ES2285085T3 - Tripeptidos con un eter de hidroxiprolina de una quinolina sustituida para la inhibicion de ns3 (hepatitis c). - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I): (I) en la que R1 es hidroxi o NHSO2R1A, en donde R1A es alquilo (C1-8), cicloalquilo (C3-7) o {alquilo(C1-6)-cicloalquilo (C3-7)}, que están todos opcionalmente sustituidos de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, O-alquilo (C1-6), amido, amino o fenilo, o R1A es arilo de C6 o C10 que está opcionalmente sustituido de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, alquilo (C1-6), O-alquilo (C1-6), amido, amino o fenilo; R2 es cicloalquilo (C4-6); R3 es t-butilo o cicloalquilo (C5-6) y R4 es cicloalquilo (C4-6), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Tripéptidos con un éter de hidroxiprolina de una
quinolina sustituida para la inhibición de NS3 (hepatitis C).
La presente invención se refiere a compuestos,
procedimiento para su síntesis y composiciones para el tratamiento
de una infección del virus de la hepatitis C (HCV). En particular,
la presente invención proporciona nuevos análogos de péptidos y
composiciones farmacéuticas que contienen tales análogos para el
tratamiento de una infección de
HCV.
HCV.
El virus de la hepatitis C (HCV) es el agente
etiológico principal de hepatitis no A y no B posterior a
transfusiones y adquirido en comunidades a nivel mundial. Se estima
que por encima de 200 millones de personas en el mundo están
infectadas por el virus. Un elevado porcentaje de portadores resulta
crónicamente infectado y muchos progresan a enfermedades crónicas
del hígado, la denominada hepatitis C crónica. Este grupo a su vez
tiene un riesgo elevado de enfermedad grave del hígado como
cirrosis hepática, cáncer hepatocelular y enfermedad terminal del
hígado que conduce a la muerte.
El mecanismo mediante el que el HCV establece la
persistencia viral y provoca una tasa elevada de enfermedad
hepática crónica no ha sido dilucidado a fondo. Es conocido el modo
en que el HCV interacciona con el sistema inmune del hospedante y
lo evade. Además, las funciones de las respuestas inmunes celulares
y tumorales en protección contra la infección por HCV y la
enfermedad no han sido todavía establecidas. Las inmunoglobulinas
han sido descritas para la profilaxis de la hepatitis viral asociada
a transfusiones, sin embargo, la institución "Center for Disease
Control" no recomienda actualmente el tratamiento con
inmunoglobulinas para estos fines. La ausencia de una respuesta
inmune protectora eficaz es un obstáculo en el desarrollo de una
vacuna o medidas adecuadas de profilaxis posteriores a la
exposición, por lo que a corto plazo, las esperanzas se asientan
firmemente en intervenciones
antivirales.
antivirales.
Se han realizado diversos estudios clínicos con
el objetivo de identificar agentes farmacéuticos capaces de tratar
eficazmente la infección por HCV en pacientes afectados con
hepatitis C crónica. Estos estudios han incluido el uso de
interferón-alfa, solo o en combinación con otros
agentes antivirales. Estos estudios han mostrado que un número
sustancial de los participantes no respondieron a estas terapias, y
de los que respondieron favorablemente, una elevada proporción se
encontró que recaía tras terminar el tratamiento.
Hasta recientemente, el interferón (IFN) era la
única terapia disponible de provecho demostrado aprobada en el
campo clínico para pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo,
la velocidad de respuesta sostenida es baja, y el tratamiento con
interferón induce también efectos secundarios graves (es decir,
retinopatía, tiroiditis, pancreatitis aguda o depresión) que
disminuyen la calidad de vida de los pacientes tratados.
Recientemente, el interferón en combinación con ribavirina ha sido
aprobado para pacientes que no responden a IFN solo. Sin embargo,
los efectos secundarios provocados por el IFN no son aliviados con
esta terapia de combinación. Las formas pegiladas (tratadas con
polietilenglicol) de interferones como PEG-Intron® y
Pegasys® pueden abordar de forma aparentemente parcial estos
efectos secundarios perjudiciales, pero los fármacos antivirales
siguen siendo todavía la vía de elección para el tratamiento oral
de HCV.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollo
de agentes antivirales eficaces para el tratamiento de una
infección por HCV que superen las limitaciones de las terapias
farmacéuticas existentes.
El HCV es un virus de RNA de cadena positiva
envuelta en la familia Flaviviridae. El genoma de RNA de HCV
de cadena única tiene una longitud de aproximadamente 9.500
nucleótidos y tiene un marco de lectura abierta único (ORF) que
codifica una única poliproteína grande de aproximadamente 3.000
aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es
escindida en múltiples sitios por proteasas celulares y virales para
producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el
caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras
(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se efectúa por dos proteasas
virales. La primera, como todavía está escasamente caracterizada,
se escinde en la unión NS2-NS3 (denominada en lo
sucesivo proteasa NS2/3); la segunda es una
proteasa-serina combinada con la región
N-terminal de NS3 (proteasa NS3) y media todas las
escisiones posteriores aguas abajo de NS3, tanto en cis, en
el sitio de escisión NS3-NS4A, como en el
trans, para los restantes sitios NS4A-NS4B,
NS4B-NS5A y NS5A-NS5B. La proteína
NS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como un
co-factor para la proteasa NS3 y ayudando
posiblemente a la localización de membranas de NS3 y otros
componentes de replicasas virales. La formación de complejos de
proteasa de NS3 con NS4A parece necesaria para los acontecimientos
de los tratamientos, aumentando la eficacia proteolítica en todos
los sitios. La proteína de NS3 exhibe actividades de
nucleósido-trifosfatasa y
RNA-helicasa. La NS5B es una
RNA-polimerasa dependiente de RNA que está
involucrada en la replicación de HCV.
Una estrategia general para el desarrollo de
agentes antivirales es inactivar viralmente enzimas codificadas que
son esenciales para a replicación del virus.
Lo que sigue es una lista de solicitudes de
patentes publicadas en los últimos años que describen análogos de
péptidos inhibidores de NS3-proteasa de HCV que son
estructuralmente diferentes de los compuestos de la presente
invención:
GB 2,337,262; JP10298151; JP 11126861; JP
11292840; JP 2001-103993; US 6,159,938; US
6,187,905; WO 97/43310; WO 98/17679; WO 98/22496; WO 98/46597; WO
98/46630; WO 99/38888; WO 99/50230; WO 99/64442; WO 99/07733; WO
99/07734; WO 00/09543; WO 00/09558; WO 00/20400; WO 00/59929; WO
00/31129; WO 01/02424; WO 01/07407; WO 01/16357; WO 01/32691; WO
01/40262; WO 01/58929; WO 01/64678; WO 01/74768; WO 01/77113; WO
01/81325; WO 02/08187; WO 02/08198; WO 02/08244; WO 02/08251; WO
02/08256; WO 02/18369; WO 02/60926 y WO 02/79234.
Una ventaja de la presente invención es que
proporciona compuestos de tripéptidos que son inhibidores de la
NS3-proteasa, una enzima esencial para la
replicación del virus de la hepatitis C. Además de ello, los
compuestos son capaces de inhibir la replicación de RNA de HCV en
el modelo de célula de replicón.
Una ventaja adicional de un aspecto de la
presente invención consiste en el hecho de que los compuestos
inhiben específicamente la NS3-proteasa y no
muestran una actividad inhibidora significativa frente a las demás
serina-proteasas como elastasa de leucocitos
humanos (HLE), elastasa pancreática porcina (PPE) o quimotripsina
pancreática bovina, o cisteína-proteasas como
catepsina B hepática humana (CatB).
Está incluido en el alcance de la invención un
compuesto de fórmula (I):
en la que R^{1} es hidroxi o
NHSO_{2}R^{1A} en donde R^{1A} es alquilo
(C_{1-8}), cicloalquilo
(C_{3-7}) o
{alquilo(C_{1-6})-cicloalquilo
(C_{3-7})}, que están todos opcionalmente
sustituidos de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro,
O-alquilo (C_{1-6}), amido, amino
o fenilo, o R^{1A} es arilo de C_{6} o C_{10} que está
opcionalmente sustituido de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro,
alquilo (C_{1-6}), O-alquilo
(C_{1-6}), amido, amino o fenilo; R^{2} es
cicloalquilo (C_{4-6}); R^{3} es
t-butilo o cicloalquilo (C_{5-6})
y R^{4} es cicloalquilo (C_{4-6}), o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo.
Está incluida en el alcance de esta invención
una composición farmacéutica que comprende una cantidad viralmente
eficaz anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula
I, o una sal terapéuticamente aceptable del mismo, mezclada con un
medio de vehículo farmacéuticamente aceptable o agente auxiliar.
Según una realización, la composición
farmacéutica de esta invención incluye adicionalmente interferón
(pegilado o no), o ribavirina, o uno o más de otro agente
anti-HCV, o cualquier combinación de los
anteriores.
Otro aspecto importante de la invención facilita
el tratamiento de una infección viral de hepatitis C en un mamífero
administrando al mamífero una cantidad viralmente eficaz
anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula I, una
sal terapéuticamente aceptable del mismo, o una composición como se
describió anteriormente, solos o en combinación con uno o más de:
interferón (pegilado o no) o ribavirina, o uno o más de otros
agentes anti-HCV, administrados conjunta o
separadamente.
Otro aspecto importante de la invención facilita
la prevención de una infección viral de hepatitis C en un mamífero
administrando al mamífero una cantidad viralmente eficaz
anti-hepatitis C de un compuesto de fórmula I, una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición como se
describió anteriormente, solos o en combinación con uno o más de:
interferón (pegilado o no) o ribavirina, o uno o más de otros
agentes anti-HCV, todos los cuales administrados
conjunta o separadamente.
También está dentro del alcance de esta
invención el uso de un compuesto de fórmula I, como se describe en
la presente memoria descriptiva, para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento o prevención de una infección viral
de hepatitis C.
Tal como se usan en la presente memoria
descriptiva, las siguientes definiciones se aplican, salvo que se
indique otra cosa:
Con referencia a los casos en que (R) o (S) se
usen para indicar la configuración absoluta de un sustituyente o
centro asimétrico de un compuesto de fórmula 1, la indicación se
hace en el contexto del compuesto completo y no en el contexto del
sustituyente o centro asimétrico solo.
La indicación "P1, P2 y P3", tal como se
usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la posición de
los residuos de aminoácidos partiendo del extremo del C terminal de
los análogos de péptidos y extendiéndose hacia el N terminal (es
decir, P1 se refiere a la posición 1 del C terminal, P2: segunda
posición desde el C terminal, etc.) (véase Berger A. &
Schechter I., Transactions of the Royal Society London series
B257, 249-264 (1970).
Tal como se usa en la presente memoria
descriptiva, el término "vinil-ACCA" se refiere
a un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, ácido
(1R,2S)-1-amino-2-etenilciclopropil-carboxílico.
El término "alquilo
(C_{1-8})", como se usa en la presente memoria
descriptiva, solo o en combinación con otro sustituyente, significa
sustituyentes alquílicos lineales o ramificados acíclicos que
contienen de 1 a 8 átomos de carbono e incluyen, por ejemplo,
metilo, etilo, 2-metilhexilo,
1,1-dimetilhexilo (o t-butilo) y
octilo.
El término "cicloalquilo
(C_{3-7})", como se usa en la presente memoria
descriptiva, solo o en combinación con otro sustituyente, significa
un sustituyente cicloalquilo que contiene de 3 a 7 átomos de carbono
e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y
cicloheptilo.
El término "{(alquilo
(C_{1-6})-cicloalquilo
(C_{3-6})}", como se usa en la presente memoria
descriptiva, significa un radical cicloalquilo que contiene de 3 a
6 átomos de carbono directamente unidos a un radical alquileno que
contiene 1 a 6 átomos de carbono; por ejemplo, ciclopropilmetilo,
ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo y ciclohexiletilo. En el caso en
que R^{1A} sea un {alquilo
(C_{1-6})-cicloalquilo
(C_{3-6})}, este grupo está unido al grupo
SO_{2} a través del alquilo (C_{1-6}) (es decir,
la parte de alquileno).
