JP2023518032A - 腫瘍誘導性ウイルスｄｎａの選択的検出のための組成物及び方法 - Google Patents

腫瘍誘導性ウイルスｄｎａの選択的検出のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、腫瘍由来ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及び腫瘍由来エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するのに有効であり、特に、腫瘍由来のウイルスＤＮＡを感染性ウイルス粒子由来のウイルスＤＮＡと区別するのに有効である、ロックド核酸、クエンチャー、及び色素で構造的に修飾された、修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの組み合わせの方法及び組成物を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／９９０，４３８号からの優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、がん又は前がん検出の目的のための体液中のウイルス核酸の検出に関する。
ウイルスは、がんの発達を促進することが知られている。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の高リスク株による感染は、子宮頸部、頭部／頸部、肛門、外陰部、又は陰茎のがんに関連する。がん発達に関連するウイルスの他の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ１）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト内因性レトロウイルスＫ型（ＨＥＲＶ－Ｋ）、メルケル細胞ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）が挙げられる。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は瀕死のがん細胞によって放出されるため、これらのウイルス核酸は、対応するがん型を有する患者の血液中で検出可能であり得る。
がん検出の目的のために体液中のウイルス核酸を検出することに大きな関心があるが、この概念に関連する２つの大きな課題がある。第一に、血液、尿、又は唾液中の循環腫瘍由来ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の量は極めて低く、しばしば血液１ｍＬ当たり数分子程度である。第二に、循環中に存在するウイルス核酸は、通常、腫瘍関連ウイルスに由来するものではなく、非腫瘍組織から流出したビリオンに由来する。これは、多くの異なる種類のウイルス由来のＤＮＡ配列が、健康なボランティアの血液中で特定されているという知見によって確立される（Ｍｏｕｓｔａｆａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１７ １３（３）：ｅ１００６２９２）。この知見を考えると、検出されたウイルス配列は患者内の正常な非腫瘍組織に由来し得るため、循環中のウイルス配列の検出は、それだけで、患者がそのウイルスに関連するがんを有するという結論には不十分である。
例えば、血液試料中で検出される任意のウイルス配列は、単にウイルス感染自体に関連し得るにすぎず、宿主における腫瘍負荷とは関係ない。この主要な混乱因子は、循環ウイルスＤＮＡをがん検出のための特異的マーカーとして使用することに重大な課題をもたらす。循環中の検出可能なウイルスＤＮＡを有する個体は、単にウイルスに感染しているだけであり、がん又は前がんを有していない可能性がある。
これに合わせて、ＨＰＶ関連前腫瘍又はがんを有する患者の循環におけるＨＰＶ ＤＮＡを検出するためのＰＣＲベースの方法が報告されているが、これらの方法は、ＨＰＶ＋がんの診断を有しないかなりの割合の患者の血液においてＨＰＶ ＤＮＡも検出する（Ｂｏｄａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ ４３（１１）：５４２８－５４３４、Ｃｏｃｕｚｚａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７ １２（１１）：ｅ０１８８５９２、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．２０１７ ２１３（７）：７５９－７６５、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２００９ ８１（１０）：１７９２－１７９６）。したがって、人の循環におけるＨＰＶウイルスの存在は、正常組織の感染に起因する可能性があるため、その検出は、人がＨＰＶ関連がんを有することを必ずしも示さない。現在利用可能なＰＣＲ検出方法は、腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡと、ウイルスに感染した正常組織由来のＨＰＶ ＤＮＡとを区別することができないため、それらは、ＨＰＶ関連がんの早期検出を可能にするのに十分な特異性を欠く。
例えば、ＨＰＶ検出のためのＰＣＲベースの方法は、ＨＰＶ関連がんを有する患者を検出するために約５４％の感受性しか示さず、これは、更なる評価を必要とする患者を、更なる評価を必要としない患者と区別するのに臨床的に有用であるには不十分である（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２０１８ Ｍａｙ １５、Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．２０１５ ９３（３）：Ｓ７８－Ｓ－７９、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．２０１２ ８２（３）：ｅ３５１－３５８、Ｄａｈｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ １２１（１９）：３４５５－３４６４）。
本開示は、腫瘍由来ウイルス、例えば、ＨＰＶ及びＥＢＶ、ＤＮＡを検出するのに有効であり、特に、腫瘍由来のウイルスＤＮＡを感染性ウイルス粒子由来のウイルスＤＮＡと区別するのに有効である、ロックド核酸、クエンチャー、及び色素で構造的に修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの組み合わせの方法及び組成物を提供する。
本明細書で開示されるＤＮＡ増幅方法及び構造的に修飾されたプライマー／プローブ組成物は、試料における腫瘍由来ウイルスＤＮＡを定量的に検出する。開示される方法及び組成物は、腫瘍由来のウイルスＤＮＡと、非腫瘍源、例えば、感染性ウイルス粒子由来のウイルスＤＮＡとを区別する。特に、対象におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連悪性腫瘍又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）関連悪性腫瘍を検出又は監視する方法及び組成物が本明細書において開示され、方法は、対象からの試料における、特定のサイズ範囲の少なくとも１つの循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡの存在又は不在を検出することを伴う。これらの方法を実施するための組成物及びキットも提供される。
一態様では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を検出するための組成物を提供し、組成物は、ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、ＨＰＶ１８について表１５に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、ＨＰＶ３１について表１６に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセット、ＨＰＶ３３について表１７に示されるような１～１５の番号が付けられたプライマー／プローブセット、ＨＰＶ３５について表１８に示されるような１～１６の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ４５について表１９に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、少なくとも三つ組、例えば、３つの修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む（からなる）か、又は４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含み得、三つ組の第１のプライマー／プローブセットは、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第２のプライマー／プローブセットは、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第３のプライマー／プローブセットは、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、かつ最小のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第１のプライマー／プローブセットに対応し、最大のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第３のプライマー／プローブセットに対応する。
例えば、表、例えば、表１４から３、５、及び７の番号が付けられた３つのプライマー／プローブセットを選択する場合、セット３は、「第１のプライマー／プローブセット」であり、セット５は、「第２のプライマー／プローブセット」であり、７は、「第３のプライマー／プローブセット」である。最小のセット番号は常に第１のセットに対応し、最大のセット番号は常に第３のセットに対応し、したがって、中間の番号は常に第２のセットに対応する。
これらの組成物において、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットは、ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ１８について表１５に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ３１について表１６に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ３３について表１７に示されるような１～１５の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ３５について表１８に示されるような１～１６の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又はＨＰＶ４５について表１９に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）を検出するための組成物を提供し、これには、ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットが含まれ、三つ組の第１のプライマー／プローブセットは、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第２のプライマー／プローブセットは、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第３のプライマー／プローブセットは、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、かつ最小のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第１のプライマー／プローブセットに対応し、最大のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第３のプライマー／プローブセットに対応する。
別の態様では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための組成物を提供し、これには、ＥＢＶについて表２０に示されるような１～２８の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットが含まれ、三つ組の第１のプライマー／プローブセットは、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第２のプライマー／プローブセットは、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、三つ組の第３のプライマー／プローブセットは、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、かつ最小のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第１のプライマー／プローブセットに対応し、最大のセット番号を有する三つ組のプライマー／プローブセットは、第３のプライマー／プローブセットに対応する。
これらの組成物において、三つ組は、２つのプライマー／プローブセットが連続していない３つ（又は４つ以上）のプライマー／プローブセットを含有することができるか、又は三つ組は、３つ（又は４つ以上）の非連続プライマー／プローブセットを含有することができる。
ある特定の実施形態では、プライマー／プローブセットは、ＨＰＶ１６について表１４に示されるように３、５、及び７、若しくは４、７、及び１０、又はＨＰＶ１８について表１５に示されるように４、７、及び１０、又はＨＰＶ３１について表１６に示されるように４、７、及び１０、又はＨＰＶ３３について表１７に示されるように４、７、及び１０、又はＨＰＶ３５について表１８に示されるように４、７、及び１０、又はＨＰＶ４５について表１９に示されるように表４、７、及び１０の番号が付けられている。いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、ＥＰＶについて表２０に示されるように４、５、及び６の番号が付けられている。
様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物は、レポーター色素、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、Ｃｙ５ＴＭ、又はＣｙ５．５などの１つ以上のレポーター部分を更に含むことができる。例えば、表１４の検出プローブ５は、レポーター部分のＨＥＸにコンジュゲートすることができ、表１４の検出プローブ３及び７は、レポーター部分のＦＡＭにコンジュゲートすることができる。別の例では、例えば、表１４の検出プローブ７は、レポーター部分のＦＡＭにコンジュゲートすることができ、表１４の検出プローブ４及び１０は、レポーター部分のＨＥＸにコンジュゲートすることができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１、３、及び５の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又は１、３、及び８の番号が付けられたセット、又は４、６、及び９の番号が付けられたプローブセット、又は１４、１６、及び１８の番号が付けられたセット、又は１、２、及び５の番号が付けられたセット、又は１０、１２、及び１３の番号が付けられたセットを含む。
別の態様では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を検出するための方法を提供し、方法は、表１４、１５、１６、１７、１８、及び１９に列記される、本明細書に記載の組成物のいずれかの修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットのいずれかの三つ組を提供することと、試料からの複数のＨＰＶ ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片の０又は１分子のみが各液滴中に存在する濃度で液滴に分画することと、三つ組のプライマー／プローブセットで各液滴中のＨＰＶ ＤＮＡを増幅して、増幅産物シグナルを生成することと、任意の増幅産物シグナルを各液滴において検出することと、を含み、第１又は第３の増幅産物ではなく、第２の増幅産物の液滴内での検出は、液滴に分画されたＨＰＶ ＤＮＡ断片が腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡ断片であることを示す。
