PL231394B1 - Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae - Google Patents
Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiaeInfo
- Publication number
- PL231394B1 PL231394B1 PL404498A PL40449813A PL231394B1 PL 231394 B1 PL231394 B1 PL 231394B1 PL 404498 A PL404498 A PL 404498A PL 40449813 A PL40449813 A PL 40449813A PL 231394 B1 PL231394 B1 PL 231394B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- newborn
- seq
- streptococcus agalactiae
- protein
- urine
- Prior art date
Links
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 title claims description 39
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 30
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 25
- 201000004538 Bacteriuria Diseases 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 208000006816 Neonatal Sepsis Diseases 0.000 description 9
- 101100424621 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) tub1 gene Proteins 0.000 description 9
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 9
- 101150084761 alp2 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 101100119095 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) ermB gene Proteins 0.000 description 4
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 101150111763 mefA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-2h-tetrazole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1N=NNN=1 ZGZLYKUHYXFIIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010056396 Asymptomatic bacteriuria Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010068402 Cervix inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010056254 Intrauterine infection Diseases 0.000 description 1
- 208000020241 Neonatal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061308 Neonatal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010053584 Neonatal pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000037129 Newborn Diseases Infant Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010040049 Sepsis neonatal Diseases 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003236 bicinchoninic acid assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 231100001046 intrauterine death Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56944—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny umożliwiający potwierdzenie zakażeń Streptococcus agalactiae u kobiet w ciąży, który wykorzystuje specyficzną reakcję białek immunoreaktywnych otrzymanych z izolatów klinicznych Streptococcus agalactiae z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentek.
Streptococcus agalactiae, zaliczany do paciorkowców grupy serologicznej B (ang. group B streptococcus - GBS) może kolonizować dolny odcinek przewodu pokarmowego, odbyt i pochwę, nie wywołując żadnych objawów zakażenia. Potwierdzono, że GBS występuje w pochwie lub odbytnicy u około 10-30% ciężarnych kobiet. Kolonizacja ta może mieć charakter przejściowy, przewlekły lub przerywany. Jednakże, obecność paciorkowców grupy B w pochwie u kobiet ciężarnych stanowi istotny czynnik ryzyka wystąpienia zakażeń u noworodków. Do zakażenia wewnątrzmacicznego może dojść w trakcie trwania ciąży, drogą wstępującą, jak również na skutek zaaspirowania zakażonego płynu owodniowego przez płód. Może być to przyczyną zgonu wewnątrzmacicznego, zapalenia płuc w okresie noworodkowym lub posocznicy. Do kolonizacji noworodka może dojść także w czasie porodu, ale w tych przypadkach częściej, dochodzi tylko do bezobjawowej kolonizacji skóry oraz błon śluzowych, a nie do rozwoju zakażenia [1,2, 3]. Zgodnie z rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 23 września 2010 r. w sprawie standardów postępowania oraz procedur medycznych przy udzielaniu świadczeń zdrowotnych z zakresu opieki okołoporodowej sprawowanej nad kobietą w okresie fizjologicznej ciąży, fizjologicznego porodu, połogu oraz opieki nad noworodkiem, w okresie między 33 a 37 tygodniem ciąży, u wszystkich ciężarnych należy wykonać badanie przesiewowe w kierunku obecności paciorkowców beta-hemolizujących w wymazie pobranym z przedsionka pochwy i okolic odbytu [4]. Potwierdzenie obecności GBS jest wskazaniem do wdrożenia u ciężarnej okołoporodowej profilaktyki antybiotykowej zgodnie z rekomendacjami Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego z roku 2008 [5]. Dodatkowo, kobiety ciężarne, u których doszło do zakażenia dróg moczowych GBS lub w badaniu bakteriologicznym moczu stwierdzono dodatni wynik posiewu w kierunku Streptococcus agalactiae, w liczbie równej co najmniej 1x104 (cfu/ml; ang. colony forming unit) (tzw. bezobjawowa bakteriuria), powinny otrzymać okołoporodową profilaktykę antybiotykową, ponieważ u kobiet tych zwykle występuję masywna kolonizacja dróg rodnych przez GBS, co istotnie zwiększa ryzyko rozwoju wczesnej posocznicy u noworodków [1, 2, 5]. Proponowane rozwiązanie nie jest jednak w pełni skuteczne, gdyż nie ogranicza rozwoju zakażeń w grupie noworodków przedwcześnie urodzonych oraz nie zabezpiecza przed rozwojem późnych zakażeń rozwijających się między 7 dniem, a trzecim miesiącem życia. Ponad to, coraz częściej problem zakażeń o etiologii GBS dotyka innych grup pacjentów, w tym szczególnie pacjentów w immunosupresji lub pacjentów geriatrycznych [1,2, 6].
