DE69408304T2

DE69408304T2 - Lipid-polymer konjugate und liposomen

Info

Publication number: DE69408304T2
Application number: DE69408304T
Authority: DE
Inventors: Lasic Danilo D. Newark Ca 94560 Lasic Danilo D.; Francis J. San Francisco Ca 94127 Martin; Martin C. Menlo Park Ca 94025 Woodle; Samuel Fremont Ca 94555 Zalipsky
Original assignee: Sequus Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1994-03-02
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2014-03-03
Also published as: JP3066437B2; US5631018A; JPH08507523A; ES2114186T3; AU6357594A; EP0688207A1; ATE162710T1; WO1994020073A1; CA2156901A1; CA2156901C; US5395619A; DE69408304D1; EP0688207B1; DK0688207T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lipid-Polymer-Konjugat und die Verwendung desselben in Liposomen.

Literaturstellen

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Hintergrund der Erfindung

Liposome können als vielseitige Arzneimittelträger im Blutstrom verwendet werden. Da sie sowohl einen inneren wässerigen Abschnitt als auch eine äußere lipophile Hülle umfassen, können die Liposome sowohl mit wasserlöslichen als auch mit lipidlöslichen Arzneimitteln beladen werden. Da die Liposome aus natürlichen biochemischen Lipiden, wie etwa Phospholipiden und Cholesterin, gebildet werden können, können sie vom Körper ohne toxische Nebenwirkungen abgebaut werden (Poznansky).
Bis vor kurzem war die Möglichkeit der Verwendung von Liposomen als Arzneimittelträger durch die rasche Auscheidung der Liposome aus dem Blutstrom begrenzt. Zum Beispiel können übliche Liposome innerhalb von 1-2 Stunden nach intravenöser Verabreichung weitgehend aus dem Blutstrom ausgeschieden werden (Saba).
Es wurden zahlreiche Wege zur Verlängerung der Zirkulationszeit von Liposomen vorgeschlagen. Zwei derselben konnten erfolgreich eine Verlängerung der Halbwertszeit von Liposomen im Blutstrom um Zeiträume von bis zu 40-50 Stunden erreichen. Bei einem dieser Wege, der in dem Patent Nr. 4,837.028 des gleichen Inhabers beschrieben ist, werden die Liposome mit dem Gangliosid GM1 und überwiegend steifen Lipiden formuliert. Bei einem anderen allgemeinen Weg, der in dem Patent Nr. 5,013.556 des gleichen Inhabers geoffenbart ist, werden die Liposome mit einer Schicht aus Polyethylenglycol(PEG)-Ketten beschichtet.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein allgemeines Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Lipid-Polymer-Konjugate zur Verwendung bei der Herstellung von Liposomen mit langen Zirkulationszeiten im Blutstrom zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, solche lang zirkulierende Liposome zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung umfaßt gemäß einem Aspekt ein Lipid-Polymer-Konjugat, das in Liposome eingebaut werden kann. Das Konjugat inkludiert (i) ein vesikelbildendes Lipid mit einer polaren Kopfgruppe und (ii) eine kovalent an die Kopfgruppe gebundene Polymerkette, die ein Polyvinylpyrrolidon-, Polyvinylmethylether-, Polyhydroxypropylmethacrylat-, Polyhydroxypropylmethacrylamid-, Polyhydroxyethylacrylat-, Polymethacrylamid-, Polydimethylacrylamid-, Polymethyloxazolin-, Polyethyloxazolin-, Polyhydroxyethyloxazolin-, Polyhydroxypropyloxazolin- oder Polyaspartamid-Polymer oder eine solche Polymer-Region enthält. Die Polymerkette ist dadurch gekennzeichnet, daß sie in freier Form in Wasser bei Raumtemperatur zu mindestens 5 % (Gew./Vol.) und in Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid und/oder Methylenchlorid bei Raumtemperatur zu mindestens etwa 0,5 % (Gew./Vol.) löslich ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Polymerkette ein Homopolymer eines der angegebenen Polymeren, bevorzugter ein Homopolymer von Polyvinylpyrrolidon, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin oder Polyhydroxypropylmethacrylamid.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer ein Blockcopolymer eines der angegebenen Polymere mit Polyethylenglykol (PEG).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer ein statistisches Copolymer, das aus Vinylpyrrolidon und einem anderen Monomer gebildet ist, wie etwa aus Vinylacetat oder Acrylamid.
Die oben angegebenen Lipid-Polymer-Konjugate können endstellige Funktionen aufweisen, um die Anbindung von therapeutsch wirksamen Verbindungen an das Konjugat zu ermöglichen.
Gemäß einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Liposoms, das durch eine verlängerte Blutzirkulationszeit gekennzeichnet ist. Das Verfahren inkludiert die Zugabe zu vesikelbildenden Lipiden von 1-30 Molprozent eines Lipid-Polymer-Konjugates und einer pharmazeutischen Verbindung zur Bildung von Liposomen, die vesikelbildende Lipide, das Lipid-Polymer-Konjugat und die pharmazeutische Verbindung in eingeschlossener Form enthalten, worauf Größensortierung der Liposome auf eine ausgewählte Größe im Größenbereich zwischen etwa 0,05 bis 0,2 Mikron erfolgt.
Liposome, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, haben charakteristische Oberflächeneigenschaften. Zum Beispiel ist die Liposomoberflächenladung abgeschirmt. Die Abschirmung der Ladung wird durch eine Reduktion der elektrophoretischen Mobilität der Liposome gemessen. Herabgesetzte Mobilität zeigt sich in einer Reduktion des Zeta-Potentials der Liposome.
Die elektrophoretische Mobilität von Liposomen, die das Lipid-Polymer-Konjugat enthalten, wird mit der von gleichen Liposomen verglichen, in welchen Phosphatidylglyzerin anstelle des Lipid-Polymer-Konjugates vorliegt. Sowohl das Lipid-Polymer-Konjugat als auch das Phosphatidylglyzerin tragen zu einer negativen Ladung der Liposom oberfläche bei, sodaß die Liposompräparate die gleiche Netto-Oberflächenladung aufweisen. Jedoch ist die elektrophoretische Mobilität der Liposome, die das Lipid-Polymer Konjugat enthalten, im Vergleich zu den Liposomen, die das Phosphatidylglyzerin enthalten, herabgesetzt.
Diese und andere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden deutlicher hervortreten, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung gemeinsam mit den angeschlossenen Zeichnungen studiert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 erläutert ein Synthesereaktionsschema zur Polymerisation von Vinylpyrrolidon;
Fig. 2 erläutert ein Synthesereaktionsschema zur Polymerisation von 2-Methyloxazolin;
Fig. 3 erläutert ein Reaktionsschema zur Synthese von Polyaspartamid;
Fig. 4 erläutert ein Synthesereaktionsschema zur statistischen Copolymerisation von Vinylpyrrolidon und Methylacrylat-Monomeren;
Fig. 5 erläutert ein Synthesereaktionsschema für ein Blockcopolymer mit Polyvinylpyrrolidon- und Polyethylenglycol-Segmenten;
Fig. 6 erläutert die Kopplung von Polyvinylpyrrolidon an ein Phospholipid durch Verwendung von N-Hydroxysuccinimid; und
Fig. 7 erläutert die Umwandlung der endständigen Hydroxylgruppe des Polymethyl oxazolins in eine Carbonsäuregruppe und die Kopplung des Polymers an ein Phospholipid mit Hilfe dieser Carboxylgruppe.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