El término "arilo de C_{6} o C_{10}",
tal como se usa en la presente memoria descriptiva, solo o en
combinación con otro radical, significa un grupo monocíclico
aromático que contiene 6 átomos de carbono o un grupo bicíclico
aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo
incluye fenilo, 1-naftilo o
2-naftilo.
El término "O-alquilo
(C_{1-6})", como se usa en la presente memoria
descriptiva, solo o en combinación con otro radical, significa el
radical -O-alquilo (C_{1-6}) en el
que alquilo es como se definió anteriormente que contiene hasta
seis átomos de carbono, e incluye metoxi, etoxi, propoxi,
1-metiletoxi, butoxi y
1,1-dimetiletoxi. Este último radical es conocido
comúnmente como terc-butoxi.
El término "halo", como se usa en la
presente memoria descriptiva, significa un sustituyente halógeno
seleccionado entre bromo, cloro, flúor o yodo.
La expresión "sal farmacéuticamente
aceptable" significa una sal de un compuesto de fórmula (1) que,
dentro del alcance de un criterio médico prudencial, sea adecuada
para ser usado en contacto con los tejidos de seres humanos y
animales inferiores sin una toxicidad excesiva, irritación,
respuesta alérgica y similares, compatible con una relación
ventaja/riesgo razonable, generalmente soluble o dispersable en agua
o aceite, y eficaz para su uso previsto. El término incluye sales
por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables y sales por
adición de bases farmacéuticamente aceptables. Las listas de sales
adecuadas se encuentran, por ejemplo, en la publicación de S.M.
Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pag.
1-19.
La expresión "sal por adición de ácidos
farmacéuticamente aceptable" significa las sales que retienen la
eficacia y las propiedades biológicas de las bases libres y que no
son indeseables biológicamente o en lo demás, formadas con ácidos
inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido
yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido
fosfórico y similares, y ácidos orgánicos como ácido acético, ácido
tricloroacético, ácido trifluoroacético, ácido adípico, ácido
algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico,
ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido
butírico, ácido canfórico, ácido canforsulfónico, ácido cinámico,
ácido cítrico, ácido diglucónico, ácido etanosulfónico, ácido
glutámico, ácido glicólico, ácido glicerofosfórico, ácido
hemisúlfico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido fórmico, ácido
fumárico, ácido 2-hidroxietanosulfónico (ácido
isetiónico), ácido láctico, ácido maleico, ácido hidroximaleico,
ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido
mesitilenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido
naftalenosulfónico, ácido nicotínico, ácido
2-naftalenosulfónico, ácido oxálico, ácido pimoico,
ácido pectínico, ácido fenilacético, ácido
3-fenilpropiónico, ácido pítrico, ácido piválico,
ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico,
ácido succínico, ácido sulfanílico, ácido tartárico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido undecanoico y
similares.
La expresión "sal por adición de bases
farmacéuticamente aceptable" significa las sales que retienen la
eficacia y propiedades biológicas de los ácidos libres y que no son
indeseables biológicamente o en lo demás, formadas con bases
inorgánicas como amoníaco o hidróxido, carbonato o bicarbonato de
amonio o un catión metálico como sodio, potasio, litio, calcio,
magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Son
particularmente preferidas las sales de amonio, potasio, sodio,
calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases no tóxicas
orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de compuestos
de aminas primarias, secundarias y terciarias, compuestos de amina
cuaternaria, aminas sustituidas incluidas las aminas sustituidas que
se producen de forma natural, aminas cíclicas y resinas básicas de
intercambio iónico, como metilamina, dimetilamina, trimetilamina,
etilamina, dietilamina, trietilamina, isopropilamina,
tripropilamina, tributilamina, etanolamina, dietanolamina,
2-dimetilaminoetanol,
2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina,
arginina, histidina, cafeína, hidrabramina, colina, betaína,
etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas,
piperazina, piperidina, N-etilpiperidina,
compuestos de tetrametilamonio, compuestos de tetraetilamonio,
piridina, N,N-dimetilanilina,
N-metilpiperidina, N-metilmorfolina,
diciclohexilamina, dibencilamina,
N,N-dibencilfenetilamina,
1-efenamina,
N,N'-dibenciletilendiamina, resinas de poliaminas y
similares. Las bases no tóxicas orgánicas particularmente
preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina,
trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.
La expresión "agente antiviral", como se
usa en la presente memoria descriptiva, significa un agente
(compuesto o biológico) que es eficaz para inhibir la formación y/o
replicación de un virus en un mamífero. Esto incluye agentes que
interfieren con los mecanismos del hospedante o virales necesarios
para la formación y/o replicación de un virus en un mamífero. Los
agentes antivirales incluyen, por ejemplo, ribavirina, amantadina,
VX-497 (merimepodib, Vertex Pharmaceuticals),
VX-498 (Vertex Pharmaceuticals), Levovirina,
Viramidina, Ceplene (maxamina), XTL-001 y
XTL-002 (XTL Biopharmaceuticals).
La expresión "otro agente
anti-HCV", como se usa en la presente memoria
descriptiva, significa que los agentes son eficaces para disminuir
o prevenir la progresión de síntomas de la enfermedad relacionados
con la hepatitis C. Estos agentes se pueden seleccionar entre:
agentes inmunomoduladores, inhibidores de
NS3-proteasa de HCV o inhibidores de otra diana en
el ciclo vital del HCV.
La expresión "agente inmunomodulador", como
se usa en la presente memoria descriptiva, significa los agentes
(compuestos o biológicos) que son eficaces para aumentar o potenciar
la respuesta del sistema inmune en un mamífero. Los agentes
inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, interferones de clase I
(como \alpha-, \beta- y omega-interferones,
tau-interferones, interferones de consenso y
asialo-interferones), interferones de clase II
(como \gamma-interferones) e interferones
pegilados.
La expresión "inhibidor de
NS3-proteasa de HCV", como se usa en la presente
memoria descriptiva, significa un agente (compuesto o biológico)
que es eficaz para inhibir la función de
NS3-proteasa de HCV en un mamífero. Los inhibidores
de NS3-proteasa de HCV incluyen, por ejemplo, los
compuestos descritos en los documentos WP 99/07733, WO 99/07734, WO
00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 o WO 02/060926, el candidato
clínico de Boehringer Ingelheim identificado como BILN 2061 y el
candidato de pre-desarrollo de Vertex/Eli Lilly
identificado como VX-950 o
LY-570310. En particular, los compuestos nºs 2, 3,
5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71,
91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124,
125, 126 y 127 descritos en la tabla de las páginas
224-226 en el documento WO 02/060926 se pueden
utilizar en combinación con los compuestos de la presente
invención.
La expresión "inhibidor de polimerasa de
HCV", como se usa en la presente memoria descriptiva, significa
un agente (compuesto o biológico) que es eficaz para inhibir la
función de una polimerasa de HCV en un mamífero. Esto incluye, por
ejemplo, inhibidores de polimerasa NS5B de HCV, inhibidores de
polimerasa de HCV incluyen no nucleósidos, por ejemplo los
compuestos descritos en:
- -
- solicitud de EE.UU. nº 10/198.680, que corresponde al documento PCT/CA02/01127, ambas presentados el 18 de julio de 2002 (Boehringer Ingelheim),
- -
- solicitud de EE.UU. nº 10/198.384, que corresponde al documento PCT/CA02/01128, ambas presentados el 18 de julio de 2002 (Boehringer Ingelheim),
- -
- solicitud de EE.UU. nº 10/198.259, que corresponde al documento PCT/CA02/01129, ambas presentados el 18 de julio de 2002 (Boehringer Ingelheim),
- -
- solicitud de EE.UU. nº 10/198.680, que corresponde al documento PCT/CA02/01127, ambas presentados el 18 de julio de 2002 (Boehringer Ingelheim),
- -
- documento WO 02/100846 A1 y documento WO 02/100851 A2 (ambos de Shire),
- -
- documento WO 01/85172 A1 y documento WO 02/098424 A1 (ambos de GSK),
- -
- documento WO 00/06529 y documento WO 02/06246 A1 (ambos de Merck),
- -
- documento WO 01/47883 y documento WO 03/000254 (ambos de Japan Tobacco) y
- -
- documento EP 1 256 628 A2 (Agouron).
Además, otros inhibidores de polimerasa de HCV
también incluyen análogos de nucleósidos, por ejemplo los compuestos
descritos en:
- -
- documento WO 01/90121 A2 (Idenix),
- -
- documento WO 02/069903 A2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.) y
- -
- documentos WO 02/057287 A2 y WO 02/057425 A2 (ambos de Merck/Isis).
Ejemplos específicos de inhibidores de una
polimerasa de HCV incluyen JTK-002,
JTK-003 y JTK-109 (Japan
Tobacco).
La expresión "inhibidor de otra diana en el
ciclo vital de HCV", como se usa en la presente memoria
descriptiva, significa un agente (compuesto o biológico) que es
eficaz para inhibir la formación y/o replicación del HCV en un
mamífero de forma distinta que inhibiendo la función de la
NS3-proteasa del HCV. Esto incluye agentes que
interfieren con los mecanismos virales del hospedante o el HCV
necesarios para la formación y/o replicación del HCV en un
mamífero. Los inhibidores de otra diana en el ciclo vital del HCV
incluyen, por ejemplo, agentes que inhiben una diana seleccionada
entre una helicasa, una NS2/3-proteasa del HCV y un
inhibidor del sitio de entrada ribosomal interno (IRES). Un ejemplo
específico de inhibidores distintos de la diana en el ciclo vital
del HCV incluye ISIS-14803 (ISIS
Pharmaceuticals).
La expresión "inhibidor de HIV", como se
usa en la presente memoria descriptiva, significa un agente
(compuesto o biológico) que es eficaz para inhibir la formación y/o
replicación del HIV en un mamífero. Esto incluye agentes que
interfieren con los mecanismos del hospedante o virales necesarios
para la formación y/o replicación del HIV en un mamífero. Los
inhibidores del HIV incluyen, por ejemplo, inhibidores
nucleosídicos, inhibidores no nucleosídicos, inhibidores de
proteasa, inhibidores de fusión e inhibidores de integrasa.
La expresión "inhibidor de HAV", como se
usa en la presente memoria descriptiva, significa un agente
(compuesto o biológico) que es eficaz para inhibir la formación y/o
replicación del HAV en un mamífero. Esto incluye agentes que
interfieren con los mecanismos del hospedante o virales necesarios
para la formación y/o replicación del HAV en un mamífero. Los
inhibidores del HAV incluyen vacunas de la hepatitis A, por ejemplo,
Havrix® (ClaxoSmithKline), VAQTA® (Merck) y Avaxim® (Aventis
Pasteur).
La expresión "inhibidor de HBV", como se
usa en la presente memoria descriptiva, significa un agente
(compuesto o biológico) que es eficaz para inhibir la formación y/o
replicación del HBV en un mamífero. Esto incluye agentes que
interfieren con los mecanismos del hospedante o virales necesarios
para la formación y/o replicación del HBV en un mamífero. Los
inhibidores del HBV incluyen, por ejemplo, agentes que inhiben la
DNA-polimerasa viral del HBV o vacunas de HBV.
ejemplos específicos de inhibidores del HBV incluyen Lamivudina
(Epivir-HBV®), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC
(Coviracil®), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine®), AM365
(Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-LdC
(Valtorcitabine), ACH-126,443
(L-Fd4C) (Achillion), MCC478 (Eli Lilly), Racivir
(RCV), Fluoro-L y D nucleósidos, Robustaflavona,
ICN 2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos),
XTL-001 (XTL), Imino-azúcares
(Nonyl-DNJ) (Synergy), HpeBzyme; y productos
inmunomoduladores como: interferón alfa 2b, HE2000
(Hollis-Eden), Theradigm (Epimmune), EHT899 (Enzo
Biochem), Thymosin alfa-1 (Zadaxin®), vacuna de DNA
de HBV (PowderJect), vacuna de DNA de HVB (Jefferon Center),
antígeno de HBV (OraGen), BayHpeo B® (Bayer),
Nabi-HB® (Nabi) y Anti-hepatitis B
(Cangene); y productos de vacunas de HBV como los siguientes:
Engerix B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare,
Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac.
