CH654210A5 - Procedimento per ottenere preparati metabolicamente attivi ottenuti da lievito di qualsiasi tipo. - Google Patents

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Description

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RIVENDICAZIONI
1. Procedimento per ottenere un prodotto sterile, apiroge-no, esente da istamina, metabolicamente attivo, in particolare promovente la fosforilazione ossidativa, a partire da lievito di qualsiasi tipo, caratterizzato dal fatto che si sottopone il lievito sotto forma di dispersione acquosa, a un processo di plasmosi e di omogeneizzazione a temperatura inferiore a 0°C, successivamente a un trattamento con enzimi proteolitici, quindi con diamminoossidasi si libera dalle sostanze di tipo istaminico, in seguito mediante aggiunta di una miscela di alcooli mono e poli-valenti si provoca la precipitazione frazionata dalla soluzione delle sostanze proteiche ancora presenti, quindi la soluzione filtrata o centrifugata viene stabilizzata con soluzioni tampone a un pH da 6 a 7 ed infine concentrata a bassa temperatura, sotto vuoto, fino ad avere un contenuto di azoto di almeno 1,4 mg/mi.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nella precipitazione frazionata si impiega una miscela di alcooli comprendente:
a) un alcole alifatico monovalente a 2-6 atomi di C;
b) due o più alcoli polivalenti, eventualmente parzialmente esterificati, contenenti almeno 3 atomi di C senza: contare i gruppi esteri eventualmente presenti, detti alcoli polivalenti essendo in quantità complessiva pari a 0,5*70-30% in peso rispetto all'alcole alifatico monovalente;
c) uno o più alcoli arilalifatici a 7-12 atomi di C, in quantità complessiva corrispondente a0,05%-0,5% rispetto all'alcole alifatico monovalente.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che gli alcoli polivalenti sono scelti tra: glicerina, sorbite, mannite, inosite, bis-acetato di pentaerìtrite.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la sospensione acquosa del lievito di partenza è' addizionata di un agente batteriostatico compatibile con gli impieghi del prodotto finale.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che l'agente batteriostatico è un para-idrossialchil-benzoato.
6. Prodotto ottenuto secondo il procedimento della rivendicazione 1, utile quale principio attivo nella preparazione di composizioni ad attività terapeutica o cosmetica.
Il processo della fosforilazione ossidativa è di fondamentale importanza per tutti gli aspetti della vita cellulare in organismi aerobi, poiché esso rappresenta la sorgente principale dell'energia utilizzabile.
Il fenomeno noto come fosforilazione ossidativa è essenzialmente un processo che si svolge nei condriosomi e che è legato con la formazione di gruppi fosfatici dell'ATP «ad alto livello energetico» attraverso la cessione di energia libera, e dove il trasferimento di energia decorre a stadiì mediante un trasferimento di elettroni nel corso del processo respiratorio. Si intende qui con il termine «ad alto livello energetico» quei composti che possiedono un alto potenziale di trasferimento dei gruppi' (25,1-58,6.KJ mole invece di 12,6-20,9 KJ mole dei normali esteri fosforici).
Sugli inibitori della fosforilazione ossidativa è disponibile una vasta letteratura (disaccoppiamento, effetto Pasteur, antibiotici) mentre non sono noti attivatori della fosforilazione ossidativa: sono noti soltanto estratti di organi dal sangue e dal fegato nei quali tuttavia gli effetti accertabili sono molto modesti e per lo più sono dovuti a sostanze estranee le quali in pratica aumentano il consumo di ossigeno nella respirazione ma non la produzione di ATP da parte della cellula.
Oggetto della presente invenzione è la produzione di preparati attivi del metabolismo intermediano, partendo dal lievito trattato in un adatto modo.
Nella preparazione e nel trattamento dell'estratto di lievito secondo la presente invenzione, il problema fondamentale è costituito dalla separazione dei componenti della cella indesiderati, in quanto in parte esplicano azione di inibizione, senza che gli attivatori, attraverso questo trattamento abbiano a subire danno.
L'operare in ambiente sterile, apirogeno è un presupposto per il processo. Una completa eliminazione delle proteine, incluso l'allontanamento di sostanze del tipo dell'istamina, sono pure una parte essenziale del processo di preparazione.
