JP2011239783A - Ａ群連鎖球菌およびｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質 - Google Patents

Ａ群連鎖球菌およびｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染に対するワクチ
ンの開発に使用され得るタンパク質を提供すること。
【解決手段】本発明は、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ）およびＡ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のタ
ンパク質（アミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を含む）を提供する。このタン
パク質がワクチン、免疫原性組成物および／または診断薬のための有用な抗原であること
を示すデータを与える。このタンパク質はまた、抗体に対する標的である。本発明の組成
物は、連鎖球菌細菌、特に、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによ
って引き起こされる感染または疾患の処置または予防のために使用される。
【選択図】なし

Description

本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）および
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）由来の核酸およびタンパク質
に関する。
（背景技術）
かつてはウシのみに感染すると考えられていたグラム陽性細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（または「Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ」、「ＧＢＳ」
と省略される）は、現在、免疫無防備の個体および新生児において重篤な疾患（菌血症お
よび髄膜炎）を引き起こすことが知られている。２つの型の新生児感染が存在する。第１
の感染（初期の発症、通常生後５日以内）は、菌血症および肺炎によって明らかになる。
これは、赤ん坊が産道を通過するときに、感染する。ＧＢＳは、若い女性の約２５％の膣
でコロニーを形成し、コロニーを形成した母親の膣出産を介して産まれる幼児の約１％が
、感染するようになる。致死率は、５０〜７０％の間である。第２の感染は、生後１０〜
６０日で生じる髄膜炎である。妊娠した女性は、幼児が受動的に免疫されるようにＩＩＩ
型カプセルでワクチン接種される場合、後期発症髄膜炎の発病率は低下するが、完全に排
除されるわけではない。
「ＧＢＳ」の中の「Ｂ」は、ランスフィールド分類をいい、これは、希酸に可溶性であ
り、Ｃ炭水化物と呼ばれる炭水化物の抗原性に基づく分類である。ランスフィールドは、
血清学的に識別され得る１３個の型のＣ炭水化物（Ａ〜Ｏと称される）を同定した。最も
一般的にヒトに感染する生物は、Ａ群、Ｂ群、Ｄ群およびＧ群に見出される。Ｂ群におい
て、その系統は、それらの多糖カプセルの構造に基づいて８つの血清型に分けられ得る（
Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ）。
Ａ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（「ＧＡＳ」、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、よくあ
るヒト病原体であり、疾患の徴候なしに５〜１５％の間の正常な個体に存在すると概算さ
れる。しかし、宿主防御が欠損した場合、または生物がその毒性を発揮し得る場合、また
はその生物が脆弱な組織もしくは宿主に導入される場合、急性感染が生じる。疾患として
は、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌性ト
キシックショック症候群が挙げられる。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、代表的に抗生物質を用いて処置される。しかし、Ｓ．ａｇａ
ｌａｃｔｉａｅは、抗生物質によって阻害されるが、ＧＡＳほど簡単にペニシリンによっ
て死なない。従って、予防的なワクチン接種が好ましい。
現在のＧＢＳワクチンは、ポリサッカリド抗原に基づくが、これらは弱い免疫原性しか
与えない。抗イデオタイプ手法もまた使用されている（例えば、ＷＯ９９／５４４５７）
。しかし、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に対する有効な成体用のワクチンに対する必要
性が残っている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染に対するワクチンの必要性もまた、残ってい
る。
このようなワクチンの開発に使用され得るタンパク質を提供することが、本発明の目的
である。これらのタンパク質はまた、診断目的のため、そして抗生物質に対する標的とし
て有用であり得る。
１つの局面において、本発明は、以下の配列番号
Figure 2011239783
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
別の局面において、本発明のタンパク質は上記タンパク質と５０％以上の配列同一性を
有する。
１つの局面において、本発明は、以下の配列番号
Figure 2011239783
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からなる群より選択されるアミノ酸配列由来の７個以上の連続したアミノ酸配列のフラグ
メントを含むタンパク質を提供する。
１つの局面において、本発明は、上記のタンパク質に結合する抗体を提供する。
別の局面において、上記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、また
は完全ヒト抗体である。
１つの局面において、本発明は、上記のタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
別の局面において、上記核酸分子は、以下の配列番号
Figure 2011239783
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からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
１つの局面において、本発明は、以下の配列番号
Figure 2011239783
Figure 2011239783
Figure 2011239783
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
１つの局面において、本発明は、以下の配列番号
Figure 2011239783
Figure 2011239783
Figure 2011239783
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からなる群より選択されるヌクレオチド配列由来の１０個以上の連続したヌクレオチドの
フラグメントを含む核酸分子を提供する。
別の局面において、本発明の核酸分子は、上記の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列
を含む。
別の局面において、本発明の核酸分子は、上記の核酸分子に５０％以上の配列同一性を
有するヌクレオチド配列を含む。
別の局面において、本発明の核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下で、上記の核酸
分子にハイブリダイズし得る。
１つの局面において、本発明は、上記タンパク質、核酸分子、または抗体を含む組成物
を提供する。
別の局面において、本発明の組成物は、免疫原性組成物、ワクチン組成物、または診断
組成物である。
別の局面において、本発明の組成物は、薬品として使用される。
別の局面において、本発明の組成物は、連鎖球菌細菌、特に、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａ
ｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによって引き起こされる感染または疾患の処置または予防
のための医薬の製造において使用される。
１つの局面において、本発明は、患者を処置するための方法を提供し、この方法は、該
患者に、治療的有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
１つの局面において、本発明は、式ＮＨ２−Ａ−［Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨによっ
て表されるハイブリッドタンパク質を提供し、ここで、Ｘが、上で規定されるアミノ酸配
列であり、Ｌが、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａが、任意のＮ末端アミノ酸配列
であり、Ｂが、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎが１より大きい整数である。
１つの局面において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列内に含まれるテ
ンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットを提供し、該キットは、第１プ
ライマーおよび第２プライマーを含み、ここで、該第１プライマーが該テンプレート配列
に対して実質的に相補的であり、そして該第２プライマーが、該テンプレート配列の相補
体に対して実質的に相補的であり、ここで、実質的な相補性を有する該プライマーの部分
が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定する。
１つの局面において、本発明は、単鎖核酸または二重鎖核酸（またはこれらの混合物）
に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓテンプレート核酸配列の増幅を可能にする第１単
鎖オリゴヌクレオチドおよび第２単鎖オリゴヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで
、（ａ）該第１オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列に実質的に相補的である
プライマー配列を含み；（ｂ）該第２オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列の
相補体に実質的に相補的であるプライマー配列を含み；（ｃ）該第１オリゴヌクレオチド
および／または該第２オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸に相補的でない配列を
含み、そして（ｄ）該プライマー配列が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定す
る。
別の局面において、本発明は上記のキットを提供し、ここで、前記（ｃ）の非相補的配
列が、制限部位および／またはプロモーター配列を含む。
１つの局面において、本発明は、配列番号１〜１２０２４のうちの１つ以上を含む、コ
ンピューター読み取り可能な媒体を提供する。
１つの局面において、本発明は、生物学的サンプルにおいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓを検出するための方法を提供し、該方法が、上記の核酸を、ハイブリダイゼーション
条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程を包含する。
別の局面において、該方法が、核酸増幅を含む。
１つの局面において、本発明は、化合物が上記のタンパク質に結合するか否かを決定す
る方法を提供し、該方法が、試験化合物を、上記のタンパク質に接触させる工程、および
該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、上記の方法によって同定された化合物を提供する。
１つの局面において、本発明は、組成物を提供し、この組成物は、上記のタンパク質お
よび以下の抗原：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のサッカ
リド抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原；
Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原；
ジフテリア抗原；
破傷風抗原；
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ．由来のサッカリド抗原；
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原；
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原；
ポリオ抗原；
狂犬病抗原；
麻疹、おたふくかぜおよび／または風疹抗原；
インフルエンザ抗原；
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原；ならびに／あるいは
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原、
のうちの１つ以上を含む。
１つの局面において、本発明は、２つ以上のタンパク質を含む組成物を提供し、ここで
、各タンパク質が、上記のタンパク質である。
（発明の開示）
本発明は、実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク
質、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓアミノ酸配列を含むタンパク質を提
供する。これらのアミノ酸配列は、配列番号１と１０９６０との間の偶数である。
実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅアミノ酸配列に対して配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含むタンパク質、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓアミ
ノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、提供される
。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは、５０％よりも高い（例えば
、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれよりも上）。これらのタ
ンパク質は、ホモログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、対立遺伝子改変体および機能
的変異体を含む。代表的に、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性が、機能的等価物
の指標であるとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、ギャップオープンペ
ナルティ＝１２およびギャップエクステンションペナルティ＝１を用いたアフィンギャッ
プ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）にお
いて実行されるように、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムによ
って決定される。
本発明の好ましいタンパク質は、ＧＢＳ１〜ＧＢＳ６８９である（表ＩＶを参照のこと
）。
本発明はさらに、実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅアミノ酸配列のフラグ
メントを含むタンパク質、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓアミノ酸配列
のフラグメントを含むタンパク質を提供する。これらのフラグメントは、特定の配列に依
存して、これらの配列から少なくともｎ個連続するアミノ酸配列を含むべきである（ｎは
７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、
７０、８０、９０、１００またはそれよりも上）である）。好ましくは、これらのフラグ
メントは、これらの配列の１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、
（ａ）実施例に開示されるタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）実施例に開示さ
れるが、それらのＮ末端シグナルペプチドを有さないタンパク質、（ｃ）実施例に開示さ
れる関連するＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質に共通するフラグメント、ならび
に（ｄ）実施例に開示されるが、Ｎ末端アミノ酸残基を有さない、タンパク質である。
本発明のタンパク質は、当然、種々の手段（例えば、組換え発現、ＧＡＳまたはＧＢＳ
からの精製、化学合成など）によって、そして種々の形態で（例えば、ネイティブ、融合
、グリコシル化、非グリコシル化など）調製され得る。これらは好ましくは、実質的に純
粋な形態で調製されるか（すなわち、実質的に他のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌタンパク
質または宿主細胞タンパク質を含まない）、または実質的に単離された形態である。本発
明のタンパク質は、好ましくは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌタンパク質である。
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。こ
れらは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得、そして任意の適切な
手段（例えば、組換え発現）によって産生され得る。ヒト免疫系との適合性を増大するた
めに、抗体はキメラであり得るか、もしくはヒト化され得るか（例えば、Ｂｒｅｅｄｖｅ
ｌｄ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５５（９２０５）：７３５−７４０；Ｇｏｒｍａｎ
＆ Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４５７−４６６）、また
は完全なヒト抗体が使用され得る。抗体は、検出可能な標識（例えば、診断アッセイのた
めに）を含み得る。
さらなる局面に従って、本発明は、実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅヌク
レオチド配列を含む核酸、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレオチド
配列を含む核酸を提供する。これらの核酸配列は、配列番号１と１０９６６との間の奇数
である。
さらに、本発明は、実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅヌクレオチド配列に
配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓヌクレオチド配列に配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供す
る。配列間の同一性は、好ましくは、上記のようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロ
ジー検索アルゴリズムによって決定される。
さらに、本発明は、好ましくは「高いストリンジェンシー」の条件下（例えば、０．１
×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で６５℃）で、実施例に開示されるＳ．ａｇａｌａｃ
ｔｉａｅ核酸にハイブリダイズし得る核酸、および実施例に開示されるＳ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた提供される。これらは、特定の配列に依
存して、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ配列またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ配列から少なくとも
ｎ個連続するヌクレオチドを含むべきである（ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５
、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５
０、２００またはそれよりも上）である）。このフラグメントは、実施例に開示されるＧ
ＡＳ配列およびＧＢＳ配列に共通する配列を含み得る。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメント
をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、以下を提供する：配列番号１０９６７のヌクレオチド配列を含む核酸；
配列番号１０９６７に配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；配列番号１０９
６７にハイブリダイズし得る（好ましくは「高いストリンジェンシー」の条件下で）核酸
；配列番号１０９６７からの少なくともｎ個連続するヌクレオチドのフラグメントを含む
核酸（ここでｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３
５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００
、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、１０００００、１０００００
０またはそれよりも上）である）。
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットもしくはサ
ザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」）、および増幅反応
（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）、および他の
核酸技術に使用され得る。
本発明が上に記載される配列に相補的な配列を含む核酸を提供することもまた、理解さ
れるべきである（例えば、アンチセンスもしくはプローブ（ｐｒｏｂｉｎｇ）のために、
またはプライマーとしての使用のために）。
本発明に従う核酸は、当然、多くの方法（例えば、化学合成によって、ゲノムライブラ
リーからもしくはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）で調製され得、そし
て種々の形態をとり得る（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、
標識化など）。核酸は、好ましくは実質的に単離された形態である。
本発明に従う核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識を用いて標識され得る。これ
は特に、核酸が核酸検出技術に使用されるべき場合（例えば、核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、
ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどのような技術における使用ための、プライマーまたはプローブで
ある場合）に有用である。
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、そしてまた、これらのアナログ
（例えば、改変骨格を含むＤＮＡおよびＲＮＡ）およびまたペプチド核酸（ＰＮＡ）など
も含む。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば
、クローニングベクターまたは発現ベクター）、およびこのようなベクターで形質転換さ
れた宿主細胞を提供する。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体、および／または核
酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、免疫原性組成物として（例えば
、診断試薬としてまたはワクチンとして）適切であり得る。
本発明はまた、医薬（例えば、免疫原性組成物としてまたはワクチンとして）または診
断試薬としての使用のための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。
（ｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる疾患および／または感染を処
置または予防するための医薬；（ｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓに対して惹起される抗体の存在を検出するために診断試薬；および／ある
いは（ｉｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する抗体を惹起し得る試薬の製造におけ
る、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用もまた、提供される。上記のｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、任意の種、群、または系統であり得るが、好ましくはＳ．ａ
ｇａｌａｃｔｉａｅ（特に血清型ＩＩＩまたはＶ）、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓである
。この疾患は、菌血症、髄膜炎、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎
、筋炎、およびトキシックショック症候群であり得る。
本発明はまた、患者を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の核酸、タンパク質
および／または抗体の治療有効量をこの患者に投与する工程を包含する。この患者は、そ
れ自体が疾患の危険性があり得るか、または妊娠女性のいずれかであり得る（「母体免疫
」、例えば、Ｇｌｅｚｅｎ ＆ Ａｌｐｅｒｓ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄ
ｉｓ．２８．２１９−２２４）。
タンパク質抗原の投与は、免疫を誘導するための好ましい処置方法である。
本発明の抗体の投与は、別の好ましい処置方法である。この受動免疫方法は、特に、新
生児または妊娠女性に対して有用である。この方法は、代表的に、ヒト化されるかまたは
完全なヒトのものであるモノクローナル抗体を使用する。
本発明はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ
．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）核酸配列内に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマー（
例えば、ＰＣＲプライマー）を含むキットを提供し、このキットは、第１のプライマーお
よび第２のプライマーを含み、ここで、この第１のプライマーは、この鋳型配列に実質的
に相補的であり、そして第２のプライマーは、この鋳型配列の相補体に実質的に相補的で
あり、ここで、実質的な相補性を有するこれらのプライマーの対が、増幅される鋳型配列
の末端を規定する。第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標
識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
本発明はまた、一本鎖核酸または二本鎖核酸（またはこれらの混合物）に含まれるＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ鋳型核酸配列の増幅を可能にする、第１の一本鎖オリゴヌクレオ
チドヌおよび第２の一本鎖オリゴヌクレオチドヌを含むキットを提供し、ここで、：（ａ
）この第１のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列に実質的に相補的であるプライマ
ー配列を含み；（ｂ）この第２のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列の相補体に実
質的に相補的であるプライマー配列を含み；（ｃ）この第１のオリゴヌクレオチドおよび
／または第２のオリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸に相補的ではない配列を含み；そし
て（ｄ）これらのプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を規定する。特徴（ｃ）
の非相補的配列は、好ましくは、これらのプライマー配列の上流（すなわち、５’側）で
ある。これらの（ｃ）配列のうちの一方または両方が、制限部位（例えば、ＥＰ−Ｂ−０
５０９６１２）またはプロモーター配列（例えば、ＥＰ−Ｂ−０５０５０１２）を含み得
る。第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能な
標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
鋳型配列は、ゲノム配列の任意の部分であり得る（例えば、配列番号１０９６７）。例
えば、鋳型配列は、ｒＲＮＡ遺伝子（例えば、Ｔｕｒｅｎｎｅら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：５１３−５２０；本明細書中の配列番号１２０１８−１
２０２４）、またはタンパク質コード遺伝子であり得る。鋳型配列は、好ましくはＧＢＳ
に特異的である。
本発明はまた、コンピューターで読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標
）ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなど）および／または配列表中の１
つ以上の配列を含むコンピューターデータベースを提供する。この媒体は、好ましくは配
列番号１０９６７を含む。
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨによって表されるハイ
ブリッドタンパク質を提供し、ここで、Ｘは、本発明のタンパク質であり、Ｌは、任意の
リンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意のＣ
末端アミノ酸配列であり、そしてｎは、１より大きい整数である。ｎの値は、２とｘとの
間であり、そしてｘの値は、代表的に３、４、５、６、７、８、９または１０である。好
ましくは、ｎは、２、３または４であり；より好ましくは２または３であり；最も好まし
くはｎは２である。各ｎの例について、−Ｘ−は、同じであっても異なってもよい。［−
Ｘ−Ｌ−］の各ｎの例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても存在しなく
てもよい。例えば、ｎが２の場合、このハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ
２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、
代表的に短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５
、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸）。例
としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すな
わち、Ｇｌｙｎ（ここで、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより
大きい））、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（ここで、ｎは、３、４、５、
６、７、８、９、１０またはそれより大きい））が挙げられる。他の適切なリンカーアミ
ノ酸配列は、当業者に明らかである。−Ａ−および−Ｂ−は、任意の配列であり、この配
列は、代表的に短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、
３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２
２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、
８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸）。例としては、タンパク質輸送を指向するた
めのリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を用意にする短いペプチド配列（例
えば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ここで、ｎは、３、４、５、６、７、８、９
、１０またはそれより大きい））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列およびＣ
末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、各Ｘは、Ｇ
ＢＳ配列であり、他方、ＧＡＳおよびＧＢＳの混合物も使用される。
さらなる局面に従って、本発明は種々のプロセスを提供する。
タンパク質発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を包含する、本発
明のタンパク質を産生するためのプロセスが提供される。
本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスが提供され、このタンパク質
または核酸は、化学的手段を用いて一部または全体が合成される。
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスが提供され、このプロセスは、（
ａ）二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で、本発明に従う核酸プローブを生
物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）その二重鎖を検出する工程、を包含する
。
生物学的サンプル（例えば、血液）中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを検出するための
プロセスもまた提供され、このプロセスは、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明に
従う核酸を生物学的サンプルと接触させる工程を包含する。このプロセスは、核酸増幅（
例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）または核酸ハイ
ブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブとのハイ
ブリダイゼーションなど）を含み得る。臨床サンプル中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（
特に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＣＲ検出が報告されている（例えば、Ｌｏｕｉｅら（
２０００）ＣＭＡＪ １６３：３０１−３０９；Ｌｏｕｉｅら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１７６９−１７７１を参照のこと）。核酸に基づく臨床ア
ッセイは、一般的に、Ｔａｎｇら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２０２１−２
０３８に記載される。
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供され、このプロセスは、（ａ）抗
体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、本発明の抗体と生物学的サンプルとを接触させ
る工程；および（ｂ）その複合体を検出する工程、を包含する。
アミノ酸配列を同定するためのプロセスが提供され、このプロセスは、Ｓ．ａｇａｌａ
ｃｔｉａｅのゲノム配列内の推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード
領域を検索する工程を包含する。これは代表的に、開始コドンおよびその下流配列中のイ
ンフレームの終止コドンについてインシリコで配列を検索する工程を包含する。これら開
始コドンと終止コドンとの間の領域が、推定タンパク質コード配列である。代表的に、全
ての６個の可能性のあるリーディングフレームが検索される。このような分析のための適
切なソフトウェアとしては、ＯＲＦＦＩＮＤＥＲ（ＮＣＢＩ）、ＧＥＮＥＭＡＲＫ［Ｂｏ
ｒｏｄｏｖｓｋｙ ＆ ＭｃＩｎｉｎｃｈ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ Ｃｈｅｍ．
１７：１２２−１３３）、ＧＬＩＭＭＥＲ［Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９８）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５４４−５４８；Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９９）Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ ５９：２４−３１；Ｄｅｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４６３６−４６４１］、またはＭａｒｋｏｖモデルを使用する
他のソフトウェア［例えば、Ｓｈｍａｔｋｏｖら（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｃｓ １５：８７４−８７６］が挙げられる。本発明はまた、同定されたアミノ酸配列を
含むタンパク質を提供する。次いで、これらのタンパク質は、従来の技術を用いて発現さ
れ得る。
本発明はまた、試験化合物が本発明のタンパク質に結合するか否かを決定するためのプ
ロセスを提供する。試験化合物が本発明のタンパク質に結合し、そしてその結合がＧＢＳ
細菌の生活環を阻害する場合、その試験化合物を抗生物質としてか、または抗生物質の設
計のためのリード化合物として使用し得る。このプロセスは、代表的に、試験化合物を本
発明のタンパク質と接触させる工程、および試験化合物がそのタンパク質に結合するか否
かを決定する工程を包含する。このプロセスにおける使用に対して好ましい本発明のタン
パク質は、酵素（例えば、ｔＲＮＡシンテターゼ）、膜トランスポーター、およびリボソ
ームタンパク質である。適切な試験化合物としては、タンパク質、ポリペプチド、炭水化
物、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの改変形態）、ならびに低分子
有機化合物（例えば、２００Ｄａと２０００Ｄａとの間のＭＷ）である。試験化合物は、
個々に提供され得るが、代表的に、ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリ
ー）の一部であり得る。結合相互作用を検出するための方法としては、ＮＭＲ、フィルタ
ー結合アッセイ、ゲルリターデイションアッセイ（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａ
ｓｓａｙ）、置換アッセイ、表面プラズモン共鳴、逆ツーハイブリッドなどが挙げられる
。本発明のタンパク質に結合する化合物は、その化合物をＧＢＳ細菌と接触させ、次いで
増殖阻害についてモニタリングすることによって、抗生物質活性について試験され得る。
本発明はまた、これらの方法を用いて同定された化合物を提供する。
本発明はまた、本発明のタンパク質および以下の抗原のうちの１つ以上を含む組成物を
提供する：
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＶａｃＡ、
ＣａｇＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ［例えば、ＷＯ９８／０４７０２］および／また
はウレアーゼ）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、ＷＯ９９／２
４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、Ｔｅ
ｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８０９−１８１５、Ｐｉｚｚａ
ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８１６−１８２０およびＷＯ９６／２９４１
２中のタンパク質抗原であって、タンパク質‘２８７’および誘導体が特に好ましい）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、Ｗ
Ｏ０１／５２８８５；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）：１
０９３−１０９６；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−
２９５８；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：
３２３−３３３などに開示される調製物）。−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、
Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のサッカリド抗原（例えば、血清群Ｃ由来の、Ｃｏｓ
ｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８に開示されるオリ
ゴ糖（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３
もまた参照のこと）。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原（例えば、
Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：３３１−
３３２；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：
２６９−２８５，ｖ；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂ
ｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７）。−Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活性化ウイ
ルス）由来の抗原（例えば、Ｂｅｌｌ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉ
ｓ Ｊ １９：１１８７−１１８８；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：
３２１−３２６）。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）（例えば、
Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８ 補遺：Ｓ６３−６８および７９−８
０）。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ
Ｄｉｓ ３：９０１−９１５）。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原、例えば、必要に応じてペルタ
クチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／または凝集原２および凝集原３とも組み合わせ
る、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および糸状赤血球凝集素
（ＦＨＡ）（例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２
−２３８）。
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリア毒素（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９８８）編
、Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ．ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０の第
３章）、例えば、ＣＲＭ１９７変異体（例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１−７０）。
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍ
ｅｒの第４章）。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来のサッカリド抗原。−Ｎ．ｇ
ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４
４、ＷＯ９９／５７２８０）。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、ＰＣＴ／ＩＢ０１／
０１４４５；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８
５−３８９；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：１３
９７−４０６；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３
）：Ｓ５２４−Ｓ５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４；ＷＯ００／３
７４９４）。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、ＷＯ９９／２８４
７５）。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、Ｒｏｓｓら
（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１４２）。
−ポリオ抗原、例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅ
ｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
＆ Ｓｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１
８、１２５−１２６）。
−狂犬病抗原（例えば、Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５ 補遺：Ｓ２
−６）、例えば、凍結乾燥不活性化ウイルス（例えば、ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａ
ｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９８ Ｊａｎ １６；４７（１）：１２，１９；ＲａｂＡｖ
ｅｒｔＴＭ）。
−麻疹、おたふくかぜおよび／または風疹抗原（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔ
ｉｍｅｒの第９章、第１０章、および第１１章）。
−インフルエンザ抗原（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒの第１９章）、
例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅ
ｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９ 補遺１：Ｓ１０１−１０７）。−Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎ
ｃｅｔ ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁もまた参照の
こと）。
サッカリド抗原または炭水化物抗原が含まれる場合、免疫原性を高めるためにキャリア
