PL231394B1

PL231394B1 - Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae

Info

Publication number: PL231394B1
Application number: PL404498A
Authority: PL
Inventors: Monika BRZYCHCZY-WŁOCH; Monika Brzychczy-Włoch; Sabina GÓRSKA; Sabina Górska; Ewa BRZOZOWSKA; Ewa Brzozowska; Andrzej Gamian; Piotr Heczko
Original assignee: Instytut Immunologii I Terapii Doświadczalnej Im Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk; Univ Jagiellonski
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2019-02-28
Also published as: WO2014209142A1; US20160377613A1; PL404498A1; EP3014276A1; ES2685833T3; PL3014276T3; EP3014276B1; US10048263B2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny umożliwiający potwierdzenie zakażeń Streptococcus agalactiae u kobiet w ciąży, który wykorzystuje specyficzną reakcję białek immunoreaktywnych otrzymanych z izolatów klinicznych Streptococcus agalactiae z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentek.

Streptococcus agalactiae, zaliczany do paciorkowców grupy serologicznej B (ang. group B streptococcus - GBS) może kolonizować dolny odcinek przewodu pokarmowego, odbyt i pochwę, nie wywołując żadnych objawów zakażenia. Potwierdzono, że GBS występuje w pochwie lub odbytnicy u około 10-30% ciężarnych kobiet. Kolonizacja ta może mieć charakter przejściowy, przewlekły lub przerywany. Jednakże, obecność paciorkowców grupy B w pochwie u kobiet ciężarnych stanowi istotny czynnik ryzyka wystąpienia zakażeń u noworodków. Do zakażenia wewnątrzmacicznego może dojść w trakcie trwania ciąży, drogą wstępującą, jak również na skutek zaaspirowania zakażonego płynu owodniowego przez płód. Może być to przyczyną zgonu wewnątrzmacicznego, zapalenia płuc w okresie noworodkowym lub posocznicy. Do kolonizacji noworodka może dojść także w czasie porodu, ale w tych przypadkach częściej, dochodzi tylko do bezobjawowej kolonizacji skóry oraz błon śluzowych, a nie do rozwoju zakażenia [1,2, 3]. Zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 23 września 2010 r. w sprawie standardów postępowania oraz procedur medycznych przy udzielaniu świadczeń zdrowotnych z zakresu opieki okołoporodowej sprawowanej nad kobietą w okresie fizjologicznej ciąży, fizjologicznego porodu, połogu oraz opieki nad noworodkiem, w okresie między 33 a 37 tygodniem ciąży, u wszystkich ciężarnych należy wykonać badanie przesiewowe w kierunku obecności paciorkowców beta-hemolizujących w wymazie pobranym z przedsionka pochwy i okolic odbytu [4]. Potwierdzenie obecności GBS jest wskazaniem do wdrożenia u ciężarnej okołoporodowej profilaktyki antybiotykowej zgodnie z rekomendacjami Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego z roku 2008 [5]. Dodatkowo, kobiety ciężarne, u których doszło do zakażenia dróg moczowych GBS lub w badaniu bakteriologicznym moczu stwierdzono dodatni wynik posiewu w kierunku Streptococcus agalactiae, w liczbie równej co najmniej 1x10⁴(cfu/ml; ang. colony forming unit) (tzw. bezobjawowa bakteriuria), powinny otrzymać okołoporodową profilaktykę antybiotykową, ponieważ u kobiet tych zwykle występuję masywna kolonizacja dróg rodnych przez GBS, co istotnie zwiększa ryzyko rozwoju wczesnej posocznicy u noworodków [1, 2, 5]. Proponowane rozwiązanie nie jest jednak w pełni skuteczne, gdyż nie ogranicza rozwoju zakażeń w grupie noworodków przedwcześnie urodzonych oraz nie zabezpiecza przed rozwojem późnych zakażeń rozwijających się między 7 dniem, a trzecim miesiącem życia. Ponad to, coraz częściej problem zakażeń o etiologii GBS dotyka innych grup pacjentów, w tym szczególnie pacjentów w immunosupresji lub pacjentów geriatrycznych [1,2, 6].

