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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Probenmaterial
in einem Probengefäß durch
zeitlich aufeinander folgende Temperaturwechsel, wobei in kühlenden
Streckenabschnitten tiefere Temperaturen herrschen als die für das Probenmaterial
angestrebte Temperatur und in wärmenden
Streckenabschnitten höhere
Temperaturen herrschen als die für
das Probenmaterial angestrebte Temperatur, sowie eine Vorrichtung.
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Insbesondere
ist die Erfindung auf Zyklen-Verfahren (Cycler) zur Amplifikation
von DNA-Templates auf dem Gebiet der Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR-Polymerase chain reactions) gerichtet und zwar bei einer Konzentration
unter der Nachweisgrenze, dies erfordert eine wiederholte Brutreaktion
des Ausgangsmaterials zwischen bestimmten Temperaturpegeln.
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Verfügbare PCR-Technologien
produzieren erst nach ca. 30 bis 120 Minuten nachweisfähiges Material.
Für ein
heutiges Testaufkommen (hoher Durchsatz, z.B. Reihenuntersuchungen)
ist die Dauer verhältnismäßig lang.
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Aus
der
EP 0 488 769 A2 bzw.
der entsprechenden
US
5475610 A ist bereits ein System zur automatischen Durchführung von
polymerasen Kettenreaktionen (PCR) bekannt, bei der Proberöhrchen, die
ein bekanntes Volumen von Probenflüssigkeit enthalten, in einer
Ausnehmung eines Probenblocks eingesetzt werden, welcher Erwärmungs-
und Kühleinrichtungen
enthält;
ein Temperatursensor ist dabei thermisch mit dem Probenblock gekoppelt;
der Temperatursensor ist mit einem als Regler dienenden Rechner
verbunden, welcher für
eine Zeitplanregelung der Temperatur im Probenblock sorgt. Dabei speichert
der Rechner die thermischen Zeitkonstanten der Proberöhrchen und
gemischten Volumina bzw. thermische Zeitkonstanten des Blocktemperatursensors;
vom Benutzer wird ein Zeitplantemperaturprofil eingegeben, welches
Steuersignale im Hinblick auf eine Standard-Mikrotiterplatte vorgibt.
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Als
vorteilhaft erweist sich nach der
EP 0 488 769 A2 die gleichzeitige Durchführung von
polymerasen Kettenreaktionen (PCR) mit einem hohen Grad von Präzision,
um damit DNA zu vervielfältigen.
Dabei wird eine sehr exakte Temperaturregelung der Probenmischung
sichergestellt, wobei die Reaktionszeiten, sofern erforderlich,
reduziert werden. Die Vorrichtung kann somit die Zeit, die üblicherweise
für PCR
erforderlich ist, verringern und ermöglicht niedrigere Reagenzkosten
durch Verwendung von kleinen PCR-Volumina.
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Als
problematisch erweist sich ein erwünschter rascher Temperaturwechsel
solcher ortsfesten Probegeräte
durch zyklische Änderung
der Umgebungstemperatur der Gefäße, z.B.
im Metallblock oder in Luft. Hierzu offenbart die
US 5455175 A eine Kammer,
in die die Proben in dünnwandigen
Kapillaren eingebracht werden. Mit Hilfe eines Ventilators können große Mengen
an Umgebungsluft in kurzer Zeit zur Abkühlung der Proben durch die
Kammer geleitet werden. Der dadurch erzielte schnelle Wärmeabtransport
ermöglicht
ein verhältnismäßig schnelles Abkühlen der
Proben, allerdings setzt dieses Verfahren einen erheblichen apparativen
Aufwand voraus. Weiterhin verursachen Wärmebäder mit wechselnden Temperaturen
in Form von Metallblöcken
inhomogene Temperaturverteilungen, die die Prozessqualität des Probengutes
verschlechtern. Die
DE 19519015
C1 führt
dazu einen in Mikrosystemtechnik gefertigten Probenaufnahmekörper an,
der eine Vielzahl von Probenkammern aufweist, die derart ausgebildet
sind, daß wenigstens
eine der Probenkammerwandungen gut wärmeleitend jedoch massearm
ausgebildet ist. Alternativ sind der
US 5720923 A , der
DE 4435107 C1 und der WO
96/30124 A1 Anordnungen zu entnehmen, in denen das Probengut zwischen verschiedenen
Temperaturzonen hin- und herbewegt wird.
