DE60014345T2

DE60014345T2 - Makrozyklische peptide als hepatitis c virus ns3 protease inhibitore

Info

Publication number: DE60014345T2
Application number: DE60014345T
Authority: DE
Inventors: S. Youla TSANTRIZOS; R. Dale CAMERON; Anne-Marie Faucher; Elise Ghiro; Nathalie Goudreau; Teddy Halmos; Montse Llinas-Brunet
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-04-03
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2020-04-04
Also published as: HK1042714B; ZA200107862B; CO5170502A1; BG65356B1; DK1169339T3; WO2000059929A1; SI1169339T1; CN1346365A; HK1042714A1; JP2002542160A; ES2230084T3; CA2367127A1; SK14072001A3; KR20010108465A; YU70701A; CN1618789A; CN1177861C; ATE277945T1; EE200100516A; RU2247126C2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Zusammensetzungen, die Herstellung derartiger Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von Hepatitis C-Virus (HCV)-Infektionen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung neuartige Peptidanaloge, pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Analoge enthalten, und Verfahren zur Verwendung dieser Analogen bei der Behandlung von HCV-Infektionen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist weltweit der wichtigste ätiologische Auslöser von durch Transfusion und durch allgemeine Umstände erworbene Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis. Es wird angenommen, dass weltweit mehr als 170 Millionen Personen von dem Virus infiziert sind. Bei einem hohen prozentualen Anteil von Virusträgern entsteht eine chronische Infektion, wobei es in zahlreichen Fällen zu einer chronischen Leberkrankheit kommt, der sogenannten chronischen Hepatitis C. Bei dieser Gruppe besteht wiederum die starke Gefahr von ernsthaften Leberkrankheiten, wie Leberzirrhose, hepatozellulärem Karzinom und zum Tod führenden terminalen Stadien von Lebererkrankungen.
Der Mechanismus, gemäß dem HCV seinen vitalen Fortbestand gewährleistet und eine hohe Rate an chronischen Lebererkrankungen hervorruft, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Wirtsimmunsystem in Wechselwirkung tritt und diesem ausweicht. Ferner müssen die Rollen der zellulären und humoralen Immunreaktionen beim Schutz gegen HCV-Infektionen und -Krankheiten noch aufgeklärt werden. Es wurde berichtet, dass Immunoglobuline eine Prophylaxe bei transfusionsbedingter viraler Hepatitis bewirken, jedoch empfiehlt das Center for Disease Control gegenwärtig zu diesem Zweck nicht die Behandlung mit Immunoglobulinen. Das Fehlen einer wirksamen schützenden Immunreaktion behindert die Entwicklung eines Impfstoffes oder angemessener Prophylaxemaßnahmen nach der Belastung, so dass in naher Zukunft die ganze Hoffnung fest auf antivirale Eingriffe gesetzt wird.
Es wurden verschiedene klinische Studien mit dem Ziel durchgeführt, pharmazeutische Mittel zu identifizieren, die in wirksamer Weise zur Behandlung von HCV-Infektionen bei von chronischer Hepatitis C betroffenen Patienten befähigt sind. Bei diesen Untersuchungen verwendete man Interferon-alpha, allein und in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln. Derartige Untersuchungen haben ergeben, dass eine erhebliche Anzahl der Teilnehmer auf diese Therapien nicht reagiert und dass von den Teilnehmern, die eine günstige Reaktion zeigen, ein großer Anteil nach Beendigung der Behandlung einen Rückfall erleidet.
Bis vor einigen Jahren stellte die Behandlung mit Interferon (IFN) die einzige verfügbare Therapie mit nachgewiesenem Nutzen dar, die in der Klinik für Patienten mit chronischer Hepatitis C anerkannt war. Jedoch ist die anhaltende Reaktionsrate gering und ferner führt die Behandlung mit Interferon auch zu schweren Nebenwirkungen (d. h. Retinopathie, Thyroiditis, akute Pankreatitis, Depressionen), die die Lebensqualität der behandelten Patienten verringern. Interferon in Kombination mit Ribavirin wurde ursprünglich für Patienten, die auf IFN allein nicht reagieren, zugelassen. Es wurde nunmehr für unbefangene Patienten zugelassen und stellt derzeit den "goldenen Standard" bei der HCV-Therapie dar. Jedoch werden mit dieser Kombinationstherapie die durch IFN verursachten Nebenwirkungen nicht gelindert.
Somit besteht ein Bedürfnis zur Entwicklung wirksamer antiviraler Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen, mit denen die Einschränkungen vorhandener pharmazeutischer Therapien überwunden werden können.
HCV ist ein umhülltes Plusstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae. Das einzelsträngige HCV-RNA-Genom weist eine Länge von etwa 9 500 Nucleotiden auf und besitzt einen einzigen offenen Leseraster (ORF), der für ein einziges großes Polyprotein mit etwa 3 000 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zelluläre und virale Proteasen gespalten, wodurch strukturelle und nicht-strukturelle (NS) Proteine entstehen. Im Fall von HCV wird die Erzeugung von reifen, nicht-strukturellen Proteinen (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NSSA und NS5B) durch zwei virale Proteasen erreicht. Die erste Protease, die noch schlecht charakterisiert ist, spaltet an der NS2-NS3-Verbindungsstelle. Die zweite Protease ist eine Serin-protease, die innerhalb der N-terminalen Region von NS3 enthalten ist (und daher als NS3-Protease bezeichnet wird) und vermittelt sämtliche anschließenden Spaltungen stromabwärts von NS3, sowohl in cis, an der NS3-NS4A-Spaltungsstelle, als auch in trans, für die restlichen NS4A-NS4B-, NS4B-NS5A- und NS5A-NS5B-Stellen. Das NS4A-Protein scheint mehrere Funktionen auszuüben, nämlich die Wirkung als Kofaktor für die NS3-Protease und möglicherweise die Unterstützung der Membranlokalisierung von NS3 und anderen viralen Replicase-Komponenten. Die Komplexbildung des NS3-Proteins mit NS4A scheint für die Prozessierungsereignisse notwendig, die die proteolytische Wirksamkeit an sämtlichen Stellen verstärken. Das NS3-Protein besitzt auch Nucleosid-triphosphatase- und RNA-Helicase-Aktivitäten. NS5B ist eine RNAabhängige RNA-Polymerase, die an der Replikation von HCV beteiligt ist.
Die Patentanmeldung WO-97/06804 beschreibt das (–)-Enantiomere des Nucleosidanalogen Cytosin-1,3-oxathiolan (auch bekannt als 3TC) mit Aktivität gegen HCV. Diese Verbindung wird zwar in früheren klinischen Untersuchungen gegen HIV und HBV als sicher bezeichnet, ihre klinische Aktivität gegen HCV ist jedoch nicht erwiesen und ihr Wirkungsmechanismus gegen das Virus bedarf noch der Aufklärung.
Eine allgemeine Strategie zur Entwicklung von antiviralen Mitteln besteht in der Inaktivierung von viral kodierten Enzymen, die für die Replikation des Virus erforderlich sind.
Diesbezüglich haben intensive Bemühungen zum Auffinden von Verbindungen, die die NS3-Protease oder die RNA-Helicase von HCV hemmen, zu folgenden Arbeiten geführt:
US-Patent 5 633 388 beschreibt heterocyclisch substituierte Carboxamide und Analoge mit Wirksamkeit gegen HCV. Diese Verbindungen sind gegen die Helicase-Aktivität des NS3-Proteins des Virus gerichtet, wobei aber bisher nicht über klinische Tests berichtet wird.
Chu et al. (Tet. Lett., (1996), S. 7229–7232), berichten über ein Phenanthrenchinon, das in vitro gegen die HCV-NS3-Protease wirksam ist. Bezüglich dieser Verbindung gibt es keine Berichte über weitere Entwicklungen.
Bei der Ninth International Conference on Antiviral Research, Urabandai, Fukyshima, Japan (1996) (Antiviral Research, Bd. 30 (1) (1996), A23 (Abstract 19)) wurde eine Arbeit vorgelegt, die über Thiazolidin-Derivate mit Hemmwirkung gegen die HCV-Protease berichtet.
Es gibt mehrere Untersuchungen über Verbindungen mit Hemmwirkung gegen andere Serin-proteasen, wie humane Leukozyten-elastase. Über eine Familie dieser Verbindungen wird in WO-95/33764 berichtet (Hoechst Marion Roussel, 1995). Bei den in dieser Anmeldung beschriebenen Peptiden handelt es sich um Morpholinylcarbonyl-benzoyl-Peptidanaloge, die sich strukturell von den erfindungsgemäßen Peptiden unterscheiden.
WO-98/17679 der Fa. Vertex Pharmaceuticals Inc. beschreibt Inhibitoren von Serin-protease, insbesondere von Hepatitis C-Virus-NS3-Protease.
Hoffman LaRoche ( WO-98/22496 ; US-5 866 684 ; und US-6 018 020 ) berichtet ebenfalls über Hexapeptide, bei denen es sich um Proteinase-Inhibitoren handelt, die sich als antivirale Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen eignen.
Steinkühler et. al. und Ingallinella et. al. beschrieben eine NS4A-4B-Produkthemmung (Biochemistry, Bd. 37 (1998), S. 8899–8905 und 8906-8914).
WO-97/43310 der Fa. Schering Corporation beschreibt Peptidsequenzen mit 20 und 21 Aminosäuren, die gegen die HCV-NS3-Protease wirksam sind.
WO-98/46597 der Emory University beschreibt Peptide und Peptidomimetika, die in vitro gegen Serin-proteasen wirksam sind.
WO-98/46630 der Fa. Peptide Therapeutics Limited beschreibt Depsipeptid-Substrate, die die HCV-NS3-Protease hemmen.
Schließlich beschreibt US-5 869 253 enzymatische RNA-Moleküle, die die HCV-NS3-Protease hemmen.
Keine der vorstehend erwähnten früheren Patentanmeldungen beschreibt cyclische Peptide mit Aktivität und Selektivität gegen die Hepatitis C-Virus NS3-Protease oder legt derartige Peptide nahe.
WO-99/07733 , WO-99/07734 , WO-00/09543 und WO-00/09558 beschreiben Hexa- bis Tetrapeptide und Tripeptidanaloge, die die NS3-Protease hemmen. Jedoch legen diese Druckschriften weder die erfindungsgemäßen makrocyclischen Analogen nahe, noch führen sie zu deren Konzeption.
WO-99/38888 , Veröffentlichungstag 5. August 1999, des Istituto de Richerche di Biologia Moleculare (IRBM) beschreibt kleine Peptide als Inhibitoren der HCV-NS3-Protease. In dieser Druckschrift findet sich keinerlei Hinweis auf die cyclische Natur der erfindungsgemäßen Peptide. Ferner wurde diese PCT-Anmeldung nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.
WO-99/64442 des IRBM, die ebenfalls nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht ist, beschreibt Oligopeptide mit Ketosäuren an P1.
WO-99/50230 der Fa. Vertex Pharmaceuticals (veröffentlicht am 7. Oktober 1999) wurde ebenfalls nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht. Trotzdem findet sich in dieser Druckschrift nicht der entfernteste Hinweis auf eines der erfindungsgemäßen cyclischen Peptide.
WO-00/09543 der Fa. Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. (veröffentlicht am 24. Februar 2000) ist ebenfalls nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht. Auch diese Druckschrift legt nicht im entferntesten irgendwelche cyclischen Peptide der vorliegenden Erfindung nahe.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass makrocyclische Peptide bereitgestellt werden, die eine Hemmwirkung gegen NS3-Protease des Hepatitis C-Virus aufweisen.
Ein weiterer Vorteil eines Aspekts der vorliegenden Erfindung besteht in der Tatsache, dass diese Peptide spezifisch die NS3-Protease hemmen und keine signifikante Hemmwirkung gegen andere Serin-proteasen ausüben, z. B. gegen humane Leukozyten-elastase (HLE), Schweinepankreas-elastase (PPE) oder Rinderpankreas-chymotrypsin, oder gegen Cystein-proteasen, wie Humanlebercathepsin B (Cat B).
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass kleine Peptide von geringem Molekulargewicht bereitgestellt werden, die dazu befähigt sind, in die Zellmembranen einzudringen und die NS3-Protease-Aktivität in Zellkultur zu hemmen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht in der Tatsache, dass sie in beiden Hauptgenotypen, die in klinischen Isolaten auftreten (1a & 1b) aktiv sind, was stark darauf hinweist, dass diese Verbindungen gegen alle derzeit bekannten Genotypen von HCV aktiv sind.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Unter den Umfang der Erfindung fallen Verbindungen der Formel (I)
worin W CH oder N ist,
R²¹ N, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Nalogenalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, Hydroxy oder N(R²³)₂ ist,
worin R²³ jeweils unabhängig H, C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist;
R²² H, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Halogenalkyl, C_1–6-Thioalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, C_2–7-Alkoxyalkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C₆ oder C₁₀-Aryl oder Het ist, worin Het ein 5-, 6- oder 7-gliedriger gesättigter oder ungesättigter Heterocyclus ist, der 1 bis 4 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel enthält;
wobei Cycloalkyl, Aryl oder Het mit R²⁴ substituiert sind,
worin R²⁴ H, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, NO₂, N(R²⁵)₂, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-NH-R²⁵ ist, worin jedes R²⁵ unabhängig N, C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist;
oder R²⁴ NH-C(O)-OR²⁶ ist, worin R²⁶ C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist;
R³ Hydroxy, NH₂ oder eine Gruppe der Formel -NH-R³¹ ist, worin R³¹ C₆- oder C₁₀-Aryl , Heteroaryl, -C(O)-R³², -C(O)-OR³² oder -C(O)-NHR³² ist,
worin R³² C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist,
D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 5 bis 10 Atomen ist, die gegebenenfalls 1 bis 3 Heteroatome enthält, die unabhängig ausgewählt sind aus O, S oder N-R⁴¹, worin
R⁴¹ H, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl oder -C(O)-R⁴² ist, worin R⁴² C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl oder C₆- oder C₁₀-Aryl ist;
R⁴ H oder von 1 bis 3 Substituenten an irgendeinem Kohlenstoffatom der Kette D ist, wobei der Substituent unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C_1–6-Alkyl, C_1–6-Halogenalkyl, C_1–6-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amino, Oxo, Thio oder C_1–6-Thioalkyl,
und
A ein Amid der Formel -C(O)-NH-R⁵ ist, worin R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C_1–8-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7–16-Aralkyl;
oder A eine Carbonsäure ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Unter den Umfang der Erfindung fällt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine bezüglich Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder ein therapeutisch annehmbares Salz oder einen therapeutisch annehmbaren Ester davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium oder Hilfsmittel umfasst.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung beinhaltet die Verwendung der Verbindung der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Replikation von Hepatitis C-Virus.
Ein weiterer wichtiger Aspekt beinhaltet die Verwendung der Verbindung der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe einer Hepatitis C-Virusinfektion.
Gemäß einer Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ein zusätzliches immunomodulatorisches Mittel. Zu Beispielen für zusätzliche immunomodulatorische Mittel gehören (ohne Beschränkung hierauf) α-, β- und δ-Interferone.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich ein antivirales Mittel enthalten. Zu Beispielen für antivirale Mittel gehören Ribavirin und Amantadin.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich andere Inhibitoren von HCV-Protease enthalten.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich einen Inhibitor von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus enthalten, wie Helicase, Polymerase, Metalloprotease oder IRES.
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Definitionen
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben die nachstehend angegebenen Definitionen die folgenden Bedeutungen.
Sofern die Symbole (R) oder (S) zur Bezeichnung der absoluten Konfiguration eines Substituenten, z. B. R⁴ der Verbindung der Formel I, verwendet werden, erfolgt die Bezeichnung im Zusammenhang mit der gesamten Verbindung und nicht im Zusammenhang mit dem Substituenten allein.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "P1, P2 und P" beziehen sich auf die Position der Aminosäurereste, ausgehend vom C-terminalen Ende der Peptidanalogen in Richtung zum N-Terminus (d. h. P1 bezieht sich auf die Position 1 vom C-Terminus aus, P2 auf die zweite Position vom C-Terminus aus und dergl.) (vergl. A. Berger & I. Schechter, Transactions of the Royal Society London Series B257 (1970), S. 249–264).
Der hier verwendete Ausdruck "1-Aminocyclopropylcarbonsäure" (ACCA) bezieht sich auf eine Verbindung der folgenden Formel
Der hier verwendete Ausdruck "Vinyl-ACCA" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel
Der hier verwendete Ausdruck "Homoallyl-ACCA" bezieht sich auf eine
Der hier verwendete Ausdruck "Halogen" bezieht sich auf einen Halogensubstituenten, der unter Brom, Chlor, Fluor oder Iod ausgewählt ist.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1–6-Halogenalkyl", der allein oder in Kombination mit einem anderen Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf acyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylsubstituenten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei ein oder mehr Wasserstoffatome durch ein Halogenatom, das unter Brom, Chlor, Fluor oder Iod ausgewählt ist, substituiert sind.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1–6-Thioalkyl", der allein oder in Kombination mit einem anderen Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf acyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylsubstituenten, die eine Thiolgruppe enthalten, z. B. Thiopropyl.
Die hier verwendeten Ausdrücke "C_1–6-Alkyl" oder "(nieder)-Alkyl", die allein oder in Kombination mit einem anderen Substituenten verwendet werden, beziehen sich auf acyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylsubstituenten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, 1-Methylethyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl und 1,1-Dimethylethyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3–6-Cycloalkyl", der allein oder in Kombination mit einem anderen Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf einen Cycloalkylsubstituenten, der 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Der Ausdruck umfasst Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Der Ausdruck "ungesättigtes Cycloalkyl" umfasst beispielsweise den Substituenten Cyclohexenyl der Formel
Der hier verwendete Ausdruck "gesättigtes oder ungesättigtes Alkylen" bezieht sich auf einen zweiwertigen Alkylsubstituenten, der sich von einem gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten, aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung von jeweils einem Wasserstoffatom von jedem Ende ableitet. Zu Beispielen hierfür gehören -CH₂CH₂C(CH₃)₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH=CHCH₂CH₂-oder -CH₂C-CCH₂CH₂-. Diese Alkylkette kann gegebenenfalls ein Heteroatom, wie Sauerstoff, enthalten (z. B. CH₃-CH₂-O-CH₂-).
Der hier verwendete Ausdruck "C_1–6-Alkoxy", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf den Substituenten -O-C_1–6-Alkyl, wobei der Alkylrest wie vorstehend definiert bis zu 6 Kohlenstoffatome enthält. Alkoxy umfasst Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy und 1,1-Dimethylethoxy. Der letztgenannte Substituent ist allgemein als tert.-Butoxy bekannt.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3–6-Cycloalkyl", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf den Substituenten -O-C_3–6-Cycloalkyl, der 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1–6-Alkoxyalkyl" bezieht sich auf den Substituenten C_1–6-Alkyl-O-C_1–6-alkyl, wobei Alkyl gemäß der vorstehenden Definition bis zu 6 Kohlenstoffatome enthält. Beispielsweise bedeutet Methoxymethyl -CH₂-O-CH₃.
Der hier verwendete Ausdruck "C_2–7-Acyl", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf eine C_1–6-Alkylgruppe, die über eine Carbonylgruppe gebunden ist, z. B. -C(O)-C_1–6-Alkyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C₆- oder C₁₀-Aryl", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf ein aromatisches monocyclisches System mit einem Gehalt an 6 Kohlenstoffatomen oder auf ein aromatisches bicyclisches System mit einem Gehalt an 10 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise umfasst Aryl ein Phenyl- oder ein Naphthyl-Ringsystem.
Der hier verwendete Ausdruck "C_7–16-Aralkyl", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf einen Arylrest gemäß der vorstehenden Definition, der über eine Alkylgruppe gebunden ist, wobei Alkyl gemäß der vorstehenden Definition 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Aralkyl umfasst beispielsweise Benzyl und Butylphenyl.
Der hier verwendete Ausdruck "Het", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf einen einwertigen Substituenten, der von einem 5-, 6- oder 7-gliedrigen, gesättigten oder ungesättigten (einschließlich aromatischen) Heterocyclus, der 1 bis 4 unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählte Heteroatome enthält, durch Entfernen eines Wasserstoffatoms abgeleitet ist. Zu Beispielen für geeignete Heterocyclen gehören: Tetrahydrofuran, Thiophen, Diazepin, Isoxazol, Piperidin, Dioxan, Morpholin, Pyrimidin oder
Der Ausdruck "Het" umfasst ferner einen Heterocyclus gemäß der vorstehenden Definition, der mit einem oder mehreren Ringen, bei denen es sich um einen Heterocyclus oder einen beliebigen anderen Ring handeln kann, fusioniert ist. Ein derartiges Beispiel ist Thiazolo[4,5-b)pyridin.
Der hier verwendete Ausdruck "Heteroaryl" fällt zwar allgemein unter den Ausdruck "Het", bedeutet aber präzise einen ungesättigten Heterocyclus, bei dem die Doppelbindungen ein aromatisches System bilden. Zu geeigneten Beispielen für heteroaromatische Systeme gehören: Chinolin, Indol, Pyridin,
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Ester", der entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten verwendet wird, bezieht sich auf Ester der Verbindung der Formel I, bei denen beliebige Carboxylfunktionen des Moleküls, vorzugsweise jedoch der Carboxyterminus, durch eine Alkoxycarbonylfunktion ersetzt sind:
worin der Rest R des Esters unter Alkyl, (z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, tert.-Butyl, n-Butyl); Alkoxyalkyl (z. B. Methoxymethyl); Alkoxyacyl (z. B. Acetoxymethyl); Aralkyl (z. B. Benzyl); Aryloxyalkyl (z. B. Phenoxymethyl); Aryl (z. B. Phenyl), die gegebenenfalls durch Halogen, C_1–4-Alkyl oder C_1–4-Alkoxy substituiert sind, ausgewählt ist. Weitere geeignete Arzneistoffvorstufen-Ester finden sich in Design of prodrugs, Bundgaard, H. Ed. Elsevier (1985) (auf diese Literaturstelle wird durch Verweis Bezug genommen). Derartige pharmazeutisch annehmbare Ester werden üblicherweise dann, wenn sie einem Säugetier injiziert werden, in vivo hydrolysiert und in die Säureform der Verbindung der Formel I umgewandelt.
Was die vorstehend beschriebenen Ester betrifft, so enthalten etwaige vorhandene Alkylreste vorzugsweise 1 bis 16 Kohlenstoffatome und insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatome. Etwaige vorhandene Arylreste in derartigen Estern umfassen vorteilhafterweise eine Phenylgruppe.
Insbesondere kann es sich bei den Estern um einen C_1–16-Alkylester, einen unsubstituierten Benzylester oder um einen Benzylester, der mit mindestens einem Halogenatom, einer C_1–6-Alkylgruppe, einer C_1–6-Alkoxygruppe, einer Nitrogruppe oder einer Trifluormethylgruppe substituiert ist, handeln.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Salz" umfasst Salze, die sich von pharmazeutisch verträglichen Basen ableiten. Zu Beispielen für geeignete Basen gehören Cholin, Ethanolamin und Ethylendiamin. Na⁺-, K⁺- und Ca⁺⁺-Salze fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung (vergl. auch Pharmaceutical salts, S. M. Birge et. al., J. Pharm. Sci., Bd. 66 (1977), S. 1–19; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht).
Bevorzugte Ausführungsformen
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen, wobei das 1-Kohlenstoffzentrum die R-Konfiguration aufweist und D syn zum Amid gebunden ist oder syn zu A gebunden ist, wie durch die Strukturen (i) und (ii) dargestellt ist:
Insbesondere ist der Linker D syn zu A gebunden, wie durch die Struktur (ii) dargestellt ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen, wobei im Rest der Formel
W vorzugsweise N bedeutet.
Vorzugsweise hat R²¹ die Bedeutung N, C_1–6-Alkyl, C_1–6-Alkoxy, Hydroxy, Chlor oder N(R²³)₂, wobei R²³ vorzugsweise H oder C_1–6-Alkyl bedeutet. Insbesondere bedeutet R²¹ H oder C_1–6-Alkoxy. Besonders bevorzugt ist für R²¹ die Bedeutung Methoxy.
Vorzugsweise bedeutet R²² H, C_1–6-Thioalkyl, C_1–6-Alkoxy, Phenyl oder Het, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Vorzugsweise hat R²⁴ die Bedeutung H, C_1–6-Alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-NH-R²⁵ oder NH-C(O)-OR²⁶.
Insbesondere hat R²² die Bedeutung C_1–4-Alkoxy, Phenyl oder Het, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
Insbesondere hat R²⁴ die Bedeutung H, C_1–6-Alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-OR²⁶.
Besonders bevorzugt ist für R²² die Bedeutung Ethoxy oder Het, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
Besonders bevorzugt für R^24a sind die Bedeutungen NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-OR²⁶. Ganz besonders bevorzugt für R^24b sind die Bedeutungen H oder C_1–6-Alkyl.
Vorzugsweise bedeutet jeder Rest R²⁵ unabhängig voneinander H, C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl. Insbesondere bedeutet R²⁵ C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl. Besonders bevorzugt für R²⁵ ist die Bedeutung C_1–6-Alkyl.
Vorzugsweise bedeutet R²⁶ C_1–6-Alkyl.
R3
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen, wobei der Rest R3 vorzugsweise ein Amid der Formel NH-C(O)-R³², einen Harnstoff der Formel NH-C(O)-NH-R³² oder ein Carbamat der Formel NH-C(O)-OR³² bedeutet. Insbesondere bedeutet R³ ein Carbamat oder einen Harnstoff. Ganz besonders bevorzugt ist für R³ die Bedeutung Carbamat.
Vorzugsweise bedeutet R³² C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl. Insbesondere bedeutet R+ C_1–6-Alkyl oder C_4–6-Cycloalkyl. Ganz besonders bevorzugt für R³² sind die Bedeutungen tert.-Butyl, Cyclobutyl oder Cyclopentyl.
D
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I, wobei der Linker D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 6 bis 8 Atomen aufweist. Insbesondere handelt es sich beim Linker D um eine Kette mit 7 Atomen.
Vorzugsweise enthält die Kette D ein oder zwei Heteroatome, die unter O, S, NH, N-C_1–6-Alkyl oder N-C_2–7-Acyl ausgewählt sind. Insbesondere enthält die Kette D gegebenenfalls ein Heteroatom, das unter NH oder N-C_2–7-Acyl ausgewählt ist, wobei es sich ganz besonders um N(Ac) handelt, wobei das Heteroatom als Atom 10 der Kette angeordnet ist. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die ein Stickstoffatom enthaltende Kette gesättigt ist.
Alternativ enthält D ein Heteroatom, das unter O oder S ausgewählt ist. Wenn D eine Länge von 7 Atomen aufweist, befindet sich das O oder S-Atom vorzugsweise in Position 9 der Kette. Vorzugsweise ist diese Kette mit R⁴ substituiert, wobei R⁴ die Bedeutung N oder C_1–6-Alkyl hat. Insbesondere bedeutet R⁴ H oder Methyl. Ganz besonders bevorzugt sind für R⁴ die Bedeutungen H oder 8-(S)-Me. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass D gesättigt ist. Alternativ enthält D eine Doppelbindung an der Position 11, 12. Vorzugsweise weist diese Doppelbindung die trans-Konfiguration auf.
Alternativ bedeutet D eine vollständig aus Kohlenstoffatomen bestehende, gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette. In diesem Fall ist D vorzugsweise gesättigt und weist eine Länge von 7 Atomen auf. Insbesondere ist D mit R⁴ substituiert, wobei R⁴ die Bedeutung H, Oxo, Thio, Hydroxy, Thioalkyl, Alkoxy oder Alkyl hat. Insbesondere bedeutet R⁴ H oder C_1–6-Alkyl. Ganz besonders bevorzugt sind für R⁴ die Bedeutungen H oder Methyl. Besonders bevorzugt ist es, dass R⁴ H oder 10-(S)-Me bedeutet.
Alternativ bedeutet D eine vollständig aus Kohlenstoffatomen bestehende Alkylenkette, die vorzugsweise eine Doppelbindung enthält und eine Länge von 7 Atomen aufweist. Insbesondere befindet sich diese Doppelbindung an der Position 13, 14 der Kette. Insbesondere weist diese Doppelbindung die cis-Konfiguration auf. Vorzugsweise ist diese Kette D mit R⁴ substituiert, wobei R⁴ die Bedeutungen H, Oxo, Hydroxy, Alkoxy oder Alkyl hat. Insbesondere hat R⁴ die Bedeutungen H oder C_1–6-Alkyl. Ganz besonders bevorzugt sind für R⁴ die Bedeutungen H oder Methyl. Am meisten bevorzugt sind für R⁴ die Bedeutungen H oder 10-(S)-Me.