La expresión "interferón de clase I", como
se usa en la presente memoria descriptiva, significa un interferón
seleccionado entre un grupo de interferones que se unen todos al
tipo I de receptores. Esto incluye los interferones de clase I
producidos tanto natural como sintéticamente. Ejemplos de
interferones de clase I incluyen \alpha-, \beta- y
omega-interferones,
tau-interferones, interferones de consenso y
asialo-interferones.
La expresión "interferón de clase II", como
se usa en la presente memoria descriptiva, significa un interferón
seleccionado entre un grupo de interferones que se unen todos al
tipo II de receptores. Ejemplos de interferones de clase II
incluyen \gamma-interferones.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden contener uno o más agentes activos adicionales seleccionados,
por ejemplo, entre agentes antivirales, agentes inmunomoduladores,
otros inhibidores de NS3-proteasa de HCV,
inhibidores de polimerasa de HCV, inhibidores de otra diana en el
ciclo vital del HCV, inhibidores de HIV, inhibidores de HAV e
inhibidores de HBV. Ejemplos de estos agentes se proporcionan en la
sección de Definiciones anterior.
Ejemplos preferidos y específicos de algunos de
estos agentes se citan a continuación:
- \sqbullet
- agentes antivirales: ribavirina y amantadina;
- \sqbullet
- agentes inmunomoduladores: interferones de clase I, interferones de clase II e interferones pegilados;
- \sqbullet
- inhibidor de otra diana en el ciclo vital del HCV que inhibe una diana seleccionada entre: NS3-helicasa, NS2/3-proteasa de HCV o un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES);
- \sqbullet
- inhibidores de HIV: inhibidores nucleosídicos, inhibidores no nucleosídicos, inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión e inhibidores de integrasa; o
- \sqbullet
- inhibidores de HBV: agentes que inhiben DNA-polimerasa viral de HBV o es una vacuna de HBV.
Como se expuso anteriormente, la terapia de
combinación está contemplada cuando un compuesto de fórmula (1), o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es administrado
conjuntamente con al menos un agente adicional seleccionado entre:
un agente antiviral, un agente inmunomodulador, otro inhibidor de
NS3-proteasa de HCV, un inhibidor de polimerasa de
HCV, un inhibidor de otra diana en el ciclo vital del HCV, un
inhibidor de HIV, un inhibidor de HAV y un inhibidor de HBV.
Ejemplos de estos agentes se proporcionan en la sección de
Definiciones anterior. Estos agentes adicionales pueden ser
combinados con los compuestos de esta invención para crear una
forma de dosificación farmacéutica única. Alternativamente, estos
agentes adicionales pueden ser separadamente administrados al
paciente como parte de una forma de dosificación múltiple, por
ejemplo, usando un estuche de ensayo. Estos agentes adicionales
pueden ser administrados al paciente antes, simultáneamente o a
continuación de la administración de un compuesto de fórmula (1), o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "tratamiento" significa la administración de un
compuesto o composición según la presente invención para aliviar o
eliminar los síntomas de la enfermedad de la hepatitis C y/o para
reducir el contenido viral en un paciente.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "prevención" significa la administración de un
compuesto o composición según la presente invención con
posterioridad a la exposición del individuo al virus, pero antes de
la aparición de los síntomas de la enfermedad y/o antes de la
detección del virus en la sangre.
Preferentemente, en los compuestos de fórmula 1
como se definió anteriormente, R^{1} es hidroxi, NHSO_{2}Me,
NHSO_{2}-ciclopropilo o NHSO_{2}Ph. Más
preferentemente, R^{1} es NHSO_{2}-ciclopropilo
o NHSO_{2}Ph. Alternativamente, y lo más preferentemente, R^{1}
es hidroxi.
Preferentemente, en los compuestos de fórmula 1
como se definió anteriormente, R^{2} es ciclopentilo o
ciclohexilo. Lo más preferentemente, R^{2} es ciclopentilo.
Preferentemente, R^{3} es
t-butilo o ciclohexilo. Lo más preferentemente,
R^{3} es t-butilo.
Preferentemente, en los compuestos de fórmula 1
como se definió anteriormente, R^{4} es ciclobutilo o
ciclopentilo. Lo más preferentemente, R^{4} es ciclopentilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1 como se definió anteriormente, R^{1} es hidroxi, R^{2} y
R^{4} son cada un ociclopentilo y R^{3} es
t-butilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidróxi, R^{2} es ciclobutilo, R^{3} es
t-butilo y R^{4} es ciclopentilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidroxi, R^{2} es ciclohexilo, R^{3} es
t-butilo y R^{4} es ciclopentilo.
Más preferentemente, R^{1} es NHSO_{2}Ph,
R^{2} y R^{4} son cada uno ciclopentilo y R^{3} es
t-butilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidroxi, R^{2} es ciclopentilo, R^{3} es
t-butilo y R^{4} es ciclobutilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidroxi, R^{2} es ciclopentilo, R^{3} es
t-butilo y R^{4} es ciclohexilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidroxi, R^{2} y R^{4} son cada uno ciclopentilo
y R^{3} es ciclohexilo.
Más preferentemente, en un compuesto de fórmula
1, R^{1} es hidroxi, R^{2}, R^{3} y R^{4} son cada uno
ciclopentilo.
Según una realización alternativa, la
composición farmacéutica de esta invención puede comprender
adicionalmente otro agente anti-HCV. Ejemplos de
agentes anti-HCV incluyen \alpha-(alfa),
\beta-(beta), \delta-(delta), \gamma-(gamma) u
\omega-(omega)-interferón, ribavirina y
amantadina.
Según otra realización alternativa, la
composición farmacéutica de esta invención puede comprender
adicionalmente otro inhibidor de NS3-proteasa de
HCV.
Según todavía otra realización alternativa, la
composición farmacéutica de esta invención puede comprender
adicionalmente un inhibidor de polimerasa de HCV.
Según todavía otra realización alternativa, la
composición farmacéutica de esta invención, puede comprender
adicionalmente un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del
HCV, que incluyen, pero sin limitación, helicasa,
NS2/3-proteasa o sitio de entrada de ribosoma
interno (IRES).
La composición farmacéutica de esta invención
puede ser administrada por vía oral, parenteral o por medio de un
depósito implantado. Se prefiere la administración oral o
administración por inyección. La composición farmacéutica de esta
invención puede contener cualquiera de los excipientes, adyuvantes o
vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos y
convencionales. En algunos casos, el pH de la formulación puede ser
ajustado con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables
para aumentar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de
suministro. El término "parenteral", como se usa en la presente
memoria descriptiva, incluye las técnicas subcutánea, intracutánea,
intravenosa, intramuscular, intra-articular,
intrasinovial, intraesternal, intratecal y de inyección o infusión
intralesional.
La composición farmacéutica puede estar en la
forma de una preparación inyectable esterilizada, por ejemplo, en
forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable esterilizada.
Esta suspensión puede ser formulada según las técnicas conocidas en
el estado de la técnica usando agentes dispersantes o humectantes
adecuados (como, por ejemplo, Tween 80) y agentes suspensores.
La composición farmacéutica de esta invención
puede ser administrada por vía oral en cualquier forma de
dosificación aceptable por vía oral incluidos, pero sin limitación,
cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas. En el
caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que son comúnmente
usados incluyen lactosa y almidón de maíz. Se añaden también
normalmente agentes lubricantes, como estearato de magnesio. Para
una administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes
útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las
suspensiones acuosas se administran por vía oral, el ingrediente
activo se combina con agentes emulsionantes y suspensores. Si se
desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes y/o aromáticos
y/o colorantes.
Otros vehículos o excipientes adecuados para las
formulaciones y composiciones anteriormente indicadas se pueden
encontrar en los textos farmacéuticos estándar, por ejemplo, en
"Remington's Pharmaceuticals Sciences", "The Science and
Practice of Pharmacy", 19º Ed. Mack Publishing Company, Easton,
Penn, (1995).
Los niveles de dosificación entre
aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal
por día, preferentemente entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto
inhibidor de proteasa descrito en la presente memoria descriptiva
son útiles en una monoterapia para la prevención y tratamiento de
una enfermedad mediada por el HCV. Normalmente, la composición
farmacéutica de esta invención se administrará de aproximadamente 1
a aproximadamente 5 veces por día o, alternativamente, en forma de
una infusión continua. Esta administración puede ser usada como una
terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que
puede ser combinado con los materiales excipientes para producir una
forma de dosificación única variará dependiendo del hospedante
tratado y del modo particular de administración. Una preparación
típica contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de
compuesto activo (p/p). Preferentemente, estas preparaciones
contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto
activo.
Como el experto en la técnica apreciará, se
pueden requerir dosis inferiores o superiores a las anteriormente
citadas. La dosificación específica y los regímenes de tratamiento
para cualquier paciente particular dependerán de una diversidad de
factores, incluida la actividad del compuesto específico empleado,
la edad, peso corporal, estado general de salud, sexo, dieta,
tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de
fármacos, la gravedad y el curso de la infección, la disposición
del paciente para la infección y el criterio del facultativo
encargado. Generalmente, el tratamiento se inicia con dosificaciones
pequeñas sustancialmente menores que la dosis óptima del péptido.
Posteriormente, la dosificación se aumenta en pequeños incrementos
hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias. En
general, el compuesto se administra lo más deseablemente a un nivel
de concentración que suministrará generalmente resultados
antivirales eficaces sin provocar efectos secundarios peligrosos o
perjudiciales.
Cuando la composición de esta invención
comprende una combinación de un compuesto de fórmula 1 y uno o más
agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto
como el agente adicional deben estar presentes a niveles de
dosificación entre aproximadamente 10 y 100% y, más preferentemente,
entre aproximadamente 10 y 80% de la dosificación normalmente
administrada en un régimen de monoterapia.
Cuando estos compuestos o sus sales
farmacéuticamente aceptables se formulan junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, la composición resultante puede ser
administrada in vivo a mamíferos, como el hombre, para
inhibir la NS3-proteasa de HCV o para tratar o
prevenir una infección por virus HCV. Este tratamiento se puede
conseguir también usando un compuesto de esta invención en
combinación con agentes que incluyen, pero sin limitación:
\alpha-, \beta-, \delta-, \omega-, tau- o
\gamma-interferón, ribavirina, amantadina; otros
inhibidores de NS3-proteasa de HCV; inhibidores de
polimerasa de HCV, inhibidores de otras dianas en el ciclo vital
del HCV, que incluye, pero sin limitación helicasa,
NS2/3-proteasa o sitio de entrada de ribosoma
interno (IRES); o sus combinaciones. Los agentes adicionales pueden
ser combinados con compuestos de esta invención para crear una
forma de dosificación única. Alternativamente, estos agentes
adicionales pueden ser administrados separadamente a un mamífero
como parte de una forma de dosificación múltiple.
Consecuentemente, otro aspecto de esta invención
facilita un método para inhibir la actividad de
NS3-proteasa de HCV en un mamífero administrando un
compuesto de fórmula 1.
Un aspecto preferido es disminuir la actividad
de NS3-proteasa del virus de la hepatitis C que
infecta a un mamífero.
Si la composición farmacéutica comprende
solamente un compuesto de esta invención como el componente activo,
este método puede comprender adicionalmente la etapa de administrar
a dicho mamífero un agente seleccionado entre un agente
inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de
NS3-proteasa de HCV, un inhibidor de polimerasa de
HCV o un inhibidor de otros agentes en el ciclo vital del HCV como
helicasa, NS2/3-proteasa o IRES. Este agente
adicional puede ser administrado al mamífero antes, simultáneamente
o a continuación de la administración de la composición de esta
invención.