これらの方法において、三つ組は表１４からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ１６を検出するか、又は三つ組は表１５からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ１８を検出するか、又は三つ組は表１６からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ３１を検出するか、又は三つ組は表１７からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ３３を検出するか、又は三つ組は表１８からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ３５を検出するか、又は三つ組は表１９からの３つのプライマー／プローブセットを含有し得、方法は腫瘍由来ＨＰＶ４５を検出する。
別の態様では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）を検出するための方法を提供し、方法は、表１４に列記される、本明細書に記載の組成物のいずれかの修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットの三つ組を提供することと、試料からの複数のＨＰＶ ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片の０又は１分子のみが各液滴中に存在する濃度で液滴に分画することと、三つ組のプライマー／プローブセットで各液滴中のＨＰＶ ＤＮＡを増幅して、増幅産物シグナルを生成することと、任意の増幅産物シグナルを各液滴において検出することと、を含み、第１又は第３の増幅産物ではなく、第２の増幅産物の液滴内での検出は、液滴に分画されたＨＰＶ ＤＮＡ断片が腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡ断片であることを示す。
別の態様では、本開示は、対象からの試料において腫瘍由来エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための方法を提供し、方法は、表２０に列記される、本明細書に記載の組成物のいずれかの修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットのいずれかの三つ組を提供することと、試料からの複数のＥＢＶ ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片の０又は１分子のみが各液滴中に存在する濃度で液滴に分画することと、三つ組のプライマー／プローブセットで各液滴中のＥＢＶ ＤＮＡを増幅して、増幅産物シグナルを生成することと、任意の増幅産物シグナルを各液滴において検出することと、を含み、第１又は第３の増幅産物ではなく、第２の増幅産物の液滴内での検出は、液滴に分画されたＥＢＶ ＤＮＡ断片が腫瘍由来ＥＢＶ ＤＮＡ断片であることを示す。
本明細書に記載の方法の全てにおいて、ＤＮＡ断片を乳化によって微小滴に分画することができ、かつ／又はＰＣＲベースの方法を使用してＤＮＡを増幅することができる。
本明細書に記載の方法の全てにおいて、試料は、血液、唾液、うがい液、又は尿試料、例えば、血液試料であり得る。
他の態様では、本開示は、それぞれ、表１４、１５、１６、１７、１８、又は１９からのプライマー／プローブセットの任意の三つ組を含むプライマー及びプローブのオリゴヌクレオチドの組成物を利用して、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を検出し（２つのプライマー及び１つのプローブからなる第１のプライマー／プローブセットは、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、２つのプライマー及び１つのプローブからなる第２のプライマー／プローブセットは、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、２つのプライマー及び１つのプローブからなる第３のプライマー／プローブセットは、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されている）、対象からの試料からのＤＮＡ断片を、０又は１のＤＮＡ断片のみが各液滴中に存在する濃度で液滴に分画し、各液滴中のＤＮＡを一連のプライマー／プローブセットで増幅して、増幅産物シグナルを生成し、各液滴において増幅産物シグナルの数を検出する（第１又は第３の増幅産物ではなく、第２の増幅産物の検出は、対象が腫瘍由来ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を有することを示す）ための方法を提供する。
また、表２０からのプライマー／プローブセットの非連続的な三つ組からなる組成物を利用して、対象からの試料において腫瘍由来ＥＢＶを検出し（２つのプライマー及び１つのプローブからなる第１のプライマー／プローブセットは、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、２つのプライマー及び１つのプローブからなる第２のプライマー／プローブセットは、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、２つのプライマー及び１つのプローブからなる第３のプライマー／プローブセットは、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されている）、対象からの試料からのＤＮＡ断片を、０又は１のＤＮＡ断片のみが各液滴中に存在する濃度で液滴に分画し、各液滴中のＤＮＡを一連のプライマー／プローブセットで増幅して、増幅産物シグナルを生成し、各液滴において増幅産物シグナルの数を検出する（第１又は第３の増幅産物ではなく、第２の増幅産物の検出は、対象が腫瘍由来ＥＢＶを有することを示す）ための方法を開示する。
デジタルＰＣＲのための液滴へのＤＮＡ断片化の方法が知られており、乳化による微小滴への分画が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、微小滴への乳化を行う前に、サイズに基づいて分画される。これは、例えば、サイズによる定量化のために、一連のＤＮＡ断片を単離するために行われ得る。
ＰＣＲ法又は非ＰＣＲ法などの任意の既知の方法を使用して、ＤＮＡ断片を増幅することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、ＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍と診断されたことがないか、又はそれに罹患したことがない。他の実施形態では、対象は、以前に、ＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療を受けたことがある。
開示される方法を使用して、治療を監視することもできる。したがって、対象におけるＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連のがん又は悪性腫瘍を監視する方法も本明細書で開示され、これは、開示された方法を使用して、ＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療を受けている対象の治療中の２つ以上の時点で収集された血液試料において腫瘍由来の無細胞ＨＰＶ又はＥＢＶウイルスＤＮＡを定量化することを伴う。これらの実施形態のうちのいくつかでは、後の時点で収集された試料における腫瘍由来の無細胞ＨＰＶ又はＥＢＶウイルスＤＮＡの存在は、ＨＰＶ関連がん又は悪性腫瘍の治療を受けている対象が、増加したＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の再発の可能性を有することを示し得る。同様に、これらの実施形態のうちのいくつかでは、後の時点で収集された試料における当該腫瘍由来の無細胞ＨＰＶ又はＥＢＶウイルスＤＮＡの迅速なクリアランス又は不在は、ＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療を受けている対象が、減少したＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の再発の可能性を有することを示し得る。これらの場合、方法はまた、対象が、治療の過程中の後の時点で収集された試料においてＨＰＶ又はＥＢＶの腫瘍由来の無細胞ＤＮＡ配列の急速なクリアランス又は不在を示す場合、放射線療法及び／又は化学療法を低減して対象を治療することを更に伴い得る。
開示される方法の態様によれば、開示される方法を用いて血液中の腫瘍由来ウイルス核酸を長期的に分析することは、悪性腫瘍に関連するいかなる症状も示さない個体、又はそのような症状がまだ臨床医によって特定されていない個体におけるウイルス陽性がんの早期検出のために利用され得る。本明細書で示されるように、開示される方法は、ＨＰＶ＋又はＥＢＶ＋がんを有する患者に適用可能な循環腫瘍由来ウイルス核酸を検出するための、以前は達成できなかったレベルの感受性及び特異性を可能にする。
いくつかの実施形態では、開示される方法は、単一の時点で、又は長期的に経時的に、対象から収集された血液試料において関連するウイルスの少なくとも１つの循環腫瘍核酸マーカーの存在又は不在を検出することを含む、ウイルス関連がんの初期診断又は再発の可能性を決定するために適用され得る。
いくつかの実施形態では、開示される方法は、中咽頭扁平上皮がん（ＯＰＳＣＣ）又は他のウイルス関連がんの治療を選択するために適用され得、これには、治療を開始する前に、及び／又は治療中の様々な時点で、ＯＰＳＣＣと診断されたか、又はＯＰＳＣＣの治療を受けている対象から収集された試料において少なくとも１つの循環腫瘍由来ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡの存在又は不在を検出することが含まれ、後の時点で収集された試料における当該循環腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡの存在及び／又は量は、ＯＰＳＣＣの治療を受けている対象が、増加したＯＰＳＣＣ再発の可能性を有することを示す。代替的に、後の時点で収集された試料における当該循環腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡの急速なクリアランス又は不在は、ＯＰＳＣＣの治療を受けている対象が、減少したＯＰＳＣＣの再発の可能性を有することを示し、対象が、がん療法を開始した後の特定の時点で、ＨＰＶの当該循環腫瘍核酸マーカーの急速なクリアランス又は不在を示す場合、放射線療法及び／又は化学療法を低減して対象を治療する。
また、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がん又は悪性腫瘍の治療レジメンを決定する方法が本明細書において開示され、これには、ＨＰＶ関連がんと診断された、又は当該ＨＰＶ関連悪性腫瘍の治療を受けている対象からの治療中の異なる時点で収集された試料において少なくとも１つの循環腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡの存在若しくは不在を検出することが含まれ、治療中の後の時点で収集された試料における当該循環腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡの不在又は急速なクリアランスが、対象が放射線療法及び／又は化学療法を低減して治療され得ることを示す。
また、対象においてＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍を検出、監視、及び／又は治療する方法が、本明細書において開示され、方法は、治療の経過中の様々な時点で対象から収集された試料において少なくとも１つの循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡの存在又は不在を検出することを含み、治療の経過中の後の時点で収集された試料における循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡの存在は、対象がＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連悪性腫瘍を有するか、又は増加したＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連悪性腫瘍の再発の可能性を示し、治療の経過中の後の時点で収集された試料における循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡの急速なクリアランス又は不在は、対象がＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍を有さないか、又は減少したＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連悪性腫瘍の可能性を有することを示す。
対象のＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍を監視及び／又は治療するための方法も本明細書において開示され、これには、ＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連悪性腫瘍と診断された、又はＨＰＶ関連若しくはＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療を受けている対象からの様々な時点で収集された試料における循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡのレベルを検出することと、対象の循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡプロファイルを決定することと、循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡプロファイルに従ってＨＰＶ関連又はＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療レジメンを調整することと、が含まれ、好ましい循環腫瘍由来ＨＰＶ又はＥＢＶ ＤＮＡプロファイルを有する対象は、強度低下（ｄｅ－ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ）治療レジメンで治療される。
本明細書に記載される対象において悪性腫瘍を検出、監視、及び／又は治療するための、本明細書に記載される構成要素及び組成物、並びにそれらの使用説明書を含むキットも本明細書において開示される。例えば、キットは、表１４～２０に記載のプライマー／プローブセット、及びその使用説明書を含み得る。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に明示されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
