ES2230084T3 - Peptidos macrociclicos que inhiben la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de **fórmula** en la que W es CH o N, R21 es H, halo, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, haloalquilo C1-6, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-6, hidroxi o N(R23)2, en donde cada R23 es, independientemente, H, alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-6; R22 es H, halo, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, haloalquilo C1-6, tioalquilo C1-6, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-6, alcoxi C2-7-alquilo, cicloalquilo C3-6, arilo C6 ó 10 o Het, en donde Het es un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado, que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre; estando dichos cicloalquilo, arilo o Het sustituidos con R24, en donde R24 es H, halo, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-6, NO2, N(R25)2; NH-C(O)-R25; o NH-C(O)-NH-R25, en donde cada R25 es, independientemente: H, alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-6; o R24 es NH-C(O)-OR26, en donde R26 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-6.

Description

Péptidos macrocíclicos que inhiben la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones, a la preparación de tales compuestos y a métodos para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (HCV). En particular, la presente invención proporciona nuevos análogos de péptidos, composiciones farmacéuticas que contienen tales análogos, y métodos para usar estos análogos en el tratamiento de una infección por HCV.

Fundamento de la invención

El virus de la hepatitis C (HCV) es el principal agente etiológico de la hepatitis no-A no-B, de adquisición post-transfusional y comunitaria en el mundo entero. Se estima que más de 170 millones de personas están infectadas por el virus en todo el mundo. Un elevado porcentaje de portadores llegan a estar infectados crónicamente y muchos prosiguen hasta una enfermedad hepática crónica, la llamada hepatitis C crónica. Este grupo es a su vez de alto riesgo para enfermedades hepáticas graves tales como cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y enfermedades hepáticas terminales que llevan a la muerte.

El mecanismo por el cual el HCV establece persistencia viral y produce una elevada tasa de enfermedades hepáticas crónicas no ha sido aún dilucidado del todo. No se sabe cómo interacciona el HCV con el sistema inmunitario del hospedador y lo evade. Además, quedan aún por establecer los papeles de las respuestas inmunes celulares y humorales en la protección frente a la infección por HCV y la enfermedad. Se han publicado inmunoglobulinas para la profilaxis de la hepatitis viral asociada a transfusiones, pero el Centro para el Control de Enfermedades no recomienda actualmente el tratamiento con inmunoglobulinas con esta finalidad. La falta de una respuesta inmune protectora eficaz está estorbando el desarrollo de una vacuna o de adecuadas medidas profilácticas post-exposición, por lo que a corto plazo las esperanzas están firmemente articuladas en intervenciones antivirales.

Se han llevado a cabo diversos estudios clínicos con el objeto de identificar agentes farmacéuticos capaces de tratar eficazmente la infección por HCV en pacientes afectados de hepatitis C crónica. Estos estudios han implicado el uso de interferón-alfa, solo o en combinación con otros agentes antivirales. Tales estudios han indicado que un número sustancial de los participantes no responden a estas terapias, y, entre los que sí responden favorablemente, se encontró que una gran proporción recaía después de la terminación del tratamiento.

Hasta hace pocos años, el interferón (IFN) era la única terapia disponible de provecho confirmado, aprobada clínicamente para pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo, la tasa de respuesta mantenida es baja y el tratamiento con interferón induce también graves efectos secundarios (p. ej. retinopatía, tiroiditis, pancreatitis aguda, depresión) que reducen la calidad de vida de los pacientes tratados. El interferón, en combinación con ribavirina, fue aprobado originalmente para pacientes que no responden al IFN solo. Ahora ha sido aprobado para pacientes simples y actualmente constituye el "patrón oro" en la terapia del HCV. Sin embargo, los efectos secundarios provocados por el IFN no se ven aliviados con esta terapia de combinación.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar agentes antivirales eficaces para el tratamiento de la infección por HCV que superen las limitaciones de las terapias farmacéuticas existentes.

El HCV es un virus de RNA de cadena positiva envuelto, de la familia de los Flaviviridae. El genoma de RNA del HCV de cadena simple tiene una longitud de aproximadamente 9500 nucleótidos y tiene un único marco de lectura abierto (ORF) que codifica una única y gran poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es segmentada en múltiples sitios por proteasas celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) es realizada por dos proteasas virales. La primera, hasta ahora escasamente caracterizada, segmenta en el empalme NS2-NS3; la segunda es una proteasa de serina contenida dentro de la región N-terminal de NS3 (denominada por ello proteasa NS3) y media todas las segmentaciones subsiguientes corriente abajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de segmentación NS3-NS4A, como en trans, para los sitios restantes NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como cofactor para la proteasa NS3 y posiblemente asistiendo en la localización de la membrana de NS3 y otros componentes de la replicasa viral. La formación del complejo de la proteína NS3 con NS4A parece necesaria para los eventos de procesamiento, mejorando la eficiencia proteolítica en la totalidad de los sitios. La proteína NS3 muestra también actividades de nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa. La NS5B es una RNA polimerasa dependiente del RNA que está implicada en la replicación del HCV.

La solicitud de patente WO 97/06804 describe el enantiómero (-) del análogo de nucleósido citosina-1,3-oxatiolano (también conocido como 3TC) como activo frente a HCV. Este compuesto, aunque calificado como seguro en ensayos clínicos previos frente al HIV y al HBV, ha de ser aún clínicamente probado como activo contra el HCV y su mecanismo de acción contra el virus no ha sido aún publicado.

Una estrategia general para el desarrollo de agentes antivirales es desactivar enzimas codificadas viralmente que son esenciales para la replicación del virus. En esta disposición, los intensos esfuerzos para descubrir compuestos que inhiben la proteasa NS3 o la RNA helicasa del HCV han llevado a las siguientes descripciones:

La patente de EE.UU. 5.633.388 describe carboxamidas sustituidas con heterociclos y análogos como activas frente al HCV. Estos compuestos están dirigidos contra la actividad de helicasa de la proteína NS3 del virus, pero aún no se han publicado pruebas clínicas.

Chu et al. (Tet. Lett. (1996), 7229-7232) han publicado que una fenantrenoquinona tiene actividad contra la proteasa NS3 de HCV in vitro. No se ha publicado ningún desarrollo posterior acerca de este compuesto.

Un trabajo publicado en la Novena Conferencia Internacional sobre Investigación Antiviral, Urabandai, Fukyshima, Japón (1996) (Antiviral Research (1996) 30, 1, A23 (resumen 19)) informa acerca de derivados de tiazolidina que son inhibidores de la proteasa del HCV.

Varios estudios han informado acerca de compuestos inhibidores para otras proteasas de serina, tales como la elastasa leucocitaria humana. Una familia de estos compuestos se publica en el documento WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Los péptidos descritos en esa solicitud son análogos del morfolinilcarbonil-benzoil-péptido que son estructuralmente diferentes de los péptidos de la presente invención.

El documento WO 98/17679 de Vertex Pharmaceuticals Inc. describe inhibidores de proteasa de serina, en particular la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

Hoffman La Roche (documento WO 98/22496; patente de EE. UU. 5.866.684 y patente de EE.UU. 6.018.020) ha publicado también hexapéptidos que son inhibidores de proteinasa útiles como agentes antivirales para el tratamiento de la infección por HCV.

Steinkühler et al. e Ingallinella et al. han publicado acerca de la inhibición de producto NS4A-4B (Biochemistry (1998) 37, 8899-8905 y 8906- 8914).

El documento WO 97/43310 de Schering Corporation describe secuencias peptídicas de 20 y 21 aminoácidos activas contra la proteasa NS3 del HCV.

El documento WO 98/46597 de Emory University describe péptidos y simulaciones de péptidos activos in vitro contra proteasas de serina.

El documento WO 98/46630 de Peptide Therapeutics Limited describe sustrato depsipeptídico que inhibe la proteasa NS3 del HCV.

Finalmente, la patente de EE.UU. 5.869.253 describe moléculas de RNA enzimáticas que inhiben la proteasa NS3 del HCV.

Ninguna de las anteriores solicitudes de patente descritas antes describe o sugiere péptidos cíclicos activos y selectivos contra la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

Los documentos WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09543 y WO 00/09558 describen de hexa- a tetra-péptidos y análogos de tripéptidos que inhiben la proteasa NS3. Sin embargo, estas descripciones no sugieren ni llevan al diseño de análogos macrocíclicos de la presente invención.

El documento WO 99/38888, publicado el 5 de agosto de 1999 por el Institute de Richerche di Biologia Moleculare (IRBM), describe inhibidores de péptidos pequeños de la proteasa NS3 del HCV. No hay nada en esta descripción que sugiera o indique la naturaleza cíclica de los péptidos de la presente invención. Además, esta solicitud PCT fue publicada después de la fecha de prioridad de la presente solicitud.

El documento WO 99/64442 del IRBM, también publicado después de la fecha de prioridad de esta solicitud, describe oligopéptidos con cetoácidos en P1.

El documento WO 99/50230 de Vertex Pharmaceuticals (publicado el 7 de octubre de 1999) fue también publicado después de la fecha de prioridad de la presente solicitud. Incluso así, la publicación no sugiere ni remotamente ningunos de los péptidos cíclicos de la presente invención.

El documento WO 00/09543 de Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. (publicado el 24 de febrero de 2000) también se publicó después de la fecha prioritaria de la presente solicitud. Incluso así, la publicación no sugiere ni remotamente ningunos de los péptidos cíclicos de la presente invención.

Una ventaja de la presente invención es que proporciona péptidos macrocíclicos que son inhibidores para la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C.

Una ventaja adicional de un aspecto de la invención reside en el hecho de que estos péptidos inhiben específicamente la proteasa NS3 y no muestran una actividad inhibidora significativa contra otras proteasas de serina tales como la elastasa leucocitaria humana (HLE), elastasa pancreática porcina (PPE), o quimiotripsina pancreática bovina, o proteasas de cisteína tales como la catepsina B hepática humana (Cat B).

Una ventaja adicional de la presente invención es que proporciona péptidos pequeños de bajo peso molecular que son capaces de atravesar las membranas de las células e inhiben la actividad de la proteasa NS3 en cultivos de células.

Todavía, una ventaja adicional de los compuestos de la presente invención reside en el hecho de que son activos en ambos genotipos principales encontrados en aislados clínicos (1a y 1b), sugiriendo fuertemente que este compuesto será activo contra todos los genotipos del HCV conocidos actualmente.

Sumario de la invención

Se incluyen en el alcance de la invención compuestos de fórmula (I):

1

en la que W es CH o N,

R^{21} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, hidroxi o N(R^{23})_{2}, en donde cada R^{23} es independientemente H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}; y

R^{22} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo C_{1-6}, tioalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, alcoxi C_{2-7}-alquilo, cicloalquilo C_{3-6}, arilo C_{6 \ ó \ 10} o Het, en donde Het es un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado, que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre; estando dichos cicloalquilo, arilo o Het sustituidos con R^{24},

en donde R^{24} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, NO_{2}, N(R^{25})_{2}; NH-C(O)-R^{25}, o NH-C(O)-NH-R^{25},

en donde cada R^{25} es, independientemente: H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

o R^{24} es NH-C(O)-OR^{26} en donde R^{26} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

R^{3} es hidroxi, NH_{2}, o un grupo de fórmula -NH-R^{31}, en donde R^{31} es arilo C_{6 \ ó \ 10}, heteroarilo, -C(O)-R^{32}, -C(O)-OR^{32} o -C(O)-NHR^{32},

en donde R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

D es una cadena de alquileno de 5 a 10 átomos saturada o insaturada, que opcionalmente contiene uno a tres heteroátomos independientemente elegidos entre: O, S o N-R^{41}, en donde R^{41} es H, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6} o -C(O)-R^{42}, en donde R^{42} es alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6} o arilo C_{6 \ ó \ 10};

R^{4} es H o de uno a tres sustituyentes en cualquier átomo de carbono de dicha cadena D, dicho sustituyente elegido independientemente entre el grupo formado por: alquilo C_{1-6}, haloalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxi, halo, amino, oxo, tio o tioalquilo C_{1-6}, y

A es una amida de fórmula -C(O)-NH-R^{5}, en donde R^{5} se elige entre el grupo formado por: alquilo C_{1-8}, cicloalquilo C_{3-6}, arilo C_{6 \ ó \ 10} o aralquilo C_{7-16};

o A es un ácido carboxílico o una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable.

Se incluye dentro del alcance de esta invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz como anti-virus de la hepatitis C de un compuesto de fórmula I, o una sal o éster del mismo aceptables terapéuticamente, mezclado con un medio vehículo o un agente auxiliar aceptables farmacéuticamente.

Un aspecto importante de la invención implica el uso del compuesto de fórmula I, según se describe antes, para la preparación de un medicamento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C.

Otro aspecto importante implica el uso del compuesto de fórmula I, según se describe antes, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por virus de la hepatitis C.

De acuerdo con una realización, las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden un agente inmunomodulador adicional. Ejemplos de agentes inmunomoduladores adicionales incluyen, pero no se limitan a \alpha-, \beta- y \delta-interferones.

De acuerdo con una realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente un agente antiviral. Ejemplos de agentes antivirales incluyen ribavirina y amantadina.

De acuerdo con otra realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente otros inhibidores de la proteasa del HCV.

De acuerdo con otra realización alternativa más, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden comprender adicionalmente un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV tales como helicasa, polimerasa, metaloproteasa o IRES.

Descripción detallada de realizaciones preferidas Definiciones

Como se usa en el presente texto, las definiciones que siguen son válidas a menos que se indique otra cosa:

Con referencia a los casos en los que se usan (R) o (S) para designar la configuración absoluta de un sustituyente, p. ej. R^{4}, del compuesto de fórmula I, la designación se hace en el contexto del compuesto completo y no en el contexto de solamente el sustituyente.

La designación "P1, P2 y P", como se usa en el presente texto, se refiere a la posición de los restos de aminoácidos partiendo del extremo del término C de los análogos de péptido y prolongándose hacia el término N (es decir, P1 se refiere a la posición 1 a partir del término C, P2: segunda posición a partir del término C, etc.) (véase Berger A. y Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)).

Como se usa en el presente texto, la expresión "ácido 1-aminociclopropil-carboxílico" (ACCA) se refiere a un compuesto de fórmula:

2

Como se usa en el presente texto, la expresión "vinil-ACCA" se refiere a un compuesto de fórmula:

3

Como se usa en el presente texto, la expresión "homoalil-ACCA" se refiere a un compuesto de fórmula:

4

El término "halo", como se usa en el presente texto, significa un sustituyente de halógeno elegido entre bromo, cloro, flúor o yodo.

La expresión "haloalquilo C_{1-6}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa sustituyentes de alquilo acíclico, de cadena lineal o ramificada, que contienen de 1 a seis átomos de carbono que tienen uno o más hidrógenos sustituidos con un halógeno elegido entre bromo, cloro, flúor o yodo.

La expresión "tioalquilo C_{1-6}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa sustituyentes de alquilo acíclico, de cadena lineal o ramificada, que contienen un grupo tiol, tal como un tiopropilo.

La expresión "alquilo C_{1-6}" o "alquilo inferior", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa sustituyentes de alquilo acíclico, de cadena lineal o ramificada, que contienen de 1 a seis átomos de carbono, e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo.

La expresión "cicloalquilo C_{3-6}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa un sustituyente de cicloalquilo que contiene de tres a seis átomos de carbono, e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. La expresión "cicloalquilo insaturado" incluye, por ejemplo, el sustituyente ciclohexenilo:

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La expresión "alquileno saturado o insaturado", como se usa en el presente texto, significa un sustituyente de alquilo divalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada extremo de un hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado, e incluye, por ejemplo:

-CH_{2}CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH_{2}CH_{2}-,

\hskip0,5cm

-CH_{2}CH_{2}CH=CHCH_{2}CH_{2}-

\hskip0,5cm

o

\hskip0,5cm

-CH_{2}C\equivCCH_{2}CH_{2}-.

Esta cadena de alquilo puede contener opcionalmente un heteroátomo tal como oxígeno (por ejemplo: CH_{3}-CH_{2}-O-CH_{2}-).

La expresión "alcoxi C_{1-6}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa el sustituyente -O-alquilo C_{1-6}, en donde alquilo es como se definió antes, que contiene hasta seis átomos de carbono. Alcoxi incluye metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi y 1,1-dimetiletoxi. Este último sustituyente es conocido comúnmente como terc-butoxi.

La expresión "cicloalquilo C_{3-6}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa el sustituyente -O-cicloalquilo C_{3-6} que contiene de tres a 6 átomos de carbono.

La expresión "alcoxi C_{1-6}-alquilo", como se usa en el presente texto, significa el sustituyente alquil C_{1-6}-O-alquilo C_{1-6}, en la que alquilo es como se definió anteriormente, que contiene hasta seis átomos de carbono. Por ejemplo, metoximetilo significa -CH_{2}-O-CH_{3}.

La expresión "acilo C_{2-7}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa un grupo alquilo C_{1-6} unido a través de un grupo carbonilo tal como -C(O)-alquilo C_{1-6}.

La expresión "arilo C_{6} o C_{10}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa un sistema monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o bien un sistema bicíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo incluye un sistema de anillo de fenilo o de naftilo.

La expresión "aralquilo C_{7-16}", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa un arilo como se definió anteriormente unido a través de un grupo alquilo, en donde el alquilo es como se definió anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Aralquilo incluye, por ejemplo, bencilo y butilfenilo.

El término "Het" como se usa en el presente texto, bien sea solo o en combinación con otro sustituyente, significa un sustituyente monovalente derivado por eliminación de un hidrógeno de un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado (incluyendo aromático), que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Los ejemplos de heterociclos adecuados incluyen: tetrahidrofurano, tiofeno, diazepina, isoxazol, piperidina, dioxano, morfolina, pirimidina o

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El término "Het" incluye también un heterociclo como se definió anteriormente fusionado con uno o más de otros ciclos, sea un heterociclo o cualquier otro ciclo. Un ejemplo de estos incluye tiazolo[4,5-b]-piridina.

Aunque generalmente se encuentra bajo el término "Het", el término "heteroarilo", como se usa en el presente texto, define con precisión un heterociclo insaturado para el cual los dobles enlaces forman un sistema aromático. Ejemplos adecuados de sistema heteroaromático incluyen: quinolina, indol, piridina,

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La expresión "éster aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, bien sea sola o en combinación con otro sustituyente, significa ésteres del compuesto de fórmula I en los que cualquiera de las funciones carboxilo de la molécula, pero preferentemente el término carboxi, está reemplazado por una función alcoxicarbonilo:

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en la que el resto R del éster se elige entre alquilo (p. ej. metilo, etilo, n-propilo, t-butilo, n-butilo); alcoxialquilo (p. ej. metoximetilo); alcoxiacilo (p. ej. acetoximetilo); aralquilo (p. ej. bencilo); ariloxialquilo (p. ej. fenoximetilo); arilo (p. ej. fenilo), opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1-4} o alcoxi C_{1-4}. Otros ésteres profármacos adecuados se encuentran en Design of Prodrugs, Bundgaard, H. comp. Elsevier (1985), que se incorpora al presente texto como referencia. Tales ésteres aceptables farmacéuticamente se hidrolizan normalmente in vivo cuando son inyectados en un mamífero, y se transforman en la forma ácido del compuesto de fórmula I.

Con relación a los ésteres descritos anteriormente, a menos que se especifique otra cosa, cualquier resto alquilo presente contendrá ventajosamente de 1 a 16 átomos de carbono, en particular de 1 a 6 átomos de carbono. Cualquier resto arilo presente en tales ésteres comprende ventajosamente un grupo fenilo.

En particular los ésteres pueden ser un éster de alquilo C_{1-16}, un éster de bencilo no sustituido o un éster de bencilo sustituido con al menos un halógeno, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, nitro o trifluorometilo.

La expresión "sal aceptable farmacéuticamente", como se usa en el presente texto, incluye las sales derivadas de bases aceptables farmacéuticamente. Ejemplos de bases adecuadas incluyen colina, etanolamina y etilendiamina. Las sales de Na^{+}, K^{+} y Ca^{++} se consideran también dentro del alcance de la invención (véase también Pharmaceutical Salts, Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. (1977), 66, 1-19, incorporada al presente texto como referencia).

Realizaciones preferidas

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I como se describió anteriormente, en la que el centro del carbono 1 tiene la configuración R y D está unido en la configuración syn respecto a A como se representa por las estructuras (i) y (ii):

9

Más preferentemente, el enlazador D está unido en la configuración syn respecto a A como se representa por la estructura (ii).

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I como se describió anteriormente, en la que el resto de fórmula

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en donde W es preferentemente N.

Preferentemente, R^{21} es H, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxi, cloro o N(R^{23})_{2}, en donde R^{23} es preferentemente H o alquilo C_{1-6}. Más preferentemente, R^{21} es H o alcoxi C_{1-6}. Lo más preferentemente R^{21} es metoxi.

Preferentemente R^{22} es H, tioalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, fenilo o Het elegido entre el grupo formado por:

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Preferentemente, R^{24} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25}, NH-C(O)-R^{25}; o NH-C(O)-NH-R^{25} o NH-C(O)-OR^{26}.

Más preferentemente, R^{22} es alcoxi C_{1-4}, fenilo o Het elegido entre el grupo formado por:

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Más preferentemente, R^{24} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25}, NH-C(O)-R^{25}; o NH-C(O)-OR^{26}.

Lo más preferentemente, R^{22} es etoxi, o Het elegido entre el grupo formado por:

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Lo más preferentemente, R^{24a} es NH-R^{25}, NH-C(O)-R^{25} o NH-C(O)-OR^{26}. Lo más preferentemente, R^{24b} es H o alquilo C_{1-6}.

Preferentemente, cada R^{25} es independientemente H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}. Más preferentemente, R^{25} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}. Más preferentemente, R^{25} es alquilo C_{1-6}.

Preferentemente, R^{26} es alquilo C_{1-6}.

R^{3}:

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I como se describió anteriormente, en la que el resto R^{3} es preferentemente una amida de fórmula NH-C(O)-R^{32}, una urea de fórmula NH-C(O)-NH-R^{32}, o un carbamato de fórmula NH-C(O)-OR^{32}. Más preferentemente, R^{3} es un carbamato o una urea. Lo más preferentemente, R^{3} es un carbamato.

Preferentemente, R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}. Más preferentemente, R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{4-6}. Lo más preferentemente, R^{32} es terc-butilo, ciclobutilo o ciclo-pentilo.

D:

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I, en la que el enlazador D es una cadena de alquileno de 6 a 8 átomos, saturada o insaturada. Más preferentemente, el enlazador D es una cadena de 7 átomos.

Preferentemente, la cadena D contiene uno o dos heteroátomos elegidos entre: O, S, NH, N-alquilo C_{1-6} o N-acilo C_{2-7}. Más preferentemente, la cadena D contiene opcionalmente un heteroátomo elegido entre: NH o N-acilo C_{2-7}, lo más preferentemente N(Ac), y está situado en el átomo 10 de la cadena. Lo más preferentemente, la cadena que contiene un átomo de nitrógeno está saturada.

Alternativamente, D contiene un heteroátomo elegido entre O ó S. Preferentemente, cuando D tiene una longitud de 7 átomos, el átomo O ó S está en la posición 9 de la cadena. Preferentemente, esta cadena está sustituida con R^{4}, en donde R^{4} es H o alquilo C_{1-6}. Más preferentemente, R^{4} es H o metilo. Lo más preferentemente, R^{4} es H u 8-(S)-Me. Aún más preferentemente, D está saturado. Alternativamente, D contiene un doble enlace en posición 11,12. Preferentemente, este doble enlace es trans.

Alternativamente, D es una cadena todo carbono de alquileno saturada o insaturada. En este caso, D está preferentemente saturado y es de una longitud de 7 átomos. Más preferentemente, D está sustituido con R^{4}, en donde R^{4} es oxo, tio, hidroxi, tioalquilo, alcoxi o alquilo. Más preferentemente, R^{4} es H o alquilo C_{1-6}. Lo más preferentemente, R^{4} es H o metilo. Lo más preferentemente, R^{4} es H ó 10-(S)-Me.

Alternativamente, D es una cadena todo carbono de alquileno que contiene preferentemente un doble enlace y es de una longitud de 7 átomos. Más preferentemente, este doble enlace está en posición 13,14 de la cadena. Lo más preferentemente, este doble enlace es cis. Preferentemente, esta cadena D está sustituida con R^{4}, en donde R^{4} es H, oxo, hidroxi, alcoxi o alquilo. Más preferentemente, R^{4} es H o alquilo C_{1-6}. Incluso más preferentemente, R^{4} es H o metilo. Lo más preferentemente, R^{4} es H ó 10-(S)-Me.

A:

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I como se describió anteriormente, en la que A es un ácido carboxílico.

Realizaciones específicas

Realizaciones preferidas de la presente invención incluyen compuestos de fórmula I como se describió anteriormente, en la que R^{2} es un sustituyente de quinolina (es decir W es N);

R^{3} es un grupo de fórmula -NH-C(O)-NHR^{32} o -NH-C(O)-OR^{32}, en donde R^{32} es alquilo C_{1-4} o cicloalquilo C_{4-6};

D es una cadena de alquileno de 6 a 8 átomos saturada o insaturada unida a R^{1} en configuración syn respecto a A, que opcionalmente contiene uno o dos heteroátomos independientemente elegidos entre: O, S ó N-R^{41}, en donde R^{41} es acilo C_{2-7};

R^{4} es H, o de uno a tres sustituyentes elegidos independientemente entre hidroxi o alquilo C_{1-6}; y

A es un ácido carboxílico, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

Más preferentemente son compuestos de fórmula I, en la que R^{1} es como se definió anteriormente; R^{21} es H o metoxi;

R^{22} es alcoxi C_{1-6}, o Het elegido entre el grupo formado por:

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en donde R^{24a} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25}, -NH-C(O)-R^{25}, -NH-C(O)-NH-R^{25},

en donde R^{25} es H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

o R^{24a} es -NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

y R^{24b} es H o alquilo C_{1-6};

R^{3} es una urea de fórmula -NH-C(O)-NHR^{32} o un carbamato de fórmula -NH-C(O)-OR^{32}, en la que R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

D es una cadena de alquileno de 7 átomos de C saturada o insaturada, que opcionalmente contiene un doble enlace en posición 11,12 ó 13,14;

conteniendo opcionalmente dicha cadena D un heteroátomo elegido independientemente entre: O, S, NH, N(Me) o N(Ac); y

R^{4} es H o alquilo C_{1-6}.