Szybka diagnostyka w kierunku zakażeń wywołanych przez GBS, gwarantowałaby natychmiastowe wdrożenie celowanej antybiotykoterapii, jednakże obecnie na rynku brak jest testów diagnostycznych, umożliwiających potwierdzenie zakażeń wywołanych przez Streptococcus agalactiae.

Dotychczas tradycyjnie stosowane metody diagnostyki Streptococcus agalactiae opierają się głównie na metodzie hodowli, a następnie na charakterystyce fenotypowej (biochemicznej), serologicznej lub molekularnej wyizolowanych i wyhodowanych mikroorganizmów. Wyniki z tych metod uzyskiwane są najwcześniej po kilkunastu godzinach, w przypadku PCR, lub kilku dniach w przypadku klasycznej metody hodowli [1,2, 5].

Opracowany wynalazek dotyczy nowego testu diagnostycznego umożliwiającego potwierdzeni e zakażeń GBS u kobiet ciężarnych, który wykorzystuje specyficzną reakcję białek wysoce immunoreaktywnych otrzymanych z izolatów Streptococcus agalactiae z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentek. Innowacyjny test cechuje stosunkowo krótki czas oznaczenia, wysoka czułość i specyficzność. Test ten stanowi alternatywę dla obecnie stosowanych rozwiązań, takich jak badanie bakteriologiczne w kierunku nosicielstwa paciorkowców grupy B, oparte na metodzie hodowli, stanowiącej tzw. złoty standard, którą cechuje niska czułość oraz długi czas (do kilku dni) oczekiwania na wynik, oraz technik biologii molekularnej, w tym metody PCR w czasie rzeczywistym, która umożliwia otrzymanie wyniku w krótkim czasie, jednakże jest bardzo kosztowna i wymagają zastosowania specjalistycznego sprzętu.

Grupą docelową dla naszego testu są wszystkie kobiety ciężarne. Opracowana metoda nadaje się do zastosowania we wszystkich laboratoriach analitycznych i/lub mikrobiologicznych, gdyż nie wymaga stosowania specjalnego sprzętu. Istnieje możliwość rozszerzenia zastosowania tego testu do detekcji zakażeń o etiologii GBS w innych grupach pacjentów (np. noworodki, pacjenci ambulatoryjni, pacjenci szpitalni) oraz w innych materiałach klinicznych (np. osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy).

PL 231 394 B1

Przykładem znanego testu, dokument WO2009122388A1, jest test oparty na analizie kwasu nukleinowego szczepów Streptococcus agalactiae izolowanych z krwi, gardła, gruczołów sutkowych, nosa lub pochwy kobiet. W prezentowanym teście sekwencją markerową jest gen GBS ssrA.

Inne, podobne rozwiązanie opisuje dokument US20040009574A1. Rozwiązanie dotyczy identyfikacji sekwencji nukleotydowej kodującej białka odpowiedzialne za syntezę otoczkowych polisacharydów, które są specyficzne dla szczepów Streptococcus agalactiae.

Dokument US8137673B2 dotyczy białka oraz jego sekwencji nukleotydowej jako potencjalnego nośnika szczepionki oraz markera diagnostycznego szczepów Streptococcus gr A i B. Białkiem markerowym jest białko wiążące fibronektynę I (Fibronectin binding protein I).

Innym potencjalnym białkiem markerowym w zakażeniach S. agalactiae mogą być różne polipeptydy opisane w dokumentach US7262024B2 oraz US20120141521A1.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych metod wykrywania zakażeń oraz dostarczenie środków, które mogą być wykorzystane do realizacji takich metod.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów do wykrywania zakażenia szczepem Streptococcus agalactiae. Korzystnie, białko zostało wyizolowane ze szczepu Streptococcus agalactiae pochodzącego z próbki krwi, moczu, wymazu z pochwy, odbytu, ucha, jamy ustnej, treści oskrzelowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego pobranej od pacjenta zakażonego tym patogenem.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae charakteryzujący się tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów lub przeciwciał specyficznych wobec tego białka, przy czym obecność tego białka lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae. Korzystnie, badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA. Korzystnie, jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500-10000 razy.