図１Ａ）腫瘍ウイルスＤＮＡを検出するための二重断片ＨＰＶ１６アッセイ。ＨＰＶ１６ゲノムの２つの異なる断片の同時検出のためのデジタルＰＣＲ蛍光検出プロットを示す。単一陽性対照、二重断片陽性対照、無傷のＨＰＶゲノム対照、及び２人の患者の血漿ＤＮＡ試料の例を示す。方法に記載されるように、単一及び二重陽性液滴を定量化するために使用されるゲートを示す。図１Ｂ）このアッセイを使用して、ＨＰＶ＋中咽頭がんを有する患者からの１２の血漿ＤＮＡ試料を分析すると、単一の陽性液滴中の両方の断片の存在量、及び同じ液滴中の両方の標的の非常に稀な同時占有率によって示される（無傷のゲノム対照とは対照的である）腫瘍由来ウイルスＤＮＡの存在が一様に示される。 実施例１に記載のＨＰＶ血液アッセイを使用した、患者の血液試料の大規模なコホートの分析。健康なボランティア３０人及びＨＰＶ陰性がん（乳がん及び膵臓がん）を有する患者５０人においてＨＰＶ腫瘍ウイルスＤＮＡは検出されなかった。対照的に、ＨＰＶ陽性中咽頭がんの診断を有する９５／１０２人の患者は、本明細書に記載の血液検査を使用して、血漿中に治療前循環腫瘍ＨＰＶ ＤＮＡを有した。アッセイによって検出されたＨＰＶＤＮＡの観察されたコピー数も示され、試験の動的範囲を強調する。このデータに基づいて、初期診断時のアッセイ特異性及び感受性の推定値は、それぞれ、１００％及び９３％である。 図３Ａ）化学放射線療法（ＣＲＴ）を受ける前、受けている間、及び受けた後に中咽頭がん患者のコホートにおいて血液を採取した時点の概略図。図３Ｂ）ＣＲＴを開始した後に観察された血漿ｃｔＨＰＶ１６プロファイルの２つのパターン。一部の患者（赤い線）では、ｃｔＨＰＶＤＮＡレベルは、治療前に最高レベルであり、治療を開始した後に減少する。他の場合（青い線）では、ｃｔＨＰＶＤＮＡレベルは、おそらくがん細胞死のスパイクに起因して、治療開始後すぐに増加する。全ての場合において、ｃｔＨＰＶＤＮＡレベルは、ＣＲＴの終了時に顕著に低下し、ｃｔＨＰＶＤＮＡレベルが患者の活性がんの体積と相関することを示す。図３Ｃ）患者のサブセットは、ＣＲＴ中にｃｔＨＰＶＤＮＡの急速なクリアランス動態を有し、ＣＲＴの４週目までにｃｔＨＰＶＤＮＡの＞９５％が除去される。図３Ｄ）患者の別のサブセットは、ＣＲＴ後のｃｔＨＰＶＤＮＡクリアランスの動態が遅延し、これは、ＣＲＴに対する不十分な又は遅延した応答と相関し得る。 ＨＰＶ＋ＯＰＣを有する２０人の患者のサブセットは、彼らの原発性腫瘍の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析並びに彼らの血液のｃｔＨＰＶＤＮＡ分析を受け、これらのアッセイ間の潜在的な相関を調査した。図４Ａ）腫瘍生検標本に適用した場合、実施例１に記載のＨＰＶＤＮＡ ｄＰＣＲアッセイと、ＮＧＳによって評価された腫瘍ＨＰＶコピー数との間に強い相関があった。これは、同じ試料上の直交アッセイを使用して、ＨＰＶＤＮＡアッセイ及びＮＧＳの両方を検証する。図４Ｂ）細胞ゲノム当たりの腫瘍ＨＰＶコピー数と、腫瘍体積（「ｃｔＨＰＶＤＮＡ密度」）に正規化された血液中の治療前ｃｔＨＰＶＤＮＡとの間に、統計的に有意な相関がある。これは、血液中で検出されるｃｔＨＰＶＤＮＡのレベルが、関連する腫瘍におけるＨＰＶコピー数と相関することを示す。図４Ｃ）腫瘍ＮＧＳデータを使用して、ヒトゲノムへのＨＰＶ組み込みのエビデンスを有するＨＰＶ＋ＨＰＶがんと、純粋にエピソームＨＰＶを有するがんとを区別するために、バイオインフォマティクス分析パイプラインを開発した。図４Ｄ）エピソームＨＰＶ（左）及び組み込まれたＨＰＶ（右）を有するがんにおける観察された再構成示したｃｉｒｃｏｓプロットを示す。本明細書に示される組み込まれたＨＰＶを有する例は、第８染色体上の領域にマッピングする組み込み部位を有する（暗い黒線を参照）。図４Ｅ）より高い腫瘍ＨＰＶコピー数は、より大きい非組み込み（エピソームのみ）ＨＰＶの可能性と相関する。図４Ｆ）血液中のより高いｃｔＨＰＶＤＮＡレベルはまた、関連するがんにおけるより高い非組み込み（エピソームのみ）ＨＰＶの可能性と相関する。したがって、ｃｔＨＰＶＤＮＡは、関連するがんにおけるＨＰＶゲノムの状態、すなわち、それが組み込みかエピソームであるかについての情報を提供することもできる。 図５Ａ）ｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルに基づいて患者を層別化するための概略図。迅速に除去される（２８日目までに＞９５％）豊富な処理前ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡを有する患者は、好ましいｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルを有すると分類される。他の全ての患者は、好ましくないｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルを有すると分類される。図５Ｂ）好ましいｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルは、臨床的に好ましい（＜Ｔ４及び＜＝１０パック年の喫煙歴）疾患を有する患者の約３０％、及び臨床的に好ましくない（Ｔ４又は＞１０パック年の喫煙歴）疾患を有する患者の約３０％において観察される。 図６Ａ）治療後頸部郭清陽性（すなわち、局所的持続性疾患）、局所再発、及び遠隔転移を有した各サブグループにおける患者の割合。好ましくない臨床的リスク因子を有し、好ましくないｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルを有した患者は、有害な疾患事象のリスクが最も高かった。図６Ｂ）臨床的リスク及びｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルによって層別化された、局所無病（持続性又は再発性）生存期間のカプランマイヤー分析。好ましいｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡプロファイルを有する患者は、喫煙歴にかかわらず、１００％の局所疾患制御を有した（５人の患者は重喫煙者であった）。対照的に、好ましくないｃｔＨＰＶＤＮＡプロファイルを有する臨床的リスクの高い患者は、局所疾患制御が顕著に低減した。Ｐ、トレンドの両側ログランク検定。 本明細書に記載のｃｔＨＰＶＤＮＡ試験は、ＨＰＶ＋中咽頭がんの治療を完了した７３人の患者のコホートに適用された。これらの患者は、疾患のエビデンスがなく、臨床的に無症状であった。これらの患者は、各フォローアップ来院時にｃｔＨＰＶＤＮＡ血液検査で監視された。７３人の患者のうち６０人は、全てのフォローアップ来院時にｃｔＨＰＶＤＮＡを検出できず、これらの患者はいずれもフォローアップ期間中に疾患の再発を発達させなかった。対照的に、臨床フォローアップ期間中に、７３人の患者のうち１３人がｃｔＨＰＶＤＮＡ血液検査陽性を発達させた。これらの１３人の患者のうち９人は、臨床的に明らかな疾患の再発も発達させた。ｃｔＨＰＶＤＮＡ血液検査は、診断放射線スキャンで再発疾患を特定する６か月前まで陽性であった。血液検査で陽性となった残りの４人の患者は、疾患再発の可能性について注意深く監視されている。 ｃｔＨＰＶＤＮＡサーベイランス研究の症例。この患者は臨床的に無症状であり、がんではないと考えられていた。２０１７年６月、ｃｔＨＰＶＤＮＡ血液検査で陽性となった。その後間もなく、彼は腫瘍専門医によって検査され、疾患のエビデンスがないことが判明した。３か月後、彼は再び臨床医によって検査されたが、いずれの再発のエビデンスは特定されなかった。しかしながら、患者は多少の頸部／肩部の痛みを報告し、これは本質的に筋骨格であると考えられた。頸部／肩部ＭＲＩを指示し、血液検査陽性の４か月後のこの検査で、単離された異常なリンパ節の拡大が特定され、これはその後生検され、再発のＨＰＶ＋中咽頭がんと一致した。 表１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０に提示される三つ組のプライマー／プローブセットを使用した、腫瘍由来ＨＰＶウイルスＤＮＡアッセイを検出する方法の代表的な実施形態。表１４からの修飾されたプライマープローブセット３、５、及び７を含む患者の血液試料において腫瘍由来ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するための多重デジタルＰＣＲ反応のデジタルＰＣＲ蛍光検出プロットを示し、検出プローブ５はＨＥＸにコンジュゲートされ、検出プローブ３及び７はＦＡＭにコンジュゲートされる。
本開示をより詳細に記載する前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、当然ながら、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によって限定されるために限定することが意図されないことも理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれ得、また、本開示内に包含されるが、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界による。記載された範囲が、限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料に類似する又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験で使用することもできるが、有用な方法及び材料をここで説明する。
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日前のその開示のためにあり、本開示が事前の開示に基づいてそのような刊行物の前に日付を付ける権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される公開日は、独立して確認する必要があり得る実際の公開日とは異なる場合がある。
この開示の閲読時に当業者には明らかであるように、本明細書で説明及び図示される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができるか、又はそれらと組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当技術分野の範囲内である化学、生物学などの技法を用いる。
実施例は、本明細書に開示され特許請求される方法の実施方法、並びに組成物及びプローブを作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示される。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、ある程度の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧又はそれに近い。標準温度及び圧力は、２０℃及び１気圧と定義される。
本開示の実施形態が詳細に記載される前に、別段の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応物質、製造プロセスなどに限定されないため、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。また、本開示において、ステップは、これが論理的に可能である場合、異なる順序で実行され得ることが可能である。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数参照を含むことに留意する必要がある。
本明細書で使用される場合、「ヒトパピローマウイルス」又は「ＨＰＶ」は、皮膚及び／又は粘膜上皮に感染する小さな非エンベロープの二本鎖ＤＮＡウイルスを指す。当業者によって理解されるように、１００を超えるＨＰＶ遺伝子型が存在することが知られている。性感染した粘膜向性ＨＰＶは、高リスク（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８）又は低リスク（ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１）に更に下位分類される。
本明細書で使用される場合、ＨＰＶ関連悪性腫瘍は、頭部及び頸部（喉頭、口腔、中咽頭、扁桃、及び食道）、呼吸組織、乳房、皮膚、子宮頸部、外陰部、陰茎、及び肛門の悪性腫瘍を含む。悪性腫瘍及びがんは、交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「検出すること」又は「検出」とは、試料中のＨＰＶに対する少なくとも１つの腫瘍核酸マーカーの存在及び／又は不在を試験、スクリーニング、又はその他の方法で決定することを意味する。そのような検出すること又は検出は、本技術に適用可能である当該技術分野で既知のもの、例えば、核酸増幅、ハイブリダイゼーションベースの検出、マイクロアレイ、及び次世代シーケンシングを含む、本明細書に記載の方法によって行うことができる。
また、本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」という用語は、例えば、当該技術分野で周知であろう、例えば、対象の（例えば、１つ以上の症状の）状態の改善、障害、疾患、若しくは病気の進行の遅延、疾患、障害、若しくは病気の発症の遅延、及び／又は状態、障害、疾患、若しくは病気の臨床パラメータの変更などを含む、状態、障害、疾患、又は病気に罹患している対象への有益及び／又は治療効果であり得る、調節効果を与える任意の種類の作用を指し得る。
本明細書で使用される場合、「監視」という用語は、がんを有する患者に対する治療の治療有効性を評価することを指す。本明細書で使用される場合、「サーベイランス」という用語は、臨床的に診断された又は症候性のがんを有し得る、又は有しない対象におけるウイルス関連悪性腫瘍の検出を指す。
本明細書で使用される場合、対象は、特徴又は転帰を有する対象の確率がある参照確率又は値を超える場合、ある臨床的特徴又は転帰（例えば、再発又は進行）の「増加した可能性」を有する。参照確率は、一般的な関連する対象又は患者集団にわたる特徴又は転帰の確率であってもよい。例えば、一般的な中咽頭がん集団における再発の確率がＸ％であり、特定の患者がＹ％の再発の確率を有すると方法によって決定されている場合、かつＹ＞Ｘの場合、患者は再発の「増加した可能性」を有する。代替的に、閾値又は基準値を決定してもよく、特定の患者の再発の確率をその閾値又は基準値と比較してもよい。
本明細書で使用される場合、「試料」は、ＨＰＶに対する腫瘍核酸マーカーを含有する生体試料を指す。試料は、組織、細胞、又は人体から採取された任意の流体、例えば、血液、血漿、尿、唾液などであり得る。特定の実施形態では、試料は、血液ベースの試料である。したがって、試料は、全血又はその構成成分、例えば、血清又は血漿であり得る。
ヒトパピローマウイルス関連悪性腫瘍の検出、治療、及びサーベイランスのための方法、並びにそれを達成するためのキットも本明細書に開示される。
循環系において具体的に腫瘍に由来するウイルス核酸を定量化するための方法、及びこれらの腫瘍由来ウイルス核酸を循環ウイルス核酸の他の供給源と区別するための方法も本明細書において開示される。
試料中の標的ＤＮＡのＤＮＡ断片をサイズ別に定量化するためのＤＮＡ増幅方法が本明細書に開示される。これは、例えば、血液試料において腫瘍由来ウイルスＤＮＡを検出し、それを非腫瘍源からのより大きなウイルスＤＮＡと区別するために使用され得る。特に、対象からの試料において少なくとも１つの循環腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡの存在又は不在を検出することを伴う、対象におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連悪性腫瘍を検出、監視、又は治療する方法が本明細書において開示される。これを達成するためのキットも提供される。
開示される方法は、例えば、Ｈｉｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ｎｏｖ １５；８３（２２）：８６０４－８６１０、Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｊａｎ １７；８４（２）：１００３－１０１１、及びＫａｎａｇａｌ－Ｓｈａｍａｎｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１３９２：３３－４２に記載されるような、例えば、乳化及び／若しくは油中水型液滴分割を介して、又は試料を、分割物／試料中に存在する腫瘍由来ＤＮＡ対非腫瘍由来ＤＮＡの分析用に別個の及び／若しくは容量的に定義された分割物に分離するための、当業者に既知の任意の他の方法を介して生成された数千の微小滴（本明細書において液滴とも称される）内で行うことができる。微小滴の場合、液滴のサイズは、マイクロスケール、ナノスケール、ピコスケール、又はフェムトスケールであり得る。
本明細書に開示されるように、微小滴は、それぞれが最大でも単一の標的化されたウイルス核酸を含有するように生成される。ウイルス核酸の２つの異なる領域のみが検出される実施形態では、標的化されたウイルス核酸を含有する微小滴は、単一陽性、すなわち、検出シグナルのうちの１つに対して陽性、又は二重陽性、すなわち、検出シグナルの両方に対して陽性のいずれかである。本明細書に開示されるように、単一陽性及び二重陽性の微小滴並びに二重陽性液滴の相対数は、試料中の腫瘍由来及び非腫瘍由来のウイルスＤＮＡの相対量を定量的に決定することを可能にする定量的情報を提供する。