Un compuesto de fórmula 1 expuesto en la
presente memoria descriptiva puede ser usado también como un
reactivo de laboratorio. Un compuesto de esta invención puede ser
usado también para tratar o prevenir la contaminación viral de
materiales y, por lo tanto, reducir el riesgo de infección viral del
personal de laboratorio o médico o de pacientes que entran en
contacto con tales materiales (por ejemplo, sangre, tejido,
instrumentos y vestimentas quirúrgicas, instrumentos y vestimentas
de laboratorio y aparatos y materiales de recogida de sangre).
Un compuesto de fórmula 1 expuesto en la
presente memoria descriptiva puede ser usado también como un
reactivo de investigación.
Un compuesto de fórmula 1 puede ser usado
también como un testigo positivo para validar ensayos basados en
células sustitutivas o en ensayos de replicación viral in
vitro o in vivo.
Detalles adicionales de la invención se ilustran
en los siguientes ejemplos, que debe entenderse que son no
limitativos con respecto a las reivindicaciones anejas.
En general, los compuestos de fórmula 1, y los
intermedios para el mismo, se preparan por métodos conocidos usando
condiciones de reacción que se conoce que son adecuadas para los
reactantes. Varios de estos métodos se describen en los documentos
WO 00/09543, WO 00/09558 y en la patente de EE.UU. nº 6.323.180.
Los compuestos de fórmula I en la que R^{1} es
NHSO_{2}R^{1A}, como se definen en la presente memoria
descriptiva, se preparan acoplando el correspondiente ácido de
fórmula I (es decir, R^{1} es hidroxi) con una sulfonamida
apropiada de fórmula R^{1A}SO_{2}NH_{2} en presencia de un
agente de acoplamiento bajo condiciones estándar. Aunque se pueden
emplear diversos agentes de acoplamiento comúnmente usados, se ha
encontrado que son prácticos TBTU y HATU. Las sulfonamidas están
disponibles en el comercio o se pueden preparar por métodos
conocidos.
Los siguientes esquemas ilustran dos
procedimientos convenientes que usan métodos conocidos para preparar
los compuestos de fórmula 1 cuando R^{1} es OH.
\newpage
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
Las temperaturas se proporcionan en grados
Celsius. Los porcentajes de las soluciones expresan una relación de
peso a volumen, y las relaciones de las soluciones expresan una
relación de volumen a volumen, salvo que se establezca otra cosa.
Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron
en un espectrómetro de 400 MHz Bruker; los desplazamientos químicos
(\delta) se expresan en partes por millón. La cromatografía
rápida se llevó a cabo sobre gel de sílice (SiO_{2}) según la
técnica de cromatografía rápida de Still et al., J. Org.
Chem., (1978), 43, 2923).
Las abreviaturas usadas en los ejemplos
incluyen:
DBU:
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno;
DCM: diclorometano; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIEA:
diisopropiletilamina; DIPEA: diisopropiletilamina; DMF:
N,N-dimetilformamida; DMAP:
4-(dimetilamino)piridina;
EtOAc: acetato de etilo; HATU: [hexafluorofosfato de (O-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio]; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; MS: espectrometría de masas (MALDI-TOF: ionización por disorción láser asistida en matriz - tiempo de vuelo, FAB: bombardeo con átomos rápidos); Me: metilo; MeOH: metanol; Ph: fenilo; T.A.: temperatura ambiente (18 a 22º); terc.butilo o t-butilo: 1,1-dimetiletilo; TBG: terc-butil-glicina: terc-leucina; TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio; TFA: ácido trifluoroacético y THF: tetrahidrofurano.
EtOAc: acetato de etilo; HATU: [hexafluorofosfato de (O-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio]; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; MS: espectrometría de masas (MALDI-TOF: ionización por disorción láser asistida en matriz - tiempo de vuelo, FAB: bombardeo con átomos rápidos); Me: metilo; MeOH: metanol; Ph: fenilo; T.A.: temperatura ambiente (18 a 22º); terc.butilo o t-butilo: 1,1-dimetiletilo; TBG: terc-butil-glicina: terc-leucina; TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio; TFA: ácido trifluoroacético y THF: tetrahidrofurano.
El intermedio de dipéptido 15 (Esquema 2) y
2-carbometoxi-4-hidroxi-7-metoxiquinolina
9 (Esquema 1) se sintetizaron según los métodos descritos en el
documento WO 00/09543.
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Una mezcla de Boc-hidroxiprolina
(50,0 g, 216 mmol), éster metílico de vinil-ACCA
(42,25 g, 238 mmol, 1,1 equiv.), TBTU (76,36 g, 238 mmol) 1,1
equiv.) y DIPEA (113 ml, 649 mmol, 3 equiv.) en DMF (800 ml) se
agitó a T.A. bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de 3,5 h, el
disolvente se evaporó y el residuo se extrajo con EtOAc. El
extracto se lavó con ácido clorhídrico (10%), bicarbonato de sodio
saturado y salmuera. La fase orgánica se secó seguidamente sobre
sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó para suministrar un
aceite. Después de secar durante una noche bajo alto vacío, se
obtuvo el dipéptido 1 en forma de una espuma amarilla (72,0 g, 94%,
pureza > 95% por HPLC).
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\vskip1.000000\baselineskip
El dipéptido 1 (72,0 g, 203 mmol),
trifenilfosfina (63,9 g, 243,8 mmol, 1,2 equiv.) y ácido
4-nitrobenzoico (41,08 g, 245,8 mmol, 1,2 equiv.)
se disolvieron en THF seco (1,4 l). La solución agitada se enfrió a
0ºC bajo una atmósfera de nitrógeno. Seguidamente se añadió gota a
gota azodicarboxilato de dietilo (38,4 ml, 244 mmol, 1,2 equiv.)
durante 45 minutos y la reacción se dejó calentar a T.A. Después de
4 h, el disolvente se evaporó. El residuo se dividió en cuatro
partes. Cada una de estas se purificó por cromatografía sobre gel
de sílice fina (malla 10-40 \mum, diámetro de la
columna 12 cm, longitud de la columna 16 cm) usando un gradiente de
2:1 hexano/EtOAc a 1:1 de hexano/EtOAc hasta EtOAc puro. De esta
manera, se obtuvo éster de Boc-dipéptido 2 en forma
de un sólido blanco amorfo después de evaporar los disolventes y
secar los residuos bajo alto vacío a 70ºC durante 1 h (108,1 g,
cuantitativo-105%). Una solución de cloruro de
hidrógeno 4 N en dioxano se añadió al éster de
Boc-dipéptido 2 (108 g, 243 mmol) dando lugar a una
solución incolora. La solución se agitó a T.A. durante 1 h. El
disolvente se evaporó y el residuo se colocó bajo alto vacío durante
3 h suministrando la sal de hidrocloruro del compuesto 3 en forma
de un sólido amorfo. El sólido se usó como tal.
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\vskip1.000000\baselineskip
A 0ºC, se añadieron a una solución de éster
metílico de terc-butil-glicina (590
mg, 3,25 mmol) en THF (8 ml): cloroformiato de vinilo (0,55 ml,
6,47 mmol) y trietilamina (1,5 ml, 8,25 mmol). La temperatura se
dejó elevar a T.A. La solución se agitó durante 16 h. La solución
se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc. La solución de
EtOAc se lavó con solución acuosa al 10% de ácido cítrico (2x), una
solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x) y salmuera, se secó y
se concentró para producir el correspondiente carbamato de vinilo
(608 mg) en forma de un aceite incoloro. El aceite se disolvió en
DCM (4 ml), se enfrió a 0ºC y se añadieron diyodometano (0,15 ml,
1,86 mmol) y dietil-cinc (95 \mul, 0,93 mmol).
Apareció un sólido blanco en primer lugar pero se disolvió con el
tiempo (\sim 1 h). La suspensión/solución se agitó a T.A. durante
5 h. Se añadió una solución saturada de cloruro de amonio y la
solución se extrajo con EtOAc (2x). El extracto orgánico se secó
(MgSO_{4}) y se concentró. El residuo se purificó por
cromatografía de columna rápida. Una elución con hexano:EtOAc 95:5
proporcionó el correspondiente éster metílico en forma de un aceite
incoloro (96 mg, 90% de rendimiento). Una solución del éster
metílico (93 mg; 0,45 mmol) en THF (5 ml), MeOH (1 ml) y una
solución acuosa de LiOH (45 mg; 1,81 mmol) en agua (2 ml) se agitó
durante 4 h. La solución se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc
(2x). La solución acuosa se acidificó mediante la adición de HCl 1
N, y la solución ácida se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos
orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
evaporaron para obtener el carbamato deseado 4a en forma de un
sólido blanco (53 mg; 60% de
rendimiento).
rendimiento).
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Se añadió THF (350 ml) a un matraz que contenía
éster ciclopentílico y éster
2,5-dioxo-pirrolidin-1-ílico
de ácido carbónico (9,00 g; 39,6 mmol) y
terc-butil-glicina (6,24 g; 47,5
mmol) dando lugar a una suspensión. Se añadió agua destilada (100
ml) con agitación vigorosa. Una pequeña cantidad de sólido
permanecía sin disolver. Seguidamente se añadió trietilamina (16,6
ml; 119 mmol) dando lugar a una solución homogénea que se agitó a
T.A. Después de 2,5 h, el THF se evaporó y el residuo acuoso se
diluyó con agua (100 ml). La reacción se hizo básica mediante la
adición de NaOH 1 N (25 ml - pH final > 10). La solución se lavó
con EtOAc (2 x 200 ml) y la fase acuosa se acidificó con HCl 1 N
(aprox. 70 ml - pH final < 2). La solución turbia se extrajo con
EtOAc (200 + 150 ml). El extracto se secó (MgSO_{4}) y se evaporó
para proporcionar carbamato 4b en forma de un sólido blanco
(8,68 g).
(8,68 g).
\newpage
Usando el procedimiento descrito anteriormente y
usando combinaciones apropiadas de
terc-butil-glicina,
ciclopentil-glicina o
ciclohexil-glicina y éster ciclobutílico,
ciclopentílico, ciclohexílico o
2,5-dioxo-pirrolidin-1-ílico
de ácido carbónico, se prepararon los carbamatos de las fórmulas
siguientes:
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\vskip1.000000\baselineskip
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Una solución de sal de hidrocloruro de éster
bencílico de terc-butil-glicina
(2,55 g; 9,89 mmol) en THF (20 ml) y piridina (2,0 ml; 24,73 mmol)
se enfrió a 0ºC. Se añadió gota a gota cloroformiato de fenilo (1,30
ml; 10,19 mmol) a la solución enfriada. La suspensión resultante se
agitó durante 5 minutos a 0ºC y seguidamente a T.A. durante 1,5 h.
La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se lavó con ácido cítrico
al 10% (2x), agua (2x), NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y
salmuera (1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para
obtener el compuesto en bruto en forma de un aceite casi incoloro
(3,73 g; > 100%; supuestamente 9,89 mmol). El producto en bruto
(1,01 g; 2,97 mmol) se disolvió en DMSO (6,5 ml) y se añadió gota a
gota ciclopentilamina. La mezcla de reacción se agitó a T.A.
durante 45 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc. La
fase orgánica se lavó con ácido cítrico al 10% (2x), agua (2x),
NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para proporcionar el producto
en bruto de ciclopentilurea-Tbg-OBn
en forma de un aceite casi incoloro. El material en bruto se
purificó por cromatografía de columna rápida con sílice usando
hexano:EtOAc 9:1 para separar las impurezas menos polares y 7:3 para
eluir el producto purificado en forma de un aceite incoloro espeso
(936 mg; 95%). El producto de éster bencílico (936 mg, 2,82 mmol) se
desprotegió bajo un balón relleno de hidrógeno a T.A. en solución
de etanol absoluto (15 ml) agitando la solución con 10% de Pd/C
(93,6 mg) durante 5,5 h. La mezcla de reacción se filtró a través de
un filtro de 0,45 micrómetros y se evaporó hasta sequedad para
proporcionar la urea 5 en forma de un sólido blanco (668,8 mg;
98%).