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Alle
Ansätze
haben allerdings den Nachteil, daß die Temperatur jeder Wärmezone
der entsprechenden Solltemperatur der Probe entspricht. Eine Angleichung
der Probentemperatur an die Temperatur der jeweiligen Temperaturzone
verläuft
daher entsprechend langsam. Dies bedingt lange Verweildauern der
Proben in jeder Temperaturzone und verlängert letztendlich die benötigte Zeitspanne
zum Durchlaufen eines Zyklus.
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Die
Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Zyklusdauer zu verkürzen, damit
nachweisbare Konzentrationen in besserer Qualität und in kürzerer Zeit erhalten werden
können.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch das Verfahren gemäß Anspruch
1.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird das Probenmaterial
kontinuierlich durch das Probengefäß geführt.
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In
einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird das Probenmaterial
diskontinuierlich durch das Probengefäß geführt.
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In
einer weiteren Ausgestaltung wird das Probenmaterial entsprechend
der Anzahl angestrebte Temperaturwechsel periodisch vor- und zurück getrieben.
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Das
Probenmaterial wird durch ein Pumpsystem getrieben; vorzugsweise
wird der zum Umlauf der Probe erforderliche Vortrieb durch einen schlauchpumpenartigen
Antrieb sichergestellt.
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Vorteilhafterweise
ist wenigstens ein Teil des Probenmaterials entlang seines Streckenabschnitts gesehen
aufgrund der Kapillarität
des als Röhrchen ausgebildeten
Streckenabschnitts von einem Gaspolster, insbesondere von einem
Luftpolster, umgeben.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Als
vorteilhaft erweist sich, daß das
Probenmaterial eine Röhre
durchströmt,
deren Wände
fest vortemperiert sind. Durch die Verweildauer im jeweiligen Streckenabschnitt
stellt sich die Probentemperatur schnellstmöglich ein. Somit können die
Temperaturwechsel rascher erfolgen, woraus sich vorteilhafterweise
eine Verkürzung
der Gesamtreaktionszeit ergibt.
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Die
Aufgabe wird außerdem
durch die Vorrichtung gemäß Anspruch
6 gelöst.
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Hierbei
erweist es sich als vorteilhaft, daß die Heizrate durch geeignete
Wahl des Leitungsmaterials, des Leitungsquerschnitts (Rohrquerschnitt
des Strömungskanals),
der Heiztemperatur der Leitungsquerschnitte und der Fließgeschwindigkeit
optimiert werden kann.
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In
einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ist als Kanal
eine Röhre
vorgesehen, deren Wände
eine fest vorgegebene bzw. fest einstellbare Temperatur aufweisen.
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In
einer ersten vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ist der
Strömungskanal
als lineare Anordnung mit Streckenabschnitten unterschiedlicher
Temperatur ausgebildet.
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In
einer zweiten vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ist der
Strömungskanal
als Ring mit Streckenabschnitten unterschiedlicher Temperierung ausgebildet,
wobei der Strömungskanal
mit einem verschließbaren
Ein- und Auslaßstutzen
versehen ist.
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In
einer dritten vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ist der
Strömungskanal
als Spirale mit unterschiedlich temperierten Streckenabschnitten
ausgebildet.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Es
erweist sich als vorteilhaft, daß das Probenvolumen in der
Röhre beidseitig
durch Luft begrenzt (diskretes Temperaturprofil) wird, so daß auf eine
Trennflüssigkeit,
die Wärmeverluste
und Temperatur-Inhomogenitäten mit
sich bringt, verzichtet werden kann. Bei einem Probevolumen von
ca. 50 μl
und einem inneren Rohrdurchmesser von 1,5 mm ergibt sich eine Streckenlänge von
ca. 28 mm für
das Probenmaterial. Die Trennung zwischen Luft und Probevolumen
erfolgt durch Meniskusbildung aufgrund der Kapillarkraft; dabei
wird der Vortrieb des Probenvolumens durch ein Pumpsystem (gasförmig oder
flüssig) erzeugt,
vorzugsweise durch einen schlauchpumpenähnlichen Antrieb. Die Durchlaufgeschwindigkeit des
Probenmaterials liegt im Bereich von 35 bis 45 mm/s, vorzugsweise
bei 40 mm/s. Reagenzien werden vor Prozeßbeginn in das Röhrensystem
eingebracht. Eine Prozeßüberwachung
ist bei allen Ausführungen
auf optischem Wege in situ möglich
(z. B. Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe).