Szybka diagnostyka w kierunku zakażeń wywołanych przez GBS, gwarantowałaby natychmiastowe wdrożenie celowanej antybiotykoterapii, jednakże obecnie na rynku brak jest testów diagnostycznych, umożliwiających potwierdzenie zakażeń wywołanych przez Streptococcus agalactiae.
Dotychczas tradycyjnie stosowane metody diagnostyki Streptococcus agalactiae opierają się głównie na metodzie hodowli, a następnie na charakterystyce fenotypowej (biochemicznej), serologicznej lub molekularnej wyizolowanych i wyhodowanych mikroorganizmów. Wyniki z tych metod uzyskiwane są najwcześniej po kilkunastu godzinach, w przypadku PCR, lub kilku dniach w przypadku klasycznej metody hodowli [1,2, 5].
Opracowany wynalazek dotyczy nowego testu diagnostycznego umożliwiającego potwierdzeni e zakażeń GBS u kobiet ciężarnych, który wykorzystuje specyficzną reakcję białek wysoce immunoreaktywnych otrzymanych z izolatów Streptococcus agalactiae z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentek. Innowacyjny test cechuje stosunkowo krótki czas oznaczenia, wysoka czułość i specyficzność. Test ten stanowi alternatywę dla obecnie stosowanych rozwiązań, takich jak badanie bakteriologiczne w kierunku nosicielstwa paciorkowców grupy B, oparte na metodzie hodowli, stanowiącej tzw. złoty standard, którą cechuje niska czułość oraz długi czas (do kilku dni) oczekiwania na wynik, oraz technik biologii molekularnej, w tym metody PCR w czasie rzeczywistym, która umożliwia otrzymanie wyniku w krótkim czasie, jednakże jest bardzo kosztowna i wymagają zastosowania specjalistycznego sprzętu.
Grupą docelową dla naszego testu są wszystkie kobiety ciężarne. Opracowana metoda nadaje się do zastosowania we wszystkich laboratoriach analitycznych i/lub mikrobiologicznych, gdyż nie wymaga stosowania specjalnego sprzętu. Istnieje możliwość rozszerzenia zastosowania tego testu do detekcji zakażeń o etiologii GBS w innych grupach pacjentów (np. noworodki, pacjenci ambulatoryjni, pacjenci szpitalni) oraz w innych materiałach klinicznych (np. osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy).
PL 231 394 B1
Przykładem znanego testu, dokument WO2009122388A1, jest test oparty na analizie kwasu nukleinowego szczepów Streptococcus agalactiae izolowanych z krwi, gardła, gruczołów sutkowych, nosa lub pochwy kobiet. W prezentowanym teście sekwencją markerową jest gen GBS ssrA.
Inne, podobne rozwiązanie opisuje dokument US20040009574A1. Rozwiązanie dotyczy identyfikacji sekwencji nukleotydowej kodującej białka odpowiedzialne za syntezę otoczkowych polisacharydów, które są specyficzne dla szczepów Streptococcus agalactiae.
Dokument US8137673B2 dotyczy białka oraz jego sekwencji nukleotydowej jako potencjalnego nośnika szczepionki oraz markera diagnostycznego szczepów Streptococcus gr A i B. Białkiem markerowym jest białko wiążące fibronektynę I (Fibronectin binding protein I).
Innym potencjalnym białkiem markerowym w zakażeniach S. agalactiae mogą być różne polipeptydy opisane w dokumentach US7262024B2 oraz US20120141521A1.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowych metod wykrywania zakażeń oraz dostarczenie środków, które mogą być wykorzystane do realizacji takich metod.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów do wykrywania zakażenia szczepem Streptococcus agalactiae. Korzystnie, białko zostało wyizolowane ze szczepu Streptococcus agalactiae pochodzącego z próbki krwi, moczu, wymazu z pochwy, odbytu, ucha, jamy ustnej, treści oskrzelowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego pobranej od pacjenta zakażonego tym patogenem.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae charakteryzujący się tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów lub przeciwciał specyficznych wobec tego białka, przy czym obecność tego białka lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae. Korzystnie, badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA. Korzystnie, jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500-10000 razy.
W wyniku przeprowadzonych badań dotyczących identyfikacji białek immunoreaktywnych należących do szczepów Streptococcus agalactiae, wywołujących zakażenia u ludzi, uzyskano rezultat nieoczywisty, a mianowicie, białka oznaczone jako: NRID1, NRID3 i NRID4 (Ryc. 1) były wysoce immunoreaktywne jedynie z surowicami osób, które przeszły zakażenie GBS i nosicieli bakterii Streptococcus agalactiae. Brak podobnej reaktywności zanotowano w przypadku surowic osób nie będących nosicielami tych szczepów bakteryjnych.
