JP4383858B2

JP4383858B2 - スブチラーゼ変異型

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Publication number: JP4383858B2
Application number: JP2003512361A
Authority: JP
Inventors: セイエルスガ−ルトファンエー，ティナ; デルオステン，クラウスボン; カッペンクリューガー，マレネ; ネーレガールト−マドセン，マズ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: US8569035B2; US20150024990A1; US20040197894A1; DK200101090A; US20130225466A1; WO2003006602A2; US10351837B2; EP1409659B1; NZ541095A; JP2004537994A; NZ530237A; CN1537163A; AU2002316816A1; US20170096654A1; US9528100B2; US20080167213A1; WO2003006602A3; ATE409744T1; EP1409659A2; ZA200309666B

Description

本発明は、下記の性質を包含する1または2以上の性質において親スブチラーゼに関して変更を示す新規なスブチラーゼ変異型に関する：洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性または触媒活性。本発明の変異型は、例えば、クリーニングまたは洗浄剤組成物、例えば、洗濯洗浄剤組成物および自動皿洗浄組成物を包含する皿洗浄組成物において使用するために適当である。また、本発明は、変異型をコードする単離されたDNA配列、発現ベクター、宿主細胞、および本発明の変異型を産生する方法および使用する方法に関する。さらに、本発明は、本発明の変異型を含んでなるクリーニングおよび洗浄剤組成物に関する。

洗浄剤産業において、酵素は30年よりも長い間洗浄配合物において利用されてきている。このような配合物において使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ならびに他の酵素、またはそれらの混合物を含んでなる。商業的に重要な酵素はプロテアーゼである。
増加する数の商業的に使用されているプロテアーゼは、天然に存在する野生型プロテアーゼのタンパク質操作された変異型、例えば、DURAZYM^TM (Novo Nordisk A／S) 、RELASE^TM (Novo Nordisk A／S) 、MAXAPEM^TM (Gist−Brocades N. V.) 、PURAFECT^TM (Genencor International, Ic.) である。

さらに、多数のプロテアーゼ変異型がこの分野においてに記載されている。先行技術のプロテアーゼ変異型の完全なリストはWO 99／27082に記載されている。
しかしながら、多数の有用なプロテアーゼ変異型が記載されてきているが、多数の産業上の使用、例えば、洗濯または硬質表面のクリーニングのために新しい改良されたプロテアーゼまたはプロテアーゼ変異型がなお必要とされている。
したがって、本発明の目的は、このような目的のために改良されたスブチラーゼ変異型を提供することである。

こうして、第1の面において、本発明は、下記の変更の少なくとも1または2以上を含んでなるスブチラーゼ変異型に関する：
X11 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X30 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X31 { R、N、D、Q、E、H、K、M、P、W、Y } 、欠失、挿入；
X32 {A、R、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V } 、挿入；
X34 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失；
X65 { A、R、C、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X66 { A、R、C、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X67 { A、R、N、Q、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V }；
X68 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X69 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X70G；
X71T；
X77N;
X83G、挿入；
X84V；
X85 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V }；
X90 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X95 { R、K、F、W、Y、V } 、欠失；

X107I；
X110G、挿入；
X121V、挿入；
X122 挿入；
X123N；
X125S；
X150 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X152 { A、R、N、D、Q、E、H、K、F、P、W、Y、V }；
X153 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V }；
X154 { A、R、G、H、I、L、M、F、W、Y、V }；
X164 { A、R、H、T、W }；
X165 { R、L、F、W、Y }；
X166 { W、Y } 、挿入；
X175 { R、N、D、Q、E、G、H、K、M、F、P、T、W、Y、V }；
X177 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X178 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X180 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X199 { R、L、K、F、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X200 { A、R、I、L、K、M、F、W、Y、V } 、欠失、挿入；

X201 { A、R、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X202 { A、R、C、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V }；
X207 { A、R、N、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V }；
X220T、挿入；
X223A、挿入；
X225P、挿入；
X226H、挿入；
X227V、挿入；
X228A、挿入；
X229G、挿入；
X230 挿入；
X231A、挿入；
X253 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X264 { A、R、N、Q、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X266 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
V68A；
M175ML、M175MI
ここで
(a) 1または2以上の変更は、独立して、次のように特定される：
(iv) 異なるアミノ酸で位置を占有するアミノ酸の置換、
(v) 位置を占有するアミノ酸の欠失、または
(vi) 位置を占有するアミノ酸から下流の少なくとも1つの追加のアミノ酸の挿入、
(b) 変異型はプロテアーゼ活性を有する、そして
(c) 各位置は第1図に示すスブチリシンBPN’ のアミノ酸配列の位置に対応する。

第2の面において、本発明は、本発明のスブチラーゼ変異型をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
第3の面において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。
第4の面において、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に関する。
第5の面において、本発明は、本発明によるスブチラーゼ変異型を産生する方法に関し、ここで変異型の発現および分泌を促進する条件下に本発明による宿主を培養し、そして変異型を回収する。
第6の面において、本発明は、本発明の変異型を含んでなるクリーニングまたは洗浄剤組成物、好ましくは洗濯または皿洗浄組成物に関する。

アラインメントおよびナンバリングに関しては、第1図を参照のこと。第1図はスブチリシンBPN’ (a) (BASBPN) とスブチリシン309 (BLSAVI) (b) との間のアラインメントを示す。
このアラインメントは、この特許出願に関して、残基のナンバリングの参照として使用される。

定義
本発明をさらに詳細に説明する前に、下記の用語およびコンベンションを最初に定義する。
アミノ酸の命名法
表1：アミノ酸の略号
A ＝ Ala ＝アラニン
V ＝ Val ＝バリン
L ＝ Leu ＝ロイシン
I ＝ Ile ＝イソロイシン
P ＝ Pro ＝プロリン
F ＝ Phe ＝フェニルアラニン
W ＝ Trp ＝トリプトファン
M ＝ Met ＝メチオニン
G ＝ Gly ＝グリシン
S ＝ Ser ＝セリン
T ＝ Thr ＝トレオニン
C ＝ Cys ＝システイン
Y ＝ Tyr ＝チロシン
N ＝ Asn ＝アスパラギン
Q ＝ Gln ＝グルタミン
D ＝ Asp ＝アスパラギン酸
E ＝ Glu ＝グルタミン酸
K ＝ Lys ＝リシン
R ＝ Arg ＝アルギニン
H ＝ His ＝ヒスチジン
X ＝ Xaa ＝任意のアミノ酸

核酸の命名法
A ＝アデニン
G ＝グアニン
C ＝シトシン
T ＝チミン (DNAにおいてのみ)
U ＝ウラシル (RANにおいてのみ)

変異型の表示のための命名法およびコンベンション
本発明に従い製造されるか、あるいは意図される変異型スブチラーゼ酵素の記載において、参照を容易にするために下記の命名法およびコンベンションを採用した。
まず単離されたまたは親酵素をスブチリシンBPN’ (BASBPN) と整列させることによって、参照フレームを定める。
下記のパラメーターを使用して変異型に番号をつけるためにGCGパッケージバージョン9.1のGAPルーチンにより、アラインメントを得ることができる：ギャップをつくるペナルティー＝8およびギャップエクステンションペナルティー＝8およびすべての他のパラメーターはそれらのデフォルト値に保持する。

他の方法は、スブチラーゼ間の既知の認識されたアラインメント、例えば、WO 91／00345の中に示されているアラインメントである。ほとんどの場合において、差は重要性をもたない。
これにより、多数の欠失および挿入がBASBPN (配列番号3) に関して規定されるであろう。第1図において、スブチリシン309 (配列番号4) はBASBPNに比較して位置36、58、158、162、163、および164に6つの欠失を有する。これらの欠失は第1図において星印 (*) で示されている。

一般に、親酵素において実行された種々の修飾は次のように3つの因子を使用して示される。
もとのアミノ酸位置置換アミノ酸
こうして、記号G195Eは、位置195におけるグリシンのグルタミン酸による置換を意味する。

もとのアミノ酸残基が任意のアミノ酸残基である場合において、位置および置換アミノ酸のみを示すために、簡略な記号法を時々使用であることがある。
位置置換アミノ酸
このような記号法は、相同的スブチラーゼにおける1または2以上の修飾に特に関係する (下文参照) 。

同様に、1または2以上の置換するアミノ酸残基の同一性が重要でないとき：
もとのアミノ酸位置
1または2以上のもとのアミノ酸および1または2以上の置換アミノ酸の両方が任意のアミノ酸を含んでなることができるとき、位置のみを示す、例えば、170。

1または2以上のもとのアミノ酸および／または1または2以上の置換アミノ酸の両方がすべてのアミノ酸ではなく、2以上を含んでなることができるとき、選択されたアミノ酸は括弧内に示す：
もとのアミノ酸位置 {置換アミノ酸 ₁ ．．．．置換アミノ酸 _n }
特定の変異型について、Xaaおよびxを包含する、特定の3または1文字コードを使用して任意のアミノ酸残基を示す。

置換：
位置195におけるグルタミン酸によるグリシンの置換は次のように表示される：
Gly195Glu または G195E
または位置195における任意のアミノ酸によるグリシンの置換は次のように表示される：
Gly195Xaa または G195X
または
Gly195 または G195
こうして、位置170におけるセリンによる任意のアミノ酸の置換は次のように表示される：
Xaa170Ser または X170S
または
170Ser または 170S

このような記号法は特に相同的スブチラーゼにおける1または2以上の修飾に関係する (下文参照) 。こうして、170Serは、例えば、BASBPNにおけるLys170Ser修飾およびBLSAVIにおけるArg170Ser修飾の両方を含んでなることを意味する (第1図参照) 。
1または2以上のもとのアミノ酸および／または1または2以上の置換アミノ酸の両方がすべてのアミノ酸ではなく、2以上を含んでなることができるとき、位置170におけるグリシン、アラニン、セリンまたはトレオニンによるアルギニンの置換は次のように示され：
Arg170 { Gly、Ala、Ser、Thr } または R170 { G、A、S、T }
下記の変異型を示す：
R170G、R170A、R170S、およびR170T。

