SK14072001A3 - Makrocyklické peptidy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Description

Makrocyklické peptidy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka zlúčenín, farmaceutických prostriedkov s ich obsahom na použitie na liečenie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV). Vynález sa bližšie týka nových peptidových analógov, farmaceutických prostriedkov, ktoré uvedené analógy obsahujú a použitia týchto analógov na liečbu HCV infekcií.

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV) je okrem typov A a B celosvetovo hlavný etiologický pôvodca potransfúznej a získanej hepatitídy. Zistilo sa, že uvedeným vírusom je infikovaných viac ako 170 miliónov obyvateľov sveta. Vysoké percento nosičov sa stáva chronicky infikovanými a u mnohých nastáva chronické ochorenie pečene, tzv. chronická hepatitída C. Táto skupina chorých je zasa vysoko riziková na vážne pečeňové ochorenia ako je cirhóza pečene, hepatocelulárny karcinóm a terminálne ochorenie pečene, vedúce k smrti.

Doteraz nebol vyriešený mechanizmus, ktorým HCV prežíva a spôsobuje vysoký podiel chronických chorôb pečene. Nie je známe, ako HCV vstupuje do interakcie s hostiteľským imunitným systémom a ako uniká jeho účinku. Ďalej, doteraz nebola zistená úloha bunkovej a humorálnej odozvy pri ochrane proti infekcii HCV a ochoreniu. Uvádza sa, že na profylaxiu vírusovej hepatitídy, súvisiacej s transfúziou, sú vhodné imunoglobulíny, ale v súčasnosti stredisko pre chorobnosť (Center for Disease Control) neodporúča imunoglobulínovú liečbu na uvedený účel. Chýbajúca účinná ochranná imunitná odozva brzdí vývoj vakcíny alebo primeraný po-expozičný rozsah profylaxie a tak sa pre blízku budúcnosť vkladá nádej na protivírusové zákroky.

Vykonali sa rôzne klinické štúdie s cieľom identifikovať farmaceutické prostriedky, schopné účinne liečiť HCV infekcie pacientov, postihnutých chronickou hepatitídou C. Tieto štúdie zahŕňajú použitie α-interferónu, samotného alebo v kombinácii s inými protivírusovými látkami. Uvedené štúdie ukázali, že podstatný

-2podiel účastníkov nemal odozvu na uvedené terapie a z účastníkov s kladnou odozvou značná časť mala recidívu po ukončení liečby.

U pacientov s chronickou hepatitídou C ešte pred niekoľkými rokmi jedinou dostupnou terapiou s klinicky preukázaným kladným účinkom bol interferón (IFN). Úroveň trvalej odozvy bola ale nízka a liečba interferónom vyvoláva tiež vážne vedľajšie účinky (napríklad retinopatiu, tyreoidítu, akútnu pankreatitídu, depresiu), čo nepriaznivo vplýva na kvalitu života liečených pacientov. Interferón v kombinácii s ribavirínom bol pôvodne odporúčaný pre pacientov, u ktorých chýbala odozva na IFN. Teraz sa odporúča detským pacientom a v súčasnosti je zlatým štandardom v terapii HCV. Uvedené vedľajšie účinky, spôsobované IFN nie sú ale zmiernené ani v tejto kombinovanej terapii.

Preto jestvuje požiadavka vyvinúť účinný protivírusový prostriedok na liečbu HCV infekcie, ktorý by prekonal obmedzenia jestvujúcich farmaceutických terapií.

HCV je vírus s obaleným pozitívnym pruhom RNA z rodiny Flaviviridae. Jednopruhový HCV RNA genóm má dĺžku približne 9500 nukleotidov a má jeden čítací rámec (open reading frame, ORF), kódujúci jeden veľký polyproteín s približne 3000 aminokyselinami. Tento protein sa v infikovaných bunkách bunkovými a vírusovými proteázami štiepi na viacerých miestach a produkuje stavebné a nestavebné (non-structural, NS) proteíny. V prípade HCV je vznik zrelých nestavebných proteínov (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a NS5B) ovplyvnený dvoma vírusovými proteázami. Prvá, doteraz málo charakterizovaná, štiepi na spoji NS2NS3; druhá je serínová proteáza, obsiahnutá v N-terminálnej oblasti NS3 (preto je ďalej označovaná ako NS3 proteáza) a sprostredkuje všetky nasledujúce štiepenia v smere NS3, v štiepnom mieste cis NS3-NS4A a na ostávajúcich miestach NS4ANS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Zdá sa, že uvedený protein NS4A má viaceré funkcie, pôsobí ako kofaktor pre NS3 proteázu a možno podporuje membránovú lokalizáciu NS3 a ďalších vírusových replikačných zložiek. Komplexné vytváranie NS3 proteínu s NS4A v uvedených procesoch sa zdá byť nevyhnutné, nakoľko podporuje proteolytickú účinnosť na všetkých štiepnych miestach. Uvedený NS3 protein má tiež nukleozidovú trifosfatázovú účinnosť a aj RNA-helikázovú účinnosť. NS5B je na RNA-závislá RNA polymeráza, ktorá ja zapojená v replikácii HCV.

-3Patentová prihláška WO 97/06804 opisuje (-)enantiomér nukleozidového analógu cytozín-1,3-oxatiolánu (známeho tiež ako 3TC) ako účinnej látky proti HCV. Hoci sa na základe klinických pokusov s HIV a HBV o tejto zlúčenine uvádza, že je bezpečná, doteraz nebola ako účinná látka proti HCV klinicky overená a doteraz nebol publikovaný mechanizmus jej účinku proti uvedenému vírusu.

Všeobecná stratégia vývoja protivírusových látok je v inaktivácii vírusovo kódovaných enzýmov, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu vírusu. Značné úsilie nájsť zlúčeniny, ktoré by inhibovali NS3 proteázu alebo RNA helikázu HCV, doteraz viedlo k nasledujúcim poznatkom:

v patente USA 5 633 388 sa opisujú heterocyklický substituované karboxamidy a analógy ako účinné látky proti HCV. Tieto zlúčeniny sú cielené proti helikázovej účinnosti NS3 proteínu vírusu, ale výsledky klinických skúšok neboli doteraz zverejnené.

Bol opísaný fenantrénchinón (Chu a ďalší, Tet. Lett. 7229 až 7232 (1996)) ako látka, ktorá je in vitro účinná proti HCV NS3 proteáze. O tejto látke neboli zverejnené nijaké ďalšie výsledky vývoja.

Na 9. medzinárodnej konferencii o protivírusovom výskume v Urabandai, Fukyshima, Japonsko v roku 1966 bol zverejnený príspevok (Antiviral Research 30, 1, A23 (abstrakt 19)) o tiazolidínových derivátoch, ktoré majú pôsobiť inhibičné na HCV proteázu.

Vo viacerých štúdiách sa uvádzajú zlúčeniny, ktoré inhibičné pôsobia na ďalšie serínové proteázy, ako je napríklad ľudská leukocytová elastáza. Jedna skupina týchto zlúčenín sa uvádza v WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1955). V tejto prihláške opísané peptidy sú morfolinylkarbonyl-benzoyl-peptidové analógy, ktoré sú štruktúrne odlišné od peptidov tohto vynálezu.

WO 98/17679 od firmy Vertex Pharmaceuticals Inc. opisuje inhibítory serínovej proteázy, najmä vírusovej proteázy NS3 hepatitídy C.

Hoffman LaRoche (WO 98/22496; patenty USA 5 866 684 a 6 018 020) uvádzajú hexypeptidy, ktoré sú tiež proteinázové inhibítory, využiteľné ako protivírusové látky na liečbu HCV infekcie.

SteinkOhler a ďalší, a Ingallinella a ďalší publikovali práce o inhibícii NS4A-4B produktu (Biochemistry 37, 8899 až 8905 a 8906 až 8914 (1998)).

-4Vo WO 97/43310 Schering Corporation zverejňuje 20 a 21 aminokyselinové peptidové sekvencie, účinné proti NS3 proteáze HCV.

Emory University v WO98/46597 zverejňuje peptidy a peptidomimetiká, účinné in vitro proti serínovým proteázam.

WO 98/46630 od Peptide Therapeutics Limited opisuje depsipeptidový substrát, inhibujúci proteázu NS3 HCV.

Konečne patent USA 5 869 253 zverejňuje enzymatické RNA molekuly, ktoré inhibujú proteázu NS3 HCV.

Žiadna z uvedených doterajších patentových prihlášok neuvažuje s cyklickými peptidmi, účinnými a selektívnymi proti proteáze NS3 hepatitídy C. WO 99/17733, WO 99/07734, WO 00/09543 a WO 00/09558 opisujú hexa- až tetrapeptidy a tripeptidové analógy, ktoré inhibujú proteázu NS3. Tieto zverejnenia ale neuvažujú alebo nevedú k návrhu makrocyklických analógov, obsiahnutých v tomto vynáleze.

WO 99/38888 z 5. augusta 1999 od Richerge di Biológia Moleculare (IRBM) opisuje inhibítory proteázy NS3 HCV na základe malých peptidov. V uvedenom opise sa ale neuvažuje alebo nepoukazuje na cyklickú podstatu peptidov, ako v tomto vynáleze. Naviac, uvedená PCT prihláška bola zverejnená po dátumu priority prihlášky tohto vynálezu.

WO 99/64442 od IRBM, tiež po dátumu priority prihlášky tohto vynálezu, opisuje oligopeptidy s ketokyselinami v P1.

WO 99/50230 od Vertex Pharmaceuticals (zo 7. októbra 1999) bola tiež publikovaná po dátumu priority prihlášky tohto vynálezu. Uvedené zverejnenie WO 99/50230 naviac ani zďaleka nenavrhuje cyklické peptidy, obsiahnuté v prihláške tohto vynálezu.

Jednou výhodou tohto vynálezu je, že poskytuje makrocyklické peptidy, ktoré sú inhibítormi NS3 proteázy vírusu hepatitídy typu C.

Ďalšia výhoda z hľadiska tohto vynálezu je v skutočnosti, že tieto peptidy špecificky inhibujú uvedenú NS3 proteázu a nevykazujú význačnú inhibičnú účinnosť proti ďalším serínovým proteázam ako je ľudská leukocytová elastáza (HLE), bravčová pankreatická elastáza (PPE), alebo bovinný pankreatický » r

-5chymotrypsín, proti cysteínovým proteázam ako je ľudský pečeňový katepsín B (Cat B).

Ďalšia výhoda tohto vynálezu je v tom, že zahŕňa malé peptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré sú schopné prenikať bunkovými membránami a inhibovať účinnosť NS3 proteázy v bunkovej kultúre.

Ešte ďalšia výhoda zlúčenín podľa tohto vynálezu záleží v skutočnosti, že uvedené zlúčeniny sú účinné v obidvoch prípadoch hlavných genotypov, nájdených v klinických izôlátoch (1a a 1b), čo oprávňuje k názoru, že tieto zlúčeniny budú účinné proti všetkým doteraz známym genotypom HCV.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I

v ktorom

WjeCHaleboN,

R²¹ je H, halogén, Ci-6-alkyl, C3_6-cykloalkyl, Ci-6-halogénalkyl, Ci-e-alkoxy, C3_6cykloalkoxy, hydroxy alebo skupina N(R²³)₂, pričom každé R²³ je nezávisle H, C1-6alkyl alebo C3_6-cykloalkyl; a

R²² je H, halogén, Ci-e-alkyl, C₃.6-cykloalkyl, Ci.₆-halogénalkyl, Ci-e-tioalkyl, C1-6alkoxy, C3-6-cykloalkoxy, C₂-7-alkoxyalkyl, C3-6-cykloalkyl, C₆ alebo C10 aryl alebo Het, pričom Het je päť, šesť alebo sedemčlenný, nasýtený alebo nenasýtený, heterocyklický kruh, obsahujúci jeden až štyri heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa dusík, kyslík a síru;

-6uvedený cykloalkyl, aryl alebo Het je substituovaný skupinou R²⁴, kde R²⁴ je H, halogén, Ci^-alkyl, C₃.₆-cykloalkyl, Ci.₆-alkoxy, C3-6-cykloalkoxy, NO2,

N(R²⁵)₂, NH-C(O)-R²⁵; alebo NH-C(O)-NH-R²⁵, kde každé R²⁵ je vzájomne nezávisle od seba: H, C-i-e-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

alebo R²⁴ je NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je C-i-e-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

R³ je hydroxy, NH2, alebo skupina vzorca -NH-R³¹, kde R³¹ je C6 alebo C10 aryl, heteroaryl, -C(O)-R³², -C(O)-OR³² alebo -C(O)-NHR³², pričom Ŕ³² je: Ci-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

D je 5 až 10 atómový, nasýtený alebo nenasýtený alkýlénový reťazec, ktorý voliteľne obsahuje jeden až tri heteroatómy, nezávisle od seba vybrané z: O, S alebo N-R⁴¹, kde

R⁴¹ je H, Ci-6-alkyl, C3_6-cykloalkyl alebo -C(O)-R⁴², kde R⁴² je Ci-₆-alkyl, C3_6-cykloalkyl alebo C6 alebo C10 aryl;

R⁴ je H alebo uvedený reťazec D, substituovaný na ktoromkoľvek uhlíku jedným až troma substituentami, pričom substituenty sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa: Ci-e-alkyl, Ci-6-halogénalkyl, Ci-6-alkoxy, hydroxy, halogén, amino, oxo, tio alebo Ci_6-tioalkyl; a

A je amid vzorca -C(O)-NH-R⁵, pričom R⁵ je vybrané zo skupiny ktorá zahŕňa: Ci-ealkyl, C3-6-cykloalkyl, C₆ alebo C10 aryl alebo C7-i6-aralkyl; alebo A je karboxylová kyselina alebo jej farmaceutický prípustná soľ alebo ester.

V rozsahu tohto vynálezu je zahrnutý farmaceutický prostriedok proti vírusu hepatitídy C obsahujúci účinné množstvo zlúčeniny vzorca I, alebo jej terapeuticky prípustnej soli alebo jej esteru, v zmesi s farmaceutický prípustným nosičovým médiom alebo pomocnou látkou.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob liečby vírusovej infekcie cicavca hepatitídou podávaním proti vírusu hepatitídy C účinného množstva zlúčeniny vzorca I, alebo jej terapeuticky prípustnej soli alebo jej esteru, alebo farmaceutického prostriedku, ako sa opisuje hore.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob inhibície replikácie vírusu hepatitídy C vystavením vírusu hepatitídy C NS3-proteázu inhibujúcemu množstvu zlúčeniny vzorca I,

-7alebo jej terapeuticky prípustnej soli alebo jej esteru, alebo farmaceutického prostriedku, ako sa opisuje hore.

Ďalej vynález zahŕňa spôsob liečby vírusovej infekcie cicavca hepatitídou C podávaním uvedenému cicavcovi proti hepatitíde C vírusovo účinného množstva kombinácie zlúčeniny vzorca I, alebo jej terapeuticky prípustnej soli alebo jej esteru. V jednom uskutočnení farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu obsahujú ďalšiu imunomodulujúcu látku. Príklady ďalších imunomodulujúcich látok zahŕňajú, ale nie sú na ďalej uvedené obmedzené: α-, β- a δ-interferóny.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu v alternatívnom uskutočnení ďalej obsahovať protivírusovú látku. Príklady protivírusových látok zahŕňajú ribavirín a amantadín.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu v ďalšom alternatívnom uskutočnení ďalej obsahovať iné inhibítory HCV proteázy.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu v ešte ďalšom alternatívnom uskutočnení ďalej obsahovať inhibitor ďalších cieľov v HCV životnom cykle, ako je helikáza, polymeráza, metaloproteáza alebo IRES.

Definície

Pokiaľ sa jednotlivo neuvádza inak, uvádzané výrazy sú určené nasledovne:

S odvolaním na prípady, keď sa používa (R) alebo (S) na označenie absolútnej konfigurácie substituenta zlúčeniny vzorca I, napríklad substituenta R⁴, toto označenie je urobené v kontexte celej zlúčeniny a nie iba v kontexte samotného substituenta.

Označenie P1, P2 a P sa tu používa tak, že znamená polohu amino-kyselinového zvyšku počínajúc od C-terminálneho konca peptidového analógu v smere N-zakončenia (to znamená, že napríklad P1 sa vzťahuje na polohu 1 od C-zakončenia, P2 na druhú polohu od C-zakončenia a tak ďalej) (pozri: Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London, série B257,249 až 264 (1970)).

Výraz 1-aminocyklopropyl-karboxylová kyselina (ACCA) sa v tomto texte vzťahuje na zlúčeninu vzorca:

o

-8Výraz vinyl-ACCA znamená zlúčeninu vzorca:

o

Výraz homo-alyl-ACCA sa v tomto texte používa na označenie zlúčeniny:

o

Výraz halogén alebo halo sa tu používa vo význame halogénu ako substituerita, vybraného zo skupiny substituentov bróm, chlór, fluór alebo jód.

Výraz Ci-6-halogénalkyľ, či už samotný alebo v spojení s ďalším substituentom, sa v tomto texte používa vo význame acyklických, rozvetvených alebo nerozvetvených substituovaných alkylových reťazcov, obsahujúcich 1 až 6 uhlíkových atómov, v ktorých jeden alebo viac vodíkových atómov je nahradených halogénom, vybraným zo skupiny bróm, chlór, fluór alebo jód.

Výraz Ci-e-tioalkyľ, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom, sa v tomto texte používa vo význame acyklických, rozvetvených alebo nerozvetvených substituovaných alkylových reťazcov, obsahujúcich tiolovú skupinu, ako je napríklad tiopropyl.

Výraz Ci-6-alkyľ alebo (nižší)alkyľ, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom, znamená acyklické, rozvetvené alebo nerozvetvené, alkylové reťazce, obsahujúce 1 až 6 uhlíkových atómov a zahŕňajú, napríklad, skupinu metyl, etyl, propyl, butyl, hexyl, 1-metyletyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl.

Výraz C3-6-cykloalkyl, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom znamená cykloalkylový substituent, obsahujúci od 3 do 6 uhlíkových atómov a zahŕňa cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl a cyklohexyl.

Výraz nenasýtený cykloalkyl zahŕňa, napríklad, substituent cyklohexenyl:

ŕ »♦

-9Výraz nasýtený alebo nenasýtený alkylén sa v tomto texte používa vo význame divalentného alkylového substituenta, odvodeného odstránením vodíkových atómov z obidvoch koncov nasýteného alebo nenasýteného, nerozvetveného alebo rozvetveného reťazca alifatického uhľovodíka a zahŕňa napríklad: -CH₂CH2C(CH3)2CH₂CH2-, -CH₂CH2CH=CHCH₂CH2- alebo -CH₂C CCH₂CH₂-.

Uvedený alkylový reťazec môže voliteľne obsahovať heteroatóm, napríklad kyslík (napríklad CH3-CH2-O-CH2-).

Výraz Ci-6-alkoxy, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom sa v tomto texte používa vo význame substituenta -O-Ci^-alkyl, pričom alkyl, ako je určený hore, obsahuje 1 až 6 uhlíkových atómov. Alkoxy zahŕňa metoxy, etoxy, propoxy, 1-metyloxy, butoxy a 1,1-dimetyletoxy. Posledne uvedený substituent je bežne známy ako ŕerc-butoxy.

Výraz C3-6-cykloalkyl, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom tu znamená substituent -O-C3-6-cykloalkyl, obsahujúci od troch do šiestich atómov uhlíka.

Výraz Cve-alkoxyalkyl v tomto texte znamená substituent C1.6-alkyl-O-C1.6alkyl, pričom alkyl, ako je určený hore, obsahuje až do 6 atómov uhlíka. Napríklad metoxymetyl znamená -CH2-O-CH3.

Výraz C2-7-acyľ, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom sa tu používa vo význame Ci-6-alkylovej skupiny, viazanej cez karbonylovú skupinu, napríklad -C(O)-Ci-6-alkyl.

Výraz C₆ alebo C10 aryl, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom, znamená alebo aromatický monocyklický systém obsahujúci 6 atómov uhlíka, alebo aromatický bicyklický systém, obsahujúci 10 uhlíkových atómov. Aryl napríklad zahŕňa fenylový alebo naftylový kruhový systém.

Výraz C7_i6-aralkyľ, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom sa tu používa vo význame arylu, ako je určený hore, viazaného cez alkylovú skupinu, pričom alkyl, ako je určený hore, obsahuje 1 až 6 uhlíkových atómov. Aralkyl zahŕňa napríklad benzyl a butylfenyl.

Výraz Het, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom tu znamená monovalentný substituent, odvodený odstránením vodíka z päť-, šesť- alebo sedem-členného nasýteného alebo nenasýteného (vrátane aromatického) heterof r

-10cyklu, obsahujúceho jeden až štyri heteroatómy, vybrané zo skupiny: dusík, kyslík a síra. Príklady vhodných heterocyklov zahŕňajú: tetrahydrofurán, tiofén, diazepín, izoxazol, piperidín, dioxán, morfolín, pyrimidín alebo

Výraz Het zahŕňa tiež hyterocyklické zoskupenie, ako je určené hore, kondenzované na jeden alebo viac kruhov, ktoré môžu byť heterocyklické, alebo iné kruhové zoskupenia. Jeden z príkladov je tiazolo[4.5-b]-pyridín.

Hoci sa všeobecne výrazom Het rozumie aj výraz heteroaryl, v tomto texte sa heteroaryl presne určuje ako nenasýtené heterocyklické zoskupenie, v ktorom dvojité väzby tvoria aromatický systém. Vhodné príklady heteroaromatických systémov zahŕňajú: chinolín, indol, pyridín,

Výraz farmaceutický prípustný ester, samotný alebo v kombinácii s ďalším substituentom, znamená ester zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom niektorá karboxylová funkčná skupina, ale výhodne karboxylové zakončenie reťazca, je nahradená alkoxykarbonylovou funkčnou skupinou:

OR v ktorej zoskupenie R esteru je vybrané zo skupín: alkyl (napríklad metyl, etyl, npropyl, ŕerc-butyl, n-butyl); alkoxyalkyl (napríklad metoxymetyl); alkoxyacyl (napríklad acetoxymetyl); aralkyl (napríklad benzyl); aryloxyalkyl (napríklad fenoxymetyl); aryl (napríklad fenyl), voliteľne substituované halogénom, skupinou C^-alkyl alebo skupinou C-M-alkoxy. Iné vhodné prekurzorové estery možno nájsť v literatúre

-11 Design of Prodrugs, Bundgaard H., Ed., Elsevier (1985), ktorá sa tu zahŕňa týmto odkazom. Uvedené farmaceutický prípustné estery sa po vstreknutí cicavcovi zvyčajne hydrolyzujú in vivo a menia sa na formu kyseliny zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Alkylové štruktúrne zoskupenie hore opísaných esterov, pokiaľ sa neuvádza inak, výhodne obsahuje 1 až 16 atómov uhlíka, najmä 1 až 6 atómov uhlíka. Akékoľvek arylové zoskupenie, prítomné v hore uvedených esteroch je výhodné, ak obsahuje fenylovú skupinu.

Podrobnejšie, uvedené estery môžu byť Ci_i6-alkylestery, nesubstituovaný benzylester, alebo benzylester substituovaný najmenej jedným halogénom, skupinou Ci-6-alkyl, Ci-6-alkoxy, nitro alebo trifluórmetyl.

Výraz farmaceutický prípustná soľ sa tu používa tak, že zahŕňa soli odvodené od farmaceutický prípustných zásad. Príklady vhodných zásad zahŕňajú cholín, etanolamín a etyléndiamín. V rozsahu tohto vynálezu sú zahrnuté aj Na⁺, K⁺ a Ca⁺⁺ soli (pozri tiež publikáciu Pharmaceuticals Salts, Birge S. M. a ďalší, J. Pharm. Sci. 66,1 až 19 (1977), ktorá sa tu zahŕňa týmto odkazom).

Výhodné uskutočnenia vynálezu

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I ako sú určené hore, v ktorých štruktúrne zoskupenie R¹ je vybrané z dvoch rôznych diastereoizomérov, v ktorých 1-uhlíkový stred má konfiguráciu R, znázornenú štruktúrami i a ii:

(i) D syn vzhľadom na amid alebo (ii) D syn vzhľadom na A

Výhodnejšie uskutočnenie má spojovník D viazaný k R¹ v konfigurácii syn k A, znázornenú štruktúrou ii.

-12R²:

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I ako sú určené hore, v ktorých štruktúrne zoskupenie R² je

v ktorom W je výhodne N

Výhodné R²¹ je H, Ci-6-alkyl, Ci-6-alkoxy, hydroxy, chlór, alebo N(R²³)₂, pričom R²³ je výhodne H alebo C-i-6-alkyl. Výhodnejšie R²¹ je H alebo Ci-6-alkoxy. Najvýhodnejšie R²¹ je metoxy.

Výhodné R²² je H, Ci-6-tioalkyl, Ci-6-alkoxy, fenyl alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa: r²⁴

Výhodné R²⁴ je H, Cve-alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵; alebo NH-C(O)-NH-R²⁵ alebo NH-C(O)-OR²⁶.

Výhodnejšie R²² je C-M-alkoxy, fenyl alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

-13» r r * *· re r C r ľ

I f ^r

Výhodnejšie R²⁴ je H, Ci-e-alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵ alebo NH-C(O)-R²⁶. Najvýhodnejšie R²² je etoxy alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

,24b

N,24b >26

Najvýhodnejšie R^^a je NH-R²⁵, NH-C(0)-R²³ alebo NH-C(O)-R°. Najvýhodnejšie R^24b je H alebo C-i-e-alkyl.

Je výhodné, ak R²⁵ je nezávisle H, Ci.6-alkyl, alebo C3-6-cykloalkyI. Výhodnejšie R²⁵ je Ci-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl. Najvýhodnejšie R²⁵ je Ci-e-alkyl.

Výhodné R²⁶ je Ci-e-alkyl.

R³:

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I ako sú určené hore, v ktorých výhodné štruktúrne zoskupenie R³ je amid vzorca NH-C(O)-R³², močovina vzorca NH-C(O)-NH-R³², alebo karbamát vzorca NH-C(O)-OR³².

Výhodnejšie R³ je karbamát alebo močovina. Najvýhodnejšie R³ je karbamát.

Výhodné R³² je Cve-alkyl, alebo C3-6-cykloalkyl. Výhodnejšie R³² je Ci_6-alkyl alebo C4-6-cykloalkyl. Najvýhodnejšie R³² je ŕerc-butyl, cyklobutyl alebo cyklopentyl.

D:

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých spojovník D je šesť- až osem-atómový, nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec. Výhodnejšie D má reťazec s 7 atómami.

-14Je výhodné, ak reťazec D obsahuje jeden alebo dva heteroatómy, vybrané z: O, S, NH, N-Ci-6-alkyl alebo N-C2-7-acyl. Výhodnejšie, reťazec D voliteľne obsahuje jeden heteroatóm, vybraný z: NH alebo N-C2-7-acylu, najvýhodnejšie N(Ac), a je v polohe na 10 atóme reťazca. Je najvýhodnejšie, ak reťazec obsahujúci dusíkový atóm je nasýtený.

Alternatívne, D obsahuje jeden heteroatóm, vybraný z: O alebo S. Výhodné je, ak D má dĺžku sedem atómov a atóm O alebo S je v polohe 9 reťazca. Je výhodné, ak tento reťazec je substituovaný substituentom R⁴, pričom R⁴ je H alebo Ci-6-alkyl. Výhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo metyl. Najvýhodnejšie R⁴ je H alebo

8-(S)-Me. Ešte najvýhodnejšie D obsahuje jednu dvojitú väzbu v polohe 11,12. Výhodné je, ak táto dvojitá väzba je trans.

Alternatívne, D je nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec, pozostávajúci z uhlíkových atómov. V tomto prípade je D výhodne nasýtený reťazec s dĺžkou 7 atómov. Výhodnejšie D je substituované substituentom R⁴, pričom R⁴ je H, oxo, tio, hydroxy, tioalkyl, alkoxy alebo alkyl. Výhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo Cv6alkyl. Najvýhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo metyl. Najvýhodnejšie R⁴ je H alebo 10(S)-Me.

Alternatívne, D je alkylénový reťazec, pozostávajúci iba z uhlíkových atómov, obsahujúci jednu dvojitú väzbu a má dĺžku 7 atómov. Výhodnejšie je, ak uvedená dvojitá väzba je v polohe 13,14 reťazca. Najvýhodnejšie je, ak táto dvojitá väzba je cis. Výhodné je, ak reťazec D je substituovamý substituentom R⁴, pričom R⁴ je H, oxo, hydroxy, alkoxy alebo alkyl. Výhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo Ci-6-alkyl. Ešte výhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo metyl. Najvýhodnejšie je, ak R⁴ je H alebo 10-(S)Me.

A:

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I, ako sú určené hore, v ktorých A je karboxylová kyselina.

Niektoré jednotlivé uskutočnenia vynálezu

Výhodné uskutočnenia tohto vynálezu zahŕňajú zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R² je chinolínový substituent (to znamená, že W je N);

-15R³ je skupina vzorca -NH-C(O)-NHR³² alebo -NH-C(O)-OR³², pričom R³² je Cualkyl alebo C4-6-cykloalkyl;

D je šesť až osem atómový nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec, viazaný k R¹ v konfigurácii syn vzhľadom na A, voliteľne obsahujúci jeden alebo dva heteroatómy, nezávisle vybrané z: O, S alebo N-R⁴¹, pričom R⁴¹ je C₂-7-acyl;

R⁴ je H, alebo reťazec D, substituovaný jedným až troma substituentami, pričom substituenty sú nezávisle od seba vybrané z: hydroxy alebo Ci-6-alkylu; a A je karboxylová skupina, alebo jej farmaceutický prípustná soľ alebo ester.

Výhodnejšie sú zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ je určené hore; R²¹ je H alebo metoxy;

R²² je Ci-6-alkoxy alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

kde R^24a je H, Ci.₆-alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵, NH-C(O)-NH-R²⁵, pričom R²⁵ je: H, Ci-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

alebo R^24a je NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je Ci_₆-alkyl alebo C₃.₆-cykloalkyl;

a R^24b je H alebo Ci_e-alkyl;

R³ je močovina vzorca NH-C(O)-NHR³² alebo karbamát vzorca NH-C(O)-OR³², kde R³² je C-i-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

D je nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec so 7 atómami uhlíka, obsahujúci jednu dvojitú väzbu v polohe 11,12 alebo 13,14;

uvedený reťazec D voliteľne obsahuje jeden heteroatóm, nezávisle vybraný z O, S, NH, N(Me), alebo N(Ac); a R⁴ je H alebo Ci.₆-alkyl.

Najvýhodnejšie zlúčeniny vzorca I sú tie, v ktorých R²¹ znamená metoxy a R²² je etoxy, alebo:

-16pričom R^24a je NH-(Ci^-alkyl), NH-C(O)-(Ci-4-alkyl); alebo NH-C(O)-O-(Ci^-alkyl), a D je nasýtené alebo obsahuje jednu cis dvojitú väzbu v polohe 13,14.

V rozsahu tohto vynálezu sú zahrnuté napokon všetky zlúčeniny vzorca I, ako sú uvedené v Tabuľkách 1 až 9.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu možno podávať perorálne, parenterálne alebo pomocou implantovaného zásobníka. Výhodné je perorálne podávanie alebo injekčné podávanie. Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať akékoľvek bežné, farmaceutický prípustné nosiče, pomocné látky alebo riedidlá. V niektorých prípadoch možno upravovať pH formulácie farmaceutický prípustnými kyselinami, zásadami alebo tlmivými látkami aby sa zvýšila stálosť formulovanej zlúčeniny alebo jej liekovej formy. Výraz parenterálne sa v tomto texte používa tak, že zahŕňa subkutánne, intrakutánne, intravenózne, intramuskulárne, intraartikulárne, intrasynoviálne, intrasternálne, intratekálne a intralézne injekčné alebo infúzne techniky.

Farmaceutické prostriedky môžu mať formu sterilných injektovateľných prípravkov, napríklad ako sterilné injektovateľné vodné alebo olejovité suspenzie. Tieto suspenzie možno formulovať technikami, ktoré sú v odbore známe s použitím rôznych dispergátorov alebo zmáčadiel (ako je napríklad Tween 80).

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu možno perorálne podávať v akejkoľvek orálne vhodnej dávkovej forme, vrátane, ale nie iba, kapsúl, tabliet, a vodných roztokov a suspenzií. V prípade tabliet na peroroálne podávanie sa použijú bežne používané nosiče vrátane laktózy a kukuričného škrobu. Typicky sa pridávajú aj lubrikačné látky, napríklad stearan horečnatý. V prípade kapsúl na perorálne podávanie sa využijú riedidlá vrátane laktózy a sušeného kukuričného škrobu. Keď sa perorálne podávajú suspenzie, kombinuje sa účinná zložka s emulgátorom a dispergátorom. Ak sa vyžaduje, možno pridať aj sladidlo a/alebo príchuť a/alebo farbiacu látku.

