JP4874323B2 - A群連鎖球菌およびb群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、細菌Streptococcus agalactiae(GBS)および
Streptococcus pyogenes(GAS)由来の核酸およびタンパク質
に関する。
かつてはウシのみに感染すると考えられていたグラム陽性細菌Streptococc
us agalactiae(または「B群streptococcus」、「GBS」
と省略される)は、現在、免疫無防備の個体および新生児において重篤な疾患(菌血症お
よび髄膜炎)を引き起こすことが知られている。2つの型の新生児感染が存在する。第1
の感染(初期の発症、通常生後5日以内)は、菌血症および肺炎によって明らかになる。
これは、赤ん坊が産道を通過するときに、感染する。GBSは、若い女性の約25%の膣
でコロニーを形成し、コロニーを形成した母親の膣出産を介して産まれる幼児の約1%が
、感染するようになる。致死率は、50〜70%の間である。第2の感染は、生後10〜
60日で生じる髄膜炎である。妊娠した女性は、幼児が受動的に免疫されるようにIII
型カプセルでワクチン接種される場合、後期発症髄膜炎の発病率は低下するが、完全に排
除されるわけではない。
り、C炭水化物と呼ばれる炭水化物の抗原性に基づく分類である。ランスフィールドは、
血清学的に識別され得る13個の型のC炭水化物(A〜Oと称される)を同定した。最も
一般的にヒトに感染する生物は、A群、B群、D群およびG群に見出される。B群におい
て、その系統は、それらの多糖カプセルの構造に基づいて8つの血清型に分けられ得る(
Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、およびVI)。
るヒト病原体であり、疾患の徴候なしに5〜15%の間の正常な個体に存在すると概算さ
れる。しかし、宿主防御が欠損した場合、または生物がその毒性を発揮し得る場合、また
はその生物が脆弱な組織もしくは宿主に導入される場合、急性感染が生じる。疾患として
は、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌性ト
キシックショック症候群が挙げられる。
lactiaeは、抗生物質によって阻害されるが、GASほど簡単にペニシリンによっ
て死なない。従って、予防的なワクチン接種が好ましい。
与えない。抗イデオタイプ手法もまた使用されている(例えば、WO99/54457)
。しかし、S.agalactiae感染に対する有効な成体用のワクチンに対する必要
性が残っている。S.pyogenes感染に対するワクチンの必要性もまた、残ってい
る。
である。これらのタンパク質はまた、診断目的のため、そして抗生物質に対する標的とし
て有用であり得る。
有する。
メントを含むタンパク質を提供する。
は完全ヒト抗体である。
フラグメントを含む核酸分子を提供する。
を含む。
有するヌクレオチド配列を含む。
分子にハイブリダイズし得る。
を提供する。
組成物である。
eおよびS.pyogenesによって引き起こされる感染または疾患の処置または予防
のための医薬の製造において使用される。
患者に、治療的有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
て表されるハイブリッドタンパク質を提供し、ここで、Xが、上で規定されるアミノ酸配
列であり、Lが、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Aが、任意のN末端アミノ酸配列
であり、Bが、任意のC末端アミノ酸配列であり、そしてnが1より大きい整数である。
ンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットを提供し、該キットは、第1プ
ライマーおよび第2プライマーを含み、ここで、該第1プライマーが該テンプレート配列
に対して実質的に相補的であり、そして該第2プライマーが、該テンプレート配列の相補
体に対して実質的に相補的であり、ここで、実質的な相補性を有する該プライマーの部分
が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定する。
に含まれるStreptococcusテンプレート核酸配列の増幅を可能にする第1単
鎖オリゴヌクレオチドおよび第2単鎖オリゴヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで
、(a)該第1オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列に実質的に相補的である
プライマー配列を含み;(b)該第2オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列の
相補体に実質的に相補的であるプライマー配列を含み;(c)該第1オリゴヌクレオチド
および/または該第2オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸に相補的でない配列を
含み、そして(d)該プライマー配列が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定す
る。
列が、制限部位および/またはプロモーター配列を含む。
ンピューター読み取り可能な媒体を提供する。
usを検出するための方法を提供し、該方法が、上記の核酸を、ハイブリダイゼーション
条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程を包含する。
る方法を提供し、該方法が、試験化合物を、上記のタンパク質に接触させる工程、および
該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する。
よび以下の抗原:
Helicobacter pylori由来のタンパク質抗原;
N.meningitidis血清型B由来のタンパク質抗原;
N.meningitidis血清型B由来の外膜小胞(OMV)調製物;
N.meningitidis血清型A、C、W135および/またはY由来のサッカ
リド抗原;
Streptococcus pneumoniae由来のサッカリド抗原;
A型肝炎ウイルス由来の抗原;
B型肝炎ウイルス由来の抗原;
C型肝炎ウイルス由来の抗原;
Bordetella pertussis由来の抗原;
ジフテリア抗原;
破傷風抗原;
Haemophilus influenzae B.由来のサッカリド抗原;
N.gonorrhoeae由来の抗原;
Chlamydia pneumoniae由来の抗原;
Chlamydia trachomatis由来の抗原;
Porphyromonas gingivalis由来の抗原;
ポリオ抗原;
狂犬病抗原;
麻疹、おたふくかぜおよび/または風疹抗原;
インフルエンザ抗原;
Moraxella catarrhalis由来の抗原;ならびに/あるいは
Staphylococcus aureus由来の抗原、
のうちの1つ以上を含む。
、各タンパク質が、上記のタンパク質である。
本発明は、実施例に開示されるS.agalactiaeアミノ酸配列を含むタンパク
質、および実施例に開示されるS.pyogenesアミノ酸配列を含むタンパク質を提
供する。これらのアミノ酸配列は、配列番号1と10960との間の偶数である。
るアミノ酸配列を含むタンパク質、および実施例に開示されるS.pyogenesアミ
ノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、提供される
。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは、50%よりも高い(例えば
、60%、70%、80%、90%、95%、99%またはそれよりも上)。これらのタ
ンパク質は、ホモログ、オルソログ(ortholog)、対立遺伝子改変体および機能
的変異体を含む。代表的に、2つのタンパク質間の50%以上の同一性が、機能的等価物
の指標であるとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、ギャップオープンペ
ナルティ=12およびギャップエクステンションペナルティ=1を用いたアフィンギャッ
プ検索を使用して、MPSRCHプログラム(Oxford Molecular)にお
いて実行されるように、Smith−Watermanホモロジー検索アルゴリズムによ
って決定される。
)。
メントを含むタンパク質、および実施例に開示されるS.pyogenesアミノ酸配列
のフラグメントを含むタンパク質を提供する。これらのフラグメントは、特定の配列に依
存して、これらの配列から少なくともn個連続するアミノ酸配列を含むべきである(nは
7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、
70、80、90、100またはそれよりも上)である)。好ましくは、これらのフラグ
メントは、これらの配列の1つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、
(a)実施例に開示されるタンパク質のN末端シグナルペプチド、(b)実施例に開示さ
れるが、それらのN末端シグナルペプチドを有さないタンパク質、(c)実施例に開示さ
れる関連するGASタンパク質およびGBSタンパク質に共通するフラグメント、ならび
に(d)実施例に開示されるが、N末端アミノ酸残基を有さない、タンパク質である。
からの精製、化学合成など)によって、そして種々の形態で(例えば、ネイティブ、融合
、グリコシル化、非グリコシル化など)調製され得る。これらは好ましくは、実質的に純
粋な形態で調製されるか(すなわち、実質的に他のstreptococcalタンパク
質または宿主細胞タンパク質を含まない)、または実質的に単離された形態である。本発
明のタンパク質は、好ましくは、streptococcalタンパク質である。
れらは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得、そして任意の適切な
手段(例えば、組換え発現)によって産生され得る。ヒト免疫系との適合性を増大するた
めに、抗体はキメラであり得るか、もしくはヒト化され得るか(例えば、Breedve
ld(2000)Lancet 355(9205):735−740;Gorman
& Clark(1990)Semin.Immunol.2:457−466)、また
は完全なヒト抗体が使用され得る。抗体は、検出可能な標識(例えば、診断アッセイのた
めに)を含み得る。
レオチド配列を含む核酸、および実施例に開示されるS.pyogenesヌクレオチド
配列を含む核酸を提供する。これらの核酸配列は、配列番号1と10966との間の奇数
である。
配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、および実施例に開示されるS.pyo
genesヌクレオチド配列に配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供す
る。配列間の同一性は、好ましくは、上記のようなSmith−Watermanホモロ
ジー検索アルゴリズムによって決定される。
×SSC、0.5% SDS溶液中で65℃)で、実施例に開示されるS.agalac
tiae核酸にハイブリダイズし得る核酸、および実施例に開示されるS.pyogen
es核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
存して、S.agalactiae配列またはS.pyogenes配列から少なくとも
n個連続するヌクレオチドを含むべきである(nは10以上(例えば、12、14、15
、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、15
0、200またはそれよりも上)である)。このフラグメントは、実施例に開示されるG
AS配列およびGBS配列に共通する配列を含み得る。
をコードする核酸を提供する。
配列番号10967に配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;配列番号109
67にハイブリダイズし得る(好ましくは「高いストリンジェンシー」の条件下で)核酸
;配列番号10967からの少なくともn個連続するヌクレオチドのフラグメントを含む
核酸(ここでnは10以上(例えば、12、14、15、18、20、25、30、35
、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、3
50、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500
、2000、3000、4000、5000、10000、100000、100000
0またはそれよりも上)である)。
ザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」)、および増幅反応
(例えば、PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBAなど)、および他の
核酸技術に使用され得る。
れるべきである(例えば、アンチセンスもしくはプローブ(probing)のために、
またはプライマーとしての使用のために)。
リーからもしくはcDNAライブラリーから、生物自体から、など)で調製され得、そし
て種々の形態をとり得る(例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、
標識化など)。核酸は、好ましくは実質的に単離された形態である。
は特に、核酸が核酸検出技術に使用されるべき場合(例えば、核酸が、PCR、LCR、
TMA、NASBAなどのような技術における使用ための、プライマーまたはプローブで
ある場合)に有用である。
(例えば、改変骨格を含むDNAおよびRNA)およびまたペプチド核酸(PNA)など
も含む。
、クローニングベクターまたは発現ベクター)、およびこのようなベクターで形質転換さ
れた宿主細胞を提供する。
酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、免疫原性組成物として(例えば
、診断試薬としてまたはワクチンとして)適切であり得る。
断試薬としての使用のための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。
(i)streptococcusによって引き起こされる疾患および/または感染を処
置または予防するための医薬;(ii)streptococcusまたはstrept
ococcusに対して惹起される抗体の存在を検出するために診断試薬;および/ある
いは(iii)streptococcusに対する抗体を惹起し得る試薬の製造におけ
る、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用もまた、提供される。上記のst
reptococcusは、任意の種、群、または系統であり得るが、好ましくはS.a
galactiae(特に血清型IIIまたはV)、またはS.pyogenesである
。この疾患は、菌血症、髄膜炎、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎
、筋炎、およびトキシックショック症候群であり得る。
および/または抗体の治療有効量をこの患者に投与する工程を包含する。この患者は、そ
れ自体が疾患の危険性があり得るか、または妊娠女性のいずれかであり得る(「母体免疫
」、例えば、Glezen & Alpers(1999)Clin.Infect.D
is.28.219−224)。
生児または妊娠女性に対して有用である。この方法は、代表的に、ヒト化されるかまたは
完全なヒトのものであるモノクローナル抗体を使用する。
.agalactiae)核酸配列内に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマー(
例えば、PCRプライマー)を含むキットを提供し、このキットは、第1のプライマーお
よび第2のプライマーを含み、ここで、この第1のプライマーは、この鋳型配列に実質的
に相補的であり、そして第2のプライマーは、この鋳型配列の相補体に実質的に相補的で
あり、ここで、実質的な相補性を有するこれらのプライマーの対が、増幅される鋳型配列
の末端を規定する。第1のプライマーおよび/または第2のプライマーは、検出可能な標
識(例えば、蛍光標識)を含み得る。
reptococcus鋳型核酸配列の増幅を可能にする、第1の一本鎖オリゴヌクレオ
チドヌおよび第2の一本鎖オリゴヌクレオチドヌを含むキットを提供し、ここで、:(a
)この第1のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列に実質的に相補的であるプライマ
ー配列を含み;(b)この第2のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列の相補体に実
質的に相補的であるプライマー配列を含み;(c)この第1のオリゴヌクレオチドおよび
/または第2のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸に相補的ではない配列を含み;そし
て(d)これらのプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を規定する。特徴(c)
の非相補的配列は、好ましくは、これらのプライマー配列の上流(すなわち、5’側)で
ある。これらの(c)配列のうちの一方または両方が、制限部位(例えば、EP−B−0
509612)またはプロモーター配列(例えば、EP−B−0505012)を含み得
る。第1のオリゴヌクレオチドおよび/または第2のオリゴヌクレオチドは、検出可能な
標識(例えば、蛍光標識)を含み得る。
えば、鋳型配列は、rRNA遺伝子(例えば、Turenneら(2000)J.Cli
n.Microbiol.38:513−520;本明細書中の配列番号12018−1
2024)、またはタンパク質コード遺伝子であり得る。鋳型配列は、好ましくはGBS
に特異的である。
)ディスク、ハードディスク、CD−ROM、DVDなど)および/または配列表中の1
つ以上の配列を含むコンピューターデータベースを提供する。この媒体は、好ましくは配
列番号10967を含む。
ブリッドタンパク質を提供し、ここで、Xは、本発明のタンパク質であり、Lは、任意の
リンカーアミノ酸配列であり、Aは、任意のN末端アミノ酸配列であり、Bは、任意のC
末端アミノ酸配列であり、そしてnは、1より大きい整数である。nの値は、2とxとの
間であり、そしてxの値は、代表的に3、4、5、6、7、8、9または10である。好
ましくは、nは、2、3または4であり;より好ましくは2または3であり;最も好まし
くはnは2である。各nの例について、−X−は、同じであっても異なってもよい。[−
X−L−]の各nの例について、リンカーアミノ酸配列−L−は、存在しても存在しなく
てもよい。例えば、nが2の場合、このハイブリッドは、NH2−X1−L1−X2−L
2−COOH、NH2−X1−X2−COOH、NH2−X1−L1−X2−COOH、
NH2−X1−X2−L2−COOHなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−L−は、
代表的に短い(例えば、20以下のアミノ酸、すなわち、19、18、17、16、15
、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1アミノ酸)。例
としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー(すな
わち、Glyn(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより
大きい))、およびヒスチジンタグ(すなわち、Hisn(ここで、nは、3、4、5、
6、7、8、9、10またはそれより大きい))が挙げられる。他の適切なリンカーアミ
ノ酸配列は、当業者に明らかである。−A−および−B−は、任意の配列であり、この配
列は、代表的に短い(例えば、40以下のアミノ酸、すなわち39、38、37、36、
35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、2
2、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、
8、7、6、5、4、3、2、1アミノ酸)。例としては、タンパク質輸送を指向するた
めのリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を用意にする短いペプチド配列(例
えば、ヒスチジンタグ、すなわちHisn(ここで、nは、3、4、5、6、7、8、9
、10またはそれより大きい))が挙げられる。他の適切なN末端アミノ酸配列およびC
末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、各Xは、G
BS配列であり、他方、GASおよびGBSの混合物も使用される。
明のタンパク質を産生するためのプロセスが提供される。
または核酸は、化学的手段を用いて一部または全体が合成される。
a)二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で、本発明に従う核酸プローブを生
物学的サンプルと接触させる工程;および(b)その二重鎖を検出する工程、を包含する
。
プロセスもまた提供され、このプロセスは、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明に
従う核酸を生物学的サンプルと接触させる工程を包含する。このプロセスは、核酸増幅(
例えば、PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBAなど)または核酸ハイ
ブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブとのハイ
ブリダイゼーションなど)を含み得る。臨床サンプル中のStreptococcus(
特に、S.pyogenes)のPCR検出が報告されている(例えば、Louieら(
2000)CMAJ 163:301−309;Louieら(1998)J.Clin
.Microbiol.36:1769−1771を参照のこと)。核酸に基づく臨床ア
ッセイは、一般的に、Tangら(1997)Clin.Chem.43:2021−2
038に記載される。
体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、本発明の抗体と生物学的サンプルとを接触させ
る工程;および(b)その複合体を検出する工程、を包含する。
ctiaeのゲノム配列内の推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード
領域を検索する工程を包含する。これは代表的に、開始コドンおよびその下流配列中のイ
ンフレームの終止コドンについてインシリコで配列を検索する工程を包含する。これら開
始コドンと終止コドンとの間の領域が、推定タンパク質コード配列である。代表的に、全
ての6個の可能性のあるリーディングフレームが検索される。このような分析のための適
切なソフトウェアとしては、ORFFINDER(NCBI)、GENEMARK[Bo
rodovsky
& McIninch(1993)Computers Chem.17:122−1
33)、GLIMMER[Salzbergら(1998)Nucleic Acids
Res.26:544−548;Salzbergら(1999)Genomics
59:24−31;Delcherら(1999)Nucleic Acids Res
.27:4636−4641]、またはMarkovモデルを使用する他のソフトウェア
[例えば、Shmatkovら(1999)Bioinformatics 15:87
4−876]が挙げられる。本発明はまた、同定されたアミノ酸配列を含むタンパク質を
提供する。次いで、これらのタンパク質は、従来の技術を用いて発現され得る。
ロセスを提供する。試験化合物が本発明のタンパク質に結合し、そしてその結合がGBS
細菌の生活環を阻害する場合、その試験化合物を抗生物質としてか、または抗生物質の設
計のためのリード化合物として使用し得る。このプロセスは、代表的に、試験化合物を本
発明のタンパク質と接触させる工程、および試験化合物がそのタンパク質に結合するか否
かを決定する工程を包含する。このプロセスにおける使用に対して好ましい本発明のタン
パク質は、酵素(例えば、tRNAシンテターゼ)、膜トランスポーター、およびリボソ
ームタンパク質である。適切な試験化合物としては、タンパク質、ポリペプチド、炭水化
物、脂質、核酸(例えば、DNA、RNA、およびこれらの改変形態)、ならびに低分子
有機化合物(例えば、200Daと2000Daとの間のMW)である。試験化合物は、
個々に提供され得るが、代表的に、ライブラリー(例えば、コンビナトリアルライブラリ
ー)の一部であり得る。結合相互作用を検出するための方法としては、NMR、フィルタ
ー結合アッセイ、ゲルリターデイションアッセイ(gel retardation a
ssay)、置換アッセイ、表面プラズモン共鳴、逆ツーハイブリッドなどが挙げられる
。本発明のタンパク質に結合する化合物は、その化合物をGBS細菌と接触させ、次いで
増殖阻害についてモニタリングすることによって、抗生物質活性について試験され得る。
本発明はまた、これらの方法を用いて同定された化合物を提供する。
提供する:
−Helicobacter pylori由来のタンパク質抗原(例えば、VacA、
CagA、NAP、HopX、HopY[例えば、WO98/04702]および/また
はウレアーゼ)。
−N.meningitidis血清群B由来のタンパク質抗原(例えば、WO99/2
4578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430、Te
ttelinら(2000)Science 287:1809−1815、Pizza
ら(2000)Science 287:1816−1820およびWO96/2941
2中のタンパク質抗原であって、タンパク質‘287’および誘導体が特に好ましい)。
−N.meningitidis血清群B由来の外膜小胞(OMV)調製物(例えば、W
O01/52885;Bjuneら(1991)Lancet 338(8775):1
093−1096;Fukasawaら(1999)Vaccine 17:2951−
2958;Rosenqvistら(1998)Dev.Biol.Stand.92:
323−333などに開示される調製物)。−N.meningitidis血清群A、
C、W135および/またはY由来のサッカリド抗原(例えば、血清群C由来の、Cos
tantinoら(1992)Vaccine 10:691−698に開示されるオリ
ゴ糖(Costantinoら(1999)Vaccine 17:1251−1263
もまた参照のこと)。
−Streptococcus pneumoniae由来のサッカリド抗原(例えば、
Watson(2000)Pediatr Infect Dis J
19:331−332;Rubin(2000)Pediatr Clin Nort
h Am 47:269−285,v;Jedrzejas(2001)Microbi
ol Mol Biol Rev 65:187−207)。−A型肝炎ウイルス(例え
ば、不活性化ウイルス)由来の抗原(例えば、Bell(2000)Pediatr I
nfect Dis J 19:1187−1188;Iwarson(1995)AP
MIS 103:321−326)。
−B型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば、表面抗原および/またはコア抗原)(例えば、
Gerlichら(1990)Vaccine 8 補遺:S63−68および79−8
0)。
−C型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば、Hsuら(1999)Clin Liver
Dis 3:901−915)。
−Bordetella pertussis由来の抗原、例えば、必要に応じてペルタ
クチン(pertactin)ならびに/または凝集原2および凝集原3とも組み合わせ
る、B.pertussis由来の百日咳ホロトキシン(PT)および糸状赤血球凝集素
(FHA)(例えば、Gustafssonら(1996)N.Engl.J.Med.