A
Zu bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören Verbindungen der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen, wobei es sich bei A um eine Carbonsäure handelt.
Spezielle Ausführungsformen
Zu bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören Verbindungen der Formel I gemäß den vorstehenden Ausführungen, wobei folgende Bedeutungen vorliegen:
R² bedeutet einen Chinolinsubstituenten (d. h. W hat die Bedeutung N);
R³ bedeutet eine Gruppe der Formel -NH-C(O)-NHR³² oder -NH-C(O)-OR³²,
wobei R³² C_1–4-Alkyl oder C_4–6-Cycloalkyl bedeutet;
D bedeutet eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen, die mit R¹ in syn-Konfiguration zu A verknüpft ist und gegebenenfalls ein oder zwei Heteroatome enthält, die unabhängig voneinander sind und unter O, S oder N-R⁴¹ ausgewählt sind, wobei R⁴¹ die Bedeutung C_2–7-Acyl hat;
R⁴ bedeutet H oder 1 bis 3 Substituenten, die unabhängig voneinander unter Hydroxy oder C_1–6-Alkyl ausgewählt sind; und
A bedeutet eine Carbonsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen pharmazeutisch annehmbaren Ester davon.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen hat; R²¹ H oder Methoxy bedeutet;
R²² C_1–6-Alkoxy oder Het bedeutet, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist
wobei R^24a H, C_1–6-Alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-NH-R²⁵ bedeutet,
wobei R²⁵ H, C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl bedeutet;
oder R^24a NH-C(O)-OR²⁶ bedeutet, wobei R²⁶ C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl bedeutet;
und R^24b H oder C_1–6-Alkyl bedeutet;
R³ einen Harnstoff der Formel NH-C(O)-NHR³² oder ein Carbamat der Formel NH-C(O)-OR³² bedeutet, wobei R³² C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl bedeutet;
D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 7 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls eine Doppelbindung in der Position 11, 12 oder 13, 14 enthält;
wobei die Kette D gegebenenfalls ein Heteroatom enthält, das unabhängig unter O, S, NH, N(Me) oder N(Ac) ausgewählt ist; und
R⁴ H oder C_1–6-Alkyl bedeutet.
Ganz besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formel I, wobei R²¹ Methoxy bedeutet und R²² Ethoxy oder einen Rest der folgenden Formel bedeutet
wobei R^24a einen Rest der Formeln NH-(C_1–4-Alkyl), NH-C(O)-(C_1–4-Alkyl}; oder NH-C(O)-O-(C_1–4-Alkyl) bedeutet; und
D gesättigt ist oder eine cis-Doppelbindung in der Position 13, 14 enthält.
Schließlich fallen unter den Umfang der Erfindung sämtliche Verbindungen der Formel I, die in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführt sind.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral, parenteral oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Eine orale Verabreichung oder eine Verabreichung durch Injektion werden bevorzugt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können beliebige herkömmliche nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe, Hilfsmittel oder Vehikel enthalten. In einigen Fällen kann der pH-Wert der Zubereitung mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren, Basen oder Puffern eingestellt werden, um die Stabilität der zubereiteten Verbindung oder ihrer Abgabeform zu erhöhen. Der hier verwendete Ausdruck "parenteral" umfasst eine subkutane, intrakutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale und intraläsionale Injektion oder Infusion.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines sterilen, injizierbaren Präparats vorliegen, z. B. als eine sterile injizierbare wässrige oder ölartige Suspension. Diese Suspension kann nach bekannten Techniken unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel (z. B. Tween 80) und Suspendiermittel zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf oralem Wege in beliebigen, oral annehmbaren Dosierungsformen verabreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen gehören. Im Fall von Tabletten für die orale Anwendung umfassen herkömmlicherweise verwendete Trägerstoffe Lactose und Maisstärke. Typischerweise werden auch Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, zugesetzt. Für die orale Verabreichung in Kapselform gehören zu geeigneten Verbindungsmitteln Lactose und getrocknete Maisstärke. Bei Verabreichung von wässrigen Suspensionen auf oralem Wege wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln vereinigt. Gegebenenfalls können bestimmte Süßungsmittel und/oder Aromastoffe und/oder farbgebende Mittel zugesetzt werden.
Weitere geeignete Vehikel oder Trägerstoffe für die vorerwähnten Zubereitungen und Zusammensetzungen finden sich in üblichen pharmazeutischen Handbüchern, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Science", 19. Auflg., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995.
Dosierungen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag der hier beschriebenen Protease-Inhibitor-Verbindungen eignen sich bei einer Monotherapie zur Prophylaxe und Therapie von HCV-vermittelten Krankheiten. Typischerweise werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 1- bis etwa 5-mal täglich oder alternativ in Form einer kontinuierlichen Infusion verabreicht. Eine derartige Verabreichung kann als eine chronische oder akute Therapie eingesetzt werden. Die Menge des Wirkstoffes, die mit den Trägermaterialien vereinigt werden kann, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, hängt von dem zu behandelnden Wirt und dem speziellen Verabreichungsweg ab. Ein typisches Präparat enthält etwa 5 bis etwa 95% Wirkstoff (Gew./Gew.). Vorzugsweise enthalten derartige Präparate etwa 20 bis etwa 80% Wirkstoff.
Wie es für den Fachmann ersichtlich ist, können im Vergleich zu den vorerwähnten Dosen niedrigere oder höhere Dosen erforderlich sein. Spezielle Dosierungs- und Behandlungsschemata für jeden speziellen Patienten hängen von einer Reihe von Faktoren ab, wozu die Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, das Alter, das Körpergewicht, der allgemeine Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Nahrung, der Zeitpunkt der Verabreichung, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, die Arzneistoffkombination, die Schwere und der Verlauf der Infektion, die Anfälligkeit des Patienten für die Infektion und die Beurteilung des behandelnden Arztes gehören. Im allgemeinen wird die Behandlung mit geringen Dosen, die erheblich unter der optimalen Dosis des Peptids liegen, eingeleitet. Anschließend wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis unter den gegebenen Umständen die optimale Wirkung erzielt wird. Im allgemeinen wird die Verbindung insbesondere in einem Konzentrationsbereich verabreicht, der allgemein eine antivirale Wirksamkeit ergibt, ohne dass irgendwelche schädlichen oder nachteiligen Nebenwirkungen hervorgerufen werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Kombination einer Verbindung der Formel I und einen oder mehrere zusätzliche therapeutische oder prophylaktische Mittel enthalten, so sollen die Verbindung und das zusätzliche Mittel in Dosierungsmengen von etwa 10 bis 100% und vorzugsweise von etwa 10 bis 80% der Dosierung, die normalerweise bei einer Monotherapie verabreicht wird, vorliegen.
Wenn diese Verbindungen oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zubereitet werden, so kann die erhaltene Zusammensetzung in vivo an Säugetiere, z. B. an den Menschen, verabreicht werden, um HCV-NS3-Protease zu hemmen oder um eine HCV-Virusinfektion zu behandeln oder zu verhindern. Eine derartige Behandlung kann auch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit Mitteln erreicht werden, zu denen (ohne Beschränkung hierauf) folgende Mittel gehören: immunomodulatorische Mittel, wie α-, β-, oder γ-Interferone; andere antivirale Mittel, wie Ribavirin und Amantadin; andere Inhibitoren von HCV-NS3-Protease; Inhibitoren von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase, Metalloprotease oder eine interne Ribosomen-Zugangsstelle (internal ribosome entry site = IRES); oder Kombinationen davon. Die zusätzlichen Mittel können mit den erfindungsgemäßen Verbindungen unter Schaffung einer einzelnen Dosierungsform kombiniert werden. Alternativ können diese zusätzlichen Mittel getrennt einem Säugetier als Bestandteil einer Mehrfachdosierungsform verabreicht werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Hemmung der HVC-NS3-Protease-Aktivität in Säugetieren bereitgestellt, indem man eine Verbindung der Formel I verabreicht, wobei die Substituenten die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verfahren zur Verringerung der HCV-NS3-Protease-Aktivität in einem Säugetier. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff enthält, können derartige Verfahren zusätzlich die Stufe der Verabreichung eines unter folgenden Mitteln ausgewählten Mittels an das Säugetier umfassen: ein immunomodulatorisches Mittel, ein antivirales Mittel, ein HCV-Protease-Inhibitor oder ein Inhibitor von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase oder Metalloprotease. Ein derartiges zusätzliches Mittel kann dem Säugetier vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verfahren zur Hemmung der viralen Replikation in einem Säugetier. Derartige Verfahren eignen sich zur Therapie oder Prophylaxe von HCV-Erkrankungen. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff enthält, können derartige Verfahren zusätzlich die Stufe der Verabreichung eines unter folgenden Mitteln ausgewählten Mittels an das Säugetier umfassen: ein immunomodulatorisches Mittel, ein antivirales Mittel, ein HCV-Protease-Inhibitor oder ein Inhibitor von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus. Ein derartiges zusätzliches Mittel kann dem Säugetier vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht werden.
Die vorstehend dargelegten Verbindungen können auch als Laboratoriumsreagenzien verwendet werden. Die Anmelderin stellt erstmals Verbindungen mit einem niedrigen Molekulargewicht bereit, die eine hohe Aktivität und Spezifität gegen die HCV-NS3-Protease besitzen. Einige der vorliegenden Verbindungen können als Instrumente bei der Bereitstellung von Forschungswerkzeugen zur Konzeption von Tests auf virale Replikation, für die Validierung von tierischen Testsystemen und für strukturelle biologische Untersuchungen zur weiteren Aufklärung der HCV-Krankheitsmechanismen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Behandlung oder Verhinderung von viralen Verunreinigungen von Materialien und somit zur Verringerung der Gefahr von viralen Infektionen von Laboratoriumspersonal oder medizinischem Personal oder von Patienten, die in Kontakt mit derartigen Materialien kommen (z. B. Blut, Gewebe, chirurgische Instrumente und Kleidungsstücke, Laboratoriumsinstrumente oder -kleidungsstücke sowie Blutsammel- oder -transfusionsvorrichtungen und -materialien), verwendet werden.
Methodik
Mehrere Wege zur Durchführung der Synthese von acyclischen Zwischenprodukten der Verbindungen der Formel I sind in WO-00/09543 und WO-00/09558 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden nach dem allgemeinen Verfahren, das in den Schemata I, II und III dargestellt ist, synthetisiert (wobei PG eine geeignete Schutzgruppe bedeutet). (In sämtlichen nachstehend dargestellten Schemata hat D' die gleiche Bedeutung wie D, ist jedoch um 2 bis 5 Atome kürzer).
Wenn die Erfindung Verbindungen der Formel I betrifft, bei denen A ein Nsubstituiertes Amid bedeutet, wird Vinyl-ACCA oder Homoallyl -ACCA vor der Kupplung an P2 an ein geeignetes Amin gekuppelt. Eine derartige Kupplung ist dem Fachmann geläufig. Wie es für den Fachmann ersichtlich ist, ist ein derartiges Amid (A) nicht geschützt, sondern trägt etwaige einschlägige Substituenten R⁵ gemäß der vorstehenden Definition. Die Ringschlussreaktion (Makrocyclisierung) wird entweder durch Olefin-Metathese (Schema I) durchgeführt oder, wenn der Linker ein Stickstoffatom enthält, durch reduktive Aminierung (Schema II) oder durch Bildung einer Peptidbindung (Schema III).
Einzelheiten über diese Verfahren sind nachstehend aufgeführt. A. Makrocyclisierung über eine Olefin-Metathese Schema I
Die Erfindung betrifft ferner Zwischenprodukte der Formeln (A), (D), (E) und
wobei X die Bedeutung PG oder R² hat;
jedes PG unabhängig voneinander eine Schutzgruppe bedeutet;
R² eine Gruppe der Formel
bedeutet, wobei R²¹, R²² und W die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben;
A' eine geschützte Carbonsäure bedeutet;
worin X, A' und PG die für die Formeln (A) und (B) definierten Bedeutungen haben;
n 0 oder 2 bedeutet;
D' die gleiche Bedeutung wie D hat, jedoch 2 bis 5 Atome kürzer ist; und
D die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat;
worin R² die vorstehend für die Formeln (A) und (B) definierten Bedeutungen hat, R³ und D die für die Formel (I) definierten Bedeutungen haben und
A' eine geschützte Carbonsäure bedeutet.
Schema I
Es gibt zur Durchführung der Kupplungssequenz mehrere Wege, die für den Fachmann leicht ersichtlich sind. Ausgehend von 4-(S)-Hydroxyprolin kann der Substituent an der 4-Hydroxygruppe über eine Mitsunobu-Reaktion (beschrieben von Mitsunobu, Synthesis, Januar 1981, S. 1–28; Rano et. al., Tet. Lett., Bd.36 (1994), S. 3779–3792; Krchnak et. al., Tet. Lett., Bd. 36 (1995), S. 6193–6196) vor oder nach der Makrocyclisierung eingebaut werden. Alternativ kann der Aufbau mit dem erforderlichen 4-(R)-hydroxysubstituierten Prolin gemäß dem allgemeinen Verfahren von WO-00/09543 und WO-00/09558 (vergl. die nachstehenden Ausführungen bezüglich spezieller Beispiele für diese Fragmente) vorgenommen werden.
Stufen A, B, C
Kurz zusammengefasst, die Reste P1, P2 und P3 können gemäß bekannten Peptid-Kupplungstechniken verknüpft werden; vergl. die allgemeine Beschreibung in WO-00/09543 und WO-00/09558 .
Stufe D
Die Bildung des Makrocyclus kann über eine Olefin-Metathese unter Verwendung eines Katalysators auf Ru-Basis durchgeführt werden, beispielsweise mit einem Katalysator gemäß S. J. Miller, H. E. Blackwell, R. N. Grubbs, J. Am. Chem. Soc., Bd. 118 (1996), S. 9606–9614 (a); J. S. Kingsbury, J. P. A. Harrity, P. J. Bonitatebus, A. H. Hoveyda, J. Am. Chem. Soc., Bd. 121 (1999), S. 791–799 (b); und J. Huang, E. D. Stevens, S. P. Nolan, J. L. Petersen, J. Am. Chem. Soc., Bd. 121 (1999), S. 2674–2678 (c). Es ist ersichtlich, dass für diese Reaktion Katalysatoren verwendet werden können, die andere Übergangsmetalle enthalten, z. B. Mo.
Stufe E
Gegebenenfalls wird die Doppelbindung durch übliche Hydrierungsverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, reduziert. Wenn es sich bei A' um eine geschützte Carbonsäure handelt, wird diese ebenfalls in geeigneter Weise von Schutzgruppen befreit.
B. Makrocyclisierung über eine reduktive Aminierung (für Linker mit einem Gehalt an N)
Wenn der Linker ein Stickstoffatom enthält, wird die Makrocyclisierung durch reduktive Aminierung gemäß Schema II durchgeführt, wodurch man Inhibitoren der allgemeinen Struktur II erhält. Schema 11
Stufe A
Eine Hydroborierung der Doppelbindung gemäß dem Verfahren von Brown (H. C. Brown und B. C. Subba Rao, J. Am. Chem. Soc., Bd. 81 (1959), S. 6434–6437) unter anschließender Oxidation des erhaltenen Alkohols (beispielsweise über Dess-Martin-Periodinan, J. Am. Chem. Soc., Bd. 113 (1991), S. 7277–7287) liefert den entsprechenden Aldehyd.
Stufe B
Eine Hydrierung in Gegenwart von Säure führt zur Entfernung der Aminoschutzgruppe, wonach eine Makrocyclisierung über eine reduktive Aminierung erfolgt. Die bei dieser Synthese verwendete P3-Einheit lässt sich leicht aus verschiedenen Aminosäuren, wie Lysin, Ornithin, Glutamin (gemäß einer Hofmann-Reaktion, Ber., Bd. 14 (1881), S. 2725) und andere, erhalten. Diese Synthesemodifikationen stellen aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren dar.
Stufe C
Gegebenenfalls wird das sekundäre Amin im Linker D (gebildet nach der Stufe D) mit Alkylhalogeniden alkyliert oder mit Alkyl- oder Arylsäurechloriden acetyliert, wobei man sich bekannter Verfahren bedient, wodurch man Inhibitoren der allgemeinen Strukturformel II erhält. Wenn A' eine geschützte Carbonsäure bedeutet, wird sie ebenfalls in entsprechender Weise von Schutzgruppen befreit.
Die Erfindung betrifft ferner Zwischenprodukte der Formeln (J), (K) und (L):

wobei R² der Definition für die Formeln (A) und (B) entspricht und R³ die für die Formel (I) definierten Bedeutungen hat;
m einen Wert von 1 bis 5 hat;
n einen Wert von 1 bis 5 hat;
A' eine geschützte Carbonsäure bedeutet;
und Cbz Benzyloxycarbonyl bedeutet.
C. Makrocyclisierung über eine Lactambildung
Alternativ lassen sich diese makrocyclischen Verbindungen der allgemeinen Strukturformeln I und II auch auf anderen Wegen synthetisieren. Beispielsweise können P1 und P3 zunächst mit dem Linker D verbunden und anschließend an P2 gekuppelt werden, wobei es sich bei der Makrocyclisierungsreaktion um eine Lactambildung gemäß zwei möglichen Wegen handelt, wie der Fachmann erkennt und in Schema III dargestellt ist. Schema III
Synthese von P1
Die Synthese von Inhibitoren der allgemeinen Strukturformeln I und II erfordert die gleichen P1-Fragmente:

a) Vinyl-ACCA, dessen Synthese und Auftrennung in WO-00/09543 und WO-00/09558 beschrieben ist, oder
b) Homoallyl-ACCA (Beispiel 1, Verbindung 1f).

Synthese von P2
Einige der für die Synthese der Verbindungen der Formel I verwendeten P2-Fragmente sind in WO-00/09543 und WO-00/09558 beschrieben.
Weitere P2-Fragmente werden folgendermaßen synthetisiert: a. Synthese von 2-"Het"-4-Hydroxy-7-methoxychinolin-Derivaten (i) Weg, ausgehend von der entsprechenden "Het"-Carbonsäure IVb Schema IV
Die Synthese wird gemäß einem modifizierten Verfahren von Li et. al., J. Med. Chem., Bd. 34 (1994), S. 3400–3407, durchgeführt. Das Zwischenprodukt IVa, in dem R21 = OMe (Beispiel 7, Verbindung 7b), wird gemäß Brown et. al., J. Med. Chem., Bd. 32 (1989), S. 807–826, hergestellt.
Stufe A
Das Zwischenprodukt IVa wird mit heterocyclischen Carbonsäuren IVb unter basischen Bedingungen mit POCl₃ zur Aktivierung der Carboxylatgruppe gekuppelt. Verschiedene Carbonsäuren der allgemeinen Strukturformel IVb werden zur Herstellung von Inhibitoren verwendet. Diese sind entweder handelsüblich, werden gemäß den Schemata V, VI und VII synthetisiert oder werden individuell unter Verwendung von in den speziellen Beispielen beschriebenen Verfahren synthetisiert.
Stufe B
Ein Ringschluss und eine anschließende Dehydratisierung wird unter basischen Bedingungen erreicht, wodurch man Chinoline der allgemeinen Strukturformel IVd erhält.
(i.a). Synthese von "Het"-Carbonsäuren der allgemeinen Formel IVb
Synthese von 2-(subst.)-Amino-4-carboxyaminothiazol-Derivaten (Vc)
Man bedient sich des modifizierten Verfahrens von Berdikhina et al., Chem. Heterocycl. Compd. (Engl. Transl.), Bd. 4 (1991), S. 427–433.
Schema V
Verschiedene 2-Alkylaminothiazolyl-4-carbonsäuren, Verbindungen der allgemeinen Strukturformel Vc, werden unter Anwendung des allgemeinen Syntheseverfahrens gemäß Schema V unter Verwendung von Thioharnstoffen (Va) mit verschiedenen Alkylsubstituenten (R²⁵ = Alkylgruppe) und 3-Brombrenztraubensäure hergestellt. Dieser Typ einer Kondensationsreaktion ist aus dem Stand der Technik bekannt. Alternativ werden P2-Fragmente, die die 2-Aminosubst.-thiazol-Derivate enthalten, aus dem entsprechenden 2-Carboxylderivat gemäß der Darstellung in Schema VI nach dem Verfahren von P. C. Unangst, D. T. Connor, J. Heterocyc. Chem., Bd. 29 (5) (1992), S. 1097–1100, synthetisiert. Schema VI
Beispiele für dieses Verfahren sind in WO-00/09543 und WO-00/09558 beschrieben.
Synthese von 2-Carboxy-4-subst.-aminothiazol-Derivaten VIId Verschiedene 4-Alkylthiazolyl-2-carbonsäuren, Verbindungen der allgemeinen Strukturformel VIId, werden unter Verwendung des allgemeinen Syntheseverfahrens gemäß der Darstellung in Schema VII hergestellt.
Schema VII
Es wird das von Janusz et. al., J. Med. Chem., Bd. 41 (1998), S. 3515–3529, beschriebene Verfahren unter folgenden Modifikationen eingehalten: Ethylthiooxamat (VIIa) wird mit verschiedenen β-Bromketonen der allgemeinen Strukturformel VIIb (R²⁴ = Alkylgruppe) unter Bildung von Thiazolylcarbonsäuren der allgemeinen Strukturformel VIId umgesetzt. Dieser Typ einer Kondensationsreaktion ist aus dem Stand der Technik bekannt.
Synthese von 2-Carboxy-(subst.)-imidazol-Derivaten (VIIIb)
Verschiedene Alkylimidazolyl-2-carbonsäuren, Verbindungen der allgemeinen Strukturformel VIIIb, werden gemäß dem allgemeinen Syntheseverfahren, das in Schema VIII dargestellt ist, hergestellt.
Schema VIII
Es wurde das von Baird et. al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 118 (1996), S. 6141–6146, beschriebene Verfahren herangezogen. Ein Alkylimidazol wird mit einer starken Base (z. B. nBuLi) deprotoniert und anschließend mit CO₂ unter Bildung der Carbonsäure VIIIb umgesetzt. Dieser Typ einer Kondensationsreaktion ist aus dem Stand der Technik bekannt.
b. Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(imidazolyl- oder pyrazolyl)chinolinen
4-Hydroxy-7-R21-chinoline mit einem Imidazolyl- oder Pyrazolylrest an C2 werden im allgemeinen unter Anwendung des in Schema IX dargestellten Verfahrens hergestellt. Schema IX
Die Synthese des Schlüsselzwischenprodukts (worin R²¹ = OMe) 4-Benzyloxy-2-chlor-7-methoxychinolin IXa, ist ausführlich in Beispiel 6 beschrieben (Verbindung 6e).
Stufe A
Bei hohen Temperaturen können verschiedene Imidazole, alkylsubstituierte Imidazole, Pyrazole oder alkylsubstituierte Pyrazole verwendet werden, um den 2-Chlorrest der Verbindung IXa unter Bildung von Verbindungen der allgemeinen Strukturformel IXb zu ersetzen.
Stufe B
Nach Entfernung der Benzylschutzgruppe vom 4-Hydroxyrest des Chinolins durch übliche Hydrierungsverfahren werden Chinolin-Derivate der allgemeinen Strukturformel IXc erhalten.
Synthese von P3
Verschiedene P3-Fragmente werden synthetisiert, die die entsprechende D-Linker-Erweiterung für die Makrocyclisierung durch Olefin-Metathese enthalten. Im allgemeinen werden P3-Einheiten mit einem Gehalt an einem terminalen Olefin für die Metathese gemäß den nachstehenden allgemeinen Schemata (Schemata X, XI und XII) synthetisiert.
Synthese von Linkern der Klasse A
Diese allgemeine Synthese wird zur Herstellung von Linkern herangezogen, die durchgehend auf Kohlenstoff basieren (kein Heteroatom) (Schema X).
Schema X
Die Synthese wird gemäß dem Verfahren von Evans et. al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 112 (1990), S. 4011–4030, durchgeführt.
Die Ausgangscarbonsäuren (Xa) sind handelsüblich oder werden nach aus der Literatur bekannten Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt.
Stufe A
Die Carbonsäure Xa wird mit Pivaloylchlorid aktiviert und anschließend mit dem Anion des chiralen unterstützenden 4(S)-4-(Phenylmethyl)-2-oxazolidinon gemäß Evans nach einem bekannten Verfahren umgesetzt (Übersichtsartikel: D. J. Ager et. al., Aldrichimica Acta, Bd. 30 (1997), S. 3–11, und die dort zitierten Literaturstellen), wodurch man Verbindungen der allgemeinen Strukturformel Xb erhält.
Stufe B
Eine stereoselektive α-Azidierung mit Trizylazid eines chiralen Imidenolats, wie sie beispielsweise aus Verbindungen der allgemeinen Strukturformel Xb in Gegenwart einer Base, wie KHMDS, entstehen, ist ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt (Übersichtsartikel: D. J. Ager et. al., Aldrichimica Acta, Bd. 30 (1997), S. 3–11, und die darin zitierten Literaturstellen).
Stufe C
Eine Reduktion des α-Azids unter Katalyse mit SnCl₂ und ein anschließender Schutz des gebildeten Amins in Form eines tert.-Butylcarbamats ergibt Zwischenprodukte der allgemeinen Strukturformel Xc. Diese Reaktionen sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt.
Stufe D
Schließlich wird das chirale Hilfsprodukt unter basischen Bedingungen, z. B. mit einem Gemisch aus H₂O₂ mit LiOH, hydrolysiert, wodurch man die Linker vom Aminosäuretyp der allgemeinen Strukturformel Xe erhält.
Alternativ werden P3-Reste der gleichen allgemeinen Strukturformel Xe gemäß dem Verfahren von M. J. Burk et. al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 120 (1998), S. 657–663 gemäß der Darstellung in Schema XI hergestellt. Diese Verbindungen variierten bezüglich der Anzahl der Methyleneinheiten (-CH₂-) entlang des Linkers (m = 1 bis 5) und der Substitution von Alkylgruppen bei R₄, enthielten aber kein Heteroatom.
Schema XI
Stufe A
Die Monosäure-Verbindung XIb wird aus handelsüblichem Diethyl-2-acetamidomalonat durch eine übliche Esterhydrolyse unter basischen Bedingungen hergestellt.
Stufe B
Eine Kondensation vom Knoevenagel-Typ zwischen einem Aldehyd der allgemeinen Strukturformel XIc und der Verbindung XIb in Gegenwart einer Base, wie Pyridin, sowie Essigsäureanhydrid führt zur Bildung eines Enamid-Zwischenprodukts XId mit der Z-stereochemischen Konfiguration um die neu gebildete Doppelbindung gemäß der Darstellung.
Stufe C
Eine regioselektive und enantioselektive katalytische Hydrierung des Enamid-Zwischenprodukts XId zum Aminosäure-Zwischenprodukt XIe wird unter Anwendung des Burk-Verfahrens erreicht.
Stufe D
Das Stickstoffatom des Acetamidoderivats XIe wird anschließend 2-fach durch Addition eines tert.-Butylcarbamat-Substituenten mit einer Schutzgruppe versehen, bevor die Acetatgruppe sowie der Ethylester unter üblichen basischen Bedingungen hydrolysiert werden, wodurch man P3-Reste der allgemeinen Strukturformel XIf erhält. Synthese von Linkern der Klasse B Allgemeine Struktur von Linkern der Klasse B
Diese allgemeine Synthese wird zur Herstellung von Linkern mit einem Gehalt an Sauerstoff oder Schwefel herangezogen. Schema XII
R = H oder CH₃
R² = H oder CH₃, jedoch bedeuten nicht beide R¹=R²=CH₃
Stufe A
In geeigneter Weise geschützte Aminosäuren, wie Boc-(L)-Serinmethylester, Boc-(L)-Threoninmethylester oder Boc-(L)-Allothreoninmethylester, werden mit Allyliodid in Gegenwart von Ag₂O unter Bildung des Methylesters XIIb alkyliert.
Stufe B
Die Hydrolyse des Methylesters unter üblichen basischen Bedingungen führt zu den Linkern vom Ethertyp der allgemeinen Strukturformel XIIc (X=O).