タンパク質に結合体化させることが好ましい（例えば、Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａ
ｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃ
ｃｉｎｅ １７ 補遺２：Ｓ２８−３６；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒ
ｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６、特に、ｖｏｌ．１０：４８−１１４など
）。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアま
たは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが、特に好ましい。
他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質
（例えば、ＥＰ−０３７２５０１）、合成ペプチド（例えば、ＥＰ−０３７８８８１、Ｅ
Ｐ−０４２７３４７］、熱ショックタンパク質（例えば、ＷＯ９３／１７７１２］、百日
咳タンパク質（例えば、ＷＯ９８／５８６６８；ＥＰ−０４７１１７７］、Ｈ．ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（例えば、ＷＯ００／５６３６０）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ由来のトキシンＡまたはトキシンＢ（例えば、ＷＯ００／６１７６１）などが挙げ
られる。任意の適切な結合体化反応が、必要である場合、任意の適切なリンカーと共に、
使用され得る。
毒性タンパク質抗原は、必要である場合、無毒化され得る（例えば、化学手段および／
または遺伝子手段による百日咳毒素の無毒化）。
ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含めること
もまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗
原を含めることもまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原
および破傷風抗原を含めることもまた、好ましい。
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着される。
組成物中の抗原は、代表的に、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的
に、任意の所定の抗原の濃度が、抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分である。
本発明はまた、本発明の２つ以上のタンパク質を含む組成物を提供する。この２つ以上
のタンパク質は、ＧＢＳ配列を含み得るか、またはＧＡＳ配列およびＧＢＳ配列を含み得
る。
本発明を実施するために（例えば、ワクチン接種目的または診断目的のために開示され
る配列を利用するために）使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下に続く。
この要約は、本発明に対する限定ではなく、むしろ、使用され得る例（しかし、必要とは
されない）を提供する。
（一般）
本発明の実施には、他に示されない限り、当該分野の範囲内の、分子生物学、微生物学
、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、以
下の文献に十分に説明される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ
．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉ
ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１
９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１５４巻および第１５
５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃ
ｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編
（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ
）；Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ
．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，第Ｉ巻−第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、
１９８６）。
ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略語を、本明細書中で使用する。
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを
「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも９０重量％
を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえを含む。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「か
らなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、また
はＸ＋Ｙのようなさらなるものも含み得る。
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、
宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天
然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に
連結されるとき、それらは共に機能し得る。別の例は、ストレプトコッカス配列がマウス
宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然においてみられない配置で
単一タンパク質に組み立てられる同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエ
ピトープである。
「複製起点」とは、発現ベクターのようなポリヌクレオチドの複製を開始または調節す
るポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律性ユ
ニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の
宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクタ
ーは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、
酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原
である。
「変異体」配列は、ネイティブ配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有
するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存し
て、ネイティブ配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好
ましくは５０％より大きく（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％
またはそれ以上）、これは、上記のようにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを
使用して算出される。本明細書中で使用される場合、本明細書でその核酸配列が提供され
る核酸分子または領域の「対立遺伝子改変体」は、別の単離体もしくは第２の単離体のゲ
ノム中に本質的に同じ遺伝子座で存在する核酸分子または領域、および、例えば、変異ま
たは組換えにより生ずる天然の変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列
を有する。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、それが比較される遺伝子によ
ってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対
立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）で
の変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
（発現系）
ストレプトコッカスヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞
、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され
得る。
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物Ｒ
ＮＡポリメラーゼを結合し、ｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３
’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これは
コード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の
２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正
しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考え
られている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流
以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは
、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有する；
従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提
供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモー
ター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルス
プロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイル
ス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、ホルモ
ン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得るプロモーターに依存して、構成
的であるかまたは調節される（誘導性）かのいずれかであり得る。
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（
エンハンサー）の存在は、通常、発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同性プロ
モーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を１０００倍まで刺激し得る調
節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、
それらが、通常方向もしくは反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より
上流もしくは下流に、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置
する場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２
３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、通常、より広い宿
主範囲を有するので、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ
ー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイル
スの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１
９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイト
メガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃ
ｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であ
り、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下でのみ活性になる（Ｓａ
ｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．
２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組
換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常に、ＡＴＧ開始コドンによりコード
されるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端
は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得
る。
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供
するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分
子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との
間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞
からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコー
ドする。アデノウイルスの三部からなる（ｔｒｉｐａｒｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細
胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻
訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共
に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポ
リアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３
４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ
．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓおよ
びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍ
ＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター
／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成
要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位
およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される
場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のよ
うな宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、
レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を
必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａ
ｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバ
ウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコ
ピー数で複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルス
およびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリ
コンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびに
クローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンは維持することが可能
である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆ
ｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓ
ｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる
。
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチ
ドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキスト
ラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェク
ション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオ
チドの封入、および核内へのＤＮＡの直接微量注入が挙げられる。
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、このような細
胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムス
ター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅ
ｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの
不死化細胞株が挙げられる。
（ｉｉ．バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に
挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクタ
ーの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として
、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる
異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌プラスミ
ド）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を
有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相
同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび
野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイル
スゲノムを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換
えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材
料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形
態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であ
り、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７
）（以下、「Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って
、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合）、コード配列、および転写終結配
列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築する。この構
築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結され
た調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは調節エレメントの同
じセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌
のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のよう
な、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはク
ローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持されることが可能である。
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは
、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計される。これらと
しては、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴ
に変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導
入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１
を参照のこと）が挙げられる。
このプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１
９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、ならびに選択および
増殖のための原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉにおける
複製起点を含む。
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを有する。バキ
ュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてｍ
ＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（５’から３’）方向の転写を開始
し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接し
て存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結
合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと
呼ばれる第二のドメインを有し得、通常これは、存在する場合は、構造遺伝子に対し遠位
にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター
配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅ
ｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公
開番号１２７ ８３９および１５５ ４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺
伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列
が挙げられる。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバキュロウ
イルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０
９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳
動物細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化
のような）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必
要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞間との間で保存されると思われるの
で、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５
９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８
８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら
，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；
マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；および
ヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコー
ドする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用
され得る。
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、あるいは
適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた
細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短い
リーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチ
オニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切
断され得る。
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆
虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパ
ク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。
リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する、疎水性ア
ミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
タンパク質の前駆体である発現産物をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿
入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノ
ムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物の
プロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を
含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分
野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉ
ｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏ
ｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入物は、相同二重
交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る；挿入物はま
た、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位内にあり得る。Ｍｉｌｌ
ｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン
遺伝子の代わりにクローン化される場合、このＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列に
より５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置さ
れる。
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウ
イルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）
；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウ
イルスである。従って、この方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。その発現系
の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルス
により産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染細胞の
核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を
形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで
、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、光学顕微鏡下で容易に可視化される。組換えウ
イルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスとを区別す
るために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層に
プラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイ
ルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；
Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された
。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄ
ｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６
９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈ
ｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直
接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知
である。例えば、上記ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖させ得、その改変した昆虫宿主内
に存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下
にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現
が構成的である場合、その産物は、培地中に連続的に発現され、そして目的産物を取り出
し、そして枯渇した栄養を補給しながら、栄養培地を連続的に循環させる必要がある。そ
の産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのよう
な技術により精製され得る。適切な場合、必要ならば、その産物をさらに精製し、その結
果、これもまた培地中に存在する実質的に全ての昆虫タンパク質を除去し、宿主細片（例
えば、タンパク質、脂質および多糖）を少なくとも実質的に含まない産物を提供し得る。
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタン
パク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条
件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の
ことに基づいて、当業者に容易に確かめられ得る。
（ｉｉｉ．植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および植物全体での遺伝子発現系が存在する。例
示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５
，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のような特許に記載される
ものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タ
ンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中にお
いても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３
３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ ５５：３
５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ １２
２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸およびジベレリン酸によ
り誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓおよ
びＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編、１９８４ Ｐｉｔｍ
ａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に見出
され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は、以下である：Ｓｈｅｅｎ，Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ
．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内
で作動させるために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入され
る。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流に
コンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配
列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のよう
なもともとのクローニング宿主から、所望の植物宿主へ、ベクターがＤＮＡを移動させる
ことを可能にするために必要とされる特徴を、ベクターに提供する。基本的な細菌／植物
ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マ
ーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移
入のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場
合は、好ましくは、この構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するた
めに適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イ
ネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される
。これらは、相同組換えのためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発
現カセットのランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカ
ーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げ
られる。さらなる機能をコードしている他のＤＮＡ配列はまた、当該分野で公知であるよ
うに、そのベクターの中に存在し得る。
本発明の核酸分子が、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以
上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、
異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物
５’非翻訳配列、構造遺伝子が開始コドンを備えているかどうかに依存して開始コドン、
ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の独特な制限
酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり得る。目
的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよび
トランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の
所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。翻訳開始領域は、大
部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためのものであるから
、トランスロケーションを提供するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた
、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク
質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ得、そして効率的に回収さ
れ得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚
盤上皮層を通過する。タンパク質を産生する細胞からタンパク質が分泌される必要がない
場合、このことは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物細胞におけるものであるために、クロー
ン化された遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオソーム（ｓ
ｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構によって、プロセシングで除去される配列を含むかどうかを決
定することが望ましい。このような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、
偽イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐために実施され得る。
ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１：９５−１０５（１９８５）。
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に移入するためにマイクロピペットを用いて植物細
胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２
０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて
植物細胞内に移入され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８
２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは粒子のマトリックスの内
部に、あるいはその表面のいずれかに核酸を有する小さな粒子による高速バリスティック
（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７
３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１
８５：３３０−３３６は、大麦胚乳の粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
によりトランスジェニック大麦を作製することを教示している）。さらに別の導入方法は
、他の実体（ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂質表面体のいずれか
）とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍ
ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４，１９８５）。
この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエ
レクトロポレーションされる。高い場の強度の電気衝撃により、生体膜を可逆的に通過で
きるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロ
トプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物
は、本発明により形質転換され得、その結果、移入された遺伝子を含む完全な植物が再生
される。実質的に全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マ
メ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組
織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の
属由来の種が挙げられる：Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂ
ｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ
、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓ
ｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、
Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａ
ｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐ
ｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ
、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、
Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、ＳｏｒｇｈｕｍおよびＤａ
ｔｕｒａ。
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピー
を含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成さ
れ、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成が
プロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を
形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイ
ニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加するこ
とは、特にトウモロコシおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュート
および根は通常、同時に発生する。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養歴に依
存する。これらの３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り
返し可能である。
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得るか、あ
るいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内
に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または
他の植物組織は、機械的に破壊されて、細胞間および組織間の任意の分泌されたタンパク
質を放出し得る。その混合物は緩衝溶液に懸濁されて、可溶性タンパク質が回収され得る
。次いで、従来のタンパク質単離方法および精製方法は組換えタンパク質を精製するため
に使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターは、異種タンパク質
の発現および回収を最適化するための慣用的な方法により調整される。
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリ
メラーゼに結合し得、そしてｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向
（３’方向）の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コー
ド配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通
常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた
、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し得、このドメインは、ＲＮＡ合成が始ま
る近接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッ
サータンパク質が、オペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得
るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーター
のような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アク
チベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、ＲＮ
Ａポリメラーゼ結合配列に（５’側で）近接している。遺伝子アクチベータータンパク質
の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、それはＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を助ける（
Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。調節さ
れる発現は、それゆえ正または負のいずれかであり得、従って転写を増強するかまたは低
下させるかのいずれかである。
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例とし
ては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ
１９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が
挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９
８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−
Ａ−００３６７７６号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５号）のような生合成酵素由来のプ
ロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）
プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（
１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６