欠失：
位置195におけるグリシンの欠失は次のように示されるであろう：
Gly195* または G195*
相応して、1または2以上のアミノ酸残基の欠失、例えば、位置195および196におけるグリシンおよびロイシンの欠失は次のように表示されるであろう：
Gly195*＋Leu196* または G195*＋L196*

挿入：
追加のアミノ酸残基の挿入、例えば、G195後におけるリシンの挿入は次のように表示される：
Gly195GlyLys または G195GK
または、2以上のアミノ酸残基が挿入されるとき、例えば、G195後にLysおよびAlaが挿入されるとき、これは次のように示されるであろう：
Gly195GlyLysAla または G195GKA

このような場合において、挿入された1または2以上のアミノ酸残基は、挿入された1または2以上のアミノ酸残基の前におけるアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって番号をつけられる。上記例において、配列194〜196は次の通りであろう：
194 195 196
BLSAVI A - G - L
194 195 195a 195b 196
変異型 A - G - K - A - L (配列番号1)

現存するアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名のデジェネラシーが生ずることが明らかである。例えば、上記例においてグリシン後にグリシンが挿入される場合、これはG195GGにより示されるであろう。同一の実際の変化は、
194 195 196
BLSAVI A - G - L
から
194 195 195a 196
変異型 A - G - G - L (配列番号2)
194 194a 195 196
への変化についてA194AGとちょうど同様に示されるであろう。
このような例は当業者にとって明らかであり、そして表示G195GGおよびこの型の挿入についての対応する表示はこうしてこのような同等のデジェネレイト表示を含んでなることを意味する。

ギャップの充填：
ナンバリングに使用したスブチリシンBPN’ 配列との参照比較において、酵素中に欠失が存在する場合、このような位置における挿入は、位置36におけるアスパラギン酸の挿入について、次のように示される：
*36Asp または *36D

多重修飾：
多重修飾を含んでなる変異型は、例えば、次のようにプラスにより分離される：
Arg170Tyr＋Gly195Glu または R170Y＋G195E
これらはチロシンおよびグルタミン酸によりそれぞれアルギニンまたはグリシンが置換されている位置170および195における修飾を示す。

こうして、Tyr167 { Gly、Ala、Ser、Thr } ＋Arg170 { Gly、Ala、Ser、Thr } は下記の変異型を表示する：
Tyr167Gly＋Arg170Gly、 Tyr167Gly＋Arg170Ala、
Tyr167Gly＋Arg170Ser、 Tyr167Gly＋Arg170Thr、
Tyr167Ala＋Arg170Gly、 Tyr167Ala＋Arg170Ala、
Tyr167Ala＋Arg170Ser、 Tyr167Ala＋Arg170Thr、
Tyr167Ser＋Arg170Gly、 Tyr167Ser＋Arg170Ala、
Tyr167Ser＋Arg170Ser、 Tyr167Ser＋Arg170Thr、
Tyr167Thr＋Arg170Gly、 Tyr167Thr＋Arg170Ala、
Tyr167Thr＋Arg170Ser、およびTyr167Thr＋Arg170Thr。

この命名法は、特定の性質を有するアミノ酸残基、例えば、正電荷の残基 (K、R、H) 、負電荷の残基 (D、E) を置換、取替え、挿入または欠失することを目的とする修飾、または、例えば、小さいアミノ酸の他の小さいアミノ酸による置換を意味するTyr167 { Gly、Ala、Ser、Thr }＋Arg170 { Gly、Ala、Ser、Thr } の1または2以上の保存的アミノ酸修飾に特に関係する。それ以上の詳細については節「発明の詳細な説明」参照。

プロテアーゼ
タンパク質基質中のアミド結合を切断する酵素はプロテアーゼ、または (互換的に) ペプチダーゼとして分類される (参照：Walsh、1979、Enzymatic Reaction Mechanisms、W. H. Freeman and Company、San Francisco、Chapter 3) 。

アミノ酸位置／残基のナンバリング
何も述べない場合、本明細書において使用するアミノ酸のナンバリングはスブチラーゼBPN’ (BASBPN) 配列のそれに対応する。BPN’ 配列のそれ以上の説明については第1図または下記の文献を参照のこと：Siezen他、Protein Engng. 4 (1991) 719−737。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、そしてその中の活性部位に必須セリン残基が存在する (White、HandlerおよびSmith、1973、“Principles of Biochemistry”、第5版、McGraw−Hill Book Company、NY、pp. 271−272) 。
細菌のセリンプロテアーゼは20,000〜45,000ダルトンの範囲の分子量を有する。それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは簡単な末端エステルを加水分解し、活性がまたセリンプロテアーゼである真核生物のキモトリプシンに類似する。サブグループをカバーする、より狭い意味の用語「アルカリ性プロテアーゼ」は、セリンプロテアーゼのあるものの高い最適pH値、pH 9.0〜11.0を反映する (概観については、下記の文献を参照のこと：Priest (1997) Bacteriological Rev. 41、711−753) 。

スブチラーゼ
仮にスブチラーゼと表示したセリンプロテアーゼのサブグループは、Siezen他、Protein Engng. 4 (1991) 719−737およびSiezen他、Protein Science 6 (1997) 501−523により提案された。それらは、以前にスブチリシン様プロテアーゼと呼んだセリンプロテアーゼの170より多いアミノ酸配列の相同性解析により規定される。スブチリシンは以前にグラム陽性細菌または真菌により産生されるセリンプロテアーゼとしてしばしば規定され、そしてSiezen他に従うと現在においてスブチラーゼのサブグループである。広範な種類のスブチラーゼが同定されてきており、そして多数のスブチラーゼのアミノ酸配列が決定されてきている。このようなスブチラーゼのいっそう詳細な説明およびそれらのアミノ酸配列の参照はSiezen他 (1997) に記載されている。

スブチラーゼの1つのサブグループ、I−S1または「真の」スブチリシンは、「古典的」スブチリシン、例えば、スブチリシン168 (BSS168) 、スブチリシンBPN’ 、スブチリシンCarlsberg (ALCALASE^TM、NOVOZYMES A/S) 、およびスブチリシンDY (BSSDY) を含んでなる。
スブチラーゼの他のサブグループ、I−S2または高いアルカリ性のスブチリシンはSiezen他 (前掲) により認識されている。サブグループI−S2プロテアーゼは高いアルカリ性のスブチリシンとして記載され、そして酵素、例えば、スブチリシンPB92 (BAALKP) (MAXACL^TM、Gist−Brocades NV) 、スブチリシン309 (SAVINASE^TM、NOVOZYMES A／S) 、スブチリシン147 (BLS147) (ESPERASE^TM、NOVOZYMES A／S) 、およびアルカリ性エラスターゼYaB (BSEYAB) を含んでなる。

“SAVINASE ^TM ”
SAVINASE^TMはNOVOZYMES A／Sにより市販されている。それはバシラス・レンツス (B. lentus) からのスブチリシン309であり、そして1つの位置においてのみBAALKPと異なる (N87S、ここにおいて第1図参照) 。SAVINASE^TMは第1図においてb) に表示するアミノ酸配列を有する。

親スブチラーゼ
用語「親スブチラーゼ」は、Siezen他 (1991および1997) に従い規定されたスブチラーゼを意味する。それ以上の詳細については、直ぐ上の「スブチラーゼ」の記載を参照のこと。また、親スブチラーゼは天然源から単離されたスブチラーゼであることができ、ここでスブチラーゼの特性を保持するように、引き続いて修飾を行うことができる。さらに、親スブチラーゼは、また、DNAシャフリング技術により、例えば、J. E. Ness他、Nature Biotechnology 17、893−896 (1999) に記載されているように調製されたスブチラーゼであることができる。選択的に、用語「親スブチラーゼ」は「野生型スブチラーゼ」と命名することができる。

参照のため、本明細書に記載する種々のスブチラーゼの頭文字の表を、それ以上の頭文字について、提供する、下記の文献を参照のこと：Siezen他、Protein Engng. 4 (1991) 719−737およびSiezen他、Protein Science 6 (1997) 501−523。

本明細書において使用する用語「1または2以上の修飾」は、スブチラーゼの化学的修飾ならびにスブチラーゼをコードするDNAの遺伝的修飾を包含することを規定する。1または2以上の修飾は、1または2以上のアミノ酸側鎖の1または2以上の取替え、問題の1または2以上のアミノ酸中の1または2以上の置換、欠失、および／または挿入であることができる。

スブチラーゼ変異型
本発明の関係において用語「スブチラーゼ変異型」または「突然変異したスブチラーゼ」は、もとのまたは親遺伝子を有しかつ対応する親酵素を産生した親微生物に由来する突然変異体遺伝子を発現する生物により産生されたスブチラーゼを意味し、ここで適当な宿主において発現されるとき、前記突然変異したスブチラーゼプロテアーゼが産生される突然変異体遺伝子を産生するように、親遺伝子は突然変異されている。

相同的スブチラーゼ配列
2つのアミノ酸配列間の相同性は、これに関してパラメーター「同一性」により記載される。
2つのスブチラーゼ間の同一性の程度を決定するために、同一の設定を使用してGCGパッケージバージョン9.1のGAPルーチンを適用させることができる (下を参照) 。ルーチンからの出力は、アミノ酸アラインメントの他に、2つの配列間の「同一性百分率」の計算である。
この記載に基づいて、本発明に従い修飾できる、適当な相同的スブチラーゼを同定することは当業者にとって日常的なことである。