334:349−355;Rappuoliら(1991)TIBTECH 9:232
−238)。
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリア毒素(例えば、Vaccines(1988)編
、Plotkin & Mortimer.ISBN 0−7216−1946−0の第
3章)、例えば、CRM197変異体(例えば、Del Guidiceら(1998)
Molecular Aspects of Medicine 19:1−70)。
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド(例えば、Plotkin & Mortim
erの第4章)。
−Haemophilus influenzae B由来のサッカリド抗原。−N.g
onorrhoeae由来の抗原[例えば、WO99/24578、WO99/3654
4、WO99/57280)。
−Chlamydia pneumoniae由来の抗原(例えば、PCT/IB01/
01445;Kalmanら(1999)Nature Genetics 21:38
5−389;Readら(2000)Nucleic Acids Res 28:13
97−406;Shiraiら(2000)J.Infect.Dis.181(補遺3
):S524−S527;WO99/27105;WO00/27994;WO00/3
7494)。
−Chlamydia trachomatis由来の抗原(例えば、WO99/284
75)。
−Porphyromonas gingivalis由来の抗原(例えば、Rossら
(2001)Vaccine 19:4135−4142)。
−ポリオ抗原、例えば、IPVまたはOPV(例えば、Sutterら(2000)Pe
diatr Clin North Am 47:287−308;Zimmerman
& Spann(1999)Am Fam Physician 59:113−11
8、125−126)。
−狂犬病抗原(例えば、Dreesen(1997)Vaccine 15 補遺:S2
−6)、例えば、凍結乾燥不活性化ウイルス(例えば、MMWR Morb Morta
l Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12,19;RabAv
ertTM)。
−麻疹、おたふくかぜおよび/または風疹抗原(例えば、Plotkin & Mort
imerの第9章、第10章、および第11章)。
−インフルエンザ抗原(例えば、Plotkin & Mortimerの第19章)、
例えば、赤血球凝集素および/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−Moraxella catarrhalis由来の抗原(例えば、McMichae
l(2000)Vaccine 19 補遺1:S101−107)。−Staphyl
ococcus aureus由来の抗原(例えば、Kurodaら(2001)Lan
cet 357(9264):1225−1240;1218−1219頁もまた参照の
こと)。
タンパク質に結合体化させることが好ましい(例えば、Ramsayら(2001)La
ncet 357(9251):195−196;Lindberg(1999)Vac
cine 17 補遺2:S28−36;Conjugate Vaccines(Cr
useら編)ISBN 3805549326、特に、vol.10:48−114など
)。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド(例えば、ジフテリアま
たは破傷風トキソイド)である。CRM197ジフテリアトキソイドが、特に好ましい。
他の適切なキャリアタンパク質としては、N.meningitidis外膜タンパク質
(例えば、EP−0372501)、合成ペプチド(例えば、EP−0378881、E
P−0427347]、熱ショックタンパク質(例えば、WO93/17712]、百日
咳タンパク質(例えば、WO98/58668;EP−0471177]、H.infl
uenzae由来のプロテインD(例えば、WO00/56360)、C.diffic
ile由来のトキシンAまたはトキシンB(例えば、WO00/61761)などが挙げ
られる。任意の適切な結合体化反応が、必要である場合、任意の適切なリンカーと共に、
使用され得る。
または遺伝子手段による百日咳毒素の無毒化)。
もまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗
原を含めることもまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原
および破傷風抗原を含めることもまた、好ましい。
に、任意の所定の抗原の濃度が、抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分である。
のタンパク質は、GBS配列を含み得るか、またはGAS配列およびGBS配列を含み得
る。
る配列を利用するために)使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下に続く。
この要約は、本発明に対する限定ではなく、むしろ、使用され得る例(しかし、必要とは
されない)を提供する。
本発明の実施には、他に示されない限り、当該分野の範囲内の、分子生物学、微生物学
、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、以
下の文献に十分に説明される:Sambrook Molecular Cloning
;A Laboratory Manual,第2版(1989);DNA Cloni
ng,Volumes I and II(D.N Glover編、1985);Ol
igonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);
Nucleic Acid
Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、
1984);Transcription and Translation(B.D.
HamesおよびS.J.Higgins編、1984);Animal Cell C
ulture(R.I.Freshney編、1986);Immobilized C
ells and Enzymes(IRL
Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide
to Molecular Cloning (1984);Methods in E
nzymologyシリーズ(Academic Press,Inc.)、特に第15
4巻および第155巻;Gene Transfer
Vectors for Mammalian Cells(J.H.Millerお
よびM.P.Calos編、1987,Cold Spring Harbor Lab
oratory);MayerおよびWalker編(1987)Immunochem
ical Methods in Cell and
Molecular Biology(Academic Press,London
);Scopes(1987)Protein Purification:Princ
iples and Practice,第2版(Springer−Verlag,N
.Y.)、ならびにHandbook of Experimental Immuno
logy,第I巻−第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、
1986)。
Xを含む組成物は、組成物中の全X+Yの少なくとも85重量%がXであるとき、Yを
「実質的に含まない」。好ましくは、Xは、組成物中の全X+Yの少なくとも90重量%
を、さらに好ましくは少なくとも約95重量%または99重量%さえを含む。
らなる」を意味する。例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXからなり得るか、また
はX+Yのようなさらなるものも含み得る。
宿主細胞、遺伝子、または調節領域(例えば、プロモーター)であり得る。異種成分は天
然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に
連結されるとき、それらは共に機能し得る。別の例は、ストレプトコッカス配列がマウス
宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然においてみられない配置で
単一タンパク質に組み立てられる同じタンパク質または異なるタンパク質由来の2つのエ
ピトープである。
るポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律性ユ
ニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の
宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクタ
ーは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、
酵母において有効な自律性複製配列;およびCOS−7細胞で有効であるウイルスT抗原
である。
するDNA配列、RNA配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存し
て、ネイティブ配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好
ましくは50%より大きく(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%
またはそれ以上)、これは、上記のようにSmith−Watermanアルゴリズムを
使用して算出される。本明細書中で使用される場合、本明細書でその核酸配列が提供され
る核酸分子または領域の「対立遺伝子改変体」は、別の単離体もしくは第2の単離体のゲ
ノム中に本質的に同じ遺伝子座で存在する核酸分子または領域、および、例えば、変異ま
たは組換えにより生ずる天然の変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列
を有する。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、それが比較される遺伝子によ
ってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対
立遺伝子改変体はまた、遺伝子の5’または3’非翻訳領域(例えば、調節制御領域)で
の変化を含み得る(例えば、米国特許第5,753,235号を参照のこと)。
ストレプトコッカスヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系;例えば、哺乳動物細胞
、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され
得る。
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物R
NAポリメラーゼを結合し、mRNAへのコード配列(例えば、構造遺伝子)の下流(3
’)転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、転写開始領域(これは
コード配列の5’末端の近位に通常位置する)およびTATAボックス(転写開始部位の
25〜30塩基対(bp)上流に通常位置する)を有する。TATAボックスは、その正
しい部位においてRNAポリメラーゼIIにRNA合成を開始させるよう指示すると考え
られている。哺乳動物プロモーターはまた、TATAボックスの100〜200bp上流
以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは
、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する(Samb
rookら(1989)「Expression of Cloned Genes i
n Mammalian Cells」 Molecular Cloning:A L
aboratory Manual、第2版)。
従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提
供する。例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスLTRプロモー
ター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、および単純疱疹ウイルス
プロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイル
ス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、ホルモ
ン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得るプロモーターに依存して、構成
的であるかまたは調節される(誘導性)かのいずれかであり得る。
エンハンサー)の存在は、通常、発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同性プロ
モーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を1000倍まで刺激し得る調
節DNA配列であり、合成は、通常のRNA開始部位で開始する。エンハンサーはまた、
それらが、通常方向もしくは反転(flipped)方向のいずれかで転写開始部位より
上流もしくは下流に、またはプロモーターから1000ヌクレオチドを超える距離で位置
する場合、活性である(Maniatisら(1987)Science 236:12
37;Albertsら(1989)Molecular Biology of th
e Cell,第2版)。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、通常、より広い宿
主範囲を有するので、特に有用であり得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサ
ー(Dijkemaら(1985)EMBO J.4:761)およびラウス肉腫ウイル
スの長末端反復(LTR)に由来するエンハンサー/プロモーター(Gormanら(1
982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777)およびヒトサイト
メガウイルスに由来するエンハンサー/プロモーター(Boshartら(1985)C
ell 41:521)が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であ
り、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下でのみ活性になる(Sa
ssone−CorsiおよびBorelli(1986)Trends Genet.
2:215;Maniatisら(1987)Science 236:1237)。
換えタンパク質のN末端における最初のアミノ酸が常に、ATG開始コドンによりコード
されるメチオニンである場合、DNA分子と直接連結され得る。所望される場合、N末端
は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得
る。
するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラDNA分
子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との
間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞
からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコー
ドする。アデノウイルスの三部からなる(triparite)リーダーは、哺乳動物細
胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
訳終止コドンの3’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共
に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的転写後切断およびポ
リアデニル化により形成される(Birnstielら(1985)Cell 41:3
49;ProudfootおよびWhitelaw(1988)「Terminatio
n and 3’end processing of eukaryotic RNA
.」Transcription and splicing(B.D.Hamesおよ
びD.M.Glover編);Proudfoot(1989)Trends Bioc
hem.Sci.14:105)。これらの配列は、mRNAの転写を方向づけ、そのm
RNAは、そのDNAにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター
/ポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のシグナルが挙げられる(Sam
brookら(1989)「Expression of cloned genes
in cultured mammalian cells.」Molecular C
loning:A Laboratory Manual)。
要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位
およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される
場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のよ
うな宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント(例えば、プラスミド)のような、
レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を
必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、SV40(Gluzma
m(1981)Cell 23:175)、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバ
ウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのT抗原の存在下で極めて高いコ
ピー数で複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルス
およびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリ
コンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびに
クローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンは維持することが可能
である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、pMT2(Kauf
manら(1989)Mol.Cell.Biol.9:946)およびpHEBO(S
himizuら(1986)Mol.Cell.Biol.6:1074)が挙げられる
。
ドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキスト
ラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェク
ション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオ
チドの封入、および核内へのDNAの直接微量注入が挙げられる。
胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、乳仔ハムス
ター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌腫細胞(例えば、He
p G2)および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、American
Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの
不死化細胞株が挙げられる。
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に
挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクタ
ーの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として
、以下のものが挙げられる:バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる
異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター(通常は細菌プラスミ
ド);転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を
有する野生型バキュロウイルス(これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相
同組換えを可能にする);ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイル
スゲノムを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換
えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材
料および方法は、特に、Invitrogen、San Diego CAからキット形
態(「MaxBac」キット)で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であ
り、そしてSummersおよびSmith,Texas Agricultural
Experiment Station Bulletin No.1555(1987
)(以下、「Summers and Smith」)に十分に記載されている。
、プロモーター配列、リーダー配列(所望される場合)、コード配列、および転写終結配
列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物(転移ベクター)に構築する。この構
築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント;作動可能に連結され
た調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子;あるいは調節エレメントの同
じセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌
のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント(例えば、プラスミド)のよう
な、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはク
ローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持されることが可能である。
、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計される。これらと
しては、例えば、pVL985(これは、ポリへドリンの開始コドンをATGからATT
に変化させ、そしてそのATTから32塩基対下流に、BamHIクローニング部位を導
入する;LuckowおよびSummers,Virology(1989)17:31
を参照のこと)が挙げられる。
988)Ann.Rev.Microbiol.,42:177)、ならびに選択および
増殖のための原核生物のアンピシリン耐性(amp)遺伝子およびE.coliにおける
複製起点を含む。
ュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼに結合し、そしてm
RNAへのコード配列(例えば、構造遺伝子)の下流(5’から3’)方向の転写を開始
し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端に近接し
て存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、RNAポリメラーゼ結
合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと
呼ばれる第二のドメインを有し得、通常これは、存在する場合は、構造遺伝子に対し遠位
にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子(Frie
senら、(1986)「The Regulation of Baculoviru
s Gene Expression」:The Molecular Biology
of Baculoviruses(Walter Doerfler編);EPO公
開番号127 839および155
476;ならびにp10タンパク質をコードする遺伝子(Vlakら,(1988),
J.Gen.Virol.69:765)由来の配列が挙げられる。
イルスポリへドリン遺伝子(Carbonellら,(1998)Gene,73:40
9)のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳
動物細胞の翻訳後修飾(シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化
のような)のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必
要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞間との間で保存されると思われるの
で、ヒトインターフェロンα(Maedaら,(1985),Nature 315:5
92);ヒトガストリン放出ペプチド(Lebacq−Verheydenら,(198
8),Molec.Cell.Biol.8:3129);ヒトIL−2(Smithら
,(1985)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、82:8404);
マウスIL−3(Miyajimaら,(1987)Gene 58:273);および
ヒトグルコセレブロシダーゼ(Martinら,(1988)DNA、7:99)をコー
ドする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用
され得る。
適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた
細胞内発現には通常、ATG開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短い
リーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、N末端のメチ
オニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切
断され得る。
虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパ
ク質をコードするキメラDNA分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。
リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する、疎水性ア
ミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種DNAおよび野生型バキュロウイルスのゲノ
ムDNAを同時形質転換(通常は、同時トランスフェクションによって)する。構築物の
プロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの2〜5kbの区域を
含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種DNAを導入する方法は、当該分
野で公知である(SummersおよびSmith、上記;Juら(1987);Smi
thら,Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156;ならびにLucko
wおよびSummers(1989)を参照のこと)。例えば、その挿入物は、相同二重
交差組換え(homologous double crossover recomb
ination)により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る;挿入物はま
た、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位内にあり得る。Mill
erら、(1989)、Bioessays 4;91。発現ベクター内のポリへドリン
遺伝子の代わりにクローン化される場合、このDNA配列は、ポリへドリン特異的配列に
より5’および3’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置さ
れる。
イルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる(約1%〜約5%の間)
;それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウ
イルスである。従って、この方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。その発現系
の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルス
により産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染細胞の
核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を
形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大15μmの大きさで
、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、光学顕微鏡下で容易に可視化される。組換えウ
イルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスとを区別す
るために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層に
プラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在(野性型ウイ
ルスを示す)または非存在(組換えウイルスを示す)によりスクリーニングする。「Cu
rrent Protocols in Microbiology」2巻(Ausub
elら編)16.8(増補10、1990);SummersおよびSmith、上記;
Millerら(1989)。
。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された:Aed
es aegypti、Autographa californica、Bombyx
mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera
frugiperda、およびTrichoplusia ni(WO89/0466
99;Carbonellら,(1985)J.Virol.56:153;Wrigh
t(1986)Nature 321:718;Smithら,(1983)Mol.C
ell.Biol.3:2156;およびFraserら,(1989)In Vitr
o Cell.Dev.Biol.25:225を一般に参照のこと)。
接発現および融合発現の両方のために市販される;細胞培養技術は、一般に当業者に公知
である。例えば、上記SummersおよびSmithを参照のこと。
に存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下
にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現
が構成的である場合、その産物は、培地中に連続的に発現され、そして目的産物を取り出
し、そして枯渇した栄養を補給しながら、栄養培地を連続的に循環させる必要がある。そ
の産物は、クロマトグラフィー(例えば、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーなど);電気泳動;密度勾配遠心;溶媒抽出などのよう
な技術により精製され得る。適切な場合、必要ならば、その産物をさらに精製し、その結
果、これもまた培地中に存在する実質的に全ての昆虫タンパク質を除去し、宿主細片(例
えば、タンパク質、脂質および多糖)を少なくとも実質的に含まない産物を提供し得る。
パク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条
件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の
ことに基づいて、当業者に容易に確かめられ得る。
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および植物全体での遺伝子発現系が存在する。例
示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第5,693,506号;米国特許第5
,659,122号;および米国特許第5,608,143号のような特許に記載される
ものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Zenk,Phy
tochemistry 30:3861−3863(1991)に記載された。植物タ
ンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中にお
いても見出され得る;Vaulcombeら,Mol.Gen.Genet.209:3
3−40(1987);Chandlerら,Plant Molecular Bio
logy
3:407−418(1984);Rogers,J.Biol.Chem.260:
3731−3738(1985);Rothsteinら,Gene 55:353−3
56(1987);Whittierら,Nucleic Acids Researc
h 15:2515−2535(1987);Wirselら,Molecular M
icrobiology 3:3−14(1989);Yuら,Gene 122:24
7−253(1992)。植物ホルモン(ジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導さ
れる分泌酵素)による植物遺伝子発現の調節の記載は、R.L.JonesおよびJ.M
acMillin,Gibberellins:Advanced Plant Phy
siology,Malcolm B.Wilkins編、1984 Pitman P
ublishing Limited,London,21−52頁の中に見出され得る
。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は、以下である:Sheen,Plant
Cell,2:1027−1038(1990);Maasら,EMBO J.9:3
447−3452(1990);BenkelおよびHickey、Proc.Natl
.Acad.Sci.84:1337−1339(1987)。
で作動させるために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入され
る。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流に
コンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配
列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のよう
なもともとのクローニング宿主から、所望の植物宿主へ、ベクターがDNAを移動させる
ことを可能にするために必要とされる特徴を、ベクターに提供する。基本的な細菌/植物
ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点;原核生物の選択マ
ーカー;および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移
入のためのT DNA配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場
合は、好ましくは、この構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するた
めに適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イ
ネ科のメンバーについては、WilminkおよびDons,1993,Plant M
ol.Biol.Reptr,11(2):165−185に見られる。
。これらは、相同組換えのためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発
現カセットのランダム挿入を可能にするTi配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカ
ーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げ
られる。さらなる機能をコードしている他のDNA配列はまた、当該分野で公知であるよ
うに、そのベクターの中に存在し得る。
上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、
異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む;プロモーター領域、植物
5’非翻訳配列、構造遺伝子が開始コドンを備えているかどうかに依存して開始コドン、
ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの5’末端および3’末端の独特な制限
酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよび
トランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の
所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。翻訳開始領域は、大
部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためのものであるから
、トランスロケーションを提供するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた
、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク
質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ得、そして効率的に回収さ
れ得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚
盤上皮層を通過する。タンパク質を産生する細胞からタンパク質が分泌される必要がない
場合、このことは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。
ン化された遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオソーム(s
plicosome)機構によって、プロセシングで除去される配列を含むかどうかを決
定することが望ましい。このような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、
偽イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐために実施され得る。
ReedおよびManiatis、Cell 41:95−105(1985)。
胞内に直接的に微量注入され得る(Crossway、Mol.Gen.Genet,2