Lo más preferentemente, son compuestos de fórmula I, en la que R^{21} es metoxi, y R^{22} es etoxi o:

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en donde R^{24a} es NH-(alquilo C_{1-4}), NH-C(O)-(alquilo C_{1-4}) o NH-C(O)-O-(alquilo C_{1-4}); y

D está saturado o contiene un doble enlace cis en posición 13,14.

Finalmente, están incluidos en el alcance de esta invención todos los compuestos de fórmula I que se presentan en las Tablas 1 a 9.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas oralmente, parenteralmente o mediante un reservorio implantado. Se prefieren la administración oral o la administración mediante inyección. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualesquiera soportes, coadyuvantes o vehículos convencionales, no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, el pH de la formulación puede ajustarse con ácidos, bases o tampones aceptables farmacéuticamente para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de suministro. El término parenteral, como se usa en el presente texto, incluye las técnicas de infusión o inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intrasternal, intratecal e intralesional.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de preparado inyectable estéril, por ejemplo como suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión puede ser formulada de acuerdo con métodos conocidos en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse oralmente en cualquier forma de dosificación aceptable oralmente incluyendo, pero sin limitarse a ellas, cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los soportes que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran oralmente suspensiones acuosas, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes y/o saborizantes y/o colorantes.

Otros vehículos o soportes adecuados para las formulaciones y composiciones anteriormente indicadas pueden encontrarse en textos farmacéuticos convencionales, p. ej. en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995. Niveles de dosificación entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal por día, de los compuestos inhibidores de proteasa descritos en el presente texto, son útiles en una monoterapia para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por el HCV. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención serán administradas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 veces al día o, alternativamente, como infusión continua. Tal administración puede usarse como terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales de soporte para producir un forma de dosificación individual variará dependiendo del hospedador tratado y del modo de administración particular. Un preparado típico contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Preferentemente, tales preparados contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo.

Como apreciará el profesional experto, pueden requerirse dosis más bajas o más altas que las citadas antes. La dosificación específica y los regímenes de tratamiento para cualquier paciente particular dependen de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de la infección, la disposición del paciente hacia la infección y el criterio del médico responsable del caso. En general, el tratamiento se inicia con pequeñas dosificaciones sustancialmente menores que la dosis de péptido óptima. A continuación, la dosificación se aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias dadas. En general, lo más deseable es administrar el compuesto a un nivel de concentración que generalmente proporcione resultados eficaces antiviralmente sin provocar ningún efecto secundario nocivo ni perjudicial.

Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de fórmula I y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben estar presentes en un nivel de dosificación entre aproximadamente 10 y 100%, y más preferentemente entre aproximadamente 10 y 80% de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia.

Cuando estos compuestos o sus sales aceptables farmacéuticamente se formulan junto con un vehículo aceptable farmacéuticamente, la composición resultante puede ser administrada in vivo a mamíferos, tales como el hombre, para inhibir la NS3 proteasa del HCV o para tratar o prevenir la infección por el virus HCV. Tal tratamiento puede también conseguirse usando los compuestos de esta invención en combinación con agentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos: agentes inmunomoduladores tales como \alpha-, \beta- o \gamma-interferones; otros agentes antivirales tales como ribavirina, amantadina; otros inhibidores de la proteasa NS3 del HCV; inhibidores de otras dianas del ciclo vital del HCV tales como helicasa, polimerasa, metaloproteasa o sitio de entrada al ribosoma interno (IRES); o combinaciones de los mismos. Los agentes adicionales pueden combinarse con los compuestos de esta invención para crear una forma de dosificación individual. Alternativamente, estos agentes adicionales pueden ser administrados separadamente a un mamífero como parte de una forma de dosificación múltiple. En consecuencia, otra realización de esta invención proporciona métodos para inhibir la actividad de la proteasa NS3 del HCV en mamíferos administrando un compuesto de fórmula I, en la que los sustituyentes son como se definió anteriormente.

En una realización preferida, estos métodos son útiles para reducir la actividad de la proteasa NS3 del HCV en un mamífero. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de la proteasa del HCV, o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV tales como helicasa, polimerasa o metaloproteasa. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes de, o al mismo tiempo que la administración de las composiciones de esta invención.

En una realización preferida alternativa, estos métodos son útiles para inhibir la replicación viral en un mamífero. Tales métodos son útiles para tratar o prevenir enfermedades por el HCV. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de esta invención como componente activo, tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar a dicho mamífero un agente elegido entre un agente inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de la proteasa del HCV, o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV. Tal agente adicional puede ser administrado al mamífero antes, al mismo tiempo, o después de la administración de la composición de acuerdo con esta invención.

Los compuestos expuestos en el presente texto pueden ser usados también como reactivos de laboratorio. La solicitante proporciona por primera vez compuestos con un bajo peso molecular, que soy muy activos y específicos frente a la proteasa NS3 del HCV. Algunos de los presentes compuesto pueden ser instrumentales para proporcionar herramientas de investigación para diseñar ensayos de replicación viral, validación de sistemas de ensayo con animales y estudios estructurales de biología para incrementar los conocimientos del mecanismo de las enfermedades por el HCV.

Los compuestos de esta invención pueden usarse también para tratar o prevenir la contaminación viral de materiales, y por tanto para reducir el riesgo de infección viral del personal médico o de laboratorio, o de pacientes que entran en contacto con tales materiales (p. ej. sangre, tejidos, instrumentos e indumentaria quirúrgicos, instrumentos e indumentaria de laboratorio, y aparatos y materiales para obtención de sangre o para transfusiones).

Metodología

En los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558 se describen varias formas de llevar a cabo la síntesis de intermedios acíclicos de compuestos de fórmula I.

Los compuestos de la presente invención se sintetizan de acuerdo con el procedimiento general ilustrado en los Esquemas I, II y III (en los que PG es un grupo protector apropiado). [En todos los esquemas presentados a continuación, D' tiene la misma definición que D, pero es de 2 a 5 átomos más corto].

Cuando la invención cubre compuestos de fórmula I, en la que A es una amida N-sustituida, vinil-ACCA o homo-alil-ACCA es acoplado a una amina apropiada antes del acoplamiento con P2. Tal acoplamiento será fácilmente reconocido por los expertos en la técnica. Como reconocerán los expertos en la técnica, tal amida (A) no está protegida, sino que lleva cualquier sustituyente relevante R^{5} como se definió antes.

La reacción de cierre de anillo (macrociclización) se lleva a cabo por metátesis de olefina (Esquema I), o cuando el enlazador contiene un átomo de nitrógeno, por aminación reductora (Esquema II) o por formación de enlace peptídico (Esquema III). Los detalles de estos procedimientos se presentan a continuación:

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A. Macrociclización mediante metátesis de olefina

Esquema I

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La invención también se refiere a productos intermedios de las fórmulas (A), (D), (E) y (G):

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en donde X es PG o R^{2};

cada PG es, independientemente, un grupo protector;

R^{2} es un grupo de fórmula

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en donde R^{21}, R^{22} y W son como se definen en la reivindicación 1;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y n es 2;

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en donde X, A' y PG son como se definen para las fórmulas (A) y (B); n es 1 ó 2;

D' es como se define para D, pero siendo 2 a 5 átomos más corta; y

D se define como para la fórmula (I);

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en donde R^{2} es como se define para las fórmulas (A) y (B), R^{3} y D son como se definen para la fórmula (I);

y

A' es un ácido carboxílico protegido.

Esquema I

Hay varias formas por las que puede llevarse a cabo la secuencia de acoplamiento, que pueden ser fácilmente reconocidas por los expertos en la técnica. Partiendo de 4-(S)-hidroxiprolina, el sustituyente en el 4-hidroxi puede ser incorporado mediante una reacción de Mitsunobu (como se describe en Mitsunobu, Synthesis 1981, enero, 1-28; Rano et al. Tet. Lett. 1994, 36, 3779-3792; Krchnak et al. Tet. Lett. 1995, 36, 6193-6196) antes o después de la macrociclización. Alternativamente, el conjunto puede hacerse con la prolina 4-(R)-hidroxi-sustituida requerida, como se describe en los procedimientos generales de los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558 (véase más adelante para ejemplos específicos de estos fragmentos).

Etapas A, B, C

Brevemente, los restos P1, P2 y P3 pueden ser unidos por técnicas de acoplamiento de péptidos bien conocidas y descritas de un modo general en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558.

Etapa D

La formación del macrociclo puede llevarse a cabo mediante una metátesis de olefina usando un catalizador basado en Ru tal como el publicado por Miller, S.J.; Blackwell, H.E.; Grubbs, R.H. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9606-9614 (a); Kingsbury, J.S.; Harrity, J.P.A.; Bonitatebus, P.J.; Hoveyda, A.H.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 791-799 (b) y Huang, J.; Stevens, E.D.; Nolan, S.P.; Petersen, J.L.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2674-2678 (c). Se reconocerá también que pueden usarse para esta reacción catalizadores que contienen otros metales de transición tales como Mo.

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Etapa E

Opcionalmente, el doble enlace se reduce por métodos de hidrogenación estándar bien conocidos en la técnica. Cuando A' es un ácido carboxílico protegido, también se le desprotege apropiadamente.

B. Macrociclización mediante aminación reductora (para enlazadores que contienen N)

Cuando el enlazador contiene un átomo de nitrógeno, la macrociclización se logra por aminación reductora como se muestra en el Esquema II para obtener inhibidores de estructura general II.

Esquema II

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Etapa A

La hidroboración del doble enlace según el procedimiento de Brown (H.C. Brown y B.C. Subba Rao, J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 6434-6437), seguida por la oxidación del alcohol resultante (por ejemplo mediante el peryodinato de Dess-Martin, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7277-7287) proporciona el correspondiente aldehído.

Etapa B

La hidrogenación en presencia de ácido conduce a la eliminación del grupo protector de amino, seguida por macrociclización mediante aminación reductora. La unidad P3 usada en esta síntesis se obtiene fácilmente a partir de una variedad de aminoácidos tales como lisina, ornitina, glutamina (después de una reacción de Hofmann: Ber. 1881, 14, 2725) y otros; estas modificaciones de síntesis son métodos bien conocidos en la técnica.

Etapa C

Opcionalmente, la amina secundaria en el enlazador D (formada después de la etapa D) es alquilada con haluros de alquilo o acetilada con cloruros de ácido de arilo o alquilo usando metodologías bien conocidas en la técnica para obtener inhibidores de estructura general II. Cuando A' es un ácido carboxílico protegido, también se le desprotege apropiadamente.

La invención se refiere, además, a los productos intermedios de las fórmulas (J), (K) y (L):

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en donde R^{2} es como se define para las fórmulas (A) y (B) y R^{3} es como se define para la fórmula (I);

m es 1 a 5;

n es 1 a 5;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y Cbz es benciloxicarbonilo.

C. Macrociclización mediante formación de lactama

Alternativamente, se entiende que estos compuestos macrocíclicos con estructura general I y II pueden ser sintetizados por otros caminos. Por ejemplo, P1 y P3 pueden ser primero conectados al enlazador D, después acoplados a P2, y la reacción de macrociclización puede ser una formación de lactama de dos formas posibles, como será reconocido por los expertos en la técnica, y como se muestra en el Esquema III.

Esquema III

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Síntesis de P1

La síntesis de inhibidores con estructura general I y II requiere los mismos fragmentos P1:

a) vinil ACCA, cuya síntesis y resolución se describen en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558, o

b) homoalil ACCA (Ejemplo 1, compuesto 1f).

Síntesis de P2

Algunos de los fragmentos de P2 usados para la síntesis de compuestos de fórmula I se describen en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558.

Otros fragmentos de P2 se sintetizan como sigue:

a. Síntesis del derivado 2-"Het"-4-hidroxi-7-metoxiquinolina (i) Planteamiento a partir del correspondiente ácido "Het" carboxílico IVb

Esquema IV

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La síntesis se lleva a cabo de acuerdo con un procedimiento modificado descrito en Li et al. J. Med. Chem. 1994, 34, 3400-3407. El producto intermedio IVa, en el que R^{21} = OMe (Ejemplo 7, compuesto 7b) se prepara como se describe en Brown et al. J. Med. Chem. 1989, 32, 807-826.

Etapa A

El producto intermedio IVa es acoplado con ácidos carboxílicos heterocíclicos IVb bajo condiciones básicas con POCl_{3} para activar el grupo carboxilato. Se usan diversos ácidos carboxílicos con la estructura general IVb para la preparación de inhibidores; éstos están disponibles comercialmente o bien se sintetizan como se indica en los esquemas V, VI y VII, o se sintetizan individualmente usando métodos descritos en los ejemplos específicos.

Etapa B

El cierre del anillo, seguido por deshidratación, se consigue bajo condiciones básicas para obtener quinolinas de estructura general IVd.

(i.a). Síntesis de ácidos "Het" carboxílicos de fórmula general IVb Síntesis de derivados 2-(sustituido)-amino-4-carboxi-aminotiazol (Vc)

Se usa el procedimiento modificado descrito por Berdikhina et al. Chem. Heterocycl. Compd. (Traduc. inglesa) 1991, 4, 427-433.

Esquema V

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Se preparan diversos ácidos 2-alquilaminotiazolil-4-carboxílicos, compuestos de estructura general Vc, usando la metodología general de síntesis señalada en el Esquema V usando tioureas (Va) con diferentes sustituyentes de alquilo (R^{25}: grupo alquilo) y ácido 3-bromopirúvico. Este tipo de reacción de condensación en bien conocido en la técnica. Alternativamente, el fragmento P2 que contiene los derivados de 2-amino-sustituido-tiazol son sintetizados a partir del correspondiente derivado 2-carboxilo como se muestra en el esquema VI de acuerdo con el procedimiento de: Unangst, P.C.; Connor, D.T. J. Heterocyc. Chem. 29, 5, 1992, 1097-1100.

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Esquema VI

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Ejemplos de este procedimiento se describen en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558.

Síntesis de derivados 2-carboxi-4-aminotiazol sustituido VIId

Se preparan diversos ácidos 4-alquiltiazol-2-carboxílicos, compuestos estructura general VIId, usando la metodología de síntesis general que se señala en el Esquema VII.

Esquema VII

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El procedimiento descrito por Janusz et al. J. Med. Chem. 1998, 41, 3515-3529 se usa con modificaciones como se describen a continuación: se hace reaccionar tiooxamato de etilo (VIIa) con diferentes \beta-bromocetonas de estructura general VIIb (R^{24} = grupo alquilo) para formar ácidos tiazolil-carboxílicos de estructura general VIId. Este tipo de reacción de condensación es bien conocido en la técnica.

Síntesis de derivado 2-carboxi-(sustituido)-imidazol (VIIIb)

Se preparan diversos ácidos alquilimidazolil-2-carboxílicos, compuestos de estructura general VIIIb, usando la metodología general de síntesis señalada en el Esquema VIII.

Esquema VIII

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Se usó el procedimiento descrito por Baird et al. J. Amer. Chem. Soc. 1996, 118, 6141-6146: se desprotoniza un alquil-imidazol con una base fuerte (p. ej. n-BuLi) y después se hace reaccionar con CO_{2} para formar el ácido carboxílico VIIIb. Este tipo de reacción de condensación es bien conocido en la técnica.

b. Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(imidazolil o pirazolil)quinolinas

Las 4-hidroxi-7-R^{21}-quinolinas que tienen un resto imidazolilo o pirazolilo en C2 se preparan generalmente usando la metodología señalada en el Esquema IX.

Esquema IX

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La síntesis del producto intermedio clave (en el que R^{21} = OMe) 4-benciloxi-2-cloro-7-metoxiquinolina IXa, se describe con detalle en el Ejemplo 6 (compuesto 6e).

Etapa A

A temperaturas elevadas, pueden usarse diversos imidazoles, imidazoles sustituidos con alquilo, pirazoles o pirazoles sustituidos con alquilo para desplazar el resto 2 -cloro del compuesto IXa dando compuestos de estructura general IXb.

Etapa B

Al eliminar el grupo protector de bencilo del resto 4-hidroxi de la quinolina por métodos de hidrogenación estándar, se obtienen derivados de quinolina de estructura general IXc.

Síntesis de P3

Se sintetizan diversos fragmentos P3 que contienen la prolongación del enlazador D apropiada para macrociclización por metátesis de olefina. En general, las unidades P3 que contienen una olefina terminal para metátesis se sintetizan siguiendo los esquemas generales que se muestran a continuación (Esquemas X, XI y XII).

Síntesis de enlazadores en la Clase A

Esta síntesis general se usa para preparar enlazadores que están basados en todo carbono (sin heteroátomos) (Esquema X).

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Esquema X

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La síntesis se realiza de acuerdo con el procedimiento de Evans et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4011-4030.

Los ácidos carboxílicos de partida (Xa) están disponibles comercialmente o se preparan por procedimientos conocidos de la bibliografía, familiares para los expertos en la técnica.

Etapa A

El ácido carboxílico Xa se activa con cloruro de pivaloílo y después se hace reaccionar con el anión del auxiliar quiral de Evans 4(S)-4-(fenilmetil)-2-oxazolidinona siguiendo una química bien conocida (revisión: D.J. Ager et al., Aldrichimica Acta 1997, 30, 3-11, y referencias contenidas en la misma) para obtener compuestos de estructura general Xb.

Etapa B

La \alpha-azidación estereoselectiva con triazilazida de un enolato de imida quiral tal como el que se formaría a partir de compuestos con estructura general Xb en presencia de una base como KHMDS, es también bien conocida en la técnica (revisión: D.J. Ager et al., Aldrichimica Acta 1997, 30, 3-11, y referencias contenidas en la misma).

Etapa C

La reducción de la \alpha-azida, catalizada por SnCl_{2} es seguida por la protección de la amina formada como su carbamato de t-butilo da productos intermedios de estructura general Xc. Estas reacciones son también bien conocidas en la técnica.

Etapa D

Finalmente, el auxiliar quiral es hidrolizado bajo condiciones básicas, tales como las de una mezcla de H_{2}O_{2} con LiOH, para producir los enlazadores de tipo amionoácido de estructura general Xe.

Alternativamente, se sintetizan restos P3 que tienen la misma estructura general Xe siguiendo el procedimiento descrito por M.J. Burk et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 657-663 ilustrado en el esquema XI. Estos compuestos variaban en el número de unidades de metileno (-CH_{2}-) a lo largo del enlazador (m = 1 a 5) y la sustitución de grupos alquilo en R_{4}, pero no contenían ningún heteroátomo.

Esquema XI

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Etapa A

El compuesto monoácido XIb se prepara a partir de 2-acetamidomalonato de dietilo disponible comercialmente por hidrólisis de ésteres estándar bajo condiciones básicas.

Etapa B

La condensación del tipo de Knoevenagel entre un aldehído de estructura general XIc y compuesto XIb en presencia de una base, tal como piridina, y anhídrido acético, conduce a la formación del producto intermedio de enamida XId que tiene la estereoquímica Z alrededor del doble enlace recién formado, como se muestra.

Etapa C

La hidrogenación catalítica regioselectiva y enantioselectiva del producto intermedio de enamida XId para dar el producto intermedio de aminoácido XIe se realiza usando el método de Burk.

Etapa D

El nitrógeno del derivado acetamido XIe es después di-protegido con la adición de un sustituyente de carbamato de t-butilo antes de que el grupo acetato así como el éster etílico, sean hidrolizados bajo condiciones básicas estándar para obtener restos P3 de la estructura general XIf.

Síntesis de enlazadores en la Clase B Estructura general de los enlazadores en la Clase B

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Esta síntesis general se usa para preparar enlazadores que contienen oxígeno o azufre.

Esquema XII

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Etapa A

Aminoácidos adecuadamente protegidos, tales como éster metílico de Boc-(L)-serina, éster metílico de Boc-(L)-treonina o éster metílico de Boc-(L)-alotreonina, son alquilados con yoduro de alilo en presencia de Ag_{2}O para dar el éster metílico XIIb.

Etapa B

La hidrólisis del éster metílico bajo condiciones básicas estándar da los enlazadores de tipo éter de estructura general XIIc (X=O).

Etapa C

El análogo de azufre se prepara a partir del mismo aminoácido de partida XIIa (apropiadamente protegido como antes) y su grupo hidroxilo es convertido en un buen grupo lábil (tal como el intermedio de tosilato XIId) usando una metodología estándar bien conocida en la técnica.

Etapa D

El resto tosilo fue subsiguientemente desplazado con el anión de tioacetato, lo que lleva a la formación del producto intermedio de tioéster XIIe por inversión del centro quiral en el carbono \beta.

Etapa E

La hidrólisis del resto tioéster bajo condiciones básicas suaves da el tiol libre XIIf.

Etapa F

La alquilación del resto tiol se consigue fácilmente bajo condiciones básicas con yoduro de alilo.

Etapa G

Finalmente, el análogo de sulfuro XIIc (X=S) se obtiene después de la hidrólisis del éster metílico usando procedimientos estándar.

Síntesis del fragmento R3

Ejemplos de síntesis de fragmentos en los que R^{3} es NH-R^{31} se describen en el documento WO 00/09543.

Ejemplos

La presente invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Otras formas específicas de síntesis o resolución pueden encontrarse en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558.

Las temperaturas se indican en grados Celsius. Los porcentajes de las soluciones expresan una relación de peso a volumen, y las relaciones de las soluciones expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia nuclear magnética (NMR) fueron obtenidos en un espectrómetro Bruker de 400 MHz; los desplazamientos químicos (\delta) se expresan en partes por millón y se refieren al disolvente deuterado interno, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de NMR de todos los compuestos finales (inhibidores) se obtuvieron en DMSO-d_{6} de su sal de TFA a menos que se indique otra cosa. La cromatografía en columna de resolución rápida se llevó a cabo sobre gel de sílice (SiO_{2}) de acuerdo con la técnica de cromatografía de resolución rápida de Still (W.C. Still et al., J. Org. Chem., 1978, 43, 2923). Las abreviaturas usadas en los ejemplos incluyen Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo [Me_{3}COC(O)]; BSA: albúmina de suero bovino; Cbz: benciloxicarbonilo; CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; CH_{2}CH_{2}=DCM cloruro de metileno; DEAD: dietilazodicarboxilato; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIPEA: diisopropiletilamina; DMAP: dimetilaminopiridina; DCC: 1,3-diciclohexilcarbodiimida; DME: 1,2-dimetoxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DTT: titiotreitol o treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol; DPPA: difenilfosforil-azida; EDTA: ácido etilendiaminatetraacético; Et: etilo; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etilo; Et_{2}O: dietil-éter; ESMS: espectrometría de masas por electropulverización; HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HPLC: cromatografía de líquidos de alto rendimiento; MS: espectrometría de masas; MALDI-TOF: tiempo de vuelo de ionización por láser asistida por matriz; FAB: bombardeo con átomos rápidos; LAH: hidruro de litio y aluminio; Me: metilo; MeOH: metanol; MES: ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico; NaHDMS: bis(trimetilsilil)amida sódica; NMM: N-metilmorfolina; NMMO: óxido de N-metilmorfolina; NMP: N-metilpirrolidina; Pr: propilo; Succ: 3-carboxipropanoílo; PNA: 4-nitrofenilamino o p-nitroanilida; TBAF: fluoruro de tetra-n-butilamonio; TBME: terc-butil-metil-éter; tBuOK: terc-butóxido potásico; TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; TCEP: hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropilsilano; TLC: cromatografía en capa fina; TMSE: trimetilsililetilo; Tris/HCl: hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano.

Restos P1 Ejemplo 1 Síntesis de carboxilato de t-butil-(1R,2R)/(1S,2S)-1-amino-2-homoalilciclopropilo (if)

35

A. A una suspensión de cloruro de benciltrietilamonio (5,08 g, 22,3 mmol) en solución acuosa de NaOH al 50% (50 mL), se añadieron sucesivamente 1,2-dibromo-5-hexeno (1b, 8,10 g, 33,46 mmol) y malonato de di-t-butilo (1a, 4,82 g, 22,30 mmol). La mezcla se agitó vigorosamente a temperatura ambiente (TA) durante 16 h, después se diluyó con H_{2}O y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 50 mL). La capa orgánica se siguió lavando con H_{2}O (2 x 50 mL) y salmuera/H_{2}O (2/1,2 x 50 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida en columna sobre gel de sílice, usando EtOAc al 3 a 5% en hexano como eluyente, para obtener el compuesto 1c con un 38% de rendimiento (2,48 g).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,19 (bd, J = 7,9 Hz, 2H); 1,25-1,33 (m, 1H); 1,46 (s, 9H); 1,48 (s, 9H); 1,47-1,60 (m, 1H); 1,75-1,82 (m, 1H), 2,14-2,22 (m, 2H); 4,93-5,50 (m, 2H); 4,96 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,18 (dm, J = 17,2 Hz, 1H). ES(+)MS m/z 297 (M+H)^{+}.

B. A una suspensión de t-butóxido potásico (5,75 g, 51,25 mmol) en dietil- éter anhidro (150 mL) a 0ºC, se añadió H_{2}O (203 \muL, 11,27 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 0º durante 10 min. Se añadió una solución etérea de compuesto 1c (2,48 g en 10 mL de dietil-éter, 10,25 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 5 h. La mezcla se diluyó con H_{2}O enfriada con hielo y se extrajo con dietil-éter (3 x 200 mL). La capa acuosa se acidificó a pH 3,5-4 con ácido cítrico acuoso al 10% enfriado con hielo y se re-extrajo con EtOAc (3 x 200 mL). La capa de EtOAc se lavó con H_{2}O (2 x 100 mL) y con salmuera (100 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó para dar el compuesto 1d con un rendimiento del 85% basado en la cantidad de material de partida recuperado.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,51 (s, 9H); 1,64-1,68 (m, 1H); 1,68-1,75 (m, 1H); 1,77-1,88 (m, 1H); 1,96-2,01 (m, 1H); 2,03-2,22 (m, 3H); 5,01 (dm, J = 6,4 Hz, 1H); 5,03 (dm, J = 14,9 Hz, 1H); 5,72-5,83 (m, 1H).

ES(+)MS m/z 241 (M+H)^{+}.

