ES2293111T3 - Reaccion en cadena automatizada de la polimerasa. - Google Patents

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Abstract

Un sistema para controlar un aparato de realización automatizada de las reacciones en cadena de la polimerasa en al menos un tubo de muestra conteniendo un volumen conocido de una mezcla de muestra líquida, comprendiendo dicho sistema: (a) un bloque de muestras (12) teniendo al menos un pocillo de muestra para el dicho al menos un tubo de muestra (10), (b) un aparato de cálculo (20), (c) medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) controlados por dicho aparato de cálculo (20) para cambiar la temperatura de dicho bloque de muestras (12), y (d) un detector de la temperatura del bloque (21) térmicamente acoplado al dicho bloque de muestras (12), proporcionando dicho detector a dicho aparato de cálculo (20) la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo, incluyendo dicho aparato de cálculo (20) medios para determinar la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida, estando dispuestos dichos medios para la determinación de la temperatura de dichamezcla de muestra líquida para utilizar una constante térmica del sistema (tau) para calcular la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida como una función de la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo.

Description

Reacción en cadena automatizada de la polimerasa.
Realización automatizada de la reacción en cadena de la polimerasa.
La invención pertenece al campo de los instrumentos controlados por ordenador para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante PCR, de sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction). Más particularmente, la invención pertenece a los instrumentos automatizados que pueden realizar la reacción en cadena de la polimerasa simultáneamente en muchas muestras con un alto grado o precisión en los resultados obtenidos para cada muestra. Esta alta precisión proporciona la capacidad, entre otras cosas, de realizar la denominada "PCR cuantitativa".
Para amplificar el ADN (ácido desoxirribonucleico) usando el proceso PCR, es necesario pasar una mezcla de reacción de un líquido especialmente constituido a través de un protocolo PCR incluyendo varios períodos de incubación a diferente temperatura. La mezcla de reacción se compone de varios componentes tales como el ADN a ser amplificado y dos cebadores al menos seleccionados en una forma predeterminada para ser suficientemente complementarios con la muestra de ADN como para permitir crear productos de extensión del ADN a ser amplificado. La mezcla de reacción incluye varias enzimas y/u otros reactivos, así como varios desoxirribonucleósidos trifosfato tales como dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Generalmente, los cebadores son oligonucleótidos capaces de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se colocan bajo las condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario de la cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y agentes inductores tales como la polimerasa de ADN termoestable a una temperatura y pH adecuados.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha demostrado ser una tecnología fenomenalmente exitosa en el análisis genético, fundamentalmente porque es muy simple y requiere instrumentación de coste relativamente bajo. Una clave de la PCR es el concepto de termo ciclos: pasos alternativos de fusión del ADN, hibridación corta de cebadores para obtener cadenas resultantes simples, y la extensión de estos cebadores para hacer nuevas copias de la cadena doble de ADN. En el termociclado, la mezcla de la reacción PCR se pasa repetidamente por altas temperaturas (>90ºC) para fundir el ADN, a bajas temperaturas (40ºC a 70ºC) para la extensión e hibridación del cebador. El primer sistema comercial para realizar los ciclos térmicos requeridos en la reacción en cadena de la polimerasa, el "Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler", se introdujo en 1987.
Las aplicaciones de la tecnología PCR se están moviendo ahora de la investigación básica a las aplicaciones en las que se desarrollan rutinariamente un gran número de amplificaciones similares. Estas áreas incluyen la investigación diagnóstica, el desarrollo bio-farmacéutico, el análisis genético y las pruebas medioambientales. Los usuarios en estas áreas se beneficiarían de un sistema de PCR de alto rendimiento que proporcionaría al usuario una alta productividad, un tiempo de ciclo rápido y resultados reproducibles. Los usuarios en estas áreas deben asegurarse la reproducibilidad de muestra a muestra, ejecución a ejecución, laboratorio a laboratorio e instrumento a instrumento.
Por ejemplo, el proceso para el mapa físico en el proyecto del genoma humano puede llegar a simplificarse grandemente utilizando sitios de secuencia identificada. Un SSI es una secuencia corta y única fácilmente amplificada por el PCR y que identifica una localización en el cromosoma. La búsqueda de tales sitios para hacer los mapas del genoma requiere amplificar grandes números de muestras en un corto tiempo con protocolos que puedan ser reproducibles en todo el mundo.
Al aumentar el número de muestras de la PCR, se hace más importante integrar la amplificación con la preparación de la muestra y los análisis pos amplificación. Los recipientes de muestra deben permitir no sólo unos ciclos térmicos rápidos sino también un manejo automatizado para operaciones tales como la extracción de solventes y la centrifugación. Los recipientes deberían funcionar consistentemente con bajos volúmenes, para reducir los costes de reactivos.
Generalmente los ciclos de temperaturas de la PCR involucran al menos dos incubaciones a diferentes temperaturas. Una de estas incubaciones es para la hibridación del cebador y una redacción catalítica de extensión del cebador. La otra incubación es para desnaturalización, es decir, separación de los productos de extensión de la cadena doble en patrones de cadena simple para usarse en la siguiente hibridación e intervalo de incubación de la extensión. Los detalles de la relación en cadena de la polimerasa, los ciclos de temperatura y condiciones de reacción necesarias para la PCR así como los varios reactivos y enzimas necesarios para realizar la reacción se describen en las patentes U.S. 4.683.202, 4.683.195, publicación EPO 258.017 y 4.889.818 (patente Tqa polymerase enzyme) y todas las otras patentes de PCR asignadas a Cetus Corporation.
La finalidad de la reacción en cadena de la polimerasa es fabricar un gran volumen de ADN que sea idéntico a un pequeño volumen inicialmente suministrado en la "semilla" de ADN. La relación involucra el copiado de cadenas de ADN y usar entonces las copias para generar otras copias en ciclos posteriores. Bajo condiciones ideales, cada ciclo duplicará la cantidad de ADN presente produciendo de ese modo una progresión geométrica en el volumen de copias de las cadenas de ADN "objetivo" o "semilla" presentes en la mezcla de reacción.
Un ciclo típico de temperaturas de PCR requiere que la mezcla de reacción se mantenga con precisión en cada temperatura de incubación durante un tiempo prescrito y que se repitan ciclos idénticos o similares muchas veces (ver también WO98/009437). Un programa PCR típico comienza con una temperatura de la muestra de 94ºC mantenida durante 30 segundos para desnaturalizar la mezcla de reacción. Entonces, la temperatura de la mezcla de reacción se baja a 37ºC y se mantiene durante un minuto para permitir la primera hibridación. A continuación, la temperatura de la mezcla de reacción se eleva a una temperatura en el rango de 50ºC a 72ºC donde se mantiene durante dos minutos para promover la síntesis de los productos de extensión. Esto completa un ciclo. El siguiente ciclo PCR comienza entonces elevando de nuevo la temperatura de la mezcla de reacción a 94ºC para la separación de las cadenas de los productos de extensión formados en el ciclo previo (desnaturalización). Típicamente, el ciclo se repite de 25 a 30 veces.
Generalmente, es deseable cambiar la temperatura de la muestra a la siguiente temperatura en el ciclo tan rápidamente como sea posible por varias razones. Primero, la reacción química tiene una temperatura óptima para cada una de sus etapas. Así, un menor tiempo invertido a temperaturas no óptimas significa que se obtienen unos resultados químicos mejores. Otro motivo es que se requiere mantener un tiempo mínimo la mezcla de reacción en cada temperatura de incubación tras alcanzar dicha temperatura de incubación. Estos tiempos mínimos de incubación establecen el tiempo mínimo o "base" que lleva completar un ciclo. Cualquier tiempo de transición entre las temperaturas de incubación de la muestra es tiempo que se añade a este tiempo de ciclo mínimo. Dado que el número de ciclos es considerablemente grande, este tiempo adicional alarga innecesariamente el tiempo total necesario para completar la amplificación.
En algunos instrumentos anteriores de PCR automatizada, la mezcla de reacción se almacenaba en un tubo de plástico desechable y se cerraba con una tapa. Un volumen típico de muestra para tales tubos era aproximadamente 100 microlitros. Típicamente, tales instrumentos usaban muchos de tales tubos rellenos con ADN de muestra y mezcla de reacción insertados en agujeros llamados pocillos de muestra en un bloque metálico. Para realizar el proceso de PCR, la temperatura del bloque metálico se controlaba de acuerdo con las temperaturas y tiempos prescritos especificados por el usuario en un archivo de protocolo de PCR. Un ordenador y la electrónica asociada controlaban entonces la temperatura del bloque metálico de acuerdo con los datos suministrados por el usuario en el archivo del protocolo PCR que define tiempos, temperaturas y el número de ciclos, etc. Al cambiar la temperatura del bloque metálico, las muestras en los varios tubos los seguían con similares cambios de temperatura.
Sin embargo, en estos instrumentos de técnicas anteriores no todas las muestras experimentaban exactamente el mismo ciclo de temperaturas. En estos instrumentos de PCR de técnicas anteriores, se generaban errores en la temperatura de la muestra por la no uniformidad de la temperatura de sitio a sitio dentro del bloque de muestras metálico, es decir, existían gradientes de temperatura dentro del bloque metálico y de ahí que algunas muestras tuviesen diferentes temperaturas que otras muestras en momentos particulares del ciclo. Además, había retrasos en la transferencia de calor desde el bloque de muestras a la muestra, y los retrasos no eran los mismos para todas las muestras. Para realizar el proceso de PCR satisfactoria y eficientemente, y permitir la denominada PCR "cuantitativa", estos tiempos de retardo y errores de temperatura deben minimizarse en gran medida.
Los problemas de minimizar los tiempos de retardo para la transferencia de calor a y desde la muestra líquida y minimizar los errores de temperatura debido a los gradientes de temperatura o no uniformidad en la temperatura de varios puntos del bloque metálico llegan a ser particularmente agudos cuando el tamaño de la región que contiene las mezclas se hace grande. Es un atributo altamente deseable para un instrumento PCR el tener un bloque metálico que sea suficientemente grande para acomodar 96 tubos de muestra dispuestos en el formato de una placa de microtitulación estándar de la industria.
La placa de microtitulación es un medio ampliamente usado para el manejo, procesado y análisis de gran número de pequeñas muestras en los campos de la bioquímica y biotecnología. Típicamente, una placa de microtitulación es una bandeja de 9,2 cm (3 5/8 de pulgada) de ancho y 12,7 cm (5 pulgadas) de largo que contiene 96 pocillos idénticos de muestra en una matriz rectangular de 8 por 12 pocillos sobre centros a 9 milímetros. Se dispone de una amplia variedad de equipos para la automatización del manejo, procesado y análisis de muestras en este formato de placa de microtitulación estándar.
Generalmente las placas de microtitulación se realizan con plástico moldeado por inyección o formado al vacío y son baratas y consideradas desechables. Que sean desechables es una característica altamente deseable debido a la responsabilidad legal en la contaminación cruzada y la dificultad de la limpieza y secado de las placas de microtitulación tras su uso.
Es por tanto una característica altamente deseable para un instrumento de PCR el poder realizar la reacción PCR en hasta 96 muestras simultáneamente, estando dichas muestras dispuestas en un formato de placa de microtitulación.
Naturalmente, el tamaño del bloque metálico que es necesario para calentar y enfriar 96 muestras en una matriz de pocillos de 8 x 12 con centros a 9 mm es considerablemente grande. Ese bloque de gran área crea múltiples desafíos de ingeniería para el diseño de un instrumento de PCR que sea capaz de calentar y enfriar al bloque muy rápidamente en una gama de temperaturas generalmente de 0 a 100ºC con muy poca tolerancia para las variaciones de temperatura entre muestras. Estos problemas provienen de varias fuentes. En primer lugar, la gran masa térmica del bloque hace difícil cambiar la temperatura del bloque hacia arriba y abajo en el rango de operación con gran rapidez. En segundo lugar, la necesidad de fijar el bloque a varios dispositivos externos tales como colectores para el suministro y retirada del líquido de refrigeración, puntos de fijación del soporte del bloque y otros equipos periféricos asociados, crea el potencial para la existencia de gradientes de temperatura a través del bloque que excedan los límites tolerables.
Hay también otros numerosos conflictos en los requisitos de diseño de un sistema de ciclos térmicos para la realización automatizada de la reacción de PCR u otras reacciones que requieran realizar ciclos de temperatura rápidos y precisos sobre un gran número de muestras. Por ejemplo, para cambiar la temperatura de un bloque metálico rápidamente, debe añadirse a él una gran cantidad de calor o retirarse del bloque de muestras en un corto periodo de tiempo. El calor puede añadirse con un calentador de resistencia eléctrica o circulando un fluido de calentamiento en contacto con el bloque. El calor puede retirarse rápidamente haciendo circular fluido de refrigeración en contacto con el bloque. Sin embargo, es aparentemente imposible añadir o retirar grandes cantidades de calor rápidamente en un bloque metálico por estos medios sin producir grandes diferencias de temperatura de sitio a sitio del bloque y por tanto formando gradientes de temperatura que pueden dar como resultado la no uniformidad de la temperatura entre las muestras.
Incluso tras terminarse el proceso de adición o retirada de calor, los gradientes de temperatura pueden persistir por un tiempo aproximadamente proporcional al cuadrado de la distancia que el calor almacenado en varios puntos del bloque debe recorrer hasta las regiones más frías para eliminar el gradiente de temperatura. Así, al hacer mayor el bloque metálico para acomodar más muestras, el tiempo que lleva disminuir los gradientes de temperatura existentes en el bloque después de que un cambio de temperatura produzca gradientes de temperatura extendidos a través de las mayores dimensiones del bloque, puede llegar a ser marcadamente mayor. Esto hace crecientemente difícil recorrer los ciclos de temperatura del bloque de muestras rápidamente mientras se mantiene una precisa uniformidad de temperatura entre todas las muestras.
Debido al tiempo requerido para disipar los gradientes de temperatura, ha surgido una importante necesidad en el diseño de un instrumento PCR de alto rendimiento para impedir la creación de gradientes de temperatura que se extiendan sobre grandes distancias en el bloque. Otra necesidad es evitar, lo más posible, la necesidad de que el calor pase a través de los límites mecánicos entre las partes metálicas y otro equipo periférico fijado al bloque. Es difícil unir partes metálicas de forma que se asegure una alta conductividad térmica uniforme en cualquier punto a través de la unión. Las no uniformidades en la conductividad térmica generarán gradientes de temperatura no deseados.
De acuerdo con las enseñanzas de la invención, se provee un sistema para controlar un aparato para la realización automática de la reacción en cadena de la polimerasa en al menos un tubo de muestras conteniendo un volumen conocido de una mezcla de muestra líquida, comprendiendo dicho sistema:
(a)
un bloque de muestras (12) teniendo al menos un pocillo para al menos uno de los dichos tubos de muestras (10),
(b)
un aparato de cálculo (20),
(c)
medios de calefacción (14, 156) y refrigeración (34, 40) controlados por dicho aparato de cálculo (20) para el cambio de la temperatura en dicho bloque de muestras (12), y
(d)
un detector de la temperatura del bloque (21) acoplado térmicamente a dicho bloque de muestras (12), proporcionando dicho detector a dicho aparato de cálculo (20) la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo,
incluyendo dicho aparato de cálculo (20) medios para determinar la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida, siendo dispuestos dichos medios para determinar la temperatura en dicha mezcla de muestra líquida para utilizar una constante de tiempo térmica del sistema (\tau) en relación con el cálculo de la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida como una función de la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo.
Las referencias a los aparatos para alcanzar un control muy preciso de la temperatura para un gran número de muestras dispuestas en el formato que una placa de microtitulación durante la realización de un ciclo de temperaturas muy rápido del protocolo de la PCR, incluyen aquí un bloque de muestras, tubos de muestras y soportes de montaje, aparatos de calefacción y refrigeración, electrónica de control y programas, una interfaz de usuario y un método para usar dichos aparatos para realizar el protocolo de la PCR
El instrumento aquí descrito se diseña para realizar la amplificación PCR de genes en hasta 96 muestras con muy estrechas tolerancias en el control de temperatura a través del universo de muestras. Esto significa que todas las muestras suben y bajan su temperatura simultáneamente con muy poca diferencia de temperatura entre los diferentes pocillos que contienen las diferentes muestras, siendo esto cierto a través de todo el ciclo de reacción en cadena de la polimerasa. El instrumento aquí descrito es también capaz de un control muy estrecho sobre la concentración de la mezcla de reacción por medio del control de los procesos de evaporación y condensación en cada pocillo de muestra. Adicionalmente, el instrumento aquí descrito es capaz de procesar hasta 96 muestras de 100 microlitros cada una de diferentes fuentes de donantes con sustancialmente ninguna contaminación cruzada entre pocillos de muestra.
Se proporciona un método y aparatos para controlar el instrumento de PCR lo cual incluye la posibilidad de calcular y mostrar continuamente la temperatura de las muestras en proceso sin medir directamente estas temperaturas. Estas temperaturas calculadas se usan para controlar el tiempo que las muestras se mantienen dentro de dicha banda de tolerancia de temperatura para cada temperatura de incubación objetivo. El sistema de control también controla un calentador de tres zonas térmicamente acoplado al bloque de muestras y controla el flujo del fluido a través de canales de refrigeración rápida direccionalmente intercalados en el bloque de muestras el cual, combinado con un caudal de refrigerante constante de refrigeración de control a través del bloque de muestras, proporciona una posibilidad de alcanzar rápidos cambios de temperatura y un control preciso de la temperatura en las temperaturas objetivo especificadas por el usuario. El método y el aparato para controlar el calentador de tres zonas incluye un aparato para tener en cuenta, entre otras cosas, la tensión de línea, la temperatura del bloque, la temperatura del refrigerante y la temperatura ambiente en el cálculo de la cantidad de energía eléctrica a suministrar a las varias zonas del calentador de tres zonas. Este calentador tiene zonas que son controlables separadamente bajo los bordes o "bandas de protección" del bloque de muestras de forma que pueda compensarse el exceso de pérdidas de calor al ambiente a través del equipo periférico fijado a los extremos del bloque de muestras. Esto ayuda a impedir la formación de gradientes
térmicos.
La presente invención se describirá adicionalmente, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los planos que la acompañan, en los cuales:
La figura 1 es un diagrama de bloques del ciclo térmico de acuerdo con las enseñanzas de la invención.
La figura 2 es una vista en planta del bloque de muestras de acuerdo con las enseñanzas de la intención.
La figura 3 es una vista del alzado lateral del bloque de muestras mostrando los canales de refrigeración rápida y de control.
Las figuras 4 y 5 son las vistas de los alzados de los extremos del bloque de muestras.
La figura 6 es una vista de la sección del bloque de muestras tomada a lo largo de la línea 6-6' en la figura 2.
La figura 7 es una vista de la sección del bloque de muestras tomada a lo largo de la línea 7-7' en la figura 2.
La figura 8 es una vista de la sección del bloque de muestras tomada a lo largo de la línea 8-8' en la figura 2.
La figura 9 es una vista del alzado de la sección de la estructura del bloque de muestras tras el montaje del calentador de película de tres zonas y del soporte del bloque.
La figura 10 es un gráfico de la tensión de la línea ilustrando la forma de control de la energía al calentador de película de tres zonas.
La figura 11 es un gráfico de temperaturas mostrando un protocolo PCR típico de incubación a tres temperaturas.
La figura 12 es una vista de la sección de corte del bloque de muestras ilustrando el concepto de zona local.
La figura 13 es una vista en planta del calentador de tres zonas.
La figura 14 es un gráfico de la temperatura de la muestra en el tiempo ilustrando el efecto de la constante de tiempo de un tubo de muestras cuya fuerza de asiento F sea demasiado baja.
La figura 15 es una vista de la sección del tubo de muestras y tapa asentado en el bloque de muestras.
La figura 16A es un gráfico de la respuesta a un impulso de un circuito RC.
La figura 16B es un gráfico de un impulso de excitación.
La figura 16C es un gráfico que ilustra cómo la convolución de la respuesta a un impulso térmico y la historia de la temperatura del bloque dan la temperatura calculada de la muestra.
La figura 16D ilustra la analogía eléctrica de la respuesta térmica del bloque de muestras/sistema de tubos de muestra.
La figura 17 ilustra como las temperaturas calculadas de las seis diferentes muestras convergen todas en una temperatura objetivo en el entorno de 0,5ºC cada una cuando las constantes de proporcionalidad para las ecuaciones usadas en el controlador del calentador de tres zonas son adecuadamente ajustadas.
La figura 18 es un gráfico ilustrando cómo la temperatura objetivo de desnaturalización afecta a la cantidad de ADN generado.
La figura 19 es una vista de la sección en corte de la tapa deslizante y la placa base calentada.
La figura 20 es una vista en perspectiva de la tapa deslizante, el bloque de muestras y el mando usado para descender la placa calentada.
La figura 21A es una vista de la sección del montaje de una realización del marco, elemento de retención, tubo de muestras y tapa cuando se asienta sobre el bloque de muestras.
La figura 21B es una vista de la sección de la realización preferida del marco, elemento de retención, tubo de muestras y tapa cuando se asienta sobre el bloque de muestras.
La figura 22 es una vista en planta superior del marco desechable, plástico para la placa de microtitulación.
La figura 23 es una vista en planta inferior del marco.
La figura 24 es una vista del alzado en un extremo del marco.
La figura 25 es una vista del alzado en el otro extremo del marco.
La figura 26 es una vista de la sección del marco tomada a lo largo de la línea 26-26' en la figura 22.
La figura 27 es una vista de la sección del marco tomada a lo largo de la línea 27-27' en la figura 22.
La figura 28 es una vista del alzado en un borde y sección parcial del marco.
La figura 29 es una vista de la sección del tubo de muestras preferido.
La figura 30 es una vista de la sección de la parte superior del tubo de muestras.
La figura 31 es una vista del alzado de una parte de la banda de tapas.
La figura 32 es una vista superior y una parte de la banda de tapas.
La figura 33 es una vista en planta superior de la parte del elemento de retención plástico desechable de la bandeja de 96 pocillos de microtitulación.
La figura 34 es una vista del alzado lateral con una sección parcial del elemento de retención.
La figura 35 es una vista del alzado del extremo del elemento de retención.
La figura 36 es una vista de la sección del elemento de retención tomada a lo largo de la línea 36-36' en la figura 33.
La figura 37 es una vista de la sección del elemento de retención tomada a lo largo de la línea 37-37' en la figura 33.
La figura 38 es una vista en planta de la base de soporte plástica desechable de la bandeja de 96 pocillos de microtitulación.
La figura 39 es una vista en planta inferior de la base.
La figura 40 es una vista de la elevación lateral de la base.
La figura 41 es una vista de la elevación de un extremo de la base.
La figura 42 es una vista de la sección de la base de soporte tomada a lo largo de la línea 42-42' en la figura 38.
La figura 43 es una vista de la sección de la base de soporte tomada a lo largo de la línea 43-43' en la figura 38.
La figura 44 es una vista de la sección de la base tomada a lo largo de la línea 44-44' en la figura 38.
La figura 45 es una vista en perspectiva de la extensión de los elementos plásticos desechables que comprenden la placa de microtitulación con algunos tubos de muestras y tapas en su posición.
La figura 46 es un diagrama del sistema de control de refrigeración 24 de la figura 1.
Las figuras 47A y 47B son diagramas de bloques de la electrónica de control de acuerdo con las enseñanzas de la invención.
La figura 48 es un esquema de un típico detector de temperatura zener.
La figura 49 es un diagrama la línea de tiempos de un típico periodo de muestras.
La figura 50 es una vista de la sección de alzado de un tubo de muestras alto y de pared delgada comercializado bajo la marca comercial MAXIAMP.
La figura 51 es un gráfico mostrando la diferente respuesta en el tiempo entre un tubo de muestras de pared delgada y los tubos de ejecuciones anteriores de paredes gruesas.
La figura 52 es una vista en planta del tubo de muestras y tapa.
Las figuras 53 y 54 son diagramas de flujo de la secuencia de pruebas iniciales.
Refiriéndonos a la figura 1, en ella se muestra un diagrama de bloques de los principales componentes del sistema de una realización de un instrumento dirigido por ordenador para realizar la PCR. Las mezclas de muestra que incluyen el ADN o el ARN a ser amplificado se sitúan en el bloque de muestras de temperatura programada 12 y se cubren con la cubierta calentada 14.
Un usuario suministra los datos de los parámetros que definen el tiempo y la temperatura del protocolo deseado de la PCR por medio de un terminal 16 que incluye un teclado y una pantalla. El teclado y la pantalla se acoplan a través del bus 18 a un ordenador de control 20 (posteriormente referido aquí como la unidad central de proceso o CPU). Esta unidad central de proceso 20 incluye la memoria que almacena el programa de control descrito más adelante, los datos que definen el protocolo deseado de la PCR y ciertas constantes de calibración descritas más adelante. El programa de control hace que la CPU 20 controle los ciclos de temperatura del bloque de muestras 12 e implemente una interfase de usuario que proporciona ciertas pantallas al usuario y la cual recibe los datos introducidos por el usuario a través del teclado del terminal 16.
En la realización preferida, la unidad central de proceso 20 se realiza ex profeso para la aplicación.
Más adelante se comentará con más detalle un diagrama de bloques de la electrónica. En realizaciones alternativas, la unidad central de proceso 20 y electrónica periférica asociada para controlar los varios calentadores y otros sistemas electromecánicos del instrumento y leer varios detectores puede ser cualquier ordenador de uso general tal como un ordenador personal o microordenador adecuadamente programado.
Las muestras 10 se almacenan en tubos desechables tapados los cuales se asientan en el bloque de muestras 12 y son aislados térmicamente del aire ambiente por la cubierta calentada 14 la cual se pone en contacto con la bandeja desechable de plástico a ser descrita más adelante para formar una caja calentada, cerrada en la cual residen los tubos de muestra. La cubierta calentada sirve, entre otras cosas, para reducir las transferencias de calor no deseadas a y desde la mezcla de muestra por evaporación, condensación y reflujo en el interior de los tubos de muestra. También reduce la oportunidad de contaminación cruzada manteniendo los interiores de las tapas secos e impidiendo por ese medio la formación de vapores cuando los tubos se destapan. La cubierta calentada está en contacto con las tapas del tubo de muestra y los mantiene calentados a una temperatura de aproximadamente 104ºC o por encima de los puntos de condensación de los varios componentes de la mezcla de reacción.
La unidad central de procesos 20 incluye la electrónica apropiada para detectar la temperatura de la cubierta calentada 14 y controlar los calentadores de resistencia eléctrica para mantener la cubierta 14 a una temperatura predeterminada. Aquí la detección de la temperatura de la cubierta calentada 14 y el control de los calentadores de resistencia se lleva a cabo a través de un detector de temperatura (no mostrado) y el bus 22.
Un sistema de control de refrigerante 24 hace circular continuamente un líquido frío refrigerante tal como una mezcla de agua y anticongelante de automóviles a través de los canales de refrigeración de control (no mostrados) en el bloque de muestras 12 a través de los tubos de entrada 26 y el tubo de salida 28. El sistema de control de refrigerante 24 también controla el alto volumen de flujo del fluido de refrigeración rápida a través de los recorridos de circulación (no mostrados) en el bloque de muestras 12. Los canales de refrigeración rápida se usan para cambiar rápidamente la temperatura del bloque de muestras 12 bombeando grandes volúmenes de líquido refrigerante enfriado a través del bloque con un caudal relativamente alto. El líquido enfriador de refrigeración rápida entra en el bloque de muestras 12 a través del tubo 30 y sale del bloque de muestras a través del tubo 32. Los detalles del sistema de control de refrigeración se muestran en la figura 46. El sistema de control de refrigeración se comentará más completamente más adelante en la descripción de la electrónica y el programa del sistema de control.
Típicamente, el líquido refrigerante usado para enfriar el bloque de muestras 12 consiste principalmente en una mezcla de agua y glicol. El líquido refrigerante se enfría en un intercambiador de calor 34 que recibe el líquido refrigerante, del cual ha extraído el calor, del bloque de muestras 12 a través del tubo 36. El intercambiador de calor 34 recibe a través del tubo de entrada 38 el refrigerante freón líquido comprimido desde una unidad de refrigeración 40. Esta unidad de refrigeración 40 incluye un compresor (no mostrado), un ventilador 42 y un radiador de calor de tubos con aletas 44. La unidad de refrigeración 40 comprime el gas freón recibido del intercambiador de calor 34 a través del tubo 46. El freón gaseoso es refrigerado y condensado a líquido en el condensador de tubo de aletas 44. La presión del freón líquido se mantiene por encima de su presión de vapor en el tubo condensador con aletas a través de un limitador de caudal de tubo capilar 47. La salida de este tubo capilar se acopla a la entrada del intercambiador de calor 34 mediante el tubo 38. En el intercambiador de calor, se permite que la presión del freón caiga por debajo de la presión de vapor del freón, y el freón se expande. En este proceso de expansión, se absorbe el calor del líquido refrigerante calentado que circula por el intercambiador de calor y este calor se transfiere al freón haciendo por ello que el freón hierva. El freón calentado es extraído entonces descomprimido del intercambiador de calor a través del tubo 46 y de nuevo circulado a través del condensador de tubo con aletas 44. El ventilador 42 impulsa aire a través del tubo condensador con aletas 44 para hacer que el calor en el freón del tubo 46 se intercambie con el aire ambiente. Como se simboliza por las flechas 48. La unidad de refrigeración 40 debería ser capaz de extraer del líquido refrigerante 400 W de calor a 30ºC y 100 vatios de calor a 10ºC para mantener los rápidos ciclos de temperatura de acuerdo con las enseñanzas de la invención.
En la realización preferida, el aparato de la figura 1 se contiene dentro de la carcasa (no mostrada). El calor 48 expelido al aire ambiente se mantiene dentro de la carcasa para ayudar a la evaporación de cualquier condensación que pueda tener lugar en los varios tubos que llevan el refrigerante líquido enfriado o el freón de un lugar a otro. Esta condensación puede producir corrosión en los metales usados en la construcción de la unidad o en los circuitos electrónicos y deben ser retirados. Expeliendo el calor 48 dentro del envolvente se ayuda a evaporar cualquier condensación y prevenir la corrosión.
Tras intercambiar su calor con el freón, el líquido refrigerante se saca del intercambiador de calor 34 a través del tubo 50 y se reintroduce en el sistema de control de refrigeración donde es regulado según las necesidades hacia el bloque de muestras durante las partes del ciclo de la PCR de refrigeración rápida definidas por los datos introducidos por usuario a través del terminal 16.
Tal como se dice anteriormente, el protocolo PCR involucra la incubación en al menos dos temperaturas diferentes y a menudo tres temperaturas diferentes. Un ciclo típico de la PCR se muestra en la figura 11 con una incubación de desnaturalización 170 realizada a una temperatura cercana a 94ºC, una incubación de hibridación 122 realizada a una temperatura cercana a la temperatura ambiente (25ºC-37ºC) y una incubación de extensión 174 realizada a una temperatura cercana a los 50ºC. Estas temperaturas son sustancialmente diferentes, y por tanto se deben proveer medios para cambiar la temperatura de la mezcla de reacción de todas las muestras rápidamente de una temperatura a otra. El sistema de refrigeración rápida es el medio por el que la temperatura del bloque de muestras 12 se hace bajar rápidamente de la alta temperatura de incubación de desnaturalización a las bajas temperaturas de incubación de hibridación y extensión. Típicamente la temperatura del refrigerante está en el rango de 10-20ºC. Cuando el refrigerante está a 20ºC puede bombear cerca de 400 W de calor del bloque de muestras. Típicamente las dimensiones del canal de refrigeración rápida, la temperatura del refrigerante y el caudal de refrigerante se ajustan de forma que pueda alcanzarse un pico de refrigeración de 5º-6ºC por segundo en las proximidades del extremo alto del rango de operación (100ºC) y se alcance un ritmo de refrigeración medio de 2,5ºC por segundo al bajar la temperatura del bloque de muestras de 94ºC a 37ºC.
Los pequeños cambios de temperatura del bloque de muestras 12 en la dirección descendente para mantener la temperatura objetivo de la incubación se logran a través del sistema de refrigeración de control.
Como se muestra en la figura 46, una bomba 41 bombea constantemente refrigerante desde un depósito/filtro 39 (130 mililitros de capacidad) a través de una tubería de 1,3 cm (1/2'') y lo bombea a través de la tubería de 1,3 cm (1/2'') a la intersección de desviación 47. La bomba 41 suministra refrigerante a la tubería 45 a un caudal constante de 3,8-4,9 L/min. En la intersección 47, una porción del caudal del tubo 45 se desvía como flujo constante a través de los canales de refrigeración de control 49, otra parte del flujo del tubo 45 se desvía a través del limitador de flujo 51 al tubo de salida 38. El limitador de flujo 51 mantiene suficiente presión en el sistema de forma que exista una presión positiva en la entrada 53 de una válvula de dos estados 55 accionada por solenoide bajo el control de la CPU 20 a través del bus 54. Cuando se desea que la refrigeración rápida realice un descenso rápido de temperatura, la CPU 20 hace que la válvula accionada por solenoide 55 abra para permitir el flujo de refrigerante a través de los canales de refrigeración rápida 57. Hay 8 canales de refrigeración rápida de forma que el caudal a través de cada canal de refrigeración rápida es alrededor de 0,5 l/min. El caudal a través de los canales de refrigeración de control es mucho menor debido a la muy reducida área de la sección de los mismos.