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Die
gewünschten
kurzen Prozeßzeiten
werden erreicht durch eine Erhöhung
der Heizrate, durch eine geeignete Wahl des Leitungsmaterials, des
Leitungsquerschnitts, der Heiztemperatur, der Leitungsabschnitte
und der Fließgeschwindigkeit
(d.h. die Temperaturwechsel erfolgen schneller); die Brutreaktion
reduziert sich dabei auf zwei Temperaturpegel, damit geht eine weitere
Erhöhung
der Reaktionsgeschwindigkeit einher, wobei eine Verkürzung der
Gesamtreaktionszeit erzielt wird. Schnelle Temperaturwechsel garantieren
eine Prozeßreaktion
bei der optimalen Temperatur ohne Qualitätseinbußen; dies führt zur Vermeidung von Temperaturinhomogenitäten, da
die Temperatur der einzelnen Temperaturabschnitte nicht verändert wird;
dadurch fällt
auch die Wärmekapazität des Gefäßes als
limitierende Größe für den Wärmeaustausch
weg. Vorteilhafterweise ergibt sich somit die Möglichkeit des parallelen Brütens ganzer
Probenreihen durch Kombination mehrerer Probengefäße. Das
Leitungssystem wird vorzugsweise als Einmalprodukt eingesetzt, so
daß später folgende
zeitaufwendige Reinigungsschritte entfallen.
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Im
folgenden ist der Gegenstand der Erfindung anhand der 1a, 1b, 1c, 2, 3, 4a, 4b, 5, 6a und 6b näher erläutert.
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Dabei
zeigt 1a, 1b, 1c schematisch
einen Probenlauf mit einem Beispielzyklus mit zwei Temperaturen
T1 und T2, wobei in 1a ein Probenkanal entlang einer
Strecke mit Streckenabschnitten unterschiedlicher Temperatur gezeigt
ist, während
in 1b das Temperaturniveau in Abhängigkeit von den Streckenabschnitten
dargestellt ist; 1c zeigt den Einsatz von Wärmeaustauschern.
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2 zeigt
eine ringförmige
Röhrchenstrecke
mit drei Segmenten bzw. Sektoren unterschiedlicher Temperaturen,
wobei das Probenmaterial die Ringanordnung mehrfach durchlaufen
kann.
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3 zeigt
eine spiralförmige
Röhrchenanordnung,
die um einen zylinderförmigen
Wärmeblock mit
zwei unterschiedlich temperierten Segmentabschnitten angeordnet
ist, wobei das Probenmaterial kontinuierlich vorgetrieben wird.
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4a zeigt
schematisch einen Röhrchenabschnitt
mit zwei unterschiedlichen Temperaturen, wobei das Probenvolumen
entlang der Rohrachse Z periodisch vor- und zurückgeschoben wird
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4b stellt
schematisch die Streckenabschnitte für die periodische Verschiebung
dar.
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5 zeigt
einen Streckenabschnitt mit Wärmetauscher
und Schlauchpumpe.
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6a und 6b zeigen
jeweils einen mäanderförmigen Durchlauf
von Proben durch unterschiedliche Temperaturbereiche, die mit T1
und T2 bezeichnet sind und vorzugsweise als Wärmebäder ausgebildet sind.
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Gemäß 1a durchströmt Probenmaterial 1 eine
als Röhre
bzw. Kanal ausgebildete Strecke 2, die Streckenabschnitte 3, 4, 5 aufweist,
welche mit T1 und T2 bezeichnete Temperaturbereiche aufweisen, die
ein unterschiedliches Temperaturniveau enthalten. Das Probenmaterial 1 wird
dabei entlang der mit Z bezeichneten Rohrachse zunächst in
den ersten Streckenabschnitt 3 mit der Temperatur T1 geführt, wobei
die Verweildauer der Probe von der Geschwindigkeit V abhängig ist,
mit der die Probe entlang der Rohrachse Z geführt wird. Dabei ist es möglich, je
nach Probevolumen die Verweildauer in den einzelnen Streckenabschnitten 3, 4 und 5 unterschiedlich
zu gestalten.