Iné vhodné riedidlá alebo nosiče v hore uvedených formuláciách a prostriedkoch možno nájsť v základných farmaceutických príručkách, napríklad v Remington's Pharmaceutical Science, 19. vydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 1995.

-17Na monoterapiu, na prevenciu a liečbu HCV sprostredkovaných ochorení sú vhodné dávkové hladiny opísaných, proteázu inhibujúcich zlúčenín medzi približne 0,01 a približne 100 mg.kg'¹ telesnej hmotnosti na deň, výhodne medzi približne 0,5 a 75 mg.kg'¹ telesnej hmotnosti na deň. Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu sa budú typicky podávať raz až päť razy za deň, alebo, alternatívne, vo forme neprerušovanej infúzie. Takéto podávania možno použiť ako v akútnej tak aj v chronickej terapii. Množstvo účinnej zložky, ktoré môže byť kombinované s materiálom nosiča na jednu dávkovú formu sa bude meniť v závislosti od liečeného hostiteľa a od jednotlivého spôsobu podávania. Typické prípravky budú obsahovať približne 5 % až 95 % účinnej zlúčeniny (hmotnostne). Výhodné sú prípravky obsahujúce od približne 20 % do 80 % účinnej zlúčeniny.

Ako je odborníkom v danej oblasti známe, môžu sa vyžadovať aj nižšie alebo vyššie dávky ako sa uvádzajú hore. Jednotlivá dávka a režimy pre každého jednotlivého pacienta budú závisieť od mnohých okolností, vrátane účinnosti jednotlivej použitej zlúčeniny, veku a telesnej hmotnosti pacienta, jeho celkového zdravotného stavu, pohlavia, diéty, času podávania, rýchlosti vylučovania, kombinácie liečiv, úpornosti a priebehu infekcie, pacientovej dispozície k infekcii a od rozhodnutia ošetrujúceho lekára. Liečba sa vo všeobecnosti začne malými dávkami, podstatne nižšími ako je optimálna dávka peptidu. Potom sa dávka po malých krokoch zvyšuje až sa v daných podmienkach dosiahne optimálny účinok. Vo všeobecnosti sa najviac vyžaduje, aby sa účinná zlúčenina podávala na takej úrovni koncentrácií, ktoré vo všeobecnosti poskytujú účinné protivírusové výsledky bez toho, aby mali nejaký škodlivý alebo nezdravý účinok.

Ak farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu obsahujú kombináciu zlúčeniny všeobecného vzorca I a jednej alebo viacerých ďalších terapeutických alebo profylaktických látok, potom uvedená zlúčenina aj uvedené ďalšie látky majú byť prítomné v dávkach medzi približne 10 a 100 %, výhodnejšie medzi 10 a 80 % dávky, normálne podávanej v monoterapeutickom režime.

Ak sa uvedené zlúčeniny alebo ich farmaceutický prípustné soli formulujú spolu s farmaceutický prípustným nosičom, výsledný prostriedok na inhibíciu HCV NS3 proteázy, alebo na liečbu alebo prevenciu HCV infekcie možno podávať cicavcom, napríklad človekovi in vivo. Liečebný účinok možno tiež dosiahnuť s

-18využitím zlúčenín podľa tohto vynálezu v kombinácii s látkami, ktoré zahŕňajú, ale nie sú na ďalej uvedené obmedzené, imunomodulujúce látky ako sú: α-, β- alebo γinterferóny; ďalšie protivírusové látky ako je ribavirín, amantadín; ďalšie inhibítory HCV NS3 proteázy; inhibítory ďalších cieľov v životnom cykle HCV ako je helikáza, polymeráza, metaloproteáza alebo interné ribozómové vstupné miesta (IRES); alebo ich kombinácie. Na prípravu jednotkovej dávkovej formy možno zlúčeniny podľa tohto vynálezu kombinovať aj s ďalšími látkami. Tieto ďalšie látky možno cicavcovi alternatívne podávať oddelene ako časť viacnásobnej dávkovej formy.

Ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu zahŕňa spôsoby inhibície HCV NS3 proteázovej aktivity u cicavcov podávaním zlúčeniny všeobecného vzorca I, pričom substituenty sú určené hore.

Vo výhodnom uskutočnení sú tieto spôsoby vhodné na zníženie HCV NS3 proteázovaj aktivity cicavcov. Ak farmaceutický prostriedok obsahuje ako účinnú zložku iba zlúčeninu podľa tohto vynálezu, tieto spôsoby môžu ďalej zahŕňať krok podávania látky, vybranej zo skupiny: protivírusová látka, inhibitor HCV NS3 proteázy; inhibitor ďalších cieľov v životnom cykle HCV ako je helikáza, polymeráza alebo metaloproteáza. Uvedené ďalšie látky možno cicavcovi podávať pred, súčasne s, alebo následne po podávaní farmaceutických prostriedkov podľa tohto vynálezu.

V alternatívnom výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sú uvedené spôsoby užitočné na inhibíciu vírusovej replikácie u cicavcov. Tieto spôsoby sú užitočné v liečbe alebo prevencii HCV ochorení. Ak farmaceutický prostriedok obsahuje ako účinnú zložku iba zlúčeninu podľa tohto vynálezu, môžu uvedené spôsoby zahŕňať krok podávania látky, vybranej zo skupiny: protivírusová látka, inhibitor HCV NS3 proteázy; inhibitor ďalších cieľov v životnom cykle HCV. Uvedené ďalšie látky možno cicavcovi podávať pred, súčasne s, alebo následne po podávaní farmaceutických prostriedkov podľa tohto vynálezu.

Uvedené zlúčeniny všeobecného vzorca I možno použiť tiež ako laboratórne činidlá. Pôvodca vynálezu prvý raz poskytol zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré sú vysoko účinné a špecifické voči HCV NS3 proteáze. Niektoré z uvedených zlúčenín možno vhodne použiť vo výskume na návrhy replikačných

-19pokusov, pri hodnotení pokusov na zvieratách a v štruktúrne-biologických štúdiách na ďalší rozvoj poznatkov o mechanizmoch HCV ochorení.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno použiť tiež na liečbu alebo prevenciu vírusovej kontaminácie materiálov a preto na znížení rizika vírusovej infekcie laboratórnych a zdravotníckych pracovníkov alebo pacientov, ktorí prichádzajú do styku s možnými infikovanými materiálmi (napríklad s krvou, tkanivom, chirurgickými nástrojmi a oblečením, laboratórnymi pomôckami a odevmi, so zariadeniami na odber krvi a transfúznymi prístrojmi a materiálmi).

Metodológia

Vo WO 00/09 543 a WO 00/09 558 sú zverejnené viaceré postupy, ktorými možno pripraviť acyklické medziprodukty zlúčenín všeobecného vzorca I.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa syntetizujú všeobecným postupom, znázorneným v reakčných schémach I, II a III (v ktorých PG sú vhodné ochranné skupiny); [vo všetkých uvádzaných schémach je D' určené ako D, ale je o 2 až 5 atómov kratšie].

Keď vynález zahŕňa zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom A je Nsubstituovaný amid, vinyl-ACCA alebo homo-alyl ACCA, (R¹) je viazané k príslušnému amínu pred spojením s P2. Toto spájanie je zrejmé odborníkom v tejto oblasti techniky. Odborníkom v tejto oblasti techniky je zrejmé, že uvedený amid (A) nie je chránený, ale nesie niektorý, hore určený, relevantný substituent R⁵.

Reakcia uzatvárania kruhu (makrocyklizácia) sa uskutoční alebo olefínovou metatézou (Schéma I) alebo, ak spojovník obsahuje dusíkový atóm, redukčnou amináciou (Schéma II) alebo vytvorením peptidovej väzby (Schéma III).

Podrobnosti o týchto spôsoboch prípravy sa uvádzajú v ďalšom texte.

A) Makrocyklizácia olefínovou metatézou

Schéma I

Z

OH

PG alebo R²

PG alebo R² _z PG alebo R² . .. Ν-Κζ^Ν·χ_χχ-^Α' _ pg' o h₂n^a· _pg/ g Λ r\.cooh

A' = chránená karboxylová kyselina alebo N-substituovaný amid J n = 0 alebo 2 ,R² r^s

N-O^n>—'^A

H

Αγ. ·- Αχ _r3/-%,_d/ nr'“''D

PG alebo R² (lb)

D = nasýtený (la)

D = nenasýtený οΠΔ _r3A^

Schéma I

Jestvuje niekoľko spôsobov uskutočnenia väzbovej postupnosti, čo je odborníkom v tejto oblasti techniky zrejmé. Vychádzajúc zo 4-(S)-hydroxyprolínu, substituent v polohe 4-hydroxy možno vložiť Mitsunobuho reakciou (ako sa opisuje v: Mitsunobu, Synthesis 1981, január, 1 až 28; Ráno a ďalší, Tet. Lett. 36, 3779 až 3792 (1994); Krchnak a ďalší, Tet. Lett. 36, 6193 až 6196 (1995)) pred alebo po makrocyklizácii. Uvedené zoskupenie možno alternatívne vytvoriť s použitím vyžadovaného 4-(/?)-hydroxy-substituovaného prolínu, ako je zverejnené vo všeobecných postupoch WO 00/09543 a WO 00/09558 (pozri v ďalšom texte na jednotlivé príklady týchto fragmentov).

Kroky A, B a C

V stručnosti, zoskupenia Ρ1, P2 a P3 možno pripojiť dobre známou technikou peptidovej väzby; táto technika je všeobecne opísaná vo WO 00/09543 a WO 00/09558.

-21 Krok D

Vytvorenie makrokruhu možno uskutočniť olefínovou metatézou s použitím katalyzátora na základe Ru ako to uvádza Miller S. J., Blackwell H. E., Grubs R. H., J. Am. Chem. Soc. 118, 9606 až 9614 (1996) (a); Kingsbury J. S., Harrity J. P. A., Bonitatebus P. J., Hoveyda A. H., J. Am. Chem. Soc. 121. 791 až 799 (1999) (b) a Huang J., Stevens E. D., Nolan S. P., Petersen J. L., J. Am. Chem. Soc. 121. 2674 až 2678 (1999) (c). Ďalej je zrejmé, že na uvedenú reakciu možno použiť katalyzátory, ktoré obsahujú aj iné prechodné kovy, napríklad molybdén.

ci*

PCy, (a)

Grubbsov katalyzátor

Horeydov katalyzátor

Krok E

Dvojitá väzba sa voliteľne redukuje bežnými spôsobmi hydrogenácie, čo je v danej oblasti techniky známe. Ak A' je chránená karboxylová kyselina, táto sa vhodným spôsobom príslušne zbavuje ochrannej skupiny.

B) Makrocyklizácia redukčnou amináciou (u spojovníkov obsahujúcich N)

Ak spojovník obsahuje atóm dusíka, makrocyklizácia sa dosiahne redukčnou amináciou, ako je znázornené v Schéme II; získajú sa inhibítory všeobecnej štruktúry II.

Schéma II

-22Α* = chránená karboxylová kyselina alebo N-substituovaný amid n = 1 až 5 m = 1 až 5

Krok A

Hydroboráciou dvojitej väzby postupom podľa Browna ( Brown H. C., Subba Rao B. C., J. Am. Chem. Soc. 81, 6434 až 6437 (1959)), nasledujúcou oxidáciou výsledného alkoholu (napríklad Dess-Martinovým spôsobom s jodistanom, J. Am. Chem. Soc. 113, 7277 až 7287 (1991)) sa získa príslušný aldehyd.

Krok B

Hydrogenácia v prítomnosti kyseliny vedie k odstráneniu ochrannej skupiny aminoskupiny a k následnej makrocyklizácii redukčnou amináciou. Jednotka P3, použitá v tejto syntéze sa ľahko získa z rôznych aminokyselín ako je lyzín, ornitín, glutamín (Hofmannovou reakciou: Berichte 14, 2725 (1881)) a ďalšie; tieto syntézne úpravy sú v danej oblasti techniky dobre známe.

Krok C

Sekundárna amínová skupina v spojovníku D (vytvorenom po kroku B) sa voliteľne alkyluje alkylhalogenidom alebo acetyluje chloridom alkyl- alebo arylkyseliny za vzniku inhibítora všeobecnej štruktúry II. Tieto spôsoby alkylácie alebo acetylácie sú v odbore známe. Ak A' je chránená karboxylová kyselina, táto sa príslušne zbavuje ochrannej skupiny.

C) Makrocyklizácia tvorbou laktámu

Je zrejmé, že uvedené makrocyklické zlúčeniny všeobecnej štruktúry I a II možno syntetizovať rôznymi spôsobmi. Napríklad P1 a P3 možno najprv spojiť spojovníkom D, potom viazať k P2 a makrocyklizačnou reakciou možno uskutočniť vznik laktámu dvomi možnými reakčnými cestami, čo je v danej oblasti techniky známe a ako je znázornené Schémou III.

-23Schéma III

Syntéza P1

Na syntézu inhibítorov všeobecnej štruktúry I a II sú potrebné rovnaké P1 fragmety:

a) vinyl ACCA; syntéza a delenie tohto fragmentu sa opisuje v WO 00/09543 a WO 00/09558, alebo

b) homoalyl ACCA (Príklad 1, zlúčenina 1f).

Syntéza P2

Niektoré z fragmentov, použitých na syntézu zlúčenín vzorca I sa opisujú vo WO 00/09543 a WO 00/09558.

Ďalšie fragmenty P2 sa syntetizujú nasledovne:

a) Syntéza 2-Het-4-hydroxy-7-metoxychinolínového derivátu r ’

-24i) Spôsob z príslušnej Het karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca IVb

Schéma IV

Syntéza sa uskutoční upraveným postupom podľa Li a ďalších, J. Med. Chem. 34, 3400 až 3407 (1994). Medziprodukt všeobecného vzorca IVa, v ktorom R²¹ = OMe (Príklad 7, zlúčenina 7b) sa pripraví spôsobom, ktorý opísal Brown a ďalší, J. Med. Chem. 32, 807 až 826 (1989).

Krok A

Medziprodukt všeobecného vzorca IVa sa viaže na heterocyklické karboxylové kyseliny všeobecného vzorca IVb v zásaditom prostredí v prítomnosti POCI3 na aktiváciu karboxylovej skupiny. Na prípravu inhibítorov týmto spôsobom sa môžu použiť rôzne karboxylové kyseliny všeobecného vzorca IVb; tieto kyseliny sú alebo komerčne dostupné, alebo syntetizované ako sa uvádza v Schémach V, VI a VII, alebo sú jednotlivo syntetizované spôsobmi, opísanými v jednotlivých Príkladoch.

Krok B

Uzatváranie kruhu s následnou dehydratáciou sa docieli v zásaditých podmienkach reakcie a získajú sa chinoiíny všeobecného vzorca IVd.

i.a) Syntéza 2-Het-karboxylových kyselín všeobecného vzorca IVb

Syntéza 2-(substituovaného)-amino-4-karboxy-aminotiazolového derivátu (Vc)

Použil sa spôsob, ktorý opísala Berhikina a ďalší Chem. Heterocycl. Compd. (angl. preklad, 4, 427 až 433 (1991).

Schéma V

H,N s

o

Br zahrievanie (Va) (Vb)

Všeobecnou metodológiou syntézy, znázornenej v Schéme V, s použitím tiomočovín všeobecného vzorca Va s rôznymi alkýlovými substituentami (R²⁵ = alkylová skupina) a 3-brómpyrohroznovou kyselinou sa pripravili rôzne 2-alkylaminotiazolyl-4-karboxylové kyseliny, zlúčeniny všeobecného vzorca Vc. Tento typ kondenzačnej reakcie je v danej oblasti techniky známy. Fragment P2, obsahujúci 2-amino-substituované tiazolové deriváty sa syntetizuje z príslušných 2karboxylových derivátov ako je znázornené v Schéme VI spôsobom, ktorý opísal Unangst P. C., Connor D. T., J. Heterocyc. Chem. 29(5), 1097 až 1100 (1992).

Schéma VI

HN(R“) (Via) (Vlb)

Príklady tohto spôsobu prípravy sú zverejnené v WO 00/09543 a WO 00/09558.

I

Syntéza 2-karboxy-4-substituovaného aminotiazolového derivátu všeobecného vzorca VI Id

Všeobecnou syntéznou metodológiou, znázornenou v Schéme Vil sa pripravili rôzne 4-alkyltiazolyl-2-karboxylové kyseliny, zlúčeniny všeobecného vzorca Vlld.

-26Schéma VII

Tento spôsob opísal Janusz a ďalší, J. Med. Chem. 41, 3515 až 3529 (1998) a použil sa v nasledujúcej úprave: etyltiooxamát (Vila) reaguje s rôznymi β-brómketónmi všeobecného vzorca VIIb (R²⁶ = alkylová skupina) za vzniku tiazolylkarboxylových kyselín všeobecného vzorca Vlld. Tento typ kondenzačnej reakcie je v danej oblasti techniky známy.

Syntéza 2-karboxy-4-(substituovaného) amidazolového derivátu (VIIIb)

Všeobecnou syntéznou metodológiou, znázornenou v Schéme VIII sa pripravili rôzne alkylimidazolyl-2-karboxylové kyseliny, zlúčeniny všeobecného vzorca Vlllb.

Schéma VIII

( Vllla)

OH (Vlllb)

Tento spôsob opísal Baird a ďalší, J. Am. Chem. Soc. 118, 6141 až 6146 (1996): použil sa alkylimidazol, ktorý sa deprotónoval silnou zásadou (napríklad nBuLi) a potom reagoval s CO₂ za vzniku karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca Vlllb. Tento typ kondenzačnej reakcie je v danej oblasti techniky známy.

b) Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(imidazolyl alebo pyrazolyl)chinolínov

4-Hydroxy-7-R²¹ chinolíny, ktoré majú imidazolylové alebo pyrazolylové skupiny na C2 sa všeobecne pripravia metodológiou, naznačenou v Schéme IX.

R²² = imidazolové alebo pyrazolové deriváty

Syntéza kľúčového medziproduktu, (v ktorom R²¹ = OMe) 4-benzyloxy-2chlór-7-metoxychinolínu všeobecného vzorca IXa sa podrobne opisuje v Príklade 6 (zlúčenina 6e).

Krok A

Pri vysokých teplotách na náhradu 2-chlórovej skupiny zlúčeniny všeobecného vzorca IXa možno použiť rôzne imidazoly, alkylsubstituované imidazoly, pyrazoly alebo alkylsubstituované pyrazoly a získajú sa zlúčeniny všeobecného vzorca IXb.

Krok B

Po odstránení benzylovej ochrannej skupiny zo 4-hydroxyskupiny chinolínu bežným hydrogenačným spôsobom sa získajú chinolínové deriváty všeobecného vzorca IXc.

Syntéza P3

Syntetizovali sa rôzne P3 fragmenty, obsahujúce príslušné D spojovníkové rozšírenie na makrocyklizáciu olefínovou metatézou. Všeobecne, P3 jednotky obsahujúce terminálny olefín na metatézu sa syntetizujú podľa všeobecných schém, naznačených nižšie (Schémy X, XI a XII).

-28Syntéza spojovníkov typu A

Použili sa všeobecné postupy na prípravu spojovníkov, na báze uhlíkových reťazcoch (bez heteroatómov) (Schéma X)

Schéma X

NHBoc

Syntéza sa uskutočnila postupom, ktorý opisuje Evans a ďalší v J. Am. Chem. Soc. 112. 4011 až 4030 (1991).

Východiskové karboxylové kyseliny všeobecného vzorca Xa sú komerčne dostupné alebo sa pripravia z literatúry známymi spôsobmi, ktoré sú odborníkom v tejto oblasti techniky bežné.

Krok A

Karboxylová kyselina všeobecného vzorca Xa sa aktivuje pivaloylchloridom a potom sa nechá reagovať s aniónom Evansovho chirálneho činidla 4(S)-4-(fenylmetyl)-2-oxazolidinónom dobre známym chemickým postupom (Prehľad v práci D. J. Ager a ďalší, Aldrichimica Acta 30, 3 až 11 (1997) a v nej uvedené odkazy) za vzniku zlúčenín všeobecného vzorca Xb.

-29KrokB

Známa je stereoselektívna α-azidácia s trizylazidom chirálnych imidenolátov, aké možno vytvoriť zo zlúčenín všeobecného vzorca Xb v prítomnosti zásady ako je KHMDS (Prehľad v práci D. J. Ager a ďalší, Aldrichimica Acta 30, 3 až 11 (1997) a v nej uvedené odkazy).

Krok C

Redukcia α-azidu, katalyzovaná pomocou SnCb, následná ochrana vytvoreného amínu formou jeho ferc-butylkarbamátu poskytuje medziprodukty všeobecného vzorca Xc. Tieto reakcie sú v danej oblasti techniky tiež známe.

Krok D

Nakoniec sa chirálne zoskupenie v zásaditom prostredí (ako je H2O2 s LiOH) hydrolyzuje za vzniku spojovníkov typu aminokyselín všeobecného vzorca Xe.

P3 skupiny s rovnakým všeobecným vzorcom Xe sa alternatívne syntetizujú spôsobom, ktorý opísal Burk M. J. a ďalší, J. Am. Chem. Soc. 120, 657 až 663 (1998) a ktorý je naznačený v Schéme XI. Tieto zlúčeniny môžu mať rôzny počet metylénových jednotiek (-CH2-) reťazca spojovníka (m = 1 až 5) a rôzne substituované alkylové skupiny v R⁴, ale neobsahujú heteroatóm.

Schéma XI

COOEt

A.

COOEt

EtOOC NHAc (XI a)

HOOC NHAc (Xlb)

R'

H (Xlc)

B.

R* NHAc

COOEt (xid) m=1-5, R⁴ = H alebo alkyl

C.

-30Schéma XI - pokračovanie

R⁴ NHBoc

COOH

R⁴ NHAc

COOEt (Xle) (Xe)

Krok A

Monokyselina všeobecného vzorca Xlb sa pripraví z komerčne dostupného dietyl-2-acetamido-malonátu bežnou hydrolýzou esteru v zásaditom prostredí.

Krok B

Kondenzácia Knoevenagelovho typu medzi aldehydom všeobecného vzorca Xlc a zlúčeninou všeobecného vzorca Xlb v prítomnosti zásady, ako je pyridín a acetanhydridom vedie k vzniku énamidového medziproduktu Xld so Zstereochémiou v okolí novo vytvorenej dvojitej väzby.

Krok C

Polohovo selektívna a enantioselektívna kytalytická hydrogenácia uvedeného énamidového medziproduktu všeobecného vzorca Xld na aminokyselinový medziprodukt všeobecného vzorca Xle sa dosiahne použitím postupu podľa Búrka.

Krok D

Potom sa odstráni ochrana dusíkového atómu z acetamidového derivátu všeobecného vzorca Xle pridaním ŕerc-butylkarbamátu miesto acetátovej skupiny a etylester sa hydrolyzuje v bežných zásaditých podmienkach, čím sa získa skupina P3 všeobecného vzorca Xlf.

Syntéza spojovníkov typu B

Všeobecná štruktúra spojovníkov typu B

NHBoc

I X = O alebo S

COOH _R ¹ = _H alebo CH₃

R’ R² = H alebo CH₃

-31 Táto všeobecne naznačená syntéza sa použije na prípravu spojovníkov obsahujúcich kyslík alebo síru.

Schéma XII

(^Xlld) (Xlle) (»11) (»lg)

R¹ = H alebo CH₃

R² = H alebo CH3, ale nie R¹ = R² = CH3.

Krok A

Vhodne chránené aminokyseliny ako je metylester Boc-(L)-serínu, metylester Boc-(L)-treonínu alebo metylester Boc-(L)-alotreonínu sa alkylujú alyljodidom v prítomnosti Ag₂O za vzniku metylesteru všeobecného vzorca XIIb.

Krok B

Hydrolýzou metylesteru v bežných zásaditých podmienkach sa získajú spojovníky éterového typu všeobecného vzorca Xllc (X = kyslík).

Krok C

Sírny analóg sa pripraví z rovnakých východiskových aminokyselín všeobecného vzorca XIla (vhodne chránených ako je opísané vyššie) a ich hydroxylová skupina sa premení na ľahko vymeniteľnú skupinu (ako je tosilátový medziprodukt všeobecného vzorca XI Id) spôsobom, ktorý je v danej oblasti techniky známy.

-32Krok D

Tosylová skupina sa následne nahradí aniónom tioacetátu, čo inverziou chirálneho stredu na β-uhlíku vedie k vzniku tioesterového medziproduktu všeobecného vzorca XIle.

Krok E

Hydrolýza tioesterovej skupiny v mierne zásaditom prostredí poskytuje voľný tiol všeobecného vzorca XI If.

Krok F

Alkylácia tiolovej skupiny sa ľahko uskutoční v zásaditom prostredí alyljodidom.

Krok G

Sulfidový analóg všeobecného vzorca Xllc ( X = síra) sa získa po hydrolýze metylesteru; hyrolýza sa uskutoční bežným spôsobom.

Syntéza fragmentu R3

Príklady syntéz fragmentov, v ktorých R³ je NH-R³¹ sa opisujú v WO 00/09542.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález sa podrobnejšie objasňuje v nasledujúcich Príkladoch, ktoré ale neobmedzujú rozsah vynálezu. Iné jednotlivé syntézne cesty alebo delenie možno nájsť v WO 00/09543 a WO 00/09558.

Teploty sa udávajú v stupňoch Celzia. Pokiaľ nie je uvedené inak, percentuálne koncentrácie roztokov sú vyjadrované pomerom hmotnosti k objemu, vzájomné pomery roztokov sú udávané v pomeroch objem k objemu. Spektrá jadrovej magnetickej rezonancie (NMR) sa zaznamenávali spektrometrom Bruker 400 MHz; chemické posuny (δ) sa vyjadrujú v častiach na milión častí (ppm) a pokiaľ sa neuvádza inak, sú vzťahované na interné deuterované rozpúšťadlo. Pokiaľ

-33nie je uvedené inak, NMR spektrá všetkých konečných zlúčenín (inhibitorov) sa zaznamenali z ich TFA solí v DMSO-d6. Stĺpcová chromatografia sa uskutočnila na géli kyseliny kremičitej (SiO₂) rýchlou chromatografickou technikou podľa Stilla (Still W. C., J. Org. Chem. 43, 2923 (1978)).

V Príkladoch sa používajú skratky vrátane Bn: benzyl; Boe: ŕerc-butyloxykarbonyl [Me3C0C(0)]; BSA: bovinný sérový albumín; Cbz: benzyloxykarbonyl; CHAPS: 3-[(3-cholamidopropyl)-dimetylamónio]-1-propánsulfonát; DBU: 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-én; CH2CI2 = DCM: metylénchlorid, dichlórmetán; DEAD: dietylazodikarboxylát; DIAD: diizopropylazodikarboxylát; DIPEA: diizopropyletylamín; DMAP: dimetylaminopyridín; DCC: 1,3-dicyklohexylkarbodiimid; DME: 1,2-di-metyloxyetán; DME: dimetylformamid; DMSO: dimetylsulfoxid; DTT: ditiotreitol alebo treo1,4-dimerkapto-2,3-butándiol; DPPA: difenylfosforylazid; EDTA: etyléndiamíntetraoctová kyselina; Et: etyl; EtOH: etanol; EtOAc: octan etylnatý; Et₂O: dietyléter; ESMS: hmotnostná spektrometria s elektrorozprašovaním; HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametylurónium hexafluórfosfát; HPLC: vysoko účinná kvapalinová chromatografia; MS: hmotnostná spektrometria; MALDI-TOF: laserom podporovaná disorpčná ionizácia matrice - čas letu [Matrix Assisted Laser Disorption lonization - Time of Flight]; FAB: bombardovanie rýchlymi atómami [Fast Atóm Bombardment]; LAH: hydrid hlinitolítny; Me: metyl; MeOH metanol; MES: (2[/\/-morfolino]etánsulfónová kyselina); NaHMDS: bis(trimetylsilyl)amid, sodná soľ; NMM: /V-metylmorfolín; NMMO: /V-metylmorfolínoxid; NMP: /V-metylpyrolidín; Pr: propyl; Suke: 3-karboxypropanoyl; PNA: 4-nitrofenylamino alebo p-nitroanilid; TBAF: tetra-n-butylamóniumfluorid; TBME: terc-butyl-metyléter; terc-BuOK: terciárny butoxid draslíka; TBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametylurónium tetrafluórborát; TCEP: tris(2-karboxyetyl)fosfín hydrochlorid; TFA: trifluóroctová kyselina; THF: tetrahydrofurán; TIS: triizopropylsilán; TLC: chromatogafia na tenkej vrstve; TMSE: trimetylsilyletyl; Tris/HCI: tris(hydroxymetyl)aminometán hydrochlorid.

Skupiny P1

-34Príkiad 1

Syntéza ŕerc-butyl-(1f?,2R)/(1S,2S)-1-amino-2-homoalylcyklopropylkarboxylátu (zlúčenina 1f)

Krok A

Do suspenzie benzyltrietylamóniumchloridu (5,08 g, 22,3 mmolov) v 50%nom vodnom roztoku NaOH (50 ml) sa postupne pridali 1,2-dibróm-5-hexén (1b, 8,10 g, 33,46 mmolov) a di-ŕerc-butylmalonát (1a, 4,82 g, 2,30 mmolov). Zmes sa 16 hodín intenzívne miešala pri teplote miestnosti; potom sa zriedila vodou a extrahovala dichlómetánom (3 x 50 ml). Organická vrstva sa ďalej premyla vodou (2 x 50 ml), roztokom soli/vodou (2/1; 2 x 50 ml), sušila nad bezvodým síranom horečnatým a odparila. Surový zvyšok sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s použitím 3 až 5%-ného octanu etylnatého v hexáne ako elučného činidla; získala sa zlúčenina 1c (2,48 g, 38 % teoretického výťažku).

¹H NMR (400 MHz, CDCI₃): δ 1,19 (bd, J = 7,9 Hz, 2H); 1,25-1,33 (m, 1H); 1,46 (s, 9H); 1,48 (s, 9H), 1,47-1,60 (m, 1H), 1,75-1,82 (m, 1H), 2,14-2,22 (m, 2H), 4,935,50 (m, 2H), 4,96 (dm, J = 10,2 Hz, 1 H), 5,18 (dm, J = 17,2 Hz, 1H).

ES (+) MS m/z 297 (M+H)⁺.

-35KrokB

Do suspenzie terc-butoxidu draslíka (5,75 g, 51,25 mmolov) v bezvodom dietyléteri (150 ml) sa pri 0 °C pridala voda (203 μΙ, 11,27 mmolov) a reakčná zmes sa 10 minút miešala pri teplote 0 °C. Pridal sa éterový roztok zlúčeniny 1c (2,48 g v 10 ml dietyléteru, 10,25 mmolov) a zmes sa 5 hodín miešala pri teplote miestnosti. Zmes sa potom zriedila ľadovou vodou a extrahovala dietyléterom (3 x 200 ml). Vodná vrstva sa okyslila na pH 3,5 až 4,0 10%-ným vodným roztokom kyseliny citrónovej, vychladenej v zmesi ľadu a vody a reextrahovala octanom etylnatým (3 x 200 ml). Vrstva EtOAc sa premyla vodou (2 x 100 ml), roztokom soli (100 ml), sušila nad bezvodým síranom horečnatým a odparila, čím sa získala zlúčenina 1d s 85%-ným výťažkom s ohľadom na spätne získaný východiskový materiál.

¹H NMR (CDCI_3i 400 MHz): δ 1,51 (s, 9H), 1,64-1,68 (m, 1H), 1,68-1,75 (m, 1H), 1,77-1,88 (m, 1H), 1,96-2,01 (m, 1H), 2,03-2,22 (m, 3H), 5,01 (dm, J = 6,4 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 14,9 Hz, 1H), 5,72-5,83 (m, 1H).

ES (+) MS: m/z 241 (M+H)⁺.

Krok C

Do roztoku kyseliny 1d v bezvodom benzéne (1,14 g v 25 ml benzénu, 4,74 mmolu) sa pridal Et₃N (800 μΙ, 5,68 mmolov), potom sa pridal difenylfosforylazid (1,13 ml, 5,21 mmolu) a zmes sa 3,5 hodiny zahrievala na teplotu varu pod spätným chladičom. Potom sa pridal trimetylsilyletanol (1,36 ml, 9,48 mmolov) a ďalšie 4 hodiny sa pokračovalo v miešaní za varu pod spätným chladičom. Zmes sa potom ochladila na teplotu miestnosti, odparila na polovicu pôvodného objemu, zriedila dietyléterom (30 ml) a premyla 5%-ným vodným roztokom NaHCO3 (2 x 30 ml), roztokom soli (50 ml), sušila nad MgSO4 a odparila. Olejovitý zvyšok sa chromatografoval na silikagéli s použitím 10%-ného EtOAC v hexáne ako elučného činidla, čím sa získala čistá zlúčenina 1e (1,49 g, 88 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 0,03 (s, 9H), 0,91-0,99 (m, 2H), 1,18 -1,29 (m, 2H), 1,45 (bs, 11H), 1,56-1,72 (m, 2H), 2,02-2,18 (m, 2H), 4,12 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 4,93 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 4,98 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,07 (bs, 1H), 5,71-5,83 (m, 1H).