Il processo di trattamento del lievito secondo la presente invenzione comprende le seguenti operazioni essenziali:
1. Plasmolisi ed omogeneizzazione a temperature inferiori a 0°C .
2. Proteolisi con enzimi proteolitici
3. Trattamento con enzimi atti a scindere i prodotti di tipo istaminico in particolare diamonoossidase
4. Trattamento con alcooli per eliminare le proteine
5. Regolazione del pH
6. Concentrazione sotto vuoto.
Nella fase 1 per ottenere la plasmolisi si effettua un trattamento con acqua e si mantiene poi a temperatura dell'ordine di —20°C per alcuni giorni.
Nella fase 2 vengono usati enzimi proteolitici come pronase, tripsina e pancreas di bue per eliminare le proteine.
La fase 3 consiste nella eliminazione di sostanze di tipo istaminico con diàminoossidase a pH 6,5-8,0.
La precipitazione frazionata con alcooli elimina le proteine residue (fase 4). Si impiega per la precipitazione frazionata una miscela di alcoli mono e poli-valenti comprendente:
a) un alcool alifatico monovalente a 2-6 atomi di C;
b) due o più alcoli polivalenti, eventualmente parzialmente esterificati, contenenti almeno 3 atomi di C (senza contare i gruppi esteri eventuali), presenti complessivamente in una quantità pari a 0,5% h- 30% in peso rispetto all'alcool alifatico monovalente e preferibilmente scelti fra: glicerina, sorbite, mannite, inosite, acetato di pentaeritrite;
c) uno o più alcooli arilalifatici a 7-12 atomi di C, in quantità complessiva corrispondente a 0,05%-0,5% in peso rispetto all'alcole alifatico monovalente.
La regolazione del pH nella soluzione ottenuta dopo allontanamento delle sostanze proteiche insolubilizzate nel trattamento con alcoli della fase 4, viene effettuata mediante soluzioni tampone, a pH 6,5 -s- 7.
Soluzioni tampone idonee sono ad esempio quelle a base di acido citrico, lattico, ascorbico, esamine N-alchilsostituite.
La soluzione a pH stabilizzato viene infine concentrata sotto vuoto a bassa temperatura, dell'ordine di —10°C o anche meno, fino ad avere un contenuto di azoto nel concentrato pari almeno a 1,4 mg/ml (fase 6).
L'eliminazione delle proteine e delle sostanze di tipo istaminico è particolarmente importante quando il prodotto finale è impiegato per composizioni terapeutiche iniettabili.
È necessario aggiungere alla sospensione del lievito di partenza un agente batteriostatico in percentuale compatibile con il prodotto finale da ottenere. Si può usare un qualsiasi agente batteriostatico che sia compatibile con la destinazione finale del prodotto preparato: in particolare sono adatti i para-idrossi-alchilbenzoati.
I preparati attivi ottenuti secondo la presente invenzione hanno una stabilità nel tempo elevatissima che ne consente un uso pratico e conveniente sotto molte forme e con varie modalità di applicazione.
Questi preparati attivi, come si è detto sopra, esplicano una attivazione dei processi di ossidazione metabolici che può essere rappresentata dal «fattore di respirazione». Si è rilevato che
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questo fattore di respirazione per i preparati attivi secondo l'invenzione assume valori da 2,5 a 4. Per confronto si può considerare che tale fattore negli estratti di sangue arriva fino a 1,5 e in quelli di placenta a 1,2.
La determinazione del fattore di respirazione dei prodotti preparati secondo l'invenzione è stata effettuata secondo il metodo Warburg descritto da Kleinzeller A. in «Manometrische Methoden» VEB G. FRISCH Verlag, Jena 1965.
I prodotti preparati secondo l'invenzione, sotto forma di soluzione, metabolicamente attivi, sono praticamente privi di tossicità; la DL nel topo risulta infatti superiore a 20 g/kg.
L'osservazione dei topi trattati, in un intervallo di tempo da 1 minuto a 24 ore, dimostra che tutti i riflessi, il tono, la coordinazione-, l'emozione, le reattività, i riflessi collegati al sistema nervoso centrale non sono affatto alterati rispetto allo stato normale.
I prodotti in questione non provocano irritazione cutanea con i tests normalmente usati secondo «Appraisal of the safety .of chemicals in foods, drugs and cosmetics» dell'F.D.A.
La tossicità cutanea e la irritabilità dell'occhio sono state determinate secondo Draize.
