листа на линии REL-1 и Sir-13 от захарно цвекло. Растенията растат в оранжерията, както е описано по-горе, до етап от четири до шест листа. ALS активност на свежи екстракти се определя в присъствието на imazethapyr при логаритмично нарастващи концентрации. Използваните методи и процедури са модифицирани чрез схема, предложена от Ray (Plant Physiol. 75: 827-831 (1984)) и Shaner, et al., (Plant Physiol. 76: 545-546 (1984)). 10 g листа от захарно цвекло се хомогенизират в 40 ml студен буфер за хомогенизиране (0,1 М К₂НРО₄, pH 7,5, 1 тМ натриева сол на пирогроздена киселина, 0,5 тМ MgCl₂, 0,5 тМ тиаминов пирофосфат, 10 μ М флавин аденинов динуклеотид, 10% об. глицерол) плюс 2,5 g поливинилполипиролидон. Хомогенатът се филтрува през осем слоя марля и се центрофугира при 27,000 g за 20 min. Супернатантата се отстранява и се довежда до 50% насищане с (NH4)₂SO₄. Този разтвор се държи при 0°С за 1 h, след това се центрофугира при 18,000 g за 15 min, гранулатът се разтваря отново в 1 mL ресуспензионен буфер (0,1 М К₂НРО₄, pH 7,5, 20 тМ натриева сол на пирогроздена киселина, 0,5 mM MgCl₂) и се обезсолява в колона върху Sephadex G-25 PD-10 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). Ензимните екстракти се анализират незабавно.

ALS активността се измерва чрез добавяне на 0,2 mL ензимен препарат (разреден 3:1 с ресуспензионен буфер) към 1,3 mL реакционен буфер (25 mM К₂НРО₄ pH 7,0, 0,625 тМ MgCl₂, 25 тМ натриева сол на пирогроздена киселина, 0,625 тМ тиаминов пирофос фат, 1,25 μ М флавин аденинов динуклеотид) и се инкубира при 35°С за 1 h. Реакционните смеси съдържат крайна концентрация 0, 4, 40, 400, 4000, 40000, 400000 или 4000000 пМ imazethapyr или 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000, 90000 пМ chiorsulfuron. Реакцията се спира чрез добавяне на 50 μ L 6Ν H₂SO₄ и се инкубира при 60°С за 15 min. Тази процедура, както е описана от Westerfield (J. Biol. Chem., 16: 495-502 (1945)) декарбоксилира ALS ензимния продукт ацетолактат, за да се образува ацетоин. Оцветен ацетоинов комплекс се образува чрез добавяне на 1 mL 2,5% тегл. α-нафтол и 0,25% тегл. креатин в 2,5 N NaOH и инкубиране при 60°С за 15 min.

Пазарен ацетоин се използва като стандарт за колориметричната реакция. Ацетоинови концентрати се определят чрез измерване на абсорбцията на реакционния разтвор при 530 nm. Експериментите с всеки хербицид се повтарят с трикратни възпроизвеждания при всеки. Протеинови концентрати на екстрактите се определят по метода на Bradford (Anal. Biochem. 72: 248-254 (1997)), като се използва волски серумен албумин за стандартната крива.

Експерименти се провеждат два пъти и обработките се възпроизвеждат три пъти. Фигура 4 показва чувствителност на ALS екстракти от Sir-13, хомозигот и чувствителните Rel-1. Sir-13 показва при ниво на извиване 150 устойчивост спрямо imazethapyr при ензимното ниво (както е определено чрез съотношението на 1₃₀за устойчивостта и чувствителните линии). Фигура 3 показва 44 пъти повече устойчивост за цялото растение, както е показано по-горе.

6. Количество на ALS гениите копия

Провежда се Souther blot анализ, за да се определи броят на ALS гениите копия, присъстващи в чувствително захарно цвекло. Геномна DNA се изолира от чувствителни F₃ растения, произлизащи от оригиналния мутант Sir-13, и се анализира, като се използват обикновени техники от практиката (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY (1991)). Също беше анализирана геномна DNA от разнообразни серийни линии захарно цвекло. В двете линии захарно цвекло беше открито единствено копие от ALS гена. Тези данни показват, че цялата ALS ензимна активност на хомозиготния мутант вид захарно цвекло би могла да се състои в устойчивостта на ензимната форма.

7, ALS генна мутация

За да се определи молекулната база за ензимната устойчивост на ALS, се използват стандартни техники спрямо последователност от два региона на ALS гена, където се среща цялата предварително съобщена хербицидна устойчивост на мутациите (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY (1991)). Захарно цвекловия ALS ген предварително се разрежда (патент US 5 378 824) и праймерите на полинеразната верижна реакция (PCR) се означават, за да се разширят двата региона на гена, отговорен за предварително съобщените случаи на хербицидна устойчивост на растенията. Сравнение на данни за последователност от устойчиви (Sir-13) и чувствителни (Rel-1) захарни цвекла показва единствена нуклеотидна промяна от гуанин на аденин при позиция 337 в нуклеотидната последователност, която дава отражение в треонина за аланиновото заместване при 113 в аминокиселата последователност на захарното цвекло ALS. Този сайт предварително се въвлича при имидазолинонова устойчивост при репей (Bernasconi et al., J. Biol. Chem. 270: 1738117385 (1995)) и за сулфонилкарбамидна устойчивост при дрожди (патент US 5 378 824). Не са наблюдавани други базисни промени от дивия тип нуклеотидна последователност в двата региона на изследвания ALS ген.