C. A una solución del ácido 1d en benceno anhidro (1,14 g en 25 mL de benceno, 4,74 mmol) se añadió Et_{3}N (800 \muL, 5,68 mmol), seguido por la adición de difenilfosforil-azida (1,13 mL, 5,21 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 h. Subsiguientemente se añadió trimetilsililetanol (1,36 mL, 9,48 mmol) y se siguió agitando a reflujo durante 4 h adicionales. Después se enfrió la mezcla a TA, se evaporó hasta la mitad de su volumen original, se diluyó con dietil-éter (30 mL) y se lavó con solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (2 x 30 mL) y salmuera (50 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El aceite residual se cromatografió sobre gel de sílice usando EtOAc al 10% en hexano como eluyente para obtener el compuesto 1e puro con un rendimiento del 88% (1,49 g).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 0,03 (s, 9H); 0,91-0,99 (m, 2H); 1,18-1,29 (m, 2H); 1,45 (bs, 11H); 1,56-1,72 (m, 2H); 2,02-2,18 (m, 2H); 4,12 (t, J = 8,3 Hz, 2H); 4,93 (dm, J = 10,2 Hz, 1H); 4,98 (dm, J = 17,2 Hz, 1H); 5,07 (bs, 1H), 5,71-5,83 (m, 1H).

D. A una solución del derivado de ciclopropilo 1e (1,19 g, 3,35 mmol, en 30 mL de THF), se añadió t-Bu_{4}NF (6,7 mL de 1M en THF, 6,7 mmol) y la mezcla se agitó primero a TA durante 16 h y a continuación se calentó a reflujo durante 15 min. El disolvente fue evaporado cuidadosamente a baja presión (debido a la alta volatilidad de la amina libre 1f, se ha de tener cuidado durante la evaporación del disolvente). El residuo crudo se redisolvió en EtOAc (100 mL) y se lavó con H_{2}O (2 x 50 mL) y con salmuera (50 mL), se secó sobre MgSO_{4} y el disolvente se evaporó de nuevo con cuidado. El producto crudo 1f (como mezcla de dos enantiómeros 1f' y 1f'') se usó para acoplamiento con los derivados de prolina P2 sin más purificación. El aislamiento del fragmento P1P2 que tiene la estereoquímica deseada en P1 se logró fácilmente en esta etapa usando cromatografía de resolución rápida (ejemplo 21, fragmento 21b).

Restos P2 Ejemplo 2 Síntesis de Boc-4(R)-[(7-metoxi-4-quinolinil)oxi]prolina (2c)

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36

Se preparó 4-hidroxi-7-metoxiquinolina (2b) de acuerdo con el método descrito por Chun, M.W.; Olmstead, K.K.; Choi, Y.S.; Lee, C.O.; Lee, C.-K.; Kim, J.H.; Lee, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 789. Una solución de compuesto 2b (1,88 g, 10,73 mmol) y DEAD (3,4 ml, 21,46 mmol) en THF anhidro se añadió a una solución agitada de cis-hidroxiprolina protegida 2a (2,63 g, 10,73 mmol) y trifenilfosfina (5,63 g, 21,46 mmol) en THF anhidro (160 ml) a 0ºC bajo N_{2}. Se dejó calentar la mezcla de reacción a TA y se agitó durante 14 h. Después, el THF se evaporó y se aisló el producto puro 2c después de cromatografía en columna de resolución rápida usando MeOH al 5% en EtOAc como eluyente, con un rendimiento del 35% (1,5 g).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,44 (s, 9H); 1,65 (bs, 1H); 2,34-2,43 (m, 1H); 2,63-2,76 (m, 1H); 3,78 (s, 3H); 3,75-3,85 y 3,89-3,99 (2m, 1H, 2 rotámeros); 3,95 (s, 3H), 4,51 y 4,60 (2t, J = 8 Hz, 1H, 2 rotámeros), 5,15 (bs, 1H); 6,53-6,59 (m, 1H); 7,12-7,18 (dd, J = 8,9 y 2,2 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 2,6 Hz, 1H); 8,03 (bd, J = 9,2 Hz, 1H); 8,65 (bd, J = 5,1 Hz, 1H).

Ejemplo 3 Síntesis de 2-etoxi-4-hidroxi-7-metoxi-quinolina (3c)

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37

La síntesis de p-metoxiantranilato de metilo 3a se hizo como se describe en Katz et al. J. Org. Chem. 1953, 18, 1380-1400.

La síntesis general para el derivado de quinolina es una modificación del procedimiento de Baccar et al., Indian Journal of Chemistry, 1995, Sat. B, 330-332.

A. Se disolvió p-metoxiantranilato de metilo 3a (3,069 g, 16,96 mmol) en ortoacetato de trietilo (4,7 ml, 25,4 mmol), y después se añadió una solución de HCl anhidro (4N/dioxano, 50 \mul, 0,6 mmol). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 19 horas. Después se evaporaron las sustancias volátiles bajo vacío para dar el producto 3b (4,92 g, aceite ámbar, rendimiento cuantitativo) que se usó tal cual para la siguiente etapa.

B. A una solución del sustrato 3b (supuestos 16,96 mmol) en THF (34 ml) a -78ºC bajo nitrógeno, se añadió LiHMDS (1M/THF, 22 ml, 1,3 eq.). Al poco de la adición, se retiró el baño a baja temperatura y la mezcla se dejó agitando a temperatura ambiente durante 1 hora, al cabo de la cual se añadió otra porción de LiHMDS (16 ml). La mezcla resultante se agitó hasta la desaparición completa del material de partida (1 hora) por TLC (EtOAc al 100%, R_{f} imidato = 0,7; R_{f} producto = 0,2). Después se añadió HCl (4N/dioxano, 10 ml) y la mezcla se concentró bajo vacío. La pasta resultante se trituró en una mezcla de EtOAc (10 ml) y solución acuosa de NaH_{2}PO_{4} (1M, 10 ml) y se sometió a ultrasonidos. Se formó un precipitado abundante, se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para dar el producto deseado 3c en forma de un sólido color beige (3,177 g, 84% de rendimiento para las 2 etapas, > 99% de pureza por HPLC).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta (ppm): 7,88 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,98 (br s, 1H), 6,89 (br d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,94 (br s, 1H), 4,30 (br s, 2H), 3,84 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H).

Ejemplo 4 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(3-metil-1,2,4-oxadiazol-5-il)-quinolina (4d)

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38

A. A una solución de 2-carbometoxi-4-hidroxi-7-metoxiquinolina 4a (cuya preparación se describe en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558 (1 g, 4,29 mmol) en DMF (10 ml) bajo nitrógeno, se añadió NaH (al 60% en aceite mineral, 190 mg, 4,98 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, después se añadió gota a gota cloruro de MEM (455 \mul, 4,98 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 19,5 horas más. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml), se lavó con H_{2}O (50 ml) y con salmuera (50 ml), se secó con MgSO_{4} y se concentró bajo vacío para dar el material de reacción aislado crudo (1,37 g). Éste fue purificado mediante cromatografía en columna de resolución rápida para dar el producto 4b (1,04 g, rendimiento 75%) en forma de un aceite incoloro.

B. A una mezcla de tamiz molecular de 4 A recién activado (500 mg) y acetamidoxima (248 mg, 3,35 mmol) se añadió THF (3 ml). La mezcla resultante se agitó durante 15 min bajo nitrógeno a temperatura ambiente, y después se añadió NaH (al 60% en aceite mineral, 124 mg, 3,24 mmol) en porciones. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se añadió éster 4b (500 mg, 1,56 mmol) en solución en THF (5 ml). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora, después se filtró sobre celite, aclarando EtOAc (3 porciones de 20 ml) y se concentró bajo vacío. La mezcla cruda resultante se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida (100% EtOAc) para dar el producto 4c (352 mg, 65% de rendimiento) en forma de un sólido blanco.

C. Al éter MEM 4c (170 g, 0,493 mmol) en THF (4 ml) se añadió HCl acuoso (1N, 1 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se diluyó con solución acuosa de NaH_{2}PO_{4} (1M, 50 ml). El sólido formado se filtró, se trituró con EtOAc, se filtró y se secó para dar el producto deseado (4d) (90 mg, 71% de rendimiento) en forma de un sólido blanco. MS (ES+) 258 (M+1), (ES-) 256 (M-1).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta (ppm): 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (br s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H).

Ejemplo 5 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-quinolina (5e)

39

40

A. Al sustrato 4b (465 mg, 1,45 mmol) en etanol (5 ml) se añadió hidrazina anhidra (57 \mul, 1,8 mmol). La solución resultante se calentó a reflujo durante 4 h, después se concentró bajo vacío para dar el producto 5a (704 mg, rendimiento en crudo cuantitativo) en forma de un sólido amarillo, que se usó en la etapa siguiente tal cual.

B. El compuesto 5a (supuestos 1,45 mmol) en ortoacetato de trietilo (5 ml) se calentó a 100-110ºC bajo nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó después con EtOAc (100 ml), se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (50 ml) y con salmuera (50 ml), se secó con MgSO_{4}, se concentró bajo vacío y se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida (EtOAc al 100%). El compuesto 5b (359 mg, 61% de rendimiento para las dos etapas) se obtuvo en forma de un aceite amarillo. MS (ES+) 392 (m+1), (ES-) 390 (m-1).

C. El compuesto 5b (333 mg, 0,852 mmol) se calentó a 140ºC en alto vacío durante 8,5 h, y se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida (100% de EtOAc) para dar una mezcla de 5b (116 mg, 35%, R_{f} 0,5) y compuesto 5c (138 mg, 72% de rendimiento corregido, R_{f} 0,3). A una solución en THF (4 ml) de compuesto 5c (138 mg, 0,4 mmol) se añadió solución acuosa de HCl (1N, 1 ml) y la mezcla resultante se agitó hasta la compleción (30 min). El THF fue evaporado bajo vacío y se añadió NaH_{2}PO_{4} acuosa (1M, 2 ml). La suspensión resultante se sometió a ultrasonidos y se filtró, y el sólido se secó en alto vacío para dar el producto deseado 5d (75 mg, 73% de rendimiento) en forma de un sólido beige. MS (ES+) 258 (m+1), (ES-) 256 (m-1).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta 8,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (br d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,85 (br s, 1H), 3,88 (s, 3H), 2,64 (s, 3H).

Ejemplo 6 Síntesis de 4-benciloxi-2-(cloro)-7-metoxiquinolina (6e)

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A. Meta-anisidina disponible comercialmente (25 g, 0,20 mol) en dioxano (80 ml) se enfrió a 0ºC y se añadió HCl anhidro (4N/dioxano, 75 ml, 0,30 mol). Después se añadió Et_{2}O (500 ml) y se mantuvo la agitación durante 1 hora. Después se filtró el sólido beige y se secó bajo vacío para dar la sal 6a (31,88 g, 98% de rendimiento).

B. A esta sal se añadió cianoacetato de etilo (21,3 ml, 0,20 mol) y la mezcla, en un matraz equipado con cabeza de destilación y un matraz colector, se calentó a 280-300ºC. El etanol producido se recogió para controlar la evolución de la reacción. A los 9 ml de etanol recogido (cantidad teórica 11,7 ml), se dejó de calentar, se enfrió la mezcla de reacción a TA, se diluyó con agua (200 ml)-EtOAc (200 ml) y después se agitó y se añadió solución acuosa de NaH_{2}PO_{4} (300 ml). Después de una agitación adicional durante 1 h, filtración y secado, se obtuvo 6b (19,06 g, 84,5% de pureza, aprox. 50% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo, y se usó tal cual en la siguiente reacción.

C. El compuesto 6b (11,0 g, 57,8 mmol) en DMF (100 ml) a 0ºC se añadió a NaH (60% en aceite mineral, 2,78 g, 115,6 mmol). Después se retiró el baño de hielo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, después se añadió bromuro de bencilo (7,6 ml, 63,6 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas. Después se diluyó la solución con EtOAc (220 ml)-hexano (220 ml) y el sólido formado se filtró, se trituró con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (110 ml), se lavó con agua, hexano-EtOAc (relación 1:1, 100 ml) y se secó bajo vacío elevado. El producto 6c (5,6 g, 91% de pureza, 35% de rendimiento) se obtuvo entonces en forma de un sólido amarillo. Al compuesto 6c (2,67 g, 9,52 mmol) en ácido acético (21 ml) se añadió nitrito de iso-amilo (3,8 ml, 28,6 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente y se controló mediante HPLC. Se añadió más nitrito de iso-amilo (1,3 ml, 9,52 mmol) al cabo de 2 horas, y la mezcla se dejó agitando durante 90 horas (HPLC 81% de producto, 3% de sustrato). Se añadió agua (100 ml) a la suspensión resultante, que después se filtró. El sólido pardo recogido se secó bajo vacío elevado dando el producto 6d (2,35 g, 92% de pureza, 72% de rendimiento).

D. Al compuesto 6d (1,5 g, 4,39 mmol) se añadió oxicloruro de fósforo (13 ml, 141 mmol) y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora y después se diluyó con EtOAc (150 ml) y se apagó a 0ºC lentamente con solución acuosa de NaOH (1N, 150 ml) a pH 9. Las dos capas se separaron y la capa orgánica se secó con MgSO_{4} y se concentró bajo vacío para dar un sólido de color pardo que se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida (15% EtOAc/hexano). El producto 6e (819 mg, pureza > del 99%, 62% de rendimiento) fue obtenido en forma de un sólido amarillo.

^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}): \delta 8,07 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50-7,40 (m, 5H), 7,29 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 5,26 (s, 2H), 3,92 (s, 3H).

Ejemplo 7 Síntesis de 4-hidroxi-2-(1-imidazolil)-7-metoxiquinolina (7b); 4-hidroxi-2-(4-metil-1-imidazolil)-7-metoxiquinolina (7d); 4-hidroxi-7-metoxi-2-(1-pirazolil)quinolina (7f); y 4-hidroxi-2-(3-metil-1-pirazolil)-7-metoxiquinolina (7h)

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42

A. El compuesto 6e (423 mg, 1,41 mmol) e imidazol (400 mg, 5,88 mmol) se calentaron a 110ºC durante 20 h. Después se diluyó la mezcla con EtOAc y se lavó con agua y salmuera, se secó con MgSO_{4}, se concentró bajo presión reducida para dar el compuesto 7a (422 mg, 96% de pureza, 90% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo. El compuesto 7a (319 mg, 0,963 mmol) con Pd (5%/C, 64 mg) en una mezcla de etanol (5 ml) y THF (5 ml) fue purgado y puesto bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 7,5 h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró, se aclaró con una mezcla de cloroformo-metanol y se concentró para dar 7b (130 mg, 97,7% de pureza, 56% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo. MS (ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta 8,51 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,23 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,12 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 6,92 (br s, 1H), 3,91 (s, 3H).

B. El compuesto 6e (251 mg, 0,837 mmol) y 4-metilimidazol (344 mg, 4,19 mmol) se calentaron a 110ºC durante 20 h. Después se diluyó la mezcla con EtOAc, se lavó con agua y salmuera, se secó con MgSO_{4} y se concentró bajo presión reducida para dar un producto en crudo que contenía una mezcla 10:1 de isómero 4-metil y 5-metil-imidazolilo, respectivamente. El principal isómero deseado 11c, un sólido blanco (166 mg, 99% de pureza, 57% de rendimiento) fue separado de una segunda fracción más polar (76 mg, 23% de rendimiento) que contiene una mezcla de isómero 4-metil y 5-metil-imidazolilo mediante cromatografía en columna de resolución rápida (100% de EtOAc). El compuesto 7c (163 mg, 0,472 mmol) con Pd (5%/C, 33 mg) en una mezcla de etanol (2,4 ml) y THF (5 ml) fue purgado y puesto bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 18 h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró, se aclaró con una mezcla de cloroformo-metanol y se concentró para dar 7d (118 mg, 99% de pureza, 98% de rendimiento) en forma de un sólido blanco.

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta 8,42 (br s, 1H), 8,01 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (br s, 1H), 7,21 (br s, 1H), 7,10 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,89 (br s, 1H), 3,90 (s, 3H); 2,20 (s, 3H).

C. El compuesto 6e (184 mg, 0,614 mmol) y pirazol (209 mg, 3,07 mmol) se calentaron a 110ºC durante 17 h. Después se diluyó la mezcla con EtOAc, se lavó con solución acuosa de NaOH (1N) y salmuera, se secó con MgSO_{4} y se concentró bajo presión reducida para dar un producto en crudo que fue purificado mediante cromatografía en columna de resolución rápida (2:1 hexano-EtOAc) para dar 7e (103 mg, 50% de rendimiento) en forma de sólido amarillo pálido. El compuesto 7e (103 mg, 0,311 mmol) con Pd (5%/C, 20 mg) en una mezcla de etanol (2 ml) y THF (2 ml) fue purgado y puesto bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 5,5 h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró, se aclaró con una mezcla de cloroformo-metanol y se concentró para dar 7f (77 mg, 99% de pureza, 99% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo. MS (ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta 8,72 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,00 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,83 (br s, 1H), 7,43 (br s, 1H), 7,24 (br s, 1H), 7,10 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,59 (br s, 1H), 3,90 (s, 3H).

D. Se calentaron compuesto 6e (217 mg, 0,724 mmol) y 4-metilpirazol (594 mg, 7,24 mmol) a 110ºC durante 23 h. La mezcla, mostrando una mezcla 1:1 de compuesto desbencilado 7h y producto bencilado 7g, fue después diluida con EtOAc (2-3 ml) y filtrada para dar el producto desbencilado 7h puro (111 mg, 95% de pureza, 54% de rendimiento) en forma de un sólido blanco.

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d): \delta 8,58 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,25 (br s, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,04 (br d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,38 (s, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,30 (s, 3H).

Ejemplo 8 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-[4-(2-isopropilaminotiazolil)]-quinolina (8f)

Nota: [Se prepararon diversos sustituyentes de 2-alquilaminotiazolilo usando el mismo esquema de síntesis en los que el compuesto 8b fue reemplazado por otras alquil-tioureas].

43

A. El protocolo usado para la conversión de m-anisidina en 8a fue idéntico al descrito en la bibliografía: F.J. Brown et al. J. Med. Chem. 1989, 32, 807-826. Sin embargo, el procedimiento de purificación fue modificado para evitar la purificación por cromatografía. La fase de EtOAc que contenía el producto deseado fue tratada con una mezcla de MgSO_{4}, carbón vegetal y 5% p/p (basado en la masa esperada) de gel de sílice. Después de filtrar por celite, el producto fue triturado con éter. El compuesto 8a se obtuvo como un sólido pardo pálido con una pureza > 99% (confirmada por HPLC).

B. Una suspensión de isopropil-tiourea (8b, 3,55 g, 30 mmol) y ácido 3-bromopirúvico (8c, 5 g, 1 eq.) en dioxano (300 ml, 0,1 M) se calentó a 80ºC. Al alcanzar los 80ºC, la solución se volvió transparente y poco después el producto precipitó como un sólido blanco. Después de 2 horas de calentamiento, la solución se enfrió a temperatura ambiente y el precipitado blanco se filtró para obtener el compuesto 8d con alta pureza (pureza > 98%, confirmada por NMR) y 94% de rendimiento (7,51 g).

C. Una mezcla del ácido carboxílico 8d (4,85 g, 18,2 mmol) y el derivado de anilina 8a (3 g, 1 eq.) en piridina (150 ml, 0,12 M) fue enfriada a -30ºC (al enfriar, la solución transparente se volvió parcialmente una suspensión). Después se añadió lentamente oxicloruro de fósforo (3,56 ml, 2,1 eq.) durante un periodo de 5 min. La mezcla de reacción se agitó a -30ºC durante 1 h, se retiró el baño y se dejó calentar la mezcla de reacción a TA. Después de 1,5 h, la mezcla de reacción se vertió en hielo, se ajustó el pH en 11 con solución acuosa de NaOH 3N, se extrajo con CH_{2}Cl_{2}, se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío. El sólido de color beige se purificó después mediante cromatografía de resolución rápida (45% de EtOAc en hexano) para dar el compuesto 8e en forma de un sólido amarillo pálido con un 73% de rendimiento (6,07 g).

D. Se calentó a reflujo una solución de t-BuOK (2,42 g, 21,6 mmol) en t-BuOH anhidro (40 ml, 0,14 M, destilado en Mg metálico). Se añadió el compuesto 8e (1,8 g, 5,4 mmol) en porciones durante 5 min y la solución de color rojo oscuro formada se agitó a reflujo durante 20 min adicionales (la terminación de la reacción se controló mediante HPLC). La mezcla se enfrió a TA y se añadió HCl (4 N en dioxano, 1,5 eq.). Después se concentró la mezcla bajo vacío con el fin de asegurar que todo el HCl y el dioxano eran eliminados, el producto se redisolvió dos veces en CH_{2}Cl_{2} y se secó bajo vacío para obtener finalmente la sal de HCl del compuesto 8f en forma de un sólido de color beige (1,62 g, 93% de pureza por HPLC). Después se vertió el producto en un tampón fosfato (NaH_{2}PO_{4} 1N, pH aprox. 4,5), y se trató con ultrasonidos. El sólido beige formado se filtró y se secó bajo vacío para dar el compuesto 8f (1,38 g, 81% de rendimiento) en forma de un sólido beige (91% de pureza por HPLC).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO): \delta 8,27 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 7,97 (br s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (dd, 1H, J = 9,2, 2,2 Hz), 3,97 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 1,24 (d, 2H, J = 6,4 Hz).

Ejemplo 9 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-[2-(4-isopropiltiazolil)]quinolina (9f)

Nota: Se prepararon diversos sustituyentes de 2-(4-alquil)-tiazolilo usando el mismo esquema de síntesis en el que el compuesto 9b era reemplazado por otras \alpha-bromocetonas.

44

A. A una solución de 3-metil-butan-2-ona (8 g, 93 mmol) en MeOH (100 ml) a -30ºC se añadió gota a gota Br_{2} (4,79 ml, 93 mmol, 1 eq.) durante un periodo de 45 min. La mezcla resultante se agitó después a TA durante 90 min. Se añadió pentano y la solución se lavó con solución acuosa de NaHCO_{3} al 5%, la capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío. El aceite amarillo crudo resultante, compuesto 9b, se usó sin más purificación. Una solución de tiooxamato de etilo (9a, 1,8 g, 13,5 mmol) y derivado de bromocetona 9b (13,5 mmol) se agitó a 70ºC durante 15 h. La mezcla se concentró después bajo vacío y a continuación se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando EtOAc al 15% en hexano como eluyente, para obtener el compuesto 9c (740 mg, 28% de rendimiento).

B. Una solución de compuesto 9c (700 mg, 3,5 mmol) en THF/MeOH/H_{2}O (relación 3:1:1, 13 ml) fue tratada con LiOH\cdotH_{2}O (148 mg, 3,5 mmol, 1 eq.) a TA durante 5 h. Después se ajustó el pH a 6 con HCl 0,1N y la mezcla se concentró a sequedad bajo vacío para obtener el ácido 13d, que se usó directamente en la siguiente etapa sin más purificación.

C. Una solución de 4-metoxi-2-amino-acetofenona (intermedio 8a, 570 mg, 3,45 mmol) y derivado de ácido carboxílico 9d (590 mg, 3,45 mmol, 1 eq.) en piridina (30 ml), se enfrió a -20ºC. Después se añadió POCl_{3} (0,35 ml, 3,379 mmol, 1,1 eq.) gota a gota durante un periodo de 5 min. La solución resultante se agitó a -10ºC durante 2 h. La reacción se apagó con la adición de H_{2}O y la mezcla se concentró bajo vacío. El residuo se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando EtOAc al 25% en hexano como eluyente, para dar el compuesto 9e en forma de un sólido blanco (740 mg, 67% de rendimiento).

D. Se añadió t-BuOK (518 mg, 2,1 eq.) a una suspensión de compuesto 9e (700 mg, 2,2 mmol) en t-BuOH anhidro (11 ml). La mezcla resultante se calentó a 75ºC durante 7,5 h, después se enfrió la solución a temperatura ambiente y se acidificó mediante la adición de HCl (HCl 4N en dioxano, 2,5 ml). La mezcla se concentró bajo vacío y el residuo obtenido se vertió en una solución de NaH_{2}PO_{4} 1N y se filtró. Después se trituró el material sólido con una pequeña cantidad de EtOAc, se filtró y se secó bajo vacío para obtener compuesto 9f como un sólido de color beige pálido (270 mg, 41% de rendimiento).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,00 (br s, 1H), 7,60 (br s, 1H), 7,51 (br s, 1H), 7,43 (br s, 1H), 7,29 (br s, 1H), 7,14 (br s, 1H), 6,95 (br a, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,15 (m, 1H), 1,33 (d, J = 5,4 Hz, 6H).

Ejemplo 10 Síntesis de 4-hidroxi-2-(1-metil-2-imidazolil)-7-metoxiquinolina (10d)

46

A. Una solución de N-metilimidazol 10a (5 g, 61 mmol) en 100 ml de THF se enfrió a -78ºC. Se añadió solución de n-BuLi (24,4 ml de una solución 2,5M/Et_{2}O, 1 eq.) gota a gota durante 15 min. La mezcla resultante se agitó durante 90 min a -78ºC y después se vertió en porciones sobre CO_{2} sólido en exceso. La mezcla heterogénea se agitó durante 2 h y se dejó que alcanzase la TA. Se añadió HCl 1N hasta pH 5 y la capa acuosa se separó y se liofilizó. El residuo así obtenido se extrajo con EtOAc (para eliminar las sales), se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. Se obtuvieron 6,2 g (80% de rendimiento) de un sólido blanco 10b.

B. Una solución de 4-metoxi-2-amino-acetofenona 8a (394 mg, 2,39 mmol) y el derivado de ácido carboxílico 10b (301 mg, 1 eq.) en piridina (10 ml) se enfrió a -20ºC. Después se añadió gota a gota POCl_{3} (244 \mul, 1,1 eq.) durante 5 min. La solución resultante se agitó a -10ºC durante 2,5 h. Después se añadió agua y la mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se vertió en una solución saturada de NaHCO_{3} y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía usando gel de sílice (25% de EtOAc/Hex) dando 530 mg (81% de rendimiento) de un sólido de color amarillo pálido 10c.

C. Se añadió t-BuOK (431 mg, 2,1 eq.) a una suspensión del sustrato 10c (500 mg, 1,8 mmol) en 8 ml de t-BuOH. Después se calentó la mezcla resultante a 75ºC durante 7 h. Se dejó que la solución llegase a la temperatura ambiente durante la noche y se añadieron 2,5 ml de HCl (4N/dioxano). La mezcla se concentró bajo presión reducida y el residuo obtenido se diluyó con EtOAc. Se añadió NaOH 1N hasta que se obtuvo un pH de 7. La fase orgánica se separó y se secó (MgSO_{4}), se filtró, y se concentró bajo presión reducida para dar 145 mg de 10d (31% de rendimiento) en forma de un sólido de color beige pálido. ^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 7,99 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,18 (s, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,84 (s, 3H).