-36KrokD

Do roztoku cyklopropylového derivátu 1e (1,19 g, 3,35 mmolov, v 30 ml THF) sa pridal ŕerc-Bu₄NF (6,7 ml 1M roztoku v THF, 6,7 mmolov) a zmes sa najprv 16 hodín miešala pri teplote miestnosti a potom 15 minút zahrievala na teplotu varu pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo sa starostlivo odparilo pri zníženom tlaku (pre vysokú prchavosť voľného amínu 1f treba odparovaniu venovať vysokú pozornosť). Surový odparok sa znova rozpustil v EtOAc (100 ml), roztok sa premyl vodou (2 x 50 ml), roztokom soli (50 ml), sušil nad MgSO₄ a rozpúšťadlo sa opäť starostlivo odparilo. Surový produkt 1f (ako zmes dvoch enantiomérov 1f a 1Γ) sa použil na reakciu s P2 prolínovým derivátom bez ďalšieho čistenia. Izolácia Ρ1P2 fragmentu s vyžadovanou stereochémiou P1 sa v tomto kroku ľahko uskutoční použitím rýchlej chromatografie (Príklad 21, fragment 21b).

Skupiny P2

Príklad 2

Syntéza Boc-4(R)-[(7-metoxy-4-chinolinyl)oxy]prolínu (zlúčenina 2c)

(2c)

4-Hydroxy-7-metoxychinolín (2b) sa pripravil spôsobom, ktorý opísal Chun M. W., Olmstead K. K., Choi Y. S., Lee C. O., Lee C. K., Kim J. H., J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 7, 789 (1997). Roztok zlúčeniny 2b (1,88 g, 10,73 mmolov) a DEAD (3,4 ml, 21,46 mmolov) v bezvodom THF pod ochrannou atmosférou dusíka sa pridal do miešaného roztoku chráneného c/s-hydroxyprolínu 2a (2,63 g, 10,73 mmolov) a trifenylfosfínu (5,63 g, 21,46 mmolov) v bezvodom THF (160 ml) pri 0 °C. Po pridaní sa reakčná zmes nechala zahriať na teplotu miestnosti a 14 hodín sa miešala pri tejto teplote. Potom sa THF odparil a čistý produkt 2c sa izoloval rýchlou

-37stĺpcovou chromatografiou s použitím 5%-ného roztoku MeOH v EtOAc ako elučného činidla. Získalo sa 1,5 g produktu (35 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,44 (s, 9H), 1,65 (bs, 1H), 2,34-2,43 (m, 1H), 2,632,76 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,75-3,85 a 3,89-3,99 (2m, 1H, 2 rotaméry), 3,95 (s, 3H), 4,51 a 4,60 (2t, J = 8 Hz, 1H, 2 rotaméry), 5,15 (bs, 1H), 6,53-6,59 (m, 1H), 7,12-7,18 (dd, J = 8,9 a 2,2 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,03 (bd, J = 9,2 Hz, 1H),8,65(bd, J =5,1 Hz, 1H).

Príklad 3

Syntéza 2-etoxy-4-hydroxy-7-metoxy-chinolínu (zlúčenina 3c)

(3a) (3b) (3cf^H

Syntéza metyl-p-metoxyantranylátu 3a sa uskutočnila tak, ako ju opisuje Katz a ďalší, J. Org. Chem. 18,1380 až 1400 (1953).

Syntéza chinolínového derivátu 3c všeobecne je úpravou postupu, ktorý opísal Baccar a ďalší, Indián Journal of Chemistry, Sat. B, 330 až 332 (1995).

Krok A

Metylester kyseliny p-metoxyantranilovej 3a (3,069 g, 16,96 mmolov) sa rozpustil v trietylortoacetáte (4,7 ml, 25,4 mmolov), potom sa pridal roztok bezvodého HCI (4M v dioxáne, 50 μΙ, 0,6 mmolov). Výsledná zmes sa 19 hodín zahrievala na teplotu varu pod spätným chladičom. Prchavé podiely sa potom odparili s použitím vákua, čím sa získal produkt 3b (4,92 g, olejovitá látka jantárovej farby, kvantitatívny výťažok), ktorý sa použil bez úpravy v ďalšom reakčnom kroku.

Krok B

Do roztoku substrátu 3b (predpodkladaných 16,96 mmolov) v THF (34 ml) pri -78 °C v ochrannej atmosfére dusíka sa pridal LiHMDS (1M roztok v THF, 22 ml, 1,3 ekvivalentu). Krátko po pridaní sa chladiaci kúpeľ odložil a zmes sa nechala zohriať

-38na teplotu miestnosti. Po hodine miešania pri teplote miestnosti sa pridala ďalšia časť LiHMDS (16 ml). Výsledná zmes sa miešala až do úplného spotrebovania východiskového materiálu (1 hodina) podľa TLC (100% EtOAc, imidát Rf = 0,7, produkt Rf = 0,2). Potom sa pridal HCI (4M roztok v dioxáne, 10 ml) a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Výsledná pastovitá látka sa rozotierala v zmesi EtOAc (10 ml) a vodného roztoku NaH₂PO₄ (1M roztok, 10 ml) a vystavila účinku ultrazvuku. Vytvoril sa značný podiel precipitátu, ktorý sa oddelil filtráciou, premyl vodou a sušil, čím sa získal Vyžadovaný produkt 3c vo forme béžovej tuhej látky (3,117 g, 84 % teoretického výťažku po 2 krokoch, >99 % čistota podľa HPLC).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ (ppm): 7,88 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,98 (br s, 1H), 6,89 (br d, J = 8,6 Hz, 1 H), 5,94 (br s, 1 H), 4,30 (br s, 2H), 3,84 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H).

Príklad 4

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(3-metyl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)chinolínu (zlúčenina 4d)

Krok A

Do roztoku 2-karbometoxy-4-hydroxy-7-metoxychinolínu 4a (jeho príprava sa opisuje v WO 00/09543 a WO 00/09558) (1 g, 4,29 mmolov) v DMF (10 ml) v ochrannej atmosfére dusíka sa pridal NaH (60%-ný v minerálnom oleji, 190 mg, 4,98 mmolov). Výsledná zmes sa hodinu miešala pri teplote miestnosti. Potom sa

-39po kvapkách pridal MEM chlorid (455 μΙ, 4,98 mmolov) a výsledná zmes sa 19,5 hodín miešala pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa potom zriedila EtOAc (100 ml), premyla vodou (50 ml), roztokom soli (50 ml), sušila nad MgSO₄, a skoncentrovala vo vákuu, čím sa získal surový reakčný produkt (1,37 g). Tento sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou a získal sa produkt 4b (1,04 g, 75 % teoretického výťažku) vo forme bezfarebnej olejovitej látky.

Krok B

Do zmesi čerstvo aktivovaného molekulového sita 4 A (500 mg) a acetamidoxímu (248 mg, 3,35 mmolu) sa pridal THF (3 ml). Výsledná zmes sa 15 minút miešala v ochrannej atmosfére dusíka pri teplote okolia. Potom sa po častiach pridal NaH (60%-ný v minerálnom oleji, 124 mg, 3,24 mmolu). Výsledná suspenzia sa hodinu miešala pri teplote miestnosti, potom sa pridal ester 4b (500 mg, 1,56 mmolu), rozpustený v THF (5 ml). Výsledná zmes sa hodinu zahrievala na teplotu varu pod spätným chladičom, filtrovala cez celit, prepláchla EtOAc (3 dávky po 20 ml) a skoncentrovala vo vákuu. Výsledná surová zmes sa čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou (100%-ný EtOAc), čím sa získal produkt 4c (352 mg, 65% teoretického výťažku) vo forme bielej tuhej látky.

Krok C

Do roztoku MEM éteru 4c (170 mg, 0,493 mmolu) v THF (4 I) sa pridal vodný roztok HCI (1M roztok, 1 ml). Výsledná zmes sa hodinu miešala pri teplote okolia a potom zriedila vodným roztokom Na2HPO₄ (1M roztok, 50 ml). Vytvorený tuhý podiel sa odfiltroval, rozotieral s EtOAc, filtroval a sušil, čím sa získal vyžadovaný produkt 4d (90 mg, 71% teoretického výťažku) vo forme bielej tuhej látky.

MS (ES+) 258 (M+1), (ES-) 256 (M-1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,38 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 7,06 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (br s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H).

Príklad 5

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(5-metyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)chinolínu (zlúčenina 5e)

Β.

(5 c) R = ΜΕΜ (5d)R = H

(5b)

Krok A

Do substrátu 4b (465 mg, 1,45 mmolu) v etanole (5 ml) sa pridal bezvodý hydrazin (57 μΙ, 1,8 mmolu). Roztok sa 4 hodiny zahrieval pod spätným chladičom na teplotu varu; potom sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získal produkt 5a (704 mg, kvantitatívny výťažok surového produktu) vo forme žltej tuhej látky, ktorá sa použila v ďalšom reakčnom kroku.

Krok B

Zlúčenina 5a (predpokladaných 1,45 mmolu) v trietylortoacetáte (5 ml) sa v ochrannej atmosfére dusíka zahrievala na 100 až 110 °C. Výsledná zmes sa potom zriedila EtOAc (100 ml), premyla vodným nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (50 ml), roztokom soli (50 ml), sušila s MgSO4, skoncentrovala vo vákuu a čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou (100 % EtOAc). Získala sa zlúčenina 5b (359 mg, 61% teoretického výťažku pre dva reakčné kroky) vo forme žltej olejovitej látky.

MS(ES+) 392 (m+1), (ES-) 390 (m-1).

Krok C

Zlúčenina 5b (333 mg, 0,852 mmolu) sa vo vysokom vákuu 8,5 hodiny zahrievala na 140 °C a potom čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou (100 % r r

-41 EtOAc); získala sa zmes zlúčenín 5b (116 mg, 35 % teoretického výťažku) a 5c (138 mg, 72 % korigovaného teoretického výťažku, R_f 0,3). Do roztoku zlúčeniny 5c (138 mg, 0,4 mmólu) v THF (4 ml) sa pridal vodný roztok HCI (c_Hci = 1 mol.dm'³, 1 ml) a výsledná zmes sa miešala až do ukončenia reakcie (30 minút). THF sa odparil vo vákuu a pridal sa vodný roztok NaH2PO4 (CNaH2PO4 = 1 mol.dm'³ 2 ml). Vznikla suspenzia, ktorá sa vystavila účinku ultrazvuku, filtrovala a tuhý podiel sa sušil vo vysokom vákuu; získal sa vyžadovaný produkt 5d (75 mg, 73 % teoretického výťažku) vo forme béžovej tuhej látky.

MS(ES+) 258 (m+1), (ES-) 256 (m-1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (široký, d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (široký, s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H).

Príklad 6

Syntéza 4-benzyloxy-2-(chlór)-7-metoxychinolínu (zlúčenina 6e)

Krok A

Komerčne dostupný mete-anizidín (25 g, 0,20 molu) sa rozpustil v dioxáne (80 ml) a roztok sa ochladil na 0 °C a pridal sa bezvodý HCI (chci = 1 mol.dm'³ v dioxáne, 75 ml, 0,30 molu). Potom sa pridal Et₂O (500 ml) a zmes sa hodinu miešala. Vylúčená béžová tuhá látka sa potom oddelila filtráciou a sušila vo vákuu; získala sa soľ 6a (31,88 g, 98 % teoretického výťažku).

-42KrokB

Do pripravenej soli 6a sa pridal etylkyanoacetát (21,3 ml, 0,20 molu) a zmes sa zahrievala v banke s destilačnou hlavou a predlohou na 280 až 300 °C. Vznikajúci etanol sa zhromažďoval v predlohe a jeho množstvo umožňovalo monitorovať priebeh reakcie. Keď sa nazhromaždilo 9 ml etanolu (teoretické množstvo 11,7 ml) zmes sa prestala ohrievať a reakčná zmes sa ochladila na teplotu miestnosti, zriedila vodou (200 ml)-EtAOc (200 ml) a za miešania sa pridal vodný roztok NaH₂PO4 (300 ml). Zmes sa ďalej hodinu miešala, filtrovala a podiel na filtri sa sušil, čím sa získal produkt 6b (19,06 g, 50 % teoretického výťažku v čistote 84,5 %) vo forme žltej tuhej látky, ktorá sa bez úpravy použila v ďalšom reakčnom kroku.

Krok C

Do NaH (60 % v minerálnom oleji, 2,78 g, 115,6 mmólu) sa pri 0 °C pridala zlúčenina 6b (11,0 g, 57,8 mmolov) v DMF (100 ml). Ľadový kúpeľ sa potom odstránil a zmes sa hodinu miešala pri teplote okolia. Potom sa pridal benzylbromid (7,6 ml, 63,6 mmólu) a reakčná zmes sa 16 hodín miešala. Roztok sa potom zriedil EtOAc (220 ml) - hexánom (220 ml) a vytvorená tuhá látka sa odfiltrovala, rozotierala vo vodnom nasýtenom roztoku NaHCO₃ (110 ml), premyla vodou, hexánom-EtOAc (1:1,100 ml) a sušila vo vysokom vákuu. Získal sa produkt 6c (5,6 g, 35 % teoretického výťažku v čistote 91 %) vo forme žltej tuhej látky. K zlúčenine 6c (2,67 g, 8,52 mmolov) v kyseline octovej (21 ml) sa pridal /zo-amylnitrit (3,8 ml, 28,6 mmólu) a výsledná zmes sa miešala pri teplote okolia a monitorovala pomocou HPLC. Po dvoch hodinách sa pridal ďalší podiel /zo-amylnitritu (1,3 ml, 9,52 mmólu) a v miešaní zmesi sa pokračovalo 90 hodín (HPLC 81 % produktu, 3 % substrátu). Do suspenzie sa potom pridala voda (100 ml) a suspenzia sa filtrovala. Oddelený hnedý tuhý podiel sa sušil vo vysokom vákuu, čím sa získal produkt 6d (2,35 g, 72 % teoretického výťažku v čistote 92 %).

Krok D

K zlúčenine 6d (1,5 g, 4,39mmolu) sa pridal oxychlorid fosforečný (13 ml, 141 mmolov) a výsledná zmes sa hodinu zahrievala na teplotu varu pod spätným

-43chladičom; výsledná zmes sa potom zriedila EtOAc (150 ml) a reakcia sa zastavila pri 0 °C pomalým pridávaním vodného roztoku NaOH (ον₃οη = 1 mol.dm'³, 150 ml) až sa pH upravilo na hodnotu 9. Oddelili sa dve vrstvy, organická vrstva sa sušila bezvodým síranom horečnatým a skoncentrovala vo vákuu, čím sa získala hnedá tuhá látka, ktorá sa čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou (15%-ný AtOAc v hexáne). Získaný produkt 6e (819 mg, 62 % teoretického výťažku v čistote >99 %) bola žltá tuhá látka.

¹H NMR (400'MHz, CDCl₃) δ (ppm): 8,07 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50 - 7,40 (m, 5H), 7,29 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 5,26 (s, 2H), 3,92 (s, 3H).

Príklad 7

Syntéza 4-hydroxy-2-(1-imidazolyl)-7-metoxychinolínu (zlúčenina 7b);

4-hydroxy-2-(4-metyl-1 -imidazolyl)-7-metoxychinolínu (zlúčenina 7d);

4-hydroxy-7-metoxy-2-(1-pyrazolyl)chinolínu (zlúčenina 7f) a

4-hydroxy-2-(3-metyl-1 -pyrazolyl)-7-metoxy-chinolínu (zlúčenina 7h)

I 7g R = Bn OR 7h R = H

-44KrokA

Zlúčenina 6e (423 mg, 1,41 mmolu) a imidazol (400 mg, 5,88 mmolu) sa spolu 20 hodín zahrievali na 110 °C. Zmes sa potom zriedila EtOAc, premyla vodou a roztokom soli, sušila s MgSCl·» a skoncentrovala pri zníženom tlaku, čím sa získala zlúčenina 7a (422 mg, 90 % teoretického výťažku v čistote 96 %) vo forme žltej tuhej látky. Zlúčenina 7a (319 mg, 0,963 mmolu) v zmesi s Pd (5%-né na uhlíku, 64 mg), etanolom (5 ml) a THF (5 ml) sa prebublávala a udržiavala pod tlakom 0,1 MPa plynného vodíka. Po 7,5 hodinách miešania pri teplote okolia sa reakčná zmes sfiltrovala, premyla zmesou chloroformu a metanolu a skoncentrovala, čím sa získala zlúčenina 7b (130 mg, 56 % teoretického výťažku v čistote 56 %) vo forme žltej tuhej látky.

MS(ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d) δ (ppm): 8,51 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,23 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,2, Hz, 1H), 6,92 (široký, s, 1H), 3,91 (s, 3H).

Krok B

Zlúčenina 6e (251 mg, 0,837 mmolu) a 4-metylimidazol (3454 mg, 4,19 mmolu) sa spolu zahrievali 20 hodín na 110 °C. Zmes sa potom zriedila EtOAc, premyla vodou a roztokom soli, sušila bezvodým síranom horečnatým a skoncentrovala pri zníženom tlaku, čím sa získala surová zmes, obsahujúca 4-metyl- a

5-metyl-imidazolylové izoméry v pomere 10:1. Z druhého polárnejšieho podielu (76 mg, 23 % teoretického výťažku), obsahujúceho zmes 4-metyl- a 5-metylimidazolylových izomérov sa rýchlou stĺpcovou chromatografiou (100 % EtOAc) oddelil predpokladaný vyžadovaný izomér 7c vo forme bielej tuhej látky (166 mg, 57 % teoretického výťažku v čistote 99 %). Zmes zlúčeniny 7c (163 mg, 0,472 mmolu), paládia (5%-né na uhlíku, 33 mg), etanolu (2,4 ml) a THF (5 ml) sa prebublávala a udržiavala plynným vodíkom pod tlakom 0,1 MPa. Po 18 hodinovom miešaní pri teplote okolia sa reakčná zmes sfiltrovala, premyla zmesou chloroformu a metanolu, skoncentrovala, čím sa získala zlúčenina 7d (118 mg, 98 % teoretického výťažku v čistote 99 %) vo forme bielej tuhej látky.

e f r r • ·» r r t ·

-451H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,42 (brs, 1H), 8,01 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (brs, 1H), 7,21 (br s, 1H), 7,10 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,89 (br s, 1H), 3,90 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

Krok C

Zlúčenina 6e (184 mg, 0,614 mmolu) a pyrazol (209 mg, 3,07 mmolu) sa spolu zahrievali 17 hodín na teplotu 110 °C. Zmes sa potom zriedila EtOAc a premyla vodným roztokom NaOH (c_NaoH = 1 mol.dm'³) a roztokom soli, sušila MgSO4 a skoncentrovala pri zníženom tlaku, čím sa získal surový produkt, ktorý sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou (2:1 hexán - EtOAc); získala sa tak zlúčenina 7e (103 mg, 50 % teoretického výťažku) vo forme svetložltej tuhej látky. Zlúčenina 7e (103 mg, 0,311 mmolu) a paládium (5%-né na uhlíku, 20 mg) v zmesi etanolu (2 ml) a THF (2 ml) sa prebublávali a udržiavali plynným vodíkom pod tlakom 0,1 MPa. Po 5,5 hodinovom miešaní pri teplote okolia sa reakčná zmes sfiltrovala, premyla zmesou chloroformu a metanolu a skoncentrovala, čím sa získala zlúčenina 7f (77 mg, 99 % teoretického výťažku v čistote 99 %) vo forme žltej tuhej látky.

MS (ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,72 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 8,31 (s, 1H), 8,00 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,83 (br s, 1H), 7,43 (br s, 1H), 7,24 (br s, 1H), 7,10 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 6,59 (brs, 1 H), 3,90 (s, 3H).

Krok D

Zlúčenina 6e (217 mg, 0,724 mmolu) a 4-metylpyrazol (594 mg, 7,24 mmolu) sa spolu zahrievali 23 hodín na 110 °C. Zmes pozostávajúca z debenzylovanej zlúčeniny 7h a benzylovaného produktu 7g (1:1) sa potom zriedila EtOAc (2 až 3 ml) a filtrovala, čím sa získal debenzylovaný čistý produkt 7h (111 mg, 54 % teoretického výťažku v čistote 95 %) vo forme bielej tuhej látky.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8,58 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,25 (br s, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,04 (br d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,38 (s, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,30 (s, 3H).

-46Príklad 8

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-[4-(2-izopropylaminotiazolyl)]chinolínu (zlúčenina 8f)

Poznámka:[Podľa rovnakej schémy syntézy možno pripraviť rôzne 2-alkylaminotiazolylové substituenty pričom zlúčenina 8b je nahradená inými alkyltiomočovinami.]

<8f)

Krok A

Premena m-anizidínu na zlúčeninu 8a sa uskutočnila rovnako, ako sa opisuje v literatúre: Brown F. J. a ďalší, J. Med. Chem. 32, 807 až 826 (1989). Postup

-47čistenia sa ale upravil tak, aby sa nepoužila chromatografia. Fáza EtOAc, obsahujúca vyžadovaný produkt sa spracovala so zmesou bezvodého síranu horečnatého, aktívneho uhlia a 5 % (hmotnostných, vzhľadom na predpokladanú hmotnosť) silikagélu. Po filtrácii cez celit sa produkt rozotieral v prostredí éteru. Získala sa zlúčenina 8a vo forme svetlohnedej tuhej látky s čistotou >99 % (podľa HPLC).

Krok B

Suspenzia izopropyltiomočoviny (8b, 3,55 g, 30 mmolov) a 3-brómpyrohroznovej kyseliny (8c, 5 g, 1 ekvivalent) v dioxáne (300 ml, 0,1 M roztok) sa zahriala na 80 °C. Pred dosiahnutím 80 °C sa vylúčil biely tuhý produkt a roztok sa vyčíril. Po dvoch hodinách zahrievania sa roztok ochladil na teplotu miestnosti a biely precipitát sa odfiltroval, čim sa získala zlúčenina 8d (s vysokou čistotou >98 % podľa NMR) v množstve 7,51 g (94 % teoretického výťažku).

Krok C

Zmes karboxylovej kyseliny 8d (4,85 g, 18,2 mmolov) a derivátu anilínu 8a (3 g, 1 ekvivalent) v pyridíne (150 ml, 0,12 M) sa ochladila na -30 °C (pri chladení sa číry roztok menil na suspenziu). V priebehu 5 minút sa pomaly pridával oxychlorid fosforečný (3,56 ml, 2,1 ekvivalentu). Reakčná zmes sa hodinu miešala pri -30 °C. Potom sa chladiaci kúpeľ odložil a reakčná zmes sa nechala zohriať na teplotu miestnosti. Po 1,5 hodine sa reakčná zmes naliala na ľad, vodným roztokom NaOH (ονθοη = 3 mol.dm'³) sa nastavilo pH na 11, zmes sa extrahovala dichlórmetánom, extrakt sa sušil nad bezvodým síranom horečnatým, filtroval a skoncentroval vo vákuu. Béžová tuhá látka sa potom čistila rýchlou chromatografiou (45 % EtOAc v hexáne), Čím sa získala zlúčenina 8e vo forme svetložltej tuhej látky (6,07 g, 73 % teoretického výťažku).

Krok D

Roztok ŕerc-BuOK (2,42 g, 21,6 mmolov) v bezvodom íerc-BuOH (40 ml, 0,14 M, destilovaný s kovovým horčíkom) sa zahrieval pod spätným chladičom na teplotu varu. Po častiach sa v priebehu 5 minút pridala zlúčenina 8e (1,8 g, 5,4 mmolov);

-48vytvoril sa tmavočervený roztok, ktorý sa miešal ďalších 20 minút pri teplote varu pod spätným chladičom (úplnosť reakcie sa monitorovala HPLC). Potom sa zmes ochladila na teplotu miestnosti a pridal sa roztok HCl v dioxáne (chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne) (1,5 ekvivalentu). Potom sa zmes skoncentrovala vo vákuu tak, aby sa zabezpečilo úplné odstránenie HCl a dioxánu; produkt sa znova dva razy opätovne rozpustil v CH2CI2 a sušil vo vákuu a nakoniec sa získala hydrochloridová soľ zlúčeniny 8f vo forme béžovej tuhej látky (1,62 g v čistote 93 % podľa HPLC). Produkt sa potom rozmiešal v fosforečnanovom tlmivom roztoku (CNaH2PO4 = 1 mol.dm‘³, pH = cca 4,5 ) a sonifikoval ultrazvukom. Béžový tuhý produkt sa oddelil filtráciou a sušil vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 8f (1,38 g, 81 % teoretického výťažku v čistote 91 % podľa HPLC).

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8,27 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 7,97 (br s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (dd, 1H, J = 9,2, 2,2 Hz), 3,97 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 1,24 (d, 2H, J=6,4Hz).

Príklad 9

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-[2-(4-izopropyltiazolyl)]chinolínu (zlúčenina 9f)

Poznámka: Podľa rovnakej schémy syntézy možno pripraviť rôzne 2-(4-alkyl)tiazolylové substituenty, pričom zlúčenina 9b je nahradená inými a-brómketónmi.

C 9a) (sb) Q9c)

B.

Ό'

-49KrokA

Do roztoku 3-metyl-bután-2-ónu (8 g, 93 mmolov) v MeOH (100 ml) pri -30 °C sa počas 45 minút po kvapkách pridával bróm (4,79 ml, 93 mmolov, 1 ekvivalent). Výsledná zmes sa potom 90 minút miešala pri teplote miestnosti. Pridal sa pentán a roztok sa premyl 5%-ným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala a skoncentrovala vo vákuu. Výsledný surový žltý olej, zlúčenina 9b, sa bez čistenia použil v ďalšom reakčnom kroku. Roztok etyltiooxamátu (9a, 1,8 g, 13,5 mmolov) a brómketónového derivátu 9b sa miešal 15 hodín pri 70 °C. Zmes sa potom skoncentrovala vo vákuu a následne čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím 15%-ného rozoku EtOAc v hexáne ako elučného činidla; získalo sa 740 mg (28 % teoretického

I výťažku) zlúčeniny 9c.

Krok B

Roztok zlúčeniny 9c (700 mg, 3,5 mmolu) v THF/MeOH/HzO (3:1:1) (13 ml) sa zmiešal s monohydrátom hydroxidu lítneho (148 mg, 3,5 mmolu, 1 ekvivalent) a nechal sa 5 hodín reagovať pri teplote miestnosti. Potom sa pomocou roztoku HCI (chci = 0,1 mol.dm'³) upravilo pH na 6 a zmes sa skoncentrovala do sucha vo vákuu, čím sa získala kyselina 9d, ktorá sa priamo bez čistenia použila v ďalšom reakčnom kroku.

Krok C

Roztok 4-metoxy-2-amino-acetofenónu (medziprodukt 8a, 570 mg, 3,45 mmolov) a derivátu karboxylovej kyseliny 9d (590 mg, 3,45 mmolov, 1 ekvivalent) v pyridíne (30 ml) sa ochladil na -20 °C. Potom sa v priebehu 5 minút po kvapkách pridal oxychlorid fosforečný (0,35 ml, 3,79 mmolov, 1,1 ekvivalentu). Výsledný roztok sa dve hodiny miešal pri -10 °C. Reakcia sa zastavila prídavkom vody a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa rozmiešal v nasýtenom vodnom roztoku hydrogénuhličitanu sodného a extrahoval EtOAc. Organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horečnatým, filtrovala a skoncentrovala vo vákuu. Surový produkt sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím 25%-ného roztoku

-50EtOAc v hexáne ako elučného činidla, čím sa získala zlúčenina 9e vo forme bielej tuhej látky (740 mg, 67 % teoretického výťažku).

Krok D

Do suspenzie zlúčeniny 9e (700 mg, 2,2 mmolu) v bezvodom ferc-BuOH (11 ml) sa pridal ŕerc-BuOK (518 mg, 2,1 ekvivalentu). Zmes sa 7,5 hodín zahrievala pri 75 °C, roztok sa potom ochladil na teplotu miestnosti a okyslil pridaním HCI (chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne, 2,5 ml). Zmes sa skoncentrovala vo vákuu a získaný zvyšok sa zmiešal s roztokom NaH2PO4 (0ν₃η2ρο4 = 1 mol.dm'³) a filtroval. Tuhý podiel sa potom rozotieral s malým množstvom EtOAc, filtroval a sušil vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 9f vo forme svetlobéžovej tuhej látky (270 mg, 41 % teoretického výťažku).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ: 8,00 (br s, 1H), 7,60 (br s, 1H), 7,51 (br s, 1H), 7,43 (br s, 1H), 7,29 (br s, 1 H), 7,14 (br s, 1H), 6,95 (br s, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,15 (m, 1H), 1,33 (d, J=5,4 Hz, 6H).

Príklad 10

Syntéza 4-hydroxy-2-(1-metyl-2-imidazolyi)-7-metoxychinolínu (zlúčenina 10d)

Krok A

Roztok /V-metylimidazolu 10a (5 g, 61 mmolov) v 100 ml THF sa ochladil na -78 °C. V priebehu 15 minút sa po kvapkách pridával roztok n-BuLi (24,4 ml 2,5 M roztoku v Et₂O, 1 ekvivalent). Výsledná zmes sa miešala 90 minút pri -78 °C a

-51 potom sa po častiach naliala na nadbytok tuhého CO₂. Heterogénna zmes sa dve hodiny miešala a nechala sa zohriať na teplotu miestnosti. Pomocou roztoku HCI (Chci = OJ mol.dm'³) sa pH zmesi upravilo na 5, vodná vrstva sa oddelila a lyofilizovala. Týmto spôsobom získaný zvyšok sa extrahoval EtOAc (na odstránenie solí), sušil (Na₂SO₄), filtroval a skoncentroval pri zníženom tlaku. Získalo sa 6,2 g (80 % teoretického výťažku) bielej tuhej látky, zlúčeniny 10b.

Krok B

Roztok 4-metoxy-2-amino-acetofenónu 8a (394 mg, 2,39 mmolov) a derivátu karboxylovej kyseliny 10b (301 mg, 1 ekvivalent) v pyridíne (10 ml) sa ochladil na -20 °C, potom sa v priebehu 5 minút po kvapkách pridával oxychlorid fosforečný (244 μΙ, 1,1 ekvivalentu). Reakčný roztok sa 2,5 hodiny miešal pri -10 °C. Potom sa pridala voda a zmes sa skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozmiešal v nasýtenom roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahoval EtOAc. Organická fáza sa sušila (MgSO₄), filtrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Produkt sa čistil chromatograficky s použitím silikagélu (25 % EtOAc v hexáne), čím sa získala zlúčenina 10c (530 mg, 81 % teoretického výťažku) vo forme svetložltej tuhej látky.

Krok C

Do suspenzie substrátu 10c (500 mg, 1,8 mmolu) v 8 ml ŕerc-BuOH sa pridal ŕerc-BuOK (431 mg, 2,1 ekvivalentu). Výsledná zmes sa 7 hodín zahrievala na 75 °C. Roztok sa potom cez noc nechal vychladnúť na teplotu miestnosti a pridalo sa

2,5 ml roztoku HCI (chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne ). Zmes sa skoncentrovala pri zníženom tlaku a získaný zvyšok sa zriedil EtOAc. Pridal sa roztok NaOH (cNaoH = 1 mol.dm*³) až sa pH upravilo na hodnotu 7. Organická fáza sa oddelila a sušila (MgSO4), filtrovala a skoncentrovala pri zníženom tlaku, čím sa získalo 145 mg zlúčeniny 10d (31 % teoretického výťažku) vo forme svetlobéžovej tuhej látky.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 7,99 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,49 (s,1 H), 7,37 (s, 1H), 7,18 (s, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,84 (s, 3H).