ＰＣＲが、２つの物理的に異なる領域を検出するために使用される実施形態では、各検出された領域に対応するフォワード及びリバースプライマー対が含まれる。いくつかの実施形態では、検出は、当業者であれば理解するであろう手順に従って、デジタルＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、又は微小滴ＰＣＲを使用して行われ得る。本明細書に開示されるように、腫瘍由来循環ウイルス核酸を含有する微小滴は、非腫瘍由来循環ウイルス核酸を含有する微小滴と比較して、より少ない陽性検出されたウイルス核酸領域を有する。ウイルス核酸中の２つの異なる領域のみが検出の標的とされる最も単純な場合において、開示される方法は、非腫瘍由来循環ウイルスＤＮＡを含有する微小滴を、異なる標的化領域に用いられる検出シグナルの両方に対して陽性であるもの（二重陽性）として特定し、対照的に、この最も単純な場合において、腫瘍由来循環ウイルス核酸を含有する微小滴は、１つの検出シグナルのみに対して陽性であるが、同時に両方のシグナルに対して陽性ではない。
例示的な例を挙げると、検出のための標的核酸領域が約７０～１００ｂｐの断片を含む場合、１００ｂｐで分離された２つ以上の標的領域は、分子が循環腫瘍ＤＮＡに由来する場合、同じウイルスＤＮＡ分子上に存在することはない。このシナリオでは、同じ微小滴内での両方の標的断片の同時検出は、それぞれが検出の標的とされる領域のうちの１つを含有する、２つの異なる標的断片分子の同じ微小滴内での共占有に起因しなければならない。したがって、分析された試料が非腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する場合、個別に分析された各標的領域の頻度に基づいて予想されるよりも、２つ以上の標的断片に対して検査で陽性を示す微小滴の頻度が高い。
例えば、試料中の非腫瘍由来ウイルスＤＮＡ断片の割合の１つの定量的測定は、［分画（両方の検出シグナルに対して二重陽性の液滴）－分画（検出シグナル１に対してのみ陽性の液滴）＊分画（検出シグナル２に対してのみ陽性の液滴）］である。したがって、試料中の腫瘍由来ウイルスＤＮＡの分画は、［１－［分画（両方の検出シグナルに対して二重陽性の液滴）－分画（検出シグナル１に対してのみ陽性の液滴）＊分画（検出シグナル２に対してのみ陽性の液滴）］］ということになる。腫瘍由来ウイルスＤＮＡの対応する定量的測定は、［＃（検出シグナル１に対してのみ陽性の液滴）＋＃（検出シグナル２に対してのみ陽性の液滴）］＊［腫瘍由来ウイルスＤＮＡ断片の割合］＝［＃（検出シグナル１に対してのみ陽性の液滴）＋＃（検出シグナル２に対してのみ陽性の液滴）］［１－分画（両方の検出シグナルに対して陽性の液滴）＋分画（検出シグナル１に対してのみ陽性の液滴）＊分画（検出シグナル２に対してのみ陽性の液滴）］である。これらの式は、生の検出シグナルデータを、試料中の腫瘍由来及び非腫瘍由来ウイルスＤＮＡの測定値に変換することができる方法の例示的な例として提供され、同じ目的のために利用され得る他の式があることを理解する。
開示される方法は、それぞれが独自の検出シグナルを有する３つ以上の領域が、各微小滴又は他の並列化されたマイクロ反応チャンバ内で検出される場合にも適用され得る。この文脈では、腫瘍由来及び非腫瘍由来ウイルスＤＮＡの定量化のための数式は、２つの増幅された領域について上で提供した推論に基づいて一般化することができる。
上の例は、少なくとも約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、又は約１００ｂｐで分離されたサイズが約７０～１００ｂｐの検出されたウイルスＤＮＡ領域を考慮するが、検出されたＤＮＡ断片のサイズ及びそれらの距離の両方が変化し得、開示される方法と関連して固定されていないことを理解されたい。
２つの異なる領域が検出の標的とされる実施形態に戻ると、二重陽性微小滴は、時折、検出の標的とされる領域の両方を包含する１つのより大きな断片の所望の測定とは対照的に、各断片が検出の標的とされる単一の領域のみを含有する、単一の微小滴内でのウイルス核酸の２つのより小さな断片の同時発生から生じ得る。いくつかの実施形態では、この可能性は、二重陽性及び単一陽性液滴の相対頻度を比較し、二重陽性液滴の頻度が単一陽性液滴の頻度の積によって近似され、より低い濃度で再分析したときに希釈因子の２乗によって有病率が低下することを確認することによって、排除されるか、又はそれが生じる程度を定量化することができる。
いくつかの実施形態では、血液試料から単離された核酸は、微小滴の大部分が、検出の標的とされるウイルス核酸のうちの１つを含有するか、又は全く含有しないかのいずれかであるように、微小滴に乳化される。正しい微小滴体積及び血液試料希釈因子を決定するための実験方法が、本明細書において提供される。乳化の後、ＰＣＲベースの方法を含み得る核酸検出方法を用いて、物理的に互いに分離される標的化ウイルス核酸の２つ以上の領域を検出する。いくつかの実施形態では、標的化検出される各ウイルス領域は、固有の検出シグナル、例えば、固有の蛍光色と関連付けられる。
ＨＰＶ－ＯＰＳＣＣ患者におけるｃｔＨＰＶＤＮＡの検出方法も本明細書において開示される。本方法は、概して、少なくとも２つの異なる領域が、断片化されている腫瘍由来ウイルスＤＮＡと、ＤＮＡが断片化されていない非腫瘍由来の無傷のビリオンとを区別するために増幅される乳化の文脈において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅を使用して、腫瘍由来ウイルスＤＮＡの存在を検出することを伴う。当該方法で使用するための核酸プローブ及び核酸プライマー、並びにそれらを含むキットもまた、本明細書において開示される。
強度低下化学放射線療法（ＣＲＴ）によって成功裏に治療することができるＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣを有する個体の予後を特定するための方法、治療後のＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣの再発生又は再発を予測する腫瘍特異的バイオマーカーを特定するための方法、及び治療後の再発生又は再発のリスクがあるＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣを有する個体の予後を特定する方法も本明細書に開示される。
開示される方法によって治療されるのに好適な対象には、哺乳類対象が含まれるが、これに限定されない。哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ類、霊長類、ヒトなど、並びに子宮内の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。治療を必要とする、又は治療を望む任意の哺乳類対象が好適である。任意の性別（例えば、男性、女性、又はトランスジェンダー）のヒト対象、及び任意の発達段階（すなわち、新生児、乳児、少年、青年、成人、高齢者）のヒト対象を治療することができる。対象は、白人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、ラテンアメリカ系、インド人など、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の人種又は民族であってもよい。更に、対象及び患者は、交換可能に使用されることに留意されたい。
特定の実施形態では、対象は、ウイルス関連悪性腫瘍と診断されたことがないか、又はそれに罹患したことがない。他の実施形態では、対象は、ウイルス関連悪性腫瘍と診断されるか、それに罹患しているか、それを患っているか、又はそのリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、対象は、以前に、ウイルス関連悪性腫瘍の治療を受けたことがある。他の実施形態では、対象は、ウイルス関連悪性腫瘍から寛解していてもよい。いくつかの実施形態では、対象は、喫煙者である。いくつかの実施形態では、対象は、非喫煙者である。
ｃｔＨＰＶＤＮＡの検出
試料中のバイオマーカー核酸、例えば、ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡなどのｃｔＨＰＶＤＮＡのレベルを決定するための方法は、例えば、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系、（ＴＡＳ）自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅、Ｑ－ベータレプリカーゼ、ローリングサークル複製、ローリングサークル増幅、又は任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅のプロセス、続いて、当業者であれば理解するであろう任意の技法を使用した増幅された分子の検出プロセスを伴い得る。
いくつかの実施形態では、核酸検出方法は、検出方法が高度に並列化された方法で実行され得るように、微小滴又は他のマイクロ反応チャンバ内で実行され得る。いくつかの実施形態では、微小滴又はマイクロ反応チャンバは、検出の標的とされるウイルスＤＮＡ領域の０又は１コピーのいずれかを含有し得る。
エマルジョンＰＣＲを伴う実施形態では、標的核酸又はポリヌクレオチド配列は、典型的には、微小滴に分散される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、各微小滴（又は液滴）が標的分子の１つ又はゼロコピーのいずれかを含有する濃度で乳化されることが不可欠である。患者の血液試料から単離された血漿又は血清ＤＮＡの場合、適切な希釈レベルは、対照ゲノム領域の存在量を評価し、陽性微小滴の頻度が１０％未満（＜１０％）のままであることを確実にすることによって認識することができる。対照ゲノム領域は、ヒト（すなわち、非ウイルス）ＤＮＡを検出し、試料の品質管理として機能し（多くの陰性試料は、アッセイにおいていかなる陽性シグナルも有さないため）、ＤＮＡ断片の濃度が適切である（低すぎず、高すぎない）ことを確立するためにも使用される。
各微小滴内で、標的分子が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプライマー対との反応によって増幅される、従来のＰＣＲの原理も適用される。プライマーは標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに十分な条件下では、１サイズの核酸断片が反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）を支配する。増幅サイクルを繰り返して、各微小滴内の単一標的核酸又はポリヌクレオチド配列の濃度を増加させる。反応は、ＰＣＲに通常使用される任意のサーモサイクラーで行うことができる。
ＰＣＲ反応を設定する方法は、当業者に周知である。当業者によって理解されるように、任意の既知のＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸塩、緩衝液、添加剤／反応促進剤、及び増幅のための条件（変性、アニーリング、及び重合のサイクル）をＰＣＲ反応に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、反応物は、各液滴内の標的分子の良好な増幅の検出を可能にする、反応混合物に対する蛍光分子及び蛍光消光分子の両方にコンジュゲートされる配列特異的加水分解プローブを含む。特定のプローブの化学組成は異なってもよいが、当業者による合成ベースの核酸増幅を検出するための確立された方法に従う。
ＰＣＲ反応のエマルジョンの調製は、当業者によって認識される様々な方法で達成することができる。１つの効果的な方法論は、水性ＰＣＲ反応物を制御された圧力で脂質溶液と混合して均一なサイズの微小滴を生成する、製造されたマイクロ流体チップを利用する。開示される方法は、２つ以上のウイルス核酸標的分子の同時検出を可能にする、分割されたＰＣＲ反応混合物を達成するための任意の方法に適用可能である。
適切に乳化又は液滴に分割されたＰＣＲ反応混合物の調製後、反応混合物をプライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに十分な条件」）、すなわち、鋳型鎖を鋳型として使用してプライマー分子の末端にヌクレオチドを付加することにより、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長を可能にする条件に供する。変性、アニーリング、及び重合のサイクルは、当業者によって理解されるであろう任意の条件（例えば、サイクル数、温度、及び時間の持続時間）に従って行われ得る。
変性、アニーリング、及び重合のサイクルは、典型的にはサーモサイクラーとして知られる自動装置を使用して行われてもよい。用いることができるサーモサイクラーは、本明細書の他の箇所、並びに米国特許第５，６１２，４７３号、同第５，６０２，７５６号、同第５，５３８，８７１号、及び同第５，４７５，６１０号に記載されている。
他の実施形態では、非ＰＣＲベースの適用は、例えば、そのような標的が固体支持体上に固定され得る標的核酸配列を検出するために使用され得る。核酸配列を固体支持体上に固定する方法は、当該技術分野で既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、並びに例えば、膜：Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁気ビーズ：Ｄｙｎａｌ、培養プレート：Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、及び他の支持体に関して製造業者によって提供されるプロトコルに記載されている。
限定されないが、ＬＣＲ、ＴＡＳ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ｂＤＮＡ、及び等温増幅などの他の核酸増幅手順は、当業者によって理解されるであろう。開示される方法は、ＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、むしろ、本明細書に記載の特定の核酸配列のうちの１つ以上の存在若しくは発現の検出及び／又は定量化のための配列の増幅に有用であり得る任意の核酸増幅方法又は任意の他の手順の使用を含む。
様々な試薬の正確な量、及び同様の増幅又は検出／定量化の結果をもたらすＰＣＲ又は他の好適な増幅手順の条件（例えば、緩衝条件、サイクル時間など）のバリエーションは、当業者に既知であり、同等であると考えられる。
試料／微小滴における標的分子の存在の検出は特に限定されず、当業者によって認識される任意の技法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、検出は、標的分子と、蛍光マーカーに連結された核酸プローブなどの標的特異的プローブとのハイブリダイゼーションを含み得る。他の実施形態では、マーカーは、非蛍光マーカーであり得る。蛍光又は非蛍光のマーカーの性質は特に限定されず、当業者によって認識されるであろう任意のマーカー又は標識であり得る。
標的分子を含有する分割物（液滴）を検出し、ゼロ標的分子を含有する分割物と区別することは、デジタルＰＣＲにおける重要なステップである。これは、様々な確立された技法を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル及び蛍光検出器を使用して、微小滴を個別に分析する。代替的に、陽性及び陰性の液滴を計数するために、高度な顕微鏡検査技法を実施してもよい。開示される方法は、任意の核酸検出方法で具体化され得る。
本明細書に開示されるいくつかの方法は、デジタルＰＣＲを使用して実施されてきたが、開示される方法は、単一の核酸を検出し、検出された断片のサイズを区別することができる任意の核酸検出方法とともに、原則として利用することができる。例えば、そのような方法には、非増幅標的分子と蛍光又は非蛍光のプローブとのハイブリダイゼーションなどが含まれ得る。任意のそのような実施形態では、開示される方法を適用して、循環中の腫瘍由来ウイルス核酸を、循環ウイルス核酸及び無傷のビリオンの他の非悪性腫瘍源と区別することができる。開示される方法の特定の態様は、ウイルスゲノム中の所定の距離で分離された少なくとも２つのＤＮＡ断片の分割反応における同時検出であり、別個の分割物における両標的の存在は、血液などの体液中の腫瘍ウイルス核酸を示し、同じ分割物における両断片の同時占有の頻度の増加は、非悪性腫瘍ウイルス核酸を示す。