02:179−185、1985)。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて
植物細胞内に移入され得る(Krensら、Nature,296、72−74、198
2)。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは粒子のマトリックスの内
部に、あるいはその表面のいずれかに核酸を有する小さな粒子による高速バリスティック
(ballistic)穿通法である(Kleinら,Nature,327,70−7
3,1987ならびにKnudsenおよびMuller,1991,Planta,1
85:330−336は、大麦胚乳の粒子ボンバードメント(bombardment)
によりトランスジェニック大麦を作製することを教示している)。さらに別の導入方法は
、他の実体(ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂質表面体のいずれか
)とのプロトプラストの融合である(Fraleyら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,79,1859−1863,1982)。
mら、Proc.Nati Acad.Sci.USA 82:5824,1985)。
この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエ
レクトロポレーションされる。高い場の強度の電気衝撃により、生体膜を可逆的に通過で
きるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロ
トプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。
は、本発明により形質転換され得、その結果、移入された遺伝子を含む完全な植物が再生
される。実質的に全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マ
メ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組
織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の
属由来の種が挙げられる:Fragaria、Lotus、Medicago、Onob
rychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Citrus
、Linum、Geranium、Manihot、Daucus、Arabidops
is、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atropa、Caps
icum、Datura、Hyoscyamus、Lycopersion、Nicot
iana、Solanum、Petunia、Digitalis、Majorana、
Cichorium、Helianthus、Lactuca、Bromus、Aspa
ragus、Antirrhinum、Hererocallis、Nemesia、P
elargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus
、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、Browaalia、
Glycine、Lolium、Zea、Triticum、SorghumおよびDa
tura。
を含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成さ
れ、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成が
プロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を
形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイ
ニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加するこ
とは、特にトウモロコシおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュート
および根は通常、同時に発生する。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養歴に依
存する。これらの3つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り
返し可能である。
るいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内
に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または
他の植物組織は、機械的に破壊されて、細胞間および組織間の任意の分泌されたタンパク
質を放出し得る。その混合物は緩衝溶液に懸濁されて、可溶性タンパク質が回収され得る
。次いで、従来のタンパク質単離方法および精製方法は組換えタンパク質を精製するため
に使用される。時間、温度、pH、酸素、および容量のパラメーターは、異種タンパク質
の発現および回収を最適化するための慣用的な方法により調整される。
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のRNAポリ
メラーゼに結合し得、そしてmRNAへのコード配列(例えば、構造遺伝子)の下流方向
(3’方向)の転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コー
ド配列の5’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通
常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた
、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し得、このドメインは、RNA合成が始ま
る近接したRNAポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッ
サータンパク質が、オペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得
るような、負の調節された(誘導性の)転写を可能にする。構成的発現は、オペレーター
のような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アク
チベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、RN
Aポリメラーゼ結合配列に(5’側で)近接している。遺伝子アクチベータータンパク質
の例は、カタボライトアクチベータータンパク質(CAP)であり、それはEscher
ichia coli(E.coli)におけるlacオペロンの転写の開始を助ける(
Raibaudら(1984)Annu.Rev.Genet.18:173)。調節さ
れる発現は、それゆえ正または負のいずれかであり得、従って転写を増強するかまたは低
下させるかのいずれかである。
ては、ガラクトース、ラクトース(lac)(Changら(1977)Nature
198:1056)、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が
挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン(trp)(Goeddelら(19
80)Nuc.Acids Res.8:4057;Yelvertonら(1981)
Nucl.Acids Res.9:731;米国特許第4,738,921号;EP−
A−0036776号およびEP−A−0121775号)のような生合成酵素由来のプ
ロモーター配列が挙げられる。g−ラクタマーゼ(g−laotamase)(bla)
プロモーター系(Weissmann(1981)「The cloning of i
nterferon and other mistakes.」Interferon
3(I.Gresser編))、バクテリオファージλPL(Shimatakeら(
1981)Nature 292:128)およびT5(米国特許第4,689,406
号)プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。
る。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の
細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリ
ッドプロモーターを形成する(米国特許第4,551,433号)。例えば、tacプロ
モーターは、trpプロモーター配列およびlacリプレッサーにより調節されるlac
オペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドtrp−lacプロモーターである(
Amannら(1983)Gene 25:167;de Boerら(1983)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.80:21)。さらに、ある細菌のプロモーターは
、細菌のRNAポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する、非細菌起
源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーター
はまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性の
あるRNAポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ
/プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である(Studierら(198
6)J.Mol.Biol.189:113;Taborら(1985)Proc Na
tl.Acad.Sci.82:1074)。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた
、バクテリオファージプロモーターおよびE.coliオペレーター領域から構成され得
る(EPO−A−0 267 851)。
ける外来遺伝子の発現に有用である。E.coliにおいて、リボソーム結合部位は、シ
ャイン−ダルガノ(SD)配列と呼ばれ、そして開始コドン(ATG)および開始コドン
の3〜11ヌクレオチド上流に位置する長さ3〜9ヌクレオチドの配列を含む(Shin
eら(1975)Nature 254:34)。SD配列は、SD配列とE.coli
の16S rRNAの3’側との間の塩基対合によりmRNAのリボソームへの結合を促
進すると考えられている(Steitzら(1979)「Genetic signal
s and nucleotide sequences in messenger
RNA.」Biological Regulation and Developme
nt:Gene Expression(R.F.Goldberger編))。弱いリ
ボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現が記載されている
(Sambrookら(1989)「Expression of cloned ge
nes in Escherichia coli」Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual)。
と連結され得、この場合、N末端の最初のアミノ酸は、常に、ATG開始コドンによりコ
ードされるメチオニンである。所望される場合、N末端のメチオニンは、臭化シアンとの
インビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンN末端ペプチダーゼとのイン
ビボまたはインビトロでのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され
得る(EP−A−0219237)。
質、あるいは他の安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列は、異種のコー
ド配列の5’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、2つのアミノ酸配列の融合
を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5’末端で連結
され得、そして細菌において発現され得る。得られた融合タンパク質は、好ましくは、外
来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素(第Xa
因子)用の部位を保持する(Nagaiら(1984)Nature 309:810)
。融合タンパク質はまた、lacZ(Jiaら(1987)Gene 60:197)、
trpE(Allenら(1987)J.Biotechnol.5:93;Makof
fら(1989)J.Gen.Microbiol.135:11)、およびChey(
EP−A−0324647)遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。2つのアミノ酸配
列の接合部でのDNA配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、あるいはコードしな
くてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は
、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素(例え
ば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)用の部位を保持するユビキチン領域と
共に作製される。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は分離され得る(Mi
llerら(1989)Bio/Technology 7:698)。
ナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラDN
A分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第4,336,336
号)。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎
水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培
地(グラム陽性細菌)、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔(グラム陰
性細菌)のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで
切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、
プロセシング部位が存在する。
pA)(Masuiら(1983)、Experimetal Manipulatio
n of Gene Expression;Ghrayebら、(1984)EMBO
J.3:2437)およびE.coliアルカリホスファターゼシグナル配列(pho
A)(Okaら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:7212)
のような、分泌性細菌タンパク質に関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種
々のBacillus株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、B.subti
lis由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る(Palvaら(1982)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5582;EP−A−024404
2)。
節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの
配列は、そのDNAによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るmRNAの転写
を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成
し得る、約50ヌクレオチドのDNA配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有
する遺伝子(例えば、E.coliのtrp遺伝子および他の生合成遺伝子)由来の転写
終結配列を含む。
列、および転写終結配列を含む)は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、
しばしば、宿主(例えば細菌)における安定な保持が可能である染色体外エレメント(例
えばプラスミド)のような、レプリコンに保持される。このレプリコンは複製系を有し、
従って、このことが、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコ
ンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピ
ー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミ
ドは、一般に約5〜約200、そして通常約10〜約150の範囲のコピー数を有する。
高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約10個、そしてより好まし
くは少なくとも約20個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベク
ターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効
果に依存する。
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同
な少なくとも1つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なDNAと細菌の染
色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のBacillus株からのD
NAによって構築される組み込みベクターは、Bacillus染色体に組み込まれる(
EP−A−0 127 328)。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたは
トランスポゾン配列から構成され得る。
転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得
、そして細菌が薬物(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン
、カナマイシン(ネオマイシン)、およびテトラサイクリン)に耐性になるようにする遺
伝子を含み得る(Daviesら(1978)Annu.Rev.Microbiol.
32:469)。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの
生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、また
は組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー(market)から構
成される。
のいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは
、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた:Bacillus subtilis
(Palvaら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5
582;EP−A−0 036 259およびEP−A−0 063 953;WO 8
4/04541)、Escherichia coli(Shimatakeら(198
1)Nature 292:128;Amannら(1985)Gene 40:183
;Studierら(1986)J.Mol.Biol.189:113;EP−A−0
036
776、EP−A−0 136 829およびEP−A−0 136 907)、St
reptococcus cremoris(Powellら(1988)Appl.E
nviron.Microbiol.54:655);Streptococcus l
ividans(Powellら(1988)Appl.Environ.Microb
iol.54:655)、Streptomyces lividans(米国特許第4
,745,056号)。
CaCl2または他の薬剤(例えば、2価の陽イオンおよびDMSO)のいずれかで処理
された細菌の形質転換を含む。DNAはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細
胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する
。例えば以下を参照のこと:(Massonら(1989)FEMS Microbio
l.Lett.60:273;Palvaら(1982)Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 79:5582;EP−A−0 036 259およびEP−A−0
063 953;WO 84/04541、Bacillus)、(Millerら(
1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:856;Wangら(199
0)J.Bacteriol.172:949、Campylobacter)、(Co
henら(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69:2110;Dow
erら(1988)Nucleic Acids Res.16:6127;Kushn
er(1978)「ColE1由来のプラスミドによるEscherichia col
iの形質転換のための改良された方法」Genetic Engineering:Pr
oceedings of the
International Symposium on Genetic Engi
neering(H.W.BoyerおよびS.Nicosia編);Mandelら(
1970)J.Mol.Biol.53:159;Taketo(1988)Bioch
im.Biophys.Acta 949:318;Escherichia)、(Ch
assyら(1987)FEMS Microbiol.Lett.44:173 La
ctobacillus);(Fiedlerら(1988)Anal.Biochem
170:38、Pseudomonas);(Augustinら(1990)FEM
S Microbiol.Lett.66:203、Staphylococcus)、
(Baranyら(1980)J.Bacteriol.144:698;Harlan
der(1987)「エレクトロポレーションによるStreptococcus la
ctisの形質転換」Streptococcal Genetics(J.Ferre
ttiおよびR.Curtiss III編);Perryら(1981)Infect
.Immun.32:1295;Powellら(1988)Appl.Environ
.Microbiol.54:655;Somkutiら(1987)Proc.4th
Evr.Cong.Biotechnology 1:412、Streptococ
cus)。
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラー
ゼに結合可能であり、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)からmRNAへの下流の
(3’側の)転写を開始し得る、任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コー
ド配列の5’末端の近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常
、RNAポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写開始部位を含む。酵
母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列(UAS)と呼ばれる第2のドメインを
有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子に対して遠位である。このUA
Sは、調節される(誘導性の)発現を可能にする。構成的発現は、UASの非存在下で生
じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させ
るかまたは減少させるかのいずれかである。
コードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げら
れる:アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(EP−A−0
284 044)、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラー
ゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘ
キソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピル
ビン酸キナーゼ(PyK)(EPO−A−0 329
203)。酸性ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子もまた、有用なプロモ
ーター配列を提供する(Myanoharaら(1983)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:1)。
する。例えば、ある1つの酵母プロモーターのUAS配列は、別の酵母プロモーターの転
写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハ
イブリッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域と連結されるADH調節配
列(米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号)が挙げられる。
ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ADH2、GAL4、GAL10、または
PHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなり、GAPまたはPyK(EP−A−0 1
64 556)のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーター
が挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼと結合し、そして
転写を開始する能力を有する、天然に存在する非酵母起源のプロモーターを含み得る。こ
のようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる:(Cohenら、(
1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1078;Heni
koffら(1981)Nature 283:835;Hollenbergら(19
81)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96:119;
Hollenbergら(1979)「The Expression of Bact
erial Antibiotic Resistance Genes in the
Yeast Saccharomyces cerevisiae」、Plasmid
s of
Medical,Environmental and Commercial Im
portance(K.N.TimmisおよびA.Puhler編);Mercera
u−Puigalonら(1980)Gene 11:163;Panthierら(1
980)Curr.Genet.2:109;)。
A分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のN末端にある最初のアミノ酸は
常に、ATG開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、
N末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパ
ク質から切断され得る。
び細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の
安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列は、異種コード配列の5’末端に
融合される。発現において、この構築物は、2つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例
えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)遺伝子は、外来遺伝子
の5’末端に連結され得、そして酵母において発現され得る。2つのアミノ酸配列の連結
部にあるDNA配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例
えば、EP−A−0 196 056を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質
である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセ
シング酵素(例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)のための部位を好ま
しくは保持する、ユビキチン領域を用いて作製される。従って、この方法によって、ネイ
ティブな融合タンパク質は、単離され得る(例えば、WO88/024066)。
ーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラDNA分子
を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコ
ードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞から
のタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、コ
ードする。
であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子(EP−A−0 012 8
73;JPO.62,096,086)およびA因子遺伝子(米国特許第4,588,6
84号)である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もま
た提供する、非酵母起源のリーダーが存在する(EP−A−0 060 057)。
ーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得
る型のα因子フラグメントは、全長のプレ−プロα因子リーダー(約83アミノ酸残基)
および短縮されたα因子リーダー(通常約25〜約50アミノ酸残基)を含む(米国特許
第4,546,083号および同第4,870,008号;EP−A−0 324 27
4)。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては
、第1の酵母のプレ配列を有するが、第2の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製
される、ハイブリッドα因子リーダーが挙げられる(例えば、WO89/02463を参
照のこと)。
節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列
は、そのDNAにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、mRNAの転写を指向す
る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコー
ドする転写終結配列である。
および転写終結配列を含む)は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主
(例えば、酵母または細菌)において安定に保持され得る染色体外エレメント(例えば、
プラスミド)のようなレプリコンにおいて、しばしば保持される。このレプリコンは、2
つの複製系を有し得、従って、レプリコンが、例えば、発現のために酵母において、なら
びにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において保持されることを可能にする
。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる:YEp24
(Botsteinら(1979)Gene 8:17〜24)、pCl/1(Brak
eら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81:4642〜4
646)、およびYRp17(Stinchcombら(1982)J.Mol.Bio
l.158:157)。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数
プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約5〜約200、そ
して通常約10〜約150の範囲のコピー数を有し得る。高コピー数プラスミドを含む宿
主は、好ましくは少なくとも約10個、そしてより好ましくは少なくとも約20個を有す
る。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿
主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Brakeら、前
出を参照のこと。
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同
な少なくとも1つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する2つの相同配
列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なDNAと酵母の染色体との間の組換えか
ら生じるようである(Orr−Weaverら(1983)Methods in En
zymol.101:228〜245)。組み込みベクターは、そのベクター中に含有す
るために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向さ
れ得る。Orr−Weaverら、前出を参照のこと。1つ以上の発現構築物が組み込ま
れ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る(Rineら(1
983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6750)。ベクター
に含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント(ベクター全体の組み込みを
生じる)、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築
物に隣接する2つのセグメント(発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る)のいず
れかとして生じ得る。
換された酵母株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る
生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およ
びALG7、ならびにG418耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシン
およびG418に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のよ
うな毒性化合物の存在下において増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、CU
P1の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする(Butt
ら(1987)Microbiol.Rev.51:351)
あるいは、上記の成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得
る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンのままで保持されるか、また
は組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーを含む。
のいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベク
ターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた:Candida albica
ns(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6:142)、Cand
ida maltosa(Kunzeら(1985)J.Basic Microbio
l.25:141)。Hansenula polymorpha(Gleesonら(
1986)J.Gen.Microbiol.132:3459;Roggenkamp
ら(1986)Mol.Gen.Genet.202:302)、Kluyveromy
ces fragilis(Dasら(1984)J.Bacteriol.158:1
165)、Kluyveromyces lactis(De Louvencourt
ら(1983)J.Bacteriol.154:737;Van den Bergら
(1990)Bio/Technology 8:135)、Pichia guill
erimondii(Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.
25:141)、Pichia pastoris(Creggら(1985)Mol.
Cell.Biol.5:3376;米国特許第4,837,148号および同第4,9
29,555号)、Saccharomyces cerevisiae(Hinnen
ら(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929;It
oら(1983)J.Bacteriol.153:163)、Schizosacch
aromyces pombe(BeachおよびNurse(1981)Nature
300:706)、およびYarrowia lipolytica(Davidow
ら(1985)Curr.Genet.10:380471;Gaillardinら(
1985)Curr.Genet.10:49)。
、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置されたインタクトな酵母細胞のい
ずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変
化する。例えば以下を参照のこと:(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Bi
ol.6:142;Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.2
5:141;Candida);(Gleesonら(1986)J.Gen.Micr
obiol.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.
Genet.202:302;Hansenula);(Dasら(1984)J.Ba
cteriol.158:1165;De Louvencourtら(1983)J.