El sistema de refrigeración de control proporciona un pequeño flujo constante de refrigerante frío a través de los canales 49 de refrigeración de control en el bloque de muestras 12. Esto produce una pérdida de calor constante y pequeña del bloque de muestras 12 que se compensa por el calentador multi zonas 156 el cual está térmicamente acoplado al bloque de muestras 12 durante los segmentos de incubación en los que la temperatura del bloque de muestras ha de mantenerse en un valor estable. La pequeña pérdida constante de calor producida por el flujo de refrigeración de control permite al sistema de control implementar un control proporcional de la temperatura tanto ascendente como descendente para pequeñas temperaturas. Esto significa que se dispone de calentamiento y refrigeración a ritmos controlados, predecibles y pequeños en el sistema de control de temperaturas para corregir los errores de temperatura del bloque y hacer que la temperatura del bloque siga fielmente el perfil de temperatura PCR introducido por el usuario. La alternativa sería cortar la energía al calentador de película y permitir que el bloque de muestras se enfríe entregando calor al ambiente por radiación y convención cuando la temperatura del bloque llega a ser demasiado alta. Esto sería demasiado lento y demasiado impredecible para cumplir con las estrechas especificaciones de control de temperatura para unos ciclos de PCR cuantitativo.
El calentador multi zonas 156 se controla por la CPU 20 a través del bus 52 de la figura 1 y es el medio por el que la temperatura del bloque de muestras 12 se incrementa rápidamente a las temperaturas de incubación más altas desde las temperaturas de incubación más bajas y es el medio a través del que la refrigeración de control se compensa y los errores de temperaturas se corrigen en la dirección ascendente durante el control y seguimiento de las temperaturas durante las incubaciones.
En realizaciones alternativas, la refrigeración de control puede suministrarse por otros medios tales como el uso de un ventilador de refrigeración y láminas de refrigeración formadas en el metal del bloque de muestras, uniones Peltier o agua corriente en constante circulación. Debe ponerse cuidado sin embargo en estas realizaciones alternativas para asegurarse de que no se crean gradientes de temperatura en el bloque de muestras lo que haría que la temperatura de algunas muestras difiera de la temperatura de otras muestras produciendo posiblemente por ello diferentes resultados de amplificación en la PCR en unos tubos de muestras con respecto a otros. En la realización preferida, la refrigeración de control es proporcional a la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura del refri-
gerante.
La CPU 20 controla la temperatura del bloque de muestras 12 detectando la temperatura del metal del bloque de muestras a través del detector de temperatura 21 y el bus 52 de la figura 1 y por la detección de la temperatura del líquido refrigerante en circulación a través del bus 54 y un detector de temperatura en el sistema de control de refrigeración. El detector de temperatura del refrigerante se muestra en 61 de la figura 46. La CPU también detecta la temperatura del aire ambiente interno dentro de la carcasa del sistema a través de un detector 56 de temperatura del aire ambiente en la figura 1. Adicionalmente, la CPU 20 detecta la tensión de línea de la entrada de energía en la línea 58 a través del detector simbolizado en 63. Todos estos datos junto con los datos introducidos por el usuario para definir el protocolo PCR deseado tales como las temperaturas y tiempos objetivo para las incubaciones se usan por el programa de control descrito detalladamente más adelante. Este programa de control calcula la cantidad de energía a aplicar a las varias zonas del calentador de película multi zona 156 del bloque de muestras a través del bus 52 y genera una señal de control de refrigeración para abrir o cerrar la válvula accionada por solenoide 55 en el sistema de control de refrigeración 24 a través del bus 54 para hacer que la temperatura del bloque de muestras siga el protocolo PCR definido por los datos introducidos por usuario.
Refiriéndonos a la figura 2, se muestra una vista superior del bloque de muestras 12. La finalidad del bloque de muestras 12 es proporcionar soporte mecánico y un elemento de intercambio de calor para una matriz de tubos de muestra de paredes delgadas en donde el calor puede intercambiarse entre la muestra líquida en cada tubo de muestra y el líquido refrigerante que circula en los canales de la refrigeración de control y de la refrigeración rápida formados en el bloque de muestras 12. Adicionalmente, es función del bloque de muestras 12 proporcionar su función de intercambio de calor sin crear grandes gradientes de temperatura entre los varios pocillos de muestra de forma que todas las mezclas de muestra en la matriz experimenten el mismo ciclo PCR incluso aunque estén espacialmente separadas. Es un objetivo general del instrumento PCR aquí descrito el proporcionar un control de temperatura muy ajustado para la temperatura de la muestra líquida de una variedad de muestras de forma que la temperatura de cualquier muestra líquida no varíe apreciablemente (aproximadamente más o menos 0,5ºC) respecto a la temperatura de cualquier otra muestra líquida en otro pocillo en cualquier punto del ciclo de la PCR.
Hay una rama emergente de la tecnología PCR llamada PCR "cuantitativa". En esta tecnología, el objetivo es realizar una amplificación PCR tan precisamente como sea posible para hacer que la cantidad de ADN objetivo se duplique exactamente en cada ciclo. La duplicación exacta en cada ciclo es difícil o imposible de alcanzar pero un control de temperatura ajustado ayuda.
Hay muchas fuentes de errores que pueden hacer que el ciclo PCR falle en la exacta duplicación de la cantidad de ADN objetivo (en adelante ADN debería entenderse como refiriéndose también al ARN) durante un ciclo. Por ejemplo, en algunas amplificaciones PCR, el proceso comienza con una célula simple de ADN objetivo. Un error que puede tener lugar fácilmente sucede cuando esta célula simple se fija a la pared del tubo de muestras y no se amplifica en varios de los primeros ciclos.
Otro tipo de error es la entrada de nucleasa extraña en la mezcla de reacción la cual ataca el ADN objetivo "extraño". Todas las células tienen alguna nucleasa no específica que ataca el ADN extraño que está suelto en la célula. Cuando esto ocurre, interfiere con o detiene el proceso de replicación. Así, si una gota de saliva o una partícula de caspa o material de otra mezcla de muestra fuera inadvertidamente introducido en una mezcla de muestra, los materiales de nucleasa en estas células podrían atacar el ADN objetivo y causar un error en el proceso de amplificación. Es altamente deseable eliminar totalmente tales fuentes de contaminación cruzada.
Otra fuente de error es un control no preciso sobre la temperatura de la mezcla de muestras, entre varias de las múltiples diferentes muestras. Por ejemplo si no se controlan con precisión todas las muestras para tener la adecuada temperatura de hibridación (una temperatura seleccionada por el usuario normalmente en el rango de 50 a 60ºC) para la extensión de la incubación, ciertas formas de ADN no se extenderán adecuadamente. Esto ocurre porque los cebadores usados en el proceso de extensión hibridan al ADN incorrecto si la temperatura es demasiado baja. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, los cebadores no se hibridarán al ADN objetivo en absoluto.
Pueden imaginarse fácilmente las consecuencias de realizar el proceso de amplificación PCR imprecisamente cuando la amplificación PCR es parte de pruebas diagnósticas tales como la presencia de anticuerpos VIH, hepatitis o la presencia de enfermedades genéticas tales como la anemia falciforme, etc. Un resultado falso positivo o falso negativo en tales pruebas diagnósticas puede tener desastrosas consecuencias personales y legales. En consecuencia, es un objetivo para el diseño del instrumento PCR aquí descrito el eliminar tantas de estas fuentes de posibles errores como sea posible tales como la contaminación cruzada o pobre control de temperatura a la vez que se proporciona un instrumento que sea compatible con el formato de placa de 96 pocillos de microtitulación estándar de la industria. El instrumento debe realizar el PCR rápidamente de forma flexible con una interfaz de usuario simple.
En la realización preferida, el bloque de muestras 12 se mecaniza a partir de un bloque sólido de aluminio relativamente puro aunque resistente a la corrosión tal como la aleación de aluminio 6061. La mecanización de la estructura del bloque a partir de un bloque sólido de aluminio da como resultado una estructura más homogénea térmicamente. Las estructuras de fundición de aluminio tienden a no ser tan térmicamente homogéneas como es necesario para cumplir con las muy estrechas especificaciones de control de temperatura deseadas.
El bloque de muestras 12 es capaz de rápidos cambios de temperatura debido a que la masa térmica del bloque se mantiene baja. Esto se realiza por la formación en el bloque de muchos caminos de refrigeración, pocillos de muestra, ranuras y otros agujeros roscados o sin roscar. Algunos de estos agujeros se usan para fijar el bloque a soportes y para fijar ahí dispositivos externos tales como colectores y bandejas de vertido.
Para apreciar mejor la naturaleza en "panal" de la estructura del bloque de muestras, referimos al lector simultáneamente a la figura 2 que muestra el bloque visto en planta así como las figuras 3 a 8 que muestran alzados y vistas de secciones del bloque de muestras estratégicamente situadas. Por ejemplo, la figura 3 es un alzado mostrando las posiciones del canal de refrigeración vistas desde el punto estratégico de la línea 3-3' en la figura 2. El alzado del bloque de muestras 12, visto desde el lado opuesto, es idéntico. La figura 4 es un alzado del borde del bloque de muestras 12 visto desde la perspectiva de la línea 4-4' en la figura 2. La figura 5 es un alzado del extremo del bloque de muestras 12 visto desde la perspectiva de la línea 5-5' en la figura 2. La figura 6 es una sección del bloque de muestras 12 realizada a lo largo de la línea de sección 6-6' en la figura 2. La figura 7 es una sección del bloque de muestras 12 realizada a lo largo de la línea de sección 7-7' en la figura 2. La figura 8 es una sección del bloque de muestras 12 realizada a lo largo de la línea de sección 8-8' en la figura 2.
La superficie superior del bloque de muestras 12 está taladrada con una matriz 8 x 12 de pocillos de muestra cónicos de los cuales dos pocillos 66 y 68 son típicos. La configuración cónica de cada pocillo de muestra se ve mejor en la figura 8. Las paredes de cada pocillo de muestra se taladran en un ángulo de 17º para ajustarse al ángulo de la sección cónica de cada tubo de muestras. Esto se hace taladrando un agujero piloto que tenga un diámetro D_{w} en la figura 8. Entonces se usa un avellanado a 17º para formar las paredes cónicas 67.
El fondo de cada pocillo de muestra incluye un sumidero 70 que tiene una profundidad que excede la profundidad de penetración de la punta del tubo de muestra. El sumidero 70 es creado por el agujero piloto y proporciona un pequeño espacio abierto por debajo del tubo de muestra cuando el tubo de muestra se asienta en el correspondiente pocillo de muestra. Este sumidero proporciona un espacio para que líquidos tales como la condensación que se forma en las paredes del pocillo residan en él sin interferir con el ajustado encaje de cada tubo de muestra con las paredes del pocillo de muestra. Este ajustado encaje es necesario para asegurar que la conductividad térmica entre la pared del pocillo y la muestra líquida es uniforme y alta en cada tubo de muestra. Cualquier contaminación en un pocillo que cause un encaje suelto para un tubo destruye esta uniformidad de la conductividad térmica a través de la matriz. Esto es, debido a que el líquido es sustancialmente incompresible a las presiones involucradas en el asiento de los tubos de muestra en los pocillos de muestra, si no estuviera el sumidero 70, la presencia del líquido en el fondo del pocillo de muestra podría impedir el pleno asiento del tubo de muestra en su pocillo de muestra. Más aún, el sumidero 70 proporciona un espacio para que una fase gaseosa de cualquier líquido que resida en el sumidero 70 se pueda expandir durante las incubaciones a alta temperatura de tal forma que las grandes fuerzas de tal expansión que estarían presentes si no estuviera el sumidero 70, no se aplican al tubo de muestra para presionar el tubo y despegarlo del contacto con el pocillo de muestra.
Se encontró experimentalmente que es importante que cada tubo de muestra esté pegado con su correspondiente pocillo de muestra y que se aplique un cierto nivel mínimo de fuerza a cada tubo de muestra para mantener la conductividad térmica entre las paredes del pocillo de muestra y la mezcla de reacción uniforme a través de la matriz. Este nivel mínimo de fuerza de asiento se muestra como un vector de fuerza F en la figura 15 y es un factor clave para impedir que la conductividad térmica a través de las paredes de un tubo de muestra sea diferente que la conductividad térmica a través de las paredes de otro tubo de muestra localizado en cualquier otro lugar del bloque. El nivel mínimo de fuerza de asiento F es 30 gramos y el nivel de fuerza preferido está entre ése y 100 gramos.
La matriz de pocillos de muestra está en esencia completamente rodeada por una ranura 78, que se ve mejor en las figuras 2, 6 y 8, la cual tienen dos funciones. La función principal es reducir la conductividad térmica desde el área central del bloque de muestras al borde del bloque. La ranura 78 se extiende aproximadamente 2/3 del espesor del bloque de muestras. Esta ranura minimiza los efectos de los gradientes térmicos inevitablemente producidos por las conexiones mecánicas necesarias con el bloque de los pernos de fijación, válvulas, etc. Una función secundaria es extraer masa térmica del bloque de muestras 12 para permitir que la temperatura del bloque de muestras 12 se varíe más rápidamente y simular una fila de pocillos en la región del borde llamada la "banda de protección". La cantidad de metal extraído por la parte de la ranura 78 entre los puntos 80 y 82 de la figura 2 se diseña para ser sustancialmente igual que la cantidad de metal extraído por la columna adyacente de ocho pocillos de muestra 83 al 90. La finalidad de esto es igualar la masa térmica de la banda de protección con la masa térmica de la "zona local" adyacente, un término que explicaremos de forma más completa más adelante.
Refiriéndonos específicamente a las figuras 3, 6 y 8, se muestra el número y posiciones relativas de varios canales de refrigeración de control y refrigeración rápida que están formados en el metal del bloque de muestras 12. Hay nueve canales de refrigeración de control marcados con los números de referencia 91 a 99. En la misma forma, hay ocho canales de refrigeración rápida marcados con los números de referencia 100 a 107.
Cada uno de estos canales de refrigeración de control y de refrigeración rápida está taladrado con refrigeración a través del aluminio del bloque de muestras. El proceso de taladrado con refrigeración es bien conocido y proporciona la posibilidad de taladrar un agujero largo y muy recto y que esté tan cerca como sea posible de la superficie inferior 110 del bloque de muestras 12. Ya que el proceso de taladrado con refrigeración taladra un agujero recto, se prefiere este proceso para impedir que cualquiera de los canales de refrigeración de control o refrigeración rápida se desvíen durante el proceso de taladrado y penetren la superficie inferior 110 del bloque de muestras o en otra forma alteren su posición relativa con el otro canal de refrigeración. Tales desplazamientos podrían causar gradientes de temperatura indeseables alterando el "equilibrio local" y la "simetría local" de las zonas locales. Estos conceptos se explican más adelante, pero por ahora el lector debería comprender que estas nociones y las estructuras que las implementan son clave para obtener ciclos rápidos de temperatura de hasta 96 muestras sin crear errores de temperatura excesivos entre los diferentes pocillos de muestra.
Los canales de refrigeración de control 91 a 99 están cubiertos con goma de silicona en la realización preferida para reducir la conductividad térmica a través de las paredes de los canales de refrigeración de control. Se prefiere disminuir la conductividad térmica a través de las paredes del canal en los canales de refrigeración de control para impedir cambios de temperatura demasiado rápidos del bloque de muestras 12 cuando el calentador multi-zonas 156 es desconectado y el bloque de muestras 12 pierde el calor principalmente a través de los canales de refrigeración de control. Esta es la situación durante el proceso de control llevado cabo cuando la temperatura del bloque de muestras se ha desviado ligeramente por encima de la deseada temperatura de incubación objetivo y el sistema de control está tratando de bajar la temperatura del bloque de muestras a la temperatura de incubación especificada por el usuario. Un ritmo de refrigeración demasiado rápido en esta situación podría hacer que se sobrepasaran las temperaturas de incubación deseadas antes de que el bucle de servo-realimentación del sistema de control pueda responder a pesar de que se usa un algoritmo de "sobrepaso controlado" tal como se describirá más adelante. Dado que el bucle de servo realimentación de la temperatura del bloque tiene una constante de tiempo para reaccionar a los estímulos, es deseable controlar la cantidad de calor y refrigeración y el ritmo de cambio de temperatura resultante del bloque de muestras tal que el sobrepaso se minimice al no cambiar la temperatura del bloque de muestras a un ritmo superior al que permite que el sistema responda a los errores de temperatura.
En la realización preferida, los canales de refrigeración de control tienen 4 mm de diámetro, y el tubo de goma de silicona tiene un diámetro interior de 1 mm con espesor de pared de 1,5 mm. Esto proporciona un ritmo de refrigeración de control de aproximadamente 0,2ºC por segundo cuando el bloque está en su extremo alto del rango de operación, es decir, cerca de 100ºC, y un ritmo de refrigeración de control de aproximadamente 0,1ºC por segundo cuando bloque de muestras 12 está a una temperatura en el extremo bajo de su rango de operación. El sistema de control de refrigeración 24 de la figura 1 hace que el caudal de refrigerante en los canales de refrigeración de control sea aproximadamente de 1/20 a 1/30 del caudal de líquido refrigerante a través de los canales de refrigeración rápida, 100 a 107. Los canales de refrigeración de control y refrigeración rápida son del mismo tamaño, es decir, 4 mm de diámetro, y se extienden completamente a través del bloque de muestras 12.
Los canales de refrigeración de control se recubren insertando un cable rígido con un gancho en el extremo del mismo a través del canal de refrigeración de control y enganchándolo a un agujero en el extremo de un tubo de goma de silicona, el cual tiene un diámetro exterior ligeramente mayor que 4 mm. El gancho del cable se coloca entonces a través del agujero en el tubo de silicona, y el tubo de silicona es empujado a través del canal de refrigeración de control y cortado enrasado con la superficie del extremo del bloque de muestras 12.
Se usan agujeros roscados 108 a 114 para fijar unos colectores de refrigerante en cada lado del bloque de muestras 12. Hay un colector roscado en cada extremo del bloque. Estos dos colectores de refrigeración se acoplan a los canales de refrigeración 26, 28, 30 y 32 de la figura 1, y se fijan al bloque de muestras 12 con un material de junta (no mostrado) interpuesto entre el colector y el metal del bloque de muestras. Estas juntas impiden la fuga de refrigerante y limitan la conductividad térmica entre el bloque de muestras 12 y los colectores que representan un sumidero de
calor.
Cualquier material de junta que sirva para los propósitos establecidos anteriormente será suficiente para poner en práctica la invención.
Las posiciones de los canales de refrigeración de control y refrigeración rápida en relación con la posición de la ranura 78 se ven mejor en la sección de la figura 6. Las posiciones de los canales de refrigeración de control y de refrigeración rápida en relación con las posiciones de los pocillos de muestra se ven mejor en la figura 8. Los canales de refrigeración de control y de refrigeración rápida se interponen generalmente entre las posiciones de las puntas de los pocillos de muestra. Además, la figura 8 revela que los canales de refrigeración de control y refrigeración rápida tales como los canales 106 y 97 no pueden desplazarse mucho en la dirección positiva z sin arriesgarse a penetrar en los pocillos de uno o más pocillos de muestra. En la misma forma, los canales de refrigeración no pueden desplazarse mucho en la dirección negativa z sin crear la posibilidad de penetrar en la superficie inferior 116 del bloque de muestras 12. Por claridad, las posiciones de los canales de refrigeración de control y rápida no se muestran en líneas ocultas en la figura 2 con relación a las posiciones de los pocillos de muestra y otras estructuras. Sin embargo, hay o bien un canal de refrigeración de control o de refrigeración rápida entre cada columna de pocillos de muestra.
Refiriéndonos a la figura 2, los agujeros 118, 119, 120 y 121 están roscados y se usan para fijar el bloque de muestras 12 a la maquinaria usada para mecanizar los varios agujeros y ranuras formados en él. En las figuras 2, 4 y 5, los agujeros 124, 125, 126 y 127 se usan para fijar el bloque de muestras 12 a un soporte de fijación mostrado en la figura 9 que será descrito detalladamente a continuación. Unos tornillos de acero que penetran a través de este soporte de fijación en los agujeros roscados 124 a 127 proporcionan una fijación mecánica al bloque de muestras 12. Estos tornillos de acero también representan sumideros de calor o fuentes de calor que tiende a añadir masa térmica al bloque de muestras 12 y proporcionan caminos adicionales para transferir energía térmica entre el bloque de muestras 12 y el ambiente que lo rodea. Estos pernos de fijación y los colectores son dos factores importantes para crear la necesidad de las bandas de protección que impidan que la transferencia de energía térmica en un sentido y otro con estas estructuras periféricas afecte a estas temperaturas de las muestras.
Refiriéndonos a la figura 5, los agujeros 128, 130 y 132 son agujeros de montaje para el detector de temperatura en circuito integrado (no mostrado) el cual se inserta en el bloque de muestras a través del agujero 128 y se asegura en él por tornillos que se ajustan a los agujeros roscados 130 y 132. El grado de penetración del objeto 128 y la posición relativa del detector de temperatura con la ranura 78 y la columna adyacente a los pocillos de muestra se ven mejor en la figura 2.
Refiriéndonos a la figura 2, los objetos 134 a 143 son agujeros de montaje que se usan para montar un anillo de rebose 147 (no mostrado). Este anillo de rebose 147 se muestra en la figura 19 que detalla la estructura de la placa calentada 14, la cubierta deslizante 316 y el conjunto de fijación atornillado 312. La finalidad de este anillo de rebose es impedir que cualquier líquido derramado de los tubos de muestra llegue al interior de la caja del instrumento donde podría producir corrosión.
Refiriéndonos a la figura 9, se muestra en ella una vista de la sección del sistema de fijación y la configuración del calentador multi-zonas 156 para el bloque de muestras 12. El bloque de muestras 12 se fija por cuatro tornillos de los cuales el tornillo 146 es típico. Estos cuatro tornillos pasan a través de las porciones verticales de un soporte de fijación de acero 148. Dos grandes muelles 150 y 152 están comprimidos entre la parte horizontal del soporte de fijación 148 y la placa de presión de acero 154. Los muelles 150 y 152 se comprimen suficientemente para procurar aproximadamente 21 kg/cm^{2} de fuerza en la dirección positiva z actuando para comprimir un calentador de película 156 contra la superficie inferior 116 del bloque de muestras 12. Esta estructura del calentador de película en tres capas se compone de un calentador de película multi zona 156, una lámina de goma de silicona 158 y una capa de espuma de resina epoxi 160. En la realización preferida del calentador de película 156 tiene tres zonas controlables separadamente. La finalidad del calentador de película 156 es suministrar calor al bloque de muestras 12 bajo el control de la CPU 20 de la figura 1. La finalidad de la lámina de goma de silicona es disminuir la conductividad térmica desde la capa del calentador de película 156 a las estructuras inferiores. Estas estructuras inferiores sirven como sumideros de calor y fuentes de calor entre las cuales puede transferirse energía calorífica no deseada a y desde el bloque de muestras 12. La lámina de goma de silicona 158 tiene la función adicional de compensar las irregularidades superficiales del calentador de película 156 dado que los calentadores de película incluyen cables de nicromo y pueden no ser perfectamente planos.
La finalidad de la placa de acero 154 y de la espuma de resina epoxi 160 es transferir la fuerza de los muelles 150 y 152 a la lámina de goma de silicona 158 y al calentador de película multizona 156 y comprimir el calentador de película contra la superficie inferior 116 del bloque de muestras tan pegado como sea posible. La espuma de resina epoxi debería ser rígida como para no ser aplastada bajo la fuerza de los muelles pero debería ser también un buen aislante y debería tener una masa térmica baja, es decir, debería ser una estructura no densa. En una realización, la resina 160 se fabrica bajo la marca registrada de espuma ECKO. En realizaciones alternativas, otras estructuras pueden ser sustituidas por la capa de goma de silicona 158 y/o la capa de espuma de resina epoxi 160. Por ejemplo, una estructura de panel rígido tal como la usada en la construcción de aeroplanos podría colocarse entre la placa de presión 154 y el calentador de película 156 con capas aislantes entre ellos. Cualquier estructura que se use para las capas 158 y 160 no debería de absorber cantidades sustanciales de calor del bloque de muestras 12 mientras el bloque está siendo calentado y no debería transferir cantidades sustanciales de calor al bloque de muestras 12 cuando el bloque está siendo enfriado. El aislamiento perfecto del bloque respecto a las estructuras que lo rodean sin embargo, es virtualmente imposible. Deberían hacerse todos los esfuerzos en el diseño de las estructuras alternativas que estarán en contacto con el bloque de muestras 12 para aislar térmicamente el bloque de muestras de su entorno tanto como sea posible para minimizar la masa térmica del bloque y posibilitar rápidos cambios de temperatura del bloque de muestras y de las mezclas de muestra almacenadas en él.
El preciso control de la temperatura del bloque de muestra es logrado por la CPU 20 de la figura 1 controlando la cantidad de calor aplicada al bloque de muestras por el calentador de película multi zona 156 de la figura 9. El calentador de película se acciona por medio de una forma modificada de pulso: la modulación de anchura. En primer lugar, la onda de 120 voltios de la línea eléctrica se rectifica para conservar solo los medios ciclos de la misma polaridad. Entonces, partes de cada medio ciclo es dirigido a las zonas apropiadas del calentador de lámina, siendo controlado por la CPU 20 el porcentaje de cada medio ciclo que se aplica a cada una de las varias zonas del calentador de lámina.
La figura 10 ilustra una realización de un concepto de control de potencia para el calentador de lámina 156. La figura 10 es un diagrama de la forma de onda del voltaje de la tensión de línea - alimentación. Tiene lugar la rectificación para eliminar el medio ciclo negativo 162. Solo los medios ciclos positivos permanecen, de los cuales el medio ciclo 164 es típico. La CPU 20 y sus circuitos electrónicos periféricos asociados controlan entonces la parte de cada medio ciclo a aplicar de acuerdo con el nivel de potencia calculado para cada zona basada en las ecuaciones dadas más adelante para cada zona. Esto es, la línea de división 166 se mueve adelante o atrás a lo largo del eje de tiempo para controlar la cantidad de potencia hacia el calentador de película basándose en un número de factores que se relacionan en una ecuación especial para cada zona. La zona rayada bajo el medio ciclo positivo 164 representa la cantidad de potencia aplicada al calentador de película 156 por la posición ilustrada de la línea de división 166. Al mover a la derecha la línea de división 166, se aplica más potencia al calentador de película y el bloque de muestras 12 se calienta más. Al mover a la izquierda la línea de división a lo largo del eje de tiempos, el área rayada se hace menor y se aplica menos potencia al calentador de película. Cómo controlan la CPU 20 y su programa asociado y sus circuitos periféricos la temperatura del bloque 12, se describe detalladamente más adelante.
La cantidad de potencia suministrada al calentador de película es variable continuamente de 0 a 600 vatios. En realizaciones alternativas, la cantidad de potencia suministrada al calentador de película 156 puede controlarse usando otros esquemas tales como control por ordenador sobre el flujo de corriente a su través o la tensión aplicada a un calentador de película de corriente continua o por el método de conmutación en el paso por cero descrito más
adelante.
En otras realizaciones, el control del calentamiento del bloque de muestras 12 puede realizarse por medio del control sobre el caudal y/o la temperatura de gases calientes o líquido caliente el cual se circula controladamente a través de los canales de control del calentamiento los cuales se forman a lo largo del bloque de muestras 12. Naturalmente en tales realizaciones alternativas, habría de ser reducido el número de pocillos de muestra en el bloque ya que no hay espacio para canales adicionales de calentamiento en el bloque de muestras 12 mostrado en las figuras 2 a 8. Tales realizaciones alternativas podrían ser aun compatibles con el formato de placa de microtitulación de 96 pocillos si, por ejemplo, uno de cada dos canales fuera quitado para hacer sitio para el canal de calentamiento en el bloque de muestras. Esto proporcionaría compatibilidad solo en cuanto a las dimensiones de tales placas de microtitulación y no en cuanto al procesado simultáneo de 96 muestras diferentes. Se debe poner cuidado en preservar el equilibrio local y la simetría local en estas realizaciones alternativas.
En la realización aquí descrita, la máxima potencia que puede entregarse al bloque por medio del calentador de película es de 1100 vatios. Esta limitación viene de la conductividad térmica de la interfase bloque/calentador. Se ha hallado experimentalmente que el suministro de más de aproximadamente 1100 vatios al calentador de película 156 causará frecuentemente la auto destrucción del dispositivo.
La potencia típica para el calentamiento o refrigeración cuando se está controlando la temperatura del bloque en o cerca de la temperatura objetivo de incubación está en el rango de más o menos 50 vatios.
Refiriéndonos a la figura 11, se muestra un trazado de la temperatura en relación con el tiempo para un protocolo PCR típico. Las grandes disminuciones en la temperatura del bloque se llevan a cabo circulando controladamente líquido refrigerante enfriado a través de los canales de refrigeración rápida mientras se vigila la temperatura del bloque de muestras por el detector de temperatura 21 de la figura 1. Típicamente estas disminuciones rápidas de temperatura se llevan a cabo durante la rampa que sigue de incubación de desnaturalización 170 hacia la temperatura de incubación de hibridación 172. Típicamente, el usuario debe especificar el protocolo definiendo las temperaturas y tiempos de una forma u otra para describir a la CPU 20 las posiciones sobre el plano temperatura/tiempo de los puntos de comprobación simbolizados por las intersecciones circuladas entre las etapas de rampa y las etapas de incubación. Generalmente, las etapas de incubación se marcan con los números de referencia 170, 172 y 174 y las rampas se marcan con los números de referencia 176, 178 y 180. Generalmente los intervalos de incubación se realizan a una temperatura única, pero en realizaciones alternativas puede ser escalonados o variados continuamente a diferentes temperaturas dentro de un rango de temperaturas que es aceptable para realizar la porción particular del ciclo PCR implicado. Esto es, en la incubación de desnaturalización 170 no necesita llevarse a cabo a una temperatura como se muestra en la figura 11, sino que puede llevarse a cabo a cualquiera de una variedad de temperaturas diferentes dentro del rango de temperaturas aceptables para la desnaturalización. En algunas realizaciones, el usuario puede especificar la longitud de los segmentos de rampa 176, 178 y 180. En otras realizaciones, el usuario sólo puede especificar la temperatura o temperaturas y duración de cada intervalo de incubación, y el instrumento cambiará entonces la temperatura del bloque de muestras tan rápidamente como sea posible entre las temperaturas de incubación desde la finalización de una incubación al comienzo de otra. En la realización preferida, el usuario puede también tener temperaturas y/o tiempos de incubación que sean diferentes para cada ciclo o que se incrementan automáticamente en cada ciclo.
La potencia media de la refrigeración rápida durante una transición desde una incubación de desnaturalización a 95ºC a la incubación de hibridación a 35ºC es típicamente mayor que de un kilovatio. Esto produce un cambio de temperatura en el bloque de muestras de aproximadamente 4-6ºC por segundo cuando la temperatura del bloque está en el extremo superior del rango operativo, y aproximadamente 2ºC por segundo cuando la temperatura del bloque está el extremo inferior del rango operativo. Generalmente es deseable tener un ritmo de refrigeración tan alto como sea posible para la refrigeración rápida.
Debido a que se extrae mucho calor del bloque de muestras durante la refrigeración rápida, pueden tener lugar gradientes de temperatura a través del bloque de muestras de un extremo al otro del canal de refrigeración rápida. Para impedir esto y minimizar estos tipos de gradientes de temperatura, los canales de refrigeración rápida tienen intercaladas sus direcciones. Esto es, en la figura 3, la dirección del flujo de refrigeración a través de los canales de refrigeración rápida 100, 102, 104, y 106 es hacia la página como se simboliza por las X en el interior del agujero de estos canales de refrigeración rápida. El flujo del líquido en la refrigeración rápida en los canales intercalados de refrigeración rápida 101, 103, 105, y 107 se dirige hacia afuera de la página como se simboliza por el punto en el centro del agujero de estos canales de refrigeración rápida. Este intercalado más el alto caudal a través de los canales de refrigeración rápida minimiza cualquier gradiente de temperatura que pudiera de otro modo ocurrir usando patrones de flujo no intercalado o menores caudales debido a que las distancias de los puntos calientes a los fríos se han hecho menores. Un caudal menor traería como resultado que la mayoría o todo el calor se toma el bloque en los primeros dos centímetros o así del recorrido lo que significa que el lado de entrada al bloque estará a una temperatura inferior que el lado de salida del bloque. Un alto caudal minimiza el gradiente de temperatura a lo largo del canal. Intercalado significa que el extremo caliente de los canales que circulan en una dirección están interpuestos entre los extremos fríos que los canales en los que el caudal va en la dirección opuesta. Esta es una distancia menor que la longitud del canal. Así, los gradientes de temperatura se reducen debido a que en las distancias que el calor debe recorrer para eliminar el gradiente de temperatura es reducido. Esto hace que cualquier gradiente de temperatura que se forme debido a los canales de la refrigeración rápida sea rápidamente eliminado antes de que tengan tiempo para calentar diferenciadamente algunas muestras y no otras. Sin el intercalado, un lado del bloque de muestras estaría aproximadamente 1ºC más alto que el otro lado. El intercalado produce la disipación de cualquier gradiente de temperatura que pueda causarse en menos de aproximadamente 15 segundos.
Para estimar con precisión la cantidad de calor añadido o extraído del bloque, la CPU 20 mide la temperatura del bloque usando el detector de temperatura 21 de la figura 1 y mide la temperatura del refrigerante por medio del detector de temperatura 61 en la figura 46 acoplado al bus 54 de la figura 1. Se mide también la temperatura del aire ambiente por medio del detector de temperatura 56 en la figura 1, y se mide también la tensión de la línea eléctrica, que controla la potencia aplicada a los calentadores de película sobre el bus 52. La conductividad térmica desde el bloque de muestras al ambiente y desde el bloque de muestras al refrigerante son conocidos por la CPU 20 como resultado de las medidas realizadas durante el proceso de inicialización para ajustar los parámetros de control del sistema.