H^{1} RMN (400
MHz,DMSO-d_{6}): \delta 12,39 (s, 1H), 6,09 (d,
J = 7,4 Hz, 1H), 5,93 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,90 (d, J = 9,4 Hz,
1H), 3,87-3,77 (m, 1H), 1,84-1,72
(m, 2H), 1,63-1,42 (m, 4H),
1,30-1,19 (m, 2H), 0,89 (s, 9H).
M.S.(electropulverización): 241,0
(M-H)- 243,0 (M+H)+. Homogeneidad de HPLC de fase
inversa (0.06% TFA; CH_{3}CN : H_{2}O) : 99%.
El carbamato 4b (6,15 g, 22,5 mmol) y TBTU (7,72
g, 24,7 mmol) se pusieron en suspensión en DCM y la suspensión se
agitó rápidamente. Se añadió DIPEA (3,92 ml, 22,5 mmol) a T.A. y
después de 10 minutos la reacción era casi homogénea. Seguidamente
se vertió en la reacción una solución de dipéptido 3 (10,39 g, 23,6
mmol) en DCM anhidro (100 ml) que contenía DIPEA (4,11 ml, 23,62
mmol). La solución amarilla resultante se dejó agitar durante 14 h.
El disolvente se evaporó seguidamente produciendo un jarabe amarillo
que se extrajo con EtOAc (300 + 150 ml) y se lavó con HCl 0,05 N (2
x 200 ml), Na_{2}CO_{3} saturado (300 ml) y salmuera (150 ml).
Los extractos combinados se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron
para producir el tripéptido 6 en forma de una espuma amarilla
pálida (15,68 g, cuantitativo).
El tripéptido 6 (15,68 g) se disolvió en THF
(200 ml) y se añadió agua (30 ml). La solución resultante se enfrió
a 0ºC y se añadió una solución de monohidrato de hidróxido de litio
(1,18 g, 28,12 mmol) durante 3 minutos con agitación vigorosa.
Después de 3 h a 0ºC, la base en exceso se neutralizó con HCl 1 N
(pH final de aprox. 6) y el THF se evaporó, dando lugar a una
suspensión acuosa (goma amarilla). La mezcla se extrajo con EtOAc
(2 x 200 ml) y se lavó con NaHCO_{3} saturado (2 x 300 ml). Los
extractos combinados se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron
para producir una espuma amarilla pálida. Una cromatografía rápida
de la espuma sobre gel de sílice usando EtOAc como eluyente
proporcionó 7 en forma de un sólido amorfo blanco (9,77 g,
91%).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de isotiocianato de
ter-butilo (5,0 ml; 39,4 mmol) en DCM (200 ml) se
añadió ciclopentilamina (4,67 ml; 47,3 mmol) y seguidamente DIEA, y
la mezcla de reacción se agitó a T.A. durante 2 h. La mezcla se
diluyó con EtOAc, se lavó con una solución acuosa al 10% de ácido
cítrico (2x), NaHCO_{3} saturado (2x), H_{2}O (2x) y salmuera
(1x). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, se filtró y
se evaporó para producir
N-terc-butil-N'-ciclopentil-tiourea
en forma de un sólido blanco (3,70 g; rendimiento de 47%). La
N-terc-butil-N'-ciclopentil-tiourea
(3,70 g) se disolvió en HCl concentrado (46 ml). La solución
amarilla oscura se calentó a reflujo suave. Después de 40 minutos,
la mezcla de reacción se dejó enfriar a T.A. y posteriormente se
enfrió en hielo y se hizo básica a pH 9,5 con sólido y una solución
acuosa saturada de NaHCO_{3}. El producto se extrajo en EtOAc
(3x). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con H_{2}O (2x)
y salmuera (1x). La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y
se concentró para producir un sólido color beige (2,46 g en bruto).
La trituración del material en bruto en hexano/EtOAc 95/5
proporcionó, después de filtrar, la
N-ciclopentilurea 8a en forma de un sólido blanco
(2,38 g, 90% de rendimiento).
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta 7,58 (bs, 1H), 7,19 (bs,
1H), 6,76 (bs, 1H), 4,34 (bs, 1H), 1,92-1,79 (m,
2H), 1,66-1,55 (m, 2H), 1,55-1,30
(m, 4H). MS; es^{+} 144.9(M + H)^{+}, es^{-}:
142,8 (M - H)^{-}.
Usando el procedimiento anteriormente descrito y
usando ciclobutilamina disponible en el comercio en lugar de
ciclopentilamina, se produjo la tiourea 8b:
Usando el procedimiento anteriormente descrito y
usando ciclohexilamina disponible en el comercio en lugar de
diclopentilamina, se produjo la tiourea 8c:
A una solución de KSCN (4,60 g; 47,33 mmol) en
acetona (35 mml) a 0ºC, se añadió gota a gota cloruro de benzoilo
(5,0 ml; 43,03 mmol). La solución lechosa se agitó en un baño con
hielo durante 1,5 h y seguidamente se añadió gota a gota
ciclopropilamina (3,2 ml; 46,0 mmol). La mezcla de reacción se agitó
durante 1,5 h a 0ºC y seguidamente se añadió más ciclopropilamina
(0,50 ml, 7,22 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a T.A. durante
30 minutos adicionales. La mezcla de reacción se vertió en
hielo/H_{2}O (300 ml), se agitó durante 5 minutos y el sólido
amarillo luminoso se filtró y se lavó varias veces con H_{2}O y se
secó para proporcionar
N-benzoil-N'-ciclopropil-tiourea
(6,62 g). La tiourea se puso en suspensión en una solución de NaOH
2 N (50 ml) y se calentó a reflujo durante 15 minutos. La solución
se enfrió a T.A., se saturó con NaCl sólido y se extrajo con EtOAc
(3x). Los extractos combinados de EtOAc se lavaron con H_{2}O
(2x) y salmuera (1x), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
evaporaron para proporcionar el producto en bruto en forma de un
sólido blanco apagado. El sólido se trituró en hexano/EtOAc 5/5
para proporcionar la
N-ciclopropil-tiourea 8d en forma de
un sólido cristalino blanco (2,5 g; 50% de
rendimiento).
rendimiento).
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta 7,92 (bs, 1H), 7,61 (bs,
1H), 7,13 (bs, 1H), 2,39 (bs, 1H), 0,67-0,63 (m,
2H), 0,51-0,44 (m, 2H).
MS; es^{+} 116,9 (M + H)^{+},
es^{-}: 114,8 (M - H)^{-}
\newpage
Ejemplo
1
Etapa
1
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\vskip1.000000\baselineskip
Al tripéptido 1 (1,0 g; 2,09 mmol) disuelto en
THF (35 ml) se añadieron hidroquinolina 9 (729 mg; 3,13 mmol) y
trifenilfosfina (1,1 g; 4,2 mmol). La suspensión amarilla se enfrió
en un baño con hielo y se añadió gota a gota DIAD (821 \mul, 4,2
mmol). La solución se agitó a la temperatura de un baño con hielo
durante 30 minutos y a T.A. durante 16 h. La solución se evaporó
hasta sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con
solución saturada de bicarbonato de sodio (2x), agua (2x) y salmuera
(1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para obtener un
aceite amarillo que precipitó en reposo. El sólido en bruto se puso
en suspensión en DCM y el material insoluble se separó por
filtración. La solución se concentró y el residuo se purificó por
cromatografía rápida en hexano:EtOAc; 5:5, para separar todas las
impurezas menos polares y en CHCl_{3}:EtOAc; 80:20 hasta que se
había eluido todo el Ph_{3}P=O. El compuesto deseado se eluyó con
CHCl_{3}:EtOAc; 65:35 en forma de un sólido blanco (1c; 70%
de
rendimiento).
rendimiento).
M.S.(electropulverización): 693.3
(M-H)- 695.4 (M+H)+ 717.4 (M+Na)+
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0,06% de
TFA; CH_{3}CN:H_{2}O):99%.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El tripéptido 10 (1 g; 1,44 mmol) se disolvió en
THF (10 ml) y se añadieron MeOH (5 ml), agua (5 ml) y una solución
acuosa 1 N de NaOH (1,5 ml) y la solución se agitó a T.A. durante 2
h. La mezcla se evaporó hasta sequedad y seguidamente se evaporó
conjuntamente con MeOH:tolueno (1:1; 4x), tolueno (2x) y dietil-éter
(2x) para obtener el producto (exento de agua) en forma de un
sólido escamoso blanco (1,04 g; 100% de rendimiento).
M.S.(electropulverización): 679.3
(M-H)- 681.3 (M+H)+ 703.3 (M+Na)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0,06% de
TFA; CH_{3}CN:H_{2}O):95%.
\newpage
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió sal de sodio 11 (supuestamente 1,44
mmol) en THF (16 ml), se añadió trietilamina (301 \mul; 2,16
mmol) y la solución se enfrió a 0ºC. Se añadió gota a gota
cloroformiato de isobutilo (280 \mul; 2,16 mmol) y la suspensión
blanca se agitó a 0ºC durante 75 minutos y seguidamente se añadió
una solución de diazometano (0,67 M en dietil-éter; 13 ml; 8,64
mmol). La mezcla de reacción se agitó 1 h a 0ºC, 45 minutos a T.A. y
se evaporó para proporcionar una suspensión espesa. Esta suspensión
se disolvió en EtOAc y agua. La solución orgánica se lavó con
NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para proporcionar el producto
de diazocetona en forma de un sólido color marfil (el material en
bruto se usó para la siguiente etapa; supuestamente
1,44 mmol).
1,44 mmol).
M.S.(electropulverización): 703.3
(M-H)- 705.3 (M+H)+. Homogeneidad de HPLC de fase
inversa (0.06% TFA; CH_{3}CN: H_{2}O) : 91%.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A 0ºC, a una solución de diazocetona 12 (1,44
mmol) en THF (24 ml) se añadió gota a gota una solución de HBr (1,0
ml) y la mezcla se agitó durante 1 h. La solución se diluyó con
EtOAc, se lavó con una solución saturada de NaHCO_{3} (2x), agua
(2x) y salmuera (1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó
para proporcionar la bromocetona deseada en forma de un sólido
color marfil-beige (1,1 g; supuestamente 1,44
mmol).
M.S. (electropulverización): 757,3 (M), 759,3
(M+2).
\newpage
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron
\alpha-bromocetona 13 (0,40 mmol) y
N-ciclopentiltiourea (68,5 mg; 0,48 mmol) en
isopropanol (15 ml) y la solución amarilla se calentó a 70ºC
durante 75 minutos. La solución se dejó enfriar a T.A. y se evaporó
hasta sequedad. El residuo se disolvió en EtOAc. La solución se lavó
con NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró para proporcionar el producto
en forma de una espuma naranja-marrón. Una
cromatografía de columna rápida en hexano:EtOAc 7:3 separó las
impurezas menos polares y una con 6:4 recuperó el compuesto deseado
en forma de una espuma amarilla luminosa (218 mg; 69%).
M.S.(electropulverización): 801.4
(M-H)- 803.4 (M+H)+ 825 (M+Na)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 99%.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de éster metílico 14 (145 mg; 0,181
mmol) en THF (3 ml), MeOH (1,5 ml) y una solución acuosa de LiOH
(75,8 mg; 1,81 mmol) en agua (1,5 ml) se agitó durante 18 h. La
solución orgánica se concentró para proporcionar una suspensión
blanca apagada que se diluyó con EtOAc y salmuera para obtener una
solución total. El pH se ajustó a 6 mediante la adición de HCl 1 N
y la capa orgánica se extrajo adicionalmente con EtOAc (2x). Los
extractor orgánicos combinados se lavaron con agua (2x), salmuera
(1x), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron para
proporcionar el compuesto deseado en forma de un sólido amarillo
(138,2 mg, 97% de
rendimiento).
rendimiento).