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In 1b ist
das entlang der Rohrachse Z wirkende Temperaturprofil eingetragen.
Hier ist erkennbar, daß das
Probenmaterial bis zum Erreichen des Punktes Z1 lediglich der Raumtemperatur
unterworfen ist. Im Bereich zwischen den Punkten Z1 und Z2, d.h.
im Streckenabschnitt 3 wirkt das verhältnismäßig hohe Temperaturniveau T1
auf das Probenmaterial ein, wobei jedoch die Temperatur T1 oberhalb
der angestrebten Probentemperatur für den Streckenabschnitt 3 liegt;
im Streckenabschnitt 4 wirkt Temperatur T2 auf Probe ein,
wobei diese Temperatur oberhalb der Raumtemperatur jedoch unterhalb
der Temperatur T1 liegt, so daß die
Probe zwischen den Punkten Z2 und Z3 nur geringfügig aufgeheizt wird; dies bedeutet,
daß die
Temperatur der Probe 1 im Punkt Z3 unterhalb der von Punkt Z2 liegt. Im
dritten Streckenabschnitt 5 wirkt dagegen wiederum Temperatur
T1 auf Probe ein, so daß die
Probe im Bereich zwischen Z3 und Z4 wieder erwärmt wird, wobei sich an Zeitpunkt
Z4 wiederum Temperaturniveau T2 anschließen kann.
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1c zeigt
schematisch die rohrförmig ausgestaltete
Strecke 2, welche in den Abschnitten 3 und 5 jeweils
von einem Wärmetauscher 6 und 8 muffenförmig umgeben
ist, die durch ein Strömungsmittel
auf hohem Temperaturniveau (T1) mittels Rohrleitungssystem 9 durchströmt werden,
wobei das Rohrleitungssystem 9 direkt oder indirekt mit
einer Wärmequelle
verbunden ist. Der Streckenabschnitt 4 weist dagegen Wärmetauscher 7 auf,
der eine verhältnismäßig niedrige
Temperatur (T2) auf die Probe 1 einwirken läßt; auch
hier ist Rohrleitungssystem 10 mit einer Wärmequelle
verbunden, welche für
die Aufrechterhaltung der Temperatur T2 im Streckenabschnitt 4 sorgt.
Dabei ist es selbstverständlich möglich, an
Streckenabschnitt 5 weitere Streckenabschnitte beispielsweise
wechselweise mit einem Temperaturniveau T2, T1 usw. anzuschließen, so daß die Probe 1 in
verhältnismäßig kurzer
Zeit eine Vielzahl von Temperaturzyklen durchläuft, in dem sie entlang der
Rohrachse Z bewegt wird.
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Der
Antrieb der Probenflüssigkeit
erfolgt vorzugsweise durch eine Schlauchquetschpumpe bzw. eine peristaltische
Schlauchpumpe, wie sie beispielsweise aus der
DE 24 25 165 C2 bekannt
ist.
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Auch
anhand der nachfolgend 5 ist eine solche Schlauchquetschpumpe
näher erläutert.
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Neben
einer rein linearen Anordnung mit wechselnden Temperaturabschnitten
entsprechend einem kontinuierlichen Vortrieb gemäß den 1a bis 1c ist
es auch möglich,
eine ringförmige
Anordnung mit temperierten Sektorenabschnitten, einem verschließbaren Ein-
und Auslaßstutzen
sowie mit einem kontinuierlichen Vortrieb einzusetzen; dabei sind
die Streckenabschnitte 3', 4', 5' auf unterschiedliche
Temperaturen T1, T2, T3 – ähnlich wie bei
den aus den 1a bis 1c bekannten
Streckenabschnitten – eingestellt,
wobei auch hier eine Temperierung durch äußere Wärmetauscher erfolgt.