Para una buena uniformidad de temperaturas en la población de muestras, el bloque, a temperatura constante, no puede tener entrada ni salida neta de calor. Sin embargo, pueden producirse gradientes de temperatura dentro del bloque de muestras que surgen por los flujos locales de calor de los puntos calientes a los puntos fríos lo que da una transferencia neta de calor cero en relación con los bordes del bloque. Por ejemplo, un trozo de material que se calienta en un extremo y se enfría en el otro está a una temperatura media constante si el flujo neto de calor en el bloque es cero. Sin embargo, en esta situación se puede establecer dentro del trozo una significativa desigualdad de temperatura, es decir, un gradiente de temperatura, debido al flujo de calor desde el borde caliente al borde frío. Cuando se termina el calentamiento de refrigeración de los bordes del bloque, el flujo de calor desde el borde caliente al borde frío finalmente disipa este gradiente de temperatura y el bloque alcanza una temperatura uniforme a través de él que es la media entre la temperatura caliente y la temperatura fría al comienzo del flujo de calor.
Si un material de área seccional A y longitud L tiene una conductividad térmica uniforme K, y el material se mantiene a temperatura constante debido a que la entrada de de la fuente de calor Q_{in} se ajusta a la salida en el sumidero de calor Q_{out}, el perfil de temperatura estable que resulta del flujo de calor es:
100
Donde,
Delta T
= gradiente de temperatura
L
= la longitud del recorrido térmico
A
= el área del recorrido térmico
K
= la conductividad térmica a lo largo del recorrido
En general, dentro de cualquier material de conductividad térmica uniforme, el gradiente de temperatura se establecerá en proporción al flujo de calor por unidad de área. El flujo de calor y la desigualdad de temperatura están así íntimamente ligados.
En términos prácticos, no es posible controlar la temperatura del bloque de muestras sin algún flujo de calor entrante o saliente. La refrigeración de control requiere algún flujo de calor entrante en los calentadores de bandas para equilibrar el calor extraído por el refrigerante que circula a través de los canales de refrigeración de control y mantener la temperatura del bloque en un valor estable. La clave para una temperatura del bloque de muestras uniforme en estas condiciones es una geometría que tenga "equilibrio local" y "simetría local" de las fuentes de calor y los sumideros de calor tanto estática como dinámicamente, y la cual se disponga de forma que cualquier flujo de calor desde los puntos calientes a los puntos fríos suceda sólo en cortas distancias.
Dicho brevemente, el concepto de "equilibrio estático local" significa que en un bloque a temperatura constante donde la entrada total de calor iguala la salida total de calor, las fuentes de calor y los sumideros de calor se disponen tal que dentro de una región local definida, todas las fuentes de calor están completamente equilibradas con los sumideros de calor en términos de calor entrante y calor saliente del bloque. Por tanto, cada región local, si estuviese aislada, se mantendría a una temperatura constante.
El concepto de "simetría estática local" significa que, dentro de una región local y para una temperatura constante, el centro de masas de las fuentes de calor coincide con el centro de masas de los sumideros de calor. Si no fuera éste el caso, dentro de cada región local puede existir a través de cada región local un gradiente de temperatura que puede añadirse a un gradiente de temperatura en una región local adyacente causando por ello un gradiente a través del bloque de muestras que es tan grande como el doble del tamaño de una región local simple debido a la ausencia de simetría local incluso aunque exista un equilibrio local dentro de cada región local. Los conceptos de equilibrio local y simetría local son importantes en la consecución de un equilibrio de temperatura estático donde la temperatura del bloque de muestras se mantenga a un nivel constante durante, por ejemplo, un intervalo de incubación.
Para el caso dinámico en el que tienen lugar rápidos cambios de temperatura en el bloque de muestras, la masa térmica, o capacidad calorífica de cada región local se convierte en importante. Esto es debido a que la cantidad de calor que debe fluir hacia cada región local para cambiar su temperatura es proporcional a la masa térmica de esa región.
Por tanto, el concepto de equilibrio local estático puede extenderse al caso dinámico requiriendo que si una región local incluye el x por ciento de las fuentes y sumideros dinámicos de calor totales, también debe incluir el x por ciento de la masa térmica para que exista un "balance dinámico local". En la misma forma, la "simetría dinámica local" requiere que el centro de masas de la capacidad calorífica coincida con el centro de masas de las fuentes y sumideros dinámicos de calor. Lo que esto significa en términos simples es que la masa térmica del bloque de muestras es el metal en sí, y que la mecanización del bloque de muestras debe ser simétrica y equilibrada de forma tal que la masa total de metal dentro de cada zona local sea la misma. Adicionalmente, el centro de masas del metal en cada zona local debería coincidir con el centro de masas de las fuentes y sumideros dinámicos de calor. Así, el centro de masas del calentador multi zonas 156, es decir, su centro geométrico, y el centro geométrico de los canales de refrigeración de control y rápidos deben coincidir. Del estudio de las figuras 2-9, puede deducirse con los comentarios a continuación que tanto la simetría y el equilibrio locales dinámico y estático existen en el bloque de muestras 12.
La figura 12 ilustra dos regiones locales contiguas para el diseño del bloque de muestras 12 de acuerdo con las enseñanzas de la invención. En la figura 12, los límites de las dos regiones locales, 200 y 202, se marcan por las líneas discontinuas 204, 206 y 208. La figura 12 muestra que cada región local que no está en la banda de protección se compone de: dos columnas de pocillos de muestra; una parte del calentador de película 156 que llega a ser 1/8 del área total del calentador; un canal de refrigeración rápida tal como los canales de refrigeración rápida 210 y 212; y un canal de refrigeración de control. Para preservar la simetría local cada región local se centra en su canal de refrigeración rápida y tiene medio canal de refrigeración de control en cada límite. Por ejemplo, la región 200 tiene su centro sobre el canal de refrigeración rápida 210 y los canales de refrigeración de control 214 y 216 se dividen por los límites de la región local 204 y 206, respectivamente. Así el centro de masas del canal de refrigeración rápida (el centro del mismo), coincide (horizontalmente) con el centro de masas de los canales de refrigeración de control (el centro de la región local) y con el centro de masas de la porción del calentador de película acoplado a cada región local. Existirá un balance estático local en cada región local cuando la CPU 20 accione el calentador de película 156 para introducir una cantidad de energía calorífica que sea igual a la cantidad de energía calorífica que está siendo extraída por los canales de refrigeración rápida y refrigeración de control. Existe balance dinámico local para cada región local porque cada región local en la parte central del bloque donde residen las 96 mezclas de muestra contiene aproximadamente 1/8 del total de la masa térmica de todo el bloque de muestras, contiene 1/8 del número total de canales de refrigeración rápida y contiene 1/8 del número total de canales de refrigeración de control. Existe simetría dinámica local para cada región local porque el centro de masas de cada región local coincide horizontalmente con: el centro de la porción el calentador de película suya frente a la región local; el centro del canal de refrigeración rápida; y el centro de masas de las dos mitades de los canales de refrigeración de control.
Gracias a estas propiedades físicas caracterizadas como balance y simetría locales estática y dinámica, el bloque de muestras calienta y enfría todas las muestras de la población mucho más uniformemente que realizadores de ciclos térmicos de técnicas anteriores.
Refiriéndonos a la figura 2, la vista en planta de los límites de las regiones locales se ilustran por las líneas discontinuas 217 a 225. La inspección de la figura 2 revela que la región central de los 96 pocillos de muestra se divide en seis regiones locales adyacentes marcadas por los límites 218 a 224. Además, se añaden dos regiones locales de protección en cada borde. Las regiones locales del borde (las regiones locales son también llamadas aquí a veces conos locales) que tiene la coordinada x más negativa está marcada por las líneas límite 217 y 218. La región local del borde que tiene la coordinada x más positiva está marcada por las líneas límite 224 y 225. Nótese que las regiones locales del borde no contienen columnas de pocillos de muestra sino que contienen la ranura 78 simulando una columna de pocillos. La profundidad y ancho de la ranura 78 se diseña para extraer la misma masa metálica que una columna de pocillos y de ahí que se preserve en alguna forma la simetría dinámica local. Las zonas locales de borde son por tanto diferentes en masa térmica (también tienen masa térmica adicional gracias a las conexiones externas tales como colectores y pernos de sujeción) que las seis zonas locales en la parte central del bloque de muestras. Esta diferencia se tiene en cuenta para el calentamiento de las zonas locales de borde o bandas de protección con zonas controlables separadamente de dicho calentador multi zonas de forma que se introduzca más energía en la banda de protección que en la zona central del bloque.
Las regiones locales de cada borde del bloque se aproximan, pero no se ajustan exactamente a las propiedades térmicas de las seis regiones locales localizadas en el centro. Las regiones locales de borde se llaman regiones de "banda de protección" porque completan una banda de protección que recorre la periferia del bloque de muestras 12. La finalidad de esta banda de protección es proporcionar algún aislamiento térmico a la porción central del bloque de muestras que contiene los 96 pocillos de muestra contra fuentes y sumideros de calor incontrolados inherentemente realizados en las conexiones mecánicas al bloque por objetos tales como los pernos de soporte, colectores, anillos de rebose y otros dispositivos que debe fijarse mecánicamente al bloque de muestras 12. Por ejemplo en la figura 2, el borde de las superficies 228 y 230 del bloque de muestras tiene colectores plásticos allí fijados que llevan refrigerante a y desde los pasos de refrigeración rápida y de control. La banda de protección a lo largo de los bordes 228 y 230 consiste en porciones de la ranura 78 que están paralelas y próximas a los bordes 228 y 230. La profundidad de la ranura 78 es tal que el fondo de la ranura se acerca a los perímetros de los canales de refrigeración rápida y de control tanto como sea posible sin intersectarlos realmente. El ancho de la ranura 78 junto con su profundidad es tal que el volumen de metal quitado por la ranura entre los puntos 82 y 232 de la figura 2 iguala aproximadamente al volumen de metal quitado por la fila adyacente de pocillos de muestra comenzando con el pocillo de muestra 234 y acabando con el pocillo de muestra 83. También, la ranura 78 alrededor del perímetro del bloque se localiza aproximadamente donde estaría una fila adicional de pocillos si el patrón periódico de pocillos de muestra se extendiera en una fila o columna de pocillos en cada dirección.
A lo largo de los bordes 250 y 252 donde se realizan las conexiones de fijación al bloque de muestras, las regiones locales de la banda de protección contienen, además de una parte de la ranura 78, la longitud completa de varios canales de refrigeración. Refiriéndonos a la figura 3, éstos incluyen: 1/2 de canal de refrigeración de control (por ejemplo, 92) que se fusiona con 1/2 de canal de refrigeración de control de la región local adyacente para formar un canal completo de refrigeración de control; un canal de refrigeración rápida (por ejemplo, 100); y un canal de refrigeración de control completo (por ejemplo, 91). Para la región local del borde en el borde 250, estos canales de refrigeración son 107, 198 y 99.
Todos los canales de refrigeración de control en las bandas de protección están ligeramente desplazados hacia el interior desde el borde del bloque. La razón por la que se usan estos canales de refrigeración de control completos es porque "medio" canal de refrigeración no es posible de construir. Dado que los canales de refrigeración de control requieren el recubrimiento con paredes gruesas de goma, sería difícil mantener un agujero a través del recubrimiento de "medio" canal de refrigeración de control fiablemente abierto. Esta asimetría en las regiones locales de borde causa un pequeño exceso de pérdida de calor hacia el refrigerante desde la regiones locales de la banda de protección del borde, pero está suficientemente alejada de la región central del bloque de muestras que contiene los pocillos de muestra como para que su contribución a las desigualdades en las temperaturas de las muestras sea pequeña. También, debido que los efectos en la temperatura de esta pequeña asimetría son predecibles, el efecto puede ser adicionalmente minimizado mediante el uso de una zona separadamente controlable del sistema de calentador multi zonas bajo cada banda de protección.
Refiriéndonos a la figura 13, se muestran en ella tres zonas separadamente controlables dentro de la capa del calentador de película 156 de la figura 9. Estas zonas separadamente controlables incluyen zonas del calentador de borde que están situadas bajo las bandas de protección en los bordes expuestos del bloque de muestras 12 que están acopladas al soporte de fijación 148. También hay zonas del calentador de colectores separadamente controlables situadas bajo las bandas de protección de los bordes 228 y 230 que están fijados a los colectores de refrigeración. Finalmente, hay una zona del calentador central que está bajo los pocillos de muestra. La potencia aplicada a cada una de estas zonas se controla separadamente por la CPU 20 y el programa de control.
El calentador de película 156 se compone de un patrón de conductores eléctricos formados por la grabación de una fina hoja de aleación metálica tal como Inconel*. La aleación metálica seleccionada debería tener una alta resistencia eléctrica y una buena resistencia al calor. El patrón de conductores así grabados se pega entre delgadas hojas de un material polímero eléctricamente aislante tal como Kapton*. Cualquiera que sea el material usado para aislar el elemento de calentamiento por resistencia eléctrica, el material ha de ser resistente a las altas temperaturas, tener un alto coeficiente dieléctrico y una buena estabilidad mecánica.
La zona central 254 del calentador de película tiene aproximadamente las mismas dimensiones que la porción central del bloque de muestras en el interior de las bandas de protección. La región central 254 entrega una densidad de potencia uniforme al área de pocillos de muestra.
La regiones del calentador del borde 256 y 258 son casi tan anchas como las bandas de protección del borde pero no son tan largas.
Las regiones de calentamiento de colectores 260 y 262 están bajo las bandas de protección de los bordes 228 y 230 de la figura 2.
Las zonas de calentamiento de colectores 260 y 262 están eléctricamente conectadas juntas para formar una zona de calentamiento separadamente controlable. También, las secciones del calentador de borde 256 y 258 están eléctricamente conectadas juntas para formar una segunda zona de calentamiento separadamente controlable. La tercera zona del calentador separadamente controlable es la sección central 254. Cada una de estas tres zonas del calentador separadamente controlables tiene terminales eléctricos separados, y cada zona es controlada por un algoritmo de control separado que puede ejecutarse en microprocesadores separados o en una CPU compartida como se hace en la realización preferida.
Las zonas del calentador de borde 256 y 258 se activan para compensar las pérdidas de calor de los soportes de fijación. Esta pérdida de calor es proporcional a la diferencia de temperatura entre el bloque de muestras 12 y el aire ambiente que lo rodea. Las zonas del calentador de borde 256 y 258 también compensan el exceso de pérdida de calor desde el bloque de muestras a los canales de refrigeración de control completos en cada borde del bloque. Esta pérdida de calor es proporcional a la diferencia de temperatura entre el bloque de muestras 12 y el refrigerante circulando a través de estos canales de refrigeración de control.
Las secciones del calentador de colectores 260 y 262 también se activan para compensar la pérdida de calor hacia los colectores plásticos de refrigeración 266 y 268 de la figura 13 que están fijados a los bordes del bloque de muestras 12. La potencia hacia las secciones del calentador de colectores 260 y 262 compensa las pérdidas de calor que son fundamentalmente proporcionales a la diferencia de temperatura entre el bloque de muestras y el refrigerante y, en un menor grado, entre el bloque de muestras y el aire ambiente.
Por razones prácticas, no es posible igualar la masa térmica de las regiones locales de la banda de protección con las masas térmicas de las regiones locales que incluyen los pocillos de muestras dispuestos sobre la sección central del calentador 254. Por ejemplo, los colectores de refrigeración plásticos 266 y 268 no sólo conducen el calor fuera de la banda de protección, sino que también añaden una cierta cantidad de masa térmica a las regiones locales de la banda de protección a las que están fijados. El resultado de esto es que durante los cambios rápidos en la temperatura del bloque, los ritmos de elevación y caída de la temperatura de la banda de protección no igualan exactamente el de las regiones locales de los pocillos de muestra. Esto genera un gradiente de temperatura dinámico entre las bandas de protección y los pocillos de muestra, y si se permite que llegue a ser grande, podría permanecer durante un tiempo mayor del que es tolerable. Este efecto de gradiente de temperatura es aproximadamente proporcional al ritmo de cambio en la temperatura del bloque y se minimiza añadiendo o quitando calor de cada zona local de la banda de protección a un ritmo que sea proporcional al ritmo de cambio de la temperatura del bloque.
Los coeficientes de proporcionalidad para los calentadores de la zona de la banda de protección son propiedades de diseño del sistema relativamente estables, y se determinan por mediciones de ingeniería sobre los prototipos. Los valores para estos coeficientes de proporcionalidad se dan a continuación en relación con las definiciones de los términos de las ecuaciones (3) a (5). Estas ecuaciones definen las cantidades de potencia a aplicar a la zona del calentador de colectores, la zona del calentador de borde y la zona central, respectivamente en una realización alternativa. Las ecuaciones usadas en la realización preferida se darán más adelante en la descripción del programa (ecuaciones (46)-(48), potencia distribuida por área).
101
donde,
P_{m}
= la potencia suministrada a las zonas del calentador de colector 260 y 262.
A_{m}
= el área de la zona del calentador de colector.
P
= potencia necesaria para que la temperatura del bloque permanezca en o se mueva a la temperatura deseada {}\hskip0.2cm en cualquier momento particular en un protocolo del ciclo térmico PCR.
K_{M1}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para compensar el exceso de pérdida {}\hskip0.2cm de calor al ambiente a través de los colectores, igual a 0 vatios/grado Kelvin.
K_{m2}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para compensar el exceso de pérdida {}\hskip0.2cm de calor al refrigerante, igual a 0,4 vatios/grado Kelvin.
K_{m3}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para dar una potencia adicional para {}\hskip0.2cm compensar la masa térmica adicional de las bandas de protección en los colectores producidas por la {}\hskip0.2cm fijación de los colectores plásticos, etc., igual a 66,6 vatios-segundo/grado Kelvin.
T_{BLQ}
= la temperatura del bloque de muestras 12.
T_{AMB}
= la temperatura del aire ambiente.
T_{REFR}
= la temperatura del refrigerante.
dt_{BLQ}/dt
= el cambio en la temperatura del bloque de muestras por unidad de tiempo.
102
donde,
P_{E}
= la potencia a ser aplicada a las zonas del calentador de borde.
A_{E}
= el área de la zona del calentador de borde.
K_{E1}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para compensar el exceso de pérdida {}\hskip0.2cm de calor al ambiente a través de los colectores, igual a 0,5 vatios/grado Kelvin.
K_{E2}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para compensar el exceso de pérdida {}\hskip0.2cm de calor al refrigerante, igual a 0,15 vatios/grado Kelvin.
K_{E3}
= una constante de proporcionalidad determinada experimentalmente para dar una potencia adicional para {}\hskip0.2cm compensar la masa térmica adicional de las bandas de protección expuestas producidas por la fijación al {}\hskip0.2cm bloque de muestras 12 de pernos de fijación y soporte, el detector de temperatura, etc., igual a 15,4 vatios- {}\hskip0.2cm segundo/grado Kelvin.
103
donde,
P_{C}
= la potencia a ser aplicada a la zona central 254 del calentador muti-zonas.
A_{C}
= el área de la zona central 254.
En cada una de las ecuaciones (3) a (5), el término de potencia, P, es una variable que se calcula por la porción del algoritmo de control ejecutado por la CPU 20 de la figura 1 que lee los puntos de consigna definidos por el usuario y determina qué hacer a continuación para hacer que la temperatura del bloque de muestras permanezca en o llegue a la temperatura apropiada para implementar el protocolo de temperaturas PCR definido por los puntos de consigna de tiempo y temperatura almacenados en la memoria por el usuario. La manera en la que se leen los puntos de consigna y se calcula la densidad de potencia se describirá en más detalle a continuación.
El algoritmo de control ejecutado por la CPU 20 de la figura 1 detecta la temperatura del bloque de muestras a través del detector de temperatura 21 de la figura 1 y figura 9 y el bus S_{2} de la figura 1. Esta temperatura se diferencia para obtener la tasa de cambio de la temperatura del bloque de muestras 12. La CPU mide entonces la temperatura del aire ambiente a través del detector de temperatura 56 de la figura 1 y mide la temperatura del refrigerante a través del detector de temperatura 61 en el sistema de control de refrigeración 24 mostrado en la figura 46. La CPU 20 calcula entonces el factor de potencia correspondiente al segmento particular del protocolo PCR que está siendo implementado y realiza tres cálculos de acuerdo con las ecuaciones (3), (4) y (5) introduciendo en ellas todas las temperaturas medidas, las constantes de proporcionalidad (que están almacenadas en una memoria no volátil), el factor de potencia P para esa integración particular del programa de control y las áreas de las varias zonas del calentador (que están almacenadas en una memoria no volátil). El factor de potencia es la potencia total necesaria para cambiar la temperatura del bloque desde su nivel actual al nivel de temperatura especificado por el usuario a través de los puntos de consigna. Más adelante, en la descripción del programa de control "tarea PID", se dan más detalles sobre los cálculos realizados por la CPU para controlar el calentamiento y refrigeración.
Tras calcular la potencia requerida a ser aplicada a cada una de las tres zonas del calentador 156, se realiza otro cálculo en relación con la proporción de cada medio ciclo de la tensión de entrada que ha de aplicarse a cada zona en algunas realizaciones. En la realización preferida descrita más adelante, el modo de cálculo es cuantos medios ciclos del número total de medios ciclos que tienen lugar durante un periodo de muestra de 200 milisegundos han de aplicarse a cada zona. Este proceso se describe más adelante en conexión con la discusión de las figuras 47A y 47B (en adelante referidas como la figura 47) y la "tarea PID" del programa de control. En una realización alternativa simbolizada por la figura 10, el calculador halla para cada zona, la posición de la línea de división 166 de la figura 10. Tras realizarse el cálculo, se generan las apropiadas señales de control para hacer que las fuentes de potencia para el calentador multi zonas 156 realicen las conmutaciones adecuadas para hacer que se aplique en él la cantidad de potencia calculada para cada zona.
En realizaciones alternativas, el calentador multi zonas puede implementarse usando un calentador de película simple que entrega una densidad de potencia uniforme a todo bloque de muestras, más uno o dos calentadores de película adicionales con sólo una zona cada uno para las bandas de protección. Estos calentadores adicionales están sobrepuestos encima del calentador simple de película que cubre todo el bloque de muestras. En tal realización, sólo se entrega a los calentadores adicionales la potencia necesaria para cubrir las pérdidas de la banda de protección.
El factor de potencia que se calcula por la CPU 20 en las ecuaciones (3) a (5) para varios puntos del protocolo de temperaturas PCR basándose en los puntos de consigna de tiempos de cambio especificados por usuario. Sin embargo, se impone una limitación basada en la máxima capacidad de entrega de potencia del calentador de zonas mencionado anteriormente.
Las constantes de proporcionalidad de las ecuaciones (3) a (5) deben fijarse apropiadamente para compensar adecuadamente el exceso pérdidas de calor en la banda de protección para una buena uniformidad de la temperatura.
Refiriéndonos a la figura 17, se muestra en ella un gráfico de las diferencias entre las temperaturas de muestra calculadas para una variedad de diferentes muestras en respuesta a un cambio en escalón en la temperatura del bloque que eleva la temperatura del bloque de muestras hacia la temperatura objetivo para la incubación de desnaturalización de aproximadamente 94ºC desde una temperatura sustancialmente menor. La figura 17 ilustra las temperaturas del líquido de las muestras calculadas cuando el calentador multi zonas 156 es gestionado adecuadamente usando las constantes de proporcionalidad dadas anteriormente en las definiciones de los términos para las ecuaciones (3) a (5). Los varios pocillos que se usaron para originar el gráfico de la figura 17 se indican en él por una simple combinación de número y letra. La matriz de pocillos 8 x 12 que se muestra en la figura 2, se codifica por columnas con letras y filas con números. Así, por ejemplo, el pocillo de muestra 90 se designa también como pocillo de muestra A12, mientras que el pocillo de muestra 89 se designa también como pocillo de muestra B12. De la misma forma, el pocillo de muestra 68 se designa también como pocillo de muestra D6, y así sucesivamente. Nótese que las temperaturas de los pocillos se sitúan asintóticamente en temperaturas que están dentro de aproximadamente 0,5ºC entre ellas, debido al diseño general térmico aquí descrito para eliminar los gradientes de temperatura.
La anterior descripción ilustra cómo puede controlarse la temperatura del bloque de muestras para ser uniforme y rápidamente cambiable. Sin embargo, en el proceso PCR, es la temperatura de la mezcla de reacción de muestra y no la temperatura del bloque la que ha de programarse. En la realización preferida de acuerdo con las enseñanzas de la invención, el usuario especifica una secuencia de temperaturas objetivo para la muestra líquida en sí y especifica los tiempos de incubación para la muestra líquida a cada una de estas temperaturas objetivo para cada etapa en el proceso PCR. La CPU 20 maneja entonces la temperatura del bloque de muestras para tener las mezclas de reacción de muestra en las temperaturas de incubación objetivo especificadas y mantener las mezclas de muestra en estas temperaturas objetivo durante los tiempos de incubación especificados. El código de interfase con el usuario ejecutado por la CPU 20 muestra en la pantalla del terminal 16, en todas las etapas de este proceso, la temperatura actual de la muestra líquida calculada.
La dificultad para mostrar la medida real de la temperatura de la muestra consiste en que medir la temperatura real de la mezcla de reacción requiere la inserción en ella de una sonda de medición de temperatura. La masa térmica de la sonda puede alterar significativamente la temperatura de cualquier pocillo en el que se coloque dado que la mezcla de reacción de muestra en cualquier pocillo particular tiene a menudo sólo 100 microlitros de volumen. Así, la mera inserción de una sonda de temperatura en una mezcla de reacción puede hacer que exista un gradiente de temperatura entre esa mezcla de reacción y las mezclas vecinas. Dado que la masa térmica extra del detector de temperatura haría que la mezcla de reacción en la que se sumerja vaya por detrás en su temperatura en relación con las temperaturas en las mezclas de reacción en otros pocillos que tienen menor masa térmica, pueden producirse errores en la amplificación simplemente al intentar medir la temperatura.
En consecuencia, el instrumento aquí descrito calcula la temperatura de la muestra a partir de factores conocidos tales como el histórico de la temperatura del bloque y la constante de tiempo térmica del sistema y muestra esta temperatura de la muestra en la pantalla. Se ha hallado experimentalmente para el sistema aquí descrito que si los tubos de mezcla se presionan hacia abajo contra los pocillos de muestra con al menos una fuerza limite mínima F, entonces para el tamaño y forma de los tubos de muestra usados en la realización preferida y los volúmenes de muestra de aproximadamente 100 microlitros, tiene lugar una convección activada térmicamente dentro de la mezcla de reacción de muestra y el sistema actúa térmicamente como un sistema lineal, con una única constante de tiempo. Los experimentos han mostrado que cada tubo de muestra debe empujarse hacia abajo con aproximadamente 50 gramos de fuerza para una buena conductividad térmica pared pocillo-a-líquido de pocillo a pocillo. El diseño de la placa calentada descrito más adelante se diseña para empujar hacia abajo cada tubo de muestra con alrededor de 100 gramos de fuerza. Esta fuerza mínima, simbolizada por el vector de fuerza F en la figura 15, es necesaria para asegurar que, independientemente de las ligeras diferencias en las dimensiones externas entre varios tubos de muestra y varios pocillos de muestra en el bloque de muestras, todos ellos serán empujados hacia abajo con fuerza suficiente para garantizar el ajustado y alineado encaje de cada tubo que garantiza una conductividad térmica uniforme. Cualquier diseño que tenga algunos tubos de muestra con un encaje holgado en sus correspondientes pocillos de muestra y algunos tubos con encajes ajustados no será capaz de alcanzar un control de temperatura igualado para todos los tubos debido a la conductividad térmica no uniforme. Un nivel de fuerza F insuficiente da como resultado una respuesta de temperatura de la muestra líquida a un cambio en escalón en la temperatura del bloque como se muestra en 286 de la figura 14. Un nivel de fuerza F adecuado da como resultado la respuesta de temperatura mostrada en 282.
El resultado obtenido por el aparato construido de acuerdo con las enseñanzas de la invención es que la temperatura de cada mezcla de muestra se comporta como si la muestra fuera mezclada bien físicamente durante las transiciones a las nuevas temperaturas. De hecho, debido a las corrientes de convección producidas en cada mezcla de muestra, la mezcla de reacción de muestra en cada tubo de muestra está bien mezclada.
El sorprendente resultado es que el comportamiento térmico del sistema completo es como el de un circuito eléctrico RC con una constante de tiempo simple de 9 segundos que es alrededor de 1,44 veces la vida media de la disminución de la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura de la muestra. Un tubo de muestra GeneAmp* relleno con 50 mililitros de muestra tiene una constante de tiempo de alrededor de 23 segundos. En otras palabras, durante un cambio ascendente en la temperatura del bloque de muestras, la temperatura de la mezcla de reacción actúa como la elevación de voltaje de un condensador C en un circuito eléctrico RC como el mostrado en la figura 16D en respuesta a un cambio en escalón en la tensión de salida de la fuente de tensión V.
Para ilustrar estos conceptos, nos referimos a la figura 14 que muestra las diferentes respuestas de temperatura de la muestra líquida a un cambio en escalón de la temperatura del bloque y a la figura 15 que muestra una sección a través de un pocillo de muestra/combinación de tubo de muestra. Se ha hallado experimentalmente que cuando el volumen de la muestra líquida 276 es aproximadamente 100 microlitros y las dimensiones del tubo son tales que el menisco 278 se localiza por debajo de la superficie superior 280 del bloque de muestras 12, y la fuerza F que empuja el tubo de muestras hacia el pocillo de muestras es al menos de 30 gramos, la constante de tiempo térmica \tau varía en alrededor de un segundo por cada 0,025 mm de cambio en el espesor de la pared para el tubo de muestras tronco (tronco de cono). Se ha hallado que los tubos de muestra de pared delgada aquí descritos tienen unas constantes de tiempo térmicas de alrededor de 5 a alrededor de 14 segundos cuando contienen de 20 a 100 microlitros de muestra. Unas paredes del tubo más gruesas darían como resultado unas constantes de tiempo mayores y un mayor retraso entre un cambio en la temperatura del bloque de muestras y el cambio resultante en la temperatura de la muestra líquida.
Matemáticamente, la expresión para la respuesta térmica de la temperatura de la muestra líquida a un cambio en la temperatura del bloque de muestras es:
104
donde,
T_{muestra}
= la temperatura de la muestra líquida
\DeltaT
= la diferencia de temperatura entre la temperatura del bloque de muestras 12 y la temperatura de la muestra {}\hskip0.2cm líquida
t
= tiempo transcurrido
\tau
= constante de tiempo térmica del sistema, o la capacidad calorífica de la muestra dividida por la conducti- {}\hskip0.2cm vidad térmica entre la pared del pocillos de muestra y la muestra líquida
En la figura 14, la curva 282 representa la respuesta de temperatura exponencial a un cambio en escalón teórico en la temperatura del bloque de muestras cuando la fuerza F que empuja hacia abajo al tubo de muestra es suficientemente alta. El cambio en escalón en la temperatura del bloque de muestras se indica como la función 284, con una rápida elevación en la temperatura comenzando en el tiempo T_{1}. Nótese como la temperatura de la muestra líquida aumenta exponencialmente en respuesta al cambio en escalón y se aproxima asintóticamente a la temperatura final del bloque de muestras. Como se mencionó brevemente con anterioridad, la curva 286 representa la respuesta térmica cuando la fuerza de asiento hacia abajo F en la figura 15 es suficiente para producir un ajustado, alineado encaje entre el cono del tubo de muestra y la pared 290 del pocillo de muestra. Generalmente, resultará la respuesta térmica de la curva 286 si la fuerza F es menor de 30 gramos. Nótese que a pesar de que la figura 15 indica una pequeña capa de aire entre el cono del tubo de muestra y la pared del pocillo de muestra por claridad, esto es exactamente lo contrario de la situación deseada ya que el aire es un buen aislante e incrementaría sustancialmente la constante de tiempo térmica del sistema.
La constante de tiempo térmica \tau es análoga a la constante de tiempo RC de un circuito serie RC donde la R corresponde a la resistencia térmica entre la pared del pocillo de muestra y el líquido de la muestra y C es la capacidad calorífica del líquido de la muestra. La resistencia térmica es igual a la inversa de la conductividad térmica la cual se expresa en unidades de vatios segundos por grado Kelvin.
Debido a las corrientes de convección 292 señaladas en el líquido de la muestra de la figura 15, todos los sitios en la mezcla de reacción del líquido de la muestra están muy próximamente a la misma temperatura; el flujo de calor entre el bloque y la muestra está muy cercanamente proporcional a la diferencia de temperatura entre el bloque de muestras y la mezcla de reacción de muestra. La constante de proporcionalidad es la conductividad térmica entre la pared del pocillo de muestra en el bloque de muestras 12 y la mezcla de reacción. Para diferentes volúmenes de muestra o diferentes tubos, es decir diferentes espesores de pared o materiales, la constante de tiempo térmica será diferente. En tal caso, el usuario puede, como parte de su especificación del protocolo PCR, introducir el volumen de muestra o el tipo de tubo y la máquina buscará automáticamente la constante de tiempo térmica correcta para usarla en el cálculo de la temperatura de la muestra. En algunas realizaciones, el usuario puede introducir la constante de tiempo real, y la máquina la usará para el cálculo de la temperatura de la muestra.
Para mantener la constante de tiempo térmica tan pequeña como sea posible, las paredes cónicas de los tubos de muestra deberían ser tan delgadas como sea posible. En la realización preferida, estas paredes cónicas tienen 0,23 mm de grosor mientras que las paredes de la parte cilíndrica del tubo de muestras tienen 0,76 mm de espesor. La forma cónica del tubo de muestra proporciona una superficie relativamente grande de contacto con el metal de la pared del pocillo de muestra en relación con el volumen de la mezcla de muestra.
El moldeado de los tubos de muestra se realiza usando un sistema de "colada fría" y un molde de cuatro cavidades en el que se moldean cuatro tubos de muestra en cada inyección. El plástico fundido se inyecta en la punta del cono del tubo de forma que cualquier resto del plástico se proyectará en la cavidad 291 entre la punta del tubo de muestra y la punta del pocillo de muestra. Éste impide que cualquier resto interfiera con el ajuste alineado entre el tubo y el pocillo. Se fija un límite máximo de 0,76 mm para el tamaño de cualquier resto de plástico.
