DE60312824T2

DE60312824T2 - Tripeptide zur inhibierung von ns3 (hepatitis c) umfassend einen hydroxyprolinrest, die durch etherbindung an einen substituiertes chinolin gebunden sind

Info

Publication number: DE60312824T2
Application number: DE60312824T
Authority: DE
Inventors: Montse Laval LLINAS-BRUNET; Vida J. Laval GORYS
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2023-01-25
Also published as: CO5611113A2; CN1642974A; PE20031012A1; NZ534689A; CA2370396A1; EP1474441B1; AU2003202347B2; UA77758C2; PL371324A1; KR20040097990A; EP1474441A1; ECSP045226A; DE60312824D1; DK1474441T3; BR0307408A; UY27636A1; WO2003064456A1; RS67204A; NO20043643L; TW200400199A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, Verfahren zu ihrer Synthese und Zusammensetzungen für die Behandlung von Hepatitis C-Virus(HCV-)Infektion. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung neue Pepitid-Analoge und pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend derartige Analoge zur Behandlung von HCV-Infektion.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hepatitis C-Virus (HCV) ist das hauptetiologische Mittel von Posttransfusions- und außerhalb des Krankenhauses erlangter ("community-acquired") nicht-A-nicht-B-Hepatitis weltweit. Es wird geschätzt, dass über 200.000.000 Menschen weltweit mit dem Virus infiziert sind. Ein hoher Prozentsatz an Trägern wird chronisch infiziert und viele schreiten fort zu chronischer Lebererkrankung, sogenannter chronischer Hepatitis C. Diese Gruppe hat ihrerseits ein hohes Risiko für schwerwiegende Lebererkrankungen, wie Leberzirrhose, hepatozelluläres Karzinom und terminale Lebererkrankung, die zum Tod führen.
Der Mechanismus, durch den virale HCV-Persistenz etabliert und eine hohe Rate chronischer Lebererkrankung verursacht wird, wurde nicht tiefgehend aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Wirtsimmunsystem interagiert und dieses umgeht. Zusätzlich müssen die Rollen von zellularen und humoralen Immunantworten als Schutz gegen HCV-Infektion und -Erkrankung noch aufgeklärt werden. Von Immunglobulinen wurde als Prophylaxe für Transfusions-assoziierte virale Hepatitis berichtet, jedoch empfiehlt das Zentrum für Erkrankungskontrolle (CDC) gegenwärtig keine Immunglobulin-Behandlung für diesen Zweck. Das Fehlen einer effektiven Schutz-Immunantwort erschwert die Entwicklung eines Vakzins oder adäquater Prophylaxe-Maßnahmen nach Ansteckung, so dass in nächster Zeit die Hoffnungen fest auf antivirale Interventionen gegründet werden.
Verschiedene klinische Studien wurden mit dem Ziel der Identifizierung pharmazeutischer Mittel durchgeführt, die zu einer effektiven Behandlung von HCV-Infektionen bei Patienten mit chronischer Hepatitis C in der Lage sind. Diese Studien haben die Verwendung von Interferon-α allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln einbezogen. Derartige Studien haben gezeigt, dass eine wesentliche Anzahl der Teilnehmer nicht auf diese Therapien reagieren, und von denen, die günstig reagieren, wurde bei einem großen Anteil gefunden, dass sie nach Beendigung der Behandlung rückfällig wurden.
Bis vor kurzem war Interferon (IFN) die einzig verfügbare Therapie von belegtem Nutzen, bestätigt in der klinischen Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C. Jedoch ist die nachhaltige Ansprechgeschwindigkeit gering und die Interferon-Behandlung induziert ebenfalls schwere Nebenwirkungen (d.h. Retinopathie, Thyroiditis, akute Pankreatitis, Depression), welche die Lebensqualität von behandelten Patienten vermindert. In jüngster Zeit wurde Interferon in Kombination mit Ribavirin für Patienten, die auf IFN allein nicht reagieren, erprobt. Jedoch werden die Nebenwirkungen, verursacht durch IFN, mit dieser Kombinationstherapie nicht abgeschwächt. Pegylierte Formen von Interferonen, wie PEG-Intron^® und Pegasys^® können offensichtlich zum Teil diese schädlichen Nebenwirkungen behandeln, aber antivirale Arzneimittel bleiben nach wie vor die erste Wahl zur oralen Behandlung von HCV.
Daher besteht ein Bedarf für die Entwicklung von effektiven antiviralen Mitteln für die Behandlung von HCV-Infektion, die die Beschränkungen existierender pharmazeutischer Therapien überwinden.
HCV ist ein umhülltes Positivstrang-RNA-Virus aus der Flaviviridae-Familie. Das Einzelstrang-HCV-RNA-Genom hat eine Länge von etwa 9.500 Nucleotiden und weist ein einzelnes offenes Leseraster (ORF) auf, das ein einzelnes großes Polyprotein von etwa 3.000 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an multiplen Stellen durch zellulare und virale Proteasen gespalten, um die strukturellen und nicht-strukturellen (NS)-Proteine zu erzeugen. Im Falle von HCV wird die Erzeugung von reifen nicht-strukturellen Proteinen (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B) durch zwei virale Proteasen durchgeführt. Die erste, die kaum charakterisiert ist, spaltet an der NS2-NS3-Bindung (von jetzt an bezeichnet als NS2/3-Protease); die zweite ist eine Serin-Protease, enthalten in der N-terminalen Region von NS3 (NS3-Protease) und vermittelt sämtliche der nachfolgenden Spaltungen stromabwärts von NS3, beide in cis bei der NS3-NS4A-Spaltungsstelle, und in trans für die verbliebenen NS4A-NS4B-, NS4B-NS5A-, NS5A-NS5B-Stellen. Das NS4A-Protein scheint multiplen Funktionen zu dienen, agierend als Co-Faktor für die NS3-Protease, und möglicherweise unterstützend in der Membranlokalisierung von NS3- und anderen viralen Replikase-Komponenten. Die Komplexbildung der NS3-Protease mit NS4A scheint für das Verarbeitungsereignis notwendig zu sein, und erhöht insgesamt die proteolytische Effizienz der Stellen. Das NS3-Protein zeigt ebenfalls Nucleosidtriphosphatase- und RNA-Helikase-Aktivitäten. NS5B ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die bei der Replikation von HCV beteiligt ist.
Eine allgemeine Strategie für die Entwicklung von antiviralen Mitteln ist es, viral kodierte Enzyme, die für die Replikation des Virus wesentlich sind, zu inaktivieren.
Das Nachfolgende ist eine Liste von Patentanmeldungen, veröffentlicht in den letzten Jahren, die HCV-NS3-Protease-Inhibitor-Peptid-Analoga offenbaren, die von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung strukturell verschieden sind:
GB 2 337 262 ; JP 10298151 ; JP 11126861 ; JP 11292840 ; JP 2001-103993 ; US 6 159 938 ; US 6 187 905 ; WO 97/43310 ; WO 98/17679 ; WO 98/22496 ; WO 98/46597 ; WO 98/46630 ; WO 99/38888 ; WO 99/50230 ; WO 99/64442 ; WO 99/07733 ; WO 99/07734 ; WO 00/09543 ; WO 00/09558 ; WO 00/20400 ; WO 00/59929 ; WO 00/31129 ; WO 01/02424 ; WO 01/07407 ; WO 01/16357 ; WO 01/32691 ; WO 01/40262 ; WO 01/58929 ; WO 01/64678 ; WO 01/74768 ; WO 01/77113 ; WO 01/81325 ; WO 02/08187 ; WO 02/08198 ; WO 02/08244 ; WO 02/08251 ; WO 02/08256 ; WO 02/18369 ; WO 02/60926 und WO 02/79234 .
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie Tripeptidverbindungen bereitstellt, die gegenüber NS3-Protease, einem Enzym, das für die Replikation des Hepatitis C-Virus wesentlich ist, inhibitorisch sind. Weiterhin sind die Verbindungen in der Lage, die HCV-RNA-Replikation im Replikon-Zellmodell zu inhibieren.
Ein weiterer Vorteil eines Aspekts der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, dass die Verbindungen spezifisch die NS3-Protease inhibieren und keine signifikante inhibitorische Aktivität gegen andere Serin-Proteasen, wie z.B. Human-Leukozyt-Elastase (HLE), Schwein-Pankreatik-Elastase (PPE) oder pankreatisches Rinderchymotrypsin oder Cystein-Proteasen, wie Humanlebercathepsin B (Cat B) zeigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Umfang der Erfindung ist eine Verbindung der Formel (1) enthalten:
worin R¹ Hydroxy oder NHSO₂R^1A darstellt, worin R^1A (C_1-8)-Alkyl, (C_3-7)-Cycloalkyl oder {(C_1-6)-Alkyl-(C_3-7)-cycloalkyl} darstellt, welche alle gegebenenfalls ein bis dreimal mit Halogen, Cyano, Nitro, O-(C_1-6)-Alkyl, Amido, Amino oder Phenyl sub stituiert sind, oder R^1A ist C₆- oder C₁₀-Aryl, das gegebenenfalls ein bis dreimal mit Halogen, Cyano, Nitro, (C_1-6)-Alkyl, O-(C_1-6)-Alkyl, Amido, Amino oder Phenyl substituiert ist; R² ist (C_4-6)-Cycloalkyl; R³ ist t-Butyl oder (C_5-6)-Cycloalkyl und R⁴ ist (C_4-6)-Cycloalkyl; oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. annehmbares Salz hiervon.
Im Umfang dieser Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung enthalten, umfassend eine gegen virale Hepatitis C wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder ein therapeutisch akzeptables Salz hiervon, in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermedium oder Hilfsmittel bzw. Zusatzstoff.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung weiterhin Interferon (pegyliert oder nicht) oder Ribavirin oder ein oder mehrere andere anti-HCV-Mittel oder irgendeine Kombination der obigen.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung erleichtert die Behandlung einer viralen Hepatitis C-Infektion in einem Säuger durch Verabreichen dem Säuger eine gegen virale Hepatitis-C wirksame Menge einer Verbindung der Formel I, ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon oder eine Zusammensetzung, wie oben beschrieben, allein oder in Kombination mit ein oder mehreren von: Interferon (pegyliert oder nicht) oder Ribavirin oder ein oder mehrere andere anti-HCV-Mittel, zusammen oder separat verabreicht.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung erleichtert die Vorbeugung einer viralen Hepatitis-C-Infektion in einem Säuger durch Verabreichen an den Säuger einer gegen virale Hepatitis-C wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I, ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon oder eine Zusammensetzung, wie oben beschrieben, allein oder in Kombination mit ein oder mehreren von: Interferon (pegyliert oder nicht) oder Ribavirin oder ein oder mehrere andere anti-HCV-Mittel, die alle zusammen oder separat verabreicht werden.
Auch im Umfang dieser Erfindung liegt die Verwendung einer Verbindung der Formel I, wie hier beschrieben, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer viralen Hepatitis-C-Infektion.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Wie hier verwendet, gelten die nachfolgenden Definitionen, sofern nicht anders angegeben:
Mit Bezug auf die Fälle, wo (R) oder (S) verwendet wird, um die absolute Konfiguration eines Substituenten oder asymmetrischen Zentrums einer Verbindung der Formel 1 zu bezeichnen, wird die Bezeichnung im Zusammenhang der gesamten Verbindung und nicht im Rahmen des Substituenten oder asymmetrischen Zentrums allein gemacht.
Die Bezeichnung "P1, P2 und P3", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Position der Aminosäure-Reste, ausgehend vom C-terminalen Ende der Peptid-Analoga, und erstreckt sich in Richtung des N-Endes (d.h. P1 bezieht sich auf Position 1 vom C-Ende, P2: zweite Position vom C-Ende etc.) (siehe Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Vinyl-ACCA" auf eine Verbindung der Formel:
d.h. (1R,2S)-1-Amino-2-ethenylcyclopropylcarbonsäure.
Der Begriff "(C_1-8)-Alkyl", wie hier verwendet, allein oder in Kombination mit einem anderen Substituenten, bedeutet acyclische geradkettige oder verzweigte Alkyl-Substituenten, enthaltend 1 bis 8 Kohlenstoffatome, und umfasst beispielsweise Methyl, Ethyl, 2-Methylhexyl, 1,1-Dimethylhexyl (oder t-Butyl) und Octyl.
Der Begriff "(C_3-7)-Cycloalkyl", wie hier verwendet, entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Substituenten, bedeutet einen Cycloalkyl-Substituenten, enthaltend 3 bis 7 Kohlenstoffatome, und umfasst Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
Der Begriff "{(C_1-6)-Alkyl-(C_3-6)-cycloalkyl}", wie hier verwendet, bedeutet einen Cycloalkyl-Rest, enthaltend 3 bis 6 Kohlenstoffatome, die direkt mit einem Alkylen-Rest, enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome, verbunden sind; beispielsweise Cyclopropylmethyl, Cyclopentylethyl, Cyclohexylmethyl und Cyclohexylethyl. Im Falle, wo R^1A ein {(C_1-6)-Alkyl-(C_3-6)-cycloalkyl} darstellt, ist diese Gruppe an die SO₂-Gruppe über das (C_1-6)-Alkyl (d.h. den Alkylen-Teil) gebunden.
Der Begriff "C₆- oder C₁₀-Aryl", wie hier verwendet, entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Rest, bedeutet entweder eine aromatische monocyclische Gruppe, enthaltend 6 Kohlenstoffatome, oder eine aromatische bicyclische Gruppe, enthaltend 10 Kohlenstoffatome. Beispielsweise umfasst Aryl Phenyl, 1-Naphthyl oder 2-Naphthyl.
Der Begriff "O-(C_1-6)-Alkyl", wie hier verwendet, entweder allein oder in Kombination mit einem weiteren Rest, bedeutet den Rest -O-(C_1-6)-Alkyl, worin Alkyl wie oben definiert ist, enthaltend bis zu 6 Kohlenstoffatome, und umfasst Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy und 1,1-Dimethylethoxy. Der letztere Rest ist herkömmlicherweise als tert-Butoxy bekannt.
Der Begriff "Halo" bzw. „Halogen", wie hier verwendet, bedeutet einen Halogen-Substituenten, ausgewählt aus Brom, Chlor, Fluor oder Iod.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptables Salz" bedeutet ein Salz einer Verbindung der Formel (1), die im Rahmen einer stimmigen medizinischen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit dem Gewebe von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergischer Reaktion und dergleichen geeignet ist, mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis vereinbar ist, im Allgemeinen wasser- oder öllöslich oder dispergierbar ist, und für ihre beabsichtigte Verwendung wirksam ist.
Der Begriff umfasst pharmazeutisch akzeptable Säure-Additionssalze und pharmazeutisch akzeptable Basen-Additionssalze. Listen geeigneter Salze werden z.B. gefunden in S.M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, S. 1-19.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptables Säure-Additionssalz" bedeutet jene Salze, die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen behalten, und die nicht biologisch oder in anderer Weise unerwünscht sind, gebildet mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen, und organischen Säuren, wie Essigsäure, Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Adipinsäure, Alginsäure, Ascorbinsäure, Aspartinsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Buttersäure, Camphersäure, Camphersulfonsäure, Zimtsäure, Citronensäure, Digluconsäure, Ethansulfonsäure, Glutaminsäure, Glykolsäure, Glycerophosphorsäure, Hemisulfinsäure, Heptansäure, Hexansäure, Ameisensäure, Fumarsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure (Isethionsäure), Milchsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Mesitylensulfonsäure, Methansulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Nicotinsäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, Oxalsäure, Pamonsäure, Pectinsäure, Phenylessigsäure, 3-Phenylpropionsäure, Picrinsäure, Pivalinsäure, Propionsäure, Pyruvinsäure, Salicylsäure, Stearinsäure, Bernsteinsäure, Sulfanilsäure, Weinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Undecansäure und dergleichen.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptables Basen-Additionssalz" bedeutet jene Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Säuren behalten, und die nicht biologisch oder in anderer Weise unerwünscht sind, gebildet mit anorganischen Basen, wie Ammoniak oder Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat, von Ammonium oder einem Metallkation, wie Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan, Aluminium und dergleichen. Insbesondere bevorzugt sind die Ammonium-, Kalium-, Natrium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Salze, abgeleitet aus pharmazeutisch akzeptablen organischen nicht-toxischen Basen umfassen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, quaternäre Ammoniumverbindungen, substituierte Amine, einschließlich natürlich auftretenden substituierten Aminen, cyclische Amine und basische Ionen-Austauschharze, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Ethyl amin, Diethylamin, Triethylamin, Isopropylamin, Tripropylamin, Tributylamin, Ethanolamin, Diethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, 2-Diethylaminoethanol, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, Coffein, Hydrabamin, Cholin, Betain, Ethylendiamin, Glucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purine, Piperazin, Piperidin, N-Ethylpiperidin, Tetramethylammoniumverbindungen, Tetraethylammoniumverbindungen, Pyridin, N,N-Dimethylanilin, N-Methylpiperidin, N-Methylmorpholin, Dicyclohexylamin, Dibenzylamin, N,N-Dibenzylphenethylamin, 1-Ephenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Polyaminharze und dergleichen. Besonders bevorzugte organische nicht-toxische Basen sind Isopropylamin, Diethylamin, Ethanolamin, Trimethylamin, Dicyclohexylamin, Cholin und Coffein.
Der Begriff "antivirales Mittel", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das wirksam ist, die Bildung und/oder Replikation eines Virus in einem Säuger zu inhibieren. Dies umfasst Mittel, die mit entweder dem Wirt oder viralen Mechanismen, die zur Bildung und/oder Replikation eines Virus in einem Säuger notwendig sind, Wechselwirken. Antivirale Mittel umfassen beispielsweise Ribavirin, Amantadin, VX-497 (Merimepodib, Vertex Pharmaceuticals), VX-498 (Vertex Pharmaceuticals), Levovirin, Viramidin, Ceplene (Maxamine), XTL-001 und XTL-002 (XTL Biopharmaceuticals).
Der Begriff anderes anti-HCV-Mittel, wie hier verwendet, bedeutet jene Mittel, die zur Herabsenkung oder Verhinderung dem Fortschreiten von mit Hepatitis C verbundenen Symptomen der Erkrankung sind. Derartige Mittel können ausgewählt sein aus: antiviralen Mitteln, immunmodulatorischen Mitteln, Inhibitoren von HCV-NS3-Protease, Inhibitoren von HCV-Polymerase oder Inhibitoren eines anderen Ziels im HCV-Lebenszyklus.
Der Begriff "immunmodulatorisches Mittel", wie hier verwendet, bedeutet, diese Mittel (Verbindung oder biologisch), die wirksam sind, die Immunsystemreaktion eines Säugers zu verstärken oder zu potenzieren. Immunmodulatorische Mittel umfassen beispielsweise Klasse 1-Interferone (wie α-, β- und ω-Interferone, τ-Interferone, Konsensus-Interferone und Asialo-Interferone), Klasse II-Interferone (wie γ-Interferone) und pegylierte Interferone.
Der Begriff "Inhibitor von HCV-NS3-Protease", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (eine Verbindung oder biologisches Mittel), das wirksam ist, die Funktion von HCV-NS3-Protease in einem Säuger zu inhibieren. Inhibitoren von HCV-NS3-Protease umfassen beispielsweise jene Verbindungen, beschrieben in der WO 99/07733 , der WO 99/07734 , der WO 00/09558 , der WO 00/09543 , der WO 00/59929 oder der WO 02/060926 , der Boehringer Ingelheim klinische Kandidat, identifiziert als BILN 2061, und der Vertex/Eli Lilly-Vorentwicklungskandidat, identifiziert als VX-950 oder LY-570310. Insbesondere können die Verbindungen #2, 3, 5, 6, 8, 10, 11,_,18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 und 127, offenbart in der Tabelle auf den Seiten 224-226 in der WO 02/060926 , in Kombination mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Begriff "Inhibitor von HCV-Polymerase", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das zur Inhibierung der Funktion einer HCV-Polymerase in einem Säuger wirksam ist. Dies umfasst beispielsweise Inhibitoren von HCV-NS5B-Polymerase. Inhibitoren von HCV-Polymerase umfassen Nicht-Nucleoside, beispielsweise jene Verbindungen, beschrieben in:

– US-Anmeldung Nr. 10/198 680 , entsprechend PCT/CA02/01127 , beide hinterlegt am 18. Juli 2002 (Boehringer Ingelheim),
– US-Anmeldung Nr. 10/198 384 , entsprechend PCT/CA02/01128 , beide hinterlegt am 18. Juli 2002 (Boehringer Ingelheim),
– US-Anmeldung Nr. 10/198 259 , entsprechend PCT/CA02/01129 , beide hinterlegt am 18. Juli 2002 (Boehringer Ingelheim),
– WO 02/100846 A1 und WO 02/100851 A2 (beide Shire),
– WO 01/85172 A1 und WO 02/098424 A1 (beide GSK),
– WO 00/06529 und WO 02/06246 A1 (beide Merck),
– WO 01/47883 und WO 03/000254 (beide Japan Tobacco) und
– EP 1 256 628 A2 (Agouron).

Weiterhin umfassen andere Inhibitoren von HCV-Polymerase Nucleosid-Analoga, beispielsweise jene Verbindungen, beschrieben in:

– WO 01/90121 A2 (Idenix),
– WO 02/069903 A2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.) und
– WO 02/057287 A2 und WO 02/057425 A2 (beide Merck/Isis).

Spezifische Beispiele von Inhibitoren einer HCV-Polymerase umfassen JTK-002, JTK-003 und JTK-109 (Japan Tobacco).
Der Begriff "Inhibitor eines anderen Ziels im HCV-Lebenszyklus", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das zur Inhibierung der Bildung und/oder Replikation von HCV in einem Säuger, außer durch die Inhibierung der Funktion der HCV-NS3-Protease, wirksam ist. Dies umfasst Mittel, die entweder mit Wirts- oder HCV-viralen Mechanismen, die zur Bildung und/oder Replikation von HCV in einem Säuger notwendig sind, Wechselwirken. Inhibitoren eines anderen Ziels des HCV-Lebenszyklus umfassen beispielsweise Mittel, die ein Ziel, ausgewählt aus einer Helikase, einer HCV-NS2/3-Protease und einem Inhibitor der internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) inhibieren. Ein spezifisches Beispiel von Inhibitoren eines anderen Ziels im HCV-Lebenszyklus umfasst ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals).
Der Begriff "HIV-Inhibitor", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das zur Inhibierung der Bildung und/oder Replikation von HIV in einem Säuger wirksam ist. Dies umfasst Mittel, die entweder mit Wirts- oder viralen Mechanismen, die zur Bildung und/oder Replikation von HIV in einem Säuger notwendig sind, Wechselwirken. HIV-Inhibitoren umfassen beispielsweise nucleosidische Inhibitoren, nicht-nucleosidische Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Fusionsinhibitoren und Integrase-Inhibitoren.
Der Begriff "HAV-Inhibitor", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das zur Inhibierung der Bildung und/oder Replikation von HAV in einem Säuger wirksam ist. Dieses umfasst Mittel, die entweder mit Wirts- oder viralen Mechanismen, die zur Bildung und/oder Replikation von HAV in einem Säuger notwendig sind, Wechselwirken. HAV-Inhibitoren umfassen Hepatitis A-Vakzine, beispielsweise Havrix^® (GlaxoSmithKline), VAQTA^® (Merck) und Avaxim^® (Aventis Pasteur).
Der Begriff "HBV-Inhibitor", wie hier verwendet, bedeutet ein Mittel (Verbindung oder biologisch), das zur Inhibierung der Bildung und/oder Replikation von HBV in einem Säuger wirksam ist. Dieser umfasst Mittel, die entweder den Wirt oder virale Mechanismus, die zur Bildung und/oder Replikation von HBV in einem Säuger notwendig sind, stören. HBV-Inhibitoren umfassen beispielsweise Mittel, die virale HBV-DNA-Polymerase inhibieren, oder HBV-Vakzine. Spezifische Beispiele von HBV-Inhibitoren umfassen Lamivudin (Epivir-HBV^®), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil^®), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine^®), AM365 (Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-LdC (Valtorcitabine), ACH-126,443 (L-Fd4C) (Achillion), MCC478 (Eli Lilly), Racivir (RCV), Fluoro-L und D-Nucleoside, Robustaflavon, ICN 2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos), XTL-001 (XTL), Imino-Zucker (Nonyl-DNJ), (Synergy), HepBzyme; und immunmodulatorische Produkte, wie Interferon α 2b, HE2000 (Hollis-Eden), Theradigm (Epimmune), EHT899 (Enzo Biochem), Thymosin alpha-1 (Zadaxin^®), HBV-DNA-Vakzin (PowderJect), HBV-DNA-Vakzin (Jefferon Center), HBV-Antigen (OraGen), BayHep B^® (Bayer), Nabi-HB^® (Nabi) und Anti-Hepatitis B (Cangene); und HBV-Vakzin-Produkte, wie die folgenden: Engerix B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare, Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac.
Der Begriff "Klasse I-Interferon", wie hier verwendet, bedeutet ein Interferon, ausgewählt aus einer Gruppe von Interferonen, die sämtliche an den Rezeptor-Typ I binden. Dies umfasst sowohl natürlich als auch synthetisch hergestellte Klasse I-Interferone. Beispiele von Klasse I-Interferonen umfassen α-, β-, ω-Interferone, τ-Interferone, Consensus-Interferone, Asialo-Interferone.
Der Begriff "Klasse II-Interferon", wie hier verwendet, bedeutet ein Interferon, ausgewählt aus einer Gruppe von Interferonen, die sämtlich an den Rezeptor-Typ II binden. Beispiele von Klasse II-Interferonen umfassen γ-Inteferone.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können ein oder mehrere zusätzliche Wirkstoffe, ausgewählt beispielsweise aus antiviralen Mitteln, immunmodulatorischen Mitteln, anderen Inhibitoren von HCV-NS3-Protease, Inhibitoren von HCV-Polymerase, Inhibitoren eines anderen Ziels im HCV-Lebenszyklus, HIV-Inhibitoren, HAV-Inhibitoren und HBV-Inhibitoren, enthalten. Beispiele derartiger Mittel werden in der obigen Definitionssektion bereitgestellt.
Spezifische bevorzugte Beispiele einiger dieser Mittel sind nachfolgend aufgelistet:

• antivirale Mittel: Ribavirin und Amantadin;
• immunmodulatorische Mittel: Klasse I-Interferone, Klasse II-Interferone und pegylierte Interferone;
• Inhibitor eines anderen Ziels des HCV-Lebenszyklus, das ein Ziel inhibiert, ausgewählt aus: NS3-Helikase, HCV-NS2/3-Protease oder interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES);
• HIV-Inhibitoren: nucleosidische Inhibitoren, nicht-nucleosidische Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Fusionsinhibitoren und Integrase-Inhibitoren; oder
• HBV-Inhibitoren: Mittel, die virale HBV-DNA-Polymerase inhibieren oder ein HBV-Vakzin darstellen.

Wie oben diskutiert, wird eine Kombinationstherapie beabsichtigt, worin eine Verbindung der Formel (1) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon mit mindestens einem zusätzlichen Mittel zusammen verabreicht wird, ausgewählt aus: einem antiviralen Mittel, einem immunmodulatorischen Mittel, einem weiteren Inhibitor von HCV-NS3-Protease, einem Inhibitor von HCV-Polymerase, einem Inhibitor von einem anderen Ziel im HCV-Lebenszyklus, einem HIV-Inhibitor, einem HAV-Inhibitor und einem HBV-Inhibitor. Beispiele derartiger Mittel werden im obigen Definitionenabschnitt bereitgestellt. Diese zusätzlichen Mittel können mit den Verbindungen dieser Erfindung kombiniert werden, um eine einzelne pharmazeutische Dosierungsform zu schaffen. Alternativ können diese zusätzlichen Mittel separat an einen Patienten verabreicht werden, als Teil einer multiplen Dosierungsform, beispielsweise unter Verwendung eines Kits. Derartige zusätzliche Mittel können dem Patienten vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung einer Verbindung der Formel (1) oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz hiervon verabreicht werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Behandlung" die Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, um Symptome der Hepatitis C-Erkrankung abzuschwächen oder auszuschalten und/oder die virale Belastung eines Patienten zu reduzieren.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Vorbeugung" die Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung nach Ansteckung des Individuums mit einem Virus, aber vor dem Erscheinen von Symptomen der Erkrankung und/oder vor dem Nachweis des Virus im Blut.
Bevorzugte Ausführungsformen Bevorzugt Verbindungen der Formel 1, wie oben definiert, worin R¹ Hydroxy, NHSO₂Me, NHSO₂-Cyclopropyl oder NHSO₂Ph ist. Bevorzugter stellt R¹ NHSO₂-Cyclopropyl oder NHSO₂Ph dar. Alternativ ist R¹ am meisten bevorzugt Hydroxy.
Bevorzugt Verbindungen der Formel 1, wie oben definiert, worin R² Cyclopentyl oder Cyclohexyl darstellt. Am meisten bevorzugt ist R² Cyclopentyl.
Bevorzugt stellt R³ t-Butyl oder Cyclohexyl dar. Am meisten bevorzugt ist R³ t-Butyl.
Bevorzugt Verbindungen der Formel 1, wie oben definiert, worin R⁴ Cyclobutyl oder Cyclopentyl darstellt. Am meisten bevorzugt ist R⁴ Cyclopentyl.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, wie oben definiert, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² und R⁴ jeweils Cyclopentyl darstellen und R³ t-Butyl darstellt.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, wie oben definiert, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² Cyclobutyl darstellt, R³ t-Butyl darstellt und R⁴ Cyclopentyl darstellt.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² Cyclohexyl darstellt, R³ t-Butyl darstellt und R⁴ Cyclopentyl darstellt.
Bevorzugter ist R¹ NHSO₂Ph, R² und R⁴ sind jeweils Cyclopentyl und R³ t-Butyl. Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² Cyclopentyl darstellt, R³ t-Butyl darstellt und R⁴ Cyclobutyl darstellt.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² Cyclopentyl darstellt, R³ t-Butyl darstellt und R⁴ Cyclohexyl darstellt.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² und R4 jeweils Cyclopentyl sind und R³ Cyclohexyl darstellt.
Bevorzugter eine Verbindung der Formel 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R², R³ und R⁴ jeweils Cyclopentyl darstellen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung zusätzlich ein weiteres anti-HCV-Mittel umfassen. Beispiele von anti-HCV-Mitteln umfassen α-(alpha), β-(beta), δ-(delta), γ-(gamma) oder ω-(omega)-Interferon, Ribavirin und Amantadin.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung zusätzlich einen weiteren Inhibitor von HCV-NS3-Protease umfassen.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung zusätzlich einen Inhibitor von HCV-Polymerase umfassen.
Gemäß noch einer anderen alternativen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung zusätzlich einen Inhibitor von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Helikase, NS2/3-Protease oder interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES).
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung kann oral, parenteral oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Orale Verabreichung oder Verabreichung durch Injektion ist bevorzugt. Die pharmazeutische Zusammmensetzung dieser Erfindung kann irgendeinen herkömmlichen nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff oder Vehikel enthalten. In einigen Fällen kann der pH-Wert der Formulierung mit pharmazeutisch akzeptablen Säuren, Basen oder Puffer eingestellt werden, um die Stabilität der formulierten Verbindung und deren freigesetzter Form zu erhöhen. Der Begriff parenteral, wie hier verwendet, umfasst subkutane, intrakutane, intravenöse, intramuskuläre, intra-artikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale und intraläsionale Injektions- oder Infusionstechniken.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form einer sterilen injizierbaren Präparation vorliegen, beispielsweise als eine sterile injizierbare wässerige oder ölhaltige Suspension. Diese Suspension kann gemäß den im Stand der Technik bekannten Techniken unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel (wie beispielsweise Tween 80) sowie Suspendiermittel formuliert werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung kann in irgendeiner oralen akzeptablen Dosierungsform, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kapseln, Tabletten und wässerige Suspensionen und Lösungen, oral verabreicht werden. Im Fall von Tabletten für die orale Verwendung umfassen Träger, die üblicherweise verwendet werden, Lactose und Maisstärke. Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, werden ebenfalls typischerweise zugegeben. Für die orale Verabreichung in Kapselform umfassen übliche Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wässerige Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können bestimmte Süßungs- und/oder Aroma- und/oder farbgebende Mittel zugegeben werden.
Andere geeignete Vehikel oder Träger für die oben angegebenen Formulierungen und Zusammensetzungen können in pharmazeutischen Standard-Texten gefunden werden, z.B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Penn. (1995).
Dosierungslevel zwischen etwa 0,01 und etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, bevorzugt zwischen etwa 0,1 und etwa 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag, der Protease-Inhibitorverbindung, die hier beschrieben werden, sind in einer Monotherapie für die Vorbeugung und Behandlung von HCV-vermittelten Erkrankungen verwendbar. Typischerweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung von etwa 1 bis etwa 5 Mal pro Tag oder alternativ mit einer kontinuierlichen Infusion verabreicht. Eine derartige Verabreichung kann als eine chronische oder akute Therapie eingesetzt werden. Die Menge an Wirkstoff, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, variiert abhängig vom behandelten Wirt und dem speziellen Verabreichungsmodus. Eine typische Präparation enthält etwa 5 bis etwa 95% aktive Verbindung (Gew./Gew.). Bevorzugt enthalten derartige Präparationen etwa 20 bis etwa 80% aktive Verbindung.
Wie der Fachmann im Stand der Technik schätzen wird, können niedrigere oder höhere Dosierungen als die oben angegebenen erforderlich sein. Spezifische Dosierungs- und Behandlungskuren für jeden speziellen Patienten hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, der Kost, Verabreichungszeit, Ausscheidungsrate, Arzneistoffkombination, dem Schweregrad und Verlauf der Infektion, der Patientendisposition gegenüber der Infektion und der Beurteilung des behandelnden Arztes. Im Allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosierungen, im Wesentlichen weniger als der optimalen Dosierung, des Peptids begonnen. Hiernach wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erreicht wird. Im Allgemeinen wird die Verbindung am meisten erwünscht bei einem Konzentrationsniveau verabreicht, das im Allgemeinen antiviral wirksame Ergebnisse leistet, ohne irgendwelche schädlichen oder nachteiligen Nebenwirkungen hervorzurufen.
Wenn die Zusammensetzung dieser Erfindung eine Kombination einer Verbindung von Formel 1 und ein oder mehrere zusätzliche therapeutische oder prophylaktische Mittel aufweist, sollen sowohl die Verbindung als auch das zusätzliche Mittel bei Dosierungsniveaus zwischen etwa 10 und 100% und bevorzugter zwischen etwa 10 und 80% der Dosierung, die normalerweise in einer Monotherapiekur verabreicht wird, vorhanden sein.
Wenn diese Verbindungen oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger formuliert werden, kann die resultierende Zusammensetzung in vivo an Säuger, wie Menschen, verabreicht werden, um HCV-NS3-Protease zu inhibieren, oder die HCV-Virusinfektion zu behandeln oder dieser vorzubeugen. Eine derartige Behandlung kann ebenfalls unter Verwendung einer Verbindung dieser Erfindung in Kombination mit Mitteln erreicht werden, die umfassen, aber nicht be schränkt sind auf: α-, β-, δ-, ω-, τ- oder γ-Interferon, Ribavirin, Amantadin; andere Inhibitoren von HCV-NS-3-Protease; Inhibitoren von HCV-Polymerase, Inhibitoren von anderen Zielen im HCV-Lebenszyklus, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf Helikase, NS2/3-Protease oder interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES); oder Kombinationen hiervon. Die zusätzlichen Mittel können mit Verbindungen dieser Erfindung kombiniert werden, um eine Einzeldosierungsform zu schaffen. Alternativ können diese zusätzlichen Mittel separat an einen Säuger als Teil einer multiplen Dosierungsform verabreicht werden.
Demgemäß erleichtert ein weiterer Aspekt dieser Erfindung die Inhibierung von HCV-NS3-Protease-Aktivität in einem Säuger durch Verabreichen einer Verbindung der Formel 1.
In einem bevorzugten Aspekt wird die NS3-Protease-Aktivität der Hepatitis C-Virusinfektion in einem Säuger herabgesetzt.
Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine Verbindung dieser Erfindung als aktive Komponente umfasst, kann ein derartiges Verfahren zusätzlich den Schritt des Verabreichens eines Mittels an den Säuger, ausgewählt aus einem immunmodulatorischen Mittel, einem antiviralen Mittel, einem HCV-NS3-Protease-Inhibitor, einem Inhibitor von HCV-Polymerase oder einem Inhibitor anderer Ziele im HCV-Lebenszyklus, wie Helikase, NS2/3-Protease oder IRES umfassen. Ein derartiges zusätzliches Mittel kann dem Säuger vor, während oder nach der Verabreichung der Zusammensetzung dieser Erfindung verabreicht werden.
Eine Verbindung der Formel 1, die hier dargestellt wird, kann ebenfalls als Laborreagens verwendet werden. Eine Verbindung dieser Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um virale Kontamination von Materialien zu behandeln oder zu verhindern, und hierdurch das Risiko von viraler Infektion von Labor- oder medizinischem Personal oder Patienten, die mit derartigen Materialien (z.B. Blut, Gewebe, Operationsinstrumente und -kleidung, Laborinstrumente und -kleidung und Blutsammelvorrichtungen und Materialien) in Kontakt kommen, zu verringern.
Eine Verbindung der Formel 1, die hier dargestellt wird, kann ebenfalls als Forschungsreagens verwendet werden. Eine Verbindung der Formel 1 kann ebenfalls verwendet werden als positive Kontrolle, um zellbasierte Ersatztests oder in vitro oder in vivo virale Replikationstests zu validieren.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht, die als nicht-beschränkend im Hinblick auf die beigefügten Ansprüche verstanden werden.
Methodologie
Im Allgemeinen werden die Verbindungen der Formel 1 und Zwischenprodukte hiervon durch bekannte Verfahren unter Verwendung von Reaktionsbedingungen, die für die Reaktanten als geeignet bekannt sind, hergestellt. Mehrere derartige Verfahren sind offenbart in der WO 00/09543 , der WO 00/09558 und im US-Patent Nr. 6 323 180 .
Verbindungen der Formel I, worin R¹ NHSO₂R^1A darstellt, wie hier definiert, werden durch Koppeln der entsprechenden Säure von Formel I (d.h. R¹ ist Hydroxy) mit einem geeigneten Sulfonamid der Formel R^1ASO₂NH₂ in Gegenwart eines Kopplungsmittels unter Standardbedingungen hergestellt. Obwohl mehrere herkömmlich verwendete Kopplungsmittel eingesetzt werden können, wurden TBTU und HATU als praktisch gefunden. Die Sulfonamide sind kommerziell erhältlich oder können durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die nachfolgenden Schemata veranschaulichen zwei herkömmliche Verfahren unter Verwendung von bekannten Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel 1, worin R¹ OH darstellt.
Schema 1:
Schema 2:
BEISPIELE
Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Lösungsprozentwerte drücken ein Gewichts-zu-Volumenverhältnis aus, und Lösungsverhältnisse drücken ein Volumen-zu-Volumen-Verhältnis aus, sofern nicht anders angegeben. Kernresonanzspektren (NMR) wurden mit einem Bruker 400 MHz-Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen (6) sind in Parts per million angegeben. Flash-Chromatographie wurde auf Silikagel (SiO₂) gemäß der Still's Flash-Chromatographie-Technik (W.C. Still et al., J. Org. Chem. (1978), 43, 2923) durchgeführt.
In den Beispielen verwendete Abkürzungen umfassen:
DBU: 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en; DCM: Dichlormethan; DIAD: Diisopropylazodicarboxylat; DIEA: Diisopropylethylamin; DIPEA: Diisopropylethylamin; DMF: N,N-Dimethylformamid; DMAP: 4-(Dimethylamino)pyridin; EtOAc: Ethylacetat; HATU: [O-7-Azabenzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat]; HPLC: Hochleistungsflüssigchromatographie; MS: Massenspektrometrie (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionization-Time of Flight, FAB: Fast Atom Bombardment); Me: Methyl; MeOH: Methanol; Ph: Phenyl; R.T.: Raumtemperatur (18 bis 22°C); tert-Butyl oder t-Butyl: 1,1-Dimethylethyl; Tbg: tert-Butylglycin: tert-Leucin; TBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat; TFA: Trifluoressigsäure und THF: Tetrahydrofuran.
Synthese von Verbindungen der Formel (I):
Das Dipeptid-Zwischenprodukt 15 (Schema 2) und 2-Carbomethoxy-4-hydroxy-7-methoxychinolin 9 (Schema 1) wurden gemäß den in der WO 00/09543 beschriebenen Verfahren synthetisiert.
Synthese von Dipeptid 1
Eine Mischung von Boc-hydroxyprolin (50,0 g, 216 mMol), Vinyl-ACCA-methylester (42,25 g, 238 mMol, 1,1 Äq.), TBTU (76,36 g, 238 mMol, 1,1 Äq.) und DIPEA (113 ml, 649 mMol, 3 Äq.) in DMF (800 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Nach 3,5 Stunden wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rest mit EtOAc extrahiert. Der Extrakt wurde mit Salzsäure (10%), gesättigtem Natriumbicarbonat und Salzlauge gewaschen. Die organische Phase wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und abgedampft, um ein Öl zu ergeben. Nach Trocknen über Nacht unter Hochvakuum wurde das Dipeptid 1 als gelber Schaum (72,0 g, 94%, Reinheit > 95% durch HPLC) erhalten.