I. Definitionen

Wenn nicht anders angegeben, haben die folgenden Ausdrücke die folgenden Definitionen:
"Homopolymere" sind Polymere, die in ihrer Zusammensetzung ein Monomer aufweisen.
"Copolymere" sind Polymere, die mehr als eine Art von Monomer in ihrer Zusammensetzung aufweisen. Copolymere können Blockcopolymere oder statistische Copolymere sein. Blockcopolymere enthalten alternierende Blöcke (Segmente) verschiedener Homopolymerer. Statistische Copolymere enthalten statistische Sequenzen von zwei oder mehreren Monomeren.
Der Ausdruck "vesikelbildendes Lipid" soll jedes amphipathische Lipid mit einer hydrophoben Gruppierung und einer polaren Kopfgruppe umfassen, welches (a) aus sich selbst heraus in Wasser spontan zweischichtige Vesikel bilden kann, wie beispielhaft bei Phospholipiden der Fall ist, oder (b) stabil in Lipid-Doppelschichten gemeinsam mit anderen amphipathischen Lipiden eingebaut ist, wobei seine hydrophobe Gruppierung mit der inneren, hydrophoben Region der doppelschichtigen Membran in Kontakt ist und seine polare Kopfgruppe in Richtung zu der äußeren polaren Oberfläche der Membran orientiert ist.
Ein Polymer ist in Wasser "löslich", wenn das Polymer (entweder ein Homopolymer oder ein Copolymer) bei Raumtemperatur bei einer Polymergröße zwischen etwa 20 bis 150 Untereinheiten zu mindestens 5 Gew.-% löslich ist.
Ein Polymer ist in einem polaren organischen Lösungsmittel, das Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid und/oder Methylenchlorid sein kann, "löslich", wenn das Polymer (entweder ein Homopolymer oder ein Copolymer) bei Raumtemperatur und bei einer Polymergröße zwischen etwa 20 bis 150 Untereinheiten zu mindestens 0,5 Gew.-% löslich ist.

II. Herstellung des Polymer-Lipid-Koniugates

Das Lipid-Polymer-Konjugat gemäß der Erfindung inkludiert (i) ein vesikelbildendes Lipid mit einer polaren Kopfgruppe und (ii) eine kovalent an die Kopfgruppe gebundene Polymerkette mit ausgewählten Löslichkeitseigenschaften, wie sie weiter unten beschrieben sind. Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Konjugates.

A. Vesikelbildendes Lipid

Die vesikelbildenden Lipide, die in dem Lipid-Polymer-Konjugat zur Herstellung der erfindungsgemäßen Liposome verwendet werden, können aus einer Vielzahl synthetischer vesikelbildender Lipide oder natürlich vorkommender vesikelbildender Lipide ausgewählt werden. In der Regel können diese Lipide Phospholipide, Sphingolipide und Sterole umfassen.
Ein wesentliches Merkmal des vesikelbildenden Lipids, das in dem Lipid-Polymer Konjugat verwendet wird, besteht darin, daß das Lipid an seiner polaren Kopfgruppe eine chemische Gruppierung enthält, die zur kovalenten Bindung einer Polymerkette befähigt ist. Die polare Kopfgruppe kann zum Beispiel eine Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Aldehydgruppe oder eine Carbonsäuregruppe enthalten.
Zusätzlich dazu ist das vesikelbildende Lipid des Lipid-Polymer-Konjugates so ausgewählt, daß ein spezielles Ausmaß an Fluidität oder Rigidität erreicht wird, um die Stabilität der Liposome im Serum zu steuern und die Freigabegeschwindigkeit von eingeschlossenen Arzneimitteln aus Liposomen in den Blutstrom zu kontrollieren. Diese Lipide können auch hinsichtlich ihrer Lipid-Hydrierungseigenschaften ausgewählt werden, um die gewünschten Eigenschaften des Liposompräparates zu erreichen. Es ist zum Beispiel im allgemeinen der Fall, daß Lipide mit höherer Fluidität leichter durch Extrusion zu formulieren und größenmäßig auszuwählen sind, als steifere Lipid-Bestandteile.
Eine bevorzugte Ausführungsform des vesikelbildenden Lipids des Lipid-Polymer Konjugates ist ein Lipid mit zwei Kohlenwasserstoffketten, in der Regel Acylketten, und einer polaren Kopfgruppe, die eine chemische Gruppierung enthält. In dieser Klasse sind die Phospholipide, wie etwa Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglyzerin (PG), Phosphatidinsäure (PA), Phosphatidylinosit (PI) und Sphingomyelin (SM), enthalten, wo die beiden Kohlenwasserstoffketten in der Regel eine Länge zwischen etwa 14 und 22 Kohlenstoffatomen und unterschiedliche Grade der Ungesättigt heit aufweisen.
Phosphatidylethanolamin (PE) ist ein Beispiel eines Phospholipids, das für die Erfindung bevorzugt ist, da es eine reaktive Aminogruppe enthält, die ftir die Lipid-Kopplung an Polymere günstig ist. Ein bevorzugtes PE, das in den Beispielen angeführt ist, ist Distearyl-PE (DSPE).