El compuesto 100 (138,2 mg; 0,175 mmol) se
disolvió en MeOH (30 ml) y se añadió 1 equivalente de NaOH 0,01 N
(17,5 ml). La solución amarilla transparente se concentró para
separar MeOH y se diluyó con agua, se congeló y se liofilizó para
obtener el producto (sal de Na) en forma de un sólido amorfo
amarillo (139 mg; rendimiento teórico: 142 mg; P.M. de la sal de
Na: 810,95).
M.S.(electropulverización): 787.2
(M-H)- 789.3 (M+H)+ 811.3 (M+Na)+. Homogeneidad
de HPLC de fase inversa (0.06% TFA; CH_{3}CN : H_{2}O):
98%.
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox. 5:1;
\delta 8,14 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 6,7
Hz, 1H), 7,49-7,36 (m, 2H), 7,27 (bs, 1H),
7,06-6,96 (m, 2H), 6,10-5,90 (m,
1H), 5,33 (s, 1H), 5,01 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 4,84 (d, J = 10,6
Hz, 1H), 4,79-4,65 (m, 1H),
4,47-4,40 (m, 1H), 4,30 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 4,15
(d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,00-3,85 (m, 2H), 3,90 (s,
3H), 2,37-2,26 (m, 1H), 2,15-1,91
(m, 2H), 1,80-1,23 (m, 18H), 0,96 y 0,86 (2x s,
9H).
Ejemplo
2
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 1 y usando
N-ciclobutil-tiourea 8b en lugar de
usar N-ciclopentil-tiourea 8a en la
etapa 5 se dio lugar al compuesto 101 en forma de la sal de TFA:
H^{1} RMN (400
MHz,DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox.
90:10, descripción de isómeros principales; \delta 8,59
(s, 1H), 8,45-8,39 (m, 1H), 8,25 (bs, 1H), 8,20 (d,
J = 9,2 Hz, 1H), 7,84 (bs, 1H), 7,74 (s, 1H),
7,32-7,26 (m, 1H), 7,01 (d, J = 8,3 Hz, 1H),
5,78-5,66 (m, 2H), 5,20 (dd, J = 17,0, 1,6 Hz, 1H),
5,09-5,04 (m, 1H), 4,53-4,36 (m,
4H), 4,05-3,92 (m, 2H), 3,97 (s, 3H),
2,63-2,55 (m, 1H), 2,44-2,29 (m,
3H), 2,07-1,95 (m, 3H), 1,79-1,23
(m, 12H), 0,96 (s, 9H).
M.S.(electropulverización): 773.4
(M-H)- 775.4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 98%
Ejemplo
3
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 1 y usando
N-ciclohexil-tiourea 8c en lugar de
usar N-ciclopentil-tiourea 8a en la
etapa 5 se dio lugar al Compuesto 102 en forma de la sal de TFA:
H^{1} RMN (400
MHz,DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox.
90:10, descripción del isómero principal; \delta 8,61 (s,
1H), 8,26-8,17 (m, 2H), 8,13-8,04
(m, 1H), 7,81 (bs, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,32-7,24 (m,
1H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,78-5,65 (m, 2H),
5,23-5,15 (m, 1H), 5,09-5,03 (m,
1H), 4,51-4,43 (m, 3H), 4,05-3,77
(m, 3H), 3,97 (s, 3H), 2,64-2,55 (m, 1H),
2,38-2,27 (m, 1H), 2,05-1,95 (m,
3H), 1,79-1,71 (m, 2H), 1,66-1,19
(m, 16H), 0,96
(s, 9H).
(s, 9H).
M.S.(electropulverización): 801,4
(M-H)- 803,4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 99%
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El Compuesto 100 (30 mg, 0,038 mmol) se combinó
con HATU (17 mg, 0,045 mmol) y se disolvió en DMF anhidra (4 ml).
La solución se agitó a T.A. antes de que se añadiera gota a gota
DIPEA (26 \mul, 0,15 mmol) durante aprox. 1 minuto. La mezcla se
agitó durante 60 minutos a T.A. y se analizó por HPLC analítica en
cuanto a la formación del éster activado. A continuación de esto,
se añadió una solución de bencenosulfonamida (23 mg, 0,15 mmol),
DMAP (17 mg, 0,14 mmol) y TBU (22 \mul, 0,15 mmol) en DMF (1 ml).
La mezcla de reacción se agitó 24 h a T.A. antes de ser vertida en
EtOAc (50 ml) y se lavó con soluciones saturada de NaHCO_{3} y
saturada de salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se
filtró y se concentró. El residuo se reconstituyó en DMSO y se
purificó por HPLC preparativa. Una liofilización proporcionó el
producto final (17 mg, 48%) en forma de un sólido amorfo
amarillo
pálido.
pálido.
H^{1} RMN (400 MHz, DMSO-d6),
\delta 10,89 (s, 1H), 8,84 (s, 1H), 8,20 (d, J = 8,8 Hz,
1H), 8,18-8,08 (m, 2H), 7,89 (d, J = 7,6 Hz,
2H), 7,70 (dd, J = 7,6, 7,6 Hz, 2H), 7,58 (dd, J =
7,7, 7,7 Hz, 2H), 7,28 (bs, 1H), 7,11 (d, J = 6,6 Hz, 1H),
5,75 (bs, 1H), 5,37-5,25 (m, 1H), 5,12 (d, J
= 17 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 12 Hz, 1H),
4,58-4,42 (m, 3H), 4,24 (bs, 1H), 4,05 (d, J
= 7,8 Hz, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,93 (d, J = 7,8 Hz, 1H),
2,69-2,61 (m, 1H), 2,35-2,21 (m,
1H), 2,13-1,98 (m, 3H), 1,78-1,68
(m, 4H), 1,68-1,51 (m, 8H),
1,50-1,41 (m, 4H), 1,29-1,22 (m,
1H), 0,99
(s, 9H).
(s, 9H).
MS (electropulverización): 928,5 (M + H)+, y
926,5 (M-H)-.
RP-HPLC: Rt = 7,3 minutos
(homogeneidad = 99%).
Usando la secuencia sintética mostrada en el
Esquema 2, se prepararon los siguientes compuestos:
\newpage
Ejemplo
5
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió dipéptido 15 (4,0 g; 7,02 mmol) en
THF (20 ml), MeOH (10 ml) y agua (10 ml) y se añadió una solución
acuosa 1 N de NaOH (1,05 equivalentes; 7,4 ml). La solución se agitó
a T.A. durante 2,75 h. La mezcla se evaporó hasta sequedad. El
residuo se diluyó con agua, se congeló y se liofilizó para
proporcionar la sal de sodio 16 en forma de un sólido amorfo blanco
(4,28 mg).
M.S.(electropulverización): 554.2
(M-H)- 556.3 (M+H)+ 578.2 (M+Na)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 96%.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La sal de sodio 16 (supuestamente 7,02 mmol) se
disolvió en THF (78 ml); se añadió trietilamina (1,37 ml, 9,83
mmol) y la solución se enfrió a 0ºC. Se añadió gota a gota
cloroformiato de isobutilo (1,28 ml; 9,83 mmol) y la suspensión
blanca se agitó a 0ºC durante 2 h, y seguidamente se añadió una
solución de diazometano (0,67 M en dietil-éter; 63 ml; 42,13 mmol).
La mezcla de reacción se agitó 1 h a 0ºC, 1,25 h a T.A. y se evaporó
para proporcionar una suspensión espesa. Esta suspensión se
disolvió en EtOAc y agua. La solución orgánica se lavó con
NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para proporcionar la
diazocetona 17 en forma de un sólido color beige (material en bruto
usado para la siguiente etapa; supuestamente
7,02 mmol).
7,02 mmol).
M.S.(electropulverización: 578.2
(M-H)- 580.3 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0,06% de
TFA; CH_{3}CN:H_{2}O): 90%.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Etapa
3
A 0ºC, a una solución de diazocetona
(supuestamente 1,44 mmol) en THF (116 ml) se añadió gota a gota una
solución acuosa al 48% de HBr (5,1 ml) y la mezcla se agitó durante
2 h. La solución se diluyó con EtOAc, se lavó con una solución
saturada de NaHCO_{3} (2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se evaporó para proporcionar la
bromocetona deseada en forma de un sólido color beige (4,25 g; 6,72
mmol).
M.S. (electropulverización): 632 (M) 634,2
(M+2).
Etapa
4
Se disolvieron
\alpha-bromocetona 18 (512 mg; 0,81 mmol) y
N-ciclopentiltiourea (128,4 mg; 0,89 mmol) en
isopropanol (20 ml). La solución amarilla resultante se calentó a
70ºC durante 1,5 h. La solución se dejó enfriar a T.A. y se evaporó
hasta sequedad. El residuo se diluyó con EtOAc. La solución de EtOAc
se lavó con NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x),
se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para proporcionar el
producto en forma de una espuma color
naranja-marrón. Una cromatografía en columna rápida
en hexano:EtOAc 7:3 separó las impurezas menos polares y con 6:4 se
recuperó el compuesto deseado en forma de un sólido amarillo
luminoso (411,5 mg; 75%).
M.S. (electropulverización): 676,3
(M-H)- 678,3 (M+H)+
Homogeneidad HPLC de fase inversa (0,06% TFA;
CH_{3}CN:H_{2}O): 99%.
Etapa
5
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el Boc-dipéptido
(32,6 g; 0,048 mmol) en HCl/dioxano 4 N (3 ml) y se agitó a T.A.
Después de 2 h, la mezcla de reacción fue tratada evaporando hasta
sequedad. La sal de HCl se obtuvo así en forma de un sólido color
blanco apagado. La sal de HCl se sometió a alto vacío durante 30
minutos. A una solución de la sal de HCl en DCM (2 ml) y DIEA (33
\mul; 0,192 mmol) se añadió urea 5 (13,96 mg; 0,058 mmol), y
seguidamente un agente de acoplamiento de HATU (21,90 mg; 0,058
mmol). La mezcla de reacción se agitó a T.A. durante 3 h. La mezcla
de reacción se diluyó con EtOAc, se lavó con NaHCO_{3} saturado
(2x), agua (2x) y salmuera (1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y
se evaporó para proporcionar el producto en bruto en forma de un
aceite espeso amarillo (supuestamente
0,048 mmol).
0,048 mmol).
M.S. (electropulverización): 800,4
(M-H)- 802,4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0,06% TFA;
CH_{3}CN:H_{2}O): 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de éster metílico 20 (77,80 mg;
0,097 mmol) en THF (2 ml) y MeOH (1 ml) y una solución acuosa de
LiOH (40,7 mg; 0,97 mmol) en agua (1 ml) se agitó durante 16 h. La
solución orgánica se concentró para proporcionar una suspensión
color blanco apagado. El material en bruto se purificó por HPLC
preparatoria (YMC Combiscreen ODS-AQ, 50 x 20 mm ID
S-5 micrómetros, 120A; \lambda=220 nm) usando un
gradiente lineal y 0,06% de TFA CH_{3}CN/H_{2}O. Las fracciones
puras se combinaron, se concentraron y se convirtieron en la sal
de
sodio.
sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones concentradas se diluyeron con
EtOAc y unos pocos ml de salmuera (basificadas a pH \sim 13 con
NaOH 5 N y seguidamente neutralizadas a pH 5,5-6,0
con HCl 1 N). El producto se extrajo con EtOAc (3x), se lavó con
agua (2x) y salmuera (1x), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se
evaporó hasta sequedad para proporcionar el producto neutro en
forma de un sólido amarillo (52,7 mg; 70%). El producto neutro (49,4
mg; 0,0627 mmol) se disolvió en MeOH (10 ml) y se añadió 1
equivalente de NaOH 0,01 N (6,27 ml). La solución amarilla
transparente se concentró para separar MeOH y se diluyó con agua,
se congeló y se liofilizó para proporcionar el producto (sal de Na)
en forma de un sólido amorfo amarillo (50,8 mg; rendimiento teórico:
50,8 mg; p.m. de la sal de Na:
809,75).
809,75).