Herstellung von Dipeptid 3
Dipeptid 1 (72,0 g, 203 mMol), Triphenylphosphin (63,94 g, 243,8 mMol, 1,2 Äq.) und 4-Nitrobenzoesäure (41,08 g, 245,8 mMol, 1,2 Äq.) wurden in trockenem THF (1,4 1) gelöst. Die gerührte Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 0°C gekühlt. Diethylazodicarboxylat (38,4 ml, 244 mMol, 1,2 Äq.) wurde dann tropfenweise über 45 Minuten zugegeben, und man ließ die Reaktion auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 4 Stunden wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rest wurde in vier Portionen aufgeteilt. Jede von diesen wurde durch Chromatographie über feines Silikagel (10-40 μm mesh, Säulendurchmesser 12 cm, Säulenlänge 16 cm) unter Verwendung eines Gradienten von 2:1 Hexan/EtOAc zu 1:1 Hexan/EtOAc zu reinem EtOAc gereinigt. In dieser Art und Weise wurde Boc-dipeptidester 2 als ein amorpher weißer Feststoff nach Verdampfen der Lösungsmittel und Trocknen des Rests unter Hochvakuum für 1 Stunde bei 70°C (108,1 g, quantitativ-105%) erhalten. Eine Lösung von 4N Salzsäure in Dioxan wurde zum Bocdipeptidester 2 (108 g, 243 mMol) zugegeben, resultierend in einer farblosen Lösung. Die Lösung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rest unter Hochvakuum für 3 Stunden belassen, um das Hydrochloridsalz von Verbindung 3 als amorphen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde als solcher verwendet.
Synthese von Carbmaten 4
Herstellung von Carbamat 4a:
Bei 0°C wurde zu einer Lösung von tert-Butylglycinmethylester (590 mg, 3,25 mMol) in THF (8 ml) Vinylchlorformiat (0,55 ml, 6,47 mMol) und Triethylamin (1,15 ml, 8,25 mMol) zugegeben. Man ließ die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Die Lösung wurde für 16 Stunden gerührt. Die Lösung wurde konzentriert und der Rest in EtOAc gelöst. Die EtOAc-Lösung wurde mit einer 10%igen wässerigen Lösung von Citronensäure (2 ×), einer gesättigten wässerigen Lösung von NaHCO₃ (2 ×) und Salzlauge gewaschen, getrocknet und konzentriert, um das entsprechende Vinylcarbamat (608 mg) als farbloses Öl zu ergeben. Das Öl wurde in DCM (4 ml) gelöst, bei 0°C gekühlt und Diiodmethan (0,15 ml, 1,86 mMol) und Diethylzink (96 μl, 0,93 mMol) wurden zugegeben. Zunächst erschien ein weißer Feststoff, löste sich aber mit der Zeit auf (~ 1h). Die Suspension/Lösung wurde für 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine gesättigte Lösung von Ammoniumchlorid wurde zugegeben und die Lösung mit EtOAc (2 ×) extrahiert. Das organische Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄) und konzentriert. Der Rest wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt. Elution mit Hexan:EtOAc 95:5 ergab den entsprechenden Methylester als farbloses Öl (96 mg, 90% Ausbeute).
Eine Lösung des Methylesters (93 mg, 0,41 mMol) in THF (5 ml), MeOH (1 ml) und eine wässerige Lösung von LiOH (45 mg, 1,81 mMol) in Wasser (2 ml) wurden für 4 Stunden gerührt. Die Lösung wird mit Wasser verdünnt und mit EtOAc (2 ×) extrahiert. Die wässerige Lösung wurde durch die Zugabe von 1N HCl angesäuert und die saure Lösung mit EtOAc (2 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das gewünschte Carbamat 4a als weißen Feststoff (53 mg, 60% Ausbeute) zu erhalten.
Herstellung von Carbamat 4b:
THF (350 ml) wurde in einen Kolben, enthaltend Carbonsäurecyclopentylester-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl-ester (9,00 g, 39,6 mMol) sowie tert-Butylglycin (6,24 g, 47,5 mMol) zugegeben, resultierend in einer Suspension. Destilliertes Wasser (100 ml) wurde unter heftigem Rühren zugegeben. Eine kleine Menge an Feststoff verblieb ungelöst. Triethylamin (16,6 ml, 119 mMol) wurde dann zugegeben, resultierend in einer homogenen Lösung, die bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach 2,5 Stunden wurde das THF abgedampft und der wässerige Rest mit Wasser (100 ml) verdünnt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1N NaOH (25 ml, End-pH-Wert > 10) basisch gemacht. Die Lösung wurde mit EtOAc (2 × 200 ml) gewaschen, und die wässerige Phase mit 1 N HCl (ca. 70 ml, End-pH-Wert < 2) angesäuert. Die trübe Lösung wurde mit EtOAc (200 + 150 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um das Carbamat 4b als weißen Feststoff (8,68 g) zu ergeben.
Herstellung anderer Carbamate:
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung geeigneter Kombinationen von tert-Butylglycin, Cyclopentylglycin oder Cyclohexylglycin und Carbonsäurecyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexylester-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester, wurden Carbamate der nachfolgenden Formeln hergestellt:
Herstellung von Harnstoffen 5
Eine Lösung von tert-Butylglycinbenzylesterhydrochloridsalz (2,55 g, 9,89 mMol) in THF (20 ml) und Pyridin (2,0 ml, 24,73 mMol) wurde auf 0°C gekühlt. Phenylchlorformiat (1,30 ml, 10,19 mMol) wurde tropfenweise zur gekühlten Lösung zugegeben. Die resultierende Suspension wurde bei 0°C für 5 Minuten gerührt, dann für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt, mit 10%iger Zitronensäure (2 ×), Wasser (2 ×), gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und verdampft, um die rohe Verbindung als nahezu farbloses Öl (3,73 g, > 100%, angenommen 9,89 mMol) zu erhalten. Das rohe Produkt (1,01 g, 2,97 mMol) wurde in DMSO (6,5 ml) gelöst und Cyclopentylamin wurde tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt. Die organische Phase wurde mit 10% Citronensäure (2 ×), Wasser (2 ×), gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und verdampft, und das rohe Cyclopentylharnstoff-Tbg-OBn-Produkt als ein nahezu farbloses Öl zu ergeben. Das rohe Material wurde durch Flash-Säulenchromatographie mit Siliciumoxid unter Verwendung von Hexan:EtOAc 9:1 gereinigt, um die weniger polaren Verunreinigungen zu entfernen, und 7:3, um das gereinigte Produkt als dickes farbloses Öl (936 mg, 95%) zu eluieren. Das Esterbenzylester-Produkt (936 mg, 2,82 mMol) wurde unter einem Wasserstoff-gefüllten Ballon bei Raumtemperatur in absoluter Ethanol-Lösung (15 ml) durch Rühren der Lösung mit 10% Pd/C (93,6 mg) für 5,5 Stunden entschützt. Die Reaktionsmischung wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert und zur Trockne abgedampft, um Harnstoff 5 als weißen Feststoff (668,8 mg, 98%) bereitzustellen.
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): δ 12,39 (s, 1H), 6,09 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 5,93 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,90 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,87-3,77 (m, 1H), 1,84-1,72 (m, 2H), 1,63-1,42 (m, 4H), 1,30-1,19 (m, 2H), 0,89 (s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 241,0 (M-H)^– 243,0 (M+H)⁺, Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
Synthese von Tripeptid 6
Carbamat 4b (6,15 g, 22,5 mMol) und TBTU (7,72 g, 24,7 mMol) wurden in DCM suspendiert, und die Suspension schnell gerührt. DIPEA (3,92 ml, 22,5 mMol) wurde bei Raumtemperatur zugegeben und nach 10 Minuten war die Reaktion fast homogen. Eine Lösung von Dipeptid 3 (10,39 g, 23,6 mMol) in wasserfreiem DCM (100 ml), enthaltend DIPEA (4,11 ml, 23,62 mMol) wurde dann in die Reaktion gegossen. Die resultierende gelbe Lösung ließ man für 14 Stunden rühren. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft, um einen gelben Sirup zu ergeben, der mit EtOAc (300 + 150 ml) gewaschen wurde und mit 0,05 N HCl (2 × 200 ml), gesättigtem Na₂CO₃ (300 ml) und Salzlauge (150 ml) gewaschen wurde. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet und abgedampft, um das Tripeptid 6 als blassgelben Schaum (15,68 g, quantitativ) zu ergeben.
Synthese von Tripeptid 7:
Das Tripeptid 6 (15,68 g) wurde in THF (200 ml) gelöst, und Wasser (30 ml) wurde zugegeben. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und eine Lösung von Lithiumhydroxidmonohydrat (1,18 g, 28,12 mMol) wurde über 3 Minuten unter heftigem Rühren zugegeben. Nach 3 Stunden bei 0°C wurde die überschüssige Base mit 1N HCl (End-pH-Wert ca. 6) neutralisiert, und das THF abgedampft, resultierend in einer wässerigen Suspension (gelber Gummi). Die Mischung wurde mit EtOAc (2 × 200 ml) extrahiert und mit gesättigtem NaHCO₃ (2 × 300 ml) gewaschen. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet und abgedampft, um einen blassgelben Schaum zu ergeben. Flash-Chromatographie des Schaums über Silikagel unter Verwendung von EtOAc als Eluierungsmittel ergab 7 als weißen amorphen Feststoff (9,77 g, 91%).
Herstellung von Thioharnstoffen 8
Synthese von Thioharnstoff 8a:
Zu einer Lösung von tert-Butylisothiocyanat (5,0 ml, 39,4 mMol) in DCM (200 ml) wurde Cyclopentylamin (4,67 ml, 47,3 mMol) zugegeben, gefolgt von DIEA, und die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit EtOAc verdünnt, mit einer 10%igen wässerigen Lösung von Citronensäure (2 ×), gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), H₂O (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und abgedampft, um N-tert-Butyl-N'-cyclopentylthioharnstoff als einen weißen Feststoff (3,70 g, 47% Ausbeute) zu ergeben. Der N-tert-Butyl-N'-cyclopentylthioharnstoff (3,70 g) wurde in konzentrierter HCl (46 ml) gelöst. Die dunkelgelbe Lösung wurde unter leichtem Rückfluss erhitzt. Nach 40 Minuten ließ man die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abkühlen und hiernach kühlte man auf Eis und machte mit Feststoff und einer gesättigten wässerigen Lösung von NaHCO₃ auf pH 9,5 basisch. Das Produkt wurde in EtOAc (3 ×) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit H₂O (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert, um einen beigen Feststoff (2,46 roh) zu ergeben. Verreiben des rohen Materials in Hexan/EtOAc 95/5 ergab nach Filtration den N-Cyclopentylthioharnstoff 8a als weißen Feststoff (2,38, 90% Ausbeute).
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): δ 7,58 (bs, 1H), 7,19 (bs, 1H), 6,76 (bs, 1H), 4,34 (bs, 1H), 1,92-1,79 (m, 2H), 1,66-1,55 (m, 2H), 1,55-1,30 (m, 4H). MS; es⁺ 144,9 (M+H)⁺, es^–: 142,8 (M-H)^–.
Herstellung von Thioharnstoff 8b
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung kommerziell erhältlichen Cyclobutylamins anstelle des Cyclopentylamins ergab sich Thioharnstoff 8b:
Herstellung von Thioharnstoff 8c
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung kommerziell erhältlichen Cyclohexylamins anstelle des Cyclopentylamins ergab sich Thioharnstoff 8c.
Herstellung von Thioharnstoff 8d
Zu einer Lösung von KSCN (4,60 g, 47,33 mMol) in Aceton (35 ml) wurde bei 0°C Benzoylchlorid (5,0 ml, 43,03 mMol) tropfenweise zugegeben. Die milchige Lösung wurde in einem Eisbad für 1,5 Stunden gerührt, dann wurde Cyclopropylamin (3,2 ml, 46,0 mMol) tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 1,5 Stunden gerührt, dann wurde mehr Cyclopropylamin (0,50 ml, 7,22 mMol) zugegeben und die Reaktionsmischung für zusätzliche 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Eis/H₂O (300 ml) gegossen, für 5 Minuten gerührt und dann der hellgelbe Feststoff filtriert, mehrere Male mit H₂O gewaschen und getrocknet, um N-Benzoyl-N'-cyclopropylthioharnstoff (6,62 g) bereitzustellen. Dieser Thioharnstoff wurde in einer Lösung von 2N NaOH (50 ml) suspendiert und für 15 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit festem NaCl gesättigt und mit EtOAc (3 ×) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit H₂O (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das rohe Produkt als cremefarbenen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde in Hexan/EtOAc 5/5 verrieben, um den N-Cyclopropylthioharnstoff 8d als weißen kristallinen Feststoff (2,5 g, 50% Ausbeute) bereitzustellen.
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): δ 7,92 (bs, 1H), 7,61 (bs, 1H), 7,13 (bs, 1H), 2,39 (bs, 1N), 0,67-0,63 (m, 2H), 0,51-0,44 (m, 2H).
MS; es⁺ 116, 9 (M+H)⁺, es^–: 114, 8 (M-H)^–.
BEISPIEL 1
Herstellung von Verbindung 100 Schritt 1: Synthese von Tripeptid 10:
Zu Tripeptid 1 (1,0 g, 2,09 mMol), gelöst in THF (35 ml), wurden Hydroxychinolin 9 (729 mg, 3,13 mMol) und Triphenylphosphin (1,1 g, 4,2 mMol) zugegeben. Die gelbe Suspension wurde in einem Eisbad gekühlt und DIAD (821 μl, 4,2 mMol) wurde tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Eisbad-Temperatur gerührt und für 16 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wurde zur Trockene abgedampft und der Rest in EtOAc gelöst, mit einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um ein gelbes Öl zu erhalten, das beim Stehen ausfiel. Der rohe Feststoff wurde in DCM suspendiert und das unlösliche Material abfiltriert. Die Lösung wurde konzentriert und der Rest durch Flash-Chromatographie in Hexan:EtOAc 5:5 gereinigt, um sämtliche weniger polaren Verunreinigungen zu entfernen, und in CHCl₃:EtOAc 80:20, bis sämtliches Ph₃P = O eluiert war. Die gewünschte Verbindung wurde mit CHCl₃:EtOAc 65:35 als weißer Feststoff (1 g, 70% Ausbeute) eluiert.
M.S. (Elektrospray): 693,3 (M-H)^– 695,4 (M+H)⁺ 717,4 (M+Na)⁺.
Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
Schritt 2: Selektive Monohydrolyse von Ester 10:
Tripeptid 10 (1 g, 1,44 mMol) wurde in THF (10 ml) gelöst und MeOH (5 ml), Wasser (5 ml) und eine 1N wässerige NaOH-Lösung (1,5 ml) wurden zugegeben und die Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde zur Trockne abgedampft und dann mit MeOH:Toluol (1:1, 4 ×), Toluol (2 ×) und Diethylether (2 ×) zusammen abgedampft, um das Produkt (wasserfrei) als weißen flockigen Feststoff (1,04 g, 100% Ausbeute) zu erhalten.
M.S. (Elektrospray): 679,3 (M-H)^– 681,3 (M+H)⁺ 703,3 (M+Na)⁺.
Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 95%.
Schritt 3: Synthese von Diazoketon 12:
Natriumsalz 11 (angenommene 1,44 mMol) wurde in THF (16 ml) gelöst, Triethylamin (301 μl, 2,16 mMol) wurde zugegeben und die Lösung auf 0°C abgekühlt. Isobutylchlorformiat (280 μl, 2,16 mMol) wurde tropfenweise zugegeben und die weiße Suspension für 75 Minuten bei 0°C gerührt, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von Diazomethan (0,67 M in Diethylether, 13 ml, 8,64 mMol). Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 1 Stunde und bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerührt und abgedampft, um eine dicke Suspension bereitzustellen. Diese Suspension wurde in EtOAc und Wasser gelöst. Die organische Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das Diazoketon-Produkt als elfenbeinfarbenen Feststoff (rohes Material wird für den nächsten Schritt verwendet; angenommene 1,44 mMol) zu ergeben.
M.S. (Elektrospray): 703,3 (M-H)^– 705,3 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 91%.
Schritt 4: Synthese von Bromketon 13:
Bei 0°C wurde zu einer Lösung von Diazoketon 12 (1,44 mMol) in THF (24 ml) tropfenweise eine HBr-Lösung (1,0 ml) zugegeben und die Mischung für 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc verdünnt, mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das gewünschte Bromketon als elfenbeinfarbenen beigen Feststoff (1,1 g, angenommene 1,44 mMol) zu ergeben.
M.S. (Elektrospray): 757,3 (M) 759,3 (M+2)
Schritt 5: Synthese von Thiazolyltripeptid 14:
α-Bromketon 13 (0,40 mMol) und N-Cyclopentylthioharnstoff (68,5 mg, 0,48 mMol) wurden in Isopropanol (15 ml) gelöst, und die gelbe Lösung für 75 Minuten bei 70°C erhitzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Trockne abgedampft. Der Rest wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Lauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert, um das Produkt als orangebraunen Schaum zu ergeben. Flash-Säulenchromatographie in Hexan:EtOAc 7:3 entfernte weniger polare Verunreinigungen und 6:4 ergab die erwünschte Verbindung als hellgelben Schaum (218 mg; 69%).
M.S. (Elektrospray): 801,4 (M-H)^– 803,4 (M+H)⁺ 825 (M+Na)⁺.
Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
Schritt 6: Hydrolyse von Ester 14:
Eine Lösung von Methylester 14 (145 mg, 0,181 mMol) in THF (3 ml), MeOH (1,5 ml) und eine wässerige Lösung von LiOH (75,8 mg, 1,81 mMol) in Wasser (1,5 ml) wurden für 18 Stunden gerührt. Die organische Lösung wurde konzentriert, um eine cremefarbene Suspension bereitzustellen, die mit EtOAc und Salzlauge verdünnt wurde, um eine Gesamtlösung zu erhalten. Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von 1N HCl auf 6 eingestellt und die organische Schicht wurde weiter mit EtOAc (2 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser (2 ×), Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um die gewünschte Verbindung als gelben Feststoff (138,2 mg, 97% Ausbeute) zu ergeben.
Umwandlung zum Na-Salz:
Verbindung 100 (138,2 mg, 0,175 mMol) wurde in MeOH (30 ml) gelöst und 1 Äquivalent 0,01N NaOH (17,5 ml) wurde zugegeben. Die klare gelbe Lösung wurde konzentriert, um MeOH zu entfernen, und mit Wasser verdünnt, ausgefroren und lyophilisiert, um das Produkt (Na-Salz) als gelben amorphen Feststoff (139 mg, theoretische Ausbeute: 142 mg, MW-Na-Salz: 810,95) zu erhalten.
M.S. (Elektrospray): 787,2 (M-H)^– 789,3 (M+H)⁺ 811,3 (M+Na)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 98%.
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 5:1 Mischung von Rotationsisomeren; δ 8,14 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,49-7,36 (m, 2H), 7,27 (bs, 1H), 7,06-6,96 (m, 2H), 6,10-5,90 (m, 1H), 5,33 (s, 1H), 5,01 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 4,84 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 4,79-4,65 (m, 1H), 4,47-4,40 (m, 1H), 4,30 (d, J = 11,5 Hz, 1H),), 4,15 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,00-3,85 (m, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,37-2,26 (m, 1H), 2,15-1,91 (m, 2H), 1,80-1,23 (m, 18H), 0,96 & 0,86 (2 × s, 9H).
Beispiel 2
Herstellung von Verbindung 101
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von N-Cyclobutylthioharnstoff 8b anstelle der Verwendung von N-Cyclopentylthioharnstoff 8a in Schritt 5 resultierte Verbindung 101 als das TFA-Salz:
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 90:10 Mischung von Rotationsisomeren, Hauptisomerenbeschreibung; δ 8,59 (s, 1H), 8,45-8,39 (m, 1H), 8,25 (bs, 1H), 8,20 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,84 (bs, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,32-7,26 (m, 1H), 7,01 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,78-5,66 (m, 2H), 5,20 (dd, J = 17,0, 1,6 Hz, 1H), 5,09-5,04 (m, 1H), 4,53-4,36 (m, 4H), 4,05-3,92 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 2,63-2,55 (m, 1H), 2,44-2,29 (m, 3H), 2,07-1,95 (m, 3H), 1,79-1,23 (m, 12H), 0,96 (s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 773,4 (M-H)^– 775,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 98%.
Beispiel 3
Herstellung von Verbindung 102
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von N-Cyclohexylthioharnstoff 8c anstelle der Verwendung von N-Cyclopentylthioharnstoff 8a in Schritt 5 resultierte Verbindung 102 als das TFA-Salz:
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 90:10 Mischung von Rotationsisomeren, Hauptisomerenbeschreibung; δ 8,61 (s, 1H), 8,26-8,17 (m, 2H), 8,13-8,04 (m, 1H), 7,81 (bs, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,32-7,24 (m, 1H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,78-5,65 (m, 2H), 5,23-5,15 (m, 1H), 5,09-5,03 (m, 1H), 4,51-4,43 (m, 3H), 4,05-3,77 (m, 3H), 3,97 (s, 3H), 2,64-2,55 (m, 1H), 2,38-2,27 (m, 1H), 2,05-1,95 (m, 3H), 1,79-1,71 (m, 2H), 1,66-1,19 (m, 16H), 0,96 (s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 801,4 (M-H)^– 803,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
Beispiel 4
Herstellung von Verbindung 103
Verbindung 100 (30 mg, 0,038 mMol) wurde mit HATU (17 mg, 0,045 mMol) kombiniert und in wasserfreiem DMF (4 ml) gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt, bevor DIPEA (26 μl, 0,15 mMol) tropfenweise über ca. 1 Minute zugegeben wurde. Die Mischung wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und durch analytische HPLC auf die Bildung des aktivierten Esters analysiert. Diesem folgend wurde eine Lösung von Benzolsulfonamid (23 mg, 0,15 mMol), DMAP (17 mg, 0,14 mMol) und DBU (22 μl, 0,15 mMol) in DMF (1 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bevor diese in EtOAc (50 ml) gegossen und mit gesättigtem NaHCO₃ und gesättigter Salzlauge-Lösung gewaschen wurde. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rest wurde in DMSO wieder aufgenommen und durch präparative HPLC gereinigt. Die Lyophilisierung ergab das Endprodukt (17 mg, 48%) als blassgelben amorphen Feststoff.
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): δ 10,89 (s, 1H), 8,84 (s, 1H), 8,20 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,18-8,08 (m, 2H), 7,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,70 (dd, J = 7,6, 7,6 Hz, 2H), 7,58 (dd, J = 7,7, 7,7 Hz, 2H), 7,28 (bs, 1 H), 7,11 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,75 (bs, 1H), 5,37-5,25 (m, 1H), 5,12 (d, J = 17 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,58-4,42 (m, 3H), 4,24 (bs, 1H), 4,05 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,93 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 2,69-2,61 (m, 1H), 2,35-2,21 (m, 1H), 2,13-1,98 (m, 3H), 1,78-1,68 (m, 4H), 1,68-1,51 (m, 8H), 1,50-1,41 (m, 4H), 1,29-1,22 (m, 1H), 0,99 (s, 9H).
MS (Elektrospray): 928,5 (M + H)⁺, und 926,5 (M-H)^–.
RP-HPLC: Rt = 7,3 Minuten (Homogenität = 99%).
Unter Verwendung der in Schema 2 gezeigten Synthesesequenz wurden die nachfolgenden Verbindungen hergestellt:
Beispiel 5
Schritt 1: Synthese von Dipeptid 16:
Dipeptid 15 (4,0 g, 7,02 mMol) wurde in THF (20 ml) gelöst, und MeOH (10 ml), Wasser (10 ml) und eine IN wässerige NaOH-Lösung (1,05 Äquivalente, 7,4 ml) wurde zugegeben. Die Lösung wurde für 2,75 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde zur Trockne abgedampft. Der Rest wurde mit Wasser verdünnt, gefroren und lyophilisiert, um das Natriumsalz 16 als weißen amorphen Feststoff (4,28 g) bereitzustellen.
M.S. (Elektrospray): 554,2 (M-H)^– 556,3 (M+H)⁺ 578,2 (M+Na)⁺.
Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 96%.
Schritt 2: Synthese von Dipeptiddiazoketon 17:
Das Natriumsalz 16 (angenommene 7,02 mMol) wurde in THF (78 ml) gelöst; Triethylamin (1,37 ml, 9,83 mMol) wurde zugegeben und die Lösung auf 0°C abgekühlt. Isobutylchlorformiat (1,28 ml, 9,83 mMol) wurde tropfenweise zugegeben und die weiße Suspension für 2 Stunden bei 0°C gerührt, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von Diazomethan (0,67 M in Diethylether, 63 ml, 42,13 mMol). Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C 1 Stunde und bei Raumtemperatur 1,25 Stunden gerührt und abgedampft, um eine dicke Suspension bereitzustellen. Diese Suspension wurde in EtOAc und Wasser gelöst. Die organische Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das Diazoketon 17 als beigen Feststoff (rohes Material wurde für den nächsten Schritt verwendet; angenommene 7,02 mMol) zu ergeben.
M.S. (Elektrospray): 578,2 (M-H)^– 580,3 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 90%.
Schritt 3: Synthese von Dipeptidbromketon 18:
Bei 0°C wurde zu einer Lösung von Diazoketon (angenommene 1,44 mMol) in THF (116 ml) eine 48%ige wässerige HBr-Lösung (5,1 ml) tropfenweise zugegeben und die Mischung für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc verdünnt, mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das gewünschte Bromketon als beigen Feststoff (4,25 g, 6,72 mMol) zu ergeben.
M.S. (Elektrospray): 632 (M) 634,2 (M+2).
Schritt 4: Synthese von Dipeptid 19:
α-Bromketon 18 (512 mg, 0,81 mMol) und N-Cyclopentylthioharnstoff (128,4 mg, 0,89 mMol) wurden in Isopropanol (20 ml) gelöst. Die resultierende gelbe Lösung wurde für 1,5 Stunden bei 70°C erhitzt. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und dampft zur Trockene ein: Der Rest wurde mit EtOAc verdünnt. Die EtOAc-Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert, um das Produkt als orangebraunen Schaum zu ergeben. Flash-Säulenchromatographie in Hexan:EtOAc 7:3 entfernte weniger polare Verunreinigungen und 6:4 ergab die erwünschte Verbindung als hellgelben Feststoff (411,5 mg; 75%).
M.S. (Elektrospray): 676,3 (M-H)^– 678,3 (M+H)⁺.
Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
Schritt 5: Synthese von Tripeptid 20:
Das Boc-Dipeptid (32,6 g, 0,048 mMol) wurde in 4N HCl/Dioxan (3 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung durch Verdampfen zur Trockene aufgearbeitet. Das HCl-Salz wurde somit als cremefarbener Feststoff erhalten. Das HCl-Salz wurde für 30 Minuten Hochvakuum unterzogen. Zu einer Lösung des HCl-Salzes in DCM (2 ml) und DIEA (33 μl, 0,192 mMol) wurde Harnstoff 5 (13,96 mg, 0,058 mMol) zugegeben, gefolgt vom HATU-Kopplungsmittel (21,90 mg, 0,058 mMol). Die Reaktionsmischung wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt, mit gesättigtem NaHCO₃ (2 ×), Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und abgedampft, um das rohe Produkt als dickes gelbes Öl (angenommene 0,048 mMol) zu ergeben.
M.S. (Elektrospray): 800,4 (M-H)^– 802,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 95%.
Schritt 6: Hydrolyse von Tripeptidmethylester 20:
Eine Lösung von Methylester 20 (77,80 mg, 0,097 mMol) in THF (2 ml) und MeOH (1 ml) und eine wässerige Lösung von LiOH (40,7 mg, 0,97 mMol) in Waser (1 ml) wurde für 16 Stunden gerührt. Die organische Lösung wurde konzentriert, um eine cremefarbene Suspension bereitzustellen. Das rohe Material wurde durch präparative HPLC (YMC Combiscreen ODS-AQ, 50 × 20 mm ID S-5-mikron, 120A, λ = 220 nm) unter Verwendung eines linearen Gradienten und 0,06% TFA CH₃CN/H₂O gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und zum Natriumsalz umgewandelt.
Umwandlung zum Na-Salz:
Die konzentrierten Fraktionen wurden mit EtOAc verdünnt, und wenige Milliliter Salzlauge zugegeben (basisch auf pH – 13 mit 5N NaOH, dann neutralisiert auf pH 5,5 bis 6,0 mit 1N HCl). Das Produkt wurde mit EtOAc (3 ×) extrahiert, mit Wasser (2 ×) und Salzlauge (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockene abgedampft, um das neutrale Produkt als gelben Feststoff (52,7 mg, 70%) bereitzustellen. Das neutrale Produkt (49,4 mg, 0,0627 mMol) wurde in MeOH (10 ml) gelöst und 1 Äquivalent 0,01N NaOH (6,27 ml) wurde zugegeben. Die klare gelbe Lösung wurde konzentriert, um MeOH zu entfernen, und mit Wasser verdünnt, ausgefroren und lyophilisiert, um das Produkt (Na-Salz) als gelben amorphen Feststoff (50,8 mg, theoretische Ausbeute: 50,8 mg, MW-Na-Salz: 809,75) zu ergeben.
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 8:1 Mischung von Rotationsisomeren; δ 8,20 (bs, 1H), 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,51-7,47 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 6,97 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,19-6,02 (m, 1H), 5,33 (bs, 1H), 4,99 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 4,52-4,41 (m, 2H), 4,34 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,04-3,96 (m, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,79-3,68 (m, 111), 3,68-3,15 (Unterwasserpeak, 2H), 2,45-2,36 (m, 1H), 2,05-1,92 (m, 2H), 1,82-1,35 (m, 16H), 1,35-1,12 (m, 2H), 0,91 & 0,84 (2 × s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 786,4 (M-H)^– 788,3 (M+H)⁺ 810 (M+Na)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
BEISPIEL 6
Verbindung 104:
Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben und unter Verwendung des Cyclobutylcarbamats von tert-Butylglycin in Schritt 5 anstelle von Harnstoff 5 und Reinigen der rohen Carbonsäure nach Schritt 6 durch präparative HPLC wurde die Titelverbindung als TFA-Salz erhalten:
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 7:1 Mischung von Rotationsisomeren; δ 8,09 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 6,5 Hz, 11-1), 7,45 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,28 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,16-7,08 (m, 1H), 7,07-7,00 (m, 1H), 6,10-5,95 (m, 1H), 5,32 (bs, 1H), 5,00 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,64-4,52 (m, 1H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,29 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,97-3,85 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 2,36-2,27 (m, 1H), 2,18-2,04 (m, 2H), 2,03-1,81 (m, 6H), 1,77-1,43 (m, 9H), 1,41-1,34 (m, 1H), 0,96 & 0,85 (2 × s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 773,3 (M-H)^– 775,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
BEISPIEL 7
Verbindung 105:
Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben und unter Verwendung des Cyclohexylcarbamats von tert-Butylglycin in Schritt 5 anstelle von Harnstoff 5 wurde die Titelverbindung als Natriumsalz erhalten:
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 5:1 Mischung von Rotationsisomeren; δ 8,29 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,27 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 2,0, 9,0 Hz, 1H), 5,89 (bs, 1H), 5,34 (s, 1H), 5,08 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 8,4, 16,8 Hz, 1H), 4,36-4,24 (m, 1H), 4,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,00-3,86 (m, 3H), 3,89 (s, 3H), 2,35-2,23 (m, 1H), 2,04-1,91 (m, 5H), 1,79-1,41 (m, 10H), 1,39-1,08 (m, 7H), 0,97 & 0,86 (2 × s, 9H).
M.S. (Elektrospray): 801,4 (M-H)^– 803,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 98%.
BEISPIEL 8
Verbindung 106:
Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben und unter Verwendung des Cyclopentylcarbamats von Cyclohexylglycin in Schritt 5 anstelle von Harnstoff 5 wurde die Titelverbindung als Natriumsalz erhalten:
¹H-NMR 400 MHz, DMSO-d₆): ca. 1:4 Mischung von Rotationsisomeren; δ 8,22 & 8,04 (2 × s, 1H), 8,00 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,27 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,01 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H), 6,09-5,98 (m, 1H), 5,34 (s, 1H), 4,98 (dd, J = 1,6, 17,4 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,73-4,67 (m, 1H), 4,43-4,31 (m, 2H), 4,05-3,95 (m, 2H), 3,95-3,84 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 2,38-2,29 (m, 1H), 2,03-1,92 (m, 2H), 1,83-1,21 (m, 24H), 1,21-0,83 (m, 5H).
M.S. (Elektrospray): 813,4 (M-H)^– 815,4 (M+H)⁺. Umkehrphasen-HPLC Homogenität (0,06% TFA; CH₃CN:H₂O): 99%.
BEISPIEL 9
Verbindung 107:
Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben und unter Verwendung des Cyclopentylcarbamats von Cyclopentylglycin in Schritt 5 anstelle von Harnstoff 5 wurde die Titelverbindung erhalten, die in ihr entsprechendes Na-Salz umgewandelt wurde.
BEISPIEL 10
NS3-NS4A-Protease-Test
Der enzymatische Test, der zur Beurteilung der vorliegenden Verbindung verwendet wurde, ist in der WO 00/09543 und der WO 00/59929 beschrieben.
BEISPIEL 11
Zellbasierter HCV-RNA-Replikationstest
Zellkultur