単離されたポリヌクレオチド
用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用するとき、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、こうして他の外部のまたは不必要なコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系内で使用するために適当な形態であることを意味する。このような単離された分子はそれらの天然の環境から分離された分子であり、そしてcDNAおよびゲノムクローンを包含する。本発明の単離されたDNA分子はそれらが通常関連する他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5’ および3’ 非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は当業者にとって明らかであろう (例えば、下記文献を参照のこと、DynanおよびTijan、Nature 316：774−78、1985) 。選択的に、用語「単離されたポリヌクレオチド」は「クローニングされたポリヌクレオチド」と命名することができる。

単離されたタンパク質
タンパク質に適用するとき、用語「単離された」はタンパク質がその天然の環境から除去されていることを示す。
好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に他の相同的タンパク質 (すなわち、「相同的不純物」(下文参照)) を実質的に含まない。
単離されたタンパク質は、SDS−PAGEにより測定して、10％より高い、好ましくは20％より高い、より好ましくは30％より高い純度を有する。さらに、SDS−PAGEにより測定して、高度に精製された形態、すなわち、40％高い、60％より高い、好ましくは80％より高い、より好ましくは95％より高い、最も好ましくは99％より高い純度のタンパク質を提供することが好ましい。
用語「単離されたタンパク質」は、選択的に、「精製されたタンパク質」と命名される。

相同的不純物
用語「相同的不純物」 (homologous impurities) は、本発明のスブチラーゼが本来得られる相同的細胞 (homologous cell) に由来する、いずれかの不純物 (例えば、本発明のスブチラーゼ以外のポリペプチド) を意味する。
から得られた
用語「から得られた」は、特定の微生物源に関して本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドおよび／またはスブチラーゼが特定の源により、またはその源からの遺伝子が挿入されている細胞により産生されていることを意味する。

基質
用語「基質」は、プロテアーゼの基質に関して使用するとき、スブチリシンプロテアーゼによる加水分解に対して感受性である少なくとも1つのペプチド (アミド) 結合を含有する化合物を含んでなるとして、その最も広い形態において解釈すべきである。
生成物
用語「生成物」は、本発明の関係において、プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物に関して使用するとき、スブチラーゼプロテアーゼを含む加水分解反応の生成物を包含すると解釈すべきである。

洗浄性能
本発明の関係において、用語「洗浄性能」は、例えば、洗濯または硬質表面のクリーニング間に、クリーニングすべき物体上に存在するタンパク質または有機の汚れを除去する酵素の能力として使用される。また、本明細書における実施例3中の「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」を参照のこと。

性能係数
用語「性能係数」は、下記式に関して規定される：
P ＝ R_変異型−R_親
ここでPは性能係数であり、R_変異型は「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」に記載されているようにスブチラーゼ変異型で処理した後における試験材料の反射 (460 nmにおいて測定した) であり、そしてR_親は「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」に記載されているように対応する親スブチラーゼで処理した後における試験材料の反射 (460 nmにおいて測定した) である。

発明の詳細な説明
本発明は、下記の性質を包含する1または2以上の性質において親スブチラーゼに関して変更を示す新規なスブチラーゼ変異型に関する：洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性または触媒活性。
本発明の一部分として意図される変異型は、野生型スブチラーゼと比較したとき、下記の位置の少なくとも1または2以上において、1または2以上のアミノ酸残基が置換、欠失または挿入されている変異型である：11、30、31、34、65、66、67、68、69、70、71、77、83、84、85、90、95、107、110、121、122、123、125、150、152、153、154、164、165、166、175、177、178、180、199、200、201、202、207、220、223、225、226、227、228、229、230、231、253、264または266 (BASBPNのナンバリング) 。

第1図に示すSavinase^TM配列において、突然変異すべき位置は下記の位置1または2以上である：V11、V30、L31、D32、G34、G65、T66、H67、V68、A69、G70、T71、N77、G83、V84、A85、L90、V95、I107、G110、V121、A122、N123、S125、V150、A152、S153、G154、*164、*165、*166、M175、V177、G178、T180、V199、A200、P201、G202、S207、T220、A223、P225、H226、V227、A228、G229、A230、A231、T253、G264またはG266。

意図される特定の置換／欠失／挿入は次の通りである：
X11 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X30 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X31 { R、N、D、Q、E、H、K、M、P、W、Y } 、欠失、挿入；
X32 {A、R、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V } 、挿入；
X34 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失；
X65 { A、R、C、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X66 { A、R、C、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X67 { A、R、N、Q、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V }；
X68 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X69 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X70G；
X71T；
X77N;
X83G、挿入；
X84V；
X85 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V }；
X90 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X95 { R、K、F、W、Y、V } 、欠失；

X201 { A、R、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X202 { A、R、C、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V }；
X207 { A、R、N、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V }；
X220T、挿入；
X223A、挿入；
X225P、挿入；
X226H、挿入；
X227V、挿入；
X228A、挿入；
X229G、挿入；
X230 挿入；
X231A、挿入；
X253 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X264 { A、R、N、Q、G、H、I、L、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
X266 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
V68A；
M175ML、M175MI
ここで各位置は第1図に示すスブチリシンBPN’ 中の位置に対応する。

本発明の第1面のスブチラーゼ変異型は、自然から同定され、単離された親または野生型スブチラーゼであることができる。
このような親野生型スブチラーゼは、この分野において知られている標準的技術により特別にスクリーニングすることができる。
これを実施する1つの好ましい方法は、多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス (Bacillus) 株からのスブチラーゼから、問題の保存されたDNA領域を特別にPCRにより増幅することである。

スブチラーゼは、それらのDNAおよびアミノ酸配列が相同的であるという意味において、保存された酵素の1グループである。したがって、問題のポリヌクレオチド配列をフランクする、比較的特異的なプライマーを構築することが可能である。
このようなPCRプライマーを使用して多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス (Bacillus) 株からのDNAを増幅し、次いで増幅されたPCRフラグメントをDNA配列決定することによって、本発明のスブチラーゼ変異型を産生する菌株を同定することが可能であろう。菌株および問題のスブチラーゼの部分的DNA配列が同定されると、このようなスブチラーゼのクローニング、発現および精製を完結することは当業者にとって日常的なことである。

しかしながら、本発明のスブチラーゼ変異型は主として親スブチラーゼの変異型であることが考えられる。
本明細書に記載する使用に適当なサブチラーゼ変異型は、この分野において知られている標準的技術、例えば、位置指定／ランダム突然変異誘発により、または異なるスブチラーゼ配列のDNAシャフリングにより構築することができる。それ以上の詳細については、本明細書における「材料および方法」の節 (下文参照) を参照のこと。
当業者にとって明らかなように、本明細書に記載する変異型は1または2以上のそれ以上の修飾、特に1または2以上のそれ以上の置換を含んでなることができる。

その上、本明細書に記載する変異型はちょうど1より多い位置に突然変異を含むことができる。例えば、本発明による変異型は1位置、2位置または2より多い位置、例えば、3、4または5位置に突然変異を含有することができる。
同様なアミノ酸残基に対する1つのアミノ酸残基のいわゆる保存的置換は酵素の特性において小さい変化のみを生成することは、この分野においてよく知られている。
保護的アミノ酸置換のグループを下記表2に記載する：

この原理に従い、保存的置換を含んでなるスブチラーゼ変異型は、互いに著しく異ならない特性を示すことが期待される。
本明細書において開示および／または例示されたスブチラーゼ変異型に基づいて、同様に改良された洗浄性能を示す他のスブチラーゼ変異型を得るために、これらの変異型に対して1または2以上の適当な保存的修飾を同定することは当業者にとって日常的なことである。

親スブチラーゼはサブグループI−S1およびI−S2、特にサブグループI−S2に属し、両方は自然からまたは多様な人工的創作物からの酵素のサブグループであり、そして親スブチラーゼから変異型を設計し、それを産生するためのサブグループであることが好ましい。
サブグループI−S1からの変異型に関して、BSS168 (BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP) 、BASBPN、BSSDY、BLSCAR (BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3) 、BSSPRC、およびBSSPRD、またはサブグループI−S1の特性を保持するそれらの機能的変異型から成る群から選択される親スブチラーゼを選択することが好ましい。

サブグループI−S2からの変異型に関して、BSAPRQ、BLS147 (BSAPRM、BAH101) 、BLSAVI (BSKSMK、BAALKP、BLSUBL) 、BYSYAB、BAPB92、TVTHER、およびBSAPRS、またはサブグループI−S2の特性を保持するそれらの機能的変異型から成る群から選択される親スブチラーゼを選択することが好ましい。特に、親スブチラーゼはBLSAVI (Savinase^TM、NOVOZYMES A／S) であり、したがって本発明の好ましいスブチラーゼ変異型はSavinase^TMの変異型である。

また、本発明は、前述の任意のスブチラーゼ変異型とそれらのアミノ酸配列に対する任意の他の修飾との組み合わせを包含する。特に、酵素に対して改良された性質を与える、この分野において知られている他の修飾との組み合わせが考えられる。この分野において、異なる改良された性質を有するスブチラーゼ変異型が記載されており、そして多数のスブチラーゼ変異型は本明細書における「発明の背景」の節 (上を見よ) に記載されている。本明細書に記載するスブチラーゼ変異型と好都合に組合わせることができるスブチラーゼ変異型を同定する参照として、それらの参照はここにおいて開示されている。

このような組み合わせは下記の位置を含んでなる：222 (酸化安定性を改良する) 、218 (熱安定性を改良する) 、酵素を安定化するCa²⁺結合部位における置換、例えば、位置796、および先行技術から明らかな多数の他の位置。
他の態様において、本明細書に記載するスブチラーゼ変異型は、下記の任意の位置における1または2以上の修飾と好都合に組合わせることができる：27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252または274。

詳しくは、下記のBLSAVI、BLSUBL、BSKSMK、およびBAALKP修飾は下記の組み合わせに適当であると考えられる：K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252KおよびT274A。