B. Polymere

Die Polymerkette in dem Konjugat wird aus Polyvinylpyrrolidon-, Polyvinylmethyl ether-, Polyhydroxypropylmethacrylat-, Polyhydroxyethylacrylat-, Polymethacrylamid-, Polydimethylacrylamid-, Polymethyloxazolin-, Polyethyloxazolin- oder Polyaspartamid- Polymeren gebildet. Die Polymerkette enthält vorzugsweise zwischen 20 und 150 Monomer-Untereinheiten, bevorzugter 40 bis 100 Monomer-Untereinheiten.
Die Kette kann ein Homopolymer des ausgewählten Polymers sein oder ein statistisches oder ein Block-Copolymer, das ein oder mehrere Blöcke des ausgewählten Polymers, durch Blöcke oder einzelne Untereinheiten eines zweiten Polymers getrennt, enthält. Das zweite Polymer kann ein anderes der oben angegebenen Polymeren oder eine andere Polymerart sein, mit der Begrenzung, daß das statistische oder Block-Copolymer den folgenden unten angegebenen Löslichkeitsbedingungen entspricht, die für die Eigenschaften des Lipid-Polymer-Konjugates in Liposomen von Bedeutung sind. Im speziellen ist die Copolymerzusammensetzung so, daß das Polymer in freier Form (nicht an die Lipidgrupperung gebunden) durch eine Löslichkeit in Wasser bei Raumtemperatur von mindestens 5 % (Gew./Vol.) und eine Löslichkeit in Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid und/oder Methylenchlorid bei Raumtemperatur von mindestens etwa 0,5 % (Gew./Vol.) gekennzeichnet ist.
Bevorzugte Homopolymere und Copolymere sowie deren Syntheseverfahren werden nun erörtert.
1. Löslichkeitseigenschaften des Homopolymers. Ein bevorzugtes Homopolymer für die vorliegende Erfindung ist Polyvinylpyrrolidon (PVP). Dieses Polymer ist in kaltem Wasser leicht löslich (mindestens 5 Gew.-%), wie in der folgenden Tabelle 1 angegeben ist (Molyneux). Das Polymer ist auch in einem oder mehreren der polaren Lösungsmittel Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid und/oder Methylenchlorid löslich (mindestens zu 0,5 Gew.-%). Die in Tabelle 1 gezeigten PVP-Polymere weisen Untereinheitsmengen im Bereich von etwa 60 (PVP7000) bis 3500 (PVP400.000) auf. Wie hierin definiert, werden die angegebenen Löslichkeiten in Wasser und in einem polaren organischen Lösungsmittel für ein Polymer mit der gewünschten Polymergröße zwischen etwa 20 und 150 Untereinheiten bestimmt. Daher geben die in Tabelle 1 angeflihrten Löslichkeiten für Polymere größerer Größen, wie etwa eine PVP-Kette mit 3.500 Untereinheiten, eher die minimalen Löslichkeitswerte für Polymere kleinerer Größen wieder, wie etwa PVP-Ketten mit etwa 20 bis 150 Untereinheiten. Tabelle 1
Wenn man die Löslichkeitseigenschatten anderer oben erwähnter Homopolymerer betrachtet, so ist Poly(dimethylacrylamid) in Wasser und organischen Lösungsmitteln, wie etwa Methanol, Ethanol und Dioxan, löslich. Polymethacrylamid ist in Wasser, Methanol, Ethylenglykol und Aceton löslich, während es in Kohlenwasserstoffen und Diethylether unlöslich ist (Molyneux).
Polyethyl- und Polymethyloxazoline sind in Wasser löslich und in Acetonitril, Chloroform und Dimethylformamid (Molyneux) löslich.
Polyvinylmethylether ist in Wassre löslich und ebenso in Alkoholen, Aminen, Estern, aromatischen Kohlenwasserstoffen und chlorierten Kohlenwasserstoffen (Molyneux).
Polyaspartamid ist ein Polymer, das von Asparaginsäure abgeleitet ist und durch Umsetzung mit Ethanolamin in Wasser löslich gemacht wurde, wobei Hydroxylgruppen entlang der Polymerkette eingebaut wurden. Dieses Polymer ist in Wasser und Dimethylformamid löslich (Neri).
Polyhydroxypropylmethacrylat und Polyhydroxyethylacrylat sind ebenfalls in Wasser und in einem oder mehreren der angegebenen polaren organischen Lösungsmittel löslich.
Zusätzlich dazu kann das Homopolymer eine derivatisierte Zellulose, wie etwa Carboxymethylzellulose, Hydroxypropylzellulose oder Hydroxyethylzellulose, sein. In underivatisierter Zellulose führt eine intermolekulare Wasserstoffbindung zu herabgesetzter Löslichkeit der Zellulose in Wasser. Die Derivatisierung von Zellulose-Hydroxylgruppen setzt die Wasserstoffbindung herab und steigert als eine Folge hievon die Löslichkeit der Zellulose in Wasser. Derivate von Zellulose werden üblicherweise mit unterschiedlichen Substitutionsgraden an den Hydroxylgruppen von C-2, C-3 und C-6 gebildet.
Bevorzugte derivatisierte Zellulosen zeigen die folgenden Löslichkeiten. Zum Beispiel sind Hydroxypropylzellulose und Hydroxyethylzellulose in Wasser, Chloroform, Aceton, Pyridin, Cyclohexanon löslich und sind nicht löslich in Ethanol, Diethylether und aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Zelluloseacetat ist löslich in Wasser, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrahydrofüran und anderen. Es ist unlöslich in aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Ethanol und Benzol (Fuchs).
Tabelle 2 zeigt vergleichende Löslichkeitsuntersuchungen für vier Polymere: Polyethylenglycol (PEG), Polymethyloxazolin (Poly(MeOz)), Polyethyloxazolin (Poly(EtOz)) und Polyvinylpyrrolidon (PVP). Die Löslichkeit jedes Polymers in zehn Lösungsmitteln mit einem Bereich des Polaritätsindex von 0,1 bis 10,2 wurde durch optische Prufling und bei Raumtemperatur, das heißt bei etwa 24ºC, bestimmt.
Die Polymeren wurden in einem speziellen Lösungsmittel als löslich bezeichnet, wenn sich das Polymer bei Raumtemperatur vollständig löste. Kombinationen von Polymer/Lösungsmittel, die sich bei Raumtemperatur nicht vollständig lösten, wurden schwach erwärmt und wurden als beim Erhitzen löslich bezeichnet, wenn sich das Polymer auflöste. Polymere, die sich in einem speziellen Lösungsmittel selbst bei Erwärmung nicht vollständig lösten, wurden als unlöslich bezeichnet.
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, ist keines der Polymeren bei Raumtemperatur in Lösungsmitteln, die einen Polaritätsindex von weniger als 2,8 aufweisen, löslich, mit der Ausnahme von PEG in Benzol. Jedoch sind alle Polymere in Lösungsmitteln löslich, die einen Polaritätsindex von mehr als 5,8 aufveisen.
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß das für das Lipid-Polymer-Konjugat ausgewählte Polymer in einem wässerigen Medium bei Raumtemperatur löslich ist und auch in verschiedenen organischen Lösungsmitteln löslich ist, wie für die vier Polymeren in Tabelle 2 aufgezeigt wurde. Ähnliche Methoden können zur Bestätigung der Löslichkeitseigenschaften anderer Polymerer, die für die Erfindung verwendbar sind, eingesetzt werden. Tabelle 2 Vergleichende Löslichkeit von vier Polymeren in verschiedenen Lösungsmitteln
+ löslich; - unlöslich; ± löslich nur beim Erhitzen
Andererseits können die erfindungsgemäßen Polymere Copolymere sein, die die oben genannten Monomere entweder als Block- oder als statistische Copolymere eingebaut enthalten. Zum Beispiel kann ein Polymer, das einen hohen Prozentsatz Polyvinylpyrrolidon und eine andere Untereinheit, wie etwa Vinylmethylether, Methylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Methacrylamid und Dimethylacrylamid, enthält, durch radikalische Polymerisationsverfahren hergestellt werden, wie sie bei der PVP-Synthese verwendet werden.
Bevorzugte Block-Copolymere mit den erforderlichen Löslichkeitseigenschaften werden gebildet, um ein oder mehrere alternierende Blöcke von PEG und einem der oben geoffenbarten Homopolymeren zu enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Heteropolymer ein Block-Copolymer, das aus alternierenden PVP- und PEG-Blöcken oder einzelnen Blöcken derselben besteht.
2. Synthese des Homopolymers. Polyvinylpyrrolidon (PVP), ein Beispiel eines N- Vinylamidpolymers, wird detailliert als eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung besprochen. PVP kann durch freiradikalische, anionische oder kationische Polymerisation von Vinylpyrrolidon- (VP)- Monomeren synthetisiert werden. Vorzugsweise wird das Monomer durch die freiradikalische Methode in Anwesenheit eines freiradikalischen Initiators, wie etwa Wasserstoffperoxid oder Azobisisobutyronitril (AIBN), polymerisiert.
Wie in Beispiel 1 beschrieben und in Fig. 1 erläutert, werden VP-Monomere mit Mercaptoessigsäure (MACA) und AIBN zur Begünstigung der Synthese von PVP mit einem Molekulargewicht von etwa 6.000 inkubiert. MACA wird bei der Polymerisationsreaktion verwendet, um eine chemische Gruppe, eine Carboxylgruppe, an einem polymerfreien Ende zur Kopplung an ein vesikelbildendes Lipid zu bilden. Zusätzlich dazu werden die Konzentrationen von MACA variiert, um Polymere einer gewunschten Länge zu synthetisieren. Zum Beispiel wird eine Konzentration von 0,2 molar für MACA zur Synthese von PVP-Polymeren eines Molekulargewichts von etwa 6.000 Dalton verwendet. MACA vermindert auch die Heterogenität des Produkts und es kann möglich sein, daß das Produkt eine weitere Reinigung durch Größenfraktionierung nicht braucht (Andreani, Veronese). Andererseits können andere Mercaptane, wie etwa Mercaptoethanol (ME) oder Mercaptopropansäure (MPA) das MACA in der Polymerisationsreaktion ersetzen, um geeignete Endgruppen zu bilden.
Ein ähnliches freiradikalisches Polymerisationsverfahren ist für die Synthese von Polyvinylmethylether, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Polydimethylacrylamid oder Polymethacrylamid zur Schaffüng von Polymeren, die für diese Erfindung geeignet sind, möglich.
Fig. 2 erläutert ein Synthesereaktionsschema für eine Polymerisation von 2-Methyloxazolin (MOZ). Bei dieser Reaktion findet MOZ-Polymerisation durch einen kationischen Polymerisationsmechanismus statt. MOZ-Polymerisation wird durch Methyltosylat initiiert, welches eine Ringöffnungsreaktion von 2-Methyloxazolin katalysiert. Die Polymerisationsreaktion pflanzt sich durch das "lebende Ende" des Polymers fort, welches weitere Ringöffnungsreaktionen des 2-Methyloxazolins verursachen kann. Nach der Polymerisationsreaktion wird durch wässeriges Aufarbeiten eine Hydroxylgruppe durch Ersetzen der Tosylatgruppe an einem Polymerende geschaffen (Saegusa). Diese Hydroxylgruppe wird zum Anhängen des Polymers an ein vesikelbildendes Lipid verwendet. Die Reaktionsbedingungen werden in Beispiel 2 besprochen.
Andere nudeophile Reagenzien als Wasser können zur Schaffiing anderer funktioneller Gruppen an einem Polymerende verwendet werden. Zum Beispiel wurde die Verwendung eines Diamins eine Aminogruppe am freien Ende erzeugen. Ein ähnliches Verfahren wird für die Synthese von Poly-(2-ethyloxazolin) verwendet.
Fig. 3 erläutert ein Synthesereaktionsschema für die Bildung von Polyaspartamid. Asparaginsaure wird durch Erhitzen auf 200ºC während 2-4 Stunden polymerisiert, um ein Polysuccinimid mit einem mittleren Molekulargewicht von 11.000 zu bilden (Vegotski). Das Polysuccinimid wird mit Ethanolamid umgesetzt. Daraus resultiert eine Ringöffnung der Succinimidgruppen der Polymerkette zur Schaffung von Poly-(hydroxyethyl-(D,L-aspartamid)). Die endständigen Carbonsäuregruppen werden nach Aktivierung einer oder beider Carbonsäuregruppen an einem Polymerende an ein vesikelbildendes Lipid gekoppelt.
Andere Arten von Homopolymeren können wie folgt synthetisiert werden. Zur Schaffting von Zellulosederivaten wird Zellulose mit Chloressigsäure umgesetzt, um Carboxymethylzellulose zu bilden, oder mit Ethylenoxid umgesetzt, um Hydroxyethylzellulose zu bilden. Um die Löslichkeit der derivatisierten Zellulosen in Wasser zu maximieren, ist es normalerweise notwendig, die vollständig derivatisierte Zellulose teilweise zu hydrolysieren (Kawaguchi, McCormick). Auf diese Weise können Polymere geschatfen werden, die zwischen 40 und 100 Zuckereinheiten enthalten. Das ist die gewunschte Länge für die Zwecke der Erfindung.