号）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能す
る。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の
細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリ
ッドプロモーターを形成する（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロ
モーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃ
オペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（
Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌のプロモーターは
、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する、非細菌起
源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーター
はまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性の
あるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８
６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた
、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得
る（ＥＰＯ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。
機能性のプロモーター配列に加え、効率的なリボソーム結合部位はまた、原核生物にお
ける外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シ
ャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドン
の３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎ
ｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ
の１６Ｓ ｒＲＮＡの３’側との間の塩基対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促
進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ
ｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ
ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリ
ボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現が記載されている
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅ
ｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子
と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコ
ードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとの
インビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのイン
ビボまたはインビトロでのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され
得る（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内因性の細菌タンパク
質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコー
ド配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合
を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で連結
され得、そして細菌において発現され得る。得られた融合タンパク質は、好ましくは、外
来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（第Ｘａ
因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）
。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、
ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆ
ｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（
ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配
列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、あるいはコードしな
くてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は
、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例え
ば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と
共に作製される。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は分離され得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグ
ナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮ
Ａ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４，３３６，３３６
号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎
水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培
地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰
性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで
切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、
プロセシング部位が存在する。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍ
ｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏ
Ａ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）
のような、分泌性細菌タンパク質に関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種
々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）
Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４
２）。
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調
節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの
配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写
を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成
し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有
する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写
終結配列を含む。
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配
列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、
しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可能である染色体外エレメント（例
えばプラスミド）のような、レプリコンに保持される。このレプリコンは複製系を有し、
従って、このことが、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコ
ンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピ
ー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミ
ドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。
高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好まし
くは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベク
ターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効
果に依存する。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同
な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染
色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤ
ＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（
ＥＰ−Ａ−０ １２７ ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたは
トランスポゾン配列から構成され得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質
転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得
、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン
、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺
伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの
生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて一緒に組み立てられ得
る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、また
は組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構
成される。
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクター
のいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは
、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５
５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８
４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３
；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０
０３６ ７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７
）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国
特許第４，７４５，０５６号）。
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、
ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理
された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細
胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する
。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０
０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９
０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏ
ｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗ
ｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎ
ｅｒ（１９７８）「ＣｏｌＥ１由来のプラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉの形質転換のための改良された方法」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉ
ｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔ
ａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１
９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕ
ｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「エレクトロポレーションによる
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅ
ｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１
９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔ
ｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラー
ゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の
（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コー
ド配列の５’末端の近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常
、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵
母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを
有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子に対して遠位である。このＵＡ
Ｓは、調節される（誘導性の）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生
じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させ
るかまたは減少させるかのいずれかである。
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素を
コードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げら
れる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０ ２８４ ０４４）、エノ
ラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）
（ＥＰＯ−Ａ−０ ３２９ ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺
伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。
さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能
する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転
写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハ
イブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配
列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）が挙げられる。
ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、または
ＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０ １
６４ ５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーター
が挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして
転写を開始する能力を有する、天然に存在する非酵母起源のプロモーターを含み得る。こ
のようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（
１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉ
ｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９
８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；
Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄ
ｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａ
ｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒ
ｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅ
ｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、このＤＮ
Ａ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は
常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、
Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパ
ク質から切断され得る。
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、およ
び細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の
安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に
融合される。発現において、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例
えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子
の５’末端に連結され得、そして酵母において発現され得る。２つのアミノ酸配列の連結
部にあるＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例
えば、ＥＰ−Ａ−０ １９６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質
である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセ
シング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ま
しくは保持する、ユビキチン領域を用いて作製される。従って、この方法によって、ネイ
ティブな融合タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リ
ーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子
を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコ
ードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞から
のタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、コ
ードする。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来
であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０ ０１２ ８
７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６
８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もま
た提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−０ ０６０ ０５７）。
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダ
ーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得
る型のα因子フラグメントは、全長のプレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）
および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許
第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ２７
４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては
、第１の酵母のプレ配列を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製
される、ハイブリッドα因子リーダーが挙げられる（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参
照のこと）。
通常、酵母によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調
節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列
は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向す
る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコー
ドする転写終結配列である。
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、
および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主
（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、
プラスミド）のようなレプリコンにおいて、しばしば保持される。このレプリコンは、２
つの複製系を有し得、従って、レプリコンが、例えば、発現のために酵母において、なら
びにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において保持されることを可能にする
。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４
（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋ
ｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６４２〜４
６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数
プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そ
して通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有し得る。高コピー数プラスミドを含む宿
主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有す
る。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿
主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前
出を参照のこと。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同
な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配
列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えか
ら生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有す
るために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向さ
れ得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込ま
れ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１
９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクター
に含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを
生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築
物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいず
れかとして生じ得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転
換された酵母株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る
生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およ
びＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシン
およびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のよ
うな毒性化合物の存在下において増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵ
Ｐ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔ
ら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記の成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得
る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンのままで保持されるか、また
は組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーを含む。
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクター
のいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベク
ターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａ
ｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（
１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ
ら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１
１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ
ら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら
（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌ
ｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９
２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎ
ら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔ
ｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ
３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗ
ら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（
１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常
、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置されたインタクトな酵母細胞のい
ずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変
化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇ
ら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）
Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号
および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｂｅａｃｈ
およびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３
９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ）。
（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から
構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形
状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、３次元結合空間であり、
これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」としては、例えば、脊椎動物抗体、ハ
イブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Ｆａｂタンパク
質、および単一ドメイン抗体が挙げられる。
本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、およ
びストレプトコッカスタンパク質の識別／同定に有用である。
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、
従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好まし
くはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤ
ギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可
能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タン
パク質を生理的食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）
に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋
肉内に）注射することによって、行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に
十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理的食塩水（好ましくはフロイント不完
全アジュバントを用いて）中のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。あるいは
、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これ
は、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいとみなされる。ポリクローナル抗血
清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を２５
℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによっ
て得られる。この血清は、遠心分離（例えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収され
る。ウサギから、採血１回につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７
５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代
表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するた
めに動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が
取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、（非特異的付着
細胞の除去後）細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェル
へ適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロ
ブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い
落とされない。得られたＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と
融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサン
チン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られたハイ
ブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異
的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。
選択されたＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中
空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培
養される。
所望の場合、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても）、従来
技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色
団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合
パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）を青い色素（分光光度計を用いて定量可能）へ変換するその能力によって、検
出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタン
パク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他
の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧ
およびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対を
含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のク
ラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、
放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは、酵素として、または
ＭＡｂについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合
せ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とす
る。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして１２５Ｉで標識したアビジン、または
ＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は
、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内に等しいとみなされる。
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この
薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレ
オチドのいずれかを含む。
本明細書において使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状
態を処置、改善、または予防するための治療剤の量、または、検出可能な治療効果または
予防効果を示すための治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原
レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における
減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質お
よび程度、および投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、
あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の情況のための有
効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
本発明の目的のために、有効な用量は、投与される個体において、本発明の分子の約０
．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである
。
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可
能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような治療
剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体
の産生をそれ自体誘導せず、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的キ
ャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重
合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、ゆっく
り代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン
酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香
酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用可能である。
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロール
およびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質
などのような補助物質が、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的には、治療組成物
は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体
ビヒクル中の溶液または懸濁液として適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソーム
は、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体へ直接投与され得る。処置される被験体
は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
その組成物の直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内の
いずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この
組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤
、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕ
ｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハ
イポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、
または多数回用量スケジュールであり得る。
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療（すな
わち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、
通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリアとしては、それ自体が
、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアが挙げら
れる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タン
パク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質
凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）である。この
ようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「
アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例え
ば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体
化され得る。
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：（１）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば
、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）、
例えば、以下：（ａ）μ未満の粒子に微小流体化機械を用いて処方される、５％スクアレ
ン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、ＭＴ
Ｐ−ＰＥを含有する）を含む、ＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ
Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ
、Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ、編、１９９５の第１０章）；（ｂ）μ未満のエマル
ジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョ
ンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プ
ルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならび
に（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ
）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくはＭ
ＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含
むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（２）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕ
ｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ
）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）（こ
のＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を欠き得る）を生成し得る）、例えば、ＷＯ００
／０７６２１；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントア
ジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ
−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４
４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージ
コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（５）モノホスホリル
リピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２
２２０２２１，ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１およ
び／または水中油エマルジョンとの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、Ｅ
Ｐ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）シトシンの代わりに必要に
応じて使用される５−メチルシトシンを有する、ＣｐＧモチーフを含む（すなわち、少な
くとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）オリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ Ｖａｃｃｉ
ｎｅ ２０００，１９，６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ
Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００１ ３：１５−２４；Ｒｏｍａｎら，
Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ
，１９９７，９４，１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
９９８，１６０，８７０−８７６；Ｃｈｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６
，１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，
２７，２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６
，１２１６−１２２４，Ｋｒｉｅｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−５４
９；Ｋｌｉｎｍａｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９−２８８３；Ｂａ
ｌｌａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄ
ｅｒｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅ
ｒｎら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６７，７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔ
ｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６−８７３；Ｓｔａ
ｃｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉ
ｎａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−１７６４；Ｙｉら，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，４９１８−４９２５；Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１９９６，１５７，５３９４−５４０２；Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９
８，１６０，４７５５−４７６１；およびＹｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１
６０，５８９８−５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５，ＷＯ９８／１６２４７
，ＷＯ９８／１８８１０，ＷＯ９８／４０１００，ＷＯ９８／５５４９５，ＷＯ９８／３
７９１９およびＷＯ９８／５２５８１］；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリ
オキシエチレンエステル、例えば、ＷＯ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組
み合わせた、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２
１２０７）または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えばオクトキシノ
ール）と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレン
アルキルエステルの界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）免疫刺激オ
リゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン、例えば、ＷＯ
００／６２８００；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子、例えば、ＷＯ００／２３１
０５；（１２）サポニンおよび水中油エマルジョン、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（
１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロ
ール））、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）アルミニウム塩（好ましくは、水酸
化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムであるが、任意の他の適切な塩もまた使用され
得る（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オキシヒドロキシド、オルトリン酸塩、硫酸塩など
［例えば、Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎの第８章および９章を参照のこと］）。異なるア
ルミニウム塩の混合物もまた使用され得る。この塩は、任意の適切な形態を取り得る（例
えば、ゲル、結晶、非晶質など）；（１５）免疫刺激剤として作用して、組成物の効力を
増強するように作用する他の物質。アルミニウム塩および／またはＭＦ５９ＴＭが好まし
い。
上記で言及したように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−ス
レオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−
アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グ
リセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げ
られるが、それらに限定されない。
免疫原性組成物（例えば、免疫抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学
的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生
理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿
潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射可能なよ
うに調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態も
また調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載
のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセ
ル化され得る。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性
のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」
とは、個体へのその量の投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、
処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身
体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の
免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方、処置する医
師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的
広い範囲であり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
免疫原性組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒ
ａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかで
の注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切な
さらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチン
は、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンが使用され得る（例えば、
ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ １５：６１７−６４８；本明細書以下を参照のこと）。
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送
達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的のいずれかで
投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクタ
ーアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列
の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。
このコード配列のインビボでの発現は、構成的かまたは調節されるかのいずれかであり得
る。
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送
達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウ
イルスベクターまたはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、
アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、
パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコ
ルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり
得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５
：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ６：１４８−１５３を参照のこと。
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任意のレト
ロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを意図する。これに
は、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性レトロウイルス（例えば、ＮＺ
Ｂ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．５３：１６０を参照のこと））、多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭ
ＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと））
、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
５を参照のこと。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例
えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラ
ウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し
得、そして第二鎖合成の起点はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそ
れらを導入することによって、形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る
（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロ
ウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって、宿主細胞ＤＮＡへの部位
特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換
えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株
は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／
０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のため
のプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株、すなわち「ＶＣＬ」とも称される）
を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ
１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を
除去する。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスとしては、
トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカ
ス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス
が挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４
Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９：１９−２５）、
Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４
５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａ
ｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロ
ニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレト
ロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関（例えば、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒ
ｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ａ
ＴＣＣ」））から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から
単離され得る。
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては
、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３
４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ
９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９
８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／
０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７
４０号、同第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８
９号、同第４，７７７，１２７号、同第５，５９１，６２４号に記載されるベクターが挙
げられる。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖ
ｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕ
ｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；
Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１；６３４９；および
Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １もまた参照のこと
。
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明に
おいて使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１
、ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２
を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベク
ターとしては、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６
９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／
００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、Ｗ
Ｏ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２
２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５
／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，
ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／
０９６５４において記載されるベクターが挙げられる。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９
２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデ
ノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた
、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのよう
なベクターの主要かつ好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＷＯ９３／０９２３９に開
示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡ
ＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブのＤ配列は、ヌクレオチドの置換によっ
て改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネ
イティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８ま
でのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され
、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドは欠失しているか、またはネイティブでないヌクレ
オチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方
向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレ
オチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオ
チドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレ
オチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−
１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２４：２５７−
２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１である（Ｓ
ａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）。別の例示
的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ
ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベク
ターは、Ｃａｒｔｅｒ 米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ 米国
特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅ 米国特許第５，４７４，９３５号な
らびにＫｏｔｉｎ ＷＯ９４／２８８１５７に開示されるベクターである。本発明におい
て使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、
これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において
優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクタ
ーは、米国特許第５，３５４，６７８号、同第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，
９４１号、および同第５，２５２，４７９号に開示される。
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要かつ好ま
しい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルス
ベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏ
ｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクタ
ーは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ｌａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１お
よびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ Ｕｓ３：：ｐｇＣ
−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳ
Ｖ ７１３４、２ＲＨ １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ
ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
意図されるのはまた、本発明において使用され得るアルファウイルス遺伝子治療ベクタ
ーである。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。
トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４
７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス
（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイ
ルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９
；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）ならびに米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７
，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出
願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、
ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、
および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるそれらのアルファウイルスベクター
が使用可能である。このようなアルファウイルスは、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａ
ｎｄのＡＴＣＣのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用
可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少した
アルファウイルスベクターを使用する（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照の
こと）。
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現につい
て有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照
のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はアルファウイルスベクターに由来し
、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、ポリオウイルス（例えば
、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）３８５お
よびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１
５に記載されるもの；リノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏ
ｌｄ（１９９０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌ４０１に記載されるもの；ポックス
ウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、Ａ
ＴＣＣ ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ
（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（
１９８９）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０
）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，
３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイルス（例
えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７
７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：１５３３に
記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７ならびに
米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１
）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌ
ｌ ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ Ｍｅｄ ３０９：１３なら
びにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）
２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝学技術を使用して作製した
組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅ
ｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイル
ス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−
０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８
）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０
）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）；チクン
グンヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）；フ
ォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４
）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）
；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）；
マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）；ムカンボウイルス（例えば、ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）；ヌヅムウイルス（例えば、ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２およびＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９
２５）；トリニティウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）；ユナウイルス（例え
ば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）
；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）；オニョンニョンウイル
ス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ ＶＲ−
１２４２）；西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）；ならびにコ
ロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏ
ｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２１：１９０に記載のものが挙げられる。
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。
他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウ
イルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特
許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（
１９９２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド
連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５−
１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号
０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４
，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米
国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号
およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷中和または細胞膜
との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１５８１−１５８５に記載される。
粒子媒介遺伝子送達が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を
参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベ
クターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるようなアシアロオロソ
ムコイド、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：２５
３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｃｈｅｍ ３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースま
たはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子送達分子（例えば、重合ＤＮＡ結合カチ
オン様ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン）とともにインキュベートされ得る。
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９
２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生体分解性の
ラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによ
るエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処
理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を
容易にすることによってさらに改良され得る。
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号
、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−
５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、
非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のため
に従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例
えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランス
フェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン
、およびアルブミン）のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他
の送達系は、種々の組織特異的または普遍的に活性なプロモーターの制御下に遺伝子を含
むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイ
ルス送達は、機械的送達システム（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載
されるアプローチ）を含む。さらに、コード配列およびこのような配列の発現産物は、光
重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達のために使用され
得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子送達粒子銃の使用（
米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化する
ための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３
に記載されるような）を含む。
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２
２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６
９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃ
ｔａ ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：
１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：７８５１
；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７６：４２０に記載されるビヒ
クルである。
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおりである）
の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体
において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍ
ｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接；（２）
エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のた
めにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る
。ヒト被験体もまた処置され得る。
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によって、ある
いは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた
、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与、坐剤、および経皮（ｔ
ｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、Ｗ
Ｏ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。
投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公
知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用
である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファー
ジ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の
手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブ
レン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へ
のポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接微量注入（これらはすべて
当該分野で周知である）で達成され得る。
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポ
リヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソム
コイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメン
ト；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコ
ロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例
えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタ
ンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
の環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ
酸ペプチド）。
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン
、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに
含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレン
グリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含
有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストラ
ンまたはＤＥＡＥデキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリ
ド）。
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への
送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ
得る。
脂質カプセル化は、一般的に、核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉および維
持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比
は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、また
はより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説につ
いては、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）
アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは
、機能的な形態の、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（
１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１
；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１
０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイル
オキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは
、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌ
ｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。
他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａ
ｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が
挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利
用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）
−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋ
ａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１
９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
同様に、アニオン性および中性のリポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ
Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易
に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホ
スファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイル
ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰ
Ｇ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが挙げられる。こ
れらの物質はまた、適切な比率でＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る
。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
このリポソームは、多重膜の小胞（ＭＬＶ）、小さな単一膜小胞（ＳＵＶ）、または大
きな単一膜の小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で
公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅ
ｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐ
ｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３；
Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ
（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ
（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；
Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３
４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕ
ｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；な
らびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を
参照のこと。
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含ま
れ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤ
Ｌ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または
融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、
アセチル化ＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプ
ターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタン
パク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはそ
の組成物中には含まれない。
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパ
ク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ
、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらのうち２つは、いくつかのタ
ンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって
命名されている。
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在
するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経つとこれらのリポタ
ンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、
Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤ
Ｌはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１
９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６
５：２３２に記載されている。
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、および
リン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質
において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在
するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性につ
いてアポタンパク質の立体構造を補助するために選択される。脂質の組成はまた、ポリヌ
クレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る
。このような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、イン
ビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって
産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ｃｈｅｍ １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ
Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡのような
商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａ
ｎｎら、ＷＯ９８／０６４３７に見い出され得る。
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組
成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し
、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤
は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれをも有する。ポリカチオン性
薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用
され得る。
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポ
リアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例としては、ヒストン、プロタ
ミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮ
Ａウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）が挙げられる。転写因子もまた
、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に
言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−
２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、
およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔ
ｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他の
ポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレ
ンが挙げられる。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは
、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成す
るモノマーである。
（免疫診断アッセイ）
本発明のストレプトコッカス抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにお
いて使用され得る（または、逆に抗ストレプトコッカス抗体は、抗原レベルを検出するた
めに使用され得る）。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイが、侵襲性の
診断方法を置換するために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまた
は血清サンプルを含む）内のストレプトコッカスタンパク質に対する抗体が検出され得る
。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれ
らは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、ま
たは直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた
、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッ
セイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分
子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを
増幅するアッセイは公知である；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッ
セイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）
である。
免疫診断に適切でありそして適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッ
セイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）
ならびに適切なセットのアッセイの説明書と共に本発明の組成物を含む適切な物質をパッ
ケージすることによって構築される。
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう
。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離してい
る。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影
響を与える因子としては、以下が挙げられる：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイ
ブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロ
ックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会
合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用
；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましい
ハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算
されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべき
である。温度および塩条件はしばしば、フィルター上に固定したゲノムＤＮＡのサンプル
が目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄され
る、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参
照のこと。
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの
複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性、である。研究される
フラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高
度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については１０−９〜１０−８ｇまで、
１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブ
ロッティング、ハイブリダイゼーション、および露光の時間、より少量の出発ポリヌクレ
オチド、およびより低い特異的活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵
母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８
ｃｐｍ／μｇのプローブを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の露光時間を用いて
検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存的アプローチは、１０μｇの
ＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて
１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる
。
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッ
ドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄につ
いての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメント
に対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変数には、長さ、ハイブリ
ダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝
液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近
似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホ
ルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッドの長さで
ある（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８
：２６７−２８４からわずかに改変した）。
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与
えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度な
らびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（す
なわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリ
ダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少す
る。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝
子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように
）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが
増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイズするバンドの強度、およびバッ
クグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少と
ともに増大する。
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標
的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％
相同では３７℃、８５％〜９０％相同では３２℃である。より低い相同性については、上
記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきであ
る。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプロー
チは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開
始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウ
ンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露
光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつか
のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験される
べきである。
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、または
ブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プロ
ーブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本
発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
核酸プローブは、本発明のストレプトコッカスヌクレオチド配列（センス鎖およびアン
チセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミ
ノ酸配列をコードするが、ネイティブなストレプトコッカス配列は、細胞に存在する実際
の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード
配列に相補的であるべきであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤ
ＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
プローブ配列は、ストレプトコッカス配列（またはその相補物）に同一である必要はな
い。核酸プローブが標的ヌクレオチドと、検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列お
よび長さのいくらかの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸プロ
ーブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらな
るストレプトコッカス配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助
となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され
得、ここでそのプローブ配列の残りはストレプトコッカス配列に相補的である。あるいは
、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得るが、但し、プローブ配
列は、ストレプトコッカス配列とハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二
重鎖を形成するために、ストレプトコッカス配列との十分な相補性を有する。
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩
条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存し
て、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５
〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くて
もよい。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形
成するのにより低い温度を必要とする。
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、ま
たは市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエート
またはメチルホスホネートのような骨格の改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増
大させ、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性を増大させるためなどに使用され得
る（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ ６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ １４：３
７６−３８７を参照のこと）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例え
ば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔ
ら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：３８４−３８６を参照のこと）。
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の
手段である。このアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８
７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３
，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブ
リダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増幅標的（ま
たはその相補物）の配列にハイブリダイズしない配列を含み、二重鎖の安定性を補助する
か、または、例えば、簡便な制限部位を組み込む。代表的には、このような配列は、所望
のストレプトコッカス配列に隣接する。
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーか
ら標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後
、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザン
ブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、ストレプトコッカス配列（またはそ
の相補物）にハイブリダイズする。
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来的
なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラー
ゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得
る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされ
る。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズ
していないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。
代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
図１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図３９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図４９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図５９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図６９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図７９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図８６Ａは、ｐＤＥＳＴ１５ベクターを示す。 図８６Ｂは、ｐＤＥＳＴ１７−１ベクターを示す。 図８７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図８８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図８９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図９９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１００は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１０９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図１１９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１２９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１３９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１４９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１５９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１６９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１７０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、１５および１０ｋＤａである。 図１７１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１７９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８０は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８１は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８２は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８３は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８４は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８５は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 図１８６は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８７は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１８９は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９０は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９７は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９８は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図１９９は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２００は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０７は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０８は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２０９は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１０は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１７は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１８は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２１９は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２０は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２７は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２８は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２２９は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３０は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３７は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３８は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２３９は、本発明のＧＢＳタンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの培養物からの総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーン１は、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４０は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４１は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４２は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４３は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４４は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４５は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４６は、本発明の精製ＧＢＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左手のレーンは、分子量マーカーを含む。これらは、９４、６７、４３、３０、２０．１および１４．４ｋＤａである。 図２４７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２４８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２４９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２５９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２６９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２７９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２８９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図２９９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３００は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３０９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１０は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１１は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１２は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１３は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１４は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１５は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１６は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１７は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１８は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。 図３１９は、本発明の種々のタンパク質についてのタンパク質特徴付けデータを示す。
（発明を実施するための形態）
以下の実施例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにおいて同定された核酸配列を、それら
の推定翻訳産物と共に記載する。これらの実施例は、一般に、以下の形式：
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにおいて同定されたヌクレオチド配列
・この配列の推定翻訳産物
・抗原性を示す、翻訳産物のコンピューター分析（例えば、ＰＳＯＲＴ出力）、
である。
ほとんどの実施例は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のヌクレオチド配列を記載する。
配列決定された特定の株は、血清型Ｖ由来であり、これは、Ｒ抗原を発現する、イタリア
で単離された臨床株である（ＩＳＳ／Ｒｏｍｅ／Ｉｔａｌｙコレクション、株２６０３
Ｖ／Ｒ）。これらの実施例のいくつかについて、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の対応する配
列もまた示す。ＧＢＳおよびＧＡＳが、この様式で相同性を示す場合、本質的機能を示唆
する種と良好な異種間反応性を与える種との間に保存性が存在する。
対照的に、いくつかの実施例は、ＧＢＳにおいて相同性が同定されなかった、ＧＡＳ由
来のヌクレオチド配列を記載する。この相同性の欠如は、ＧＡＳをＧＢＳと区別するため
に、およびＧＡＳ特異的産物を作製するために有用である、分子を与える。同じことが、
ＧＡＳホモログを欠くＧＢＳ配列についても当てはまり、例えば、これらは、ＧＢＳ特異
的産物を作製するために有用である。
これらの実施例は、代表的に、公のデータベースにおける配列に対する相同性の詳細を
含む。配列が類似するタンパク質は、一般に、構造および機能の両方が類似し、そしてそ
の相同性は、しばしば、共通の進化起源を示す。既知機能のタンパク質の配列との比較は
、新規配列に対して推定のタンパク質機能を割り当てるためのガイドとして広範に使用さ
れ、そしてゲノム全体の分析において特に有用であることが証明されている。
種々の試験を使用して、これらの実施例で同定されたタンパク質のインビボ免疫原性を
評価し得る。例えば、これらのタンパク質を組換え発現させ、そしてこれらを使用して、
イムノブロットによって患者血清をスクリーニングし得る。タンパク質と患者血清との間
の陽性反応は、その患者が、その問題のタンパク質に対して既に免疫応答を備えている（
すなわち、そのタンパク質が免疫原である）ことを示す。この方法はまた、免疫優性タン
パク質を同定するために使用され得る。これらの実施例で使用されるマウスモデルもまた
、使用され得る。
組換えタンパク質はまた、例えば、マウスにおいて、抗体を調製するために慣用的に使
用され得る。これらは、タンパク質が細胞表面に位置する、直接のコンフォメーションに
ついて使用され得る。標識した抗体（例えば、ＦＡＣＳのための蛍光標識）を、インタク
トな細菌と共にインキュベートし得、そして細菌表面上の標識の存在は、そのタンパク質
の位置を確認する。
多くのＧＢＳタンパク質について、以下のデータが与えられる：
−ＧＢＳタンパク質発現についての全組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析
−タンパク質精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
−組換えタンパク質に対して惹起された抗血清を使用する、全ＧＢＳ細胞抽出物のウエ
スタンブロット分析
−組換えタンパク質に対して惹起された抗血清を使用する、ＧＢＳに対するＦＡＣＳお
よびＥＬＩＳＡ分析
−インビボ受動保護アッセイの結果。
使用した実験技術の詳細を、以下に示す。
（配列分析）
ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＧＬＩＭＭＥＲプ
ログラム［Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６
：５４４−８］を使用して推定した。必要な場合、開始コドンを、上流のＤＮＡ配列にお
けるリボソーム結合部位およびプロモーター領域の存在に基づいて、手動で修正および補
正した。
次いで、ＯＲＦを、プログラムＢＬＡＳＴｐ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０］およびＰＲＡＺＥ（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒ
ｍａｎアルゴリズムの改良型）［ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ １４７：１９５−７；Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら（１９９５）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６９：４９６−５１２を参照のこと］を使用して、非重複タンパク質データベ
ースに対してスクリーニングした。
ＯＲＦ内のリーダーペプチドを、以下の３つの異なるアプローチを使用して位置決めし
た：（ｉ）ＰＳＯＲＴ［Ｎａｋａｉ（１９９１）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ
．，Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖ．６９：２６９−２９１；ＨｏｒｔｏｎおよびＮａｋａｉ（１
９９６）Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：１０９−１１５；Ｈｏｒ
ｔｏｎおよびＮａｋａｉ（１９９７）Ｉｎｔｅｌｌｉｇ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
５：１４７−１５２］；（ｉｉ）ＳｉｇｎａｌＰ［ＮｉｅｌｓｅｎおよびＫｒｏｇｈ（１
９９８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＭＢ ６），ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅ
ｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１２２−１３０頁；Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９
９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２：３−９；Ｎｉｅｌｓｅｎら（１
９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ Ｓｙｓ．８：５８１−５９９］；および（ｉｉｉ）
ＯＲＦ配列の目視検査。シグナル配列を「予想部位（ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｓｉｔｅ）」値
で示す場合、その値は、シグナルペプチドのＣ末端残基を表す（例えば、２６の「予想部
位」は、そのシグナル配列がアミノ酸１〜２６からなることを意味する）。
リポタンパク質特異的シグナルペプチドを、以下の３つの異なるアプローチを使用して
位置決めした：（ｉ）ＰＳＯＲＴ［上記を参照のこと］；（ｉｉ）「原核生物膜リポタン
パク質脂質結合部位」ＰＲＯＳＩＴＥモチーフ［Ｈｏｆｍａｎｎら（１９９９）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２１５−２１９；ＢｕｃｈｅｒおよびＢａｉｒｏｃ
ｈ（１９９４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎ
ｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＭＢ−９４），ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，５３−６１頁］
；および（ｉｉｉ）パターン（Ｍ、Ｌ、Ｖ）ｘ｛９、３５｝ＬｘｘＣｘを使用する、ＧＣ
Ｇ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅにおいて利用可能なＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ
プログラム。
膜貫通ドメインを、以下の２つのアプローチを使用して位置決めした：（ｉ）ＰＳＯＲ
Ｔ［上記を参照のこと］；および（ｉｉ）ＴｏｐＰｒｅｄ［ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９
９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５：４８７−４９４］。
ＬＰＸＴＧモチーフ（グラム陽性細菌における細胞壁結合タンパク質に特徴的）［Ｆｉ
ｓｃｈｅｔｔｉら（１９９０）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：１６０３−５］を、パ
ターン（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｙ、Ｆ）Ｐｘ（Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｇ）（Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｌ）
を使用する、ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳで位置決めした。
ＲＧＤモチーフ（細胞接着分子に特徴的）［Ｄ’Ｓｏｕｚａら（１９９１）Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １６：２４６−５０］を、ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳを使
用して位置決めした。
解糖系に属する酵素もまた、抗原として選択した。なぜなら、これらは、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｉの表面上に発現されることが実験的に見出されているからである［例えば、
ＰａｎｃｈｏｌｉおよびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：
４１５−２６；ＰａｎｃｈｏｌｉおよびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２７３：１４５０３−１５］。
（タンパク質のクローニング、発現および精製）
ＧＢＳ遺伝子を、以下の２つの異なる型の融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおける
発現を容易にするようにクローニングした：
ａ）アミノ末端にヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質（Ｈｉｓ−ｇｂｓ）
ｂ）アミノ末端にＧＳＴ融合パートナーを有するタンパク質（Ｇｓｔ−ｇｂｓ）。
クローニングを、ＧａｔｅｗａｙＴＭ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を
使用して行った。この技術は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム内への、およびＥ．ｃｏｌｉゲノムか
らの、λファージの組み込みおよび切り出しを媒介する、部位特異的組換え反応に基づく
。１回のクローニング実験には、以下の工程が含まれる：
１−ＧＢＳ染色体ＤＮＡを増幅して、ａｔｔＢ組換え部位に隣接する単一のＯＲＦをコ
ードするＰＣＲ産物を得る工程
２−このＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲベクター（ａｔｔＰ部位を含む）にＢＰ反応（ａｔｔ
Ｂ×ａｔｔＰ部位）を介して挿入する工程。この反応は、いわゆる、「ｐＥｎｔｒｙ」ベ
クターを与え、これは、ここで、そのインサートに隣接するａｔｔＬ部位を含む。
３−このＧＢＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（ａｔｔＲ部位を含む、ｐＤｅｓｔ
ｉｎａｔｉｏｎベクター）に、ｐＥｎｔｒｙプラスミドとｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎプラ
スミドとの間のＬＲ反応（ａｔｔＬ×ａｔｔＲ部位）を介して挿入する工程。
（Ａ）染色体ＤＮＡ調製）
染色体ＤＮＡ調製のために、ＧＢＳ株２６０３ Ｖ／Ｒ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｓｕｐｅ
ｒｉｏｒｅ Ｓａｎｉｔａ、Ｒｏｍｅ）を、２リットルのＴＨ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ
）中３７℃で、対数期まで増殖させ、遠心分離によって回収し、そして４０ｍｌのＴＥＳ
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２０％スクロース）中
に溶解した。２．５ｍｌのリゾチーム溶液（ＴＥＳ中２５ｍｇ／ｍｌ）および０．５ｍｌ
のムタノリシン（Ｓｉｇｍａ Ｍ−９９０１、Ｈ２Ｏ中２５０００Ｕ／ｍｌ）の添加後、
懸濁液を、３７℃で１時間インキュベートした。１ｍｌのＲＮａｓｅ（２０ｍｇ／ｍｌ）
および０．１ｍｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そしてインキュベー
ションを、３７℃で３０分間続けた。
細胞溶解物を、５ｍｌサルコシル溶液（２５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中１０％
Ｎ−ラウリルサルコシン）を添加して、そして３７℃で１時間、頻繁に反転させながら
インキュベートすることによって得た。フェノール、フェノール−クロロホルムおよびク
ロロホルムでの連続抽出後、ＤＮＡを、０．３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および
２容量の無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスし、
そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８））に溶解
した。ＤＮＡ濃度を、ＯＤ２６０によって評価した。
（Ｂ）オリゴヌクレオチド設計）
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、各ＯＲＦのコード配列に基づいて設計した。こ
の目的は、そのタンパク質の細胞外領域を発現させることであった。従って、推定シグナ
ルペプチドを除去し（推定リーダー配列から直ぐ下流の５’末端増幅プライマー配列を推
定することによって）、そしてＣ末端細胞壁結合領域を除去した（例えば、ＬＰＸＴＧモ
チーフおよび下流のアミノ酸）。さらなるヌクレオチドを欠失させた場合、これを、接尾
語「ｄ」によって示す（例えば、「ＧＢＳ３５２ｄ」−表Ｖを参照のこと）。逆に、接尾
語「Ｌ」は、これらの欠失を伴わない発現をいう。Ｃ末端残基およびＮ末端残基の欠失も
また、時折作製し、接尾語「Ｃ」または「Ｎ」で示す。
発現されたＧＢＳタンパク質のアミノ酸配列（「ｄ」形態および「Ｌ」形態などを含む
）を、表ＩＩに示されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列によって、明確に規定する
。
順方向プライマーの５’テールおよび逆方向プライマーの３’テールは、それぞれ、ａ
ｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位を含んだ：
順方向プライマー：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＣＴＣＴ−ＯＲＦインフレーム−３’（このＯＲＦの最初のコードトリプレットがＴで始
まる場合、このＯＲＦに先行するＴＣＴ配列を除去した）。
逆方向プライマー：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧ
ＧＴＴ−ＯＲＦ逆方向相補体−３’。
増幅される配列にハイブリダイズしたヌクレオチドの数は、プライマーの融解温度（Ｂ
ｒｅｓｌａｕｅｒら［ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８６）８３：３７４６−５０］によって記
載されるように決定した）に依存した。選択されたオリゴの平均融解温度は、ハイブリダ
イズする領域について、５０〜５５℃であり、そしてオリゴ全体について、８０〜８５℃
であった。
（Ｃ）増幅）
標準的なＰＣＲプロトコルは、以下であった：５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、最終容量１
００μｌ中、０．５μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１×緩衝液（Ｍｇ＋＋なし）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および２ユニットのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で、テ
ンプレートとして使用した。各サンプルに対して、以下の二重工程の増幅を行った：ハイ
ブリダイズ温度として、５０℃を使用して行う５サイクル、その後の、６８℃での２５サ
イクル。
標準的なサイクルは、以下のとおりである：
変性：９４℃、２分
５サイクル： 変性：９４℃、３０秒
ハイブリダイゼーション：５０℃、５０秒
伸長：７２℃、１分または２分４０秒
２５サイクル： 変性：９４℃、３０秒
ハイブリダイゼーション：６８℃、５０秒
伸長：７２℃、１分または２分４０秒。
伸長時間は、２０００ｂｐより短いＯＲＦについては１分であり、そして２００ｂｐよ
り長いＯＲＦについては、２分４０秒であった。増幅を、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲシス
テム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。
増幅結果を確認するために、２μｌの各ＰＣＲ産物を、１〜１．５アガロースゲルにロ
ードし、そして増幅フラグメントのサイズを、ＤＮＡ分子量標準（ＤＮＡマーカーＩＸ
Ｒｏｃｈｅ、１ｋｂ ＤＮＡラダー Ｂｉｏｌａｂｓ）と比較した。
単一バンドのＰＣＲ産物を、ＰＥＧ沈殿によって精製した：３００μｌのＴＥ緩衝液お
よび２００μｌの３０％ ＰＥＧ ８０００／３０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、１００μｌ Ｐ
ＣＲ反応物に添加した。ボルテックス後、ＤＮＡを、１００００ｇで２０分間遠心分離し
、１容量の７０％エタノールで洗浄し、そしてペレットを、３０μｌのＴＥ中に溶解した
。３５０ｂｐより小さいＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精
製し、そして３０μｌの提供される溶出緩衝液で溶出させた。
収率を評価するために、２μｌの精製ＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動に供し、そし
て滴定分子量標準に対して比較した。
（Ｄ）発現ベクターへのＰＣＲ産物のクローニング）
クローニングを、ＧａｔｅｗａｙＴＭ技術の「１チューブプロトコル」に従って行った
。この技術は、ＰＣＲ産物を発現ベクターに直接挿入するための２工程反応（ＢＰおよび
ＬＲ）からなる。
ＢＰ反応（ａｔｔＢ×ａｔｔＰ部位）：この反応は、ｐＤＯＮＲベクターへのＰＣＲ産
物の挿入を可能にする。本発明者らが使用したｐＤＯＮＲＴＭ２０１ベクターは、ＰＣＲ
インサートを欠くバックグラウンドコロニーを最小化するための、ａｔｔＰ１部位とａｔ
ｔＰ２部位との間のキラー毒素遺伝子ｃｃｄＢ、およびカナマイシン耐性のための、選択
マーカー遺伝子を含む。この反応は、いわゆる、ｐＥｎｔｒｙベクターを生じ、ここで、