Stufe C
Das Schwefelanaloge wird aus der gleichen Ausgangsaminosäure XIIa (wie vorstehend in entsprechender Weise geschützt) hergestellt und seine Hydroxylgruppe wird in eine leicht austretende Gruppe (z. B. Tosylat-Zwischenprodukt XIId) unter Anwendung eines aus dem Stand der Technik üblichen Verfahrens umgewandelt.
Stufe D
Der Tosylrest wird anschließend durch das Anion von Thioacetat ersetzt, was zur Bildung des Thioester-Zwischenprodukts XIIe unter Inversion des chiralen Zentrums am β-Kohlenstoffatom führt.
Stufe E
Eine Hydrolyse des Thioesterrestes unter milden basischen Bedingungen führt zum freien Thiol XIIf.
Stufe F
Eine Alkylierung des Thiolrestes wird leicht unter basischen Bedingungen mit Allyliodid erreicht.
Stufe G
Schließlich wird das Sulfidanaloge XIIc (X=S) nach Hydrolyse des Methylesters unter Anwendung üblicher Verfahren erhalten.
Synthese des R3-Fragments
Beispiele für die Synthese von Fragmenten, in denen R³ die Bedeutung NH-R³¹ hat, sind in WO-00/09543 beschrieben.
Beispiele
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich anhand der folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben. Weitere spezielle Wege zur Synthese oder Auftrennung finden sich in WO-00/09543 und WO-00/09558 .
Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Prozentangaben für Lösungen beziehen sich auf das Gewicht in Bezug zum Volumen und Lösungsverhältnisse beziehen sich auf Volumen pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Kernmagnetische Resonanzspektren (NMR-Spektren) wurden mit einem Bruker 400 MHz-Spektrometer aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen (δ) werden in Teile pro Million angegeben und beziehen sich auf das interne deuterierte Lösungsmittel, sofern nichts anderes angegeben ist. Die NMR-Spektren sämtlicher Endprodukte (Inhibitoren) wurden in DMSO-d₆ in Form von TFA-Salzen aufgezeichnet, sofern nichts anderes angegeben ist. Eine Flash-Säulenchromatographie wurde an Kieselgel (SiO₂) gemäß der Still-Flash-Chromatographietechnik durchgeführt (W. C. Still et. al., J. Org. Chem., Bd. 43 (1978), S. 2923).
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet: Bn: Benzyl; Boc: tert.-Butyloxycarbonyl [Me₃COC(O)]; BSA: Rinderserumalbumin; Cbz: Benzyloxycarbonyl; CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat; DBU: 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en; CH₂Cl₂ = DCM: Methylenchlorid; DEAD: Diethylazodicarboxylat; DIAD: Diisopropylazodicarboxylat; DIPEA: Diisopropylethylamin; DMAP: Dimethylaminopyridin; DCC: 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid; DME: 1,2-Dimethyoxyethan; DMF: Dimethylformamid; DMSO: Dimethylsulfoxid; DTT: Dithiothreit oder Threo-1,4-dimercapto-2,3-butandiol; DPPA: Diphenylphosphorylazid; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; Et: Ethyl; EtOH: Ethanol; EtOAc: Ethylacetat; Et₂O: Diethylether; ESMS: Elektrospray-Massenspektrometrie; HATU: O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat; HPLC: Hochleistungs-Flüssigchromatographie; MS: Massenspektrometrie; MALDI-TOF: matrixgestützte Laser-Disorptionsionisationszeit des Flights; FAB: Fast Atom Bombardment; LAN: Lithiumaluminiumhydrid; Me: Methyl; McOH: Methanol; MES: (2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure); NaHMDS: Natrium-bis-(trimethylsilyl)-amid; NMM: N-Methylmorpholin; NMMO: N-Methylmorpholinoxid; NMP: N-Methylpyrrolidin; Pr: Propyl; Succ: 3-Carboxypropanoyl; PNA: 4-Nitrophenylamin oder p-Nitroanilid; TBAF: Tetra-n butylammoniumfluorid; TBME: tert.-Butylmethylether; tBuOK: Kalium-tert.-butoxid; TBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat; TCEP: Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid; TFA: Trifluoressigsäure; THF: Tetrahydrofuran; TIS: Triisopropylsilan; TLC: Dünnschichtchromatographie; TMSE: Trimethylsilylethyl; Tris/HCl: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid. P1-Reste Beispiel 1 Synthese von tert.-Butyl-(1 R,2R)/(1 S,2S)-1-amino-2-homoallylcyclopropylcarboxylat (1f)
A
Eine Suspension von Benzyltriethylammoniumchlorid (5,08 g, 22,3 mmol) in 50%igem wässrigen NaOH (50 ml) wurde nacheinander mit 1,2-Dibrom-5-hexen (1b, 8,10 g, 33,46 mmol) und Di-tert.-butylmalonat (1a, 4,82 g, 22,30 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur heftig gerührt, sodann mit H₂O verdünnt und mit CH₂Cl₂ (3 × 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit H₂O (2 × 50 ml), Kochsalzlösung/H₂O (2/1, 2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der rohe Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 3 bis 5% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die Verbindung 1c in einer Ausbeute von 38% (2,48 g).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,19 (bd, J = 7,9 Hz, 2H), 1,25–1,33 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,48 (s, 9H), 1,47–1,60 (m, 1H), 1,75–1,82 (m, 1H), 2,14–2,22 (m, 2H), 4,93–5,50 (m, 2H), 4,96 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,18 (dm, J = 17,2 Hz, 1H).
ES(+)MS m/z 297 (M+H)⁺.
B
Eine Suspension von Kalium-tert.-butoxid (5,75 g, 51,25 mmol) in wasserfreiem Diethylether (150 ml) wurde bei 0°C mit H2O (203 μl, 11,27 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 0°C gerührt. Sodann wurde eine Etherlösung der Verbindung 1c (2,48 g in 10 ml Diethylether, 10,25 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit eiskaltem H₂O verdünnt und mit Diethylether (3 × 200 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit eiskalter 10%iger wässriger Citronensäure auf den pH-Wert 3,5–4 angesäuert und mit EtOAc reextrahiert (3 × 200 ml). Die EtOAc-Phase wurde mit H₂O (2 × 100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Man erhielt die Verbindung 1d in einer Ausbeute von 85%, bezogen auf die Menge des gewonnenen Ausgangsmaterials.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,51 (s, 9H), 1,64–1,68 (m, 1H), 1,68–1,75 (m, 1H), 1,77–1,88 (m, 1H), 1,96–2,01 (m, 1H), 2,03–2,22 (m, 3H), 5,01 (dm, J = 6,4 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 14,9 Hz, 1H), 5,72–5,83 (m, 1H).
ES(+)MS: m/z 241 (M+H)⁺.
C
Eine Lösung der Säure 1d in wasserfreiem Benzol (1,14 g in 25 ml Benzol, 4,74 mmol) wurde mit Et₃N (800 μl, 5,68 mmol) versetzt. Anschließend wurde Diphenylphosphorylazid (1,13 ml, 5,21 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde 3,5 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde Trimethylsilylethanol (1,36 ml, 9,48 mmol) zugegeben. Der Rührvorgang wurde unter Rückfluss 4 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, auf die Hälfte seines ursprünglichen Volumens eingedampft, mit Diethylether (30 ml) verdünnt, mit 5%iger wässriger NaHCO3-Lösung (2 × 30 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Das verbleibende Öl wurde an Kieselgel unter Verwendung von 10% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die reine Verbindung 1 e in einer Ausbeute von 88% (1,49 g).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 0,03 (s, 9H), 0,91–0,99 (m, 2H), 1,18–1,29 (m, 2H), 1,45 (bs, 11H), 1,56–1,72 (m, 2H), 2,02–2,18 (m, 2H), 4,12 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 4,93 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 4,98 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,07 (bs, 1H), 5,71–5,83 (m, 1H).
D
Eine Lösung des Cyclopropyl-Derivats 1e (1,19 g, 3,35 mmol in 30 ml TNF) wurde mit tert.-Bu₄NF (6,7 ml, 1 M in THF, 6,7 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann 15 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde sorgfältig unter geringem Druck abgedampft (wegen der starken Flüchtigkeit des freien Amins 1f ist die Abdampfung des Lösungsmittels vorsichtig vorzunehmen). Der rohe Rückstand wurde wieder in EtOAc (100 ml) in Lösung gebracht und mit H₂O (2 × 50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und erneut einer sorgfältigen Abdampfung des Lösungsmittels unterzogen. Das rohe Produkt 1f (ein Gemisch von zwei Enantiomeren 1f und 1f') wurde für die Kupplung mit P2-Prolinderivaten ohne weitere Reinigung verwendet. Die Isolierung des P1 P2-Fragments mit der angestrebten stereochemischen Beschaffenheit an P1 wurde in dieser Stufe unter Anwendung von Flash-Chromatographie leicht erreicht (Beispiel 21, Fragment 21 b). P2-Reste Beispiel 2 Synthese von Boc-4(R)-[(7-Methoxy-4-chinolinyl)-oxy]-prolin (2c)
4-Hydroxy-7-methoxychinolin (2b) wurde gemäß dem Verfahren von M. W. Chun, K. K. Olmstead, Y. S. Choi, C. O. Lee, C.-K. Lee, J. N. Kim, Lee, J. Bioorg. Med. Chem. Lett., Bd. 7 (1997), S. 789, hergestellt. Eine Lösung der Verbindung 2b (1,88 g, 10,73 mmol) und von DEAD (3,4 ml, 21,46 mmol) in wasserfreiem THF wurde bei 0°C unter N₂ zu einer gerührten Lösung von geschütztem cis-Hydroxyprolin 2a (2,63 g, 10,73 mmol) und Triphenylphosphin (5,63 g, 21,46 mmol) in wasserfreiem THF (160 ml) gegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte es 14 Stunden. Sodann wurde das THF abgedampft. Das reine Produkt 2c wurde nach Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% McOH in EtOAc als Elutionsmittel in einer Ausbeute von 35% (1,5 g) isoliert.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,44 (s, 9H), 1,65 (bs, 1H), 2,34–2,43 (m, 1H), 2,63–2,76 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,75–3,85 & 3,89–3,99 (2m, 1H, 2 Rotamere), 3,95 (s, 3H), 4,51 & 4,60 (2t, J = 8 Hz, 1H, 2 Rotamere), 5,15 (bs, 1H), 6,53–6,59 (m, 1H), 7,12–7,18 (dd, J = 8,9 & 2,2 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,03 (bd, J = 9,2 Hz, 1H), 8,65 (bd, J = 5,1 Hz, 1H). Beispiel 3 Synthese von 2-Ethoxy-4-hydroxy-7-methoxychinolin (3c)
Die Synthese von Methyl-p-methoxyanthranylat 3a wurde gemäß Katz et. al., J. Org. Chem., Bd. 18 (1953), S. 1380–1400, durchgeführt.
Die allgemeine Synthese des Chinolinderivats 3c stellt eine Modifikation des Verfahrens von Baccar et. al., Indian Journal of Chemistry, Sat. B (1995), S. 330–332, dar.
A
Methyl-p-methoxyanthranylat 3a (3,069 g, 16,96 mmol) wurde in Triethylorthoacetat (4,7 ml, 25,4 mmol) gelöst. Sodann wurde eine Lösung von wasserfreiem HCl (4 N/Dioxan, 50 μl, 0,6 mmol) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 19 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurden die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum abgedampft. Man erhielt das Produkt 3b (4,92 g, bernsteinfarbenes Öl, quantitative Ausbeute, das direkt in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
B
Eine Lösung des Substrats 3b (vermutlich 16,96 mmol) in THF (34 ml) wurde bei –78°C unter Stickstoff mit LiHMDS (1 MTTHF, 22 ml, 1,3 Äq.) versetzt. Kurz nach der Zugabe wurde das Kältebad entfernt und man ließ das Gemisch 1 Stunde bei Umgebungstemperatur stehen. Anschließend wurde eine weitere Portion von LiHMDS (16 ml) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt, bis dünnschichtchromatographisch (100% EtOAc, Imidat R_f = 0,7, Produkt R_f = 0,2) das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials festgestellt wurde. HCl (4 N/Dioxan, 10 ml) wurde sodann zugegeben. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingeengt. Die erhaltene Paste wurde mit einem Gemisch aus EtOAc (10 ml) und wässrigem NaH₂PO₄ (1 M, 10 ml) verrieben und mit Ultraschall behandelt. Der gebildete reichliche Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt das angestrebte Produkt 3c als beigefarbenen Feststoff (3,117 g, Ausbeute 84% für die beiden Stufen, Reinheit bei HPLC > 99%).
¹H-NMR, (400 MHz, DMSO-d) δ (ppm): 7,88 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,98 (br, s, 1 H), 6,89 (br, d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,94 (br, s, 1H), 4,30 (br, s, 2H), 3,84 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H). Beispiel 4 Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(3-methyl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)chinolin (4d)
A
Eine Lösung von 2-Carbomethoxy-4-hydroxy-7-methoxychinolin 4a (die Herstellung erfolgte gemäß WO-00/09543 und WO-00/09558 ) (1 g, 4,29 mmol) in DMF (10 ml) wurde unter Stickstoff mit NaH (60% in Mineralöl, 190 mg, 4,98 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und anschließend tropfenweise mit MEM-Chlorid (455 μl, 4,98 mmol) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde weitere 19,5 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (100 ml) verdünnt, mit H₂O (50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt das rohe Reaktionsisolationsprodukt (1,37 g). Dieses Produkt wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt. Man erhielt das Produkt 4b (1,04 g, Ausbeute 75%) in Form eines farblosen Öls.
B
Ein Gemisch von frisch aktiviertem 4 A-Molekularsieb (500 mg) und Acetamidoxim (248 mg, 3,35 mmol) wurde mit THF (3 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei Umgebungstemperatur unter Stickstoff gerührt und sodann portionsweise mit NaH (60% in Mineralöl, 124 mg, 3,24 mmol) versetzt. Die erhaltene Suspension wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und sodann mit dem Ester 4b (500 mg, 1,56 mmol) in Lösung in THF (5 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt, sodann über Celite filtriert, mit EtOAc (3 Portionen von 20 ml) gespült und unter Vakuum eingeengt. Das erhaltene rohe Gemisch wurde durch Flash-Säulenchromatographie (100% EtOAc) gereinigt. Man erhielt das Produkt 4c (352 mg, Ausbeute 65%) in Form eines weißen Feststoffes.
C
Der MEM-Ether 4c (170 mg, 0,493 mmol) in THF (4 ml) wurde mit wässrigem NCl (1 N, 1 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und sodann mit wässrigem NaH₂PO₄ (1 M, 50 ml) verdünnt. Der gebildete Feststoff wurde abfiltriert, mit EtOAc verrieben, filtriert und getrocknet. Man erhielt das angestrebte Produkt (4d) (90 mg, Ausbeute 71%) in Form eines weißen Feststoffes.
MS (ES+) 258 (M + 1), (ES–) 256 (M–1).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d) δ (ppm): 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (br, s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H). Beispiel 5 Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)chinolin (5e)
A
Das Substrat 4b (465 mg, 1,45 mmol) in Ethanol (5 ml) wurde mit wasserfreiem Hydrazin (57 μl, 1,8 mmol) versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 4 Stunden unter Rückfluss erwärmt und sodann unter Vakuum eingeengt. Man erhielt das rohe Produkt 5a (704 mg, quantitative Rohausbeute) in Form eines gelben Feststoffes, der direkt in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
B
Die Verbindung 5a (vermutlich 1,45 mmol) wurde in Triethylorthoacetat (5 ml) unter Stickstoff auf 100–110°C erwärmt. Das erhaltene Gemisch wurde sodann mit EtOAc (100 ml) verdünnt, mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, unter Vakuum eingeengt und durch Flash-Säulenchromatographie (100% EtOAc) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 5b (359 mg, Ausbeute 61% für die beiden Stufen) in Form eines gelben Öls.
MS (ES+) 392 (m +1), (ES–) 390 (m–1).
C
Die Verbindung 5b (333 mg, 0,852 mmol) wurde unter Hochvakuum 8,5 Stunden auf 140°C erwärmt und sodann durch Flash-Säulenchromatographie (100% EtOAc) gereinigt. Man erhielt ein Gemisch aus 5b (116 mg, 35%, R_f 0,5) und der Verbindung 5c (138 mg, korrigierte Ausbeute 72%, R_f 0,3). Eine Lösung der Verbindung 5c (138 mg, 0,4 mmol) in THF (4 ml) wurde mit wässriger HCl (1 N, 1 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bis zur vollständigen Umsetzung gerührt (30 min). THF wurde unter Vakuum abgedampft. Wässriges NaH₂PO₄ (1 M, 2 ml) wurde zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde mit Ultraschall behandelt und filtriert. Der Feststoff wurde unter Hochvakuum getrocknet. Man erhielt das angestrebte Produkt 5d, (75 mg, Ausbeute 73%) in Form eines beigefarbenen Feststoffes.
MS (ES+) 258 (m+1), (ES-) 256 (m-1).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (br, d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (br, s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H). Beispiel 6 Synthese von 4-Benzyloxy-2-chlor-7-methoxychinolin (6e)
A
Handelsübliches meta-Anisidin (25 g, 0,20 mol) in Dioxan (80 ml) wurde auf 0°C gekühlt und mit wasserfreiem HCl (4 N/Dioxan, 75 ml, 0,30 mol) versetzt. Sodann wurde Et₂O (500 ml) zugegeben und der Rührvorgang wurde 1 Stunde fortgesetzt. Der beigefarbene Feststoff wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt das Salz 6a (31,88 g, Ausbeute 98%).
B
Dieses Salz wurde mit Ethylcyanoacetat (21,3 ml, 0,20 mol) versetzt. Das Gemisch wurde in einem Kolben, der mit einem Destillationskopf und einem Auffangkolben ausgerüstet war, auf 280–300°C erwärmt. Gebildetes Ethanol wurde zur Überwachung der Reaktionsentwicklung gesammelt. Nach Sammeln von 9 ml Ethanol (theoretische Menge 11,7 ml) wurde der Erwärmungsvorgang abgebrochen und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit Wasser (200 ml) EtOAc (200 ml) verdünnt, gerührt und mit wässrigem NaH₂PO₄ (300 ml) versetzt. Nach weiterem 1-ständigem Rühren wurde das Produkt abfiltriert und getrocknet. Man erhielt die Verbindung 6b (19,06 g, Reinheit 84,5%, Ausbeute ~50%) in Form eines gelben Feststoffes, der direkt bei der nächsten Umsetzung eingesetzt wurde.
C
Die Verbindung 6b (11,0 g, 57,8 mmol) in DMF (100 ml) wurde bei 0°C zu NaH (60% in Mineralöl, 2,78 g, 115,6 mmol) gegeben. Sodann wurde das Eisbad entfernt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt, anschließend mit Benzylbromid (7,6 ml, 63,6 mmol) versetzt und weitere 16 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit EtOAc (220 ml) – Hexan (220 ml) verdünnt. Der gebildete Feststoff wurde abfiltriert, mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (110 ml) verrieben, mit Wasser und Hexan-EtOAc (Verhältnis 1 : 1, 100 ml) gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Auf diese Weise erhielt man das Produkt 6c (5,6 g, Reinheit 91%, Ausbeute 35%) in Form eines gelben Feststoffes.
Die Verbindung 6c (2,67 g, 9,52 mmol) in Essigsäure (21 ml) wurde mit Isoamylnitrit (3,8 ml, 28,6 mmol) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde sodann bei Umgebungstemperatur gerührt und durch HPLC überwacht. Nach 2 Stunden wurde weiteres Isoamylnitrit (1,3 ml, 9,52 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde 90 Stunden gerührt (HPLC: 81% Produkt, 3% Substrat). Die erhaltene Suspension wurde mit Wasser (100 ml) versetzt und sodann filtriert. Der gewonnene braune Feststoff wurde unter Hochvakuum getrocknet. Man erhielt das Produkt 6d (2,35 g, Reinheit 92%, Ausbeute 72%).
D
Die Verbindung 6d (1,5 g, 4,39 mmol) wurde mit Phosphoroxychlorid (13 ml, 141 mmol) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt, sodann mit EtOAc (150 ml) verdünnt und bei 0°C langsam mit wässrigem NaOH (1 N, 150 ml) auf den pH-Wert 9 gebracht. Die beiden Phasen wurden getrennt. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt einen braunen Feststoff, der durch Flash-Säulenchromatographie (15% EtOAc/Hexan) gereinigt wurde. Man erhielt das Produkt 6e (819 mg, Reinheit > 99%, Ausbeute 62%) in Form eines gelben Feststoffes.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,07 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50–7,40 (m, 5H), 7,29 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 5,26 (s, 2H), 3,92 (s, 3H).
Beispiel 7
Synthese von 4-Hydroxy-2-(1-imidazolyl)-7-methoxychinolin (7b); 4-Hydroxy-2-(4-methyl-1-imidazolyl)-7-methoxychinolin (7d); 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(1-pyrazolyl)-chinolin (7f); und 4-Hydroxy-2-(3-methyl-1-pyrazolyl)-7-methoxychinolin (7h).
A
Die Verbindung 6e (423 mg, 1,41 mmol) und Imidazol (400 mg, 5,88 mmol) wurden 20 Stunden auf 110°C erwärmt. Sodann wurde das Gemisch mit EtOAc verdünnt, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt die Verbindung 7a (422 mg, Reinheit 96%, Ausbeute 90%) in Form eines gelben Feststoffes. Die Verbindung 7a (319 mg, 0,963 mmol) wurde zusammen mit Pd (5%/C, 64 mg) in einem Gemisch aus Ethanol (5 ml) und THF (5 ml) gespült und unter 1 atm Wasserstoff gesetzt. Nach 7,5-ständigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch abfiltriert, mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch gespült und eingeengt. Man erhielt die Verbindung 7b (130 mg, Reinheit 97,7%, Ausbeute 56%) in Form eines gelben Feststoffes.
MS (ES+) 242 (m + 1), (ES–) 240 (m–1).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,51 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,23 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 6,92 (br, s, 1H), 3,91 (s, 3H).
B
Die Verbindung 6e (251 mg, 0,837 mmol) und 4-Methylimidazol (344 mg, 4,19 mmol) wurden 20 Stunden auf 110°C erwärmt. Anschließend wurde das Gemisch mit EtOAc verdünnt, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt ein Rohprodukt, das ein 10 : 1-Gemisch des 4-Methyl- bzw. 5-Methylimidazolyl-Isomeren enthielt. Das vermutlich das Hauptprodukt darstellende, angestrebte Isomere 11 c, ein weißer Feststoff (166 mg, Reinheit 99%, Ausbeute 57%), wurde aus einer zweiten, polareren Fraktion (76 mg, Ausbeute 23%), das ein Gemisch der 4- und 5-Methylimidazolyl-Isomeren enthielt, durch Flash-Säulenchromatographie (100% EtOAc) abgetrennt. Die Verbindung 7c (163 mg, 0,472 mmol) wurde zusammen mit Pd (5%/C, 33 mg) in einem Gemisch aus Ethanol (2,4 ml) und THF (5 ml) gespült und unter 1 atm Wasserstoff gesetzt. Nach 18-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert, mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch gespült und eingeengt. Man erhielt die Verbindung 7d (118 mg, Reinheit 99%, Ausbeute 98%) in Form eines weißen Feststoffes.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,42 (br, s, 1H), 8,01 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (br, s, 1H), 7,21 (br, s, 1H), 7,10 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,89 (br, s, 1H), 3,90 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).
C
Die Verbindung 6e (184 mg, 0,614 mmol) und Pyrazol (209 mg, 3,07 mmol) wurden 17 Stunden auf 110°C erwärmt. Anschließend wurde das Gemisch mit EtOAc verdünnt, mit wässrigem NaOH (1 N) und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt ein Rohprodukt, das durch Flash-Säulenchromatographie (2 : 1 Hexan-EtOAc) gereinigt wurde. Man erhielt die Verbindung 7e (103 mg, Ausbeute 50%) in Form eines blassgelben Feststoffes. Die Verbindung 7e (103 mg, 0,311 mmol) wurde zusammen mit Pd (5%/C, 20 mg) in einem Gemisch aus Ethanol (2 ml) und THF (2 ml) gespült und unter 1 atm Wasserstoff gesetzt. Nach 5,5-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert, mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch gespült und eingeengt. Man erhielt die Verbindung 7f (77 mg, Reinheit 99%, Ausbeute 99%) in Form eines gelben Feststoffes.
MS (ES+) 242 (m + 1), (ES–) 240 (m–1).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,72 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,00 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,83 (br, s, 1H), 7,43 (br, s, 1H), 7,24 (br, s, 1H), 7,10 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,59 (br, s, 1H), 3,90 (s, 3H).
D
Die Verbindung 6e (217 mg, 0,724 mmol) und 4-Methylpyrazol (594 mg, 7,24 mmol) wurden 23 Stunden auf 110°C erwärmt. Das Gemisch erwies sich als 1 : 1-Gemisch von debenzylierter Verbindung 7h und benzyliertem Produkt 7g. Es wurde sodann mit EtOAc (2–3 ml) verdünnt und filtriert. Man erhielt das reine debenzylierte Produkt 7h (111 mg, Reinheit 95%, Ausbeute 54%) in Form eines weißen Feststoffes.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,58 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,25 (br, s, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,04 (br, d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,38 (s, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,30 (s, 3H).
Beispiel 8
Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-[4-(2-isopropylaminothiazolyl)]chinolin (8f)
Anmerkung: [Eine Reihe von 2-Alkylaminothiazolyl-Substituenten wurden gemäß dem gleichen Syntheseschema hergestellt, wobei die Verbindung 8b durch andere Alkylthioharnstoffe ersetzt wurde.]
A
Das Verfahren zur Umwandlung von m-Anisidin in 8a war identisch mit den Literaturangaben von F. J. Brown et. al., J. Med. Chem., Bd. 32 (1989), S. 807–826. Jedoch wurde das Reinigungsverfahren modifiziert, um eine chromatographische Reinigung zu vermeiden. Die EtOAc-Phase, die das gewünschte Produkt enthielt, wurde mit einem Gemisch aus MgSO₄, Aktivkohle und 5% (Gew./Gew., bezogen auf die erwartete Masse) Kieselgel behandelt. Nach Filtration über Celite wurde das Produkt mit Ether verrieben. Die Verbindung 8a wurde in Form eines blassbraunen Feststoffes in einer Reinheit von > 99% (bestätigt durch HPLC) erhalten.
B
Eine Suspension von Isopropylthioharnstoff (8b, 3,55 g, 30 mmol) und 3-Brombrenztraubensäure (8c, 5 g, 1 Äq.) in Dioxan (300 ml, 0,1 M) wurde auf 80°C erwärmt. Beim Erreichen von 80°C wurde die Lösung klar, wobei bald danach das Produkt in Form eines weißen Feststoffes ausfiel. Nach 2-ständigem Erwärmen wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert. Man erhielt die Verbindung 8d in hoher Reinheit (Reinheit > 98%, bestätigt durch NMR) und einer Ausbeute von 94% (7,51 g).
C
Ein Gemisch aus der Carbonsäure 8d (4,85 g, 18,2 mmol) und dem Anilinderivat 8a (3 g, 1 Äq.) in Pyridin (150 ml, 0,12 M) wurde auf –30°C abgekühlt (beim Abkühlen entstand aus der klaren Lösung partiell eine Suspension). Sodann wurde langsam innerhalb von 5 Minuten Phosphoroxychlorid (3,56 ml, 2,1 Äq.) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei –30°C gerührt. Nach Entfernen des Bades ließ man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1,5 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gegossen. Der pH-Wert wurde mit wässrigem 3 N NaOH auf 11 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der beigefarbene Feststoff wurde sodann durch Flash-Chromatographie (45% EtOAc in Hexan) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 8e in Form eines blassgelben Feststoffes in einer Ausbeute von 73% (6,07 g).
D
Eine Lösung von tBuOK (2,42 g, 21,6 mmol) in wasserfreiem tBuOH (40 ml, 0,14 M, destilliert über Mg-Metall) wurde unter Rückfluss erwärmt. Die Verbindung 8e (1,8 g, 5,4 mmol) wurde portionsweise innerhalb von 5 Minuten zugegeben. Die gebildete dunkelrote Lösung wurde weitere 20 Minuten unter Rückfluss gerührt (die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch HPLC überwacht). Das Gemisch wurde sodann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit HCl (4 N in Dioxan, 1,5 Äq.) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt, um zu gewährleisten, dass das gesamte HCl und Dioxan entfernt worden waren. Das Produkt wurde 2-mal in CH₂Cl₂ erneut in Lösung gebracht und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt schließlich das HCl-Salz der Verbindung 8f in Form eines beigefarbenen Feststoffes (1,62 g, Reinheit 93% gemäß HPLC. Das Produkt wurde sodann in Phosphatpuffer (1 N NaH₂PO₄, pH-Wert = ~4,5) gegossen und mit Ultraschall behandelt. Der beigefarbene Feststoff wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt die Verbindung 8f (1,38 g, Ausbeute 81%) in Form eines beigefarbenen Feststoffes (Reinheit 91% gemäß HPLC).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO): δ 8,27 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 7,97 (br,s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (dd, 1H, J = 9,2, 2,2 Hz), 3,97 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 1,24 (d, 2H, J = 6,4 Hz).