下記の任意の修飾を含んでなるそれ以上の変異型は改良された性質を示す：S101G＋V104N、S87N＋S101G＋V104N、K27R＋V104Y＋N123S＋T274A、N76D＋S103A＋V104IまたはN76D＋V104A、または修飾K27R、N76D、S101G、S103A、V104N、V104N、V104Y、V104I、V104A、N123S、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274Aの組み合わせと前述の任意の1または2以上の修飾との組み合わせ。

特に重要な変異型は、本発明による修飾に加えて、下記の置換を含有する変異型である：S101G＋S103A＋V104I＋G159D＋A232V＋Q236H＋Q245R＋N248D＋N252K。
その上、本発明の1または2以上の主要な面のスブチラーゼ変異型は、好ましくは任意の位置129、131および194における1または2以上の修飾と組合わせる、例えば、129K、131Hおよび194P修飾、最も好ましくはP129K、P131HおよびA194P修飾として組み合わせる。任意のそれらの修飾は、スブチラーゼ変異型の産生においてスブチラーゼ変異型をより高いレベルで発現することが期待される。

さらに、本発明の下記の特定の変異型は重要であると考えられる：
BPN’ (BASBPN) ：
I11V、L
L90I、V
M199* (欠失)
サビナーゼ (BLSAVI) ：
V11I；V11I＋I44V；V11I＋L96LA；S9R＋V11I＋A15T＋T22A；V11I＋L96LA＋A108C＋A138C； V11I＋ N76D＋A194P＋A230V； V11I＋V84I； V11I＋V84I＋K251R； V11I＋V30I； V11I＋V139L； V11I＋V30L；V30I； V30I＋ V84I； V30I＋V139L；S9R＋A15T＋T22A＋V30I； V30I＋V244R； V30I＋K251R；V30I＋V139L＋Y167A＋R170S＋A194P＋N218S；D32A；V68A；V68A＋S106A；V68A＋V139I；V68A＋A158V；V68A＋V203A；V68A＋V139L；A48T＋V68A＋P131M；V51A＋V68A＋S106T＋A168G；V51A＋V68A＋S106T＋A168G；N76D＋M175ML＋A194P＋A230V；N76D＋M175MI＋A194P＋A23OV。

本発明の選択した変異型の洗浄性能を、本明細書中の実施例3に開示されている「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」において試験することができる。「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」を使用して、標準的洗浄剤組成物中に混入したとき、参照系、すなわち、親スブチラーゼ (同一のモデルの洗浄剤系中に混入し、同一条件下に試験した) に比較して、標準的繊維材料からタンパク質の汚れを除去する変異型の能力を評価することができる。この試験を使用して、選択した変異型の洗浄性能を最初に研究し、根本的理由は、試験において、選択した変異型が親スブチラーゼに比較して有意な改良を示さない場合、それ以上の試験的実験を実施することが通常不必要であるということである。

したがって、本明細書に記載する目的に特に重要である変異型は、本明細書中の「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」に記載されているように、下記成分を含んでなるモデルの洗浄剤組成物において試験したとき、同一条件下に試験した親スブチラーゼに比較して、改良された洗浄性能を示す：
6.2％ LAS (Nansa 80S)
2％ C₁₆−C₁₈脂肪酸のナトリウム塩
4％非イオン界面活性剤 (Plurafax LF404)
22％ゼオライトP
10.5％ Na₂CO₃
4％ Na₂Si₂O₅
2% カルボキシメチルセルロース (CMC)
6.8％アクルレート液CP5 40％
20％過臭素酸ナトリウム (実験式NaBO₂・H₂O₂)
0.2％ EDTA
21％ Na₂SO₄
水 (残部)

本明細書における実施例3において規定されているいわゆる「性能係数」を使用することによって、洗浄性能の改良を定量することができる。
本発明の非常に重要な態様において、本発明の変異型は、「洗浄性能試験」において試験したとき、少なくとも1、例えば、少なくとも1.5、例えば、少なくとも2、特に少なくとも2.5、例えば、少なくとも3、例えば、少なくとも3.5、特に少なくとも4、例えば、少なくとも4.5、例えば、少なくとも5の性能係数を有する。
明らかなように、本発明の変異型は、少なくとも記載した最低レベルにおいて、より好ましくは記載した中間レベルにおいて、最も好ましくは記載した最高のレベルにおいて上記基準を満足することが好ましい。

スブチラーゼ変異型の製造
スブチラーゼをクローニングする多数の方法および遺伝子 (例えば、スブチラーゼ遺伝子) 中に置換、欠失または挿入を導入する多数の方法はこの分野においてよく知られている。

一般に、遺伝子をクローニングし、前記遺伝子中に突然変異 (ランダムおよび／または位置指定) を導入する標準的手順を使用して、本発明の変異型を得ることができる。適当な技術のそれ以上の説明については下記を参照のこと：実施例 (下文参照) およびSambrook他 (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Lab. 、Cold Spring Harbor、NY；Ausubel F. M. 他 (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995；Harwood C. R. 、およびCutting S. M. (編者) “Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990、およびWO 96／34946。

さらに、スブチラーゼ変異型は多様な人工的創作物のための標準的技術、例えば、異なるスブチラーゼ遺伝子のDNAシャフリングにより構築することができる (WO 95／22625；Stemmer WPC、Nature 370：389−91 (1994)) 。例えば、天然において同定された1または2以上の部分的スブチラーゼ配列を有するSavinase^TMをコードする遺伝子のDNAシャフリングは、改良された洗浄性能の変異型についてスクリーニングした後、本明細書に記載する目的に対して適当なスブチラーゼ変異型を提供するであろう。

発現ベクター
本発明の酵素をコードするDNA構築物を含んでなる組換えベクターは組換えDNA手順に好都合に付すことができる任意のベクターである。ベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。こうして、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実在物であることができ、その複製は染色体の複製に対して独立であり、例えば、プラスミドである。
選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、それが組込まれた1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。

ベクターは、本発明の酵素をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な追加のセグメントに作用可能に連鎖されている、発現ベクターであることが好ましい。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスのDNAに由来するか、あるいは両方の因子を含有することができる。用語「作用可能に連鎖された」は、セグメントがそれらの意図する目的に対してと共同して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、酵素をコードするDNA配列を通して進行するように、セグメントが配置されていることを意味する。
プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であることができ、宿主細胞に対して相同的または異種的であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。

細菌宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は次の通りである：バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus sterothermophillus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、またはバシラス・プミラス (Bacillus pumillus) キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージラムダP_RまたはP_Lプロモーターまたは大腸菌 (E. coli) lac、trpまたはtacプロモーター。

本発明の酵素をコードするDNA配列を、必要に応じて、適当なターミネーターに作用可能に結合させることができる。
本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを発現させることができるDNA配列をさらに含んでなることができる。
ベクターは、また、選択可能なマーカー、例えば、その産物が宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、または、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびその他のような抗生物質に対する耐性、または重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んでなることができる。

本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル配列 (またリーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られている) を組換えベクターの中に準備ことができる。酵素をコードするDNA配列に正しいリーデイングフレームで分泌シグナル配列を結合する。分泌シグナル配列は酵素をコードするDNA配列に対して5’ に普通に位置決定される。分泌シグナル配列は、通常酵素に関連するものであるか、あるいは他の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。

酵素をコードするDNA配列、プロモーターおよび必要に応じてターミネーターおよび／または分泌シグナル配列を連結するか、あるいはこれらの配列を適当なPCR増幅スキームにより構築し、そして複製または組込みに必要な情報を含有する適当なベクターの中にそれらを挿入するために使用する手順は当業者によく知られている (例えば、下記文献を参照のこと、Sambrook他、前掲)。

宿主細胞
宿主細胞の中に導入される本発明の酵素をコードするDNA分子は、問題の宿主に対して相同的または異種的であることができる。宿主細胞に対して相同的である場合、すなわち、天然の宿主細胞により産生される場合、それは典型的には他のプロモーター配列、あるいは適用可能な場合、その天然の環境以外において他の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作用可能に結合されている。用語「相同的」は、問題の宿主生物に対して自然である酵素をコードするDNA配列を包含することを意図する。用語「異種的」は、自然における宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することを意図する。こうして、DNA配列は他の生物に由来するか、あるいは合成配列であることができる。
本発明のクローニングされたDNA分子が導入された宿主細胞は必要な酵素を産生することができる任意の細胞であることができ、そして細菌、酵母、真菌および植物を包含する高等真核生物の細胞を包含する。

培養時に本発明の酵素を産生することができる細菌細胞の例は次の通りである：グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) の株、例えば、バシラス・サチリス (B. subtilis) 、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) 、バシラス・レンツス (B. lentus) ，バシラス・ブレビス (B. brevis) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) 、バシラス・アルカロフィルス (B. alkalophilus) 、バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens) 、バシラス・コアギュランス (B. coagulans) 、バシラス・サーキュランス (B. circulans) 、バシラス・ラウツス (B. lautus) 、バシラス・メガテリウム (B. megaterium) またはシラス・スリンジェンシス (B. thuringiensis) の株、またはストレプトマイセス (Streptomyces) の株、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (S. lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (S. murinus) の株、またはグラム陰性菌、例えば、大腸菌 (Escherichia coli) 。

細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、接合により、またはそれ自体知られている方法 (例えば、Sambrook他、前掲、参照) においてコンピテント細胞を使用することによって実施することができる。
大腸菌 (E. coli) のような細菌中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に、典型的には不溶性粒体 (封入体として知られている) として保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により周辺腔に向けることができる。前者の場合において、細胞を溶解し、粒体を回収し、変性し、次いで変性剤を希釈することによって酵素をリフォルディングする。後者の場合において、例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより、細胞を崩壊させることによって、周辺腔の内容物を解放し、酵素を回収することによって、酵素を周辺腔から回収することができる。

グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株またはストレプトマイセス (Streptomyces) 株中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により細胞外媒質に向けることができる。後者の場合において、酵素は後述するように媒質から回収することができる。

スブチラーゼ変異型を製造する方法
本発明は、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供し、この方法において、酵素の産生を可能とする条件下に、酵素をコードするDNA配列で形質転換された適当な宿主細胞を培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する。
酵素をコードするDNA配列を含んでなる発現ベクターを異種的宿主細胞の中に形質転換するとき、本発明の酵素の異種的組換え産生が可能である。
これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製されたスブチラーゼ組成物を作ることが可能である。

この関係において、相同的不純物は、本発明の酵素が本来得られる相同的細胞に由来する任意の不純物 (例えば、本発明の酵素以外の他のポリペプチド) を意味する。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用する媒質は、問題の宿主細胞を増殖させるために適当な任意の慣用媒質であることができる。発現されたスブチラーゼを媒質中に好都合に分泌させることができ、既知の手順により媒質から回収することができる。既知の手順は、遠心または濾過による培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩による培地のタンパク質成分の沈降、および引き続くクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他を包含する。

クリーニングおよび洗浄剤組成物
一般に、クリーニングおよび洗浄剤組成物は十分にこの分野において記載されており、そして適当なクリーニングおよび洗浄剤組成物のそれ以上の詳細についてはWO 96／34946、WO 97／07202、WO 95／30011を参照のこと。

洗浄剤組成物
スブチラーゼ変異型を洗浄剤組成物に添加し、こうして洗浄剤組成物の1成分となる。
本発明の洗浄剤組成物は、例えば、手によるまたは機械的洗濯洗浄剤組成物、例えば、汚れた布帛の前処理に適当な洗濯添加剤組成物およびすすぎ添加布帛柔軟剤組成物として配合するか、あるいは一般に家庭の硬質表面クリーニング操作に使用するための洗浄剤として配合するか、あるいは手によるまたは機械的皿洗浄操作のために配合することができる。

特定の面において、本発明は、本発明のスブチラーゼ変異型を含んでなる洗浄剤添加剤を提供する。洗浄剤添加剤ならびに洗浄剤組成物は、1または2以上の他の酵素、例えば、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ、および／またはペルオキシダーゼを含んでなることができる。
一般に、1または2以上の選択した酵素は選択した洗浄剤と適合性 (すなわち、pH最適条件、他の酵素および非酵素成分、およびその他との適合性) であり、そして1または2以上の酵素は有効量で存在すべきである。

プロテアーゼ：適当なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物由来のプロテアーゼを包含する。微生物由来は好ましい。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。プロテアーゼはセリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバシラス (Bacillus) に由来するもの、例えば、スブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147およびスブチリシン168 (WO 89／06279に記載されている) である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン (例えば、ブタまたはウシ由来) およびWO 89／06270に記載されているフザリウム (Fusarium) プロテアーゼである。

有用なプロテアーゼ例は、WO 92／19729、WO 98／20115、およびWO 98／34946に記載されている変異型、特に下記の位置の1または2以上における置換を有する変異型である：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235および274。
好ましい商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は下記のものを包含する：Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、およびKannase^TM (Novozymes A／S) 、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、PN2^TM、およびPN3^TM (Genencor International Inc. ) 。

リパーゼ：適当なリパーゼは、細菌または真菌由来のリパーゼを包含する。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有用なリパーゼの例は次の通りである：フザリウム (Fusarium) (同義語Thermomyces) 、例えば、EP 258 068およびEP 305 216に記載されているフミコラ・ラヌギノサ (H. lanuginosa) (T. lanuginosus) リパーゼまたはWO 96／13580に記載されているフミコラ・インソレンス (H. insolens) 、シュードモナス (Pseudomonas) リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス (P. alcaligenes) またはシュードモナス・シュードアルカリゲネス (P. pseudoalcaligenes) ( EP 218 272) 、シュードモナス・セパシア (P. cepacia) リパーゼ (EP 331 376) 。

シュードモナス・スツゼリ (P. stutzeri) リパーゼ (GB 1,372,034) 、シュードモナス・フルオレッセンス (P. fluorescens) リパーゼ、シュードモナス (Pseudomonas) 種SD 705株リパーゼ (WO 95／06720およびWO 96／27002) 、シュードモナス・ウィスコンシネンシス (P. wisconsinensis) (WO 96／12012) 、バシラス (Bacillus) リパーゼ、例えば、バシラス・サチリス (B. subtilis) リパーゼ (Dartosis他、(1993)、Biochimica et Biophysica Acta 1131：253−360)、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) リパーゼ (JP 64／744992) およびバシラス・プミラス (B. pumillus) リパーゼ (WO 91／16422)。
好ましい商業的に入手可能なリパーゼ酵素は、Lipolase^TMおよびLipolase Ultra^TM (Novozymes A／S) を包含する。

アミラーゼ：適当なアミラーゼ (αおよび／またはβ) は、細菌または真菌由来のリパーゼを包含する。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。アミラーゼは、例えば、GB 1,296,839にいっそう詳細に記載されているバシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) の特別の株から得られるα−アミラーゼを包含する。

有用な酵素の例はWO 94／02597、WO 94／18314、WO 96／23873およびWO 97／43424、特に下記の位置の1または2以上における置換を有する変異型である：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444。
商業的に入手可能なアミラーゼは、Duramly^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TMおよびBAN^TM (Novozymes A／S) およびRapidase^TMおよびPurastar^TM (Genencor International Inc. ) を包含する。

セルラーゼ：適当なセルラーゼは、細菌または真菌由来のリパーゼを包含する。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。セルラーゼは下記のものを包含する：属バシラス (Bacillus) 、シュードモナス (Pseudomonas) 、フミコラ (Humicola) 、フザリウム (Fusarium) 、チエラビア (Thielavia) 、アクレモニウム (Acremonium) からのセルラーゼ、例えば、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) 、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora themophila) およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) から産生される真菌セルラーゼ (米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号およびWO 89／09259に開示されている) 。

特に適当なセルラーゼは色管理利益を有するアルカリ性または中性のセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96／11262、WO 96／29397、WO 98／08940に記載されているセルラーゼである。他の例は、例えば、WO 94／07998、EP 0 531 315、米国特許第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特許第5,763,254号、WO 95／24471、WO 98／12307およびPCT／DK 98／00299に記載されているセルラーゼ変異型である。
商業的に入手可能なセルラーゼは、Celluzyme^TMおよびCarezyme^TM (Novozymes A／S)、Clazinase^TM、およびPuradax HA^TM (Genencor International Inc.) 、およびKAC−500 (B)^TM (Kao Corporation) である。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリヌス (Coprinus) からの、例えば、コプリヌス・シネレウス (C. cinereus) からのペルオキシダーゼ、およびそれらの変異型、WO 93／24618、WO 95／10602、およびWO 98／15257に記載されている変異型を包含する。
商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、Guardzyme^TM (Novozymes A／S) を包含する。

1または2以上の酵素を含有する別々の添加剤の添加により、またはこれらの酵素のすべてを含んでなる組合わせた添加剤の添加により、1または2以上の洗浄剤酵素を洗浄剤組成物に含めることができる。本発明の洗浄剤添加剤、すなわち、別々の添加剤または組合わせた添加剤を、例えば、粒体、液体、スラリー、およびその他として配合することができる。好ましい洗浄剤添加剤配合物は粒体、特に非ダスチング粒体、液体、特に安定化液体、またはスラリーである。

非ダスチング粒体は、例えば、米国特許第4,106,991号および米国特許第4,661,452号に開示されているように製造することができ、必要に応じてこの分野において知られている方法により被覆することができる。蝋状被覆材料の例は次の通りである：平均分子量1,000〜20,000のポリエチレンオキシド生成物 (ポリエチレングリコール、PEG) ；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、そして15〜80エチレンオキシド単位が存在する、エトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリド。流動床技術による適用に適当な皮膜形成被覆材料の例はGB 1483591に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、ポリオール、例えば、ポリプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を確立された方法に従い添加することによって安定化することができる。保護された酵素はEP 238,216に開示されている方法に従い調製することができる。

本発明の洗浄剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、タブレット、粉末、粒体、ペーストまたは液体であることができる。液状洗浄剤は水性であり、典型的には70％までの水および0〜30％の有機溶媒を含有するか、あるいは非水性であることができる。

典型的には、洗浄剤組成物は1または2以上の界面活性剤を含んでなり、半極性を包含する非イオンおよび／またはアニオンおよび／またはカチオンおよび／または両性イオンであることができる。界面活性剤は典型的には0.1〜60重量％のレベルで存在する。含有するとき、洗浄剤は通常約1％〜約40％のアニオン界面活性剤、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルサルフェート (脂肪族アルコールサルフェート) 、アルコールエトキシサルフェート、第二級アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−またはアルケニルコハク酸または石鹸を含有するであろう。

含有するとき、洗浄剤は通常約0.2％〜約40％の非イオン界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミン (「グルカミド」) のN−アシルN−アルキル誘導体を含有するであろう。

洗浄剤は0〜65％の洗浄剤ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩 (例えば、HoechstからのSKS−6) を含有することができる。
洗浄剤は1または2以上のポリマーを含んでなることができる。例は次の通りである：カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ (ビニルピリジン−N−オキシド) 、ポリビニルイミダゾール、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー。

洗浄剤は漂白系を含有することができる。漂白系はH₂O₂源、例えば、過ホウ素酸塩または過炭酸塩を含んでなることができ、これらは過酸生成漂白アクチベーター、例えば、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと組み合わせることができる。選択的に、漂白系は、例えば、アミド、イミド、またはスルホン型のペルオキシ酸を含んでなることができる。