Príklad 11

Syntéza 4-hydroxy-2-(1-pyrolyl)-7-metoxychinolínu (zlúčenina 11b)

Krok A

Roztok substrátu 11a (získaný zo zlúčeniny 6c po hydrogenolýze benzylovej skupiny s 5%-ným Pd na uhlíku v prostredí etanolu-THF) (1 g, 5,25 mmolov) a 2,5dimetoxytetrahydrofuránu (0,68 ml, 1 ekvivalent) v ľadovej kyseline octovej sa 4,5 hodiny zahrieval pod spätným chladičom na teplotu varu. Potom sa nechal vychladnúť na teplotu miestnosti. Zmes sa potom skoncentrovala pri zníženom tlaku. Zvyšok sa zriedil metanolom a pridal sa vodný roztok NaOH (c_NaoH = 1 mol.dm'³) až sa dosiahlo pH 7. Produkt sa chromatograficky čistil s použitím silikagélu (3%-ný MeOH/CH2CI₂; zvyšok sa predadsorboval na silikagéli) Získalo sa 140 mg (13 % teoretického výťažku) zlúčeniny 11b vo forme biele tuhej látky.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,18 (d, J =

2,5 Hz, 1 H), 7,05 (br d, J = 7,9 Hz, 1 H), 6,88 (br s, 1 H), 6,32 (s, 2H), 3,90 (s, 3H).

Príklad 12

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(6-metyl-2-pyridyl)chinolínu (zlúčenina 12d)

-53Krok A

6-Metylpikolínová kyselina 12a (411 g, 3,0 mmoly) a SOCb (0,520 ml, 7,2 mmolov, 2,4 ekvivalentov) sa v prostredí benzénu (5 ml) 2 hodiny zahrievali pod spätným chladičom na teplotu varu. Rozpúšťadlo a nadbytok SOCI2 sa z reakčnej zmesi odstránili vo vákuu a zvyšok sa rozotieral v pentáne. Vytvorený tuhý podiel sa odfiltroval a filtrát sa skoncentroval, čím sa získal chlorid kyseliny 12b (500 mg, 2,6 mmólu)

Krok B

Do roztoku surového chloridu kyseliny 12b v CH2CI2 (5 ml) pri 0 °C sa pridal roztok anilínu 8a (344 mg, 2,08 mmólu), DIPEA (1,45 ml, 8,35 mmolov) a DMAP (61 mg, 0,5 mmólu) v CH2CI2 (10 ml). Reakčná zmes sa 16 hodín miešala pri teplote miestnosti. Prchavé zložky sa odstránili vo vákuu, zvyšok sa rozpustil v EtOAc a roztok sa premyl 5%-ným roztokom NaHCO₃ (2x), vodou a roztokom soli. Organická vrstva sä potom sušila nad bezvodým síranom horečnatým a skoncentrovala vo vákuu. Zmes sa čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu (1:2) ako elučného činidla; získal sa amid 12c (490 mg, 82 % teoretického výťažku).

Krok C

Do suspenzie amidu 12c (490 mg, 1,71 mmólu) v ŕerc-BuOH (10 ml) sa pridal ŕerc-BuOK (410 mg, 3,43 mmólu) a zmes sa 6 hodín miešala pri 75 °C a potom 16 hodín pri teplote miestnosti. Zmes sa potom naliala do fosforečnanového tlmivého roztoku (175 ml, pH = 7) a zmes sa 30 minút miešala. Tuhý podiel sa rozotieral s EtOAC (2 x ). Organická fáza sa premyla roztokom soli, sušila nad MgSO4 a skoncentrovala vo vákuu. Získaný tuhý podiel sa rozotieral s EtOAc, čím sa získal chinolínový derivát 12d (263 mg, 58 % teoretického výťažku).

¹H NMR: (CDCI₃,400 MHz): δ 2,68 (s, 3 H), 3,94 (s, 3H), 6,85-6, 88 (2d, J = 8,68 a

9,5 Hz, 2 H), 6,94 (dd, J = 8,9 a 2,2 Hz, 1 H), 7,27 (dd, J = 6,7 a 1,9 Hz, 1 H), 7,737,79 (m, 2 H), 8,28 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 10,3 (br s, 1 H).

Príklad 13

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(5-metoxy-2-pyridyl)chinolínu (zlúčenina 13d)

KrokA

Do roztoku zlúčeniny 13a (623 mg, 3,73 mmolu) v MeOH sa pridal roztok NaOH (CNaOH = 2 mol.dm'³, 4,70 ml) a reakčná zmes sa 2 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Roztok sa potom okyslil kyselinou chlorovodíkovou (chci = 6 mol.dm'³, 2,2 ml) a skoncentroval, čím sa získala zlúčenina 13b, ktorá sa použila bez čistenia v ďalšom reakčnom kroku.

Krok B

Do roztoku nečistenej zlúčeniny 13b (-3,73 mmolu) v pyridíne (25 ml) sa pridal anilín 8a (500 mg, 3,03 mmolov) a roztok sa ochladil na -25 °C; potom sa pridal POCI3 (0,35 ml, 3,73 mmolu). Reakčná zmes sa hodinu miešala pri -10 “C a potom 2 hodiny pri 0 °C. Reakčná zmes sa potom naliala do vody a extrahovala EtOAc ( 2 až 3 x). Spojené organické vrstvy sa premyli 5%-ným vodným roztokom NaHCO3, sušili nad MgSO4 a skoncentrovali pri zníženom tlaku. Surový produkt sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu (1:2) ako elučného činidla. Získal sa amid 13c (617 mg, 55 % teoretického výťažku).

Krok C

Do suspenzie amidu 13c (617 mg, 2,05 mmolu) v bezvodom ŕerc-BuOH (10 ml) sa pridal ŕerc-BuOK (490 mg, 4,11 mmolu) a zmes sa 6 hodín miešala pri 75 °C

-55a potom ešte 16 hodín pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa potom naliala do fosforečnanového tlmivého roztoku (175 ml, pH = 7) a zmes sa 30 minút miešala. Vytvorený tuhý podiel sa odfiltroval a rozotieral s EtOAc, čím sa získal chinolínový derivát 13d (250 mg, 43 % teoretického výťažku).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 3,86 (s, 3 H), 3,94 (s, 3 H), 6,72 (bs, 1 H), 6,91 (dd, J = 8,9, 1,9 Hz, 1 H), 7,54 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 7,60 (dd, J = 8, 9, 2,9 Hz, 1 H), 7,97 (d, J=8, 9 Hz, 1 H), 8,21 (d, J = 8, 6 Hz, 1 H), 8,48 (d, J = 1,9 Hz, 1 H).

Príklad 14

Syntéza 4-hydroxy-7-metoxy-2-(oxazol-5-yl)chinolínu (zlúčenina 14c)

Krok A

Chránený chinolínový derivát 4b z Príkladu 4 (3,8 g, 11,8 mmolov) sa rozpustil v dichlórmetáne (60 ml) a roztok sa ochladil na -78 °C. Potom sa veľmi pomaly po kvapkách v priebehu 15 minút pridával diizobutylalumíniumhydrid (7,9 ml, 1 ekvivalent, 1,5 M roztok v toluéne). Po 80 minútovom miešaní sa pridal ďalší podiel DIBAL (5,5 ml, 0,7 ekvivalentu, 1,5 M roztok v toluéne). Po dvojhodinovom miešaní pri -78 °C sa reakcia opatrne zastavila pridaním metanolu (4 ml) pri -78 °C a potom naliatím do vodného roztoku Rochellovej soli (1 M roztok K-Na vínanu). Hustá pastovitá hmota sa 2 hodiny rozotierala s CH2CI2 (300 ml) až sa získal číry roztok. Fázy sa nechali oddeliť a organická fáza sa sušila (MgSO₄), filtrovala a skoncentrovala, čím sa získala biela tuhá látka. Čistením rýchlou chromatografiou

-56(SiC>2, 0,038 až 0,063 mm [230 až 240 mesh]) s použitím 50%-ného roztoku EtOAc v hexáne sa získal aldehyd 14a vo forme bielej tuhej látky (2,5 g, 73 % teoretického výťažku).

Krok B

Do suspenzie K₂CO₃ (48 mg, 0,34 mmolu) v MeOH (7 ml) sa za miešania pridal toluénsulfonyimetylizokyanid (66 mg, 0,34 mmolu). Reakčná zmes sá zahriala na 45 °C a pridal sa aldehyd 14a (0,10 g, 0,34 mmolu). Reakčná zmes sa potom 16 hodín zahrievala pri 80 °C, potom sa skoncentrovala do sucha s použitím vákua. Produkt sa čistil rýchlou chromatografiou (S1O2, 0,038 až 0,063 mm [230 až 240 mesh]), čím sa získal vyžadovaný oxazol 14b (0,089 g, 80 % teoretického výťažku). MS: 331,0 (M + H)⁺.

Krok C

MEM chránený hydroxychinolín 14b sa rozpustil v THF (3 ml) a zmiešal sa s vodným roztokom HCI (chci = 1 mol.dm'³, 1 ml). Reakčná zmes sa 30 minút miešala pri teplote miestnosti, potom sa s použitím vákua odparila do sucha. Zvyšok sa rozmiešal v fosforečnanovom tlmivom roztoku (3 ml, 1 M roztok, pH = 4,5), odfiltroval, premyl destilovanou vodou a cez noc sušil vo vysokom vákuu (60 °C, 16 hodín). Vyžadovaný hydroxychinolín 14c sa získal vo forme do hneda sfarbenej tuhej látky (0,065 g, 100 % teoretického výťažku).

MS: 242,9 (M + H)⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,65 (s, 1H), 8,02 (bs, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,93 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,42 (bs, 1H), 3,87 (s, 3H),

ES (+) MS: m/z 242,9 (M + H)⁺.

Peptidové spojovníkové skupiny (P3)

Príklad 15

Syntéza kyseliny (2S)-A/-Boc-amino-non-8-énovej (zlúčenina 15g)

-57r · t e e « • · ľ - r t

COOE1 dioxán-NaOH (1 N) _C00Et ľ ^1:1 , T ^A'*‘ _A. HOOC NHAc

EíOOC NHAc (15a) (15b)

C (21b)

-* (15d) pyridim. ficfi x*

(15e) (S,S)-E1-DUPHOS (1/500) BOH ^l>^HAc H, (30 PSI)

COOEt

D.

x?

<150 >99%ee(GQ

NHAc

COOEt

NaIO₄

4,0

1) BOC^O, DMAP, THF 3U0HHP

S (15c) .OH

OH

S ^k (15g)

COOH

Krok A

Do roztoku komerčne dostupného dietyl-2-acetamidomalonátu (15a)(100 g, 0,46 molu) v dioxáne (500 ml) sa po kvapkách v priebehu 30 až 45 minút pridával vodný roztok hydroxidu sodného (cnsoh = 1 mol.dm'³,1 ekvivalent, 460 ml). Reakčná zmes sa 16,5 hodín miešala, dioxán sa potom odparil vo vákuu, vodný roztok sa extrahoval tromi dávkami po 300 ml etylacetátu a okyslil na pH = 1 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Roztok sa potom nechal stať a kryštalizovať za chladenia v kúpeli zo zmesi ľadu a vody. Po vzniku niekoľkých kryštálov sa zmes sonifikovala ultrazvukom, čím sa vytvoril značný podiel precipitátu. Precipitát sa zachytil na filtri a sušil vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 15b (62,52 g, 72% teoretického výťažku) vo forme bielej tuhej látky.

Krok B

Emulzia komerčne dostupného 7-oktén-1,2-diolu (15c) (25 g, 0,173 molu) v H2O (100 ml) sa magnetickým miešadlom miešala v 1 litrovej banke s guľatým dnom; v priebehu 20 minút sa pomaly pridal jodistan sodný (40,7 g, 0,190 molu, 1,1 ekvivalentu v 475 ml H2O (slabšia exotermická reakcia). Výsledná zmes sa ešte hodinu miešala pri teplote miestnosti (úplnosť reakcie sa overovala TLC). Zmes sa »· P

-58potom dekantovala v deliacom lieviku a vodná vrstva sa oddelila od organickej vrstvy. Vodný roztok sa nasýtil chloridom sodným, dekantoval a ešte raz oddelil od organickej vrstvy. Obidva organické podiely sa spojili, sušili bezvodým síranom sodným a filtrovali cez bavlnenú vložku (v Pasteurovej pipete), čím sa získala zlúčenina 15d (15,135 g, bezfarebná olejovitá látka, 78 % teoretického výťažku). Vodný roztok sa extrahoval dichlórmetánom, sušil bezvodým síranom horečnatým a skoncentroval s použitím vákua (bez zahrievania, teplota varu heptanálu 153 °C), čím sa získal ď'alší podiel zlúčeniny 15d (1,957 g, bezfarebná olejovitá látka, 10 % teoretického výťažku), celkový výťažok bol 88 %.

Krok C

K tuhému etyl-2-acetamidomalonátu 15b (7,57 g, 40 mmolov) sa v priebehu minútu pridal 6-heptenal 15d (4,48 g, 40 mmolov) rozpustený v pyridíne (32 ml, 10 ekvivalentov). Výsledný roztok sa ochladil v kúpeli s teplotou 10 °C a v priebehu 4 minút sa pridával anhydrid kyseliny octovej (12 ml, 3,2 ekvivalentov). Výsledný oranžový roztok sa 3 hodiny miešal pri teplote miestnosti a potom sa pridal ďalší podiel etyl-2-acetamidomalonátu 15b (2,27 g). Výsledná zmes sa 11 hodín miešala pri teplote miestnosti. Potom sa do reakčnej zmesi pridal ľad (60 ml) a roztok sa 1,5 hodiny ďalej miešal; zmes sa potom zriedila 250 ml vody a extrahovala dvoma dávkami éteru. Éterový roztok sa premyl roztokom HCI (c_Hci = 1 mol.dm'³), nasýteným vodným roztokom NaHCO3, sušil nad NaaSO^ skoncentroval a čistil rýchlou chromatografiou (40%-ný roztok EtOAc v hexáne), čím sa získala zlúčenina 15e (4,8 g, 50 % teoretického výťažku) vo forme svetložltej olejovitej látky.

Krok D

Do odplyneného (30 minútovým prebublávaním argónom) roztoku Z-etyl 2-acetoamido-2,8-nonadiénoátu 15e (8,38, 35 mmolov) v suchom etanole (70 ml) sa pridal (S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf (51 mg, S/C = 496). Zmes sa prepláchla plynným vodíkom (4 cykly vákuum - vodík) a udržiavala 2 hodiny pod tlakom približne 0,21 MPa (30 psi) vodíka v reaktore podľa Parra. Výsledná zmes sa odparila do sucha, čím sa získala surová zlúčenina 15f, ktorá sa bez ďalšieho čistenia použila v nasledujúcom reakčnom kroku.

-59Krok E

Do roztoku surového (S)-etyl 2-acetamido-8-nonenoátu 15f (7,3 g, 30,3 mmolu) v THF (100 ml) sa pridal Boc₂O (13,2 g, 2 ekvivalenty) a DMAP (740 mg, 0,2 ekvivalentu) a reakčná zmes sa 2,5 hodiny zahrievala pod spätným chladičom na teplotu varu. Následne sa väčšia časť rozpúšťadla THF odparila, surová zmes sa zriedila dichlórmetánom a premyla roztokom HCI (chci = 1 mol.dm'³) na odstránenie DMAP. Organická vrstva sa ďalej extrahovala nasýteným vodným roztokom NaHCO3, sušila bezvodým síranom sodným a skoncentrovala s použitím vákua. Surový produkt sa potom zriedil THF (50 ml) a vodou (30 ml). Pridal sa LÍOH.H2O (2,54 g, 2 ekvivalenty) a výsledná zmes sa 25 hodín miešala pri teplote miestnosti (úplnosť hydrolýzy sa overovala pomocou TLC). Reakčná zmes sa skoncentrovala s použitím vákua tak, aby sa odstránil čo najväčší podiel THF a zriedila sa dichlórmetánom. Výsledný roztok sa premyl roztokom HCI (chci = 1 moLdm’³), sušil bezvodým síranom sodným a skoncentroval s použitím vákua. Aby sa odstránili zvyšky nečistôt a nadbytok Boc₂O, surový produkt sa čistil rýchlou chromatografiou (s použitím gradientu rozpúšťadla od 100 % hexánu až po 100 % EtOAc, ako elučného činidla). V nadpise uvedená zlúčenina 15g sa získala veľmi čistá vo forme svetložltej olejovitej látky (5,82 g, 71 % teoretického výťažku).

Ή NMR (400 MHz, DMSO): δ 7,01 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,79 (t dd, Jt = 6,7 Hz, Jd = 17,0,10,2 Hz, 1 H), 5,00 (md, Jd = 17,0 Hz, 1 H), 4,93 (md, Jd = 10,2 Hz, 1H), 3,83 (m, 1 H), 2,00 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 1,65-1,5 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 1,35-1,21 (m, 6H).

Príklad 15a

Alternatívna syntéza kyseliny (2S)-A/-Boc-amino-non-8-énovej (zlúčenina 15g) <15h)

A.

.COOH (15i)

KrokA

Do suspenzie jemných horčíkových pilín (0,55 g, 22,5 mmolu) v suchom THF (30 ml), obsahujúcom dibrómmetán (0,1 ml), sa za miešania a po kvapkách v priebehu 15 minút pridal 8-bróm-1-oktán (15h, 2,52 ml, 15 mmolov). [Reakcia je mierne exotermická.j Po 30 minútach sa zmes zohriala na 38 ®C a táto teplota sa hodinu udržiavala. Potom sa zmes ochladila na -78 °C a kanylou sa pridalo nadbytočné množstvo tuhého CO₂. Zmes sa potom zriedila dietyléterom (100 ml) a roztok sa premyl roztokom soli (2 x 50 ml), sušil nad bezvodým síranom horečnatým a odparil. Získal sa surový olejovitý produkt, ktorý sa čistil chromatograficky na géli kyseliny kremičitej s použitím 15%-ného roztoku EtOAc v hexáne ako elučného činidla; získala sa tak zlúčenina 15i s 62%-ným výťažkom (1,44 g).

¹H NMR (CDCI₃,400 MHz): δ 1,31-1,42 (m, 6H), 1,60-1,69 (m, 2H), 2,02-2,09 (m, 2H), 2,35 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 4,99 (dm, J = 10,0 Hz, 1H), 5,04 (dm, J = 17,0 Hz, 1H), 5,755,86 (m, 1H).

Krok B

Za silného miešania sa v bezvodých podmienkach do roztoku karboxylovej kyseliny 15i (1,36 g, 8,7 mmolov) v bezvodom THF (70 ml) pri -78 °C kanylou pridali čerstvo predestilovaný Et₃N (1,6 ml, 11,3 mmolov) a pivaloylchlorid (1,18 ml, 9,58

-61 mmolov). Zmes sa 15 minút miešala pri -78 °C a potom 45 minút pri 0 °C. Zmes sa znova ochladila na -78 °C a potom sa kanylou preniesla do bezvodého roztoku lítnej soli (S)-4-(fenylmetyl)-2-oxazolidinónu v THF (pri -78 °C); lítna soľ oxazolidinónového činidla sa vopred pripravila pomalým pridávaním π-BuLi ( 2 M roztok v hexáne, 7,85 ml, 15,7 mmolov) do THF (20 ml) roztoku oxazolidinónu (2,78 g, 15,7 mmolov) pri -78 °C.

Reakčná zmes sa 15 minút miešala pri -78 °C a potom 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Nakoniec sa reakcia zastavila vodným roztokom hydrogensíranu sodného (100 ml 1 M roztoku) a potom sa THF odparil na 3/4 pôvodného objemu. Zvyšok sa extrahoval EtOAc (2 x 150 ml) a spojené organické vrstvy sa premyli 5%ným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (3 x 50 ml), roztokom soli (2 x 50 ml), sušili nad MgSO₄ a odparili. Výsledný olejovitý produkt sa chromatografoval na géli kyseliny kremičitej s použitím 15%-ného roztoku EtOAc v hexáne, čím sa získala zlúčenina 15j v 68%-nom výťažku (1,88 g).

¹H NMR (CDCb,400 MHz): δ 1,35 -1,47 (m, 6H), 1,67-1,74 (m, 2H), 2,02-2,09 (m, 2H), 2,65 (dd, J = 13,4 a 9,9 Hz, 1H), 2,84-3,02 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 13,4 a 3,2 Hz, 1H), 4,13-4,22 (m, 2H), 4,62-4,71 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 17,2 a 1,6 Hz, 1H), 5,75-5,84 (m, 1H), 7,18-7,38 (m, 5H).

Krok C

Do roztoku KHMDS (0,8 M roztok v THF, 22 ml, 17,5 mmolov) v suchom THF (50 ml) sa za miešania pri -78 °C kanylou pridal roztok derivátu kyseliny 15j (3,25 g, 10,30 mmolov) v suchom THF (40 ml). Zmes sa potom 45 minút miešala pri -78 °C. Do tejto zmesi sa potom pri -78 °C pridal roztok trizylazidu (3,67 g, 11,85 mmolov) v suchom THF (40 ml). Zmes sa pri teplote -8 °C miešala 3 minúty a potom sa reakcia zastavila kyselinou octovou (5 ml). Zmes sa potom miešala 45 minút pri teplote miestnosti a nakoniec 15 minút pri 40 °C. Väčšina THF sa odparila. Zvyšok sa vybral do EtOAc (100 ml) a organický roztok sa premyl H₂O (50 ml), 5%-ným vodným roztokom NaHCO₃ (3 x 50 ml) a roztokom soli (50 ml), sušil nad MgSO₄ a odparil. Získaný olejovitý produkt sa chromatografoval na géli kyseliny kremičitej s použitím hexánu/dichlórmetánu (1:1) ako elučného činidla, čím sa získala zlúčenina 15k (2,47 g, 67 % teoretického výťažku).

-62¹H NMR (CDCb,400 MHz): δ 1,32-1,45 (m, 6H), 1,45-1,6 (m, 1 H), 1,75-1,88 (2, 2H, rotaméry), 2,01-2,11 (m, 2H), 2,82-2,87 (m, 1H), 3,33 (dd, J = 13,4 a 3,2 Hz, 1H),

4,10-4,28 (m, 2H), 4,62-4,72 (m, 1H), 4,90-5,05 (m, 3H), 5,73-5,88 (m, 1H), 7,177,38 (m, 5H).

Krok D

Do roztoku bezvodého SnCb (2,61 g, 13,8 mmolov) v bezvodom MeOH (80 ml) sa kanylou za miešania pri 0 °C pridal roztok azidu 15k (2,45 g, 6,9 mmolov) v bezvodom MeOH (20 ml). Zmes sa 4 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Potom sa MeOH odparil a získaný penový materiál sa vybral do zmesi dioxánu a vody (100 μΙ/ 20 μΐ) a zmiešal s Boc₂0 (3,0 g, 13,8 mmolov) a NaHCO3 (2,89 g, 34,5 mmolov) (pH upravené na hodnotu 8 prípadným ďalším pridaním NaHCOs) a zmes sa 16 hodín miešala pri teplote miestnosti. Časť dioxánu sa odparila (~ 50 %) a zvyšok sa dva razy extrahoval EtOAc. Organický roztok sa premyl roztokom soli (2 x 50 ml), sušil a odparil. Získaný odparok sa chromatogratoval na géli kyseliny kremičitej s použitím 20 až 25%-ného roztoku EtOAc v hexáne ako elučného činidla. Získala sa tak zlúčenina 151 (1,75 g, 60 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,27-1,53 (m, 6H), 1,46 (s, 9H), 1,80 (m, 1 H), 2,002,08 (m, 1H), 2,80 (t, J = 12,1 Hz, 1H), 3,34 (d, 14,3 Hz, 1H), 4,17-4,23 (m, 2H), 4,60-4,66 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 17,2 a 1,9 Hz, 1H), 5,13 (bs, 1H), 5,38-5,43 (m, 1H), 5,74-5,84 (m, 1 H), 7,22-7,36 (m, 5H).

Krok E

Do roztoku derivátu /V-Boc 151 (1,74 g, 4,04 mmoly) v THF/H₂O (0,75 ml/15 ml) sa pri 90 °C a za miešania pridal H₂O₂ (30%-ný objem/hmotnosť, 2,05 ml, 16,2 mmolov) a monohydrát hydroxidu lítneho (0,34 g, 8,1 mmolov). Zmes sa hodinu miešala pri 0 °C. Reakcia sa ukončila pridaním Na₂SO3 (2,24 g vo vode, 15 ml, 17,8 mmolov). pH sa upravilo na hodnotu 4 až 5 vodným roztokom kyseliny citrónovej a zmes sa zriedila EtOAc. Vodný podiel sa extrahoval ešte raz EtOAc a organický roztok sa dva razy premyl roztokom soli, sušil a odparil. Zvyšok sa chromatografoval na géli kyseliny kremičitej s použitím 20%-ného roztoku hexánu v EtOAc ako elučného činidla; získala sa tak voľná karboxylová kyselina 15g (0,76 g, 70 %

-63teoretického výťažku). Táto zlúčenina bola identická so zlúčeninou, získanou v Príklade 15.

Príklad 16

Syntéza metylesteru kyseliny (2S)-/V-Boc-amino-5-oxo-non-8-énovej (zlúčenina 16d) (16a)

Mg

BocHN^-COjCH^

O

A.

BocHN^^COjCHj

(16c)

B.

(I6d)

Táto syntéza je založená na metodológii autorov Tsuda T. a ďalších, J. Am. Chem. Soc. 102, 6381 až 6384 (1980).

Krok A

Do roztoku monoalylesteru kyseliny malónovej (1,50g, 10,4 mmolov) v suchom THF (20 ml) sa za intenzívneho miešania v ochrannej atmosfére plynného dusíka pri -78 °C po kvapkách v priebehu 5 minút pridával roztok n-Bu2Mg (0,9 M roztok v hexáne, 5,8 ml, 5,2 mmolov). Hustá suspenzia sa potom hodinu miešala pri teplote miestnosti a odparila do sucha (vákuum sa uvoľnilo pod prúdom dusíka. Tuhá horečnatá soľ 16b sa sušila hodinu vo vákuu.

Derivát kyseliny glutámovej 16a sa najprv zmiešal s 1,ľ-karbonyldiimidazolom (1,65 g, 10,21 mmolov) v bezvodom THF a zmes sa hodinu miešala pri teplote miestnosti aby sa aktivovalo voľné kyselinové zoskupenie. Aktivovaný derivát kyseliny glutámovej sa potom kanylou dávkoval do roztoku Mg soli 16b a

-64získaná reakčná zmes sa 16 hodín miešala pri teplote miestnosti. Potom sa zriedila EtOAc a organický roztok sa premyl roztokom kyseliny chlorovodíkovej (c_Hci = 0,5 mol.dm'³) vychladenej ľadom, roztokom soli, sušil a odparil. Získaný zvyšok sa chromatografoval na géli kyseliny kremičitej s použitím 35 až 40%-ného roztoku EtOAc v hexáne ako elučného činidla, čím sa získala zlúčenina 16c (1,85 g, 53 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,44 (s, 9H), 1,85-1,95 (m, 1H), 2,12-2,22 (m, 1H), 2,58-2,74 (m, 2H), 3,48 (s, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,24-4,34 (m, 1H), 4,52 (dm, J = 5,7 Hz, 2H), 5,09 (m, 1H), 5,25 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,34 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,91 (m, 1H).

Krok B

Do roztoku tetrakis(trifenylfosfín)Pd(0) (0,116 g, 5 mol %, 0,1 mmolu) v suchom THF (injekčnou striekačkou pod ochrannou atmosférou plynného dusíka) sa za miešania pridal diester 16c (0,687 g, 2 mmoly) v suchom DMF (3 ml). Zmes sa 3,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. DMF sa potom odparil s použitím zníženého tlaku a zvyšok sa zriedil EtOAc (20 ml). Roztok v EtOAc sa premyl roztokom HCI (c_Hci = 0,5 mol.dm'³, 5 ml) vychladenej ľadom, roztokom soli (10 ml), sušil a oc.paril. Zvyšok sa chromatografoval na géli kyseliny kremičitej s použitím 15 až 20%-ného roztoku EtOAc v hexáne ako elučného činidla, čím sa získala zlúčenina 16d (0,253 g, 42 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,44 (s, 9H), 1,84-1,94 (m, 1H), 2,08-2,22 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 14,0 a 7,3 Hz, 2H), 2,45-2,55 (m, 4H), 3,74 (s, 3H), 4,28 (bm, 1 H), 4,98 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,00-5,10 (m, 1H), 5,74-5,85 (m, 1H).

Príklad 17

Syntéza kyseliny (2S,5/?)-A/-Boc-2-amino-5-metyl-non-8-énovej (zlúčenina 17f)

-65F.

NalO.

1HF/H,O

2)Boc.O DMAP.THF NH3OC 3JLÍOH. HjO

CO,Ei G.

1) PhjPCHjBf KHMDS

NHAc PhCH/THF .CH, \ NHAC

Kroky A, B, C, D

Komerčne dostupný (R)-(+)-citronelal 17a sa najprv premenil na derivát aminokyseliny 17b rovnakými syntéznymi krokmi, aké sa opisujú v Príklade 15 na premenu aldehydu 15d na aminokyselinový medziprodukt 15f.

Krok E

Zlúčenina 17b (0,675 g, 5,6 mmolov) sa rozpustila v zmesi ťerc-BuOH/acetónu/HžO (1:1:1,18 ml) a vložila do ľadového kúpeľa (0 °C). Postupne sa pridali NMMO (0,789 g, 6,74 mmolov, 1,2 ekvivalentu) a OSO4 (2,5%-ný (hmotnostné) roztok v ferc-BuOH, 0,7 ml, 0,067 mmolov, 0,012 ekvivalentu) a reakčná zmes sa 4 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Väčšia časť acetónu sa odstránila odparením vo vákuu a zmes sa potom extrahovala EtOAc. Organická vrstva sa premyla vodou a roztokom soli, sušila nad bezvodým MgSO4 a odparila do sucha. Po chromatografovaní s použitím 1%-ného roztoku EtOH v EtOAc ako elučného činidla sa získal vysoko čistý diol 17c (0,575 g, 77 % teoretického výťažku).

Krok F

Do roztoku diolu 17c (0,575 g, 1,73 mmolu) v THF/H₂O (1:1, 20 ml) sa pri 0 °C pridal NalO₄ (0,48 g, 2,25 mmoly, 1,3 ekvivalentu) a reakčná zmes sa 3,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Väčšina rozpúšťadla THF sa postupne odstránila odparením vo vákuu a ostatok sa extrahoval EtOAc (2 x 100 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli 5%-ným vodným roztokom kyseliny citrónovej (2 x 20 ml), 5%-ným vodným roztokom NaHCO3 (20 ml) a roztokom soli (2 x 50 ml). Roztok v EtOAc sa sušil nad bezvodým síranom horečnatým a odparil do sucha s použitím vákua. Aldehydový medziprodukt 17d (0,47 g surového produktu) sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom reakčnom kroku.

-66Krok G

Do roztoku PhaPCHaBr (925 mg, 2,6 mmoly) v bezvodom toluéne (15 ml), sa pridal KHMDS (0,5 M roztok v toluéne, 5,2 ml, 2,6 mmoly); vytvorená žltá suspenzia sa 30 minút miešala v ochrannej atmosfére dusíka pri teplote miestnosti. Suspenzia sa potom ochladila na 0 °C a kanylou sa pridal roztok aldehydu 17d (0,47 g, 1,73 mmolu, rozpustený v 15 ml bezvodého THF) a zmes sa potom nechala zohriať na teplotu miestnosti. Po hodine miešania pri teplote miestnosti sa odstránila väčšia časť THF odparením vo vákuu. K zvyšku sa pridal EtOAc (100 ml) a organická vrstva sa premyla vodou (30 ml), 5%-ným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (30 ml) a roztokom soli (30 ml). Roztok v EtOAc sa potom sušil nad bezvodým MgSO4 a odparil do sucha s použitím vákua. Chromatografickým čistením na géli kyseliny kremičitej s použitím hexánu a EtOAc (3:2) ako elučného činidla sa získala čistá zlúčenina 17e, ktorá sa izolovala (0,29 g) v 63%-nom výťažku.

Hydrolýza etylesteru a súčasná výmena /V-acetylovej ochrannej skupiny za Boe v medziprodukte 17e na získanie zlúčeniny 17f sa uskutočnili rovnakým postupom, aký sa uvádza na premenu zlúčeniny 15f na 15g (17f, 310 mg, kvantitatívny výťažok).

¹H NMR (CDCI_3i 400 MHz): δ 0,88 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,18-1,28 (m, 2H), 1,35-1,48 (m, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,64-1,74 (m, 1H), 1,81-1,89 (m, 1H), 1,94-2,12 (m, 2H), 4,28 (bd, J =-3,2 Hz, 1H), 4,93 (dm, J = 11,1 Hz, 1 H), 5,00 (dm, J = 16,8 Hz, 1 H), 5,74-5,84 (m, 1H).

Príklad 18

Syntéza /V-Boc-O-alyl-(L)-treonínu (zlúčenina 18d)

OH Q •VNHBc (18a)

OH o o ŇHBoc

-V

NHB( (18b)

O' ŇHBoc

ŇHBoc (18c)

ŇHBoc (18d)

-67Krok A

Boc-(L)-treonín 18a (500 mg, 2,28 mmolov) sa čiastočne rozpustil v zmesi dichlórmetánu a MeOH (8 ml a 5 ml) pri 0 °C. Potom sa pomaly pridával roztok diazometánu v dietyléteri, až bol roztok trvalo žlto sfarbený, čo poukazovalo na nadbytok diazometánu. Po odparení rozpúšťadiel sa získal surový metylester 18b vo forme do biela zakalenej olejovitej látky (0,534 g).