Beispiel 9
Herstellung von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-[2-(4-isopropylthiazolyl)]-chinolin (9f)
Anmerkung: Eine Vielzahl von 2-(4-Alkyl)-thiazolyl-Substituenten wurde gemäß dem gleichen Syntheseschema hergestellt, wobei die Verbindung 9b durch andere α-Bromketone ersetzt wurde.
A
Eine Lösung von 3-Methylbutan-2-on (8 g, 93 mmol) in McOH (100 ml) wurde bei –30°C tropfenweise innerhalb von 45 Minuten mit Br₂ (4,79 ml, 93 mmol, 1 Äq.) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von Pentan wurde die Lösung mit 5%igem wässrigem NaHCO₃ gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Das erhaltene rohe gelbe Öl, Verbindung 9b, wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Eine Lösung von Ethylthiooxamat (9a, 1,8 g, 13,5 mmol) und von Bromketon-Derivat 9b (13,5 mmol) wurde 15 Stunden bei 70°C gerührt. Sodann wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt und anschließend durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von 15% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die Verbindung 9c (740 mg, Ausbeute 28%).
B
Eine Lösung der Verbindung 9c (700 mg, 3,5 mmol) in THF/MeOH/H₂O (Verhältnis 3 : 1 : 1, 13 ml) wurde mit LiOH·H₂O (148 mg, 3,5 mmol, 1 Äq.) 5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Sodann wurde der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 6 eingestellt. Das Gemisch wurde unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhielt die Säure 13d, die ohne weitere Reinigung direkt in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
C
Eine Lösung von 4-Methoxy-2-amino-acetophenon (Zwischenprodukt 8a, 570 mg, 3,45 mmol) und des Carbonsäurederivats 9d (590 mg, 3,45 mmol, 1 Äq.) in Pyridin (30 ml) wurde auf –20°C gekühlt. Sodann wurde POCl₃ (0,35 ml, 3,79 mmol, 1,1 Äq.) innerhalb von 5 Minuten zugetropft. Die erhaltene Lösung wurde 2 Stunden bei –10°C gerührt. Sodann wurde die Umsetzung durch Zugabe von H₂O gestoppt. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in eine gesättigte wässrige Lösung von NaHCO₃ gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von 25% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die Verbindung 9e in Form eines weißen Feststoffes (740 mg, Ausbeute 67%).
D
tBuOK (518 mg, 2,1 Äq.) wurde zu einer Suspension der Verbindung 9e (700 mg, 2,2 mmol) in wasserfreiem tBuOH (11 ml) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 7,5 Stunden auf 75°C erwärmt. Sodann wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von HCl angesäuert (4N HCl in Dioxan, 2,5 ml). Anschließend wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in eine Lösung von 1 N NaH₂PO₄ gegossen und filtriert. Das feste Material wurde sodann mit einer geringen Menge an EtOAc verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt die Verbindung 9f in Form eines blass-beigefarbenen Feststoffes (270 mg, Ausbeute 41%).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,00 (br, s, 1H), 7,60 (br, s, 1H), 7,51 (br, s, 1H), 7,43 (br, s, 1H), 7,29 (br, s, 1H), 7,14 (br, s, 1H), 6,95 (br, a, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,15 (m, 1H), 1,33 (d, J=5,4 Hz, 6H). Beispiel 10 Synthese von 4-Hydroxy-2-(1-methyl-2-imidazolyl)-7-methoxychinolin (10d)
A
Eine Lösung von N-Methylimidazol 10a (5 g, 61 mmol) in 100 ml THF wurde auf –78°C gekühlt. n-BuLi (24,4 ml einer 2,5 M/Et₂O-Lösung, 1 Äq.) wurde innerhalb von 15 Minuten zugetropft. Das erhaltene Gemisch wurde 90 Minuten bei –78°C gerührt und sodann portionsweise auf überschüssiges festes CO₂ gegossen. Das heterogene Gemisch wurde 2 Stunden gerührt, wobei man es auf Raumtemperatur kommen ließ. 1 N HCl wurde bis zum Erreichen eines pH-Werts von 5 zugesetzt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und lyophilisiert. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde mit EtOAc extrahiert (zur Entfernung von Salzen), getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt 6,2 g (Ausbeute 80%) des weißen Feststoffes 10b.
B
Eine Lösung von 4-Methoxy-2-amino-acetophenon 8a (394 mg, 2,39 mmol) und des Carbonsäurederivats 10b (301 mg, 1 Äq.) in Pyridin (10 ml) wurde auf –20°C gekühlt. Sodann wurde tropfenweise POCl₃ (244 μl, 1,1 Äq.) innerhalb von 5 Minuten zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 2,5 Stunden bei –10°C gerührt. Anschließend wurde Wasser zugesetzt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in eine gesättigte NaHC_O3-Lösung gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Produkt wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel (25% EtOAc/Hex) gereinigt. Man erhielt 530 mg (Ausbeute 81%) des blassgelben Feststoffes 10c.
C
tBuOK (431 mg, 2,1 Äq.) wurde zu einer Suspension des Substrats 10c (500 mg, 1,8 mmol) in 8 ml tBuOH gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde sodann 7 Stunden auf 75°C erwärmt. Man ließ die Lösung über Nacht auf Raumtemperatur kommen. Sodann wurden 2,5 ml NCl (4 N/Dioxan) zugegeben. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt. 1 N NaOH wurde bis zum Erreichen eines pH-Werts von 7 zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt 145 mg 10d (Ausbeute 31%) in Form eines blass-beigefarbenen Feststoffes.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 7,99 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,18 (s, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,84 (s, 3H). Beispiel 11 Synthese von 4-Hydroxy-2-(1-pyrrolyl)-7-methoxychinolin (11b)
A
Eine Lösung des Substrats 11a (erhalten aus der Verbindung 6c nach Hydrogenolyse der Benzylgruppe mit 5% Pd/C in Ethanol-THF) (1 g, 5,25 mmol) und von 2,5-Dimethoxytetrahydrofuran (0,68 ml, 1 Äq.) in Eisessig wurde 4,5 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Nach Erreichen von Raumtemperatur wurde das Gemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Methanol verdünnt und mit 1 N NaOH (wässrig) bis zum Erreichen eines pH-Werts von 7 versetzt. Das Produkt wurde chromatographisch unter Verwendung von Kieselgel (3% McOH/CH₂Cl₂, Voradsorption des Rückstands an Kieselgel) gereinigt. Man erhielt 140 mg (Ausbeute 13%) der Verbindung 11 b in Form eines weißen Feststoffes.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,18 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,05 (br, d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,88 (br, s, 1H), 6,32 (s, 2H), 3,90 (s, 3H). Beispiel 12 Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(6-methyl-2-pyridyl)-chinolin (12d)
A
6-Methylpicolinsäure 12a (411 mg, 3,0 mmol) und SOCl₂ (0,520 ml, 7,2 mmol, 2,4 Äq.) wurden 2 Stunden in Benzol (5 ml) unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel und überschüssiges SOCl₂ wurden aus dem Reaktionsgemisch unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Pentan verrieben. Das gebildete feste Material wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt. Man erhielt das Säurechlorid 12b (500 mg, 2,6 mmol).
B
Eine Lösung des rohen Säurechlorids 12b in CN₂Cl₂ (5 ml) wurde bei 0°C mit einer Lösung des Anilins 8a (344 mg, 2,08 mmol), DIPEA (1,45 ml, 8,35 mmol) und DMAP (61 mg, 0,5 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit 5% NaHCO₃ (2×), H₂O und Kochsalzlösung gewaschen. Sodann wurde die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Das Gemisch wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt das Amid 12c (490 mg, 82%).
C
Eine Suspension des Amids 12c (490 mg, 1,71 mmol) in t-BuOH (10 ml) wurde mit tBuOK (410 mg, 3,43 mmol) versetzt. Sodann wurde das Gemisch 6 Stunden bei 75°C und anschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch in Phosphatpuffer (175 ml, pH-Wert 7) gegossen und 30 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde 2-mal mit Ethylacetat verrieben. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Der erhaltene Feststoff wurde mit EtOAc verrieben. Man erhielt das Chinolinderivat 12d (263 mg, 58%).
¹H-NMR: (CDCl₃, 400 MHz): δ 2,68 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 6,85–6,88 (2d, J= 8,68 & 9,5 Hz, 2H), 6,94 (dd, J = 8,9 & 2,2 Hz, 1H), 7,27 (dd, J= 6,7 & 1,9 Hz, 1H), 7,73–7,79 (m, 2H), 8,28 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 10,3 (br s, 1H).
Beispiel 13 Herstellung von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(5-methoxy-2-pyridyl)-chinolin (13d)
A
Eine Lösung der Verbindung 13a (623 mg, 3,73 mmol) in McOH wurde mit NaOH (2 M, 4,70 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde die Lösung mit HCl (6 N, 2,2 ml) angesäuert und eingeengt. Man erhielt die Verbindung 13b, die ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
B
Eine Lösung der rohen Verbindung 13b (3,73 mmol) in Pyridin (25 ml) wurde mit dem Anilin 8a (500 mg, 3,03 mmol) versetzt. Sodann wurde die Lösung auf –25°C abgekühlt, wonach POCl₃ (0,35 ml, 3,73 mmol) zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei –10°C und sodann 2 Stunden bei 0°C gerührt. Anschließend wurde das Gemisch in H₂O gegossen und mit EtOAc (2–3×) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 5% NaHCO₃ und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Das rohe Material wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt das Amid 13c (617 mg, 55%).
C
Eine Suspension des Amids 13c (617 mg, 2,05 mmol) in wasserfreiem t-BuOH (10 ml) wurde mit tBuOK (490 mg, 4,11 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 6 Stunden bei 75°C und sodann 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch in Phosphatpuffer (175 ml, pH-Wert = 7) gegossen und 30 Minuten gerührt. Das gebildete feste Material wurde abfiltriert und mit EtOAc verrieben. Man erhielt das Chinolinderivat 13d (250 mg, 43%).
¹H-NMR: (DMSO, 400 MHz): δ 3,86 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 6,72 (bs, 1H), 6,91 (dd, J = 8,9 & 1,9 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,60 (dd, J = 8,9 & 2,9 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,48 (d, J = 1,9 Hz, 1H), Beispiel 14 Synthese von 4-Hydroxy-7-methoxy-2-(oxazol-5-yl)-chinolin (14c)
A
Das geschützte Chinolinderivat 4b von Beispiel 4 (3,8 g, 11,8 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (60 ml) gelöst und auf –78°C abgekühlt, wonach Diisobutylaluminiumhydrid (7,9 ml, 1 Äq., 1,5 M in Toluol) sehr langsam innerhalb von 15 Minuten zugegeben wurde. Nach 80-minütigem Rühren wurde eine weitere Menge an DIBAL (5,5 ml, 0,7 Äq., 1,5 M in Toluol) zugegeben. Nach 2-ständigem Rühren bei –78°C wurde die Umsetzung vorsichtig mit Methanol (4 ml) bei –78°C gestoppt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch in eine wässrige Lösung von Rochelle-Salz (1 N K-Na-Tartrat) gegossen. Die dicke Paste wurde 2 Stunden mit CH₂Cl₂ (300 ml) bis zur Erzielung einer klaren Beschaffenheit gerührt. Die Phasen wurden abgetrennt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der erhaltene weiße Feststoff ergab nach Flash-Chromatographie (SiO₂, 230–400 mesh) mit 50% EtOAc/Hexan den Aldehyd 14a in Form eines weißen Feststoffes (2,5 g, 73%).
B
Eine gerührte Suspension von K₂CO₃ (48 mg, 0,34 mmol) in McOH (7 ml) wurde mit Toluolsulfonylmethylisocyanid (66 mg, 0,34 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 45°C erwärmt und mit dem Aldehyd 14a (0,10 g, 0,34 mmol) versetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 16 Stunden auf 80°C erwärmt und anschließend unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Die Reinigung wurde durch Flash-Chromatographie (SiO₂, 230–400 mesh) durchgeführt. Man erhielt das angestrebte Oxazol 14b (0,089 g, 80%).
MS: 331,0 (M + H)⁺.
C
Das MEM-geschützte Hydroxychinolin 14b wurde in THF (3 ml) gelöst und mit wässrigem HCl (1 N, 1 ml) versetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wonach es unter Vakuum zur Trockne eingeengt wurde. Der Rückstand wurde mit Phosphatpuffer (3 ml, 1 N Lösung, pH-Wert 4,5) behandelt und gerührt. Sodann wurde das Produkt abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und über Nacht unter Hochvakuum (60°C, 16 Stunden) getrocknet. Das angestrebte Hydroxychinolin 14c wurde in Form eines gelbbraunen Feststoffes erhalten (0,065 g, 100%).
MS: 242,9 (M + H)⁺.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 8,65 (s, 1H), 8,02 (bs, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,93 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,42 (bs, 1H), 3,87 (s, 3H).
ES (+) MS: m/z 242,9 (M + H)⁺. Peptid-Linkerreste (P3) Beispiel 15 Synthese von (2S)-N-Boc-Amino-non-8-ensäure (15 g)
A
Eine Lösung des handelsüblichen Diethyl-2-acetamidomalonats 15a (100 g, 0,46 mol) in Dioxan (500 ml) wurde tropfenweise innerhalb von 30 bis 45 Minuten mit wässrigem Natriumhydroxid (1 M, 1 Äq., 460 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 16,5 Stunden gerührt. Sodann wurde das Dioxan unter Vakuum abgedampft. Die wässrige Lösung wurde mit 3 Portionen von jeweils 300 ml Ethylacetat extrahiert und mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man ließ diese Lösung in einem Eis/Wasser-Bad kristallisieren. Nach Auftreten von einigen Kristallen wurde das Gemisch einer Ultraschallbehandlung unterzogen, wobei reichlicher Niederschlag auftrat. Nach Filtrieren und Trocknen unter Vakuum erhielt man die Verbindung 15b (62,52 g, Ausbeute 72%) in Form eines weißen Feststoffes.
B
Eine mit einem Magnetrührer gerührte Emulsion von handelsüblichem 7-Octen-1,2-diol 15c (25 g, 0,173 mol) in H₂O (100 ml) wurde in einem 1 Liter fassenden Rundkolben innerhalb von 20 Minuten mit einer wässrigen Lösung von Natriumperiodat (40,7 g, 0,190 mol, 1,1 Äq., in 475 ml H₂O) versetzt (leicht exotherme Reaktion). Das erhaltene Gemisch wurde 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt (die Beendigung der Umsetzung wurde durch TLC bestätigt). Anschließend wurde das Gemisch in einem Scheidetrichter dekantiert. Die wässrige Phase wurde von der organischen Phase abgetrennt. Die wässrige Lösung wurde mit NaCl gesättigt, dekantiert und ein weiteres Mal von der organischen Fraktion abgetrennt. Die beiden organischen Fraktionen wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und durch einen Wattebausch (in einer Pasteur-Pipette) filtriert. Man erhielt die Verbindung 15d (15,135 g, farbloses Öl, Ausbeute 78%). Die wässrige Lösung wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt (ohne Erwärmen, Heptanal Kp. 153°C). Man erhielt eine weitere Menge der Verbindung 15d (1,957 g, farbloses Öl, Ausbeute 10%). Gesamtausbeute 88%.
C
Festes Ethyl-2-acetamidomalonat 15b (7,57 g, 40 mmol) wurde innerhalb von 1 Minute mit 6-Heptenal 15d (4,48 g, 40 mmol) in Lösung in Pyridin (32 ml, 10 Äq.) versetzt. Die erhaltene Lösung wurde in einem Bad von 10°C gekühlt und innerhalb von 4 Minuten mit Essigsäureanhydrid (12 ml, 3,2 Äq.) versetzt. Die erhaltene orangefarbene Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit einer weiteren Portion Ethyl-2-acetamidomalonat 15b (2,27 g) versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde weitere 11 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde Eis (60 ml) zugegeben. Die Lösung wurde 1,5 Stunden gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit 250 ml Wasser verdünnt und mit 2 Portionen Ether extrahiert. Die Etherlösung wurde mit 1 N HCl und gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, eingeengt und durch Flash-Chromatographie (EtOAc 40%/Hexan) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 15e (4,8 g, Ausbeute 50%) in Form eines blassgelben Öls.
D
Eine entgaste (30-minütiges Einleiten von Argon) Lösung von Z-Ethyl-2-acetamido-2,8-nonadienoat 15e (8,38 g, 35 mmol) in trockenem Ethanol (70 ml) wurde mit (S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf (51 mg, S/C = 496) versetzt. Das Gemisch wurde unter einem Wasserstoffdruck von 30 psi gesetzt (nach 4 Vakuum-H₂-Zyklen) und 2 Stunden auf einem Parr-Schüttler gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde zur Trockne eingedampft. Man erhielt die rohe Verbindung 15f, die ohne weitere Reinigung in der folgenden Stufe eingesetzt wurde.
E
Eine Lösung von rohem (S)-Ethyl-2-acetamido-8-nonenoat 15f (7,3 g, 30,3 mmol) in THF (100 ml) wurde mit Boc₂O (13,2 g, 2 Äq.) und DMAP (740 mg, 0,2 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Anschließend wurde der Großteil des THF-Lösungsmittels abgedampft. Das rohe Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und zur Entfernung von DMAP mit 1 N HCl gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃ extrahiert, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde sodann mit THF (50 ml) und Wasser (30 ml) verdünnt, mit LiOH·H₂O (2,54 g, 2 Äq.) versetzt und das erhaltene Gemisch wurde 25 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (die Beendigung der Hydrolyse wurde durch TLC bestätigt).
Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des Großteils des THF-Lösungsmittels unter Vakuum eingeengt und mit CH₂Cl₂ verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde mit 1 N HCl gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Um geringfügige Verunreinigungen und überschüssiges Boc₂O zu entfernen, wurde das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie (unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 100% Hexan zu 100% EtOAc als Elutionsmittel) gereinigt. Man erhielt die Titelverbindung 15g in hoher Reinheit in Form eines blassgelben Öls (5,82 g, Ausbeute 71%).
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 7,01 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,79 (tdd, Jt = 6,7 Hz, Jd = 17,0, 10,2 Hz, 1H), 5,00 (md, Jd = 17,0 Hz, 1H), 4,93 (md, Jd = 10,2 Hz, 1H), 3,83 (m, 1H), 2,00 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 1,65–1,5 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 1,35–1,21 (m, 6H). Beispiel 15a Alternative Synthese von (2S)-N-Boc-Amino-non-8-ensäure (15g)
A
Eine gerührte Suspension von fein geschnittenen Mg-Streifen (0,55 g, 22,5 mmol) in trockenem THF (30 ml) mit einem Gehalt an Dibromethan (0,1 ml) wurde tropfenweise innerhalb von 15 Minuten mit 8-Brom-1-octen (15 h, 2,52 ml, 15 mmol) versetzt (die Reaktion verläuft leicht exotherm). Nach 30 Minuten wurde das Gemisch 1 Stunde auf 38°C erwärmt und sodann auf –78°C abgekühlt, wonach es mit einer Kanüle auf eine überschüssige Menge an festem CO₂ gegeben wurde. Das Gemisch wurde mit Diethylether (100 ml) verdünnt. Die Lösung wurde mit Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Man erhielt ein rohes Öl, das durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 15% EtOAc in Hexanen als Elutionsmittel gereinigt wurde. Man erhielt die Verbindung 15i in einer Ausbeute von 62% (1,44 g).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,31–1,42 (m, 6H), 1,60–1,69 (m, 2H), 2,02–2,09 (m, 2H), 2,35 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 4,99 (dm, J = 10,0 Hz, 1H), 5,04 (dm, J = 17,0 Hz, 1H), 5,75–5,86 (m, 1H).
B
Eine heftig gerührte Lösung der Carbonsäure 15i (1,36 g, 8,7 mmol) in wasserfreiem THF (70 ml) wurde bei –78°C mit frisch destilliertem Et₃N (1,6 ml, 11,3 mmol) und Pivaloylchlorid (1,18 ml, 9,58 mmol) mit einer Spritze unter wasserfreien Bedingungen versetzt. Sodann wurde das Gemisch 15 Minuten bei –78°C und anschließend 45 Minuten bei 0°C gerührt. Anschließend wurde das Gemisch erneut auf –78°C abgekühlt und mit einer Kanüle in eine wasserfreie Lösung von 4(S)-4-(Phenylmethyl)-2-oxazolidinon-lithiumsalz in THF bei –78°C übertragen. Das Lithiumsalz des Oxazolidinon-Reagenz war vorher durch langsame Zugabe von n-BuLi (2,00 M in Hexanen, 7,85 ml, 15,7 mmol) einer THF-Lösung (20 ml) des Oxazolidinons (2,78 g, 15,7 mmol) in THF bei –78°C hergestellt worden. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei –78°C und anschließend 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich wurde das Gemisch mit einer wässrigen Lösung von Natriumbisulfat (100 ml einer 1 M Lösung) versetzt. Das THF wurde auf 3/4 des ursprünglichen Volumens eingedampft. Der Rückstand wurde mit EtOAc (2 × 150 ml) extrahiert. Die vermischten organischen Phasen wurden mit 5% NaHCO₃ (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Das erhaltene rohe Öl wurde an Kieselgel unter Verwendung von 15% EtOAc in Hexanen chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 15j in einer Ausbeute von 68% (1,88 g).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,35–1,47 (m, 6H), 1,67–1,74 (m, 2H), 2,02–2,09 (m, 2H), 2,65 (dd, J = 13,4 & 9,9 Hz, 1H), 2,84–3,02 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 13,4 & 3,2 Hz, 1H), 4,13–4,22 (m, 2H), 4,62–4,71 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 17,2 & 1,6 Hz, 1H), 5,75–5,84 (m, 1H), 7,18–7,38 (m, 5H).
C
Eine gerührte Lösung von KHMDS (0,8 M THF, 22 ml, 17,5 mmol) in trockenem THF (50 ml) wurde bei –78°C mittels einer Kanüle mit einer Lösung des Säurederivats 15j (3,25 g, 10,30 mmol) in trockenem THF (40 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei –78°C gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit einer Lösung von Trizylazid (3,67 g, 11,85 mmol) in trockenem THF (40 ml) bei –78°C versetzt. Das Gemisch wurde 3 Minuten bei –78°C gerührt und sodann mit Essigsäure (5 ml) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch 1 Stunde und 45 Minuten bei Raumtemperatur und schließlich 15 Minuten bei 40°C gerührt. Nach Abdampfen des Großteils des THF wurde der Rückstand in EtOAc (100 ml) aufgenommen. Die organische Lösung wurde mit H₂O (50 ml), 5% NaHCO₃ (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Das erhaltene Öl wurde an Kieselgel unter Verwendung von Hexan/CH₂Cl₂ (1/1) als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 15k (2,47 g, Ausbeute 67%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,32–1,45 (m, 6H), 1,45–1,6 (m, 1H), 1,75–1,88 (2, 2H, Rotamere), 2,01–2,11 (m, 2H), 2,82–2,87 (m, 1H), 3,33 (dd, J = 13,4 & 3,2 Hz, 1H), 4,10–4,28 (m, 2H), 4,62–4,72 (m, 1H), 4,90–5,05 (m, 3H), 5,73–5,88 (m, 1H), 7,17–7,38 (m, 5H).
D
Eine gerührte Lösung von wasserfreiem SnCl₂ (2,61 g, 13,8 mmol) in wasserfreiem McOH (80 ml) wurde mittels einer Kanüle mit einer Lösung des Azids 15k (2,45 g, 6,9 mmol) in wasserfreiem McOH (20 ml) von 0°C versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des McOH wurde das erhaltene schaumartige Material in Dioxan/H₂O (100 μl/20 μl) aufgenommen und mit Boc₂O (3,0 g, 13,8 mmol) und NaHCO₃ (2,89 g, 34,5 mmol) behandelt (der pH-Wert wurde gegebenenfalls mit NaHCO₃ auf 8 oder mehr eingestellt). Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde ein Teil des Dioxans abgedampft (~50%) und der Rückstand wurde 2-mal mit EtOAc extrahiert. Die organische Lösung wurde mit Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde an Kieselgel unter Verwendung von 20–25% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 15l (1,75 g, Ausbeute 60%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,27–1,53 (m, 6H), 1,46 (s, 9H), 1,80 (m, 1H), 2,00–2,08 (m, 1H), 2,80 (t, J = 12,1 Hz, 1H), 3,34 (d, 14,3 Hz, 1H), 4,17–4,23 (m, 2H), 4,60–4,66 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 17,2 & 1,9 Hz, 1H), 5,13 (bs, 1H), 5,38–5;43 (m, 1H), 5,74–5,84 (m, 1H), 7,22–7,36 (m, 5H).
E
Eine gerührte Lösung des N-Boc-Derivats 15l (1,74 g, 4,04 mmol) in THF/H₂O (75 ml/15 ml) wurde bei 90°C mit H₂O₂ (30% Vol./Gew., 2,05 ml, 16,2 mmol) und LiOH·N₂O (0,34 g, 8,1 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Sodann wurde die Umsetzung mit Na₂SO₃ (2,24 g in H₂O, 15 ml, 17,8 mmol) gestoppt. Der pH-Wert wurde mit 10%iger wässriger Citronensäure auf 4–5 eingestellt. Das Gemisch wurde mit EtOAc verdünnt. Die wässrige Fraktion wurde ein weiteres Mal mit EtOAc extrahiert. Die organische Lösung wurde 2-mal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Verwendung von 20% Hexan in EtOAc als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhielt die freie Carbonsäure 15g (0,76 g, Ausbeute 70%).
Diese Verbindung war in jeglicher Hinsicht mit dem in Beispiel 15 erhaltenen Produkt identisch. Beispiel 16 Synthese von (2S)-N-Boc-Amino-5-oxo-non-8-ensäure-methytester (16d)
Diese Synthese beruht auf der Methode von T. Tsuda et. al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 102 (1980), S. 6381–6384.
A
Eine gründlich gerührte Lösung des Monoallylesters von Malonsäure (1,50 g, 10,4 mmol) in trockenem THF (20 ml) wurde unter N₂ bei –78°C tropfenweise innerhalb von 5 Minuten mit n-Bu₂Mg (0,9 M/Hexan, 5,8 ml, 5,2 mmol) versetzt. Die schwere Suspension wurde sodann 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und zur Trockne eingedampft (Vakuumentlastung unter N₂). Das feste Mg-Salz 16b wurde 1 Stunde unter Vakuum getrocknet.
Das Glutaminsäurederivat 16a wurde zunächst mit 1,1'-Carbonylidiimidazol (1,65 g, 10,21 mmol) in wasserfreiem THF vermischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, um den freien Säurerest zu aktivieren. Anschließend wurde das aktivierte Glutaminsäurederivat mittels einer Kanüle zu einer Lösung des Mg-Salzes 16b gegeben. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde es mit EtOAc verdünnt. Die organische Lösung wurde mit 0,5 N eiskalter HCl und mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde an Kieselgel unter Verwendung von 35–40% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 16c (1,85 g, Ausbeute 53%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,44 (s, 9H), 1,85–1,95 (m, 1H), 2,12–2,22 (m, 1H), 2,58–2,74 (m, 2H), 3,48 (s, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,24–4,34 (m, 1H), 4,52 (dm, J = 5,7 Hz, 2H), 5,09 (m, 1H), 5,25 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,34 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,91 (m, 1H).