En varias realizaciones, pueden usarse tres grados distintos de polipropileno cada una con sus diferentes ventajas. El polipropileno preferido es el PD701 de Himont porque es apto para autoclaves. No obstante este plástico es difícil de moldear debido a que tiene un bajo índice de fusión. Este plástico tiene un índice de fusión de 35 y una densidad molecular de 9. El PD701 tiende a dejar manchas y crear partes con una calidad de alguna forma irregular pero funcionaría mejor si fuera inyectado en la parte de las paredes delgadas del molde en lugar de en la punta de la sección cónica como se hace normalmente. Generalmente, es deseable que tenga un alto índice de fusión para un fácil moldeado pero también una densidad molecular alta para mantener una buena rigidez e impedir su agrietado o rotura bajo el estrés térmico del proceso de autoclave a 127ºC. Otro plástico, el PPW1780 de American Hoescht tiene un índice de fusión de 75 y una densidad molecular de 9 y es apto para autoclaves. Otro plástico que puede usarse en algunas realizaciones es el Himont 444. Este plástico no es apto para autoclaves y necesita ser esterilizado de otra forma.
En realizaciones alternativas, los tubos pueden moldearse usando un sistema de "colada caliente" o "tobera caliente" donde la temperatura del plástico fundido se controla hasta salida hacia el molde. También, en algunas realizaciones, se pueden usar múltiples salidas. Sin embargo, ninguna de estas técnicas han probado experimentalmente en el momento de escribir esto que sean mejores que el sistema actualmente usado de "colada fría".
El hecho de que el sistema actúe térmicamente como circuito RC de constante de tiempo simple es un importante resultado, porque significa que si la conductividad térmica desde el bloque de muestras a la mezcla de reacción de muestra es conocida y uniforme, la respuesta térmica de las mezclas de muestra será conocida y uniforme. Dado que la capacidad calorífica de la mezcla de reacción de muestra es conocida y constante, la temperatura de la mezcla de reacción de muestra puede ser calculada con precisión usando sólo el histórico de las medidas de la temperatura del bloque en el tiempo. Esto elimina la necesidad de medir la temperatura de la muestra eliminando por ello los errores y la dificultad mecánica de situar una sonda con masa térmica no despreciable en un pocillo de muestra para medir la temperatura de la muestra directamente y con ello cambiar la masa térmica de la muestra en el pocillo probado.
El algoritmo que realiza este cálculo imita el comportamiento térmico del sistema a la manera de un circuito eléctrico RC serie con constante de tiempo simple. Ese modelo usa la relación de la capacidad calorífica de la muestra líquida dividida por la conductividad térmica desde el bloque de muestras a la mezcla de reacción de muestra. La capacidad calorífica de la mezcla de reacción de muestra es igual al calor específico del líquido multiplicado por la masa del líquido. La resistencia térmica es igual a uno dividido por la conductividad térmica desde el bloque de muestras a la mezcla de reacción líquida a través de las paredes del tubo de muestra. Cuando está relación de la capacidad calorífica dividida por la conductividad térmica se expresa en unidades consistentes, tiene la dimensión de tiempo. Para un volumen de muestra fijo y una composición de muestra fija ambos de los cuales son los mismos en cada pocillo de muestra y una conductividad térmica fija, la relación es también una constante para cada pocillo de muestra, y se denomina la constante de tiempo térmica del sistema. Es el tiempo necesitado por la temperatura de la muestra para llegar al 36,8% de la temperatura del bloque tras un cambio en escalón brusco en la temperatura del bloque.
Hay un teorema matemático usado en el análisis de circuitos electrónicos que mantiene que es posible calcular la respuesta de salida de un filtro u otro sistema lineal si se conoce la respuesta del sistema a un impulso. Esta respuesta a un impulso se conoce también como la función de transferencia. En el caso de un circuito serie RC, la respuesta a un impulso es una función exponencial como se muestra en la figura 16A. El estímulo de impulso que da como resultado la respuesta de la figura 16A es como el mostrado en la figura 16B. El teorema matemático anteriormente referido mantiene que la respuesta de salida de tal sistema lineal puede determinarse por el cálculo de la convolución de la señal de entrada y una función de ponderación donde la función de ponderación es la respuesta del sistema al impulso invertida en el tiempo. La convolución es también conocida como una media ponderada móvil a pesar de que una convolución es un concepto de cálculo con intervalos infinitamente pequeños mientras que una media ponderada móvil tiene intervalos discretos, es decir, muestras múltiples. La respuesta a un impulso del circuito serie RC mostrado en la figura 16D es tal que cuando la tensión del generador de tensión V aumenta de pronto y cae con un pico de tensión como se muestra en la figura 16B, la tensión del condensador C aumenta rápidamente hasta un pico en 294 de la figura 16A que es igual al pico de tensión del impulso mostrado en la figura 16B y entonces decae exponencialmente hacia su estado estable de tensión V_{1}. La función de ponderación resultante es la respuesta al impulso de la figura 16A invertida en el tiempo como se muestra en la figura 16C en 385.
Sobrepuesta en la figura 16C está una curva hipotética 387 ilustrando un historial de temperatura típico para la temperatura del bloque de muestras 12 para un cambio aproximado de la temperatura en escalón. También se sobreponen en la figura 16C los tiempos de cinco periodos de muestra de temperatura etiquetados. De acuerdo con las enseñanzas de la invención, la temperatura de la muestra se calcula multiplicando la temperatura de cada uno de estos tiempos T_{1} a T_{5} por el valor de la función de ponderación en ese tiempo particular y sumando entonces todos estos productos y dividiéndolos por 5. El hecho de que el sistema térmico actúe como un circuito lineal de constante de tiempo simple es un resultado sorprendente basándonos en las complejidades de las consideraciones de la transferencia de calor en este complicado sistema térmico.
En una realización, el cálculo de la temperatura de la muestra se ajusta con un corto retardo para tener en cuenta el retraso en el transporte causado por las diferentes longitudes del recorrido térmico para el detector de temperatura del bloque y para la muestra líquida. La temperatura de la muestra calculada se visualiza para información del usuario en la pantalla 16 indicada en la figura 1.
La figura 17 muestra los resultados de la respuesta de la temperatura en seis pocillos diferentes repartidos a través del bloque de muestras de 96 pocillos a un cambio en escalón en la temperatura del bloque de muestras desde una temperatura relativamente baja en el rango de temperatura de la hibridación/extensión a la temperatura relativamente alta de aproximadamente 94ºC usada para desnaturalización. El gráfico de la figura 17 muestra una buena concordancia entre la elevación exponencial predicha en la temperatura de la muestra si el sistema fuera perfectamente análogo al circuito RC serie mostrado en la figura 16D, y también muestra una excelente uniformidad de la respuesta de la temperatura en que las temperaturas de los seis pocillos de muestra usados para este estudio se aproximan asintóticamente a temperaturas muy cercanas entre sí y en una banda de "tolerancia" de la temperatura de desnaturalización que tiene una amplitud de aproximadamente 0,5ºC.
En una realización, se usan las 10 muestras de temperatura del bloque más recientes para ejecutar una media ponderada, pero en otras realizaciones pueden usarse un número diferente de muestras históricas de temperatura. La buena concordancia con los resultados teóricamente predichos proviene del hecho de que las corrientes de convección térmica producen una buena mezcla de los líquidos de las muestras haciendo por ello que el sistema actúe de forma lineal.
La uniformidad entre las temperaturas de la muestra en varios pocillos de muestra repartidos a través de la matriz de 96 pocillos es el resultado del equilibrio local y simetría local estática y dinámica en la estructura del bloque de muestras así como de todos los otros factores de diseño térmico aquí detallados. Nótese sin embargo que durante los cambios rápidos de temperatura todos los pocillos de muestra tendrán temperaturas difiriendo entre sí 0,5ºC sólo si el usuario ha llenado cuidadosamente cada pocillo de muestra con la misma masa de muestra de la muestra líquida. Las desigualdades en la masa en diferentes pocillos no producen temperaturas desiguales en un estado estable, con condiciones no cambiantes, sólo durante los cambios rápidos. La masa de la muestra líquida en cada pocillo es el factor dominante para determinar la capacidad calorífica de cada muestra y, por tanto, es el factor dominante en la constante de tiempo térmica para ese pocillo de muestra particular.
Nótese que la capacidad para hacer que la muestra líquida en todos los pocillos de muestra suban y bajen su temperatura al unísono y se estabilicen en temperaturas objetivo muy cercanas entre sí, es decir, en bandas de tolerancia que tienen sólo una amplitud de 0,5ºC, también depende de la fuerza F de la figura 15. Esta fuerza debe exceder una fuerza límite mínima antes de que las constantes de tiempo térmicas de todos los pocillos de muestra rellenos con masas similares de la muestra líquida tengan la misma constante de tiempo. Este mínimo nivel de fuerza se ha determinado experimentalmente que está en 30 gramos para la configuración de tubo de muestra y pocillo de muestra aquí descrita. Para mayores niveles de precisión, el mínimo nivel de fuerza F de la figura 15 debería establecerse en al menos 50 gramos y preferiblemente 100 gramos para tener un margen adicional de seguridad como se dijo anteriormente.
La importancia de la uniformidad térmica en la temperatura del pocillo de muestras puede apreciarse refiriéndonos a la figura 18. Esta figura muestra la relación entre la cantidad de ADN generado en un ciclo PCR y la temperatura real durante el intervalo de desnaturalización de un ejemplo de una amplificación de un cierto segmento de ADN. La pendiente de la función 298 entre las temperaturas 93 y 95 grados centígrados es aproximadamente 8% por grado centígrado para este caso particular de ADN y cebadores. La figura 18 muestra la forma general de la curva con relación a la cantidad de ADN generado por amplificación, pero los detalles de la forma de la curva variarán con cada caso diferente de cebadores y ADN objetivo. Las temperaturas para desnaturalización por encima de 97 grados centígrados son generalmente demasiado calientes y dan como resultado una disminución de la amplificación al incrementar la temperatura de desnaturalización. Las temperaturas entre 95 y 97 grados centígrados son generalmente las justamente correctas.
La figura 18 ilustra que cualquier pocillo de muestra que contenga esta combinación particular de ADN objetivo y cebador y que se fija a una temperatura de desnaturalización de aproximadamente 93ºC tendrá comúnmente un 6% menos de ADN generado durante la realización de un protocolo PCR típico que pocillos desnaturalizados a 94ºC. En la misma forma, muestras líquidas de esta mezcla que estabilicen sus temperaturas de desnaturalización a 95ºC tendrán comúnmente un 8% más de ADN generado aquí que el que es generado en pocillos de muestra que se estabilicen en temperaturas de desnaturalización de 94ºC. Debido a que todas las curvas de esta naturaleza tienen la misma forma general, es importante tener una uniformidad en la temperatura de la muestra.
Las temperaturas de la muestra calculadas como se describe anteriormente se usan por el algoritmo de control para controlar los calentadores y el caudal a través de los canales de refrigeración rápida y determinar cuanto tiempo se han mantenido las muestras en varias temperaturas objetivo. El algoritmo de control usa estos tiempos para su comparación con los tiempos deseados para período de incubación tal como se introdujo por el usuario. Cuando coinciden los tiempos, el algoritmo de control toma las medidas apropiadas para calentar o enfriar el bloque de muestras hacia la temperatura objetivo definida por el usuario para la siguiente incubación.
Cuando la temperatura de la muestra calculada está dentro de un grado centígrado del punto de consigna, es decir, la temperatura de incubación programada por un usuario, el programa de control arranca un temporizador. Este temporizador puede reajustarse para contar hacia atrás desde un número fijado como el tiempo para el intervalo especificado por usuario para la incubación en realización. El temporizador comienza la cuenta atrás desde el valor preajustado cuando la temperatura calculada de la muestra está dentro de un grado centígrado. Cuando el temporizador alcanza un valor cero, se activa una señal que hace que la CPU tome acciones para incrementar el siguiente segmento del protocolo PCR. Cualquier forma de temporizar el intervalo especificado será suficiente para la finalidad de poner en práctica la invención.
Típicamente, la banda de tolerancia alrededor de cualquier temperatura objetivo particular es más o menos 0,5ºC. Una vez se alcanza la temperatura objetivo, el calculador mantiene al bloque de muestras a la temperatura objetivo usando los canales de refrigeración de control y el calentador de película de forma tal que las muestras permanezcan cerca de la temperatura objetivo durante el intervalo especificado.
Para que el sistema térmico aquí descrito funcione bien, la conductividad térmica desde el bloque de muestras a cada muestra debe ser conocida y uniforme dentro de una tolerancia muy estrecha. De otra forma, no todas las muestras se mantendrán dentro de la banda de tolerancia especificada para la temperatura objetivo cuando arranca el temporizador y no todas las muestras experimentarán los mismos intervalos de incubación a la temperatura objetivo.
También, para que este sistema térmico funcione bien, todos los tubos de muestra deben aislarse de variables en el entorno ambiental. Esto es, no es deseable, que ciertos tubos de muestra sean refrigerados por corrientes de aire mientras que otros tubos de muestra en diferentes posiciones físicas no experimentan los mismos efectos de refrigeración. Para lograr una buena uniformidad es altamente deseable que las temperaturas de todas las muestras se determinen por la temperatura del bloque de muestras y por nada más.
El aislamiento de los tubos del ambiente y la aplicación de un nivel mínimo de fuerza F hacia abajo sobre los tubos de muestra se obtienen mediante una cubierta calentada sobre los tubos de muestra y el bloque de muestras.
A pesar de que la muestra líquida está en un tubo de muestra estrechamente presionado contra un bloque metálico de temperatura controlada, con un cierre apretado, con un menisco bien por debajo de la superficie del bloque metálico de temperatura controlada, las muestras aún perderán su calor hacia arriba por convección. Significativamente, cuando la muestra está muy caliente (la temperatura de desnaturalización está típicamente cerca del punto de ebullición de la muestra líquida), la muestra líquida puede perder una cantidad muy significativa de calor por el reflujo del vapor de agua. En este proceso, el agua se evapora de la superficie caliente de la muestra líquida y se condensa en el interior de las paredes de la tapa y de las partes superiores frías del tubo de muestra por encima de la superficie superior del bloque de muestras. Si hay un volumen de muestra relativamente grande, la condensación continúa y se forma arriba el condensado que desciende por las paredes del tubo de muestra hasta la mezcla de reacción. Este proceso de "reflujo" se lleva alrededor de 2300 julios de calor por gramo de agua en reflujo. Este proceso puede producir una caída de varios grados en la temperatura superficial de una mezcla de reacción de 100 microlitros causando por ello una gran reducción en la eficiencia de la reacción.
Si la mezcla de reacción es pequeña, digamos 20 microlitros, y el tubo de muestra tiene una superficie relativamente grande por encima de la superficie superior del bloque de muestras, una fracción significativa del agua en la mezcla de reacción puede evaporarse. Esta agua puede entonces condensarse en el interior de la parte superior del tubo de mezcla y permanecer ahí por la tensión superficial durante el resto de la parte del ciclo a alta temperatura. Esto puede concentrar de tal forma el resto de la mezcla de reacción que la reacción se perjudica o falla completa-
mente.
En los realizadores de ciclos térmicos PCR de técnicas anteriores, el problema del reflujo fue resuelto recubriendo la mezcla de reacción con una capa de aceite o cera fundida. Esta capa no miscible de aceite o cera flotaba en la mezcla de reacción acuosa e impedía la rápida evaporación. Sin embargo, se requería un trabajo para añadir el aceite lo que elevaba el coste de los procesos. Adicionalmente, la presencia de aceite interfería con los pasos siguientes de procesado y análisis y creaba una posibilidad de contaminación en la muestra. De hecho, es sabido que aceites minerales de grado industrial contaminaron muestras en el pasado por la presencia desconocida de factores contaminantes en el aceite que eran desconocidos para los usuarios.
La necesidad de un recubrimiento de aceite se elimina, y los problemas de pérdida de calor y concentración de la mezcla de reacción por evaporación y los efectos térmicos no predecibles por el reflujo se evitan, de acuerdo con las enseñanzas de la invención, encerrando el volumen por encima del bloque de muestras en el cual se proyectan las partes superiores del tubo de muestra y calentando este volumen desde arriba por una cubierta calentada a veces llamada también aquí en adelante la placa de presión.
Refiriéndonos a la figura 19, se muestra en ella una vista de sección de la estructura que se usa para encerrar los tubos de muestra y aplicar una fuerza hacia abajo en ellos de forma que se suministre el mínimo nivel de fuerza F de la figura 15. Se acopla una placa de presión calentada 14 a un tornillo de carga 312 de forma que se mueva arriba y abajo a lo largo del eje simbolizado por la flecha 314 con la rotación del tornillo de carga. El tornillo de carga está roscado a través de una apertura en la cubierta deslizante 316 y se gira mediante un mando 318. La placa de presión 314 se mantiene a una temperatura por encima del punto de ebullición del agua por calentadores de resistencia (no mostrados) controlados por el ordenador 20.
La cubierta deslizante se desliza adelante y atrás a lo largo del eje Y sobre los raíles 320 y 322. La cubierta 316 incluye los laterales verticales 317 y 319 y también incluye los lados verticales paralelos al plano X-Z (no mostrados) que encierran el bloque de muestras 12 y los tubos de muestra. Esta estructura básicamente impide que las corrientes de aire actúen sobre los tubos de muestra, de los cuales los tubos 324 y 326 son típicos.
La figura 20 es una vista en perspectiva de la cubierta deslizante 316 y el bloque de muestras 12 con la cubierta deslizante en posición retirada para permitir el acceso al bloque de muestras. La cubierta deslizante 316 se asemeja a la tapa de una caja rectangular teniendo la pared 328 la porción 330 retirada para permitir que la cubierta deslizante 316 se deslice sobre el bloque de muestras. La cubierta deslizante se mueve a lo largo del eje Y en la figura 20 hasta que la cubierta se centra sobre el bloque de muestras 12. El usuario entonces gira el mando 318 en una dirección para bajar la placa de presión calentada 14 hasta que una marca 332 sobre el mando 318 se alinea con una marca 334 sobre un escudete 336. En algunas realizaciones, el escudete 336 puede fijarse permanentemente a la parte superior de la cubierta deslizante 316. En otras realizaciones. El escudete 336 puede ser girado de forma que la marca 334 puede situarse en posiciones diferentes cuando se usan diferentes tamaños de tubos de muestra. En otras palabras, si se usan tubos de muestra más altos la placa de presión calentada 14 no necesita bajarse tanto para aplicar el nivel mínimo de fuerza F de la figura 15. Al utilizarlo, el usuario gira el tornillo 318 para bajar la placa de presión 14 hasta que se alinean las marcas de índice. Entonces el usuario sabe que se ha aplicado el nivel de fuerza mínimo F a cada tubo de muestra.
Refiriéndonos conjuntamente a las figuras 15 y 19, antes de bajar la placa de presión calentada 14 de la figura 19, las tapas plásticas 338 de cada tubo de muestra sobresalen alrededor de 0,5 mm por encima del nivel de la parte superior de las paredes de la bandeja plástica 340 (figura 19) que mantiene todos los tubos de muestra en una matriz separada de 8 x 12 con centros a 9 milímetros. La matriz de pocillos de muestra puede sostener hasta 96 tubos de PCR MicroAmp^{TM} de 100 \mul de capacidad o 48 tubos mayores GeneAmp^{TM} de 0,5 ml de capacidad. Los detalles de esta bandeja serán discutidos en gran detalle a continuación. La bandeja 340 tiene una superficie plana con una matriz de agujeros de 8 x 12 para los tubos de muestra. Esta superficie plana se muestra en las figuras 15 y 19 como una línea horizontal que se cruza con los tubos de muestra 324 y 326 en la figura 19. La bandeja 340 tiene también cuatro paredes verticales dos de las cuales se muestran en 342 y 344 de la figura 19. El nivel superior de estas paredes verticales, mostrado en 346 de la figura 15, establece una caja rectangular que define un plano de referencia.
Como se ve mejor en la figura 15, las tapas 338 de todos los tubos de muestra se proyectan por encima de este plano de referencia 346 en una pequeña cantidad que se diseña para permitir que las tapas 338 sean ablandadas y deformadas por la placa de presión calentada 14 y "aplastadas" hacia abajo al nivel del plano de referencia 346. En la realización preferida, la placa de presión calentada 14 se mantiene a una temperatura de 105ºC por la CPU 20 de la figura 1 y el bus 22 acoplado a los calentadores de resistencias (no mostrados) en la placa de presión 14. En la realización preferida, el mando 318 de la figura 19 y el tornillo de carga 312 se giran hasta que la placa de presión calentada 14 desciende y hace contacto con las partes superiores de las tapas 338. En la realización preferida, las tapas 338 de los tubos de muestra están hechas de polipropileno. Estas tapas se ablandan poco tiempo después de entrar en contacto con la placa de presión calentada 14. Al ablandarse las tapas, se deforman, pero no pierden toda su elasticidad. Tras contactar con las tapas, la placa de presión calentada se desciende adicionalmente hasta que descansa sobre el plano de referencia 346. Este descenso adicional deforma las tapas 338 y produce un nivel mínimo de fuerza F de al menos 50 gramos para empujar cada tubo de muestra y mantener cada tubo asentado firmemente en su pocillo de muestra. La cantidad en la que las tapas 338 se proyectan por encima del plano de referencia 346, y la cantidad de deformación y elasticidad residual cuando la placa de presión calentada 14 descansa sobre el plano de referencia 346, se diseñan tal que se haya alcanzado un nivel mínimo de fuerza F de al menos 50 gramos y preferiblemente 100 gramos para todos los tubos de muestra entonces presentes después de que la placa de presión calentada 14 ha descendido al nivel del plano de referencia 346.
La placa de presión calentada 14 y las cuatro paredes verticales y superficie plana de la bandeja 340 forman un compartimiento calentado, sellado cuando la placa de presión 14 está en contacto con el borde superior 346 de la bandeja. El plástico de la bandeja 340 tiene una propiedad de conductividad térmica relativamente pobre. Se ha hallado experimentalmente que poniendo en contacto la placa de presión calentada 14 con las tapas 338 y aislando la parte de los tubos de muestra 288 que se proyectan por encima del nivel superior 280 del bloque de muestras 12 con una pared de material que tenga una conductividad térmica relativamente pobre tiene resultados beneficiosos. Con esta estructura, toda la parte superior del tubo y tapa se llevan a una temperatura que está suficientemente alta para que se forme poca o ninguna condensación en las superficies interiores del tubo y tapa ya que la placa calentada se mantiene a una temperatura por encima del punto de ebullición del agua. Esto es verdad incluso cuando el líquido de la muestra 276 de la figura 15 se calienta a una temperatura cerca de su punto de ebullición. Esto elimina la necesidad de una capa de material no miscible tal como aceite o cera flotando encima de la mezcla de muestra 276 y por ello reduciendo la cantidad de trabajo involucrado en la reacción PCR y eliminando una fuente de posible contaminación de la
muestra.
Se ha hallado experimentalmente que a pesar de la muy alta temperatura de la cubierta calentada y su cercana proximidad al bloque de muestras 12, es pequeño el efecto sobre la aptitud del bloque de muestras 12 para realizar ciclos precisa y rápidamente entre temperaturas altas y bajas.
La placa de presión calentada 14 impide el enfriamiento de las muestras por el proceso de reflujo anteriormente mencionado debido a que mantiene la temperatura de las tapas por encima del punto de condensación del agua y de ahí que se mantengan los interiores de las tapas secos. Esto también impide la formación de vapores cuando las tapas se retiran de los tubos.
En realizaciones alternativas, cualquier medio por el que pueda aplicarse la mínima fuerza hacia abajo aceptable F de la figura 15 a cada tubo de muestra individual independientemente del número de tubos de muestra presentes y que pueda impedir la condensación y reflujo y refrigeración por convección será suficiente para los propósitos de poner en práctica la invención. La aplicación de esta fuerza hacia abajo F y el uso de calor para impedir el reflujo y la concentración no deseada de la muestra líquida no necesitan ser implementados ambos por el mismo sistema que se utiliza en la realización preferida.
Los tubos de muestra pueden variar en unas pocas centésimas de milímetro en su altura total. Adicionalmente, las tapas de los tubos de muestra también pueden variar su altura en unas pocas centésimas de milímetro. También, cada pocillo de muestra cónico en el bloque de muestras 12 puede no estar taladrado exactamente a la misma profundidad, y cada pocillo de muestra cónico en el bloque de muestras puede estar taladrado con un diámetro y ángulo ligeramente diferentes. Así, cuando una población de tubos tapados se coloca en el bloque de muestras para asentarse en los correspondientes pocillos de muestra, la parte superior de las tapas no estarán todas necesariamente a la misma altura. La discrepancia en el peor caso para esta altura podría llegar a ser tanto como 0,5 milímetros desde el más alto al más bajo de los tubos.
Si una placa de presión perfectamente plana y no calentada 14 montada de forma que quede libre para encontrar su propia posición fuese presionarse hacia abajo sobre tal matriz de tapas, tocaría primero los tres tubos más altos. Al aplicar una presión adicional y los tubos más altos comprimirse en alguna forma, la placa de presión comenzaría a tocar algunas de las tapas de los tubos más bajos. Hay una clara posibilidad de que, a menos de que el conjunto de los tubos y tapas se adaptase, los tubos más altos se dañarían antes de que se entrara en contacto en absoluto con los tubos más bajos. Alternativamente, la fuerza necesaria para comprimir todos los tubos altos suficientemente como para ponerse en contacto con los tubos más cortos debería ser demasiado grande para ser aplicada al dispositivo. En cualquier caso, uno o más tubos cortos podrían no ser presionados en absoluto o podrían presionarse hacia abajo con una cantidad de fuerza insuficiente para garantizar que la constante de tiempo térmica para ese tubo fuese igual que las constantes de tiempo térmicas de todos tubos restantes. Esto produciría el fallo en alcanzar el mismo ciclo PCR para todos los tubos en el bloque de muestras ya que los mismos tubos con diferentes constantes de tiempo térmicas no seguirían el mismo paso que el resto de tubos. El calentamiento de la placa de presión y el ablandamiento de las tapas elimina estos riesgos impidiendo que sean un factor a considerar los errores de tolerancia en la fabricación que conducen a diferentes alturas en los tubos.
En una realización alternativa, la placa de presión calentada 14 entera se cubre con una capa de goma adaptada. Una capa de goma adaptada sobre la placa de presión calentada resolvería el problema de la tolerancia en altura, pero podría también actuar como una capa de aislamiento térmico que retrasaría el flujo de calor desde la placa de presión calentada a las tapas de los tubos. Adicionalmente, tras un largo uso a altas temperaturas, la mayoría de los materiales de goma se deterioran o se vuelven duros. Es deseable por tanto que la superficie de la placa de presión calentada sea de metal y un buen conductor del calor.
En otra realización alternativa, se pueden montar 96 muelles individuales sobre la placa de presión de forma que cada muelle presione individualmente hacia abajo sobre un único tubo de muestra. Esta es una solución compleja y costosa, sin embargo, y requiere que la placa de presión se alinee sobre la matriz de tubos con una precisión mecánica que sería difícil o incómoda de alcanzar.
La adaptación individual necesaria para cada tubo de muestra en la realización preferida se proporciona por el uso de tapas plásticas que colapsan de forma predecible bajo la fuerza de la placa de presión pero que, incluso cuando están colapsadas, aún ejercen una fuerza hacia abajo F sobre los tubos de muestra que es adecuada para mantener cada tubo de muestras firmemente asentado en su pocillo.
En la tapa del tubo de muestra 338 mostrado en la figura 15, la superficie 350 debería estar libre de hendiduras, manchas y con forma que pueda proporcionar un sellado hermético con las paredes interiores 352 de la muestra, tubo 288. En la realización preferida, el material de la tapa es polipropileno. Un material adecuado podría ser Valtec HH-444 ó PD701 polipropileno fabricado por Himont como se describió anteriormente o PPW 1780 de American Hoescht. En la realización preferida, el grosor de la pared para la porción abombada de la tapa es 3,30 + 0,00 - 0,13 mm. El espesor de la porción de los hombros 356 es 0,635 mm y el ancho de la porción de la tapa con forma de cúpula es de 5,16 mm en la realización preferida.
Cualquier material y configuración para las tapas que haga que se aplique el mínimo nivel de fuerza F de la figura 15 a todos los tubos de muestra y que permita que la tapa y las partes superiores de los tubos de muestra se calienten a una temperatura suficientemente alta para impedir la condensación y el reflujo será suficiente para los propósitos de poner en práctica la invención. La tapa con forma de cúpula 338 tiene una pared delgada para ayudar en la deformación de la tapa. Debido a que la placa de presión calentada se mantiene a una alta temperatura, el grosor de la pared de la tapa con forma de cúpula puede ser suficientemente gruesa para ser fácilmente fabricada por moldeado por inyección ya que la necesaria adaptación para tener en cuenta las diferencias en la altura de los tubos no es necesaria a la temperatura ambiente.
La placa de presión puede mantenerse a una temperatura en cualquier punto entre 94ºC a 110ºC de acuerdo con las enseñanzas de la invención aunque se prefiere el rango de 100ºC a 110ºC para prevenir el reflujo ya que el punto de ebullición del agua es 100ºC. En este rango de temperaturas, se ha hallado experimentalmente que las tapas se ablandan justo lo suficiente para colapsar fácilmente hasta en 1 milímetro. Los estudios han enseñado que las propiedades elásticas del polipropileno usado son tales que incluso a estas temperaturas, el colapso no es enteramente inelástico. Esto es, incluso aunque la placa de presión calentada produzca la deformación permanente de las tapas, el material de las tapas aún retiene una fracción suficientemente significativa de su elasticidad a temperatura ambiente como para que el mínimo nivel de fuerza F se aplique en cada tubo de muestra. Adicionalmente, la placa de presión calentada nivela todas las tapas con las que contacta sin excesiva fuerza independientemente de cuantos tubos estén presentes en el bloque de muestras debido al ablandamiento de la tapa.
Debido a que la temperatura de la tapa está por encima del punto de ebullición del agua durante todo el ciclo PCR, las superficies interiores en cada tapa permanecen completamente secas. Así, al final del proceso PCR, si las muestras se enfrían a la temperatura ambiente antes de ser retiradas del bloque de muestras, si se abre la tapa de cada tubo de muestras, no hay posibilidad de crear un rociado de vapores del contenido del tubo de muestras que podría dar como resultado una contaminación cruzada. Esto se debe a que no hay líquido en la tapa que sella el tubo cuando el sello se rompe.
Esto es extremadamente ventajoso, porque minúsculas partículas de vapor, conteniendo producto de ADN amplificado pueden contaminar un laboratorio y llegar a tubos de muestra que contienen muestras de otras fuentes, por ejemplo, otros pacientes, causando posiblemente por ello falsos resultados diagnósticos positivos o negativos que pueden ser muy perturbadores. Los usuarios de los procesos de amplificación PCR están extremadamente preocupados por que no se creen vapores que puedan contaminar otras muestras.
Se usa un sistema de elementos de plástico desechable para convertir los tubos de muestra individuales en una matriz 8 x 12 que es compatible con los equipos de laboratorio en formato de placa de microtitulación pero que mantiene suficiente libertad de movimiento individual para compensar las diferencias en los variados índices de expansión térmica de los componentes del sistema. La relación de la tapa térmicamente adaptaba con el resto de este sistema se ve mejor en la figura 21A que es una vista de sección del bloque de muestras y dos tubos de muestra con tapas en su lugar con los tubos de muestras situados en su sitio por la combinación de una realización de una bandeja plástica de microtitulación de 96 pocillos y un elemento de retención. La figura 21B es una realización alternativa, preferida mostrando la estructura e interrelación de la mayoría de los varios componentes en plástico desechable del sistema. La bandeja de placa de microtitulación plástica rectangular de 96 pocillos 342 descansa sobre la superficie del bloque de muestras 12. El borde superior 346 del marco 342 en una altura que es aproximadamente 0,5 mm más corta que la altura de las tapas de las cuales la tapa 364 es el ejemplo. Todos los tubos tapados proyectarán su altura más allá del borde 346 del marco 342. El marco 342 se configura en tal forma que se extiende hacia abajo un resalte 366 que se introduce en la ranura de la banda de protección 78 a lo largo de su longitud total. El marco 342 tiene sin embargo una muesca (no mostrada) que corresponde con la muesca en la ranura 78 para el detector de temperatura mostrado en la figura 2 visto en planta y en la figura 7 visto en sección.
El plano de referencia 346 anteriormente mencionado se establece por la parte superior del marco 342. Este plano de referencia interactúa con la placa de presión calentada tal como sigue. Antes de girar hacia abajo el mando 318 de la figura 20 para alinear las marcas de índice 332 y 334 y comenzar a ejecutar una amplificación, se ha realizado un proceso de calibración para localizar la posición del índice marcado en la placa escudete 336 de la figura 20. Esta calibración se inicia colocando el marco 342 de la figura 21 en posición sobre el bloque de muestras. El marco 342 estará sin embargo vacío o cualquiera de los tubos de muestra allí no tendrán ninguna de sus tapas colocadas. Entonces, el mando 318 se gira hacia abajo hasta que la placa de presión calentada 14 está firmemente en contacto con el borde superior 346 del marco 342 alrededor de todo su perímetro. Cuando el mando 318 ha sido girado hacia abajo suficientemente para permitir que la placa de presión calentada descanse sobre el plano de referencia 346 y presione el marco 342 firmemente contra la superficie superior 280 del bloque de muestras, el escudete girable 336 de la realización preferida será rotado hasta que el índice de marca 334 sobre el escudete se alinee con la marca índice 332 sobre el mando 318. Entonces, el mando 318 se gira en sentido contrario a las agujas del reloj para elevar la placa de presión 14 y la tapa 316 en la figura 19 se desliza en la dirección Y negativa para descubrir el marco 342 y el bloque de muestras 12. Los tubos de muestra con las tapas colocadas y rellenos con una mezcla de muestra pueden situarse entonces en posición dentro del marco 342. La cubierta calentada 316 se sitúa de nuevo sobre el bloque de muestras, y el mando 318 es girado en el sentido de las agujas del reloj para bajar la placa de presión calentada 14 hasta que la marca índice 332 en el mando se alinea con la marca índice 334 previamente posicionada. Esto garantiza que todos los tubos han sido firmemente asentados con la fuerza mínima F aplicada. El uso de marcas de índice proporciona al usuario una tarea simple y verificable a realizar.