Bacteriol.154:1165;Van den Bergら(1990)Bi
o/Technology 8:135;Kluyveromyces);(Cregg
ら(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376;Kunzeら(1985)
J.Basic Microbiol.25:141;米国特許第4,837,148号
および同第4,929,555号;Pichia);(Hinnenら(1978)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929;Itoら(1983)J
.Bacteriol.153:163 Saccharomyces);(Beach
およびNurse(1981)Nature 300:706;Schizosacch
aromyces);(Davidowら(1985)Curr.Genet.10:3
9;Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49;Yarr
owia)。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも1つの抗体結合部位から
構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形
状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、3次元結合空間であり、
これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」としては、例えば、脊椎動物抗体、ハ
イブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Fabタンパク
質、および単一ドメイン抗体が挙げられる。
びストレプトコッカスタンパク質の識別/同定に有用である。
従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好まし
くはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤ
ギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可
能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タン
パク質を生理的食塩水(好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント)
に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に(一般的に皮下、または筋
肉内に)注射することによって、行われる。50〜200μg/注射の用量が、代表的に
十分である。免疫は、一般的に、2〜6週後に生理的食塩水(好ましくはフロイント不完
全アジュバントを用いて)中のタンパク質の1回以上の注射でブーストされる。あるいは
、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これ
は、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいとみなされる。ポリクローナル抗血
清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を25
℃で1時間インキュベートし、その後4℃で2〜18時間インキュベートすることによっ
て得られる。この血清は、遠心分離(例えば1,000g、10分間)によって回収され
る。ウサギから、採血1回につき約20〜50mlが得られ得る。
5)256:495〜96)の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代
表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するた
めに動物から採血するよりも、脾臓(および必要に応じていくつかの大きなリンパ節)が
取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、(非特異的付着
細胞の除去後)細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェル
へ適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロ
ブリンを発現するB細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い
落とされない。得られたB細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と
融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地(例えばヒポキサン
チン、アミノプテリン、チミジン培地、「HAT」)において培養される。得られたハイ
ブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異
的に結合する(かつ関連しない抗原に結合しない)抗体の産生についてアッセイされる。
選択されたMAb分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ(例えば、組織培養瓶または中
空線維リアクター中で)、またはインビボ(マウスにおける腹水として)のいずれかで培
養される。
技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる:発蛍光団、発色
団、放射性原子(特に32Pおよび125I)、電子密度試薬、酵素、および特異的結合
パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
(TMB)を青い色素(分光光度計を用いて定量可能)へ変換するその能力によって、検
出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタン
パク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他
の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgG
およびプロテインA、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対を
含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のク
ラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、125Iは、
放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。HRPは、酵素として、または
MAbについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合
せ得る。例えば、MAbおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とす
る。従って、MAbをビオチンで標識して、そして125Iで標識したアビジン、または
HRPで標識した抗ビオチンMAbで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は
、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内に等しいとみなされる。
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この
薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレ
オチドのいずれかを含む。
態を処置、改善、または予防するための治療剤の量、または、検出可能な治療効果または
予防効果を示すための治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原
レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における
減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質お
よび程度、および投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、
あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の情況のための有
効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
.01mg/kg〜50mg/kgまたは0.05mg/kg〜約10mg/kgである
。
能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような治療
剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体
の産生をそれ自体誘導せず、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的キ
ャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重
合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、ゆっく
り代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香
酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Re
mington’s Pharmaceutical
Sciences(Mack Pub.Co.、N.J.1991)にて利用可能であ
る。
およびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質
などのような補助物質が、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的には、治療組成物
は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される;注射前に液体
ビヒクル中の溶液または懸濁液として適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソーム
は、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体へ直接投与され得る。処置される被験体
は、動物であり得;特に、ヒト被験体が処置され得る。
いずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この
組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤
、および経皮(transdermal)適用または経皮(transcutaneou
s)適用(例えば、WO98/20734を参照のこと)、針、および遺伝子銃またはハ
イポスプレー(hypospray)が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、
または多数回用量スケジュールであり得る。
本発明に従うワクチンは、予防的(すなわち、感染を予防するため)または治療(すな
わち、感染後の疾患を処置するため)のいずれかであり得る。
通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリアとしては、それ自体が
、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアが挙げら
れる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子(例えば、タン
パク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質
凝集物(例えば、油小滴またはリポソーム)、および不活性ウイルス粒子)である。この
ようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤(「
アジュバント」)として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素(例え
ば、ジフテリア、破傷風、コレラ、H.pyloriなどの病原体由来の毒素)と結合体
化され得る。
が、これらに限定されない:(1)水中油懸濁処方物(他の特定の免疫刺激薬剤(例えば
、ムラミルペプチド(以下を参照のこと)または細菌細胞壁成分)を伴うか伴わない)、
例えば、以下:(a)μ未満の粒子に微小流体化機械を用いて処方される、5%スクアレ
ン、0.5% Tween 80、および0.5% Span85(必要に応じて、MT
P−PEを含有する)を含む、MF59TM(WO90/14837;Vaccine
Design−the subunit and adjuvant approach
、Powell & Newman、編、1995の第10章);(b)μ未満のエマル
ジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョ
ンを生成したかのいずれかである、10%スクアレン、0.4%Tween80、5%プ
ルロニックブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含有するSAF、ならび
に(c)2%スクアレン、0.2%Tween80、およびモノホスホリピドA(MPL
)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)(好ましくはM
PLおよびCWS(DetoxTM))からなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分を含
むRibiTMアジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem、Ham
ilton、MT);(2)サポニンアジュバント(例えば、QS21またはStimu
lonTM)(Cambridge Bioscience、Worcester、MA
)を使用し得るか、またはそれから粒子(例えば、ISCOM(免疫刺激性複合体)(こ
のISCOMSは、さらなる界面活性剤を欠き得る)を生成し得る)、例えば、WO00
/07621;(3)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントア
ジュバント(IFA);(4)サイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、IL
−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(WO99/4
4636)など)、インターフェロン(例えば、γインターフェロン)、マクロファージ
コロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など;(5)モノホスホリル
リピドA(MPL)または3−O−デアシル化MPL(3dMPL)、例えば、GB−2
220221,EP−A−0689454;(6)3dMPLと、例えば、QS21およ
び/または水中油エマルジョンとの組み合わせ、例えば、EP−A−0835318、E
P−A−0735898、EP−A−0761231;(7)シトシンの代わりに必要に
応じて使用される5−メチルシトシンを有する、CpGモチーフを含む(すなわち、少な
くとも1つのCGジヌクレオチドを含む)オリゴヌクレオチド[Krieg Vacci
ne 2000,19,618−622;Krieg
Curr opin Mol Ther 2001 3:15−24;Romanら,
Nat.Med.,1997,3,849−854;Weinerら,PNAS USA
,1997,94,10833−10837;Davisら,J.Immunol.,1
998,160,870−876;Chuら,J.Exp.Med.,1997,186
,1623−1631;Lipfordら,Eur.J.Immunol.,1997,
27,2340−2344;Moldoveanuら,Vaccine,1988,16
,1216−1224,Kriegら,Nature,1995,374,546−54
9;Klinmanら,PNAS USA,1996,93,2879−2883;Ba
llasら,J.Immunol.,1996,157,1840−1845;Cowd
eryら,J.Immunol.,1996,156,4570−4575;Halpe
rnら,Cell.Immunol.,1996,167,72−78;Yamamot
oら,Jpn.J.Cancer Res.,1988,79,866−873;Sta
ceyら,J.Immunol.,1996,157,2116−2122;Messi
naら,J.Immunol.,1991,147,1759−1764;Yiら,J.
Immunol.,1996,157,4918−4925;Yiら,J.Immuno
l.,1996,157,5394−5402;Yiら,J.Immunol.,199
8,160,4755−4761;およびYiら,J.Immunol.,1998,1
60,5898−5906;国際特許出願WO96/02555,WO98/16247
,WO98/18810,WO98/40100,WO98/55495,WO98/3
7919およびWO98/52581];(8)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリ
オキシエチレンエステル、例えば、WO99/52549;(9)オクトキシノールと組
み合わせた、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(例えば、WO01/2
1207)または少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤(例えばオクトキシノ
ール)と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレン
アルキルエステルの界面活性剤(例えば、WO01/21152);(10)免疫刺激オ
リゴヌクレオチド(例えば、CpGオリゴヌクレオチド)およびサポニン、例えば、WO
00/62800;(11)免疫刺激剤および金属塩の粒子、例えば、WO00/231
05;(12)サポニンおよび水中油エマルジョン、例えば、WO99/11241;(
13)サポニン(例えば、QS21)+3dMPL+IL−12(必要に応じて+ステロ
ール))、例えば、WO98/57659;(14)アルミニウム塩(好ましくは、水酸
化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムであるが、任意の他の適切な塩もまた使用され
得る(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オキシヒドロキシド、オルトリン酸塩、硫酸塩など
[例えば、Powell&Newmanの第8章および9章を参照のこと])。異なるア
ルミニウム塩の混合物もまた使用され得る。この塩は、任意の適切な形態を取り得る(例
えば、ゲル、結晶、非晶質など);(15)免疫刺激剤として作用して、組成物の効力を
増強するように作用する他の物質。アルミニウム塩および/またはMF59TMが好まし
い。
レオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−
アラニル−D−イソグルタミン(ノル−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル
−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グ
リセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)などが挙げ
られるが、それらに限定されない。
的に受容可能なキャリア、およびアジュバント)は、代表的に、希釈剤(例えば、水、生
理食塩水、グリセロール、エタノールなど)を含有する。さらに、補助物質(例えば、湿
潤剤または乳化剤、pH緩衝物質など)は、このようなビヒクル中に存在し得る。
うに調製され;注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態も
また調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載
のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセ
ル化され得る。
のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」
とは、個体へのその量の投与が、単回用量であれ、一連の(用量の)一部としてであれ、
処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身
体状態、処置される個体の分類学上の群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の
免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方、処置する医
師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的
広い範囲であり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
ansudermally)/経皮(transcutaneously)のいずれかで
の注射による)に投与される(例えば、WO98/20734)。他の投与様式に適切な
さらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチン
は、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
RobinsonおよびTorres(1997)Seminars in Immun
ol 9:271−283;Donnellyら(1997)Annu Rev Imm
unol 15:617−648;本明細書以下を参照のこと)。
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送
達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的のいずれかで
投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクタ
ーアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列
の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。
このコード配列のインビボでの発現は、構成的かまたは調節されるかのいずれかであり得
る。
達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウ
イルスベクターまたはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、
アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、
パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコ
ルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり
得る。一般的には、Jolly(1994)Cancer Gene Therapy
1:51−64;Kimura(1994)Human Gene Therapy 5
:845−852;Connelly(1995)Human Gene Therap
y 6:185−193;およびKaplitt(1994)Nature Genet
ics 6:148−153を参照のこと。
ロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを意図する。これに
は、B型、C型およびD型のレトロウイルス、異種栄養性レトロウイルス(例えば、NZ
B−X1、NZB−X2およびNZB9−1(O’Neill(1985)J.Viro
l.53:160を参照のこと))、多栄養性レトロウイルス(例えば、MCFおよびM
CF−MLV(Kelly(1983)J.Virol.45:291を参照のこと))
、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。RNA Tumor Viruse
s、第2版、Cold Spring Harobor Laboratory、198
5を参照のこと。
えば、レトロウイルスLTRは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、tRNA結合部位はラ
ウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し
得、そして第二鎖合成の起点はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
れらを導入することによって、形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る
(米国特許第5,591,624号を参照のこと)。レトロウイルスベクターは、レトロ
ウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって、宿主細胞DNAへの部位
特異的組込みのために構築され得る(WO96/37626号を参照のこと)。この組換
えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
は、当該分野で周知であり、容易に調製され(WO95/30763号およびWO92/
05266号を参照のこと)、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のため
のプロデューサー細胞株(これは、ベクター細胞株、すなわち「VCL」とも称される)
を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞(例えば、HT
1080細胞)またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を
除去する。
トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカ
ス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス
が挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aおよび1504
A(HartleyおよびRowe(1976)J Virol 19:19−25)、
Abelson(ATCC番号VR−999)、Friend(ATCC番号VR−24
5)、Graffi、Gross(ATCC番号VR−590)、Kirsten、Ha
rvey肉腫ウイルスおよびRauscher(ATCC番号VR−998)およびモロ
ニーマウス白血病ウイルス(ATCC番号VR−190)が挙げられる。このようなレト
ロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関(例えば、Rockville、Mar
ylandのAmerican Type Cultue Collection(「A
TCC」))から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から
単離され得る。
、特許出願GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP033
4301、WO89/02468;WO89/05349、WO89/09271、WO
90/02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/2569
8、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/
02805、WO91/02825、WO95/07994、米国特許第5,219,7
40号、同第4,405,712号、同第4,861,719号、同第4,980,28
9号、同第4,777,127号、同第5,591,624号に記載されるベクターが挙
げられる。Vile(1993)Cancer Res 53:3860−3864;V
ile(1993)Cancer Res 53:962−967;Ram(1993)
Cancer Res 53(1993)83−88;Takamiya(1992)J
Neurosci Res 33:493−503;Baba(1993)J Neu
rosurg 79:729−735;Mann(1983)Cell 33:153;
Cane(1984)Proc Natl Acad Sci 81;6349;および
Miller(1990)Human Gene Therapy 1もまた参照のこと
。
おいて使用可能である。例えば、Berkner(1988)Biotechnique
s 6:616およびRosenfeld(1991)Science 252:431
、ならびにWO93/07283、WO93/06223、およびWO93/07282
を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベク
ターとしては、上記に参照される文書およびWO94/12649、WO93/0376
9、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/
00655、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、W
O96/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/062
23、WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95
/02697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241,
WO95/25807、WO95/05835、WO94/18922およびWO95/
09654において記載されるベクターが挙げられる。あるいは、Curiel(199
2)Hum.Gene Ther.3:147−154に記載されるような殺傷したアデ
ノウイルスに連結したDNAの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた
、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む。本発明における使用のためのこのよう
なベクターの主要かつ好ましい例は、Srivastava WO93/09239に開
示されるAAV−2ベースのベクターである。最も好ましいAAVベクターは、2つのA
AV逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブのD配列は、ヌクレオチドの置換によっ
て改変され、その結果、少なくとも5つのネイティブなヌクレオチドおよび18までのネ
イティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも10のネイティブヌクレオチドから18ま
でのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは10のネイティブヌクレオチドが維持され
、そしてD配列の残りのヌクレオチドは欠失しているか、またはネイティブでないヌクレ
オチドで置換されている。AAV逆方向末端反復のネイティブなD配列は、各AAV逆方
向末端反復において(すなわち、各末端に1つの配列が存在する)20の連続するヌクレ
オチドの配列であって、これは、HP形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオ
チドは、同じ位置でのネイティブなD配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレ
オチドであり得る。他の使用可能な例示的なAAVベクターは、pWP−19、pWN−
1であり、これらは両方ともNahreini(1993)Gene 124:257−
262に開示される。このようなAAVベクターの別の例は、psub201である(S
amulski(1987)J.Virol.61:3096を参照のこと)。別の例示
的なAAVベクターは、Double−D ITRベクターである。Double−D
ITRベクターの構築は、米国特許第5,478,745号に開示される。なお他のベク
ターは、Carter 米国特許第4,797,368号およびMuzyczka 米国
特許第5,139,941号、Chartejee 米国特許第5,474,935号な
らびにKotin WO94/288157に開示されるベクターである。本発明におい
て使用可能なAAVベクターのなおさらなる例は、SSV9AFABTKneoであり、
これは、AFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において
優性に発現を指向する。その構造および構築は、Su(1996)Human Gene
Therapy 7:463−470に開示される。さらなるAAV遺伝子治療ベクタ
ーは、米国特許第5,354,678号、同第5,173,414号、同第5,139,
941号、および同第5,252,479号に開示される。
しい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルス
ベクター(例えば、米国特許第5,288,641号、およびEP0176170(Ro
izman)に開示されるもの)である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクタ
ーは、WO95/04139(Wistar
Institute)に開示されるHFEM/ICP6−lacZ、Geller(1
988)Science 241:1667−1669ならびにWO90/09441お
よびWO92/07945に記載されるpHSVlac、Fink(1992)Huma
n Gene Therapy 3:11−19に記載されるHSV Us3::pgC
−lacZ、ならびにEP0453242(Breakefield)に記載されるHS
V 7134、2RH 105およびGAL4、ならびにATCCに受託番号ATCC
VR−977およびATCC VR−260として寄託されたものを含む。
ーである。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。
トガウイルス、セムリキ森林ウイルス(ATCC VR−67;ATCC VR−124
7)、Middlebergウイルス(ATCC VR−370)、ロスリバーウイルス
(ATCC VR−373;ATCC VR−1246)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイ
ルス(ATCC VR−923;ATCC VR−1250;ATCC VR−1249
;ATCC VR−532)ならびに米国特許第5,091,309号、同第5,217
,879号、およびWO92/10578に記載されるもの。より詳細には、米国特許出
願第08/405,627号(1995年3月15日出願)、WO94/21792号、
WO92/10578号、WO95/07994号、米国特許第5,091,309号、
および米国特許第5,217,879号に記載されるそれらのアルファウイルスベクター
が使用可能である。このようなアルファウイルスは、Rockville、Maryla
ndのATCCのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用
可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少した
アルファウイルスベクターを使用する(米国特許出願番号08/679640号を参照の
こと)。
て有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはWO95/07994を参照
のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はアルファウイルスベクターに由来し
、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
、ATCC VR−58およびEvans、Nature 339(1989)385お
よびSabin(1973)J.Biol.Standardization 1:11
5に記載されるもの;リノウイルス、例えば、ATCC VR−1110およびArno
ld(1990)J Cell Biochem L401に記載されるもの;ポックス
ウイルス(例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス(例えば、A
TCC VR−111およびATCC VR−2010ならびにFisher−Hoch
(1989)Proc Natl Acad Sci 86:317;Flexner(
1989)Ann NY Acad Sci 569:86、Flexner(1990
)Vaccine 8:17;米国特許第4,603,112号および同第4,769,
330号ならびにWO89/01973号に記載されるもの));SV40ウイルス(例
えば、ATCC VR−305およびMulligan(1979)Nature 27
7:108およびMadzak(1992)J Gen Virol 73:1533に
記載されるもの);インフルエンザウイルス(例えば、ATCC VR−797ならびに
米国特許第5,166,057号およびEnami(1990)Proc Natl A
cad Sci 87:3802−3805;EnamiおよびPalese(1991
)J Virol
65:2711−2713およびLuytjes(1989)Cell 59:110
(McMichael(1983)NEJ Med 309:13ならびにYap(19
78)Nature 273:238およびNature(1979)277:108も
また参照のこと)に記載されるような逆遺伝学技術を使用して作製した組換えインフルエ
ンザウイルス);EP−0386882およびBuchschacher(1992)J
.Virol.66:2731に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス;麻疹ウイルス
(例えば、ATCC VR−67およびVR−1247ならびにEP−0440219に
記載されるもの);アウラウイルス(例えば、ATCC VR−368);ベバルウイル
ス(例えば、ATCC VR−600およびATCC VR−1240);カバス(Ca
bassou)ウイルス(例えば、ATCC VR−922);チクングンヤウイルス(
例えば、ATCC VR−64およびATCC VR−1241);フォートモーガン(
Fort Morgan)ウイルス(例えば、ATCC VR−924);ゲタウイルス
(例えば、ATCC VR−369およびATCC VR−1243);キジラガハ(K
yzylagach)ウイルス(例えば、ATCC VR−927);マヤロウイルス(
例えば、ATCC VR−66);ムカンボウイルス(例えば、ATCC VR−580