B
Eine gerührte Lösung von Tetrakis-(triphenylphosphin)-Pd(0) (0,116 g, 5 Mol-%, 0,1 mmol) in trockenem DMF (7 ml) wurde (mit einer Spritze und unter einer N₂-Atmosphäre) mit dem Diester 16c (0,687 g, 2 mmol) in trockenem DMF (3 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit EtOAc (20 ml) verdünnt. Die EtOAc-Lösung wurde mit 0,5 N eiskalter HCl (5 ml) und Kochsalzlösung (10 ml), gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel unter Verwendung von 15–20% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 16d (0,253 g, Ausbeute 42%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,44 (s, 9H), 1,84–1,94 (m, 1H), 2,08–2,22 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 14,0 & 7,3 Hz, 2H), 2,45–2,55 (m, 4H), 3,74 (s, 3H), 4,28 (bm, 1H), 4,98 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,00–5,10 (m, 1H), 5,74–5,85 (m, 1H). Beispiel 17 Synthese von (2S,5R)-N-Boc-2-Amino-5-methyl-non-8-ensäure (17f)
A, B, C, D
Handelsübliches (R)-(+)-Citronellal 17a wurde zunächst den gleichen Synthesestufen, die in Beispiel 15 für die Umwandlung des Aldehyds 15d in das Aminosäure-Zwischenprodukt 15f beschrieben wurden, in das Aminosäurederivat 17b umgewandelt.
E
Die Verbindung 17b (0,675 g, 5,6 mmol) wurde in einem Gemisch aus tBuOH/Aceton/H₂O (1 : 1 : 1, 18 ml) gelöst und in ein Eisbad (0°C) gestellt. NMMO (0,789 g, 6,74 mmol, 1,2 Äq.) und OsO₄ (2,5% Gew./Gew. in tBuOH, 0,7 ml, 0,067 mmol, 0,012 Äq.) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Großteil des Acetons wurde unter Vakuum abgedampft. Sodann wurde das Gemisch mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde mit H₂O und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Diol 17c wurde nach Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von 1% EtOH in EtOAc als Elutionsmittel in einer Ausbeute von 77% (0,575 g) erhalten.
F
Eine Lösung des Diols 17c (0,575 g, 1,73 mmol) in THF/H₂O (1 : 1, 20 ml) wurde bei 0°C mit NaIO₄ (0,48 g, 2,25 mmol, 1,3 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Großteil des THF-Lösungsmittels durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das verbleibende Gemisch wurde mit EtOAc (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 5%iger wässriger Citronensäurelösung (2 × 20 ml), 5%iger wässriger NaHCO₃-Lösung (20 ml) und Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen und die EtOAc-Lösung wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Aldehyd-Zwischenprodukt 17d (0,47 g Rohprodukt) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
G
Eine Lösung von Ph₃PCH₃Br (925 mg, 2,6 mmol) in wasserfreiem Toluol (15 ml) wurde mit KHMDS (0,5 M in Toluol, 5,2 ml, 2,6 mmol) versetzt. Die gebildete gelbe Suspension wurde 30 Minuten unter N₂ bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension zunächst auf 0°C abgekühlt und sodann mit einer Spritze mit der Lösung des Aldehyds 17d (0,47 g 1,73 mmol (gelöst in 15 ml wasserfreiem THF) versetzt. Sodann ließ man das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der Großteil des THF durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (100 ml) versetzt. Die organische Phase wurde mit H₂O (30 ml), 5%iger wässriger NaNCO₃-Lösung (30 ml) und Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde sodann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Die reine Verbindung 17e wurde nach Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Hexan : EtOAc (3 : 2) als Elutionsmittel isoliert. Die Ausbeute betrug 63% (0,29 g) für die beiden letzten Stufen.
Die Hydrolyse des Ethylesters und der gleichzeitige Austausch der N-Acetylschutzgruppe anstelle von Boc im Zwischenprodukt 17e zur Bildung der Verbindung 17f wurden nach dem gleichen Verfahren, wie es für die Umwandlung der Verbindung 15f zu 15g angegeben wurde, durchgeführt (17f, 310 mg, quantitativ).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 0,88 (d, J=6,4 Hz, 3H), 1,18–1,28 (m, 2H), 1,35–1,48 (m, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,64–1,74 (m, 1H), 1,81–1,89 (m, 1H), 1,94–2,12 (m, 2H), 4,28 (bd, J=3,2 Hz, 1H), 4,93 (dm, J=11,1 Hz, 1H), 5,00 (dm, J=16,8 Hz, 1H), 5,74–5,84 (m, 1H). Beispiel 18 Synthese von N-Boc-O-Allyl-(L)-threonin (18d)
A
Boc-(L)-threonin 18a (500 mg, 2,28 mmol) wurde bei 0°C partiell in CH₂Cl₂/MeOH (8 ml bzw. 0,5 ml) gelöst. Eine Lösung von Diazomethan in Diethylether wurde langsam zugegeben, bis die gelbe Farbe bestehen blieb, was auf das Vorliegen von überschüssigem Diazomethan hindeutete. Nach Abdampfen der Lösungsmittel wurde der rohe Methylester 18b in Form eines trüben weißen Öls (0,534 g) erhalten.
B
Das Zwischenprodukt 18b (311 mg, 1,33 mmol) wurde sodann in wasserfreiem Diethylether (8 ml) gelöst, mit Ag₂O (341 mg, 1,47 mmol) und frisch aktivierten 4 Å-Molekularsieben (1 g) versetzt. Schließlich wurde Allyliodid (134 μl, 1,47 mmol) in den Reaktionskolben gegeben und das Gemisch wurde unter Rückfluss gerührt. Nach 20 Stunden und 30 Stunden wurden weitere 2 Portionen Allyliodid (jeweils 45 μl, 0,50 mmol) zugegeben. Der Rührvorgang wurde insgesamt 36 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde das Gemisch durch Celite filtriert und durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 4) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt 73 mg (Ausbeute 27%) der Verbindung 18c in Form eines klaren Öls.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,21 (d, J=6,0 Hz, 3H), 1,45 (s, 9H), 3,75 (s, 3H), 3,82–3,87 (m, 1H), 3,99–4,07 (m, 2H), 4,29 (dd, J=9,5 & 2,5 Hz, 1H), 5,14 (dm, J=10,5 Hz, 1H), 5,21 (dm, J=17,2 Hz, 1H), 5,75–5,84 (m, 1H).
C
Die Esterverbindung 18c (99 mg, 0,362 mmol) wurde in einem Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (2 : 1 : 1, 4 ml) gelöst und mit LiOH·H2O (61 mg, 1,45 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit 1H HCl auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, wonach die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wurden. Das erhaltene Öl, die Verbindung 18d, wurde direkt für die Synthese von makrocyclischen Inhibitoren verwendet. Beispiel 19 Synthese von (2S,3S)-N-Boc-2-Amino-3-(mercaptoallyl)-butansäure (19e)
A
Die Verbindung 19a (9,1 mmol) wurde in Pyridin (5 ml) gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt und in kleinen Portionen mit Tosylchlorid (2,3 g, 11,8 mmol, 1,3 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Diethylether (300 ml) und H₂O (100 ml) ausgeschüttelt. Die Etherphase wurde ferner mit 0,2 N HCl (6 × 100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Nach Reinigung des Rohmaterials durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc (Gradient von 8 : 2 bis 7 : 3) als Elutionsmittel erhielt man das Tosylderivat 19b in einer Ausbeute von 85% (3,05 g).
B
Eine Lösung des Zwischenprodukts 19b (775 mg, 2 mmol) in wasserfreiem DMF (2,5 ml) wurde mit Kaliumthioacetat (365 mg, 3,2 mmol, 1,6 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Großteil des DMF wurde unter Vakuum abgedampft. Das restliche Gemisch wurde mit EtOAc und H₂O ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Nach Reinigung des Rohmaterials durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc (Verhältnis 4 : 1) als Elutionsmittel erhielt man die Verbindung 19c in einer Ausbeute von 80% (465 mg).
C
Eine Lösung des Thioesters 19c (465 mg) in H₂O/EtOH (Verhältnis 3 : 5, 8 ml) wurde mit einer wässrigen Lösung von 0,2 M NaOH (2,4 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde Allyliodid (0,292 ml, 3,2 mmol, 2 Äq.) zugegeben. Der Rührvorgang wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf die Hälfte seines ursprünglichen Volumens eingeengt und anschließend mit EtOAc extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit wässriger 0,5 N HCl auf den pH-Wert ~3 angesäuert und mit EtOAc rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das rohe Reaktionsgemisch enthielt mindestens vier Produkte. Sämtliche Produkte wurden durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Hexan/EtOAc (Gradient von 9 : 1 bis 3 : 1) isoliert. Die Struktur der am wenigsten polaren Verbindung (TLC R_f = 0,68 in Hex/EtOAc 4 : 1) entsprach dem angestrebten Produkt 19d (83 mg, Ausbeute 18%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,24 (d, J=7,0 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 3,13–3,19 (m, 2H), 3,24–3,29 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 4,50 (dd, J=8,6 & 3,8 Hz, 1H), 5,12 (d, J=12,4 Hz, 1H), 5,15 (dd, J=18,4 & 1,3 Hz, 1H), 5,22 (bd, J=7,6 Hz, 1H), 5,75–5,85 (m, 1H).
D
Eine Lösung des Methylesters 19d (83 mg, 0,287 mmol) in McOH/H₂O (3 : 1,4 ml) wurde mit wässrigem NaOH (0,2 N, 1,3 ml, 0,26 mmol) 24 Stunden bei Raumtemperatur und 1 Stunde bei 40°C vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde mit kalter wässriger HCl (0,5 N HCl, 0°C, pH-Wert 4–5) angesäuert. Das McOH wurde unter Vakuum entfernt und das restliche wässrige Gemisch mit EtOAc extrahiert. Die organische Lösung wurde über MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhielt die Verbindung 19e. Die Verbindung 19e wurde ohne weitere Reinigung für die endgültige Synthese von Inhibitoren verwendet. Beispiel 20 Synthese von (S)-N-Boc-2-Amino-3-methyl-3-(1-mercapto-4-butenyl)-butansäure (20e)
A
L-Penicillamin 20a (448 mg, 3 mmol) wurde in DMF/DMSO (Verhältnis 5 : 1,6 ml) gelöst und mit 4-Brompenten (0,46 ml, 4,5 mmol, 1,5 Äq.) und CsOH·H₂O (1,0 g, 6 ml, 2 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 Stunden wurde Boc₂O (820 mg, 3,75 mmol, 1,25 Äq.) zum Gemisch gegeben und der Rührvorgang wurde weitere 12 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das DMF unter Vakuum entfernt. Das verbleibende Gemisch wurde mit kalter wässriger 0,5 N HCl unter Einstellung des pH-Werts auf ~4–5 verdünnt und sodann mit EtOAc (2 × 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung (2×) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhielt die rohe Carbonsäure 20b.
B
Die Reinigung von 20b erwies sich als schwierig, so dass das Rohprodukt zunächst mit Diazomethan unter Bildung des entsprechenden Methylesters 20c behandelt wurde. Anschließend wurde eine Reinigung durch Flash- Säulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc (9 : 1) als Elutionsmittel durchgeführt. Man erhielt 190 mg (Ausbeute 20%) des reinen Methylesters 20c.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1,35 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,59–1,67 (m, 2H), 2,11–2,17 (m, 2H), 2,51–2,60 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,29 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 4,98 (dm, J=10,5 Hz, 1H), 5,03 (dm, J=19 Hz, 1H), 5,35 (bd, J=7 Hz, 1H), 5,72–5,83 (m, 1H).
C
Der Ester wurde anschließend in THF/MeOH/H₂O (2 : 2 : 1,5 ml) gelöst und mit LiOH·H₂O (50 mg, 2,0 mmol, 2 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 40°C gerührt, um den Ester 20c zurück zur Säure 20b zu hydrolysieren. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,5 N HCl auf den pH-Wert 4–5 angesäuert, das THF und das McOH wurden zur Trockne abgedampft. Die verbleibende wässrige Lösung wurde mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhielt die Verbindung 20b, die ohne weitere Reinigung bei der anschließenden Synthese von makrocyclischen Inhibitoren verwendet wurde.
Acyclische Dipeptid- und Tripeptid-Zwischenprodukte
Das allgemeine Verfahren zur Durchführung der Kupplungsreaktionen in Lösung sowie spezielle Beispiele hierfür sind in WO-00/09543 und WO-00/09558 beschrieben.
Diese Verfahren wurden zur Synthese der Zwischenprodukt-Dipeptide 26c, 30a und Tripeptide 23a, 24a, 31a, 32a und 33a herangezogen. Beispiel 21 Synthese des acyclischen Tripeptids 21e
A
Eine Lösung des Prolinderivats 21a (hergestellt aus handelsüblichem Boc-4(R)-Hydroxyprolin und 4-Chlorchinolin gemäß WO-00/05543 und WO-00/09558 ) (1,32 g, 3,68 mmol) und des rohen Homoallyl-ACCA 1f (~3,35 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurde nacheinander mit NMM (1,21 ml, 10,05 mmol) und HATU (1,53 g, 4,02 mmol) versetzt. Die Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel abgedampft. Das rohe Reaktionsgemisch wurde erneut in EtOAc (30 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 5%iger wässriger NaHCO₃-Lösung (2 × 10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 8% Diethylether in EtOAc als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt das gewünschte Diastereomere der Verbindung 21 b in einer Ausbeute von 20% (die absolute stereochemische Beschaffenheit wurde nicht bestimmt).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 0,93 & 1,01 (t, J = 8,3 Hz, 1H, Rotamere im Verhältnis 3 : 7), 1,14–1,35 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 1,50–1,82 (m, 4H), 2,08–2,24 (m, 2H), 2,32 (bs, 0,7H), 2,63 (bs, 0,75H), 2,93 (bs, 0,75H), 3,16 (m, 0,25H), 3,77 (bs, 1,5H), 3,88 (bs, 0,5H), 4,4–4,55 (m, 1H), 4,98 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 17,2 & 1,6 Hz, 1H), 5,24 (bs, 1H), 5,75–5,88 (m, 1H), 6,57 & 6,78 (2bs, 1H, 2 Rotamere), 7,42–7,58 (m, 3H), 7,63–7,73 (m, 2H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,74 (d, J = 5,1 Hz, 1H).
B
Eine Lösung des Dipeptids 21 b (137 mg, 0,248 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ wurde mit einer Lösung von HCl in Dioxan (4 M, 4 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand unter Hochvakuum getrocknet. Man erhielt die freie Aminosäure. Das Gemisch wurde in Diethylether/MeOH (3 μl/2 μl) gelöst und mit einem geringfügigen Überschuss an Diazomethan in Lösung in Diethylether behandelt. Nach 30 Minuten wurde das überschüssige Diazomethan durch Zugabe von HCl (4 M in Dioxan) zerstört. Das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft. Man erhielt das HCl-Salz der Verbindung 21 c, die ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
C
Eine gerührte Suspension des rohen Dipeptids 21 c (0,23 g, 0,48 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) wurde nacheinander mit (2S)-N-Boc-Amino-hept-6-ensäure 21d (0,151 g, 0,62 mmol), NMM (210 μl, 1,91 mmol) und HATU (0,236 g, 0,62 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (der pH-Wert wurde, sofern erforderlich, nach 1 Stunde mit NNM auf ~8 eingestellt). Das CH₂Cl₂ wurde abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) aufgenommen. Die organische Lösung wurde mit einer 5%igen NaHCO₃-Lösung (2 × 20 ml) und Kochsalzlösung (2 × 20 ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Die erhaltene rohe Verbindung wurde an Kieselgel (50 ml, 2% EtOH/EtOAc) chromatographiert. Man erhielt die Verbindung 21e (0,139 g, Ausbeute 46%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz, Rotamere im Verhältnis 6 : 1) chemische Verschiebungen des Hauptrotameren: δ 1,21–1,27 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,45–1,81 (4m, 7H), 2,20–2,22 (m, 4H), 2,28–2,37 (m, 1H), 2,90–2,99 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,94–3,98 (m, 1H), 4,29 (bd, J = 9,9 Hz, 1H), 4,46–4,50 (m, 1H), 4,81 (dd, J = 8,3 & 5,4 Hz, 1H), 4,92–5,06 (m, 4H), 5,16 (d, J = 8,3 Hz 1H), 5,37 (m, 1H), 5,70–5,84 (m, 2H), 6,82 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,47–7,55 (m, 2H), 7,71 (dt, J = 7,0 & 1,3 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,78 (d, J = 5,1 Hz, 1H).
Makrocyclische Peptide
Beispiel 22
Allgemeines Verfahren zur Makrocyclisierung über Olefin-Metathese
In sämtlichen Fällen wurde das Tripeptidien in CH₂Cl₂ in einer Konzentration von 0,01 M gelöst. Die Lösung wurde durch Einleiten von Argon (~1 Stunde für ein Volumen von 500 ml) desoxygeniert. Eine Lösung des Katalysators (5–30 Mol-%, gelöst in einer geringen Menge an entgastem CH₂Cl₂) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss erwärmt, bis das gesamte Ausgangsmaterial in das oder die Produkte umgewandelt war, wie sich durch TLC und HPLC ergab. Die rohen Reaktionsgemische wurden anschließend bis nahezu zur Trockne eingeengt und durch eine kurze Kieselgelschicht filtriert, wobei zunächst mit CH₂Cl₂ zur Entfernung des Großteils des Katalysators und anschließend mit EtOAc zur Entfernung sämtlicher makrocyclischer Produkte eluiert wurde (meist als einzelnes Diastereomeres). Die Rohprodukte jeder Umsetzung wurden durch chirale HPLC an einer CHIRALCEL OJ-R-Säule (Produkt der Fa. Chiral Technologies Inc, 0,46 ⌀ × 15 cm) analysiert, wozu ein isokratisches Lösungsmittelgemisch aus 70% H₂O + 0,06% TFA – 30% CH₃CN + 0,06% TFA verwendet wurde (205 nm). Die hauptsächlichen makrocyclischen Produkte wurden vollständig charakterisiert durch ¹H-, COSY-, TOCSY- und ROESY-NMR-Daten, um ihre Struktur und stereochemische Beschaffenheit zu bestätigen. Beispiel 23 Synthese des makrocyclischen Zwischenprodukts (23b)
Eine Lösung des Diens 23a (4,0 g, 7,88 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (800 ml, Aldrich, wasserfrei) wurde durch 2-stündiges Einleiten von Ar desoxygeniert. Anschließend wurde Hoveyda-Katalysator (262 mg, 0,434 mmol, 5,5 Mol-%) als Feststoff zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einem Ar-Ballon unter Rückfluss erwärmt. Nach 28 Stunden wurde die rot-orangefarbene Lösung zu einem amorphen Feststoff eingedampft und sodann durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt. Beim anfänglichen Lösungsmittelsystem handelte es sich um 10% EtOAc in CH₂Cl₂. Nach Elution des Katalysators von der Säule wurde das Lösungsmittel in reines EtOAc abgeändert. Die Elution des Katalysators von der Säule ist aufgrund der Färbung ersichtlich. Das makrocyclische Produkt 23b wurde in Form eines farblosen Schaums isoliert, der in CH₂Cl₂/Hexan (~1 : 2) erneut in Lösung gebracht wurde. Durch Eindampfen des Lösungsmittels erhielt man ein weißes Pulver (3,362 g, Ausbeute 89%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,20–1,50 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,53 (dd, J = 9,5 & 5,4, 1H), 1,61–1,70 (m, 1H), 1,76–1,90 (m, 2H), 2,05–2,26 (m, 4H), 2,45 (d, J = 14,3, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,71 (d, J = 11,1, 1H), 3,90 (dd, J = 11,1 & 4,3, 1H), 4,43–4,53 (m, 2H), 4,76 (d, J = 8,6, 1H), 4,86 (bd, J = 9,8, 1H), 5,20–5,23 (m, 2H), 5,57 (dt, J = 7,0 & 9,8, 1H), 7,32 (bs, 1H). Beispiel 24 Synthese des makrocyclischen Zwischenprodukts (24b)
Eine Lösung des Diens 24a (2,76 g, 3,82 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (600 ml, wasserfrei) wurde durch 1,5-stündiges Einleiten von Ar desoxygeniert. Eine Lösung des Hoveyda-Katalysators (117 mg, 0,19 mmol, 0,05 Äq.) in wasserfreiem und entgastem CH₂Cl₂ (8 ml) wurde über eine Kanüle zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einem Ar-Ballon unter Rückfluss gerührt. Nach 20 Stunden war die Umsetzung zu etwa 50% beendet. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite Portion Katalysator (117 mg) zugegeben und der Rührvorgang wurde weitere 16 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde die Lösung auf 100 ml eingeengt und oben auf eine Schicht Kieselgel (6 × 10 cm) aufgesetzt. Der Katalysator wurde zuerst durch Elution mit CN₂Cl₂ gewonnen. Die Verbindung 24b wurde mit 3% McOH in EtOAc aus der Kieselgelschicht ausgewaschen und durch Flash- Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (2 : 1) gereinigt. Man erhielt in einer Ausbeute von 70% einen leicht olivfarbenen weißen Feststoff (1,85 g, Reinheit 94% gemäß HPLC).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,69 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50–7,44 (m, 2H), 7,17 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,60–5,56 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 11 Hz, 1N), 4,44 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,05–3,98 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,89–3,82 (m, 1H), 3,55 (s, 3H), 2,64–2,53 (m, 1H), 2,46 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 2,40–2,31 (m, 1H), 2,21 (dd, J = 8,9 Hz, 1H), 1,78–1,65 (m, 2H), 1,55 (dd, J = 4,8 Hz, 1H), 1,485 (dd, J = 4,8 Hz, 1H), 1,41–1,30 (m, 7H), 1,16 (s, 9H), MS; ES+: 795,4 (M + H)⁺. Beispiel 25 Synthese der Verbindungen 202 und 203 (Tabelle 2)
A
Die Dienverbindung 21e (0,130 g, 0,205 mmol) wurde unter Verwendung katalytischer Mengen an Bis-(tricyclohexylphosphin)-benzylidenruthenium IV-dichlorid (Grubb-Katalysator, vergl. oben) (52 mg, 0,064 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) unter 2-stündigem Sieden unter Rückfluss cyclisiert. Nach Chromatographie an Kieselgel (50 ml, 3% EtOH/EtOAc) erhielt man die Verbindung 25a (60,1 mg, Ausbeute 48%).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,22–1,30 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,44–2,35 (m, 13H), 3,07–3,14 & 3,16–3,24 (2m, 1H, Rotamere im Verhältnis 1 : 3), 3,69 (s, 3H), 3,96–4,04 (m, 1H0, 4,42–4,50 (m, 1H), 4,95–5,04 (m, 1H), 5,05–5,15 (m, 1H), 5,20–5,30 (m, 1H), 5,55–5,65 (m, 1H), 6,75–6,79 (2d, J = 5,4 Hz, 1H, Rotamere im
Verhältnis 1 : 3), 7,36 (s, 1H), 7,46–7,50 (m, 1H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,13 & 8,17 (2d, J = 8,0 Hz, 1H, Rotamere im Verhältnis 1 : 3), 8,77 (d, J = 5,1 Hz, 1H).
B
Der Esterrest der makrocyclischen Verbindung 25a (0,0156 g, 0,026 mmol) wurde mit LiOH·H₂O (8,7 mg, 0,206 mmol) in THF/MeOH/H₂O (4 ml/2 ml/2 ml) hydrolysiert. Das Rohprodukt wurde durch Umkehrphasen-C18-HPLC an einer Whatman-Säule (Partisil 10,0 DS3; 50/2,4 cm) unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 5% wässrigem CH₃CN zu 100% CH₃CN gereinigt. Man erhielt die reine Verbindung 202 in Form eines amorphen weißen Feststoffes (11,8 mg).
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,12 (s, 9H), 1,20–1,24 (m, 2H), 1,32–1,40 (m, 3H), 1,58–1,62 (m, 2H), 1,68–1,78 (m, 3H), 1,95–2,02 (m, 1H), 2,08–2,18 (m, 2H), 2,42–2,59 (m, 2H), 3,97–4,00 (bd, J = 9,8 Hz, 2H), 4,47 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,58 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 5,22–5,29 (m, 1H), 5,46–5,54 (m, 1H), 5,66 (s, 1H), 7,12 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J = 7,3 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 7,0 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,35 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 9,08 (d, J = 5 Hz, 1H).
C
Die makrocyclische Verbindung 25a (20 mg, 0,033 mmol) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (1 ml) 1 Stunde in Gegenwart von 4 M HCl/Dioxan (5 ml) gerührt. Das Gemisch wurde eingedampft und sorgfältig getrocknet. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂/DMF (3 ml/1 ml) in Lösung gebracht und mit NMM (14,5 μl, 0,132 mmol) und Essigsäureanhydrid (7,0 μl, 0,073 mmol) behandelt und 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch eingedampft und unter Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (4 ml/2 ml/2 ml) gelöst und über Nacht mit LiOH·2H₂O (11 mg, 0,264 mmol) gerührt. Der nach Ansäuern auf den pH-Wert 3 mit 1H eiskalter HCl isolierte Rückstand wurde durch Umkehrphasen-C18-HPLC unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 0–40% wässrigem CH₃CN (0,06% TFA) gereinigt. Es wurde die reine Verbindung 203 in Form eines amorphen weißen Feststoffes (12 mg) isoliert.
¹H-NMR (50 mM Na₂PO₄-Puffer, pH-Wert = 6,0, 600 MHz): δ 1,22–1,27 (m, 2H), 1,38–1,43 (m, 2H), 1,58–1,64 (m, 2H), 1,67–1,76 (m, 2H), 1,77–1,84 (m, 1H), 1,92–1,99 (m, 1H), 2,22–2,08 (m, 1H), 2,12–2,27 (m, 1H), 2,22–2,27 (m, 1H), 2,60–2,67 (m, 1H, Pro-β'), 2,83–2,89 (m, 1H, Pro-β), 4,32 (dd, J = 12,1 & 3,5 Hz, 1H, Pro-δ'), 4,41 (dd, J = 12,1 & 7,3 Hz, 1H), 4,56 (bd, J = 8,0 Hz, 1H, Pro-δ), 4,62 (dd, J = 8,9 Hz, 1H, Pro-α), 5,40–5,46 (m, 1H), 5,55–5,61 (m, 1H), 5,73 (bs, 1H, Pro-γ), 7,41 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,64 (bs, 1H, Acca-NH), 7,80 (dd, J = 7,9 Hz, 1H), 8,03 (dd, J = 8,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 7 Hz, 1H, AcNH), 8,36 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,90 (d, J = 6,0 Hz, 1H). Beispiel 26 Synthese der Verbindung 508 (Tabelle 5)
A
Eine Lösung von Boc-geschütztem L-Glutamin 26a (4,93 g, 20 mmol) und Iodbenzoldiacetat (7,73 g, 24 mmol, 1,2 Äq.) in EtOAc/CH₃CN/H₂O (2 : 2 : 1, 60 ml) wurde 1 Stunde bei 16°C und 3 Stunden bei 20°C gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit H₂O (20 ml) verdünnt. Die Lösungsmittel EtOAc und CH₃CN wurden unter Vakuum entfernt. Das verbleibende wässrige Gemisch wurde mit Diethylether (3 × 50 ml) und EtOAc (50 ml) extrahiert, um den Großteil der Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Phase (die das Amin-Zwischenprodukt enthält) wurde sodann zur Trockne eingeengt. Das restliche Material wurde in 10% Na₂CO₃ (30 ml) in Lösung gebracht, in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt und langsam (~10 Minuten) mit einer Lösung von Chlorameisensäurebenzylester (3,3 ml, 20,4 mmol, 1,02 Äq.) in Dioxan (40 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit H₂O (50 ml) verdünnt, mit kaltem (~5°C) Diethylether (3 × 50 ml) extrahiert, mit 4 M HCl auf den pH-Wert 3–4 angesäuert und mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das rohe Material wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan/AcOH (7 : 2,9 : 0,1) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 26b in einer Gesamtausbeute von 43% (3,04 g).
B
Das Dipeptid-Zwischenprodukt 26c (250 mg, 0,41 mmol), die Verbindung 26b (171 mg, 0,49 mmol, 1,2 Äq.) und HATU (185 mg, 0,49 mmol, 1,2 Äq.) wurden in CH₂Cl₂ (6 ml) gelöst und mit DIPEA (0,29 ml, 1,62 mmol, 4 Äq.) versetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das CH₂Cl₂ unter Vakuum abgedampft und das rohe Material wurde in EtOAc in Lösung gebracht. Die EtOAc-Lösung wurde mit wässriger 5%iger NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Die Verbindung 26d wurde nach Reinigung des rohen Materials durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Nexan (4 : 1) als Elutionsmittel in einer Ausbeute von 98% erhalten (338 mg).