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Wie
anhand 2 zu erkennen ist, durchläuft die Probe somit einen Streckenabschnitt 3' mit einem verhältnismäßig hohen
Temperatur T1, anschließend
durchläuft
sie den sektoralen Streckenabschnitt 4', in dem das gegenüber T1 niedrigere
Temperaturniveau T2 herrscht, anschließend durchläuft Probe 1 Streckenabschnitt 5', in dem ein
neues Temperaturniveau T3 herrscht, dessen Temperatur beispielsweise
zwischen T1 und T2 liegt. Nach Durchlaufen von Streckenabschnitt 5' ist es möglich, das Probenmaterial über einen
verschließbaren
Ein-Auslaß 13 zu
entnehmen; als besonders zweckmäßig erweist
es sich bei einer solchen Ringanordnung jedoch, die Streckenabschnitte
von der Probe 1 mehrfach durchlaufen zu lassen, so daß eine wiederholte Brutreaktion
des Ausgangsmaterials erfolgt. Nachdem der Prozeß der thermischen Behandlung
abgeschlossen ist, wird der Ein-Auslaß 13 geöffnet und die
Probenflüssigkeit
entnommen. Der zum Umlauf der Probe 1 erforderliche Vortrieb
wird durch einen schlauchpumpenartigen Antrieb gewährleistet.
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Ein
wesentlicher Vorteil der Ausgestaltung nach 2 ist darin
zu sehen, daß insgesamt
die kürzeste
mögliche
Gesamtstrecke gewählt
werden kann, so daß hinsichtlich
Materialkosten (Einmalprodukt), Kompaktheit und Handhabbarkeit (die
Röhre wird
in einen stationären
Wärmeblock
eingesetzt), ein Optimum erreicht werden kann. Außerdem sind hierbei
die Anforderungen an das Pumpsystem am geringsten, da die kürzesten
Wegstrecken zurückgelegt
werden müssen.
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3 zeigt
schematisch eine Spiralanordnung der Strecke 2 für das Probenmaterial,
wobei die einzelnen Streckenabschnitte als Spiralanordnung um einen
zylinderförmigen
Wärmeblock
mit zwei unterschiedlich temperierten Segmenten angeordnet sind;
die Zahl der Wicklungen entspricht der Anzahl der Zyklen. Diese
Anordnung ist nur für
den kontinuierlichen Vorwärtsbetrieb
geeignet, wobei die Probe auf den verschieden temperierten Halbzylindern 15, 16 jeweils
die Temperaturprofile T1 und T2 nacheinander durchläuft und
zwar so oft, wie sich Windungen auf dem Zylinder befinden. Hier
erweist es sich als besonders vorteilhaft, daß bei Einrichtung mehrerer Temperaturbereiche
die nötige
Zyklenzahl bei kontinuierlichem Vortrieb in gleicher Richtung durch
die Anzahl der Windungen eingestellt wird und nicht durch eine wiederholte
Anordnung der Temperaturbereiche.
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4a zeigt
Probenmaterial 1 in einer Strecke 2, die aus zwei
Streckenabschnitten 3', 4' besteht, wobei
jeder Streckenabschnitt ein unterschiedliches Temperaturniveau mit
den Temperaturen T1 und T2 aufweist, wie sie bereits anhand der 1 erläutert
sind. Die Probe 1 wird als Probenvolumen in der als Röhre ausgebildeten
Strecke 2 beidseitig durch Luft begrenzt, wobei der Vortrieb
des Probenvolumens bzw. seine Rückführung durch
ein Pumpensystem mit gasförmigem
oder flüssigem
Medium erfolgt. Bei der linearen Anordnung gemäß 4a wird
die Probe 1 durch einen Schlauchpumpenantrieb periodisch
vor- und zurückgefahren,
so daß sie wechselweise
den beiden Streckenabschnitten mit jeweils unterschiedlichem Temperaturniveau
T1 und T2 ausgesetzt ist.