ＧＢＳ遺伝子は、ａｔｔＬ１部位とａｔｔＬ２部位との間に位置した。
６０ｆｍｏｌのＰＣＲ産物および１００ｎｇのｐＤＯＮＲＴＭ２０１ベクターを、１２
．５μｌの最終容量中、２，５μｌのＢＰクローナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）ＴＭと共に、
２５℃で４時間インキュベートした。
ＬＲ反応（ａｔｔＬ×ａｔｔＲ部位）：この反応は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（ａｔ
ｔＲ部位を含む、ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター）へのＧＢＳ遺伝子（ここでは、ｐ
Ｅｎｔｒｙベクターに存在する）の挿入を可能にする。２つのｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ
ベクターを使用した（Ｎ末端ＧＳＴ融合物についてｐＤＥＳＴ１５（図８６）；およびＮ
末端Ｈｉｓタグ化融合物についてｐＤＥＳＴ１７−１（図８７））。両方は、Ｔ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼプロモーター下でのＯＲＦ融合コードｍＲＮＡの転写を可能にする［Ｓｔ
ｕｄｉｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：６０ｆｆ］。
５μｌのＢＰ反応物に、０．２５μｌの０．７５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｎｇのＤｅｓｔ
ｉｎａｔｉｏｎベクターおよび１．５μｌのＬＲクローナーゼＴＭを添加した。この反応
物を、２５℃で２時間インキュベートし、そして１μｌの１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
溶液を３７℃、１５分で用いて停止させた。
１μｌの完了反応物を使用して、５０μｌのエレクトロコンピテントＢＬ２１−ＳＩＴ
Ｍ細胞を形質転換した（０．１ｃｍ、２００オーム、２５μＦ）。ＢＬ２１−ＳＩ細胞は
、塩誘導性ｐｒＵプロモーターの制御下に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
を含む［Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：４３
４ｆｆ］。エレクトロポレーション後、細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地（２０ｇ／ｌバクト
トリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、０．５８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ｌ ＫＣ
ｌ、２０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に希釈し、そして３７℃で１時間
インキュベートした。２００μｌの細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
ＯＮプレート（ＮａＣｌを含まないＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ培地）上にプレートした。次
いで、プレートを、３７℃で１６時間インキュベートした。
Ｅｎｔｒｙクローン：免疫学的アッセイ後に目的物と認められ得る遺伝子を含むＧａｔ
ｅｗａｙ適合性ｐＥｎｔｒｙプラスミドの将来の調製を可能にするために、２．５μｌの
ＢＰ反応物を、３μｌの０．１５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液の存在下で１５分間
インキュベートし、次いで、−２０℃に維持した。この反応は、この様式で、他のＤｅｓ
ｔｉｎａｔｉｏｎベクター中の遺伝子の将来の導入のためのＥｎｔｒｙクローンを産生す
るようにＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞を形質転換するために利用可能であった。
（Ｅ）タンパク質発現）
ＬＲ反応の形質転換から誘導された単一コロニーを、３ｍｌ ＬＢＯＮ（１００μｇ／
ｍｌ アンピシリン）中の小スケールの培養物として播種し、２５℃で一晩増殖させた。
５０〜２００μｌの培養物を、３ｍｌ ＬＢＯＮ／Ａｍｐ中に０．１の開始ＯＤ６００に
まで播種した。培養物を、０．４〜０．６のＯＤ６００まで３７℃で増殖させ、そして組
換えタンパク質発現を、最終濃度０．３ＭのＮａＣｌの添加によって誘導した。２時間の
インキュベーション後、最終ＯＤをチェックして、培養物を氷上で冷却した。０．５のＯ
Ｄ６００の細胞を、遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、５０μｌのタンパク質
ローディングサンプル緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５％
ｗ／ｖ ＳＤＳ、２．５％ ｖ／ｖ グリセリン、０．０５％ ｗ／ｖ ブロモフェノー
ルブルー、１００ｍＭ ＤＴＴ）中に懸濁し、そして１００℃で５分間インキュベートし
た。１０μｌのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって分析
し、誘導されたタンパク質のバンドの存在を確認した。
（Ｆ）組換えタンパク質の精製）
単一コロニーを、２５ｍｌ ＬＢＯＮ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）中に播種し、
そして２５℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、５００ｍｌ ＬＢＯＮ／ａｍｐ中に
播種し、そして０．４〜０．６のＯＤ６００値まで２５℃で振盪しながら増殖させた。次
いで、タンパク質発現を、最終濃度０．３ＭのＮａＣｌの添加によって誘導した。２５℃
での３時間でのインキュベーション後、最終ＯＤ６００をチェックして、培養物を氷上で
冷却した。６０００ｒｐｍ（ＪＡ１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）での２０分間の遠心分
離後、細胞ペレットを、精製のために処理したか、または−２０℃で凍結させた。
タンパク質を、融合パートナーおよびタンパク質の可溶性に依存する３つの方法のうち
の１つにおいて精製した。
（Ｅ．ｃｏｌｉからの可溶性Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製）
１．−２０℃から氷浴にペレットを移し、そして各ペレットを１０ｍｌ Ｂ−ＰＥＲＴＭ
溶液（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、
Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ．７８２６６）、１０μｌの１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２溶液、５０μｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−４２６３、ＰＢＳ中１０
０Ｋユニット）および１００μｌのＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ
Ｌ−７６５１、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で再構成する。
２．再懸濁したペレットを５０ｍｌ遠心管に移し、そして３〜４回ボルテックスしながら
、３０〜４０分間室温で放置する。
３．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。
４．１ｍｌのＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｎｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
カラムを調製する。５０ｍＭ リン酸緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で平
衡化する。
５．ペレットを−２０℃で保存し、そしてカラムに上清をロードする。
６．フロースルーを廃棄する。
７．１０ｍｌの２０ｍＭ イミダゾール緩衝液、５０ｍＭ ホスフェート、３００ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄する。
８．４．５ｍｌ（１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ）の２５０ｍＭ イミダゾール緩
衝液、５０ｍＭ ホスフェート、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で、カラムに結合
したタンパク質を溶出し、そして各々約１．５ｍｌの３つの画分を収集する。各チューブ
に１５μｌの２００ｍＭ ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加する。
９．Ｂｒａｄｏｆｏｒｄ法で収集画分のタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
ってタンパク質を分析する。
１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ間、＋４℃で収集画分を保存する。
１１．免疫のために、４０％グリセロール中０．５ｍｌの各２０〜１００μｇの４〜５個
のアリコートを調製する。希釈緩衝液は、上記の溶出緩衝液＋２ｍＭ ＤＴＴである。免
疫までにアリコートを−２０℃で保存する。
（封入体からのＨｉｓタグ化タンパク質の精製）
１．細菌を、遠心分離によって５００ｍｌ培養物から収集する。必要な場合、細菌ペレッ
トを−２０℃で保存する。−２０℃から室温にペレットを移し、そして各ペレットを１０
ｍｌ Ｂ−ＰＥＲＴＭ溶液、１０μｌの１００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液（最終１ｍＭ）、５
０μｌのＤＮＡｓｅＩ（ＰＢＳ中１００Ｋユニットに等価）および１００μｌのＰＢＳ中
１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ
Ｌ−７６５１）溶液（１０ｍｇに等価、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で再構成する。
２．再懸濁したペレットを５０ｍｌ遠心管に移し、そして３〜４回ボルテックスしながら
、３０〜４０分間室温で放置する。
３．約３０〜４０００×ｇで１５間遠心分離し、ペレットを収集する。
４．５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ｛トリス（２−カルボキシエチル）
−ホスフィン塩酸塩、Ｐｉｅｒｃｅ｝、６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ８．５）でペレッ
トを溶解、磁気棒を用いて１０分間攪拌する。
５．上記のように遠心分離し、上清を収集する。
６．１ｍｌのＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｎｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
カラムを調製する。５ｍｌのＨ２Ｏでカラムを２回洗浄し、そして５０ｍＭ ＴＲＩＳ−
ＨＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ８．５）で平衡化する。
７．工程５由来の上清をカラムにロードし、５ｍｌの５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液
、１ｍＭ ＴＣＥＰ、６Ｍ 尿素（ｐＨ８．５）で洗浄する。
８．１０ｍｌの２０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ 尿素、１
ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．５）でカラムを洗浄する。可能性のあるさらなるコントロール
のために最初の５ｍｌを収集して取っておく。
９．２５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ 尿素、１ｍＭ Ｔ
ＣＥＰ（ｐＨ８．５）を含む４．５ｍｌの緩衝液で、カラムに結合したタンパク質を溶出
させる。溶出緩衝液を、３回の１．５ｍｌアリコートで添加し、そして対応する３つの画
分を収集する。１５μｌ ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を各画分に添加する。
１０．Ｂｒａｄｏｆｏｒｄ法でこれらの画分のタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによってタンパク質を分析する。
１１．選択した画分を、１０％ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５ｍＭ
還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、２Ｍ 尿素を含む、５０ｍＭ
リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．８）に対して一晩透析する。
１２．１０％ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５ｍＭ 還元型グルタチオン、０
．５ｍＭ 酸化型グルタチオンを含む、５０ｍＭ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．８）に対
して透析する。
１３．透析したタンパク質調製物を遠心分離によって清澄化し、そして不溶性物質を廃棄
し、そしてＢｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を測定する。
１４．免疫する予定の各タンパク質について、グリセロール含量を４０％にまで調製した
後、０．５ｍｌの各２０〜１００μｇの４〜５個のアリコートを調製する。免疫までにア
リコートを−２０℃で保存する。
（Ｅ．ｃｏｌｉからのＧＳＴ融合タンパク質の精製）
１．細菌を、遠心分離によって５００ｍｌ培養物から収集する。必要な場合、細菌ペレッ
トを−２０℃で保存する。ペレットを−２０℃から室温に移し、そして各ペレットを１０
ｍｌ Ｂ−ＰＥＲＴＭ溶液、１０μｌの１００ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液（最終１ｍＭ）、５
０μｌのＤＮＡｓｅＩ（ＰＢＳ中１００Ｋユニットに等価）および１００μｌのＰＢＳ中
１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ
Ｌ−７６５１）（１０ｍｇに等価、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で再構成する。
２．再懸濁したペレットを５０ｍｌ遠心管に移し、そして３〜４回ボルテックスしながら
、３０〜４０分間室温で放置する。
３．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。
４．遠心分離ペレットを廃棄し、そして以下のように、上清をクロマトグラフィーカラム
にロードする。
５．０．５ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂を含むＰｏｌ
ｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを調製する。カラムを１ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄
し、そして１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化する。
６．カラムに上清をロードし、そしてフロースルーを廃棄する。
７．カラムを１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。
８．カラムに結合したタンパク質を４．５ｍｌの５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、１０ｍＭ
還元型グルタチオン（ｐＨ８．０）で溶出する（１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌで
添加し、各々約１．５ｍｌの各３画分を収集する）。
９．Ｂｒａｄｏｆｏｒｄ法でこれらの画分のタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によってタンパク質を分析する。
１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ間、＋４℃で収集画分を保存する。
１１．免疫する予定の各タンパク質について、０．５ｍｌの４０％グリセロール中の各２
０〜１００μｇの４〜５個のアリコートを調製する。希釈緩衝液は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ
−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．０）である。免疫までにアリコートを−２０℃で保
存する。
（図１６７〜１７０および２３８〜２３９）
図１６７〜１７０、図２３８、および図２３９のレーン２〜６に示される実験について
、ＧＢＳタンパク質を、Ｎ末端でチオレドキシンに融合し、そしてＣ末端でポリＨｉｓテ
ールに融合した。クローニングのために使用したプラスミドは、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧａｔｅｗａｙＴＭ技術）であり、発現は、Ｌ（＋）−アラビ
ノース依存性プロモーターの制御下にある。これらのＧＢＳ抗原の産生のために、細菌を
、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＲＭ培地（６ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３
ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ７．４）
、２％ カザミノ酸、０．２％ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）上で増殖させた。細
胞がＯＤ６００＝０．５に到達するまで３７℃でインキュベートした後、タンパク質発現
を、０．２％（ｖ／ｖ）Ｌ（＋）アラビノースを添加して、３時間誘導する。
（ＧＢＳタンパク質での免疫）
精製したタンパク質を使用して、４匹のＣＤ−１マウスの群に腹腔内免疫した。各２０
μｇの精製タンパク質を、１日目、２１日目および３５日目にフロイントアジュバント中
で注射した。免疫応答を、０日目および４９日目に採取したサンプルを使用することによ
ってモニターした。血清を、マウスの各群由来の血清のプールとして分析した。
（ＦＡＣＳｃａｎ細菌結合アッセイ手順）
ＧＢＳ血清型Ｖ２６０３ Ｖ／Ｒ株を、ＴＳＡ血液寒天プレートにプレートし、３７℃
で一晩インキュベートした。細菌コロニーを、滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使
用してプレートから収集し、そして１００ｍｌのＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈへ
播種した。細菌増殖を、ＯＤ６００を追跡することによって、３０分毎にモニターした。
ＯＤ６００＝０．７〜０．８になるまで、細菌を増殖させた。培養物を、５０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細菌を、ＰＢＳで１回洗浄し、０．０５
％パラホルムアルデヒドを含有する１／２培養物容量のＰＢＳ中に再懸濁し、そして３７
℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃で一晩インキュベートした。
５０μｌの細菌細胞（ＯＤ６００ ０．１）を、ＰＢＳで１回洗浄し、２０μｌのブロ
ッキング血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、そ
して室温で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を、希釈緩衝液（ＰＢＳ中の２０
％ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、０．１％ ＢＳＡ）中の１００μｌの希釈
血清（１：２００）と共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞を５０００ｒｐｍで
遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を、２００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１
％ ＢＳＡ）を添加することによって洗浄した。５０μｌのＲ−フィコエリトリン結合体
化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウス（希釈緩衝液中に１：１００希釈した）を、各サンプルに添
加し、そして４℃で１時間インキュベートした。細胞を、５０００ｒｐｍでの遠心分離に
よってスピンダウンし、そして２００μｌの洗浄緩衝液を添加することによって洗浄した
。上清を吸引し、細胞を２００μｌＰＢＳ中に再懸濁した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎ
チューブに移し、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定についての条件は、以下である
：ＦＬ２オン；ＦＳＣ−Ｈ閾値：５４；ＦＳＣ ＰＭＴ Ｖｏｌｔａｇｅ：Ｅ ０２；Ｓ
ＳＣ ＰＭＴ：５１６；Ａｍｐ．Ｇａｉｎｓ
２．６３；ＦＬ−２ ＰＭＴ：７２８。Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ値：０。
サンプルが、５０チャネル値より高いΔ平均値を有する場合に、そのサンプルを陽性と
みなした。
（全抽出物調製）
ＧＢＳ血清型ＩＩＩＣＯＨ１株および血清型Ｖ２６０３ Ｖ／Ｒ株の細胞を、Ｔｏｄｄ
Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ中で一晩増殖させた。１ｍｌの培養物を、１００ｍｌのＴｏ
ｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈに播種した。細菌増殖を、ＯＤ６００を追跡することに
よって、３０分毎にモニターした。ＯＤが０．７〜０．８になるまで、細菌を増殖させた
。培養物を、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細菌を、Ｐ
ＢＳで１回洗浄し、４００ユニットのムタノリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添
加した２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中に再懸濁し、そして３７℃
で３時間インキュベートした。３サイクルの凍結／融解後、細胞細片を、１４０００ｇで
１５分間の遠心分離によって除去し、上清のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準として使用
して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイによって測定した。
（ウエスタンブロッティング）
ＧＢＳ血清型ＩＩＩＣＯＨ１株および血清型Ｖ２６０３Ｖ／Ｒ株由来の精製タンパク質
（５０ｎｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１２％または１５％のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにロードし、そしてニトロセルロース膜に転写した。転写は、転写緩衝液（２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭ グリシン、２０％ メタノール）中、４℃、１００Ｖで、１
時間行った。膜を、飽和緩衝液（ＰＢＳ中５％ スキムミルク、０．１％ Ｔｗｅｅｎ
２０）中４℃での一晩のインキュベーションによって飽和させた。膜を、飽和緩衝液中に
１：１０００希釈したマウス血清と共に、室温で１時間インキュベートした。膜を、洗浄
緩衝液（ＰＢＳ中３％ スキムミルク、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、１
：５０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と
共に１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で２回洗浄
し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で発色さ
せた。反応を、水を添加することによって停止させた。
他に示されない限り、図中のブロットのレーン１、２および３は、以下である：（１）
精製タンパク質；（２）ＧＢＳ−ＩＩＩ抽出物；および（３）ＧＢＳ−Ｖ抽出物。分子量
マーカーもまた示す。
（新生児敗血症モデルにおけるインビボ受動保護アッセイ）
ＣＤ１免疫マウスから収集した免疫血清を、マウス新生児敗血症モデルにおいて試験し
、ＧＢＳ血清型ＩＩＩでチャレンジしたマウス中のそれらの保護効率を確認した。新生児
Ｂａｌｂ／Ｃ同腹仔を、出生から２４時間以内に２つの群にランダムに分け、そして免疫
したＣＤ１成体マウス由来の２５μｌの希釈血清（１：１５）を皮下注射した。１つの群
に、免疫前血清を与え、他方の群に、免疫血清を与えた。４時間後、全ての仔マウスを、
７５％致死用量のＧＢＳ血清型ＩＩＩ ＣＯＨ１株でチャレンジした。対数中期培養物を
希釈して得られたチャレンジ用量を、２５μｌの生理食塩水中で皮下投与した。ＧＢＳ感
染を生存する仔マウスの数を、４日間、１２時間毎に評価した。結果を、表ＩＩＩに示す
。
（実施例１）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１４０２）を、アミノ酸配列＜配列番号２＞をコードする、Ｓ．
ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号１＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、
以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
配列番号１９８４に対する相同性もまた存在する。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８７８５＞およびタンパク質＜配列番号８７８６＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
配列番号２（ＧＢＳ４）を、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた。総細
胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図９（レーン３；ＭＷ ４３．１ｋＤａ）および図
６３（レーン４；ＭＷ ５０ｋＤａ）に示す。これをまたＨｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏ
ｌｉ中で発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１２（レーン７；ＭＷ
３０ｋＤａ）、図６３（レーン３；ＭＷ ３０ｋＤａ）および図１７８（レーン３；Ｍ
Ｗ ３０ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ４−ＧＳＴを、図１９０（レーン６）および図２０９（レーン８）中に示すよう
に精製した。
精製したＧＢＳ４−Ｈｉｓを、図８９Ａ、図１９１（レーン１０）、図２０９（レーン
７）および図２２８（レーン９およびレーン１０）に示す。
精製したＧＢＳ４−Ｈｉｓ融合産物を、マウスを免疫するために使用した（レーン２産
物；２０μｇ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図８９Ｂ）、ＦＡＣ
Ｓのため、およびインビボでの受動的保護（ｐａｓｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）ア
ッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験は、タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫
学的に接近可能（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）であること、およびそれが有効な
防御免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例２）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１１００）を、アミノ酸配列＜配列番号４＞をコードする、Ｓ．
ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号３＞において同定した。このタンパク質は、凝集促進タ
ンパク質であることが予期される。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて、対応するＤＮＡ配列は、同定されなかった。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８７０９＞およびタンパク質＜配列番号８７１０＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８７１１＞およびタンパク質＜配列番号８７１２＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
配列番号８７１２（ＧＢＳ１６６）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３０（レーン２；ＭＷ １３．１ｋＤ
ａ）に示す。
ＧＢＳ１６６−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図２００、レーン１０）、そしてマウスを免
疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図３１５）のために使用し、これ
は、このタンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
配列番号４（ＧＢＳ１５）を、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた。総
細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図９（レーン５；ＭＷ ４４．８ｋＤａ）、図６
３（レーン５；ＭＷ ４４．８ｋＤａ）および図６６（レーン７；ＭＷ ４５ｋＤａ）に
示す。これをまた、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた。総細胞抽出物の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１０（レーン４；ＭＷ ２２．３ｋＤａ）に示す。これをま
た、図１８５（レーン１；ＭＷ ５０ｋＤａ）に示す、総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を用いて、ＧＢＳ１５Ｌとして発現させた。
精製したＧＢＳ１５−ＧＳＴを、図９１Ａ、図１９０（レーン９）、図２１０（レーン
４）および図２４５（レーン４およびレーン５）に示す。
精製したＧＢＳ１５−ＧＳＴ融合産物を、マウスを免疫するために使用した（レーン１
＋２の産物；２０μｇ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図９１Ｂ）
、ＦＡＣＳ（図９１Ｃ）のため、およびインビボでの受動的保護アッセイ（表ＩＩＩ）に
おいて使用した。これらの試験は、タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能である
こと、およびそれが有効な防御免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例３７）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ００３５）を、アミノ酸配列＜配列番号１１６＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号１１５＞において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて、対応するＤＮＡ配列は、同定されなかった。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８４７７＞およびタンパク質＜配列番号８４７８＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
配列番号８４７８（ＧＢＳ１７６）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３６（レーン５およびレーン６；ＭＷ
３０ｋＤａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４１（レーン７；ＭＷ ５５．４ｋＤａ）
に示す。
ＧＢＳ１７６−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１１７Ａ；図２０２、レーン５もまた参照
のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２の産物；１３．５μｇ
／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１１７Ｂ）、ＦＡＣＳ（図１１
７Ｃ）のため、そしてインビボでの受動的保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。
これらの試験は、タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれ
が有効な防御免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例６５）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ００６５）を、アミノ酸配列＜配列番号２０８＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号２０７＞において同定した。このタンパク質は、Ｄ
−グルタミン酸付加（ａｄｄｉｎｇ）酵素ＭｕｒＤ（ｍｕｒＤ）であることが予測される
。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
アミノ酸配列＜配列番号９６１６＞をコードする、関連するＧＢＳの核酸配列＜配列番
号９６１５＞をまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号２１０＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ＜配列番号２０９＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
配列番号２０８（ＧＢＳ３０５）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させ
た。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５１（レーン１１；ＭＷ ５３．７ｋＤ
ａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。総細胞抽
出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５６（レーン３；ＭＷ ７９ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ３０５−ＧＳＴ融合産物を精製し（図２０７、レーン８）、そしてマウスを免疫
するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２７０）に使用し、これは、この
タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例６７）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ００６７）を、アミノ酸配列＜配列番号２１６＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号２１５＞において同定した。このタンパク質は、細
胞分裂タンパク質ＤｉｖＩＢであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以
下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号２１８＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ＜配列番号２１７＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
配列番号２１６（ＧＢＳ８５）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７（レーン１０；ＭＷ
４５．２ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ８５−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図１０５Ａ；図１９３、レーン５もまた参照の
こと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１の産物；２０μｇ／マウス）
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１０５Ｂ）、ＦＡＣＳ（図１０５Ｃ）のた
め、インビボでの受動的保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験は、
このタンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防御
免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例８１）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ００８１）を、アミノ酸配列＜配列番号２７２＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号２７１＞において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
を示す。
アミノ酸配列＜配列番号９６２４＞をコードする、関連するＧＢＳ核酸配列＜配列番号
９６２３＞をまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて、対応するＤＮＡ配列は、同定されなかった。
配列番号２７２（ＧＢＳ４１３）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させ
た。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７９（レーン２；ＭＷ
３４．２ｋＤａ）に示す。これはまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７１（レーン７；ＭＷ ５９ｋＤａ
）に示す。
ＧＢＳ４１３−ＧＳＴを、図２１８、レーン１２に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例１１６）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０１２１）を、アミノ酸配列＜配列番号３９０＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号３８９＞において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号３９２＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ＜配列番号３９１＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
配列番号３９０（ＧＢＳ６３）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５（レーン５；ＭＷ ３９ｋＤａ）に示す
。これはまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。総細胞抽出物のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析を、図１３（レーン２；ＭＷ ６４ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ６３−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１０１Ａ；図１９１、レーン３もまた参照の
こと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１の産物；２０μｇ／マウス）
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１０１Ｂ）、ＦＡＣＳ（図１０１Ｃ）のた
め、そしてインビボでの受動的保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試
験は、タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防
御免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例１１８）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０１２３）を、アミノ酸配列＜配列番号３９８＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号３９７＞において同定した。このタンパク質は、Ｃ
ｏｍＹＤまたはＣｏｍＧＤであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下
：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号４００＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ＜配列番号３９９＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８４９５＞およびタンパク質＜配列番号８４９６＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
配列番号３９８（ＧＢＳ６）を、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた。
総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１（レーン２；ＭＷ ４０ｋＤａ）に示す。
これはまた、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析を、図２（レーン２；ＭＷ １５ｋＤａ）に示す。ＧＢＳ６−ＧＳＴ融合
産物を精製し（図１８９、レーン２）、そしてマウスを免疫するために使用した。得られ
た抗血清を、ＦＡＣＳ（図２６０）のために使用し、これは、このタンパク質がＧＢＳ細
菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例２５８）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０２７３）を、アミノ酸配列＜配列番号８２０＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号８１９＞において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
アミノ酸配列＜配列番号９５８２＞をコードする、関連するＧＢＳ核酸配列＜配列番号
９５８１＞をまた同定した。
配列番号８２２に対する相同性もまた存在する。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８５２５＞およびタンパク質＜配列番号８５２６＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
を示す。
配列番号８５２６（ＧＢＳ１４７）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２９（レーン４；ＭＷ １３２ｋＤａ
）に示す。
ＧＢＳ１４７−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図２００、レーン５）、そしてマウスを免疫
するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２８６）のために使用し、これは
、このタンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例２７８）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０３０４）を、アミノ酸配列＜配列番号８９２＞をコードする、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号８９１＞において同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の配列と有意な相同性を有さない。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号８９４＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ＜配列番号８９３＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
に示す。
配列番号８９２（ＧＢＳ３１９）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現させ
た。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４０（レーン４；ＭＷ
３７ｋＤａ）に示す。これはまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４６（レーン７；ＭＷ ６２ｋＤａ）に示
す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例３２５）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０３５５）を、アミノ酸配列＜配列番号１０５４＞をコードする
、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号１０５３＞において同定した。このタンパク質は
、エンドリシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）であると予想される。このタンパク質配列の分析
は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号１０５６＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ＜配列番号１０５５＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下
：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
関連するＧＢＳの遺伝子＜配列番号８５５１＞およびタンパク質＜配列番号８５５２＞
をまた同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、データベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
と相同性を有する。
配列番号８５５２（ＧＢＳ２０６）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５１（レーン６；ＭＷ ３１．７ｋＤ
ａ）に示す。
ＧＢＳ２０６−Ｈｉｓを、図２０６、レーン６において示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例３４０）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０３７１）を、アミノ酸配列＜配列番号１１０２＞をコードする