C
Eine Lösung der Verbindung 26d (335 mg, 0,394 mmol) in THF (5 ml) wurde auf 0°C abgekühlt und mit einer Lösung von BH₃ in Dimethylsulfid (0,12 ml einer 10 M Lösung, 1,2 mmol, 3 Äq.) versetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte es 1 Stunde. Anschließend wurde es erneut auf 0°C abgekühlt, wonach eine wässrige Lösung von NaOH (0,8 ml einer 2,5 M Lösung, 1,97 mmol, 5 Äq.) langsam innerhalb von 15 Minuten zugegeben wurde. Hieran schloss sich die langsame Zugabe (~15 Minuten) einer wässrigen Lösung von H₂O₂ (0,8 ml einer 8,8 M Lösung, 6,9 mmol, 17,5 Äq.) an. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte es 1 Stunde. Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf den pH-Wert ~4 angesäuert, um überschüssiges BH₃ zu beseitigen. Sodann wurde zur Einstellung eines pH-Werts von ~9–10 eine wässrige NaHCO₃-Lösung zugegeben. Das THF wurde unter Vakuum entfernt und das rohe Material wurde mit H₂O und EtOAc ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde erneut mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das rohe Material wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan/NH₄OH (8 : 2 : 0,5) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die reine Verbindung 26e in einer Ausbeute von 57% (192 mg).
D
Eine Lösung der Verbindung 26e in CH₂Cl₂ (8 ml) wurde mit Dess-Martin-Periodinat (195 mg, 97%, 0,33 mmol, 1,5 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde die Umsetzung durch Zugabe von wässrigem Na₂S₂O₃ (3 ml einer 5%igen Lösung) gestoppt. Anschließend wurde eine wässrige NaHCO₃-Lösung (5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich wurde das rohe Reaktionsgemisch mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde mit wässriger 5%iger NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Man erhielt 188 mg des Aldehyds 28f, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
E
Eine Lösung der Verbindung 26f (188 mg, 0,22 mmol) von CH₃CO₂H (38 μl) und Pd(OH)₂ (25 mg) in Ethanol (5 ml) wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur unter H₂ bei atmosphärischem Druck gerührt. Anschließend wurde weiteres H₂-Gas, Pd(OH)₂ (180 mg) und CH₃CO₂H (154 μl) in den Kolben gegeben. Der Rührvorgang wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Gemisch filtriert. Das Lösungsmittel wurde zur Trockne eingedampft. Das rohe makrocyclische Produkt wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von CHCl₃/MeOH/AcOH (10 : 2 : 1) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 26g in einer Ausbeute von ~30% (48 mg).
F
Ein Gemisch aus der Verbindung 26g (22 mg, 0,031 mmol), DIPEA (27 μl, 0,155 mmol, 5 Äq.) und Essigsäureanhydrid (8,7 μl, 0,093 mmol, 3 Äq.) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das CH₂Cl₂ unter Vakuum entfernt. Ein Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (2 : 2 : 1, 5 ml) und LiOH·2H₂O (13 mg, 0,31 mmol, 10 Äq.) wurde zugegeben. Man ließ die Hydrolysereaktion 68 Stunden bei Raumtemperatur und 2 Stunden bei 50°C ablaufen. Sodann wurde das Reaktionsgemisch angesäuert (pH-Wert = ~4) und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Man erhielt das Endprodukt 508 (~6 mg, Ausbeute ~26% für die letzten 2 Stufen).
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz) von 508 (Gemisch von Rotameren bestätigt durch COSY-, TOCSY- und ROESY-NMR-Daten): δ 1,18 (s, 9H), 1,09–1,85 (überlappendes m, 11H), 1,95 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 3,18–4,14 (überlappendes m, 6H), 3,96 (s, 3H), 4,44 (m, 1H), 4,62 & 4,69 (2d, J =11,8 Hz, 1H, Rotamere), 5,82 (bs, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,53 (bs, 1H), 7,67 (bs, 4H), 8,19 (bs, 3H), 8,61 (s, 1H). Beispiel 27 Synthese des gesättigten makrocyclischen Zwischenprodukts (27a)
A
Das ungesättigte makrocyclische Zwischenprodukt 23b (3,50 g, 7,30 mmol) wurde in EtOAc (30 ml) gelöst. 700 mg (20% Gew./Gew.) 5% Rh-auf-Aluminiumoxid wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter H₂-Gas bei atmosphärischem Druck und bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend bestätigte die HPLC-Analyse die vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials in zwei Produkte, nämlich das angestrebte Produkt 27a und ein untergeordnetes Produkt (8% der Gesamtmasse), das später als Verbindung 27b identifiziert wurde und sich durch Öffnung des Cyclopropanrings gebildet hatte. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und eingeengt. Man erhielt einen hellgrünen Feststoff (3,47 g). Dieser Feststoff wurde 2-mal mit EtOH eingedampft, um das EtOAc zu entfernen (die Anwesenheit von EtOAc stört die nächste Stufe). Die Abtrennung der Verbindung 27a von der Verbindung 27b durch Chromatographie erwies sich als sehr schwierig, so dass ein alternatives Verfahren auf der Grundlage der relativen Hydrolysegeschwindigkeiten der entsprechenden Methylesterreste konzipiert wurde.
B
Das rohe Gemisch der Verbindungen 27a und 27b (3,47 g) wurde in THF : MeOH (1 : 1, 20 ml) gelöst und eine wässrige Lösung von LiOH·H₂O (24 mg in 5 ml H₂O, 8% Äq.) wurde zugegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (die vollständige Hydrolyse des Nebenprodukts 27b in die entsprechende Säure 27c wurde durch HPLC bestätigt). Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum eingeengt, um den Großteil des THF und McOH zu entfernen, und mit H₂O (100 ml) und EtOAc (300 ml) ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit 0,5 N NaOH (3 × 100 ml), Kochsalzlösung (100 ml), 10%iger wässriger Citronensäure (2 × 100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockne eingeengt. Das angestrebte Produkt 27a wurde in hoher Reinheit (> 90% gemäß HPLC) als hellgrüner Schaum und in einer Gesamtausbeute von 93% (3,28 g) für die beiden Stufen erhalten.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δ 1,1–1,38 (m, 13H), 1,42 (s, 9H), 1,51–1,57 (m, 1H), 1,63–1,67 (dd, J = 8,0 & 5,1 Hz, 1H), 1,81–1,87 (m, 1H), 1,92–1,99 (m, 1H), 2,02–2,08 (m, 1H), 2,62 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,4 (d, J= 8,3, 1H), 3,65 (s, 3H), 4,01 (dd, J = 10,8 & 4,1 Hz, 1H), 4,42–4,48 (m, 1H), 4,51–4,55 (m, 1H), 4,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,97 (br s, 1H). Beispiel 28 Synthese der Verbindung #741 (Tabelle 7)
Das Chinolinderivat 8f wurde über eine Mitsunobu-Reaktion an der vorher gebildeten makrocyclischen Verbindung 23b angebracht. Das Chinolinderivat 8f (30 mg, 0,095 mmol) wurde in THF gelöst. Anschließend wurden die makrocyclische Verbindung 23b (45,6 mg, 1 Äq.) und PPh₃ (49,8 mg, 2 Äq.) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde auf 0°C gekühlt. Anschließend wurde DIAD (37,4 μl, 2 Äq.) zugetropft. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 0°C und sodann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wurde das Gemisch mit EtOAc (15 ml) verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (15 ml) und anschließend mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösung wurde mit MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt 202 mg eines gelben Öls. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (100% EtOAc) gereinigt. Das Produkt enthielt nach der Reinigung noch DIAD-Nebenprodukte. Das erhaltene Produkt enthielt 55% (Gew./Gew.) des angestrebten Produkts, so dass die Ausbeute 62% betrug.
Das Ester-Zwischenprodukt (46 mg, 0,06 mmol) wurde in einem Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (Verhältnis 2 : 1 : 1,2 ml) gelöst. LiOH·H₂O (20 mg, 0,48 mmol) wurde zugegeben und die Lösung würde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 16 Stunden ergab eine Analyse des Reaktionsgemisches durch HPLC, dass die Hydrolyse vollständig war. Die organischen Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt. Das verbleibende rohe Material wurde in DMSO gelöst und durch Umkehrphasen-C18-HPLC gereinigt. Man erhielt den reinen Inhibitor 741.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,67 (s, 1H), 8,29–8,14 (m, 2H), 8,08–7,97 (m, 1H), 7,91–7,78 (m, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,31–7,20 (m, 1H), 7,10 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,82–5,71 (m, 1H), 5,58–5,47 (m, 1H), 5,32–5,23 (m, 1H), 4,74–4,64 (m, 1H), 4,55–4,47 (m, 1H), 4,23–4,06 (m, 1H), 4,04–3,94 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92–3,85 (m, 1H), 2,70–2,55 (m, 2H), 2,53–2,36 (m, 2H), 2,20–2,09 (m, 1H), 1,80–1,62 (m, 2H), 1,56–1,43 (m, 2H), 1,42–1,29 (m, 6H), 1,27 (d, J = 3,2 Hz, 3H), 1,25 (d, J = 2,9 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H).
MS: 763,1 (M + 1), 761,1 (M – 1). Beispiel 29 Synthese der Verbindung 205 (Tabelle 2)
Eine Lösung der makrocyclischen Verbindung 25a (21 mg, 0,035 mmol) in tert.-Butanol/H₂O) (1,5 ml/1,5 ml) wurde bei 0°C mit einer Lösung von OsO₄ in tert.-Butanol (0,36 ml einer 35%igen (Gew./Vol.) Lösung, 0,035 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit EtOAc (20 ml) verdünnt und die organische Lösung wurde mit 5%iger NaHCO₃-Lösung (2 × 10 ml) und Kochsalzlösung (2 × 10 ml) gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Die rohe Verbindung wurde in THF/MeOH/H₂O (3 ml/1,5 ml/1,5 ml) aufgenommen und 16 Stunden in Gegenwart von LiOH·H₂O (13 mg, 0,28 mmol) gerührt. Das Gemisch wurde mit 0,5 N eiskalter HCl auf den pH-Wert 4 angesäuert, eingedampft und durch Umkehrphasen-C18-HPLC unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von H₂O (0,06% TFA) bis zu 40%igem wässrigem CH₃CN (0,06% TFA) gereinigt. Das syn-Diol 205 wurde in hoher Reinheit in Form eines amorphen weißen Feststoffes isoliert.
Verbindung #205: ¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,01 (s, 9H), 1,06–1,30 (m, 9H), 1,48–1,68 (m, 3H), 1,78–1,88 (m, 1H), ≈2,2-2,5 (2m, 2H), 3,78–3,82 (m, 1H), 3,86–3,90 (m, 1H), 4,39 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 5,60 (bs, 1H, Pro-γ), 7,03 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,40 (bs, 1H), 7,58–7,62 (m, 1H), 7,87–7,91 (m, 1H), 8,00 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,99 (bs, 1H),
EMS (negativer Ionisationsmodus): m/z 625 (M – H)^–. Beispiel 30 Synthese der Verbindungen 214 und 218 (Tabelle 2)
A
Eine Lösung des Ketononenoatesters 16d (0,180 g, 0,6 mmol) in McOH/H₂O (5 ml/2 ml) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von LiOH·H₂O (50 mg, 1,2 mmol) gerührt. Die Lösung wurde mit 0,5 N eiskalter HCl auf den pH-Wert 6 angesäuert und ein Großteil des McOH wurde abgedampft. Sodann wurde der Rückstand in EtOAc (30 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 0,5 N eiskalter HCl (10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der rohe Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (10 ml) in Lösung gebracht und mit dem P1–P2-Fragment 30a (0,337 g, 0,6 mmol) in Gegenwart von HATU (233 mg, 0,612 mmol) und DIPEA (420 μl, 2,4 mmol) bei Raumtemperatur innerhalb von 16 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde der Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1/1) als Elutionsmittel unterzogen. Man erhielt die reine Verbindung 30b (0,370 g, Ausbeute 83%, Reinheit > 95% gemäß HPLC).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,41 (s, 9H), 1,45–1,54 (m, 1H), 1,58–1,62 (m, 1H), 1,73–1,77 (m, 1H), 1,86–1,91 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 17,8 & 8,6 Hz, 1H), 2,26–2,43 (2m, 2H), 2,46–2,58 (m, 2H), 2,64–2,81 (m, 1H), 2,85–2,92 & 2,95–3,03 (2m, 1H, Rotamere im Verhältnis 1 : 3), 3,67 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 4,10–4,18 (m, 1H), 4,20–4,30 (m, 1H), 4,40–4,55 (m, 1H), 4,80–4,88 (m, 1H), 4,92–5,10 (m, 2H), 5,14 (dd, J = 10,2 & 1,6 Hz, 1H), 5,24–5,38 (m, 4H), 5,42–5,54 (m, 1H), 5,68–5,86 (m, 2H), 7,04–7,14 (m, 2H, 7,42–7,64 (m, 5H), 7,92–8,12 (m, 3H).
B
Das Dien 30b (0,370 g, 0,49 mmol) wurde in Gegenwart des Bis-(tricyclohexylphosphin)-benzyliden-ruthenium IV-dichlorid-Katalysators (0,125 mg, 0,15 mmol) in CH₂Cl₂ (über CaH₂ destilliert und 30 Minuten mit Argon entgast) 2 Stunden unter Rückfluss cyclisiert. Die Verbindung wurde nach Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von EtOAc/Hexan (3/1) in Form eines Gemisches von Stereoisomeren (30c und 30d, Verhältnis 1 : 1) in einer Ausbeute von 35% (0,124 g) erhalten.
¹H-NMR des Gemisches 30c & 30d (CDCl₃, 400 MHz) δ 1,44 (s, 4H) & 1,37 (s, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,83 (m, 0,5H), 2,01 (m, 1H), 2,09 (m, 1N), 2,42 (m, 5H), 2,73 (m, 2H), 3,26 (m, 0,5H), 3,69 (s, 1,5H), 3,76 (s, 1,5H), 3,96 (s, 3H), 4,10 (m, 1H), 4,24 (m, 0,5H), 4,10 (m, 0,5H), 4,58 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,89 (m, 0,5H), 4,97 (m, 0,5H), 5,30 (m, 0,5H), 5,44 (m, 2H), 5,64 (m, 1H), 7,1–7,0 (m, 3H), 7,47 (m, 4H), 8,08–7,98 (m, 3H).
C, D
Die Hydrolyse der Methylester 30c und 30d (24 mg, 0,033 mmol) wurde in THF/MeOH/H₂O (1 ml/0,5 ml/0,5 ml) mit LiO·H₂O (11 mg, 0,246 mmol) 16 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf den pH-Wert 4–5 angesäuert und an einer Umkehrphasen-C18-HPLC-Säule unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von H₂O (0,06% TFA) bis 50% wässrigem CH₃CN (0,06% TFA) chromatographiert. Die angestrebten Verbindungen 214 und 218 wurden aus dem Gemisch der beiden Verbindungen in hoher Reinheit (94% rein gemäß HPLC) in einer Ausbeute von 15% (3 mg) isoliert.
Verbindung 214: ¹H-NMR (DMSO, 400 MHz) δ 1,15 (s, 9H), 1,48–1,54 (m, 2H), 1,65–1,74 (m, 1H), 1,77–1,85 (m, 1H), 2,12–2,25 (m, 4H), 2,27–2,34 (m, 1H), 2,61–2,68 (m, 1H), 2,87 (bt, J = 11,5 Hz, 1H), 3,92 (dd, J = 9,2 & 1,5 Hz, 1H, Pro-δ), 3,97 (s, 3H, -OCH₃), 4,14–4,20 (m, 1H), 4,52 (t, J = 7,8 Hz, 1H, Pro-α), 4,66 (d, J = 11,8 Hz, 1H, Pro-δ), 5,45 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 5,51–5,58 (m, 1H), 5,82 (bs, 1H, Pro-γ), 7,09 (d, J = 6,0 Hz, 1H, BocNH), 7,26 (bs, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,67 (bs, 3H), 8,16 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,83 (s, 1H, ACCA-NH).
Verbindung 218: ¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,06–1,10 (m, 1H), 1,18 (s, 9H), 1,52–1,55 (m, 1H), 1,62–1,80 (m, 1H), 2,10–2,68 (überlappend, 9H), 3,90 (bd, J = 8,3 Hz, 1H), 3,96 (s, 3H, OCH₃), 4,20–4,27 (m, 1H), 4,58–4,63 (m, 1H, Pro-δ), 4,66 (dd, J = 8,3 Hz, 1H, Pro-α) 4,88 (dd, J = 10,2 Hz, 1H), 5,18–5,26 (m, 1H), 5,73–5,79 (m, 1H, Pro-γ), 7,01 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,23 (bs, 1H), 7,50 (bs, 1H), 7,66 (bs, 3H), 8,20 (bs, 2H), 8,53 (s, 1H). Beispiel 31 Synthese der Verbindung 209 (Tabelle 2)
A
Das Dien 31a (249 mg, 0,330 mmol) wurde in 30 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gelöst und die Lösung wurde 15 Minuten mit Argon entgast. Der Katalysator Bis-(tricyclohexylphosphin)-benzyliden-ruthenium IV-dichlorid (82 mg, 0,100 mmol) wurde in 3 ml wasserfreiem und entgastem CN₂Cl₂ gelöst und zu der Dienlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden unter N₂ unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde die Lösung eingeengt und durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt. Man erhielt die Verbindung 31 b in Form eines braunen Feststoffes in einer Ausbeute von 71% (171 mg).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 1,22–1,44 (m, 10H), 1,42 (s, 9H), 1,66–1,74 (m, 1H), 1,87–1,97 (m, 2H), 2,13–2,28 (m, 3H), 2,32–2,39 (m, 1H), 3,08–3,16 (m, 1H), 3,41 (s, 3H), 4,07–4,22 (m, 3H), 4,28–4,34 (m, 1H), 4,58–4,64 (m, 1H), 4,95–4,99 (m, 1H), 5,22–5,29 (m, 2H), 5,38–5,43 (m, 1H), 5,48–5,56 (m, 1H), 7,00–7,12 (m, 3H), 7,43–7,55 (m, 4H), 7,97–8,11 (m, 3H).
ES(+)MS: m/z 727,4 (M + H)⁺.
B
Die Verbindung 31 b (0,117 mmol) wurde in einer Lösung von HCl (1 ml, 4H in Dioxan) 30 Minuten gerührt und sodann zur Trockne eingeengt. Der Feststoff wurde in CH₂Cl₂ (2 ml) aufgenommen und nacheinander mit Et₃N (82 μl, 0,585 mmol) und tert.-Butylisocyanat (35 mg, 0,351 mmol) versetzt. Nach 20-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Trockne eingeengt. Die rohe Verbindung 31c wurde ohne weitere Reinigung in der endgültigen Hydrolysestufe eingesetzt.
D
Die Verbindung 31c (85 mg, 0,117 mmol) wurde in THF/MeOH/H₂O (2 ml/1 ml/1 ml) gelöst und mit LiON·H₂O (39 mg, 0,936 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Essigsäure (1 ml) zugegeben. Die Lösung wurde zur Entfernung von McON und THF eingeengt.
Die reine Verbindung 209 wurde nach Reinigung des Rohprodukts durch Umkehrphasen-C18-HPLC isoliert (25 mg, Ausbeute ~31%).
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,04 (s, 9H), 1,15–1,24 (m, 2H), 1,30-1,40 (m, 5H), 1,44–1,51 (m, 2H), 1,54–1,68 (m, 1H), 1,75–1,88 (m, 1H), 2,18 (dd, J = 17,2 & 8,5 Hz, 1H), 2,32–2,45 (m, 1H, Pro-β), 2,54–2,62 (m, 1H), 2,65–2,68 (m, 1H, Pro-β), 3,91 (dd, J = 11,1 & 3,5 Hz, 1H, Pro-δ), 3,96 (s, 3H, -OCH₃), 4,17–4,23 (m, 1H), 4,47 (dd, J = 8,6, 1H, Pro-α), 4,67 (bd, J = 7,9 Hz, 1H, Pro-6), 5,30 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 5,52 (bdd, J = 19 & 8,3, 1H), 5,68 (s, 1H), 5,78 (bs, 1H, Pro-γ), 5,94 (bs, 1H), 7,21 (bs, 1H), 7,51 (bs, 1H), 7,66 (bs, 4H), 8,19 (s, 2H), 8,40 (d, J = 7 Hz, 1H), 8,61 (s, 1H, ACCA-NH).
ES(+)MS: m/z 698,3 (M + H)+. Beispiel 32 Synthese der Verbindungen #404 und #407 (Tabelle 4)
A
Das Dien 32a (84 mg, 0,11 mmol) wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (11 ml) gelöst. Die Lösung wurde innerhalb von 15 Minuten unter einem Argonstrom entgast. Der Bis-(tricyclohexylphosphin)-benzyliden-ruthenium IV-dichlorid-Katalysator (19 mg, 0,023 mmol) wurde zunächst in 1 ml entgastem CH₂Cl₂ gelöst und sodann über eine Kanüle in den Reaktionskolben übertragen. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 1) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die makrocyclische Verbindung 32b in Form eines gelben Öls (33 mg, Ausbeute 41%).
B
Das Ester-Zwischenprodukt 32b (33 mg, 0,045 mmol) wurde in einem Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (Verhältnis 2 : 1 : 1, 2 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit LiOH·H₂O (8 mg, 0,18 mmol) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 16 Stunden ergab die Analyse des Reaktionsgemisches durch HPLC, dass die Hydrolyse unvollständig war. Daher wurde eine weitere Menge an LiOH·H₂O (4 mg, 0,09 mmol) zugegeben und die Lösung wurde insgesamt 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich wurde die Lösung mit einer geringen Menge an Essigsäure angesäuert. Nach Entfernen der organischen Lösungsmittel unter Vakuum wurde das verbleibende Rohmaterial durch Umkehrphasen-C18-HPLC gereinigt. Man erhielt den reinen Inhibitor 404.
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Boc), 1,1–1,4 (3m, 3H), 1,66 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 2,10 (m, 2H), 2,57 (m, 2H), 3,90 (m, 4H), 4,47 (bd, J=12,7 Hz, 1H), 4,58 (bd, J=7,3, 1H), 4,66 (dd, J=8,0 Hz, 1H), 5,57 (m, 1H), 5,66 (m, 1H), 5,83 (bs, 1H), 6,18 (bd, J=6,9 Hz, 1H), 7,25 (bd, J=7,3 Hz, 1 H), 7,56 (bs, 1H), 7,70 (m, 4H), 8,22 (bd, J=2,9 Hz, 2H), 8,29 (bs, J=9,2 Hz, 1H).
C
Der Inhibitor 404 (15 mg, 0,021 mmol) wurde in Ethanol (2 ml) gelöst und mit Pd 10%/C (2 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Wasserstoff gerührt. Nach Filtration wurde das Gemisch durch Umkehrphasen-C18-HPLC gereinigt. Man erhielt den Inhibitor 407 in Form eines weißen Feststoffes (10 mg, 66 %).
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 1,04 (m, 1H), 1,17 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,35 (s, 9H), 1,25-1,75 (m, 12H), 2,32–2,45 (m, 1H), 3,40–3,50 (m, 2H), 3,74–3,83 (m, 1H), 3,85–3,93 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 4,27–4,36 (dd, J = 21,1 & 8,6 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 7,95 & 7,95 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,82 (br s, 1H), 7,27–7,33 (m, 1H), 7,53–7,57 (bs, 1H), 7,60–7,74 (m, 4H), 8,13–8,27 (m, 3H), 8,30–8,35 (br s, 1H). Beispiel 33 Synthese der Verbindung #824 (Tabelle 8)
A
Die Verbindung 33a (0,55 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde vorsichtig entgast, wonach eine Probe des Hoveyda-Katalysators (17 mg, 0,028 mmol, 0,05 Äq.) zugegeben wurde. Anschließend wurde die Lösung 5 Stunden unter Rückfluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von CH2Cl₂/EtOAc (Verhältnis von 3 : 2 bis 2 : 3) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 33b in einer Ausbeute von 72% (194 mg).
B
Eine Lösung der Verbindung 33b (70 mg, 0,142 mmol), 2-Ethoxy-4-hydroxy-7-methoxychinolin 3c (63 mg, 0,284 mmol, 2 Äq.) und Ph₃P (186 mg, 0,71 mmol, 5 Äq.) in wasserfreiem THF (15 ml) wurde bei 0°C langsam innerhalb von 20 Minuten mit DIAD (140 μl, 0,71 mmol, 5 Äq.) versetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte es 2,5 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das THF unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von Hexan/EtOAc (Verhältnis von 7 : 3 bis 1 : 1) gereinigt. Die reine Verbindung 33c wurde in einer Ausbeute von 73% (72 mg) isoliert.
C
Die Verbindung 33c (72 mg, 0,104 mmol) wurde mit CH₂Cl₂ (5 ml) und 4M HCl in Dioxan (5 ml) vermischt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um die Boc-Schutzgruppe abzuspalten. Man erhielt das HCl-Salz des Zwischenprodukts 33d. Das rohe Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft und unter Vakuum getrocknet, um zu gewährleisten, dass das gesamte HCl entfernt war. Das Produkt wurde ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
D
Eine Lösung von Cyclopentanol (29 μl, 0,32 mmol) in THF (10 ml) wurde tropfenweise mit einer Lösung von Phosgen in Toluol (1,93 M, 274 μl, 0,528 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das Chlorameisensäurecyclopentylester-Reagenz zu bilden. Anschließend wurde etwa die Hälfte des Lösungsmittels durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die verbleibende hellgelbe Lösung wurde durch Zugabe von CH₂Cl₂ (5 ml) verdünnt und erneut auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens eingeengt, um zu gewährleisten, dass das gesamte überschüssige Phosgen entfernt war. Die vorstehende Lösung des Chlorameisensäurecyclopentylester-Reagenz wurde ferner mit THF (10 ml) verdünnt, auf 0°C abgekühlt und bei 0°C zu der festen Verbindung 33d (0,104 mmol) gegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit Et₃N (75 μl, 0,534 mmol, 5,2 Äq.) versetzt und weitere 1,5 Stunden bei 0°C gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt. Das rohe Material wurde durch Fiash-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 1) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt die Verbindung 33e in fast quantitativer Ausbeute (75 mg).
E
Die Hydrolyse des Methylesters wurde durch Umsetzung der Verbindung 33e (75 mg, 0,11 mmol) mit LiOH·H₂O (35 mg, 0,84 mmol, 8 Äq.) in einem Lösungsmittelgemisch aus THF/MeOH/H₂O (Verhältnis 2 : 2 : 1, 7,5 ml) für 2,5 Stunden bei 50°C erreicht. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde das Gemisch auf den pH-Wert 4,5 angesäuert und die Lösungsmittel wurden unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch präparative Umkehrphasen-C18-HPLC unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von H₂O bis 58%igem wässrigem CH₃CN (mit 0,06 % TFA) gereinigt. Man erhielt den Inhibitor #824 in Form eines weißen amorphen Feststoffes (45 mg, Ausbeute 65%).
¹H-NMR des Na⁺-Salzes von #824 (DMSO, 400 MHz): δ 0,88 (d, J=6,7 Hz, 3H), 0,95–1,70 (überlappende Resonanzen, 17H), 1,37 (t, J=7 Hz, 3H), 2,00–2,10 (m, 1H), 2,10–2,33 (m, 3H), 2,38–2,44 (m, 1H), 3,80–3,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,02–4,08 (m, 1H), 4,42 (q, J=7 Hz, 2H), 4,35–4,44 (m, 1H), 4,50 (d, J=10,8 Hz, 1H), 4,63 (bs, 1H), 5,28 (dd, J=9,5 Hz, 1H), 5,38 (bs, 1H), 5,42–5,49 (m, 1H), 6,37 (s, 1H), 6,87 (dd, J-8,9 & 2,2 Hz, 1H), 7,07 (d, J=2,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J=7,0 Hz, 1H), 7,90 (d, J=8,9 Hz, 1H), 8,57 (s, 1H). Beispiel 34 Synthese der Verbindung #812 (Tabelle 8)
A
Eine Lösung des makrocyclischen Zwischenprodukts 23b (13,05 g, 27,2 mmol, 1,0 Äq.) von Ph₃P (14,28 g, 54,4 mmol, 2,0 Äq.) und von 2-Carboxymethoxy-4-hydroxy-7-methoxychinolin ( WO-00/09543 und WO-00/09558 ) (6,67 g, 28,6 mmol, 1,05 Äq.) in THF (450 ml) wurde innerhalb von 15 Minuten bei 0°C tropfenweise mit DIAD (10,75 ml, 54,6 mmol, 2,0 Äq.) versetzt. Sodann wurde das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach beendeter Umsetzung des Ausgangsmaterials zu Produkten wurde das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Das verbleibende Gemisch wurde mit EtOAc verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Die reine Verbindung 34a wurde nach Flash-Säulenchromatographie erhalten. Die Säule wurde zunächst mit Hexan/EtOAc (50 : 50) und anschließend mit CHCl₃/EtOAc (95 : 5) zur Entfernung von Ph₃PO und DIAD-Nebenprodukten eluiert. Die Elution der Verunreinigungen wurde durch TLC überwacht. Schließlich wurde das angestrebte Produkt 34a von der Säule mit CHCl₃/EtOAc (70 : 30) eluiert. Üblicherweise musste die Chromatographiestufe 2- bis 3-mal wiederholt werden, bevor die Verbindung 34a in hoher Reinheit in Form eines weißen Feststoffes in einer Gesamtausbeute von 68% (12,8 g, 99,5% rein gemäß HPLC) isoliert werden konnte.