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox. 8:1;
\delta 8,20 (bs, 1H), 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 5,7
Hz, 1H), 7,51-7,47 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 6,97 (d,
J = 8,6 Hz, 1H), 6,19-6,02 (m, 1H), 5,33 (bs, 1H),
4,99 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 10,0 Hz, 1H),
4,52-4,41 (m, 2H), 4,34 (d, J = 11,0 Hz, 1H),
4,04-3,96 (m, 2H), 3,89 (s, 3H),
3,79-3,68 (m, 1H), 3,68-3,15 (bajo
pico de agua, 2H), 2,45-2,36 (m, 1H),
2,05-1,92 (m, 2H), 1,82-1,35 (m,
16H), 1,35-1,12 (m, 2H), 0,91 y 0,84 (2x s,
9H).
M.S.(electropulverización): 786.4
(M-H)- 788.3 (M+H)+ 810 (M+Na)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 99%.
\newpage
Ejemplo
6
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 5 y usando el ciclobutil-carbamato de
terc-butil-glicina en la Etapa 5 en
lugar de urea 5 y purificando el ácido carboxílico en bruto después
de la Etapa 6 por HPLC, se proporcionó el compuesto del título en
forma de una sal de TFA:
H^{1} RMN (400
MHz,DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox. 7:1;
\delta 8.09 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,0Hz, 1H), 7,88 (d, J = 6,5
Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,28 (d, J = 2,3 Hz, 1H),
7,16-7,08 (m, 1H), 7,07-7,00 (m,
1H), 6,10-5,95 (m, 1H), 5,32 (bs, 1H), 5,00 (d, J =
17,2 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,64-4,52
(m, 1H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,29 (d, J = 11,7 Hz,
1H), 4,12 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,97-3,85 (m, 2H),
3,91 (s, 3H), 2,36-2,27 (m, 1H),
2,18-2,04 (m, 2H), 2,03-1,81 (m,
6H), 1,77-1,43 (m, 9H), 1,41-1,34
(m, 1H), 0,96 y 0,85 (2x s, 9H).
M.S.(electropulverización): 773,3
(M-H)- 775,4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 99%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 5 y usando el ciclohexil-carbamato de
terc-butil-glicina en la Etapa 5 en
lugar de urea 5, se suministró el compuesto del título en forma de
sal de sodio:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox. 5:1;
\delta 8,29 (bs, 1H), 8,02 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 6,5
Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,27 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,05
(d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 2,0, 9,0 Hz, 1H), 5,89 (bs, 1H),
5,34 (s, 1H), 5,08 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 9,4 Hz, 1H),
4,43 (dd, J = 8,4, 16,8 Hz, 1H), 4,36-4,24 (m, 1H),
4,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,00-3,86 (m, 3H), 3,89
(s, 3H), 2,35-2,23 (m, 1H),
2,04-1,91 (m, 5H), 1,79-1,41 (m,
10H), 1,39-1,08 (m, 7H), 0,97 y 0,86 (2x s,
9H).
M.S.(electropulverización): 801,4
(M-H)- 803,4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 98%.
Ejemplo
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 5 y usando el ciclopentil-carbamato de
ciclohexil-glicina en la Etapa 5 en lugar de urea
5, se suministró el compuesto del título en forma de la sal de
sodio:
H^{1} RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}): mezcla de rotámeros aprox. 1:4;
\delta 8,22 y 8,04 (2xs, 1H), 8,00 (d, J = 9,2Hz, 1H), 7,91 (d, J
= 6,5 Hz, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,27 (d, J = 2,4 Hz,
1H), 7,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,01 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H),
6,09-5,98 (m, 1H), 5,34 (s, 1H), 4,98 (dd, J = 1,6,
17,4 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,73-4,67
(m, 1H), 4,43-4,31 (m, 2H),
4,05-3,95 (m, 2H), 3,95-3,84 (m,
1H), 3,90 (s, 3H), 2,38-2,29 (m, 1H),
2,03-1,92 (m, 2H), 1,83-1,21 (m,
24H), 1,21-0,83 (m, 5H)
M.S.(electropulverización): 813,4
(M-H)- 815,4 (M+H)+.
Homogeneidad de HPLC de fase inversa (0.06% TFA;
CH_{3}CN: H_{2}O): 99%.
Ejemplo
9
Usando el mismo procedimiento descrito en el
Ejemplo 5 y usando el ciclopentil-carbamato de
ciclopentil-glicina en lugar de urea 5 en la Etapa
5, se suministró el compuesto del título, que se convirtió en su
correspondiente sal de Na.
Ejemplo
10
El ensayo enzimático usado para evaluar el
presente compuesto se describe en los documentos WO 00/09543 y WO
00/59929.
Ejemplo
11
Células Huh7 que mantienen establemente un
replicón de HCV subgenómico fueron establecidas como se describió
previamente (Lohman et al., 1999. Science 285:
110-113) y se denominaron la línea celular S22.3. Se
mantienen células S22.3 en medio Earle modificado de Dulbecco
(DMEM) complementado con 10% de FBS y 1 mg/ml de neomicina
(Standard Medium). Durante el ensayo, se usó medio DMEM
complementado con 10% de FBS, que contenía 0,5% de DMSO y carecía
de neomicina (Medio de Ensayo). antes de 16 horas de la adición del
compuesto, células S22.3 fueron tripsinizadas y diluidas hasta
50.000 células/ml en Medio Standard. Se distribuyeron 200 \mul
(10.000 células) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La
placa se incubó seguidamente a 37ºC con 5% de CO_{2} hasta el día
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 10 \mul del compuesto del ensayo
(en 100% de DMSO) a 2 ml de Medio de Ensayo hasta una concentración
final de DMSO de 0,5% y la solución fue sonicada durante 15 minutos
y se filtró a través de una unidad de filtración Millipore de 0,22
\muM. SE transfirieron 900 \mul en la hilera A de una placa de
titulación de pocillos profundos de polipropileno. Las hileras B a
H contenían 400 \mul de partes alícuotas de Medio de Ensayo (que
contenía 0,5% de DMSO) y se usaron para preparar diluciones en serie
1/2) transfiriendo 400 \mul de una hilera a otra (no se incluyó
ningún compuesto en la hilera A).
El medio de cultivo celular fue aspirado de la
placa de 96 pocillos que contenía las células S22.3. Se
transfirieron 175 \mul del medio del ensayo con la dilución
apropiada de compuesto del ensayo desde cada pocillo de la placa de
compuesto al pocillo correspondiente de la placa de cultivo celular
(la hilera H se usó como el "testigo sin inhibición"). La
placa de cultivo celular se incubó a 37º con 5% de CO_{2} durante
72 h.
a continuación del período de incubación de 72
h, el RNA celular total fue extraído de las células S22.3 de la
placa de 96 pocillos usando el estuche de ensayo RNeasy 96 (Qiagen®,
RNeasy Handbook. 1999). Brevemente, el medio de ensayo fue
completamente separado de las células y se añadieron a cada pocillo
100 \mul de tampón RLT (Qiagen®) que contenía
\beta-mercaptoetanol 143 mM de la placa de cultivo
celular de 96 pocillos. La microplaca fue suavemente agitada
durante 20 segundos. Seguidamente se añadieron 100 \mul de etanol
al 70% a cada pocillo de la microplaca y se mezcló con pipeteo. El
lisado fue separado y fue aplicado a pocillos de una placa RNeasy
96 (Qiagen®) que se colocó en la parte superior de un bloque de
pocillos Qiagen® Square-Well. La placa RNeasy 96
fue sellada con cinta y el bloque Square-Well con la
placa RNeasy 96 fue introducida en la sujeción y colocada en un
cubo rotor de una centrifugadora 4K15C. La muestra fue centrifugada
a 6.000 rpm (\sim 5.600 x g) durante 4 minutos a temperatura
ambiente. La cinta se retiró de la placa y se añadieron 0,8 ml de
tampón Buffer RW1 (estuche de ensayo Qiagen® RNeasy) a cada pocillo
de la placa RNeasy 96. La placa RNeasy 96 fue sellada con un nuevo
trozo de cinta y se centrifugó a 6.000 rpm durante 4 minutos a
temperatura ambiente. La placa RNeasy 96 se colocó en la parte
superior de otro bloque Square-Well limpio, la cinta
se retiró y se añadieron 0,8 ml de tampón RPE (estuche de ensayo
Qiagen® RNeasy) a cada pocillo de la placa RNeasy 96. La placa
RNeasy 96 fue sellada con un nuevo trozo de cinta y se centrifugó a
6.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente. La cinta se
retiró y se añadieron otros 8 ml de tampón Buffer RPE (estuche de
ensayo Qiagen® RNeasy) a cada pocillo de la placa RNeasy 96. La
placa RNeasy fue sellada con un nuevo trozo de cinta y se
centrifugó a 6.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. La
cinta se retiró, la placa RNeasy 96 se colocó en la parte superior
de un estante que contenía microtubos de recogida de 1,2 ml. El RNA
fue eluido añadiendo 50 ml de RNasa exento de agua, sellando la
placa con un nuevo trozo de cinta e incubando durante 1 minuto a
temperatura ambiente. La placa se centrifugó seguidamente a 6.000
rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente. La etapa de elución
se repitió con un segundo volumen de 50 \mul de RNasa exenta de
agua. Los microtubos con RNA celular total se almacenaron a
-70º.
Se cuantificó RNA en el sistema STORM®
(Moledular Dynamics®) usando el estuche de ensayo de cuantificación
de RNA RiboGreen® (Molecular Probes®). Brevemente, el reactivo
RiboGreen se diluyó 200 veces en TE (Tris-HCl 10
mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM). Generalmente, se diluyeron 50 \mul de
reactivo en 10 ml de TE. Una curva estándar de RNA ribosomal se
diluyó en TE hasta 2 \mug/ml y cantidades predeterminadas (100,
50, 40, 20, 10, 5, 2 y 0 \mul) de la solución de RNA ribosomal
fueron seguidamente transferidas a una placa de 96 pocillos nueva
(COSTAR nº 3997) y el volumen se completó hasta 100 \mul con TE.
Generalmente, la columna 1 de la placa de 96 pocillos se usó para
la curva estándar y los demás pocillos se usaron para cuantificar
las muestras de RNA. Se transfirieron 10 \mul de cada muestra de
RNA que iba a ser cuantificada al correspondiente pocillo de la
placa de 96 pocillos y se añadieron 90 \mul de TE. Se añadió un
volumen (100 \mul) de reactivo RiboGreen diluido a cada pocillo
de la placa de 96 pocillos y se incubó durante 2 a 5 minutos a
temperatura ambiente, con protección de la luz (una muestra de RNA
de 10 \mul en un volumen final de 200 \mul genera una dilución
20). La intensidad de la fluorescencia de cada pocillo se midió en
el sistema STORM® (Molecular Dynamics®). Se creó una curva estándar
sobre la base de las cantidades conocidas de RNA ribosomal y las
intensidades fluorescentes resultantes. La concentración de RNA en
las muestras experimentales se determinó a partir de la curva
estándar y se corrigió para la dilución
20X.
20X.
\vskip1.000000\baselineskip
El RT-PCR en tiempo real se
realizó en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700
usando el estuche de ensayo TaqMan EZ RT-PCR (de la
empresa Perkin-Elemer Applied Biosystems®). El
RT-PCR fue optimizado para la cuantificación del
5'IRES de RNA de HCV usando la tecnología de TaqMan (Roche Molecular
Diagnostics Sistems) similar a la técnica previamente descrita
(Martell et al., 1999. J. Clin. Microbiol.