本発明は、多数の修正及び変形が当業者には明らかであり、理解されるため、単に例示として意図される以下の実施例においてより詳細に説明される。血液などの体液において腫瘍ウイルス核酸を検出するためのこの特異的かつ感受性の高い方法の適用が、がん治療中の患者予後を予測し、臨床的に無症候性であり、疾患寛解状態にあると考えられる患者のコホートの中で、疾患再発のリスクが最も高い患者を特定するためにどのように使用され得るかの例を以下に提供する。
本発明のいくつかの実施形態が説明されている。本開示は、特許請求の範囲に説明される本発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。
実施例１：循環無細胞ＤＮＡにおけるＨＰＶウイルスＤＮＡを検出するためのデジタルＰＣＲアッセイ
血液から単離された循環無細胞ＤＮＡにおいて腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡを検出するためにデジタルエマルジョンＰＣＲを使用する、開示される方法の実施形態が本明細書において提供される。本実施例に記載される方法論的詳細、例えば、使用される核酸増幅及び検出方法は、本発明が実践に移されたことを確立するためだけに含まれる。この特定の実施形態にのみ関連するこの実施例において提供される方法論的詳細は、本文書の特許請求の範囲及び要約のセクションで説明されるように、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
材料
試薬：無細胞ＤＮＡ ＢＣＴチューブ、ＲＵＯ（Ｓｔｒｅｃｋカタログ番号＃２１８９６２）；ＱＩＡａｍｐ（商標）循環核酸キット、カタログ番号＃５５１１４；ｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍａｘ（登録商標）Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－３０２４；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）９６－Ｗｅｌｌ ｔｗｉｎ．ｔｅｃ（商標）ＰＣＲプレート；Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号＃Ｅ９５１０２０３６２；ピペットチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１２１又は＃１８６－４１２０）；カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１０９又は＃１８６－４１０８）；シーリングホイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８１－４０４０）；任意：ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒｓ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号／ＩＤ：１９４０７）。この追加のコネクタは、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット、カタログ番号５５１１４；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号：＃Ｑ３２８５１）；Ｑｕｂｉｔ（商標）アッセイチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号：＃Ｑ３２８５６）；Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）１５ｍｌコニカル遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号＃３５２０９６）；Ｆａｌｃｏｎ（商標）５０ｍｌコニカル遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号＃３５２０９８）；使い捨て滅菌５ｍｌ、１０ｍｌ、及び２５ｍｌ血清用ピペット（任意の良質なブランド）；滅菌ＰＣＲチューブ（任意の良質なブランド）；容量２μｌ、１０μｌ、２００μｌ、及び１２００μｌの滅菌フィルターチップ（任意の良質なブランド）；プライマー及びプローブに利用可能なコネクタに何か不具合が生じた場合に有用である。
機器：微量遠心分離機（１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２４微量遠心分離機に好適である）、遠心分離機（１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブ、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５８１０Ｒに好適である）、Ｑｕｂｉｔフルオリメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号＃Ｑ３３２２６）、ディープ９６ウェルサーモサイクラー（９６－ディープウェルリアクションモジュール＃１８５１１９７を備えたＢｉｏ－ＲａｄのＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）熱サイクラー）；１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを乾燥させるための加熱ブロック（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号＃Ｉ０５４０）、水浴（２４の試料が一度に処理できるように２４の５０ｍｌのコニカル遠心分離機チューブをインキュベートするための十分なスペースを有する必要がある）；自動液滴発生器（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１０１）；Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００（商標）液滴読取機カタログ番号＃１８６４００３；携帯式Ｐｉｐｅｔ－Ａｉｄ（登録商標）ＸＰピペット制御装置Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４－０００－１０１）；ピペット（容量：２μｌ、１０μｌ、２０μｌ、２００μｌ、及び１０００μｌ；任意の良質なブランド）；８チャネルピペット（任意の良質なブランド、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号＃３１２５００００１０）。
方法
採血：無細胞ＤＮＡ ＢＣＴチューブ、ＲＵＯ（Ｓｔｒｅｃｋカタログ番号＃２１８９６２）に血液を収集する。
血漿抽出：ステップＩから収集した血液は、理想的には、血漿を抽出するために同じ日に処理するべきである。同じチューブを、室温（ＲＴ）で１０分間、２０００ｘｇで遠心分離することができる。上清を新しいＦａｌｃｏｎ（商標）１５ｍＬコニカル遠心チューブに移す。血漿の下の真ん中の白っぽい層を取らないように注意する必要がある。チューブを、室温で１０分間、２０００ｘｇで再度遠心分離する。次いで、上清を新しいＦａｌｃｏｎ（商標）１５ｍｌコニカル遠心チューブに移す。血漿は、更なる使用まで－８０℃の冷凍庫に保管される。注意：１０分間の遠心分離では、血漿層が明確に分離されないことがある。そのような状況では、血漿を取り出す前に、試料を更に１０分間遠心分離する必要がある。又は、代替的に、第１のステップでの遠心分離を１５～２０分間行うことができる。血漿が赤く見える場合は、試料を記録する。溶血のため、ＰＣＲステップ中に試料を追加処理することが必要な場合がある。血液は１０％漂白剤中に廃棄されるか、又はオートクレーブ処理されるか、又は任意の他の施設／会社承認のプロトコルに従って廃棄される必要がある。
無形質細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）抽出：保存した血漿試料を、水浴中で約５分間、３７℃で解凍する。Ｑｉａｇｅｎキット（ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット、カタログ＃５５１１４）を使用して、以下の修正を伴う製造業者のプロトコルを使用してＤＮＡを抽出する。実験室で利用可能な標準的な真空をプロトコルで使用することができる。ｃｆＤＮＡは、最初に１００μｌ溶出緩衝液で、次いで血漿体積が３ｍｌを超える場合は７５μｌ溶出緩衝液で、２つのステップで溶出される。収集した血漿体積が、ｃｆＤＮＡの過度の希釈を回避するために少ない場合、より小さい体積で溶出を行うことができ、溶出緩衝液を添加した後にカラムを３分間インキュベーションすると（プロトコルで提案されるように）、ｃｆＤＮＡが完全に抽出されないことが観察された。一般に、室温で３０分～１時間のインキュベーションは、概して、両溶出ステップに従う。ｃｆＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔフルオリメーターで定量化される。（注意：一般に、定量化の目的で使用するには、２μｌの溶出液で十分である）。溶出したｃｆＤＮＡは、更なる使用まで－２０℃の冷凍庫に保存される。注意：最初の溶出で回収されたｃｆＤＮＡは、全ての実験及び計算に使用される。第２の溶出ステップで回収されたｃｆＤＮＡは、第１の溶出でｃｆＤＮＡが枯渇した場合にのみ使用される。ＮＧＳなどの任意の目的のためにより濃縮されたｃｆＤＮＡが必要な場合、試料を速度真空（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ）を使用して濃縮することができる。
ｄＰＣＲ：ｄＰＣＲは、液滴生成、ＰＣＲ、及び液滴読み取りの３つステップを伴う。
液滴の生成：以下の組成に従ってカスタマイズされた各試料について２５μｌの反応物を調製する（試薬：ｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍａｘ（登録商標）Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－３０２４；任意のヌクレアーゼフリーＰＣＲグレードの水を使用することができ、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブなどの他の試薬は、ユーザによって設計される）
Figure 2023518032000002
本明細書に記載のｃｔＨＰＶＤＮＡアッセイ用のプライマー及びプローブ配列は、以下のとおりである。
Figure 2023518032000003
プライマー混合物の作業溶液は、各２２．５μＬの４つのプライマー（１００μＭ濃度）をチューブに組み合わせ、１０μＬのヌクレアーゼフリー水を添加して、各プライマーについて２２．５μＭの最終濃度を達成することによって組み立てられる。
プローブ混合物の作業溶液は、６．２５μＬの各プライマー（１００μＭ濃度）をチューブに組み合わせ、８７．５μＬのヌクレアーゼフリー水を添加して、各プライマーについて６．２５μＬの最終濃度を達成することによって組み立てられる。
約２２～２３μｌの上記反応混合物を、マルチチャネルピペッターを使用して、９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）９６－Ｗｅｌｌ ｔｗｉｎ．ｔｅｃ（商標）ＰＣＲプレート、Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号＃Ｅ９５１０２０３６２）に充填した（注意：機器は各ウェルから２０μｌしか使用しない。いずれのピペッティングエラーを回避するために余分な体積が追加される）液滴は、自動液滴発生器（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１０１）を使用して製造業者のプロトコルに従って生成される。このステップで必要とされる試薬は、ピペットチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１２１又は＃１８６－４１２０）及びカートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８６－４１０９又は＃１８６－４１０８）である。試料プレートは、製造業者のプロトコルに従ってシーリングホイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号＃１８１－４０４０）で密閉される。注意：ｃｆＤＮＡ＋水の体積は４．３μｌでなければならない。一般に、反応物に４．３μｌのｃｆＤＮＡ試料を使用することによる問題はないが、対立遺伝子コピー数が多すぎることもあり、これは軸に対して陽性液滴及び多くの二重陽性液滴のストリーキングをもたらす。そのような場合、より少ない試料を使用することにより実行を繰り返す必要があり、残りの体積は水で調整され得る。希釈は、そのような場合における対立遺伝子頻度のより良い定量化をもたらす。２０μｌの反応物当たり５コピー～５０，０００コピーの範囲のＨＰＶ１６コピー数において、５桁にわたる線形関係が観察された。プレートを適切に密閉するように注意する必要がある。プレートが適切に密閉されていないと、ＰＣＲステップ中に試料の蒸発につながる。
ＰＣＲ：ＰＣＲサーモサイクリングは、以下に記載されるプロトコルを使用して行われた。
Figure 2023518032000004
全てのウェルは、ＰＣＲの後及び液滴リーダーでプレートを読み取る前に目視で観察する必要がある。液滴の読み取り中に観察されたコピー数は、不適切な密閉のために試料が蒸発するウェルがある場合、正しくない可能性がある。ＰＣＲが完了した後、約１５～２０分間、プレートをサーモサイクラーに放置しておくとよい。プレートの温度がより制御された方法で下がり、液滴の奇形を回避する。静電流による液滴の奇形は、サーモサイクラーからプレートを取り出す前に、他の金属表面に手を触れることによって回避することができることがある。結果の再現性を向上させるために、日常的な慣行にする必要がある。ＰＣＲプレートは、ＰＣＲ後に一晩保管することができ、時間が限られている場合は、翌日の朝に読み取ることができる。しかしながら、１日で全てを終えるのが最良慣行である。
液滴の読み取り：液滴リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００（商標）液滴リーダーカタログ番号＃１８６４００３）を使用して、製造業者のプロトコルに従って液滴中のシグナルを読み取る。注意：油廃棄物の廃棄：液滴リーダー油の組成は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ独自のものである。典型的な廃棄物プロファイルは、フッ素化油（９５％）、水（５％）、漂白剤（０．５％未満）、タンパク質、核酸、及び蛍光色素（０．１％未満）を含有する。それに応じて適切な廃棄を計画する必要がある。
データ分析：コピー数の計算は、製造業者のガイドラインに従って行う必要がある。ｄＰＣＲ ｃｔＨＰＶＤＮＡアッセイ読み出しの例を、図１Ａに示す。ＦＡＭ単一陽性、ＨＥＸ単一陽性、及びＦＡＭ＋ＨＥＸ二重陽性液滴の計算のために以下のパラメータを設定した。ＦＡＭチャネルでは、７００のカットオフを使用して、陰性液滴を陽性液滴から分離する。同様に、ＨＥＸチャネルでは、３０００のカットオフを使用して、陰性液滴をと陽性液滴から分離する。ＦＡＭ＋ＨＥＸ二重陽性液滴は、ＦＡＭチャネルにおいて＞７００の蛍光強度、及びＨＥＸチャネルにおいて＞３０００の蛍光強度を有するものである。二重陰性液滴は、ＦＡＭ蛍光７００未満及びＨＥＸ蛍光３０００未満を有する。
ポアソン統計は、以下の式を使用して反応物中の各断片のコピーを個別に計算するために使用される。
＃コピー＝＃総液滴＊ｌｎ（＃総液滴／＃単一陰性液滴）。
これは、まず、断片１（ＦＡＭ陽性）及び断片２（ＨＥＸ陽性）について計算される。
実験ノイズのレベルを決定するために、広範な対照アッセイが実行された。これらの対照に基づいて、以下の基準を使用して、アッセイ反応物における標的断片のコピー数を決定した。
Figure 2023518032000005