Krok B

Medziprodukt 18b (311 mg, 1,33 mmolu) sa potom rozpustil v bezvodom dietyléteri (8 ml), pridal sa Ag₂O (341 mg, 1,47 mmolu) a čerstvo aktivované 4 A moleklulové sito (1 g). Do reakčnej nádoby sa nakoniec pridal alyljodid (134 μΙ, 1,47 mmolu) a zmes sa za miešania zahrievala pod spätným chladičom na teplotu varu. Po 20 a 30 hodinách sa pridali ďalšie podiely alyljodidu (vždy 45 μΙ, 0,50 mmolu) a v miešaní a zahrievaní sa pokračovalo, doba miešania spolu 36 hodín. Zmes sa potom filtrovala Celitom a čistila rýchlou chromatografiou na géli kyseliny kremičitej s použitím EtOAc/hexánu (1:4) ako elučného činidla, čím sa získalo 73 mg (27 % teoretického výťažku) zlúčeniny 18c vo forme čírej olejovitej látky.

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,45 (s, 9H), 3,75 (s, 3H), 3,82-3,87 (m, 1H), 3,99-4,07 (m, 2H), 4,29 (dd, J =9,5 a 2,5 Hz, 1 H), 5,14 (dm, J = 10,5 Hz, 1H), 5,21 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,75-5,84 (m, 1H).

Krok C

Ester 18c (99 mg, 0,362 mmolu) sa rozpustil v zmesi THF/MeOH/H₂O (2:1:1,4 ml) a pridal sa monohydrát hydoxidu lítneho (61 mg, 1,45 mmolu). Roztok sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa okyslil na pH približne 3 roztokom HCI (chci = 1 mol.dm'³) a rozpúšťadlá sa odstránili s použitím vákua. Výsledná olejovitá látka, zlúčenina 18d sa použila ako taká na syntézu makrocyklických inhibítorov.

Príklad 19

Syntéza kyseliny (2S,3S)-/V-Boc-2-amino-3-(merkaptoalyl)butánovej (zlúčenina 19e)

-68BocHN^^COjH ho^ch, (19a)

BoeHN^COjCH,

C

1) 0.2 M NaOH. 1.5 h

2) alyljodid

BoeHN^^cOjH _{Q2 M Na0Hi 2}4 h BocHN^^CO^Hj

<19«ϋ 0*0

Krok A

Zlúčenina 19a (9,1 mmolov) sa rozpustila v pyridíne (5 ml) a roztok sa ochladil na 0 ’C v ľadovom kúpeli, v malých dávkach sa pridal tosylchlorid (2,3 g, 11,8 mmolov, 1,3 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 24 hodín pri teplote miestnosti. Po uplynutí tejto doby sa reakčná zmes rozdelila medzi dietyléter (300 ml) a vodu (100 ml). Éterová vrstva sa ďalej premyla zriedenou HCI (c_Hci = 0,2 mol.dm³) (6 x 100 ml) a roztokom soli (100 ml), sušila nad bezvodým síranom horečnatým, filtrovala a skoncentrovala do sucha s použitím vákua. Čistenie surového produktu rýchlou chromatografiou s použitím hexánu/EtOAc (gradient od 8:2 do 7:3) ako elučného činidla viedlo k izolácii tosylového derivátu 19b (3,05 g, 85 % teoretického výťažku).

Krok B

Do roztoku medziproduktu 19b (775 mg, 2 mmoly) v bezvodom DMF (2,5 ml) sa pridal tiooctan draselný (365 mg, 3,2 mmolu) a reakčná zmes sa 24 hodín miešala pri teplote miestnosti. Potom sa väčšia časť DMF odparila s použitím vákua a ostávajúca zmes sa rozdelila medzi EtOAc a H₂O. Vodná vrstva sa reextrahovala EtOAc, spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom horečnatým a odparili do sucha. Čistenie surového produktu rýchlou chromatografiou s použitím hexánu/EtOAc (v pomere 4:1) ako elučného činidla viedlo k izolácii zlúčeniny 19c (465 mg, 80% teoretického výťažku).

-69KrokC

Do roztoku tioesteru 19c (465 mg) v HkO/EtOH (v pomere 3:5, 8 ml) sa pridal vodný roztok hydroxidu sodného (ον₃οη = 0,2 mol.dm'³) a zmes sa 1,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Potom sa pridal alyljodid (0,292 ml, 3,2 mmolu, 2 ekvivalenty) a v miešaní pri teplote miestnosti sa pokračovalo ďalších 30 minút. Reakčná zmes sa potom skoncentrovala na polovicu pôvodného objemu a potom extrahovala EtOAc. Vodná vrstva sa okyslila na pH približne 3 zriedenou HCl (chci = 0,5 mol.dm'³) a reextrahovala EtOAc. Spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým MgSO4 a odparili do sucha s použitím vákua. Surová reakčná zmes obsahovala najmenej štyri produkty; všetky sa izolovali po rýchlej stĺpcovej chromatografii na géli kyseliny kremičitej s použitím hexánu/EtOAc (gradient od pomeru 9:1 do 3:1). Štruktúra najmenej polárnej zlúčeniny (TLC Rf = 0,68 v hexáne/EtOAc 4:1) zodpovedala vyžadovanému produktu 19d (83 mg, 18 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 3,13-3,19 (m, 2H), 3,24-3,29 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 4,50 (dd, J = 8,6 a 3,8 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,15 (dd, J = 18,4 a 1,3 Hz, 1H), 5,22 (bd, J = 7,6 Hz, 1H), 5,75-5,85 (m,1H).

Krok D

Roztok metylesteru 19d (83 mg, 0,287 mmolu) v MeOH/HaO (3:1,4 ml) sa zmiešal s vodným roztokom NaOH (cn₃oh = 0,2 mol.dm'³) a miešal sa 24 hodín pri teplote miestnosti a hodinu pri 40 °C. Reakčná zmes sa potom pri 0 °C okyslila studeným roztokom HCl (chci = 0,5 mol.dm'³) na pH 4 až 5, MeOH sa odstránil s použitím vákua a ostatok vodnej zmesi sa extrahoval EtOAc. Organický roztok sa sušil nad MgSO4 a odparil do sucha, čím sa získala zlúčenina 19e. Zlúčenina 19e sa použila na konečnú syntézu inhibítorov bez ďalšieho čistenia.

Príklad 20

Syntéza kyseliny (S)-/V-Boc-2-amino-3-metyl-3-(1 -merkapto-4-butenyl)butánovej (zlúčenina 20c)

-70SH

C 20a)

(20b)

LiOH ^H,c*^y^c

,co₂ch₃ ^HJ^C NHBoc

A

1) CsOH HjO DMF/DMSO

2) BoľjO (20c)

Krok A

L-Penicilamín 20a (448 mg, 3 mmoly) sa rozpustil v DMF/DMSO (pomer 5:1, 6 ml), pridali sa 4-brompentén (0,46 ml, 4,5 mmolu, 1,5 ekvivalentu) a CsOH.H₂O (1,0 g, 6 ml, 2 ekvivalenty), reakčná zmes sa miešala 24 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa pridal Boc₂O (820 mg, 3,75 mmolu, 1,25 ekvivalentu) a v miešaní sa pokračovalo ďalších 12 hodín. DMF sa potom odstránil s použitím vákua, ostatok zmesi sa zriedil chladným vodným roztokom HCI (chci = 0.5 mol.dm’³) a pH sa upravilo na 4 až 5; zmes sa potom extrahovala EtOAc (2 x 50 ml). Organická vrstva sa premyla roztokom soli (2x), sušila nad bezvodým MgSO4 a odparila do sucha, čím sa získala surová karboxylová kyselina 20b.

Krok B

Čistenie 20b sa ukázalo ako veľmi obťažné. Preto sa surový produkt najprv spracoval s diazometánom za vzniku zodpovedajúceho metylesteru 20c a ester sa potom čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím hexánu/EtOAc (9:1) ako elučného činidla, čím sa získalo 190 mg (20%-ný výťažok) čistého metylesteru 20c. ¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,35 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,59-1,67 (m, 2H), 2,11-2,17 (m, 2H), 2,51-2,60 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,29 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,98 (dm, J = 10,5 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 19 Hz, 1H), 5,35 (bd, J = 7 Hz, 1H), 5,725,83 (m, 1H).

Krok C

Pripravený ester sa potom rozpustil v THF/MeOH/H₂O (2:2:1,5 ml), pridal sa LiOH.H₂O (50 mg. 2,0 mmoly, 2 ekvivalenty) a reakčná zmes sa 4 hodiny miešala pri 40 °C, aby sa ester 20c hydrolyzoval späť na kyselinu 20b. Reakčná zmes sa okyslila HCI (chci = 0.5 mol.dm’³) na pH 4 až 5, THF a MeOH sa odparili do sucha a

-71 ostatok vodného roztoku sa extrahoval EtOAc. Vrstva EtOAc sa sušila nad bezvodým MgSO₄ a odparila do sucha, čím sa získala zlúčenina 20b, ktorá sa použila v syntéze makrocyklických inhibítorov bez ďalšieho čistenia.

Acyklické dipeptidové a tripeptidové medziprodukty

Všeobecný postup väzbových reakcií, uskutočňovaných v roztoku a jednotlivé príklady postupov sa opisujú v WO 00/09 543 a WO 00/09 558.

Uvedené postupy sa použili na syntézu medziproduktových dipeptidov 26c, 30a a tripeptidov 23a, 24a, 31a, 32a a 33a.

Príklad 21

Syntéza acyklického tripeptidu 21 e

Krok A

Do roztoku prolínového derivátu 21a (pripraveného z komerčne dostupného Boc-4(R)-hydroxyprolínu a 4-chlórchinolínu spôsobom, opísanom v WO 00/05 543 a WO 00/09 558) (1,32 g, 3,68 mmolu) a surového homoalyl ACCA 1f (približne 3,35

-72mmolu) v CH2CI2 (10 ml), sa postupne pridali NMM (1,21 ml, 10,05 mmolov) a HATU (1,53 ml, 4,02 mmolu) a suspenzia sa miešala 18 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa odparilo rozpúšťadlo a surová reakčná zmes sa opäť rozpustila v EtOAc (30 ml). Roztok sa premyl 5%-ným vodným roztokom NaHCO3 (2 x 10 ml), roztokom soli (10 ml), sušil nad MgSO4 a odparil. Surový produkt sa chromatograficky čistil na géli kyseliny kremičitej s použitím 8%-ného roztoku dietyléteru v EtOAc ako elučného činidla, čím sa získal vyžadovaný diastereomér zlúčeniny 21b (20 % teoretického výťažku); (absolútna stereochémia nebola stanovená).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 0,93 a 1,01 (t, J = 8,3 Hz, 1H, rotaméry v pomere 3:7), 1,14-1,35 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 1,50-1,82 (m, 4H), 2,08-2,24 (m, 2H), 2,32 (bs, 0,7H), 2,63 (bs, 0,75H), 2,93 (bs, 0.75H), 3,16 (m, 0,25H), 3,77 (bs, 1,5H), 3,88 (bs, 0,5H), 4,4-4,55 (m, 1H), 4,98 (d, J =10,2 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 17,2 a 1,6 Hz, 1H), 5,24 (bs, 1H), 5,75-5,88 (m, 1H), 6,57 a 6,78 (2bs, 1H, 2 rotaméry), 7,42-7,58 (m, 3H), 7,63-7,73 (m, 2H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,74 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

Krok B

Do roztoku dipeptidu 21b (137 mg, 0,248 mmolu) v suchom CH₂CI₂ sa pridal roztok HCI v dioxáne (c_Hci = 4 mol.dm'³ v dioxáne, 4 ml) a zmes sa 1,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa potom odparilo, zvyšok sa sušil vo vysokom vákuu, čím sa získala voľná aminokyselina. Zmes sa rozpustila v dietyléteri/MeOH (3 μΙ : 2 μΙ) a zmiešala s miernym nadbytkom diazometánu, rozpusteného v dietyléteri. Po 30 minútach sa nadbytok diazometánu odstránil pridaním roztoku HCI v dioxáne ((chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne ) a zmes sa odparila do sucha, čím sa získal hydrochlorid zlúčeniny 21c, ktorý sa použil v ďalšom reakčnom kroku bez čistenia.

Krok C

Do suspenzie surového dipeptidu 21c (0,23 g, 0,48 mmolu) v CH2CI2 (25 ml) sa za miešania postupne pridali kyselina (2S)-/V-Boc-amino-hept-6-énová (0,151 g, 0,62 molu), NMM (210 μΙ, 1,91 mmolu) a HATU (0,236 g, 0,62 mmolu); zmes sa miešala 16 hodín pri teplote miestnosti (ak bolo treba, tak sa pH po prvej hodine

-73miešania upravilo na hodnotu približne 8 pomocou NNM). Dichlórmetán sa odparil, zvyšok sa vybral do EtOAc (50 ml) a organický roztok sa premyl 5%-ným vodným roztokom NaHCCb (2 x 20 ml), roztokom soli (2 x 20 ml), sušil a odparil. Získaná surová zlúčenina sa chromatografovala na géli kyseliny kremičitej (50 ml, 2%-ný roztok EtOH v EtOAc), čím sa pripravila zlúčenina 21e (0,139 g, 46 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃,400 MHz, rotaméry v pomere 6:1) chemický posun prevládajúceho rotaméru δ : 1,21-1,27 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,45-1,81 (4m, 7H), 2,20-2,22 (m, 4H), 2,28-2,37 (m, 1H), 2,90-2,99 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,94-3,98 (m, 1H), 4,29 (bd, J = 9,9 Hz, 1H), 4,46-4,50 (m, 1H), 4,81 (dd, J = 8,3 a 5,4 Hz, 1H), 4,92-5,06 (m, 4H), 5,16 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,70-5,84 (m, 2H), 6,82 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,47-7,55 (m, 2H), 7,71 (dt, J = 7,0 a 1,3 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8, 6Hz, 1H), 8,17 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 8,78 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

Makrocyklické peptidy

Príklad 22

Všeobecný syntézny postup makrocyklizácie olefínovou metatézou

Tripeptidový dién sa vždy rozpustil v dichlórmetáne tak, aby koncentrácia roztoku bola 0,01 mol.dm'³ a roztok sa zbavil kyslíka prebublávaním orgónom (približne hodinu pri objeme roztoku 500 ml). Pridal sa roztok katalyzátora (5 až 30 mol%, rozpustený v malom množstve odplyneného dichlórmetánu a reakčná zmes sa zahrievala pod spätným chladičom na teplotu varu až sa všetok východiskový materiál premenil na produkt(y), čo sa sledovalo pomocou TLC a HPLC. Surové reakčné zmesi sa postupne skoncentrovali až takmer do sucha a filtrovali vrstvou silikagélu s elúciou najprv s CH₂CI₂ na odstránenie väčšiny katalyzátora a potom s EtOAc aby sa eluoval(i) všetok (všetky) makrocyklický(é) produkt(y) (najčastejšie ako jednotlivý diastereomér). Surový produkt(y) každej reakcie sa analyzoval(i) chirálnou HPLC na kolóne CHIRALCEL OJ-R (od Chiral Technologies Inc., priemer 0,46 x 15 cm) s použitím izokratickej rozpúšťadlovej zmesi 70 % H2O +0,06 % TFA - 30 % CH3CN + 0,06 % TFA pri 205 nm. Hlavný(é) makrocyklický(é) produkt(y) sa

-74charakterizoval(i) údajmi ¹H, COSY, TOCSY a ROESY NMR s cieľom potvrdiť jeho štruktúru a stereochémiu.

Príklad 23

Syntéza makrocyklického medziproduktu (zlúčenina 23b)

Krok A

Z roztoku diénu 23a (4,0 g, 7,88 mmolov) v suchom dichlórmetáne (800 ml, Aldrich - bezvodý) sa odstránil kyslík dvojhodinovým prebublávaním roztoku argónom. Potom sa pridal tuhý Hoveyda-ov katalyzátor (262 mg, 0,434 mmolu, 5,5 mol%) a reakčná zmes sa varila pod spätným chladičom v ochrannej atmosfére argónu. Po 28 hodinách sa červenooranžový roztok odparil až do vzniku amorfného tuhého zvyšku, ktorý sa potom čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou na géli kyseliny kremičitej. Počiatočný elučný systém bol 10%-ný roztok EtOAc v dichlórmetáne. Po vymytí katalyzátora z kolóny sa rozpúšťadlo zmenilo na čistý EtOAc. Elúcia katalyzátora bola zrejmá podľa sfarbenia. Makrocyklický produkt 23b sa izoloval vo forme bezfarebnej peny, ktorá sa opäť rozpustila v Ci^Ch/hexáne (približne 1:2). Odparením rozpúšťadla sa získal biely prášok (3,362 g, 89 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,20 -1,50 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,53 (dd, J = 9,5 a 5,4, 1H), 1,61-1,70 (m, 1H), 1,76-1,90 (m, 2H), 2,05-2,26 (m, 4H), 2,45 (d, J = 14,3, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,71 (d, J = 11,1, 1H), 3,90 (dd, J = 11,1 a 4,3, 1H), 4,43 -4,53 (m, 2H), 4,76 (d, J = 8,6, 1H), 4,86 (bd, J = 9,8, 1H), 5,20-5,23 (m, 2H), 5,57 (dt, J = 7,0 a 9,8,1H), 7,32 (bs, 1H).

r ·

-75Príklad 24

Syntéza makrocyklického medziproduktu (zlúčenina 24b)

Krok A

Z roztoku diénu 24a (2,76 g, 3,82 mmolov) v suchom dichlórmetáne (800 ml, bezvodý) sa odstránil kyslík jedenapolhodinovým prebublávaním roztoku argónom. Potom sa kanylou pridal roztok Hoveyda-ovho katalyzátora (117 mg, 0,19 mmolu, 0,05 ekvivalentu) v bezvodom a odplynenom dichlórmetáne (8 ml) a reakčná zmes sa miešala a varila pod spätným chladičom v ochrannej atmosfére argónu. Po 20 hodinách prebehla reakcia približne na 50 % a pridal sa druhý podiel katalyzátora (117 mg) a v miešaní sa pokračovalo ďalších 16 hodín. Roztok sa potom skoncentroval na približne 100 ml, naniesol na vrstvu silikagélu (56 x 10 cm) a najprv sa elúciou s dichlórmetánom získal katalyzátor. Zlúčenina 24b sa vymyla zo silikagélu 3%-ným MeOH v EtOAc a znova čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu (2:1) ako elučného činidla, čím sa získala biela tuhá látka so slabým olivovým nádychom (1,85 g, 70 % teoretického výťažku o čistote 94 % podľa HPLC).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ: 8,69 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50-7,44 (m, 2H), 7,17 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,60-5,56 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,59 (d, J =11 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,05-3,98 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,89-3,82 (m, 1H), 3,55 (s, 3H), 2,64-2,53 (m, 1H), 2,46 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 2,40-2,31 (m, 1H), 2,21 (dd, J = 8,9 Hz, 1H), 1,78-1,65 (m, 2H), 1,55 (dd, J = 4,8 Hz, 1 H), 1,485 (dd, J = 4,8 Hz, 1 H), 1,41-1,30 (m, 7H), 1,16 (s, 9H).

-76MS; es⁺: 795,4 (M + H)⁺.

Príklad 25

Syntéza zlúčeniny 202 a 203 (Tabuľka 2)

Krok A

Diénová zlúčenina 21 e (0,130 g, 0,205 mmólu) sa cyklizovala použitím katalytického množstva bis(tricyklofosfín)benzylidéndichloridu ruteničitého (Grubbsov katalyzátor) (52 mg, 0,064 mmólu) v CH₂CI₂ (60 ml) dvojhodinovým zahrievaním na teplotu varu pod spätným chladičom. Chromatografiou na géli kyseliny kremičitej (50 ml, 3 % EtOH v EtOAc) sa získala zlúčenina 25a (60,1 mg, 48 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,22-1,30 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,44-2,35 (m, 13H), 3,07- 3,14 a 3,16-3,24 (2m, 1H, rotaméry v pomere 1: 3), 3,69 (s, 3H), 3,96-4,04 (m, 1H), 4,42-4,50 (m, 1H), 4,95-5,04 (m, 1H), 5,05-5,15 (m, 1H), 5,20-5,30 (m, 1H), 5,55-5,65 (m, 1H), 6,75-6,79 (2d, J = 5,4 Hz, 1 H, rotaméry v pomere 1: 3), 7,36 (s, 1H), 7,46-7,50 (m, 1H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,13 a 8,17 (2d, J = 8,0 Hz, 1H, rotaméry v pomere 1: 3), 8,77 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

-77KrokB

Esterové štruktúrne zoskupenie makrocyklickej zlúčeniny 25a (0,0156 g, 0,026 mmolu) sa hydrolyzovalo účinkom LiOH.H₂O (8,7 mg, 0,206 mmolu) v prostredí THF/MeOH/HhO (4 ml / 2 ml / 2 ml). Surový produkt sa čistil HPLC s Ci₈ reverznou fázou na kolóne Whatman (Partisil 10.0DS3) 52/2,4 cm s použitím gradientu rozpúšťadla od 5%-ného vodného CH3CN do 100 % CH3CN. Získala sa čistá zlúčenina 202 vo forme amorfnej bielej tuhej látky (11,8 mg).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1,12 (s, 9H), 1,20 -1,24 (m, 2H), 1,32-1,40 (m, 3H),

I, 58-1,62 (m, 2H), 1,68-1,78 (m, 3H), 1,95-2,02 (m, 1H), 2,08-2,18 (m, 2H), 2,422,59 (m, 2H), 3,97-4,00 (bd, J = 9,8 Hz, 2H), 4,47 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,58 (d, J =

II, 8 Hz, 1H), 5,22-5,29 (m, 1H), 5,46-5,54 (m, 1H), 5,66 (s, 1H), 7,12 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 7,49 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J = 7,3 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 7,0 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,35 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 9,08 (d, J = 5 Hz, 1H).

Krok C

Makrocyklická zlúčenina 25a (20 mg, 0,033 mmolu) v suchom dichlórmetáne sa po pridaní roztoku HCl v dioxáne (chci = 4 mol.dm'³, 5 ml) hodinu miešala pri teplote miestnosti. Zmes sa starostlivo odparila a sušila. Zvyšok sa opäť rozpustil v zmesi dichlórmetánu a DMF (3 ml /1 ml), zmiešal s NMM (14,5 μΙ, 0,132 mmolu) a anhydridom kyseliny octovej (7,0 μΙ, 0,073 mmolu) a miešal 14 hodín pri teplote miestnosti. Zmes sa potom odparila a sušila vo vysokom vákuu. Zvyšok sa rozpustil v zmesi THF/MeOH/HzO (4 ml / 2 ml / 2 ml) a po pridaní LiOH.2H2O (11 mg, 0,264 mmolu) miešal cez noc. Po okyslení na pH = 3 ľadom vychladenou kyselinou chlorovodíkovou (chci = 1 mol.dm'³) sa izoloval podiel, ktorý sa čistil HPLC s reverznou C18 fázou s použitím gradientu rozpúšťadla od 0 do 40 % vodného CH₃CN (0,06 % TFA). Potom sa izolovala čistá zlúčenina 203 vo forme amorfnej bielej tuhej látky.

¹H NMR (50 mM Na₂HPO₄ tlmivý roztok, pH = 6,0, 600 MHz) δ: 1,22-1,27 (m, 2H), 1,38-1,43 (m, 2H), 1,58-1,64 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 2H), 1,77-1,84 (m, 1H), 1,921,99 (m, 1H), 2,22-2,08 (m, 1H), 2,12-2,27 (m, 1H), 2,22-2,27 (m, 1H), 2,60-2,67 (m, 1H, Pro-β'), 2,83-2,89 (m, 1H, Pro-β), 4,32 (dd, J = 12,1 a 3,5 Hz, 1H, Pro-δ'),

-784,41 (dd, J = 12,1 a 7,3 Hz, 1H), 4,56 (bd, J = 8,0 Hz, 1H, Pro-δ), 4,62 (dd, J = 8,9 Hz, 1H, Pro-a), 5,40-5,46 (m, 1H), 5,55-5,61 (m, 1H), 5,73 (bs, 1H, Pro-γ), 7,41 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,64 (bs, 1H, Acca-NH), 7,80 (dd, J = 7,9 Hz, 1H), 8,03 (dd, J = 8,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 7 Hz, 1H, AcNH), 8,36 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,90 (d, J = 6,0 Hz, 1H).

Príklad 26

Syntéza zlúčeniny 508 (Tabuľka 5)

<26d)

D

Dess-Martinova oxidácia

Krok A

Roztok Boc-chráneného L-glutamínu 26a (4,93 g, 20 mmolov) a diacetátu jódbenzénu (7,73 g, 24 mmolov, 1,2 ekvivalentu) v EtOAc/CH3CH/H₂O (2:2:1,60 ml) sa hodinu miešal pri 16 °C a 3 hodiny pri 20 °C. Reakčná zmes sa potom zriedila

-79vodou (20 ml), rozpúšťadlá EtOAc a CH₃CN sa odstránili odparením vo vákuu a na odstránenie väčšiny nečistôt sa ostávajúca vodná zmes extrahovala dietyléterom (3 x 50 m) a EtOAc (50 ml). Vodná vrstva (obsahujúca amínový medziprodukt) sa potom skoncentrovala do sucha. Zvyšok sa opäť rozpustil v 10%-nom roztoku uhličitanu sodného (30 ml), ochladil na 0 °C v ľadovom kúpeli a pomaly sa pridal (v priebehu asi 10 minút) roztok benzylesteru kyseliny chlórmravčej (3,3 ml, 20,4 mmolov, 1,02 ekvivalentu) v dioxáne (40 ml). Reakčná zmes sa hodinu miešala pri 0 °C a potom 2 hodiny pri teplote miestnosti. Zmes sa potom zriedila vodou (50 ml), extrahovala ochladeným (približne na 5 °C) dietyléterom (3 x 50 ml), okyslila HCI (chci = 4 mol.dm'³) na pH = 3 až 4 a extrahovala EtOAc (3 x 50 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili nad bezvodým síranom horečnatým a odparili do sucha s použitím vákua. Surový materiál sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu/AcOH (7:2,9:0,1), čím sa získala zlúčenina 26b (3,04 g, 43 % celkového teoretického výťažku).

Krok B

Dipeptidový medziprodukt 26c (250 mg, 0,41 mmólu), zlúčenina 26b (171 mg, 0,49 mmólu, 1,2 ekvivalentu) a HATU (185 mg, 0,49 mmólu, 1,2 ekvivalentu) sa rozpustili v dichlórmetáne (6 ml) a pridal sa DIPEA (0,29 ml, 1,62 mmólu, 4 ekvivalenty). Reakčná zmes sa potom 14 hodín miešala pri teplote miestnosti, potom sa dichlórmetán odparil s použitím vákua a surový materiál sa opäť rozpustil v EtOAc. Roztok EtOAc sa premyl 5%-ným vodným roztokom NaHCO3 a roztokom soli, sušil nad bezvodým síranom horečnatým a odparil do sucha. Zlúčenina 26d sa získala čistením surového materiálu rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu (4:1) ako elučného činidla; získalo sa 338 g (98 % teoretického výťažku) produktu.

Krok C

Roztok zlúčeniny 26d (335 mg, 0,394 mmólu) v THF (5 ml) sa ochladil na 0 °C a pridal sa roztok BH₃ v dimetylsulfide (0,12 m,l 10 M roztoku, 1,2 mmólu, 3 ekvivalenty). Reakčná zmes sa potom nechala zohriať na teplotu miestnosti a hodinu miešala. Potom sa opäť ochladila na 0 °C a pomaly, v priebehu 15 minút, sa

-80pridal roztok NaOH (ον₃οη = 2,5 mol.dm’³ 0,8 ml, 1,97 mrnolu, 5 ekvivalentov). Potom sa pozvoľna, v priebehu asi 15 minút, pridal vodný roztok H₂O₂ (0,8 mi, 8,8 M roztok, 6,9 mrnolu, 17,5 ekvivalentov). Reakčná zmes sa nechala zohriať na teplotu miestnosti a hodinu miešala. Reakčná zmes sa potom okyslila na pH asi 4 na odstránenie nadbytku BH₃, potom sa pridal vodný roztok NaHCO₃, ktorým sa upravilo pH na približne 9 až 10; THF sa odstránil s použitím vákua a surový materiál sa rozdelil medzi H₂O a EtOAc. Vodná vrstva sa reextrahovala EtOAc, spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým MgSO₄ a odparili do sucha s použitím vákua. Surový materiál sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAc/hexánu/NH₄OH (8:2:0,5) ako elučného činidla, čím sa získala čistá zlúčenina 26e (192 mg, 57 % teoretického výťažku).

Krok D

Do roztoku zlúčeniny 26e v CH₂CI₂ (8 ml) sa pridal Dess-Martinov jodistan (195 mg, 97 %, 0,33 mrnolu, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa 1,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Reakcia sa ukončila prídavkom vodného roztoku Na₂S₂O₃ (3 ml 5%-ného roztoku), potom sa pridal nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného (5 ml) a zmes sa 15 minút miešala pri teplote miestnosti. Surový produkt sa nakoniec extrahoval EtOAc, organická vrstva sa premyla 5%-ným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, roztokom soli, sušila bezvodým MgSO₄ a odparila s použitím vákua, čím sa získalo 188 mg aldehydu 28f, ktorý sa použil v nasledujúcom reakčnom kroku bez ďalšieho čistenia.

Krok E

Roztok zlúčeniny 26f (188 mg, 0,22 mrnolu), CH₃CO₂H (38 μΙ) a Pd(OH)₂ (25 mg) v etanole (5 ml) sa 16 hodín miešal pri teplote miestnosti pod atmosférickým tlakom vodíka. Potom sa do nádoby pridal ďalší podiel Pd(OH)₂ (180 mg) a CH₃CO₂H (154 μΙ) a zvýšil sa tlak vodíka; v miešaní sa pokračovalo ďalších 24 hodín. Zmes sa potom filtrovala, rozpúšťadlo sa odstránilo odparením do sucha, surový makrocyklický produkt sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím CHCI₃/MeOH/AcOH (10:2:1) ako elučného činidla, čím sa získala zlúčenina 26g (48 mg, približne 30 % teoretického výťažku).

-81 Krok F

Zmes zlúčeniny 26g (22 mg, 0,031 mmolu), DIPEA (27μΙ, 0,155 mmolu, 5 ekvivalentov) a anhydridu kyseliny octovej (8,7 μΙ, 0,093 mmolu, 3 ekvivalenty) v CH2CI2 sa 16 hodín miešala pri teplote miestnosti. Pomocou vákua sa potom dichlórmetán odstránil, pridali sa zmes THF/MeOH/hbO (2:2:1,5 ml) a LÍOH.2H2O (13 mg, 0,31 mmolu, 10 ekvivalentov) a reakcia sa nechala 68 hodín prebiehať pri teplote miestnosti a 2 hodiny pri 50 °C. Potom sa reakčná zmes okyslila (na pH približne 4) a čistila HPLC s reverznou fázou, čím sa získala konečná zlúčenina 508 (približne 6 mg, približne 26 % teoretického výťažku v posledných dvoch krokoch).

¹H NMR (400 MHz, DMSO) (zmes rotamérov potvrdená údajmi z COSY, TOCSY a ROESY NMR) δ: 1,18 (s, 9H), 1,09-1,85 (prekrývanie m, 11 H), 1,95 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 3,18-4,14 (prekrývanie m, 6H), 3,96 (s, 3H), 4,44 (m, 1H), 4,62 a 4,69 (2d, J =11,8 Hz, 1H, rotaméry), 5,82 (bs, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,53 (bs, 1H), 7,67 (bs, 4H), 8,19 (bs, 3H), 8,61 (s, 1H).