37:327-332). El sistema explota la actividad
nucleolítica en 5'-3' de la
DNA-polimerasa de AmpliTaq. Brevemente, el método
utiliza una sonda de hibridación fluorógena de etiqueta dual (sonda
PUTR) que se reasocia específicamente a la plantilla entre los
cebadores de PCR (cebadores 8125 y 7024). El extremo 5' de la sonda
contiene un reportero fluorescente
(6-carboxifluoresceína [FAM]) y el extremo 3'
contiene un inactivador fluorescente
(6-carboxitetrametil-rodamina
[TAMRA]). El espectro de emisión del reportero FAM fue suprimido por
el inactivador en la sonda de hibridación intacta. La degradación
de nucleasa de la sonda de hibridación libera el reportero, dando
lugar a un aumento de la emisión de fluorescencia. El detector de
secuencias ABI Prism 7700 mide el aumento de la emisión de
fluorescencia continuamente durante la amplificación por PCR de
forma que el producto amplificado fue directamente proporcional a
la señal. La representación de la amplificación fue analizada
tempranamente en la reacción en un punto que representa la fase
logarítmica de la acumulación de producto. Un punto que representa
un umbral de detección definida del aumento en la señal
fluorescente asociada con el crecimiento exponencial del producto
de PCR para el detector de secuencias se definió como el umbral del
ciclo (C_{T}). Los valores de C_{T} son inversamente
proporcionales a la cantidad de RNA de HCV producido; de forma que
bajo condiciones idénticas de PCR, cuanto mayor es la concentración
de partida de RNA de HCV, más bajo es el valor de C_{T}. Se creó
una curva estándar automáticamente por el sistema de detección ABI
Prism 7700 representando gráficamente el valor de C_{T} frente a
cada dilución estándar de concentración conocida de RNA de HCV.
Las muestras de referencia para la curva
estándar están incluidas en cada placa de RT-PCR. El
RNA de replicón de HCV se sintetizó (por transcripción de T7) in
vitro, se purificó y se cuantificó por OD_{260}. Considerando
que 1 \mug de este RNA = 2,15 x 10^{11} copias de RNA, se
hicieron diluciones con el fin de tener 10^{8}, 10^{7},
10^{6}, 10^{5}, 10^{4}, 10^{3} ó 10^{2} copias de RNA
genómico/5 \mul. El RNA de Huh-7 celular total se
incorporó también con cada dilución (50 ng/5 \mul). Se combinaron
5 \mul de cada patrón de referencia (replicón de HCV + RNA de
Huh-7) con 45 \mul de reactivo Mix, y se usaron en
la reacción de RT-PCR en tiempo real.
La reacción de RT-PCR en tiempo
real se ajustó para las muestras experimentales que se purificaron
en placas de 96 pocillos RNeasy combinando 5 \mul de cada muestra
de RNA celular total con 45 \mul de reactivo Mix.
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Testigos sin plantillas
(NTC): En cada placa, se usaron 4 pocillos como "NTC". Para
estos testigos, se añadieron 5 \mul de agua al pocillo en lugar
de
RNA.
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\vskip1.000000\baselineskip
A continuación de la terminación se la reacción
de RT-PCR, el análisis de datos requiere el ajuste
de la señal de fluorescencia umbral para la placa de PCR y se
construyó una curva estándar representando gráficamente el valor de
Ct frente al número de copias de RNA usado en cada reacción de
referencia. Los valores de Ct obtenidos para las muestras del
ensayo se usan para interpolar un número de copias de RNA basado en
la curva
estándar.
estándar.
Finalmente, el número de copias de RNA fue
normalizado (basándose en la cuantificación de RNA RiboGreen del
RNA extraído del pocillo de cultivo de células) y se expresó como
equivalentes de genoma/\mug de RNA total
[ge/\mug].
[ge/\mug].
El número de copias de RNA (g.e./\mug] de cada
pocillo para la placa de cultivo celular fue una medida de la
cantidad de RNA de HCV replicante en presencia de diversas
concentraciones de inhibidor. El % de inhibición se calculó con la
siguiente ecuación:
100 -
[(g.e./\mu g\ inh)/(g.e./\mu g\ ctl)\ x\
100].
Se aplicó un ajuste de curva no lineal con el
modelo de Hill a los datos de
inhibición-concentración, y la concentración eficaz
en 50% (EC_{50}) se calculó mediante el uso del software SAS
(Statistical Software System; SAS Institute, INc. Cary, N.C.).
Cuando los compuestos de esta invención se
valuaron en los ensayos precedentes enzimáticos y basados en la
células, se encontró que los compuestos eran altamente activos. Más
específicamente, los compuestos tenían una IC_{50} pro debajo de
0,1 \muM en el ensayo de
NS3-NS4A-proteasa y una EC_{50}
por debajo de 0,5 \muM en el ensayo de replicación de RNA de HCV
basado en células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Los ensayos de la especifidad usados para
evaluar la selectividad de este compuesto se describen en el
documento 00/09543.
\newpage
Cuando los compuestos se evaluaron en los
ensayos de especifidad, los compuestos de Fórmula 1 se encontró que
eran selectivos en cuanto que no muestran ninguna inhibición
significativa en los ensayos de elastasa y catepsina B de
leucocitos humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Los presentes compuestos muestran también buenas
propiedades farmacocinéticas como niveles en plasma significativos
en rata al cabo de 1 hora y 2 h de una dosis oral de 5 mg/kg.
Más explícitamente, el siguiente ensayo, una
selección de absorción oral in vivo, se usó para determinar
niveles en plasma de los compuestos del ensayo en una rata después
de una administración oral:
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de compuestos para ser reunidos en
una "cassette" se basó en su analogía estructural y propiedades
fisicoquímicas. Se estableció un método de extracción en fase
sólida aplicable a todos los compuestos seleccionados. Basándose en
el ensayo inicial, en el que cada compuesto fue salpicado en plasma
de rata y experimentado por medio de HPLC o HPLC/MS a una
concentración de 0,5 \muM, se usaron el tiempo de retención, masa
iónica y separación posible entre compuestos por HPLC y/o HPLC/MS
como una base para reunir 3-4 compuestos en
una
"cassette".
"cassette".
\vskip1.000000\baselineskip
Cada "cassette" contiene
3-4 compuestos a 5 ó 4 mg/kg para cada compuesto.
Las cassette se prepararon en forma de una suspensión oral en 0,5%
de metilcelulosa acuosa y 0,3% de monoleato de polioxietileno
(20)-sorbitan (Tween-80). El
volumen de dosificación fue 10 ml/kg por medio de gavaje oral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas machos Ssprague Dawley se mantuvieron en
ayunas durante una noche en jaulas individuales, con acceso a
dextrosa acuosa al 10%. Dos ratas fueron dosificadas con cada
"cassette". Las muestras de plasma (\sim 1 ml) se recogieron
a las 1 y 2 h después de la dosificación de las 2 ratas y se
reunieron para la extracción y análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de cada cassette, las muestras de
plasma a las 1 y 2 h, plasma en blanco, plasma en blanco salpicado
con todos los compuestos a 0,5 \muM cada uno, son extraídos por el
método de extracción en fase sólida. Las muestras se analizaron por
HPLC y HPLC/MS para fines de comparación. Las concentraciones en
plasma se estimaron basándose en la concentración única de patrón
0,5 \muM.
Cuando se ensayan en la selección precedente,
los compuestos de los Ejemplos 1 a 9 de esta invención se encontró
que estaban presentes en niveles significativos en el plasma a los
intervalos de 1 hora y 2 horas a continuación de la administración
oral, con una media de niveles en plasma de sangre de 1,23 \muM y
1,16 \muM, respectivamente. Esta demostración de la absorción
oral significativa in vivo para los compuestos de esta
invención es inesperada, teniendo en cuenta la inferior absorción
oral generalmente atribuida a esta clase de péptidos. La absorción
oral fácil hace que estos compuestos sean útiles para tratar una
infección de HCV.
La siguiente tabla es una lista de compuestos
representativos de la invención. Adicionalmente, en congruencia con
la presente descripción, los compuestos tenían todos una IC_{50}
por debajo de 0,5 \muM en el ensayo de
NS3-NS4A-proteasa, y una EC_{50}
por debajo de 0,5 \muM en el ensayo de replicación de RNA de HCV
basado en células.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL
GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> TRI-PÉPTIDOS
INHIBIDORES DE HEPATITIS C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 13/106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 2.370.396
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-08-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccggggca ctcgcaagca ccctatcagg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda PUTR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtctgcgg aaccggtgag tacacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (30)
1. Un compuesto de fórmula (I):
en la que R^{1} es hidroxi o
NHSO_{2}R^{1A}, en donde R^{1A} es alquilo
(C_{1-8}), cicloalquilo
(C_{3-7}) o
{alquilo(C_{1-6})-cicloalquilo
(C_{3-7})}, que están todos opcionalmente
sustituidos de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro,
O-alquilo (C_{1-6}), amido, amino
o fenilo, o R^{1A} es arilo de C_{6} o C_{10} que está
opcionalmente sustituido de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro,
alquilo (C_{1-6}), O-alquilo
(C_{1-6}), amido, amino o fenilo; R^{2} es
cicloalquilo (C_{4-6}); R^{3} es
t-butilo o cicloalquilo (C_{5-6})
y R^{4} es cicloalquilo (C_{4-6}), o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo.
2. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, NHSO_{2}Me,
NHSO_{2}-ciclopropilo o
NHSO_{2}-Ph.
3. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 2, en el que R^{1} es
NHSO_{2}-ciclopropilo o
NHSO_{2}-Ph.
4. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 2, en el que R^{1} es hidroxi.
5. El compuesto de fórmula I según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R^{2} es
ciclopentilo o ciclohexilo.
6. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 5, en el que R^{2} es ciclopentilo.
7. El compuesto de fórmula I según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que R^{3} es
t-butilo o ciclohexilo.
8. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 7, en el que R^{3} es t-butilo.
9. El compuesto de fórmula I según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R^{4} es
ciclobutilo o ciclopentilo.
10. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 9, en el que R^{4} es ciclopentilo.
11. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} y R^{4} es
cada uno ciclopentilo y R^{3} es t-butilo.
12. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} es
ciclobutilo y R^{4} es ciclopentilo.
13. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} es
ciclohexilo, R^{3} es t-butilo y R^{4} es
ciclopentilo.
14. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es NHSO_{2}Ph, R^{2} y
R^{4} es cada uno ciclopentilo y R^{3} es
t-butilo.
15. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} es
ciclopentilo, R^{3} es t-butilo y R^{4} es
ciclobutilo.
\newpage
16. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} es
ciclopentilo, R^{3} es t-butilo y R^{4} es
ciclohexilo.
17. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2} y R^{4} es
cada uno ciclopentilo y R^{3} es ciclohexilo.
18. El compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, en el que R^{1} es hidroxi, R^{2}, R^{3} y
R^{4} es cada uno ciclopentilo.
19. Una composición farmacéutica, que comprende
una cantidad viralmente eficaz anti-hepatitis C de
un compuesto de fórmula 1 según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, mezclado con un medio excipiente o agente auxiliar
farmacéuticamente aceptable.
20. La composición farmacéutica según la
reivindicación 19, que comprende adicionalmente una cantidad
terapéuticamente eficaz de uno o más de otro agente
anti-HCV.
21. La composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el otro agente anti-HCV
mencionado se selecciona entre: \alpha-interferón
o \alpha-interferón pegilado.
22. La composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el otro agente anti-HCV
mencionado es ribavirina.
23. La composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el otro agente anti-HCV
mencionado se selecciona entre inhibidores de: helicasa,
NS2/3-proteasa y sitio de entrada de ribosomas
internos (IRES).
24. La composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el otro agente anti-HCV
mencionado es un inhibidor de polimerasa de HCV.
25. Uso de un compuesto de fórmula I según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la elaboración de
un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección
viral de hepatitis C.
26. Uso de un compuesto de fórmula I según la
reivindicación 25, caracterizado porque el medicamento
comprende uno o más de otro agente anti-HCV.
27. El uso según la reivindicación 26, en el que
el otro agente anti-HCV mencionado se selecciona
entre: \alpha-interferón o
\alpha-interferón pegilado.
28. El uso según la reivindicación 26, en el que
el otro agente anti-HCV mencionado es
ribavirina.
29. El uso según la reivindicación 26, en la que
el otro agente anti-HCV mencionado se selecciona
entre inhibidores de: helicasa, NS2/3-proteasa y
sitio de entrada de ribosomas internos (IRES).
30. El uso según la reivindicación 26, en el que
el otro agente anti-HCV mencionado es un inhibidor
de polimerasa de HCV.
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