およびATCC VR−1244);ヌヅムウイルス(例えば、ATCC VR−371
);ピクスナウイルス(例えば、ATCC VR−372およびATCC VR−124
5);トナテ(Tonate)ウイルス(例えば、ATCC VR−925);トリニテ
ィウイルス(例えば、ATCC VR−469);ユナウイルス(例えば、ATCC V
R−374);ワタロアウイルス(例えば、ATCC VR−926);Y−62−33
ウイルス(例えば、ATCC VR−375);オニョンニョンウイルス、東部ウマ脳脊
髄炎ウイルス(例えば、ATCC VR−65およびATCC VR−1242);西部
ウマ脳脊髄炎ウイルス(例えば、ATCC VR−70、ATCC VR−1251、A
TCC VR−622およびATCC VR−1252);ならびにコロナウイルス(例
えば、ATCC VR−740)およびHamre(1966)Proc Soc Ex
p Biol Med 121:190に記載のものが挙げられる。
他の送達方法および媒体が使用され得る(例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウ
イルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合DNA単独(例えば、米国特
許出願番号08/366,787(1994年12月30日出願)およびCuriel(
1992)Hum Gene Ther 3:147−154を参照のこと)、リガンド
連結DNA(例えば、Wu(1989)J Biol Chem 264:16985−
16987を参照のこと)、真核生物細胞送達ビヒクル細胞(例えば、米国特許出願番号
08/240,030(1994年5月9日出願)および米国特許出願番号08/404
,796を参照のこと)、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃(米
国特許第5,149,655号に記載されるような)、米国特許第5,206,152号
およびWO92/11033に記載されるような電離放射線、核酸電荷中和または細胞膜
との融合)。さらなるアプローチは、Philip(1994)Mol Cell Bi
ol 14:2411−2418およびWoffendin(1994)Proc Na
tl Acad Sci 91:1581−1585に記載される。
参照のこと)。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベ
クターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド(例えば、WuおよびWu(1987)J
.Biol.Chem.262:4429−4432に記載されるようなアシアロオロソ
ムコイド、Hucked(1990)Biochem Pharmacol 40:25
3−263に記載されるようなインスリン、Plank(1992)Bioconjug
ate Chem 3:533−539に記載されるようなガラクトース、ラクトースま
たはトランスフェリン)に連結された合成遺伝子送達分子(例えば、重合DNA結合カチ
オン様ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン)とともにインキュベートされ得る。
2および米国特許第5,580,859号に記載される。取り込み効率は、生体分解性の
ラテックスビーズを用いて改良され得る。DNAコートラテックスビーズは、ビーズによ
るエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処
理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのDNAの放出を
容易にすることによってさらに改良され得る。
、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445、およびEP−
524,968に記載される。米国特許出願60/023,867に記載されるように、
非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のため
に従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド(例
えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランス
フェリン)に連結された、重合性DNA結合カチオン(例えば、ポリリジン、プロタミン
、およびアルブミン)のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他
の送達系は、種々の組織特異的または普遍的に活性なプロモーターの制御下に遺伝子を含
むDNAをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイ
ルス送達は、機械的送達システム(例えば、Woffendinら(1994)Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 91(24):11581−11585に記載
されるアプローチ)を含む。さらに、コード配列およびこのような配列の発現産物は、光
重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達のために使用され
得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子送達粒子銃の使用(
米国特許第5,149,655号に記載されるような);移入された遺伝子を活性化する
ための電離放射線の使用(米国特許第5,206,152号およびWO92/11033
に記載されるような)を含む。
2,120号および同4,762,915号;WO95/13796;WO94/236
97;およびWO91/14445;EP−0524968;およびStryer、Bi
ochemistry、236−240頁(1975)、W.H.Freeman、Sa
n Francisco;Szoka(1980)Biochem Biophys A
cta 600:1;Bayer(1979) Biochem Biophys Ac
ta 550:464;Rivnay(1987)Meth Enzymol 149:
119;Wang(1987)Proc Natl Acad Sci 84:7851
;Plant(1989)Anal Biochem 176:420に記載されるビヒ
クルである。
の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体
において、約0.01mg/kg〜50mg/kgまたは0.05mg/kg〜約10m
g/kgのDNA構築物である。
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、(1)被験体に直接;(2)
エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて;または(3)組換えタンパク質の発現のた
めにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る
。ヒト被験体もまた処置され得る。
いは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた
、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与、坐剤、および経皮(t
ransdermal)または経皮(transcutaneous)適用(例えば、W
O98/20734を参照のこと)、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。
投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
知であり、そして例えばWO93/14778に記載されている。エキソビボ適用に有用
である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファー
ジ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
手順:例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブ
レン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へ
のポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのDNAの直接微量注入(これらはすべて
当該分野で周知である)で達成され得る。
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポ
リヌクレオチド組成物および/またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
1つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである:アシアロオロソム
コイド(ASOR);トランスフェリン;アシアロ糖タンパク質;抗体;抗体フラグメン
ト;フェリチン;インターロイキン;インターフェロン;顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコ
ロニー刺激因子(M−CSF)、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原(例
えば、エンベロープタンパク質)もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタ
ンパク質(例えば、RIIとして知られるplasmodium falciparum
の環境スポロゾイト(circumsporozoite)タンパク質由来の17アミノ
酸ペプチド)。
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン
、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドとともに
含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレン
グリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含
有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストラ
ンまたはDEAEデキストランである。また、キトサンおよびポリ(乳酸−コ−グリコリ
ド)。
所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への
送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ
得る。
持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比
は、変動し得るが、一般的に約1:1(mgDNA:マイクロモル脂質)であるか、また
はより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説につ
いては、HugおよびSleight(1991)Biochim.Biophys.A
cta.1097:1−17;Straubinger(1983)Meth.Enzy
mol.101:512−527を参照のこと。
アニオン性(負に荷電した)および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは
、機能的な形態の、プラスミドDNA(Felgner(1987)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 84:7413−7416);mRNA(Malone(
1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6077−6081
;および精製した転写因子(Debs(1990)J.Biol.Chem.265:1
0189−10192)の細胞内送達を媒介することが示されている。
オキシ)プロピル]−N,N,N−トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは
、GIBCO BRL、Grand Island、NYからの商標リポフェクチン(L
ipofectin)の下で入手可能である(Felgner前出もまた参照のこと)。
他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテース(transfecta
ce)(DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE(Boerhinger)が
挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利
用可能な物質から調製され得る。例えば、DOTAP(1,2−ビス(オレイルオキシ)
−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の記載について、Szok
a(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:4194−41
98;WO90/11092を参照のこと。
Lipids(Birmingham,AL)から容易に入手可能であるか、または容易
に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホ
スファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイル
ホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOP
G)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などが挙げられる。こ
れらの物質はまた、適切な比率でDOTMAおよびDOTAPの出発物質と混合され得る
。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
きな単一膜の小胞(LUV)を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で
公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Straubinger(1983)Me
th.Immunol.101:512−527;Szoka(1978)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 75:4194−4198;Papahadjop
oulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394:483;
Wilson(1979)Cell 17:77);DeamerおよびBangham
(1976)Biochim.Biophys.Acta 443:629;Ostro
(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76:836;
Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:33
48);EnochおよびStrittmatter(1979)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 76:145;Fraley(1980)J.Biol.C
hem.(1980)255:10431;SzokaおよびPapahadjopou
los(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:145;な
らびにSchaefer−Ridder(1982)Science 215:166を
参照のこと。
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド/ポリペプチドとともに含ま
れ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、キロミクロン、HDL、IDL、LD
L、およびVLDLが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または
融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体(例えば、
アセチル化LDL)が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプ
ターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタン
パク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはそ
の組成物中には含まれない。
ク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質A、B、C、D
、およびEが単離および同定されている。少なくともこれらのうち2つは、いくつかのタ
ンパク質を含み、ローマ数字、AI、AII、AIV;CI、CII、CIIIによって
命名されている。
するキロミクロンはA、B、C、およびEからなり、そして時間が経つとこれらのリポタ
ンパク質はAを欠失し、そしてCおよびEアポタンパク質を獲得する。VLDLは、A、
B、C、およびEアポタンパク質を含み、LDLはアポタンパク質Bを含み;そしてHD
Lはアポタンパク質A、C、およびEを含む。
985)Annu Rev.Biochem 54:699;Law(1986)Adv
.Exp.Med.Biol.151:162;Chen(1986)J Biol C
hem 261:12918;Kane(1980)Proc Natl Acad S
ci USA 77:2465;Utermann(1984)Hum Genet 6
5:232に記載されている。
リン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質
において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在
するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Meth.Enzymo
l.128(1986)に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性につ
いてアポタンパク質の立体構造を補助するために選択される。脂質の組成はまた、ポリヌ
クレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
。このような方法は、Meth.Enzymol.(前出);Pitas(1980)J
.Biochem.255:5454−5460およびMahey(1979)J Cl
in.Invest 64:743−750に記載される。リポタンパク質はまた、イン
ビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって
産生され得る。例えば、Atkinson(1986)Annu Rev Biophy
s Chem 15:403およびRadding(1958)Biochim Bio
phys Acta 30:443を参照のこと。リポタンパク質はまた、Biomed
ical
Techniologies,Inc.,Stoughton,MA,USAのような
商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Zuckerma
nnら、WO98/06437に見い出され得る。
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドを有する組
成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤
は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれをも有する。ポリカチオン性
薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用
され得る。
リアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例としては、ヒストン、プロタ
ミン、ヒト血清アルブミン、DNA結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、DN
Aウイルス由来のコートタンパク質(例えば、X174)が挙げられる。転写因子もまた
、DNAに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に
言えば、転写因子(例えば、C/CEBP、c−jun、c−fos、AP−1、AP−
2、AP−3、CPF、Prot−1、Sp−1、Oct−1、Oct−2、CREP、
およびTFIID)は、DNA配列に結合する塩基性ドメインを含む。
rescine)を含む。
ポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
ンが挙げられる。LipofectinTM、およびlipofectAMINETMは
、ポリヌクレオチド/ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成す
るモノマーである。
本発明のストレプトコッカス抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにお
いて使用され得る(または、逆に抗ストレプトコッカス抗体は、抗原レベルを検出するた
めに使用され得る)。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイが、侵襲性の
診断方法を置換するために開発され得る。生物学的サンプル(例えば、血液サンプルまた
は血清サンプルを含む)内のストレプトコッカスタンパク質に対する抗体が検出され得る
。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれ
らは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、ま
たは直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた
、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッ
セイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分
子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを
増幅するアッセイは公知である;これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッ
セイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ(例えば、ELASAアッセイ)
である。
セイの実行に必要とされる残りの試薬および物質(例えば、適切な緩衝液、塩溶液など)
ならびに適切なセットのアッセイの説明書と共に本発明の組成物を含む適切な物質をパッ
ケージすることによって構築される。
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による2つの核酸配列の互いの会合をいう
。代表的には、1つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離してい
る。次いで、2つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影
響を与える因子としては、以下が挙げられる:溶媒のタイプおよび容量;反応温度;ハイ
ブリダイゼーションの時間;撹拌;液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロ
ックする薬剤(Denhardt’s試薬またはBLOTTO);配列の濃度;配列の会
合の速度を増大させる化合物(硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール)の使用
;およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Sambrook
ら(前出)第2巻、第9章、9.47〜9.57頁を参照のこと。
ハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算
されたTmより約120〜200℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべき
である。温度および塩条件はしばしば、フィルター上に固定したゲノムDNAのサンプル
が目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄され
る、予備的な実験において経験的に決定され得る。Sambrookら、9.50頁を参
照のこと。
複雑さ、および(2)プローブおよび検出される配列の間の相同性、である。研究される
フラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については0.1〜1μg、高
度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については10−9〜10−8gまで、
10倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブ
ロッティング、ハイブリダイゼーション、および露光の時間、より少量の出発ポリヌクレ
オチド、およびより低い特異的活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵
母遺伝子は、1μgの酵母DNAで開始し、2時間ブロットし、そして4〜8時間108
cpm/μgのプローブを用いてハイブリダイズして、わずか1時間の露光時間を用いて
検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存的アプローチは、10μgの
DNAで開始し、一晩ブロットし、そして108cpm/μgより多いプローブを用いて
10%硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約24時間露光時間を生じる
。
ドの融解温度(Tm)、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄につ
いての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメント
に対して100%相同なわけではない。他の共通して直面する変数には、長さ、ハイブリ
ダイズする配列の全G+C含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝
液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近
似され得る:
Tm=81+16.6(log10Ci)+0.4[%(G+C)]−0.6(%ホ
ルムアミド)−600/n−1.5(%ミスマッチ)。
ここでCiは塩濃度(一価イオン)であり、およびnは塩基対内のハイブリッドの長さで
ある(MeinkothおよびWahl(1984)Anal.Biochem.138
:267−284からわずかに改変した)。
えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度な
らびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度(す
なわち、ストリンジェンシー)が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリ
ダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少す
る。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合(遺伝
子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように
)、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが
増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイズするバンドの強度、およびバッ
クグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少と
ともに増大する。
的フラグメントに95%〜100%相同であるプローブについて42℃、90%〜95%
相同では37℃、85%〜90%相同では32℃である。より低い相同性については、上
記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきであ
る。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプロー
チは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開
始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウ
ンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露
光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつか
のハイブリダイゼーションおよび/または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験される
べきである。
本発明に従う核酸プローブを利用する、PCR、分枝DNAプローブアッセイ、または
ブロッティング技術のような方法は、cDNAまたはmRNAの存在を決定し得る。プロ
ーブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本
発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
チセンス鎖の両方を含む)にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミ
ノ酸配列をコードするが、ネイティブなストレプトコッカス配列は、細胞に存在する実際
の配列であるので、好ましい。mRNAは、コード配列を表し、従ってプローブはコード
配列に相補的であるべきであり、一本鎖cDNAはmRNAに相補的であり、従ってcD
NAプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
い。核酸プローブが標的ヌクレオチドと、検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列お
よび長さのいくらかの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸プロ
ーブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらな
るストレプトコッカス配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助
となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの5’末端に付着され
得、ここでそのプローブ配列の残りはストレプトコッカス配列に相補的である。あるいは
、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得るが、但し、プローブ配
列は、ストレプトコッカス配列とハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二
重鎖を形成するために、ストレプトコッカス配列との十分な相補性を有する。
条件など)に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存し
て、核酸プローブは、代表的には、少なくとも10〜20ヌクレオチド、好ましくは15
〜25、そしてより好ましくは少なくとも30ヌクレオチドを含むが、これよりも短くて
もよい。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形
成するのにより低い温度を必要とする。
m.Chem.Soc.(1981)103:3185))、またはUrdeaら(Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:7461)に従って、ま
たは市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
AまたはRNAが適切である。他の適用については、改変(例えば、ホスホロチオエート
またはメチルホスホネートのような骨格の改変)が組み込まれ得、インビボの半減期を増
大させ、RNA親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性を増大させるためなどに使用され得
る(例えば、AgrawalおよびIyer(1995)Curr Opin Biot
echnol 6:12−19;Agrawal(1996)TIBTECH 14:3
76−387を参照のこと);ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る(例え
ば、Corey(1997)TIBTECH 15:224−229;Buchardt
ら(1993)TIBTECH 11:384−386を参照のこと)。
手段である。このアッセイは、Mullisら、(Meth.Enzymol.(198
7)155:335−350);米国特許第4,683,195号および同第4,683
,202号に記載されている。2つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブ
リダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増幅標的(ま
たはその相補物)の配列にハイブリダイズしない配列を含み、二重鎖の安定性を補助する
か、または、例えば、簡便な制限部位を組み込む。代表的には、このような配列は、所望
のストレプトコッカス配列に隣接する。
ら標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後
、それらはより従来的な方法(例えば、サザンブロット)によって検出され得る。サザン
ブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、ストレプトコッカス配列(またはそ
の相補物)にハイブリダイズする。
なブロッティング技術によって検出され得る。mRNA、またはmRNAからポリメラー
ゼ酵素を使用して生成されたcDNAは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得
る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされ
る。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズ
していないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。
代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
以下の実施例は、Streptococcusにおいて同定された核酸配列を、それら
の推定翻訳産物と共に記載する。これらの実施例は、一般に、以下の形式:
・Streptococcusにおいて同定されたヌクレオチド配列
・この配列の推定翻訳産物
・抗原性を示す、翻訳産物のコンピューター分析(例えば、PSORT出力)、
である。
配列決定された特定の株は、血清型V由来であり、これは、R抗原を発現する、イタリア
で単離された臨床株である(ISS/Rome/Italyコレクション、株2603
V/R)。これらの実施例のいくつかについて、S.pyogenes由来の対応する配
列もまた示す。GBSおよびGASが、この様式で相同性を示す場合、本質的機能を示唆
する種と良好な異種間反応性を与える種との間に保存性が存在する。
来のヌクレオチド配列を記載する。この相同性の欠如は、GASをGBSと区別するため
に、およびGAS特異的産物を作製するために有用である、分子を与える。同じことが、
GASホモログを欠くGBS配列についても当てはまり、例えば、これらは、GBS特異
的産物を作製するために有用である。
含む。配列が類似するタンパク質は、一般に、構造および機能の両方が類似し、そしてそ
の相同性は、しばしば、共通の進化起源を示す。既知機能のタンパク質の配列との比較は
、新規配列に対して推定のタンパク質機能を割り当てるためのガイドとして広範に使用さ
れ、そしてゲノム全体の分析において特に有用であることが証明されている。
評価し得る。例えば、これらのタンパク質を組換え発現させ、そしてこれらを使用して、
イムノブロットによって患者血清をスクリーニングし得る。タンパク質と患者血清との間
の陽性反応は、その患者が、その問題のタンパク質に対して既に免疫応答を備えている(
すなわち、そのタンパク質が免疫原である)ことを示す。この方法はまた、免疫優性タン
パク質を同定するために使用され得る。これらの実施例で使用されるマウスモデルもまた
、使用され得る。
用され得る。これらは、タンパク質が細胞表面に位置する、直接のコンフォメーションに
ついて使用され得る。標識した抗体(例えば、FACSのための蛍光標識)を、インタク
トな細菌と共にインキュベートし得、そして細菌表面上の標識の存在は、そのタンパク質
の位置を確認する。
−GBSタンパク質発現についての全組換えE.coli細胞抽出物のSDS−PAG
E分析
−タンパク質精製後のSDS−PAGE分析
−組換えタンパク質に対して惹起された抗血清を使用する、全GBS細胞抽出物のウエ
スタンブロット分析
−組換えタンパク質に対して惹起された抗血清を使用する、GBSに対するFACSお
よびELISA分析
−インビボ受動保護アッセイの結果。
ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレーム(ORF)を、GLIMMERプ
ログラム[Salzbergら(1998)Nucleic Acids Res 26
:544−8]を使用して推定した。必要な場合、開始コドンを、上流のDNA配列にお
けるリボソーム結合部位およびプロモーター領域の存在に基づいて、手動で修正および補
正した。
ol.Biol.215:403−410]およびPRAZE(Smith−Water
manアルゴリズムの改良型)[SmithおよびWaterman(1981)J M
ol Biol 147:195−7;Fleischmannら(1995)Scie
nce 269:496−512を参照のこと]を使用して、非重複タンパク質データベ
ースに対してスクリーニングした。
た:(i)PSORT[Nakai(1991)Bull.Inst.Chem.Res
.,Kyoto Univ.69:269−291;HortonおよびNakai(1
996)Intellig.Syst.Mol.Biol.4:109−115;Hor
tonおよびNakai(1997)Intellig.Syst.Mol.Biol.