これらのコピー数値を使用して、標的断片を有する液滴の頻度を計算することができる：Ｐｒ（ｆｒａｇ）＝（＃陽性液滴／＃総液滴）。試料が断片化された循環腫瘍ウイルスＤＮＡからなる場合に予想される二重陽性液滴の頻度は、以下のように推定される：Ｐｒ（二重陽性）＝Ｐｒ（ｆｒａｇ１）＊Ｐｒ（ｆｒａｇ２）。対照的に、Ｐｒ（二重陽性）＞２＊Ｐｒ（ｆｒａｇ１）＊Ｐｆ（ｆｒａｇ２）の場合、試料は、腫瘍由来ではない非断片化ウイルスＤＮＡを含有するとみなされた。Ｐｒ（二重陽性）＞Ｐｒ（ｆｒａｇ１）又はＰｒ（二重陽性）＞Ｐｒ（ｆｒａｇ２）の場合、試料は循環腫瘍由来ウイルス核酸に対して陰性であると解釈した。Ｐｒ（ｆｒａｇ１）及びＰｒ（ｆｒａｇ２）＞２＊Ｐｒ（二重陽性）の場合、試料は循環腫瘍由来ウイルス核酸に対して陽性とみなされたが、共存する非腫瘍由来ウイルス核酸のエビデンスがある。実験対照、及びＨＰＶ＋中咽頭がんを有する１２人の患者のコホートからの血漿ＤＮＡに適用されたこのアッセイの生データを、図１Ａ～１Ｂに示す。
ＨＰＶ１６Ｆ１アッセイについて、７００のカットオフをｙ軸（ＦＡＭチャネル）に設定した。７００を超える任意の液滴は、ＨＰＶ１６に対して陽性液滴とみなされる。ＨＰＶ１６Ｆ２アッセイについて、３０００のカットオフをｘ軸（Ｈｅｘチャネル）に設定した。３０００を超える任意の液滴は、ＨＰＶ１６Ｆ２に対して陽性液滴とみなされた。時折、ｄＰＣＲ読み出しのパターンが異常に見える。これは、不良な試料（分析不可能なｃｆＤＮＡ）又は不良なｄＰＣＲ実行が原因であり得る。そのような試料を繰り返して、問題を修正する必要があり得る。そのような試料からのデータは、解釈に使用することはできない。任意の利用可能な戦略で試料の品質が改善されない場合、試料は分析不可能なＤＮＡ又は不良な試料として分類される必要がある。試料の品質を改善するためのいくつかの戦略は、以下のとおりである。血液試料中のヘパリンの存在は、ｄＰＣＲ反応を妨げる可能性がある。製造業者のプロトコルを使用して、試料をＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号＃Ｐ０７３５Ｓ）で処理すると、試料の品質が改善される。過度の溶血は、ｄＰＣＲを妨げることがある。０．４％ウシ血清アルブミンを添加することによって、アッセイ読み出しで改善が観察された。不良な試料からの代表的なドットプロットのいくつかは、提案される解決策とともに別個のファイルとして提供される。
内因性ゲノム配列をｄＰＣＲ反応物の陽性対照として使用することは、試料の質を検証するために不可欠である。ＥＳＲ１遺伝子における標的配列のｄＰＣＲベースの検出は、試料の質に対する陽性対照として利用された。アッセイを以下に記載する。
Figure 2023518032000006

Figure 2023518032000007

Figure 2023518032000008
血漿ＤＮＡ試料の分析のためのワークフロー：
１）ＥＳＲ１ゲノム対照ｄＰＣＲアッセイを使用して試料を試験し、増幅可能なＤＮＡ及び試料濃度を評価する。
２）二重断片ＨＰＶ１６アッセイ（ＨＰＶ１６ＺＥＮｖ２）のための試料を試験する。
４）試料がＨＰＶ１６に対して陰性である場合、ＨＰＶ多重アッセイ（ＨＰＶｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＿ｖ１）を行う。
５）特定のＨＰＶバリアントを知るためにデュプレックスアッセイを行う。
実施例２：５つの異なるＨＰＶ亜株（ＨＰＶｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ＿ｖ１）を検出するための多重ｄＰＣＲアッセイ
開示される方法を、所与のウイルスの亜株に適用した。本明細書の実施形態は、ＨＰＶウイルスの亜株に関するが、方法は、当業者に既知の確立された技法を使用して、他のウイルス亜株に容易に適用することができる。記載の方法の実施形態に含まれるバリアントは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、及びＨＰＶ３５である。
ＨＰＶ１６プローブをＦＡＭ－Ｚｅｎでタグ付けし、他のプローブをＨＥＸでタグ付けした（ＬＮＡバージョン）。
Figure 2023518032000009
反応混合物
プライマー混合物：各１００μＭの等体積の１０のプライマーを混合する（各プライマーを混合物中で１：１０に希釈した）。プローブ混合物：６．２５μｌの５つのプローブのそれぞれをチューブに混合し、６８．７５μｌの水を添加する（最終濃度は１００μｌの体積で各６．２５μＭとする）
Figure 2023518032000010

Figure 2023518032000011
注意：ＬＮＡ（商標）－ＦＡＭプローブもまた、同じプライマーを有する全ての既知のＨＰＶ１６バリアントにおける共通領域を増幅するように設計した（Ｎｏ．２８３及び２８５）。これは、多重アッセイでは使用しなかった。
４１３＿ＨＰＶ１６＿ＬＮＡ＿ＦＡＭ－ＣｏｍｍｏｎＰｒｏｂｅ：ＣＡ（＋Ｃ）Ａ（＋Ｃ）（＋Ｇ）（＋Ｔ）Ａ（＋Ｇ）（＋Ａ）ＣＡＴ（配列番号２２）
実施例３：特定のＨＰＶバリアント（ＨＰＶ＿１８＆３３＿ｖ１及びＨＰＶ＿３１＆３５＿ｖ１）を検出するための二重ｄＰＣＲアッセイ
このアッセイは、患者試料中の特定のＨＰＶバリアントの同一性を知るために設計された。
Figure 2023518032000012
反応混合物
プライマー混合物：２２．５μｌの４つのプライマーのそれぞれを混合し、１０μｌの水を添加する（混合物中各プライマー２２．５μＭ）。プローブ混合物：６．２５μｌの両プローブをチューブに混合し、８７．５μｌの水を添加する（最終濃度は１００μｌの体積で各６．２５μＭとする）。
Figure 2023518032000013

Figure 2023518032000014
実施例４：前向き臨床試験における患者の血液試料への適用
健康なボランティア、非ウイルス関連がん、及びＨＰＶ＋がんからの血液試料を分析した。実施例１に記載のアッセイ技術を使用して測定した循環腫瘍ＨＰＶ ＤＮＡコピー数を、図２に示す。これらのデータは、ｃｔＨＰＶＤＮＡ血液検査が、ＨＰＶ＋がんを有する患者を特定するのに１００％の特異性及び９３％の感受性を有することを示す。
２つの前向き第ＩＩ相臨床試験に登録した患者からの血液試料を分析した。血液中の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡを特異的に検出するための開示される方法は、これらの臨床試験の両方の設計に統合された。これらの長期的臨床研究からの知見は、患者の療法を個別化するため、及びがんのサーベイランスのための両方の、開示される方法の適用可能性及び有用性を例示する。
患者のコホート及び臨床試験設計の要約。低リスクＯＰＳＣＣにおける強度低下化学放射線療法レジメンの有効性を評価した、２つの前向き第ＩＩ相臨床試験が完了した。ＬＣＣＣ １１２０（ＮＣＴ０１５３０９９７）では、４５人の患者が強度低下ＣＲＴで治療された。適格患者は、ＨＰＶ陽性及び／又はｐ１６陽性ＯＰＳＣＣ、Ｔ０－Ｔ３、Ｎ０－Ｎ２ｃ、Ｍ０、及び１０パック年未満の喫煙を有した。患者は、６０Ｇｙの強度変更放射線療法（ＩＭＲＴ）と同時に静脈内シスプラチン（３０ｍｇ／ｍ２）を毎週受けた。全患者が主要部位の生検を受け、ＣＲＴ後４～１４週間以内に、治療前に陽性であった結節レベルを包含するように選択的頸部郭清を受けた。ＬＣＣＣ １１２０の主要評価項目は、ｐＣＲ率であり（８６％（３７／４３）であった）、３年間のがん制御及び全生存率は、それぞれ、１００％及び９５％であった。優れたがん制御に加えて、患者は、標準治療ＣＲＴ（７０Ｇｙ）と比較して、毒性が低く、また優れた生活の質及び症状負荷が少ないことを報告した。第二世代第二相試験（ＬＣＣＣ １４１３、ＮＣＴ０２２８１９５５）では、治療後１２週間のＰＥＴ／ＣＴを使用して、生検／頸部郭清の使用を指導した（すなわち、ＣＲＴ後の外科的評価は必須ではなく、画像診断によって指導された）。登録された１１３人の患者のうち、８２人の患者は最低１年間のフォローアップを受けており、これら８２人の患者の２年間の保険数理がん制御及び全生存率は、それぞれ、９０％及び９５％である（再び優れた結果である）。患者は、１年時点での生活の質の良好な回復を報告し続けており、したがって、用量漸減が治療比を改善することができるという概念を支持する。第三世代第二相試験（ＬＣＣＣ １６１２、ＮＣＴ０３０７７２４３）が現在実施されており、予想される１２０人の患者のうち５３人が登録されている。１１３人の患者からの血液試料を前向きに分析して、腫瘍由来血漿ウイルスＨＰＶ ＤＮＡを検出した。
開示される方法によって定量化される血液中の腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡのレベルは、原発性腫瘍におけるＨＰＶウイルスＤＮＡと顕著に相関する。ＨＰＶ－ＯＰＳＣＣを有する６３人の患者において、腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡの連続レベル（ＲＴ前週及びＲＴ中毎週）を、開示される方法を使用して患者血液試料において前向きに定量した（図３Ａ）。４９人の患者は、治療前の循環において検出可能な腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡを有した。４９人全ての患者において、循環ＨＰＶ ＤＮＡのレベルは、化学放射線療法の開始後６週目までに顕著に低下し（図３Ｂ）、治療レジメンの終了までに大部分の患者（９０％、ｎ＝４４／４９）において検出不可能なレベルまで減少した。患者にわたって、血液中の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡのピークレベルは、１０コピー／ｍＬ～約３０，０００コピー／ｍＬの範囲であった。更に、腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡの明確なクリアランス動態が、ＣＲＴ治療中に血液において観察された。ある群では、迅速なクリアランス動態があり（図３Ｃ）、血液中のピーク腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡの＞９５％が、療法の２８日目までに除去された。第２の群では、血液中の腫瘍ウイルスＨＰＶ ＤＮＡのクリアランスが遅延しており（図３Ｄ）、これは、療法に対する不十分な又は遅延した応答と関連付けられ得る。
開示される方法は、血液中の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡのレベルを、２０人の患者のコホートにおける一致した原発性腫瘍の分析と相関させることによって更に検証された（図４）。腫瘍生検材料における正規化されたＨＰＶ ＤＮＡコピーは、次世代シーケンシングによって測定されるように、ＨＰＶ ＤＮＡコピーと強く相関する（図４Ａ）。更に、血液中の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡの量は、患者の全体的な腫瘍量に正規化した後、一致した腫瘍生検におけるＨＰＶ ＤＮＡコピー数と有意に相関する（図４Ｂ）。次世代シーケンシングを使用して、がん細胞ゲノムへのＨＰＶの組み込みを有するがんを特定した（図４Ｃ～４Ｄ）。腫瘍生検材料におけるＨＰＶ ＤＮＡのより高いコピー数は、一致した原発性腫瘍におけるエピソーム（非組み込み）ＨＰＶ ＤＮＡの可能性が高いことと相関した（図４Ｅ）。同様に、血液中の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡのコピー数が多いほど、一致した原発性腫瘍におけるエピソーム（非組み込み）ＨＰＶ ＤＮＡの可能性が高いことと相関した（図４Ｆ）。これらの知見は、開示される方法を使用した血液中のウイルスＤＮＡの定量化が、一致した腫瘍組織におけるウイルスＤＮＡの測定値と有意に相関することを確立することによって、開示される方法を検証する。これらの観察はまた、開示される方法が、患者の血液試料の長期的分析において腫瘍由来ＨＰＶウイルスＤＮＡの存在及びクリアランスを監視することができることを示す。
がん患者の臨床リスクを予測する。開示される方法を、上述の臨床試験に登録された６３人の患者の療法前及び療法中の血液において腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡを監視するために適用した。好ましいプロファイルは、血液中の豊富なｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡピークレベルの腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡ（＞２００コピー／ｍＬ）及び迅速なクリアランス動態（４週目までにピーク値の≦２％）を有すると定義された（図５Ａ）。６３人の評価可能な患者のうち１８人（２９％）が好ましいプロファイルを有し（図５Ｂ）、これらの１８人の患者のいずれも再発していない（喫煙状態に関係なく）（図６Ａ～Ｂ）。好ましくないプロファイルは、（ｉ）血液中の検出不可能な治療前腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡ、（ｉｉ）血液中の低いピーク値の腫瘍由来ウイルスＨＰＶ ＤＮＡ（≦２００コピー／ｍＬ）、又は（ｉｉｉ）４週目（４０Ｇｙ）までにピーク値の＞２％と定義された（図５Ａ～Ｂ）。顕著なことに、好ましいプロファイルを有する患者は、非喫煙者（６０Ｇｙ）及び重喫煙者（６０～７０Ｇｙ）において１００％の疾患制御を示した。対照的に、好ましくないプロファイルを有する重喫煙者（＞１０パック年）は、療法完了の１２か月後、局所疾患管理率が４５％と非常に劣っていた（図６Ａ～Ｂ）。これらの観察は、ウイルス関連がん患者間の臨床リスクを予測するためのバイオマーカーとして、血液中の腫瘍由来ウイルスＤＮＡを定量化するために開示される方法を適用することの臨床的有用性を示す。更に、これらの知見は、循環腫瘍由来ウイルスＤＮＡのリアルタイム評価を利用して、患者の推測されるリスクに基づいて、患者の療法の強度を個別化することができることを示す。
既存の臨床手順を使用した無症候性で無病とみなされる健康な患者におけるＨＰＶ陽性がんの再発の早期検出。化学放射線療法後の典型的なサーベイランススケジュールは、最初の５年間は２～６か月ごとの臨床検査（身体検査及び光ファイバー鼻咽頭鏡検査）である。ほとんどの頭頸部腫瘍専門医は、６～１２か月ごとにＰＥＴ／ＣＴも取得する。現在、ＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣを有する患者に対する利用可能なサーベイランス血液検査はない。高感度の血液ベースのサーベイランス試験の利用可能性は、がん再発の早期検出（臨床的又は放射線学的所見の前に）を支援し、来院の頻度及び高価な放射線画像検査の使用を減らすことによって、この集団におけるがんサーベイランスの価値を改善する。これまでに、７３人の患者がＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣで前向きに観察されている（図７）。臨床所見にかかわらず、各フォローアップ来院ごとに血液試料を得た。血漿ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡは、１３人の患者（中央値コピー／ｍｌ及び範囲）の治療後のフォローアップで検出可能となり、そのうち９人はがん再発の臨床／放射線学的エビデンスを有している。治療後に検出可能なｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡを有するこれらの患者は、無症候性であり、非常に早期の、低量のがん再発を確認するＸ線検査を受けた。例示的な事例を図８に示す。ここで、患者はすでに根治目的の療法を完了しており、疾患のエビデンスがなく、完全に無症候性であった。しかしながら、彼は２０１７年６月に血液における腫瘍由来ＨＰＶウイルスＤＮＡの陽性結果を発達させた。その後すぐに、彼は腫瘍専門医によって検査され、疾患のエビデンスがないと判断された。３か月後、彼は再度フォローアップ来院したが、腫瘍専門医は身体検査で疾患の再発の任意のエビデンスを特定しなかった。しかしながら、患者は多少の頸部／肩部の痛みを報告し、これは本質的に筋骨格であると考えられた。頸部／肩部ＭＲＩを指示し、初回の陽性血液検査から４か月後のこの検査で、頸部に孤立した異常なリンパ節拡大が特定された。この異常な腫瘤は、その後生検され、再発ＨＰＶ＋中咽頭がんであることが証明された。