Si hay sólo unos pocos tubos de muestras situados, se necesitará sólo una pequeña cantidad de fuerza de giro para alinear las marcas de índice 332 y 334. Si hay muchos tubos, sin embargo, se necesitará más fuerza de giro en el mando 318 para alinear las marcas de índice. Esto es debido a que cada tubo se resiste al movimiento hacia abajo de la placa de presión calentada 14 al deformarse las tapas. Sin embargo, el usuario se asegura de que cuando las marcas de índice 332 y 334 están alineadas, la placa de presión calentada estará una vez más situada firmemente contra el borde superior 346 del marco 342 y todos los tubos tendrán el nivel mínimo de fuerza F aplicada sobre ellos. Esto virtualmente garantiza que la constante de tiempo térmica será sustancialmente la misma para todos los tubos.
En realizaciones alternativas, puede prescindirse de las marcas de índice 332 y 334, y el mando 318 puede simplemente ser girado en el sentido de las agujas del reloj hasta que no gire más. Esta condición sucederá cuando la placa de presión calentada 314 haya alcanzado el borde superior del plano de referencia 346 y el marco de plástico 342 haya detenido el movimiento adicional hacia abajo de la placa de presión calentada 14. Obviamente en esta realización alternativa, y preferiblemente en la realización de la marca de índice descrita anteriormente, el plástico del marco 342 tendrá una temperatura de fusión que será suficientemente alta para impedir la deformación del plástico del marco 342 cuando esté en contacto con la placa de presión calentada 14. En la realización preferida, el plástico del marco 342 es nylon Celanese 1503 con un espesor de pared de 1,27 mm.
Una ventaja de los sistemas anteriormente descritos es que pueden usarse tubos de muestra de diferentes alturas simplemente usando marcos 342 que tengan alturas diferentes. El marco 342 debería tener una altura que sea aproximadamente 0,5 mm más corta que el plano de las puntas de los tubos tapados cuando ambos están asentados en el bloque de muestras. En la realización preferida, se usan dos alturas de tubo diferentes. El rango del movimiento del tornillo de presión 312 que acciona la placa de presión calentada 14 de la figura 19 debe ser suficiente para todos los tamaños de los tubos de muestra a usar. Naturalmente, durante cualquier ciclo de proceso PCR particular, todos los tubos deben ser de la misma altura.
El sistema anteriormente descrito proporciona temperaturas uniformes en el bloque de muestras, conductividad térmica uniforme desde el bloque de muestras, y aislamiento de los tubos de muestra de los caprichos del ambiente que lo rodea. Cualquier número de tubos de muestra hasta 96 puede ser dispuesto en la matriz en el formato de placa de microtitulación. El sistema permite un control de temperatura preciso para un gran número de muestras e indicación visual de la temperatura de la muestra para todas las muestras sin medir realmente la temperatura de ninguna muestra.
Como contenedor de reacciones PCR, ha sido común en técnicas anteriores usar tubos de polipropileno que estaban diseñados originalmente para microcentrifugadoras. Este tubo de técnicas anteriores tenía una sección de corte cilíndrica cerrada por la parte superior por una tapa ajustada que realizaba sellado contra gas. Este tubo de técnicas anteriores tenía una sección inferior que comprimía el tronco de un cono con un ángulo incluido de aproximadamente 17 grados.
Cuando tal tubo de muestra cónico se presiona hacia abajo en el pocillo de muestra de un bloque de muestras con una cavidad cónica con el mismo ángulo incluido, y cuando la mezcla de la muestra en el tubo cae enteramente dentro del volumen cónico y por debajo de la superficie superior del bloque de muestras, la conductividad térmica entre el bloque y el líquido puede hacerse adecuadamente predecible para una buena uniformidad de la temperatura de la muestra a través del la matriz. Para conseguir un control adecuado de la conductividad térmica entre el bloque de muestras y la mezcla de muestra, los ángulos incluidos del tubo cónico y del pocillo de muestra deben estar muy próximos, y las superficies cónicas del tubo y del pocillo deben ser suaves y mantenerse juntas en una relación a nivel. Adicionalmente, el mínimo nivel de fuerza F debe aplicarse a cada tubo de muestra para presionar cada tubo ajustadamente en su pocillo de muestra de forma que no se eleve o quede flojo en el pocillo durante el ciclo térmico por cualquier razón, tal como la formación de vapor en el líquido atrapado en el espacio 291 de la figura 15. Finalmente, cada tubo debe ser rellenado con la misma cantidad de muestra líquida. Si se cumplen las condiciones anteriormente listadas, la conductividad térmica entre el bloque de muestras y la muestra líquida en cada tubo se determinará predominantemente por la conductividad de la pared plástica del cono 368 de la figura 15 y una capa límite (no mostrada) de la muestra líquida en la superficie interior 370 de la pared cónica del tubo de muestra.
La conductividad térmica de las paredes del tubo plástico se determinan por su grosor, que puede ser rigurosamente controlado por el método de moldeo por inyección en la fabricación de los tubos. La muestra líquida en todos los tubos de muestra tiene virtualmente idénticas propiedades térmicas.
Se ha hallado experimentalmente y por cálculo que una única pieza moldeada de placa de microtitulación con 96 pocillos sólo es marginalmente viable para la PCR debido a que las diferencias en los coeficientes de expansión térmica entre el aluminio y el plástico conducen a cambios dimensionales que pueden destruir la uniformidad de la conductividad térmica con la muestra líquida a través de la matriz. Esto es, dado que cada pocillo en tal placa de pieza única se conecta con los demás pocillos a través de la superficie de la placa, las distancias entre los pocillos se determinan en el momento de la fabricación inicial de la placa pero cambian con la temperatura cambiante dado que el plástico de la placa tiene un significativo coeficiente de expansión térmica. También las distancias entre los pocillos de muestra en el bloque de muestras metálico 12 dependen de la temperatura del bloque de muestras dado que el aluminio también tiene un significativo coeficiente de expansión térmica que es diferente del de plástico. Para tener una buena conductividad térmica, cada pocillo de muestra en una placa de microtitulación en una pieza de 96 pocillos debería ajustar casi perfectamente al correspondiente pocillo del bloque de muestras a todas las temperaturas. Dado que la temperatura del bloque de muestras cambia en un amplio rango de temperaturas, las distancias entre los pocillos de muestras en el bloque de muestras varían cíclicamente durante el ciclo PCR. Debido a que los coeficientes de expansión térmica para el plástico y el aluminio son sustancialmente diferentes, las distancias de separación de los pocillos en el bloque de muestras variarían de forma diferente con las temperaturas cambiantes a como lo harían las distancias entre los pocillos de muestra de la placa de microtitulación plástica en una pieza de 96 pocillos.
Así, como importante criterio para un perfecto ajuste entre el tubo de muestra y el correspondiente pocillo de muestra en el rango de temperaturas de la PCR, es necesario que cada tubo de muestra en la matriz de 96 pocillos sea individualmente libre de moverse lateralmente y que cada tubo sea individualmente libre de ser presionado hacia abajo verticalmente en cualquier cantidad necesaria para hacer contacto enrasado con las paredes del pocillo de muestra.
Los tubos de muestra usados en la invención son diferentes de los tubos de microcentrifugación de técnicas anteriores en que el grosor de las paredes de la posición de tronco cónica del tubo de muestra es más delgada para permitir una transferencia de calor más rápida hacia y desde el líquido de la muestra. La parte superior de estos tubos tiene un grosor de pared más grueso que la parte cónica. En la figura 15, el grosor de la pared en la parte cilíndrica de la figura 15 es generalmente 0,76 mm mientras que el grosor de la pared de la pared cónica 368 es de 0,23 mm. Debido a que las partes delgadas se enfrían más rápido que las partes gruesas en el proceso de moldeado por inyección, es importante extraer completamente el molde antes de que las partes delgadas se enfríen.
El material de los tubos de muestra debe ser químicamente compatible con la reacción de la PCR. El vidrio no es un material compatible con PCR, debido a que el ADN se adhiere al vidrio y no se despegará lo que interferiría con la amplificación PCR. Se usa preferiblemente un polipropileno válido para autoclave. Aquí se identificaron anteriormente tres tipos de polipropileno adecuados. Algunos plásticos no son compatibles con el proceso PCR debido al desprendimiento de materiales gaseosos del plástico o porque el ADN se adhiere a las paredes plásticas. El polipropileno es el mejor de los plásticos conocidos en este momento.
Las técnicas convencionales de moldeado por inyección y las técnicas de fabricación de moldes para el molde de inyección son suficientes para la finalidad de poner en práctica la invención.
El uso de tubos de muestra con forma de cono básicamente traduce todos los errores de tolerancia en la fabricación en errores de altura, es decir, una variación de tubo a tubo en la altura desde la punta de la tapa a la parte superior del bloque de muestras cuando el tubo de muestra se asienta en el pocillo de muestra. Por ejemplo, un error angular para el ángulo de las paredes del tubo de muestra se convierte en un error de altura cuando el tubo se coloca en el bloque de muestras debido al desajuste entre el ángulo de la pared del tubo y el ángulo de la pared del pocillo de muestra. En la misma forma, un error del diámetro en las dimensiones del cono también se traduciría en un error de altura dado que la parte cónica del tubo o bien penetraría más profundamente o no tanto como un tubo apropiadamente dimensionado.
Para tener una buena uniformidad en la conductividad térmica a través de la matriz, debe existir un buen ajuste entre los tubos de muestra y los pocillos de muestra en todos los 96 pocillos para el rango completo de temperaturas de 0 a 100ºC independientemente de los diferentes índices de expansión térmica. También, cada uno de los 96 tubos debe tener paredes con dimensiones y espesor en las paredes que sean uniformes en un alto grado. Cada tubo de muestra en el que se vaya a mantener la mezcla de muestra debe ser provisto de una tapa de ajuste para gases que realice un sellado para gases para impedir la pérdida de vapor de agua desde la mezcla de reacción cuando esta mezcla está en o cerca del punto de ebullición de forma que el volumen de la mezcla de muestra no disminuya. Todos estos factores se combinan para hacer que una placa de microtitulación de una sola pieza con 96 pocillos de muestra individuales sea extremadamente difícil de fabricar de forma que se alcance una conductividad térmica uniforme para todos los 96 pocillos.
Cualquier estructura que proporcione los necesarios grados de libertad individuales laterales y verticales para cada tubo de muestra será suficiente para la finalidad de poner en práctica la invención.
De acuerdo con las enseñanzas de la realización preferida de la invención, todos los requisitos anteriormente mencionados se han cumplido usando un sistema plástico desechable de cuatro piezas. Este sistema da a cada tubo de muestra suficiente libertad de movimiento en toda las direcciones necesarias para compensar los diferentes índices de expansión térmica manteniendo aún hasta 96 tubos de muestra en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos para la conveniencia del usuario y la compatibilidad con otros equipos del laboratorio que está dimensionado para trabajar con la placa de microtitulación estándar industrial de 96 pocillos. El sistema de multi piezas plásticas desechables es muy indulgente con los errores de tolerancia en la fabricación y a los diferentes índices de expansión térmica sobre el amplio rango de temperatura encontrado durante los ciclos térmicos de la PCR.
Las figuras 21A y 21B muestran realizaciones alternativas de la mayoría de los componentes del sistema plástico en cuatro piezas vistos en sección tal como se montan para contener una variedad de tubos de muestra en sus pocillos de muestra con suficiente libertad de movimiento para tener en cuenta los diferentes índices de expansión térmica. La figura 45 muestra todas las partes del sistema de emulación de una placa de microtitulación plástica desechable vistos en despiece. Esta figura ilustra cómo las partes encajan juntas para formar una placa de microtitulación con todos los tubos de muestra flexiblemente retenidos en una matriz de 96 pocillos en formato de placa de microtitulación de 8 x 12. La figura 22 muestra una vista en planta de un marco 342 de placa de microtitulación de acuerdo con las enseñanzas de la invención el cual se muestra parcialmente en sección en las figuras 21A y 21B. La figura 23 muestra una vista en planta desde abajo del marco 342. La figura 24 es una vista del extremo del marco 342 realizada desde el punto de vista de la línea 24-24' de la figura 22. La figura 25 es una vista del extremo del marco 342 realizada desde el punto de vista de la línea 25-25' de la figura 22. La figura 26 es una vista en sección del marco 342 realizada por la línea 26-26' de la figura 22. La figura 27 es una vista en sección del marco 342 realizada a lo largo de la línea 27-27' de la figura 22. La figura 28 es una vista del extremo del marco 342 realizada desde a lo largo de la línea 28-28' de la figura 22 con un corte parcial para mostrar en más detalle la localización en donde un retén a ser descrito más adelante se fija al marco 342.
Refiriéndonos conjuntamente a las figuras 21A, 21B y 22 a 28, el marco 342 se compone de una placa de plástico horizontal 372 en la que hay informados 96 agujeros espaciados 9 mm entre centros en el formato estándar de placa de microtitulación. Hay ocho filas etiquetadas A a H y 12 columnas etiquetadas 1 a 12. El agujero 374 en la fila D, columna 7 es típico de estos agujeros. En cada agujero del marco 342 hay colocado un tubo de muestra cónico tal como el tubo de muestra 376 mostrado en la figura 15. Cada tubo de muestra es más pequeño en diámetro que el agujero en el cual se sitúa en alrededor de 0,7 mm, de forma que queda con ajuste holgado en el agujero. Esto se ve mejor en las figuras 21A y 21B observando la distancia entre el borde interior 378 de un agujero típico y la pared lateral 380 del tubo de muestra allí situado. El número de referencia 382 en las figuras 21A y 21B muestra el borde opuesto del agujero que está también separado de la pared exterior de la parte cilíndrica del tubo de muestra 376.
Cada tubo de muestras tiene un reborde mostrado en 384 en las fibras 15, 21 y 29. Este reborde está moldeado alrededor de la circunferencia completa de la parte cilíndrica 288 de cada tubo de muestra. El diámetro de este reborde 384 es suficientemente grande como para que el tubo no pase a través de los agujeros en el marco 342. Pero no tan grande que se toquen los rebordes con los de los tubos adyacentes de los agujeros vecinos.
Una vez que todos los tubos están situados en sus agujeros en el marco 342, un elemento de retención plástico 386 (se ve mejor en las figuras 21A y 21B y la figura 45) se cierra con un clip sobre las aperturas del marco 342. La finalidad de este elemento de retención es mantener todos los tubos en su lugar de forma que no puedan caerse o golpearse fuera del marco 342, a la vez que no se interfiere con su holgura para ajustarse al marco 342. El elemento de retención 366 está dimensionado y ajustado al marco 342 de tal forma que cada tubo de muestra tiene la libertad de moverse hacia arriba y abajo en alguna medida antes de que el reborde 384 del tubo se encuentre bien con el elemento de retención 386 o bien con el marco 342. Así, el marco y el elemento de retención, cuando están acoplados, proporcionan un formato de placa de microtitulación para hasta 96 tubos de muestra pero que proporciona la suficiente libertad horizontal y vertical en tal forma que cada tubo es libre de encontrar su mejor ajuste en todas las temperaturas bajo la influencia del nivel mínimo de fuerza F de la figura 15.
Una vista más clara del tubo de muestra y de su reborde puede tenerse con referencia a las figuras 29 y 30. Las figuras 29 y 30 son vistas de la sección en alzado y una sección parcial superior de la parte del reborde, respectivamente, de un tubo de muestra típico. Una tapa con forma de cúpula tal como la que será descrita en más detalle a continuación se inserta en el tubo de muestra mostrado en la figura 29 y forma un sello hermético con la pared interior 390 de la parte superior del tubo de muestra. Un resalte 392 formado en la pared interior del tubo de muestra actúa como detención para la tapa con forma de cúpula para impedir su penetración adicional. Normalmente, las tapas con forma de cúpula vienen en tiras conectadas por una red.
La figura 31 muestra tres tapas en una vista en alzado conectadas por una red 394 y terminadas en una lengüeta 396. La lengüeta ayuda al usuario a retirar la fila completa de tapas con un simple movimiento. Normalmente, la red 394 se apoya en la superficie superior 398 del tubo de muestras e impide una penetración adicional de la tapa en el tubo de muestra. Cada tapa incluye un resalte 400 que forma un sellado hermético entre la tapa y la pared interior del tubo de muestra. La figura 32 muestra una vista superior de las tres tapas de una tira típica de 12 tapas unidas.
Para una comprensión más detallada del elemento de retención, nos referimos a las figuras 33 a 37. La figura 33 es una vista superior del elemento de retención plástico. En la figura 34 es una vista en alzado del elemento de retención tomada a lo largo de la línea 34-34' en la figura 33. En la figura 35 es una vista en alzado del elemento de retención tomada a lo largo de la línea 35-35' en la figura 33. La figura 36 es una vista en sección tomada a lo largo de la línea 36-36' en la figura 33. La figura 37 es una vista en sección a través del elemento de retención tomada a lo largo de la línea 37-37' en la figura 33.
Refiriéndonos conjuntamente las figuras 33-37, el elemento de retención 386 se compone de un único plano horizontal de plástico 402 rodeado por una pared vertical 404. El plano 402 tiene 96 agujeros en una matriz de 8 x 12 formados en él y divididos en 24 grupos de cuatro agujeros por grupo. Estos grupos están determinados por los resaltes formados en el plano 402 tales como los resaltes 406 y 408. Cada agujero, de los cuales el agujero 410 es típico, tiene un diámetro D que es mayor que el diámetro D_{1} en la figura 29 y más pequeño que el diámetro D_{2}. Esto permite al elemento de retención deslizarse sobre los tubos de muestra después de que éstos hayan sido situados en el marco 342 pero impide que los tubos de muestra caigan fuera del marco ya que el reborde 384 es demasiado grande para pasar a través del agujero 410.
El elemento de retención encaja con un clip en el marco 342 por medio de unas lengüetas de plástico 414 mostradas en las figuras 34 y 36. Estas lengüetas de plástico se insertan a través de las ranuras 416 y 418 en el marco como se muestra en la figura 23. Hay dos lengüetas de plástico 414, una en cada borde largo del elemento de retención. Estas dos lengüetas plásticas se muestran como 414A y 414B en la figura 33.
El marco 342 de las figuras 22-28, con hasta 96 tubos de muestra situados en él y con el elemento de retención 386 encajado en su lugar, forma un conjunto único tal como se muestra en las figuras 21A y 21B el cual puede situarse sobre el bloque de muestras 12 para un procesado PCR.
Tras el procesado, todos los tubos pueden quitarse simultáneamente levantando el marco 342 del bloque de muestras. Por comodidad y almacenamiento, el marco 342 con los tubos de muestra y el elemento de retención en su lugar pueden insertarse en otro componente plástico llamado la base. La base tienen las dimensiones exteriores y la huella de una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos como se muestra en las figuras 38 a 44. La figura 38 es una vista en planta superior de la base 420, mientras la figura 39 es una vista en planta inferior de la base. La figura 40 es una vista en alzado de la base tomada desde la línea 40-40' en la figura 38. La figura 41 es una vista en alzado de un extremo tomada desde la línea 41-41' en la figura 38. La figura 42 es una vista en sección a través de la base a lo largo de la línea 42-42' en la figura 38. La figura 43 es una vista en sección a través de la base a lo largo de la línea 43-43' en la figura 38. La figura 44 es una vista en sección a lo largo de la línea 44-44' en la figura 38.
La base 420 incluye una superficie de plástico plana 422 en la cual se forma una matriz de agujeros 8 x 12 con los bordes inclinados. Estos agujeros tienen unas dimensiones y están espaciados de tal forma que cuando el marco 342 se asienta en la base, la parte inferior de los tubos de muestra ajustan en los agujeros cónicos de la base de forma que los tubos de muestra se sitúan en relación con el marco 342 de la misma manera que cuando los tubos de muestra se sitúan cuando el marco 342 se monta sobre el bloque de muestras. El agujero 424 es el típico de los 96 objetos formados en la base y se muestra en las figuras 38, 44 y 43. Los tubos de muestra individuales, a pesar de estar holgadamente retenidos entre la bandeja y el elemento de retención, se quedan firmemente asentados e inmóviles cuando el marco se inserta en la base. La manera en la que el tubo de muestra típico 424 ajusta en la base se muestra en la figura 44.
En otras palabras, cuando el marco, tubos de muestra y elemento de retención se asientan en la base 420 el montaje conjunto se convierte en el equivalente funcional exacto de una placa de microtitulación de 96 pocillos estándar industrial, y puede situarse virtualmente en cualquier sistema de muestreo o rellenado con pipetas automático para placas de microtitulación estándar industriales de 96 pocillos para otros procesos.
Después de que los tubos de muestra hayan sido rellenados con los necesarios reactivos y la muestra de ADN a amplificar, los tubos de muestra puede ser tapados. En una realización alternativa de la tira de tapas mostrada en las figuras 31 y 32, puede usarse una alfombra ya completa de 96 tapas con una red adaptada conectándolas en una matriz de 8 x 12. Esta red, mostrada en 394 de la figura 31 debe estar suficientemente adaptada para que las tapas no impidan a los tubos de muestra realizar los pequeños movimientos que estos tubos deben realizar para ajustar perfectamente en los pocillos cónicos del bloque de muestras a todas las temperaturas.
El conjunto de tubos, marcos de tapas, elemento de retención y base se lleva tras haber rellenado los tubos al realizador de ciclos térmicos. Ahí, el marco, los tubos tapados y la placa elemento de retención se separan de la base como una unidad. Esta unidad se sitúa entonces en el bloque de muestras 12 para realizar el montaje mostrado la figura 21A ó 21B con los tubos holgadamente contenidos en los pocillos cónicos en el bloque de muestras. Como se muestra en la figura 21, el marco 342 se asienta sobre la superficie superior 280 de la banda de protección. En la realización preferida, el resalte 366 se extiende hacia abajo dentro de la ranura 78 de la banda de protección, pero esto no es esencial.
A continuación, la tapa calentada se desliza sobre las muestras, y la placa de presión calentada se atornilla hacia abajo como se describió anteriormente hasta que toma contacto con el borde superior 346 del marco 342.
Unos segundos después de que la placa de presión calentada 14 de la figura 19 toca las tapas, las tapas comienzan a ablandarse y ceden bajo la presión hacia abajo del tornillo de carga 312 de la figura 19. El usuario continúa entonces girando el mando 318 hasta que las marcas de los índices 332 y 334 de la figura 20 se alinean lo cual indica que cada tubo de muestra ha sido ajustadamente presionado en el bloque de muestras con al menos el mínimo nivel de fuerza F y que todos los espacios de aire entre la placa de presión calentada 14, el bloque de muestras y el borde superior 346 del marco 342 han sido ajustadamente cerrados.
Los tubos de muestra están ahora en un entorno completamente cerrado y controlado, y puede comenzar un ciclo de temperaturas con precisión.
Al final del protocolo PCR, la placa de presión calentada 14 se mueve hacia arriba y afuera de los tubos de muestra, y la cubierta calentada 316 se desliza para exponer el marco 342 y los tubos de muestra. El marco, tubos de muestra y elemento de retención son entonces retirados y recolocados en la base vacía, y las tapas pueden ser retiradas. Mientras se tira hacia afuera de cada tapa o tira de tapas, el elemento de retención mantiene el tubo impidiendo que salga de la bandeja. Unos nervios formadas en la base (no mostrados en las figuras 38-44) contactan con las lengüetas del elemento de retención 414A y 414B mostradas en la figura 33 para mantener el elemento de retención enclavado en su lugar de forma que la fuerza ejercida sobre los tubos al retirar las tapas no descoloca el elemento de retención 386.
Obviamente, el marco 342 puede usarse con menos de 96 tubos si se desea. También, el elemento de retención 386 puede retirarse si se desea desencajándolo.
Un usuario que desee trabajar sólo con pocos tubos a la vez y manejar estos tubos individualmente debe colocar un marco vacío 342 sin elemento de retención en el bloque de muestras. El usuario puede entonces usar la base como un "rack de tubos de prueba" y dejar una pequeña cantidad de tubos en él. Estos tubos pueden rellenarse entonces manualmente y taparse con tapas individuales. Entonces el usuario puede transferir los tubos individualmente en los pocillos del bloque de muestras, cerrar la cubierta calentada y atornillar la placa de presión calentada 14 hasta que las marcas se alineen. Puede comenzar entonces el ciclo PCR. Cuando el ciclo está completo, la cubierta 316 se retira y los tubos de muestra son colocados individualmente en una base disponible. El elemento de retención no es necesario en este tipo de uso.
Refiriéndonos a las figuras 47A y 47B (en adelante figura 47), se muestra en ella un diagrama de bloques para la electrónica de una realización preferida de un sistema de control en un tipo de sistema de control representado por el bloque CPU 20 de la figura 1. La finalidad de la electrónica de control de la figura 47 es, entre otras cosas, recibir y almacenar los datos introducidos por usuario definiendo el protocolo PCR deseado, leer los varios detectores de temperatura, calcular la temperatura de la muestra, comparar la temperatura de la muestra calculada con la temperatura deseada para el protocolo PCR definido por el usuario, vigilar la tensión de la línea de alimentación y controlar las zonas del calentador de película y las válvulas de refrigeración rápida para llevar a cabo el perfil de temperatura deseado del protocolo PCR definido por el usuario.
Un microprocesador (en adelante CPU) 450 ejecuta el programa de control descrito a continuación citado en el Apéndice C en forma de código fuente. En la realización preferida, la CPU 450 es una OKI CMOS 8085. La CPU controla un bus de direcciones 452 a través del cual son direccionados varios de los otros elementos del circuito de la figura 47. La CPU también controla un bus de datos 454 a través del que se transmiten los datos a varios de los otros elementos del circuito de la figura 47.
El programa de control del Apéndice C y algunas de las constantes del sistema se almacenan en la EPROM 456. Los datos introducidos por el usuario y otras constantes y características del sistema medidas durante el proceso de instalación (ejecución del programa de instalación descrito a continuación) se almacenan en la RAM 458 alimentada por baterías. Un reloj/calendario 460 proporciona a la CPU 450 la información de fecha y hora con la finalidad de registrar un histórico de eventos durante las ejecuciones PCR y la duración de los fallos de alimentación tal como se describe a continuación en la descripción del programa de control.
Un decodificador de direcciones 462 recibe y decodifica las direcciones del bus de direcciones 452 y activa las adecuadas líneas de selección de circuitos en el bus de selección de circuitos 464.
El usuario introduce los datos del protocolo PCR a través del teclado 466 en respuesta a la información mostrada por la CPU en la pantalla 468. Las dos formas de comunicación entre el usuario y la CPU 450 se describen más detalladamente a continuación en la sección de interfase con el usuario de la descripción del programa de control. Un circuito de interfase 470 con el teclado convierte las pulsaciones de tecla del usuario en datos que son leídos por la CPU a través del bus de datos 454.
Dos temporizadores de intervalo programable 472 y 474 contienen cada uno contadores que son cargados con los valores calculados por la CPU 450 para controlar los intervalos durante los cuales se aplica potencia a las varias zonas del calentador de película.
Un controlador de interrupciones 476 envía peticiones de interrupción a la CPU 450 cada 200 milisegundos, haciendo que la CPU 450 ejecute la tarea PID descrita a continuación en la descripción del programa de control. Esta tarea lee los detectores de temperatura y calcula la potencia de calentamiento o refrigeración necesaria para llevar la temperatura de la muestra desde su nivel actual al nivel deseado por el usuario para ese punto en el tiempo del protocolo PCR que está siendo ejecutado.
Una UART 478 atiende un circuito 480 de interfase RS232 de forma que los datos almacenados en la RAM 480 pueden ser enviados a la impresora. El programa de control mantiene un registro de cada ejecución PCR que se realiza en relación con las temperaturas reales que existieron en varios momentos durante la ejecución con la finalidad de que el usuario valide que el protocolo PCR realmente ejecutado corresponde al protocolo PCR deseado por el usuario. Además, los datos introducidos por el usuario definiendo los tiempos y temperaturas deseadas durante un protocolo PCR particular también se almacenan. Todos estos datos así como otros datos pueden ser leídos por la CPU 450 y enviados a una impresora acoplada al puerto de RS232 por medio de la UART 478. La interfase RS232 también permite que un ordenador externo tome el control de los buses de direcciones y datos para propósitos de
prueba.
Un circuito de interfase periférico (en adelante PIC de sus siglas en inglés Peripheral Interface Chip) 482 sirve como un conjunto programable de cuatro registros de entrada/salida. En el arranque, la CPU 450 selecciona el PIC 482 a través del decodificador de direcciones 462 y el bus de selección de circuitos 464. Entonces la CPU escribe una palabra de datos en el PIC por medio del bus de datos 454 para programar al PIC 482 en relación con qué registros han de ser puertos de salida y cuáles han de ser puertos de entrada. Posteriormente, la CPU 450 usa los registros de salida para almacenar palabras de datos escritas en ellos por la CPU a través del bus de datos 454 para controlar el estado lógico interno de un circuito de matriz lógica programable (PAL) 484.
El PAL 484 es una máquina de estados que tiene una variedad de señales de entrada y una variedad de señales de salida. Los PAL en general contienen una matriz lógica que tiene un número de estados diferentes. Cada estado se define por la matriz o vector de estados lógicos en las entradas y cada estado da como resultado una matriz o vector diferente de estados lógicos de las salidas. La CPU 450, el PIC 482, el PAL 484 y otros varios circuitos a ser definidos a continuación cooperan para generar diferentes estados de las varias señales de salida del PAL 484. Estos estados diferentes y señales de salida asociadas son las que controlan la operación de la electrónica mostrada en la figura 47 como será descrito a continuación.
Un conversor analógico digital de 12 bits (A/D) 486 convierte las tensiones analógicas de las líneas 488 y 490 en señales digitales en el bus de datos 454. Éstas son leídas por la CPU mediante la generación de una dirección para el conversor A/D de forma que se active una señal en el selector de circuitos del bus 464 acoplado a la entrada de selección del circuito del conversor A/D y active el conversor. Las señales analógicas en las líneas 488 y 490 son las líneas de salida de dos multiplexores 492 y 494. El multiplexor 492 tiene cuatro puertos de entrada, teniendo cada uno dos líneas de señal. Cada uno de estos puertos se acopla a uno de los cuatro detectores de temperatura del sistema. El primer puerto se acopla al detector de temperatura del bloque de muestras. El segundo y tercer puerto se acoplan a los detectores de temperatura del refrigerante y ambiente, respectivamente y el cuarto puerto se acopla al detector de temperatura de la cubierta calentada. Un circuito típico para cada uno de estos detectores de temperatura se muestra en la figura 48. Una resistencia de 20.000 ohmios 496 recibe en el nodo 427 +15 V regulados de la fuente de alimentación regulada 498 de la figura 47 a través de una línea de conexión que no está mostrada. Esta señal de 15 V c.c. polariza inversamente un diodo zener 500. La corriente de polarización inversa y la caída de tensión a través del diodo zener son función de la temperatura. La caída de tensión a través del diodo es la entrada al multiplexor 292 a través de las líneas 502 y 504. Cada detector de temperatura tiene una conexión similar al multiplexor 292.
El multiplexor 494 tiene también cuatro puertos de entrada pero sólo tres están conectados. El primer puerto de entrada está acoplado a un generador de tensión de calibración 506. Este generador de tensión extrae dos niveles de tensión controlados con precisión para las entradas del multiplexor y son térmicamente muy estables. Esto es, la salida de la tensión de referencia de la fuente de tensión 506 tiene una muy pequeña deriva, si alguna, con la temperatura. Esta tensión es leída de vez en cuando por la CPU 450 y comparada con una constante almacenada que representa el nivel que tenía esta tensión de referencia a una temperatura conocida tal como se midió durante la ejecución del proceso de instalación descrito a continuación. Si la tensión de referencia ha derivado desde el nivel medido y almacenado durante el proceso de instalación, la CPU 450 sabe que todos los demás circuitos electrónicos usados para detectar las varias temperaturas y tensiones de línea también han derivado y ajusta sus salidas en consecuencia para mantener un control muy preciso sobre el proceso de medición de temperatura.
La otra entrada al multiplexor 494 se acopla a través de la línea 510 un circuito conversor valor eficaz a tensión continua 512. Ese circuito tiene una entrada 514 acoplada a un transformador 516 de disminución de tensión y recibe una tensión alterna en la entrada 514 que es proporcional a la tensión de línea existente entonces en la entrada de alimentación de alterna 518. El convertidor valor eficaz a tensión continua 512 rectifica la tensión alterna y realiza la media para tener una tensión de continua en la línea 510 que también es proporcional a la tensión de entrada de alterna en la línea 518.
Cuatro accionadores de triac acoplados ópticamente 530, 532, 534 y 536 reciben las señales de control de entrada a través del bus de control 538 de la lógica PAL 484. Cada uno de los accionadores de triac 530, 532 y 534 controla la potencia a una de las tres zonas del calentador de película. Estas zonas del calentador se representan por los bloques 254, 260/262 y 256/258 (los mismos números de referencia usados en la figura 13). El accionador de triac 536 controla la potencia a la cubierta calentada, representada por el bloque 544 a través de interruptor de corte térmico 546. Las zonas del calentador del calentador de película están protegidas por un bloque de interruptores de corte térmico 548. La finalidad de los interruptores de corte térmico es impedir la fusión del calentador de película/bloque de muestras sobre la cubierta calentada en caso de que un fallo lleve a que los accionadores de triac queden conectados durante un intervalo no seguro. Si tal situación tiene lugar, los interruptores de corte térmico detectarán una condición de demasiado caliente, y cortarán los triacs a través de las señales de las líneas 552 ó 554.