Huh7-Zellen, die stabil ein subgenomisches HCV-Replikon aufrechterhalten, wurden wie zuvor beschrieben (Lohman et al., 1999, Science 285: 110-113) etabliert und als die S22.3-Zelllinie bezeichnet. S22.3-Zellen werden in Dulbecco's modifiziertem Earle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS und 1mg/ml Neomycin (Standardmedium) gehalten. Während des Tests wurde DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS, enthaltend 0,5% DMSO und ohne Neomycin verwendet (Testmedium). 16 Stunden vor Verbindungszugabe werden S22.3-Zellen trypsinisiert und auf 50.000 Zellen/ml im Standardmedium verdünnt. 200 μl (10.000 Zellen) werden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Die Platte wird dann mit 5% CO₂ bis zum nächsten Tag bei 37°C inkubiert. Reagentien und Materialien:

Produkt	Firma	Katalog #	Lagerung
DMEM	Wisent Inc.	10013CV	4°C
DMSO	Sigma	D-2650	RT
Dulbeccos PBS	Gibco-BRL	14190-136	RT
Fötales Rinderserum	Bio-Whittaker	14-901F	-20°C/4°C
Neomycin (G418)	Gibco-BRL	10131-027	-20°C/4°C
Trypsin-EDTA	Gibco-BRL	25300-054	-20°C/4°C
Platten mit 96-Vertiefungen	Costar	3997	RT
0,22 μm PVDF-Filtereinheit	Millipore	SLGV025LS	RT
Polypropylen Deep-Well-Titerplatte	Beckman	267007	RT