Ejemplo 11 Síntesis de 4-hidroxi-2-(1-pirrolil)-7-metoxiquinolina (11b)

47

A. Una solución del sustrato 11a (obtenido a partir del compuesto 6c después de hidrogenolisis del grupo bencilo con Pd/C al 5% en etanol-THF) (1 g, 5,25 mmol) y 2,5-dimetoxitetrahidrofurano (0,68 ml, 1 eq.) en ácido acético glacial se calentó a reflujo durante 4,5 h y se dejó que alcanzase la TA. Después se concentró la mezcla bajo presión reducida. El residuo se diluyó con metanol y se añadió solución acuosa de NaOH 1N hasta alcanzar el pH 7. El producto se purificó mediante cromatografía usando gel de sílice (3% de MeOH/ CH_{2}Cl_{2}, el residuo estaba pre-adsorbido sobre gel de sílice). Se obtuvieron 140 mg (13% de rendimiento) de 11b en forma de un sólido blanco.

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 7,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,18 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,50 (br d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,88 (br s, 1H), 6,32 (s, 2H), 3,90 (s, 3H).

Ejemplo 12 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(6-metil-2-piridil)quinolina (12d)

48

A. Se calentaron a reflujo ácido 6-metilpicolínico 12a (411 mg, 3,0 mmol) y SOCl_{2} (0,520 ml, 7,2 mmol, 2,4 eq.) en benceno (5 ml) durante 2 h. El disolvente y el SO_{2} en exceso se eliminaron de la mezcla de reacción bajo vacío, y el residuo se trituró con pentano. El material sólido formado se separó por filtración y el filtrado se concentró para dar el cloruro de ácido 12b (500 mg, 2,6 mmol).

B. A una solución del cloruro de ácido 12b crudo en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) a 0ºC se añadieron una solución de la anilina 8a (344 mg, 2,08 mmol), DIPEA (1,45 ml, 8,35 mmol) y DMAP (61 mg, 0,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 16 h. Los componentes volátiles se eliminaron bajo vacío, el residuo se disolvió en EtOAc y la solución se lavó con solución de NaHCO_{3} al 5% (2x), H_{2}O y salmuera. La capa orgánica se secó después sobre MgSO_{4} y se concentró bajo vacío. La mezcla se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando EtOAc/hexano (1:2) como eluyente para obtener la amida 12c (490 mg, 82%).

C. A una suspensión de amida 12c (490 mg, 1,71 mmol) en t-BuOH (10 ml), se añadió t-BuOK (410 mg, 3,43 mmol) y la mezcla se agitó a 75ºC durante 6 h y después a TA durante 16 h. La mezcla se vertió entonces sobre tampón fosfato (175 ml, pH = 7) y se agitó durante 30 min. El sólido se trituró dos veces con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró bajo vacío. El sólido obtenido fue triturado con EtOAc para dar el derivado de quinolina 12d (263 mg, 58%). ^{1}H NMR (CDCl_{3},400 MHz): \delta 2,68 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 6,85-6,88 (2d, J = 8,68 y 9,5 Hz, 2H), 6,94 (dd, J = 8,9 y 2,2 Hz, 1H), 7,27 (dd, J = 6,7 y 1,9 Hz, 1H), 7,73-7,79 (m, 2H), 8,28 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 10,3 (br s, 1H).

Ejemplo 13 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(5-metoxi-2-piridil)quinolina (13d)

49

A. A una solución de compuesto 13a (623 mg, 3,73 mmol) en MeOH, se añadió NaOH (2M, 4,70 ml) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 h. Después se acidificó la solución con HCl (6N, 2,2 ml) y se concentró para obtener el compuesto 13b, que se usó en la siguiente etapa sin purificar.

B. A una solución del compuesto crudo 13b (aprox. 3,73 mmol) en piridina (25 ml) se añadió la anilina 8a (500 mg, 3,03 mmol) y la solución se enfrió a -25ºC antes de añadir POCl_{3} (0,35 ml, 3,73 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -10ºC durante 1 h y después a 0ºC durante 2 h. Después se vertió la mezcla sobre H_{2}O y se extrajo con EtOAc (2-3x). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con NaHCO_{3} al 5% y salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron bajo vacío. El material crudo fue purificado mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando EtOAc/hexano (1:2) como eluyente, para dar la amida 13c (617 mg, 55%).

C. A una suspensión de la amida 13c (617 mg, 2,05 mmol) en t-BuOH anhidro (10 ml), se añadió t-BuOK (490 mg, 4,11 mmol) y la mezcla se agitó a 75ºC durante 6 h y después a TA durante 16 h. La mezcla de reacción se vertió en tampón fosfato (175 ml, pH = 7) y se agitó durante 30 min. El material sólido formado se filtró y se trituró con EtOAc para dar el derivado de quinolina 13d (250 mg, 43%). ^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 3,86 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 6,72 (b s, 1H), 6,91 (dd, J = 8,9 y 1,9 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 1,9, 1H), 7,60 (dd, J = 8,9 y 2,9 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,48 (d, J = 1,9 Hz, 1H).

Ejemplo 14 Síntesis de 4-hidroxi-7-metoxi-2-(oxazol-5-il)quinolina (14c)

50

A. El derivado de quinolina protegido 4b del Ejemplo 4 (3,8 g, 11,8 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (60 ml) y se enfrió a -78ºC antes de añadir hidruro de diisobutil-aluminio (7,9 ml, 1 eq., 1,5M en tolueno) muy lentamente a lo largo de 15 min. Después de agitar durante 80 min, se añadió una cantidad adicional de DIBAL (5,5 ml, 0,7 eq., 1,5 M en tolueno). Después de agitar a -78ºC durante 2 h más, la reacción fue apagada cuidadosamente con metanol (4 ml) a -78ºC y después se vertió en una solución acuosa de sal de Rochelle (tartrato de Na-K 1N). La pasta espesa se agitó con CH_{2}Cl_{2} (300 ml) durante 2 h hasta quedar transparente. Se separaron las fases y la fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un sólido blanco. La purificación mediante cromatografía de resolución rápida (SiO_{2}, malla 230-400) con EtOAc al 50%/ hexano dio el aldehído 14a en forma de un sólido blanco (2,5 g, 73%).

B. A una suspensión agitada de K_{2}CO_{3} (48 mg, 0,34 mmol) en MeOH (7 ml) se añadió isocianuro de toluenosulfonilmetilo (66 mg, 0,34 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 45ºC y se añadió aldehído 14a (0,10 g, 0,34 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 16 h y después se concentró a sequedad bajo vacío. La purificación se realizó mediante cromatografía de resolución rápida (SiO_{2}, malla 230-400) para dar el oxazol deseado 14b (0,089 g, 80%). MS: 331,0 (M+H)^{+}.

C. La hidroxiquinolina protegida MEM 14b se disolvió en THF (3 ml) y se trató con HCl acuoso (1N, 1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a TA antes de ser concentrada a sequedad bajo vacío. El residuo se trató con tampón fosfato (3 ml, solución 1N, pH 4,5) y se agitó antes de filtrar el producto, se lavó con agua destilada y se secó durante la noche bajo vacío elevado (60ºC, 16 h). La hidroxiquinolina deseada 14c se obtuvo en forma de un sólido de color canela (0,065 g, 100%). MS: 242,9 (M+H)^{+}.

^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): \delta 8,65 (s, 1H), 8,02 (bs, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,39 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,42 (b s, 1H), 3,87 (s, 3H), ES (+) MS: m/z 242,9 (M+H)^{+}.

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(Esquema pasa a página siguiente)

Restos enlazadores de péptidos (P3) Ejemplo 15 Síntesis de ácido (2S)-N-Boc-amino-non-8-enoico (15g)

51

A. A una solución de 2-acetamidomalonato de dietilo 15a disponible comercialmente (100 g, 0,46 mol) en dioxano (500 ml) se añadió solución acuosa de hidróxido sódico (1 M, 1 eq. 460 ml) gota a gota durante 30 a 45 min. La mezcla resultante se dejó agitando durante 16,5 h y luego se evaporó el dioxano bajo vacío, la solución acuosa se extrajo con tres porciones de 300 ml de acetato de etilo y se acidificó a pH 1 con HCl concentrado. Esta solución se dejó cristalizar en un baño de hielo fundente. Después de aparecer algunos cristales, la mezcla se sometió a ultrasonidos y apareció un abundante precipitado. La filtración y el secado bajo vacío dieron el compuesto 15b (62,52 g, 72% de rendimiento) en forma de un sólido blanco.

B. A una emulsión agitada magnéticamente de 7-octeno-1,2-diol 15c (25 g, 0,173 mol) comercialmente disponible y H_{2}O (100 ml), en un matraz de fondo redondo de 1 l, se añadió una solución acuosa de peryodato sódico (40,7 g, 0,190 mol, 1,1 eq., en 475 ml de H_{2}O) durante un periodo de 20 min (ligeramente exotérmica). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h más (la terminación de la reacción se confirma mediante TLC). Después se decantó la mezcla en un embudo de separación y la capa acuosa se separó de la capa orgánica. La solución acuosa se saturó con NaCl, se decantó y se separó de la fracción orgánica una vez más. Las dos fracciones orgánicas se reunieron, se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron sobre un tapón de algodón (en una pipeta Pasteur) para dar el compuesto 15d (15,135 g, aceite incoloro, 78% de rendimiento). La solución acuosa se extrajo con CH_{2}Cl_{2}, se secó con MgSO_{4} anhidro y se concentró bajo vacío (sin calentamiento, heptanal p. eb. 153ºC) para obtener una cantidad adicional de compuesto 15d (1,957 g, aceite incoloro, 10% de rendimiento). Rendimiento total 88%.

C. A 2-acetamidomalonato de etilo sólido 15b (7,57 g, 40 mmol) se añadió 6-heptenal 15d (4,48 g, 40 mmol) en solución en piridina (32 ml, 10 eq.) durante 1 min. La solución resultante se enfrió en un baño a 10ºC y se añadió anhídrido acético (12 ml, 3,2 eq.) durante 4 min. La solución de color naranja resultante se agitó durante 3 h a TA, y se añadió otra porción de 2-acetamidomalonato de etilo 15b (2,27 g). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 11 h más. Después se añadió hielo (60 ml) y la solución se agitó durante 1,5 h, después la mezcla se diluyó con 250 ml de agua y se extrajo con dos porciones de éter. La solución etérea se lavó con HCl 1N y solución saturada de NaHCO_{3}, se secó con Na_{2}SO_{4}, se concentró y se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (EtOAc 40%/hexano) para dar el compuesto 15e (4,8 g, 50% de rendimiento) en forma de un aceite amarillo pálido.

D. A una solución desgasificada (burbujeo de argón durante 30 min) de 2-acetamido-2,8-nonadienoato de Z-etilo 15e (8,38 g, 35 mmol) en etanol seco (70 ml) se añadió (S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf (51 mg, S/C=496). La mezcla se puso bajo 2,1 atmósferas de hidrógeno (después de 4 ciclos de vacío-H_{2}) y se agitó en un agitador Parr durante 2 h. La mezcla resultante se evaporó a sequedad para obtener el compuesto crudo 15f, que se usó en la subsiguiente etapa sin purificar.

E. A una solución de 2-acetamido-8-nonenoato de (S)-etilo crudo 15f (7,3 g, 30,3 mmol) en THF (100 ml), se añadieron Boc_{2}O (13,2 g, 2 eq.) y DMAP (740 mg, 0,2 eq.), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2,5 h. Subsiguientemente, la mayoría del disolvente THF fue evaporado, se diluyó la mezcla cruda con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con HCl 1N con el fin de eliminar el DMAP. La capa orgánica se extrajo más intensamente con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo vacío. El producto se diluyó después con THF (50 ml) y agua (30 ml), se añadió LiOH\cdotH_{2}O (2,54 g, 2 eq.) y la mezcla resultante se agitó a TA durante 25 h (la terminación de la hidrólisis se confirmó mediante TLC). La mezcla de reacción se concentró bajo vacío para eliminar la mayor parte del disolvente THF y se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. La solución resultante se lavó con HCl 1N, se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo vacío. Para eliminar impurezas menores y el Boc_{2}O en exceso, el producto crudo fue purificado mediante cromatografía de resolución rápida (usando un gradiente de disolvente de 100% de hexano - 100% de EtOAc como eluyente). El compuesto del título 15g se obtuvo con una elevada pureza en forma de un aceite amarillo pálido (5,82 g, 71% de rendimiento). ^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 7,01 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,79 (tdd, Jt = 6,7 Hz, Jd = 17,0, 10,2 Hz, 1H), 5,00 (md, Jd = 17,0 Hz, 1H), 4,93 (md, Jd = 10,2 Hz, 1H), 3,83 (m, 1H), 2,00 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 1,65-1,5 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 1,35-1,21 (m, 6H).

Ejemplo 15A Síntesis alternativa de ácido (2S)-N-Boc-amino-non-8-enoico (15g)

52

A. A una suspensión agitada de tiras de Mg cortadas finamente (0,55 g, 22,5 mmol) en THF seco (30 ml) que contiene dibromoetano (0,1 ml), se añadió gota a gota 8-bromo-1-octeno (15 h, 2,52 ml, 15 mmol) a lo largo de un periodo de 15 min [la reacción es ligeramente exotérmica]. Después de 30 min, la mezcla se calentó a 38ºC durante 1 h y después se enfrió a -78ºC antes de añadirla mediante una cánula sobre una cantidad en exceso de CO_{2} sólido. La mezcla se diluyó con dietil-éter (100 ml) y la solución se lavó con salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. Se obtuvo un aceite crudo que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice usando EtOAc al 15% en hexanos como eluyente para dar el compuesto 15i con un 62% de rendimiento (1,44 g).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta1,31-1,42 (m, 6H), 1,60-1,69 (m, 2H), 2,02-2,09 (m, 2H), 2,35 (t, J = 8,3 Hz, 2H), 4,99 (dm, J = 10,0 Hz, 1H), 5,04 (dm, J = 17,0 Hz, 1H), 5,75-5,86 (m, 1H).

B. A una solución vigorosamente agitada del ácido carboxílico 15i (1,36 g, 8,7 mmol) en THF anhidro (70 ml) a -78ºC, se añadieron Et_{3}N recién destilado (1,6 ml; 11,3 mmol) y cloruro de pivaloílo (1,18 ml, 9,58 mmol) mediante una jeringa bajo condiciones anhidras. La mezcla se agitó a -78ºC durante 15 min y después a 0ºC durante 45 min. La mezcla se enfrió de nuevo a -78ºC y después se transfirió mediante una cánula a una solución anhidra de sal de litio de 4(S)-4-(fenilmetil)-2-oxazolidinona en THF a -78ºC; la sal de litio del reactivo de oxazolidinona había sido preparada previamente mediante la adición lenta de n-BuLi (2,00 M en hexanos, 7,85 ml, 15,7 mmol) a una solución en THF (20 ml) de la oxazolidinona (2,78 g, 15,7 mmol) en THF a -78ºC.

La mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 15 min y después a TA durante 1,5 h. Finalmente, fue apagada con una solución acuosa de bisulfato sódico (100 ml de 1M) y el THF se evaporó a los 3/4 de su volumen inicial. El residuo se extrajo con EtOAc (2 x 150 ml) y las capas orgánicas mezcladas se lavaron con solución de NaHCO_{3} al 5% (3 x 50 ml) y salmuera (2 x 50 ml), se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron. El aceite crudo resultante se cromatografió en gel de sílice usando EtOAc al 15% en hexanos para obtener el compuesto 15j con un 68% de rendimiento (1,88 g).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,35-1,47 (m, 6H), 1,67-1,74 (m, 2H), 2,02-2,09 (m, 2H), 2,65 (dd, J = 13,4 y 9,9 Hz, 1H), 2,84-3,02 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 13,4 y 3,2 Hz, 1H), 4,13-4,22 (m, 2H), 4,62-4,71 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 17,2 y 1,6 Hz, 1H), 5,75-5,84 (m, 1H), 7,18-7,38 (m, 5H).

C. A una solución agitada de KHMDS (0,8 M THF, 22 ml, 17,5 mmol) en THF seco (50 ml) a -78ºC se añadió por medio de una cánula una solución del derivado de ácido 15j (3,25 g, 10,30 mmol) en THF seco (40 ml) a -78ºC. La mezcla se agitó a -78ºC durante 45 min. A esta mezcla se añadió una solución de trizilazida (3,67 g, 11,85 mmol) en THF seco (40 ml) a -78ºC. La mezcla se agitó a -78ºC durante 3 min y después se apagó con ácido acético (5 ml). Subsiguientemente, se agitó a TA durante 1 h y 45 min y finalmente a 40ºC durante 15 min. La mayor parte del THF se evaporó. El residuo se recogió en EtOAc (100 ml) y la solución orgánica se lavó con H_{2}O (50 ml), NaHCO_{3} al 5% (3 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con MgSO_{4} y se evaporó. El aceite obtenido se cromatografió sobre gel de sílice usando hexano/CH_{2}Cl_{2} (1/1) como eluyente para dar el compuesto 15k (2,47 g, rendimiento 67%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,32-1,45 (m, 6H), 1,45-1,6 (m, 1H), 1,75-1,88 (2, 2H, rotámeros), 2,01-2,11 (m, 2H), 2,82-2,87 (m, 1H), 3,33 (dd, J = 13,4 y 3,2 Hz, 1H), 4,10-4,28 (m, 2H), 4,62-4,72 (m, 1H), 4,90-5,05 (m, 3H), 5,73-5,88 (m, 1H), 7,17-7,38 (m, 5H).

D. A una solución agitada de SnCl_{2} anhidro (2,61 g, 13,8 mmol) en MeOH anhidro (80 ml) se añadió mediante cánula una solución de la azida 15k (2,45 g, 6,9 mmol) a 0ºC en MeOH anhidro (20 ml). La mezcla se agitó a TA durante 4 h. El MeOH fue evaporado y el material espumoso obtenido se recogió en dioxano/H_{2}O (100 \muL/20 \muL) y se trató con Boc_{2}O (3,0 g, 13,8 mmol) y NaHCO_{3} (2,89 g, 34,5 mmol) (el pH se ajusta en 8 con más NaHCO_{3} si es necesario) y la mezcla se agitó a TA durante 16 h. Parte del dioxano se evaporó (aprox. 50%) y el residuo se extrajo dos veces con EtOAc. La solución orgánica se lavó con salmuera (2 x 50 ml), se secó y se evaporó. El residuo obtenido fue cromatografiado sobre gel de sílice usando 20-25% de EtOAc en hexano como eluyente para dar el compuesto 15l (1,75 g, rendimiento 60%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,27-1,53 (m, 6H), 1,46 (s, 9H), 1,80 (m, 1H), 2,00-2,08 (m, 1H), 2,80 (t, J = 12,1 Hz, 1H), 3,34 (d, 14,3 Hz, 1H), 4,17-4,23 (m, 2H), 4,60-4,66 (m, 1H), 4,93 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 17,2 y 1,9 Hz, 1H), 5,13 (bs, 1H), 5,38-5,43 (m, 1H), 5,74-5,84 (m, 1H), 7,22-7,36 (m, 5H).

E. A una solución agitada a 90º del derivado N-Boc 15l (1,74 g, 4,04 mmol) en THF/H_{2}O (75 ml/15 ml) se añadieron H_{2}O_{2} (30% v/p, 2,05 ml, 16,2 mmol) y LiOH\cdotH_{2}O (0,34 g, 8,1 mmol) y la solución se agitó a 0º durante 1 h. La reacción fue apagada con Na_{2}SO_{3} (2,24 g en H_{2}O, 15 ml, 17,8 mmol). El pH se ajustó en 4-5 con solución acuosa de ácido cítrico al 10% y la mezcla se diluyó con EtOAc. La fracción acuosa se extrajo una vez más con EtOAc y la solución orgánica se lavó dos veces con salmuera, se secó y se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice usando 20% de hexano en EtOAc como eluyente, para dar el ácido carboxílico libre 15g (0,76 g, rendimiento 70%). Este compuesto era idéntico en todos sus aspectos al obtenido en el Ejemplo 15.

Ejemplo 16 Síntesis del éster metílico del ácido (2S)-N-Boc-amino-5-oxo-non-8-enoico (16d)

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Esta síntesis se basa en la metodología de T. Tsuda et al., J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, 6381-6384.

A. A una solución bien agitada del éster monoalílico del ácido malónico (1,50 g, 10,4 mmol) en THF seco bajo N_{2} (20 ml) a -78ºC, se añadió gota a gota n-Bu_{2}Mg (0,9M/hexano, 5,8 ml, 5,2 mmol) durante un periodo de 5 min. La suspensión pesada se agitó después a TA durante 1 h y se evaporó a sequedad (liberación de vacío bajo N_{2}). La sal sólida de Mg 16b fue secada bajo vacío durante 1 h.

El derivado de ácido glutámico 16a se mezcló primero con 1,1'-carbonil-diimidazol (1,65 g, 10,21 mmol) en THF anhidro, y la mezcla se agitó a TA durante 1 h para activar el resto ácido libre. Subsiguientemente, el derivado de ácido glutámico activado fue canulado en una solución de la sal de Mg 16b y la mezcla de reacción obtenida se agitó a TA durante 16 h. Después se diluyó con EtOAc y la solución orgánica fue lavada con HCl 0,5N enfriado en hielo, se trató con salmuera, se secó y se evaporó. El residuo obtenido fue cromatografiado sobre gel de sílice usando 35-40% de EtOAc en hexano como eluyente para dar el compuesto 16c (1,85 g, rendimiento 53%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 1,44 (s, 9H), 1,85-1,95 (m, 1H), 2,12-2,22 (m, 1H), 2,58-2,74 (m, 2H), 3,48 (s, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,24-4,34 (m, 1H), 4,52 (dm, J = 5,7 Hz, 2H), 5,09 (m, 1H), 5,25 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,34 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,91 (m, 1H).

B. A una solución agitada de tetraquis(trifenilfosfina) Pd(0) (0,116 g, 5% en moles, 0,1 mmol) en DMF seca (7 ml) se añadió (mediante jeringuilla y bajo una atmósfera de N_{2}) el diéster 16c (0,687 g, 2 mmol) en DMF seca (3 ml). La mezcla se agitó a TA durante 3,5 h. La DMF fue evaporada bajo presión reducida y el residuo se diluyó con EtOAc (20 ml). La solución en EtOAc se lavó con HCl 0,5N enfriado con hielo (5 ml), y con salmuera (10 ml), se secó y se evaporó. El residuo fue cromatografiado sobre gel de sílice usando 15-20% de EtOAc en hexano como eluyente para dar el compuesto 16d (0,253 g, rendimiento 42%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 1,44 (s, 9H), 1,84-1,94 (m, 1H), 2,08-2,22 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 14,0 y 7,3 Hz, 2H), 2,45-2,55 (m, 4H), 3,74 (s, 3H), 4,28 (bm, 1H), 4,98 (dm, J = 10,2 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,00-5,10 (m, 1H), 5,74-5,85 (m, 1H).

Ejemplo 17 Síntesis de ácido (2S,5R)-N-Boc-2-amino-5-metil-non-8-enoico (17f)

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A,B,C,D. (R)-(+)-citronelal 17a disponible comercialmente fue convertido primero en el derivado de aminoácido 17b siguiendo las mismas etapas de síntesis que las descritas anteriormente en el Ejemplo 15 para la conversión de aldehído 15d en el producto intermedio de aminoácido 15f.

E. El compuesto 17b (0,675 g, 5,6 mmol) se disolvió en una mezcla de t-BuOH/acetona/H_{2}O (1:1:1, 18 ml) y se puso en un baño de hielo (0ºC). Se añadieron consecutivamente NMMO (0,789 g, 6,74 mmol, 1,2 eq.) y OsO_{4} (2,5% p/p en t-BuOH, 0,7 ml, 0,067 mmol, 0,012 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 4 h. La mayor parte de la acetona se eliminó por evaporación bajo vacío y después se extrajo la mezcla con EtOAc. La capa orgánica se lavó más con H_{2}O y salmuera, se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad. El diol 17c se obtuvo con alta pureza después de cromatografía en columna de resolución rápida usando 1% de EtOH en EtOAc como eluyente, con un 77% de rendimiento (0,575 g).

F. A una solución de diol 17c (0,575 g, 1,73 mmol) en THF/H_{2}O (1:1, 20 ml) a 0ºC se añadió NaIO_{4} (0,48 g, 2,25 mmol, 1,3 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 3,5 h. La mayor parte del disolvente de THF fue subsiguientemente eliminado por evaporación bajo vacío y la mezcla restante se extrajo con EtOAc (2x100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron adicionalmente con solución acuosa de ácido cítrico al 5% (2x20 ml), solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (20 ml) y con salmuera (2x50 ml), y después la solución en EtOAc se secó bajo MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad bajo vacío. El producto intermedio de aldehído 17d (0,47 g de producto crudo) fue usado en la etapa siguiente sin más purificación.

G. A una solución de Ph_{3}PCH_{3}Br (925 mg, 2,6 mmol) en tolueno anhidro (15 ml), se añadió KHMDS (0,5 M en tolueno, 5,2 ml, 2,6 mmol) y la suspensión amarilla formada se agitó a TA durante 30 min bajo N_{2}. Después de ese periodo, la suspensión fue primero enfriada a 0ºC, se añadió una solución del aldehído 17d (0,47 g, 1,73 mmol, disuelto en 15 ml de THF anhidro) mediante una jeringa, y se dejó calentar la mezcla a TA. Después de agitar a TA durante 1 h, la mayor parte del THF se eliminó por evaporación bajo vacío, se añadió a la mezcla EtOAc (100 ml), y la capa orgánica se lavó con H_{2}O (30 ml), solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (30 ml) y salmuera (30 ml). La solución en EtOAc se secó después sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad bajo vacío. El compuesto puro 17e fue aislado después de purificación por cromatografía en columna de resolución rápida sobre gel de sílice usando hexano:EtOAc (3:2) como eluyente, con un rendimiento del 63% (0,29 g) para las dos últimas etapas.

La hidrólisis del éster etílico y el intercambio simultáneo del grupo protector de N-acetilo por un Boc en el intermedio 17e para obtener el compuesto 17f se llevó a cabo usando el mismo procedimiento que se indicó para la conversión de compuesto 15f en 15g (17f, 310 mg, cuantitativo).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 0,88 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,18-1,28 (m, 2H), 1,35-1,48 (m, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,64-1,74 (m, 1H), 1,81-1,89 (m, 1H), 1,94-2,12 (m, 2H), 4,28 (bd, J = \sim3,2 Hz, 1H), 4,93 (dm, J = 11,1 Hz, 1H), 5,00 (dm, J = 16,8 Hz, 1H), 5,74-5,84 (m, 1H).