3. Synthese von statistischen Copolymeren

Fig. 4 zeigt die Bildung eines statistischen Copolymers von VI)- und Acrylamid- ((AA)- -Monomeren. Wie für die Polymerisation von VP-Monomeren beschrieben wurde, werden die Copolymerisationsreaktionen in Anwesenheit eines freiradikalischen Initiators und eines Terminators, wie etwa MACA, durchgeführt, um eine fünktionelle Endgruppe einzuführen und die Heterogenität des Produkts zu vermindern. Das Verhältnis der einzelnen Monomeren in einer Polymerisationsreaktionsmischung hängt von der Reaktionslähigkeit jedes Monomers für freiradikalische Polymerisation und von dem gewünschten Verhältnis der Monomeren in dem Polymerisationsprodukt ab (Barabas).
VP copolymerisiert leicht mit den verschiedensten anderen Monomeren, wie etwa Ethylacrylat, Methylacrylat, Methylmethacrylat, Maleinsäureanhydrid, Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Ethylen, Vinylpropionat, Vinylcaprolactam und Methylvinylketon. Die mit VP copolymerisierten Monomeren haben vorzugsweise ähnliche Löslichkeitseigenschafien wie VP, wie etwa Methacrylamid-Monomer.
Andererseits können die mit VP copolymerisierten Monomeren unterschiedliche Löslichkeitseigenschaften aufweisen, wie etwa Methylmethacrylat-Monomere. Der Gehalt an Methylmethacrylat-Monomer des statistischen Copolymers wird so ausgewählt, daß das Polymerprodukt Löslichkeitseigenschafien ähnlich jenen von PVP aufweist.
4. Synthese eines Block-Copolymers. Fig. 5 erläutert die Synthese eines Block-Copolymers, welches einen PVP- und einen PEG-Block enthält. Eine kurze PVP-Polymerkette, die gemäß obiger Beschreibung hergestellt wurde, kann an eine bifünktionalisierte PEG- Polymerkette gekoppelt werden, die endständige Amino- und Carbonsäuregruppen enthält, wobei Standard-Kopplungsverfahren verwendet werden, um eine Amidbindung zu schaffen (Zalipsky, 1986).
Andere Block-Copolymere, die Blöcke von PEG und Blöcke von beliebigen anderen geoffenbarten Homopolymeren enthalten, die die erforderlichen Löslichkeitseigenschafien aufweisen, können in einer ähnlichen Weise hergestellt werden, indem ein Homopolymer, das eine chemische Gruppe an einem seiner Enden enthält, mit einer bifünktionalisierten Polymerkette umgesetzt wird.
Heteropolymere, die mehr als einen alternierenden Block von PEG und eines beliebigen der geoffenbarten Homopolymeren enthalten, können durch Umsetzung biftinktionalisierter PEG-Ketten mit bifunktionalisierten Homopolymerketten in Anwesenheit eines verbindenden Reagens, wie etwa eines Diisocyanats, hergestellt werden. Das heteropolymere Produkt sollte die erforderlichen Löslichkeitseigenschaften aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Heteropolymer mehrere alternierende Blöcke von PVP und PEG.

C. Kopplungsverfahren

Im allgemeinen wird die kovalente Bindung von Polymeren an ein vesikelbildendes Lipid dadurch erreicht, daß chemische Gruppen an einem Ende des Polymers vor der Reaktion mit einem vesikelbildenden Lipidaktiviert werden. Eine endständige Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppe kann zur Kopplung des Lipids durch monofünktionelle Aktivierungsmittel, wie etwa N-Hydroxysuccinimid, Ethylchloroformat, DCCD, Woodward's Reagens K, Cyanursäure und Trifluormethansulfonylchlorid und andere, aktiviert werden. Eine Anzahl bifünktioneller Vernetzungsmittel, die Gruppen mit unterschiedlichen Reaktivitäten enthalten, wie etwa einige Diisocyanate, können ebenso zur Aktivierung von Polymeren vor der Kopplung an Lipidkomponenten verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Aktivierung eines PVP-Polymers für eine Bindung an ein Phospholipid ist in Fig. 6 erläutert. In dieser Reaktion wird die endständige Carboxylgruppe des Polymers durch Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Nach diesem Aktivierungsschritt wird das Polymer mit einem aminogruppenhaltigen Phospholipid, wie etwa Phosphatidylethanolamin, umgesetzt, um das mit dem Polymer derivatisierte vesikelbildende Lipid zu erzeugen, welches Teil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist.
Für die Aktivierung endständiger Hydroxylgruppen stehen dem Fachrnann Verfahren zur Verfügung (Zalipsky, 1992). Bei einem solchen Verfahren, das in Fig. 7 dargestellt ist, wird Polymethyloxazolin mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt, um an einem Ende des Polymers eine Carboxylgruppe zu bilden. Die endständige Carboxylgruppe des Polymers wird durch Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Nach diesem Aktivierungsschritt wird das Polymer mit einem aminogruppenhaltigen Phospholipid, wie etwa Phosphatidylethanolamin, umgesetzt, wodurch das gewunschte Produkt gebildet wird.
Die meisten der in dieser Erfindung beschriebenen Polymeren können durch eines der oben beschriebenen Kopplungsverfahren gekoppelt werden. Für die Kopplung von derivatisierten Zellulosen werden die Polymere in Anwesenheit eines aminogruppenhaltigen Lipids ohne irgendeinem vorhergehenden Aktivierungsschritt inkubiert. Die Kopplung kann am reduzierenden Ende der Polysaccharidkette durch reduktive Aminierung stattfinden.

III. Liposom-Zusammensetzung

Das erfindungsgemäße Polymer-Lipid-Konjugat wird zur Herstellung von Liposom- Zusammensetzungen verwendet, die zum Einsatz bei der Anlieferung eines Arzneimittels über den Blutstrom bestimmt sind. Bei einer Ausführungsform bildet das Polymer-Lipid- Konjugat, wenn es mit einem Molverhältnis von vorzugsweise 1-30 Molprozent in die äußere Lipidschichte der Liposome eingebaut wird, eine polymere Schichte, die imstande ist, die Blutzirkulationszeit der Liposome um ein Mehrfaches gegenüber jener von Liposomen auszudehnen, denen das Polymer-Lipid-Konjugat fehlt.

