TW557216B

TW557216B - Cosmetic compositions for increasing or decreasing pigmentation in mammalian skin

Info

Publication number: TW557216B
Application number: TW087112280A
Authority: TW
Inventors: Stanley S Shapiro; Miri Seiberg; Susan Niemiec; John Kung
Original assignee: Johnson & Johnson Consumer
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2003-10-11
Also published as: HUP0000216A2; IL129090A0; PL333284A1; JP2001502360A; US20120027706A1; AR016780A1; JP4401441B2; BR9806118A; EP0948308A1; CN1234735A; ES2215317T3; WO1999004752A3; KR100691395B1; ATE260083T1; CA2267077A1; BR9816322B1; JP2009114187A; US8039026B1; DE69821913T2; EP0948308B1

Description

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五、發明説明G 1. 發明範圍本發明係有關使皮膚色素形喊及/或使皮膚色素脫除之方法及組合物。更特定言之，，本發明係有關影響黑色素形成且可用為色素脫除劑或作為加深膚色之製劑之化合物。丨 2. 發明背景多年來膚色與人類習習相關，特定言之，排除過多色素形成，如：老年斑、雀斑或一般老化皮膚之能力係尋求均勻膚色的A注意的重點。在世界某些地區，期望使身體美白，但亦有過多色素形成及過少色素形成之病變需要治秦。同樣地，如何在接受日照時得到黝黑膚色的外觀但又不遭受晒傷的能力亦是許多人關心的重點，現已有人提出脫除色素之方法及加深膚色之方法。例如：已使用麴酸、鼠酉昆、類視黃素及其他化學化合物來脫除色素。二經基丙酮及類似之化學化合物具有不需日照即可使膚色”黝黑"之能力。過去此等解決方法中有許多仍無法接受。此等組合物可施用之皮膚範圍之間經常有明顯區分。因此，必須正確施用此等組合物，以達成所需結果。已發現許多此等化合物對皮膚相當刺激且因此不適合使用。已有許多文獻記載有關黑色素形成之化學及酵素學理基礎。黑細胞自胚胎神經脊移動至皮膚内，產生分泌顆本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規枋（2i〇x297 ^-y 請先閲背項再奮經濟部中央標準局貝工消費合作社印^