L'assenza di prodotti istaminici viene confermata con il testo del gatto [U.S.P. Pharmacopea XX - pag. 890 (101)].
La somministrazione del prodotto può avvenire per iniezione sia intramuscolare che endoperitoneale, sia endovena, oppure per via orale o anche in forma topica.
La somministrazione per via endovena influisce favorevolmente sui disturbi circolatori in particolare sulla circolazione periferica, complessiva e locale; è particolarmente utile nelle ischemie acute o croniche.
La somministrazione parenterale è particolarmente utile nella rigenerazione delle mucose: ad esempio nel caso di ulcera e nelle ustioni.
L'applicazione del prodotto accelera la formazione dei tessuti nelle operazioni di chirurgia plastica.
Tale effetto si esplica su tutti i tipi di tessuto anche quelli ossei.
Sopprime inoltre l'irritazione dei tessuti dovuta al trattamento con radiazioni a scopo terapeutico.
II prodotto secondo l'invenzione migliora la struttura della pelle e pertanto può trovare utile impiego nella cosmesi.
Nello strato fondamentale dell'epidermide vengono continuamente formate nuove celle che spostano quelle precedentemente formate e le spingono verso l'esterno alla superficie della pelle (desquamazione).
Nella pelle in condizioni normali l'epidermide si rinnova nel corso di un mese e dallo strato fondamentale, dove essa si trova a contatto col derma per l'assunzione di nutrimento, si sposta attraverso lo strato «compatto» verso lo strato «lasso» dove avviene una segregazione. La cellula della pelle in questo processo passa attraverso gli stadi di cellula dello strato granuloso, cellu-5 la dello strato spinoso ed infine di cellula dello strato corneo (cheratinico) la quale è appiattita, essiccata e morta. È stato ora trovato che applicando con energico massaggio sulla pelle il nuovo prodotto alla concentrazione del 4%-5% in una pomata idonea, si ha formazione di un maggior numero di nuove cellu-ìo le da parte del derma con allontanamento dello strato «disgiunto» nello strato fondamentale, le quali cellule sono caratterizzate dal fatto di essere particolarmente idratate, ricche di liquido citoplasmatico e disposte strettamente le une accanto alle altre. Il prodotto è quindi molto utile per applicazioni cosmetiche.
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Esempio
Preparazione dell'estratto di lievito metabolicamente attivo. Come materiale di partenza si impiega lievito delle speci Sac-charomyces ad esempio quello della birra o quello per panifica-20 zione. Il lievito viene miscelato con 5 parti di acqua distillata contenente 0,1% in peso di metil-para-idrossibenzoato, e mantenuto a —20°C per più di 8 giorni. Dopo questo tempo si omogeneizza a —20°C e si riporta il pH al valore di partenza; quindi si sottopone all'azione di enzimi proteolitici a 36,5°C. Si 25 usa tripsina e pancreas di bue, si mantiene a pH 8 e alla suddetta temperatura per un minimo di 70 ore e un massimo di 120 ore. Si separa con metodi convenzionali, ad esempio per filtrazione con letti filtranti o preferibilmente mediante centrifugazione, le proteine non reagite e i residui cellulari. A questo pun-30 to si ottiene una soluzione. Per eliminare da quest'ultima le sostanze di tipo istaminico si tratta con diammino-ossidase a pH 6,2-8,0 fino a scomparsa dei composti istaminici.
Quindi si sottopone la soluzione ad una precipitazione frazionata mediante aggiunta di una miscela di alcoli per eliminare 35 le proteine residue.
Detta miscela è costituita da: etanolo 10 parti peso, glicerina 0,2 parti peso, alcole fenil-propilico 0,001 parti peso, alcool benzilico 0,02 parti peso, acetato di pentaeritrite 0,0005 parti peso.
40 Si filtra, o centrifuga, a precipitazione ultimata, e la soluzione viene portata a pH 7 con un tampone a base di acido citrico o ascorbico o lattico e N-alchilglucamina.
Si procede quindi alla concentrazione a —15°C e sotto vuoto di 133-2666 Pa (1 20 mm Hg) fino a raggiungere una con-45 centrazione di azoto di 1,4 mg/ml nel preparato finale.
Quest'ultimo si presenta come soluzione stabile nel tempo che presenta un fattore di respirazione di almeno '3,5-4.
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