A. Lipid-Bestandteile

Das Liposom setzt sich aus underivatisierten vesikelbildenden Lipiden und oben beschriebenen Polymer-Lipid-Konjugaten zusammen. Die underivatisierten vesikelbildenden Lipide werden die Masse der Vesikelstruktur in dem Liposom bilden.
Im allgemeinen inkludieren diese vesikelbildenden Lipide alle amphipathischen Lipide, die hydrophobe und polare Kopfgruppen-Reste enthalten und die (a) spontan doppelschichtige Vesikel in Wasser bilden können, wie beispielhaft durch Phospholipide dargestellt wird, oder die (b) stabil in Lipid-Doppelschichten incorporiert sind, wobei ihre hydrophobe Gruppierung in Kontakt mit dem inneren, hydrophoben Bereich der Doppelschichtmembran steht und ihr polarer Kopfgruppen-Rest in Richtung zur äußeren polaren Oberfläche der Membran orientiert ist.
Die vesikelbildenden Lipide dieser Art sind vorzugsweise solche, die zwei Kohlenwasserstoffketten, in der Regel Acylketten, und eine polare Kopfgruppe aufweisen. In dieser Klasse inkludiert sind die Phospholipide, wie etwa Phosphatidylcholin (PC), PE, Phosphatidinsäure (PA), Phosphatidylinositol (Pl) und Sphingomyelin (SM), wo die beiden Kohlenwasserstoffketten in der Regel eine Länge zwischen etwa 14 und 22 Kohlenstoffatomen und unterschiedliche Grade der Ungesättigtheit aufweisen.
Die oben beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten eine Vielzahl von Sättigungsgraden aufweisen, können im Handel erhalten werden oder sie können nach veröffentlichten Methoden hergestellt werden. Andere Lipide, die in der Erfindung inkludiert sind, sind Glycolipide und Sterole, wie etwa Cholesterol.
Die zweite Art von Lipid in der Liposom-Zusammensetzung ist das im Abschnitt IIA beschriebene Polymer-Lipid-Konjugat. Dieses Polymer-Lipid-Konjugat ist mit einer molaren Konzentration enthalten, die ausreicht, um die Blutzirkulationszeit der Liposome um ein Mehrfaches gegenüber jener von Liposomen ohne Polymer-Lipid-Konjugat zu erstrekken. Das Lipid-Konjugat ist in der Regel mit 3-10 Molprozent, vorzugsweise etwa 5 Molprozent, enthalten.
Eine bevorzugte Ausfühmngsform des Polymer-Lipid-Konjugates ist ein mit PVP- Polymer derivatisiertes Distearylphosphatidylethanolamin (PVP-DSPE). Die PVP-Kette ist vorzugsweise eine PVP-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 2.000 und 17.000 Dalton, bevorzugter zwischen 4.500 und 11.000 Dalton. Das Lipid ist vorzugsweise ein PE, wie etwa DSPE.
Eine andere bevorzugte Ausführungsforrn des Polymer-Lipid-Konjugates ist ein mit Polymethyloxazolin derivatisiertes Distearylphosphatidylethanolamin (PMOZ-DSPE). Die Polymethyloxazolin-Kette ist vorzugsweise eine Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 2.000 und 16.000 Dalton, bevorzugter zwischen 4.000 und 11.000 Dalton.

B. Herstellung der Liposome

Die Liposome können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, wie sie etwa in Szoka et al., 1980, detailliert angegeben sind. Eine Methode zur Herstellüng von arzneimittelhaltigen Liposomen ist das Verfahren der Umkehrphasen-Verdampfüng, das von Szoka et al. und in der US-PS 4,235.871 beschrieben ist. Bei diesem Verfahren wird eine organische Lösung von Liposom-bildenden Lipiden mit einem kleineren Volumen eines wassengen Mediums gemischt und die Mischung, vorzugsweise unter Verwendung pyrogenfreier Komponenten, dispergiert, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden. Das Arzneimittel oder andere pharmazeutische Mittel, das herangeführt werden soll, wird entweder im Falle eines lipophilen Arzneimittels der Lipidlösung zugesetzt oder im Falle eines wasserlöslichen Arzneimittels dem wassengen Medium zugesetzt.
Nach Abtrennung des Lipid-Lösungsmittels durch Verdampfüng wird das entstehende Gel mit einer Einkapselungswirksamkeit für ein wasserlösliches Arzneimittel von bis zu 50 % in Liposome umgewandelt. Die Vesikel aus der Umkehrphasenverdampfüng (REVs) haben in der Regel durchschnittliche Größen zwischen etwa 0,2 und 0,4 Mikron und sind überwiegend oligolamellar, das heißt sie enthalten eine oder wenige Lipid-Doppelschichthüllen. Die REVs können, wie weiter unten besprochen wird, leicht durch Extrusion in ihrer Größe sortiert werden, um oligolamellare Vesikel mit einer ausgewählten maximalen Größe von vorzugsweise zwischen etwa 0,05 und 0,2 Mikron zu ergeben.
Zur Bildung von MLV's wird eine Mischung von Liposom-bildenden Lipiden der oben detailliert beschriebenen Art, die in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst ist, in einem Behälter eingedampft, um einen dünnen Film zu bilden, der dann mit einem wässerigen Medium bedeckt wird. Der Lipid-Film hydratisiert zur Bildung von MLVs, die in der Regel Größen zwischen etwa 0,1 und 10 Mikron aufweisen. In der Regel werden die MLVs auf einen gewünschten Größenordnungsbereich von 0,5 oder weniger und vorzugsweise zwischen etwa 0,05 und 0,2 Mikron durch Extrusion größenmäßig herabgesetzt.
Eine wirksame Größenfestsetzungsmethode für REVs und MLVs bedient sich der Extrusion einer wässerigen Suspension der Liposome durch eine Polycarbonatmembran mit einer ausgewählten gleichmäßigen Porengröße in der Regel von 0,05, 0,08, 0,1, 0,2 oder 0,4 Mikron (Szoka). Die Porengröße der Membran entspricht grob der größten Größe der Liposome, die durch Extrusion durch diese Membran gewonnen werden, insbesondere wenn das Präparat zwei- oder mehrfach durch die gleiche Membran extrudiert wird.
Andererseits können die REV- oder MLV-Präparate so behandelt werden, daß kleine einlamellare Vesikel (SUVs) gebildet werden, die durch Größen im Bereich von 0,04 bis 0,08 Mikron gekennzeichnet sind. SUVs können zum Beispiel bei der Anpeilung von Tumorgewebe verwendbar sein, welches einen selektiven Durchgang kleiner Partikel, in der Regel kleiner als etwa 0,1 Mikron, durch die den Tumor versorgenden Kapillarwände gestattet. Wie oben angegeben, können SUVs leicht aus fluiden vesikelformenden Lipiden gebildet werden.
Nach einer endgültigen Größensortierung können die Liposome erforderlichenfalls behandelt werden, um freies (nicht eingeschlossenes) Arzneimittel abzutrennen. Übliche Abtrennungsverfahren, wie etwa Zentrifügieren, Diafiltration und Molekularsieb-Chromatografie, sind geeignet. Die Zusammensetzung kann sterilisiert werden, indem sie durch ein übliches 0,45 Mikron Tiefenlilter filtriert wird.
Obwohl das erfindungsgemäße Polymer-Lipid-Konjugat vorzugsweise in den zur Bildung der Liposome verwendeten Lipid-Bestandteilen enthalten ist, können die Konjugate andererseits durch Diffusion in vorgeformte Liposome in die äußere Liposomschichte eingebaut werden. In der Regel erfolgt dies durch Inkubation vorgeformter Liposome in Anwesenheit des Konjugates (das in Lösung in micellarer Form vorliegen kann), bis eine gewünschte Konzentration des Konjugates in den Liposomen aufgenommen ist. Die Suspension kann zusätzlich oberflächenaktive Mittel enthalten, wie etwa Deoxycholat, um die Diflusion des Konjugates in die Liposome zu erleichtern. Das oberflächenaktive Mittel kann anschließend z.B. durch Dialyse entfernt werden.
Die Liposome können hergestellt werden, um oberflächlich gebundene Ligandenmoleküle, wie etwa Antikörper, zu inkludieren, deren Wirkung darin besteht, spezifisch und mit hoher Affinität an Liganden-bindende Moleküle, wie etwa Antigene, zu binden, die speziell auf Zielzellen lokalisiert sind. Als ein Beispiel können die Ligandenmoleküle tumorspezifische Antikörper sein, um an tumorspezifische Antigene auf Tumorzellen zu binden.
Eine Vielzahl von Methoden zur Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen ist bekannt. Ein Verfahren inkludiert den Einbau von vorgeformten Ligandenderivatisierten Lipid-Bestandteilen in Liposome. Andererseits können die Liganden an aktivierte Enden von Polymerketten in einem vorgeformten Liposom gekoppelt werden.