Описанието пояснява изобретението, без да го ограничава.

Claims

Патентни претенции

1. Растителен материал от захарно цвекло, включващ мутирали клетки с мутирал ацетолактатен синтазен ген, кодиращ синтазата, при който нуклеотид се модифицира от гуанин в аденин при позиция 337, при което мутиралите клетки имат устойчивост спрямо имидазолинонов хербицид, а устойчивостта се предава по наследство чрез известна хибридизация на растения, получени от клетките, които клетки са възстановяеми до растения.
2. Материал съгласно претенция 1, който е модифициран от чувствителни клетки на родителско растение захарно цвекло, означено като REL-1 и депозирано като АТСС 97885, не проявяващо устойчивост спрямо хербицида, чрез култивиране на чувствителни клетки в културална среда с хербицида, който материал е избран за мутиралите клетки.
3. Материал съгласно претенция 1, депозиран като зародиш, означен като АТСС 97534 (Sir-13).
4. Материал съгласно претенция 1, като зародиш или плод на зародиш.
5. Метод за предизвикване на хербицидна устойчивост в растение на захарно цвекло, характеризиращ се с това, че включва:

a) излагане първо на клетки от захарното цвекло на имидазолинонов хербицид, към който първите клетки са чувствителни в културална среда;

b) подбор на втори клетки, проявяващи хербицидна устойчивост с мутирал ацетолактатен синтазен ген, кодиращ синтазата, при което нуклеотид се модифицира от гуанин в аденин при позиция 337, а устойчивостта може да бъде предавана чрез кръстосано размножаване на растения, съдържащи вторите клетки.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че вторите клетки са модифицирани от първите клетки на растение на захарно цвекло, означено като REL-1 и депозирано като АТСС 97885.
7. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че вторите клетки са депозирани като зародиш, означен като АТСС 97534 (SIR-13).
8. Метод за придаване на хербицидна устойчивост в захарно цвекло, характеризиращ се с това, че включва:

а) излагане на първи клетки от растение на захарно цвекло на имидазолинонов хербицид, към който първите клетки са чувствителни в културална среда;

d) подбор на втори клетки, проявяващи хербицидна устойчивост;

c) култивиране на първо растение от вторите клетки, така че растението да проявява хербицидна устойчивост с мутирал ацетолактатен синтазен ген, кодиращ синтазата, като нуклеотид се модифицира от гуанин в аденин при позиция 337;

d) хибридизация на първите растения с втори растения, за да се получат хибридни растения, които проявяват хербицидна устойчивост.
9. Метод за придаване на хербицидна устойчивост на друго цвекло, характеризиращо се с това, че включва:

а) излагане на първи клетки от растение на захарно цвекло на имидазолинонов хербицид, към който първите клетки са чувстви телни в културална среда;

b) подбор на втори клетки, проявяващи хербицидна устойчивост;

c) култивиране на първо растение от вторите клетки, така че растението да проявява хербицидна устойчивост с мутирал ацетолактазен синтазен ген, кодиращ синтазата, като нуклеотид се модифицира от гуанин в аденин при позиция 337;

d) хибридизация на първите растения с втори растения, за да се получат хибридни растения, които проявяват хербицидна устойчивост.
10. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че първите клетки в етап (а) са модифицирани от захарно цвекло, означено като REL-1 и депозирани като АТСС 97885.
11. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че вторите клетки са депозирани като зародиш, означен като АТСС 97534 (SIR-13).
12. Метод за контролиране на плевели, израстващи с растения на захарно цвекло, характеризиращ се с това, че включва:

a) засаждане в поле с цвекло на семена, съдържащи клетки с мутирал ацетолактатен синтазен ген, кодиращ синтазата, при което нуклеотид се модифицира от гуанин в аденин при позиция 337, а мутиралите клетки проявяват устойчивост спрямо имидазолинонови хербициди, а устойчивостта се предава чрез известно кръстосване на растения, получени от клетките, за да се получи растение на захарно цвекло.

b) използване на имидазолинонов хербицид върху растението в полето за контрол на плевели.
13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че растението е модифицирано от чувствителни клетки на родителско растение на захарно цвекло, означено като REL-1 и депозирано като АТСС 97885 и не проявяващо устойчивост на имидазолинонови хербициди, чрез култивиране на чувствителните клетки в културална среда с имидазолинонов хербицид, избран за мутиралите клетки.
14. Метод съгласно претенция 12, при който растението е модифицирано от зародиш, депозиран като АТСС 97534 (SIR-13).