、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号１１０１＞において同定した。このタンパク質は
、この遺伝子に由来するｃＤＮＡ ＥＳＴ ｙｋ５４２ｃ１２．５であることが予測され
る。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列：
Figure 2011239783
と相同性を有する。
関連するＤＮＡ配列を、アミノ酸配列＜配列番号１１０４＞をコードする、Ｓ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ＜配列番号１１０３＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下
：
Figure 2011239783
を示す。
関連する配列をまた、アミノ酸配列＜配列番号９１１８＞をコードする、ＧＡＳ＜配列
番号９１１７＞において同定した。このタンパク質配列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下：
Figure 2011239783
に示す。
配列番号１１０２（ＧＢＳ１６４）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３０（レーン４；ＭＷ １７．４ｋＤ
ａ）に示す。
ＧＢＳ１６４−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図１１５Ａ；図２００、レーン４もまた参照
のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２＋３の産物；２０μｇ
／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ（図１１５Ｂ）のため、
そしてインビボでの受動的保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験は
、タンパク質がＧＢＳ細菌に免疫学的に接近可能であること、およびそれが有効な防御免
疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例３９５）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０４２９）を、アミノ酸配列＜配列番号１２８６＞をコードする
、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ＜配列番号１２８５＞において同定した。このタンパク質配
列の分析は、以下：
Figure 2011239783
を示す。
アミノ酸配列＜配列番号８５７０＞をコードする、関連するＧＢＳ核酸配列＜配列番号
８５６９＞をまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の配列と有意な相同性を有さない。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて、対応するＤＮＡ配列は、同定されなかった。
配列番号８５７０（ＧＢＳ２７１）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５１（レーン８；ＭＷ ３１．３ｋＤ
ａ）に示す。これはまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。総細胞抽
出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５５（レーン６；ＭＷ ５６．３ｋＤａ）および図６
２（レーン１０；ＭＷ ５６．３ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ２７１−ＧＳＴを、図２１０、レーン８に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまた
は診断のための有用な抗原であり得ることが予期された。
（実施例４３０）
アミノ酸配列（配列番号１３８４）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０４６６）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号１３８３）。このタンパク質配列
の分析は、以下を示す：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号９６６４）をコードする関連のＧＢＳ核酸配列（配列番号９６
６３）もまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおけるいずれの配列とも有意な相同
性を有さない。
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
関連のＧＢＳ遺伝子（配列番号８５７３）およびタンパク質（配列番号８５７４）もま
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
配列番号８５７４（ＧＢＳ３６６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧＳＴ融合タンパク質
として発現させた。この精製した融合タンパク質（図２１５、レーン５）を使用して、マ
ウスを免疫した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２８１）のために使用し、これにより
このタンパク質がＧＢＳ細菌に対して免疫アクセス可能であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に有用な抗原であり得ることが予測される。
（実施例４５１）
アミノ酸配列（配列番号１４５２）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０４８８）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号１４５１）。このタンパク質は、
構造的タンパク質であることが予想される。このタンパク質配列の分析は、以下を示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号１４５４）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号１４５３）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
配列番号１４５２（ＧＢＳ３６４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｈｉｓ融合産物として
発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７３に示す（レーン６；ＭＷ
５０ｋＤａ）。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧＳＴ融合産物として発現させた。
総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図８１に示す（レーン１１；ＭＷ ７５ｋＤａ
）。
ＧＢＳ３６４−ＧＳＴを、図２１６、レーン１０に示されるように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測される。
（実施例６７９）
アミノ酸配列（配列番号２０９２）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０７２１）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２０９１）。このタンパク質は、
ＳａｔＤであることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号９８１２）をコードする関連のＧＢＳ核酸配列（配列番号９８
１１）もまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号２０９４）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号２０９３）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
関連のＧＢＳ遺伝子（配列番号８６３７）およびタンパク質（配列番号８６３８）もま
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
配列番号８６３８（ＧＢＳ３３８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合タンパク質と
して発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６２に示す（レーン５；Ｍ
Ｗ ３０ｋＤａ）。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６８に示す（レーン１１；ＭＷ ５５ｋＤ
ａ）。
ＧＢＳ３３８−ＧＳＴを、図２１５のレーン３に示されるようにして、精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例７３１）
アミノ酸配列（配列番号２２４４）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０７７５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２２３４）。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
関連のＧＢＳ遺伝子（配列番号８６５３）およびタンパク質（配列番号８６５４）をま
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
配列番号２２４４（ＧＢＳ６２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５に示す（レーン７；ＭＷ ８０．
５ｋＤａ）。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現させた。総細
胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１３に示す（レーン４；ＭＷ １０５ｋＤａ）。
ＧＢＳ６２−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１００Ａ；図１９３のレーン７もまた参照の
こと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１の産物；２０μｇ／マウス）
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１００Ｂ）のため、ＦＡＣＳ（図１００Ｃ
）のため、およびインビボ受動的保護アッセイ（図ＩＩＩ）において使用した。これらの
試験により、このタンパク質がＧＢＳ細菌に対して免疫アクセス可能であること、および
これらのタンパク質が有効な保護的免疫原であることが確認される。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例８３２）
アミノ酸配列（配列番号２５１４）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０８８４）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２５１３）。このタンパク質は、
Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼであることが予測される。このタンパ
ク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
関連のＧＢＳ遺伝子（配列番号８６６９）およびタンパク質（配列番号８６７０）をま
た、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
ＲＧＤ ｍｏｔｉｆ ８１−８３
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号８６７０（ＧＢＳ３０２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｈｉｓ融合産物として
発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５０に示す（レーン６４；ＭＷ
５５ｋＤａ）。
ＧＢＳ３０２−Ｈｉｓ融合産物を、精製し（図２０５、レーン６）、そしてマウスを免
疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳのために使用し（図３０２）、これ
によりこのタンパク質がＧＢＳ細菌に対して免疫アクセス可能であることが確認された。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例８３８）
アミノ酸配列（配列番号２５３２）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ０８９０）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２５３１）。このタンパク質は、
ＡＴＰ結合カセットトランスポーター様タンパク質であることが予測される。このタンパ
ク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号９９６６）をコードする関連のＧＢＳ核酸配列（配列番号９９
６５）もまた、同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号２５３４）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号２５３３）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質ＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例９５７）
アミノ酸配列（配列番号２９１８）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１０１５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２９１７）。このタンパク質は、
不特定のタンパク質産物であることが予測される。このタンパク質配列の分析は、以下の
ことを示す：
Figure 2011239783
配列番号２９２０に対する相同性もまた存在する。
関連のＧＢＳ遺伝子（配列番号８６９３）およびタンパク質（配列番号８６９４）もま
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
Figure 2011239783
配列番号８６９４（ＧＢＳ８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２（レーン５；ＭＷ
３１ｋＤａ）、図６３（レーン２；ＭＷ ３１．１ｋＤａ）、図６６（レーン２および
３；ＭＷ ３１ｋＤａ）、図１７８（レーン２；ＭＷ ３１ｋＤａ）、図１７９（レーン
３および４；ＭＷ ３１ｋＤａ）および図１８０（レーン３；ＭＷ ３１ｋＤａ）に示す
。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧＳＴ融合産物として発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを、図６６（レーン４および５；ＭＷ ５６ｋＤａ）および図１８０（レーン４および
５；ＭＷ ５５ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ８−Ｈｉｓを、図１８９（レーン７）、図２１１（レーン３）、図２２８（レー
ン４〜５）および図２３０（レーン３〜６）に示されるように精製した。精製したＧＢＳ
８−ＧＳＴを、図２０９のレーン６に示す。
ＧＢＳ８−Ｈｉｓ融合産物を、精製し（図９０Ａ）、そしてマウスを免疫するために使
用した（レーン２の産物；１２．９μｇ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロ
ット（図９０Ｂ）のため、ＦＡＣＳ（図９０Ｃ）のため、およびインビボ受動的保護アッ
セイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験により、このタンパク質がＧＢＳ細菌
に対して免疫アクセス可能であること、およびこのタンパク質が有効な保護的免疫原であ
ることが確認される。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例９７３）
アミノ酸配列（配列番号２９７８）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１０３２）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号２９７７）。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号２９８０）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号２９７９）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
配列番号２９７８（ＧＢＳ８６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７に示す（レーン６；ＭＷ ５９ｋ
Ｄａ）。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧＳＴ融合産物として発現させた。総細胞
抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１３に示す（レーン５；ＭＷ ８４ｋＤａ）。ＧＢ
Ｓ８６−ＧＳＴを、図１９２のレーン３に示されるように精製した。
この結果に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例１０３１）
アミノ酸配列（配列番号３１８４）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１１０３）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号３１８３）。このタンパク質は、
Ｌ−セリンデヒドラーゼ１（ｓｄａＡ−２）であることが予測される。このタンパク質配
列の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号３１８６）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号３１８５）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
配列番号３１８４（ＧＢＳ３５８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７６に示す（レーン６；ＭＷ
３５ｋＤａ）。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープがワクチンまたは診断
薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例１０８５）
アミノ酸配列（配列番号３３４８）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１１６０）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号３３４７）。このタンパク質は、
能力損傷誘導性タンパク質（ｃｉｎＡ）（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ−ｄａｍａｇｅ ｉｎｄ
ｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）であることが予測される。このタンパク質配列の分析は
、以下のことを示す：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号１０２６２）をコードする関連のＧＢＳ核酸配列（配列番号１
０２６１）もまた、同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号３３５０）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号３３４９）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列に対して相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
配列番号３３４８（ＧＢＳ６４６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１３１（レーン２〜４；ＭＷ ６
１．６ｋＤａ）、図１３４（レーン３；ＭＷ ５７．５ｋＤａ）＋レーン２および４；Ｍ
Ｗ ２７ｋＤａ）に示す。これをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１３１（レーン５〜７；ＭＷ ３６
．６ＫＤａ）および図１７８（レーン５；ＭＷ ３７ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ６４６−Ｈｉｓを、図２２９のレーン５に示されるように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対する有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例１１１３）
アミノ酸配列（配列番号３４４２）をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１１８８）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した（配列番号３４４１）。このタンパク質配列
の分析は、以下のことを示す：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列に対して相同性を
有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列（配列番号２７６４）をコードする関連のＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓにおいて同定した（配列番号２７６３）。このタンパク質配列の分析は、以下のこ
とを示す：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す：
Figure 2011239783
配列番号３４４２（ＧＢＳ５４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１６に示す（レーン８；ＭＷ ４８
．４ｋＤａ）。
ＧＢＳ５４−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図９８Ａ；図１９４のレーン６もまた参照のこ
と）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２の産物；２０マイクロｇ／
マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロットのため（図９８Ｂ）、ＦＡＣＳのため
（図９８Ｃ）、およびインビボ受動的保護アッセイにおいて（表ＩＩＩ）使用した。これ
らの試験により、このタンパク質がＧＢＳに対して免疫アクセス可能であること、および
これらのタンパク質が有効な保護的免疫原であることが確認される。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診
断薬に対して有用な抗原であり得ることが予測された。
（実施例１１３７）
アミノ酸配列＜配列番号３５３２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１２１３）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３５３１＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
関連ＧＢＳ遺伝子＜配列番号８７３５＞およびタンパク質＜配列番号８７３６＞もまた
同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号３５３２（ＧＢＳ１）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１に示す（レーン３；ＭＷ ７８ｋＤ
ａ）。配列番号３５３２（ＧＢＳ１）を、Ｈｉｓ融合産物としても、Ｅ．ｃｏｌｉにおい
て発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２に示す（レーン３；ＭＷ ５
３ｋＤａ）。
このＨｉｓ融合タンパク質を、図１８９、レーン５に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンおよ
び診断薬のために有用な抗原であり得ると推定された。
（実施例１１４３）
アミノ酸配列＜配列番号３５５０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１２１９）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３５４９＞。このタンパク質は、
輸送タンパク質であると推定される。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかに
なる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号１０１１４＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号１０
１１３＞もまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号７１６＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓにおいて同定した＜配列番号７１５＞。このタンパク質配列の分析により、以下が明ら
かになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号３５５０（ＧＢＳ２５７）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４４（レーン３；ＭＷ ３５ｋＤ
ａ）、図１６９（レーン９および１０；ＭＷ ５０ｋＤａ）および図２３９（レーン２；
ＭＷ ５０ｋＤａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて
発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４８に示す（レーン６；ＭＷ
６０ｋＤａ）。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１１８６）
アミノ酸配列＜配列番号３６９２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１２６２）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３６９１＞。このタンパク質は、
フェリクロームＡＢＣトランスポーターであると推定される。このタンパク質配列の分析
により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号３６９４＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓにおいて同定した＜配列番号３６９３＞。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１１９９）
アミノ酸配列＜配列番号３７３６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１２７５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３７３５＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおけるいずれの配列とも有意な相同
性を有さない。
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号３７３６（ＧＢＳ１５０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２３（レーン７；ＭＷ ２９．７
ｋＤａ）および図１７５（レーン４および５；ＭＷ ３０ｋＤａ）に示す。
精製ＧＢＳ１５０−Ｈｉｓを、図１１０Ａ、図１９９（レーン５）および図２２７（レ
ーン６〜７）に示す。
精製ＧＢＳ１５０−Ｈｉｓ融合産物を用いて、マウスを免疫した（レーン１および２の
産物；２０μｇ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１１０Ｂ）、Ｆ
ＡＣＳ（図１１０Ｃ）、およびインビボ受動防御アッセイ（表ＩＩＩ）のために用いた。
これらの試験により、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌に対して免疫的に利用しやすく、有
用な防御免疫原であることが確認される。
この分析に基づいて、このタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断薬
に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２０３）
アミノ酸配列＜配列番号３７４６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１２７９）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３７４５＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号３７４６（ＧＢＳ６７）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７（レーン１０；ＭＷ １４０ｋＤ
ａ）、図１１（レーン１０；ＭＷ １５０ｋＤａ）および図１２（レーン６；ＭＷ ９５
．３ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ６７−Ｈｉｓを、図１９２、レーン１０に示されるように精製した。
この分析に基づいて、このタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断薬
に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２２９）
アミノ酸配列＜配列番号３８１６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１３０５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３８１５＞。
このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
配列番号３８１６（ＧＢＳ３６３）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７４（レーン５；ＭＷ ２８ｋＤ
ａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。総
細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図８１（レーン１０；ＭＷ ５３ｋＤａ）に示す
。
ＧＢＳ３６３−ＧＳＴを、図２１６、レーン９に示すように精製した。
この分析に基づいて、このタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断薬
に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２４５）
アミノ酸配列＜配列番号３８５０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１３２２）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３８４９＞。このタンパク質は、
ＣｙｌＩ（ｆａｂＦ）であると推定される。このタンパク質配列の分析により、以下が明
らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９６８８＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号９６８
７＞もまた同定した。
配列番号３８５２に対する相同性もまた存在する。
関連ＧＢＳ遺伝子＜配列番号８７６９＞およびタンパク質＜配列番号８７７０＞もまた
、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
配列番号８７７０（ＧＢＳ３６１）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図７３（レーン４；ＭＷ ８４ｋＤａ
）に示す。
ＧＢＳ３６１−Ｈｉｓを、図２１３、レーン５に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２７４）
アミノ酸配列＜配列番号３９２２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１３５１）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３９２１＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号８７８０＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号８７７
９＞もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号８７８０（ＧＢＳ８０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発現
させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１６（レーン６；ＭＷ ５６．８ｋ
Ｄａ）に示す。
ＧＢＳ８０−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図１０４Ａ；図１９４、レーン５もまた参照の
こと）、これを用いてマウスを免疫した（レーン１および２の産物；２０μｇ／マウス）
。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１０４Ｂ）、ＦＡＣＳ（図１０４Ｃ）、お
よびインビボ受動防御アッセイ（表ＩＩＩ）において用いた。これらの試験により、この
タンパク質が、ＧＢＳに対して免疫的に利用しやすく、有効な防御免疫原であることが確
認される。
この分析に基づいて、このタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断薬
に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２８５）
アミノ酸配列＜配列番号３９５２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１３６２）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３９５１＞。このタンパク質は、
シキミ酸キナーゼ（ａｒｏＫ）であることが推定される。このタンパク質配列の分析によ
り、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号３９５４＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓにおいて同定した＜配列番号３９５３＞。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号３９５２（ＧＢＳ１５２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２５（レーン２；ＭＷ ２０ｋＤ
ａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。総
細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３７（レーン２；ＭＷ ４５．５ｋＤａ）に示
す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１２９３）
アミノ酸配列＜配列番号３９７６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１３７１）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号３９７５＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
配列番号３９７６（ＧＢＳ４２６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図８０（レーン４；ＭＷ ５８．８
ｋＤａ）に示す。これをまた、ＧＳＴ融合産物として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた
。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７３（レーン３；ＭＷ ８４ｋＤａ）に
示す。
ＧＢＳ４２６−ＧＳＴを、図２２０、レーン５に示すように、精製した。
この分析に基づいて、このタンパク質およびそのエピトープがワクチンまたは診断薬に
有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１３２１）
アミノ酸配列＜配列番号４０４６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１４０３）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号４０４５＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号８７８８＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号８７８
７＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
配列番号４０４８に対する相同性もまた存在する。
配列番号８７８８（ＧＢＳ１７３）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４１（レーン５；ＭＷ ９６．８
ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ１７３−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１１６Ａ；図２０１，レーン７もまた参照
のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２の産物；１５μｇ／マ
ウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロットのため、ＦＡＣＳのため、およびインビ
ボ受動保護アッセイにおいて使用した（表ＩＩＩ）。これらの試験により、このタンパク
質がＧＢＳ細菌に対して免疫的に利用しやすく、有効な防御免疫原であることが確認され
る。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１３３１）
アミノ酸配列＜配列番号４０８２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１４１５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号４０８１＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９７９８＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号９７９
７＞を同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４０８４＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓにおいて同定した＜配列番号４０８３＞。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
関連ＧＢＳ遺伝子＜配列番号８７８９＞および関連ＧＢＳタンパク質＜配列番号８７９
０＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号８７９０（ＧＢＳ７）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現さ
せた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１に示す（レーン４；ＭＷ ４６ｋＤａ
）。この配列番号８７９０（ＧＢＳ７）をまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物と
して発現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２に示す（レーン４；ＭＷ
２１ｋＤａ）。ＧＢＳ７−Ｈｉｓ融合産物を精製し（図１８９、レーン６）、これを用
いてマウスを免疫した。得られた抗血清をＦＡＣＳに使用し（図２６２）、これにより、
このタンパク質がＧＢＳ細菌に対して免疫的に利用しやすいことが確認された。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１３３２）
アミノ酸配列＜配列番号４０８６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１４１６）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号４０８５＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９７９６＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号９７９
５＞もまた同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４０８８＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓにおいて同定した＜配列番号４０８７＞。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
関連ＧＢＳ遺伝子＜配列番号８７９１＞および関連ＧＢＳタンパク質＜配列番号８７９
２＞もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号８７９２（ＧＢＳ３３０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７３に示す（レーン５；ＭＷ ５
９ｋＤａ）。
ＧＢＳ３３０−Ｈｉｓを、図２１３，レーン６に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１４００）
アミノ酸配列＜配列番号４２９８＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１４８５）を、
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した＜配列番号４２９７＞。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号８８００＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号８７９
９＞もまた同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４３００＞をコードする関連ＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓにおいて同定した＜配列番号４２９９＞。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースにおける以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質とＧＢＳタンパク質との整列を以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号８８００（ＧＢＳ４０４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発
現させた。総細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７１に示す（レーン３；ＭＷ
６２ｋＤａ）。
ＧＢＳ４０４−ＧＳＴを、図２１８、レーン７において示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬に有用な抗原であり得ることが推定された。
（実施例１４４２）
アミノ酸配列＜配列番号４４２４＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１５２８）＜配
列番号４４２３＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号８８１４＞をコードする関連のＧＢＳ核酸配列＜配列番号８８
１３＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおける以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号８８１４（ＧＢＳ１１９）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＨｉｓ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２９（レーン２；ＭＷ８４．３ｋＤａ
）に示す。このＧＢＳ１１９をまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現させた
。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３５（レーン５；２バンド）に示す。
このＧＢＳ１１９−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１０９Ａ；図２０１のレーン６もまた
参照のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２＋３の産物；２０
μｍ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ（図１０９Ｂ）、お
よびインビボでの受動保護アッセイ（ｐａｓｓｉｖｅ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験に
より、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌上で免疫受容性（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌ
ｅ）であり、そして効果的な保護免疫原であることを確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１４４８）
アミノ酸配列＜配列番号４４４４＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１５３４）＜配
列番号４４４３＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４４４６＞をコードする関連するＤＮＡ配列＜配列番号４４４
５＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明
らかにする：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号４４４４（ＧＢＳ２８２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５２（レーン９；ＭＷ１９．８ｋ
Ｄａ）に示す。このＧＢＳ２８２をまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６０（レーン６；ＭＷ４４．８ｋＤａ
）および図６３（レーン７；ＭＷ４７ｋＤａ）に示す。
このＧＢＳ２８２−ＧＳＴ融合産物を精製し（図２１１、レーン４；図２２５、レーン
６も参照のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した。この得られた抗血清を、Ｆ