C. Oberflächenabschirmungseigenschaften

Die derivatisierten Lipid-Polymer-Konjugate, die nach obiger Beschreibung hergestellt wurden, können weiters hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Abschirmung von Oberflächenladungen auf Liposomen selektiert werden. Die Abschirmung von Oberflächenladung kann zum Beispiel durch Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität von negativ geladenen Liposomen gemäß den weiter unten beschriebenen Verfahren gemessen werden.
Tabelle 3 zeigt die Oberflächenladung, das Zeta-Potential und das Verteilungsverhältnis zwischen dem mononuclearen phagozytischen System (MPS) und Blut für Liposome, die 3 Molprozent der Lipid-Komponente von der linken Seite der Tabelle enthalten. Hier bezieht sich PC auf Phosphatidylcholin, PS bedeutet Phosphatidylserin, PG bedeutet Phosphatidylglyzerin, GTi, GDla und Ml bezeichnen verschiedene Ganglioside und PEG- DSPE bezieht sich auf Distearylphosphatidyl-ethanolamin, das mit PEG derivatisiert ist. Tabelle 3
Die Verhältnisse der Liposome in dem mononudearen phagozytischen System (MPS) und im Blut werden als ein Maß ftir die Lebensdauer der Blutzirkulation der Liposome in vivo verwendet, wobei ein geringeres Verhältnis eine geringere Aufnahme durch das MPS und eine längere Zirkulation im Blutstrom bedeutet. Die in der Tabelle gezeigten Verhältnisse wurden für Liposom-Verteilungen 24 Stunden nach der intravenösen Verabreichung, zum Beispiel durch das in der US-PS 4,920.016 beschriebene Verfahren, bestimmt. Wie ersichtlich, ergaben alle Formulierungen mit Ausnahme einer, die PEG-DSPE enthielt, MPS/Blut-Verhältnisse von deutlich über 1
Die Oberflächenladungswerte, die in der Tabelle angegeben sind, wurden nach Standardmethoden berechnet, wie jenen, die in Mcdaniel et al. beschrieben sind, und zeigen die Oberflächendichte der negativen Ladungen auf den Liposomen. Es wird festgehalten, daß die Oberflächenladung mit Bezugnahme auf die ausgewählte Ionenstärke und den pH des Liposoms zusätzlich zum Molgehalt der geladenen Lipid-Bestandteile bestimmt wurde.
Die Werte des Zeta-Potentials in der Tabelle liefern ein Maß für die scheinbare Ladung an der äußeren Oberfläche der Liposome. Diese Werte werden aus der elektrophoretischen Mobilität der Liposome nach bekannten Methoden (Woodle) bestimmt. Die Werte des Zeta-Potentials geben somit die Ladung auf den Liposomen wieder, wie sie durch das elektrische Feld während der Elektrophorese ersichtlich ist. Ein weniger negatives Zeta- Potential bedeutet, daß die Liposome eine geringere scheinbare Oberflächenladung aufweisen, wie sie durch eine herabgesetzte Migrationsrate in einem elektrischen Feld bestimmt wird.
Wenn die Werte des Zeta-Potentials für eine beliebige Liposom-Formulierung geringer sind als die Werte der Oberflächenladung, dürfte das herabgesetzte Zeta-Potential auf ein Screenen der Oberflächenladung hinweisen. Es wird keine Abschirmung der Ladung bei Liposomen beobachtet, die PS, PG, GTl oder GDla enthalten. Die Liposom-Formulierung, die PEG-DSPE enthält, zeigt jedoch Ladungsabschirmung. Das Zeta-Potential von -1,3 mV für PEG-DSPE-Liposome (Woodle) stellt einen mehrfachen Abfall der negativen Ladung gegenüber Liposomen dar, die Phosphatidylglyzerin (PG) enthalten (Zeta-Potential -8 mV). Liposome, die entweder PG oder DSPE enthalten, haben die gleiche Oberflächenladungsdichte wie PEG-DSPE-Liposome, jedoch ist die Ladung nicht abgeschirmt. Diese Wirkung der Ladungsabschirmung hängt mit dem geringen MPS/Blut-Verhältnis zusammen, das für diese Formulierung beobachtet wurde.
Liposome, die GMl enthalten, zeigen auch Ladungsabschirmung, jedoch nicht im gleichen Ausmaß wie PEG-DSPE-Liposome. GMl enthält eine negativ geladene Sialsäure- Gruppe, die sich von der Liposomoberfläche weg in die wässerige Phase erstreckt. Wenn die Sialgruppe auf der Liposomoberfläche angeordnet wäre, würde die Oberflächenladung vergleichbar mit der von PG- oder PEG-DSPE-Liposomen sein (-6 mV). Jedoch ist der Wert der Oberflächenladung geringer als aus der Stelle der negativen Ladung erwartet worden wäre (-3,4 mV).
Das Zeta-Potential von GMl ist daher im Vergleich zu einem Wert von -6 mV, der die echte Liposomladung darstellt, herabgesetzt (-5 mV). Auch ist das Zeta-Potential niedriger als für PG-Liposome, obwohl die negativen Ladungen näher an der das Zeta-Potential bestimmenden Ebene liegen (McLaughlin, McDaniel). Das MPS/Blut-Verhältnis für GMl Liposome ist im Vergleich zu dem von PG- oder PS-Liposomen herabgesetzt, ist jedoch nicht so niedrig wie bei PEG-DSPE-Liposomen.
Noch allgemeiner gesagt, ist in Übereinstimmung mit einem Aspekt der Erfindung das in der erfindungsgemäßen Liposomzusammensetzung verwendete Lipid-Polymer-Konjugat vorzugsweise eines, das zur Abschirmung der Liposomladung in einem Ausmaß wirksam ist, um die elektrophoretische Mobilität der Liposome im Vergleich zu den gleichen Liposomen, in welchen ein Lipid mit etwa Phosphatidylglyzerin anstelle des zugesetzten Konjugates verwendet wird, herabzusetzen. Das Lipid-Polymer-Konjugat und das Phosphatidylglyzerin enthalten beide eine einzelne negative Ladung an ihrer polaren Lipidkopfgruppe und tragen zur Oberfiächenladung auf den Liposomen bei.

IV. Verwendung

Wie oben angegeben, wirkt die auf den Liposomen oder auf anderen kolbidalen Arzneimittelanlieferungssystemen gebildete polymere Schichte durch das Lipid-Polymer-Konjugat so, daß die Blutzirkulationszeit der Liposome um ein Mehrfaches verlängert wird. Die verbesserte Blutzirkulationszeit ihrerseits wird eine Vielzahl therapeutischer Verwendungen erlauben, die bei üblichen, rasch ausgeschiedenen Liposomen nicht möglich ist. Einige dieser neuen therapeutischen Verwendungen inkludieren.
1. Verlängerte Anlieferung eines Arzneimittels durch Freigabe aus den Partikeln, wenn diese mit dem Blutstrom während eines verlängerten Zeitraums zirkulieren
2. Behandlung fester Tumore. Die lange Zirkulationszeit erlaubt, daß die Partikel eine Tumor-Zielstelle über den Blutstrom erreichen und in den Tumorbereich austreten können.
3. Behandlung von Infektionen oder Entzündungen. Wie oben erlaubt die lange Zirkulationszeit, daß die Partikel eine Stelle der Infektion oder Entzündung über den Blutstrom erreichen und in den Bereich der Infektion austreten.
Ein kritisches Merkmal der polymeren Schichte auf dem Liposom, das oben angegeben wurde, ist das, daß die die Schichte bildenden Polymeren in einem wässerigen Medium löslich sind, jedoch auch in einem oder mehreren von vielen polaren organischen Lösungsmitteln löslich sind. Die Löslichkeit des Polymers in Wasser gestattet es, daß sich die Polymerketten von der Liposomoberfläche in die wässerige das Liposom umgebende Schichte wegerstrecken und die wässerige Hülle wirksam "auffüllen". Die Löslichkeit des Polymers in einer Vielzahl von organischen Lösungsmitteln und Wasser deutet darauf hin, daß die Polymerketten gleichermaßen flexibel und somit imstande sind, eine gleichmäßige lokale Konzentration von Polymerketten rund um die äußere Oberfiäche der Liposome zu schaffen, die eine wirksame Barriere gegenüber Wechselwirkungen zwischen den Liposomoberflächen und Blutbestandteilen bilden, die an der Liposomaufhahme aus dem Blut beteiligt sind.
Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung von Lipid-Polymer- Konjugaten, die in Liposom-Zusammensetzungen eingebaut werden können, um die Zirkulationszeit der Liposome in dem Blutstrom zu verlängern. Die Beispiele sind dazu gedacht, spezielle Herstellungen von Lipid-Polymer-Konjugaten zu erläutern, sollen jedoch in keiner Weise den Rahmen derselben beschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung von PVP-DSPE-Konjugat