La zona del calentador principal del calentador de zonas tiene una potencia de 360 vatios mientras que las zonas del calentador de colectores y de borde tienen una potencia de 180 vatios y 170 vatios respectivamente. Los accionadores son triacs de 15 A Motorola MAC 15A10. Cada zona del calentador está dividida en dos secciones eléctricamente aisladas disipando cada una 1/2 de la potencia. Las dos mitades se conectan en paralelo para tensiones de línea en 518 menores de 150 V c.a. Para tensiones de línea mayores que ésta, las dos mitades se conectan en serie. Estas conexiones alternativas se llevan a cabo a través de un conector 550 de "personalización".
El suministro de tensión alterna para las zonas del calentador de película es la línea 559, y el suministro de tensión alterna para la cubierta calentada es a través de la línea 560.
Un detector de paso por cero 566 proporciona una temporización del sistema básica mediante la emisión de un pulso en la línea 568 en cada paso por cero de la tensión alterna de la línea 518. El detector de paso por cero es un National IX 311N referido a la tensión de tierra y tiene 25 mV de histéresis. El detector de paso por cero toma su entrada del transformador 516 que obtiene una señal de alterna de 0 a 5,52 V para una señal de alterna de entrada de 0 a 240 V c.a.
Un transformador de potencia 570 suministra la potencia alterna a la bomba 41 que bombea refrigerante a través de los canales de refrigeración rápida y de control. La unidad de refrigeración 40 también recibe su alimentación de alterna del transformador 570 a través de otra parte del conector de personalización 550. El transformador 350 también suministra alimentación a las tres fuentes de alimentación reguladas 572, 498 y 574 y a una fuente de alimentación no regulada 576.
Con propósitos de precisión en la medida de las temperaturas, el generador de tensión de calibración 506 usa una serie de resistencias muy precisas, de película delgada, de ultra-baja deriva de temperatura de 20 k\Omega (no mostradas en la figura 47).
Estas mismas resistencias de deriva ultra-baja se usan para ajustar la ganancia de un amplificador analógico 578 que amplifica la tensión de salida del detector de temperatura seleccionado antes de su conversión a un valor digital. Estas resistencias derivan sólo 5 ppm/ºC.
Todos los detectores de temperatura se calibran colocándolos (separados de las estructuras cuyas temperaturas miden) primero en un baño estable, con aceite en agitación, de temperatura controlada a 40ºC y midiendo las tensiones de salida reales en las entradas al multiplexor 492. Los detectores de temperatura se colocan entonces en un baño a una temperatura de 95ºC y sus tensiones de salida son medidas de nuevo en los mismos puntos. La tensión de salida del generador de tensión de calibración 506 también se mide en la entrada del multiplexor 494. Para cada temperatura, se mide la diferencia de la salida digital del conversor A/D 486 entre cada una de las salidas el detector de temperatura y la salida digital resultante de la tensión generada por el generador de tensión de calibración 506. Pueden calcularse entonces las constantes de calibración de cada detector de temperatura para calibrar cada uno para los cambios de temperatura.
El detector de temperatura del bloque de muestras se somete entonces a un procedimiento de calibración adicional. Este procedimiento implica llevar el bloque de muestras a dos temperaturas diferentes. En cada nivel de temperatura, se mide la temperatura real del bloque en sus diferentes pocillos de muestra usando la sonda de termopar RTD 16 con una precisión de 0,02ºC. Se genera entonces un perfil de la media de temperaturas del bloque y se mide la salida del conversor A/D 464 con el detector de temperatura del bloque en su lugar del bloque de muestras. Esto se hace a ambos niveles de temperatura. A partir de la temperatura del bloque real tal como la miden las sondas RTD y la salida A/D del detector de temperatura del bloque, puede calcularse un factor de calibración adicional. Los factores de calibración de temperatura así generados se almacenan en la RAM alimentada por baterías 458. Una vez que estos factores de calibración quedan determinados para el sistema, es importante que el sistema no derive apreciablemente sus características eléctricas de las existentes en el momento de la calibración. Es importante por tanto que se seleccionen circuitos de baja deriva y que se usen resistencias de deriva ultra baja.
La manera en la que la CPU 450 controla la temperatura del bloque de muestras puede comprenderse mejor refiriéndose a la sección siguiente que describe el programa de control. Sin embargo, para ilustrar cómo los circuitos electrónicos de la figura 47 cooperan con el programa de control para llevar a cabo el protocolo PCR considérese lo siguiente.
El detector de paso por cero 566 tiene dos salidas en el bus de salidas 568. Una de estas salidas emite un pulso negativo por cada transición positiva de la señal de alterna en su paso por la referencia de tensión cero. La otra emite un pulso negativo en cada transición negativa de la señal de alterna en su paso por la referencia de tensión cero. Estos dos pulsos, mostrados típicamente en 580 definen un ciclo completo o dos medios ciclos. Es el tren de impulsos sobre el bus 561 el que define los periodos de muestra de 200 milisegundos. Para una corriente alterna de 60 ciclos/segundo como la que se encuentra en los E.E.U.U., 200 milisegundos contienen 24 medios ciclos.
En la figura 49 se visualiza un periodo de muestra típico. Cada marca de la figura 49 representa un medio ciclo. Durante cada periodo de muestra de 200 ms, la CPU 450 está calculando la cantidad de potencia de calentamiento o refrigeración necesaria para mantener la temperatura del bloque de muestras en la temperatura de consigna definida por el usuario o de incubación o para mover la temperatura del bloque a la nueva temperatura dependiendo de donde se encuentre en la línea de tiempos del protocolo PCR del período de muestra particular. La cantidad de potencia necesaria en cada zona del calentador de película se convierte en un número de medios ciclos en los que el calentador de zona debe permanecer desconectado durante el siguiente periodo de muestra de 200 ms. Justamente antes del final del periodo actual de muestra en el que se realizan estos cálculos, la CPU 450 se dirige a cada uno de los cuatro temporizadores en el temporizador de intervalos programables (PIT) 472. En cada temporizador, la CPU escribe los datos que constituyen una cuenta "actual" que representa el número de medios ciclos que el calentador de zona asociado con ese temporizador ha de permanecer desconectado en el siguiente periodo de muestra. En la figura 49, este dato se escribe en los temporizadores durante el intervalo 590 que precede justamente al momento de arranque 592 del siguiente período de muestra. Supongamos que se requiere, por los datos de consigna del usuario, una rápida rampa hasta la temperatura desnaturalización de 94ºC para un intervalo que incluye el intervalo de muestra entre los tiempos 592 y 594. En consecuencia, los calentadores de película estarán conectados la mayor parte del período. Supongamos que el calentador de la zona central ha de estar conectado en todos excepto en tres de los medios ciclos durante el periodo de muestra. En este caso, la CPU 450 escribe un tres en el contador del PIT 472 asociado con el calentador de la zona central durante el intervalo 590. Esta operación de escritura hace que el temporizador envíe una señal de "desconectar" a la línea de control particular del bus 593 que controla el calentador de la zona central. Esta señal de "desconectar" hace que la PAL 484 envíe una señal de "desconectar" sobre una en particular de las líneas de señal del bus 538 asociada con la zona central. El accionador de triac 530 se desconecta entonces en el siguiente paso por cero, es decir, en el tiempo 592. El PIT recibe un tren de impulsos de los pulsos de transiciones positivas en la línea 594 del PAL 484. Estos pulsos son traducciones del PAL 484 de los pulsos de paso por cero sobre el bus de dos líneas 568 a pulsos positivos en todos los pulsos de paso por cero sobre una línea, es decir, la línea 594. El temporizador en el PIT 472 asociado con la zona central del calentador de película comienza su cuenta atrás desde su valor actual de 3 usando las marcas de pulsos de medio ciclo en la línea 594 como su reloj. Al final del tercer medio ciclo, este temporizador llega 0 y hace que su señal de salida en la línea del bus 592 cambie de estado. Esta transición desde el estado bajo al alto se muestra en 596 de la figura 49. Esta transición se comunica al PAL 484 haciéndole cambiar el estado de la señal de salida apropiada en el bus 538 para conectar el accionador de triac 530 en el tercer paso por cero. Nótese que conectando los triacs en el paso por cero como se hace en la realización preferida, se evita cortar la elevada corriente que circula a través de un inductor (el conductor del calentador de película). Esto minimiza la generación de interferencias de radiofrecuencia u otros ruidos. Nótese que la técnica de conmutar una parte de cada medio ciclo en el calentador de película de acuerdo con la cantidad calculada de potencia necesaria también funcionará como una realización alternativa, pero no es la preferida debido al ruido generado por esta técnica.
Los otros temporizadores PIT 472 y 474 funcionan de manera similar para controlar la potencia aplicada a las otras zonas del calentador y a la cubierta calentada de acuerdo con la potencia calculada por la CPU.
La refrigeración rápida se controla por la CPU 450 directamente a través de la interfase periférica 482. Cuando los cálculos de la potencia de calentamiento/refrigeración realizados durante cada periodo de muestra indican que se necesita una potencia de refrigeración rápida, la CPU 450 se dirige al controlador de interfase periférico (PIC) 482. Entonces se escribe una palabra de datos en el registro apropiado para situar la línea de salida 600 en alto. Esta línea de salida dispara un par de multivibradores monoestables 600 y 604 y hace que cada uno emita un único pulso, en las líneas 606 y 608, respectivamente. Cada uno de estos pulsos tiene corrientes de pico justamente bajo 1 A y una duración de impulsos de aproximadamente 100 ms. La finalidad de estos pulsos es activar con fuerza la bobina de la válvula solenoide que controla el flujo a través de los canales de refrigeración rápida para abrir rápidamente el caudal de refrigeración rápida. El pulso en la línea 606 hace que un actuador 610 conecte a tierra la línea 612 acoplada a un lado de la bobina del solenoide 614 de una de las válvulas actuadas por solenoide. El otro terminal de la bobina 614 se conecta a un "común" de la fuente de alimentación 616 a +24 V c.c. de la fuente de alimentación 576. Uno de los disparos 602 controla la apertura de la válvula solenoide de refrigeración para que el caudal vaya en una dirección, y el otro disparo 604 controla la válvula operada por solenoide para que circule en la dirección opuesta.
Simultáneamente, la activación de la señal RCOOL en la línea 600 causa la activación de un actuador 618. Este actuador pone a tierra la línea 612 a través de una resistencia limitadora 620. El valor de esta resistencia limitadora de corriente es tal que la corriente circulando a través de la línea 622 es al menos igual a la corriente de mantenimiento necesaria para conservar la válvula solenoide 614 abierta. Las bobinas de los solenoides tienen características transitorias que hacen que se requieran grandes corrientes para abrir una válvula actuada por solenoide pero considerablemente menos corriente para mantener la válvula abierta. Cuando el pulso de 100 ms en la línea 606 decae, el actuador 612 cesa directamente la puesta a tierra de la línea 612 dejando sólo la conexión a tierra a través de la resistencia 620 y el actuador 618 para mantener la corriente.
La válvula solenoide 614 controla el flujo del refrigerante de refrigeración rápida a través del bloque de muestras sólo en 1/2 de los tubos de refrigeración rápida, es decir, los tubos que llevan el refrigerante en una dirección a través del bloque de muestras. Otra válvula actuada por solenoide 624 controla el flujo de refrigerante a través del bloque de muestras en la dirección opuesta. Esta válvula 624 es accionada exactamente en la misma forma que la válvula actuada por solenoide 614 por los accionadores 626 y 628, un disparo en la 604 y línea 608.
La necesidad de una refrigeración rápida se evalúa una vez cada periodo de muestra. Cuando la tarea PID del programa de control determina por las mediciones de la temperatura del bloque, comparándola con la temperatura de bloque deseada que no se necesita ya la refrigeración rápida, se desactiva la señal RCOOL en la línea 600. Esto es realizado por la CPU 450 dirigiéndose al PIC 482 y escribiendo en él datos que invierten el estado del bit apropiado en el registro del PIC 482 que está conectado a la línea 600.
El PIT 474 tiene también otros dos temporizadores en él que temporizan una interrupción a 20 Hz y un LED de calentamiento que proporciona una indicación visible cuando el bloque de muestras está caliente y no es seguro tocarlo.
El sistema incluye también un monoestable del avisador acústico 630 y un avisador acústico 632 para avisar al usuario cuando será realizado una pulsación de teclas incorrecta.
El controlador de interrupciones programable 476 se usa para detectar siete interrupciones: Nivel 1-prueba; Nivel 2-20 Hz; Nivel 3-transmisión preparada; Nivel 4-recepción preparada; Nivel 5-interrupción del teclado; Nivel 6-calentador principal encendido; y Nivel 7-paso por cero en la línea de alta.
El controlador de interfase periférico 482 tiene cuatro salidas (no mostradas) para controlar los multiplexores 492 y 494. Estas señales MUX1 EN y MUX2 EN habilitan uno u otro de los dos multiplexores 492 y 494 mientras que las señales MUX 0 y MUX 1 controlan qué canal se selecciona para entrada del amplificador 578. Estas señales se gestionan de forma que sólo puede seleccionarse un canal desde los dos multiplexores en un momento dado.
Una señal RLTRIG* repone un temporizador monoestable 632 para los calentadores que inhabilita los calentadores a través de la activación de la señal TIMEOUT EN* a la PIL 484 si la CPU falla. Esto es, el monoestable 632 tiene un intervalo predeterminado que es lo que él espera después de cada disparo antes de que active la señal TIMEOUT EN* que inhabilita todos los calentadores de zona. La CPU 450 ejecuta periódicamente una rutina que se dirige a la PIC 482 y escribe datos en el registro apropiado para activar una señal en la línea 634 y disparar el monoestable 632. Si la CPU 450 falla por cualquier razón y no ejecuta esta rutina, el temporizador monoestable 632 inhabilita todos los calentadores de zona.
El PIC 482 también tiene las salidas COVHTR EN* y BLKHTREN* (no mostradas) para habilitar la cubierta calentada y el calentador del bloque de muestras. Ambas señales son activas a nivel bajo y se controlan por la CPU 450. Son enviadas a la PAL 484 a través del bus 636.
El PIC 482 también suministra las señales BEEP y BEEPCLR* en el bus 640 para controlar el monoestable del avisador acústico 630.
El PIC 482 también suministra la señal MEM1 (no mostrada) que se usa para conmutar las páginas entre la sección de direcciones altas de la EPROM 456 y la sección de direcciones bajas de la RAM alimentada por batería 458. Se proporcionan otras dos señales PAGE SEL 0 y PAGE SEL 1 (no mostradas) para seleccionar entre las cuatro páginas de 16K en la EPROM 456.
Los cuatro detectores de temperatura son del tipo de diodo zener National LM 135 con una dependencia tensión zener/temperatura de 10 mV/K. Los diodos zener son activados por la fuente de alimentación regulada 498 a través de una resistencia de 20K 496. La corriente a través de los zener varía desde aproximadamente 560 \muA a 615 \muA en el rango operativo de 0ºC a 100ºC. El auto calentamiento del zener varía desde 1,68 mW a 2,10 mW en el mismo rango.
Los multiplexores 492 y 494 son conmutadores analógicos DG409. Las tensiones en las líneas 488 y 490 son amplificadas por un amplificador de instrumentación AD625KN con una función de transferencia de V_{out} = 3*V_{in} -7,5. El conversor A/D 486 es un AD7672 con un rango de entrada 0-5 voltios. Con la salida del detector de temperatura zener de 2,73 a 3,73 voltios en el rango 0ºC a 100ºC, la salida del amplificador 578 será 0,69 voltios a 3,69 voltios, que está confortablemente dentro del rango de entrada del A/D.
La clave para una alta precisión en el rendimiento del sistema son una buena precisión y una baja deriva con los cambios en la temperatura ambiente. Ambos objetivos se alcanzan usando una fuente de referencia de tensión de precisión, es decir, el generador de tensión de calibración 506, y vigilando continuamente su salida a través de la misma cadena electrónica que la usada para vigilar las salidas de los detectores de temperatura y a la tensión de la línea de alterna en la línea 510.
El generador de tensión de calibración 506 proporciona dos tensiones de precisión en las líneas 650 y 652. Un voltaje es de 3,75 V y el otro de 3,125 V. Estas tensiones se obtienen dividiendo la tensión de alimentación regulada usando una cadena de resistencias de película delgada, integradas y de ultra baja deriva con un 0,05% de ajuste entre resistencias y un coeficiente de deriva por temperatura de 5 ppm/grado centígrado entre resistencias. El generador de tensión de calibración también genera -5 V para la referencia de tensión del conversor A/D y -7,5 V para la compensación del amplificador de instrumentación. Estas dos tensiones se conectan al A/D 486 y al amplificador 578 por líneas que no se muestran. Estas dos tensiones negativas se generan usando la misma red de resistencias de película delgada y un amplificador operacional OP 27 GZ (no mostrado). Las resistencias de ajuste de ganancia del amplificador operacional 578 son también resistencias ajustadas, de ultra baja deriva, de película delgada e
integradas.
Los programas de control, la electrónica de control y el proyecto del conjunto están diseñados de forma que es posible una portabilidad de los protocolos PCR pocillo-a-pocillo e instrumento-a-instrumento.
Los laboratorios de alta producción se benefician de los instrumentos que son fáciles de usar por un amplio espectro de personal de laboratorio y que requieren una mínima cantidad de formación. El programa de la invención se desarrolló para manejar protocolos de ciclos térmicos PCR complejos mientras conservaban la facilidad para programarse. Además, se proporciona con la protección que asegura la integridad de las muestras durante las interrupciones de potencia, y puede documentar detalladamente los eventos de cada ejecución en una memoria segura.
Tras completar las auto-comprobaciones de arranque mostrados en las figuras 53 y 54, para asegurar al operador que el sistema está funcionando adecuadamente, la interfase de usuario de la invención ofrece un menú de alto nivel, simple, que invita al usuario a ejecutar, crear o editar un archivo, o acceder a una función de utilidades. No se requieren habilidades de programación, ya que pueden editarse rápidamente archivos por defecto preexistentes con tiempos y temperaturas personalizados, y entonces almacenarlos en memoria para un uso posterior. Un esquema de protección de archivos impide cambios no autorizados a cualquier programa de usuario. Un archivo consiste normalmente en una serie de instrucciones para mantener una temperatura deseada o para realizar ciclos térmicos. Se crean programas complejos enlazando archivos juntos para formar un método. Un archivo comúnmente usado, como una incubación a 4ºC seguida de un ciclo térmico, puede almacenarse e incorporarse entonces en métodos creados por otros usuarios. Un nuevo tipo de archivo, el archivo AUTO es un programa de ciclos PCR que permite al usuario especificar cuál de varios tipos de cambios en los parámetros de control tendrán lugar en cada ciclo: incrementos de tiempo (a otra extensión del segmento, para mejorar el rendimiento), disminución del tiempo, o aumento o disminución de la temperatura. Para el más alto grado de precisión en el control y para la transferencia de los métodos más fiable, las temperaturas son ajustables en 0,1ºC y los tiempos se programan al segundo más próximo. La invención tiene la posibilidad de programar una PAUSE (pausa) planificada en uno o más puntos de consigna durante una ejecución para adiciones de reactivo o para retirar tubos en ciclos específicos.
El sistema de la invención tiene la capacidad de almacenar un archivo histórico de 500 registros para cada ejecución. Esta característica permite al usuario revisar los pasos individuales en cada ciclo y marcar cualquier estado especial o mensaje de error en relación con irregularidades. Con la impresora opcional, la invención proporciona una documentación escrita del archivo y de los parámetros del método, tiempo de ejecución/datos de temperatura con un marcaje de la fecha/hora, parámetros de configuración y directorios de archivos clasificados.
Para asegurar unos ciclos térmicos reproducibles, la temperatura de la muestra calculada se indica durante los segmentos de cambio y de mantenimiento de cada ciclo. Se usa normalmente una temperatura un grado menor que la temperatura de consigna para disparar los relojes temporizadores de cambio y de mantenimiento, aunque esto puede ser alterado por el usuario. Siempre que se use la apropiada constante de tiempo para el tipo de tubo y volumen, la muestra siempre se aproximará a la temperatura de la muestra deseada con la misma precisión, independientemente de si han sido programados tiempos de incubación de muestra largos o cortos. Los usuarios pueden programar cambios lentos para requerimientos de hibridación especializados de conjuntos de cebadores degenerados, o muy cortos (1-5 segundos) periodos de desnaturalización a alta temperatura para objetivos muy ricos en GC. Están preprogramados inteligentes ciclos PCR por omisión para 2- y 3-temperaturas.
Cualquier usuario puede acceder a las pruebas de diagnóstico para comprobar el estado de los sistemas de ca-
lentamiento y refrigeración, ya que el programa proporciona informes de Pasa/Falla. Además, un programa de rendimiento del sistema realiza una evaluación exhaustiva de los subsistemas y genera un informe resumen del
estado.
El programa (firmware) de control se compone de varias secciones que se listan a continuación:
\bullet
Diagnósticos
\bullet
Calibración
\bullet
Instalación
\bullet
Sistema operativo en tiempo real
\bullet
Nueve tareas priorizadas que manejan el sistema
\bullet
Secuencia de arranque
\bullet
Interfase de usuario
Las varias secciones del programa se describirán bien con su descripción textual, pseudocódigo o ambos.
Las características del programa (firmware) son:
1.
Un sistema de control que gestiona la temperatura media del bloque de muestras dentro de +/-0,1ºC manteniendo asimismo la no uniformidad de temperatura entre los pocillos en el bloque de muestras dentro de +/-0,5ºC.
2.
Un sistema de control de temperatura que mide y compensa por las fluctuaciones en la tensión de la línea y la deriva por temperatura de la electrónica.
3.
Extensos diagnósticos en el arranque que determinan si los componentes del sistema están funcionando
4.
Exhaustivos diagnósticos en el programa de instalación que verifican los sistemas de calentamiento y refrigeración para asegurar que están funcionando adecuadamente.
5.
Una interfase de usuario lógica y organizada, empleando un sistema dirigido por menú que permite la operación del instrumento con una mínima dependencia del manual de operadores.
6.
La capacidad de enlazar hasta 17 protocolos PCR y almacenarlos como un método.
7.
La capacidad de almacenar hasta 150 protocolos PCR y métodos en la interfase de usuario.
8.
Un archivo histórico que registra hasta 500 eventos de la ejecución previa como parte de la tarea de la secuencia.
9.
La capacidad para definir el volumen de reacción y el tipo del tamaño de tubo al comienzo de una ejecución para una máxima precisión y control de la temperatura como parte de la interfase de usuario y que modifica la tau (la constante de tiempo del tubo) en la tarea PID.
10.
Tras la recuperación de un fallo en la alimentación de energía, el sistema lleva al bloque de muestras a 4ºC para proteger cualquier muestra que pueda estar cargada en el compartimiento de muestras. El analizador también informa de la duración del fallo de alimentación como parte de la tarea de la secuencia.
11.
La capacidad de imprimir el contenido del archivo histórico, los parámetros de "ejecución" y los parámetros del protocolo PCR almacenados como parte de la tarea de impresión.
12.
La capacidad de configurar en cual estado volverá el aparato durante cualquier estado de detención.
13.
La capacidad de comprobar que la temperatura de consigna se alcanza con una cantidad de tiempo razonable.
14.
La capacidad de controlar el instrumento remotamente a través de un puerto RS232.
Hay varios niveles de diagnóstico que se describen a continuación:
Se realizan automáticamente una serie de pruebas de arranque cada vez que el instrumento se enciende. Se evalúan las áreas críticas del hardware sin la intervención del usuario. Cualquier prueba que detecte un fallo en un componente será ejecutada de nuevo. Si la prueba falla, se muestra un mensaje de error y el teclado es bloqueado electrónicamente para impedir que el usuario continúe.
Se prueban las siguientes áreas:
Dispositivo de interfase periférico programable
Dispositivo RAM alimentado por batería
Suma de comprobación de la RAM
Dispositivos EPROM
Dispositivos de temporizadores de interfase programables
Dispositivo de reloj/calendario
Dispositivo controlador de interrupciones programable
Sección analógica a digital
Sensores de temperatura
Verificar el adecuado conector de configuración
Se dispone de una serie de diagnósticos sólo para servicio para las pruebas finales en el lugar de fabricación o para los ingenieros de servicio en campo a través de una secuencia de teclas "oculta" (es decir, desconocida para el cliente). Muchas de estas pruebas son las mismas que las de los diagnósticos de arranque con la excepción de que pueden ser ejecutadas continuamente hasta 99 veces.
Se prueban las siguientes áreas:
Dispositivo de interfase periférico programable
Dispositivo RAM alimentado por batería
Suma de comprobación de la RAM
Dispositivos EPROM
Dispositivos de temporizadores de interfase programables
Dispositivo de reloj/calendario
Dispositivo controlador de interrupciones programable
Sección analógica a digital
Sección RS-232
Sección de visualización
Teclado
Avisador acústico
Válvulas de refrigeración rápida
Comprobación del desajuste de la EPROM
Nivel de versión del programa (firmware)
Suma de comprobación e inicialización de la RAM
Testigo de programa de auto arranque
Testigo de borrado de calibración
Calentador de la cubierta calentada y circuitos de control
Calentador del borde y circuitos de control
Calentador de colector y circuitos de control
Calentador central y circuitos de control
Prueba del corte térmico del bloque de muestras
Prueba del corte térmico de la cubierta calentada
También se dispone de diagnósticos del usuario para permitir que el usuario realice una rápida prueba de calentar y enfriar rápidamente y una amplia confirmación del sistema de refrigeración y calentamiento. Estos diagnósticos también permiten que el usuario vea el archivo histórico, que es un registro secuencial de eventos que ocurrieron en la ejecución previa. Los registros contienen hora, temperatura, número del punto de consigna, número del ciclo, número del programa y mensajes de estado.
Se dispone de diagnósticos remotos para permitir el control del sistema desde un ordenador externo a través de un puerto RS-232. El control se limita solamente a los diagnósticos de servicio y a la calibración del instrumento.
Se realiza la calibración para determinar varios parámetros tales como la resistencia del calentador, etc. El acceso a la pantalla de calibración está limitada por una secuencia de teclas "oculta" (es decir, desconocida para el cliente). Se calibran los siguientes parámetros:
El conector de configuración que restablezca la unidad de enfriamiento, los calentadores del bloque de muestras, la bomba de refrigerante y la alimentación de potencia para la tensión y frecuencias apropiadas (100 V/50 Hz, 100 V/60 Hz, 120 V/60 Hz, 220 V/50 Hz ó 230 V/50 Hz). El usuario introduce el tipo de colector de configuración instalado. El programa usa esta información para calcular la resistencia equivalente de los calentadores del bloque de muestras. Tras el arranque, el sistema verifica el conector de configuración seleccionado es consistente con la línea, tensión frecuencia actuales.
La resistencia del calentador debe determinarse en el proceso de calibración de forma que puedan realizarse cálculos precisos de la potencia del calentador entregada. El usuario introduce las resistencias reales de los seis calentadores del bloque de muestras (dos calentadores principales, dos calentadores de colectores y dos calentadores de bordes). El conector de configuración cablea físicamente el calentador en serie para 220-230 V c.a. y en paralelo para 100-120 V c.a. El programa calcula la resistencia equivalente de cada uno de los tres calentadores con la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
105 
\vskip1.000000\baselineskip
La resistencia equivalente se usa para proporcionar una cantidad precisa de potencia de calentamiento al bloque de muestras (Potencia = Voltaje^{2} \times Resistencia).
La calibración del circuito A/D es necesaria para que las temperaturas puedan ser medidas con precisión. Esto se realiza midiendo dos puntos de prueba de tensión (TP6 y TP7 en el circuito de la CPU) e introduciendo las tensiones medidas. La salida del A/D para cada tensión es la base de los dos puntos de calibración de la curva. Estas tensiones se derivan de la fuente de precisión de 5 V y son precisas e independientes de la temperatura. En el comienzo de cada ejecución, estas tensiones son leídas por el sistema para medir la deriva electrónica debida a la temperatura porque cualquier cambio en la salida del A/D es debida a las dependencias de la temperatura en la cadena analógica (multiplexor, amplificador analógico y convertidor A/D).
Se realiza la calibración de los cuatro detectores de temperatura (bloque de muestras, ambiente, refrigerante y cubierta calentada) para tener unas mediciones de temperatura precisas. Antes de su instalación en un instrumento los detectores de temperatura del ambiente, refrigerante y cubierta calentada se colocan en un baño de agua donde se registra su salida (XX,XºC a YYYY mV). Estos valores son introducidos entonces en el sistema. Se usa una curva de calibración de un punto ya que la precisión de la temperatura en esas áreas no es crítica.
En detector del bloque de muestras se calibra en el instrumento. Se sitúa estratégicamente en el bloque de muestras una matriz de 15 sondas de temperatura de precisión en la realización preferida. La salida de las ondas de temperatura se recoge y promedia en un ordenador. Los comandos del programa del bloque lo llevan a 40ºC. Tras un breve periodo de estabilización el usuario introduce la temperatura del bloque media tal como se lee por las 15 sondas. Este procedimiento se repite a 95ºC, formando la curva de calibración en dos puntos.
La calibración del circuito de muestreo de la tensión de línea de alterna a continua se realiza introduciendo en el sistema la salida del circuito de alterna a continua para dos tensiones de entrada de alterna dadas, formando una curva de calibración de dos puntos. La salida del circuito no es lineal en el rango requerido (90 - 260 V c.a.) y por tanto requiere dos puntos en cada terminal (100 y 120, 220 y 240 V c.a.), pero sólo usa un conjunto basándose en la tensión de entrada actual.
Es necesaria una medida precisa de la tensión de alterna para entregar una precisa cantidad de potencia al bloque de muestras (Potencia = Voltaje^{2} \times Resistencia).
El programa de instalación es una prueba diagnóstica que realiza una amplia prueba de los sistemas de refrigeración y calentamiento. La instalación mide o calcula la conductancia de la refrigeración de control, la conductancia de la refrigeración rápida a 10ºC y 18ºC, la potencia de refrigeración a 10ºC y 20ºC, la capacidad térmica y de refrigeración del bloque de muestras y el retardo en el detector del bloque de muestras. La finalidad que la instalación es
triple:
1.
Descubrir componentes marginales o defectuosos.
2.
Usar algunos de los valores medidos como constantes del sistema almacenados en una RAM alimentada por baterías para optimizar el sistema de control para un instrumento dado.
3.
Medir la degradación del sistema y calentamiento de refrigeración con el tiempo.
La instalación se ejecuta una vez antes de enviar el sistema y debería ejecutarse también antes de su uso o cuando sea sustituido algún componente principal. El programa de instalación puede ejecutarse también por el usuario bajo los diagnósticos del usuario.
La prueba de impulso del calentador verifica que los calentadores están apropiadamente configurados para la tensión de línea actual (es decir, en paralelo para 90-132 V a.c. y en serie para 208-264 V c.a.). El programa suministra un impulso de potencia al bloque de muestras y entonces vigila la elevación de temperatura en un período de tiempo de 10 segundos. Si la elevación de temperatura está fuera de un margen especificado para el índice de ascenso, entonces los calentadores están incorrectamente cableados para la tensión de línea actual y se finaliza el proceso instalación.
Las pruebas de conductancia de la refrigeración de control miden la conductancia térmica K_{cc} a través del bloque de muestras hasta los pasos de la refrigeración de control. Esta prueba se realiza llevando primero la temperatura del bloque de muestras a 60ºC (las válvulas rápidas están cerradas), e integrando entonces la potencia del calentador requerida para mantener el bloque a 60ºC en un periodo de tiempo de 30 segundos. La potencia integrada se divide por la suma de la diferencia entre las temperaturas del bloque y refrigerante durante el intervalo.
106
Los valores típicos son 1,40 a 1,55 W/ºC. Una baja K_{cc} puede indicar una(s) línea(s) obstruida(s). Una alta K_{cc} puede deberse a una válvula rápida que no esté completamente cerrada, fugas de refrigerante al diámetro exterior de la funda o una funda que se ha desplazado.
La prueba de la capacidad térmica del bloque (Cap Blq) mide la capacidad térmica del bloque de muestras controlando primero el bloque a 35ºC y aplicando entonces la máxima potencia a los calentadores durante 20 segundos. La capacidad térmica del bloque es igual a la potencia integrada dividida por la diferencia en la temperatura del bloque. Para aumentar la precisión, el efecto de la potencia de refrigeración de control se resta de la potencia integrada.
107
donde:
tiempo rampa
= 20 segundos
potencia calentador
= 500 vatios
refrig. control
= (\Sigma Temp Bloque - Temp Refrig) * K_{cc}
delta temp
= TBloque_{t=20} - TBloque_{t=0}
El valor típico de Cap Blq es 540 vatios-segundos/ºC \pm 30. Suponiendo un valor de K_{cc} normal, un aumento en la capacidad térmica del bloque se debe a un aumento de las cargas térmicas, tales como humedad en la espuma de recubrimiento, pérdida de aislamiento alrededor del bloque de muestras o una disminución en la potencia del calentador tal como un fallo en uno de las seis zonas del calentador o un fallo en el del circuito electrónico que acciona las zonas de los calentadores, o un módulo de configuración de tensión incorrecto o incorrectamente cableado.