B
Eine Lösung des Boc-geschützten Zwischenprodukts 34a (1,567g) in CH₂Cl₂ (15 ml) wurde mit 4 N HCl in Dioxan (12 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. (Für den Fall, dass nach Ablauf der Hälfte der Reaktionsdauer ein dickes Gel entstand, wurden weitere 10 ml CH₂Cl₂ zugesetzt.) Nach Beendigung der Schutzgruppenentfernung wurden die Lösungsmittel zur Trockne abgedampft. Man erhielt einen gelben Feststoff und ein pastenartiges Material. Das Gemisch wurde in etwa 5% McOH in CH₂Cl₂ in Lösung gebracht und erneut unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt die Verbindung 34b in Form eines gelben Feststoffes, der ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
C
Eine Lösung von Cyclopentanol (614 μl, 6,76 mmol) in THF (15 ml) wurde tropfenweise mit einer Lösung von Phosgen in Toluol (1,93 M, 5,96 ml, 11,502 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Bildung des Chlorameisensäurecyclopentyl-Reagenz (z) gerührt. Anschließend wurde etwa die Hälfte des Lösungsmittels durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die verbleibende hellgelbe Lösung wurde durch Zugabe von CH₂Cl₂ (5 ml) verdünnt und auf die Hälfte ihre ursprünglichen Volumens eingeengt, um zu gewährleisten, dass das gesamte überschüssige Phosgen entfernt wurde. Die vorstehende Lösung des Chlorameisensäurecyclopentylester-Reagenz wurde ferner mit THF (15 ml) verdünnt und zum Amin-2HCl-Salz 34b gegeben. Das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Et₃N (tropfenweise) auf ~8,5–9 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit EtOAc verdünnt und mit Wasser (1×), gesättigter NaHCO₃-Lösung (2×), H₂O (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄, getrocknet, filtriert und unter Vakuum unter Bildung eines gelb-bernsteinfarbenen Schaums eingedampft. Die Verbindung 34c wurde nach Reinigung durch Flash-Säulenchromatographie (unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 30% Hexan bis 20 % Hexan in EtOAc als Elutionsmittel) in Form eines weißen Schaums in einer Ausbeute von 80% (1,27 g) und in einer Reinheit von > 93% erhalten.
D
Der Dimethylester 34c (1,17 g) wurde in einem Gemisch aus THF/MeOH/H₂O (20 ml, Verhältnis 2 : 1 : 1) gelöst. Eine wässrige Lösung von NaOH (1,8 ml, 1 N, 1 Äq.) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockne eingedampft. Man erhielt das Natriumsalz 34d in Form eines weißen Feststoffes (1,66 mmol). Die Verbindung 34d wurde ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
E
Das rohe Natriumsalz 34d (1,66 mmol) wurde in THF (17 ml) gelöst und mit Et₃N versetzt. Das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Chlorameisensäureisobutylester (322 μl, 2,5 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und das Gemisch wurde 75 Minuten bei 0°C gerührt. Anschließend wurde Diazomethan (15 ml) zugegeben. Der Rührvorgang wurde 30 Minuten bei 0°C und sodann 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der Großteil des Lösungsmittels wurde unter Vakuum zur Trockne abgedampft. Das verbleibende Gemisch wurde mit EtOAc verdünnt, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (2 ×), H₂O (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhielt die Verbindung 34e in Form eines hellgelben Schaums (1,2 g, 1,66 mmol). Das Diazoketon-Zwischenprodukt 34e wurde ohne Reinigung in der nächsten Stufe verwendet.
F
Das Diazoketon 34e (1,2 g, 1,66 mmol) wurde in Lösung in THF (17 ml) in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Eine Lösung von wässrigem HBr (48%, 1,24 ml) wurde zugetropft und das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit EtOAc verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (2×), H₂O (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft.
Man erhielt das β-Bromketon-Zwischenprodukt 34f in Form eines hellgelben Schaums (1,657 mmol).
G
Eine Lösung des Bromketons 34f (600 mg, 0,779 mmol) in Isopropanol (5 ml) wurde mit Thioharnstoff (118 mg, 1,55 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in ein auf 75°C vorgeheiztes Ölbad gestellt und darin 1 Stunde gerührt. Sodann wurde das Isopropanol unter Vakuum entfernt. Das Produkt wurde in EtOAc (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhielt das Rohprodukt 34g (522 mg) in Form eines rotbraunen Feststoffes. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung in der letzten Stufe eingesetzt.
H
Der rohe Methylester 34g (122 mg, 0,163 mmol) wurde in einer Lösung von THF/MeOH/H₂O (Verhältnis 2 : 1 : 1,4 ml) gelöst und unter Verwendung von LiOH·H₂O (89 mg, 2,14 mmol) verseift. Die Hydrolysereaktion wurde 12 bis 15 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend wurden die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Umkehrphasen-C18-HPLC unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 10% CH₃CN in H₂O bis 100% CH₃CN gereinigt. Man erhielt den HCV-Proteaseinhibitor #812 in Form eines gelben Feststoffes (24 mg, 20 % Gesamtausbeute für die Umwandlung des Zwischenprodukts 34f in den Inhibitor #812).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,63 (s, 1H), 8,26–8,15 (m, 2H), 7,79 (bs, 1H), 7,72 (bs, 1H), 7,50 (bs, 2H), 7,33–7,25 (m, 2H), 5,77 (bs, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,39–4,31 (m, 1H), 4,08–3,99 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,87 (d, J = 9,5 Hz, 2H), 2,65–2,53 (m, 2H), 2,46–2,36 (m, 2H), 2,20–2,12 (dd, J = 8,6 Hz, 1H), 1,80–1,64 (m, 2H), 1,63–1,06 (m, 14H).
MS; es⁺: 733,2 (M + H)⁺, es^–: 731,2 (M – H)^–.
Beispiel 34A
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 34, jedoch durch Umsetzung von Bromketon 34f mit handelsüblichem N-Methylthioharnstoff erhielt man die Verbindung # 811 (Tabelle 8)
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,63 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,12–7,93 (m, 1H) , 7,88–7,69 (m , 2H), 7,32–7,24 (m, 2H), 5,82–5,75 (m, 1H), 5,52 (ddd, J= 8,1 Hz, 1H), 5,28 (dd, J= 9,9 Hz, 1H), 4,67–4,61 (m, 1H), 4,51 (dd , J= 8,8 Hz, 1H), 4,44–4,37 (m, 1H), 4,08–4,00 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,04 (d, J= 4,1 Hz, 3H), 2,65–2,37 (m, 3H), 2,16 (m, 1H), 1,77–1,65 (m, 2H), 1,63–1,11 (m, 17H).
MS; es⁺: 747,2 (M + H)⁺, es^–: 745,3 (M – H)^–.
Beispiel 34B
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 34, jedoch unter Umsetzung des Bromketons 34f mit handelsüblichem N-Ethylthioharnstoff erhielt man die Verbindung #810 Tabelle 8).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,63 (s, 1H), 8,27 (bs, 1H), 8,20 (d, J= 9,0 Hz, 1H), 8,13–8,07 (m, 1H), 7,86 (bs, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,33–7,25 (m, 2H), 5,81 (bs, 1H), 5,54 (dd, J= 8,8 Hz, 1H), 5,28 (dd, J= 9,7 Hz, 1H), 4,65 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,51 (dd, J= 8,8 Hz, 1H), 4,38 (bs, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92–3,87 (m, 1H), 3,54–3,46 (m, 2H), 2,68–2,65 (m, 2H), 2,47–2,38 (m, 1H), 2,15 (dd, J= 8,6 Hz, 1H), 1,78–1,65 (m, 2H), 1,60–1,12 (m, 17H), 1,25 (t, J= 7,3 Hz, 3H).
MS; es⁺: 783,2 (M + Na)⁺, es^–: 761,2 (M + H)⁺.
Beispiel 34C
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 34, jedoch unter Umsetzung des Bromketons 34f mit handelsüblichem N-Isopropylthioharnstoff erhielt man die Verbindung # 822.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,63 (s, 1H), 8,33–8,23 (bs, 1H), 8,21 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (bs, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,35–7,23 (m, 2H), 5,81 (bs, 1H), 5,52 (dd, J = 8,5 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 7,6 Hz, 1H), 4,37 (bs, 1H), 4,15 (bs, 1H), 4,07–3,98 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,88 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 2,60–2,53 (m, 2H), 2,47–2,37 (m, 2H), 2,19–2,10 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 1,80–1,64 (m, 2H), 1,63–1,29 (m, 13H), 1,27 and 1,25 (2 × d, J = 6,5 Hz, 6H), 1,23–1,09 (m, 2H).
MS; es⁺: 775,0 (M + H)⁺, es^–: 772,9 (M – H)^–.
Beispiel 34D
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 34, jedoch unter Umsetzung des Bromketons 34f mit handelsüblichem N-Acetylthioharnstoff erhielt man die Verbindung # 809.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,62 (s, 1H), 8,30 (bs, 1H), 8,17 (d, J= 8,9 Hz, 1H), 7,62 (bs , 1H) , 7,52 (bs , 1H), 7,28 (d, J= 6,4 Hz, 1H), 7,21 (bs, 1H), 5,63 (bs, 1H), 5,54 (dd, J= 8,1 Hz, 1H), 5,28 (dd, J= 9,5 Hz, 1H), 4,62 (d, J= 12,1 Hz, 1H), 4,56–4,46 (m , 2H), 4,11–4,04 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,93–3,88 (m, 1H), 2,62–2,54 (m, 1H), 2,45–2,36 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,21–2,13 (m, 1H), 1,79–1,69 (m, 2H), 1,65–1,30 (m, 16H), 26-1,12 (m, 2H).
MS; es+: 775,3 (M + H)+, es^–: 773,3 (M – H)^–.
Beispiel 34E
Eine gerührte Lösung des 2-Amino-4-thiazolyl-Zwischenprodukts 34g (0,24 g, 0,32 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde bei Raumtemperatur mit DIPEA (0,55 ml, 3,18 mmol, 10 Äq.) und Chlorameisensäuremethylester (0,13 ml, 1,6 mmol, 5 Äq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6,5 Stunden gerührt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Das rohe isolierte Material wurde sodann gemäß Beispiel 34 zu der angestrebten Carbonsäure hydrolysiert. Man erhielt die Verbindung #818.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,61 (s, 1H), 8,21–8,07 (m, 2H), 7,61–7,38 (m, 2H), 7,26 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,19–7,10 (m, 1H), 5,60–5,47 (m, 2H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,63–4,53 (m, 1H), 4,47 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,13–4,04 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92–3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,42–2,30 (m, 2H), 2,17 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 1,81–1,68 (m, 2H), 1,63–1,29 (m, 16H), 1,23–1,10 (m, 2H).
MS; es⁺: 791,1 (M + H)⁺, es^–: 789,1 (M – H)^–.
Beispiel 34F
Es wurden die im vorstehenden Beispiel 34E beschriebenen Bedingungen eingehalten, wobei aber Chlorameisensäureisobutylester verwendet wurde. Man erhielt das analog substituierte Carbamat-Zwischenprodukt. Das rohe isolierte Material wurde sodann zu der angestrebten Verbindung #$19 hydrolysiert.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,62 (s, 1H), 8,47–8,27 (bs, 1H), 8,18 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,69–7,60 (m, 1H), 7,60–7,51 (m, 1H), 7,28 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,28–7,19 (m, 1H), 5,70–5,60 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,8 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,53–4,44 (m, 2H), 4,10–3,99 (m, 1H), 4,04 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,94–3,87 (m, 1H), 2,65–2,53 (m, 1H), 2,46–2,34 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 8,1 Hz, 1H), 2,03–1,91 (m, 1H), 1,79–1,09 (m, 20H), 0,95 (d, J = 6,7 Hz, 6H).
MS; es⁺: 833,2 (M + H)⁺, es^-: 831,2 (M – H)^–.
Beispiel 35
Synthese der Verbindung #90$
Ausgehend vom Derivat 27a und unter Anwendung der in Beispiel 34 beschriebenen chemischen Reaktionen wurde die nachstehend angegebene gesättigte makrocyclische Verbindung #908 (Tabelle 9) erhalten.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,47 (s, 1H), 8,16 (d, J = 10 Hz, 1H), 8,15–8,07 (m, 1H), 7,82–7,63 (m, 2H), 7,53–7,43 (m, 2H), 7,33–7,22 (m, 1H), 7,13 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,77–5,65 (m, 1H), 4,62–4,52 (m, 2H), 4,50–4,4 (m, 1H), 4,20–4,10 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,89–3,83 (m, 1H), 2,59–2,53 (m, 1H), 2,48–2,40 (m, 1H), 1,79–1,0 (m, 25H);).
MS; es⁺: 735,2 (M + H)⁺, es^–: 733,2 (M – N)^–.
Beispiel 35A
Synthese der Verbindung #909
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 35, jedoch unter Verwendung von handelsüblichem N-Acetyλthioharnstoff erhielt man die Verbindung
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,53–8,41 (m, 2H), 8,20 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,68 (bs , 1H) , 7,68 (bs , 1H), 7,27 (dd, J= 9,2 Hz, 1H), 7,15 (d, J= 6,4 Hz, 1H), 5,67 (bs, 1H), 4,65–4,50 (m, 3H), 4,44–4,37 (m, 1H), 4,21–4,13 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,99–3,86 (m, 1H), 2,62–2,39 (m, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,78–1,67 (m, 3H), 1,67–1,01 (m, 22H).
MS; es⁺: 798,0 (M + Na)⁺, es^–: 777,0 (M + H)⁺.
Beispiel 35B
Synthese der Verbindung #910
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 35, jedoch unter Verwendung von handelsüblichem N-Ethylthioharnstoff erhielt man die Verbindung # 910 (Tabelle 9).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,47 (s, 1H), 8,29 (bs, 1H), 8,20 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09 (bs, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,32 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,14 (dd, J = 6,7 Hz, 1H), 5,78 (bs, 1H), 4,58 (dd, J = 8,1 Hz, 2H), 4,43 (bs, 1H), 4,18–4,12 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,55–3,46 (m, 2H), 2,63–2,53 (m, 1H), 2,47–2,41 (m, 1H), 1,78–1,00 (m, 25H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H), ). MS; es⁺: 763,1 (M + H)⁺, es^–: 761,1 (M – H)^–.
Beispiel 35C
Synthese der Verbindung #911
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 35, jedoch unter Verwendung von handelsüblichem N-Isopropylthioharnstoff erhielt man die Verbindung # 911 (Tabelle 9).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,47 (s, 1H), 8,29–8,19 (m, 1H), 8,19 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09–8,0 (m, 1H), 7,83 (bs, 1H), 7,74 (bs, 1H), 7,31 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,76 (bs, 1H), 4,64–4,53 (m, 2H), 4,44 (bs, 1H), 4,22–4,09 (m, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 2,63–2,58 (m, 1H), 2,46–2,41 (m, 1H), 1,79–1,10 (m, 24H), 1,27 and 1,26 (2 × d, J = 6,5 Hz, 6H).
MS; es⁺: 777,0 (M + H)⁺, es^–: 775,0 (M – H)^–. Beispiel 36 Synthese der Verbindung #716
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,13 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,64–7,54 (m, 2H), 7,47 (d, J=2,6 Hz, 1H), 7,16 (dd, J=9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,03 (d, J=6,0 Hz, 1H), 5,63 (s, 1H), 5,52 (q, J=9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J=8,9 Hz, 1H),4,62 (d, J=11,45, 1H), 4,45 (dd, J=9,2, 8,27 Hz, 1H),4,02 (m, 1H) 3,93 (s, 3H), 3,7 (dd, J=7,6, 1,0 Hz, 1H), 2,66 (s, 3H), 2,55–2,65 (m, 1H), 2,35–2,45 (m, 1H), 2,17 (q, J=8,6 Hz, 1H), 1,65–1,75 (m, 2H), 1,5–1,35 (m, 7H), 1,15 (s, 9H).
MS : 705, (M + 1), 703 (M – 1) Beispiel 37 Synthese der Verbindung #717
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,15 (d, J=8,9 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (dd, J=9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J=5,4 Hz, 1H), 5,64 (s, 1H), 5,52 (q, J=9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J=9,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J=11,44, 1H), 4,45 (t, J=9,2 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,9–3,8 (m, 1H),2,7-2,55 (m, 1H), 2,4–2,3 (m, 1H), 2,18 (q, J=8,9 Hz, 1H), 1,75–1,65 (m, 2H), 1,5–1,2 (m, 7H), 1,14 (s, 9H).
MS : 705, (M + 1), 703 (M – 1). Beispiel 38 Synthese der Verbindung #718
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 9,55 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,32 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,10–7,07 (m, 2H), 5,64–5,54 (m, 1H), 5,59–5,48 (m, 1H), 5,33–5,23 (m, 1H), 4,73–4,61 (m, 1H), 4,45 (dd, J = 7,5, 9,1 Hz, 1H), 4,09–4,00 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,93–3,83 (m, 1H), 2,67–2,55 (m, 2H), 2,53–2,43 (m, 1H), 2,42–2,31 (m, 1H), 2,23–2,12 (m, 1H), 1,81–1,66 (m, 2H), 1,52–1,42 (m, 2H), 1,42–1,25 (m, 6H), 1,21 (s, 9H).
MS: 689,3 (M + 1), 687,3 (M – 1) Beispiel 39 Synthese der Verbindung #722
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 9,70 (s, 1H), 8,64 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,14 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,30 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,14–7,06 (m, 2H), 5,60–5,54 (m, 1H), 5,58–5,48 (m, 1H), 5,31–5,23 (m, 1H), 4,71–4,62 (m, 1H), 4,49–4,40 (m, 1H), 4,08–3,99 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,92–3,84 (m, 1H), 2,69–2,54 (m, 2H), 2,53–2,46 (m, 1H), 2,42–2,31 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,22–2,13 (m, 1H), 1,81–1,64 (m, 2H), 1,54–1,42 (m, 2H), 1,42–1,27 (m, 6H), 1,22 (s, 9H).
MS: 703,3 (M + 1), 701,3 (M – 1) Beispiel 40 Synthese der Verbindung #733
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,75 (m, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,06 ( , J=9,2 Hz, 1H), 7,88–7,87 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,28 (d, J=2,6 Hz, 1H), 7,05–7,00 (m, 2H), 6,64–6,63 (m, 1H), 5,62–5,58 (m, 1H), 5,55–5,49 (m, 1H), 5,28–5,24 (m, 1H), 4,64–4,61 (m, 1H), 4,48–4,44 (m, 1H), 4,07–4,03 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,92–3,85 (m, 1H), 2,67–2,54 (m, 2H),2,53–2,45 (m, 1H), 2,41–2,34 (m, 1H), 2,20–2,14 (m, 1H), 1,75–1,69 (m, 2H), 1,50–1,43 (m, 2H), 1,41–1,32 (m, 6H), 1,17 (s, 9H).
MS : 689,3 (M + 1), 687,2 (M – 1). Beispiel 41 Synthese der Verbindung # 703
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,50 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 8,11–8,00 (m, 1H), 7,88–7,77 (m, 1H), 7,73 (s, 1 H), 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,89–5,68 (m, 1H), 4,62 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,53 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,16–4,07 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,88 (bd, J = 9,5 Hz, 1H), 3,53–3,43 (m, 2H), 2,63–2,51 (m, 1H), 2,46–2,36 (m, 1H), 1,81–1,62 (m, 2H), 1,60–1,01 (m, 15H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H).
MS; es⁺: 751,1(M + H)⁺, es^–: 749,1- (M – H)-. Beispiel 42 Synthese der Verbindung #734
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,04 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (d, J=2,6 Hz, 1H), 7,05–6,98 (m, 2H), 5,57–5,54 (m, 1H), 5,55–5,48 (m, 1H), 5,28–5,24 (m, 1H), 4,63–4,59 (m, 1H), 4,47–4,43 (m, 1H), 4,13–3,99 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,92–3,83 (m, 1H), 2,67–2,55 (m, 2H), 2,53–2,46 (m, 1H), 2,43–2,31 (m, 1H), 2,22–2,15 (m, 1H), 2,15 (3H), 1,75–1,70 (m, 2H), 1,51–1,42 (m, 2H), 1,41–1,28 (m, 6H), 1,17 (s, 9H).
MS : 703,2 (M + 1), 701, 3 (M – 1) Beispiel 43 Synthese der Verbindung #738
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,64 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,24 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,99 (dd, J = 2,2, 9,2 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,62–5,57 (m, 1H), 5,56–5,47 (m, 1H), 5,31–5,22 (m, 1H), 4,65–4,56 (m, 1H), 4,45 (dd, J = 7,6, 8,9 Hz, 1H), 4,07–4,00 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,88–3,84 (m, 1H), 2,68–2,56 (m, 2H), 2,54–2,43 (m, 1H), 2,42–2,31 (m, 1H), 2,34 (s, 3H), 2,24–2,14 (m, 1H), 1,80–1,64 (m, 2H), 1,52–1,43 (m, 2H), 1,43–1,27 (m, 6H), 1,18 (s, 9H).
MS: 703,2 (M + 1), 701,2 (M – 1) Beispiel 44 Synthese der Verbindung #725
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,10 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,35 (d, J=2,2 Hz, 1H), 7,09–7,03 (m, 2H), 5,65–5,61 (m, 1H), 5,55–5,49 (m, 1H), 5,28–5,24 (m, 1H), 4,62–4,57 (m, 1H), 4,49–4,45 (m, 1H), 4,08–4,01 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92–3,86 (m, 1H), 3,20–3,14 (m, 1H), 2,65–2,56 (s, 1H), 2,53–2,47 (m, 1H) 2,42–2,35 (m, 1H), 2,22–2,15 (m, 1H), 1,79–1,68 (m, 2H), 1,50–1,43 (m, 2H), 1,41–1,28 (m, 12H), 1,18 (s, 9H).
MS : 748,2 (M + 1), 746,2 (M – 1) Beispiel 45 Synthese der Verbindung #726
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,64 (s, 1H), 8,10 (d, J=9,5 Hz, 1H), 7,83–7,76 (m, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,44–7,42 (m, 1H), 7,18–7,01 (m, 2H), 5,56–5,49 (m, 2H), 5,29–5,24 (m, 1H), 4,66–4,63 (m, 1H), 4,47–4,42 (m, 1H), 4,28 (s, 3H), 4,06–4,02 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,93–3,86 (m, 1H), 2,66–2,55 (m, 2H), 2,42–2,31 (m, 2H), 2,22–2,14 (m, 1H), 1,79–1,65 (m, 2H), 1,52–1,27 (m, 7H), 1,22 (s, 9H).
MS : 703,2 (M + 1), 701,3 (M – 1) Beispiel 46 Synthese der Verbindung #906
¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,46 (s, 1H), 8,06 (d, J=9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,34 (m, 1H), 7,14–7,05 (m, 2H), 5,63–5,58 (m, 1H), 4,66–4,61 (m, 1H), 4,54–4,44 (m, 2H), 4,23–4,18 (m, 1H) 3,93 (s, 3H), 3,92–3,88 (m, 1H), 3,21–3,14 (m, 1H), 2,44–2,33 (m, 1H), 1,35 (d, J=7 Hz, 6H), 1,73–1,01 (m, 26H).
MS : 762,0 (M + 1), 759,9 (M – 1) Beispiel 47 Synthese der Verbindung #907
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 8,46 (s, 1H), 7,98 (d, J=8,9 Hz, 1H), 7,91–7,89 (m, 2H), 7,23–7,21 (m, 2H), 7,07–7,00 (m, 2H), 6,35–6,32 (m, 2H), 564–5,58
(m, 1H), 4,65–4,61 (m, 1H), 4,53–4,47 (m, 2H), 4,24–4,19 (m, 1H) 3,90 (s, 3H), 3,86–3,84 (m, 1H), 2,40–2,33 (m, 1H), 1,73–1,01 (m, 26H).
MS : 702,0 (M + 1), 699,9 (M – 1)
Beispiel 48
Fluorogener Test auf das heterodimere NS3-NS4A-Protein von voller Länge
Die NS2-NS5B-3'-Nichtcodierungsregion wurde durch RT-PCR in den pCR^®3-Vektor (Invitrogen) unter Verwendung von RNA, die aus dem Serum einer mit HCV-Genotyp 1 b infizierten Person (bereitgestellt von Dr. Bernard Willems, Hôpital St-Luc, Montreal, Quebec, Kanada) extrahiert worden war, kloniert. Die NS3-NS4A-Region (NS3-NS4AFL) wurde sodann durch PCR in den pFastBac^R HTa-Baculovirus-Expressionsvektor (Gibco/BRL) subkloniert. Die Vektorsequenz umfasst eine Region, die für eine N-terminale Sequenz mit 28 Resten, die eine Hexahistidin-Markierung enthält, kodiert. Das Bac-to-Bac^®-Baculovirus-Expressionssystem (Gibco/BRL) wurde zur Herstellung des rekombinanten Baculovirus verwendet. His-NS3-NS4AFL wurde durch Infektion von 106 Sf21-Zellen/ml mit dem rekombinanten Baculovirus in einer Infektionsmultiplizität von 0,1–0,2 bei 27°C exprimiert. Eine authentische Autoproteolyse erfolgte während der Expression unter Bildung eines nicht-kovalenten und stabilen NS3-NS4A-Proteinkomplexes (nachstehend als volle Länge "FL" bezeichnet). Die infizierte Kultur wurde 48 bis 64 Stunden später durch Zentrifugation bei 4°C geerntet. Das Zellpellet wurde in 50 mM NaPO₄, pH-Wert 7,5, 40 Glycerin (Gew./Vol.) und 2 mM β-Mercaptoethanol in Gegenwart eines Cocktails von Protease-Inhibitoren homogenisiert. His-NS3-NS4AFL wurde sodann aus dem Zelllysat mit 1,5% NP-40, 0,5 % Triton X-100, 0,5 M NaCl und eine DNase-Behandlung extrahiert. Nach Ultrazentrifugation wurde der lösliche Extrakt 4-fach verdünnt und an eine Pharmacia Hi-Trap-Ni-Chelatbildungssäule gebunden. Das His-NS3-NS4AFL wurde in einer Form mit einer Reinheit von > 90% (festgestellt durch SDS-PAGE) unter Verwendung eines 50 bis 400 mM Imidazolgradienten eluiert. Das His-NS3-NS4AFL wurde bei –80°C in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% (Gew./Vol.) Glycerin, 0,5 M NaCl, 0,25 M Imidazol, 0,1% NP-40 gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wurde es auf Eis aufgetaut und verdünnt.
Die Protease-Aktivität von His-NS3-NS4AFL wurde in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,25 M Natriumcitrat, 0,01 % (Gew./Vol.) n-Dodecyl-β-D-maltosid und 1 mM TCEP bestimmt. 5 μM des intern gequenchten Substrats Anthranilyl-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO₂)TW-OH in Gegenwart von verschiedenen Inhibitorkonzentrationen wurden mit 1,5 nM His-NS3-NS4AFL 45 Minuten bei 23°C inkubiert. Die endgültige DMSO-Konzentration überstieg 5,25 % nicht. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1 M MES, pH-Wert 5,8, beendet. Die Fluoreszenz des N-terminalen Produkts wurde mit einem Perkin-Elmer LS-50B- Fluorimeter, der mit einem Lesegerät für Platten mit 96 Vertiefungen ausgerüstet war, überwacht (Anregungswellenlänge 325 nm; Emissionswellenlänge 423 nm).
Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: 100 – [(Fluo_inh-Fluo_Leerwert)/(Fluo_Kontrolle-fluo_Leerwert) × 100].
Eine nicht-lineare Kurvenanpassung nach dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrations-Daten angewandt. Die 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung von SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc, Cary, N.C.) berechnet.