Die Polymerisation von PVP und die Verknüpfüng von PVP an DSPE, die in diesem Beispiel beschrieben wird, ist in Fig. 1 erläutert.

A. Polymerisation zu PVP

Eine Mischung von 25 g (0,23 Mol) N-Vinyl-2-pyrrolidon mit 0,7 mi (10 mMol) Mercaptoessigsäure (in einer 70%igen wässerigen Lösung) und 125 mg (0,76 mMol) AIBN wird mit Methanol auf 50 ml verdünnt und unter Rühren in Stickstoffatmosphäre auf 60ºC gehalten. Nach 24 Stunden werden 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Rühren in einen Überschuß von trockenem Ether gegossen. Das Polymer wird gereinigt, indem es in Methylenchlorid gelöst und neuerlich in einem Überschuß von trockenem Ether ausgefällt wird.
Das Produkt wird weiters durch Größenfraktionierung unter Verwendung einer Biogel P60-Säule (5 x 50 cm) mit Wasser als mobiler Phase gereinigt. PVP-Polymere mit einem Molekulargewicht von etwa 6.000 Dalton (etwa 53 Monomereinheiten) werden isoliert.

B. Anbindung von PVP an DSPE

Zur Aktivierung der Carbonsäure des PVP zur Kopplung der Aminogruppe des DSPE wird die folgende Vorschrift verwendet. Zu einer Lösung von PVP6000, 10 g, 1,7 mMol, in 50 ml N,N-Dimethylformamid (DMF), die auf 10ºC gekuhlt ist, werden 0,575 g, 5 mMol N-Hydroxysuccinimid in DMF und Dicyclohexylcarbodiimid (1,032 g, 4,6 mMol) in DMF zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht gerührt und die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen. Nach Abtrennung des ausgefällten Dicyclohexylharnstoffs durch Filtration wird die Lösung unter Hochvakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 50 mi Methylenchlorid aufgenommen und die Lösung zu gerührtem Diethylether (500 ml) zugetropft. Der weiße Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und zweimal aus Methylenchlorid/Diethylether umgefällt.
Zur Anbindung von PVP6000 an die polare Kopfgruppe des DSPE werden zu einer Chloroformlösung (10 ml) von N-Hydroxysuccinimidester-PVP (0,8 mMol) DSPE (0,52 g, 0,70 mMol) und TEA (0,2 ml, 1,4 mMol) zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Die Mischung wird 2 Stunden lang in einem auf 40 - 45ºC erhitzten Ölbad gehalten. Die Bildung des Produkts wird durch TLC auf Silica-Platten bestätigt (Chloroformlmethanol/Wasser/konzentriertes Ammoniumhydroxid (21,5/70/8/0,5).

BEISPIEL 2

Herstellung des Polymethyloxazolin-DSPE-Konjugates

Die Polymerisation von 2-Methyl-2-oxazolin und die Anbindung des Polymers an DSPE, die in diesem Beispiel beschrieben wird, ist in Fig. 2 erläutert.

A. Polymerisation von 2-Methyl-2-oxazolin

Es wird kationische Polymerisation von 2-Methyl-2-oxazolin (MOZ) durch Verwendung von Methyltosylat (MET) als Initiator vorgenommen. Zu MOZ (3,2 mMol) wird MET (0,07 mMol) in 1 ml Acetonitril zugesetzt. Die Reaktion schreitet 5 Stunden lang bei 80ºC fort. Das Polymerisationsprodukt wird zweimal mit Diethylether ausgefällt. Das Polymerisationsprodukt wird durch Größen-Chromatografie zur Isolierung der polymeren Spezies mit etwa 30 bis 60 Monomereinheiten gereinigt. Das entspricht einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis 4000.
Das Produkt wird in Wasser gelöst, um eine Tosylatgruppe von einem der Polymerenden zu verdrängen.

B. Anbindung von Polymethyloxazolin an DSPE

Die endständige Hydroxylgruppe kann durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid vor der Anbindung des Polymethyloxazolins an DSPE in eine Carboxylgruppe umgewandelt werden. Polymethyloxazolin (10 mMol) und Bernsteinsäureanhydrid (11 mMol)) werden in 1,2-Dichlorethan-haltigem Pyridin (10 mMol) gemischt. Die Mischung wird 4 Stunden unter Rückfluß in Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach der Filtration und der Abdampfüng des Lösungsmittels wird der Rückstand in Methylenchlorid gelöst und zweimal durch Zusatz von Diethylether ausgefallt. Die Anbindung des Polymers an DSPE erfolgt wie bei der Beschreibung für PVP.

BEISPIEL 3

Synthese von Polyaspartamid

Asparaginsäure (100 g) wird durch Erhitzen während 2 Stunden bei 200ºC in einem offenen Rohr polymerisiert. Diese Polymerisationsreaktion führt zu einem Polymer mit 11.000 Dalton. Das Polymer wird in N,N-Dimethylformamid gelöst und die Lösung in ein Becherglas gegossen, in dem 1 Liter Wasser vorgelegt war. Es bildet sich ein flockiger Niederschlag, der filtriert, mit Wasser bis zur Neutralität gespült und in einem Ofen bei 110ºC während 24 Stunden getrocknet wird.
Poly-(D,L-Succinimid) (30 g) wird in Dimethylformamid gelöst. Ethanolamin (45 ml) wird tropfenweise zugesetzt und die Lösung in einem Eisbad gekühlt, um die Temperatur auf 25-30ºC zu halten. Die Mischung wird 2 Stunden gerührt und dann mit Eisessig neutralisiert, mit Wasser verdünnt, dialysiert und lyophilisiert (Neri).
Die einzige Aminogruppe des Polymers wird für die selektive Konjugation mit den Lipid-Derivaten verwendet. Zum Beispiel durch reduktive Aminierung mit Periodat-oxidiertem Phosphatidylglyzerin oder Phosphatidylinositol.

BEISPIEL 4

Herstellung von VP/Acrylamid-DSPE-Koniugat

A. Polymerisation von VP mit Acrylamid-Monomeren

Das VP/Acrylamid-Copolymer wird in ähnlicher Weise hergestellt, wie für das PVP- Homopolymer beschrieben wurde. N-Vinylpyrrolidon (60 mMol) und Vinylacetat (67 mMol) mit 0,7 ml (10 mMol) Mercaptoessigsaure (in einer 70%igen wassengen Lösung) und 125 mg (0,76 mMol) AIBN werden mit Methanol auf 50 mi verdünnt und unter Rühren und unter Stickstoffatmosphäre bei 60ºC gehalten. Nach 24 Stunden werden 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Rühren in einen Überschuß von trockenem Ether gegossen. Das Polymer wird durch Auflösen in Methylenchlorid und Ausfällung in einem Überschuß von trockenem Ether gereinigt.
Das Produkt wird weiters durch Größenfraktionierung unter Verwendung einer Biogel P60-Säule (5 x 50 cm) mit Wasser als mobiler Phase gereinigt. PVP/AA-Copolymere mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 Dalton (etwa 53 Monomereinheiten) werden isoliert.