Príklad 27

Syntéza nasýteného makrocyklického medziproduktu (zlúčenina 27a)

(27a)

B

(27a)

-82KrokA

Nenasýtený makrocyklický medziprodukt 23b (3,50 g, 7,30 mmolov) sa rozpustil v EtOAc (30 ml) a pridalo sa 700 mg (20 % (hmotnostné)) 5%-ného Rh na oxide hlinitom. Zmes sa potom 1,5 hodiny miešala v atmosfére vodíka pri atmosférickom tlaku a teplote miestnosti. Po uplynutí uvedeného reakčného času sa HPLC analýzou potvrdila úplná premena východiskového materiálu na dva produkty, vyžadovaný produkt 27a a vedľajší produkt (8 % celkovej hmotnosti), ktorý sa neskoršie identifikoval ako zlúčenina 27b, vytvorený otvorením cyklopropánového kruhu. Reakčná zmes sa potom filtrovala a skoncentrovala, čím sa získala svetlozelená tuhá látka (3,47 g). Tento tuhý podiel sa dva razy odparil s EtOH na odstránenie EtOAc (prítomnosť EtOAc vadí v ďalšom reakčnom kroku). Chromatografické delenie zlúčeniny 27a od 27b sa ukázalo ako veľmi obťažné a preto sa zvolila iná možnosť delenia, založená na rozdielnych rýchlostiach hydrolýzy príslušných metylesterových štruktúrnych zoskupení.

Krok B

Surová zmes zlúčenín 27a a 27b (3,47 g) sa rozpustila v THF/MeOH (1:1, 20 ml), pridal sa vodný roztok LiOH.H₂O (24 mg v 5 ml vody, 8%-ekvivalentov) a reakčná zmes sa 16 hodín miešala pri teplote miestnosti (úplná hydrolýza vedľajšieho produktu 27b na príslušnú kyselinu 27c sa potvrdila HPLC). Reakčná zmes sa skoncentrovala s použitím vákua aby sa odstránila väčšina THF a MeOH a zvyšok sa potom rozdelil medzi H₂O (100 ml) a EtOAc (300 ml). Organická vrstva sa premyla roztokom NaOH (c_NaoH = 0,5 mol.dm'³, 3 x 100 ml), roztokom soli (100 ml), 10%-ným vodným roztokom kyseliny citrónovej (2 x 100 ml), opäť roztokom soli (100 ml), sušila nad bezvodým síranom horečnatým, filtrovala a skoncentrovala do sucha. Vyžadovaný produkt 27c sa získal vo veľmi čistej forme (>90 % podľa HPLC) ako svetlozelená pena (3,28 g, 93 % teoretického výťažku v posledných dvoch reakčných krokoch).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,1 -1,38 (m, 13H), 1,42 (s, 9H), 1,51-1,57 (m, 1H), 1,63-1,67 (dd, J = 8,0 a 5,1 Hz, 1H), 1,81-1,87 (m, 1H), 1,92-1,99 (m, 1H), 2,02-2,08 (m, 1H), 2,62 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,4-d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 4,01 (dd, J = r r

-8310,8 a 4,1 Hz, 1H), 4,42-4,48 (m, 1H), 4,51-4,55 (m, 1H), 4,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,97 (brs, 1H).

Príklad 28

Syntéza zlúčeniny 741 (Tabuľka 7)

zlúčenina 741

Na vopred vytvorenú makrocyklickú zlúčeninu 23b sa naviazal chinolínový derivát 8f Mitsunobu-ovou reakciou. Chinolínový derivát 8f (30 mg, 0,095 mmólu) sa rozpustil v THF, potom sa pridala makrocyklické zlúčenina 23b (45,6 mg, 1 ekvivalent) a PPh3 (49,8 mg, 2 ekvivalenty). Zmes sa ochladila na 0 °C a po kvapkách sa pridal DIAD (37,4 μΙ, 2 ekvivalenty). Roztok sa hodinu miešal pri 0 °C a potom sa miešal cez noc pri teplote miestnosti. Zmes sa potom zriedila EtOAc (15 ml), premyla nasýteným roztokom NaHCO3 (15 ml) a roztokom soli. Organický roztok sa sušil bezvodým síranom horečnatým, filtroval a skoncentroval s použitím vákua. Získalo sa 202 mg žltej olejovitej látky. Tento produkt sa čistil rýchlou chromatografiou na géli kyseliny kremičitej (100%-ný EtOAc). Produkt po čistení stále ešte obsahoval vedľajší produkt DIAD. Konečný produkt obsahoval 55 % (hmotnostné) vyžadovaného produktu, čomu zodpovedá výťažok 62 %.

Esterový medziprodukt (46 mg, 0,06 mmólu) sa rozpustil v zmesi THF/MeOH/H₂O (v pomere 2:1:1; 2 ml), pridal sa LiOH.H₂O (20 mg, 0,48 mmólu) a roztok sa miešal pri teplote miestnosti. Po 16 hodinách miešania sa HPLC analýzou zistilo, že nastala úplná hydrolýza. Organické rozpúšťadlá sa odstránili s použitím vákua a ostatok surového materiálu sa rozpustil v DMSO a čistil HPLC s reverznou fázou, čím sa získal čistý inhibítor 741.

-84¹H NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ (ppm): 8,67 (s, 1H), 8,29-8,14 (m, 2H), 8,08-7,97 (m,1H), 7,91-7,78 (m, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,31-7,20 (m, 1H), 7,10 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,82-5,71 (m, 1H), 5,58-5,47 (m, 1H), 5,32-5,23 (m, 1H), 4,74-4,64 (m, 1H),

4.55- 4,47 (m, 1H), 4,23-4,06 (m, 1 H), 4,04-3,94 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92-3,85 (m, 1H), 2,70-2,55 (m, 2H), 2,53-2,36 (m, 2H), 2,20-2,09 (m, 1H), 1,80-1,62 (m, 2H),

1.56- 1,43 (m, 2H), 1,42-1,29 (m, 6H), 1,27 (d, J = 3,2 Hz, 3H), 1,25 (d, J = 2,9 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H),

MS: 763,1 (Μ+Ί), 761,1 (M-1).

Príklad 29

Syntéza zlúčeniny 205 (Tabuľka 2)

(²⁵³) zlúčenina 205

Do roztoku makrocyklickej zlúčeniny 25a (21 mg, 0,0305 mmolu) v tercbutanole a vode (1,5 ml /1,5 ml) pri 0 °C sa pridal roztok OsO₄ v ŕerc-butanole (0,36 ml 35%-ného roztoku (hmotnosť/objem), 0,035 mmolu) a zmes sa pri teplote miestnosti hodinu miešala. Zmes sa potom zriedila EtOAc (20 ml) a organický roztok sa premyl 5%-ným vodným roztokom NaHCO3 (2x10 ml), roztokom soli (2 x 10 ml), sušil a odparil do sucha. Surová zlúčenina sa rozpúšťala v THF/MeOH/H2O (3 ml : 1,5 ml : 1,5 ml) a po pridaní LÍOH.H2O (13 mg, 0,28 mmolu) sa 16 hodín miešala. Zmes sa potom okyslila na pH 4 pomocou ľadom vychladeného roztoku HCI (chci = 0.5 mol.dm'³), odparila a zvyšok sa čistil HPLC s reverznou Cw fázou s použitím gradientu rozpúšťadla od H₂O (0,06 % TFA) do 40 % vodného CH3CN (0,06 % TFA). Pripravený syn diol 205 sa izoloval vo veľmi čistej forme ako amorfná tuhá biela látka.

-85Zlúčenina 205:¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,01 (s, 9H), 1,06-1,30 (m, 9H),

1,48-1,68 (m, 3H), 1,78-1,88 (m, 1H), 2,2-2,5 (2m, 2H), 3,78-3,82 (m, 1H), 3,86-3,90 (m, 1H), 4,39 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 5,60 (bs, 1H, Pro-γ), 7,03 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,40 (bs, 1H), 7,58-7,62 (m, 1H), 7,87-7,91 (m, 1H), 8,00 (d, J =

8,3 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,60 (s, 1 H), 8,99 (bs, 1H).

EMS (mód negatívnej ionizácie): m/z 625 (M-H)'.

Príklad 30

Syntéza zlúčeniny 214 a 218 (Tabuľka 2)

zlúčenina 218

-86Krok A

Roztok esteru kyseliny keto-nonénovej 16d (0,180 mg, 0,6 mmolu) v MeOH/H₂O (5 ml / 2 ml) sa hodinu miešal s LiOH.H₂O (50 mg, 1,2 mmolu) pri teplote miestnosti. Roztok sa potom okyslil na pH 6 ľadom chladeným roztokom HCI (chci = 0,5 mol.dm'³) a väčšina MeOH sa odparila. Zvyšok sa potom rozpustil v EtOAc (30 ml) a roztok sa premyl ľadom chladeným roztokom HCI (chci = 0,5 mol.dm'³) (10 ml), roztokom soli (10 ml), sušil a odparil. Surový zvyšok sa rozpustil v CH₂CI₂ (10 ml) a 16 hodín reagoval s P1 - P2 fragmentom 30a (0,337 g, 0,6 mmolu) v prítomnosti HATU (233 mg, 0,612 mmolu) a DIPEA (420 μΙ, 2,4 mmolu) pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa chromatografovala na géli kyseliny kremičitej s použitím EtOAc/hexánu (1:1) ako elučného činidla, čím sa izolovala čistá zlúčenina 30b v čistote >95 % podľa HPLC (0,370 g, 83 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,41 (s, 9H), 1,45-1,54 (m, 1H), 1,58-1,62 (m, 1H), 1,73-1,77 (m, 1H), 1,86-1,91 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 17,8 a 8,6 Hz, 1H), 2,26-2,43 (2m, 2H), 2,46-2,58 (m, 2H), 2,64-2,81 (m, 1H), 2,85-2,92 a 2,95-3,03 (2m, 1H, rotaméry v pomere 1:3), 3,67 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 4,10-4,18 (m, 1 H), 4,20-4,30 (m, 1H), 4,40-4,55 (m, 1H), 4,80-4,88 (m, 1H), 4,92-5,10 (m, 2H), 5,14 (dd, J =10,2 a 1,6 Hz, 1 H), 5,24-5,38 (m, 4H), 5,42-5,54 (m, 1 H). 5,68-5,86 (m, 2H), 7,04-7,14 (m, 2H), 7,42-7,64 (m, 5H), 7,92-8,12 (m, 3H).

Krok B

Dién 30b (0,370 g, 0,49 mmolu) sa cyklizoval v prítomnosti katalyzátora bis(tricyklohexylfosfín)benzylidén dichloridu ruteničitého (0,125 mg, 0,15 mmolu) v CH₂CI₂ (destilovaný s CaH₂ a odplynený 30 minútovým prebublávaním argónom) dvojhodiným varom pod spätným chladičom. Zlúčenina sa pripravila ako zmes stereoizomérov (30c a 30d v pomere 1:1) a čistila sa rýchlou stĺpcovou chromatografiou na géli kyseliny kremičitej s použitím EtOAc/hexánu (3:1); získalo sa 0,124 g produktu (35 % teoretického výťažku).

¹H NMR zmesi 30c a 30d (CDCI₃, 400 MHz): δ 1,44 (s, 4H), 1,37 (s, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,83 (m, 0,5H), 2,01 (m, 1H), 2,09 (m, 1 H), 2,42 (m, 5H), 2,73 (m, 2H), 3,26 (m, 0,5H), 3,69 (s, 1,5H), 3,76 (s, 1,5H), 3,96 (s, 3H), 4,10 (m, 1H), 4,24 (m, 0,5H), 4,10

-87(m, 0,5H), 4,58 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,89.(m, 0,5H), 4,97 (m, 0,5H), 5,30 (m, 0,5H), 5,44 (m, 2H), 5,64 (m, 1H), 7,1-7,0 (m, 3H), 7,47 (m, 4H), 8,08-7,98 (m, 3H).

Kroky C, D

Hydrolýza metylesterov 30c a 30d (24 mg, 0,033 mmolu) sa uskutočnila v prostredí THF/MeOH/HaO (1 ml: 0,5 ml: 0,5 ml) s L1OH.H2O (11 mg, 0,246 mmolu) 16 hodín pri teplote miestnosti. Po uplynutí uvedeného reakčného času sa zmes okyslila na pH 4 až 5 a chromatografovala HPLC s Cia reverznou fázou s použitím gradientu od H2O (0,06 % TFA) do 50 % CH3CN (0,06 % TFA). Vyžadované zlúčeniny 214 a 218 sa izolovali zo zmesi uvedených dvoch zlúčenín vo vysokej čistote (94 % podľa HPLC) v 15%-nom výťažku (3 mg).

Zlúčenina 214:¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,15 (s, 9H), 1,48-1,54 (m, 2H), 1,65-1,74 (m, 1H), 1,77-1,85 (m, 1H), 2,12-2,25 (m, 4H), 2,27-2,34 (m, 1H), 2,612,68 (m, 1 H), 2,87 (bt, J = 11,5 Hz, 1 H), 3,92 (dd, J = 9,2 a 1,5 Hz, 1 H, Prq-δ), 3,97 (s, 3H,-OCH₃), 4,14-4,20 (m, 1H), 4,52 (t, J = 7,8 Hz, 1H, Pro-a), 4,66 (d, J = 11,8 Hz, 1H, Pro-δ), 5,45 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 5,51-5,58 (m, 1H), 5,82 (bs, 1H, Pro-γ),

7,09 (d, J = 6,0 Hz, 1H, BocNH), 7,26 (bs, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,67 (bs, 3H), 8,16 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,83 (s, 1H, ACCA-NH).

Zlúčenina 218:¹H NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 1,06-1,10 (m, 1H), 1,18 (s, 9H), 1,521,55 (m, 1H), 1,62-1,80 (m, 1H), 2,10-2,68 (prekrývanie, 9H), 3,90 (bd, J = 8,3 Hz, 1H), 3,96 (s, 3H, OCH₃), 4,20-4,27 (m, 1H), 4,58-4,63 (m, 1H, Pro-δ), 4,66 (dd, J = 8,3 Hz, 1H, Pro-a) 4,88 (dd, J = 10,2 Hz, 1H), 5,18-5,26 (m, 1H), 5,73-5,79 (m, 1H, Pro-γ), 7,01 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,23 (bs, 1H), 7,50 (bs, 1H), 7,66 (bs, 3H), 8,20 (bs, 2H), 8,53 (s, 1H).

Príklad 31

Syntéza zlúčeniny 209 (Tabuľka 2)

zlúčenina 209 (31c)

Krok A

Dién 31a (249 mg, 0,330 mmolu) sa rozpustil v 30 ml bezvodého dichlórmetánu a roztok sa odplynil 15 minútovým prebublávaním argónom. Katalyzátor bis(tricyklohexylfosfín)benzylidén dichlorid ruteničitý (82 mg, 0,100 mmolu) sa rozpustil v 3 ml bezvodého a odplyneného CH2CI2 a pridal sa do roztoku diénu. Reakčná zmes sa potom 2 hodiny zahrievala na teplotu varu pod spätným chladičom v ochrannej atmosfére dusíka. Roztok sa potom skoncentroval a čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou, čím sa získala zlúčenina 31b vo forme hnedej tuhej látky (171 mg, 71 % teoretického výťažku).

¹H NMR (CDCb, 400 MHz): δ 1,22-1,44 (m, 10H), 1,42 (s, 9H), 1,66-1,74 (m, 1H), 1,87-1,97 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 3H), 2,32-2,39 (m, 1H), 3,08-3,16 (m, 1H), 3,41 (s, 3H), 4,07-4,22 (m, 3H), 4,28-4,34 (m, 1 H), 4,58-4,64 (m, 1H), 4,95-4,99 (m, 1H), 5,22-5,29 (m, 2H), 5,38-5,43 (m, 1H), 5,48-5,56 (m, 1H), 7,00-7,12 (m, 3H), 7,437,55 (m, 4H), 7,97-8,11 (m, 3H).

ES (+) MS: m/z 727,4 (M+H)⁺.

Krok B

Roztok zlúčeniny 31b (0,117 mmolu) v HCI (1 ml, (chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne)) sa 30 minút miešal a potom skoncentroval do sucha. Tuhý zvyšok sa rozmiešal v CH₂CI₂ (2 ml), postupne sa pridali Et₃N (82 μΙ, 0,585 mmolu) a tercbutylizokyanát (35 mg, 0,351 mmolu). Po 20 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa zmes skoncentrovala do sucha a získaná surová zlúčenina 31c sa bez ďalšieho čistenia použila v konečnom reakčnom kroku hydrolýzy.

-89KrokD

Zlúčenina 31c (85 mg, 0,117 mmolov) sa rozpustila v THF/MeOH/HaO (2 ml: 1 ml :1 ml), pridal sa LiOH.H₂O (39 mg, 0,936 mmolu) a roztok sa 20 hodín miešal pri teplote miestnosti. Potom sa pridala kyselina octová (1 ml) a roztok sa skoncentroval aby sa odstránili MeOH a THF. Čistá zlúčenina 209 sa získala po čistení surového produktu HPLC s Cie reverznou fázou (25 mg, približne 31 % teoretického výťažku).

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,04 (s, 9H), 1,15-1,24 (m, 2H), 1,30-1,40 (m, 5H), 1,44-1,51 (m, 2H), 1,54-1,68 (m, 1H), 1,75-1,88 (m, 1H), 2,18 (dd, J = 17,2 a 8,5 Hz, 1H), 2,32-2,45 (m, 1H, Pro-β ), 2,54-2,62 (m, 1H), 2,65-2,68 (m, 1H, Pro-β), 3,91 (dd, J = 11,1 a 3,5 Hz, 1H, Prao-δ), 3,96 (s, 3H,-OCH₃), 4,17-4,23 (m, 1H), 4,47 (dd, J = 8,6,1 H, Pro a), 4,67 (bd, J = 7,9 Hz, 1H, Pro-δ), 5,30 (dd, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,52 (b dd, J = 19 a 8,3 Hz, 1H), 5,68 (s, 1H), 5,78 (bs, 1H, Pro-γ), 5,94 (bs, 1H), 7,21 (bs, 1H), 7,51 (bs, 1 H). 7,66 (bs, 4H), 8,19 (s, 2H), 8,40 (d, J = 7 Hz, 1H), 8,61 (s, 1H, ACCA-NH).

ES (+) MS: m/z 698,3 (M+H)⁺.

Príklad 32

Syntéza zlúčenín 404 a 407 (Tabuľka 4)

(32b)

Dién 32a (84 mg, 0,11 mmolu) sa rozpustil v bezvodom dichlórmetáne (11 ml) a roztok sa odplynil 15 minútovým prebublávaním argónom. Katalyzátor bis(tricyklohexylfosfín)benzylidén dichlorid ruteničitý (19 mg, 0,023 mmolu) sa rozpustil v 1 ml bezvodého a odplyneného CH2CI2 a potom sa pomocou kanyly preniesol do reakčnej nádoby do roztoku diénu. Reakčná zmes sa 2 hodiny miešala pri teplote varu pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo s použitím vákua a reakčná zmes sa čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou na géli kyseliny kremičitej s použitím EtOAc/hexánu (1:1) ako elučného činidla, čím sa získala makrocyklická zlúčenina 32b vo forme žltej olejovitej látky (33 mg, 41 % teoretického výťažku).

Krok B

Esterový medziprodukt 32b (33 mg, 0,045 mmolu) sa rozpustil v zmesi THF/MeOH/H₂O (2:1:1, 2 ml), pridal sa LÍOH.H2O (8 mg, 0,18 mmolu) sa roztok sa miešal pri teplote miestnosti Po 16 hodinách analýza HPLC reakčnej zmesi preukázala neúplnosť hydrolýzy. Preto sa pridal ďalší podiel LÍOH.H2O (4 mg, 0,09 mmolu) a roztok sa ďalej miešal pri teplote miestnosti, spolu 36 hodín. Nakoniec sa roztok okyslil malým podielom kyseliny octovej, organické rozpúšťadlá sa odstránili s použitím vákua a ostatok surového materiálu sa čistil HPLC s reverznou Cw fázou, čím sa získal čistý inhibitor 404.

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Boe), 1,1-1,4 (3m, 3H), 1,66 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 2,10 (m, 2H), 2,57 (m, 2H), 3,90 (m, 4H), 4,47 (bd, J = 12,7 Hz, 1H), 4,58 (bd, J =7,3,1 H), 4,66 (dd, J = 8,0 Hz, 1H), 5,57

-91 (m, 1H), 5,66 (m, 1H), 5,83 (bs, 1H), 6,18 (bd, J = 6,9 Hz, 1H), 7,25 (bd, J = 7,3 Hz, 1H), 7,56 (bs, 1H), 7,70 (m, 4H), 8,22 (bd, J = 2,9 Hz, 2H), 8,29 (bs, J=9,2 Hz, 1H).

Krok C

Inhibítor 404 (15 mg, 0,024 mmolu) sa rozpustil v etanole (2 ml) a pridalo sa 10%-né paládium na uhlíku (2 mg). Zmes sa 16 hodín miešala v atmosfére vodíka pri teplote miestnosti. Po odfiltrovaní katalyzátora sa reakčná zmes čistila HPLC s Cw reverznou fázou, čím sa získal inhibítor 407 vo forme bielej tuhej látky (10 mg, 66 % teoretického výťažku).

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,04 (m, 1H), 1,17 (d, J = 6,0 Hz, 3 H), 1,35 (s, 9H), 1,25-1,75 (m, 12 H), 2,32-2,45 (m, 1 H), 3,40-3,50 (m, 2 H), 3,74-3,83 (m, 1H), 3,85-3,93 (m, 1 H), 3,97 (s, 3H), 4,27-4,36 (dd, J = 21,1 a 8,6 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 7,95 a 7,95 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,82 (br s, 1H), 7,27-7,33 (m, 1H), 7,53-7,57 (bs, 1 H), 7,60-7,74 (m, 4 H), 8,13-8,27 (m, 3 H), 8,30-8,35 (br s, 1H).

Príklad 33

Syntéza zlúčeniny 824 (Tabuľka 8)

EtO

-92Krok A

Zlúčenina 33a (približne 0,55 mmolu) sa rozpustila v dichlórmetáne (100 ml) a roztok sa pred pridaním Hoveyda-ovho katalyzátora (17 mg, 0,028 mmolu, 0,05 ekvivalentu) starostlivo odplynil. Potom sa roztok 5 hodín miešal pri teplote varu pod spätným chladičom. Reakčná zmes sa potom skoncentrovala a čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím gradientu rozpúšťadla C^WEtOAc (od pomeru 3:2 do 2:3), čím sa získala zlúčenina 33b (194 mg, 72% teoretického výťažku).

Krok B

Do roztoku zlúčeniny 33b (70 mg, 0,142 mmolu), 2-etoxy-4-hydroxy-7metoxychinolínu 3c (63 mg, 0,284 mmolu, 2 ekvivalenty) a Ph3p (186 mg, 0,71 mmolu, 5 ekvivalentov) v bezvodom THF (15 ml) sa pomaly, v priebehu 20 minút pri 0 °C pridal DIAD (140 μΙ, 0,71 mmolu, 5 ekvivalentov). Reakčná zmes sa potom nechala zohriať na teplotu miestnosti a pri tejto teplote sa miešala 2,5 hodiny. Potom sa THF odparil s použitím vákua a surový produkt sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím gradientu rozpúšťadla hexánu/EtOAc (od pomeru 7:3 do 1:1). Izolovala sa čistá zlúčenina 33c (72 mg, 73 % teoretického výťažku).

Krok C

Zlúčenina 33c (72 mg, 0,104 mmolu) sa zmiešala s CH2CI2 (5 ml) a roztokom HCl v dioxáne (chci = 4 mol.dm'³) (5 ml) a zmes sa 1,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti, aby sa odštiepila ochranná skupina Boe a získala sa soľ (hydrochlorid) medziproduktu 33d. Reakčná zmes sa potom odparila do sucha s použitím.vákua, sušila vo vákuu na úplné odstránenie všetkého množstva HCl a použila sa v nasledujúcom reakčnom kroku bez ďalšieho čistenia.

Krok D

Do roztoku cyklopentanolu (29μΙ, 0,32 mmolu) v THF (10 ml) sa po kvapkách pridal roztok fosgénu v toluéne (1,93 M roztok, 274 μΙ, 0,528 mmolu). Reakčná zmes sa 2 hodiny miešala pri teplote miestnosti pričom sa vytvorilo cyklopentylchlórmravčanové činidlo. Potom sa približne polovica rozpúšťadla odstránila odparením s r p

-93použitím vákua, ostávajúci svetložltý roztok sa zriedil pridaním dichlórmetánu (5 ml) a opäť skoncentroval na polovicu pôvodného objemu aby sa bezpečne odstránil všetok nadbytok fosgénu. Uvedené cyklopentylchlór-mravčanové činidlo sa ďalej zriedilo THF (10 ml), ochladilo na 0 °C a pridalo k tuhej zlúčenine 33d (0,104 mmolu), chladenej na 0 °C. Do reakčnej zmesi sa potom pridal Et₃N (75 μΙ, 0,534 mmolu, 5,2 ekvivalentu) a zmes sa 1,5 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlá sa potom odstránili s použitím vákua a surový materiál sa čistil rýchlou stĺpcovou chromatografiou s použitím EtOAC/hexánu (1:1) ako elučného činidla; získala sa zlúčenina 33e v takmer kvantitatívnom výťažku (75 mg).

Krok E

Hydrolýza metylesteru sa dosiahla reakciou zlúčeniny 33e (75 mg, 0,11 mmolu) s UOH.H2O (35 mg, 0,84 mmolu, 8 ekvivalentov) v zmesi rozpúšťadiel THF/MeOH/H₂O (v pomere 2:2:1, 7,5 ml) 2,5 hodinovým zahrievaním na 50 °C. Po úplnej hydrolýze sa reakčná zmes okyslila na pH = 4,5 a rozpúšťadlá sa s použitím vákua odparili do sucha. Surový produkt sa čistil preparatívnou HPLC s Cis reverznou fázou s použitím gradientu rozpúšťadla od H₂O do 58%-ného vodného roztoku CH3CN (s 0,06 % TFA); získal sa tak inhibítor 824 vo forme bielej amorfnej tuhej látky (45 mg, 65 % teoretického výťažku).

¹H NMR Na⁺ soli zlúčeniny 824 (400 MHz, DMSO) δ (ppm): 0,88 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,95-1,70 (prekrývanie, rezonancie, 17H), 1,37 (t, J = 7 Hz, 3H), 2,00-2,10 (m, 1H),

2,10-2,33 (m, 3H), 2,38-2,44 (m, 1H), 3,80-3,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,02-4,08 (m, 1H), 4,42 (q, J = 7 Hz, 2H), 4,35-4,44 (m, 1H), 4,50 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,63 (bs, 1H), 5,28 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 5,38 (bs, 1H), 5,42-5,49 (m, 1H), 6,37 (s, 1H), 6,87 (dd, J = 8,9 a 2,2 Hz, 1H), 7,07 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,57 (s, 1 H).

Príklad 34

Syntéza zlúčeniny 812 (Tabuľka 8) * »

-95r »·

Krok A

Do roztoku makrocyklického medziproduktu 23b (13,05 g, 1,0 ekvivalent), PH3P (14,28 g, 54,4 mmolov, 2,0 ekvivalentu) a 2-karboxymetoxy-4-hydroxy-7metoxychinolínu (WO 00/09 543 a WO 00/09 558) (6,67 g, 28,6 mmolov, 1,05 ekvivalentu) v THF (450 ml) sa po kvapkách v priebehu 15 minút pri 0 °C pridal DIAD (10,75 ml, 54,6 mmolov, 2,0 ekvivalentu). Ľadový kúpeľ sa potom odložil a reakčná zmes sa 3 hodiny miešala pri teplote miestnosti. Po úplnej premene východiskového materiálu na produkty sa s použitím vákua odparilo rozpúšťadlo, ostatok zmesi sa zriedil EtOAc, premyl nasýteným vodným roztokom NaHCO3 (2 x) a roztokom soli (1 x), organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horečnatým, filtrovala a odparila do sucha. Čistá zlúčenina 34a sa získala rýchlou stĺpcovou chromatografiou; stĺpec sa eluoval najprv hexánom/EtOAc (50:50) potom CHCIs/EtOAc (95:5) na odstránenie PH₃PO a DIAD vedľajších produktov a elúcia nečistôt sa monitorovala pomocou TLC. Nakoniec sa zo stĺpca chloroformom/EtOAc (70:30) eluoval vyžadovaný produkt 34a. Chromatografický krok čistenia sa opakoval 2 až 3 razy pred tým ako sa mohla izolovať zlúčenina 34a, ktorá sa získala vo forme bielej tuhej látky (12,8 g, 99,5%-ná čistota podľa HPLC, spolu 68 % teoretického výťažku).

Krok B

Do roztoku Boc-chráneného medziproduktu 34a (1,567 g) v CH2CI2 (15 ml) sa pridal roztok HCI v dioxáne (chci = 4 mol.dm³) (12 ml) a reakčná zmes sa hodinu miešala pri teplote miestnosti. [V prípade, že sa do polovičnej doby reakcie vytvoril hustý gél, pridalo sa ďalších 10 ml CH2CI2.] Po ukončení odstránenia ochrannej skupiny sa rozpúšťadlá odparili do sucha, čím sa získala žltá tuhá látka s pastovitým podielom. Táto zmes sa opäť rozpustila v približne 5%-nom MeOH v CH₂C!₂ a opäť odparila do sucha, čím sa získala zlúčenina 34b ako žltá tuhá látka, ktorá sa použila v nasledujúcom reakčnom kroku bez ďalšieho čistenia.

Krok C

Do roztoku cyklopentanolu (614μΙ, 6,76 mmolov) v THF (15 ml) sa po kvapkách pridal roztok fosgénu v toluéne (1,93 M roztok, 5,96 ml, 11,502 mmolov) a

-96zmes sa 2 hodiny miešala pri teplote miestnosti za vzniku cyklopentylchlórmravčanového činidla (z). Potom sa asi polovina rozpúšťadla odstránila odparením s použitím vákua, zvyšok svetložltého roztoku sa zriedil prídavkom dichlórmetánu (5 ml) a skoncentroval na polovinu pôvodného objemu aby sa zabezpečilo úplné odstránenie nadbytku fosgénu. Uvedený roztok cyklopentylchlórmravčanového činidla sa ďalej zriedil THF (15 ml) a pridal k amín-dihydrochloridovej soli 34b. Zmes sa ochladila na 0 °C v radovom kúpeli, pH sa upravilo na približne 8,5 až 9 prídavkom Et₃N (pridávanie po kvapkách); reakčná zmes sa potom hodinu miešala pri 0 °C. Potom sa zriedila EtOAc, premyla vodou (1 x), nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (2 x), vodou (2 x) a roztokom soli (1 x). Organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horečnatým, filtrovala a odparila s použitím vákua, čím sa získala žltojantárová pena. Zlúčenina 34c sa získala vo forme bielej peny po čistení rýchlou stĺpcovou chromatografiou (s použitím gradientu rozpúšťadla od 30 % hexánu do 20 % hexánu v EtOAc ako elučného činidla); získalo sa 1,27 g v čistote >93 % (80 % teoretického výťažku).

Krok D

Dimetylester 34c (1,17 g) sa rozpustil v zmesi THF/MeOH/H₂O (pomer 2:1:1, 20 ml) a pridal sa vodný roztok NaOH (1,8 ml, (c_N3oh = 1 mol.dm'³), 1 ekvivalent. Reakčná zmes sa hodinu miešala pri teplote miestnosti, potom sa odparila do sucha, čím sa získala sodná soľ 34d vo forme bielej tuhej látky (približne 1,66 mmolu). Zlúčenina 34d sa použila v nasledujúcom reakčnom kroku bez ďalšieho čistenia.

Krok E

Surová sodná soľ 34d (1,66 mmolu) sa rozpustila v THF (17 ml). Pridal Et₃N a zmes sa ochladila na 0 °C v ľadovom kúpeli. Po kvapkách sa pridal izobutylester kyseliny chlórmravčej (322 μΙ, 2,5 mmolu) a zmes sa 75 minút miešala pri 0 °C. Potom sa pridal diazometán (15 ml) a v miešaní sa pokračovalo 30 minút pri 0 °C a potom ešte hodinu pri teplote miestnosti. Väčšina rozpúšťadla sa odstránila odparením do sucha s použitím vákua, zvyšok zmesi sa zriedil EtOAc, premyl nasýteným vodným roztokom NaHCO₃ (2 x), vodou (2 x) a roztokom soli (1 x), sušil

-97nad bezvodým síranom horečnatým, filtroval a odparil do sucha, čím sa získala zlúčenina 34e vo forme svetložltej peny (1,2 g, približne 1,66 mmólu). Diazoketónový medziprodukt 34e sa použil v nasledujúcom reakčnom kroku bez ďalšieho čistenia.

Krok F

Diazoketón 34e (1,2 g, 1,66 mmólu) sa rozpustil v THF (17 ml) a roztok sa v ľadovom kúpeli ochladil na 0 °C. Po kvapkách sa pridal roztok kyseliny bromovodíkovej (48%-ná, 1,24 ml) a zmes sa hodinu miešala pri 0 °C. Zmes sa potom zriedila EtOAc, roztok sa premyl nasýteným vodným roztokom NaHCO3 (2 x), vodou (2 x) a roztokom soli (1 x), sušil nad bezvodým síranom horečnatým, filtroval a odparil do sucha, čím sa získal β-brómketónový medziprodukt 34f vo forme svetložltej peny (približne 1,657 mmólu).