Ujawniony sposób jest rozwiązaniem umożliwiającym szybką, czułą i specyficzną diagnostykę zakażenia wywołanego przez Streptococcus agalactiae. Nowatorskim podejściem w opracowanym teście jest wykorzystanie sekwencji aminokwasowych wysoce immunoreaktywnych, należących do białek szczepów Streptococcus agalactiae, na które to białka następuje indukcja przeciwciał naturalnych podczas procesu zakażenia, a które to sekwencje mogą posłużyć jako markery do identyfikacji tychże zakażeń u ludzi. Wykorzystanie sekwencji NRID1, NRID3 i NRID4 nie ogranicza się jedynie do samego testu diagnostycznego, ale także ze względu na swoje właściwości immunogenne można je wykorzystać jako nośniki do szczepionek przeciwko zakażeniom GBS. Epitopy sekwencji NRID1, NRID3 i NRID4 mogą dalej posłużyć do wytworzenia wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych i do opracowania testu diagnostycznego jeszcze szybszego i równie precyzyjnego.
Sposób według wynalazku obejmuje metody immunochemiczne, takie jak Western Blotting, ale nie ogranicza się jedynie do tej metody i może obejmować inne techniki np. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku opis został uzupełniony załączonymi figurami oraz przedstawionymi poniżej przykładami.
Na Figurze 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe immunoreaktywnych białek S. agalactiae.
Na Figurze 2 przedstawiono wyniki testu immunologicznego reakcji przeciwciał surowicy ludzkiej uzyskanej od ciężarnej kobiety z zakażeniem GBS (SB8) z białkami szczepów S. agalactiae z uwzględnieniem podziału na grupy badane.
P r z y k ł a d 1.
Zidentyfikowanie wysoce immunoreaktywnych sekwencji aminokwasowych należących do białek szczepów Streptococcus agalactiae
Kliniczne szczepy S. agalactiae podzielono na cztery grupy (Tabela 1):
PL 231 394 Β1
Grupa 1 - Szczepy izolowane z moczu noworodków z objawami zakażenia układu moczowego (14, 15, 18, 21,27, 47, 54, 55, 56, 57)
Grupa 2 - Szczepy izolowane z moczu dorosłych pacjentów z objawami zakażenia układu moczowego (305167, 309192, d11, d12, d88, d96, d122, d147, d165)
Grupa 3 - Szczepy izolowane z krwi, ucha lub jamy ustnej od noworodków z sepsą (4, 12, 13, 25, 26, 34, 35, 37, 38, 40, 41,42, 43, 44, 50, 52, 53)
Grupa 4 - Szczepy z nosicielstwa od noworodków i ciężarnych bez objawów zakażenia GBS oraz inne szczepy GBS (1,2,3,5,6,7,8,9, 10, 11, 16, 17, 19,20,22,23,24,28,29,30,31,32,33,36,39, 45, 46, 48, 49, 51,58, 59, 60)
Tabela 1.
Charakterystyka izolatów klinicznych S. agalactiae z podziałem na grupy badane (Grupa 1, Grupa 2, Grupa 3) i grupę kontrolną (Grupa 4).
| Numer izolatu GBS | serotyp | Geny z rodziny Alp | Fenotyp oporności | Typ SI | Materiał kliniczny | Objawy kliniczne | |
| Grupa 1 - Szczepy S. agaiactiae izolowane od noworodków z objawami zakażenia układu moczowego | |||||||
| 14 | /5279/08 | la | epsiton | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 15 | /5303/08 | la | epsiton | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 18 | /13695/08 | la | epsiion | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 21 | /13608/08 | Ib | bca | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 27 | /9353/08 | II | rib | - | • | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 47 | /306723 | III | alp2 | - | ST- 23 | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 54 | /1716/08 | V | alp2 | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 55 | /1736/08 | V | alp2 | kMLSs | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 56 | /2992/08 | V | rib | - | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| 57 | /13793/08 | V | alp3 | kMLSe | - | Mocz noworodka | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
| Grupa 2 - Szczepy S. agalactiae izolowane od pacjentów dorosłych z objawami zakażenia układu moczowego | |||||||
| 289370 | II | rib | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | |||
| 305167 | la | epsiton | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | |||
| 309192 | II | bca | - | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | ||
| d11 | V | alp2 | kMLSs | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | ||
| d12 | III | rib | Mocz- pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | |||
| d88 | V | alp2 | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | |||
| d96 | la | epsiton | - | - | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (Ł105 cfu/ml) | |