87294A 557216 A7 1 1 1 mi" — - 1 11 1 —— 五、發明説明（2 ) 粒、黑色體，其會產生黑色素。黑色體中發生黑色素形成作用，黑色素隨後即利用黑細胞樹突分佈至角質細胞中。黑色素形成作用中之關鍵性酵素為酪胺酸酶，其啟動-連串反應，使酷胺酸轉化成生物聚合物黑色素，已知有二種與酪胺酸酶有關之蛋白質(TR匕s”TRP-l與TRP-2。此等蛋白質具有約40%之酪胺酸酶同質性，且在黑色素形成作用中具有觸媒活性及扮演調節角色。TRP-1為黑細胞中含量最多之醋蛋白。經滴部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事壻再填艿本頁) 儘管黑色素形成作用之化學及酵素學理已有許多報告，但其在細胞層次上之調節作用之了解程度仍有限。酪胺酸酶及TRP’s之結構及生物性質與結合溶酶體之膜蛋白質(LAMP)基因族群具有部分同質性，因此其可針對黑色體膜誘發活化作用。在此等蛋白質之細胞質尾部進行之磷酸化/脫磷酸化反應可能涉及黑色素形成作之調節作用，蛋白質激酶C (PKC)族群之泠-同功型已顯示可以透過絡胺酸酶活化作用調節人類之黑色素形成作用。酪胺酸酶、 TRP-1與TRP-2之基因表現r均互相協調。所有這三種酵素均表現在人體表皮，當黑細胞與角質細胞共同培養時，此等轉錄本之表現比例分別為45:45:10。單獨培養黑細胞時’僅出現TRP-1轉錄本，顯示角質細胞所衍生之訊號涉及此等基因之協調表現’角質細胞-黑細胞交互作用之調節作用及黑色體轉移至角質細胞中之機轉則尚未了解。受蛋白酶活化之受體2(PAR-2)為一種與7種穿透膜之 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規拮（210Χ29ϋΤ 557216 A7 B7 五、經漪部中央標率局員工消費合作社印裝發明説明（ G蛋白質偶合之受體，其序列與凝血酶受體(TR，亦稱為 PAR-1及PAR-3)相關但不同。這二種受體之細胞外區域受蛋白質分解作，因精胺酸-絲胺酸裂解而活化。新產生之N-末端再活化此等受體成為末端配位體。這二種受體均可被胰蛋白酶活化，但僅TRs被凝血酶活化。僅PAR-2被肥大細胞類胰蛋白酶活化。這二種受體亦可被與其新 N-末端相應之肽活化，不受受體裂解作用影響。SLIGRL 為小白鼠PAR_2活化肽，對活化人類受體具有同等效力。雖然TR功能在文獻中有完整報導，但PAR-2之生物學則未完全了解。PAR-2活化作用在抑制角質細胞生長及分化上之角色近來已有d明（狄李安〇)erian)等人，”新穎之蛋白酶活化受體族群對人類角質細胞生長及分化上之差異性調節（Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth and Differentiation by a Novel Family of Protease-activate Receptors)，細胞生長及分化（Cell Growth & Differentiation)，Vol· 8, ρρ· 743-749, 1997 年 7 月）。發明概要、根據本發明，吾等已發現一種影響哺乳動物皮膚色素形成之變化之方法，其包括在嚙乳動物皮膚上局部施用寸影響PAR-2途徑之化合物。本發明組合物可包含一種或多種其作用為作為胰蛋白酶、類胰蛋白酶'絲胺酸蛋白酶，或PAR-2促效劑之化合物，以增加色素形成。或本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4坭枋（210X297公焓） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經滴部中央標率局貝工消費合作社印製 557216 __ Η 7 五、發明説明（4 ) 者，其可包含一種或多種其作用备作為蛋白酶抑制、胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、pAR_2 途徑抑制劑或PAR-2拮抗劑之化合物，以降低色素形成，或”脫除色素”。本文採用之哺乳動物"係指如韋氏醫學桌上字典407 (Webster’s medical Desk Dictionary 407)(1986)定義之較高等脊椎動物（包括·· ”哺乳動物”綱）中之任何組員，且包括 (但不限於）人類。本文採用之"受體"應包括細胞内與細胞外受體且應指彼等可接受並轉導訊號之分子。"PAR_2，，一詞係指蛋白酶活化受體-2或相關之蛋白酶活化受體。蛋白酶活化受體_2(下文稱為” PAR-2")為一種表現在許多組織中，包括角質細胞及减維母細胞中之絲胺酸胥白'酶活化受體。凝血酶受體（亦稱為pAR-1，下文稱為"丁灰")為一種表現在許多組織（包括角質細胞）中之絲胺酸蛋白酶活化受體。PAR-2與TR於皮膚中之生物角色並未完全了解。然而’吾等已發現，角質細胞與黑細胞之間之交互作用經由PAR-2途徑影響黑色素形成。吾等已發現，凝血酶抑制劑，及/或類胰蛋白酶抑制，及/或胰蛋白酶抑制劑及PAR-2拮抗劑可用為脫除色素劑，不會刺激皮膚。 PAR_2促效劑與絲胺酸蛋白酶如··胰蛋白酶與類胰蛋白酶可用於加深膚色製劑。此外，PAR_2可用為美白劑及加深膚色劑之目標物。圖示之簡要說明 -6- 本紙張尺度適用中酬家標準（CNS) Λ4· (21Gx297^yy (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