Krok G

Do roztoku brómketónu 34f (600 mg, 0,779 mmólu) v izopropanole (5 ml) sa pridala tiomočovina (118 mg, 1,55 mmólu) a reakčná zmes sa vložila do olejového kúpela, vopred vyhriateho na 75 °C, kde sa miešala hodinu. Izopropanol sa potom odstránil s použitím vákua a produkt sa rozpustil v EtOAc (100 ml). Roztok sa premyl nasýteným vodným roztokom NaHCO3, roztokom soli, organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala a odparila, čím sa získal surový produkt 34g (522 mg) vo forme červenohnedej tuhej látky. Tento materiál sa bez ďalšieho čistenia použil v záverečnom kroku syntézy.

Krok H

Surový metylester 34g (1222 mg, 0,163 mmólu) sa rozpustil v roztoku

I

THF/MeOH/H₂O (v pomere 2:1:1,4 ml) a zmydelnil použitím LiOH.H₂O (89 mg, 2,14 mmólu). Hydrolýza pri teplote miestnosti trvala 12 až 15 hodín. Rozpúšťadlá sa potom odstránili s použitím vákua a surový produkt sa čistil HPLC s Cw reverznou fázou s použitím gradientu rozpúšťadla od 10 % CH3CN v H₂O do 100 % CH3CN, získal sa tak HCV proteázový inhibítor 812 vo forme žltej tuhej látky (24 mg, 20 % teoretického výťažku pre premenu medziproduktu 34f až na inhibítor 812).

-98¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,63 (s, 1 H), 8,26-8,15 (m, 2H), 7,79 (bs, 1H), 7,72 (bs, 1 H), 7,50 (bs, 2H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,77 (bs, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 10,8 Hz, 1 H), 4,50 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,39-4,31 (m, 1H), 4,08-3,99 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,87 (d, J = 9,5 Hz, 2H),

2,65-2,53 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 2H), 2,20-2,12 (dd, J = 8,6 Hz, 1H), 1,80-1,64 (m, 2H), 1,63-1,06 (m, 14H).

MS; es+: 733.2 (M + H)⁺, es: 731.2 (M-H)'.

Príklad 34A

Použil sa rovnaký postup, aký sa opisuje v Príklade 34; reakciou brómketónu 34f s komerčne dostupnou /V-metyltiomočovinou sa získa zlúčenina 811 (Tabuľka 8)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8, 63 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,12-7,93 (m, 1H), 7,88-7,69 (m, 2H), 7,32-7,24 (m, 2H), 5,82-5,75 (m, 1H), 5,52 (ddd, J = 8,1 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 9,9 Hz, 1H), 4,67-4,61 (m, 1H), 4,51 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,08-4,00 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,04 (d, J = 4,1 Hz, 3H), 2,65-2,37 (m, 3H), 2,16 (m, 1H), 1,77-1,65 (m, 2H), 1,63-1,11 (m, 17H).

MS; es⁺: 747,2 (M + H)⁺, es: 745,3 (M-H)’.

Príklad 34B

Použil sa rovnaký postup, aký sa opisuje v Príklade 34; reakciou brómketónu 34f s komerčne dostupnou /V-etyltiomočovinou sa získa zlúčenina 810 (Tabuľka 8) r r

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,63 (s, 1H), 8,27 (bs, 1H), 8,20 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,13-8,07 (m, 1H), 7,86 (bs, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,81 (bs,1H), 5,54 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 9,7 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 4,38 (bs, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92-3,87 (m, 1H), 3,54-3,46 (m, 2H), 2,68-2,65 (m, 2H), 2,47-2,38 (m, 1H), 2,15 (dd, J = 8,6 Hz,1H), 1,78-1,65 (m, 2H), 1,60-1,12 (m, 17H), 1,25 (t, J = 7,3Hz, 3H),

MS; es⁺: 783,2 (M + Na)⁺, es: 761,2 (M + H)⁺.

Príklad 34C

Použil sa rovnaký postup, aký sa opisuje v Príklade 34; reakciou brómketónu 34f s komerčne dostupnou /V-izopropyltiomočovinou sa pripraví zlúčenina 822

’H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,62 (s,1 H), 8,30 (bs, 1H), 8,17 (d, J = 8,9 Hz,1H), 7,62 (bs, 1H), 7,52 (bs, 1H), 7,28 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,21 (bs, 1H), 5,63 (bs, 1H), 5,54 (dd, J = 8,1 Hz, 1 H), 5,28 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,56-4,46 (m, 2H), 4,11-4,04 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,93-3,88 (m, 1H), 2,622,54 (m, 1H), 2,45-2,36 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,21-2,13 (m, 1H), 1,79-1,69 (m, 2H),

1,65-1,30 (m, 16H), 1,26-1,12 (m, 2H).

-100MS; es⁺: 775,3 (M + H)⁺, es: 773,3 (M-H).

Príklad 34D

Použil sa rovnaký postup, aký sa opisuje v Príklade 34; reakciou brómketónu 34f s komerčne dostupnou /V-acetyltiomočovinou sa pripraví zlúčenina 809

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,30 (bs, 1H), 8,17 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,62 (bs, 1H), 7,52 (bs, 1H), 7,28 (d, J = 6,4Hz, 1H), 7,21 (bs, 1H), 5,63 (bs, 1H), 5,54 (dd, J = 8,1 Hz, 1 H), 5,28 (dd, J = 9,5Hz, 1H), 4,62 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,56-4,46 (m, 2H), 4,11-4,04 (m, 1 H), 3,95 (s, 3H), 3,93-3,88 (m, 1H), 2,622,54 (m, 1H), 2,45-2,36 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,21-2,13 (m, 1H), 1,79-1,69 (m, 2H),

1,65-1,30 (m, 16H), 1,26-1,12 (m, 2H).

MS; es⁺: 775,3 (M + Hf, es773,3 (M-H)’.

Príklad 34E

Do roztoku 2-amino-4-tiazolylového medziproduktu 34g (0,24 g, 0,32 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) sa za miešania pri teplote miestnosti pridal DIPEA (0,55 ml, 3,18 mmólu, 10 ekvivalentov). Reakčná zmes sa 6,5 hodiny miešala, potom sa skoncentrovala s pomocou vákua. Izolovaný surový materiál sa potom hydrolyzoval na vyžadovanú karboxylovú kyselinu spôsobom, aký sa opisuje v Príklade 34; získala sa zlúčenina 818.

f* P «· -101 ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,61 (s, 1H), 8,21-8,07 (m, 2H), 7,61-7,38 (m, 2H), 7,26 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,19-7,10 (m, 1H), 5,60-5,47 (m, 2H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,63-4,53 (m, 1H), 4,47 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,13-4,04 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,42-2,30 (m, 2H), 2,17 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 1,81-1,68 (m, 2H), 1,63-1,29 (m, 16H), 1,23-1,10 (m, 2H).

MS; es⁺: 791,1 (M + H)⁺, es: 789,1 (M-H)'.

Príklad 34F

Postupovalo sa rovnako, ako sa uvádza v Príklade 34E; na syntézu sa použil izobutylester kyseliny chlórmravčej, čím sa získal obdobný substituovaný karbamátový medziprodukt. Izolovaný surový materiál sa potom hydrolyzoval na vyžadovanú zlúčeninu 819.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,47-8,27 (bs, 1H), 8,18 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,69-7,60 (m, 1H), 7,60-7,51 (m, 1H), 7,28 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,287,19 (m, 1H), 5,70-5,60 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,8 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,53-4,44 (m, 2H), 4,10-3,99 (m, 1H), 4,04 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,94-3,87 (m, 1H), 2,65-2,53 (m, 1H), 2,46-2,34 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 8,1 Hz, 1H), 2,03-1,91 (m, 1H), 1,79-1,09 (m, 20H), 0,95 (d, J = 6,7 Hz, 6H).

MS; es⁺: 833,2 (M + H)⁺, es: 831,2 (M-H)'.

Príklad 35

Syntéza zlúčeniny 908

-102Vychádzalo sa z derivátu 27a a použil sa obdobný chemický postup, aký sa uvádza v Príklade 34; získala sa nasledujúca makrocyklická zlúčenina 908 (Tabuľka 9).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,47 (s, 1H), 8,16 (d, J = 10 Hz, 1 H), 8,158,07 (m, 1H), 7, 82-7,63 (m, 2H), 7, 53-7,43 (m, 2H), 7,33-7,22 (m, 1H), 7,13 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,77-5,65 (m, 1H), 4,62-4,52 (m, 2H), 4,50-4,4 (m, 1H), 4,20-4,10 (m, 1 H), 3, 94 (s, 3H), 3,89-3,83 (m, 1H), 2,59-2,53 (m, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 1,791,0 (m, 25H),

MS; es⁺: 735,2 (M + H)⁺, es: 733,2 (M-H)'.

Príklad 35A

Syntéza zlúčeniny 909

Postupovalo sa rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príklade 35 ale s použitím komerčne dostupnej /V-acetyltiomočoviny, čím sa pripravila zlúčenina 909 (Tabuľka 9)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,53-8, 41 (m, 2H), 8, 20 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,68 (bs, 1H), 7,68 (bs, 1H), 7,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,67

-103 (bs, 1H), 4,65-4,50 (m, 3H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,21-4,13 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3, 99-3, 86 (m, 1H), 2,62-2,39 (m, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,78-1,67 (m, 3H), 1, 67-1, 01 (m, 22H).

MS; es⁺: 798,0 (M + Na)⁺, es: 777,0 (M + H)⁺.

Príklad 35B

Syntéza zlúčeniny 910

Postupovalo sa rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príklade 35 ale s použitím komerčne dostupnej W-etyltiomočoviny, čím sa pripravila zlúčenina 910 (Tabuľka 9)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,47 (s, 1H), 8,29 (bs, 1H), 8,20 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09 (bs, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,32 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,14 (dd, J = 6,7 Hz, 1H), 5,78 (bs, 1H), 4,58 (dd, J = 8,1 Hz, 2H), 4,43 (bs, 1H), 4,184,12 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,9 Hz,1H), 3,55-3,46 (m, 2H), 2,63-2, 53 (m, 1H), 2,47-2, 41 (m, 1 H), 1,78-1,00 (m, 25H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H). MS; es⁺: 763,1 (M + H)⁺, es: 761,1 (M-H)'.

Príklad 35C

Syntéza zlúčeniny 911

Postupovalo sa rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príklade 35 ale s použitím komerčne dostupnej /V-izopropyltiomočoviny, čím sa pripravila zlúčenina 911 (Tabuľka 9) ι- -

¹H NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ (ppm): 8,47 (s, 1H), 8,29-8,19 (m, 1H), 8,19 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09-8,0 (m, 1H), 7,83 (bs, 1H), 7,74 (bs, 1H), 7,31 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,76 (bs, 1H), 4,64-4,53 (m, 2H), 4,44 (bs, 1H), 4,22-4,09 (m, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 2,63-2,58 (m, 1H), 2,46-2,41 (m, 1 H), 1,79-1,10 (m, 24H), 1,27 a 1,26 (2 x d, J = 6,5 Hz, 6H).

MS; es⁺: 777,0 (M + H)*, es: 775,0 (M-H)’.

Príklad 36

Syntéza zlúčeniny 716

¹H NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ (ppm): 8,62 (s, 1 H). 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,647,54 (m, 2H), 7,47 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 7,16 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1 H), 7,03 (d, J =6,0 Hz, 1H), 5,63 (s, 1 H). 5,52 (q, J = 9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 11,45,1 H), 4,45 (dd, J = 9,2, 8,27 Hz, 1 H). 4,02 (m, 1H) 3,93 (s, 3H), 3,7 (dd, J = 7,6, 1,0 Hz, 1H), 2,66 (s, 3H), 2,55-2,65 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,17 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 1,65-1,75 (m, 2H), 1,5-1,35 (m, 7H), 1,15 (s, 9H).

MS: 705 (M+1), 703 (M-1).

-105Príklad 37

Syntéza zlúčeniny 717

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,62 (s,1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,64 (s, 1H), 5,52 (q, J = 9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 11,44,1 H), 4,45 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,9-3,8 (m, 1H), 2,7-2, 55 (m, 1H), 2,4-2,3 (m, 1H), 2,18 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 1,75-1,65 (m, 2H), 1,5-1,2 (m, 7H), 1,14 (s, 9H).

MS: 705 (M+1), 703 (M-1).

Príklad 38

Syntéza zlúčeniny 718

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 9,55 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,32 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,10-7,07 (m, 2H), 5,64-5,54 (m, 1H), 5,59-5,48 (m, 1H), 5,33-5,23 (m, 1H), 4,73-4,61 (m, 1H),

4,45 (dd, J = 7,5, 9,1 Hz, 1H), 4,09-4,00 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,93-3,83 (m, 1H), 2,67-2,55 (m, 2H), 2,53-2,43 (m, 1H), 2,42-2,31 (m, 1H), 2,23-2,12 (m, 1H), 1,811,66 (m, 2H), 1,52-1,42 (m, 2H), 1,42-1,25 (m, 6H), 1,21 (s, 9H).

MS: 689,3 (M+1), 687,3 (M-1).

-106

Príklad 39

Syntéza zlúčeniny 722

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 9,70 (s, 1H), 8,64 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,14 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,30 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,14-7,06 (m, 2H), 5,605,54 (m, 1H), 5,58-5,48 (m, 1H), 5,31-5,23 (m, 1H), 4,71-4,62 (m, 1H), 4,49-4,40 (m, 1H), 4,08-3,99 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,92-3,84 (m, 1H), 2,69-2,54 (m, 2H), 2,532,46 (m, 1H), 2,42-2,31 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,22-2,13 (m, 1H), 1,81-1,64 (m, 2H), 1,54-1,42 (m, 2H), 1,42-1,27 (m, 6H), 1,22 (s, 9H).

MS: 703,3 (M+1), 701,3 (M-1).

Príklad 40

Syntéza zlúčeniny 733

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,75 (m, 1 H). 8,62 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,88-7,87 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,28 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,05-7,00 (m, 2H), 6,64-6,63 (m,1H), 5,62-5,58 (m, 1H), 5,55-5,49 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,644,61 (m, 1H), 4,48-4,44 (m, 1 H), 4,07-4,03 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,92-3,85 (m, 1H), 2,67-2,54 (m, 2H), 2,53-2,45 (m, 1H), 2,41-2,34 (m, 1H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,751,69 (m, 2H), 1,50-1,43 (m, 2H), 1,41-1,32 (m, 6H), 1,17 (s, 9H).

107

MS: 689,3 (M+1), 687,2 (M-1).

Príklad 41

Syntéza zlúčeniny 703

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,50 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 8,118,00 (m, 1H), 7,88-7,77 (m, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,89-5,68 (m, 1H), 4,62 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,53 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,16-4,07 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,88 (bd, J = 9,5 Hz, 1 H), 3,53-3,43 (m, 2H), 2,632,51 (m, 1H), 2,46-2,36 (m, 1H), 1,81-1,62 (m, 2H), 1,60-1,01 (m, 15H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H).

MS; es⁺: 751,1 (M + H)⁺, es: 749,1 (M-H)'.

Príklad 42

Syntéza zlúčeniny 734

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,04 (d, J =9,2 Hz, 1 H), 7,70 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,05-6,98 (m, 2H), 5,575,54 (m, 1H), 5,55-5,48 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,63-4,59 (m, 1H), 4,47-4,43 (m, 1H), 4,13-3,99 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,92-3,83 (m, 1H), 2,67-2,55 (m, 2H), 2,53-1082,46 (m, 1H), 2,43-2,31 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 1H), 2,15 (3H), 1,75-1,70 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,41-1,28 (m, 6H), 1,17 (s, 9H). MS: 703,2 (M+1), 701,3 (M-1).

Príklad 43

Syntéza zlúčeniny 738

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8, 64 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,62 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (s, 1 H), 7,24 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 6,99 (dd, J = 2,2, 9,2 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,62 -5,57 (m, 1H), 5,565,47 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 1H), 4,65-4,56 (m, 1H), 4,45 (dd, J = 7,6, 8,9 Hz, 1H), 4,07-4,00 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,88-3,84 (m, 1H), 2,68-2,56 (m, 2H), 2,54-2,43 (m, 1H), 2,42-2,31 (m,1H), 2,34 (s, 3H), 2,24-2,14 (m, 1H), 1,80-1,64 (m, 2H), 1,52-1,43 (m, 2H), 1,43-1,27 (m, 6H), 1,18 (s, 9H).

MS: 703,2 (M+1), 701,2 (M-1).

Príklad 44

Syntéza zlúčeniny 725

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,10 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,35 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,09-7,03 (m, 2H), 5,65-5,61 (m, 1H),

-1095,55-5,49 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,62-4,57 (m, 1H), 4,49-4,45 (m, 1H), 4,084,01 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,20-3,14 (m, 1H), 2,65-2,56 (s, 1H),

2,53-2,47 (m, 1H) 2,42-2,35 (m, 1 H), 2,22-2,15 (m, 1H), 1,79-1,68 (m, 2H), 1,501,43 (m, 2H), 1,41-1,28 (m, 12H), 1,18 (s, 9H).

MS: 748,2 (M+1), 746,2 (M-1).

r* r

Príklad 45

Syntéza zlúčeniny 726

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,64 (s, 1H), 8,10 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,837,76 (m, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,44 -7,42 (m, 1H), 7,18-7,01 (m, 2H), 5,56-5,49 (m, 2H), 5,29-5,24 (m, 1H), 4,66-4,63 (m, 1H), 4,47-4,42 (m, 1H), 4,28 (s, 3H), 4,06-4,02 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,93-3,86 (m, 1H), 2,66-2,55 (m, 2H), 2,42-2,31 (m, 2H), 2,222,14 (m, 1H), 1,79-1,65 (m, 2H), 1,52-1,27 (m, 7H), 1,22 (s, 9H).

MS: 703,2 (M+1), 701,3 (M-1).

Príklad 46

Syntéza zlúčeniny 906

-110¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,46 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,34 (m, 1H), 7,14-7,05 (m, 2H), 5,-5,58 (m, 1H), 4,66-4,61 (m, 1H), 4,54-4,44 (m, 2H), 4,23-4,18 (m, 1H) 3,93 (s, 3H), 3,92-3,88 (m, 1H), 3,213,14 (m, 1H), 2,44-2,33 (m, 1 H), 1,35 (d, J = 7Hz, 6H), 1,73 -1,01 (m, 26H).

MS: 762,0 (M+1), 759,9 (M-1).

Príklad 47

Syntéza zlúčeniny 907

¹H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 8,46 (s, 1 H). 7,98 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,917,89 (m, 2H), 7,23-7,21 (m, 2H), 7,07-7,00 (m, 2H), 6,35-6,32 (m, 2H), 5,64-5,58 (m, 1H), 4,65-4,61 (m, 1H), 4,53-4,47 (m, 2H), 4,24-4,19 (m, 1H) 3,90 (s, 3H), 3,86-3,84 (m, 1H), 2,40-2,33 (m, 1H), 1,73-1,01 (m, 26H).

MS: 702,0 (M+1), 699,9 (M-1).

Príklad 48

Fluorogénna analýza s FL-NS3-NS4A heterodimérnym proteínom

Nekódujúca oblasť NS2-NS5B-3' sa klonovala pomocou RT-PCR do pCR®3 vektora (Invitrogen) s použitím RNA, extrahovanej zo séra HCV genotypom 1b infektovanej osoby (poskytnuté Dr. Bernardom Willemsom, Hôpital St. Luc, Montréal, Qubéc, Kanada) Uvedená oblasť NS3-NS4A z (NS3-NS4AFL) sa potom subklonovala PCR do pFastBac™ HTa baculovírusového expresného vektora (Gibco/BRL). Uvedená vektorová sekvencia zahŕňa oblasť kódujúcu 28-zvyškovú terminálnu sekvenciu, ktorá obsahuje hexahistidínový koniec. Uvedený Bac-toBac™ baculovírusový expresný systém (Gibco/BRL) sa použil na produkciu rekom-111 binantného baculovírusu. Infektovaním 10⁶ Sf21 buniek.mľ¹ rekombinantným baculovírusom sa exprimoval His-NS3-NS4AFL s šírením infekcie 0,1 až 0,2 pri 27 °C. V priebehu expresie nastávala autentická auto-proteolýza za vzniku nekovalentného a stáleho NS3-NS4A proteínového komplexu (označovaného ako komplexu úplnej dĺžky - full-length, FL). Kultúra sa zberala 48 až 64 hodín neskoršie odstredením pri 4 °C. Pelety buniek sa homogenizovali v 50 mM roztoku NaH2PO4 pH 7,5, glycerolu (40 %, hmotnosť/objem), 2 mM roztoku β-merkapto-etanolu v prítomnosti koktejlu proteázových inhibítorov. Z bunkového lyzátu sa potom extrahoval HisNS3-NS4AFL 1,5%-ným NP-40, 0,5%-ným Tritonom X-100, 0,5 M roztokom NaCl a účinkom DNázy. Po odstredení na ultracentrifúge sa rozpustný extrakt štvornásobne zriedil a viazal na Hi-Trap-Ni-chelačnú kolónu (Pharmacia). His-NS3-NS4AFL sa eluoval v >90%-nej čistej forme (podľa analýzy SDS-PAGE) pri použití od 50 až do 400 mM koncentračného gradientu imidazolu. Tento His-NS3-NS4AFL sa skladoval pri -80 °C v roztoku: 50 mM roztoku fosforečnanu sodného pH 7,5 , v 10%-nom (hmotnosť/objem) glycerole, 0,5 M NaCl, 0,25 M imidazolu, 0,1 % NP-40. Tesne pred použitím sa preparát nechal roztopiť na ľade a zriedil.

Proteázová účinnosť (aktivita) His-NS3-NS4AFL sa stanovovala v prostredí 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,25 M roztoku citranu sodného, 0,01 % (hmotnosť/objem) n-dodecyl-p-D-maltozidu, 1 mM TCEP. Päť μΜ substrátu antranilyl-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH sa v prítomnosti rôznych koncentrácií inhibítora inkubovalo 45 minút s 1,5 nM His-NS3-NS4AFL pri 23 °C. Konečná koncentrácia DMSO neprekročila 5,25 %. Reakcia sa ukončila prídavkom 1M MES, pH 5,8.

Fluorescencia N-terminálneho produktu sa monitorovala flurometrom LS-50B od firmy Perkin-Elmer, vybavenom snímačom pre 96 jamkové platne (excitačná vlnová dĺžka 325 nm; emisná vlnová dĺžka 423 nm).

Percento inhibície sa počítalo pomocou nasledujúcej rovnice:

100 - [(FlUOinh - FIUOblank)/(FIUOcU - FlUOblank)] X 100

Na súbor dvojíc údajov inhibícia - koncentrácia sa použila nelineárna korelácia podľa Hilla (Hillov model). Počítala sa 50%-ná účinná koncentrácia (IC₅o) s využitím softvéru SAS (Statistical Software System; SAS Inštitúte, Inc., Čary, NC, USA).

-112Príklad 49

Rádiometrická analýza s rekombinantnou HCV NS3 proteázou

Na rádiometrickú analýzu použitý substrát DDIVPC-SMSYTW s rekombinantnou HCV NS3 proteázou sa štiepil enzýmom medzi cysteínovým a serínovým zvyškom. Uvedená sekvencia DDIVPC-SMSYTW zodpovedá NS5A/NS5B prirodzenému štiepnemu miestu v ktorom cysteínový zvyšok v P2 bol nahradený prolínom. Peptidový substrát DDIVPC-SMSYTW a značkovač biotín-DDIVPCSMS[¹²⁵I-Y]TW sa inkuboval s rekombinantnou NS3 proteázou v neprítomnosti alebo v prítomnosti inhibítorov. Oddelenie substrátu z produktov sa uskutočnilo pridaním agarózových perličiek s avidínovým povlakom do skúšobnej zmesi a odfiltrovaním. Stanovenie množstva SMS[¹²⁵I-Y]TW produktu vo filtráte (alebo s, alebo bez inhibítora) umožnilo výpočet percentuálnej premeny substrátu a percento inhibície.

A) Činidlá

Tris a Tris-HCl (Ultra-Pure) sa získali od Life Technologies. Glycerol (UltraPure), Mes a BSA boli dodané firmou Sigma®, TCEP od firmy Pierce, DMSO od firmy Aldrich® s NaOH od firmy Anachemia®.

Tlmivý roztok: 50 nM Tris.HCI, pH 7,5, 30 % (hmotnosť/objem) glycerol, 2 % (hmotnosť/objem) CHAPS, 1 mg.mľ¹ BSA, 1 mM TCEP (TCEP sa pridal až priamo pred použitím 1 M zásobného roztoku) vo vode.

Substrát: DDIVPC-SMSYTW, 25 μΜ konečná koncentrácia (z 2 mM zásobného roztoku v DMSO, uloženého pri -20 °C na zabránenie oxidácie).

Značkovač: redukovaný mono-jódovaný substrát (biotín-DDIVPC-SMS[¹²⁵l-Y]TW) (približne 1 nM konečná koncentrácia).

HCV NS3 proteáza typ 1b, 25 nM konečná koncentrácia (zo zásobného roztoku v 50 mM fosforečnane sodnom pH 7,5, 10%-nom glycerole, 300 mM NaCI, 5 mM DTT, 0,01 %-nom NP-40).

B) Protokol

-113Analýza sa uskutočnila na 96-jamkovej polypropylénovej platni. Každá jamka obsahovala: 20 μΙ substrátu/značkovača v tlmivom prostredí; 10 μΙ ± inhibítor v 20%-nom DMSO v tlmivom prostredí; 10 μΙ NS3 proteázy 1b.

Slepý pokus ((blank), bez inhibítora a bez enzýmu) a kontrolná vzorka ((cti) bez inhibítora) sa pripravili rovnako na rovnakej platni ako vzorky s inhibítorom a enzýmom (inh).

Enzymatická reakcia sa iniciovala pridaním roztoku enzýmu a vzorka sa inkubovala 60 minút pri 23 °C a mierne miešala. Na zastavenie enzymatickej reakcie sa pridalo 20 μΙ roztoku NaOH (ον₃οη = 0,025 mol.dm'³).

Na filtračnú platňu Milipore® MADP N65 sa pridalo 20 μΙ agarózových perličiek s avidínovým povlakom (Pierce). Skúšaná vzorka sa potom preniesla na filtračnú platňu a inkubovala 60 minút pri 23 °C za mierneho premiešavania. Filtrácia sa uskutočnila použitím zariadenia Milipore® Multiscreen Vacuum Manifold Filtration apparatus; 40 μΙ filtrátu sa prenieslo na opaknú 96 jamkovú platňu na ktorej bolo v každej jamke 60 μΙ scintilačnej kvapaliny.

Filtráty sa merali na prístroji Packard® TopCount Inštrument s použitím ¹²⁵lkvapalinového jednominútového protokolu.

Percento inhibície sa počítalo podľa nasledujúcej rovnice:

100 - [(pulzy_inh - pulzy_biank)/(pulzy_cti - pulzy_biank)j x 100

Na súbor dvojíc údajov inhibicia - koncentrácia sa použila nelineárna korelácia podľa Hilla (Hillov model). Počítala sa 50%-ná účinná koncentrácia (IC50) s využitím softvéru SAS (Statistical Software System; SAS Inštitúte, Inc., Čary, NC, USA).

Príklad 50

Analýza špecifickosti

Špecifickosť zlúčenín sa stanovovala vzhľadom z rôznym serínovým proteázam: ľudskej leukocytovej elastáze, bravčovej pankreatickej elastáze a bovinnému pankreatickému a-chymotrypsínu a vzhľadom na jednu cysteínovú proteázu: ľudský pečeňový katepsín B. Vo všetkých prípadoch sa použil protokol s 96

-114jamkovou platňou s použitím chrómogenného substrátu, špecifického pre každý enzým. Každá skúška zahŕňala jednohodinovú enzýmovovú-inhibítorovú preinkubáciu pri teplote miestnosti, nasledovalo pridanie substrátu a hydrolýza na úroveň 30%-nej premeny, čo bolo merané na UV Thermomax® mikroplatňovom čítači alebo fluorescenčným čítačom platní Perkin-Elmer® LS50B. Koncentrácie substrátu sa udržiavali čo najnižšie v porovnaní s K_M, aby sa znížil vplyv substrátu. Koncentrácie skúšaných zlúčenín sa menili od 300 do 0,06 μΜ v závislosti od ich účinkov.

Výsledné podmienky v každej analýze boli:

mM Tris.HCI pH 8, 0,5 M Na₂SO₄₎ 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3 % DMSO, 0,01 % Tween-20 s:

[100 μΜ Sukc-AAPF-pNA a 250 pM a-chymotrypsín], [133 μΜ Sukc-AAA-pNA a 8 nM bravčovej elastázy], [133 μΜ Sukc-AAV-pNA a 8 nM leukocytovej elastázy]; alebo [100 mM NaH₂PO₄ pH 6,1, 1mM EDTA, 3 % DMSO, 1 mM TCEP, 0.01 % Tween20, 4 μΜ Z-FR-AMC (7-amino-4-metylkumarín) a 0,5 nM katepsínu B (zásobný enzým sa pred použitím aktivoval v tlmivom roztoku obsahujúcom 20 mM TCEP)].

Typický príklad s použitím bravčovej pankreatickej elastázy:

Do polystyrénovej 96 jamkovej (s plochým dnom) platne (Cellwells, Corning) sa s použitím kvapalinového manipulátora Biomek (Beckman) dávkovalo:

μΙ tlmivého prostredia (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA);

I enzýmového roztoku (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 40 nM bravčovej pankreatickej elastázy) a 20 μΙ roztoku inhibítora (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 1,5 mM až 0,3 μΜ inhibítora, 15 % (objemových) DMSO),

Po 60 minútach predinkubácie pri teplote miestnosti sa do každej jamky pridal roztok substrátu (50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 μΜ Sukc-AAA-pNA) a zmesi sa ďalej hodinu inkubovali pri teplote miestnosti; potom sa určila absorbancia pomocou čítača platní Thermomax®. Zvolili

-115sa oddelené rady jamiek pre kontrolné vzorky (bez inhibítora) a pre slepé pokusy (blanky) (bez inhibítora a bez enzýmu).

Na inej platni sa robili pomocou dávkovača kvapalín dvojnásobné riedenia inhibičného roztoku s použitím riedidla 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NasCI, 0,1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20,15 % (objemových) DMSO.

Podobným spôsobom sa uskutočnili aj ostatné skúšky špecifikosti.

Percento inhibície sa počítalo s použitím vzorca:

[1 - ((UVinh-UB_b,_ank)/(UV_cti - UVbiank))] X 100

Na súbor údajov inhibícia - koncentrácia sa použila nelineárna korelácia podľa Hilla (Hillov model). Počítala sa 50%-ná účinná koncentrácia (IC₅o) s využitím softvéru SAS (Statistical Software System; SAS Inštitúte, Inc., Čary, NC, USA).

Príklad 51

NS3 proteázová analýza s bunkou (Cell-based Assay)

Táto skúška sa uskutočnila s Huh-7 bunkami, ľudskou bunkovou líniou odvodenou z hepatomu, ko-transfektovanými dvomi DNA konštruktami: jedným (označeným NS3) s exprimujúcou časťou HCV ne-stavebného polyproteínu, fúzovaného k tTa proteínu cez NS5A-NS5B štiepne miesto v nasledujúcom poradí: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-(NS5B)tTa, kde (NS5B) znamená šesť prvých aminokyselín z NS5B. Tento polyproteín je exprimovaný pod kontrolou CMV promótor, druhý konštrukt (označený SEAP), exprimujúci spravodajský proteín, vylučoval alkalickú fosfatázu (SEAP) pod kontrolou tTA-citlivého promótora.

Prvý konštrukt vedie k expresii polyproteínu, z ktorého sa štiepením NS3 proteázou uvoľňujú rôzne zrelé proteíny. Usudzuje sa, že zrelé vírusové proteíny tvoria komplex v membráne ergastoplazmy. tTA je fúzový proteín, opísaný Gossenem a Bujardom (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 až 5551 (1992), ktorý obsahuje DNA-väzbovú doménu a transkripčný aktivátor. Uvoľnenie tTA proteínu vyžaduje NS3-závislé štiepenie na štiepnom mieste NS5A - NS5B medzi NS5A a tTA. Toto štiepenie umožňuje migráciu tTA do jadra a transaktivovať SEAP gén.

-116Zníženie NS3 proteolytickej aktivity preto vedie k obmedzeniu prieniku tTA do cytoplazmy a sprievodné zníženie SEAP aktivity.

Na ovládnutie - kontrolu iných bunkových aktivít ako je inhibícia NS3 proteázy, spôsobených zlúčeninou - inhibítorom sa uskutoční ko-transfekcia s konštruktom exprimujúcim samotný tTA a s rovnakým spravodajským konštruktom tak, že SEAP aktivita je nezávislá od NS3 proteázy.