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4b stellt
symbolisch den Verschiebungsbereich für das Probenmaterial 1 dar,
wobei die Probe gemäß dem oberen
Teil der 4b sich im Streckenabschnitt 3' befindet, während sie
im unteren Teil der 4b in den Streckenabschnitt 4' verschoben
ist. Das Probenmaterial ist dabei entlang der Z-Achse gesehen stets
von einem Luftvolumen 21, 22 umgeben, das ebenfalls
periodisch hin- und hergeschoben wird und etwa die gleiche Streckenlänge wie
das Probenmaterial aufweist.
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Dies
bedeutet, daß für die periodische
Verschiebung ein Streckenabschnitt von der vierfachen Streckenlänge des
Probevolumens erforderlich ist.
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Ein
wesentlicher Vorteil der Ausgestaltung nach 4a und 4b ist
auch darin zu sehen, daß hier
die kürzeste
mögliche
Gesamtstrecke gewählt
werden kann, so daß hinsichtlich
Materialkosten (Einmalprodukt), Kompaktheit und Handhabbarkeit (die
Röhre wird
in einen stationären
Wärmeblock eingesetzt),
ein Optimum erreicht werden kann. Außerdem sind hierbei die Anforderungen
an das Pumpsystem am geringsten, da die kürzesten Wegstrecken zurückgelegt
werden müssen.
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Darüber hinaus
erweist es sich außerdem
als vorteilhaft, daß dieses
System sowohl geschlossen, d.h. versiegelt, als auch offen, mit
einem Flüssigkeitsabschluß zur Vermeidung
von Kontaminationen, ausgeführt
werden kann.
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5 zeigt
eine Anordnung mit Schlauchpumpenantrieb, bei welcher die als Schlauch
bzw. Röhre
(Leitung) ausgebildete Strecke 2 teilweise von einem Temperaturbad 19 umgeben
bzw. seitlich umschlossen ist, so daß die durch Strecke 2 geführte Probe
mit Hilfe eines Schlauchkolbens 18 durch die Röhre und
damit die zur Temperierung vorgesehene Umgebung gepumpt wird.
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6a zeigt
einen mäanderförmigen Durchlauf
durch die unterschiedlichen Temperaturbereiche T1, T2 in Form von
ausgedehnten Wärmebädern 19, 19', die durch
eine Wärmeleitsperre 20 voneinander abgegrenzt
sind; gemäß 6a durchläuft die
Strecke 2 des Probenmaterials einen Temperierungsbereich,
dessen Temperaturen zwischen T1 und T2 variieren. Die jeweilige
Verweildauer ergibt sich aus der Länge der einzelnen Schlaufen
der Strecke 2. Die Probe wird bei kontinuierlichem Vorwärtslauf
periodisch dem jeweiligen Temperaturniveau T1, T2, T1 usw. ausgesetzt.
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Die
Probe erfährt
dabei einen periodischen Temperaturwechsel analog zu 1b,
wobei die Zahl der Temperaturwechsel der Zahl der mäanderförmigen Schlaufen
entspricht.
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6b zeigt
eine Anordnung mit drei räumlich
getrennten temperierenden Bereichen T1, T2, T1 mit Wärmebädern 19', 19, 19', die jeweils
durch eine Wärmeleitsperre 20 voneinander
abgegrenzt sind; diese werden ebenfalls von der das Probenmaterial führenden
Strecke 2 mäanderförmig durchströmt, so daß die Probe
zunächst
bei ihrem Eintritt T1, dann T2, dann T1, dann wiederum T2, dann
T1 usw. durchläuft.
Somit werden während
eines Durchlaufs durch eine Schlaufe der Strecke 2 eineinhalb
Zyklen aus 1b durchlaufen.
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Die
Ausgestaltungen nach den 2, 3, 4a, 4b, 6a und 6b,
bei denen das Probenvolumen immer wieder das gleiche Temperaturbad
durchläuft,
haben den Vorteil, daß bei
jedem Zyklus exakt die gleichen Temperaturbedingungen herrschen.
Dies ist wichtig für
die Qualität
des Endprodukts.
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Bei
allen Ausgestaltungen der Erfindung kann der Vortrieb direkt im
Einmalprodukt erfolgen (z.B. durch Quetschen der Verbrauchsteile
selbst mit einer Schlauchpumpe), als auch durch Ankopplung der Einmalprodukte
an ein Pumpsystem durch geeignete Schlauchverbindungen.