Ejemplo 18 Síntesis de N-Boc-O-alil-(L)-treonina (18d)

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A. Se disolvió parcialmente Boc-(L)-treonina 18a (500 mg, 2,28 mmol) en CH_{2}Cl_{2}/MeOH (8 ml/0,5 ml, respectivamente) a 0ºC. Se añadió lentamente una solución de diazometano en dietil-éter hasta que persistió el color amarillo, indicando la presencia de diazometano en exceso. Al evaporar los disolventes, se obtuvo éster metílico 18b crudo en forma de un aceite blanco turbio (0,534 g).

B. El producto intermedio 18b (311 mg, 1,33 mmol) se disolvió después en dietil-éter anhidro (8 ml), se añadió Ag_{2}O (341 mg, 1,47 mmol) y tamices moleculares de 4A recién activados (1 g). Finalmente, se añadió yoduro de alilo (134 \mul, 1,47 mmol) al matraz de reacción, y la mezcla se agitó a reflujo. Se añadieron dos porciones más de yoduro de alilo (45 \mul, 0,50 mmol, cada vez) después de un periodo de 20 h y 30 h, y se siguió agitando durante un total de 36 horas. Después, la mezcla se filtró a través de celite y se purificó mediante cromatografía en columna rápida sobre gel de sílice, usando EtOAc/hexano (1:4) como eluyente, para dar 73 mg (27% de rendimiento) de compuesto 18c como un aceite transparente.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,45 (s, 9H), 3,75 (s, 3H), 3,82-3,87 (m, 1H), 3,99-4,07 (m, 2H), 4,29 (dd, J = 9,5 y 2,5 Hz, 1H), 5,14 (dm, J = 10,5 Hz, 1H), 5,21 (dm, J = 17,2 Hz, 1H), 5,75-5,84 (m, 1H).

C. El compuesto éster 18c (99 mg, 0,362 mmol) se disolvió en una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (2:1:1,4 ml) y se añadió LiOH\cdotH_{2}O (61 mg, 1,45 mmol). La solución se agitó a TA durante 2 h y después se acidificó con HCl 1N a pH aprox. 3 antes de eliminar los disolventes bajo vacío. El aceite resultante, compuesto 18d, se usó tal cual para la síntesis de inhibidores macrocíclicos.

Ejemplo 19 Síntesis de ácido (2S,3S)-N-Boc-2-amino-3(mercaptoalil)butanoico (19e)

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A. El compuesto 19a (9,1 mmol) se disolvió en piridina (5 ml) y la solución se enfrió a 0ºC en un baño de hielo, se añadió cloruro de tosilo (2,3 g, 11,8 mmol, 1,3 eq.) en pequeñas porciones, y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 24 h. Después de ese periodo, la mezcla de reacción se repartió entre dietil-éter (300 ml) y H_{2}O (100 ml). La capa etérea se siguió lavando con HCl 0,2 N (6x100 ml) y salmuera (100 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a sequedad bajo vacío. La purificación del material crudo mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando hexano/EtOAc (gradiente de relación 8:2 a 7:3) como eluyente, condujo al aislamiento de derivado de tosilo 19b con un 85% de rendimiento (3,05 g).

B. A una solución de producto intermedio 19b (775 mg, 2 mmol) en DMF anhidra (2,5 ml) se añadió tioacetato potásico (365 mg, 3,2 mmol, 1,6 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 24 h. La mayor parte de la DMF fue después evaporada bajo vacío y la mezcla que quedaba se repartió entre EtOAc y H_{2}O. La capa acuosa se reextrajo con EtOAc, las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporaron a sequedad. La purificación del material crudo mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando hexano/EtOAc (relación 4:1) como eluyente, condujo al aislamiento del compuesto 19c con un rendimiento del 80% (465 mg).

C. A una solución de tioéster 19c (465 mg) en H_{2}O/EtOH (relación 3:5, 8 ml), se añadió una solución acuosa de NaOH 0,2 M (2,4 ml) y la mezcla se agitó a TA durante 1,5 h. Después se añadió yoduro de alilo (0,292 ml, 3,2 mmol, 2 eq.) y se siguió agitando a TA durante 30 min adicionales. La mezcla de reacción se concentró a la mitad de su volumen original y después se extrajo con EtOAc. La capa acuosa se acidificó a pH aprox. 3 con HCl acuoso 0,5N frío y se re-extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporaron a sequedad bajo vacío. La mezcla de reacción en crudo contenía al menos cuatro productos; todos los productos fueron aislados después de cromatografía en columna de resolución rápida sobre gel de sílice, usando hexano/EtOAc (gradiente de relación 9:1 a 3:1). La estructura del compuesto menos polar (TLC R_{f} = 0,68 en hex/EtOAc 4:1) correspondía a la del producto deseado 19d (83 mg, 18% de rendimiento).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,24 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 3,13-3,19 (m, 2H), 3,24-3,29 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 4,50 (dd, J = 8,6 y 3,8 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,15 (dd, J = 18,4 y 1,3 Hz, 1H), 5,22 (bd, J = 7,6 Hz, 1H), 5,75-5,85 (m, 1H).

D. Una solución del éster metílico 19d (83 mg, 0,287 mmol) en MeOH/H_{2}O (3:1,4 ml) se mezcló con solución acuosa de NaOH (0,2N, 1,3 ml, 0,26 mmol) durante 24 h a TA y durante 1 h a 40ºC. La mezcla de reacción fue acidificada con HCl acuoso frío (HCl 0,5 N, a 0ºC, pH = 4-5), el MeOH se eliminó bajo vacío y la mezcla acuosa restante se extrajo con EtOAc. La solución orgánica se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó a sequedad para obtener el compuesto 19e. El compuesto 19e se usó para la síntesis final de inhibidores sin más purificación posterior.

Ejemplo 20 Síntesis de ácido (S)-N-Boc-2-amino-3-metil-3-(1-mercapto-4-butenil)butanoico (20c)

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A. Se disolvió N-penicilamina 20a (448 mg, 3 mmol) en DMF/DMSO (relación 5:1, 6 ml), se añadieron 4-bromopenteno (0,46 ml, 4,5 mmol, 1,5 eq.) y CsOH\cdotH_{2}O (1,0 g, 6 ml, 2 eq.), y la mezcla de reacción se agitó a TA. Después de 24 h, se añadió Boc_{2}O (820 mg, 3,75 mmol, 1,25 eq.) a la mezcla y se siguió agitando durante 12 h adicionales. La DMF se eliminó posteriormente bajo vacío, la mezcla restante se diluyó con HCl acuoso 0,5N frío ajustando el pH en aprox. 4-5, y después se extrajo con EtOAc (2x50 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera (2x), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad para dar el ácido carboxílico crudo 20b.

B. La purificación de 20b resultó ser difícil, por lo que el producto crudo se trató primero con diazometano para formar el correspondiente éster metílico 20c, y después se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando hexano/EtOAc (9:1) como eluyente, para obtener 190 mg (20% de rendimiento) del éster metílico 20c puro.

^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}): \delta 1,35 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,59-1,67 (m, 2H), 2,11-2,17 (m, 2H), 2,51-2,60 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,29 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,98 (dm, J = 10,5 Hz, 1H), 5,03 (dm, J = 19 Hz, 1H), 5,35 (bd, J = 7 Hz, 1H), 5,72-5,83 (m, 1H).

C. El éster se disolvió posteriormente en THF/MeOH/H_{2}O (2:2:1,5 ml), se añadió LiOH\cdotH_{2}O (50 mg, 2,0 mmol, 2 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a 40ºC durante 4 h para hidrolizar el éster 20c, para dar de nuevo el ácido 20b. La mezcla de reacción se acidificó con HCl 0,5N a pH=4-5, el THF y el MeOH se evaporaron a sequedad y la solución acuosa restante se extrajo con EtOAc. La capa de EtOAc se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad para dar el compuesto 20b, que se usó en la subsiguiente síntesis de inhibidores macrocíclicos sin más purificación.

Productos intermedios de dipéptido y tripéptido acíclico

El procedimiento general para reacciones de acoplamiento hechas en solución, y ejemplos específicos de las mismas, se describen en los documentos WO 00/09543 y WO 00/09558.

Estos procedimientos han sido utilizados para la síntesis de los dipéptidos intermedios 26c, 30a y los tripéptidos 23a, 24a, 31a, 32a y 33a.

Ejemplo 21 Síntesis del tripétido acíclico 21e

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A. A una solución del derivado de prolina 21a (preparado a partir de Boc-4(R)-hidroxiprolina disponible comercialmente y 4-cloro-quinolina como se describe en los documentos WO 00/05543 y WO 00/09558) (1,38 g, 3,68 mmol) y el homoalil-ACCA 1f crudo (aprox. 3,35 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml), se añadieron sucesivamente NMM (1,21 ml, 10,05 mmol) y HATU (1,53 g, 4,02 mmol) y la suspensión se agitó a TA durante 18 h. Después de ese tiempo, el disolvente fue evaporado y la mezcla de reacción cruda se redisolvió en EtOAc (30 ml). La solución se lavó con solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% (2 x 10 ml) y salmuera (10 ml), y se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía sobre gel de sílice usando dietil-éter al 8% en EtOAc como eluyente para obtener el diastereoisómero del compuesto 21b con un 20% de rendimiento (no se ha determinado la estereoquímica absoluta).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 0,93 y 1,01 (t, J = 8,3 Hz, 1H, rotámeros en relación 3:7), 1,14-1,35 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 1,50-1,82 (m, 4H), 2,08-2,24 (m, 2H), 2,32 (b s, 0,7H), 2,63 (b s, 0,75 H), 2,93 (b s, 0,75H), 3,16 (m, 0,25H), 3,77 (b s, 1,5H), 3,88 (b s, 0,5H), 4,4-4,55 (m, 1H), 4,98 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 17,2 y 1,6 Hz, 1H), 5,24 (b s, 1H), 5,75-5,88 (m, 1H), 6,57 y 6,78 (2 b s, 1H, 2 rotámeros), 7,42-7,58 (m, 3H), 7,63-7,73 (m, 2H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,74 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

B. A una solución del dipéptido 21b (137 mg, 0,248 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco se añadió una solución de HCl en dioxano (4M, 4 ml) y la mezcla se agitó a TA durante 1,5 h. Después se evaporó el disolvente y el residuo se secó bajo vacío elevado para dar el aminoácido libre. La mezcla se disolvió en dietil-éter/MeOH (3 \mul/2 \mul) y se trató con un ligero exceso de diazometano disuelto en dietil-éter. Después de 30 min, el diazometano en exceso se destruyó con la adición de HCl (4M en dioxano) y la mezcla se evaporó a sequedad para obtener la sal HCl del compuesto 21c, que se usó en la siguiente etapa sin purificar.

C. A una suspensión agitada del dipéptido crudo 21c (0,23 g, 0,48 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (25 ml) se añadió sucesivamente el ácido (2S)-N-Boc-amino-hept-6-enoico 21d (0,151 g, 0,62 mmol), NMM (210 \mul, 1,91 mmol) y HATU (0,236 g, 0,62 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 16 h (el pH se ajustó aprox. en 8 con NNM después de 1 h en caso necesario). El CH_{2}Cl_{2} se evaporó, el residuo se recogió en EtOAc (50 ml) y la solución orgánica se lavó con solución de NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y salmuera (2 x 20 ml), se secó y se evaporó. El compuesto crudo obtenido fue cromatografiado en gel de sílice (50 ml, EtOH al 2%/EtOAc) para dar el compuesto 21e (0,319 g, rendimiento 46%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz, rotámeros en relación 1:6) desplazamientos químicos del rotámero principal \delta 1,21-1,27 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,45-1,81 (4m, 7H), 2,20-2,22 (m, 4H), 2,28-2,37 (m, 1H), 2,90-2,99 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,94-3,98 (m, 1H), 4,29 (b d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,46-4,50 (m, 1H), 4,81 (dd, J = 8,3 y 5,4 Hz, 1H), 4,92-5,06 (m, 4H), 5,16 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,70-5,84 (m, 2H), 6,82 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,47-7,55 (m, 2H), 7,71 (dt, J = 7,0 y 1,3 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,78 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

Péptidos macrocíclicos Ejemplo 22 Procedimiento general para la macrociclización mediante metátesis de olefina

En todos los casos, el tri-péptido dieno se disolvió en CH_{2}Cl_{2} a una concentración de 0,01 M, y la solución fue desoxigenada borboteando argón (aprox. 1 h para un volumen de 500 ml). Se añade una solución de catalizador (5-30% en moles disuelto en una pequeña cantidad de CH_{2}Cl_{2} desgasificado) y la mezcla de reacción se somete a reflujo hasta que todo el material de partida se convirtió en el producto o los productos, según se indica por TLC y HPLC. Las mezclas de reacción crudas fueron concentradas a continuación casi a sequedad y se filtraron a través de una corta almohadilla de gel de sílice, eluyendo primero con CH_{2}Cl_{2} para eliminar la mayor parte del catalizador, y después con EtOAc para eluir todos los productos macrocíclicos (la mayor parte del tiempo como un único diastereoisómero). El producto o los productos crudos de cada reacción se analizan mediante HPLC quiral en una columna CHIRALCEL OJ-R (adquirida de Chiral Technologies Inc., 0,46 \varphi x 15 cm) usando una mezcla de disolventes isocrática de 70% de H_{2}O + 0,06% de TFA - 30% de CG_{3}CN + 0,06% de TFA a 205 nm. El o los productos macrocíclicos principales fueron caracterizados totalmente por los datos de: ^{1}H, COSY, TOCSY y ROESY NMR con el fin de confirmar su estructura y estereoquímica.

Ejemplo 23 Síntesis del intermedio macrocíclico (23b)

59

Una solución de dieno 23a (4,0 g, 7,88 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (800 ml, Aldrich, anhidro) fue desoxigenada burbujeando Ar durante 2 h. Después se añadió catalizador de Hoveyda (262 mg, 0,434 mmol, 5,5% en moles) en forma de un sólido, y la mezcla de reacción se calentó a reflujo bajo un balón de Ar. Después de 28 h, la solución de color rojo-naranja se evaporó para dar un sólido amorfo y después se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida sobre gel de sílice. El sistema inicial de disolventes fue 10% de EtOAc en CH_{2}Cl_{2}. Una vez eluido el catalizador de la columna, el disolvente se cambió por EtOAc puro. La elución del catalizador de la columna se evidenció por su color. El producto macrocíclico 23b fue aislado en forma de espuma incolora que se redisolvió en CH_{2}Cl_{2}/hexano (aprox. 1:2). La evaporación del disolvente proporcionó un polvo blanco (3,362 g, 89% de rendimiento).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,20-1,50 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,53 (dd, J = 9,5 y 5,4 Hz, 1H), 1,61-1,70 (m, 1H), 1,76-1,90 (m, 2H), 2,05-2,26 (m, 4H), 2,45 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,71 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 11,1 y 4,3 Hz, 1H), 4,43-4,53 (m, 2H), 4,76 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,86 (b d, J = 9,8 Hz, 1H), 5,20-5,23 (m, 2H), 5,57 (dt, J = 7,0 y 9,8 Hz, 1H), 7,32 (b s, 1H).

Ejemplo 24 Síntesis del intermedio macrocíclico (24b)

60

Una solución de dieno 24a (2,76 g, 3,82 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (600 ml, anhidro) fue desoxigenada burbujeando Ar durante 1,5 h. Se añadió mediante una cánula una solución de catalizador de Hoveyda (117 mg, 0,19 mmol, 0,05 eq.) en CH_{2}Cl_{2} anhidro y desgasificado (8 ml), y la mezcla de reacción se agitó a reflujo bajo un balón de Ar. Después de 20 h, la mezcla de reacción estaba completa aproximadamente al 50%, momento en el cual se añadió una segunda porción de catalizador (117 mg), y se siguió agitando durante 16 h más. Después se concentró la solución a aproximadamente 100 ml, se aplicó a la parte superior de una almohadilla de gel de sílice (6 x 10 cm) y el catalizador se recuperó primero eluyendo con CH_{2}Cl_{2}. El compuesto 24b se retiró por lavado de la almohadilla de sílice con MeOH al 3% en EtOAc y se volvió a purificar mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando EtOAc/hexano (2:1) para obtener un 70% de rendimiento de un sólido blanco con un ligero tono oliva (1,85 g, 94% de pureza por HPLC).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,69 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,50-7,44 (m, 2H), 7,17 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,60-5,56 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,05-3,98 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,89-3,82 (m, 1H), 3,55 (s, 3H), 2,64-2,53 (m, 1H), 2,46 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 2,40-2,31 (m, 1H), 2,21 (dd, J = 8,9 Hz, 1H), 1,78-1,65 (m, 2H), 1,55 (dd, J = 4,8 Hz, 1H), 1,485 (dd, J = 4,8 Hz, 1H), 1,41-1,30 (m, 7H), 1,16 (s, 9H). MS; es^{+}: 795,4 (M+H)^{+}.

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 25 Síntesis de los compuestos 202 y 203 (Tabla 2)

61

A. El compuesto de dieno 21e (0,130 g, 0,205 mmol) fue ciclizado usando cantidades catalíticas de dicloruro de bis-(triciclohexilfosfina)bencilideno-rutenio IV (catalizador de Grubb, supra) (52 mg, 0,064 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (60 ml) bajo reflujo durante 2 h, para dar, después de cromatografía en gel de sílice (50 ml, 3% de EtOH/EtOAc), el compuesto 25a (60,1 mg, rendimiento 48%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,22-1,30 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,44-2,35 (m, 13H), 3,07-3,14 y 3,16-3,24 (2m, 1H, rotámeros en relación 1:3), 3,69 (s, 3H), 3,96-4,04 (m, 1H), 4,42-4,50 (m, 1H), 4,95-5,04 (m, 1H), 5,05-5,15 (m, 1H), 5,20-5,30 (m, 1H), 5,55-5,65 (m, 1H), 6,75-6,79 (2d, J = 5,4 Hz, 1H, rotámeros en relación 1:3), 7,36 (s, 1H), 7,46-7,50 (m, 1H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,13 y 8,17 (2d, J = 8,0 Hz, 1H, rotámeros en relación 1:3), 8,77 (d, J = 5,1 Hz, 1H).

B. El resto éster del compuesto macrocíclico 25a (0,0156 g, 0,026 mmol) se hidrolizó con LiOH\cdotH_{2}O (8,7 mg, 0,206 mmol) en THF/MeOH/H_{2}O (4 ml/2 ml/2 ml). El producto crudo fue purificado mediante HPLC en fase inversa C18 en una columna Whatman (Partisil 10,0DS3) 50/2,4 cm usando un gradiente de disolvente de 5% de CH_{3}CN acuoso a 100% de CH_{3}CN, para obtener el compuesto puro 202 en forma de sólido blanco amorfo (11,8 mg).

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,12 (s, 9H), 1,20-1,24 (m, 2H), 1,32-1,40 (m, 3H), 1,58-1,62 (m, 2H), 1,68-1,78 (m, 3H), 1,95-2,02 (m, 1H), 2,08-2,18 (m, 2H), 2,42-2,59 (m, 2H), 3,97-4,00 (b d, J = 9,8 Hz, 2H), 4,47 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,58 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 5,22-5,29 (m, 1H), 5,46-5,54 (m, 1H), 5,66 (s, 1H), 7,12 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J = 7,3 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 7,0 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,35 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 9,08 (d, J = 5 Hz, 1H).

C. El compuesto macrocíclico 25a (20 mg, 0,033 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (1 ml) se agitó en presencia de HCl 4M/dioxano (5 ml) durante 1 h. La mezcla se evaporó y se secó cuidadosamente. El residuo se redisolvió en CH_{2}Cl_{2}/
DMF (3 ml/1 ml) y se trató con NMM (14,5 \mul, 0,132 mmol) y anhídrido acético (7,0 \mul, 0,073 mmol) y se agitó a TA durante 14 h. La mezcla se evaporó y se secó en alto vacío. El residuo se disolvió después en una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (4 ml/2 ml/2 ml) y se agitó durante la noche con LiOH\cdot2H_{2}O (11 mg, 0,264 mmol). El residuo aislado después de acidificar a pH = 3 con HCl 1N enfriado en hielo fue purificado mediante HPLC en fase inversa C18 usando un gradiente de disolvente de 0-40% de CH_{3}CN acuoso (0,06% de TFA) con el fin de aislar el compuesto puro 203 como un sólido blanco amorfo (12 mg).

^{1}H NMR (tampón de Na_{2}PO_{4} 50 mM, pH = 6,0, 600 MHz): \delta 1,22-1,27 (m, 2H), 1,38-1,43 (m, 2H), 1,58-1,64 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 2H), 1,77-1,84 (m, 1H), 1,92-1,99 (m, 1H), 2,22-2,08 (m, 1H), 2,12-2,27 (m, 1H), 2,22-2,27 (m, 1H), 2,60-2,67 (m, 1H, Pro-\beta'), 2,83-2,89 (m, 1H, Pro-\beta), 4,32 (dd, J = 12,1 y 3,5 Hz, 1H, Pro-\delta'), 4,41 (dd, J = 12,1 y 7,3 Hz, 1H), 4,56 (b d, J = 8,0 Hz, 1H, Pro-\delta), 4,62 (dd, J = 8,9 Hz, 1H, Pro-\alpha), 5,40-5,46 (m, 1H), 5,55-5,61 (m, 1H), 5,73 (b s, 1H, Pro-\gamma), 7,41 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,64 (b s, 1H, Acca-NH), 7,80 (dd, J = 7,9 Hz, 1H), 8,03 (dd, J = 8,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 7 Hz, 1H, AcNH), 8,36 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,90 (d, J = 6,0 Hz, 1H).

Ejemplo 26 Síntesis del compuesto 508 (Tabla 5)

62

A. Una solución de L-glutamina protegida con Boc 26a (4,93 g, 20 mmol) y diacetato de yodobenceno (7,73 g, 24 mmol, 1,2 eq.) en EtOAc/CH_{3}CN/H_{2}O (2:2:1, 60 ml) se agitó a 16ºC durante 1 h y a 20ºC durante 3 h. La mezcla de reacción se diluyó después con H_{2}O (20 ml), los disolventes EtOAc y CH_{3}CN se eliminaron bajo vacío, y la mezcla acuosa restante se extrajo con dietil-éter (3 x 50 ml) y EtOAc (50 ml) con el fin de eliminar la mayor parte de las impurezas. La capa acuosa (que contenía el producto intermedio de amina) se concentró después a sequedad, el material restante se redisolvió en Na_{2}CO_{3} al 10% (30 ml), se enfrió a 0ºC en un baño de hielo y se añadió lentamente una solución de cloroformiato de bencilo (3,3 ml, 20,4 mmol, 1,02 eq.), dioxano (40 ml) (aprox. 10 min). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 h y a TA durante 2 h. Después se diluyó la mezcla con H_{2}O (50 ml), se extrajo con dietil-éter frío (aprox. 5ºC) (3 x 50 ml), se acidificó con HCl 4M a pH = 3-4 y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporaron a sequedad bajo vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando EtOAc/hexano/AcOH (7:2,9:0,1) para obtener el compuesto 26b con un 43% de rendimiento global (3,04 g).

B. El producto intermedio de dipéptido 26c (250 mg, 0,41 mmol), el compuesto 26b (171 mg, 0,49 mmol, 1,2 eq.) y HATU (185 mg, 0,49 mmol, 1,2 eq.) se disolvieron en CH_{2}Cl_{2} (6 ml) y se añadió DIPEA (0,29 ml, 1,62 mmol, 4 eq.). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 14 h, después se evaporó bajo vacío el CH_{2}Cl_{2} y el material crudo se redisolvió en EtOAc. La solución en EtOAc se lavó con solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% y con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad. El compuesto 26d fue obtenido después de purificar el material crudo mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando EtOAc/hexano (4:1) como eluyente, con un 98% de rendimiento (338 mg).

C. Una solución de compuesto 26d (335 mg, 0,394 mmol) en THF (5 ml) se enfrió a 0ºC y se añadió una solución de BH_{3} en sulfuro de dimetilo (0,12 ml de solución 10 M, 1,2 mmol, 3 eq.). La mezcla de reacción se dejó calentar a TA y se agitó durante 1 h. Después se enfrió de nuevo a 0ºC antes de añadir lentamente una solución acuosa de NaOH (0,8 ml de solución 2,5 M, 1,97 mmol, 5 eq.) a lo largo de un periodo de 15 min, seguido por la adición lenta (aprox. 15 min) de una solución acuosa de H_{2}O_{2} (0,8 ml de una solución 8,8 M, 6,9 mmol, 17,5 eq.). La mezcla de reacción se dejó calentar a TA y se agitó durante 1 h. Después de ese tiempo, la mezcla de reacción se acidificó a pH aprox. 4 con el fin de apagar el BH_{3} en exceso, después se añadió solución acuosa de NaHCO_{3} para ajustar el pH en aprox. 9-10, se eliminó el THF bajo vacío, y el material crudo se repartió entre H_{2}O y EtOAc. La capa acuosa se volvió a extraer con EtOAc, las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporaron a sequedad bajo vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando EtOAc/hexano/NH_{4}OH (8:2:0,5) como eluyente, para obtener compuesto puro 26e con un rendimiento del 57% (192 mg).

D. A una solución de compuesto 26e en CH_{2}Cl_{2} (8 ml) se añadió peryodinato de Dess-Martin (195 mg, 97%, 0,33 mmol, 1,5 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 1,5 h. La reacción se apagó añadiendo solución acuosa de Na_{2}S_{2}O_{3} (3 ml de solución al 5%), después se añadió solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (5 ml) y la mezcla se agitó a TA durante 15 min. Finalmente, la mezcla de reacción cruda se extrajo con EtOAc, la capa orgánica se lavó con solución acuosa de NaHCO_{3} al 5% y salmuera, se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporó bajo vacío para dar 188 mg de aldehído 28f que se usó en la siguiente etapa sin más purificación.

E. Una solución de compuesto 26f (188 mg, 0,22 mmol), CH_{3}CO_{2}H (38 \mul) y Pd(OH)_{2} (25 mg) en etanol (5 ml) se agitó a TA bajo H_{2} a presión atmosférica durante 16 h. Después de ese periodo se añadieron al matraz más H_{2} gas, Pd(OH)_{2} (180 mg) y CH_{3}CO_{2}H (154 \mul) y se siguió agitando durante 24 h más. Después se filtró la mezcla y el disolvente se evaporó a sequedad, y el producto macrocíclico crudo se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando CHCl_{3}/MeOH/AcOH (10:2:1) para obtener el compuesto 26g con un rendimiento de aprox. 30% (48 mg).