Beispiel 49
Radiometrischer Test auf rekombinante HCV-NS3-Protease
Das für den radiometrischen Test auf HCV-NS3-Protease verwendete Substrat, nämlich DDIVPC-SMSYTW, wird durch das Enzym zwischen dem Cystein- und dem Serinrest gespalten. Die Sequenz DDIVPC-SMSYTW entspricht der natürlichen Spaltungsstelle von NS5A/NS5B, bei der der Cysteinrest in P2 durch Prolin ersetzt ist. Das Peptidsubstrat DDIVPC-SMSYTW und der Tracer Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵l- Y]TW wurden mit der rekombinanten NS3-Protease in Abwesenheit oder in Gegenwart von Inhibitoren inkubiert. Die Abtrennung des Substrats von den Produkten wurde durch Zugabe von mit Avidin beschichteten Agaroseperlen zum Testgemisch und anschließende Filtration durchgeführt. Die Menge an SMS[¹²⁵l- Y]TW-Produkt im Filtrat (mit oder ohne Inhibitor), die festgestellt wurde, ermöglichte die Berechnung des prozentualen Anteils der Substratumwandlung und des prozentualen Hemmgrads.
A. Reagenzien
Tris- und Tris-HCl (Ultrarein) wurden von der Fa. Life Technologies bezogen. Glycerin (Ultrarein), MES und BSA wurden von der Fa. Sigma^R bezogen. TCEP wurde von der Fa. Pierce, DMSO von der Fa. Aldrich^R und NaOH von der Fa. Anachemia^R bezogen.
Testpuffer: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 30% (Gew./Vol.) Glycerin, 2% (Gew./Vol.) CHAPS, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (TCEP wurde unmittelbar vor der Verwendung aus einer 1 M Vorratslösung in Wasser zugegeben).
Substrat: DDIVPC-SMSYTW, Endkonzentration 25 μM (aus einer 2 mM Vorratslösung in DMSO, die zur Vermeidung von Oxidation bei –20°C aufbewahrt wurde).
Tracer: Reduziertes, monojodiertes Substrat (Biotip-DDIVPC-SMS[¹²⁵l-Y]TW) (≈1 nM Endkonzentration).
HCV-NS3 Protease Typ 1 b, Endkonzentration 25 nM (aus einer Vorratslösung in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP-40).
B. Verfahren
Der Test wurde an einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die einzelnen Vertiefungen enthielten folgende Bestandteile:
20 μl Substrat/Tracer im Testpuffer;
10 μl ± Inhibitor in 20% DMSO/Testpuffer;
10 μl NS3-Protease 1 b.
Leerwert (kein Inhibitor und kein Enzym) und Kontrolle (kein Inhibitor) wurden ebenfalls auf der gleichen Testplatte zubereitet.
Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe der Enzymlösung eingeleitet und das Testgemisch wurde 60 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert. 20 μl 0,025 N NaOH wurden zum Stoppen der enzymatischen Reaktion zugesetzt.
20 μl mit Avidin beschichtete Agaroseperlen (bezogen von der Fa. Pierce^R) wurden in einer Millipore^R-MADP-N65-Filtrationsplatte zugegeben. Das gestoppte Testgemisch wurde auf die Filtrationsplatte übertragen und unter mäßigem Bewegen bei 23°C 60 Minuten inkubiert.
Die Platten wurden unter Verwendung einer Millipore^R-MuItiScreen-Vacuum-Manifold-Filtrationsvorrichtung filtriert. 40 μl des Filtrats wurden auf eine undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Gehalt an 60 μl Szintillationsflüssigkeit pro Vertiefung übertragen.
Die Filtrate wurden mit einem Packard^R-TopCount-Gerät unter Anwendung eines ¹²⁵l-Flüssigverfahrens 1 Minute ausgezählt.
Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: 100-[(Zählereignisseinh-ZählereignisseLeerwert)/ (ZählereignisseKontrolle ZählereignisseLeerwert)×100]
Eine nicht-lineare Kurvenanpassung mit dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrations-Daten angewandt. Die 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Can, N.C.) berechnet.
Beispiel 50
Spezifitätstests
Die Spezifität der Verbindungen wurden gegen eine Vielzahl von Serinproteasen bestimmt: humane Leukozyten-elastase, Schweinepankreas-elastase und Rinderpankreas-α-chymotrypsin, und eine Cystein-Protease: humanes Lebercathepsin B. In sämtlichen Fällen wurde ein Verfahren mit einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines chromogenen Substrats, das für jedes Enzym spezifisch war; herangezogen. Die einzelnen Tests umfassten eine 1-stündige Vorinkubation von Enzym-Inhibitor bei Raumtemperatur unter anschließender Zugabe von Substrat und anschließender Hydrolyse zu einer ≈30%igen Umwandlung, gemessen an einem UV-Thermomax^R-Mikroplattenlesegerät oder einem Fluoreszenz- Perkin-ElmerR-LS50B-Plattenlesegeräts. Die Substrat-Konzentrationen wurden im Vergleich zum K_M-Wert möglichst gering gehalten, um eine Substratkonkurrenz zu verringern. Die Konzentrationen der Verbindungen variierten von 300 bis 0,06 μM, je nach ihrer Wirkungsstärke.
Für die einzelnen Tests wurden die folgenden Endkonzentrationen herangezogen:
50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 für:
[100 μM Succ-AAPF-pNA und 250 pM α-Chymotrypsin), [133 μM Succ-AAApNA und 8 nM Schweine-elastase], [133 μM Succ-AAV-pNA und 8 nM Leukozytenelastase]; oder
[100 mM NaHPO₄, pH-Wert 6, 1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 0,01% Tween-20, 4 μM Z-FR-AMC (7-Amino-4-methylcumarin) und 0,5 nM Cathepsin B (das Vorratsenzym wurde in Puffer mit einem Gehalt an 20 mM TCEP vor der Verwendung aktiviert)].
Nachstehend ist ein repräsentatives Beispiel für Schweinepankreas-elastase zusammengefasst:
In einer Polystyrolplatte mit 96 flachbödigen Vertiefungen (Cellwells, Corning) wurden unter Verwendung eines Biomek-Flüssigkeitshandhabungsgeräts (Beckman) folgende Bestandteile vorgelegt:
40 μl Testpuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 1 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA); 20 μl Enzymlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 40 nM Schweinepankreas-elastase); und
20 μl Inhibitorlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 1,5 mM-0,3 μM Inhibitor, 15 % (Vol./Vol.) DMSO).
Nach einer 60-minütigen Vorinkubation bei Raumtemperatur wurden 20 μl Substratlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 μM Succ-AAA-pNA) in jede Vertiefung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ferner 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Absorption am UV-Thermomax^R-Plattenlesegerät abgelesen wurde. Reihen von Vertiefungen wurden für Kontrollen (ohne Inhibitor) und für Leerwerte (ohne Inhibitor und ohne Enzym) vorgesehen.
Zweifach Reihenverdünnungen der Inhibitorlösung wurden auf einer getrennten Platte mit dem Flüssigkeitshandhabungsgerät unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 15% (Vol./Vol.) DMSO, vorgenommen. Sämtliche übrigen Spezifitätstests wurden auf ähnliche Weise durchgeführt.
Die prozentuale Hemmung wurde unter Anwendung, der folgenden Formel berechnet: [1-((UVinh-UVLeerwert)/(UVKontrolle-UVLeerwert))] × 100
Eine nicht-lineare Kurvenanpassung mit dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrations-Daten angewandt. Die 50 % effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Cary, N.C.) berechnet.
Beispiel 51
Test auf NS3-Protease auf Zellbasis
Dieser Test wurde mit Huh-7-Zellen durchgeführt, einer humanen Zelllinie, die sich von einem Hepatom ableitete und mit 2 DNA-Konstrukten transfiziert war: Ein Konstrukt (mit der Bezeichnung NS3), das einen Teil des HCV-Nichtstruktur-Polyproteins in Fusion mit dem tTA-Protein über eine NS5A-NS5B-Spaltungsstelle in der folgenden Reihenfolge exprimierte: NS3-NS4A-NS4B-NS5A(NS5B)tTA, wobei (NSSB) die ersten 6 Aminosäuren von NSSB wiedergibt. Dieses Polyprotein wird unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert. Das andere Konstrukt (mit der Bezeichnung SEAP), das das Reporterprotein exprimiert, sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) unter der Regulation des tTA-reaktiven Promotors.
Das erste Konstrukt führt zur Expression eines Polyproteins, aus dem die verschiedenen reifen Proteine durch Spaltung durch die NS3-Protease freigesetzt werden. Es wird angenommen, dass die reifen viralen Proteine einen Komplex an der Membran des endoplasmatischen Retikulums bilden. tTA ist ein Fusionsprotein, beschrieben von Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 5547–5551), das eine DNA-Bindungsdomäne und einen transkriptionalen Aktivator enthält. Die Freisetzung des tTA-Proteins erfordert eine NS3-abhängige Spaltung an der NS5A-NS5B-Spaltungsstelle zwischen NS5A und dem Protein selbst. Diese letztgenannte Spaltung ermöglicht es dem tTA zum Nucleus zu wandern und das SEAP-Gen zu transaktivieren. Daher führt eine Verringerung der proteolytischen NS3-Aktivität zu einer Begrenzung von tTA auf das Zytoplasma und zu einer gleichzeitigen Verringerung der SEAP-Aktivität.
Zur Kontrolle von zellulären Aktivitäten, die sich von der Hemmung von NS3-Protease unterscheiden und die auf die Verbindung zurückzuführen sind, wurde eine parallele Cotransfektion mit einem Konstrukt, das tTA allein exprimiert, und dem gleichen Reporterkonstrukt so durchgeführt, dass die SEAP-Aktivität von der NS3-Protease unabhängig ist.
Testverfahren
Huh-7-Zellen, die in CHO-SFMII (Life Technologies) + 10% FCS (fötales Kälberserum) gezüchtet worden waren, wurden mit den beiden DNA-Konstrukten in folgenden Verhältnissen cotransfiziert:
7 μg NS3 + 500 ng SEAP + 800 μl FuGENE (Boehringer Mannheim) pro 4 × 106 Huh-7-Zellen. Nach 5 Stunden bei 37°C wurden die Zellen gewaschen, trypsiniert und auf Platten mit 96 Vertiefungen, die verschiedene Konzentrationen der zu testenden Verbindungen enthielten, ausgestrichen (80 000 Zellen/Vertiefung). Nach einer 24-stündigen Inkubationsdauer wurde die SEAP-Aktivität im Medium mit dem Phospha-Light Kit (Tropix) gemessen.
Die Analyse der prozentualen Hemmung der SEAP-Aktivität in Bezug auf die Konzentration der Verbindung wurde mit der SAS-Software zur Ermittlung des EC₅₀-Werts durchgeführt.
Tabellen bezüglich der Verbindungen
In den folgenden Tabellen sind repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen aufgeführt.
Sämtliche in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführten Verbindungen erwiesen sich bei dem in Beispiel 48 erläuterten enzymatischen Test als aktiv. Eine mit einem Stern (*) versehene Zahl gibt die enzymatische Aktivität an, die mit dem in Beispiel 49 aufgeführten radiometrischen Test bei IC₅₀-Werten unter 50 μm erhalten wurden. Bei diesen enzymatischen Tests wurde die folgende Abstufung verwendet: A ≥ 1 μM; 1 μM > B > 0,1 μM; und C ≤0,1 μM.
Verschiedene Verbindungen wurden in den in Beispiel 50 beschriebenen Spezifitätstests getestet. Es wurde festgestellt, dass sie für die NS3-Protease spezifisch sind. Im allgemeinen wurden bei den verschiedenen Spezifitätstests folgende Ergebnisse erzielt: HLE > 300 μM; PPE > 300 μM; α-Chym. > 300 μM; Cat. B > 300 μM, was darauf hinweist, dass diese Verbindungen gegenüber der HCV-NS3-Protease hochspezifisch sind. Es ist nicht zu erwarten, dass sie zu ernsthaften Nebenwirkungen führen. Ferner wurden darunter bestimmte Verbindungen in dem in Beispiel 51 beschriebenen Test auf Zellbasis getestet. Es wurde festgestellt, dass sie aktiv sind, wobei der EC₅₀-Wert unter 10 μM liegt, was stark darauf hinweist, dass diese Verbindungen die Zellmembran durchqueren können. Insbesondere die Verbindungen der Tabellen 7, 8 und 9 wurden im Zelltest getestet. Die Ergebnisse sind in der letzten Spalte aufgeführt. Bei diesem Zelltest wurde die folgende Codierung herangezogen: A > 1 μM; B ≤ 1 μM.
Innerhalb der nachstehenden Tabellen wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
MS: Elektrospray-Massenspektroskopiedaten; m/z MH⁺, ausgenommen bei Bezeichnung mit einem Stern * = m/z MH^–; Ac: Acetyl; Bn: Benzyl; Boc: tert.-Butyloxycarbonyl; Ph: Phenyl; Pr: Propyl. Tabelle 1
Tabelle 2

Tabelle 3

Tabelle 4

Tabelle 5
Tabelle 6
Tabelle 7

Tabelle 8

Tabelle 9

Claims

Verbindung der Formel (I)
worin W CH oder N ist, R²¹ H, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Halogenalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, Hydroxy oder N(R²³)₂ ist, worin R²³ jeweils unabhängig H, C_1–6-Alkyl oder C₃_₆-Cycloalkyl ist; R²² H, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Halogenalkyl, C_1–6-Thioalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, C_2–7-Alkoxyalkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C₆- oder ₁₀-Aryl oder Het ist, worin Het ein 5-, 6- oder 7-gliedriger gesättigter oder ungesättigter Neterocyclus ist, der 1 bis 4 Neteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel enthält; wobei das Cycloalkyl, Aryl oder Het mit R²⁴ substituiert sind, worin R²⁴ H, Halogen, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C_1–6-Alkoxy, C_3–6-Cycloalkoxy, NO₂, N(R²⁵)₂, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-NH-R²⁵ ist, worin jedes R²⁵ unabhängig: H, C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist; oder R²⁴ NH-C(O)-OR²⁶ ist, worin R²⁶ C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist; R³ Hydroxy, NH₂ oder eine Gruppe der Formel -NH-R³¹ ist, worin R³¹ C₆ oder ₁₀-Aryl , Heteroaryl, -C(O)-R³², -C(O)-NHR³² oder -C(O)-OR³² ist, worin R³² C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist, D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 5 bis 10 Atomen ist, die gegebenenfalls 1 bis 3 Heteroatome enthält, die unabhängig ausgewählt sind aus: O, S oder N-R⁴¹, worin R⁴¹ H, C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl oder -C(O)-R⁴² ist, worin R⁴² C_1–6-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl oder C₆ oder ₁₀-Aryl ist; R⁴ H oder von 1 bis 3 Substituenten an irgendeinem Kohlenstoffatom der Kette D ist, wobei der Substituent unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C_1–6-Alkyl, C_1–6-Halogenalkyl, C_1–6-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amino, Oxo, Thio oder C1–6-Thioalkyl, und A ein Amid der Formel -C(O)-NH-R⁵ ist, worin R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C_1–8-Alkyl, C_3–6-Cycloalkyl, C₆ oder ₁₀-Aryl oder C_7–16-Ar-alkyl; oder A eine Carbonsäure ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin das 1-Kohlenstoffzentrum die (R)-Konfiguration aufweist und D syn zum Amid gebunden ist oder syn zu A gebunden ist, wie durch die Strukturen (i) und (ii) dargestellt:
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder 2, worin D syn zu A gebunden ist, wie durch Formel (ii) dargestellt.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin W N ist; R²³ H, C_1–6-Alkyl, C_1–6-Alkoxy, Hydroxy, Chlor oder N(R²³)₂ ist, worin R²³ H oder C_1–6-Alkyl ist; R²² H, C_1–6-Thioalkyl, C_1–6-Alkoxy, Phenyl oder Het ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R²⁴ H, C_1–6-Alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵, NH-C(O)-NH-R²⁵, worin jedes R²⁵ unabhängig H, C_1–6-Alkyl oder C₃_₆-Cycloalkyl ist; oder NH-C(O)-OR²⁶, worin R²⁶ C_1–6-Alkyl ist, ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 4, worin R²¹ H oder C1–6-Alkoxy ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 4, worin R²² C_1–4-Alkoxy, Phenyl oder Het ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R²⁴ H, C1–6-Alkyl, NH-R²⁵ oder NH-C(O)-R²⁵; worin R²⁵ jeweils C_1–6-Alkyl oder C3_₆-Cycloalkyl ist, oder NH-C(O)-OR²⁶, worin R²⁶ wie in Anspruch 4 definiert ist, ist.
Verbindung der Formel nach Anspruch 6, worin R²¹ Methoxy ist.
Verbindung der Formel nach Anspruch 7, worin R²² Ethoxy oder Het ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R^24a NH-R²⁵ oder NH-C(O)-R²⁵ ist, worin R²⁵ C_1–6-Alkyl ist; oder R^24a NH-C(O)-OR²⁶ ist, worin R²⁶ C_1–6-Alkyl ist, und R^24b H oder C_1–6-Alkyl ist, ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R³ ein Amid der Formel NH-C(O)R³² oder ein Harnstoff der Formel NH-C(O)-NH-R³² oder ein Carbamat der Formel NH-C(O)-OR³² ist, worin R³² C₁_₆-Alkyl oder C₃_₆-Cycloalkyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 9, worin R³ ein Harnstoff oder ein Carbamat ist, worin R³² C_1–6-Alkyl oder C₄_₆-Cycloalkyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 10, worin R³ ein Carbamat ist und R³² tert.-Butyl, Cyclobutyl oder Cyclopentyl ist.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 6 bis 8 Atomen ist, die gegebenenfalls 1 oder 2 Heteroatome enthält, die unabhängig ausgewählt sind aus: O, S oder N-R⁴¹, worin R⁴¹ H, C_1–6-Alkyl oder C_2–7-Acyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 12, worin D gegebenenfalls ein Heteroatom enthält, das ausgewählt ist aus NH und N-C_2–7-Acyl.
Verbindung nach Anspruch 13, worin das Heteroatom ausgewählt ist aus NH und N(Ac).
Verbindung nach Anspruch 13, worin die Kette D 7 Atome enthält.
Verbindung nach Anspruch 15, worin das Heteroatom an Position 10 der Kette D ist.
Verbindung nach Anspruch 13, worin die Kette D gesättigt ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 12, worin D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 6 bis 8 Atomen ist, die gegebenenfalls ein Heteroatom enthält, das ausgewählt ist aus O oder S.
Verbindung nach Anspruch 18, worin die Kette D 7 Atome enthält.
Verbindung nach Anspruch 19, worin das Heteroatom an Position 9 der Kette D ist.
Verbindung nach Anspruch 20, worin die Kette D an Position 8 mit R⁴ substituiert ist, worin R⁴ H oder C_1–6-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 21, worin R⁴ H oder Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 22, worin R⁴ H oder 8-(S)-Me ist.
Verbindung nach Anspruch 23, worin die Kette D gesättigt ist.
Verbindung nach Anspruch 19, worin die Kette D an Position 11,12 eine Doppelbindung enthält.
Verbindung nach Anspruch 25, worin die Doppelbindung trans ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 12, worin D eine gesättigte oder ungesättigte Ganzkohlenstoff-Alkylenkette mit 6 bis 8 Atomen ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 27, worin D eine Kette mit 7 Atomen ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 28, worin D gesättigt ist.
Verbindung nach Anspruch 29, worin die Kette D mit R⁴ substituiert ist, worin R⁴ H, Oxo, Hydroxy, Alkoxy oder Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 30, worin R⁴ H oder C_1–6-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 31, worin R⁴ H oder Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 32, worin R⁴ H oder 10-(S)-Me ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 28, worin D eine Doppelbindung enthält.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 34, worin die Doppelbindung an Position 13,14 der Kette D ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 35, worin die Doppelbindung cis ist.
Verbindung nach Anspruch 36, worin die Kette D mit R⁴ substituiert ist, worin R⁴ H, Oxo, Hydroxy, C_1–6-Alkoxy oder C_1–6-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 37, worin R⁴ H oder C_1–6-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 38, worin R⁴ H oder Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 39, worin R⁴ H oder 10-(S)-Me ist.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 40, worin A eine Carbonsäure ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin W N ist; R³ eine Gruppe der Formel -NH-C(O)-NHR³² oder -NH-C(O)-OR³² ist, worin R³² C1–4-Alkyl oder C₄_₆-Cycloalkyl ist; D eine gesättigte oder ungesättigte Alkylenkette mit 6 bis 8 Atomen ist, die syn zu A an die Cyclopropylgruppe der Verbindung der Formel I gebunden ist, gegebenenfalls enthaltend 1 oder 2 Heteroatome, die unabhängig ausgewählt sind aus: O, S oder N-R⁴¹, worin R⁴¹ H oder C_2–7-Acyl ist; R⁴ H oder von 1 bis 3 Substituenten unabhängig ausgewählt aus Hydroxy oder C_1–6-Alkyl ist und A eine Carbonsäure ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 42, worin R²¹ H oder Methoxy ist; R²² C_1–6-Alkoxy oder Het ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R^24a H, C_1–6-Alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ oder NH-C(O)-NH-R²⁵ ist, worin R²⁵ H, C_1–6-Alkyl oder C₃_₆-Cycloalkyl ist; oder R^24a NH-C(O)-OR²⁶ ist, worin R²⁶ C₁_₆-Alkyl oder C₃_₆-Cycloalkyl ist; und R^24b H oder C_1–6-Alkyl ist, ist; R³ Harnstoff der Formel N-C(O)-NHR³² oder ein Carbamat der Formel N-C(O)-OR³², worin R³² C_1–6-Alkyl oder C_3–6-Cycloalkyl ist, ist; D eine Alkylenkette mit 7 Atomen ist, die gegebenenfalls eine Doppelbindung an Position 11,12 oder 13,14 enthält; wobei die Kette D gegebenenfalls ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus: O, S, NH, N(Me) oder N(Ac), und R⁴ Hoder C_1–6-Alkyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 43, worin R²¹ Methoxy ist und R²² Ethoxy oder
worin R^24a NH-(C_1–4-Alkyl); NH-C(O)-(Cis-Alkyl); NH-C(O)-O-(C_1–4-Alkyl) oder NH-C(O)-NH-(C_1–4-Alkyl) ist, ist; D eine C7-Ganzkohlenstoffkette ist, die gesättigt ist oder eine cis-Doppelbindung in Position 13, 14 enthält.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
umfassend ein einzelnes Stereoisomer am 1-Kohlenstoffzentrum, wobei die Doppelbindung und die Stereochemie von D und R²² wie folgt definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
umfassend ein einzelnes Stereoisomer am 1-Kohlenstoffzentrum, wobei R³, R⁴, die Doppelbindungsposition und die Stereochemie von D, R²¹ und R²² wie folgt definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
umfassend ein einzelnes Stereoisomer am 1-Kohlenstoffzentrum, wobei R³, D, die Stereochemie von D, R²¹ und R²² wie folgt definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, R⁴, X₉ und die 11,12-Doppelbindung folgendermaßen definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, X₁₀, X₁₁ und X₁₂ folgendermaßen definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, R²¹ und R²² folgendermaßen definiert sind:
Verbindung der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, R⁴, X₉, X₁₀, X₁₁, die 13,14-Doppelbindung und R²² folgendermaßen definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, die 13,14-Doppelbindung cis ist, R³² R⁴ und R²² folgendermaßen definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
worin D syn zur Carbonsäure -COOH ist, R³², R⁴ und R²² folgendermaßen definiert sind:
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 als Arzneimittel.
Verwendung einer Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 als Research-Tool zum Entwerfen von viralen Replikations-Assays.
Verwendung der Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus.
Verwendung der Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung einer Hepatitis C-Virusinfektion.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine bezüglich Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder eines therapeutisch annehmbaren Esters davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium oder Hilfsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 58, ferner umfassend einen zusätzlichen Immunmodulator.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin der zusätzliche Immunmodulator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus α-, β- und δ-Interferonen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 58, ferner umfassend ein antivirales Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 61, worin das antivirale Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribavirin und Amantadin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 58, ferner umfassend einen anderen Inhibitor von HCV-Protease.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 58, ferner umfassend einen Inhibitor von anderen Targets im HCV-Lebenszyklus.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 64, worin der Inhibitor von anderen Targets im HCV-Lebenszyklus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Helicase, Polymerase und Metalloprotease.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 58 bis 65 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung einer Hepatitis C-Virusinfektion in einem Säuger.
Verbindung mit der folgenden Formel (A):
worin X PG oder R² ist; jedes PG unabhängig eine Schutzgruppe ist; R² eine Gruppe der Formel
ist, worin R²¹, R²² und W wie in Anspruch 1 definiert sind; A' eine geschützte Carbonsäure ist; und n 2 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (A) nach Anspruch 67, wobei das Verfahren umfasst das Umsetzen einer Verbindung der Formel (B) mit einer Verbindung der Formel (C):
worin PG, X, A' und n wie in Anspruch 67 definiert sind.
Verbindung mit der folgenden Formel (D):
worin X PG or R² ist; PG eine Schutzgruppe ist; R² wie in Anspruch 67 definiert ist; A' eine geschützte Carbonsäure ist; und n 2 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (D) nach Anspruch 69, wobei das Verfahren umfasst das Abspalten der Schutzgruppe PG am Pyrrolidinring in der Verbindung der Formel (A):
worin X PG oder R² ist; jedes PG unabhängig eine Schutzgruppe ist; R², A' und n wie in Anspruch 69 definiert sind.
Verbindung mit der folgenden Formel (E):
worin X PG or R² ist; PG eine Schutzgruppe ist; R² wie in Anspruch 67 definiert ist; A' eine geschützte Carbonsäure ist; R³ wie in Anspruch 1 definiert ist; n 0 oder 2 ist; D' wie für D definiert ist, aber 2 bis 5 Atome kürzer ist; und D wie in Anspruch 1 definiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (E) nach Anspruch 71, wobei das Verfahren umfasst das Umsetzen einer Verbindung der Formel (D) mit einer Verbindung der Formel (F):
worin X, A', n, R³ und D' wie in Anspruch 71 definiert sind.
Verbindung mit der folgenden Formel (G):
worin R² wie in Anspruch 67 definiert ist, R³ und D wie in Anspruch 1 definiert sind; und A' eine geschützte Carbonsäure ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (G'), die der Verbindung der Formel (G) entspricht, nach Anspruch 73, wobei D eine ungesättigte Gruppe wie in Anspruch 1 definiert ist, wobei das Verfahren umfasst das Bewirken eines Ringschlusses der Verbindung der Formel (E) durch Umsetzen der Verbindung der Formel (E) in Anwesenheit eines Katalysators auf Übergangsmetallbasis, um eine Verbindung der Formel (G') zu erhalten:
worin R² wie in Anspruch 67 definiert ist, R³, n und A' wie in Anspruch 1 definiert sind.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (G) nach Anspruch 73, worin D eine gesättigte Gruppe wie in Anspruch 1 definiert darstellt, wobei das Verfahren die Hydrierung der Verbindung der Formel (G') nach Anspruch 74 umfasst.
Verbindung mit der folgenden Formel (J):
worin R² wie in Anspruch 67 definiert ist und R³ wie in Anspruch 1 definiert ist; m 1 bis 5 ist; n 1 bis 5 ist; A' eine geschützte Carbonsäure ist; und Cbz Benzyloxycarbonyl ist.
Verbindung der folgenden Formel (K):
worin R² wie in Anspruch 67 definiert ist und R³ wie in Anspruch 1 definiert ist; m 1 bis 5 ist; n 1 bis 5 ist; A' eine geschützte Carbonsäure ist; und Cbz Benzyloxycarbonyl ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (K) nach Anspruch 77, wobei das Verfahren das Unterwerfen einer Verbindung der Formel (J) einer Hydroborierung und dann einer Oxidation umfasst:
worin R², R³, m, n A' und Cbz wie in Anspruch 76 definiert sind.
Verbindung mit der folgenden Formel (L):
worin R² wie in Anspruch 67 definiert ist und R³ wie in Anspruch 1 definiert ist; m 1 bis 5 ist; n 1 bis 5 ist; und A' eine geschützte Carbonsäure ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (L) nach Anspruch 79, wobei das Verfahren die Hydrierung der Verbindung der Formel (K) in Anwesenheit einer Säure umfasst:
worin R² und R³, m, n und A' wie in Anspruch 79 definiert sind; und Cbz Benzyloxycarbonyl ist.
Verwendung einer Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 53 zur Behandlung oder Verhinderung der viralen Kontamination von Materialien.