5:147−152];(ii)SignalP[NielsenおよびKrogh(1
998)Proceedings of the Sixth Internation
al Conference on Intelligent Systems for
Molecular Biology(ISMB 6),AAAI Press,Me
nlo Park,California,122−130頁;Nielsenら(19
99)Protein Engineering 12:3−9;Nielsenら(1
997)Int.J.Neural Sys.8:581−599];および(iii)
ORF配列の目視検査。シグナル配列を「予想部位(possible site)」値
で示す場合、その値は、シグナルペプチドのC末端残基を表す(例えば、26の「予想部
位」は、そのシグナル配列がアミノ酸1〜26からなることを意味する)。
位置決めした:(i)PSORT[上記を参照のこと];(ii)「原核生物膜リポタン
パク質脂質結合部位」PROSITEモチーフ[Hofmannら(1999)Nucl
eic Acids Res.27:215−219;BucherおよびBairoc
h(1994)Proceedings 2nd International Con
ference on Intelligent Systems for Molec
ular Biology(ISMB−94),AAAI Press,53−61頁]
;および(iii)パターン(M、L、V)x{9、35}LxxCxを使用する、GC
G Wisconsin Packageにおいて利用可能なFINDPATTERNS
プログラム。
T[上記を参照のこと];および(ii)TopPred[von Heijne(19
92)J.Mol.Biol.225:487−494]。
schettiら(1990)Mol Microbiol 4:1603−5]を、パ
ターン(L、I、V、M、Y、F)Px(T、A、S、G)(G、N、S、T、A、L)
を使用する、FINDPATTERNSで位置決めした。
s Biochem Sci 16:246−50]を、FINDPATTERNSを使
用して位置決めした。
ococciの表面上に発現されることが実験的に見出されているからである[例えば、
PancholiおよびFischetti(1992)J Exp Med 176:
415−26;PancholiおよびFischetti(1998)J Biol
Chem 273:14503−15]。
GBS遺伝子を、以下の2つの異なる型の融合タンパク質としてE.coliにおける
発現を容易にするようにクローニングした:
a)アミノ末端にヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質(His−gbs)
b)アミノ末端にGST融合パートナーを有するタンパク質(Gst−gbs)。
使用して行った。この技術は、E.coliゲノム内への、およびE.coliゲノムか
らの、λファージの組み込みおよび切り出しを媒介する、部位特異的組換え反応に基づく
。1回のクローニング実験には、以下の工程が含まれる:
1−GBS染色体DNAを増幅して、attB組換え部位に隣接する単一のORFをコ
ードするPCR産物を得る工程
2−このPCR産物をpDONRベクター(attP部位を含む)にBP反応(att
B×attP部位)を介して挿入する工程。この反応は、いわゆる、「pEntry」ベ
クターを与え、これは、ここで、そのインサートに隣接するattL部位を含む。
inationベクター)に、pEntryプラスミドとpDestinationプラ
スミドとの間のLR反応(attL×attR部位)を介して挿入する工程。
染色体DNA調製のために、GBS株2603 V/R(Istituto Supe
riore Sanita、Rome)を、2リットルのTH Broth(Difco
)中37℃で、対数期まで増殖させ、遠心分離によって回収し、そして40mlのTES
(50mM Tris(pH8)、5mM EDTA(pH8)、20%スクロース)中
に溶解した。2.5mlのリゾチーム溶液(TES中25mg/ml)および0.5ml
のムタノリシン(Sigma M−9901、H2O中25000U/ml)の添加後、
懸濁液を、37℃で1時間インキュベートした。1mlのRNase(20mg/ml)
および0.1mlのプロテイナーゼK(20mg/ml)を添加し、そしてインキュベー
ションを、37℃で30分間続けた。
N−ラウリルサルコシン)を添加して、そして37℃で1時間、頻繁に反転させながら
インキュベートすることによって得た。フェノール、フェノール−クロロホルムおよびク
ロロホルムでの連続抽出後、DNAを、0.3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)および
2容量の無水エタノールで沈殿させた。DNAペレットを70%エタノールでリンスし、
そしてTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA(pH8))に溶解
した。DNA濃度を、OD260によって評価した。
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、各ORFのコード配列に基づいて設計した。こ
の目的は、そのタンパク質の細胞外領域を発現させることであった。従って、推定シグナ
ルペプチドを除去し(推定リーダー配列から直ぐ下流の5’末端増幅プライマー配列を推
定することによって)、そしてC末端細胞壁結合領域を除去した(例えば、LPXTGモ
チーフおよび下流のアミノ酸)。さらなるヌクレオチドを欠失させた場合、これを、接尾
語「d」によって示す(例えば、「GBS352d」−表Vを参照のこと)。逆に、接尾
語「L」は、これらの欠失を伴わない発現をいう。C末端残基およびN末端残基の欠失も
また、時折作製し、接尾語「C」または「N」で示す。
)を、表IIに示されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列によって、明確に規定する
。
ttB1部位およびattB2部位を含んだ:
順方向プライマー:5’−GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG
CTCT−ORFインフレーム−3’(このORFの最初のコードトリプレットがTで始
まる場合、このORFに先行するTCT配列を除去した)。
GTT−ORF逆方向相補体−3’。
reslauerら[PNAS USA(1986)83:3746−50]によって記
載されるように決定した)に依存した。選択されたオリゴの平均融解温度は、ハイブリダ
イズする領域について、50〜55℃であり、そしてオリゴ全体について、80〜85℃
であった。
標準的なPCRプロトコルは、以下であった:50ngのゲノムDNAを、最終容量1
00μl中、0.5μMの各プライマー、200μMの各dNTP、1.5mM MgC
l2、1×緩衝液(Mg++なし)(Gibco−BRL)および2ユニットのTaq
DNAポリメラーゼ(Platinum Taq、Gibco−BRL)の存在下で、テ
ンプレートとして使用した。各サンプルに対して、以下の二重工程の増幅を行った:ハイ
ブリダイズ温度として、50℃を使用して行う5サイクル、その後の、68℃での25サ
イクル。
変性:94℃、2分
5サイクル: 変性:94℃、30秒
ハイブリダイゼーション:50℃、50秒
伸長:72℃、1分または2分40秒
25サイクル: 変性:94℃、30秒
ハイブリダイゼーション:68℃、50秒
伸長:72℃、1分または2分40秒。
り長いORFについては、2分40秒であった。増幅を、Gene Amp PCRシス
テム9600(Perkin Elmer)を使用して行った。
ードし、そして増幅フラグメントのサイズを、DNA分子量標準(DNAマーカーIX
Roche、1kb DNAラダー Biolabs)と比較した。
よび200μlの30% PEG 8000/30mM MgCl2を、100μl P
CR反応物に添加した。ボルテックス後、DNAを、10000gで20分間遠心分離し
、1容量の70%エタノールで洗浄し、そしてペレットを、30μlのTE中に溶解した
。350bpより小さいPCR産物を、PCR精製キット(Qiagen)を使用して精
製し、そして30μlの提供される溶出緩衝液で溶出させた。
て滴定分子量標準に対して比較した。
クローニングを、GatewayTM技術の「1チューブプロトコル」に従って行った
。この技術は、PCR産物を発現ベクターに直接挿入するための2工程反応(BPおよび
LR)からなる。
物の挿入を可能にする。本発明者らが使用したpDONRTM201ベクターは、PCR
インサートを欠くバックグラウンドコロニーを最小化するための、attP1部位とat
tP2部位との間のキラー毒素遺伝子ccdB、およびカナマイシン耐性のための、選択
マーカー遺伝子を含む。この反応は、いわゆる、pEntryベクターを生じ、ここで、
GBS遺伝子は、attL1部位とattL2部位との間に位置した。
.5μlの最終容量中、2,5μlのBPクローナーゼ(clonase)TMと共に、
25℃で4時間インキュベートした。
tR部位を含む、pDestinationベクター)へのGBS遺伝子(ここでは、p
Entryベクターに存在する)の挿入を可能にする。2つのpDestination
ベクターを使用した(N末端GST融合物についてpDEST15(図86);およびN
末端Hisタグ化融合物についてpDEST17−1(図87))。両方は、T7 RN
Aポリメラーゼプロモーター下でのORF融合コードmRNAの転写を可能にする[St
udierら(1990)Meth.Enzymol 185:60ff]。
inationベクターおよび1.5μlのLRクローナーゼTMを添加した。この反応
物を、25℃で2時間インキュベートし、そして1μlの1mg/mlプロテイナーゼK
溶液を37℃、15分で用いて停止させた。
M細胞を形質転換した(0.1cm、200オーム、25μF)。BL21−SI細胞は
、塩誘導性prUプロモーターの制御下に組み込まれたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子
を含む[Gowrishankar(1985)J.Bacteriol.164:43
4ff]。エレクトロポレーション後、細胞を、1mlのSOC培地(20g/lバクト
トリプトン、5g/l酵母抽出物、0.58g/l NaCl、0.186g/l KC
l、20mM グルコース、10mM MgCl2)中に希釈し、そして37℃で1時間
インキュベートした。200μlの細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB
ONプレート(NaClを含まないLuria Broth培地)上にプレートした。次
いで、プレートを、37℃で16時間インキュベートした。
eway適合性pEntryプラスミドの将来の調製を可能にするために、2.5μlの
BP反応物を、3μlの0.15mg/mlのプロテイナーゼK溶液の存在下で15分間
インキュベートし、次いで、−20℃に維持した。この反応は、この様式で、他のDes
tinationベクター中の遺伝子の将来の導入のためのEntryクローンを産生す
るようにE.coliコンピテント細胞を形質転換するために利用可能であった。
LR反応の形質転換から誘導された単一コロニーを、3ml LBON(100μg/
ml アンピシリン)中の小スケールの培養物として播種し、25℃で一晩増殖させた。
50〜200μlの培養物を、3ml LBON/Amp中に0.1の開始OD600に
まで播種した。培養物を、0.4〜0.6のOD600まで37℃で増殖させ、そして組
換えタンパク質発現を、最終濃度0.3MのNaClの添加によって誘導した。2時間の
インキュベーション後、最終ODをチェックして、培養物を氷上で冷却した。0.5のO
D600の細胞を、遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、50μlのタンパク質
ローディングサンプル緩衝液(50mM TRIS−HCl(pH6.8)、0.5%
w/v SDS、2.5% v/v グリセリン、0.05% w/v ブロモフェノー
ルブルー、100mM DTT)中に懸濁し、そして100℃で5分間インキュベートし
た。10μlのサンプルを、SDS−PAGEおよびクーマシーブルー染色によって分析
し、誘導されたタンパク質のバンドの存在を確認した。
単一コロニーを、25ml LBON(100μg/mlアンピシリン)中に播種し、
そして25℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、500ml LBON/amp中に
播種し、そして0.4〜0.6のOD600値まで25℃で振盪しながら増殖させた。次
いで、タンパク質発現を、最終濃度0.3MのNaClの添加によって誘導した。25℃
での3時間でのインキュベーション後、最終OD600をチェックして、培養物を氷上で
冷却した。6000rpm(JA10ローター、Beckman)での20分間の遠心分
離後、細胞ペレットを、精製のために処理したか、または−20℃で凍結させた。
の1つにおいて精製した。
1.−20℃から氷浴にペレットを移し、そして各ペレットを10ml B−PERTM
溶液(Bacterial−Protein Extraction Reagent、
Pierce cat.78266)、10μlの100mM
MgCl2溶液、50μlのDNAseI(Sigma D−4263、PBS中10
0Kユニット)および100μlのPBS中100mg/mlのリゾチーム(Sigma
L−7651、最終濃度1mg/ml)で再構成する。
2.再懸濁したペレットを50ml遠心管に移し、そして3〜4回ボルテックスしながら
、30〜40分間室温で放置する。
3.約30〜40000×gで15〜20分間遠心分離する。
4.1mlのFast Flow Ni−activated Chelating S
epharose(Pharmacia)を含むPoly−Prep(Bio−Rad)
カラムを調製する。50mM リン酸緩衝液、300mM NaCl(pH8.0)で平
衡化する。
5.ペレットを−20℃で保存し、そしてカラムに上清をロードする。
6.フロースルーを廃棄する。
7.10mlの20mM イミダゾール緩衝液、50mM ホスフェート、300mM
NaCl(pH8.0)で洗浄する。
8.4.5ml(1.5ml+1.5ml+1.5ml)の250mM イミダゾール緩
衝液、50mM ホスフェート、300mM NaCl(pH8.0)で、カラムに結合
したタンパク質を溶出し、そして各々約1.5mlの3つの画分を収集する。各チューブ
に15μlの200mM DTT(最終濃度2mM)を添加する。
9.Bradoford法で収集画分のタンパク質濃度を測定し、SDS−PAGEによ
ってタンパク質を分析する。
10.SDS−PAGE分析の結果を待つ間、+4℃で収集画分を保存する。
11.免疫のために、40%グリセロール中0.5mlの各20〜100μgの4〜5個
のアリコートを調製する。希釈緩衝液は、上記の溶出緩衝液+2mM DTTである。免
疫までにアリコートを−20℃で保存する。
1.細菌を、遠心分離によって500ml培養物から収集する。必要な場合、細菌ペレッ
トを−20℃で保存する。−20℃から室温にペレットを移し、そして各ペレットを10
ml B−PERTM溶液、10μlの100mM MgCl2溶液(最終1mM)、5
0μlのDNAseI(PBS中100Kユニットに等価)および100μlのPBS中
100mg/mlのリゾチーム(Sigma
L−7651)溶液(10mgに等価、最終濃度1mg/ml)で再構成する。
2.再懸濁したペレットを50ml遠心管に移し、そして3〜4回ボルテックスしながら
、30〜40分間室温で放置する。
3.約30〜4000×gで15間遠心分離し、ペレットを収集する。
4.50mM TRIS−HCl、1mM TCEP{トリス(2−カルボキシエチル)
−ホスフィン塩酸塩、Pierce}、6M グアニジン塩酸塩(pH8.5)でペレッ
トを溶解、磁気棒を用いて10分間攪拌する。
5.上記のように遠心分離し、上清を収集する。
6.1mlのFast Flow Ni−activated Chelating S
epharose(Pharmacia)を含むPoly−Prep(Bio−Rad)
カラムを調製する。5mlのH2Oでカラムを2回洗浄し、そして50mM TRIS−
HCl、1mM TCEP、6M グアニジン塩酸塩(pH8.5)で平衡化する。
7.工程5由来の上清をカラムにロードし、5mlの50mM TRIS−HCl緩衝液
、1mM TCEP、6M 尿素(pH8.5)で洗浄する。
8.10mlの20mM イミダゾール、50mM TRIS−HCl、6M 尿素、1
mM TCEP(pH8.5)でカラムを洗浄する。可能性のあるさらなるコントロール
のために最初の5mlを収集して取っておく。
9.250mM イミダゾール、50mM TRIS−HCl、6M 尿素、1mM T
CEP(pH8.5)を含む4.5mlの緩衝液で、カラムに結合したタンパク質を溶出
させる。溶出緩衝液を、3回の1.5mlアリコートで添加し、そして対応する3つの画
分を収集する。15μl DTT(最終濃度2mM)を各画分に添加する。
10.Bradoford法でこれらの画分のタンパク質濃度を測定し、SDS−PAG
Eによってタンパク質を分析する。
11.選択した画分を、10% グリセロール、0.5M アルギニン、5mM
還元型グルタチオン、0.5mM 酸化型グルタチオン、2M 尿素を含む、50mM
リン酸Na緩衝液(pH8.8)に対して一晩透析する。
12.10% グリセロール、0.5M アルギニン、5mM 還元型グルタチオン、0
.5mM 酸化型グルタチオンを含む、50mM リン酸Na緩衝液(pH8.8)に対
して透析する。
13.透析したタンパク質調製物を遠心分離によって清澄化し、そして不溶性物質を廃棄
し、そしてBradford法でタンパク質濃度を測定する。
14.免疫する予定の各タンパク質について、グリセロール含量を40%にまで調製した
後、0.5mlの各20〜100μgの4〜5個のアリコートを調製する。免疫までにア
リコートを−20℃で保存する。
1.細菌を、遠心分離によって500ml培養物から収集する。必要な場合、細菌ペレッ
トを−20℃で保存する。ペレットを−20℃から室温に移し、そして各ペレットを10
ml B−PERTM溶液、10μlの100mM MgCl2溶液(最終1mM)、5
0μlのDNAseI(PBS中100Kユニットに等価)および100μlのPBS中
100mg/mlのリゾチーム(Sigma
L−7651)(10mgに等価、最終濃度1mg/ml)で再構成する。
2.再懸濁したペレットを50ml遠心管に移し、そして3〜4回ボルテックスしながら
、30〜40分間室温で放置する。
3.約30〜40000×gで15〜20分間遠心分離する。
4.遠心分離ペレットを廃棄し、そして以下のように、上清をクロマトグラフィーカラム
にロードする。
5.0.5mlのGlutathione−Sepharose 4B樹脂を含むPol
y−Prep(Bio−Rad)カラムを調製する。カラムを1mlのH2Oで2回洗浄
し、そして10mlのPBS(pH7.4)で平衡化する。
6.カラムに上清をロードし、そしてフロースルーを廃棄する。
7.カラムを10mlのPBS(pH7.4)で洗浄する。
8.カラムに結合したタンパク質を4.5mlの50mM TRIS緩衝液、10mM
還元型グルタチオン(pH8.0)で溶出する(1.5ml+1.5ml+1.5mlで
添加し、各々約1.5mlの各3画分を収集する)。
9.Bradoford法でこれらの画分のタンパク質濃度を測定し、SDS−PAGE
によってタンパク質を分析する。
10.SDS−PAGE分析の結果を待つ間、+4℃で収集画分を保存する。
11.免疫する予定の各タンパク質について、0.5mlの40%グリセロール中の各2
0〜100μgの4〜5個のアリコートを調製する。希釈緩衝液は、50mM TRIS
−HCl、2mM DTT(pH8.0)である。免疫までにアリコートを−20℃で保
存する。
図167〜170、図238、および図239のレーン2〜6に示される実験について
、GBSタンパク質を、N末端でチオレドキシンに融合し、そしてC末端でポリHisテ
ールに融合した。クローニングのために使用したプラスミドは、pBAD−DEST49
(Invitrogen GatewayTM技術)であり、発現は、L(+)−アラビ
ノース依存性プロモーターの制御下にある。これらのGBS抗原の産生のために、細菌を
、100μg/mlのアンピシリンを含有するRM培地(6g/l Na2HPO4、3
g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、1g/l NH4Cl(pH7.4)
、2% カザミノ酸、0.2% グルコース、1mM MgCl2)上で増殖させた。細
胞がOD600=0.5に到達するまで37℃でインキュベートした後、タンパク質発現
を、0.2%(v/v)L(+)アラビノースを添加して、3時間誘導する。
精製したタンパク質を使用して、4匹のCD−1マウスの群に腹腔内免疫した。各20
μgの精製タンパク質を、1日目、21日目および35日目にフロイントアジュバント中
で注射した。免疫応答を、0日目および49日目に採取したサンプルを使用することによ
ってモニターした。血清を、マウスの各群由来の血清のプールとして分析した。
GBS血清型V2603 V/R株を、TSA血液寒天プレートにプレートし、37℃
で一晩インキュベートした。細菌コロニーを、滅菌ドラコン(dracon)スワブを使
用してプレートから収集し、そして100mlのTodd Hewitt Brothへ
播種した。細菌増殖を、OD600を追跡することによって、30分毎にモニターした。
OD600=0.7〜0.8になるまで、細菌を増殖させた。培養物を、5000rpm
で20分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細菌を、PBSで1回洗浄し、0.05
%パラホルムアルデヒドを含有する1/2培養物容量のPBS中に再懸濁し、そして37
℃で1時間インキュベートし、次いで、4℃で一晩インキュベートした。
ッキング血清(Newborn Calf Serum、Sigma)中に再懸濁し、そ
して室温で20分間インキュベートした。次いで、細胞を、希釈緩衝液(PBS中の20
% Newborn Calf Serum、0.1% BSA)中の100μlの希釈
血清(1:200)と共に、4℃で1時間インキュベートした。細胞を5000rpmで
遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を、200μlの洗浄緩衝液(PBS中の0.1
% BSA)を添加することによって洗浄した。50μlのR−フィコエリトリン結合体
化F(ab)2ヤギ抗マウス(希釈緩衝液中に1:100希釈した)を、各サンプルに添
加し、そして4℃で1時間インキュベートした。細胞を、5000rpmでの遠心分離に
よってスピンダウンし、そして200μlの洗浄緩衝液を添加することによって洗浄した
。上清を吸引し、細胞を200μlPBS中に再懸濁した。サンプルを、FACScan
チューブに移し、そして読み取った。FACScan設定についての条件は、以下である
:FL2オン;FSC−H閾値:54;FSC PMT Voltage:E 02;S
SC PMT:516;Amp.Gains
2.63;FL−2 PMT:728。Compensation値:0。
みなした。
GBS血清型IIICOH1株および血清型V2603 V/R株の細胞を、Todd
Hewitt Broth中で一晩増殖させた。1mlの培養物を、100mlのTo
dd Hewitt Brothに播種した。細菌増殖を、OD600を追跡することに
よって、30分毎にモニターした。ODが0.7〜0.8になるまで、細菌を増殖させた
。培養物を、5000rpmで20分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細菌を、P
BSで1回洗浄し、400ユニットのムタノリシン(Sigma−Aldrich)を添
加した2mlの50mM Tris−HCl(pH6.8)中に再懸濁し、そして37℃
で3時間インキュベートした。3サイクルの凍結/融解後、細胞細片を、14000gで
15分間の遠心分離によって除去し、上清のタンパク質濃度を、BSAを標準として使用
して、Bio−Rad Proteinアッセイによって測定した。
GBS血清型IIICOH1株および血清型V2603V/R株由来の精製タンパク質
(50ng)および全細胞抽出物(25μg)を、12%または15%のSDS−PAG
Eにロードし、そしてニトロセルロース膜に転写した。転写は、転写緩衝液(25mM
Tris塩基、192mM グリシン、20% メタノール)中、4℃、100Vで、1
時間行った。膜を、飽和緩衝液(PBS中5% スキムミルク、0.1% Tween
20)中4℃での一晩のインキュベーションによって飽和させた。膜を、飽和緩衝液中に
1:1000希釈したマウス血清と共に、室温で1時間インキュベートした。膜を、洗浄
緩衝液(PBS中3% スキムミルク、0.1% Tween 20)で2回洗浄し、1
:5000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗マウスIg(Bio−Rad)と
共に1時間インキュベートした。膜を、PBS中0.1% Tween 20で2回洗浄
し、そしてOpti−4CN Substrate Kit(Bio−Rad)で発色さ
せた。反応を、水を添加することによって停止させた。
精製タンパク質;(2)GBS−III抽出物;および(3)GBS−V抽出物。分子量
マーカーもまた示す。
CD1免疫マウスから収集した免疫血清を、マウス新生児敗血症モデルにおいて試験し
、GBS血清型IIIでチャレンジしたマウス中のそれらの保護効率を確認した。新生児
Balb/C同腹仔を、出生から24時間以内に2つの群にランダムに分け、そして免疫
したCD1成体マウス由来の25μlの希釈血清(1:15)を皮下注射した。1つの群
に、免疫前血清を与え、他方の群に、免疫血清を与えた。4時間後、全ての仔マウスを、
75%致死用量のGBS血清型III COH1株でチャレンジした。対数中期培養物を
希釈して得られたチャレンジ用量を、25μlの生理食塩水中で皮下投与した。GBS感
染を生存する仔マウスの数を、4日間、12時間毎に評価した。結果を、表IIIに示す
。
DNA配列(GBSx1402)を、アミノ酸配列<配列番号2>をコードする、S.