F. Una mezcla de compuesto 26g (22 mg, 0,031 mmol), DIPEA (27 \mul, 0,155 mmol, 5 eq.) y anhídrido acético (8,7 \mul, 0,093 mmol, 3 eq.) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) se agitó a TA durante 16 h. El CH_{2}Cl_{2} se eliminó después bajo vacío, se añadió una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (2:2:1,5 ml) y LiOH\cdot2H_{2}O (13 mg, 0,31 mmol, 10 eq.), y se dejó que tuviese lugar la reacción de hidrólisis durante 68 h a TA y durante 2 h a 50ºC. Después se acidificó la mezcla de reacción (pH aprox. 4) y se purificó mediante HPLC en fase inversa para obtener el compuesto final 508 (aprox. 6 mg, aprox. 26% de rendimiento para las 2 últimas etapas).

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz) de 508 (mezcla de rotámeros confirmada por datos de COSY, TOCSY y ROESY NMR): \delta 1,18 (s, 9H), 1,09-1,85 (m solap., 11H), 1,95 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 3,18-4,14 (m solap., 6H), 3,96 (s, 3H), 4,44 (m, 1H), 4,62 y 4,69 (2d, J = 11,8 Hz, 1H, rotámeros), 5,82 (b s, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,53 (b s, 1H), 7,67 (b s, 4H), 8,19 (b s, 3H), 8,61 (s, 1H).

Ejemplo 27 Síntesis del producto intermedio macrocíclico saturado (27a)

63

A. El producto intermedio macrocíclico insaturado 23b (3,50 g, 7,30 mmol) se disolvió en EtOAc (30 ml) y se añadieron 700 mg (20% p/p) de Rh al 5% sobre alúmina. La mezcla se agitó bajo gas H_{2} a presión atmosférica y a TA durante 1,5 h. Después de ese tiempo, el análisis por HPLC confirmó la completa conversión del material de partida en dos productos, el producto deseado 27a y un producto minoritario (8% de la masa total) que fue identificado más tarde como el compuesto 27b, formado a partir de la apertura del anillo de ciclopropano. La mezcla de reacción se filtró y se concentró para dar un sólido de color verde claro (3,47 g). El sólido se evaporó conjuntamente dos veces con EtOH para eliminar todo el EtOAc (la presencia de EtOAc interfiere en la etapa siguiente). La separación de compuesto 27a del 27b por cromatografía mostró ser muy difícil, por lo que se ideó un método alternativo basado en las velocidades relativas de hidrólisis de sus correspondientes restos éster metílico.

B. La mezcla cruda de compuestos 27a y 27b (3,47 g) se disolvió en THF:MeOH (1:1, 20 ml), se añadió una solución acuosa de LiOH\cdotOH (24 mg en 5 ml de H_{2}O, 8% eq.) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 16 h (la hidrólisis completa del producto secundario 27b para dar su ácido correspondiente 27c fue confirmada por HPLC). La mezcla de reacción se concentró bajo vacío para eliminar la mayor parte del THF y el MeOH y se repartió entre H_{2}O (100 ml) y EtOAc (300 ml). La capa orgánica se lavó con NaOH 0,5 N (3 x 100 ml), salmuera (100 ml), solución acuosa de ácido cítrico al 10% (2 x 100 ml) y salmuera (100 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a sequedad. El producto deseado 27a se obtuvo con una pureza elevada (> 90% por HPLC) en forma de una espuma de color verde claro y con un 93% de rendimiento global (3,28 g) para las dos etapas.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,1-1,38 (m, 13H), 1,42 (s, 9H), 1,51-1,57 (m, 1H), 1,63-1,67 (dd, J = 8,0 y 5,1 Hz, 1H), 1,81-1,87 (m, 1H), 1,92-1,99 (m, 1H), 2,02-2,08 (m, 1H), 2,62 (d, J = 14 Hz, 1H), 3,4 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 4,01 (dd, J = 10,8 y 4,1 Hz, 1H), 4,42-4,48 (m, 1H), 4,51-4,55 (m, 1H), 4,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,97 (br s, 1H).

Ejemplo 28 Síntesis del compuesto nº 741 (Tabla 7)

64

El derivado de quinolina 8f fue unido al compuesto macrocíclico preformado 23b mediante una reacción de Mitsunobu. El derivado de quinolina 8f (30 mg, 0,095 mmol) se disolvió en THF y después se añadieron el macrociclo 23b (45,6 mg, 1 eq.) y PPh_{3} (49,8 mg, 2 eq.). La mezcla resultante se enfrió a 0ºC. Después se añadió gota a gota DIAD (37,4 \mul, 2 eq.). La solución se agitó durante 1 hora a 0ºC y después se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después se diluyó la mezcla con EtOAc (15 ml), se lavó con una solución saturada de NaHCO_{3} (15 ml), seguido de salmuera. La solución se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró bajo vacío. Se obtuvieron 202 mg de un aceite amarillo. El producto se purificó mediante cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice (100% de EtOAc). El producto contenía aún subproductos de DIAD después de la purificación. El producto resultante que se obtuvo contenía 55% p/p del producto deseado, por lo que el rendimiento se declaró el 62%.

El producto intermedio de éster (46 mg, 0,06 mmol) se disolvió en una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (relación 2:1:1, 2 ml), se añadió LiOH\cdotH_{2}O (20 mg, 0,48 mmol) y la solución se agitó a TA. Después de un periodo de 16 h, el análisis de la mezcla de reacción por HPLC indicó que la hidrólisis era completa. Los disolventes orgánicos se eliminaron bajo vacío y el material crudo resultante disuelto en DMSO se purificó mediante HPLC en fase inversa C18 para dar el inhibidor puro 741.

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,67 (s, 1H), 8,29-8,14 (m, 2H), 8,08-7,97 (m, 1H), 7,91-7,78 (m, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,31-7,20 (m, 1H), 7,10 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,82-5,71 (m, 1H), 5,58-5,47 (m, 1H), 5,32-5,23 (m, 1H), 4,74-4,64 (m, 1H), 4,55-4,47 (m, 1H), 4,23-4,06 (m, 1H), 4,04-3,94 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92-3,85 (m, 1H), 2,70-2,55 (m, 2H), 2,53-2,36 (m, 2H), 2,20-2,09 (m, 1H), 1,80-1,62 (m, 2H), 1,56-1,43 (m, 2H), 1,42-1,29 (m, 6H), 1,27 (d, J = 3,2 Hz, 3H), 1,25 (d, J = 2,9 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H).

MS: 763,1 (M+1), 761,1 (M-1).

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 29 Síntesis de compuesto 205 (Tabla 2)

65

A una solución del compuesto macrocíclico 25a (21 mg, 0,035 mmol) en t-butanol/H_{2}O) (1,5 ml/1,5 ml) a 0º, se añadió una solución de OsO_{4} en t-butanol (0,36 ml de 35% p/v, 0,035 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 1 h. La mezcla se diluyó con EtOAc (20 ml) y la solución orgánica se lavó con NaHCO_{3} al 5% (2 x 10 ml) y salmuera (2 x 10 ml), se secó y se evaporó a sequedad. El compuesto crudo se recogió en THF/MeOH/H_{2}O (3 ml/1,5 ml/1,5 ml) y se agitó en presencia de LiOH\cdotH_{2}O (13 mg, 0,28 mmol) durante 16 h. La mezcla se acidificó a pH 4 con HCl 0,5N enfriado con hielo, se evaporó y se purificó mediante HPLC en fase inversa C18 usando un gradiente de disolvente de H_{2}O (0,06% de TFA) a 40% de CH_{3}CN acuoso (0,06% de TFA). El diol syn 205 fue aislado con alta pureza en forma de un sólido blanco amorfo.

Compuesto nº 205: ^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,01 (s, 9H), 1,06-1,30 (m, 9H), 1,48-1,68 (m, 3H), 1,78-1,88 (m, 1H), 2,2-2,5 (2m, 2H), 3,78-3,82 (m, 1H), 3,86-3,90 (m, 1H), 4,39 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 5,60 (b s, 1H, Pro-\gamma), 7,03 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,40 (b s, 1H), 7,58-7,62 (m, 1H), 7,87-7,91 (m, 1H), 8,00 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,99 (b s, 1H).

EMS (modo de ionización negativa): m/z 625 (M-H)^{-}.

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 30 Síntesis de los compuestos 214 y 218 (Tabla 2)

66

A. Una solución del éster ceto-nonenoato 16d (0,180 g, 0,6 mmol) en MeOH/H_{2}O (5 ml/2 ml) se agitó a TA en presencia de LiOH\cdotH_{2}O (50 mg, 1,2 mmol) durante 1 h. La solución se acidificó a pH 6 con HCl 0,5 N enfriado con hielo y se evaporó la mayor parte del MeOH. Después se disolvió el residuo en EtOAc (30 ml) y la solución se lavó con HCl 0,5 N enfriado con hielo (10 ml), se trató con salmuera (10 ml), se secó y se evaporó. Después se redisolvió el residuo crudo en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y se hizo reaccionar con el fragmento P1-P2 30a (0,337 g, 0,6 mmol) en presencia de HATU (233 mg, 0,612 mmol) y DIPEA (420 \mul, 2,4 mmol) durante un periodo de 16 h a TA. La mezcla de reacción se cromatografió sobre gel de sílice usando EtOAc/hexano (1/1) como eluyente para aislar el compuesto puro 30b (0,370 g, 83% de rendimiento, pureza > 95% por HPLC).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,41 (s, 9H), 1,45-1,54 (m, 1H), 1,58-1,62 (m, 1H), 1,73-1,77 (m, 1H), 1,86-1,91 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 17,8 y 8,6 Hz, 1H), 2,26 - 2,43 (2m, 2H), 2,46-2,58 (m, 2H), 2,64-2,81 (m, 1H), 2,85-2,92 y 2,95-3,03 (2m, 1H, rotámeros en relación 1:3), 3,67 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 4,10-4,18 (m, 1H), 4,20-4,30 (m, 1H), 4,40-4,55 (m, 1H), 4,80-4,88 (m, 1H), 4,92-5,10 (m, 2H), 5,14 (dd, J = 10,2 y 1,6 Hz, 1H), 5,24-5,38 (m, 4H), 5,42-5,54 (m, 1H), 5,68-5,86 (m, 2H), 7,04-7,14 (m, 2H), 7,42-7,64 (m, 5H), 7,92-8,12 (m, 3H).

B. El dieno 30b (0,370 g, 0,49 mmol) fue ciclizado en presencia del catalizador dicloruro de bis(triciclohexilfosfina) bencilideno-rutenio IV (0,125 mg, 0,15 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (destilado en CaH_{2} y desgasificado con argón durante 30 min) durante un periodo de 2 h a reflujo. El compuesto se obtuvo en forma de una mezcla de estereoisómeros (30c y 30d en la relación 1:1) después de cromatografía en columna de resolución rápida en gel de sílice usando EtOAc/hexano (3/1) con un rendimiento del 35% (0,124 g).

^{1}H NMR de la mezcla de 30c y 30d (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,44 (s, 4H), 1,37 (s, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,83 (m, 0,5H), 2,01 (m, 1H), 2,09 (m, 1H), 2,42 (m, 5H), 2,73 (m, 2H), 3,26 (m, 0,5H), 3,69 (s, 1,5H), 3,76 (s, 1,5H), 3,96 (s, 3H), 4,10 (m, 1H), 4,24 (m, 0,5H), 4,10 (m, 0,5H), 4,58 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,89 (m, 0,5H), 4,97 (m, 05H), 5,30 (m, 0,5H), 5,44 (m, 2H), 5,64 (m, 1H), 7,1-7,0 (m, 3H), 7,47 (m, 4H), 8,08-7,98 (m, 3H).

C,D. Se llevó a cabo la hidrólisis de los ésteres metílicos 30c y 30d (24 mg, 0,033 mmol) en THF/MeOH/H_{2}O (1 ml/0,5 ml/0,5 ml) con LiOH\cdotH_{2}O (11 mg, 0,246 mmol) durante un periodo de 16 h a TA. Al cabo de ese tiempo, la mezcla de reacción se acidificó a pH 4-5 y se cromatografió en una columna de HPLC de fase inversa C18 usando un gradiente de disolvente de H_{2}O (0,06% de TFA) a solución acuosa al 50% de CH_{3}CN (0,06% de TFA). Los compuestos deseados 214 y 218 fueron aislados de la mezcla de los dos compuestos con alta pureza (94% de pureza por HPLC) con un 15% de rendimiento (3 mg).

Compuesto 214: ^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,15 (s, 9H), 1,48-1,54 (m, 2H), 1,65-1,74 (m, 1H), 1,77-1,85 (m, 1H), 2,12-2,25 (m, 4H), 2,27-2,34 (m, 1H), 2,61-2,68 (m, 1H), 2,87 (b t, J = 11,5 Hz, 1H), 3,92 (dd, J = 9,2 y 1,5 Hz, 1H, Pro-\delta), 3,97 (s, 3H, -OCH_{3}), 4,14-4,20 (m, 1H), 4,52 (t, J = 7,8 Hz, 1H, Pro-\alpha), 4,66 (d, J = 11,8 Hz, 1H, Pro-\delta), 5,45 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 5,51-5,58 (m, 1H), 5,82 (b s, 1H, Pro-\gamma), 7,09 (d, J = 6,0 Hz, 1H, BocNH), 7,26 (b s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,67 (b s, 3H), 8,16 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,83 (s, 1H, ACCA-NH).

Compuesto 218: ^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,06-1,10 (m, 1H), 1,18 (s, 9H), 1,52-1,55 (m, 1H), 1,62-1,80 (m, 1H), 2,10-2,68 (solapamiento, 9H), 3,90 (b d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,96 (s, 3H, OCH_{3}), 4,20-4,27 (m, 1H), 4,58-4,63 (m, 1H, Pro-\delta), 4,66 (dd, J = 8,3 Hz, 1H, Pro-\alpha), 4,88 (dd, J = 10,2 Hz, 1H), 5,18-5,26 (m, 1H), 5,73-5,79 (m, 1H, Pro-\gamma), 7,01 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,23 (b s, 1H), 7,50 (b s, 1H), 7,66 (b s, 3H), 8,20 (b s, 2H), 8,53 (s, 1H).

Ejemplo 31 Síntesis del compuesto 209 (Tabla 2)

67

A. El dieno 31a (249 mg, 0,330 mmol) se disolvió en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro y la solución fue desgasificada con argón durante 15 min. El catalizador dicloruro de bis(triciclohexilfosfina) bencilideno-rutenio IV (82 mg, 0,100 mmol) se disolvió en 3 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro y desgasificado, y se añadió a la solución de dieno. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h bajo N_{2}. La solución se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida para obtener el compuesto 31b en forma de un sólido de color pardo con un rendimiento del 71% (171 mg).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 1,22-1,44 (m, 10H), 1,42 (s, 9H), 1,66-1,74 (m, 1H), 1,87-1,97 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 3H), 2,32-2,39 (m, 1H), 3,08-3,16 (m, 1H), 3,41 (s, 3H), 4,07-4,22 (m, 3H), 4,28-4,34 (m, 1H), 4,58-4,64 (m, 1H), 4,95-4,99 (m, 1H), 5,22-5,29 (m, 2H), 5,38-5,43 (m, 1H), 5,48-5,56 (m, 1H), 7,00-7,12 (m, 3H), 7,43-7,55 (m, 4H), 7,97-8,11 (m, 3H).

ES(+) MS: m/z 727,4 (M+H)^{+}.

B. El compuesto 31b (0,117 mmol) se agitó en una solución de HCl (1 ml de solución 4N en dioxano) durante 30 min y se concentró a sequedad. El sólido se recogió en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) y se añadieron sucesivamente Et_{3}N (82 \mul, 0,585 mmol) e isotiocianato de t-butilo (35 mg, 0,351 mmol). Después de agitar a TA durante 20 h, la mezcla se concentró a sequedad y el compuesto crudo 31c se usó en la etapa de hidrólisis final sin más purificación.

D. El compuesto 31c (85 mg, 0,117 mmol) se disolvió en THF/MeOH/H_{2}O (2 ml/1 ml/1 ml), se añadió LiOH\cdotH_{2}O (39 mg, 0,936 mmol), y la solución se agitó durante 20 h a TA. Después de ese tiempo, se añadió ácido acético (1 ml) y la solución se concentró para eliminar el MeOH y el THF. El compuesto puro 209 fue aislado después de purificar el producto crudo mediante HPLC en fase inversa C18 (25 mg, aprox. 31% de rendimiento).

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,04 (s, 9H), 1,15-1,24 (m, 2H), 1,30-1,40 (m, 5H), 1,44-1,51 (m, 2H), 1,54-1,68 (m, 1H), 1,75-1,88 (m, 1H), 2,18 (dd, J = 17,2 y 8,5 Hz, 1H), 2,32-2,45 (m, 1H, Pro-\beta), 2,54-2,62 (m, 1H), 2,65-2,68 (m, 1H, Pro-\beta), 3,91 (dd, J = 11,1 y 3,5 Hz, 1H, Pro-\delta), 3,96 (s, 3H, -OCH_{3}), 4,17-4,23 (m, 1H), 4,47 (dd, J = 8,6 Hz, 1H, Pro-\alpha), 4,67 (b d, J = 7,9 Hz, 1H, Pro-\delta), 5,30 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 5,52 (b dd, J = 19 y 8,3 Hz, 1H), 5,68 (s, 1H), 5,78 (b s, 1H, Pro-\gamma), 5,94 (b s, 1H), 7,21 (b s, 1H), 7,51 (b s, 1H), 7,66 (b s, 4H), 8,19 (s, 2H), 8,40 (d, J = 7 Hz, 1H), 8,61 (s, 1H, ACCA-NH).

ES(+) MS: m/z 698,3 (M+H)^{+}.

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Ejemplo 32 Síntesis de los compuestos nº 404 y nº 407 (Tabla 4)

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68

A. El dieno 32a (84 mg, 0,11 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} anhidro (11 ml) y la solución se desgasificó durante un periodo de 15 min con un flujo de argón. El catalizador de dicloruro de bis(triciclohexilfosfina) bencilideno-rutenio IV (19 mg, 0,023 mmol) se disolvió primero en 1 ml de CH_{2}Cl_{2} desgasificado y después se pasó al matraz de reacción mediante una cánula. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a reflujo. Después se eliminó el disolvente bajo vacío y la mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida en gel de sílice, usando EtOAc/hexano (1:1) como eluyente, para dar el compuesto macrocíclico 32b en forma de un aceite amarillo (33 mg, 41% de rendimiento).

B. El producto intermedio éster 32b (33 mg, 0,045 mmol) se disolvió en una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (relación 2:1:1, 2 ml), se añadió LiOH\cdotH_{2}O (8 mg, 0,18 mmol) y la solución se agitó a TA. Después de un periodo de 16 h, el análisis de la mezcla de reacción mediante HPLC indicó que la hidrólisis era incompleta. Así, se añadió una cantidad adicional de LiOH\cdotH_{2}O (4 mg, 0,09 mmol) y la solución se agitó a TA durante un total de 36 h. Finalmente, la solución se acidificó con una pequeña alícuota de ácido acético, los disolventes orgánicos se eliminaron bajo vacío y el material crudo que quedaba se purificó mediante HPLC en fase inversa C18 para dar inhibidor 404
puro.

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,21 (d, J = 6,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Boc), 1,1-1,4 (3m, 3H), 1,66 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 2,10 (m, 2H), 2,57 (m, 2H), 3,90 (m, 4H), 4,47 (b d, J = 12,7 Hz, 1H), 4,58 (b d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,66 (dd, J = 8,0 Hz, 1H), 5,57 (m, 1H), 5,66 (m, 1H), 5,83 (b s, 1H), 6,18 (bd, J = 6,9 Hz, 1H), 7,25 (b d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,56 (b s, 1H), 7,70 (m, 4H), 8,22 (b d, J = 2,9 Hz, 2H), 8,29 (b s, J = 9,2 Hz, 1H).

C. Se disolvió inhibidor 404 (15 mg, 0,021 mmol) en etanol (2 ml) y se añadió Pd al 10%/C (2 mg). La mezcla se agitó bajo hidrógeno a TA durante 16 h. Después de filtrar, la mezcla se purificó mediante HPLC en fase inversa C18 para dar el inhibidor 407 en forma de un sólido blanco (10 mg, 66% de rendimiento).

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 1,04 (m, 1H), 1,17 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,35 (s, 9H), 1,25-1,75 (m, 12H), 2,32-2,45 (m, 1H), 3,40-3,50 (m, 2H), 3,74-3,83 (m, 1H), 3,85-3,93 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 4,27-4,36 (dd, J = 21,1 y 8,6 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 7,95 y 7,95 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,82 (br s, 1H), 7,27-7,33 (m, 1H), 7,53-7,57 (b s, 1H), 7,60-7,74 (m, 4H), 8,13-8,27 (m, 3H), 8,30-8,35 (br s, 1H).

Ejemplo 33 Síntesis del compuesto nº 824 (Tabla 8)

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69

A. El compuesto 33a (aprox. 0,55 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y la solución fue desgasificada cuidadosamente antes de añadir una muestra de catalizador de Hoveyda (17 mg, 0,028 mmol, 0,05 eq.). Después se agitó la solución bajo reflujo durante 5 h. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando un gradiente de disolvente de CH_{2}Cl_{2}/EtOAc (relación de 3:2 a 2:3), para dar el compuesto 33b con un 72% de rendimiento (194 mg).

B. A una solución de compuesto 33b (70 mg, 0,142 mmol) se añadieron lentamente, a lo largo de un periodo de 20 min, 2-etoxi-4-hidroxi-7-metoxiquinolina 3c (63 mg, 0,284 mmol, 2 eq.) y Ph_{3}P (186 mg, 0,71 mmol, 5 eq.) en THF anhidro (15 ml) a 0ºC, y DIAD (140 \mul, 0,71 mmol, 5 eq.). La mezcla de reacción se dejó calentar a TA y se agitó a TA durante 2,5 h. Subsiguientemente, el THF fue evaporado bajo vacío y el producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida, usando un gradiente de disolvente de hexano/EtOAc (relación de 7:3 a 1:1). El compuesto puro 33c fue aislado con un rendimiento del 73% (72 mg).

C. El compuesto 33c (72 mg, 0,104 mmol) se mezcló con CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y HCl 4M en dioxano (5 ml), y la mezcla se dejó agitando a TA durante 1,5 h para segmentar el grupo protector Boc y obtener la sal de HCl del compuesto intermedio 33d. La mezcla de reacción cruda se evaporó a sequedad bajo vacío, se secó bajo vacío para asegurar la eliminación de todo el HCl y se usó en la etapa siguiente sin purificar.

D. A una solución de ciclopentanol (29 \mul, 0,32 mmol) en THF (10 ml), se añadió gota a gota una solución de fosgeno en tolueno (1,93 M, 274 \mul, 0,528 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 2 h para formar el reactivo cloroformiato de ciclopentilo. Después de ese periodo, se eliminó aproximadamente la mitad del disolvente por evaporación bajo vacío, la solución de color amarillo claro restante se diluyó mediante la adición de CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se volvió a concentrar a la mitad de su volumen original, con el fin de asegurar la eliminación de todo el fosgeno en exceso. La anterior solución del reactivo de cloroformiato de ciclopentilo se diluyó adicionalmente con THF (10 ml), se enfrió a 0ºC y se añadió al compuesto sólido 33d (0,104 mmol) a 0ºC. Se añadió Et_{3}N (75 \mul, 0,534 mmol, 5,2 eq.) a la mezcla de reacción y se siguió agitando a 0ºC durante 1,5 h. Los disolventes se eliminaron bajo vacío y el material crudo se purificó mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando EtOAc/hexano (1:1) como eluyente, para obtener el compuesto 33e con rendimiento casi cuantitativo (75 mg).

E. La hidrólisis del éster metílico se logró haciendo reaccionar el compuesto 33e (75 mg, 0,11 mmol) con
LiOH\cdotH_{2}O (35 mg, 0,84 mmol, 8 eq.) en una mezcla de disolventes de THF/MeOH/H_{2}O (relación 2:2:1, 7,5 ml) a 50ºC durante 2,5 h. Al terminar la hidrólisis, la mezcla se acidificó a pH = 4,5 y los disolventes se evaporaron a sequedad bajo vacío. El producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa C18, usando un gradiente de disolvente de H_{2}O a solución acuosa de CH_{3}CN al 58% (con 0,06% de TFA), para obtener el inhibidor nº 824 en forma de un sólido amorfo de color blanco (45 mg, 65% de rendimiento).

^{1}H NMR de la sal Na^{+} del nº 824 (DMSO, 400 MHz): \delta 0,88 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,95-1,70 (resonancias solapantes, 17H), 1,37 (t, J = 7 Hz, 3H), 2,00-2,10 (m, 1H), 2,10-2,33 (m, 3H), 2,38-2,44 (m, 1H), 3,80-3,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,02-4,08 (m, 1H), 4,42 (q, J = 7 Hz, 2H), 4,35-4,44 (m, 1H), 4,50 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,63 (b s, 1H), 5,28 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 5,38 (b s, 1H), 5,42-5,49 (m, 1H), 6,37 (s, 1H), 6,87 (dd, J = 8,9 y 2,2 Hz, 1H), 7,07 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,57 (s, 1H).

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 34 Síntesis del compuesto nº 812 (Tabla 8)

70

A. A una solución del compuesto intermedio macrocíclico 23b (13,05 g, 27,2 mmol, 1,0 eq.), Ph_{3}P (14,28 g, 54,4 mmol, 2,0 eq.) y 2-carboximetoxi-4-hidroxi-7-metoxiquinolina (documentos WO 00/09543 y WO 00/09558) (6,67 g, 28,6 mmol, 1,05 eq.) en THF (450 ml) a 0ºC, se añadió DIAD (10,75 ml, 54,6 mmol, 2,0 eq.) gota a gota durante un periodo de 15 min. Después se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 3 h. Después de la conversión completa del material de partida en los productos, el disolvente se evaporó bajo vacío, la mezcla restante se diluyó con EtOAc, se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x) y salmuera (1x), y la capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad. Se obtuvo el compuesto puro 34a después de cromatografía de resolución rápida; la columna se eluyó primero con hexano/EtOAc (50:50), seguido por CHCl_{3}/EtOAc (95:5) para eliminar los subproductos Ph_{3}PO y DIAD, y la elución de la impurezas se controló mediante TLC. Finalmente, el producto 34a deseado se eluyó de la columna con CHCl_{3}/EtOAc (70:30). Normalmente, la etapa de cromatografía hubo de repetirse 2-3 veces antes de poder ser aislado el compuesto 34a con pureza elevada en forma de un sólido blanco con un rendimiento global del 68% (12,8 g, 99,5% de pureza por HPLC).