W wyniku przeprowadzonych badań dotyczących identyfikacji białek immunoreaktywnych należących do szczepów Streptococcus agalactiae, wywołujących zakażenia u ludzi, uzyskano rezultat nieoczywisty, a mianowicie, białka oznaczone jako: NRID1, NRID3 i NRID4 (Ryc. 1) były wysoce immunoreaktywne jedynie z surowicami osób, które przeszły zakażenie GBS i nosicieli bakterii Streptococcus agalactiae. Brak podobnej reaktywności zanotowano w przypadku surowic osób nie będących nosicielami tych szczepów bakteryjnych.

Ujawniony sposób jest rozwiązaniem umożliwiającym szybką, czułą i specyficzną diagnostykę zakażenia wywołanego przez Streptococcus agalactiae. Nowatorskim podejściem w opracowanym teście jest wykorzystanie sekwencji aminokwasowych wysoce immunoreaktywnych, należących do białek szczepów Streptococcus agalactiae, na które to białka następuje indukcja przeciwciał naturalnych podczas procesu zakażenia, a które to sekwencje mogą posłużyć jako markery do identyfikacji tychże zakażeń u ludzi. Wykorzystanie sekwencji NRID1, NRID3 i NRID4 nie ogranicza się jedynie do samego testu diagnostycznego, ale także ze względu na swoje właściwości immunogenne można je wykorzystać jako nośniki do szczepionek przeciwko zakażeniom GBS. Epitopy sekwencji NRID1, NRID3 i NRID4 mogą dalej posłużyć do wytworzenia wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych i do opracowania testu diagnostycznego jeszcze szybszego i równie precyzyjnego.

Sposób według wynalazku obejmuje metody immunochemiczne, takie jak Western Blotting, ale nie ogranicza się jedynie do tej metody i może obejmować inne techniki np. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku opis został uzupełniony załączonymi figurami oraz przedstawionymi poniżej przykładami.

Na Figurze 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe immunoreaktywnych białek S. agalactiae.

Na Figurze 2 przedstawiono wyniki testu immunologicznego reakcji przeciwciał surowicy ludzkiej uzyskanej od ciężarnej kobiety z zakażeniem GBS (SB8) z białkami szczepów S. agalactiae z uwzględnieniem podziału na grupy badane.

P r z y k ł a d 1.

Zidentyfikowanie wysoce immunoreaktywnych sekwencji aminokwasowych należących do białek szczepów Streptococcus agalactiae

Kliniczne szczepy S. agalactiae podzielono na cztery grupy (Tabela 1):

PL 231 394 Β1

Grupa 1 - Szczepy izolowane z moczu noworodków z objawami zakażenia układu moczowego (14, 15, 18, 21,27, 47, 54, 55, 56, 57)

Grupa 2 - Szczepy izolowane z moczu dorosłych pacjentów z objawami zakażenia układu moczowego (305167, 309192, d11, d12, d88, d96, d122, d147, d165)

Grupa 3 - Szczepy izolowane z krwi, ucha lub jamy ustnej od noworodków z sepsą (4, 12, 13, 25, 26, 34, 35, 37, 38, 40, 41,42, 43, 44, 50, 52, 53)

Grupa 4 - Szczepy z nosicielstwa od noworodków i ciężarnych bez objawów zakażenia GBS oraz inne szczepy GBS (1,2,3,5,6,7,8,9, 10, 11, 16, 17, 19,20,22,23,24,28,29,30,31,32,33,36,39, 45, 46, 48, 49, 51,58, 59, 60)

Tabela 1.