agalactiae<配列番号1>において同定した。このタンパク質配列の分析は、
以下:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図9(レーン3;MW 43.1kDa)および図
63(レーン4;MW 50kDa)に示す。これをまたHis融合産物としてE.co
li中で発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図12(レーン7;MW
30kDa)、図63(レーン3;MW 30kDa)および図178(レーン3;M
W 30kDa)に示す。
に精製した。
7)および図228(レーン9およびレーン10)に示す。
物;20μg/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図89B)、FAC
Sのため、およびインビボでの受動的保護(passive protection)ア
ッセイ(表III)において使用した。これらの試験は、タンパク質がGBS細菌に免疫
学的に接近可能(immunoaccessible)であること、およびそれが有効な
防御免疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx1100)を、アミノ酸配列<配列番号4>をコードする、S.
agalactiae<配列番号3>において同定した。このタンパク質は、凝集促進タ
ンパク質であることが予期される。このタンパク質配列の分析は、以下:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図30(レーン2;MW 13.1kD
a)に示す。
疫するために使用した。得られた抗血清を、FACS(図315)のために使用し、これ
は、このタンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図9(レーン5;MW 44.8kDa)、図6
3(レーン5;MW 44.8kDa)および図66(レーン7;MW 45kDa)に
示す。これをまた、His融合産物としてE.coli中に発現させた。総細胞抽出物の
SDS−PAGE分析を、図10(レーン4;MW 22.3kDa)に示す。これをま
た、図185(レーン1;MW 50kDa)に示す、総細胞抽出物のSDS−PAGE
を用いて、GBS15Lとして発現させた。
4)および図245(レーン4およびレーン5)に示す。
+2の産物;20μg/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図91B)
、FACS(図91C)のため、およびインビボでの受動的保護アッセイ(表III)に
おいて使用した。これらの試験は、タンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能である
こと、およびそれが有効な防御免疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0035)を、アミノ酸配列<配列番号116>をコードする、
S.agalactiae<配列番号115>において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図36(レーン5およびレーン6;MW
30kDa)に示す。これをまた、GST融合産物としてE.coli中で発現させた
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図41(レーン7;MW 55.4kDa)
に示す。
のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2の産物;13.5μg
/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図117B)、FACS(図11
7C)のため、そしてインビボでの受動的保護アッセイ(表III)において使用した。
これらの試験は、タンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれ
が有効な防御免疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0065)を、アミノ酸配列<配列番号208>をコードする、
S.agalactiae<配列番号207>において同定した。このタンパク質は、D
−グルタミン酸付加(adding)酵素MurD(murD)であることが予測される
。このタンパク質配列の分析は、以下:
号9615>をまた同定した。
enes<配列番号209>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
た。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図51(レーン11;MW 53.7kD
a)に示す。これをまた、GST融合産物としてE.coli中で発現させた。総細胞抽
出物のSDS−PAGE分析を、図56(レーン3;MW 79kDa)に示す。
するために使用した。得られた抗血清を、FACS(図270)に使用し、これは、この
タンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0067)を、アミノ酸配列<配列番号216>をコードする、
S.agalactiae<配列番号215>において同定した。このタンパク質は、細
胞分裂タンパク質DivIBであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以
下:
enes<配列番号217>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図17(レーン10;MW
45.2kDa)に示す。
こと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1の産物;20μg/マウス)
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図105B)、FACS(図105C)のた
め、インビボでの受動的保護アッセイ(表III)において使用した。これらの試験は、
このタンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防御
免疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0081)を、アミノ酸配列<配列番号272>をコードする、
S.agalactiae<配列番号271>において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下:
9623>をまた同定した。
た。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図79(レーン2;MW
34.2kDa)に示す。これはまた、GST融合産物としてE.coli中で発現さ
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図171(レーン7;MW 59kDa
)に示す。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0121)を、アミノ酸配列<配列番号390>をコードする、
S.agalactiae<配列番号389>において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下:
enes<配列番号391>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図5(レーン5;MW 39kDa)に示す
。これはまた、GST融合産物としてE.coli中で発現させた。総細胞抽出物のSD
S−PAGE分析を、図13(レーン2;MW 64kDa)に示す。
こと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1の産物;20μg/マウス)
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図101B)、FACS(図101C)のた
め、そしてインビボでの受動的保護アッセイ(表III)において使用した。これらの試
験は、タンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防
御免疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0123)を、アミノ酸配列<配列番号398>をコードする、
S.agalactiae<配列番号397>において同定した。このタンパク質は、C
omYDまたはComGDであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下
:
enes<配列番号399>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図1(レーン2;MW 40kDa)に示す。
これはまた、His融合産物としてE.coli中で発現させた。総細胞抽出物のSDS
−PAGE分析を、図2(レーン2;MW 15kDa)に示す。GBS6−GST融合
産物を精製し(図189、レーン2)、そしてマウスを免疫するために使用した。得られ
た抗血清を、FACS(図260)のために使用し、これは、このタンパク質がGBS細
菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0273)を、アミノ酸配列<配列番号820>をコードする、
S.agalactiae<配列番号819>において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下:
9581>をまた同定した。
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図29(レーン4;MW 132kDa
)に示す。
するために使用した。得られた抗血清を、FACS(図286)のために使用し、これは
、このタンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0304)を、アミノ酸配列<配列番号892>をコードする、
S.agalactiae<配列番号891>において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下:
enes<配列番号893>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
た。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図40(レーン4;MW
37kDa)に示す。これはまた、GST融合産物としてE.coli中で発現させた
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図46(レーン7;MW 62kDa)に示
す。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0355)を、アミノ酸配列<配列番号1054>をコードする
、S.agalactiae<配列番号1053>において同定した。このタンパク質は
、エンドリシン(endolysin)であると予想される。このタンパク質配列の分析
は、以下:
genes<配列番号1055>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下
:
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図51(レーン6;MW 31.7kD
a)に示す。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0371)を、アミノ酸配列<配列番号1102>をコードする
、S.agalactiae<配列番号1101>において同定した。このタンパク質は
、この遺伝子に由来するcDNA EST yk542c12.5であることが予測され
る。このタンパク質配列の分析は、以下:
genes<配列番号1103>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下
:
番号9117>において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図30(レーン4;MW 17.4kD
a)に示す。
のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2+3の産物;20μg
/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、FACS(図115B)のため、
そしてインビボでの受動的保護アッセイ(表III)において使用した。これらの試験は
、タンパク質がGBS細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防御免
疫原であることを確認する。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
DNA配列(GBSx0429)を、アミノ酸配列<配列番号1286>をコードする
、S.agalactiae<配列番号1285>において同定した。このタンパク質配
列の分析は、以下:
8569>をまた同定した。
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図51(レーン8;MW 31.3kD
a)に示す。これはまた、GST融合産物としてE.coli中で発現させた。総細胞抽
出物のSDS−PAGE分析を、図55(レーン6;MW 56.3kDa)および図6
2(レーン10;MW 56.3kDa)に示す。
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
アミノ酸配列(配列番号1384)をコードするDNA配列(GBSx0466)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号1383)。このタンパク質配列
の分析は、以下を示す:
63)もまた同定した。
性を有さない。
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
として発現させた。この精製した融合タンパク質(図215、レーン5)を使用して、マ
ウスを免疫した。得られた抗血清を、FACS(図281)のために使用し、これにより
このタンパク質がGBS細菌に対して免疫アクセス可能であることを確認した。
断薬に有用な抗原であり得ることが予測される。
アミノ酸配列(配列番号1452)をコードするDNA配列(GBSx0488)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号1451)。このタンパク質は、
構造的タンパク質であることが予想される。このタンパク質配列の分析は、以下を示す:
有する:
nesにおいて同定した(配列番号1453)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図73に示す(レーン6;MW
50kDa)。これをまた、E.coliにおいて、GST融合産物として発現させた。
総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図81に示す(レーン11;MW 75kDa
)。
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測される。
アミノ酸配列(配列番号2092)をコードするDNA配列(GBSx0721)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2091)。このタンパク質は、
SatDであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
11)もまた同定した。
有する:
nesにおいて同定した(配列番号2093)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
して発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図62に示す(レーン5;M
W 30kDa)。これをまた、E.coliにおいてGST融合産物として発現させた
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図68に示す(レーン11;MW 55kD
a)。
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号2244)をコードするDNA配列(GBSx0775)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2234)。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す:
有する:
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図5に示す(レーン7;MW 80.