Herstellung der Testverbindung
10 μl der Testverbindung (in 100% DMSO) wurden zu 2 ml Testmedium für eine DMSO-Endkonzentration von 0,5% zugegeben und die Lösung für 15 Minuten mit Ultraschall behandelt und durch eine 0,22 μM-Millipore-Filtereinheit filtriert. 900 μl wurden in Reihe A einer Polypropylen-Deep-Well-Titerplatte transferiert. Die Reihen B bis H enthalten 400 μl Aliquote des Testmediums (enthaltend 0,5% DMSO) und werden verwendet, um serielle Verdünnungen (1/2) herzustellen, indem 400 μl Reihe pro Reihe transferiert werden (in Reihe H war keine Verbindung enthalten).
Anwendung der Testverbindung auf Zellen
Zellkulturmedium wurde aus der Platte mit 96 Vertiefungen, enthaltend die S22.3-Zellen aspiriert. 175 μl des Testmediums mit der geeigneten Verdünnung der Testverbindung wurde von jeder Vertiefung der Verbindungsplatte zur entsprechenden Vertiefung der Zellkulturplatte (Reihe H wurde als die "Nicht-Inhibierungskontrolle" verwendet) transferiert. Die Zellkulturplatte wurde für 72 Stunden mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert.
Extraktion von gesamtzellularer RNA
Nach der 72 Stunden-Inkubationsdauer wurde die gesamtzellulare RNA aus den S22.3-Zellen der Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung des RNeasy-96-Kits (Qiagen^®, RNeasy Handbook, 1999) extrahiert. Kurz gesagt, wurde Testmedium vollständig aus den Zellen entfernt und 100 μl RLT-Puffer (Qiagen^®), enthaltend 143 mM β-Mercaptoethanol, wurde zu jeder Vertiefung der Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Die Mikroplatte wurde vorsichtig für 20 Sekunden geschüttelt. 100 μl 70%iges Ethanol wurden dann zu jeder Mikroplattenvertiefung zugegeben und durch Pipettieren gemischt. Das Lysat wurde entfernt und auf die Vertiefungen einer RNeasy-96-Platte (Qiagen^®) aufgetragen, die auf einen Qiagen^®-Square-Well-Block platziert war. Die RNeasy-96-Platte wurde mit Band abgedichtet und der Square-Well-Block mit der RNeasy-96-Platte wurde in den Halter gegeben und in einen Rotorbehälter einer 4K15C-Zentrifuge platziert. Die Probe wurde bei 6000 UpM (~ 5600 × g) für 4 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Band wurde von der Platte entfernt und 0,8 mm Puffer RW1 (Qiagen^® RNeasy-96-Kit) wurde zu jeder Vertiefung der RNeasy-96-Platte zugegeben. Die RNeasy-96-Platte wurde mit einem neuen Stück Band abgedichtet und bei 6000 UpM für 4 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die RNeasy-96-Platte wurde oben auf einen weiteren sauberen Square-Well-Block gelegt, das Band entfernt und 0,8 ml Puffer RPE (Qiagen^® RNeasy-96-Kit) wurde zu jeder Vertiefung der RNeasy-96-Platte zugegeben. Die RNeasy-96-Platte wurde mit einem neuen Stück Band abgedichtet und bei 6000 UpM für 4 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Band wurde entfernt und weitere 0,8 ml Puffer RPE (Qiagen^® RNeasy-96-Kit) wurden zu jeder Vertiefung der RNeasy-96-Platte zugegeben. Die RNeasy-96-Platte wurde mit einem neuen Stück Band abgedichtet und bei 6000 UpM für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Band wurde entfernt, die RNeasy-96-Platte wurde oben auf ein Regal, enthaltend 1,2 ml-Sammelmikroröhrchen, gestellt. Die RNA wurde durch Zugaben von 50 μl RNase-freies Wasser zu jeder Vertiefung eluiert, die Platte mit einem neuen Stück Band abgedichtet und für 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann bei 6000 UpM für 4 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Eluierungsschritt wurde mit einem zweiten Volumen 50 μl RNase-freiem Wasser wiederholt. Die Mikroröhrchen mit gesamtzellularer RNA wurden bei -70°C gelagert.
Quantifizierung von gesamtzellularer RNA

RNA wurde auf dem STORM^®-System (Molecular Dynamics^®) unter Verwendung des RiboGreen^® RNA-Quantifizierungs-Kits (Molecular Probes^®) quantifiziert. Kurz gesagt, wurde das RiboGreen-Reagens 200-fach in TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) verdünnt. Im Allgemeinen wurden 50 μl Reagens in 10 ml TE verdünnt. Eine Standardkurve ribosomaler RNA wurde in TE auf 2 μg/ml verdünnt und vorbestimmte Mengen (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 und 0 μl) der ribosomalen RNA-Lösung wurden dann in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen (COSTAR #3997) transferiert und das Volumen wurde mit TE auf 100 μl komplettiert. Im Allgemeinen wurde Säule 1 der Platte mit 96 Vertiefungen für die Standardkurve verwendet, und die anderen Vertiefungen wurden für die zu quantifizierenden RNA-Proben verwendet. 10 μl jeder RNA-Probe, die zu quantifizieren war, wurden zu der entsprechenden Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen transferiert und 90 μl TE wurde zugegeben. Ein Volumen (100 μl) verdünntes RiboGreen- Reagens wurde zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben und vor Licht geschützt für 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (eine 10 μl RNA-Probe in einem 200 μl-Endvolumen erzeugt eine 20fache Verdünnung). Die Fluoreszenz-Intensität jeder Vertiefung wurde auf dem STORM^®-System (Molecular Dynamics®) gemessen. Eine Standardkurve wurde auf Basis der bekannten Mengen der ribosomalen RNA und den resultierenden Fluoreszenz-Intensitäten erzeugt. Die RNA-Konzentration der experimentellen Proben wurde aus der Standardkurve bestimmt und für die 20fache Verdünnung korrigiert. Reagentien und Materialien:

Produkt	Firma	Katalog #	Lagerung
DEPC	Sigma	D5758	4°C
EDTA	Sigma	E5134	RT
Trizma-Base	Sigma	T8524	RT
Trizma-HCl	Sigma	T7149	RT
Sammelröhrchenstreifen	Quiagen	19562	RT
Ribogreen RNA-Quantifizierungs-Kit	Molecular Probe	R11490	-20°C
Rneasy 96-Kit	Quiagen	74183	RT
Square-Well-Blöcke	Quiagen	19573	RT

Echtzeit-RT-PCR
Die Echtzeit-RT-PCR wurde auf dem ABI Prism 7700 Sequence Detection System unter Verwendung des TaqMan EZ RT-PCR-Kits von (Perkin-Elmer Applied Biosystems^®) durchgeführt. Die RT-PCR wurde für die Quantifizierung des 5' IRES von HCV-RNA unter Verwendung der Taqman Technology (Roche Molecular Diagnostics Systems) ähnlich zur vorbeschriebenen Technik (Martell et al., 1999, J. Clin. Microbiol. 37: 327-332) optimiert. Das System nutzt die 5'-3'-nucleolytische Aktivität von AmpliTaq-DNA-Polymerase aus. Kurz gesagt, verwendet das Verfahren eine dual-markierte fluorogenische Hybridisierungssonde (PUTR-Sonde), die sich speziell an das Template zwischen den PCR-Primern (Primer 8125 und 7028) anknüpft. Das 5'-Ende der Sonde enthält einen Fluoreszenz-Reporter (6-Carboxyfluorescein[FAM]) und das 3'-Ende enthält einen Fluoreszenz-Quencher (6-Carboxytetramethylrhodamin[TAMRA]). Das FAM-Reporter-Emissionsspektrum wurde durch den Quencher bei der intakten Hybridisierungssonde unterdrückt. Die Nuclease-Degradation der Hybridisierungssonde setzte den Reporter frei, resultierend in einer Zunahme der Fluoreszenz-Emission. Der ABI-Prism 7700 Sequenzdetektor misst die Zunahme der Fluoreszenz-Emission kontinuierlich während der PCR- Amplifikation derart, dass das amplifizierte Produkt direkt proportional zum Signal war.
Der Amplifikationsausdruck wurde früh in der Reaktion an dem Punkt analysiert, der die logarithmische Phase von Produkt-Akkumulation darstellt. Ein Punkt, der eine definierte Detektionsgrenze der Zunahme des Fluoreszenzsignals, verbunden mit dem exponentiellen Wachstum des PCR-Produkts für den Sequenzdetektor darstellt, wurde als Zyklusgrenze (C_T) definiert. Die C_T-Werte sind umgekehrt proportional zur Menge der eingebrachten HCV-RNA; derart, dass unter identischen PCR-Bedingungen, je größer die Startkonzentration von HCV-RNA war, je geringer das C_T war. Eine Standardkurve wurde automatisch durch das ABI Prism 7700 Detektionssystem durch Auftragen des C_T gegen jede Standardverdünnung von bekannter HCV-RNA-Konzentration erzeugt.
Referenzproben für die Standardkurve sind auf jeder RT-PCR-Platte enthalten. Die HCV-Replikon-RNA wurde in vitro synthetisiert (durch T7-Transkription), gereinigt und durch OD₂₆₀ quantifiziert. Unter Berücksichtigung, dass 1 μg dieser RNA = 2,15 × 10¹¹ RNA-Kopien, werden Verdünnungen durchgeführt, um 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ oder 10² genomische RNA-Kopien/5 μl zu haben. Die gesamte zellulare Huh-7-RNA wurde ebenfalls mit jeder Verdünnung einbezogen (50 ng/5 μl). 5 μl jedes Referenzstandards (HCV-Replikon + Huh-7-RNA) wurden mit 45 μl Reagenzmischung kombiniert und in der Echtzeit-RT-PCR-Reaktion verwendet.