| d122 | Ib | bca | - | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) |
PL 231 394 Β1
| Numer izolatu GBS | serotyp | Geny z rodziny Alp | Fenotyp oporności | Typ ST | Materiał kliniczny | Objawy kliniczne | |
| d147 | III | rib | kMLSs | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>105 cfu/ml) | ||
| d165 | III | alp2/3 | - | - | Mocz -pacjent dorosły | Bakteriuria (>106 cfu/ml) | |
| Grupa 3 - Szczepy S. agalactiae izolowane od noworodków z scpsą | |||||||
| 4 | /305245 | II | bca | - | 5T- 106 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 12 | /306735 | la | epsiton | - | ST- 23 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek EOD) |
| 13 | /CM 169 | la | bca | ST- 220 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) | |
| 25 | /CM 47 | II | rib | I<MLSb ermB | ST- 19 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD)/ zgon |
| 34 | /5886/09 | III | rib | - | ST- 17 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 35 | /3634/08 | III | rib | - | ST- 17 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 37 | /L1-181 | III | rib | * | ST- 17 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 38 | /4504/08 | III | rib | - | ST- 19 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 40 | /W2/18 | III | alp2 | - | ST- 23 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 41 | /CM 173 | III | bca | kMLSe ermB | ST- 22 | Jama ustna noworodka | Sepsa noworodek (EOD)/ zgon |
| 42 | /CM 176 | III | rib | - | ST- 220 | Jama ustna noworodka | Sepsa noworodek (EOD)/zgon |
| 43 | /CM 185 | III | rib | iMLSe | ST- 410 | Ucho noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 44 | /CM 28 | III | rib | ST- 286 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) | |
| 50 | /S1/4 | V | alp3 | * | ST-1 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD)/zgon |
| 52 | /3514/08 | V | rib | - | ST- 220 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| 53 | /14030/08 | V | rib | fenotyp M | ST- 638 | Krew żylna noworodka | Sepsa noworodek (EOD) |
| Grupa 4 - Szczepy S. agalactiae z nosicielstwa od noworodków i ciężarnych bez objawów zakażenia oraz inne szczepy GBS | |||||||
| 1 | /7/P/2a | la | epsiton | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | ||
| 3 | /28/0/3a | III | rib | - | • | Wymaz z odbytu | Nosicielstwo u ciężarnej |
| 5 | /3/P/2a | V | alp3 | kMLSB ermB | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | |
| 6 | /10/P/3a | II | rib | - | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej |
PL 231 394 Β1
| Numer izolatu GBS | serotyp | Geny z rodziny Alp | Fenotyp oporności | Typ ST | Materiał kliniczny | Objawy kliniczne | |
| 7 | /42/P/3a | V | alp2 | * | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | |
| 8 | /9/0/2a | Ib | bca | - | - | Wymaz z odbytu | Nosicielstwo u ciężarnej |
| 9 | /14/P/3a | V | alp3 | kMLSB ermB | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | |
| 10 | /23/P/3a | II | rib | fenotypM mefA/E | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | |
| 11 | /25/P/1a | la | epsiton | • | Wymaz z pochwy | Nosicielstwo u ciężarnej | |
| 16 | /13445/07 | la | epsiton | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 17 | /11277/08 | la | rib | Ucho noworodka | Kolonizacja noworodka | ||
| 19 | /2337/08 | la | epsiton | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 20 | /5338/08 | la | - | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 22 | /D121 | Ib | epsilon | - | - | Szyjka macicy | Stan zapalny |
| 23 | /2107/08 | Ib | bca | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 24 | /CM 184 | Ib | bca | Pochwa - Ciężarna | Kolonizacja noworodka | ||
| 28 | /13640/07 | II | bca | - | ST- 10 | Treść oskrzelowa now. | Zapalenie płuc |
| 29 | /14041/07 | II | rib | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 30 | /14191/07 | II | bca | - | Ucho noworodka | Kolonizacja noworodka | |
| 31 | /2341/08 | II | rib | - | - | Jama ustna noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 32 | /D120 | II | epsilon | fenotyp M mefA/E | - | Pochwa | Stan zapalny |
| 33 | /D126 | II | epsilon | - | - | Pochwa | Stan zapalny |
| 36 | /13723/07 | III | rib | - | ST- 358 | Ucho noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 39 | /D136 | III | epsiton | - | - | Pochwa | Stan zapalny |
| 45 | /3A-012 | III | rib | - | ST- 447 | Pochwa - Ciężarna | Kolonizacja noworodka |