5kDa)。これをまた、E.coliにおいてGST融合産物として発現させた。総細
胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図13に示す(レーン4;MW 105kDa)。
こと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1の産物;20μg/マウス)
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図100B)のため、FACS(図100C
)のため、およびインビボ受動的保護アッセイ(図III)において使用した。これらの
試験により、このタンパク質がGBS細菌に対して免疫アクセス可能であること、および
これらのタンパク質が有効な保護的免疫原であることが確認される。
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号2514)をコードするDNA配列(GBSx0884)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2513)。このタンパク質は、
N−アセチルムラモイル−L−アラニンアミダーゼであることが予測される。このタンパ
ク質配列の分析は、以下のことを示す:
有する:
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
RGD motif 81−83
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する:
発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図50に示す(レーン64;MW
55kDa)。
疫するために使用した。得られた抗血清を、FACSのために使用し(図302)、これ
によりこのタンパク質がGBS細菌に対して免疫アクセス可能であることが確認された。
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号2532)をコードするDNA配列(GBSx0890)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2531)。このタンパク質は、
ATP結合カセットトランスポーター様タンパク質であることが予測される。このタンパ
ク質配列の分析は、以下のことを示す:
65)もまた、同定した。
有する:
nesにおいて同定した(配列番号2533)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号2918)をコードするDNA配列(GBSx1015)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2917)。このタンパク質は、
不特定のタンパク質産物であることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下の
ことを示す:
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図2(レーン5;MW
31kDa)、図63(レーン2;MW 31.1kDa)、図66(レーン2および
3;MW 31kDa)、図178(レーン2;MW 31kDa)、図179(レーン
3および4;MW 31kDa)および図180(レーン3;MW 31kDa)に示す
。これをまた、E.coliにおいて、GST融合産物として発現させ、SDS−PAG
Eを、図66(レーン4および5;MW 56kDa)および図180(レーン4および
5;MW 55kDa)に示す。
ン4〜5)および図230(レーン3〜6)に示されるように精製した。精製したGBS
8−GSTを、図209のレーン6に示す。
用した(レーン2の産物;12.9μg/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロ
ット(図90B)のため、FACS(図90C)のため、およびインビボ受動的保護アッ
セイ(表III)において使用した。これらの試験により、このタンパク質がGBS細菌
に対して免疫アクセス可能であること、およびこのタンパク質が有効な保護的免疫原であ
ることが確認される。
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号2978)をコードするDNA配列(GBSx1032)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号2977)。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す:
有する:
nesにおいて同定した(配列番号2979)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図7に示す(レーン6;MW 59k
Da)。これをまた、E.coliにおいて、GST融合産物として発現させた。総細胞
抽出物のSDS−PAGE分析を、図13に示す(レーン5;MW 84kDa)。GB
S86−GSTを、図192のレーン3に示されるように精製した。
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号3184)をコードするDNA配列(GBSx1103)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号3183)。このタンパク質は、
L−セリンデヒドラーゼ1(sdaA−2)であることが予測される。このタンパク質配
列の分析は、以下のことを示す:
有する:
nesにおいて同定した(配列番号3185)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図176に示す(レーン6;MW
35kDa)。
薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号3348)をコードするDNA配列(GBSx1160)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号3347)。このタンパク質は、
能力損傷誘導性タンパク質(cinA)(competence−damage ind
ucible protein)であることが予測される。このタンパク質配列の分析は
、以下のことを示す:
0261)もまた、同定した。
有する:
nesにおいて同定した(配列番号3349)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図131(レーン2〜4;MW 6
1.6kDa)、図134(レーン3;MW 57.5kDa)+レーン2および4;M
W 27kDa)に示す。これをまた、E.coliにおいてHis融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図131(レーン5〜7;MW 36
.6KDa)および図178(レーン5;MW 37kDa)に示す。
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列(配列番号3442)をコードするDNA配列(GBSx1188)を、
S.agalactiaeにおいて同定した(配列番号3441)。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す:
有する:
nesにおいて同定した(配列番号2763)。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す:
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図16に示す(レーン8;MW 48
.4kDa)。
と)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2の産物;20マイクロg/
マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロットのため(図98B)、FACSのため
(図98C)、およびインビボ受動的保護アッセイにおいて(表III)使用した。これ
らの試験により、このタンパク質がGBSに対して免疫アクセス可能であること、および
これらのタンパク質が有効な保護的免疫原であることが確認される。
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
アミノ酸配列<配列番号3532>をコードするDNA配列(GBSx1213)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3531>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
。
同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図1に示す(レーン3;MW 78kD
a)。配列番号3532(GBS1)を、His融合産物としても、E.coliにおい
て発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を図2に示す(レーン3;MW 5
3kDa)。
び診断薬のために有用な抗原であり得ると推定された。
アミノ酸配列<配列番号3550>をコードするDNA配列(GBSx1219)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3549>。このタンパク質は、
輸送タンパク質であると推定される。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかに
なる:
113>もまた同定した。
。
sにおいて同定した<配列番号715>。このタンパク質配列の分析により、以下が明ら
かになる:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図44(レーン3;MW 35kD
a)、図169(レーン9および10;MW 50kDa)および図239(レーン2;
MW 50kDa)に示す。これをまた、GST融合産物として、E.coliにおいて
発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図48に示す(レーン6;MW
60kDa)。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3692>をコードするDNA配列(GBSx1262)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3691>。このタンパク質は、
フェリクロームABCトランスポーターであると推定される。このタンパク質配列の分析
により、以下が明らかになる:
。
esにおいて同定した<配列番号3693>。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3736>をコードするDNA配列(GBSx1275)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3735>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
性を有さない。
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図23(レーン7;MW 29.7
kDa)および図175(レーン4および5;MW 30kDa)に示す。
ーン6〜7)に示す。
産物;20μg/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図110B)、F
ACS(図110C)、およびインビボ受動防御アッセイ(表III)のために用いた。
これらの試験により、このタンパク質が、GBS細菌に対して免疫的に利用しやすく、有
用な防御免疫原であることが確認される。
に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3746>をコードするDNA配列(GBSx1279)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3745>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
。
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図7(レーン10;MW 140kD
a)、図11(レーン10;MW 150kDa)および図12(レーン6;MW 95
.3kDa)に示す。
に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3816>をコードするDNA配列(GBSx1305)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3815>。
。
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図74(レーン5;MW 28kD
a)に示す。これをまた、GST融合産物として、E.coliにおいて発現させた。総
細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図81(レーン10;MW 53kDa)に示す
。
に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3850>をコードするDNA配列(GBSx1322)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3849>。このタンパク質は、
CylI(fabF)であると推定される。このタンパク質配列の分析により、以下が明
らかになる:
7>もまた同定した。
、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を図73(レーン4;MW 84kDa
)に示す。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3922>をコードするDNA配列(GBSx1351)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3921>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
9>もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
。
させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図16(レーン6;MW 56.8k
Da)に示す。
こと)、これを用いてマウスを免疫した(レーン1および2の産物;20μg/マウス)
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図104B)、FACS(図104C)、お
よびインビボ受動防御アッセイ(表III)において用いた。これらの試験により、この
タンパク質が、GBSに対して免疫的に利用しやすく、有効な防御免疫原であることが確
認される。
に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3952>をコードするDNA配列(GBSx1362)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3951>。このタンパク質は、
シキミ酸キナーゼ(aroK)であることが推定される。このタンパク質配列の分析によ
り、以下が明らかになる:
。
esにおいて同定した<配列番号3953>。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図25(レーン2;MW 20kD
a)に示す。これをまた、GST融合産物として、E.coliにおいて発現させた。総
細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図37(レーン2;MW 45.5kDa)に示
す。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号3976>をコードするDNA配列(GBSx1371)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号3975>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
。
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図80(レーン4;MW 58.8
kDa)に示す。これをまた、GST融合産物として、E.coliにおいて発現させた
。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図173(レーン3;MW 84kDa)に
示す。
有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号4046>をコードするDNA配列(GBSx1403)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号4045>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
7>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
。
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図41(レーン5;MW 96.8
kDa)に示す。
のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2の産物;15μg/マ
ウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロットのため、FACSのため、およびインビ
ボ受動保護アッセイにおいて使用した(表III)。これらの試験により、このタンパク
質がGBS細菌に対して免疫的に利用しやすく、有効な防御免疫原であることが確認され
る。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号4082>をコードするDNA配列(GBSx1415)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号4081>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
7>を同定した。
。
esにおいて同定した<配列番号4083>。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
0>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
せた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を図1に示す(レーン4;MW 46kDa
)。この配列番号8790(GBS7)をまた、E.coliにおいてHis融合産物と
して発現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図2に示す(レーン4;MW
21kDa)。GBS7−His融合産物を精製し(図189、レーン6)、これを用
いてマウスを免疫した。得られた抗血清をFACSに使用し(図262)、これにより、
このタンパク質がGBS細菌に対して免疫的に利用しやすいことが確認された。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号4086>をコードするDNA配列(GBSx1416)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号4085>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
5>もまた同定した。
:
esにおいて同定した<配列番号4087>。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
2>もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図73に示す(レーン5;MW 5
9kDa)。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号4298>をコードするDNA配列(GBSx1485)を、
S.agalactiaeにおいて同定した<配列番号4297>。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
9>もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
。
esにおいて同定した<配列番号4299>。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。総細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図171に示す(レーン3;MW
62kDa)。
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
アミノ酸配列<配列番号4424>をコードするDNA配列(GBSx1528)<配
列番号4423>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析は、以下を明らかにする:
13>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする:
。
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図29(レーン2;MW84.3kDa
)に示す。このGBS119をまた、E.coli中でGST融合産物として発現させた
。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図35(レーン5;2バンド)に示す。
参照のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2+3の産物;20
μm/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、FACS(図109B)、お
よびインビボでの受動保護アッセイ(passive
protection assay)(表III)において使用した。これらの試験に
より、このタンパク質が、GBS細菌上で免疫受容性(immunoaccessibl
e)であり、そして効果的な保護免疫原であることを確認する。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4444>をコードするDNA配列(GBSx1534)<配
列番号4443>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする:
5>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明
らかにする:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図52(レーン9;MW19.8k
Da)に示す。このGBS282をまた、E.coli中でGST融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図60(レーン6;MW44.8kDa
)および図63(レーン7;MW47kDa)に示す。
6も参照のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した。この得られた抗血清を、F
ACS(図269)のために使用し、タンパク質がGBS細菌上で免疫受容性であること
を確認した。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4550>をコードするDNA配列(GBSx1566)<配
列番号4549>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質は、表
面に位置する膜タンパク質1(lmp1)であると予測される。このタンパク質配列の分
析は、以下を明らかにする:
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする:
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図49(レーン5;MW49kDa)に
示す。このGBS201をまた、E.coli中でGST融合産物として発現させた。全
細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図54(レーン3;MW74.5kDa)および
図62(レーン8および9;MW74.5kDa)に示す。このGBS201−GST融
合産物を精製し(図209、レーン9)、そしてマウスを免疫するために使用した。得ら
れた抗血清を、FACSのために使用し(図304)、このタンパク質が、GBS細菌上
で免疫受容性(immunoaccessible)である。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4722>をコードするDNA配列(GBSx1625)<配
列番号4721>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする:
。
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする:
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図58(レーン3;MW35.6kDa
)に示す。
を免疫するために使用した。得られた抗血清を、FACS(図280)のために使用し、
このタンパク質が、GBS細菌上で免疫受容性(immunoaccessible)で
あることを確認した。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4812>をコードするDNA配列(GBSx1650)<配
列番号4811>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質は、u
dp−n−アセチルムラメート−アラニンリガーゼ(murC/ddlA)であると予測
される。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする:
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする:
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図24(レーン11;MW49kDa)
に示す。このGBS157をまた、E.coli中でGST融合産物として発現させた。
全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図31(レーン8;MW74kDa)、図33
(レーン8;MW74kDa)および図37(レーン3;MW74kDa)に示す。
参照のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2の産物;19.5
μm/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図112B)、FACS、お
よびインビボでの受動保護アッセイ(表III)において使用した。これらの試験により
、このタンパク質が、GBS細菌上で免疫受容性であり、そして効果的な保護免疫原であ
ることを確認する。
た。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図183に示す(レーン11−13;MW
74kDa)。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4916>をコードするDNA配列(GBSx1684)<配
列番号4915>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質は、糖
タンパク質エンドペプチダーゼであると予測される。このタンパク質配列の分析は、以下
を明らかにする:
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする:
た、GASにおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする:
た。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図17(レーン9;MW28.9kDa)
に示す。このGBS69をまた、E.coli中でGST融合産物として発現させた。全
細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図20(レーン4;MW53.9kDa)に示す
。
疫するために使用した。得られた抗血清を、FACS(図285)のために使用し、この
タンパク質が、GBS細菌上で免疫受容性であることを確認した。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号4956>をコードするDNA配列(GBSx1698)<配
列番号4955>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質の分析
は、以下を明らかにする:
して発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図69(レーン8;MW55
kDa)において示す。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号5146>をコードするDNA配列(GBSx1755)<配
列番号5145>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質は、D
ivICホモログであると予測された。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにす
る:
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質の分析は、以下を明らかに
する:
して発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図172(レーン3;MW4
2kDa)において示す。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号5374>をコードするDNA配列(GBSx1834)<配
列番号5373>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質の分析
は、以下を明らかにする:
さない。
>を、S.pyogenesおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする:
さない。
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図59(レーン3;MW53.7kDa
)に示す。
出物のSDS−PAGE分析を、図154(レーン8〜10;MW26kDa)および図
183(レーン3;MW26kDa)に示す。このGBS288dをまた、E.coli
中でGST融合産物として発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図18
7(レーン11;MW51kDa)に示す。精製したGBS288d−GTSを、図23
7のレーン8に示す。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号5406>をコードするDNA配列(GBSx1848)<配
列番号5405>を、S.agalacctiaeおいて同定した。このタンパク質は、
6kDaタンパク質であると予測される。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかに
する:
>を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明
らかにする:
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする:
させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図9(レーン4;MW33.3kDa
)に示す。このGBS14−GST融合産物を精製し(図190、レーン8)、そしてマ
ウスを免疫するために使用した。この得られた抗血清を、FACS(図263)のために
使用し、タンパク質がGBS細菌上で免疫受容性であることを確認した。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号5486>をコードするDNA配列(GBSx1872)<配
列番号5485>を、S.agalactiaeおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図168(レーン17および18;
MW89kDa)および図169(レーン2;MW89kDa)に示す。GBS197を
また、E.coliにおいてGST融合産物として発現させた。全細胞抽出物のSDS−
PAGE分析を、図37(レーン6;MW99kDa)に示す。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号5504>をコードするDNA配列(GBSx1877)<配
列番号5503>を、S.agalacctiaeおいて同定した。このタンパク質は、
カルボキシメチレンブテノリダーゼ関連タンパク質であると予測される。このタンパク質
配列の分析は、以下を明らかにする:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図26(レーン4および18;MW
27kDa)に示す。このGBS158をまた、E.coliにおいてGTS融合タンパ
ク質として発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図37(レーン5;M
W52kDa)に示す。
こと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2の産物;14.5μm/
マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、FACS(図109B)、およびイ
ンビボでの受動保護アッセイ(表III)において使用した。これらの試験により、この
タンパク質が、GBS細菌上で免疫受容性であり、そして効果的な保護免疫原であること
を確認する。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
DNA配列(GBSx1989)を、メチラーゼ遺伝子ホモログである、アミノ酸配列
<配列番号5856>をコードするS.agalacctiae<配列番号5855>お
いて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする:
9929>を同定した。
発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図148(レーン8〜10;MW
140kDa)に示す。このGBS327Nをまた、E.coliにおいてHis融合タ
ンパク質として発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図148(レーン
11〜13;MW115kDa)および図182(レーン8;MW115kDa)に示す
。
7N−Hisを、図235のレーン5に示す。
出物のSDS−PAGE分析を、図148(レーン14;MW73kDa)に示す。
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
アミノ酸配列<配列番号6016>をコードするDNA配列(GBSx2049)<配
列番号6015>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質は、
5’−ヌクレオチダーゼファミリータンパク質であると予測される。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図69(レーン4;分子量73kD
a)に示す。そのGBS328−His融合産物を、精製し(図213、レーン9)、そ
してマウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、FACSのために使用した(
図268)。これにより、このタンパク質が、GBS細菌に対して免疫的に接近可能であ
ることが確認された。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6220>をコードするDNA配列(GBSx2122)<配
列番号6219>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質は、
溶血素(patB)であると予測される。このタンパク質配列の分析により、以下が明ら
かになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図75(レーン4;分子量46.4
kDa)に示す。配列番号6220(GBS392)を、GST融合産物としても、E.
coliにおいて発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図83(レーン
5;分子量71kDa)に示す。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6266>をコードするDNA配列(GBSx2135)<配
列番号6265>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質は、
M様タンパク質であると予測される。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかに
なる:
8>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
せた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図3(レーン5;分子量65kDa)に
示す。このGBS3−His融合タンパク質を精製し(図189、レーン8)、そしてマ
ウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、FACSのために使用した(図26
1)。これにより、このタンパク質が、GBS細菌に対して免疫的に接近可能であること
が確認された。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6320>をコードするDNA配列(GBSx2157)<配
列番号6319>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質は、
アデニレートキナーゼ(adk)であると予測される。このタンパク質配列の分析により
、以下が明らかになる:
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
8>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図29(レーン9;分子量26.9
kDa)に示す。
た参照のこと)、そしてマウスを免疫するために使用した(レーン1+2+3産物;20
μg/マウス)。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図108B)、FACS(図
108C)、およびインビボでの受動防御アッセイ(表III)のために使用した。これ
らの試験により、このタンパク質が、GBS細菌に対して免疫的に接近可能であること、
およびこのタンパク質が、有効な防御免疫原であることが、確認された。
アミノ酸配列<配列番号6632>をコードするDNA配列(GBSx2262)<配
列番号6631>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
7>もまた、同定した。アミノ酸配列<配列番号10782>をコードするさらなる関連
GBS核酸配列<配列番号10781>もまた、同定した。アミノ酸配列<配列番号10
952>をコードするさらなる関連GBS核酸配列<配列番号10951>もまた、同定
した。
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図143(レーン8〜10;分子
量62.8kDa)および図187(レーン3;分子量63kDa)に示す。精製GBS
657−GSTを、図245、レーン2およびレーン3に示す。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6678>をコードするDNA配列(GBSx2277)<配
列番号6677>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図76(レーン7;分子量45.4
kDa)に示す。
出物のSDS−PAGE分析を、図166(レーン3および4;分子量35kDa)およ
び図188(レーン12;分子量35kDa)に示す。精製タンパク質を、図240、レ
ーン9〜10に示す。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6720>をコードするDNA配列(GBSx2292)<配
列番号6719>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図36(レーン2;分子量25kD
a)に示す。配列番号6720(GBS171)を、GST融合産物としてもまた、E.
coliにおいて発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図41(レーン
3;分子量49.8kDa)に示す。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6772>をコードするDNA配列(GBSx2309)<配
列番号6771>を、S.agalactiaeにおいて同定した。
013>もまた、同定した。
、GASにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる:
4>もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、残基1〜16にあるシグナル
ペプチドが明らかになる。
を、S.pyogenesにおいて同定した。 GASタンパク質およびGBSタンパク
質のアライメントを、以下に示す。
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図61(レーン6;分子量23.7
kDa)に示す。配列番号8994(GBS245)を、GST融合産物としてもE.c
oliにおいて発現させた。そして精製GBS245−GSTを、図211、レーン6に
示す。
を、FACSのために使用した(図278)。これにより、このタンパク質が、GBS細
菌に対して免疫的に接近可能であることが確認された。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号6832>をコードするDNA配列(GBSx2332)<配
列番号6831>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図38(レーン8;分子量28.9
kDa)に示す。配列番号6832(GBS110)もまた、GST融合産物としてE.
coliにおいて発現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図41(レーン
10;分子量53.9kDa)に示す。
マウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、ウエスタンブロット(図252A
)、FACS(図252B)、およびインビボでの受動防御アッセイ(表III)のため
に使用した。これらの試験により、このタンパク質が、GBS細菌に対して免疫的に接近
可能であること、およびこのタンパク質が、有効な防御免疫原であることが、確認された
。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
アミノ酸配列<配列番号7048>をコードするDNA配列(GBSx2419)<配
列番号7047>を、S.agalactiaeにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる:
5>もまた、同定した。
を、S.pyogenesにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる:
現させた。全細胞抽出物のSDS−PAGE分析を、図136(レーン8〜10;分子量
63kDa)および図187(レーン4;分子量63kDa)に示す。
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
にあるままでなされ得ることが、理解される。
(表I−GBSタンパク質の理論上の分子量)
準方向プライマーは、
である。
られる。逆方向プライマー配列は、配列番号11493〜12017である。
Claims (23)
- 単離されたタンパク質であって、配列番号8780に示されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質と90%以上の配列同一性を有し、かつ、GBS血清型III COH1に対する受動的保護免疫を提供する活性を有する単離されたタンパク質。
- 請求項1〜2のいずれか1項に記載のタンパク質に結合する単離された抗体。
- 請求項3に記載の抗体であって、該抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、抗体。
- 請求項1〜2のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項5に記載の核酸分子であって、配列番号8779に示されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 単離された核酸分子であって、請求項5〜6のいずれか1項に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 単離された核酸分子であって、請求項5〜6のいずれか1項に記載の核酸分子に90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、該核酸分子は、GBS血清型III COH1に対する受動的保護免疫を提供する活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
- 単離された核酸分子であって、高ストリンジェンシー条件下で、請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸分子にハイブリダイズし得、該核酸分子は、少なくとも20ヌクレオチドの長さである、単離された核酸分子。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のタンパク質、核酸分子、または抗体を含む、組成物。
- 請求項10に記載の組成物であって、免疫原性組成物である、組成物。
- 請求項1、2、または、8のいずれかに記載のタンパク質を含む請求項10に記載の組成物であって、ワクチン組成物である、組成物。
- 請求項10に記載の組成物であって、診断組成物である、組成物。
- 請求項10〜12のいずれか1項に記載の組成物であって、薬品として使用される、組成物。
- S.agalactiaeによって引き起こされる感染または疾患の処置または予防のための医薬の製造における、請求項10に記載の組成物の、使用。
- 患者を処置するための、請求項10に記載の組成物。
- 式NH2−A−[X−L−]n−B−COOHによって表される単離されたハイブリッドタンパク質であって、ここで、Xが、請求項1で規定されるアミノ酸配列であり、Lが、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Aが、任意のN末端アミノ酸配列であり、Bが、任意のC末端アミノ酸配列であり、そしてnが1より大きい整数である、単離されたハイブリッドタンパク質。
- 生物学的サンプルにおいて、Streptococcusを検出するための方法であって、該方法が、請求項5〜9のいずれかに記載の核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程を包含する、方法。
- 請求項18に記載の方法であって、該方法が核酸増幅を含む、方法。
- 化合物が請求項1または請求項2に記載のタンパク質に結合するか否かを決定する方法であって、該方法が、試験化合物を、請求項1または請求項2に記載のタンパク質に接触させる工程、および該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する、方法。
- 請求項20に記載の方法によって同定された単離された抗体。
- 請求項1または請求項2に記載のタンパク質および以下の抗原:
Helicobacter pylori由来のタンパク質抗原;
N.meningitidis血清型B由来のタンパク質抗原;
N.meningitidis血清型B由来の外膜小胞(OMV)調製物;
N.meningitidis血清型A、C、W135および/またはY由来のサッカリド抗原;
Streptococcus pneumoniae由来のサッカリド抗原;
A型肝炎ウイルス由来の抗原;
B型肝炎ウイルス由来の抗原;
C型肝炎ウイルス由来の抗原;
Bordetella pertussis由来の抗原;
ジフテリア抗原;
破傷風抗原;
Haemophilus influenzae B.由来のサッカリド抗原;
N.gonorrhoeae由来の抗原;
Chlamydia pneumoniae由来の抗原;
Chlamydia trachomatis由来の抗原;
Porphyromonas gingivalis由来の抗原;
ポリオ抗原;
狂犬病抗原;
麻疹、おたふくかぜおよび/または風疹抗原;
インフルエンザ抗原;
Moraxella catarrhalis由来の抗原;ならびに/あるいは
Staphylococcus aureus由来の抗原、
のうちの1つ以上を含む、組成物。 - 2つ以上のタンパク質を含む組成物であって、ここで、各タンパク質が、請求項1または請求項2に記載のタンパク質である、組成物。
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