Charakterystyka izolatów klinicznych S. agalactiae z podziałem na grupy badane (Grupa 1, Grupa 2, Grupa 3) i grupę kontrolną (Grupa 4).

Numer izolatu GBS	serotyp	Geny z rodziny Alp	Fenotyp oporności	Typ SI	Materiał kliniczny	Objawy kliniczne
Grupa 1 - Szczepy S. agaiactiae izolowane od noworodków z objawami zakażenia układu moczowego
14	/5279/08	la	epsiton	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
15	/5303/08	la	epsiton	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
18	/13695/08	la	epsiion	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
21	/13608/08	Ib	bca	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
27	/9353/08	II	rib	-	•	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
47	/306723	III	alp2	-	ST- 23	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
54	/1716/08	V	alp2	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
55	/1736/08	V	alp2	kMLSs	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
56	/2992/08	V	rib	-	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
57	/13793/08	V	alp3	kMLSe	-	Mocz noworodka	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
Grupa 2 - Szczepy S. agalactiae izolowane od pacjentów dorosłych z objawami zakażenia układu moczowego
289370		II	rib			Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
305167		la	epsiton			Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
309192		II	bca	-		Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
d11		V	alp2	kMLSs		Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
d12		III	rib			Mocz- pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
d88		V	alp2			Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
d96		la	epsiton	-	-	Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (Ł105 cfu/ml)
d122		Ib	bca	-		Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)

PL 231 394 Β1

Numer izolatu GBS	serotyp	Geny z rodziny Alp	Fenotyp oporności	Typ ST	Materiał kliniczny	Objawy kliniczne
d147		III	rib	kMLSs		Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁵cfu/ml)
d165		III	alp2/3	-	-	Mocz -pacjent dorosły	Bakteriuria (>10⁶cfu/ml)
Grupa 3 - Szczepy S. agalactiae izolowane od noworodków z scpsą
4	/305245	II	bca	-	5T- 106	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
12	/306735	la	epsiton	-	ST- 23	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek EOD)
13	/CM 169	la	bca		ST- 220	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
25	/CM 47	II	rib	I<MLSb ermB	ST- 19	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)/ zgon
34	/5886/09	III	rib	-	ST- 17	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
35	/3634/08	III	rib	-	ST- 17	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
37	/L1-181	III	rib	*	ST- 17	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
38	/4504/08	III	rib	-	ST- 19	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
40	/W2/18	III	alp2	-	ST- 23	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
41	/CM 173	III	bca	kMLSe ermB	ST- 22	Jama ustna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)/ zgon
42	/CM 176	III	rib	-	ST- 220	Jama ustna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)/zgon
43	/CM 185	III	rib	iMLSe	ST- 410	Ucho noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
44	/CM 28	III	rib		ST- 286	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
50	/S1/4	V	alp3	*	ST-1	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)/zgon
52	/3514/08	V	rib	-	ST- 220	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
53	/14030/08	V	rib	fenotyp M	ST- 638	Krew żylna noworodka	Sepsa noworodek (EOD)
Grupa 4 - Szczepy S. agalactiae z nosicielstwa od noworodków i ciężarnych bez objawów zakażenia oraz inne szczepy GBS
1	/7/P/2a	la	epsiton			Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
3	/28/0/3a	III	rib	-	•	Wymaz z odbytu	Nosicielstwo u ciężarnej
5	/3/P/2a	V	alp3	kMLSB ermB		Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
6	/10/P/3a	II	rib	-		Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej

PL 231 394 Β1

Numer izolatu GBS	serotyp	Geny z rodziny Alp	Fenotyp oporności	Typ ST	Materiał kliniczny	Objawy kliniczne
7	/42/P/3a	V	alp2		*	Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
8	/9/0/2a	Ib	bca	-	-	Wymaz z odbytu	Nosicielstwo u ciężarnej
9	/14/P/3a	V	alp3	kMLSB ermB		Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
10	/23/P/3a	II	rib	fenotypM mefA/E		Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
11	/25/P/1a	la	epsiton	•		Wymaz z pochwy	Nosicielstwo u ciężarnej
16	/13445/07	la	epsiton	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
17	/11277/08	la	rib			Ucho noworodka	Kolonizacja noworodka
19	/2337/08	la	epsiton	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
20	/5338/08	la	-	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
22	/D121	Ib	epsilon	-	-	Szyjka macicy	Stan zapalny
23	/2107/08	Ib	bca	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
24	/CM 184	Ib	bca			Pochwa - Ciężarna	Kolonizacja noworodka
28	/13640/07	II	bca	-	ST- 10	Treść oskrzelowa now.	Zapalenie płuc
29	/14041/07	II	rib	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
30	/14191/07	II	bca		-	Ucho noworodka	Kolonizacja noworodka
31	/2341/08	II	rib	-	-	Jama ustna noworodka	Kolonizacja noworodka
32	/D120	II	epsilon	fenotyp M mefA/E	-	Pochwa	Stan zapalny
33	/D126	II	epsilon	-	-	Pochwa	Stan zapalny
36	/13723/07	III	rib	-	ST- 358	Ucho noworodka	Kolonizacja noworodka
39	/D136	III	epsiton	-	-	Pochwa	Stan zapalny
45	/3A-012	III	rib	-	ST- 447	Pochwa - Ciężarna	Kolonizacja noworodka
46	/CM49	III	rib		ST- 148	Pochwa - Ciężarna	Kolonizacja noworodka
48	/CM 87	III	rib	-	ST- 19	Ucho noworodka	Kolonizacja noworodka
49	/CM 3	IV	epsiton			Pochwa - Ciężarna	Kolonizacja noworodka
51	/D156	V	epsiton	-	-	Pochwa	Stan zapalny
58	/104112	III	alp2	-	-	ATCC	Szczep referencyjny
59	/2134	II	rib	-	-	DSM	Szczep referencyjny
60	/10511	V	rib	-	-	ATCC	Szczep referencyjny

PL 231 394 B1

Szczepy S. agalactiae hodowano na podłożu stałym BHI w warunkach tlenowych przez 24 h w temperaturze 37°C. Masa komórkowa po żwirowaniu zawieszana była w PBS do stężenia A600 = 1.0. Po żwirowaniu osad zawieszano w buforze Tris (60 mM, pH 6.8) zawierającym 2% SDS. Następnie próbki sonifikowano przez 5 minut. Uzyskany po wirowaniu supernatant białkowy precypitowano 3 obj. 95% etanolu przez noc w 4°C. Próbki żwirowano i osad rozpuszczono w wodzie. Metodą BCA (ang. Bicinchoninic acid assay) [7] określono stężenie wyizolowanych białek.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS wg Laemmli'ego [8]

Rozdział elektroforetyczny białek prowadzono, wg metody opisanej przez Laemmli'ego (1970) [7] w żelu 5% zagęszczającym i 12,5% żelu rozdzielającym, w buforze elektrodowym pH 8,6. Próby (10 μg) przed naniesieniem na żel (objętość maksymalna 10 pil) denaturowano 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Rozdział białek prowadzono ok. 80 minut, początkowo przy natężeniu prądu 10 mA na każdą płytkę o wymiarach 83 x 73 x 0,75 mm, a po wejściu w żel zagęszczający 20 mA. Elektroforezę prowadzono w zestawie do elektroforezy firmy Bio-Rad model Mini PROTEAN® 3 cell. Po zakończeniu elektroforezy żele barwiono 30 minut w 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 w 40% (v/v) metanolu i 10% (v/v) kwasie octowym.