Una prueba de enfriamiento mide la salida de refrigeración del sistema en vatios a 10ºC y 18ºC. La potencia de refrigeración del sistema, o salida de enfriamiento, a una temperatura dada es igual a la suma de cargas térmicas a esa temperatura. Los principales componentes son: 1. potencia de calentamiento requerida para mantener el bloque a una temperatura dada, 2. potencia disipada por la bomba usada para hacer circular el refrigerante alrededor del sistema, y 3. pérdidas en las líneas de refrigerante hacia el ambiente. El parámetro de potencia de enfriamiento se mide controlando la temperatura del refrigerante tanto a 10ºC como a 18ºC e integrando la potencia aplicada al bloque de muestras para mantener una temperatura de refrigerante constante, durante un intervalo de 32 segundos. La diferencia entre la temperatura del refrigerante y el bloque se integra también para calcular las pérdidas hacia la temperatura ambiente.
108
donde:
Potencia calentam
= Suma de la potencia de calentamiento requerida para mantener el refrigerante a 10ºC o {}\hskip0.2cm 18ºC durante 32 segundos
Potencia bomba
= Bomba de circulación, 12 vatios
Kamb
= Conductancia al ambiente, 20 vatios/ºC
temp bloque - temp refrig
= suma de las diferencias en la temperatura del bloque y del refrigerante durante los 32 {}\hskip0.2cm segundos.
El valor típico para la potencia de enfriamiento es 230 vatios \pm 40 a 10ºC y 370 vatios \pm 40 a 18ºC. Una potencia de enfriamiento baja puede deberse a una obstrucción en el conducto del ventilador, un ventilador defectuoso, o una unidad de enfriamiento marginal o con fallos. Se puede deber también a un conector de configuración de tensión mal cableado.
Las pruebas de conductancia de la refrigeración rápida miden la conductancia térmica K_{c} a 10ºC y a 18ºC a través del bloque de muestras hasta los pasos de la refrigeración rápida. Esta prueba se realiza controlando primero la temperatura del refrigerante a 10ºC o 18ºC, e integrando entonces, durante un intervalo de 30 segundos, la potencia del calentador aplicada para mantener el refrigerante a la temperatura dada dividida por la diferencia de temperaturas del bloque y del refrigerante en el intervalo de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
109 
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores típicos para K_{c} son 28 vatios/ºC \pm 3 a 10ºC y 31 vatios/ºC \pm 3 a 18ºC. Una baja K_{c} puede deberse a una válvula rápida cerrada u obstruida, tuberías de refrigerante retorcidas, bomba débil o una mezcla agua/Prestone (anticongelante) dura.
Una prueba de retardo del detector mide el retardo del detector del bloque controlando primero la temperatura del bloque a 35ºC y aplicando entonces 500 vatios de potencia de calentamiento durante 2 segundos y midiendo el tiempo requerido por el bloque para elevar 1ºC. Los valores típicos son 13 a 16 unidades, donde cada unidad es igual a 200 ms. Un retardo del detector más lento o largo puede deberse a una pobre interfase entre el detector y el bloque, tal como falta de pasta térmica, una cavidad del detector pobremente realizada o un defecto en el detector.
Las restantes pruebas de instalación se ejecutan actualmente por el programa de instalación pero tienen una finalidad de diagnóstico limitada debido al hecho de que son valores calculados o son función de tantas variables que sus resultados no determinan la fuente de un problema con precisión.
El programa instalación calcula la pendiente de la conductancia de refrigeración rápida (S_{c}) entre 18ºC y 10ºC. Es una medida de la linealidad de la curva de conductancia. También se usa para aproximar la conductancia de refrigeración en rampa a 0ºC. Los valores típicos son 0,40 \pm 0,2. La dispersión de los valores confirma el hecho de que es sólo una aproximación.
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110 
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El programa de instalación también calcula la conductancia de refrigeración K_{c0}. K_{c0} es una aproximación a la conductancia de la refrigeración a 0ºC. El valor se extrapola de la conductancia real a 10ºC. Los valores típicos son 23 vatios/ºC \pm 5. La fórmula usada es:
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111 
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El programa de instalación también calcula la capacidad de refrigeración (Cap Refr) que es una aproximación a la capacidad térmica de la cadena completa de refrigerante (refrigerante, líneas de tuberías, intercambiador de calor y válvulas). La capacidad de refrigeración es igual a los componentes que bombean calor hacia el refrigerante menos los componentes que retiran el calor del refrigerante. El mecanismo usado para medir y calcular estos componentes es complejo y se describe en detalle en la sección de descripción del código fuente. En esta medida, se deja que el refrigerante se estabilice a 10ºC. Se aplica la máxima potencia de calentamiento al bloque de muestra por un período de 128 segundos.
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112 
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Los caracteres encerrados en {} indican los nombres de variables usados en el código fuente.
\newpage
Pseudocódigo de la prueba de impulso del calentador:
La prueba de impulso del calentador verifica que los calentadores están apropiadamente cableados para la tensión de línea actual.
Llevar el bloque de muestras y el refrigerante a un punto conocido y estable.
113
Medir el efecto en la refrigeración del control de refrigeración midiendo la caída de la temperatura del bloque durante un intervalo de 10 segundos. Esperar 10 segundos para la estabilización antes de realizar ninguna medida.
114
Examinar la variable (linevolts) que contiene la tensión de línea medida real. Enviar un pulso al calentador con 75 vatios para una tensión de línea mayor que 190 V o con 300 vatios si es menor que 140 V.
115
Medir la elevación de temperatura durante un periodo de 10 segundos. El resultado es el índice el calor medio en 0,01º/segundo.
116
Restar el índice de calor medio {tempb} del efecto del control de refrigeración para calcular el verdadero índice de calentamiento
1000
Evaluar el Índice_calent. Para 220 V-230 V, el índice de calentamiento debería ser menor de 0,30º/segundo. Para 100 V-120 V el índice de calentamiento debería ser mayor que 0,30º/segundo.
117
Pseudocódigo de la prueba K_{cc}:
Esta prueba mide la conductancia de la refrigeración de control también conocida como K_{cc}.
K_{cc} se mide a una temperatura del bloque de 60ºC.
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118 
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Integrar la potencia que está siendo aplicada a los calentadores del bloque de muestras durante el periodo de 30 segundos. Medir e integrar la potencia requerida para mantener la temperatura del bloque con la refrigeración de control.
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119
120 
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Acumular la potencia aplicada a los calentadores principal y auxiliar. El código real reside en la tarea de control PID y es por tanto sumada cada 200 ms.
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121 
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Calcula la conductancia dividiendo la suma de la potencia por la suma de la temperatura. Nótese que las unidades son 10 mW/ºC.
122 
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Pseudocódigo de la prueba CP BLOQUE:
Esta prueba mide la capacidad térmica del bloque de muestras.
123
dar la máxima potencia a los calentadores durante 20 segundos mientras se suma la diferencia de temperaturas en el bloque al refrigerante, así como la potencia del calentador.
124
125
Calcular los julios en la potencia de refrigeración debido a la refrigeración de control que tiene lugar durante la rampa.
126
Calcular los julios totales aplicados al bloque por el calentador principal y la refrigeración de control. Dividir por los cambios de temperatura durante el intervalo para calcular la capacidad térmica.
127
donde:
tiemporampa
= 20 segundos
potencia calentador
= 500 vatios
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COOL_{-}PWR_{-}10:
Esta prueba mide la potencia de enfriamiento a 10ºC.
Controlar la temperatura del refrigerante 10ºC y estabilizarla durante 120 segundos.
128
En este punto, el refrigerante ha estado a 10ºC durante 120 segundos y se ha estabilizado. Integrar, durante 32 segundos, la potencia aplicada para mantener la temperatura del refrigerante en 10ºC.
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129
130 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular el número de julios de energía añadida a la masa del refrigerante durante el intervalo de integración. "(coolant_temp - cool_init)" es el cambio en la temperatura de refrigeración durante el intervalo de integración. 550 es la capacidad del refrigerante en julios, de este modo el producto es en julios. Representa el calor extra añadido al refrigerante que le hace desviarse del punto de consigna durante el intervalo de integración. Este error se resta a continuación del calor total aplicado antes de calcular la potencia de refrigeración.
131 
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir la suma de la potencia principal a la suma del calentador auxiliar para obtener los julios disipados en 32 segundos. Dividir por 32 para tener la media de julios/segundos.
132 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular la potencia de enfriamiento a 10ºC sumando todos los componentes de la potencia de enfriamiento.
133 
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
{main_pwr_sum}
= suma de la potencia del calentador en el intervalo
POT_BOMB
= 12 vatios, bomba que hace circular el refrigerante
delta_temp_sum
= suma de amb - refrigerante durante el intervalo
K_AMB
= 20 vatios/K, conductancia térmica de refrigeración al ambiente.
\newpage
Pseudocódigo de la prueba KC_{-}10:
Esta prueba mide la conductancia de la refrigeración rápida a 10ºC.
Controlar la temperatura del refrigerante a 10ºC \pm 0,5 y permitirle que se estabilice durante 10 segundos.
En este punto, el refrigerante está en su punto de consigna y está siendo controlado. Integrar, durante un intervalo de 30 segundos, la potencia que está siendo aplicada a los calentadores para mantener el refrigerante a 10ºC. Sumar la diferencia entre las temperaturas del bloque y el refrigerante.
134
Calcular la energía en julios entregada al bloque durante el período de integración. Las unidades están en 0,1 vatios.
135
Dividir la potencia sumada por la suma de la temperatura bloque - refrigerante para obtener la conductancia de la refrigeración rápida en 100 mW/K.
136 
\vskip1.000000\baselineskip
Pseudocódigo de la prueba COOL_{-}PWR_{-}18:
Esta prueba mide la potencia de refrigeración a 18ºC.
Llevar el bloque de muestras y el refrigerante a un punto estable y conocido. Controlar la temperatura del refrigerante a 18ºC y estabilizarla durante 128 segundos.
137
En este punto, el refrigerante ha estado a 18ºC durante 120 segundos y se ha estabilizado. Integrar, durante 32 segundos, la potencia que está siendo aplicada para mantener la temperatura del refrigerante a 18ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
138 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular el número de julios de energía añadida a la masa del refrigerante durante el intervalo de integración. "(coolant_temp - cool_init)" es el cambio en la temperatura de refrigeración durante el intervalo de integración. 550 es la capacidad del refrigerante en julios, de este modo el producto es en julios. Representa el calor extra añadido al refrigerante que le hace desviarse del punto de consigna durante el intervalo de integración. Este error se resta a continuación del calor total aplicado antes de calcular la potencia de refrigeración.
139 
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir la suma de la potencia principal a la suma del calentador auxiliar para obtener los julios disipados en 32 segundos. Dividir por 32 para tener la media de julios/segundos.
140 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular la potencia de enfriamiento a 18ºC sumando todos los componentes de la potencia de enfriamiento.
141
donde:
{main_pwr_sum}
= suma de la potencia del calentador en el intervalo
POT_BOMB
= 12 vatios, bomba que hace circular el refrigerante
delta_temp_sum
= suma de amb - refrigerante durante el intervalo
K_AMB
= 20 vatios/K, conductancia térmica de refrigeración al ambiente.
\newpage
Pseudocódigo de la prueba KC_{-}18:
Esta prueba mide la conductancia de la refrigeración rápida a 18ºC.
Controlar la temperatura del refrigerante a 18ºC \pm 0,5 y permitir que se estabilice durante 10 segundos.
En este punto, el refrigerante está en su punto de consigna y está siendo controlado. Integrar, durante un intervalo de 30 segundos, la potencia que está siendo aplicada a los calentadores para mantener el refrigerante a 18ºC. Sumar la diferencia entre las temperaturas del bloque y el refrigerante.
\vskip1.000000\baselineskip
142 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular la energía en julios entregada al bloque durante el período de integración. Las unidades están en 0,1 vatios.
\vskip1.000000\baselineskip
143 
\vskip1.000000\baselineskip
Dividir la potencia sumada por la suma de la temperatura bloque - refrigerante para obtener la conductancia de la refrigeración rápida en 100 mW/K.
\vskip1.000000\baselineskip
144 
\vskip1.000000\baselineskip
Pseudocódigo de la prueba SENLAG:
Esta prueba mide el retardo en el detector del bloque de muestras.
Llevar el bloque a 35ºC. Mantenerlo dentro de \pm 0,2ºC durante 20 segundos y entonces registrar la temperatura del bloque.
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145 
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Dar 500 W de potencia al bloque de muestras.
\newpage
Aplicar 500 W de potencia durante los 2 segundos siguientes y contar la cantidad de iteraciones a través del bucle para que la temperatura del bloque aumente 1ºC. El bucle de iteración se ejecuta cada 200 ms, por tanto el retraso del detector real es igual a la cuenta * 200 ms.
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146 
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Pseudocódigo de la prueba CP Refrigerante
Esta prueba calcula la capacidad de refrigeración de sistema completo.
Estabilizar la temperatura del refrigerante a 10ºC \pm 0,5ºC.
Enviar un mensaje a la tarea de control PID para elevar rápidamente la temperatura de refrigeración desde su valor actual (alrededor de 10ºC) a 18ºC.
Esperar a que el refrigerante cruce los 12ºC de forma que la rampa del coeficiente de refrigeración siempre comienza a la misma temperatura y ya ha comenzado claramente a elevarse. Anotar las temperaturas ambiente inicial y del bloque.
\vskip1.000000\baselineskip
147 
\newpage
Durante los dos minutos siguientes, mientras la temperatura del refrigerante se está elevando a 18ºC, sumar la temperatura del refrigerante y la diferencia entre las temperaturas del ambiente y del refrigerante.
\vskip1.000000\baselineskip
148 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular el cambio en las temperaturas durante el periodo de dos minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
149 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular KChill, es decir, el índice de cambio de la potencia de enfriamiento con la temperatura del refrigerante en el rango de refrigeración de 10ºC a 20ºC. Notar que las unidades son en vatios/10ºC.
150 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular Sc que es la pendiente de la conductividad de la refrigeración rápida versus el rango de temperatura de 18ºC a 10ºC. Las unidades son en vatios/10ºC/10ºC.
151 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular Kc_0, la conductancia de la refrigeración rápida extrapolada a 0ºC.
152 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular Cp_cool, la capacidad del refrigerante mediante:
153
- Pot_0ºC * 128
- CP_Bloque * blk_delta
+ K_AMB * temp_sum
- Kchill * cool_temp_sum)/h2o_delta
donde:
POTCALORIF
= 500 W, la potencia calorífica aplicada para calentar el bloque, y de ahí calentar el refrigerante. {}\hskip0.2cm Se multiplica por 128, ya que el intervalo de calentamiento fueron 128 segundos.
POT_BOMB
= 12 vatios, la potencia de la bomba que hace circular el refrigerante multiplicada por 128 segundos
Pot_0ºC
= La potencia de refrigeración a 0ºC multiplicada por 128 segundos
CP_Bloque
= Capacidad térmica del bloque de muestras.
blk_delta
= Cambio en la temperatura del bloque durante el intervalo de calentamiento.
K_AMB
= 20 vatios/K, conductancia térmica de refrigeración al ambiente.
temp_sum
= La suma, una vez por segundo, de la temperatura ambiente - refrigerante durante el intervalo.
h2o_delta
= Cambio en la temperatura del refrigerante durante el intervalo de calentamiento (aproximada- {}\hskip0.2cm mente 6ºC).
KChill
= Pendiente de la potencia de enfriamiento versus temperatura del refrigerante.
cool_temp_sum
= La suma de la temperatura del refrigerante, una vez por segundo, durante el intervalo de calen- {}\hskip0.2cm tamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Sistema operativo en tiempo real - CRETIN
CRETIN es un núcleo independiente, multitarea que proporciona servicios de sistema a otros módulos de programación llamados tareas. Las tareas se escriben en el lenguaje "C" con algunas áreas en las que el tiempo es crítico, escritas en el lenguaje ensamblador del Intel 8085. Cada tarea tiene un nivel de prioridad y proporciona una función independiente. CRETIN reside en la memoria baja y se ejecuta después de que los diagnósticos de arranque hayan sido ejecutados con éxito.
CRETIN gestiona la planificación de tareas y sólo permite que se ejecute una tarea a la vez. CRETIN recibe todas las interrupciones de hardware posibilitando así que las tareas esperen a ejecutarse cuando se reciba la interrupción adecuada. CRETIN proporciona un reloj en tiempo real para permitir a las tareas esperar a eventos temporizados o detenerse durante intervalos conocidos. CRETIN también proporciona comunicación entre las tareas a través de unos nodos de mensaje del sistema.
El programa (firmware) se compone de nueve tareas que se describen a continuación brevemente en el orden de su prioridad. Las secciones posteriores describirán cada tarea con mayor detalle.
1.
La tarea de control (PID) es la responsable de controlar la temperatura del bloque de muestras.
2.
La tarea del teclado es responsable de procesar las entradas del teclado desde las teclas.
3.
La tarea de temporizador espera la interrupción de hardware de medio segundo, entonces envía un mensaje de despertar tanto a la tarea de secuencia como a la de pantalla.
4.
La tarea de secuencia ejecuta los programas del usuario.
5.
La tarea de pausa maneja las pausas programadas y del teclado cuando está en ejecución un programa.
6.
La tarea de pantalla actualiza la pantalla en tiempo real.
7.
La tarea de impresión maneja la comunicación del puerto RS-232 y la impresión.
8.
La tarea del LED es responsable de activar el LED de calentamiento. Se usa también para controlar la temperatura del refrigerante mientras se ejecuta la instalación.
9.
La tarea de enlaces arranca archivos que están enlazados juntos en un método mediante la simulación de una pulsación de tecla.
\newpage
Programa de control de la temperatura del bloque (Tarea PID)
La tarea Proporcional Integral Diferencial (PID) es la responsable de controlar la temperatura absoluta del bloque de muestras en 0,1ºC, así como controlar la no uniformidad de la temperatura del bloque de muestras (TNU, Temperature Non-Uniformity, definida como la temperatura del pocillo más caliente menos la temperatura del pocillo más frío) en menos de \pm 0,5ºC mediante la aplicación de más potencia de calentamiento al perímetro del bloque para compensar las pérdidas a través de los bordes de la banda de protección. La tarea PID es responsable también de controlar la temperatura de la cubierta calentada con un menor grado de precisión. Esta tarea se ejecuta 5 veces por segundo y tiene la más alta prioridad.
La cantidad de potencia de calentamiento o de refrigeración proporcionada al bloque de muestras se deriva de la diferencia o "error" entre la temperatura de la muestra especificada por el usuario almacenada en la memoria, llamada punto de consigna, y la temperatura de la muestra actual calculada. Este esquema sigue la práctica estándar en bucles de control. Además de una contribución de potencia a los calentadores de película directamente proporcional al error actual, es decir, el componente proporcional, (temperatura del punto de consigna menos la temperatura del bloque de muestras), la potencia calculada también incorpora un término integral que sirve para cancelar cualquier error estático (punto de consigna de temperatura menos temperatura del bloque menor que 0,5ºC). Éste componente es llamado el componente integral. Para evitar la acumulación del término integral o "deslizamiento", las contribuciones del integral se restringen a una pequeña banda alrededor del punto de consigna de temperatura. Las ganancias de los componentes proporcional e integral han sido cuidadosamente seleccionadas y probadas, ya que las constantes de tiempo asociadas con el detector del bloque y del tubo de muestras restringen severamente el margen de fase del sistema, creando así un potencial para inestabilidades del bucle. El término de la ganancia proporcional es P en la ecuación (46) siguiente y el término de la ganancia integral es Ki en la ecuación (48) siguiente.
La tarea PID usa un "algoritmo de sobrepaso controlado" por el que la temperatura del bloque a menudo sobrepasa el valor de su estado estable final para que la temperatura de la muestra llegue a su temperatura deseada tan rápidamente como sea posible. El uso del algoritmo de sobrepaso hace que la temperatura del bloque se sobrepase de manera controlada pero no hace que la temperatura de la muestra se sobrepase. Esto ahorra potencia y se cree que es nuevo en la instrumentación PCR.
La potencia total entregada a todos los calentadores del bloque de muestras para obtener el índice de elevación deseado es dado por:
154
donde:
CP
= Masa térmica del bloque
ajuste
= potencia de la refrigeración de control o control
indice_rampa
= T_{final} - T_{inicial}/índice de elevación deseado
Esta potencia se limita por seguridad a un máximo de 500 W de potencia de calentamiento.
Con cada iteración de la tarea (cada 200 ms) el sistema aplica la potencia de calentamiento o de refrigeración rápida (si es necesario) basándose en los siguientes algoritmos.
El sistema de control es gobernado regido por la temperatura de la muestra calculada. La temperatura de la muestra se define como la temperatura media del líquido en un tubo de muestra plástico de paredes delgadas colocado en uno de los pocillos del bloque de muestras (en adelante el "bloque"). La constante de tiempo del sistema (tubo de muestra y sus contenidos) es una función del tipo de tubo y del volumen. Al comienzo de una ejecución, el usuario introduce el tipo de tubo y la cantidad del volumen de reacción. El sistema calcula una constante de tiempo resultante (\tau o tau). Para el tubo "MicroAmp" y 100 microlitros de volumen de reacción, tau es aproximadamente 9 segundos.
155
donde:
T_{bloque-nueva-}
= temperatura actual del bloque
T_{bloque}
= temperatura del bloque hace 200 ms
potencia
= potencia aplicada al bloque
CP
= masa térmica del bloque
T_{muestra-nueva-}
= temperatura actual de la muestra
T_{muestra}
= temperatura de la muestra hace 200 ms
tau
= constante de tiempo térmica del tubo de muestra, ajustada para el retardo en el detector (aproximada- {}\hskip0.2cm mente 1,5)
El error en la señal de temperatura es simplemente:
156
Como en cualquier sistema de bucle cerrado, se aplica una acción correctiva (potencia de calentamiento o refrigeración) para cancelar parte del error actual. En la ecuación (45) siguiente, F es la fracción de la señal de error a ser cancelada en un periodo de muestra (200 ms).
157
donde:
PA
= Punto de consigna de temperatura del usuario
Debido al gran retardo en el sistema (gran constante de tiempo del tubo), la fracción F se fija pequeña.
Combinando las fórmulas (42) y (44) obtenemos:
158
Combinando las fórmulas (41) y (45) y añadiendo el término P (la ganancia del término proporcional) para limitar las oscilaciones de la temperatura del bloque y mejorar la estabilidad del sistema obtenemos:
159
donde:
P
= la ganancia del término proporcional y
T
= el periodo de muestra de 0,2 segundos (200 ms).
P/T
= 1 en la realización preferida
La ecuación (46) es una ecuación teórica que da la potencia (potencia) necesaria para mover la temperatura del bloque a algún valor deseado sin tener en cuenta las pérdidas al ambiente a través de las bandas de protección, etc.
Una vez que se determina por medio de la ecuación (46) la potencia necesaria para cambiar el bloque, esta potencia se reparte en la potencia a ser entregada a cada una de las tres zonas del calentador dividiendo por las áreas de estas zonas. Entonces se determinan las pérdidas a los colectores y se añade un término de potencia que tiene la magnitud suficiente para compensar estas pérdidas a la cantidad de potencia a ser entregada a la zona del calentador de colectores. De la misma forma, otro término de potencia suficiente para compensar la potencia perdida por los pernos de sujeción del bloque, el detector de temperatura del bloque y el ambiente se añade a la potencia a entregar a la zona del calentador de borde. Estos términos adicionales y la división de la potencia por el área de las zonas convierte la ecuación (46) en las ecuaciones (3), (4) y (5) dadas anteriormente.
La ecuación (46) es la fórmula usada por la realización preferida del sistema de control para determinar la potencia del calentamiento o refrigeración necesario para el bloque de muestras.
Cuando la temperatura de la muestra calculada está dentro de la "banda integral", es decir, \pm 0,5ºC alrededor de la temperatura objetivo (PA), la ganancia del término proporcional es demasiado pequeña para cancelar el error remanente. Por tanto se añade un término integral al término proporcional para cancelar pequeños errores. El término integral se inhabilita fuera de la banda integral para impedir la acumulación de una gran señal de error. El algoritmo dentro de la "banda integral" es el siguiente:
160
donde:
Int_sum
= suma en el período de muestra de la diferencia entre el punto de consigna (PA) y la temperatura T_{muestra}, y
Ki
= la ganancia integral (512) en la realización preferida.
Una vez que se ha calculado la potencia de calentamiento, el programa de control distribuye la potencia a las tres zonas de los calentadores de película 254, 262 y 256 de la figura 13 basándose en el área en la realización preferida. Los calentadores de borde reciben una potencia adicional basándose en la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura ambiente. Similarmente, los calentadores de colectores reciben una potencia adicional basándose en la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura del refrigerante.
Pseudocódigo del PID
En el arranque del sistema o reposición
161
Esa parte del código también lee la referencia de tensión estable de temperatura y compara la tensión con la tensión de referencia que se determinó durante la calibración del instrumento. Si hay cualquier discrepancia, la electrónica ha derivado y las lecturas de tensión de los detectores de temperatura se ajustan en consecuencia para obtener lecturas de temperatura precisas.
Calcular la temperatura de la muestra {tubetenths} o la temperatura que se visualiza usando un filtro digital paso-bajo.
162
donde:
TT_{n-1}
= última temperatura de la muestra (tubetenths)
TB_{n}
= temperatura actual del detector del bloque {blktenths}
T
= intervalo de muestra en segundos -200 ms
tau
= tau del tubo {cf_tau} - tau del detector {cf_lag}
La ecuación (49) representa el primer término de una expansión en serie de Taylor del exponencial que define la temperatura de la muestra calculada dada anteriormente como la ecuación (6).
Calcula la temperatura de la espuma que cubre por debajo el bloque de muestras, (phantenths) conocida como la masa fantasma. La temperatura de la masa fantasma se usa para ajustar la potencia entregada al bloque al tener en cuenta el flujo de calor hacia y desde la masa fantasma. La temperatura se calcula por medio de un filtro digital paso-bajo implementado en el programa.
163
donde:
TT_{n-1}
= última temperatura de la masa fantasma {phantenths}
TB_{n}
= temperatura actual del detector del bloque {blktenths}
T
= intervalo de muestra en segundos -200 ms
tau_{foam}
= tau del bloque de espuma - 30
calcular el error de la temperatura de la muestra (la diferencia entre la temperatura de la muestra y la temperatura del punto de consigna) {abs_tbe_err}.
164
donde
ERR
= el ancho de temperatura de la "banda integral", es decir, la banda de error que rodea la temperatura objetivo {}\hskip0.15cm o del punto de consigna.
Calcular la potencia de refrigeración de control actual {cool_ctrl} para determinar cuanto calor se está perdiendo en los canales de refrigeración de control.
Calcular la potencia de refrigeración rápida actual {cool_ramp}
Calcular {cool_brkpt} \cdot {cool_hrkpt} es la potencia de refrigeración que se usa para determinar cuándo realizar una transición desde la refrigeración rápida a la de control en las rampas descendentes. Es una función de la temperatura del bloque y del refrigerante.
La potencia de refrigeración de control {cool_ctrl} y la potencia de refrigeración rápida {cool_ramp} son todos factores que la CPU debe conocer para controlar las rampas de temperatura descendentes, es decir, para calcular cuánto tiempo mantener abiertas las válvulas accionadas por solenoide de refrigeración rápida. La potencia de refrigeración de control es igual a una constante más la temperatura del refrigerante por la conductividad térmica desde el bloque a los canales de refrigeración de control. Igualmente, la potencia de refrigeración rápida es igual a la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura del refrigerante multiplicada por la conductividad térmica desde el bloque a los canales de refrigeración rápida. El punto de corte de refrigeración es igual a una constante multiplicada por la diferencia de temperatura entre el bloque y el refrigerante.
Calcular la potencia de calentamiento o refrigeración {int_pwr} necesaria para cambiar la temperatura del bloque desde su temperatura actual al punto de consigna (PA) de temperatura deseado.
165
donde:
XP a ganancia proporcional
= P/T en la ecuación (46) = aproximadamente uno en la realización preferida
CP
= masa térmica del bloque
PA
= punto de consigna de temperatura
T_{muestra}
= temperatura de la muestra
T_{bloque}
= temperatura del bloque
cf_kd
= Tau * K_{d}/delta_t donde tau es la misma tau usada en la ecuación (49) y K_{d} es una {}\hskip0.15cm constante y delta_t es el periodo de muestra de 200 ms.
166
167 
\vskip1.000000\baselineskip
Calcular el término integral de la potencia.
168 
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir el término integral a la potencia.
169
Ajustar la potencia para compensar la carga de calentamiento debida a los efectos de la masa fantasma (recubrimiento de espuma) encontrando primero la potencia de la masa fantasma y añadiéndole entonces a la potencia {int_pwr}.
Calcular la potencia de la masa fantasma {phan_pwr} mediante:
170
Donde: C = masa térmica del recubrimiento de espuma (1,0 W/K)
171
Calcular la potencia necesaria en los calentadores de colectores {aux1_pwr} los cuales compensarán las pérdidas desde el bloque de muestras hacia los bordes de colectores que tienen refrigerante circulando a través de ellos. Nótese que si el sistema está en una rampa descendente {aux_pwr} = 0. La potencia requerida por la zona de colectores se describe a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
172 
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
K1
= coeficiente (cf_1coeff)
K2
= coeficiente (cf_2coeff)
K5
= coeficiente {cf_5coeff}
dT/dt
= relación de cambio
T_{bloque}
= temperatura del bloque
T_{amb}
= temperatura ambiente
T_{refrig}
= temperatura del refrigerante
calcular la potencia necesaria en los calentadores de borde {aux2_power} que compensa las pérdidas desde los bordes del bloque de muestra al ambiente. Nótese que si el sistema está en una rampa descendente {aux2_power} = 0. La potencia requerida por la zona de borde se describe a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
173 
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
K3
= coeficiente {cf_3coeff}
K4
= coeficiente {cf_4coeff}
K6
= coeficiente {cf_6coeff}
dT/dt
= relación de cambio
T_{bloque}
= temperatura del bloque
T_{amb}
= temperatura ambiente
T_{refrig}
= temperatura del refrigerante
Quitar la contribución de potencia a los calentadores de colectores {aux1_power} y borde {aux2_power} para tener la potencia total que debe suministrarse a los calentadores principales y refrigerantes.
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174 
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Decidir si la refrigeración rápida debería aplicarse. Nótese que {cool_brkpt} se usa como punto de cambio de la refrigeración rápida a la refrigeración de control.
175
En este punto, {int_pwr} contiene la potencia de calentadores total y {aux1_power} y {aux2_power} contiene las pérdidas desde el bloque hacia los bordes. La potencia suministrada a los calentadores auxiliares se compone de dos componentes: aux_power y int_power. La potencia se distribuye {int_pwr} a los calentadores principal y auxiliares basándose en el área.
176
Calcular el número de medios ciclos que ha de conducir el triac 5 para cada zona final y cada iteración del bucle de control para enviar la cantidad de potencia apropiada a los calentadores. Este bucle se ejecuta una vez cada 1/5 de segundo, por tanto hay 120/5 = 24 medios ciclos a 60 Hz o 100/5 = 20 a 50 Hz. El número de medios ciclos es una función de la potencia requerida {int_pwr}, la tensión de línea actual {linevolts} y la resistencia del calentador. Dado que puede que no se entregue en cada bloque la potencia exacta necesaria, se calcula un resto {delta_power} para mantener el seguimiento de lo que se ha de incluir del bucle anterior.
177
Calcular el número de 1/2 ciclos para mantener el triac conectado. El índice es igual al número de ciclos para mantener el triac conectado.
178
Donde la ecuación (61) se realiza una vez por cada zona del calentador y donde "potencia" = int_pwr para la zona de calentador principal, aux1_pwr para la zona del calentador de colectores y aux2_pwr para la zona del calentador de borde.
Calcular la cantidad de potencia real entregada.
179
Calcular el resto a ser añadido la siguiente vez.
180
Calcular el número de 1/2 ciclos para los calentadores de borde y colectores usando la misma técnica descrita por los calentadores principales sustituyendo {aux1_pwr} y {aux2_pwr} en la ecuación (60).
Cargar las cuentas calculadas en los contadores que controlan los triacs principal, de colectores y de borde.
Observar el detector de la cubierta calentada. Si la cubierta calentada está a menos de 100ºC, entonces cargar el contador de la cubierta calentada para suministrar 50 vatios de potencia.
Observar la temperatura de la muestra. Si es mayor que 50ºC, encender el LED de CALIENTE para avisar al usuario de que no toque el bloque.
181 
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Tarea del teclado
La finalidad de la tarea del teclado es esperar a que el usuario pulse una tecla del teclado, comparar la tecla con una lista de pulsaciones de tecla válidas para el estado actual, ejecutar la función del comando asociado con la tecla válida y cambiar a un nuevo estado. Las pulsaciones de teclas no válidas se indican con un aviso acústico y se ignoran. Esta tarea es el corazón de la interfase del usuario activada por el estado. Es "activada por el estado" porque la acción tomada depende del estado actual de la interfase del usuario.
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Pseudo código de la tarea del teclado
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Visión general de la tarea del temporizador
La finalidad de la tarea del temporizador es activar la tarea de la secuencia y de la visualización del tiempo real cada medio segundo. La tarea de temporizador pide al sistema (CRETIN) despertarse cuando se recibe la interrupción de hardware de medio segundo que es generada por el dispositivo de reloj/calendario. La tarea de temporizador envía entonces sucesivamente 2 mensajes a la tarea de secuencia y a la tarea de visualización del tiempo real respectivamente. Esta tarea intermedia es necesaria ya que CRETIN sólo servirá una tarea por interrupción y de ahí que sólo se ejecutaría la tarea de mayor prioridad (la tarea de secuencia).