本発明の洗浄剤組成物の1または2以上の酵素は、慣用安定化剤、例えば、ポリオール、例えば、ポリプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ボレートエステル、またはフェニルホウ酸誘導体、例えば、4−ホルミルホウ酸で安定化することができ、そして組成物は、例えば、WO 92／19709およびWO 92／19708に記載されているように配合することができる。
また、洗浄剤は他の慣用洗浄剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば、粘土、発泡ブースター、泡抑制剤、耐蝕剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、色素、殺菌剤、蛍光増白剤、ハイドロトープ、曇り抑制剤、または香料を含有することができる。

現在、洗浄剤組成物において、任意の酵素、特に本発明の酵素を洗浄液の1リットル当たり0.01〜100 mg、好ましくは0.05〜5 mg、特に0.1〜1 mgの酵素タンパク質に対応する量で添加できることが考えられる。
さらに、本発明の酵素はWO 97／07202 (参考文献として引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されている洗浄剤配合物に混入することができる。
下記の実施例を参照して本発明をいっそう詳細に例示するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものと解釈すべきでない。

洗浄剤組成物において、略した成分の識別は下記の意味を有する：
LAS：直鎖状C₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
TAS：獣脂アルキル硫酸ナトリウム
XYAS： C_1X−C_1Yアルキル硫酸ナトリウム
SS： 2−ブチルオクタン酸の第二級石鹸界面活性剤
25EY：平均Yモルのエチレンオキシドと縮合したC₁₂−C₁₅の主として直鎖状第一級アルコール
45EY：平均Yモルのエチレンオキシドと縮合したC₁₄−C₁₅の主として直鎖状第一級アルコール
XYEZS：平均Zモルのエチレンオキシド／モルと縮合したC_1X−C_1Yアルキル硫酸ナトリウム

非イオン： BASF GmbHにより商品名Plurafax LF404で販売されている3.8の平均エトキシル化度および4.5の平均プロポキシル化度を有するC₁₃−C₁₅混合エトキシル化／プロポキシル化脂肪族アルコール
CFAA： C₁₂−C₁₄アルキルN−メチルグルカミド
TFAA： C₁₆−C₁₈アルキルN−メチルグルカミド
ケイ酸塩：非晶質ケイ酸ナトリウム (SiO₂：Na₂O比＝2.0)
NaSKS−6：式δ−Na₂Si₂O₅の結晶質層状ケイ酸塩
炭酸塩：無水炭酸ナトリウム
リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム
MA／AA： 1：4マレイン酸／アクリル酸のコポリマー、約80,000の分子量
ポリアクルレート：平均分子8,000のポリアクリレートホモポリマー、BASF GmbHにより商品名PA30で販売されている

ゼオライトA：1〜10マイクロメーターの一次粒度を有する式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂・27H₂Oの水和アルミノケイ酸ナトリウム
クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム二水和物
過ホウ素酸塩：無水過臭素酸ナトリウム一水和物、実験式NaBO₂・H₂O2
PB4：無水過臭素酸ナトリウム四水和物
過炭酸塩：実験式2Na₂CO₃・3H₂O₂の無水過炭酸ナトリウム漂白剤
TAED：テトラアセチルエチレンジアミン
CMC：ナトリウムカルボキシメチルセルロース
HEDP：ヒドロキシエタンジメチレンホスホン酸
DETPMP：ジエチレントリアミンペンタ (メチレンホスホン酸)、Monsantoにより商品名Dequest 2060で販売されている
PVP：ポリビニルピロリドンポリマー
EDDS：ナトリウム塩の形態のエチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸、[S,S] 異性体

泡抑制剤： 25％パラフィン蝋、融点50 ℃、17％疎水性シリカ、58％パラフィン油
粒状泡抑制剤： 12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％澱粉、粒体の形態
硫酸塩：無水硫酸ナトリウム
HMWPEO：高分子量ポリエチレンオキシド
TAE 25：獣脂アルコールエトキシレート (25)

洗浄剤実施例I.
本発明による粒状布帛クリーニング組成物を次のようにして調製することができる：
C₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 6.5
硫酸ナトリウム 15.0
ゼオライトA 26.0
ニトリロ三酢酸ナトリウム 5.0
酵素 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
ホウ酸 4.0
過ホウ素酸塩 18.0
フェノールスルホネート 0.1
少量成分 100％まで

洗浄剤実施例II.
本発明による圧縮粒状布帛クリーニング組成物 (密度800 g／l) を次のようにして調製することができる：
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
ゼオライトA 17.0
NaSKS−6 12.0
クエン酸 3.0
炭酸塩 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
酵素 0.1
TAED 6.0
過炭酸塩 22.0
EDDS 0.3
粒状泡抑制剤 3.5
水／少量成分 100％まで

洗浄剤実施例III.
着色布帛の洗濯において特に有効である、本発明による粒状布帛クリーニング組成物を次のようにして調製することができる：
LAS 10.7 −
TAS 2.4 −
TFAA − 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 −
25E3S − 3.0
68E11 1.8 −
25E5 − 8.0
クエン酸塩 15.0 7.0
炭酸塩 − 10.0
クエン酸 2.5 3.0
ゼオライトA 32.1 25.0
NaSKS−6 − 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 2.5 −
硫酸塩 5.2 3.0
PVP 0.5 −
ポリ (4−ビニルピリジン) −N− − 0.2
オキシド／ビニルイミダゾールおよび
ビニルピロリドンのコポリマー
過ホウ素酸塩 1.0 −
フェノールスルホネート 0.2 −
水／少量成分 100％まで

洗浄剤実施例IV.
「洗浄を通して柔軟化」を提供する、本発明による粒状布帛クリーニング組成物を次のようにして調製することができる：
45AS − 10.0
LAS 7.6 −
68AS 1.3 −
45E7 4.0 −
25E3 − 5.0
塩化ココ−アルキル−ジメチル 1.4 1.0
ヒドロキシエチルアンモニウム
クエン酸塩 5.0 3.0
NaSKS−6 − 11.0
ゼオライトA 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
過ホウ素酸塩 15.0 −
過炭酸塩 − 15.0
TAED 5.0 5.0
スメクタイト粘土 10.0 10.0
HMWPEO − 0.1
酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 3.0 5.0
炭酸塩 10.0 10.0
粒状泡抑制剤 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水／少量成分 100％まで

洗浄剤実施例V.
本発明による強力液状布帛クリーニング組成物を次のようにして調製することができる：
LAS酸型 − 25.0
クエン酸 5.0 2.0
25AS酸型 8.0 −
25AE2S酸型 3.0 −
25AE7 8.0 −
CFAA 5 −
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 −
オレイン酸 − 1.0
エタノール 4.0 6.0
プロパンジオール 2.0 6.0
酵素 0.10 0.05
塩化ココ−アルキルジメチル − 3.0
ヒドロキシエチルアンモニウム
スメクタイト粘土 − 5.0
PVP 2.0 −
水／少量成分 100％まで

粉末状自動皿洗浄組成物I.
非イオン界面活性剤 0.4〜2.5％
メタケイ酸ナトリウム 0〜20％
二ケイ酸ナトリウム 3〜20％
三リン酸ナトリウム 20〜40％
炭酸ナトリウム 0〜20％
過ホウ素酸ナトリウム 2〜9％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 1〜4％
硫酸ナトリウム 5〜33％
酵素 0.0001〜0.1％

粉末状自動皿洗浄組成物II.
非イオン界面活性剤 1〜2％
(例えば、アルコールエトキシレート)
二ケイ酸ナトリウム 2〜30％
炭酸ナトリウム 10〜50％
リン酸ナトリウム 0〜5％
クエン酸三ナトリウム二水和物 9〜30％
ニトリロ三酢酸ナトリウム (NTA) 0〜20％
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 5〜10％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 1〜2％
ポリアクリレートポリマー (例えば、 6〜25％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー)
酵素 0.0001〜0.1％
香料 0.1〜0.5％
水 5〜10

粉末状自動皿洗浄組成物III.
非イオン界面活性剤 0.5〜2.0％
二ケイ酸ナトリウム 25〜40％
クエン酸ナトリウム 30〜55％
炭酸ナトリウム 0〜29％
重炭酸ナトリウム 0〜20％
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜15％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜6％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0〜5％
粘土 1〜3％
ポリアミノ酸 0〜20％
ポリアクリル酸ナトリウム 0〜8％
酵素 0.0001〜0.1％

粉末状自動皿洗浄組成物IV.
非イオン界面活性剤 1〜2％
ゼオライトMAP 15〜42%
二ケイ酸ナトリウム 30〜34％
クエン酸ナトリウム 0〜12％
炭酸ナトリウム 0〜20％
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 7〜15％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜3％
ポリマー 0〜4％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0〜5％
有機ホスホン酸塩 0〜4％
粘土 1〜2％
酵素 0.0001〜0.1％
硫酸ナトリウム残部

粉末状自動皿洗浄組成物V.
非イオン界面活性剤 1〜7％
二ケイ酸ナトリウム 18〜30％
クエン酸三ナトリウム 10〜24％
炭酸ナトリウム 12〜20％
モノ過硫酸塩 (2KHSO₅・KHSO₄・K₂SO₄) 15〜21％
漂白安定剤 0.1〜2％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0〜6％
ジエチルトリアミン五酢酸五ナトリウム 0〜2.5％
酵素 0.0001〜0.1％
硫酸ナトリウム残部