Die Echtzeit-RT-PCR-Reaktion wurde für die experimentellen Proben eingestellt, die auf RNeasy-Platten mit 96 Vertiefungen durch Kombinieren von 5 μl jeder zellularen Gesamt-RNA-Probe mit 45 μl Reagenzmischung gereinigt wurde. Reagenzien und Materialien:

Produkt	Firma	Katalog #	Lagerung
TaqMan EZ RT-PCR-Kit	PE Applied Biosystems	N808-0236	-20°C
MicroAmp Optical Caps	PE Applied Biosystems	N801-0935	RT
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	PE Applied Biosystems	N801-0560	RT

Regeanz-Mischzubereitungen:

Komponente	Volumen für eine Probe (μl)	Volumen für eine Platte (μl) (91 Proben + Totvolumen)	Endkonzentration
Rnase-freies Wasser	16,5	1617
5X TaqMan EZ Puffer	10	980	1X
Mn(OAc)₂ (25 mM)	6	588	3 mM
dATP (10 mM)	1,5	147	300 μM
dCTP (10 mM)	1,5	147	300 μM
dGTP (10 mM)	1,5	147	300 μM
dUTP (20 mM)	1,5	147	600 μM
Vorwärtsprimer (10 μM)	1	98	200 nM
Umkehrprimer (10 μM)	1	98	200 nM
PUTR-Sonde (5 μM)	2	196	200 nM
rTth DNA-Polymerase (2,5 U/μl)	2	196	0,01 U/μl
AmpErase UNG (1 U/μl)	0,5	49	0,01 U/μl
Gesamtvolumen	45	4410

Vorwärts-Primer-Sequenz (SEQ ID NR. 1): 5' – ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT GGC GTT AGT – 3'
Umkehr-Primer-Sequenz (SEQ ID NR. 2): 5' – TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG – 3'
Bemerkung: Diese Primer amplifizieren eine Region von 256-nt, die in der 5'-nicht-translatierten Region von HCV vorliegt.
PUTR-Sonden-Sequenz (SEQ ID NR. 3): [6FAM] – TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA CC – [TAMRA]
Keine Template-Kontrollen (NTC): Auf jeder Platte wurden 4 Vertiefungen als "NTC" verwendet. Für diese Kontrollen werden 5 μl Wasser anstelle von RNA zur Vertiefung zugegeben.

Thermische Cyclierungsbedingungen:
Nach der Beendigung der RT-PCT-Reaktion erfordert die Datenanalyse das Einstellen des Grenzfluoreszenzsignals für die PCR-Platte und eine Standardkurve wurde durch Auftragen des Ct-Werts gegen die RNA-Kopiezahl, die in jeder Referenzreaktion verwendet wurde, erzeugt. Die für die Testproben erhaltenen Ct-Werte werden verwendet, um eine RNA-Kopiezahl, basierend auf der Standardkurve, zu interpolieren.
Schließlich wurde die RNA-Kopiezahl normalisiert (basierend auf der RiboGreen-RNA-Quantifizierung der Gesamt-RNA, extrahiert aus der Zellkulturvertiefung) und ausgedrückt als Genom-Äquivalente/μg der Gesamt-RNA [ge/μg].
Die RNA-Kopiezahl [g.e./μg] von jeder Vertiefung der Zellkulturplatte war ein Maß der Menge an Replikations-HCV-RNA in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Inhibitor. Die %-Inhibierung wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: 100 – [(g.e./μg inh)/(g.e./μg ctl) × 100].
Ein nichtlineare Kurve, angepasst mit dem Hill-Modell, wurde auf die Inhibierungs-Konzentrationsdaten angewandt, und die 50%ige wirksame Konzentration (EC₅₀) wurde unter Verwendung von SAS-Software (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.) berechnet.
Wenn die Verbindungen dieser Erfindung in den vorangehenden enzymatischen und zellbasierten Tests beurteilt wurden, wurde gefunden, dass die Verbindungen hochgradig aktiv sind. Noch spezieller hatten die Verbindungen IC₅₀-Werte unterhalb 0,1 μM im NS3-NS4A-Protease-Test und EC₅₀-Werte unter 0,5 μM im zellbasierten HCV-RNA-Replikationstest.
BEISPIEL 12
Spezifizitätstests
Die Spezifizitätstests, verwendet, um die Selektivität dieser Verbindung zu beurteilen, sind in der WO 00/09543 beschrieben.
Wenn die Verbindungen in den Spezifizitätstests beurteilt wurden, wurde von den Verbindungen von Formel 1 gefunden, dass sie dahingehend selektiv sind, dass sie keine signifikante Inhibierung in den Human-Leukozyt-Elastase- und Cathepsin-B-Tests zeigen.
BEISPIEL 13
Pharmakokinetische Eigenschaften
Die vorliegenden Verbindungen zeigen ebenfalls gute pharmakokinetische Eigenschaften, wie signifikante Plasmaspiegel in der Ratte 1 Stunde und 2 Stunden nach einer oralen Dosis von 5 mg/kg.
Noch expliziter wurde der folgende Test eines in vivo Oral-Absorptions-Screens verwendet, um die Plasmaspiegel der Testverbindungen in einer Ratte nach oraler Verabreichung zu bestimmen:
Materialien und Methoden:
1. Verfahren, verwendet, um die Verbindungen zu sammeln ("Kassettenselektion"):
Die Selektion von zu sammelnden Verbindungen in einer "Kassette" basierte auf ihrer strukturellen Ähnlichkeit und ihren physikochemischen Eigenschaften. Ein Festphasen-Extraktionsverfahren, anwendbar auf sämtliche der ausgewählten Verbindungen, wurde etabliert. Basierend auf dem anfänglichen Testen wurde jede Verbindung in ein Ratten-Plasma gespiked und durch HPLC oder HPLC/MS bei einer Konzentration von 0,5 μM laufen gelassen, die Retentionszeit, Ionenmasse und die mögliche Abtrennung von Verbindungen durch HPLC und/oder HPLC/MS wurde als Basis zum Sammeln von 3 bis 4 Verbindungen in einer "Kassette" verwendet.
2. Orales Vehikel und Verbindungsherstellung:
Jede "Kassette" enthält 3 bis 4 Verbindungen bei 5 oder 4 mg/kg für jede Verbindung. Die Kassetten wurden als orale Suspension in 0,5% wässeriger Methylcellulose und 0,3% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonooleat (Tween-80) hergestellt. Das Dosierungsvolumen war 10 ml/kg über orale Sondenernährung.
3. Dosierung und Plasmaprobennahme:
Männliche Sprague-Dawley-Ratten ließ man über Nacht in Einzelkäfigen hungern, mit Zugang zu wässeriger 10%iger Dextrose. Zwei Ratten bekamen Dosierungen mit jeder "Kassette". Plasmaproben (~ 1 ml) wurden 1 und 2 Stunden nach Dosierung von den 2 Ratten gesammelt und für Extraktion und Analyse gesammelt.
4. Verbindungsextraktion und Analyse:
Von jeder Kassette wurden Plasmaproben nach 1 und 2 Stunden, blankes Plasma, blankes Plasma, gespiked mit sämtlichen Verbindungen bei jeweils 0,5 μM, durch das Festphasenextraktionsverfahren extrahiert. Die Proben wurden durch HPLC und HPLC/MS für Vergleichszwecke analysiert. Die Plasma-Konzentrationen werden, basierend auf der Einzelkonzentration des 0,5 μM-Standards, abgeschätzt.
Wenn in dem vorangehenden Screen gestestet, wurde von den Verbindungen der Beispiele 1 bis 9 dieser Erfindung gefunden, dass ein signifikanter Spiegel im Plasma bei 1- und 2-Stunden-Intervallen, die der Oralverabreichung folgten, vorlagen, mit durchschnittlichen Blutplasmaspiegeln von 1,23 μM bzw. 1,16 μM. Diese Demonstration von signifikanter in vivo Oralabsorption der Verbindungen dieser Erfindung ist unerwartet im Hinblick auf die geringere orale Absorption, die im Allgemeinen dieser Klasse von Peptiden zugeschrieben wird. Die leichte orale Absorption macht die Verbindungen zur Behandlung von HCV-Infektion verwendbar.
Die nachfolgende Tabelle listet Verbindungen auf, die für die Erfindung repräsentativ sind. Weiterhin, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung, hatten die Verbindungen sämtlich IC₅₀-Werte unterhalb 0,1 μM im NS3-NS4A-Protease-Test und EC₅₀-Werte unterhalb 0,5 μM im zellbasierten HCV-RNA-Replikationstest.
Tabelle 1
SEQUENZLISTE

Claims

Verbindung der Formel (I):
worin R¹ Hydroxy oder NHSO₂R^1A darstellt, worin R^1A (C_1-8)-Alkyl, (C_3-7)-Cycloalkyl oder {(C_1-6)-Alkyl-(C_3-7)-cycloalkyl) darstellt, welche alle gegebenenfalls ein bis dreimal mit Halogen, Cyano, Nitro, O-(C_1-6)-Alkyl, Amido, Amino oder Phenyl substituiert sind, oder R^1A ist C₆- oder C₁₀-Aryl, das gegebenenfalls ein bis dreimal mit Halogen, Cyano, Nitro, (C_1-6)-Alkyl, O-(C_1-6)-Alkyl, Amido, Amino oder Phenyl substituiert ist; R² ist (C_4-6)-Cycloalkyl; R³ ist t-Butyl oder (C_5-6)-Cycloalkyl und R⁴ ist (C_4-6)-Cycloalkyl; oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. annehmbares Salz hiervon.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy, NHSO₂Me, NHSO₂-Cyclopropyl oder NHSO₂Ph darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 2, worin R¹ NHSO₂-Cyclopropyl oder NHSO₂Ph darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 2, worin R¹ Hydroxy darstellt.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin R² Cyclopentyl oder Cyclohexyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 5, worin R² Cyclopentyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin R³ t-Butyl oder Cyclohexyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 7, worin R³ t-Butyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin R⁴ Cyclobutyl oder Cyclopentyl darstellt.
Verbindung der Formel l nach Anspruch 9, worin R⁴ Cyclopentyl darstellt.
Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R² und R⁴ jeweils Cyclopentyl darstellen und R³ t-Butyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy, R² Cyclobutyl, R³ t-Butyl und R⁴ Cyclopentyl darstellen.
Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy, R² Cyclohexyl, R³ t-Butyl und R⁴ Cyclopentyl darstellen.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ NHSO₂Ph darstellt, R² und R⁴ jeweils Cyclopentyl darstellen und R³ t-Butyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy, R² Cyclopentyl, R³ t-Butyl und R⁴ Cyclobutyl darstellen.
Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy, R² Cyclopentyl, R³ t-Butyl und R⁴ Cyclohexyl darstellen.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxydarstellt, R² und R4 jeweils Cyclopentyl darstellen und R³ Cyclohexyl darstellt.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R¹ Hydroxy darstellt, R², R³ und R⁴ jeweils Cyclopentyl darstellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine gegen virale Hepatitis C wirksame Menge einer Verbindung der Formel 1 nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. annehmbares Salz hiervon, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen bzw. annehmbaren Trägermedium oder Zusatzstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, weiterhin umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von ein oder mehr anti-HCV-Mitteln.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das andere anti-HCV-Mittel ausgewählt ist aus: α-Interferon oder pegyliertem α-Interferon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das andere anti-HCV-Mittel Ribavirin darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das andere anti-HCV-Mittel ausgewählt ist aus Inhibitoren von: Helicase, NS2/3-Protease und Interner Ribosomen-Eintrittstelle (IRES).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das anti-HCV-Mittel einen HCV-Polymerase-Inhibitor darstellt.
Verwendung einer Verbindung der Formel I nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung von viraler Hepatitis C-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ein oder mehr andere anti-HCV-Mittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 26, worin das andere anti-HCV-Mittel ausgewählt ist aus: α-Interferon oder pegyliertem α-Interferon.
Verwendung nach Anspruch 26, worin das andere anti-HCV-Mittel Ribavirin darstellt.
Verwendung nach Anspruch 26, worin das andere anti-HCV-Mittel ausgewählt ist aus Inhibitoren von: Helicase, NS2/3-Protease und Interner Ribosomen-Eintrittstelle (IRES).
Verwendung nach Anspruch 26, worin das andere anti-HCV-Mittel einen HCV-Polymerase-Inhibitor darstellt.