ＡＣＳ（図２６９）のために使用し、タンパク質がＧＢＳ細菌上で免疫受容性であること
を確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１４８０）
アミノ酸配列＜配列番号４５５０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１５６６）＜配
列番号４５４９＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、表
面に位置する膜タンパク質１（ｌｍｐ１）であると予測される。このタンパク質配列の分
析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４５５２＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号４５５１
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号４５５０（ＧＢＳ２０１）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＨｉｓ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４９（レーン５；ＭＷ４９ｋＤａ）に
示す。このＧＢＳ２０１をまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現させた。全
細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５４（レーン３；ＭＷ７４．５ｋＤａ）および
図６２（レーン８および９；ＭＷ７４．５ｋＤａ）に示す。このＧＢＳ２０１−ＧＳＴ融
合産物を精製し（図２０９、レーン９）、そしてマウスを免疫するために使用した。得ら
れた抗血清を、ＦＡＣＳのために使用し（図３０４）、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌上
で免疫受容性（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）である。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１５３４）
アミノ酸配列＜配列番号４７２２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１６２５）＜配
列番号４７２１＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースにおいて以下の配列と相同性を有する
。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４７２４＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号４７２３
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号４７２２（ＧＢＳ２３３）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５８（レーン３；ＭＷ３５．６ｋＤａ
）に示す。
このＧＢＳ２３３−ＧＳＴ融合産物を精製し（図２０７；レーン１０）、そしてマウス
を免疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２８０）のために使用し、
このタンパク質が、ＧＢＳ細菌上で免疫受容性（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）で
あることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１５５８）
アミノ酸配列＜配列番号４８１２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１６５０）＜配
列番号４８１１＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、ｕ
ｄｐ−ｎ−アセチルムラメート−アラニンリガーゼ（ｍｕｒＣ／ｄｄｌＡ）であると予測
される。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４８１４＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号４８１３
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースの以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号４８１２（ＧＢＳ１５７）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＨｉｓ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２４（レーン１１；ＭＷ４９ｋＤａ）
に示す。このＧＢＳ１５７をまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現させた。
全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３１（レーン８；ＭＷ７４ｋＤａ）、図３３
（レーン８；ＭＷ７４ｋＤａ）および図３７（レーン３；ＭＷ７４ｋＤａ）に示す。
このＧＢＳ１５７−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１１２Ａ；図２００のレーン３もまた
参照のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２の産物；１９．５
μｍ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１１２Ｂ）、ＦＡＣＳ、お
よびインビボでの受動保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験により
、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌上で免疫受容性であり、そして効果的な保護免疫原であ
ることを確認する。
配列番号４８１２（ＧＢＳ１５７）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現し
た。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１８３に示す（レーン１１−１３；ＭＷ
７４ｋＤａ）。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１５９０）
アミノ酸配列＜配列番号４９１６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１６８４）＜配
列番号４９１５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、糖
タンパク質エンドペプチダーゼであると予測される。このタンパク質配列の分析は、以下
を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号４９１８＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号４９１７
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９１６０＞をコードする関連の配列＜配列番号９１５９＞をま
た、ＧＡＳにおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号４９１６（ＧＢＳ６９）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＨｉｓ融合産物として発現させ
た。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７（レーン９；ＭＷ２８．９ｋＤａ）
に示す。このＧＢＳ６９をまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現させた。全
細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２０（レーン４；ＭＷ５３．９ｋＤａ）に示す
。
このＧＢＳ６９−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１９７、レーン６）、そしてマウスを免
疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２８５）のために使用し、この
タンパク質が、ＧＢＳ細菌上で免疫受容性であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１６０３）
アミノ酸配列＜配列番号４９５６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１６９８）＜配
列番号４９５５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質の分析
は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
これらはまた、配列番号１７１２と相同性である。
配列番号４９５６（ＧＢＳ３７２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合タンパク質と
して発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６９（レーン８；ＭＷ５５
ｋＤａ）において示す。
ＧＢＳ３７２−ＧＳＴを、図２１５、レーン８において示したように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１６６０）
アミノ酸配列＜配列番号５１４６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１７５５）＜配
列番号５１４５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、Ｄ
ｉｖＩＣホモログであると予測された。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにす
る：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号５１４８＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号５１４７
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質の分析は、以下を明らかに
する：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースの以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号５１４６（ＧＢＳ４１８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合タンパク質と
して発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１７２（レーン３；ＭＷ４
２ｋＤａ）において示す。
ＧＢＳ４１８−ＧＳＴを、図２１９、レーン４〜５において示したように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１７２９）
アミノ酸配列＜配列番号５３７４＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１８３４）＜配
列番号５３７３＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質の分析
は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースのいずれの配列とも有意な相同性を有
さない。
アミノ酸配列＜配列番号５３７６＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号５３７５
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明ら
かにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースのいずれの配列とも有意な相同性を有
さない。
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号５３７４（ＧＢＳ２８８）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合産物として発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５９（レーン３；ＭＷ５３．７ｋＤａ
）に示す。
このＧＢＳ２８８ｄを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＨｉｓ融合産物として発現させた。全細胞抽
出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１５４（レーン８〜１０；ＭＷ２６ｋＤａ）および図
１８３（レーン３；ＭＷ２６ｋＤａ）に示す。このＧＢＳ２８８ｄをまた、Ｅ．ｃｏｌｉ
中でＧＳＴ融合産物として発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１８
７（レーン１１；ＭＷ５１ｋＤａ）に示す。精製したＧＢＳ２８８ｄ−ＧＴＳを、図２３
７のレーン８に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１７４１）
アミノ酸配列＜配列番号５４０６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１８４８）＜配
列番号５４０５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、
６ｋＤａタンパク質であると予測される。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかに
する：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号５４０８＞をコードする関連のＤＮＡ配列＜配列番号５４０７
＞を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明
らかにする：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
関連のＧＢＳ遺伝子＜配列番号８８９１＞およびタンパク質＜配列番号８８９２＞もま
た同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、データベースの以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号５４０６（ＧＢＳ１４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現
させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図９（レーン４；ＭＷ３３．３ｋＤａ
）に示す。このＧＢＳ１４−ＧＳＴ融合産物を精製し（図１９０、レーン８）、そしてマ
ウスを免疫するために使用した。この得られた抗血清を、ＦＡＣＳ（図２６３）のために
使用し、タンパク質がＧＢＳ細菌上で免疫受容性であることを確認した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１７６５）
アミノ酸配列＜配列番号５４８６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１８７２）＜配
列番号５４８５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質配列の
分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号５４８６（ＧＢＳ１９７）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１６８（レーン１７および１８；
ＭＷ８９ｋＤａ）および図１６９（レーン２；ＭＷ８９ｋＤａ）に示す。ＧＢＳ１９７を
また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析を、図３７（レーン６；ＭＷ９９ｋＤａ）に示す。
精製したチオ−ＧＢＳ１９７−Ｈｉｓを、図２４４、レーン６に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１７７０）
アミノ酸配列＜配列番号５５０４＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１８７７）＜配
列番号５５０３＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｃｔｉａｅおいて同定した。このタンパク質は、
カルボキシメチレンブテノリダーゼ関連タンパク質であると予測される。このタンパク質
配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴにおける以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
対応するＤＮＡ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定されなかった。
配列番号５５０４（ＧＢＳ１５８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合産物として発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２６（レーン４および１８；ＭＷ
２７ｋＤａ）に示す。このＧＢＳ１５８をまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＴＳ融合タンパ
ク質として発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３７（レーン５；Ｍ
Ｗ５２ｋＤａ）に示す。
このＧＢＳ１５８−ＧＴＳ融合産物を精製し（図１１３；図２０１のレーン４も参照の
こと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２の産物；１４．５μｍ／
マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ（図１０９Ｂ）、およびイ
ンビボでの受動保護アッセイ（表ＩＩＩ）において使用した。これらの試験により、この
タンパク質が、ＧＢＳ細菌上で免疫受容性であり、そして効果的な保護免疫原であること
を確認する。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１８８１）
ＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ１９８９）を、メチラーゼ遺伝子ホモログである、アミノ酸配列
＜配列番号５８５６＞をコードするＳ．ａｇａｌａｃｃｔｉａｅ＜配列番号５８５５＞お
いて同定した。このタンパク質配列の分析は、以下を明らかにする：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９９３０＞をコードする、関連するＧＢＳ核酸配列＜配列番号
９９２９＞を同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベースの以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
Figure 2011239783
配列番号５８５６（ＧＢＳ３２７Ｎ）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として
発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１４８（レーン８〜１０；ＭＷ
１４０ｋＤａ）に示す。このＧＢＳ３２７Ｎをまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓ融合タ
ンパク質として発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１４８（レーン
１１〜１３；ＭＷ１１５ｋＤａ）および図１８２（レーン８；ＭＷ１１５ｋＤａ）に示す
。
精製したＧＢＳ３２７Ｎ−ＧＳＴを、図２４３のレーン５に示し；精製したＧＢＳ３２
７Ｎ−Ｈｉｓを、図２３５のレーン５に示す。
ＧＢＳ３２７Ｃを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合産物として発現させた。全細胞抽
出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１４８（レーン１４；ＭＷ７３ｋＤａ）に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそれらのエピトープが、ワクチンまた
は診断薬のための有用な抗原であり得ることを予測した。
（実施例１９４０）
アミノ酸配列＜配列番号６０１６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２０４９）＜配
列番号６０１５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質は、
５’−ヌクレオチダーゼファミリータンパク質であると予測される。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号１６０８＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号１６０７＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号６０１６（ＧＢＳ３２８）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６９（レーン４；分子量７３ｋＤ
ａ）に示す。そのＧＢＳ３２８−Ｈｉｓ融合産物を、精製し（図２１３、レーン９）、そ
してマウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳのために使用した（
図２６８）。これにより、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌に対して免疫的に接近可能であ
ることが確認された。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２０１１）
アミノ酸配列＜配列番号６２２０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２１２２）＜配
列番号６２１９＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質は、
溶血素（ｐａｔＢ）であると予測される。このタンパク質配列の分析により、以下が明ら
かになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
配列番号１００６との相同性もまた、存在する。
配列番号６２２０（ＧＢＳ３９２）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７５（レーン４；分子量４６．４
ｋＤａ）に示す。配列番号６２２０（ＧＢＳ３９２）を、ＧＳＴ融合産物としても、Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図８３（レーン
５；分子量７１ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ３９２−ＧＳＴを、図２１７、レーン４に示されるように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２０２４）
アミノ酸配列＜配列番号６２６６＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２１３５）＜配
列番号６２６５＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質は、
Ｍ様タンパク質であると予測される。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかに
なる：
Figure 2011239783
配列番号８２２との相同性もまた、存在する。
関連するＧＢＳ遺伝子＜配列番号８９５７＞およびＧＢＳタンパク質＜配列番号８９５
８＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号６２６６（ＧＢＳ３）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現さ
せた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３（レーン５；分子量６５ｋＤａ）に
示す。このＧＢＳ３−Ｈｉｓ融合タンパク質を精製し（図１８９、レーン８）、そしてマ
ウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、ＦＡＣＳのために使用した（図２６
１）。これにより、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌に対して免疫的に接近可能であること
が確認された。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２０４６）
アミノ酸配列＜配列番号６３２０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２１５７）＜配
列番号６３１９＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質は、
アデニレートキナーゼ（ａｄｋ）であると予測される。このタンパク質配列の分析により
、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６３２２＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６３２１＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
関連するＧＢＳ遺伝子＜配列番号８９６７＞およびＧＢＳタンパク質＜配列番号８９６
８＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
配列番号８９６８（ＧＢＳ１１４）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図２９（レーン９；分子量２６．９
ｋＤａ）に示す。
そのＧＢＳ１１４−Ｈｉｓ融合産物を、精製し（図１０８Ａ；図２００、レーン８もま
た参照のこと）、そしてマウスを免疫するために使用した（レーン１＋２＋３産物；２０
μｇ／マウス）。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図１０８Ｂ）、ＦＡＣＳ（図
１０８Ｃ）、およびインビボでの受動防御アッセイ（表ＩＩＩ）のために使用した。これ
らの試験により、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌に対して免疫的に接近可能であること、
およびこのタンパク質が、有効な防御免疫原であることが、確認された。
（実施例２１４６）
アミノ酸配列＜配列番号６６３２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２２６２）＜配
列番号６６３１＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９３３８＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号９３３
７＞もまた、同定した。アミノ酸配列＜配列番号１０７８２＞をコードするさらなる関連
ＧＢＳ核酸配列＜配列番号１０７８１＞もまた、同定した。アミノ酸配列＜配列番号１０
９５２＞をコードするさらなる関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号１０９５１＞もまた、同定
した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６６３４＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６６３３＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号１０７８２（ＧＢＳ６５７）を、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて
発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１４３（レーン８〜１０；分子
量６２．８ｋＤａ）および図１８７（レーン３；分子量６３ｋＤａ）に示す。精製ＧＢＳ
６５７−ＧＳＴを、図２４５、レーン２およびレーン３に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２１６０）
アミノ酸配列＜配列番号６６７８＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２２７７）＜配
列番号６６７７＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６６８０＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６６７９＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号６６７８（ＧＢＳ４０９）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図７６（レーン７；分子量４５．４
ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ４０９−Ｈｉｓを、図２１４、レーン６に示す。
ＧＢＳ４０９ｄを、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。全細胞抽
出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１６６（レーン３および４；分子量３５ｋＤａ）およ
び図１８８（レーン１２；分子量３５ｋＤａ）に示す。精製タンパク質を、図２４０、レ
ーン９〜１０に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２１７５）
アミノ酸配列＜配列番号６７２０＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２２９２）＜配
列番号６７１９＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６７２２＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６７２１＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号６７２０（ＧＢＳ１７１）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３６（レーン２；分子量２５ｋＤ
ａ）に示す。配列番号６７２０（ＧＢＳ１７１）を、ＧＳＴ融合産物としてもまた、Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４１（レーン
３；分子量４９．８ｋＤａ）に示す。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２１９２）
アミノ酸配列＜配列番号６７７２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２３０９）＜配
列番号６７７１＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号１００１４＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号１０
０１３＞もまた、同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９１１２＞をコードする関連配列＜配列番号９１１１＞もまた
、ＧＡＳにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
関連するＧＢＳ遺伝子＜配列番号８９９３＞およびＧＢＳタンパク質＜配列番号８９９
４＞もまた、同定した。このタンパク質配列の分析により、残基１〜１６にあるシグナル
ペプチドが明らかになる。
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６７７４＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６７７３＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。 ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク
質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号８９９４（ＧＢＳ２４５）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図６１（レーン６；分子量２３．７
ｋＤａ）に示す。配列番号８９９４（ＧＢＳ２４５）を、ＧＳＴ融合産物としてもＥ．ｃ
ｏｌｉにおいて発現させた。そして精製ＧＢＳ２４５−ＧＳＴを、図２１１、レーン６に
示す。
この精製ＧＳＴ融合タンパク質を、マウスを免疫するために使用した。得られた抗血清
を、ＦＡＣＳのために使用した（図２７８）。これにより、このタンパク質が、ＧＢＳ細
菌に対して免疫的に接近可能であることが確認された。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２２１３）
アミノ酸配列＜配列番号６８３２＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２３３２）＜配
列番号６８３１＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号６８３４＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号６８３３＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号６８３２（ＧＢＳ１１０）を、Ｈｉｓ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図３８（レーン８；分子量２８．９
ｋＤａ）に示す。配列番号６８３２（ＧＢＳ１１０）もまた、ＧＳＴ融合産物としてＥ．
ｃｏｌｉにおいて発現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図４１（レーン
１０；分子量５３．９ｋＤａ）に示す。
このＧＢＳ１１０−ＧＳＴ融合タンパク質を、精製し（図２０４、レーン５）、そして
マウスを免疫するために使用した。得られた抗血清を、ウエスタンブロット（図２５２Ａ
）、ＦＡＣＳ（図２５２Ｂ）、およびインビボでの受動防御アッセイ（表ＩＩＩ）のため
に使用した。これらの試験により、このタンパク質が、ＧＢＳ細菌に対して免疫的に接近
可能であること、およびこのタンパク質が、有効な防御免疫原であることが、確認された
。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
（実施例２２８５）
アミノ酸配列＜配列番号７０４８＞をコードするＤＮＡ配列（ＧＢＳｘ２４１９）＜配
列番号７０４７＞を、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅにおいて同定した。このタンパク質配列
の分析により、以下が明らかになる：
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号９２８６＞をコードする関連ＧＢＳ核酸配列＜配列番号９２８
５＞もまた、同定した。
このタンパク質は、ＧＥＮＰＥＰＴデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
アミノ酸配列＜配列番号７０５０＞をコードする関連ＤＮＡ配列＜配列番号７０４９＞
を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて同定した。このタンパク質配列の分析により、以下が
明らかになる：
Figure 2011239783
このタンパク質は、このデータベース中の以下の配列と相同性を有する。
Figure 2011239783
ＧＡＳタンパク質およびＧＢＳタンパク質のアライメントを、以下に示す。
Figure 2011239783
配列番号９２８６（ＧＢＳ６６２）を、ＧＳＴ融合産物としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発
現させた。全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図１３６（レーン８〜１０；分子量
６３ｋＤａ）および図１８７（レーン４；分子量６３ｋＤａ）に示す。
ＧＢＳ６６２−ＧＳＴを、図２３７、レーン７に示すように精製した。
この分析に基づいて、これらのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチン用または
診断薬用の有用な抗原であり得ることが、予測された。
本発明は、例のみのために記載されており、改変が、本発明の範囲および趣旨の範囲内
にあるままでなされ得ることが、理解される。
（表Ｉ−ＧＢＳタンパク質の理論上の分子量）
Figure 2011239783
Figure 2011239783
Figure 2011239783
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（表ＩＩ−ＧＢＳｎｎｎタンパク質を増幅するために使用したプライマー）
準方向プライマーは、
Figure 2011239783
で始まり、そして以下の表に示される配列が続く；逆方向プライマーは、
Figure 2011239783
で始まり、そして表に示される配列が続く。従って、ＧＢＳ１のプライマーは以下の通り
である。
Figure 2011239783
完全な順方向プライマー配列は、配列番号１０９６８〜１１４９２として配列表に与え
られる。逆方向プライマー配列は、配列番号１１４９３〜１２０１７である。
Figure 2011239783
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（表ＩＩＩ−インビボＧＢＳチャレンジの結果）
Figure 2011239783
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（表ＩＶ−ＧＢＳｎｎｎ番号と配列番号との比較）
Figure 2011239783
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（表Ｖ−ＧＢＳｎｎｎタンパク質の発現において欠失されたヌクレオチド）
Figure 2011239783
（表ＶＩ−特定の配列番号についての推定機能）
Figure 2011239783
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Claims (27)

  1. タンパク質であって、以下の配列番号：
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     からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
  2. 請求項１に記載のタンパク質と５０％以上の配列同一性を有するタンパク質。
  3. タンパク質であって、以下の配列番号：
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     からなる群より選択されるアミノ酸配列由来の７個以上の連続したアミノ酸のフラグメントを含むタンパク質。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する抗体。
  5. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、抗体。
  6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
  7. 請求項６に記載の核酸分子であって、以下の配列番号：
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     からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  8. 核酸分子であって、以下の配列番号：
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     からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  9. 核酸分子であって、以下の配列番号：
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     からなる群より選択されるヌクレオチド配列由来の１０個以上の連続したヌクレオチドのフラグメントを含む、核酸分子。
  10. 核酸分子であって、請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  11. 核酸分子であって、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子に５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  12. 核酸分子であって、高ストリンジェンシー条件下で、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、核酸分子。
  13. 請求項１〜１２のいずれかに記載のタンパク質、核酸分子、または抗体を含む、組成物。
  14. 請求項１３に記載の組成物であって、免疫原性組成物、ワクチン組成物、または診断組成物である、組成物。
  15. 請求項１３または請求項１４に記載の組成物であって、薬品として使用される、組成物。
  16. 連鎖球菌細菌、特に、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによって引き起こされる感染または疾患の処置または予防のための医薬の製造における、請求項１３に記載の組成物の、使用。
  17. 患者を処置するための、請求項１３に記載の組成物。
  18. 式ＮＨ２−Ａ−［Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨによって表されるハイブリッドタンパク質であって、ここで、Ｘが、請求項１で規定されるアミノ酸配列であり、Ｌが、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａが、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂが、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎが１より大きい整数である、ハイブリッドタンパク質。
  19. Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列内に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、該キットは、第１プライマーおよび第２プライマーを含み、ここで、該第１プライマーが該テンプレート配列に対して実質的に相補的であり、そして該第２プライマーが、該テンプレート配列の相補体に対して実質的に相補的であり、ここで、実質的な相補性を有する該プライマーの部分が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定する、キット。
  20. 単鎖核酸または二重鎖核酸（またはこれらの混合物）に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓテンプレート核酸配列の増幅を可能にする第１単鎖オリゴヌクレオチドおよび第２単鎖オリゴヌクレオチドを含むキットであって、ここで、（ａ）該第１オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列に実質的に相補的であるプライマー配列を含み；（ｂ）該第２オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸配列の相補体に実質的に相補的であるプライマー配列を含み；（ｃ）該第１オリゴヌクレオチドおよび／または該第２オリゴヌクレオチドが、該テンプレート核酸に相補的でない配列を含み、そして（ｄ）該プライマー配列が、増幅される該テンプレート配列の末端を規定する、キット。
  21. 請求項２０に記載のキットであって、ここで、前記（ｃ）の非相補的配列が、制限部位および／またはプロモーター配列を含む、キット。
  22. 生物学的サンプルにおいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを検出するための方法であって、該方法が、請求項６〜１２のいずれかに記載の核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程を包含する、方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、該方法が核酸増幅を含む、方法。
  24. 化合物が請求項１、請求項２、または請求項３に記載のタンパク質に結合するか否かを決定する方法であって、該方法が、試験化合物を、請求項１、請求項２、または請求項３に記載のタンパク質に接触させる工程、および該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法によって同定された化合物。
  26. 請求項１、請求項２、または請求項３に記載のタンパク質および以下の抗原：
    Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；
    Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原；
    Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；
    Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のサッカリド抗原；
    Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原；
    Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原；
    Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；
    Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原；
    Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原；
    ジフテリア抗原；
    破傷風抗原；
    Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ．由来のサッカリド抗原；
    Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原；
    Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原；
    Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原；
    Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原；
    ポリオ抗原；
    狂犬病抗原；
    麻疹、おたふくかぜおよび／または風疹抗原；
    インフルエンザ抗原；
    Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原；ならびに／あるいは
    Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原、
    のうちの１つ以上を含む、組成物。
  27. ２つ以上のタンパク質を含む組成物であって、ここで、各タンパク質が、請求項１、請求項２、または請求項３に記載のタンパク質である、組成物。
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