Immunobloting [9]

Żel po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS przeniesiono do buforu Tris/Gly z 10% (v/v) metanolem o pH 8,3 (bufor do transferu) na 15 minut. Membranę, Immobilon-P (PVDF firmy Millipore), moczono 15 sekund w 100% MeOH, 2 minuty w wodzie mili Q i 2 minuty w buforze do transferu. Transfer prowadzono 1 h, przy napięciu 100 V z użyciem zestawu firmy Bio-Rad. Membranę po transferze barwiono w Ponceau S, a następnie nadmiar barwnika odbarwiono w wodzie mili Q. Immunobloting prowadzono z białkami związanymi na hydrofobowej membranie Immobilon-P. Wolne miejsca na membranie blokowano 1% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze Tris/HCl pH 7,5 z dodatkiem 50 mM NaCl i 0,05% (v/v) Tween 20 (bufor TBS-T) przez 1 godzinę w 37°C. Nadmiar BSA odpłukiwano TBS-T, 1 x przez 15 minut i 2 razy po 5 minut. Następnie prowadzono reakcję z 24 ludzkimi surowicami (w tym: 16 surowic pochodziło od kobiet ciężarnych z nosicielstwem GBS oraz od pacjentek z zakażeniem; 8 surowic stanowiło kontrolę i pochodziło od kobiet ciężarnych nie będących nosicielkami GBS), rozcieńczonymi w zakresie 500-10000 razy w TBS-T z 1% BSA, przez 2 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Nadmiar niezwiązanych przeciwciał płukano TBS-T.

Następnym etapem eksperymentu była reakcja z przeciwciałami znakowanymi enzymem - alkaliczną fosfatazą - w TBS-T, przez 1 godzinę w 37°C z dodatkiem 5% (v/v) surowicy koziej. Nadmiar koniugatu odpłukano TBS-T (1 x 15minut, 4 razy po 5 minut). Obraz wywoływano stosując substraty dla alkalicznej fosfatazy: NBT (nitrotetrazol), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indozylofosforan) w buforze TBS z dodatkiem jonów Mg²⁺, pH 9,5. Po uzyskaniu obrazu (po około 1 5-20 sekundach) przerywano reakcję przenosząc membranę do wody mili Q.

Wyniki

W wyniku przeprowadzonych eksperymentów uzyskano obraz białek immunogennych szczepów

S. agalactiae. Obrazy reaktywnych białek badanych szczepów różniły się pomiędzy sobą, a bliższa analiza ukazała korelację pomiędzy materiałem klinicznym i rodzajem objawów klinicznych z których był izolowany dany szczep, a reaktywnością z surowicami. Stwierdzono, iż wszystkie szczepy wyizolowane z moczu noworodków (14, 15, 18, 21,27, 47, 54, 55, 56, 57) oraz z moczu dorosłych pacjentów (305167, 309192, d11, d12, d88, d96, d122, d147, d165) produkują białka w zakresie 35-50 kDa reagujące ze wszystkimi badanymi surowicami pochodzącymi od kobiet z nosicielstwem GBS oraz z zakażeniem, zaś nie reagującymi z surowicami z grupy kontrolnej.

Poniżej przedstawiono wyniki testu immunologicznego reakcji przeciwciał surowicy ludzkiej uzyskanej od ciężarnej kobiety z zakażeniem GBS (próbka numer SB8) z białkami szczepów S. agalactiae z uwzględnieniem podziału na grupy badane izolowanych (Ryc. 2).

Białka w zakresie 35-50 kDa wykazywały reaktywność z przeciwciałami w surowicach pacjentów z zakażeniami S. agalactiae, natomiast nie reagowały z surowicami otrzymanymi od zdrowych pacjentek nie będących nosicielkami GBS. Wytypowane białka reagowały specyficznie i mogą być wykorzystywane w testach immunologicznych, takich jak Immunobloting, ELISA, dot-ElA, do detekcji zakażeń S. agalactiae.