| 46 | /CM49 | III | rib | ST- 148 | Pochwa - Ciężarna | Kolonizacja noworodka | |
| 48 | /CM 87 | III | rib | - | ST- 19 | Ucho noworodka | Kolonizacja noworodka |
| 49 | /CM 3 | IV | epsiton | Pochwa - Ciężarna | Kolonizacja noworodka | ||
| 51 | /D156 | V | epsiton | - | - | Pochwa | Stan zapalny |
| 58 | /104112 | III | alp2 | - | - | ATCC | Szczep referencyjny |
| 59 | /2134 | II | rib | - | - | DSM | Szczep referencyjny |
| 60 | /10511 | V | rib | - | - | ATCC | Szczep referencyjny |
PL 231 394 B1
Szczepy S. agalactiae hodowano na podłożu stałym BHI w warunkach tlenowych przez 24 h w temperaturze 37°C. Masa komórkowa po żwirowaniu zawieszana była w PBS do stężenia A600 = 1.0. Po żwirowaniu osad zawieszano w buforze Tris (60 mM, pH 6.8) zawierającym 2% SDS. Następnie próbki sonifikowano przez 5 minut. Uzyskany po wirowaniu supernatant białkowy precypitowano 3 obj. 95% etanolu przez noc w 4°C. Próbki żwirowano i osad rozpuszczono w wodzie. Metodą BCA (ang. Bicinchoninic acid assay) [7] określono stężenie wyizolowanych białek.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS wg Laemmli'ego [8]
Rozdział elektroforetyczny białek prowadzono, wg metody opisanej przez Laemmli'ego (1970) [7] w żelu 5% zagęszczającym i 12,5% żelu rozdzielającym, w buforze elektrodowym pH 8,6. Próby (10 μg) przed naniesieniem na żel (objętość maksymalna 10 pil) denaturowano 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Rozdział białek prowadzono ok. 80 minut, początkowo przy natężeniu prądu 10 mA na każdą płytkę o wymiarach 83 x 73 x 0,75 mm, a po wejściu w żel zagęszczający 20 mA. Elektroforezę prowadzono w zestawie do elektroforezy firmy Bio-Rad model Mini PROTEAN® 3 cell. Po zakończeniu elektroforezy żele barwiono 30 minut w 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 w 40% (v/v) metanolu i 10% (v/v) kwasie octowym.
Immunobloting [9]
Żel po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS przeniesiono do buforu Tris/Gly z 10% (v/v) metanolem o pH 8,3 (bufor do transferu) na 15 minut. Membranę, Immobilon-P (PVDF firmy Millipore), moczono 15 sekund w 100% MeOH, 2 minuty w wodzie mili Q i 2 minuty w buforze do transferu. Transfer prowadzono 1 h, przy napięciu 100 V z użyciem zestawu firmy Bio-Rad. Membranę po transferze barwiono w Ponceau S, a następnie nadmiar barwnika odbarwiono w wodzie mili Q. Immunobloting prowadzono z białkami związanymi na hydrofobowej membranie Immobilon-P. Wolne miejsca na membranie blokowano 1% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze Tris/HCl pH 7,5 z dodatkiem 50 mM NaCl i 0,05% (v/v) Tween 20 (bufor TBS-T) przez 1 godzinę w 37°C. Nadmiar BSA odpłukiwano TBS-T, 1 x przez 15 minut i 2 razy po 5 minut. Następnie prowadzono reakcję z 24 ludzkimi surowicami (w tym: 16 surowic pochodziło od kobiet ciężarnych z nosicielstwem GBS oraz od pacjentek z zakażeniem; 8 surowic stanowiło kontrolę i pochodziło od kobiet ciężarnych nie będących nosicielkami GBS), rozcieńczonymi w zakresie 500-10000 razy w TBS-T z 1% BSA, przez 2 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Nadmiar niezwiązanych przeciwciał płukano TBS-T.
Następnym etapem eksperymentu była reakcja z przeciwciałami znakowanymi enzymem - alkaliczną fosfatazą - w TBS-T, przez 1 godzinę w 37°C z dodatkiem 5% (v/v) surowicy koziej. Nadmiar koniugatu odpłukano TBS-T (1 x 15minut, 4 razy po 5 minut). Obraz wywoływano stosując substraty dla alkalicznej fosfatazy: NBT (nitrotetrazol), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indozylofosforan) w buforze TBS z dodatkiem jonów Mg2+, pH 9,5. Po uzyskaniu obrazu (po około 1 5-20 sekundach) przerywano reakcję przenosząc membranę do wody mili Q.
Wyniki
W wyniku przeprowadzonych eksperymentów uzyskano obraz białek immunogennych szczepów
S. agalactiae. Obrazy reaktywnych białek badanych szczepów różniły się pomiędzy sobą, a bliższa analiza ukazała korelację pomiędzy materiałem klinicznym i rodzajem objawów klinicznych z których był izolowany dany szczep, a reaktywnością z surowicami. Stwierdzono, iż wszystkie szczepy wyizolowane z moczu noworodków (14, 15, 18, 21,27, 47, 54, 55, 56, 57) oraz z moczu dorosłych pacjentów (305167, 309192, d11, d12, d88, d96, d122, d147, d165) produkują białka w zakresie 35-50 kDa reagujące ze wszystkimi badanymi surowicami pochodzącymi od kobiet z nosicielstwem GBS oraz z zakażeniem, zaś nie reagującymi z surowicami z grupy kontrolnej.