Protokol analýzy

Huh-7 bunky, pestované v CHO-SFII (Life Technologies) + 10% FCS (fetálne teľacie sérum), sa ko-transfektovali dvomi DNA konštruktami v nasledujúcich pomeroch:

pg NS3 + 500 ng SEAP + 800 μΙ FuGENE (Boehringer Mannheim) na 4x10⁶ Huh7 buniek. Po 5 hodinách pri 37 °C sa bunky premyli, trypsínovali a očkovali (80 000 buniek na jamku) do 96 jamkových platní, obsahujúcich rôzne koncentrácie skúšaných zlúčenín. Po 24 hodinovej inkubačnej perióde sa v prostredí merala SEAP aktivita pomocou súpravy Phospha-Light (Tropix).

Analýza vzťahu percent inhibície SEAP aktivity k koncentrácii zlúčeniny sa uskutočnila použitím softvéru SAS a vypočítali sa hodnoty EC50.

Tabuľky zlúčenín

Nasledujúce tabuľky obsahujú zoznam zlúčenín, predstavujúcich tento vynález.

Zistilo sa, že všetky zlúčeniny, uvedené v Tabuľkách 1 až 9 sú podľa enzymatickej analýzy (Príklad 48) aktívne. Čísla označené hviezdičkou (*) predstavujú enzymatickú aktivitu, stanovenú rádiometrickou analýzou (Príklad 49) s IC50 hodnotami pod 50 μΜ. V tomto hodnotení výsledkov z enzymatickej analýzy sa použilo nasledujúce vyjadrenie: A 1 μΜ; 1 μΜ > B > 0,1 μΜ a C 0,1 μΜ.

Viaceré zlúčeniny sa hodnotili analýzou špecifickosti (podľa Príkladu 50) a zistilo sa, že sú špecifické k NS3 proteáze. Výsledky analýz rôznych špecifickostí sú vo všeobecnosti: HLE > 300 μΜ; PPE > 300 μΜ; α-Chym. > 300 μΜ; Katepsín B > 300 μΜ; tieto výsledky ukazujú, že zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú vysoko

-117špecifické k HCV NS3 proteáze a nepredpokladá sa, že by mali vážne vedľajšie účinky. Niektoré z týchto zlúčenín boli ďalej skúšané analýzou s bunkami, opísanou v Príklade 51 a zistilo sa, že sú účinné s EC50 pod 10 μΜ, čo potvrdzuje, že tieto zlúčeniny môžu prenikať bunkovou membránou. Podrobnejšie, zlúčeniny v Tabuľke 7, 8 a 9 boli hodnotené skúškou s bunkami a výsledky sa uvádzajú v poslednom stĺpci. V tejto analýze s bunkami sa použilo hodnotenie vyjadrením: A > 1 μΜ; B 1 μΜ.

V Tabuľkách sa použili tieto skratky:

MS: údaje hmotnostnej spektrometrie s elektrorozprašovaním; m/z MH⁺ s výnimkou, pokiaľ sa neuvádza inak hviezdičkou * = m/z MH'; Ac: acetyl; Bn: benzyl; Boe: tercbutyloxykarbonyl; Ph: fenyl; Pr: propyl.

Tabuľka 1

Jeden stereoizomér na R¹

Zlúčenina číslo	Dvojitá väzba	D-R1 väzba stereochémia	R'2	MS	Enzýmová aktivita
101	12,13 trans	1R, D syn k amidu	fenyl	685,8	A*
102	nijaká	1R, D syn ku kyseline	fenyl	687,2	C
103	nijaká	1R, D syn k amidu	fenyl	687,2	A*

Tabuľka 2

Jeden stereoizomér na R¹

Zlúč. č.	R3	R^	Dvojitá väzba	D-R1 väzba stereochémia	Ŕ21”	R22”	MS	Enzým. aktivita
202	NH-Boc	H	11,12- trans	1/? alebo 1S, D, syn ku kyseline	H	H	593,7	B
203	NH- acetyl	H	11,12- trans	1R alebo 1 S, D, syn ku kyseline	H	H	535,6	A
205	NH-Boc	11- OH 12- OH cis	žiadna	1R alebo 1 S, D, syn ku kyseline	H	H	627,7	B
206	NH-Boc	H	13,14 - cis	1 R, D syn ku kyseline	H	H	593,7	C
207	NH-Boc	H	13,14- cis	1 R, D syn ku kyseline	OMe	H	623,7	C
208	NH-Boc	H	13,14- cis	1R, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	699,8	C

-119-

209	ΝΗ- C(O)- ΝΗ- terc-Bu	H	13,14- cis	1 R, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	698,8	C
210	NH-Boc	H	13,14- cis	1 S, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	699,8	A*
211	nh2	H	13,14- cis	1/?, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	599,7	C
213	OH (jeden izomér)	H	13,14- cis	1 R, D syn ku kyseline	OMe	H	524,6	B
214	NH-Boc	10-oxo	13,14- cis	1R, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	713,8	C
215	NH-Boc	H	žiadna	1/?, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	701,8	C
217	NH-Boc	10-OH (zmes diastereo- mérov)	13,14- cis	1 R, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	715,8	C
218	NH-Boc	10-oxo	13,14- c/s	1/?, D syn k amidu	OMe	fenyl	713,8	C
219	NH-Ac	H	žiadna	1R, D syn ku kyseline	OMe	fenyl	643,2	C
220	NH-Boc	H	13,14- cis	1R, D syn k amidu	OMe	Λ	706,2	C

-120Tabuľka 3

Jeden stereoizomér na R¹

Zlúč. č.	R3	-D-	D-R1 väzba sterchem.	R31		MS	Enzým. aktivita
301	NH- Boc	Λ 16 7. e ,sí ''-%Λ Γ	1R alebo 1S, D syn ku kyseline	H	H	621,7	B
302	NH- Boc		1R, D syn k amidu	OMe	Ph	671	A
303	NH- Boc	8 10 12 14 Λ'Υ'Γ	1R, D syn k amidu	OMe	Ph	701,3	B
304	NH- Boc	’'WSr^	ÍR, D syn ku kyseline	OMe	Ph	711,1	C
305	HO	’·- λ - t • 10 >- 12 13	1R, D syn ku kyseline	OMe	Ph	602,2	B
306	NH- Boc	\ JL jj**-^12 8 19	1R, D syn k amidu	OMe	Ph	673,2	A*

P P

-121 -

307	NH- Boc	• » ÍM	1R, D syn ku kyseline	OMe	λΛ>” H 777	C
308	NH- Ac	” 12 13	1K, D syn ku kyseline	OMe	OEt	609,2	C

Tabuľka 4

D-R¹ väzba syn ku kyseline

Zlúč. č.	-R3-	9-X	11,12 dvojitá väzba	MS	Enzým. aktivita
401	H	ch2	trans	699,3	C
402	H	ch2	cis	699,4	B
403	H	O	trans	701,3	C
404	« * Me'	O	trans	715,3	B
405	/ Me	O	trans	715,2	C
406	H	O	žiadna	703,3	C

-122-

407	• * Me'	0	žiadna	717,3	B
408	/ Me	0	žiadna	717,3	C
409	/ Me	0	cis	715,2	B
410	/ Me	s	trans	731,3	C
411	/ Me	s	cis	731,3	A*
412	8-(Me)2	9-S	cis	745,3	A

Tabuľka 5

D-R¹ väzba syn ku kyseline

Zlúč. č.	10-X	11 -X	12-X	MS	Enzým. aktivita
501	ch2	0	ch2	703,2	C
502	ch2	ch2	ch2	701	C
503	ch2	ch2	NH	702,3	A

e * e e

-123-

504	ch2	ch2	N(Me)	716,3	A*
505	ch2	ch2	N(CO)Me	744,3	B
506	ch2	ch2	N(CO)Ph	806,3	B
507	NH	ch2	ch2	702,3	C
508	N(CO)Me	ch2	ch2	744,3	C

Tabuľka 6

D-R¹ väzba syn ku kyseline

Zluc. c.	R21	Ŕ22-	MS	Enzým. aktivita
601	N(Me)2	h Z? N—Y Áf	776,2	C
602	OH	(CFa)	675,2 *	C
603	OMe	θ'-s	690,1	C

-124Tabuľka 7

D-R¹ väzba syn ku kyseline

Zlúč. č.	' R4	X9; X10 alebo X11	13,14 dvojitá väzba	Ŕ52-	MS	Bunková aktivita
701	H	11-0	cis	fenyl	701,3	A
702	H	ch2	cis		763,1	B
703	H	ch2	žiadna		751,4	B
704	H	ch2	cis	jO	700,3	B
705	H	ch2	cis	-AJ	706,2	B
707	H	ch2	cis		748,2	B
708	H	ch2	cis		749,2	B

-125-

709	Η	ch2	žiadna	H o -CH	765,2	B
710	Η	ch2	žiadna		750,1	B
711	Η	ch2	žiadna	O N	702,2	B
712	Η	ch2	c/s	-OEt	667,3	B
713	Η	ch2	žiadna		708,1	B
714	Η	ch2	žiadna	-OEt	669,3	B
715	Η	ch2	c/s	O	688,3	B
716	Η	ch2	c/s	-ď	705,3	A
717	Η	ch2	c/s	-U	705,2	B
718	Η	ch2	c/s	P	689,3	B
719	Η	ch2	c/s		714,2	B
720	Η	ch2	žiadna		751,2	B
721	Η	ch2	žiadna	A	716,3	B

-126-

722	Η	ch2	cis	fr	703,3	B
723	Η	ch2	žiadna	/-7	690,3	B
724	Η	ch2	žiadna	H o AfV V «	781,1	B
725	Η	ch2	cis		748,2	B
726	Η	ch2	cis	η	703,2	B
727	Η	ch2	cis	-CH2-0Me	667,3	A
728	Η	ch2	cis	Me	637,3	A
729	Η	ch2	cis		735,2	B
730	Η	ch2	žiadna	H O Vť -Vs HN^	780,1	B
731	Η	ch2	cis	-čf	721,1	B
732	Η	ch2	cis	-0	705,3	A
733	Η	ch2	cis	O /-n	689,3	B
734	Η	ch2	cis	A /-N	703,2	B

-127-

735	H	ch2	cis		749,2	B
736	H	ch2	cis		779,2	B
737	H	ch2	cis		730,2	B
738	H	ch2	cis	/“N	703,2	B
739	10-(/?) Me	ch2	žiadna	Ph	715,2	B
740	10-(S) Me	ch2	žiadna	Ph	715,3	B
741	H	ch2	cis		763,1	B

Tabuľka 8

D-R¹ väzba syn ku kyseline, dvojitá väzba 13,14: cis

-128-

Zlúč. č.	-Ŕ32-	r1-	R22-	MS	Bunková aktivita
801	o-^	H	H n	761,2	B
803	n-Pr	H	OEt	637,3	A
804	W	H	H O	790,3	B
805		H		700,1	B
806		H	OEt	663,2	A
807		H	OEt	679,3	B
808		H	OEt	653,2	A
809	a. o	H	~</ϊ°	775,1	B
810		H	γΛ	761,2	B
811	<A	H		747,2	B
812		H	yNaa/NHz	733,2	B
813	Y	H	OEt	691,3	B
814	<Y	H	Aí	718,3	B
815	<Y	H	A	726,3	B

-129 -

816	21	H		776,3	B
817		H	-RČ	760,2	B
818	cv	H		791,1	BB
819		H	xrV'2'	833,2	B
820		H		747,2	B
821.	<v	H	O	700,9	B
822		H		775,4	B
823		H	rr z*	715,2	B
824		10-(R) Me	OEt	693,0	B

Tabuľka 9

D-R¹ väzba syn ku kyseline

-130-

Zlúč. č.	Ŕ32	R4	R22	MS	Bunková aktivita
901	cu	H	OEt	681,3	B
902	<v	H		719,9	B
903	cu	H	-O	705,9	B
904	<v	H		703,0	B
905	cu	H	Λ /-N	689,0	B
906		H	~u	762,0	B
907	CU	H	P	702,0	B
908		H	AT	735,2	B
909	CU	H	-^Y	777,0	B
910		H		763,1	B
911	CU	H	H	777,0	B
912		H		748,9	B
913	o·^	H		762,9	B
914	<=u	H	-M	749,0	B

-131 -

915		Η		751,1	B
916		10(R) Me	OEt	695,2	B

-132-

Claims (56)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1 .Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I v ktorom

   W je CH alebo N,

   R²¹ je H, halogén, Ci.₆-alkyl, C3-6-cykloalkyl, Ci.₆-halogénalkyl, Ci.₆-alkoxy, C₃.₆cykloalkyloxy, hydroxy alebo skupina N(R²³)2, pričom R²³ je nezávisle H, C^-alkyl alebo, C₃.₆-cykloalkyl;

   R²² je H, halogén, Ci.₆-alkyl, C₃-e-cykloalkyl, Ci-6-halogénalkyl, Ci-e-tioalkyl, C1-6alkoxy, C₃.6-cykloalkoxy, C2-7-alkoxyalkyl, C₃.6-cykloalkyl, Οβ alebo Cw aryl alebo Het, pričom Het je päť, šesť alebo sedemčlenný, nasýtený alebo nenasýtený, heterocyklický kruh, obsahujúci jeden až štyri heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa dusík, kyslík a síru;

   uvedený cykloalkyl, aryl alebo Het je substituovaný skupinou R²⁴, pričom R²⁴ je H, halogén, Ci.6-alkyl, C3.6-cykloalkyl, Ci-6-alkoxy, C3-6-cykloalkoxy, NO2, N(R²⁵)2, NH-C(O)-R²⁵ alebo NH-C(O)-NH-R²⁵, v ktorom R²⁵ je vzájomne nezávisle od seba: H, Ci-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

   alebo R²⁴ je NH-C(O)-OR²⁶, v ktorom R²⁶ je Ci-6-alkyl alebo C₃-6-cykloalkyl;

   R³ je hydroxy, NH2 alebo skupina vzorca -NH-R³¹, kde R³¹ je C6 alebo C₁₀ aryl, heteroaryl, -C(O)-R³², -C(O)-NHR³² alebo -C(O)-OR³², pričom R³²je Ci.₆-alkyl alebo C₃.6-cykloalkyl;

   r í

   -133 D je 5 až 10 atómový, nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec, ktorý voliteľne obsahuje jeden až tri heteroatómy, nezávisle od seba vybrané z: O, S alebo N-R⁴¹, kde

   R⁴¹ je H, Ci-6-alkyl, Cjj-e-cykloalkyl alebo -C(O)-R⁴², kde R⁴² je Ci-6-alkyl, Ca-e-cykloalkyl alebo C6 alebo Cw aryl;

   R⁴ je H alebo uvedený reťazec D, substituovaný na ktoromkoľvek uhlíku jedným až troma substituentami, pričom substituenty sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa: Ci_6-alkyl, Ci-e-halogénalkyl, Ci-6-alkoxy, hydroxy, halogén, amino, oxo, tio alebo C-i-e-tioalkyl; a

   A je amid vzorca -C(O)-NH-R⁵, pričom R⁵ je vybrané zo skupiny ktorá zahŕňa: C^alkyl, C3-6-cykloalkyl, Ce alebo Cw aryl alebo C7-i6-aralkyl; alebo A je karboxylová kyselina alebo jej farmaceutický prípustná soľ alebo jej farmaceutický prípustný ester.
2. 2. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde skupina R¹ je vybraná z dvoch rozdielnych diastereoizomérov, znázornených štruktúrami i a ii:

   (i) D syn vzhľadom na amid alebo (ii) D syn vzhľadom na A
3. 3. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 2, kde D je viazané v konfigurácii syn k A, ako je znázornené štruktúrou ii.
4. 4. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde W je N; R²¹ je H, Ci-6-alkyl, Ci-e-alkoxy, hydroxy, chlór alebo N(R²³)₂, kde R²³ je výhodne H alebo Ci_6-alkyl,

   R²² je H, Ci-6-tioalkyl, Ci-e-alkoxy, fenyl alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   -134- kde R²⁴ je H, Ci.₆-alkyl, NH-R²⁵, NH-C(O)-R²⁵; alebo NH-C(O)-NH-R²⁵, kde R²⁵ je nezávisle: H, Ci-6-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl;

   alebo NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je C^-alkyl.
5. 5. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 4, kde R²¹ je H alebo Ci.₆-alkoxy.
6. 6. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 4, kde R²² je Ci-4-alkoxy, fenyl alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   kde R²⁴ je H, Ci-6-alkyl, NH-R²⁵ alebo NH-C(O)-R²⁵, kde R²⁵ je Ci-6-alkyl alebo C3.6-cykloalkyl, alebo NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je určené v nároku 4.

   -1357. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 6, kde R²¹ je metoxy.
7. 8. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 7, kde R²² je etoxy alebo Het, vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   R' ,24b alebo kde R^24a je NH-R²⁵ alebo NH-C(O)-R²⁵, kde R²⁵ je Cve-alkyl;

   alebo R^24a je NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je Ci-6-alkyl, a R^24b je H alebo Ci-e-alkyl.
8. 9. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde R³ znamená amid vzorca NH-C(O)R³² alebo močovinu vzorca NH-C(O)-NH-R³² alebo karbamát vzorca NH-C(O)-OR³², kde R³² je Ci-e-alkyl alebo C3-6-cykloalkyl.
9. 10. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 9, kde R³ je močovina alebo karbamát, kde R³² je Ci-6-alkyl alebo C4-6-cykloalkyl.
10. 11. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 10, kde R³ je karbamát a R³² je ŕerc-butyl, cyklobutyl alebo cyklopentyl.
11. 12. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde D je šesť až osem atómový, nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec, voliteľne obsahujúci jeden alebo dva heteroatómy nezávisle vybrané z: O, S alebo N-R⁴¹, kde R⁴¹ je H, C-i-6-alkyl alebo C₂-7-acyl.
12. 13. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 12, kde D voliteľne obsahuje jeden heteroatóm, vybraný z: NH alebo N-C2-7-acylu.

    -136
13. 14. Makrocyklické peptidy podľa nároku 13, kde heteroatóm je vybraný z: NH alebo N(Ac).
14. 15. Makrocyklické peptidy podľa nároku 13, kde reťazec D obsahuje sedem atómov.
15. 16. Makrocyklické peptidy podľa nároku 15, kde uvedený heteroatóm je v polohe 10 reťazca D.
16. 17. Makrocyklické peptidy podľa nároku 13, kde reťazec D je nasýtený.
17. 18. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 12, kde D je šesť až osem atómový, nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec, voliteľne obsahujúci jeden heteroatóm vybraný z: O alebo S.
18. 19. Makrocyklické peptidy podľa nároku 18, kde reťazec D obsahuje sedem atómov.
19. 20. Makrocyklické peptidy podľa nároku 19, kde uvedený heteroatóm je v polohe 9 reťazca D.
20. 21. Makrocyklické peptidy podľa nároku 20, kde reťazec D je substituovaný v polohe 8 substituentom R⁴, kde R⁴ je H alebo Ci-6-alkyl.
21. 22. Makrocyklické peptidy podľa nároku 21, kde R⁴ je H alebo metyl.
22. 23. Makrocyklické peptidy podľa nároku 22, kde R⁴ je H alebo 8-(S)-Me.
23. 24. Makrocyklické peptidy podľa nároku 23, kde reťazec D je nasýtený.
24. 25. Makrocyklické peptidy podľa nároku 19, kde reťazec D obsahuje jednu dvojitú väzbu v polohe 11,12.

    -13726. Makrocyklické peptidy podľa nároku 25, kde dvojitá väzba je trans.
25. 27. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 12, kde D je šesť až osem atómový, nasýtený alebo nenasýtený, iba uhlíkový alkylénový reťazec.
26. 28. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 27, kde D je sedem-atómový reťazec.
27. 29. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 28, kde D je nasýtený reťazec.
28. 30. Makrocyklické peptidy podľa nároku 29, kde reťazec D je substituovaný substituentom R⁴, pričom R⁴ je H, oxo, hydroxy, alkoxy alebo alkyl.
29. 31. Makrocyklické peptidy podľa nároku 30, kde substituent R⁴ je H alebo Ci-6-alkyl.
30. 32. Makrocyklické peptidy podľa nároku 31, kde substituent R⁴ je H alebo metyl.
31. 33. Makrocyklické peptidy podľa nároku 32, kde substituent R⁴ je H alebo 10-(S)-Me.
32. 34. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 28, kde D obsahuje jednu dvojitú väzbu.
33. 35. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 34, kde dvojitá väzba je v polohe 13,14 reťazca D.
34. 36. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 35, kde dvojitá väzba je c/s.

    -13837. Makrocyklické peptidy podľa nároku 36, kde reťazec D je substituovaný substituentom R⁴, pričom R⁴ je H, oxo, hydroxy, Ci.₆-alkoxy alebo Ci.₆-alkyl.
35. 38. Makrocyklické peptidy podľa nároku 37, kde substituent R⁴ je H alebo C^-alkyl.
36. 39. Makrocyklické peptidy podľa nároku 38, kde substituent R⁴ je H alebo metyl.
37. 40. Makrocyklické peptidy podľa nároku 39, kde substituent R⁴ je H alebo 10-(S)-Me.
38. 41. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde A je karboxylová kyselina.
39. 42. Makrocyklické peptidy podľa nároku 1, kde W je N;

    R³ je skupina vzorca -NH-C(O)-NHR³² alebo -NH-C(O)-OR³², kde R³² je Ci_4-alkyl alebo C4-6-cykloaikyl;

    D je šesťatómový až osematómový, nasýtený alebo nenasýtený alkylénový reťazec viazaný k R¹ syn vzhľadom na A, voliteľne obsahujúci jeden alebo dva heteroatómy, nezávisle vybrané zo skupiny: O, S alebo N-R⁴¹, kde R⁴¹ je H alebo C2-7-3cyl;

    R⁴ je H, alebo reťazec D, substituovaný jedným až troma substituentami, pričom substituenty sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa: hydroxy alebo C^-alkyl; a

    A je karboxylová kyselina alebo jej farmaceutický prípustná soľ alebo ester.
40. 43. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 42, kde R²¹ je H alebo metoxy;

    R²² je Ci-6-aikoxy alebo HET vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

    R^24b

    -139kde R^24a je H, C1.6-alkyl, NH-R²⁵ , NH-C(O)-R²⁵; alebo NH-C(O)-NH-R²⁵, pričom R²⁵ je H, Ci-6-alkyl alebo C3.6-cykloalkyl;

    alebo R^24a je NH-C(O)-OR²⁶, kde R²⁶ je Ci.₆-alkyl alebo C₃-6-cykloalkyl;

    a R^24b je H alebo C-i-6-aIkyl;

    R³ je močovina vzorca N-C(O)-NHR³² alebo karbamát vzorca N-C(O)-OR³², kde R³² je Ci-e-alkyl alebo C₃-6-cykloalkyl;

    D je sedem-atómový alkylénový reťazec, voliteľne obsahujúci jednu dvojitú väzbu v polohe 11,12 alebo 13,14;

    uvedený reťazec D voliteľne obsahuje jeden heteroatóm, nezávisle vybraný z: O, S, NH, N(Me), alebo N(Ac); a R⁴ je H alebo Ci-6-alkyl.
41. 44. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 43, kde R²¹ je metoxy a R²² je etoxy, alebo

    R' ,24a v ktorom R^24a je NH-(Ci-₄-alkyl), NH-C(O)-(C^-alkyl), NH-C(O)-O-(C^-alkyl) alebo NH-C(O)-NH-(Ci_4-alkyl);

    D je sedem-atómový, iba uhlíkový reťazec, nasýtený alebo obsahujúci jednu cis dvojitú väzbu v polohe13,14.
42. 45. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca

    COOH

    -140zahŕňajúce jeden stereoizomér na R¹, pričom uvedená dvojitá väzba, D-R¹ väzbová stereochémia a R²² sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo Dvojitá väzba D-R¹ väzbová stereochémia -R²²- 101 12,13-ŕrans 1R, D syn k amidu fenyl 102 nijaká 1R, D syn ku kyseline fenyl a 103 nijaká 1R, D syn k amidu fenyl
43. 46. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca zahŕňajúce jeden stereoizomér na R¹, pričom poloha dvojitej väzby, D-R¹ väzbová stereochémia, R²¹ a R²² sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo R^{3 —}R*^- Dvojitá väzba D-R¹ väzbová stereochémia “Ŕ²¹” 202 NH-Boc H 11,12- trans 1R alebo 1S, D syn ku kyseline H H 203 NH- acetyl H 11,12- trans 1R alebo 1S, D syn ku kyseline H H

    -141 -

    205 NH-Boc 11- OH 12- OH cis žiadna 1R alebo 1S, D syn ku kyseline H H . 206 NH-Boc H 13,14 - cis 1R, D syn ku kyseline H H 207 NH-Boc H 13,14- cis 1 R, D syn ku kyseline OMe H 208 NH-Boc H 13,14- cis 1R, D syn ku kyseline OMe fenyl 209 NH- C(O)- NH-ŕerc- Bu H 13,14- cis 1R, D syn ku kyseline OMe fenyl 210 NH-Boc H 13,14- cis 1 S, D syn ku kyseline OMe fenyl 211 nh₂ H 13,14- cis 1 R, D syn ku kyseline OMe fenyl 213 OH (jeden izomér) H 13,14- cis 1R, D syn ku kyseline OMe H 214 NH-Boc 10-oxo 13,14- c/s 1 R, D syn ku kyseline OMe fenyl 215 NH-Boc H žiadna 1R, D syn ku kyseline OMe fenyl 217 NH-Boc 10-OH (zmes diastereo- mérov) 13,14- cis 1R, D syn ku kyseline OMe fenyl 218 NH-Boc 10-oxo 13,14- cis 1R, D syn k amidu OMe fenyl

    -142-

    219 NH-Ac H žiadna 1R, D syn ku kyseline OMe fenyl a 220 NH-Boc H 13,14- c/s 1R, D syn k amidu OMe
44. 47. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca zahŕňajúce jeden stereoizomér na R¹, pričom R³, D, D-R¹ väzbová stereochémia R²¹ a R²² sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo R³ -D- D-R¹ väzbová stereochémia R²¹ Ŕ²² 301 NH-Boc Al6 \ ” C ^,C ,2-U 1R alebo 1 S, D syn ku kyseline H H 302 NH-Boc 1R, D syn k amidu OMe Ph 303 NH-Boc a io « ⁹ n « 1R, D syn k amidu OMe Ph 304 NH-Boc ₇e’‘\. jíK '3-^j/ * ¹⁵ 12 1K, D syn ku kyseline OMe Ph

    -143r «

    305 HO \ ® ” t ϊ'Λτ \ 12 13 1«, D syn ku kyseline OMe Ph 306 NH-Boc ** * ⁸ 10 1R, D syn k amidu OMe Ph 307 NH-Boc ^{7 5 8} ” « * 1/?, D syn ku kyseline OMe H n a 308 NH-Ac ¹⁰ 12 13 1R, D syn ku kyseline OMe OEt
45. 48. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca pričom D-R¹ väzba je syn ku kyseline, R⁴, X⁹ a dvojitá väzba 11,12 sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo -Ŕ* x⁹— 11,12 dvojitá väzba 401 H ch₂ trans 402 H ch₂ cis 403 H 0 trans

    r ŕ

    P P

    -144-

    404 % Me' O trans 405 / Me O trans 406 H O žiadna 407 % Me' O žiadna 408 / Me O žiadna 409 / Me O c/s 410 / Me S trans 411 / Me S cis a 412 8-(Me)₂ 9-S cis
46. 49. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca kde D-R¹ väzba je syn ku kyseline, X¹⁰, X¹¹ a X¹² sú určené nasledovne:

    -145-

    Zlúčenina číslo X¹⁰ X¹¹ x¹² 501 ch₂ 0 ch₂ 502 ch₂ ch₂ ch₂ 503 ch₂ ch₂ NH 504 ch₂ ch₂ N(Me) 505 ch₂ ch₂ N(CO)Me 506 ch₂ ch₂ N(CO)Ph 507 NH ch₂ ch₂ 508 N(CO)Me ch₂ ch₂
47. 50. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca kde D-R¹ väzba je syn ku kyseline, R²¹ a R²² sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo R²¹ R^ 601 N(Me)₂ R° Ä/ 602 OH (CF₃) 603 OMe

    -14651. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca kde D-R¹ väzba je syn ku kyseline, R⁴, X⁹, X¹⁰, X¹¹, dvojitá väzba 13,14 a R⁴ sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo -Ŕ³ X⁹; X¹⁰; alebo X¹¹ 13,14 dvojitá väzba -R²²- 701 H 11-0 cis fenyl 702 H ch₂ cis H o -tn 703 H ch₂ žiadna -tn 704 H ch₂ cis 705 H ch₂ cis 707 H ch₂ cis W' 708 H ch₂ cis -tn

    -147-

    709 H ch₂ žiadna h o 710 H ch₂ žiadna a/' 711 H ch₂ žiadna JO N 712 H ch₂ cis -OEt 713 H ch₂ žiadna Rl 714 H ch₂ žiadna -OEt 715 H ch₂ c/s O 716 H ch₂ c/s -tí N 717 H ch₂ c/s N—/ -V 718 H ch₂ c/s o 719 H ch₂ c/s .ó 720 H ch₂ žiadna 721 H ch₂ žiadna ,0

    -148-

    722 Η ch₂ cis A /-⁷ 723 Η ch₂ žiadna o 724 Η ch₂ žiadna H O 725 Η ch₂ cis -ď' 726 Η ch₂ cis p 727 Η ch₂ cis -CH₂-OMe 728 Η ch₂ cis Me 729 Η ch₂ cis / IZ fr 730 Η ch₂ žiadna H o κΎ 731 Η ch₂ cis -tf 732 Η ch₂ cis -Q 733 Η ch₂ cis p 734 Η ch₂ cis A /N

    -149-

    735 H ch₂ cis H Ό 736 H ch₂ cis 737 H ch₂ cis 738 H ch₂ cis 739 10-(R)Me ch₂ žiadna Ph 740 10-(S)Me ch₂ žiadna Ph 741 H ch₂ cis
48. 52. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca kde D-R¹ väzba je syn ku kyseline, dvojitá väzba 13,14 je cis, R^32, R⁴ a R²² sú určené nasledovne:

    P

    -150-

    Zlúčenina číslo -R³² i?— R²² 801 H H O -cn 803 n-Pr H OEt 804 b·!' H 805 H 806 cr H OEt 807 <b- H OEt 808 H OEt 809 H 810 H -3 811 H I / xz 812 H -cf 813 Y H OEt

    -151 -

    814 H N) 815 H A 816 H xz 817 <A H s 818 H 819 <A H Α'Η' 820 □U H 821 <L· H Λ z* 822 <A H H . *^5 823 a. o H ťV /-N a 824 <v 10-(R)Me OEt

    - 15253. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca

    COOH kde D-R¹ väzba je syn ku kyseline, R^32, R⁴ a R²² sú určené nasledovne:

    Zlúčenina číslo -Ŕ³² i?— -Ŕ²²- 901 <v H OEt 902 H 903 θ'* H N*-. A.1 904 <v H A /-N 905 0^ H A Y 906 <v H Y s

    -153-

    907 cv H p 908 H -U' 909 H 910 <V H 911 H y xz 912 H 913 H 914 <v H -tr 915 ^z o H -y a 916 <v 10(/?)Me OEt

    -15454. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vírusovo účinné množstvo makrocyklického peptidu všeobecného vzorca I podľa nároku 1 proti hepatitíde C, alebo jeho terapeuticky prípustnej soli alebo esteru v zmesi s farmaceutický prípustným nosným prostredím alebo pomocnou látkou.
49. 55. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 54, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje ďalšiu imunomodulačnú látku.
50. 56. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 55, vyznačujúci sa , I t ý m, že sa ďalšia imunomodulačná látka vyberie zo skupiny, ktorá zahŕňa α-, β- a δ-interferóny.
51. 57. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 54, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje protivírusovú látku.
52. 58. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 57, vyznačujúci sa t ý m, že protivírusová látka sa vyberie zo skupiny, ktorá zahŕňa ribavirín a amantadín.
53. 59. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 54, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje ďalší inhibítor HCV proteázy.
54. 60. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 55, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje inhibítor ďalších cieľov v životnom cykle HCV, ako je helikáza, polymeráza alebo metaloproteáza.
55. 61. Makrocyklické peptidy všeobecného vzorca I podľa nároku 1 na použitie na inhibíciu množenia vírusu hepatitídy C vystavením vírusovej NS3 proteázy vírusu hepatitídy C.
56. 62. Použitie makrocyklických peptidov všeobecného vzorca I podľa nároku 1 na výrobu lieku na liečenie vírusovej infekcie hepatitídy C u cicavca.