クリーニング界面活性剤系VIを使用する粉末状および液状皿洗浄組成物
非イオン界面活性剤 0〜1.5％
オクタデシルジメチルアミンN−オキシド 0〜5％
二水和物
オクタデシルジメチルアミンN−オキシド 0〜4％
二水和物／ヘキサデシルジメチルアミン
N−オキシド二水和物の80：20重量の
C18／C16ブレンド
無水オクタデシルビス (ヒドロキシエチル) 0〜5％
アミンN−オキシド／無水ヘキサデシル
ビス(ヒドロキシエチル) アミンN−オキシド
の70：30重量のC18／C16ブレンド
平均エトキシル化度3のC₁₃−C₁₅アルキル 0〜10％
エトキシサルフェート
平均エトキシル化度3のC₁₂−C₁₅アルキル 0〜5％
エトキシサルフェート
平均エトキシル化度12のC₁₃−C₁₅ 0〜5％
エトキシル化アルコール
平均エトキシル化度9のC₁₂−C₁₅ 0〜6.5％
エトキシル化アルコールのブレンド
平均エトキシル化度30のC₁₃−C₁₅ 0〜4％
エトキシル化アルコールのブレンド
二ケイ酸ナトリウム 0〜33％
トリポリリン酸ナトリウム 0〜46％
クエン酸ナトリウム 0〜28％
クエン酸 0〜29％
炭酸ナトリウム 0〜20％
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜11.5％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜4％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0〜7.5％
硫酸ナトリウム 0〜12.5％
酵素 0.0001〜0.1％

非水性液状自動皿洗浄組成物VII.
非水性非イオン界面活性剤 (例えば、 2.0〜10.0％
アルコールエトキシレート）
アルカリ金属ケイ酸塩 3.0〜15.0％
アルカリ金属リン酸塩 20.0〜40.0％
高級グリコール、ポリグリコール、 25.0〜45.0％
ポリオキシド、グリコールエーテル
から選択される液状担体
安定剤 (例えば、リン酸とC₁₆−C₁₈ 0.5〜7.0％
アルカノールとの部分的エステル)
抑泡剤 (例えば、シリコーン) 0〜1.5％
酵素 0.0001〜0.1％

非水性液状皿洗浄組成物VIII.
非水性非イオン界面活性剤 (例えば、 2.0〜10.0％
アルコールエトキシレート）
ケイ酸ナトリウム 3.0〜15.0％
アルカリ金属炭酸塩 7.0〜20.0％
クエン酸ナトリウム 0.0〜1.5％
可溶化剤系 (例えば、微細シリコーンと 0.5〜7.0％
低分子量ジアルキルポリグリコール
エーテルとの混合物)
低分子量ポリアクリレートポリマー 5.0〜15.0％
粘土ゲル増粘剤 (例えば、ベントナイト) 0.0〜10.0％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー 0.0〜0.6％
酵素 0.0001〜0.1％
高級グリコール、ポリグリコール、残部
ポリオキシドおよびグリコールエーテル
から選択される液状担体

チキソトロープ液状自動皿洗浄組成物IX.
C₁₂−C₁₄脂肪酸 0〜0.5％
ブロックコポリマーの界面活性剤 1.5〜15.0％
クエン酸ナトリウム 0〜12％
トリポリリン酸ナトリウム 0〜15％
炭酸ナトリウム 0〜8％
三ステアリン酸アルミニウム 0〜1.0％
クメンスルホン酸ナトリウム 0〜1.7％
ポリアクリレート増粘剤 1.32〜2.5％
ポリアクリル酸ナトリウム 2.4〜6.0％
ホウ酸 0〜4.0％
フマル酸ナトリウム 0〜0.45％
フマル酸カルシウム 0〜0.2％
n−デシルジフェニルオキシド 0〜4.0％
二スルホン酸ナトリウム
モノエタノールアミン (MEA) 0〜1.86％
水酸化ナトリウム (50％) 1.9〜9.3％
1,2−プロパンジオール 0〜9.4％
酵素 0.0001〜0.1％
泡抑制剤、色素、香料、水残部

液状自動皿洗浄組成物X.
アルコールエトキシレート 0〜20％
脂肪酸エステルスルホネート 0〜30％
ドデシル硫酸ナトリウム 0〜20％
アルキルポリグルコシド 0〜21％
オレイン酸 0〜10％
二ケイ酸ナトリウム一水和物 18〜33％
炭酸ナトリウム二水和物 18〜33％
ステアリン酸ナトリウム 0〜2.5％
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜13％
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜8％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 4〜8％
酵素 0.0001〜0.1％

保護された粒子を含有する液状自動皿洗浄組成物XI.
ケイ酸ナトリウム 5〜10％
ピロリン酸四ナトリウム 15〜25％
トリポリリン酸ナトリウム 0〜2％
炭酸カリウム 4〜8％
保護された漂白剤粒状、例えば、塩素 5〜10％
ポリマー増粘剤 0.7〜1.5％
水酸化カリウム 0〜2％
酵素 0.0001〜0.1％
水残部

XII：過ホウ素酸塩が過炭酸塩で置換されているI、II、III、IV、VIおよびX。
XIII：さらにマンガン触媒を含有するI〜VIに記載する自動皿洗浄組成物。マンガン触媒は、例えば、「低温漂白のための効率よいマンガン触媒」、Nature (1994) 、369：637−639に記載されている化合物の1つであることができる。

材料および方法
繊維材料：
標準的繊維材料片は、WFK Testgewebe GmbH (ドイツ国ブルッゲンブラヒトD−41379クリステンフェルド10) から入手した。

汚れ：
バシラス・サチリス (B. subtilis) DN 1855 (Diderichsen他、1990) 。
バシラス・レンツス (B. lentus) 309および147はバシラス・レンツス (Bacillus lentus) の特別の株であり、これらはNCIBに寄託され、受け入れ番号NCIB 10309および10147を与えられ、そして米国特許第3,723,250号 (引用することによって本明細書の一部分とされる) に記載されている。
大腸菌 (E. coli) MC 1000 (M. J. CasadabanおよびS. N. Cohen (1980) 、J. Mol. Biol. 138：179−207) は慣用法によりr^-、m⁺とされ、また米国特許出願第039,298号に記載されている。

プラスミド：
pJS3：スブチラーゼ309をコードする合成遺伝子を含有する大腸菌 (E. coli) −バシラス・サチリス (B. subtilis) シャトルベクター (Jacob Schiedt他、Protein and Peptide letters 3：39−44 (1996) に記載されている) 。
pSX222：バシラス・サチリス (B. subtilis) 発現ベクター (WO 96／34946に記載されている) 。

一般的分子生物学的方法
特記しない限り、DNAの操作および形質転換は分子生物学の標準的方法を使用して実施する (Sambrook他 (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY；Ausubel F. M. 他 (編者) “Current protocol in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995；Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者)“Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990) 。
DNA操作のための酵素は、供給業者の使用説明書に従い使用する。

DNA操作のための酵素
特記しない限り、DNA修飾のためのすべての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リパーゼ、およびその他はニュー・イングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド (New England Biolabs, Inc.) から入手した。

タンパク質分解活性
本発明の関係において、タンパク質分解活性はKilo NOVO (KNPU) で表される。この活性は比較的に酵素標準 (SAVINASE^TM) に対して決定され、そしてこの決定は標準的条件、すなわち、50 ℃、pH 8.3、9分の反応時間、3分の測定時間においてタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン (DMC) 溶液の消化に基づく。フォルダーAF 220/1は要求に応じてNovozymes A/Sから入手可能であり、このフォルダーはここに参照のために含める。

GUはグリシン単位であり、標準的条件下に、40 ℃において基質としてN−アセチルカゼインと15分間のインキュベートしたとき、1ミリモルのグリシンに等しい量のNH₂基を生成する、タンパク質分解酵素活性として定義される。
また、酵素活性はPNAアッセイを使用して、可溶性基質スクシニル−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトロ−フェノールとの反応に従い測定することができ、これは下記の文献に記載されている：Journal of American Oil Chemists Society、Rothgeb T. M.、Goodlander B. D. 、Garrison P. H. およびSmith L. A. (1988) 。

発酵：
スブチラーゼ酵素を製造する発酵は、30 ℃において回転震蘯テーブル (300 rpm) 上で100 mlのBPX培地を含有する500 mlのバッフルド・エルレンマイヤーフラスコ中で5日間実施される。

培地：
BPX培地の組成物 (1リットル当たり)
ジャガイモ澱粉 100 g
粉砕したオオムギ 50 g
ダイズ粉末 20 g
Na₂HPO₄×H₂O 9 g
Pluronic 0.1 g
ナトリウムカゼイネート 10 g
培地中の澱粉をα−アミラーゼで液化し、そして培地を120 ℃に45分間加熱することによって滅菌する。滅菌後、NaHCO₃を0.1 Mに添加することによって、培地のpHを9に調節する。

実施例１．酵素変異型の構築および発現
位置指定突然変異誘発：
必要な突然変異を含有するオリゴを使用するPCRにより調製したDNAフラグメントの伝統的クローニング (Sambrook他、Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 、第2版、Cold Spring Harbor、1989) により、特定の挿入／欠失／置換を含んでなる本発明のスブチラーゼ309 (Savinase^TM) 位置指定変異型を作る (下文参照) 。
鋳型プラスミドDNAはpJS3 (下文参照) 、またはスブチラーゼ309の変異型を含有するこの類似体であることができる。

突然変異をオリゴ指定突然変異誘発による変異型の構築に導入する。
スブチラーゼ309変異型を大腸菌 (E. coli) の中に形質転換する。これらの形質転換体の一夜の培養物から精製されたDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNAフラグメントの精製、結合、バシラス・サチリス (B. subtilis) の形質転換により、バシラス・サチリス (B. subtilis) の中に形質転換する。バシラス・サチリス (B. subtilis) の形質転換は下記の文献に記載されているように実施する：Dubnau他、1971、J. Mol. Biol. 56、pp. 209−221。

特定の領域の中に突然変異を導入するための位置指定突然変異誘発
位置指定突然変異誘発を実施するために使用する全体の方法は次の通りである：
突然変異原性プライマー (オリゴヌクレオチド) は、挿入／欠失／置換を規定するDNA塩基対により分離された、突然変異部位をフランクするDNA配列に対応するように合成する。