Poniżej przedstawiono wyniki testu immunologicznego reakcji przeciwciał surowicy ludzkiej uzyskanej od ciężarnej kobiety z zakażeniem GBS (próbka numer SB8) z białkami szczepów S. agalactiae z uwzględnieniem podziału na grupy badane izolowanych (Ryc. 2).
Białka w zakresie 35-50 kDa wykazywały reaktywność z przeciwciałami w surowicach pacjentów z zakażeniami S. agalactiae, natomiast nie reagowały z surowicami otrzymanymi od zdrowych pacjentek nie będących nosicielkami GBS. Wytypowane białka reagowały specyficznie i mogą być wykorzystywane w testach immunologicznych, takich jak Immunobloting, ELISA, dot-ElA, do detekcji zakażeń S. agalactiae.
Wyizolowano opisane powyżej białka i ustalono ich sekwencje aminokwasowe. Zidentyfikowane w ten sposób wysoce immunoreaktywne sekwencje aminokwasowe należące do białek szczepów
PL 231 394 B1
Streptococcus agalactiae zostały przedstawione w załączonym wykazie sekwencji jako Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 2, Sekw. Nr 3 oraz Sekw. Nr 4.
P r z y k ł a d 2.
Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae
Przykładowa realizacja sposobu według wynalazku obejmuje następujące etap y:
a) Gotowe membrany PVDP o grubości 0.45 μm zawierające rozdzielone sekwencje immunoreaktywne białek szczepów Streptococcus agalactiae według wynalazku namacza się w metanolu, odpłukuje i poddaje reakcji blokowania wolnych miejsc przy użyciu czynnika blokującego, korzystnie 0.5-5.0% BSA w buforze fosforanowym. Przy czym, membranę uzyskuje się poprzez wykonanie transferu rozdzielonych sekwencji białek GBS z żelu poliakrylamidowego, najkorzystniej 7,5-15%, suszy i przechowuje w ciemności.
b) Przygotowaną membranę PVDP inkubuje się z surowicą ludzką rozcieńczoną 500-10000 razy, inkubuje na kołysce w 37°C przez 1 godzinę, odmywa się nadmiar przeciwciał przy użyciu buforu fosforanowego z detergentem, korzystnie z Tween-20 w stężeniu 0.01-0.5%.
c) Wykonuje się reakcję sekwencji immunoreaktywnych na membranie PVDP z koniugatem przeciwciał anty-ludzkie IgG z zasadową fosfatazą w rozcieńczeniu 500-10000 razy na kołysce w 37°C przez 1 godzinę, nadmiar koniugatu odmywa się przy użyciu buforu fosforanowego z Tween-20.
d) Wizualizacja testu przy użyciu substratów dla zasadowej fosfatazy. Piśmiennictwo:
1. Schrag S, i inni. Prevention of perinatal group B streptococcal disease. Revised guidelines from CDC. MMWR 2002; 15: 1 -22.
2. Verani J, i inni. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease. Revised Guidelines from CDC, 2010. MMWR 2010; 59: 1-32.
3. Rodriguez-Granger J, i inni. Prevention of group B streptococcal neonatal disease revisited. The DEVANI European project. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 2097-104.
4. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 września 2010 r. Załącznik do rozporządzenia Standardy postępowania oraz procedury medyczne przy udzielaniu świadczeń zdrowotnych z zakresu opieki okołoporodowej sprawowanej nad kobietą w okresie fizjologicznej ciąż y, fizjologicznego porodu, połogu oraz opieki nad noworodkiem. 2010; 1-27.
5. Kotarski J, i inni. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków. Ginekol Pol 2008; 79: 221-3.
6. Edwards MS, Baker CJ. Group B Streptococcal infections in elderly adults. Clin Infect Dis 2005;41: 839-847.
7. Smith PK, i inni. Measurement of protein using bincichoninic acid. Anal. Biochem. 1985; 150: 76-85.
8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-5.
9. Towbin., T. Staechelin., J. Gordon; Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to ultracellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979; 4350-4354.