經漪部中央標準局貝工消费合作社印製 557216 A7 B7 ---一 1 五、發明説明（5 ) 圖1A說明含黑細胞之表皮同等物根據本發明方法，經已知之色素形成劑及脫除色素劑處理後之相對色素形成作用增加或下降之結果。圖1B說明含黑細胞之表皮同等物經根據本發明方法及本發明組合物處理後之相對色素形成作用增加或下降之結果。圖2說明含黑細胞之表皮同等物經PAR-2促效劑及化合物I處理後之影像。圖3說明含黑細胞之表皮同等物經根據本發明方法及本發明組合物處理後之相對色素形成作用增加或下降之結圖4A說明含黑細胞之表皮同等物經本發明組合物處理時之色素形成作用'之劑量/效應圖。圖4B說明含黑細胞之表皮同等物曝露到紫外光後，以本發明組合物處理後之效應圖。圖5A說明顯示有皮膚、黑色素瘤細胞及含黑細胞之表皮同等物中TR及PAR-2之表現之凝膠照像圖。圖5B說明顯示有原發人類黑細胞之TR與PAR-2表現之凝膠照像圖。圖6A與6B說明顯示有各種不同基因經不同濃度化合物I及SLIGRL處理後之表現之凝膠照像圖。 / 圖7說明本發明不同組合物對天竺鼠乳頭色素形成作用之亮度之影響。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規辂（2Κ)><29ϋ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j έ— *訂 557216