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Pseudocódigo de la tarea del temporizador 
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Visión general de la tarea de secuencia
La finalidad de la tarea de secuencia es ejecutar el contenido de un programa definido por el usuario. Pasa secuencialmente a través de cada punto de consigna en un ciclo, consistente en un segmento de rampa y uno de mantenimiento, y envía los mensajes de temperatura del punto de consigna a la tarea PID lo que a su vez controla la temperatura del bloque de muestras. Al final de cada segmento, envía un mensaje a la tarea de visualización del tiempo real para cambiar la pantalla y un mensaje a la tarea de impresora para imprimir la información de ejecución del segmento. El usuario puede detener un programa en ejecución pulsando la tecla PAUSE en el teclado y reanudar el programa pulsando la tecla START. El usuario puede abortar prematuramente un programa pulsando la tecla STOP. Esta tarea se ejecuta cada medio segundo cuando es despertada por la tarea del temporizador.
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Pseudocódigo de la tarea de secuencia 
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Visión general de la tarea de pausa
La finalidad de la tarea de pausa es manejar bien una pausa que el usuario programa en un programa CYCLE o una pausa cuando el usuario pulsa la tecla PAUSE en el teclado.
Cuando la tarea de secuencias encuentra una pausa programada en la ejecución de un programa CYCLE, se va a dormir y despierta a la tarea de pausa. La tarea de pausa a su vez envía un mensaje a la tarea de visualización en tiempo real para mostrar continuamente y decrementar el tiempo que el usuario solicitó como pausa. Cuando el temporizador de pausa finaliza, la tarea de pausa envía un mensaje para despertar a la tarea de secuencia y entonces va a dormir. El usuario puede reanudar prematuramente el programa pulsando la tecla START en el teclado o puede abortar prematuramente el programa pulsando la tecla STOP.
Cuando la tarea del teclado detecta una tecla PAUSE durante la ejecución de un programa, fija una marca (pause_flag) y entonces espera a que la tarea de secuencia la reconozca. Cuando la tarea de secuencia ve esta marca fijada, envía un mensaje de reconocimiento de vuelta a la tarea del teclado que entonces se pone a sí misma a dormir. Cuando la tarea del teclado recibe este mensaje, despierta a la tarea de pausa. La tarea de pausa envía un mensaje a la tarea de visualización en tiempo real para mostrar continuamente e incrementar la cantidad de tiempo que el programa está en pausa. El temporizador finalizará cuando alcance el tiempo límite de pausa fijado por el usuario en la sección de configuración. El usuario puede reanudar el programa pulsando la tecla START en el teclado o abortar el programa usando la tecla STOP.
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Pseudo código de la tarea de pausa
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Visión general de la tarea de visualización
La finalidad de la tarea de visualización en tiempo real es mostrar las temperaturas, temporizadores, lectura de detectores, lecturas de los canales ADC, y otros parámetros que necesitan ser continuamente actualizados cada medio segundo.
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Pseudo código de la tarea de visualización
Inicializar las variables de la tarea de visualización.
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Visión general de la tarea de impresión
La finalidad de la tarea de impresión es manejar la impresión durante la ejecución. Es una tarea de baja prioridad y no debería interferir con otras tareas de tiempo crítico.
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Pseudo código de la tarea de impresión 
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198 
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Visión general de la tarea de LED
La finalidad de la tarea de LED es controlar la iluminación del LED de "calentamiento" reflejando la potencia aplicada al calentador principal. Es una tarea de baja prioridad que se ejecuta una vez por segundo.
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Pseudo código de la tarea de LED
Inicializar las variables de la tarea de LED.
199
Visión general de la tarea de enlace
La finalidad de la tarea de enlace es simular que el usuario pulsa la tecla START en el teclado. Esta tarea es necesaria para que los programas puedan ejecutarse uno a continuación del otro (como en un método) sin la intervención del usuario. La tarea de enlace despierta la tarea de secuencia y comienza la ejecución del siguiente programa como si se hubiera pulsado la tecla START.
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Pseudo código de la tarea de enlace
Inicializar las variables de la tarea de enlace.
200
Secuencia de arranque
SECUENCIA DE ENCENDIDO
Cuando se conecta la alimentación al instrumento o el programa realiza un RESET, tiene lugar la siguiente secuencia. Nota: los números a continuación corresponden a los números en el diagrama de flujo.
1.
Transmite un carácter Ctrl-G (decimal 7) hacia el puerto de la impresora RS-232. Interroga al puerto RS-232 durante al menos un segundo y si se recibe un Ctrl-G, se supone que un ordenador externo está conectado al puerto y que toda la comunicación durante la secuencia de encendido será redirigida desde el teclado al puerto RS-232. Si no se recibe Ctrl-G, la secuencia de encendido continúa normalmente.
2.
Comprobar si la tecla MORE esta pulsada. Si es así, ir directamente al diagnóstico de hardware sólo para servicio.
3.
Las siguientes tres pruebas son comprobaciones audio/visuales y no pueden anunciar un error: 1) el zumbador suena 2) los LED del teclado de caliente, refrigeración y calentamiento están parpadeando 3) cada píxel de la pantalla está iluminado. Se muestran las pantallas de copyright e identificación del instrumento mientras se ejecutan los diagnósticos de encendido.
4.
Si tiene lugar algún error en uno de los diagnósticos del encendido, se muestra el nombre del componente que falló y el teclado se bloquea excepto para el código "MORE 999" lo que dará acceso a los diagnósticos de hardware sólo para servicio.
5.
Comprobar el canal cero del dispositivo PPI-B para ver si el bit de prueba automatizada está en bajo. Si es así, ejecutar la prueba de la UART. Si se pasa la prueba, hacer sonar el avisador acústico continuamente.
6.
Arrancar el sistema operativo CRETIN lo que su vez atracara cada tarea por nivel de prioridad.
7.
Comprobar una marca en la RAM alimentada por batería para ver si el instrumento ha sido calibrado. Si no, mostrar un mensaje de error y bloquear el teclado excepto para el código "MORE 999" lo que dará acceso a los diagnósticos de hardware sólo para servicio.
8.
Ejecutar una prueba que mide la tensión y frecuencia de línea y ver si ambos valores se ajustan al conector de configuración seleccionado mientras se calibraba el instrumento. Si no, mostrar un mensaje de error y bloquear el teclado excepto para el código "MORE 999" lo que dará acceso a los diagnósticos de hardware sólo para servicio.
9.
Realizar la prueba de impulso al calentador como se describe en la sección de instalación. Si los calentadores están incorrectamente cableados, mostrar un mensaje de error y bloquear el teclado excepto para el código "MORE 999" lo que dará acceso a los diagnósticos de hardware sólo para servicio.
10.
Comprobar una marca en la RAM alimentada por batería para ver si el instrumento ha sido instalado. Si no, mostrar un mensaje de error y bloquear el teclado excepto para el código "MORE 999" lo que dará acceso a los diagnósticos de hardware sólo para servicio.
11.
Si no se está en modo remoto, comprobar una marca en la RAM alimentada por batería para ver si hubo un fallo de alimentación mientras el instrumento estaba en ejecución. Si es así, arrancar una estabilización a 4ºC y mostrar la cantidad de tiempo en que la alimentación estuvo desconectada. Preguntar al usuario si desea ver el archivo histórico el cual le dirá exactamente cómo de avanzado se estaba en la ejecución cuando se perdió la alimentación. Si selecciona sí, ir directamente a los diagnósticos de usuario.
12.
Hacer sonar el avisador acústico y borrar la marca de modo remoto de forma que toda la comunicación vuelve a ser ahora a través del teclado.
13.
Comprobar una marca en la RAM alimentada por batería para ver si el fabricante desea que el programa de pruebas arranque automáticamente. Si es así, arrancar la ejecución del programa y reponer el instrumento después de que se ejecute.
14.
Mostrar la pantalla de interfase de usuario de nivel superior.
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Refiriéndonos a la figura 50, se muestra una vista de la sección de un tubo de reacción de mayor volumen, paredes delgadas comercializado bajo la marca registrada MAXIAMP. Este tubo es útil para reacciones PCR en las que es necesario añadir reactivos u otros materiales a la mezcla de reacción lo cual llevará el volumen total a ser mayor que 200 microlitros. Este tubo mayor se muestra en la figura 50 realizado con polipropileno Himont PD701 o polipropileno Valtec HH-444 y tiene una delegada pared en contacto con el bloque de muestras. Cualquiera que sea el material seleccionado debería ser compatible con el ADN y otros componentes de la mezcla de reacción PCR de forma que no impida el proceso de la reacción PCR como por ejemplo teniendo el ADN objetivo adherido a las paredes y no replicándose. El vidrio en general no es una buena elección porque se ha conocido que el ADN se pega a las paredes de los tubos de vidrio.
La dimensión A de la figura 50 es típicamente 0,3 \pm 0,025 mm y el ángulo de la pared en relación con el eje longitudinal del tubo es típicamente 17º. La ventaja de un ángulo de pared de 17º es que mientras que una fuerza hacia abajo produce un buen contacto térmico con el bloque de muestras, los tubos no se atascan en los pocillos de muestra. La ventaja de las paredes delgadas es que minimizan el retraso entre cambios en la temperatura del bloque de muestras y los correspondientes cambios en la temperatura de la mezcla de reacción. Esto significa que si el usuario desea que una mezcla de reacción permanezca con un margen de 1ºC a 94ºC durante 5 segundos en el segmento de desnaturalización, y programa estos parámetros, él o ella obtiene la desnaturalización en 5 segundos con menor retardo de tiempo que con tubos convencionales de paredes más gruesas. Esta característica del producto de ser capaz de programar un corto intervalo de estabilización tal como una estabilización de desnaturalización de 5 segundos y obtener una estabilización a la temperatura programada por el tiempo exacto programado se posibilita por el uso de una temperatura de la muestra calculada para controlar el temporizador. En el sistema aquí descrito, el temporizador que cronometra una incubación o intervalo de estabilización no se arranca hasta que la temperatura de la muestra calculada alcanza la temperatura de estabilización programada.
Adicionalmente, con los tubos de muestra de paredes delgadas, para que la muestra llegue dentro de 1ºC de la temperatura objetivo sólo se requiere la mitad o dos tercios del tiempo en comparación con los tubos de micro-centrifugado de paredes gruesas de técnicas anteriores y esto es verdad tanto para el tubo MAXIAMP^{TM} alto mostrado en la figura 50 como con los tubos MCROAMP más pequeños de paredes delgadas mostrados en la figura 15.
El espesor de pared tanto de los tubos MAXIAMP^{TM} como de los MICROAMP^{TM} es controlada estrechamente en el proceso de fabricación para ser tan delgada como sea posible consistentemente con la adecuada resistencia estructural. Típicamente, para polipropileno, ésta estará en algún punto entre 0,23 a 0,3 mm. Si se usan materiales nuevos, más exóticos que sean más resistentes que el polipropileno para obtener la ventaja de acelerar la reacción PCR, el espesor de pared puede ser menor en tanto se mantenga la resistencia adecuada para soportar la fuerza hacia abajo que asegura un buen contacto térmico, y otros esfuerzos del uso normal. Con una altura (dimensión B en la figura 50) de 28,45 mm y una dimensión C de 19,8 mm y un espesor de pared de la sección superior (dimensión de D) de 10 mm, la constante de tiempo del tubo MAXIAMP es aproximadamente 14 segundos aunque esto no ha sido medido con precisión en el momento de escribir esto. La constante de tiempo del tubo MICROAMP para el tubo más corto mostrado en la figura 15 es típicamente de 9,5 segundos aproximadamente con un espesor de pared del tubo en la sección cónica de 0,23 mm más o menos 0,025 mm.
La figura 51 muestra los resultados del uso de un tubo MICROAMP de paredes más delgadas. Se obtendrá una aceleración similar alcanzando las temperaturas objetivo con el uso de un tubo MAXIAMP de paredes delgadas.
Refiriéndonos a la figura 51, se muestra un gráfico de los tiempos relativos para la temperatura de la muestra calculada en un tubo MICROAMP versus el tiempo para un tubo de técnicas anteriores para alcanzar una temperatura dentro de 1ºC de la temperatura de desnaturalización objetivo de 94ºC desde una temperatura inicial de 72ºC. En la figura 51, estaba presente en cada tubo una muestra de 100 microlitros. La curva con los puntos de datos marcados por cajas abiertas es la respuesta de la temperatura de la muestra calculada para un tubo MICROAMP con un tiempo de respuesta de 9,5 segundos y un espesor de pared de 0,23 mm. La curva con puntos de datos marcados por X representa la temperatura de la muestra calculada para una muestra de 100 microlitros en un tubo de micro-centrifugado de paredes gruesas, de una técnica anterior con un espesor de pared de 0,76 mm. Este gráfico muestra que el tubo de muestras de paredes delgadas MICROAMP alcanza una temperatura dentro de 1ºC de los 94ºC de temperatura de estabilización objetivo antes de aproximadamente 36 segundos mientras que los tubos de técnicas anteriores necesitan alrededor de 73 segundos. Esto es importante porque en instrumentos que no arrancan sus temporizadores hasta que se ha alcanzado básicamente la temperatura de estabilización, los tubos de técnicas anteriores pueden aumentar considerablemente el tiempo de procesado total especialmente cuando lo consideramos a la luz del hecho de que cada ciclo PCR tendrá al menos dos rampas y estabilizaciones y hay generalmente muchos más ciclos realizados. Duplicando el tiempo de rampa para cada rampa con el uso de tubos de técnicas anteriores puede aumentarse por tanto drásticamente el tiempo de procesado. En sistemas que comienzan sus tiempos basándose en la temperatura del bloque/baño/horno sin tener en consideración la temperatura de la muestra real, estos largos retardos entre los cambios en la temperatura del bloque/baño/horno y los correspondientes cambios en la temperatura de la mezcla de muestra pueden tener serias consecuencias negativas. El problema es que el largo retardo puede acortar el tiempo en que la mezcla de reacción está realmente a la temperatura programada para una estabilización. En estabilizaciones muy cortas como son comunes en los últimos procesos PCR, puede que la mezcla de reacción nunca alcance realmente la temperatura de estabilización programada antes de que el sistema de calentamiento/refrigeración comience a intentar cambiar la temperatura de la mezcla de reacción.
La figura 50 muestra una tapa 650 de polipropileno conectada al tubo de muestra MAXIAMP por la red de plástico 652. El diámetro exterior E de la tapa y el diámetro interior F de la sección superior del tubo están dimensionado los para un ajuste de entre 0,05 y 0,13 mm. La superficie interior 654 del tubo debería estar libre de marcas, hendiduras y rasguños de forma que pueda formarse un sellado con la tapa para gases.
La figura 52 muestra una vista en planta del tubo 651, la tapa 650 y la red 652. Un reborde 656 impide que la tapa sea empujada demasiado profundamente en el tubo y permite una proyección suficiente de la tapa por encima del borde superior del tubo de muestras, para hacer contacto con la placa de presión calentada. Esto también permite una deformación de la tapa suficiente de forma que pueda ser aplicada la fuerza aceptable mínima F de la figura 15 por deformación de la tapa.
En la realización preferida, el tubo y la tapa se hacen de polipropileno Himont PD701 que es válido para autoclaves a temperaturas de hasta 126ºC durante tiempos de hasta 15 minutos. Esto permite que los tubos desechables sean esterilizados antes de su uso. Debido a que las tapas se deforman permanentemente al usarse en máquinas con placas de presión calentadas, los tubos se diseñan para ser usados una vez solamente.
Las tapas para los tubos MICROAMP están disponibles en tiras conectadas de 8 ó 12 tapas con cada tapa numerada o como tapas individuales. Pueden usarse simples filas de tapas y las filas pueden acortarse fácilmente hasta tan pocas como se desee o pueden cortarse tapas individuales de la tira. Las tapas para los tubos MAXIAMP están o bien pegadas como se muestra en la figura 50, o son tapas individuales separadas.
El máximo volumen para adicción de reactivos pos-PCR para permitir la mezcla en un tubo MICROAMP es de 200 microlitros y es de hasta 500 microlitros para el tubo MAXIAMP. Los límites de temperatura son -70ºC a
126ºC.
La respuesta en el tiempo depende del volumen de la muestra. La respuesta se mide como el tiempo para que la muestra llegar al 37% de la nueva temperatura cuando la temperatura del bloque cambia repentinamente. El tiempo de respuesta típico para un rellenado de 50 microlitros es de 7,0 segundos y para un rellenado de 20 microlitros de 5,0 segundos.
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APÉNDICE A
Interfase de usuario
El objetivo de la interfase de usuario GeneAmp PCR System 9600 es proporcionar una forma simple de desarrollar y ejecutar programas que realicen la PCR.
Hay 3 tipos de programas disponibles. El programa HOLD (mantener) consiste en un punto de consigna único mantenido durante una cantidad de tiempo fija o mantenido por una infinita cantidad de tiempo y finalizado por la tecla STOP. El programa CYCLE (ciclar) añade las características de rampas con tiempo medido y pausas programables. Este programa permite hasta nueve puntos de consigna y hasta 99 ciclos. El programa AUTO permite al usuario incrementar o disminuir el tiempo y/o la temperatura del punto de consigna una cantidad fija cada ciclo. Este programa también permite hasta nueve puntos de consigna y hasta 99 ciclos. Un programa METHOD (método) proporciona una forma para enlazar hasta 17 programas "hold", "cycle" o "auto" juntos.
Pueden almacenarse un total de 150 programas numerados del 1 al 150. Los programas pueden crearse, almacenarse, protegerse, imprimirse o borrarse. Se puede ver o imprimir un directorio de los programas almacenados.
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(Esquema pasa a página siguiente)
1 
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RUN (ejecutar)
{}\hskip0.15cm Arranca la ejecución de un programa desde la pantalla del programa o reanuda una pausa programada {}\hskip0.15cm o del teclado.
MORE (más)
Cambia entre las pantallas de ejecución y también accede a las funciones sólo para servicio (si se sigue del código 999).
BACK (atrás)
Se mueve al campo anterior dentro de la misma pantalla. Si está posicionado actualmente en el campo primero, se mueve a la pantalla anterior.
STEP (adelante)
{}\hskip0.15cm Se mueve hacia abajo hasta el primer campo de la siguiente pantalla.
PAUSE (pausa)
Arranca una cuenta atrás pausada por interrupciones manuales.
OPTION (opción)
O bien mueve el cursor izquierda-a-derecha a través de los elementos del menú (rotando sobre la opción más a la izquierda) o bien conmuta una respuesta SÍ/NO.
STOP (detener)
{}\hskip0.15cm Aborta un programa en ejecución o lleva al usuario un nivel hacia arriba en la interfase de usuario.
CE
Borra entradas numéricas no válidas.
ENTER (introducir)
Acepta la entrada numérica actual, acepta un elemento de menú, acepta una respuesta SÍ/NO o pasa al siguiente campo de una pantalla. Si la entrada numérica es la última de una pantalla, ENTER pasa a la siguiente pantalla.
2
3 
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Los programas se crean seleccionando un tipo de programa en la pantalla CREATE (crear). El usuario es llevado directamente a la primera pantalla de edición del programa.
Los programas almacenados se recuperan introduciendo un número del 1 al 150 desde las pantallas de EJECUCIÓN, EDICIÓN, o programa. Al introducir un número de programa válido en la pantalla de EJECUCIÓN automáticamente comienza la ejecución. Al introducir un número de programa válido en la pantalla de EDICIÓN o de programa se lleva al usuario a la primera pantalla de la edición del programa.
Los programas se editan pulsando la tecla STEP (adelante) (se mueve hacia abajo una pantalla), BACK (atrás) (se mueve al campo anterior) o ENTER (introducir) (se mueve al campo siguiente).
Los programas se ejecutan seleccionando RUN en el menú RUN-STORE-PRINT-HOME o pulsando la tecla RUN del teclado. El usuario debe introducir primero los dos parámetros requeridos para cada ejecución.
4 
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Aceptar HOME (inicio) en el menú RUN-STORE-PRINT-HOME sin guardar un programa muestra la pantalla:
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5 
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5000
6
7
8
9
10
11 
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Programa MÉTODO - Pantallas de ejecución
Las pantallas de EJECUCIÓN, MÁS y PAUSA serán aquellas del programa actualmente en ejecución. Se ofrecen dos pantallas MORE (MÁS) adicionales cuando el programa en ejecución está enlazado en un método.
1110
12 
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Almacenamiento de un programa
Cuando se selecciona STORE del menú RUN-STORE-PRINT-HOME, la rutina para almacenar un programa es la misma para un archivo que para un método. La protección de un programa asegura al usuario que el programa no será sobrescrito o borrado sin conocer el número de usuario. Otros usuarios podrán ver, editar, ejecutar o enlazar el archivo protegido en sus métodos pero no podrán alterar la versión almacenada.
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UTILIDADES - DIAGNÓSTICOS DEL USUARIO
Mientras ejecuta cualquier prueba de diagnóstico, la tecla STOP siempre devuelve al usuario a la pantalla de diagnóstico de nivel superior que incrementa automáticamente el número de prueba y el nombre de la siguiente prueba. Esto facilita pasar manualmente a través de los diagnósticos disponibles.
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20 
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Los dos tipos de registros son 1) registros de estado que dan información acerca del programa y 2) registros de datos que dan información acerca de cada segmento de mantenimiento y rampa en un programa. Un programa de mantenimiento se trata como un segmento de mantenimiento y el registro de datos se almacenará cuando acabe el archivo.
Dado que podría haber cientos de entradas (50 ciclos x 6 puntos de consigna = 350 entradas), se requiere un movimiento rápido, bi-direccional a través del archivo. Nótese que la mayoría de los programas PCR serán de 3 ó 6 puntos de consigna y 40 ciclos o menos. Las entradas se revisarán normalmente en orden inverso, de ahí que el primer registro visto será el último registro escrito.
Si el usuario ha elegido un tipo de registro a visualizar, STEP o BACK le llevarán hacia abajo y arriba en el almacenamiento de entrada en entrada del tipo elegido. Precediendo STEP o BACK con un número, la segunda línea se reemplaza con "Skip #xxx entries" ("Saltar #xxx entradas"). El usuario introduce un número y pulsa ENTER para aceptar el valor y ese número de entradas es omitido yendo hacia delante (STEP) o hacia atrás (BACK).
Precediendo STEP o BACK con la tecla RUN, el usuario puede moverse rápidamente al registro # mayor (el registro más nuevo) o al registro # 1 (el registro más viejo) del tipo elegido.
STOP finaliza el modo de revisión y muestra la cabecera del archivo.
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Los campos de ciclo y de punto de consigna se omitirán en un programa de mantenimiento.
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Para el programa de mantenimiento, se omitirán los campos de ciclo y punto de consigna.
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Impresión del archivo histórico
El acceso a las rutinas de impresión del archivo histórico se realiza a través del menú de cabecera del archivo histórico. La tecla OPTION mueve cíclicamente el cursor a través de las opciones:
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501 
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Pulsando la tecla ENTER cuando el cursor está posicionado bajo PRNT muestra la pantalla de impresión:
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ALL imprime todos los registros en el archivo
STAT imprime sólo los registros de estado
ERRORS imprime sólo los registros con mensajes de error
Cuando se selecciona una de las opciones de impresión, se muestra la siguiente pantalla:
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El primer (más reciente) número de programa será el programa por omisión. El usuario puede cambiar el número de programa desde el cual comenzar a imprimir. Mientras se imprime, se muestra la siguiente pantalla:
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Al final de la impresión, se muestra de nuevo el menú de impresión del histórico.
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504 
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba del calentador calcula el ritmo de calentamiento del bloque de muestras cuando su temperatura se eleva desde 35ºC a 65ºC. Mientras se fuerza la temperatura del bloque a 35ºC se muestra la siguiente pantalla.
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505 
\newpage
Cuando la temperatura se estabiliza, todos los calentadores son conectados a plena potencia. En la pantalla ahora se lee "going to 65C" (yendo a 65ºC) y la temperatura del bloque se supervisa durante 20 segundos después de que pase los 50ºC. Tras 20 segundos, se muestra un mensaje de "pasó" o "fallo".
25
La prueba del calentador calcula el ritmo de refrigeración del bloque de muestras cuando su temperatura desciende desde 35ºC a 15ºC. Mientras se fuerza la temperatura del bloque a 35ºC se muestra la siguiente pantalla.
506
Cuando la temperatura se estabiliza, la refrigeración está conectada. En la pantalla ahora se lee "going to 15C" (yendo a 15ºC) y la temperatura del bloque se supervisa durante 20 segundos después de que pase los 25ºC. Tras 20 segundos, se muestra un mensaje de "pasó" o "fallo".
507

Claims (26)

1. Un sistema para controlar un aparato de realización automatizada de las reacciones en cadena de la polimerasa en al menos un tubo de muestra conteniendo un volumen conocido de una mezcla de muestra líquida, comprendiendo dicho sistema:
(a) un bloque de muestras (12) teniendo al menos un pocillo de muestra para el dicho al menos un tubo de muestra (10),
(b) un aparato de cálculo (20),
(c) medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) controlados por dicho aparato de cálculo (20) para cambiar la temperatura de dicho bloque de muestras (12), y
(d) un detector de la temperatura del bloque (21) térmicamente acoplado al dicho bloque de muestras (12), proporcionando dicho detector a dicho aparato de cálculo (20) la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo,
incluyendo dicho aparato de cálculo (20) medios para determinar la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida, estando dispuestos dichos medios para la determinación de la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida para utilizar una constante térmica del sistema (\tau) para calcular la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida como una función de la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo.
2. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho sistema comprende medios para permitir a un usuario introducir dicha constante de tiempo térmica del sistema.
3. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho sistema comprende un dispositivo de entrada para recibir de un usuario un volumen de muestra y un tipo de tubos de muestra y dicho aparato de cálculo comprende medios para determinar una primera constante de tiempo térmica de dichas entradas de volumen de muestra y tipo de tubo de muestra.
4. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho aparato de cálculo comprende medios para almacenar una constante de tiempo del detector de temperatura.
5. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho aparato de cálculo comprende medios dispuestos para calcular dicha constante de tiempo térmica del sistema a partir de dicha primera constante de tiempo térmica y dicha constante de tiempo del detector de temperatura.
6. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos medios dispuestos para calcular dicha constante de tiempo térmica del sistema están dispuestos para restar dicha constante de tiempo del detector de temperatura de dicha primera constante de tiempo térmica.
7. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho sistema está dispuesto para visualizar la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida.
8. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aparato de cálculo (20) determina dicha temperatura de la muestra en un intervalo de muestra actual en un momento actual n como:
201
donde T_{muest_{n}} es igual a la temperatura de la muestra en el momento n, T_{muest_{n-1}} es igual a la temperatura de la muestra en un momento inmediatamente precedente del intervalo de muestreo habiendo sucedido en el momento n-1, T_{B_{n}} es igual a la temperatura del bloque de muestras en el momento n, t_{intervalo} es un tiempo, en segundos '' entre intervalos de muestra, y tau es dicha constante de tiempo térmica del sistema.
9. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se proporciona el dicho o un dispositivo de entrada para recibir los puntos de consigna definidos por el usuario, opcionalmente temperaturas de muestra objetivo, definiendo un perfil de tiempo de mantenimiento/temperatura, y en el que dicho aparato de cálculo (20) incluye medios para controlar dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario y dicha temperatura de la muestra.
10. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho aparato de cálculo (20) adicionalmente comprende medios para permitir a los usuarios llamar a dichos perfiles de ejecución.
11. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho aparato de cálculo (20) adicionalmente comprende medios para enlazar múltiples perfiles en cualquier orden para formar un protocolo, definiendo dicho protocolo una secuencia de dichos perfiles a ser ejecutados, en el que llamar a dicha secuencia de perfiles a ser ejecutados constituye la realización de dicho protocolo como un protocolo de ejecución.
12. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho aparato de cálculo (20) adicionalmente comprende medios para enlazar un único archivo una multitud de veces en un protocolo simple.
13. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho aparato de cálculo (20) adicionalmente comprende medios para almacenar una multitud de protocolos.
14. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho aparato de cálculo (20) adicionalmente comprende medios para incluir cualquiera de dichos perfiles en una multitud de dichos protocolos.
15. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho dispositivo de entrada comprende adicionalmente medios para recibir una cuenta de ciclos definida por el usuario para cada uno de dichos perfiles, constituyendo dicha cuenta de ciclos el número de veces que dicho perfil será ejecutado cuando sea llamado.
16. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho sistema adicionalmente incluye medios para incrementar y/o disminuir automáticamente el tiempo de mantenimiento en cualquiera o en todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo en dicha cuenta de ciclos.
17. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la activación de dichos medios para aumentar automáticamente el tiempo de mantenimiento de cualquiera o de todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo es seleccionable como una opción en el nivel del usuario a través de dicho dispositivo de entrada.
18. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dichos aumentos automáticos en el tiempo de mantenimiento de cualquiera o de todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo son por medio de un primer y/o segundo valor definidos por el usuario introducidos por medio de dicho dispositivo de entrada y pueden ser geométricamente o linealmente basados en dichos primero y/o segundo valores definidos por el usuario.
19. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho sistema adicionalmente incluye medios para incrementar y/o disminuir automáticamente el punto de consigna de temperatura en cualquiera o en todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo en dicha cuenta de ciclos.
20. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la activación de dichos medios para incrementar y/o disminuir automáticamente el punto de consigna de temperatura en cualquiera o en todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo es seleccionable como una opción en el nivel del usuario a través de dicho dispositivo de entrada.
21. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dichos aumentos automáticos y/o disminuciones en el punto de consigna de temperatura de cualquiera o de todos los puntos de consigna de ciclo a ciclo son por medio de un tercer y/o cuarto valor definidos por el usuario introducidos por medio de dicho dispositivo de entrada y pueden ser geométricamente o linealmente basados en dichos tercer y/o cuarto valores definidos por el usuario.
22. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21, en el que el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dichos puntos de consigna definidos por el usuario constituye la realización de dicho perfil como un perfil de ejecución, en el que dicho sistema adicionalmente comprende medios para una opción de pausa programada para detener automáticamente una ejecución por un periodo de tiempo definido por el usuario.
23. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dichos medios para una opción de pausa comprenden medios para detener dicha ejecución después de que cualquiera o todos los puntos de consigna están completos, durante cualquiera o todos los ciclos y tras cualquiera o todos los perfiles en un protocolo en ejecución.
24. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha constante de tiempo térmica del sistema está entre 3,5 y 12,5 segundos.
25. Un método para el control por ordenador de la realización automatizada de las reacciones en cadena de la polimerasa en al menos un tubo de muestra (10) conteniendo un volumen conocido de una mezcla de muestra líquida por medio de un realizador de ciclos térmicos controlado por ordenador incluyendo un aparato de cálculo (20), un bloque de muestras (12) teniendo al menos un pocillo de muestra para el dicho al menos un tubo de muestra (10), un detector de la temperatura del bloque (21) térmicamente acoplado al dicho bloque de muestras (12), y medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) controlados por dicho aparato de cálculo (20) para cambiar la temperatura de dicho bloque de muestras, comprendiendo las etapas de dicho aparato de cálculo (20):
(a) lectura de la temperatura del bloque en momentos predeterminados,
(b) determinar la temperatura de dicha mezcla de muestra líquida como una función de la temperatura de dicho bloque de muestras (12) a lo largo del tiempo, en el que dicha etapa de determinación comprende la etapa de:
determinar la temperatura de la muestra en el intervalo de muestreo actual en el momento actual n de acuerdo con la fórmula:
202
donde T_{muest_{n}} es igual a la temperatura de la muestra en el momento n, T_{muest_{n-1}} es igual a la temperatura de la muestra en un momento inmediatamente precedente del intervalo de muestreo habiendo sucedido en el momento n-1, T_{B_{n}} es igual a la temperatura del bloque de muestras en el momento n, t_{intervalo} es un tiempo en segundos entre intervalos de muestra, y tau es una constante de tiempo térmica del sistema.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, comprendiendo adicionalmente el control de dichos medios de calentamiento (14, 156) y refrigeración (34, 40) como una función de dicha temperatura de la muestra, y la etapa de controlar dichos medios de calentamiento y refrigeración comprende las etapas de:
(i) determinar una segunda potencia teórica representando la potencia total a aplicar al dicho bloque en un intervalo de muestreo actual en un momento actual n sin tener en cuenta las pérdidas de potencia,
(ii) dividir dicha segunda potencia teórica en potencias teóricas, cada una a ser aplicada a cada una de las zonas de calentamiento de dicho bloque de muestras,
(iii) determinar las pérdidas de potencia por dichas regiones en dicho intervalo de muestra actual, y
(iv) determinar una tercera potencia real para cada una de dichas zonas en dicho intervalo de muestra actual para tener en cuenta las pérdidas de potencia por cada una de dichas zonas, y opcionalmente en el que dicho realizador de ciclos térmicos adicionalmente incluye refrigeración de control constantemente aplicada a dicho bloque de muestras (12), en el que dichos medios de refrigeración controlados por ordenador comprenden medios de refrigeración rápida selectivamente operables para entregar selectivamente un fluido de refrigeración a dicho bloque de muestras (12), y en el que la etapa de controlar dichos medios de refrigeración rápida selectivamente operables incluyen las etapas de:
(v) determinar que la dirección de la rampa de temperatura de la muestra es descendente,
(vi) determinar la temperatura de dicho fluido de refrigeración,
(vii) determinar como una función de dicha temperatura de la muestra una potencia de refrigeración total a aplicar al dicho bloque en dicho intervalo de muestreo actual sin tener en cuenta las pérdidas de potencia,
(viii) determinar una potencia de refrigeración intermedia restando las pérdidas de potencia al dicho al menos un colector y al ambiente de dicha potencia de refrigeración total,
(ix) determinar un punto de interrupción de la refrigeración como una función de la diferencia entre la temperatura del bloque y la temperatura de dicho fluido de refrigeración en el intervalo de muestra actual, y
(x) operar selectivamente dichos medios de refrigeración rápida como una función de la diferencia entre dicha potencia de refrigeración intermedia en dicho punto de interrupción de la refrigeración.
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