PL 231 394 Β1
Wykaz sekwencji
Sekw. Nr 1
MSTSFENKAT NRGIITFTIS QDEIKPALDQ AFNKVKKDLN VPGFRKGHMP RTVFNQKFGE EALYENALNL VLPKAYEAAV AELGLDVVAQ PKIDWSMEK GQDWKLTAEV VTKPEVKLGD YKDLSVEVDA SKEVSDEEVD AKVERERNNL AELTVKDGEA AQGDTVVIDF VGSVDGVEFD GGKGDNFSLE LGSGQFIPGF EEQLVGSKAG QTVDVNVTFP EDYQAEDLAG KDAKFVTTIH EVKTKEVPAL DDELAKDIDD EVETLDELKA KYRKELESAK EIAFDDAVEG AAIELAVANA EIVELPEEMV HDEVHRAMNE FMGNMQRQGI SPEMYFQLTG TTEEDLHKQY QADADKRVKT NLVIEAIAAA EGFEATDEEI EKEITDLASE YNMEADQVRG LLSADMLKHD IAMKKAVDVI TSSATVK
Sekw. Nr 2
| MSIITDVYAR | EVLDSRGNPT LEVEVYTESG AFGRGMVPSG ASTGEHEAVE |
| LRDGDKSRYG | GLGTQKAVDN VNNVIAEAII GYDVRDQQAI DRAMIALDGT |
| PNKGKLGANA | ILGVSIAVAR AAADYLEVPL YSYLGGFNTK VLPTPMMNII |
| NGGSHSDAPI | AFQEFMIMPV GAPTFKEALR WGAEVFHALK KILKERGLET |
| AVGDEGGFAP | KFEGTEDGVE TILKAIEAAG YEAGENGIMI GFDCASSEFY |
| DAERKVYDYG | KFEGEGGAVR TAAEQIDYLE ELVNKYPIIT IEDGMDENDW |
| DGWKALTERL | GGRVQLVGDD FFVTNTDYLA RGIKEEAANS ILIKVNQIGT |
| LTETFEAIEM | AKEAGYTAW SHRSGETEDS TIADIAVATN AGQIKTGSLS |
| RTDRIAKYNQ | LLRIEDQLGE VAQYKGIKSF YNLKK |
Sekw. Nr 3
MAYKTIYPYT NEVLHEFDNI SDSDLEQSLD IAHALYKTWR KEDNVEERQN QLHKVADLLR KDRDKYAEVM TKDMGKLFTE AQGEVDLCAD IADYYADNGQ KFLKPVPLES PNGEAYYLKQ AVGVLLAVEP WNFPFYQIMR VFAPNFIVGN TMLLKHASIC PASAQAFEDL VREAGAPEGA FKNIFASYDQ VSNLISDPRV AGVCLTGSER GGASIAAEAG KNLKKSSMEL GGNDAFLILD DADFDLLSKT IFFARLYNAG QVCTSSKRFI VMADKYDEFV NMWETFKSA KWGDPMDSET TLAPLSSAGA KDDVLKQIKL AVDHGAEVVF GNDTIDHPGN FVMPTVLTNI TKANPIYNGE IFGPVASIYK VDTEEEAIAL ANDSSYGLGS TVFSSDPEHA KKVAAQIETG MTFINSGWTS LPELPFGGIK NSGYGRELSQ LGFDAFVNEH LVFTPNSD
Sekw. Nr 4
MAKEKYDRSK PHVNIGTIGH VDHGKTTLTA AITTVLARRL PTSVNQPKDY ASIDAAPEER ERGITINTAH VEYETEKRHY AHIDAPGHAD YVKNMITGAA QMDGAILWA STDGPMPQTR EHILLSRQVG VKHLIVFMNK VDLVDDEELL ELVEMEIRDL LSEYDFPGDD LPVIQGSALK ALEGDEKYED IIMELMSTVD EYIPEPERDT DKPLLLPVED VFSITGRGTV ASGRIDRGTV RVNDEVEIVG IKEDIQKAVV TGVEMFRKQL DEGLAGDNVG VLLRGVQRDE IERGQVLAKP GSINPHTRFK GEVYILSKEE GGRHTPFFNN YRPQFYFRTT DVTGSIELPA GTEMVMPGDN VTIEVELIHP IAVEQGTTFS IREGGRTVGS GIVSEIEA
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw, Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów do wykrywania zakażenia szczepem Streptococcus agalactiae.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że białko zostało wyizolowane ze szczepu Streptococcus agalactiae pochodzącego z próbki krwi, moczu, wymazu z pochwy, odbytu, ucha, jamy ustnej, treści oskrzelowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego pobranej od pacjenta zakażonego tym patogenem.
- 3. Sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae, znamienny tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność białka zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 oraz zawartych w nich epitopów lub przeciwciał specyficznych wobec tego białka, przy czym obecność tego białka lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA.