引き続いて、生ずる突然変異原性プライマーを修飾されたプラスミドpJS3 (上文参照) とのPCR反応において使用する。生ずるPCRフラグメントを精製し、第2 PCR反応により伸長させ、生ずるPCR生成物を精製し、第3 PCR反応により伸長させ、次いでエンドヌクレアーゼで消化し、大腸菌 (E. coli) −バシラス・サチリス (B. subtilis) シャトルベクターの中にクローニングする (下文参照) 。PCR反応を通常の条件下に実施する。
プラスミドDNAをよく知られている技術により大腸菌 (E. coli) の中に形質転換し、そして1つの大腸菌 (E. coli) コロニーを配列決定して設計した突然変異を確認する。

下記に列挙する変異型を親スブチリシン309について前述したように構築し、その配列を第1図に示す：
V11 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y } 、欠失、挿入；
V30 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y } 、欠失、挿入；
L31 { R、N、D、Q、E、H、K、M、P、W、Y } 、欠失、挿入；
D32 { A、R、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V }、挿入；
G34 { A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失；
G65 { A、R、C、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
T66 { A、R、C、H、I、L、K、M、F、W、Y、V } 、欠失、挿入；
H67 { A、R、N、W、G、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V }；
V68 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y } 、欠失、挿入；
A69 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
G83挿入；
A85 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、F、S、T、W、Y、V }；
L90 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
V95 { R、K、F、W、Y } 、欠失；

G110挿入；
V121挿入；
A122挿入；
V150 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y } 、欠失、挿入；
A152 { R、N、D、Q、E、H、K、F、P、W、Y、V }；
S153 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V }；
G154 { A、R、H、I、L、M、F、W、Y、V }；
*164 { A、R、H、T、W }；
*165 { R、L、F、W、Y }；
*166 { W、Y } 、挿入；
M175 { R、N、D、Q、E、G、H、K、F、P、T、W、Y、V }；
V177 { R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y } 、欠失、挿入；
G178 { A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
T180 { A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、V } 、欠失、挿入；
V199 { R、L、K、F、W、Y } 、欠失、挿入；
A200 { R、I、L、K、M、F、W、Y、V } 、欠失、挿入；

P201 { A、R、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
G202 { A、R、C、H、I、L、K、M、F、T、W、Y、V }；
S207 { A、R、N、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y、V }；
T220挿入；
A223挿入；
P225挿入；
H226挿入；
V227挿入；
A228挿入；
G229挿入；
A230挿入；
A231A、挿入；
T253 { A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、M、F、S、W、Y、V } 、欠失、挿入；
G264 { A、R、N、Q、H、I、L、M、F、S、T、W、 Y、V } 、欠失、挿入；
G266 { A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、V } 、欠失、挿入；
V68A；
M175ML、M175MI
本発明のスブチラーゼ変異型を精製するために、本発明の変異型を含んでなるバシラス・サチリス (B. subtilis) pJS3発現プラスミドをコンピテントバシラス・サチリス (B. subtilis) 株の中に形質転換し、前述したように発酵する。

実施例２．酵素変異型の精製
この手順は、バシラス (Bacillus) 宿主細胞中で本発明のスブチラーゼを産生する2リットル規模の発酵物の精製に関する。
ほぼ1.6リットルの発酵ブロスを、1リットルのビーカー中で5000 rpmで35分間遠心する。10％酢酸を使用して上清のpHを6.5に調節し、Seitz Supra S100フィルタープレート上で濾過する。

アミコン (Amicon) S1Y10 UFカートリッジを装備したアミコンCH2A UF単位装置を使用して濾液をほぼ400 mlに濃縮する。UF濃縮物を遠心し、濾過した後、温室においてバシトラシン (Bacitracin) アフィニティーカラム上にpH 7において吸収させる。温室においてpH 7に調節した0.01 Mジメチルグルタル酸、0.1 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝液中の25％2−プロパノールおよび1 M塩化ナトリウムを使用して、バシトラシンカラムからプロテアーゼを溶離する。

バシトラシン精製工程からのプロテアーゼ活性を含む画分を組合わせ、そしてpH 6.5に調節した0.01 Mジメチルグルタル酸、0.1 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡化した750 mlのセファデックス (Sephadex) G25カラム (直径5 cm) に適用する。
セファデックスG25カラムからのタンパク質分解活性を含む画分を組合わせ、そしてpH 6.5に調節した0.01 Mジメチルグルタル酸、0.1 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡化した150 mlのCMセファローズ (Sepharose) CL 6Bカチオン交換カラム (直径5 cm) に適用する。
2リットルの同一緩衝液中の0〜0.1 M塩化ナトリウムの直線勾配 (スブチリシン147の場合において0〜0.2 M塩化ナトリウム) を使用して、プロテアーゼを溶離する。
最終精製工程において、CMセファローズ細胞からのプロテアーゼを含有する画分を組合わせ、そしてGR81PPアミコン限外濾過セル (Dunish Sugar Factories Inc. から) 中で濃縮する。

下記の本発明による変異型を前述の手順に従い製造し、精製する。
BPN’ (BASBPN) ：
I11V、L
L90I、V
M199* (欠失)
サビナーゼ (BLSAVI) ：
V11I；V11I＋I44V；V11I＋L96LA；S9R＋V11I＋A15T＋T22A；V11I＋L96LA＋A108C＋A138C； V11I＋ N76D＋A194P＋A230V； V11I＋V84I； V11I＋V84I＋K251R； V11I＋V30I； V11I＋V139L； V11I＋V30I；V30I； V30I＋ V84I； V30I＋V139L；S9R＋A15T＋T22A＋V30I； V30I＋V244R； V30I＋K251R；V30I＋V139L＋Y167A＋R170S＋A194P＋N218S；D32A；V68A；V68A＋S106A；V68A＋V139I；V68A＋A158V；V68A＋V203A；V68A＋V139L；A48T＋V68A＋P131M；V51A＋V68A＋S106T＋A168G；V51A＋V68A＋S106T＋A168G；N76D＋M175ML＋A194P＋A230V；N76D＋M175MI＋A194P＋A23OV。
すべてのこれらの変異型は上に示したタンパク質分解活性を示した。

実施例３．「モデルの洗浄剤の洗浄性能試験」
標準的洗浄剤組成物中の選択したスブチラーゼの洗浄性能を評価するために、下記の実験条件を使用して標準的洗浄実験を実施した：
洗浄剤：モデルの洗浄剤
洗浄剤の用量 4.0 g／l
pH 10.1
洗浄時間 20分
温度： 30 ℃
水の硬度： 15°dH
酵素濃度： 10 nm (洗浄剤溶液中の)
試験系：攪拌ロッドを有する10 mlのビーカー
繊維材料／体積： 5繊維材料片 (φ 2.5 cm) ／50 mlの洗浄剤溶液
試験材料：適当な繊維材料スワッチ、例えば、WFK10N (卵の汚れ)
モデルの洗浄剤の組成は次の通りである：

6.2％ LAS (Nansa 80S)
2％ C₁₆−C₁₈脂肪酸のナトリウム塩
4％非イオン界面活性剤 (Plurafax LF404)
22％ゼオライトP
10.5％ Na₂CO₃
4％ Na₂Si₂O₅
2% カルボキシメチルセルロース (CMC)
6.8％アクルレート液CP5 40％
20％過臭素酸ナトリウム (実験式NaBO₂・H₂O₂)
0.2％ EDTA
21％ Na₂SO₄
水 (残部)

HClまたはNaOHの添加により、洗浄剤溶液のpHを10.1に調節する。試験系にCaCl₂およびMgCl₂ (Ca²⁺：Mg²⁺＝4：1) の添加により、水の硬度を15°dHに調節する。洗浄後、繊維材料片を水道水でフラッシュし、空気乾燥する。
マクベス・カラーアイ (Macbeth ColorEye) 7000フォトメーター (Macbeth, Divishon of Kollmorgen Instruments Corporation、ドイツ国) を使用して、試験材料についての反射 (R_変異型) を測定する。測定は製造業者のプロトコルに従い実施する。
ブランク値を決定するために、酵素を添加しないで同様な洗浄実験を実施する。前述したように、引き続いて反射 (R_ブランク) を測定する。

次いで、前述したように参照実験を実施し、ここで親酵素の洗浄性能を試験する。ちょうど前述したように、引き続いて反射 (R_親) を測定する。
下記式に従い規定される性能係数 (P) により、洗浄性能を評価する：
P ＝ (R_変異型 − R_ブランク)− (R_親 − R_ブランク)
＝ R_変異型 − R_親

第1図は、前述のGAPルーチンを使用するスブチリシンBPN’ (a) とSavinase^TM (b) との間のアラインメントを示す。

配列表

Claims

図１に示されるスブチリシンBPN'のアミノ酸配列中の位置に対応する置換V68A＋S106Aを含み、プロテアーゼ活性を有するスブチラーゼ変異体。
次の位置：27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252又は274（BASBPN番号付け）に少なくとも１個の修飾を更に含む、請求項１に記載の変異体。
変異体が修飾：S101G＋S103A＋V103A＋V104I＋G159D＋A232V＋Q236H＋Q245R＋N248D＋N252Kを更に含む、請求項２に記載の変異体。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスブチラーゼ変異体をコードするDNA。
請求項４に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
請求項５に記載の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。
細菌、好ましくはバシルス（Bacillus）、特にバシルス・レンツス（Bacillus lentus）である、請求項６に記載の微生物宿主細胞。
真菌または酵母、好ましくは糸状真菌、特にアスペルギルス（Aspergillus）である、請求項６に記載の微生物宿主細胞。
変異体の発現および分泌を促進する条件下に請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主を培養し、そして変異体を回収する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスブチラーゼ変異体の製造方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスブチラーゼ変異体を含んでなる、クリーニングまたは洗浄剤組成物、好ましくは洗濯または皿洗浄組成物。
セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、他のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物を更に含んでなる、請求項10に記載の組成物。
洗濯および／または皿洗浄用洗浄剤における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体の使用。