B. A una solución del producto intermedio 34a protegido con Boc (1,567 g) en CH_{2}Cl_{2} (15 ml), se añadió HCl 4N en dioxano (12 ml) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 1 h. [En caso de formarse un gel espeso en medio del periodo de reacción, se añaden 10 ml más de CH_{2}Cl_{2}]. Al terminar la desprotección, los disolventes se evaporaron a sequedad para obtener un sólido amarillo y un material similar a una pasta. La mezcla se redisolvió en MeOH aproximadamente al 5% en CH_{2}Cl_{2} y se volvió a evaporar a sequedad bajo vacío para obtener el compuesto 34b en forma de un sólido amarillo, que se usó en la etapa siguiente sin más purificación.

C. A una solución de ciclopentanol (614 \mul, 6,76 mmol) en THF (15 ml), se añadió gota a gota una solución de fosgeno en tolueno (1,93 M, 5,96 ml, 11,502 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 2 h para formar el reactivo cloroformiato de ciclopentilo (z). Al cabo de ese tiempo, se eliminó aproximadamente la mitad del disolvente mediante evaporación bajo vacío, la solución de color amarillo claro restante se diluyó mediante la adición de CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se concentró a la mitad de su volumen original para asegurar la eliminación de todo el fosgeno en exceso. La anterior solución de reactivo de cloroformiato de ciclopentilo se diluyó más con THF (15 ml) y se añadió a la sal amina-2HCl 34b. La mezcla se enfrió a 0ºC en un baño de hielo, el pH se ajustó a aproximadamente 8,5-9 mediante la adición de Et_{3}N (añadido gota a gota) y la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 h. Después de ese periodo, la mezcla se diluyó con EtOAc, se lavó con agua (1x), solución saturada de NaHCO_{3} (2x), H_{2}O (2x) y salmuera (1x). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó bajo vacío para obtener una espuma de color amarillo-ámbar. El compuesto 34c se obtuvo en forma de una espuma blanca después de purificar mediante cromatografía en columna de resolución rápida (usando un gradiente de disolvente de 30% de hexano a 20% hexano en EtOAc como eluyente) con 80% de rendimiento (1,27 g) y una pureza > 93%.

D. El éster dimetílico 34c (1,17 g) se disolvió en una mezcla de THF/MeOH/H_{2}O (20 ml; relación 2:1:1) y se añadió una solución acuosa de NaOH (1,8 ml, 1N, 1 eq.). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 1 h antes de ser evaporada a sequedad, para obtener la sal sódica 34d en forma de un sólido blanco (aprox. 1,66 mmol). El compuesto 34d fue usado en la etapa siguiente sin purificar.

E. La sal sódica cruda 34d (1,66 mmol) se disolvió en THF (17 ml), se añadió Et_{3}N y la mezcla se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Se añadió gota a gota cloroformiato de isobutilo (322 \mul, 2,5 mmol) y la mezcla se agitó a 0ºC durante 75 min. Después de ese periodo se añadió diazometano (15 ml) y se siguió agitando a 0ºC durante 30 min y después a temperatura ambiente durante 1 h más. La mayor parte del disolvente se evaporó a sequedad bajo vacío, la mezcla restante se diluyó con EtOAc, se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2x), H_{2}O (2x) y salmuera (1x), se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad para obtener el compuesto 34e en forma de una espuma de color amarillo claro (1,2 g, aprox. 1,66 mmol). El producto intermedio diazocetona 34e se usó en la etapa siguiente sin purificar.

F. La diazocetona 34e (1,2 g, 1,66 mmol) disuelta en THF (17 ml) se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Se añadió gota a gota una solución acuosa de HBr (48%, 1,24 mL) y la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1h. Después se diluyó la mezcla con EtOAc, se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2x), H_{2}O (2x) y salmuera (1x), la capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad para obtener el producto intermedio de \beta-bromocetona 34f en forma de una espuma de color amarillo claro (aprox. 1,657 mmol).

G. A una solución de la bromocetona 34f (600 mg, 0,779 mmol) en isopropanol (5 ml) se añadió tiourea (118 mg, 1,55 mmol) y la mezcla de reacción se puso en un baño de aceite precalentado a 75ºC en el que se dejó agitando durante 1 h. Después se eliminó bajo vacío el isopropanol, y el producto se disolvió en EtOAc (100 ml). La solución se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} y salmuera, la capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó para dar el producto crudo 34g (522 mg) en forma de un sólido de color pardo-rojizo. Este material se usó en la etapa final sin más purificación.

H. El éster metílico crudo 34g (122 mg, 0,163 mmol) se disolvió en una solución de THF/MeOH/H_{2}O (relación 2:1:1, 4 ml) y se saponificó usando LiOH\cdotH_{2}O (89 mg, 2,14 mmol). La reacción de hidrólisis se llevó a cabo durante un periodo de 12-15 h a TA. Después se eliminaron los disolventes bajo vacío y el producto crudo se purificó mediante HPLC C18 de fase inversa usando un gradiente de disolvente de 10% de CH_{3}CN en H_{2}O a 100% de CH_{3}CN, para dar el inhibidor de proteasa del HCV nº 812 en forma de un sólido de color amarillo (24 mg, 20% de rendimiento global para la conversión del producto intermedio 34f en el inhibidor nº 812).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,63 (s, 1H), 8,26-8,15 (m, 2H), 7,79 (b s, 1H), 7,72 (b s, 1H), 7,50 (b s, 2H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,77 (b s, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,39-4,31 (m, 1H), 4,08-3,99 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,87 (d, J = 9,5 Hz, 2H), 2,65-2,53 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 2H), 2,20-2,12 (dd, J = 8,6 Hz, 1H), 1,80-1,64 (m, 2H), 1,63-1,06 (m, 14H). MS; es^{+}: 733,2 (M+H)^{+}, es^{-}: 731,2 (M-H)^{-}.

Ejemplo 34A

Usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 34, pero haciendo reaccionar la bromocetona 34f con N-metiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el nº 811 (Tabla 8).

71

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,63 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,12-7,93 (m, 1H), 7,88-7,69 (m, 2H), 7,32-7,24 (m, 2H), 5,82-5,75 (m, 1H), 5,52 (ddd, J = 8,1 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 9,9 Hz, 1H), 4,67-4,61 (m, 1H), 4,51 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,08-4,00 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,04 (d, J = 4,1 Hz, 3H), 2,65-2,37 (m, 3H), 2,16 (m, 1H), 1,77- 1,65 (m, 2H), 1,63-1,11 (m, 17H). MS; es^{+}: 747,2 (M+H)^{+}, es^{-}: 745,3 (M-H)^{-}.

Ejemplo 34B

Usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 34, pero haciendo reaccionar la bromocetona 34f con N-etiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el nº 810 (Tabla 8).

72

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,63 (b s, 1H), 8,27 (b s, 1H), 8,20 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,13-8,07 (m, 1H), 7,86 (b s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,81 (b s, 1H), 5,54 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 9,7 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 4,38 (b s, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,92-3,87 (m, 1H), 3,54-3,46 (m, 2H), 2,68-2,65 (m, 2H), 2,47-2,38 (m, 1H), 2,15 (dd, J = 8,6 Hz, 1H), 1,78-1,65 (m, 2H), 1,60-1,12 (m, 17H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H). MS; es^{+}: 783,2 (M+Na)^{+}, es^{-}: 761,2 (M+H)^{+}.

Ejemplo 34C

Usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 34, pero haciendo reaccionar la bromocetona 34f con N-isopropiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el nº 822.

73

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,63 (s, 1H), 8,33-8,23 (b s, 1H), 8,21 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (bs, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,35-7,23 (m, 2H), 5,81 (b s, 1H), 5,52 (dd, J = 8,5 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 7,6 Hz, 1H), 4,37 (b s, 1H), 4,15 (b s, 1H), 4,07-3,98 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,88 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 2,60- 2,53 (m, 2H), 2,47-2,37 (m, 2H), 2,19-2,10 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 1,80-1,64 (m, 2H), 1,63-1,29 (m, 13H), 1,27 y 1,25 (2 x d, J = 6,5 Hz, 6H), 1,23-1,09 (m, 2H). MS; es^{+}: 775,0 (M+H)^{+}, es^{-}: 772,9 (M-H)^{-}.

Ejemplo 34D

Usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 34, pero haciendo reaccionar la bromocetona 34f con N-acetiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el nº 809.

74

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,62 (s, 1H), 8,30 (b s, 1H), 8,17 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,62 (b s, 1H), 7,52 (b s, 1H), 7,28 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,21 (bs, 1H), 5,63 (b s, 1H), 5,54 (dd, J = 8,1 Hz, 1H), 5,28 (dd, J = 9,5 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,56-4,46 (m, 2H), 4,11-4,04 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,93-3,88 (m, 1H), 2,62-2,54 (m, 1H), 2,45-2,36 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,21-2,13 (m, 1H), 1,79-1,69 (m, 2H), 1,65-1,30 (m, 16H), 1,26-1,12 (m, 2H). MS; es^{+}: 775,3 (M+Na)^{+}, es^{-}: 773,3 (M-H)^{-}.

Ejemplo 34E

A una solución agitada del producto intermedio 2-amino-4-tiazolilo 34g (0,24 g, 0,32 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) a TA se añadió DIPEA (0,55 ml, 3,18 mmol, 10 eq.) y cloroformiato de metilo (0,13 ml, 1,6 mmol, 5 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante 6,5 h antes de ser concentrada bajo vacío. El material aislado crudo se hidrolizó después para dar el ácido carboxílico deseado como se describe en el Ejemplo 34 para dar el compuesto nº 818.

75

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,61 (s, 1H), 8,21-8,07 (m, 2H), 7,61-7,38 (m, 2H), 7,26 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,19-7,10 (m, 1H), 5,60-5,47 (m, 2H), 5,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 4,63-4,53 (m, 1H), 4,47 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,13-4,04 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,42-2,30 (m, 2H), 2,17 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 1,81-1,68 (m, 2H), 1,63-1,29 (m, 16H), 1,23-1,10 (m, 2H). MS; es^{+}: 791,1 (M+H)^{+}, es^{-}: 789,1 (M-H)^{-}.

Ejemplo 34F

Siguiendo las condiciones descritas anteriormnete en el ejemplo 34E, pero usando cloroformiato de isobutilo, se obtuvo el producto intermedio análogo de carbamato sustituido. El material aislado crudo fue después hidrolizado para dar el compuesto deseado nº 819.

76

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,62 (s, 1H), 8,47-8,27 (b s, 1H), 8,18 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,69-7,60 (m, 1H), 7,60-7,51 (m, 1H), 7,28 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,28-7,19 (m, 1H), 5,70-5,60 (m, 1H), 5,52 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,8 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,53-4,44 (m, 2H), 4,10-3,99 (m, 1H), 4,04 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,94-3,87 (m, 1H), 2,65-2.53 (m, 1H), 2,46-2,34 (m, 1H), 2,16 (dd, J = 8,1 Hz, 1H), 2,03-1,91 (m, 1H), 1,79-1,09 (m, 20H), 0,95 (d, J = 6,7 Hz, 6H). MS; es^{+}: 833,2 (M+H)^{+}, es^{-}: 831,2 (M-H)^{-}.

Ejemplo 35 Síntesis del compuesto nº 908

Partiendo del derivado 27a y usando la misma química que se describió en el ejemplo 34, se obtuvo el siguiente macrociclo saturado, compuesto nº 908 (Tabla 9).

77

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,47 (s, 1H), 8,16 (d, J = 10 Hz, 1H), 8,15-8,07 (m, 1H), 7,82-7,63 (m, 2H), 7,53-7,43 (m, 2H), 7,33-7,22 (m, 1H), 7,13 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,77-5,65 (m, 1H), 4,62-4,52 (m, 2H), 4,50-4,4 (m, 1H), 4,20-4,10 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,89-3,83 (m, 1H), 2,59-2,53 (m, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 1,79-1,0 (m, 25H). MS; es^{+}: 735,2 (M+H)^{+}, es^{-}: 733,2 (M-H)^{-}.

Ejemplo 35A Síntesis del compuesto nº 909

Usando el mismo procedimiento que se describió en el ejemplo 35 pero usando N-acetiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el compuesto nº 909 (Tabla 9).

78

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,53-8,41 (m, 2H), 8,20 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,68 (b s, 1H), 7,68 (b s, 1H), 7,27 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,67 (b s, 1H), 4,65-4,50 (m, 3H), 4,44-4,37 (m, 1H), 4,21-4,13 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,99-3,86 (m, 1H), 2,62-2,39 (m, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,78-1,67 (m, 3H), 1,67-1,01 (m, 22H). MS; es^{+}: 798,0 (M+Na)^{+}, es^{-}: 777,0 (M+H)^{+}.

Ejemplo 35B Síntesis del compuesto nº 910

Usando el mismo procedimiento que se describió en el ejemplo 35 pero usando N-etiltiourea disponible comercialmente se obtuvo el compuesto nº 910 (Tabla 9).

79

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,47 (s, 1H), 8,29 (b s, 1H), 8,20 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09 (b s, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,32 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,14 (dd, J = 6,7 Hz, 1H), 5,78 (b s, 1H), 4,58 (dd, J = 8,1 Hz, 2H), 4,43 (b s, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,55-3,46 (m, 2H), 2,63-2,53 (m, 1H), 2,47-2,41 (m, 1H), 1,78-1,00 (m, 25H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H). MS; es^{+}: 763,1 (M+H)^{+}, es^{-}: 761,1 (M-H)^{-}.

Ejemplo 35c Síntesis del compuesto nº 911

Usando el mismo procedimiento que se describió en el ejemplo 35 pero usando N-isopropiltiourea disponible se obtuvo el compuesto nº 911 (Tabla 9).

80

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 8,47 (s, 1H), 8,29-8,19 (m, 1H), 8,19 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,09-8,0 (m, 1H), 7,83 (b s, 1H), 7,74 (b s, 1H), 7,31 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,76 (b s, 1H), 4,64-4,53 (m, 2H), 4,44 (b s, 1H), 4,22-4,09 (m, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 2,63-2,58 (m, 1H), 2,46-2,41 (m, 1H), 1,79-1,10 (m, 24H), 1,27 y 1,26 (2 x d, J = 6,5 Hz, 6H). MS; es^{+}: 777,0 (M+H)^{+}, es^{-}: 775,0 (M-H)^{-}.

Ejemplo 36 Síntesis del compuesto nº 716

81

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm) 8,62 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,64-7,54 (m, 2H), 7,47 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,16 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,63 (s, 1H), 5,52 (q, J = 9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J = 8,9 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 11,45 Hz, 1H), 4,45 (dd, J = 9,2, 8,27 Hz, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,7 (dd, J = 7,6, 1,0 Hz, 1H), 2,66 (s, 3H), 2,55-2,65 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,17 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 1,65-1,75 (m, 2H), 1,5-1,35 (m, 7H), 1,15 (s, 9H).

MS: 705 (M+1), 703 (M-1).

Ejemplo 37 Síntesis del compuesto nº 717

82

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,64 (s, 1H), 5,52 (q, J = 9,9 Hz, 1H), 5,26 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 11,44 Hz, 1H), 4,45 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,9-3,8 (m, 1H), 2,7-2,55 (m, 1H), 2,4-2,3 (m, 1H), 2,18 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 1,75-1,65 (m, 2H), 1,5-1,2 (m, 7H), 1,14 (s, 9H).

MS: 705 (M+1), 703 (M-1).

Ejemplo 38 Síntesis del compuesto nº 718

83

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 9,55 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,32 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,10-7,07 (m, 2H), 5,64-5,54 (m, 1H), 5,59-5,48 (m, 1H), 5,33-5,23 (m, 1H), 4,73-4,61 (m, 1H), 4,45 (dd, J = 7,5, 9,1 Hz, 1H), 4,09-4,00 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,93-3,83 (m, 1H), 2,67-2,55 (m, 2H), 2,53-2,43 (m, 1H), 2,42-2,31 (m, 1H), 2,23-2,12 (m, 1H), 1,81-1,66 (m, 2H), 1,52-1,42 (m, 2H), 1,42-1,25 (m, 6H), 1,21 (s, 9H).

MS: 689,3 (M+1), 687,3 (M-1).

Ejemplo 39 Síntesis del compuesto nº 722

84

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 9,70 (s, 1H), 8,64 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,14 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,30 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,14-7,06 (m, 2H), 5,60-5,54 (m, 1H), 5,58-5,48 (m, 1H), 5,31-5,23 (m, 1H), 4,71-4,62 (m, 1H), 4,49-4,40 (m, 1H), 4,08-3,99 (m, 1H), 3,92-3,84 (m, 1H), 2,69-2,54 (m, 2H), 2,53-2,46 (m, 1H), 2,42-2,31 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,22-2,13 (m, 1H), 1,81-1,64 (m, 2H), 1,54-1,42 (m, 2H), 1,42-1,27 (m, 6H), 1,22 (s, 9H).

MS: 703,3 (M+1), 701,3 (M-1).

Ejemplo 40 Síntesis del compuesto nº 733

85

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,75 (m, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,88-7,87 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,28 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,05-7,00 (m, 2H), 6,64-6,63 (m, 1H), 5,62-5,58 (m, 1H), 5,55-5,49 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,64-4,61 (m, 1H), 4,48-4,44 (m, 1H), 4,07-4,03 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,92-3,85 (m, 1H), 2,67-2,54 (m, 2H), 2,53-2,45 (m, 1H), 2,41-2,34 (m, 1H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,75-1,69 (m, 2H), 1,50-1,43 (m, 2H), 1,41-1,32 (m, 6H), 1,17 (s, 9H).

MS: 689,3 (M+1), 687,2 (M-1).

Ejemplo 41 Síntesis del compuesto nº 703

86

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta: 8,50 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 8,11-8,00 (m, 1H), 7,88-7,77 (m, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,89-5,68 (m, 1H), 4,62 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,53 (dd, J = 8,3 Hz, 1H), 4,16-4,07 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,88 (b d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,53-3,43 (m, 2H), 2,63-2,51 (m, 1H), 2,46-2,36 (m, 1H), 1,81-1,62 (m, 2H), 1,60-1,01 (m, 15H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H).

MS; es^{+}: 751,1 (M+H)^{+}, es^{-}: 749,1 (M-H)^{-}.

Ejemplo 42 Síntesis del compuesto nº 734

87

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,24 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,05-6,98 (m, 2H), 5,57-5,54 (m, 1H), 5,55-5,48 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,63-4,59 (m, 1H), 4,47-4,43 (m, 1H), 4,13-3,99 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,92-3,83 (m, 1H), 2,67-2,55 (m, 2H), 2,53-2,46 (m, 1H), 2,43-2,31 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 1H), 2,15 (3H), 1,75-1,70 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,41-1,28 (m, 6H), 1,17 (s, 9H).

MS:703,2 (M+1), 701,3 (M-1).

Ejemplo 43 Síntesis del compuesto nº 738

88

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,64 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,24 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,99 (dd, J = 2,2, 9,2 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,62-5,57 (m, 1H), 5,56-5,47 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 1H), 4,65-4,56 (m, 1H), 4,45 (dd, J = 7,6, 8,9 Hz, 1H), 4,07-4,00 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,88-3,84 (m, 1H), 2,68-2,56 (m, 2H), 2,54-2,43 (m, 1H), 2,42-2,31 (m, 1H), 2,34 (s, 3H), 2,24-2,14 (m, 1H), 1,80-1,64 (m, 2H), 1,52-1,43 (m, 2H), 1,43-1,27 (m, 6H), 1,18 (s, 9H).

MS:703,2 (M+1), 701,2 (M-1).

Ejemplo 44 Síntesis del compuesto nº 725

89

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,62 (s, 1H), 8,10 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H); 7,49 (s, 1H), 7,35 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,09-7,03 (m, 2H), 5,65-5,61 (m, 1H), 5,55-5,49 (m, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 4,62-4,57 (m, 1H), 4,49-4,45 (m, 1H), 4,08-4,01 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,20-3,14 (m, 1H), 2,65-2,56 (s, 1H), 2,53-2,47 (m, 1H), 2,42-2,35 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 1H), 1,79-1,68 (m, 2H), 1,50-1,43 (m, 2H), 1,41-1,28 (m, 12H), 1,18 (s, 9H).

MS:748,2 (M+1), 746,2 (M-1).

Ejemplo 45 Síntesis del compuesto nº 726

90

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,64 (s, 1H), 8,10 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,83-7,76 (m, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,44-7,42 (m, 1H), 7,18-7,01 (m, 2H), 5,56-5,49 (m, 2H), 5,29-5,24 (m, 1H), 4,66-4,63 (m, 1H), 4,47-4,42 (m, 1H), 4,28 (s, 3H), 4,06-4,02 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,93-3,86 (m, 1H), 2,66-2,55 (m, 2H), 2,42-2,31 (m, 2H), 2,22-2,14 (m, 1H), 1,79-1,65 (m, 2H), 1,52-1,27 (m, 7H), 1,22 (s, 9H).

MS:703,2 (M+1), 701,3 (M-1).

Ejemplo 46 Síntesis del compuesto nº 906

91

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,46 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,34 (m, 1H), 7,14-7,05 (m, 2H), 5,63- 5,58 (m, 1H), 4,66-4,61 (m, 1H), 4,54-4,44 (m, 2H), 4,23-4,18 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,92-3,88 (m, 1H), 3,21-3,14 (m, 1H), 2,44-2,33 (m, 1H), 1,35 (d, J = 7 Hz, 6H), 1,73-1,01 (m, 26H).

MS:762,0 (M+1), 759,9 (M-1).

Ejemplo 47 Síntesis del compuesto nº 907

92

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}): \delta (ppm): 8,46 (s, 1H), 7,98 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,91-7,89 (m, 2H), 7,23-7,21 (m, 2H), 7,07-7,00 (m, 2H), 6,35-6,32 (m, 2H), 5,64-5,58 (m, 1H), 4,65-4,61 (m, 1H), 4,53-4,47 (m, 2H), 4,24-4,19 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,86-3,84 (m, 1H), 2,40-2,33 (m, 1H), 1,73-1,01 (m, 26H).

MS:702,0 (M+1), 699,9 (M-1).

Ejemplo 48 Ensayo fluorogénico de la proteína heterodímera NS3-NS4A de longitud completa

La región no codificadora NS2-NS5B-3' fue clonada mediante RT-PCR en el vector pCR®3 (Invitrogen) usando RNA extraído de suero de un individuo infectado por el HCV genotipo 1b (proporcionado por el Dr. Bernard Willems, H\hat{o}pital St-Luc, Montreal, Quebec, Canadá). La región NS3-NS4A (NS3-NS4AFL) fue después subclonada por PCR en el vector de expresión de baculovirus pFastBac™HTa (Gibco/BRL). La secuencia del vector incluye una región que codifica una secuencia N-terminal de 28 restos que contiene una etiqueta de hexahistidina. Se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL) para producir el baculovirus recombinante. His-NS3-NS4AFL se expresó infectando 10^{6} células Sf21/ml con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 0,1-0,2 a 27º. Durante la expresión ocurre auténtica auto-proteolisis para producir un complejo de proteína NS3-NS4A no covalente y estable (denominado de longitud completa "FL" [Full Lenght]). El cultivo infectado se recolectó 48 a 64 h después mediante centrifugación a 4º. El sedimento celular fue homogeneizado en NaPO_{4} 50 mM, pH 7,5, 40% de glicerol (p/v), \beta-mercaptoetanol 2 mM, en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa. Después se extrajo la His-NS3-NS4AFL del lisado celular con 1,5% de NP-40, 0,5% de Triton X-100, NaCl 0,5 M y un tratamiento con DNasa. Después de ultracentrifugación, el extracto soluble se diluyó 4 veces y se unió en una columna quelante de Ni Hi-Trap Pharmacia. La His-NS3-NS4AFL se eluyó en forma pura en > 90% (según se juzgó por SDS-PAGE), usando un gradiente de imidazol de 50 a 400 mM. La His-NS3-NS4AFL se almacenó a -80º en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, 10% (p/v) de glicerol, NaCl 0,5 M, imidazol 0,25 M, 0,1% de NP-40. Se descongeló en hielo y se diluyó justo antes de su uso.

La actividad de proteasa de His-NS3-NS4AFL se ensayó en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, citrato sódico 0,25 M, 0,01% (p/v) de n-dodecil-\beta-D-maltósido, TCEP 1 mM. Cinco (5) \muM del sustrato apagado internamente antranil-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO_{2})TW-OH en presencia de varias concentraciones de inhibidor fueron incubados con 1,5 nM de His-NS3-NS4AFL durante 45 min a 23º. La concentración final de DMSO no sobrepasó 5,25%. La reacción se terminó mediante la adición de MES 1M, pH 5,8. La fluorescencia del producto N-terminal se controló en un fluorómetro Perkin-Elmer LS-50B equipado con un lector de placas de 96 pocillos (longitud de onda de excitación: 325 nm; longitud de onda de emisión: 423 nm).

El % de inhibición se calculó con la ecuación siguiente:

100 - [(fluo_{inh}-fluo_{blanco})/(fluo_{ctl}-fluo_{blanco}) x 100]

Se aplicó un ajuste no lineal con el modelo de Hill a los datos de inhibición-concentración, y se calculó la concentración eficaz al 50% (IC_{50}) usando el software SAS (Statistical Software Systems; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Ejemplo 49 Ensayo radiométrico de la proteasa NS3 de HCV recombinante

El sustrato usado para el ensayo radiométrico de la proteasa NS3 de HCV recombinante, DDIVPC-SMSYTW, es segmentado entre los restos cisteína y serina por la enzima. La secuencia DDIVPC-SMSYTW corresponde al sitio de segmentación natural NS5A/NS5B en el que una prolina ha sido sustituida por el resto cisteína en P2. El sustrato peptídico DDIVPC-SMSYTW y el trazador biotina-DDIVPC-SMS[^{125}I-Y]TW se incubaron con la proteasa NS3 recombinante en ausencia o en presencia de inhibidores. La separación del sustrato de los productos se llevó a cabo añadiendo a la mezcla de ensayo esferas de agarosa recubiertas con avidina, y filtrando a continuación. La cantidad de producto SMS[^{125}I-Y]TW encontrado en el filtrado (con o sin inhibidor) permitió el cálculo del porcentaje de conversión del sustrato y del porcentaje de inhibición.