- 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500-10000 razy.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL404498A PL231394B1 (pl) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
| US14/900,620 US10048263B2 (en) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | Diagnostic test of Streptococcus agalactiae infections |
| PL14722388T PL3014276T3 (pl) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
| PCT/PL2014/050018 WO2014209142A1 (en) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | A diagnostic test of streptococcus agalactiae infections |
| ES14722388.7T ES2685833T3 (es) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | Una prueba diagnóstica de infecciones por Streptococcus agalactiae |
| EP14722388.7A EP3014276B1 (en) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | A diagnostic test of streptococcus agalactiae infections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL404498A PL231394B1 (pl) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL404498A1 PL404498A1 (pl) | 2015-01-05 |
| PL231394B1 true PL231394B1 (pl) | 2019-02-28 |
Family
ID=50680094
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL404498A PL231394B1 (pl) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
| PL14722388T PL3014276T3 (pl) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL14722388T PL3014276T3 (pl) | 2013-06-28 | 2014-03-28 | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10048263B2 (pl) |
| EP (1) | EP3014276B1 (pl) |
| ES (1) | ES2685833T3 (pl) |
| PL (2) | PL231394B1 (pl) |
| WO (1) | WO2014209142A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL239045B1 (pl) | 2018-01-09 | 2021-11-02 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk | Epitop specyficzny dla zakaźnych Streptococcus agalactiae oraz sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6245335B1 (en) * | 1996-05-01 | 2001-06-12 | The Rockefeller University | Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines |
| US7939087B2 (en) * | 2000-10-27 | 2011-05-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B |
| AU2002351623A1 (en) | 2001-12-20 | 2003-07-09 | Shire Biochem Inc. | Streptococcus antigens |
| US20040009574A1 (en) | 2002-07-09 | 2004-01-15 | Nanibhushan Dattagupta | Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae capsular polysaccharide synthesis genes |
| DK2054431T3 (da) | 2006-06-09 | 2012-01-02 | Novartis Ag | Konformere af bakterielle adhæsiner |
| WO2009122388A1 (en) | 2008-03-31 | 2009-10-08 | National University Of Ireland, Galway | A method for the detection of group b streptococcus (gbs) (streptococcus agalactiae) in mammals |
-
2013
- 2013-06-28 PL PL404498A patent/PL231394B1/pl unknown
-
2014
- 2014-03-28 ES ES14722388.7T patent/ES2685833T3/es active Active
- 2014-03-28 EP EP14722388.7A patent/EP3014276B1/en active Active
- 2014-03-28 US US14/900,620 patent/US10048263B2/en active Active
- 2014-03-28 WO PCT/PL2014/050018 patent/WO2014209142A1/en not_active Ceased
- 2014-03-28 PL PL14722388T patent/PL3014276T3/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2685833T3 (es) | 2018-10-11 |
| US10048263B2 (en) | 2018-08-14 |
| US20160377613A1 (en) | 2016-12-29 |
| PL404498A1 (pl) | 2015-01-05 |
| EP3014276A1 (en) | 2016-05-04 |
| WO2014209142A1 (en) | 2014-12-31 |
| PL3014276T3 (pl) | 2019-01-31 |
| EP3014276B1 (en) | 2018-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12203934B2 (en) | Method of detecting Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection | |
| CN102253204A (zh) | 利用hbha来检测肺结核和由结核分枝杆菌引起的感染 | |
| CN103059109B (zh) | 一种肺炎支原体抗原、制备方法以及免疫检测试剂盒 | |
| Natarajaseenivasan et al. | Leptospiral proteins expressed during acute & convalescent phases of human leptospirosis | |
| PL231394B1 (pl) | Test diagnostyczny zakażeń Streptococcus agalactiae | |
| JPH08502720A (ja) | ネコ引っ掻き病および細菌性血管腫症の診断のための方法および組成物 | |
| EP1240519B1 (en) | Compositions and methods for detecting treponema pallidum | |
| EP0737313B1 (en) | Marker for pathologies comprising an auto-immune reaction and/or for inflammatory diseases | |
| CN108802368A (zh) | 一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒 | |
| CN102010468B (zh) | 一种弓形虫循环抗原双抗夹心elisa检测方法 | |
| ES2700507T3 (es) | Método para la detección de una infección por salmonela | |
| JP5351367B2 (ja) | クラミジア・トラコマチス検出用抗体 | |
| EP4058469A1 (en) | New serological marker for the latent form of toxoplasmosis | |
| JP2002539819A (ja) | ウィップル病の診断 | |
| KR102695056B1 (ko) | 잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물 | |
| JP4763149B2 (ja) | ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法 | |
| KR100421539B1 (ko) | 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이의 편모 성분인ＦＩａＢ 유전자의 재조합 항원 단백질 및 그를 이용한진단키트 | |
| Gupta et al. | KatG protein: A novel marker for differential diagnosis of Myobacterium avium complex infection | |
| CN101363855A (zh) | 一种钩端螺旋体属特异性抗体胶体金快速检测试纸条 | |
| JP2000197483A (ja) | ＲｅｃＱＤＮＡヘリカ―ゼファミリ―遺伝子の変異に起因する疾患の検査方法 | |
| ITRM960805A1 (it) | Peptidi sintetici immunodominanti della proteina caga di helicobacter pylori e loro impiego per la realizzazione di diagnostici e vaccini | |
| CN101302250A (zh) | 重组胎儿弯杆菌n端表面膜蛋白及其编码基因和应用 | |
| JPWO1996007910A1 (ja) | クラミジア感染症の診断薬 |