B. Anbindung des PVP/AA-Polymerprodukts an DSPE

Das Polymer wird an das vesikelbildende Lipid durch Aktivierung der Polymer-Carboxylgruppe mit N-Hydroxysuccinimid vor dem Zusatz von DSPE nach der Beschreibung von Beispiel 1 gekoppelt.

BEISPIEL 5

Herstellung des PEG/PVP-Blockcopolymer-DSPE-Konjugates

A. Herstellung des PEG/PVP-Block-Copolymers

Eine PVP-Kette, die eine endständige Carboxylgruppe enthält, ist in Beispiel 1 beschrieben. Da das gewünschte PVP-Produkt ein mittleres Molekulargewicht von etwa 3000 anstelle von etwa 6000 aufweisen soll, wird die Konzentration von MACA von 0,2 M auf 0,4 M angehoben. PEG-Ketten mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000, jede mit einer endständigen Amino- und Carboxylgruppe, können synthetisiert werden (Zalipsky). Die beiden polymeren Segmente werden dann gekoppelt, indem zuerst die PVP-Carboxylgruppe mit N-Hydroxysuccinimidester aktiviert und dann die aktivierte Carboxylgruppe mit der Aminogruppe des PEG umgesetzt wird.
Zur Aktivierung der Carbonsäure des PVP zur Kopplung mit der Aminogruppe des PEG wird das folgende Protokoll verwendet. Zu einer Lösung von PVP3000, 1 g in 10 ml N,N-Dimethylformamid (DMF), gekühlt auf 10ºC, werden äquimolare Mengen von N- Hydroxysuccinimid in DMF und Dicyclohexylcarbodiimid in DMF tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht gerührt und die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen. Nach Entfernung des ausgefallten Dicyclohexylharnstoffs durch Filtration wird die Lösung unter Hochvakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml Methylenchlorid aufgenommen und die Lösung tropfenweise zu gerührtem Diethylether (100 ml) zugesetzt. Der weiße Niederschlag wird durch Filtration gewonnen und zweimal aus Methylenchlorid/Diethylether umkristallisiert.
Zur Anbindung des PVP3000 an PEG wird zu einer Methylenchloridlösung von N- Hydroxysuccinimidester-endständigem PVP (2,1 g, 0,70 mMol) das Omega-Aminosäure- Derivat von PEG (1,4 g, 0,70 mMol) in 5 mi Methylenchlorid und anschließend TEA (0,2 ml, 1,4 mMol) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 22 Stunden bei 25ºC gerührt. Das Produkt wird aus der Methylenchloridlösung durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Diese Stufe wird mehrfach wiederholt.

B. Anbindung des PVP-PEG-Block-Copolymers an DSPE

Zur Aktivierung der Carbonsäure des PVP-PEG-Copolymers zur Kopplung an die Aminogruppe des DSPE wird die folgende Vorschrift verwendet. Zu einer Lösung von PVP-PEG (MG=5000, 1 g, 0,2 mMol) in 4 ml N,N-Dimethylformamid (DMF), die auf 10ºC gekühlt ist, werden N-Hydroxysuccinimid (30 mg, 0,26 mMol) in DMF (1 ml) und Dicyclohexylcarbodiimid (59 mg, 0,26 mMol) in DMF (1 ml) zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht gerührt und die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen. Nach Abtrennung des ausgefällten Dicyclohexylharnstoffs durch Filtration wird die Lösung unter Hochvakuum eingedampfi. Der Rückstand wird in 5 ml Methylenchlorid aufgenommen und die Lösung tropfenweise zu gerührtem Diethylether (100 ml) zugesetzt. Der weiße Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und zweimal aus Methylenchlorid/Diethylether umkristallisiert.
Zur Anbindung des PVP-PEG (MG=5000) an die polare Kopfgruppe des DSPE werden zu der Methylenchloridlösung von N-Hydroxysuccinimidester-endständigem PVP- PEG-Copolymer (3,5 g, 0,70 mMol) DSPE (0,70 mMol) in 2 mi Chloroform und TEA (0,2 ml, 1,4 mMol) zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Die Mischung wird in einem Ölbad 2 Stunden lang auf 70 bis 75ºC erwärmt. Die Bildung des Produkts wird durch TLC auf Silica-Platten (Chloroform/Methanol/Wasser/konzentriertes Ammoniumhydroxid (21,5/70/8/0,5) bestätigt.
Obwohl die Erfindung im Hinblick auf spezielle Zusammensetzungen derivatisierter Lipide beschrieben und erläutert wurde, ist es offensichtlich, daß eine Vielzahl von Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden kann, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Ein Lipid-Polymer-Konjugat, welches umfaßt:

ein vesikelbildendes Lipid mit einer hydrophoben Gruppierung und einer polaren Kopfgruppe und,

kovalent an die Kopfgruppe gebunden, eine Polymerkette, die ein Polymer enthält, das aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin und Polyaspartamid bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

wobei die genannte Polymerkette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in freier Form in Wasser bei Raumtemperatur zu mindestens 5 % und in einem organischen Lösungsmittel, das aus der aus Chloroform, Acetonitril, Dimethylformamid und Methylenchlorid bestehenden Gruppe ausgewählt ist, bei Raumtemperatur zu mindestens etwa 0,5 % löslich ist.

2. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin die Polymerkette ein Homopolymer eines aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylanrid, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin und Polyaspartamid bestehenden Gruppe ist.

3. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin die Polymerkette ein Blockcopolymer oder ein unregelmäßiges Copolymer von Polymeren ist, die aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Polymethacrylamid und Polydimethylacrylamid bestehenden Gruppe ausgewählt sind.

4. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin die Polymerkette ein Blockcopolymer oder ein unregelmäßiges Copolymer von Polymeren ist, die aus der aus Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxyethyloxazolin und Polyhydroxypropyloxazolin bestehenden Gruppe ausgewählt sind.

5. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin die Polymerkette ein Blockcopolymer eines Polymers, das aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polymethyloxazolin und Polyethyloxazolin bestehenden Gruppe ausgewählt ist, in Kombination mit Polyethylenglykol ist.

6. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Homopolymer von Polyvinylpyrrolidon ist.

7. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Homopolymer ist, das aus der aus Polymethyloxazolin und Polyethyloxazolin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin die Polymerkette einen Polymerisationsgrad zwischen etwa 20 und 150 hat.

9. Das Konjugat nach Anspruch 1, worin das vesikelbildende Lipid ein Phospholipid ist.

10. Das Konjugat nach Anspruch 9, worin das vesikelbildende Lipid Phosphatidylethanolamin ist.

11. Ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die durch eine verlängerte Blutzirkulationszeit gekennzeichnet sind, welches umfaßt:

Zugabe zu vesikelbildenden Lipiden von 1 bis 30 Molprozent, eines Lipid-Polymer- Konjugates mit einer hydrophoben Gruppierung und einer polaren Kopfgruppe und, kovalent an die Kopfgruppe gebunden, einer Polyrnerkette, die ein Polymer enthält, das aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polyhydroxyethylacrylat, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin und Polyaspartamid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bildung von Liposomen, die die genannten vesikelbildenden Lipide und das Lipid- Polymer-Konjugat enthalten und die die pharmazeutische Verbindung in eingeschlossener Form enthalten, und

Größensortierung der Liposome auf eine ausgewählte Größe im Größenbereich zwischen etwa 0,05 bis 0,5 Mikron,

wobei das zugesetzte Konjugat dahingehend wirkt, daß es die Zirkulationszeit der Liposome um ein Mehrfaches im Vergleich zu den gleichen, jedoch in Abwesehneit des genannten Konjugates bereiteten Liposome erhöht.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin das zugesetzte Lipid-Polymer-Konjugat dahingehend wirkt, daß es die elektrophoretische Mobilität der Liposome im Vergleich zu den gleichen Liposomen, in welchen das zugesetzte Konjugat durch Phosphatidylglycerin substituiert ist, reduziert.