A. Reactivos

El Tris y Tris-HCl (UltraPure) fueron obtenidos de Life Technologies. El glicerol (UltraPure), MES y BSA fueron adquiridos de Sigma®. El TCEP se obtuvo de Pierce, el DMSO de Aldrich® y el NaOH de Anachemia®.

Tampón de ensayo: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol al 30% (p/v), CHAPS al 2% (p/v), 1 mg/ml de BSA, TCEP 1 mM (TCEP se añade inmediatamente antes de usarlo a partir de una solución madre 1M en agua).

Sustrato: DDIVPC-SMSYTW, 25 \muM de concentración final (desde una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC para evitar la oxidación).

Trazador: Sustrato monoyodado reducido (biotina-DDIVPC-SMS[^{125}I-Y]TW) (aprox. 1 nM de concentración final).

Proteasa NS3 de HCV tipo 1b, 25 nM de concentración final (desde una solución madre en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, 10% de glicerol, NaCl 300 mM, DTT 5 mM, 0,01% de NP-40).

B. Protocolo

El ensayo se realizó en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Cada pocillo contenía:

20 \mul de sustrato/trazador en tampón para ensayo;

10 \mul \pm de inhibidor en 20% de DMSO/tampón para ensayo;

10 \mul de proteasa NS3 1b.

El blanco (sin inhibidor y sin enzima) y el testigo (o control) (sin inhibidor) fueron también preparados en la misma placa de ensayo.

La reacción enzimática se inició mediante la adición de la solución de enzima y la mezcla de ensayo se incubó durante 60 min a 23ºC con agitación suave. Se añadieron veinte (20) \mul de NaOH 0,025 N para apagar la reacción enzimática.

Se añadieron veinte (20) \mul de esferas de agarosa recubiertas con avidina (adquiridas de Pierce®) en una placa de filtración Millipore® MADP N65. La mezcla de ensayo apagada se transfirió a la placa de filtración y se incubó durante 60 min a 23ºC con agitación suave.

Las placas se filtraron usando un aparato Millipore® MultiScreen Vaccuum Manifold Filtration, y 40 \mul del filtrado se pasaron a una placa opaca de 96 pocillos que contenía 60 \mul de fluido de centelleo por pocillo.

Los filtrados se sometieron a recuento en un instrumento Packard® TopCount usando un protocolo de ^{125}I durante 1 minuto.

El % de inhibición se calculó con la ecuación siguiente:

100 - [(\text{cuentas}_{inh}- \text{cuentas}_{blanco})/(\text{cuentas}_{ctl}-\text{cuentas}_{blanco}) x 100]

Se aplicó un ajuste no lineal con el modelo de Hill a los datos de inhibición-concentración, y se calculó la concentración eficaz al 50% (IC_{50}) usando el software SAS (Statistical Software Systems; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Ejemplo 50 Ensayos de especificidad

La especificidad de los compuestos se determinó frente a diversas proteasas de serina: elastasa leucocitaria humana, elastasa pancreática bovina y \alpha-quimotripsina pancreática bovina y una proteasa de cisteína: catepsina B hepática humana. En todos los casos se utilizó un protocolo de formato de placa de 96 pocillos usando un sustrato cromogénico específico para cada enzima. Cada ensayo incluyó 1 h de preincubación de enzima-inhibidor a TA, seguida por la adición de sustrato e hidrólisis a aprox. 30% de conversión, determinada en un lector de microplacas UV Thermomax® o un lector de placas Perkin-Elmer® LS50B de fluorescencia. Las concentraciones de sustrato se mantuvieron lo más bajas posible en comparación con K_{M} para reducir la competición del sustrato. Las concentraciones de compuesto variaron de 300 a 0,06 \muM, dependiendo de su potencia.

Las condiciones finales para cada ensayo fueron las siguientes:

Tris-HCl 50 mM pH 8, Na_{2}SO_{4} 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 con

[100 \muM de Succ-AAPF-pNA y 250 pM de \alpha-quimotripsina], [133 \muM de Succ-AAA-pNA y 8 nM de elastasa porcina], [133 \muM de Succ-AAV-pNA y 8 nM de elastasa leucocitaria];

o

[NaHPO_{4} 100 mM, pH 6, EDTA 1 mM, DMSO al 3%, TCEP 1 mM, 0,01% de Tween-20, Z-FR-AMC (7-amino-4-metilcumarina) 4 \muM y catepsina B 0,5 nM (la enzima de partida fue activada en tampón que contenía TCEP 20 mM antes de usarla)].

Un ejemplo representativo se resume a continuación para elastasa pancreática porcina: a una placa de 96 pocillos de poliestireno de fondo plano (Cellwells, Corning) se añadió, usando un manipulador de líquidos Biomek (Beckman):

40 \mul de tampón para ensayo (Tris-HCl 50 mM pH 8, Na_{2}SO_{4} 1 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM);

20 \mul de solución de enzima (Tris HCl 50 mM pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% Tween-20, elastasa pancreática porcina 40 nM); y

20 \mul de solución de inhibidor (Tris HCl 50 mM pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% Tween-20, inhibidor 1,5 mM-0,3 \muM, 15% v/v DMSO).

Después de 60 minutos de preincubación a TA, se añadieron a cada pocillo 20 \mul de solución de sustrato (Tris-HCl 50 mM pH 8, Na_{2}SO_{4} 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, Succ-AAA-pNA 665 \muM), y la mezcla de reacción se siguió incubando a TA durante 60 min, al cabo de los cuales se leyó la absorbancia en el lector de placas UV Thermomax®. Filas de pocillos fueron asignadas para testigos o controles (sin inhibidor) y para blancos (sin inhibidor y sin enzima).

Las diluciones dobles secuenciales de la solución de inhibidor fueron realizadas por el manipulador de líquido en una placa separada, usando Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, 0,02% Tween-20, 15% DMSO (v/v). Todos los demás ensayos de especificidad se realizaron de manera similar.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:

[1-((UV_{inh}-UV_{blanco})/(UV_{ctl}-UV_{blanco}))] x 100

Se aplicó un ajuste no lineal con el modelo de Hill a los datos de inhibición-concentración, y se calculó la concentración eficaz al 50% (IC_{50}) usando el software SAS (Statistical Software Systems; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Ejemplo 51 Ensayo de la proteasa NS3 basado en células

Este ensayo se hace con células Huh-7, una línea celular humana derivada de un hepatoma, cotransfectadas con 2 construcciones de DNA:

una (llamada NS3) que expresa parte de la poliproteína no estructural del HCV fusionada con la proteína tTA a través de un sitio de segmentación NS5A-NS5B por el orden siguiente: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-(NS5B)tTA, en donde (NS5B) representa los 6 primeros aminoácidos de NS5B. Esta poliproteína se expresa bajo el control del promotor CMV,

la otra (llamada SEAP) que expresa la proteína informadora, fosfatasa alcalina secretada (SEAP), bajo la regulación de un promotor respondedor a tTA.

La primera construcción conduce a la expresión de una poliproteína a partir de la cual las diferentes proteínas maduras se liberan por segmentación por la proteasa NS3. Se cree que las proteínas virales maduras forman un complejo en la membrana del retículo endoplasmático. La tTA es una proteína de fusión, descrita por Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992): 5547-5551), que contiene un dominio de unión de DNA y un activador transcripcional. La liberación de la proteína tTA requiere una segmentación dependiente de NS3 en el sitio de segmentación NS5A-NS5B entre NS5A y ella misma. Esta última segmentación permite que la tTA migre al núcleo y transactive el gen de la SEAP. Por consiguiente, la reducción de la actividad proteolítica de NS3 conduce al confinamiento de tTA en el citoplasma y al concomitante descenso de la actividad de SEAP.

Para controlar actividades celulares distintas de la inhibición de la NS3 proteasa que son debidas al compuesto, se hace una co-transfección paralela con una construcción que expresa tTA sola y la misma construcción informadora, de forma que la actividad de SEAP es independiente de la proteasa NS3.

Protocolo del ensayo: células Huh-7, desarrolladas en CHO-SFMII (Life Technologies) + 10% de FCS (suero de ternera fetal) fueron co-transfectadas con las dos construcciones de DNA en las proporciones siguientes:

7 \mug de NS3 + 500 ng de SEAP + 800 \mul de FuGENE (Boehringer Mannheim) por 4 x 10^{6} células Huh-7. Después de 5 horas a 37ºC, las células se lavaron, se tripsinaron y se extendieron en placas (a razón de 80.000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos que contenían una gama de concentraciones de los compuestos a ensayar. Después de un periodo de incubación de 24 h, se midió la actividad de SEAP en el medio con el kit Phospha-Light (Tropix).

El análisis del porcentaje de inhibición de la actividad de SEAP con respecto a la concentración de compuesto se realizó con el software SAS para obtener el valor de EC_{50}.

Tablas de compuestos

Las tablas que siguen recogen compuestos representativos de la invención. Se encontró que todos los compuestos expuestos en las Tablas 1 a 9 eran activos en el ensayo enzimático presentado en el Ejemplo 48. Un número acompañado por un asterisco (*) representa actividad enzimática obtenida con el ensayo radiométrico presentado en el Ejemplo 49 con valores de IC_{50} por debajo de 50 \muM. En estos ensayos enzimáticos, se usó la escala siguiente:

A \geq 1 \muM; 1 \muM > B > 0,1 \muM; y C \leq 0,1 \muM.

Se ensayaron varios compuestos en los ensayos de especificidad presentados en el Ejemplo 50, y se encontró que eran específicos para la proteasa NS3. En general, los resultados de los diferentes ensayos de especificidad son los siguientes: HLE > 300 \muM; PPE > 300 \muM; \alpha-Chym. > 300 \muM; Cat. B > 300 \muM, lo que indica que estos compuestos son altamente específicos hacia la proteasa NS3 del CHV y no es de esperar que muestren efectos secundarios graves. Además, algunos de estos compuestos fueron analizados en el ensayo basado en células descrito en el Ejemplo 51, y se encontró que tenían actividad con un valor de EC_{50} inferior a 10 \muM, lo cual es una firme indicación de que estos compuestos pueden atravesar la membrana de la célula. En particular, se han evaluado compuestos de las Tablas 7, 8 y 9 en el ensayo celular y el resultado se ha indicado en la última columna. En este ensayo celular, se usó la codificación siguiente: A > 1 \muM; B \leq 1 \muM.

Las abreviaturas siguientes se usan en las tablas que siguen a continuación:

MS: datos espectrales de masas por electroproyección; m/z MH^{+}, excepto cuando se indique de otra forma mediante un asterisco* = m/z MH^{-}; Ac: acetilo; Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo; Ph: fenilo; Pr: propilo.

TABLA 1

93

Estereoisómero simple en R^{1}

94

TABLA 2

95

Estereoisómero simple en R^{1}

96

97

\newpage

TABLA 3

98

Estereoisómero simple en R^{1}

99

100

TABLA 4

101

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido

102

103

\newpage

TABLA 5

104

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido

105

TABLA 6

106

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido

107

\newpage

TABLA 7

108

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido

109

110

111

112

113

TABLA 8

114

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido; doble enlace 13,14: cis

115

116

118

\newpage

TABLA 9

119

Enlace D-R^{1} syn resp. al ácido

120

121

Claims (81)

1. Un compuesto de fórmula (I):

122

en la que W es CH o N,

R^{21} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, hidroxi o N(R^{23})_{2},

en donde cada R^{23} es, independientemente, H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

R^{22} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo C_{1-6}, tioalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, alcoxi C_{2-7}-alquilo, cicloalquilo C_{3-6}, arilo C_{6 ó 10} o Het, en donde Het es un heterociclo de cinco, seis o siete miembros, saturado o insaturado, que contiene de uno a cuatro heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre;

estando dichos cicloalquilo, arilo o Het sustituidos con R^{24},

en donde R^{24} es H, halo, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, alcoxi C_{1-6}, cicloalcoxi C_{3-6}, NO_{2}, N(R^{25})_{2}; NH-C(O)- R^{25}; o NH-C(O)-NH-R^{25}, en donde cada R^{25} es, independientemente: H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

o R^{24} es NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

R^{3} es hidroxi, NH_{2}, o un grupo de fórmula -NH-R^{31}, en donde R^{31} es arilo C_{6 ó 10}, heteroarilo, -C(O)-R^{32}, -C(O)-NHR^{32}, o -C(O)-OR^{32},

en donde R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

D es una cadena de alquileno de 5 a 10 átomos saturada o insaturada, que contiene opcionalmente uno a tres heteroátomos independientemente elegidos entre O, S o N-R^{41}, en donde R^{41} es H, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, o -C(O)-R^{42}, en donde R^{42} es alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6} o arilo C_{6 \ ó \ 10};

R^{4} es H o de uno a tres sustituyentes en cualquier átomo de carbono de dicha cadena D, siendo dicho sustituyente elegido independientemente entre el grupo formado por: alquilo C_{1-6}, haloalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxi, halo, amino, oxo, tio o tioalquilo C_{1-6},

y

A es una amida de fórmula -C(O)-NH-R^{5}, en donde R^{5} se elige entre el grupo formado por: alquilo C_{1-8}, cicloalquilo C_{3-6}, arilo C_{6 ó 10} o aralquilo C_{7-16};

o A es un ácido carboxílico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, en donde el centro de carbono 1 tiene la configuración (R) y D está unido syn respecto a la amida, o está unido syn respecto a A, según se representa por las estructuras (i) y (ii):

123

3. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en la que D está unido syn respecto a A como se representa por la fórmula (ii).

4. El compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde W es N;

R^{21} es H, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxi, cloro o N(R^{23})_{2}, en donde R^{23} es H o alquilo C_{1-6};

R^{22} es H, tioalquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, fenilo o Het elegido entre el grupo formado por:

124

en donde R^{24} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25}, NH-C(O)-R^{25}; NH-C(O)- NH-R^{25},

en donde cada R^{25} es, independientemente: H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

o NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es alquilo C_{1-6}.

5. Un compuesto de fórmula I según la reivindicación 4, en donde R^{21} es H o alcoxi C_{1-6}.

6. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 4, en donde R^{22} es alcoxi C_{1-4}, fenilo o Het elegido entre el grupo formado por:

125

en donde R^{24} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25} o NH-C(O)-R^{25};

en donde cada R^{25} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}; o NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es como se definió en la reivindicación 4.

7. Un compuesto de fórmula I según la reivindicación 6, en donde R^{21} es metoxi.

8. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 7, en donde R^{22} es etoxi, o Het elegido entre el grupo formado por:

126

en donde R^{24a} es NH-R^{25} o NH-C(O)-R^{25}, en donde R^{25} es alquilo C_{1-6};

o R^{24a} es NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es alquilo C_{1-6}, y R^{24b} es H o alquilo C_{1-6}.

9. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, en donde R^{3} es una amida de fórmula NH-C(O)R^{32} o una urea de fórmula NH-C(O)-NH-R^{32} o un carbamato de fórmula NH-C(O)-OR^{32}, en donde R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}.

10. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 9, en donde R^{3} es una urea o un carbamato, en donde R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{4-6}.

11. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 10, en donde R^{3} es un carbamato y R^{32} es terc-butilo, ciclobutilo o ciclopentilo.

12. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, en donde D es una cadena de alquileno saturada o insaturada, de 6 a 8 átomos de carbono, que contiene opcionalmente uno o dos heteroátomos elegidos independientemente entre: O, S o N-R^{41}, en donde R^{41} es H, alquilo C_{1-6} o acilo C_{2-7}.

13. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 12, en donde D contiene opcionalmente un heteroátomo elegido entre NH ó N-acilo C_{2-7}.

14. El compuesto según la reivindicación 13, en donde dicho heteroátomo se elige entre NH ó N(Ac).

15. El compuesto según la reivindicación 13, en donde dicha cadena D contiene 7 átomos.

16. El compuesto según la reivindicación 15, en donde dicho heteroátomo está en la posición 10 de dicha cadena D.

17. El compuesto según la reivindicación 13, en donde dicha cadena D es saturada.

18. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 12, en donde D es una cadena de alquileno saturada o insaturada, de 6 a 8 átomos, que contiene opcionalmente un heteroátomo elegido entre: O ó S.

19. El compuesto según la reivindicación 18, en donde dicha cadena D contiene 7 átomos.

20. El compuesto según la reivindicación 19, en donde dicho heteroátomo está en la posición 9 de dicha cadena D.

21. El compuesto según la reivindicación 20, en donde dicha cadena D está sustituida en posición 8 con R^{4}, en donde R^{4} es H o alquilo C_{1-6}.

22. El compuesto según la reivindicación 21, en donde dicho R^{4} es H o metilo.

23. El compuesto según la reivindicación 22, en donde dicho R^{4} es H u 8-(S)-Me.

24. El compuesto según la reivindicación 23, en donde dicha cadena D es saturada.

25. El compuesto según la reivindicación 19, en donde dicha cadena D contiene un doble enlace en posición 11,12.

26. El compuesto según la reivindicación 25, en donde dicho doble enlace es trans.

27. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 12, en donde D es una cadena de alquileno todo carbono de 6 a 8 átomos, saturada o insaturada.

28. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 27, en donde D es una cadena de 7 átomos.

29. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 28, en donde D es saturada.

30. El compuesto según la reivindicación 29, en donde dicha cadena D está sustituida con R^{4}, en donde R^{4} es H, oxo, hidroxi, alcoxi o alquilo.

31. El compuesto según la reivindicación 30, en donde dicho R^{4} es H o alquilo C_{1-6}.

32. El compuesto según la reivindicación 31, en donde dicho R^{4} es H o metilo.

33. El compuesto según la reivindicación 32, en donde dicho R^{4} es H ó 10-(S)-Me.

34. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 28, en donde D contiene un doble enlace.

35. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 34, en donde dicho doble enlace está en posición 13,14 de dicha cadena D.

36. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 35, en donde dicho doble enlace es cis.

37. El compuesto según la reivindicación 36, en donde dicha cadena D está sustituida con R^{4}, en donde R^{4} es H, oxo, hidroxi, alcoxi C_{1-6} o alquilo C_{1-6}.

38. El compuesto según la reivindicación 37, en donde dicho R^{4} es H o alquilo C_{1-6}.

39. El compuesto según la reivindicación 38, en donde dicho R^{4} es H o metilo.

40. El compuesto según la reivindicación 39, en donde dicho R^{4} es H ó 10-(S)-Me.

41. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, en donde A es un ácido carboxílico.

42. Un compuesto según la reivindicación 1, en donde W es N;

R^{3} es un grupo de fórmula o -NH-C(O)-NHR^{32} ó -NH-C(O)-OR^{32}, en donde R^{32} es alquilo C_{1-4} o cicloalquilo C_{4-6};

D es una cadena de alquileno de 6 a 8 átomos, saturada o insaturada, unida al resto ciclopropilo del compuesto de fórmula I syn respecto a A, que contiene opcionalmente uno o dos heteroátomos elegidos independientemente entre: O, S ó N-R^{41}, en donde R^{41} es H o acilo C_{2-7};

R^{4} es H, o de uno a tres sustituyentes elegidos independientemente entre hidroxi, o alquilo C_{1-6}; y

A es un ácido carboxílico, o una sal o éster del mismo aceptable farmacéuticamente.

43. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 42, en donde R^{21} es H o metoxi;

R^{22} es alcoxi C_{1-6} o Het elegido entre el grupo formado por:

127

en donde R^{24a} es H, alquilo C_{1-6}, NH-R^{25}, NH-C(O)-R^{25} o NH-C(O)-NH-R^{25},

en donde R^{25} es: H, alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6}; o R^{24a} es NH-C(O)-OR^{26}, en donde R^{26} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

y R^{24b} es H o alquilo C_{1-6};

R^{3} es urea de fórmula N-C(O)-NHR^{32} o un carbamato de fórmula N-C(O)-OR^{32}, en donde R^{32} es alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-6};

D es una cadena de alquileno de 7 átomos que contiene opcionalmente un doble enlace en posición 11,12 ó 13,14; conteniendo dicha cadena D opcionalmente un heteroátomo elegido independientemente entre: O, S, NH, N(Me) o N(Ac); y

R^{4} es H o alquilo C_{1-6}.

44. El compuesto de fórmula I según la reivindicación 43, en donde R^{21} es metoxi y R^{22} es etoxi o

128

en donde R^{24a} es NH-(alquilo C_{1-4}), NH-C(O)-(alquilo C_{1-4}), NH-C(O)-O-(alquilo C_{1-4}); o NH-C(O)-NH-(alquilo C_{1-4});

D es una cadena C7 todo carbono, saturada o que contiene un doble enlace cis en posición 13,14.

45. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

129

que comprende un estereoisómero sencillo en el centro de carbono 1, en donde dicho doble enlace, la estereoquímica de D y R^{22} se definen como sigue:

130

46. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

131

que comprende un estereoisómero sencillo en el centro de carbono 1, en donde R^{3}, R^{4}, dicha posición del doble enlace, la estereoquímica de D, R^{21} y R^{22} se definen como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

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(Tabla pasa a página siguiente)

132

\newpage

47. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

134

que comprende un estereoisómero sencillo en el centro de carbono 1, en donde R^{3}, D, la estereoquímica de D, R^{21} y R^{22} se definen como sigue:

135

\newpage

48. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

136

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, R^{4}, X_{9} y dicho doble enlace 11,12 se definen como sigue:

137

49. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

139

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, X_{10}, X_{11} y X_{12} se definen como sigue:

140

50. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

141

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, R^{21} y R^{22} se definen como sigue:

142

51. Un compuesto de fórmula:

143

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, R^{4}, X_{9}, X_{10}, X_{11}, dicho doble enlace 13,14 y R^{22} se definen como sigue:

144

145

146

147

52. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

148

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, dicho doble enlace 13,14 está en cis, R^{32}, R^{4} y R^{22} se definen como sigue:

149

150

151

53. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

152

en donde dicho D está en syn respecto al ácido carboxílico -COOH, R^{32}, R^{4} y R^{22} se definen como sigue:

153

154

54. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 como medicamento.

55. Uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 como una herramienta de investigación para diseñar ensayos de replicación viral.

56. El uso del compuesto de la fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 para la preparación de un medicamento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C.

57. El uso del compuesto de la fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por el virus de la hepatitis C.

58. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad viralmente eficaz anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53, o una sal o éster del mismo terapéuticamente aceptable, mezclada con un medio vehículo o agente auxiliar aceptable farmacéuticamente.

59. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 58, que comprende, además, un agente inmunomodulador adicional.

60. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 59, en donde dicho agente inmunomodulador adicional se selecciona del grupo que consiste en \alpha-, \beta- y \delta-interferones.

61. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 58, que comprende, además, un agente antiviral.

62. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 61, en donde dicho agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en: ribavirina y amantadina.

63. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 58, que comprende, además, otro inhibidor de proteasa del HCV.

64. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 58, que comprende, además, un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del HCV.

65. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 64, en donde el inhibidor de las otras dianas en el ciclo vital del HCV se selecciona del grupo que consiste en helicasa, polimerasa y metaloproteasa.

66. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 65 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por virus de la hepatitis C en un mamífero.

67. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (A):

155

en donde X es PG o R^{2};

cada PG es, independientemente, un grupo protector;

R^{2} es un grupo de fórmula

156

en donde R^{21}, R^{22} y W son como se definen en la reivindicación 1;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y n es 2.

68. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (A) de acuerdo con la reivindicación 67, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula (B) con un compuesto de fórmula (C):

157

en donde PG, X, A' y n son como se definen en la reivindicación 67.

69. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (D):

158

en donde X es PG o R^{2};

PG es un grupo protector;

R^{2} es como se define en la reivindicación 67;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y n es 2.

70. Un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula (D) de acuerdo con la reivindicación 69, comprendiendo dicho procedimiento escindir el grupo protector PG en el anillo de pirrolidina en el compuesto de fórmula (A):

159

en donde X es PG o R^{2};

cada PG es, independientemente, un grupo protector;

R^{2}, A' y n son como se definen en la reivindicación 69.

71. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (E):

160

en donde X es PG o R^{2};

PG es un grupo protector;

R^{2} es como se define en la reivindicación 67;

A' es un ácido carboxílico protegido;

R^{3} es como se define en reivindicación 1;

N es 0 ó 2;

D' es como se define para D, pero siendo 2 a 5 átomos más corto; y

D es como se define en la reivindicación 1.

72. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (E) de acuerdo con la reivindicación 71, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula (D) con compuesto de fórmula (F):

161

en donde X, A', n, R^{3}, y D son como se definen en la reivindicación 71.

73. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (G):

162

en donde R^{2} es como se define en la reivindicación 67, R^{3} y D son como se definen en la reivindicación 1; y

A' es un ácido carboxílico protegido.

74. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (G'), el cual corresponde al compuesto de fórmula (G) de acuerdo con la reivindicación 73, en donde D es un grupo insaturado según se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento provocar un cierre del anillo del compuesto de fórmula (E) haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (E) en presencia de un catalizador basado en un metal de transición, para obtener un compuesto de fórmula (G'):

163

en donde

R^{2} es como se define en la reivindicación 67, R^{3}, n y A' son como se definen en la reivindicación 1.

75. Un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula (G) de acuerdo con la reivindicación 73, en donde D representa un grupo saturado según se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento someter a hidrogenación el compuesto de fórmula (G') de acuerdo con la reivindicación 74.

76. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (J):

164

en donde R^{2} es como se define en la reivindicación 67, y R^{3} es como se define en la reivindicación 1;

m es 1 a 5;

n es 1 a 5;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y Cbz es benciloxicarbonilo.

77. Un compuesto de la siguiente fórmula (K):

165

en donde R^{2} es como se define en la reivindicación 67, y R^{3} es como se define en la reivindicación 1;

m es 1 a 5;

n es 1 a 5;

A' es un ácido carboxílico protegido;

y Cbz es benciloxicarbonilo.

78. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (K) de acuerdo con la reivindicación 77, comprendiendo dicho procedimiento someter a hidroboración y luego a oxidación un compuesto de fórmula (J):

166

en donde R^{2}, R^{3}, m, n, A' y Cbz son como se definen en la reivindicación 76.

79. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (L):

167

en donde R^{2} es como se define en la reivindicación 67, y R^{3} es como se define en la reivindicación 1;

m es 1 a 5;

n es 1 a 5;

y A' es un ácido carboxílico protegido.

80. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (L) de acuerdo con la reivindicación 79, comprendiendo dicho procedimiento someter a hidrogenación, en presencia de ácido, el compuesto de fórmula (K):

168

en donde R^{2} y R^{3}, m, n y A' son como se definen en la reivindicación 79; y Cbz es benciloxicarbonilo.

81. Uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 para el tratamiento o la prevención de la contaminación viral de materiales.