本研究には、開示される方法を使用して血液中に検出可能なＨＰＶ ＤＮＡを有するが、疾患の臨床的／Ｘ線学的エビデンスがなく、再発について注意深く経過観察されている患者が４人いる。検出不可能なｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡを有する患者では、がんの再発は検出されていない。要約すると、がん再発の検出における血漿ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡアッセイの陰性予測値及び陽性予測値は、それぞれ、１００％及び７０％である。これらの観察は、血漿ｃｔＨＰＶＤＮＡが、ＨＰＶ関連がんの早期検出に非常に特異的で感受性があることを示唆している。臨床ケアの一環としての開示される方法の適用は、ＨＰＶ関連中咽頭がんを有する患者のがんサーベイランスの有効性を改善し、コストを低減し得る。
実施例５：ＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣの治療のためのバイオマーカーとしての血漿循環腫瘍ＨＰＶ１６ＤＮＡ
ＲＴＯＧ０１２９研究は、曝露が中咽頭がんの臨床リスクに影響を与えることを示した。ＨＰＶ陽性患者は良好である傾向があり、広範な喫煙歴を有するＨＰＶ陰性の患者は悪い傾向がある。ＲＴＯＧ０１２９を含むほとんどの研究では、重喫煙者で発達するＨＰＶ＋がんの中間予後も示されている。これを、図８に示す。
遺伝子バイオマーカーは、臨床リスクの層別化を改善することができる。例えば、ＨＰＶ＋非喫煙者における腫瘍のサブセットは、療法に対して例外的に感受性であり得るが、一方で、より多くのＨＰＶ様生物学を有するＨＰＶ＋がんを有する喫煙者、及びより多くのタバコ様生物学を有する他の喫煙者が存在し得る。バイオマーカーは、これらのサブグループを臨床パラメータ単独よりも良好に特定し得る。
血漿ｃｔＨＰＶＤＮＡは、大部分のＨＰＶ－ＯＰＳＣＣ患者で検出される。したがって、ｃｔＨＰＶ ＤＮＡは、腫瘍負荷のバイオマーカーであり得、重要なのは、応答動態である。血漿循環腫瘍ＨＰＶ ＤＮＡはまた、ＨＰＶ関連ＯＰＳＳＣの漸減療法に誰が適切であるかに関する決定に情報を提供することができる。
デジタルＰＣＲアッセイは、ＨＰＶ１６ ＤＮＡのために開発された、つまり、このアッセイは、ＨＰＶ－１８、－３１、－３３、又は３５を交差検出せず、非常に低いバックグラウンドシグナルを有し、コピー数（５～５０，０００コピー）の５桁を超える線形であり、正確かつ優れた再現性を有し、超感受性であり、約８０％の感受性でＨＰＶ１６のわずか６コピーを検出することができるという点で、非常に特異的である。これを、図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａは、陽性液滴が反応における陰性液滴から十分に分離されている個々のＨＰＶ１６ ＤＮＡ分子の存在を示す、このアッセイの一例の読み出しを示す。図１Ｂは、線形回帰の９５％信頼区間を示し、驚くべき直線性及び精度を示し、アッセイ可変性は、１０標的コピー範囲内でのみ問題となる。このアッセイは、偽陽性を与えないアッセイ閾値を使用して、ＨＰＶ１６ ＤＮＡのわずか６個の標的分子を検出することができる。
生検で証明されたＨＰＶ陽性ＯＰＳＣＣを有する６４人の患者を含む研究集団は、ｐ１６（ＩＨＣ）を過剰発現し、かつ／又はＨＰＶ ＩＳＨ陽性であった。全患者が根治的化学放射線治療（導入化学療法なし）を受けた。５４人の患者（８４％）が前向きＣＲＴ強度低下試験（６０Ｇｙ ＩＭＲＴ＋毎週のシスプラチン３０ｍｇ／ｍ２）に登録された。それらの患者のうち、４６人の患者が臨床的に好ましく（＜Ｔ４及び≦１０パック年のタバコ）、１８人の患者が臨床的に好ましくなかった（Ｔ４又は＞１０パック年のタバコ）。Ｎ３又はＭ１疾患を有する患者はいなかった。研究血液を、治療前、ＣＲＴ中毎週、及び治療後の来院で収集した（約４５０の血液試料を分析した）。
血漿ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡレベルを、化学放射線療法中に測定した。血漿ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡは、ＣＲＴに応答し、ほとんどの場合、治療後に「除去」される。治療有効性のバイオマーカーとしての可能性、並びにピーク－ｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡレベルと、喫煙状態、疾患負荷、及び腫瘍ＨＰＶコピー数との相関性を評価した。このレジメンを、図１０に示し、正規化レベルのｃｔＨＰＶ１６ＤＮＡを図３Ａに示す。
血漿ｃｔＨＰＶ１６ ＤＮＡは患者の７７％で検出され、図１１は各患者のピーク値を示す。図１１に示されるように、幅広い範囲の値が観察され、１ｍＬ当たりわずか１０コピーから最大３０，０００コピーが観察された。また、血漿中の任意の検出可能なＨＰＶ１６ ＤＮＡを有しない患者も２３％存在した。更に、血漿中のＨＰＶ１６の量と喫煙状態との間に有意な相関は見られなかった。
しかしながら、血漿ｃｔＨＰＶ１６レベルは、図３Ｃに示されるように、疾患負荷との有意な相関を示さなかった。疾患負荷とピークＨＰＶ１６ ＤＮＡ値との間の相関のための多くの異なる方法を調べたが、見つけることができなかった。しかしながら、腫瘍シーケンシング及び血漿ＨＰＶ１６ ＤＮＡが一致した２５人の患者サブセットを分析することにより、図３Ｄに示される、血漿循環腫瘍ＨＰＶ１６と腫瘍におけるＨＰＶ１６のコピー数との間に控えめであるが統計的に有意な相関が特定された。したがって、特定の患者の血漿中のＨＰＶ１６コピーの数は、腫瘍中のＨＰＶコピー数を反映し得、病期及び喫煙歴を超えた予後上の影響がある。
次に、ＨＰＶ１６陰性患者に注目し、最も一般的な４つの代替ＨＰＶ株のためのデジタルＰＣＲアッセイを開発した。この分析を図１２に示す。実際、非重喫煙者の間では、ＨＰＶ１６陰性患者全員が、血漿中で検出可能なＨＰＶ１８／３１／３３又は３５を有していた。重喫煙者であった患者では、顕著に異なるパターンが観察された。ＨＰＶ１６陽性の患者はやや少なかった。しかしながら、ＨＰＶ１６陰性患者のうち、検出可能なバリアントＨＰＶを有したのは約３分の１のみであり、残りは５つ全てのＨＰＶ株に対して陰性であった。おそらく更に懸念すべきことに、これらの４人の患者のうち２人は治療後に頸部郭清陽性を有し、１人の患者も腫瘍のｐ５３変異が試験で陽性であった。非喫煙者の間では、代替ＨＰＶ株による疾患事象の増加は観察されなかったが、喫煙者の間では、ここでは２人の患者しかいなかったが、そのうちの１人はＣＲＴを完了してすぐに局所再発を発達させた。したがって、ＨＰＶ１６陰性と喫煙状態の相互作用効果があるように思われる。
ＨＰＶ１６の高発現者であった患者間の異なるクリアランス動態も観察された。図１３に示されるように、一部の患者は、ＨＰＶ１６ ＤＮＡの指数関数的クリアランスを有し、他の患者は、血漿からのクリアランスの遅延を伴うより複雑な動態パターンを有した。これを、ピークＨＰＶ値と比較して、４週目にどのくらいの血漿ＨＰＶ ＤＮＡが存在したかを測定することによって定量化した。上の患者の場合、この値は０％であり、下の患者の場合は３９％である。中央値５％を使用して、迅速なクリアランス又はクリアランスの遅延のいずれかの動態を有する患者を層別化した。
これらをまとめて、血漿循環腫瘍ＨＰＶ１６ベースのリスク群を定義した。これを図１４に示す。好ましいリスク患者は、豊富なＨＰＶ１６及び迅速なクリアランス動態を有した。他の患者全員が、動態の遅れ、低コピー数、バリアントＨＰＶに対して陽性、又は検出不可能なＨＰＶのいずれかに起因して、好ましくない循環腫瘍ＨＰＶ１６プロファイルを有した。非喫煙者及び喫煙者の両方に関して、約３０％の患者は好ましい循環腫瘍ＨＰＶ１６プロファイルを有し、７０％は好ましくなかった。ここでも、最も一般的な５つのＨＰＶ株が検出されなかった喫煙者の２０％のサブセットが検出されなかったことに留意する。
図４に示されるように、好ましい循環腫瘍ＨＰＶ１６プロファイルを有する患者は、喫煙状態に関係なく、いかなる局所疾患事象も有しなかった。しかしながら、好ましくない循環腫瘍ＨＰＶプロファイルを有する患者の場合、喫煙状態は大きな影響を与えた。非重喫煙者は依然として良好な結果であり、９０％が局所疾患制御を有した。しかしながら、重喫煙者又はＴ４疾患を有する少数は、好ましくない血漿循環腫瘍ＨＰＶ１６プロファイルも有していた場合、局所疾患制御が悪かった。
要約すると、血漿ｃｔＨＰＶ１６ ＤＮＡは、＞１０パック年のタバコ又はＴ４疾患を有するＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣ患者４／１８人（２２％）の間の遺伝学的異質性を明らかにし、ｐ１６＋ＯＰＳＣＣは、ＨＰＶ－１６／１８／３１／３３／３５に対して陰性であった。ＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣの約３０％は、好ましいｃｔＨＰＶ１６プロファイル（すなわち、２００コピー／ｍＬ以上及び迅速なクリアランス動態）を有し、好ましくないｃｔＨＰＶ１６プロファイル（すなわち、低／検出不可能又はクリアランスの遅延）は、重喫煙者における局所疾患不良と強く関連する。ｃｔＨＰＶ１６プロファイルの評価は、ＨＰＶ関連ＯＰＳＣＣの治療を受けている非喫煙者及び喫煙者の治療強度を導くのに役立つ。
実施例６：療法後のがんの任意の臨床的エビデンスを示さない患者の長期的臨床試験におけるがんサーベイランスへの適用
前向き試験は、以前にＨＰＶ＋悪性腫瘍と診断されたが、根治目的の療法後に「疾患のエビデンスがない」とみなされた７３人の患者で実施された。ＨＰＶ血液検査は、定期的なフォローアップ中にこれらの患者に適用された。ＨＰＶ血液検査で陰性であった患者のいずれも、新しいＨＰＶ＋がん又は以前のＨＰＶ＋がんの再発を発達させなかった。対照的に、ＨＰＶ血液検査で陽性であった１３人の患者のうち９人は、ＨＰＶ＋がんと診断された。
図７はＨＰＶ血液検査の結果を示す。陰性試料は、陽性試料と明確に区別することができる。図８は、ＨＰＶ血液検査によれば陽性であったが、腫瘍専門医へのフォローアップ来院時に異常又は疾患のエビデンスを示さず、フォローアップの数か月後に疾患が再発した患者の症例の要約を示す。
臨床結果の要約を図７に示す。これらの結果は、ＨＰＶ血液検査の予測有効性を示す。本研究の７３人の患者のうち、６０人はＨＰＶ血液検査によれば陰性であり、そのいずれの患者も疾患の再発を示さなかった。対照的に、ＨＰＶ血液検査によれば陽性であった１３人の患者のうち、９人は疾患の再発を有し、残りの４人は再発を綿密に監視している。
実施例７：腫瘍由来ＨＰＶ１６の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１４に、腫瘍由来ＨＰＶ１６の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ１６ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１４からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
図９は、表１４からの修飾されたプライマープローブセット３、５、及び７を含む患者の血液試料において腫瘍由来ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するための多重デジタルＰＣＲ反応の結果を示し、検出プローブ５はＨＥＸにコンジュゲートされ、検出プローブ３及び７はＦＡＭにコンジュゲートされる。
別の例として、表１４からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１４において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、…｛１４、１６、１８｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000015
Figure 2023518032000016
Figure 2023518032000017
Figure 2023518032000018

実施例８：腫瘍由来ＨＰＶ１８の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１５に、腫瘍由来ＨＰＶ１８の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ１８ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１５からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表１５からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ１８ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１５において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、・・・｛１４、１６、１８｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000019
Figure 2023518032000020
Figure 2023518032000021
Figure 2023518032000022

実施例９：腫瘍由来ＨＰＶ３１の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１６に、腫瘍由来ＨＰＶ３１の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ３１ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１６からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表１６からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ３１ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１６において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、・・・｛１３、１５、１７｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。



本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000023
Figure 2023518032000024
Figure 2023518032000025
Figure 2023518032000026

実施例１０：腫瘍由来ＨＰＶ３３の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１７に、腫瘍由来ＨＰＶ３３の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ３３ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１７からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表１７からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ３３ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１７において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、・・・｛１１、１３、１５｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000027
Figure 2023518032000028
Figure 2023518032000029
Figure 2023518032000030

実施例１１：腫瘍由来ＨＰＶ３５の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１８に、腫瘍由来ＨＰＶ３５の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ３５ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１８からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表１８からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ３５ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１８において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、・・・｛１２、１４、１６｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000031