Wyizolowano opisane powyżej białka i ustalono ich sekwencje aminokwasowe. Zidentyfikowane w ten sposób wysoce immunoreaktywne sekwencje aminokwasowe należące do białek szczepów

PL 231 394 B1

Streptococcus agalactiae zostały przedstawione w załączonym wykazie sekwencji jako Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 2, Sekw. Nr 3 oraz Sekw. Nr 4.

P r z y k ł a d 2.

Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae

Przykładowa realizacja sposobu według wynalazku obejmuje następujące etap y:

a) Gotowe membrany PVDP o grubości 0.45 μm zawierające rozdzielone sekwencje immunoreaktywne białek szczepów Streptococcus agalactiae według wynalazku namacza się w metanolu, odpłukuje i poddaje reakcji blokowania wolnych miejsc przy użyciu czynnika blokującego, korzystnie 0.5-5.0% BSA w buforze fosforanowym. Przy czym, membranę uzyskuje się poprzez wykonanie transferu rozdzielonych sekwencji białek GBS z żelu poliakrylamidowego, najkorzystniej 7,5-15%, suszy i przechowuje w ciemności.

b) Przygotowaną membranę PVDP inkubuje się z surowicą ludzką rozcieńczoną 500-10000 razy, inkubuje na kołysce w 37°C przez 1 godzinę, odmywa się nadmiar przeciwciał przy użyciu buforu fosforanowego z detergentem, korzystnie z Tween-20 w stężeniu 0.01-0.5%.

c) Wykonuje się reakcję sekwencji immunoreaktywnych na membranie PVDP z koniugatem przeciwciał anty-ludzkie IgG z zasadową fosfatazą w rozcieńczeniu 500-10000 razy na kołysce w 37°C przez 1 godzinę, nadmiar koniugatu odmywa się przy użyciu buforu fosforanowego z Tween-20.

d) Wizualizacja testu przy użyciu substratów dla zasadowej fosfatazy. Piśmiennictwo:

1. Schrag S, i inni. Prevention of perinatal group B streptococcal disease. Revised guidelines from CDC. MMWR 2002; 15: 1 -22.

2. Verani J, i inni. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease. Revised Guidelines from CDC, 2010. MMWR 2010; 59: 1-32.

3. Rodriguez-Granger J, i inni. Prevention of group B streptococcal neonatal disease revisited. The DEVANI European project. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 2097-104.

4. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 września 2010 r. Załącznik do rozporządzenia Standardy postępowania oraz procedury medyczne przy udzielaniu świadczeń zdrowotnych z zakresu opieki okołoporodowej sprawowanej nad kobietą w okresie fizjologicznej ciąż y, fizjologicznego porodu, połogu oraz opieki nad noworodkiem. 2010; 1-27.

5. Kotarski J, i inni. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków. Ginekol Pol 2008; 79: 221-3.

6. Edwards MS, Baker CJ. Group B Streptococcal infections in elderly adults. Clin Infect Dis 2005;41: 839-847.

7. Smith PK, i inni. Measurement of protein using bincichoninic acid. Anal. Biochem. 1985; 150: 76-85.

8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-5.

9. Towbin., T. Staechelin., J. Gordon; Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to ultracellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979; 4350-4354.

PL 231 394 Β1

Wykaz sekwencji

Sekw. Nr 1

MSTSFENKAT NRGIITFTIS QDEIKPALDQ AFNKVKKDLN VPGFRKGHMP RTVFNQKFGE EALYENALNL VLPKAYEAAV AELGLDVVAQ PKIDWSMEK GQDWKLTAEV VTKPEVKLGD YKDLSVEVDA SKEVSDEEVD AKVERERNNL AELTVKDGEA AQGDTVVIDF VGSVDGVEFD GGKGDNFSLE LGSGQFIPGF EEQLVGSKAG QTVDVNVTFP EDYQAEDLAG KDAKFVTTIH EVKTKEVPAL DDELAKDIDD EVETLDELKA KYRKELESAK EIAFDDAVEG AAIELAVANA EIVELPEEMV HDEVHRAMNE FMGNMQRQGI SPEMYFQLTG TTEEDLHKQY QADADKRVKT NLVIEAIAAA EGFEATDEEI EKEITDLASE YNMEADQVRG LLSADMLKHD IAMKKAVDVI TSSATVK