Figure 2023518032000032
Figure 2023518032000033
Figure 2023518032000034

実施例１２：腫瘍由来ＨＰＶ４５の検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表１９に、腫瘍由来ＨＰＶ４５の検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＨＰＶ４５ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表１９からの任意の３つのプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。プライマー／プローブセットのＤＮＡは、クエンチャー、色素部分、及びロックド核酸を含むように修飾される。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表１９からの修飾されたプライマープローブセット４、７、及び１０は、腫瘍由来ＨＰＶ４５ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ７はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び１０はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出７はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ１０は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、プライマー／プローブセットは、２つのセットが表１９において連続していないように選択され得る。例示のために、連続したプライマープローブセットを有しないこの実施形態における三つ組の例としては、｛１、３、５｝、｛１、３、８｝、｛４、６、９｝、・・・｛１３、１５、１７｝が挙げられる。連続したプライマープローブセットを有する三つ組の例としては、｛１、２、５｝及び｛１０、１２、１３｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000035
Figure 2023518032000036
Figure 2023518032000037
Figure 2023518032000038

実施例１３：腫瘍由来ＥＢＶの検出のための修飾されたオリゴヌクレオチド組成物及び方法
以下の表２０に、腫瘍由来ＥＢＶの検出のためのプライマー及びプローブを提供し、「＋」は、ロックド核酸を意味する。腫瘍由来ＥＢＶ ＤＮＡは、単一の多重デジタルＰＣＲ反応内で、表２０からの任意の３つの連続したプライマー／プローブセットを使用して、非腫瘍源から検出及び区別することができ、中央プローブは、他の（境界）プローブの両方とは異なる検出色を有する。２つの境界プローブは、同じ色であってもなくてもよい。この実施例では、中央プローブの検出標識に対して陽性であり、境界／遠位プローブの検出標識に対して陰性である液滴は、腫瘍由来ウイルスＤＮＡを含有する。
例えば、表２０からの修飾されたプライマープローブセット４、５、及び６は、腫瘍由来ＥＢＶ ＤＮＡを検出するために多重デジタルＰＣＲ反応に使用することができ、検出プローブ５はＦＡＭにコンジュゲートされ、検出プローブ４及び６はＨＥＸにコンジュゲートされる。代替的に、検出５はＦＡＭにコンジュゲートされ得、プローブ４はＨＥＸにコンジュゲートされ得、プローブ６は、異なる検出部分にコンジュゲートされ得る。
例示のために、３つの連続したプライマープローブセットの例としては、｛１、２、３｝、｛２、３、４｝、｛３、４、５｝、・・・｛１５、１６、１７｝が挙げられる。
本出願の目的のために、デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物が分析のために多くの副反応物に分割される、当業者に理解される任意の方法を指す。分割物は、液滴若しくはマイクロウェル、又はデジタルＰＣＲに使用される任意の他の分割物であり得る。
ＨＥＸ及びＦＡＭは、全ての実施例において、単に明確さ及び例示目的のために使用されることが理解されるべきである。
Figure 2023518032000039
Figure 2023518032000040
Figure 2023518032000041
Figure 2023518032000042
Figure 2023518032000043
Figure 2023518032000044
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定するものではない。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (29)

  1. 対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を検出するための組成物であって、
    ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、
    ＨＰＶ１８について表１５に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセット、
    ＨＰＶ３１について表１６に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセット、
    ＨＰＶ３３について表１７に示されるような１～１５の番号が付けられたプライマー／プローブセット、
    ＨＰＶ３５について表１８に示されるような１～１６の番号が付けられたプライマー／プローブセット、又は
    ＨＰＶ４５について表１９に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、少なくとも三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含み、
    前記三つ組の第１のプライマー／プローブセットが、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、
    前記三つ組の第２のプライマー／プローブセットが、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、
    前記三つ組の第３のプライマー／プローブセットが、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、かつ
    前記最小のセット番号を有する前記三つ組の前記プライマー／プローブセットが、前記第１のプライマー／プローブセットに対応し、前記最大のセット番号を有する前記三つ組の前記プライマー／プローブセットが、前記第３のプライマー／プローブセットに対応する、組成物。
  2. ＨＰＶ１６について表１４に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ１６を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  3. ＨＰＶ１８について表１５に示されるような１～１８の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ１８を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  4. ＨＰＶ３１について表１６に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ３１を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  5. ＨＰＶ３３について表１７に示されるような１～１５の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ３３を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  6. ＨＰＶ３５について表１８に示されるような１～１６の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ３５を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  7. ＨＰＶ４５について表１９に示されるような１～１７の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含む、対象からの試料において腫瘍由来ＨＰＶ４５を検出するための、請求項１に記載の組成物。
  8. 対象からの試料においてエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための組成物であって、ＥＢＶについて表２０に示されるような１～２８の番号が付けられたプライマー／プローブセットから選択される、三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを含み、
    前記三つ組の第１のプライマー／プローブセットが、第１の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、
    前記三つ組の第２のプライマー／プローブセットが、第２の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、
    前記三つ組の第３のプライマー／プローブセットが、第３の増幅産物シグナルを生成するように構成されており、かつ
    前記最小のセット番号を有する前記三つ組の前記プライマー／プローブセットが、前記第１のプライマー／プローブセットに対応し、前記最大のセット番号を有する前記三つ組の前記プライマー／プローブセットが、前記第３のプライマー／プローブセットに対応する、組成物。
  9. 前記三つ組が、２つのプライマー／プローブセットが連続していない、３つのプライマー／プローブセットを含有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記三つ組が、３つの非連続プライマー／プローブセットを含有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  11. ＨＰＶ１６について表１４に示されるような３、５、及び７の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項２に記載の組成物。
  12. ＨＰＶ１８について表１５に示されるような４、７、及び１０の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項３に記載の組成物。
  13. ＨＰＶ３１について表１６に示されるような４、７、及び１０の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項４に記載の組成物。
  14. ＨＰＶ３３について表１７に示されるような４、７、及び１０の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項５に記載の組成物。
  15. ＨＰＶ３５について表１８に示されるような４、７、及び１０の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項６に記載の組成物。
  16. ＨＰＶ４５について表１９に示されるような４、７、及び１０の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項７に記載の組成物。
  17. ＥＰＶについて表２０に示されるような４、５、及び６の番号が付けられたプライマー／プローブセットを含む、請求項３に記載の組成物。
  18. 対象からの試料において腫瘍由来ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、又はＨＰＶ４５を検出するための方法であって、
    請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを提供することと、
    前記試料からの複数のＨＰＶ ＤＮＡ断片を、前記ＤＮＡ断片の０又は１分子のみが各液滴中に存在する濃度で液滴中に分画することと、
    各液滴中のＨＰＶ ＤＮＡを、前記三つ組のプライマー／プローブセットで増幅して、増幅産物シグナルを生成することと、
    各液滴において任意の増幅産物シグナルを検出することと、を含み、
    前記第１又は第３の増幅産物ではなく、前記第２の増幅産物の液滴内での検出が、前記液滴に分画された前記ＨＰＶ ＤＮＡ断片が腫瘍由来ＨＰＶ ＤＮＡ断片であることを示す、方法。
  19. 前記三つ組が、表１４からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ１６を検出する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記三つ組が、表１５からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ１８を検出する、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記三つ組が、表１６からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ３１を検出する、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記三つ組が、表１７からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ３３を検出する、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記三つ組が、表１８からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ３５を検出する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記三つ組が、表１９からの３つのプライマー／プローブセットを含有し、前記方法が、腫瘍由来ＨＰＶ４５を検出する、請求項１８に記載の方法。
  25. 対象からの試料において腫瘍由来エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための方法であって、
    請求項８、９、１０、又は１７のいずれか一項に記載の組成物の三つ組の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー／プローブセットを提供することと、
    前記試料からの複数のＥＢＶ ＤＮＡ断片を、前記ＤＮＡ断片の０又は１分子のみが各液滴中に存在する濃度で液滴中に分画することと、
    各液滴中のＥＢＶ ＤＮＡを、前記三つ組のプライマー／プローブセットで増幅して、増幅産物シグナルを生成することと、
    各液滴において任意の増幅産物シグナルを検出することと、を含み、
    前記第１又は第３の増幅産物ではなく、前記第２の増幅産物の液滴内での検出が、前記液滴に分画された前記ＥＢＶ ＤＮＡ断片が腫瘍由来ＥＢＶ ＤＮＡ断片であることを示す、方法。
  26. 前記ＤＮＡ断片が、乳化によって微小滴に分画される、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＤＮＡが、ＰＣＲベースの方法を使用して増幅される、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記試料が、血液、唾液、うがい液、又は尿試料である、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記試料が、血液試料である、請求項２８に記載の方法。
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