Sekw. Nr 2

MSIITDVYAR	EVLDSRGNPT LEVEVYTESG AFGRGMVPSG ASTGEHEAVE
LRDGDKSRYG	GLGTQKAVDN VNNVIAEAII GYDVRDQQAI DRAMIALDGT
PNKGKLGANA	ILGVSIAVAR AAADYLEVPL YSYLGGFNTK VLPTPMMNII
NGGSHSDAPI	AFQEFMIMPV GAPTFKEALR WGAEVFHALK KILKERGLET
AVGDEGGFAP	KFEGTEDGVE TILKAIEAAG YEAGENGIMI GFDCASSEFY
DAERKVYDYG	KFEGEGGAVR TAAEQIDYLE ELVNKYPIIT IEDGMDENDW
DGWKALTERL	GGRVQLVGDD FFVTNTDYLA RGIKEEAANS ILIKVNQIGT
LTETFEAIEM	AKEAGYTAW SHRSGETEDS TIADIAVATN AGQIKTGSLS
RTDRIAKYNQ	LLRIEDQLGE VAQYKGIKSF YNLKK

Sekw. Nr 3

MAYKTIYPYT NEVLHEFDNI SDSDLEQSLD IAHALYKTWR KEDNVEERQN QLHKVADLLR KDRDKYAEVM TKDMGKLFTE AQGEVDLCAD IADYYADNGQ KFLKPVPLES PNGEAYYLKQ AVGVLLAVEP WNFPFYQIMR VFAPNFIVGN TMLLKHASIC PASAQAFEDL VREAGAPEGA FKNIFASYDQ VSNLISDPRV AGVCLTGSER GGASIAAEAG KNLKKSSMEL GGNDAFLILD DADFDLLSKT IFFARLYNAG QVCTSSKRFI VMADKYDEFV NMWETFKSA KWGDPMDSET TLAPLSSAGA KDDVLKQIKL AVDHGAEVVF GNDTIDHPGN FVMPTVLTNI TKANPIYNGE IFGPVASIYK VDTEEEAIAL ANDSSYGLGS TVFSSDPEHA KKVAAQIETG MTFINSGWTS LPELPFGGIK NSGYGRELSQ LGFDAFVNEH LVFTPNSD

Sekw. Nr 4

MAKEKYDRSK PHVNIGTIGH VDHGKTTLTA AITTVLARRL PTSVNQPKDY ASIDAAPEER ERGITINTAH VEYETEKRHY AHIDAPGHAD YVKNMITGAA QMDGAILWA STDGPMPQTR EHILLSRQVG VKHLIVFMNK VDLVDDEELL ELVEMEIRDL LSEYDFPGDD LPVIQGSALK ALEGDEKYED IIMELMSTVD EYIPEPERDT DKPLLLPVED VFSITGRGTV ASGRIDRGTV RVNDEVEIVG IKEDIQKAVV TGVEMFRKQL DEGLAGDNVG VLLRGVQRDE IERGQVLAKP GSINPHTRFK GEVYILSKEE GGRHTPFFNN YRPQFYFRTT DVTGSIELPA GTEMVMPGDN VTIEVELIHP IAVEQGTTFS IREGGRTVGS GIVSEIEA

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw, Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów do wykrywania zakażenia szczepem Streptococcus agalactiae.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że białko zostało wyizolowane ze szczepu Streptococcus agalactiae pochodzącego z próbki krwi, moczu, wymazu z pochwy, odbytu, ucha, jamy ustnej, treści oskrzelowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego pobranej od pacjenta zakażonego tym patogenem.
3. Sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae, znamienny tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów lub przeciwciał specyficznych wobec tego białka, przy czym obecność tego białka lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500-10000 razy.