五、發明説明（6 )，圖8說明經本發明組合物處理脫除皮膚色素之 Yucatan豬皮膚之照像圖。 (蝻先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖9說明Yucatan豬皮膚於接受根據本發明方法及本發明組合物處理期間之亮度圖。圖10A、10B、10C及10D為Yucatan豬皮膚根據本發明方法，分別經含濃度 0、1〇βΜ、50//M 及之化合物I之組合物處理後，以F&M染色之組織切片照像圖。圖11Α、11Β與11C為含黑細胞之表皮同等物經本發明組合物處理後之電子顯微鏡照像圖。圖11Ε、11F與11Η為Yucatan豬皮膚經本發明組合物處理後之電子顯微鏡照像圖。圖11D與11G為Yucatan豬皮膚未處理部位之電子顯微鏡照像圖。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製圖 12A、12B、12C、12D 與 12E 為 Yucatan 豬皮膚經 F&M染色之組織切片照像圖如下：12A出示未處理之皮膚；12B出示經本發明組合物處理八週後之皮膚；12C出示停止處理一週後之皮膚；12D出示停止處理二週後之皮膚；及12E出示停止處理四週後之皮膚。圖13為取自經本發明組合物處理之Yucatan豬皮膚之F&M染色之組織切片。圖丨4包含人類皮膚於處理前及隨後接受本發明組合物處理後之紫外光與可見光數位照像圖。本紙張尺度適用中國國家縣（CNS) Λ4^ (21Gx 297公势） 557216 A7 B7 五、發明説明（7 ) 較佳具髏實施例之詳細說明吾等已發現胰蛋白酶、類胰蛋白酶與PAR-2促效劑可用於增加色素形成作用，而胰蛋白抑劑劑、及/或類胰蛋白酶抑制劑、及/或凝血酶抑制劑及PAR-2拮抗劑之作用為降低哺乳動物皮膚之色素形成作用。吾等認為，美國專利寒Ν〇·5,523,308說明之某些化合物之表現如同凝血酶與/或胰蛋白酶與/或類胰蛋白酶抑制劑，因此適用於本發叼方法，該案則已併為本£之參考文獻。其中有些化合物亦說明於考斯坦佐(Costanzo)等人之“偵測S!亞位置之強效凝血酶抑制劑··以雜環活化羰基為主之三肽過渡狀態類似物（Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S! Subsite: Tripeptide Transition State. Analogues Based on a Heterocycle_Activated Carbonyl Group)” ： J· Med. Chem·， 1996, Vol· 39, pp.3039-3043 且具有下列結構式：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注秦事項再填^?5本頁> ••訂其中： A係選自：烷基、羧基烷基、CV4烷氧羰墓-C〗·4烧基、笨基Cm烧基、經取代之苯基&烧基(其中苯 557216 ΑΊ __ ~—_____________ 五、發明説明（8 ) 基取代基分別選自下列一個或多個基團·· Ci_4烷基、全氟烧基、Cw烧氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、烷胺基、CM二烷胺基、羧基或烷氧羰基）、甲醯基、Cw烷氧羰基、Ci2烷羰基、苯基Cm烷氧羰基、CM環烷羰基、苯羰基、經取代之苯羰基(其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：Ci4烷基、全氟Ci4 烷基、C〗_4烷氧基、羥基、_素、醯胺基、硝基 '胺基、 Cm烷胺基、Cm二烷胺基、羧基或Ci 4烷氧羰基）、經漪部中央標準局貝工消費合作社印^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 烷磧醯基、c〗·4烷氧磺醯基、全氟院基-磺醯基、笨續醯基、經取代之苯磺醯基（其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：CM烷基、全氟Ci 4烷基、烷氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、4烧胺基、Ci_4 二烷胺基、羧基或CM烷氧羰基）、10_樟腦磺醯基、苯基 Cm烷磺醯基、經取代之笨基Ci 4烷磺醯基、4烧亞磺醯基、全氟Cm烷亞磺醯基、苯亞磺醯基、經取代之笨亞 %醯基（其中本基取代基分別選自下列一個或多個基團： Cm烧基、全氣Cm燒基、Cw烧氧基、經基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、CM烷胺基、Ch二烷胺基、羧基或 C】·4燒氧基）、本基Cl.#烧亞績酿基、經取代之苯基c 烧亞續醯基、1-萘績醯基、2-萘確醯基或經取代之萘績醯基(其中奈基取代基分別選自下列一個或多個基團：^ 4烧基、全既C〗·4烧基、CM烧氧基、經基、齒素、酿胺基、确基、胺基、羧基或Cm烷氧羰基）、1-萘亞磺醯基、2_萘 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规梠（210X29*7公势） 557216 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 Α7 137 五、發明説明（9 ) 亞磺醯基或經取代之萘亞磺醯基(其中萘基取代基分別選自下列一個或多個基團：Cw烷基、全氟CV4烷基、Cm 烷氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、Cm烷胺基、Q-4二烷胺基、羧基或（^4烷氧羰基） D或L胺基酸，其羧基末端與式I中之氮偶合，且係選自：丙胺酸、天冬醯胺、2-吖丁咬羧酸、甘胺酸、N_Cle 8烷基甘胺酸、脯胺酸、1-胺基_1-環C3_8烷基羧酸、噻唑啶_4_羧酸、5,5-二甲基噻唑啶-4_羧酸、啐唑啶-4-羧酸、六氫吡啶曱酸、纈胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、正白胺酸、白胺酸、第三白胺酸、異白胺酸、苯基丙胺酸、1-萘丙胺酸、2_萘丙胺酸、2_嗔吩基丙胺酸、 3-嗔吩基丙胺酸、〔1，2，3，4〕_四氫異喳咐緩酸及 U，2，3，4〕-四氫異喳啉-2-羧酸，其中該胺基酸之胺基末端連接一個選自下列之基團： CV4烧基、四味_5_基C“2烧基、叛基燒基、（^_4烧氧羰基C!·4烷基、苯基CV4烷基、經取代之苯基烷基 (其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：CN4烧基、全氟C1-4烧基、ον*烧氧基、經基、齒素 '醯胺基、硝基、胺基、CV4烧胺基、C1-4二统胺基、叛基或Cl_4烧氧羰基）、1，1-二苯基C!·4烷基、3-苯基-2-羥基丙醢基、 2,2-二苯基-1·經乙幾基、〔1 ’ 2，3，4〕-四氫異4咐小羰基、〔1，2，3，4〕-四氫異喳啉_3_羰基、：[_曱胺基小壞己幾基、1-經基-1-環己Μ基、1-經基-1-笨基-乙醯基、 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规枱（210X297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ _ 557216 經濟部中央標率局負工消費合作社印說 A7 137 五、發明説明（i〇 ) 1- 環己基-1-羥乙醯基、3-苯基-2-羥丙醯基、3，3-二笨基_ 2- 輕丙醯基、3-環己基_2•經丙醯基、甲醯基、CM燒氧幾基、CM2烷羰基、全氟c1-4烧基、CM烧羰基、苯基c ^1-4 烷羰基、經取代之苯基C!·4烷羰基(其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：CN4烷基、全氟CM烷基、c ^1-4 烧氧基、經基、齒素、醯胺基、確基、胺基、C1-4燒胺基、C〗·4 一烧胺基、叛基或C!·4烧氧魏基）、1，1-二笨基 CM烷羰基、經取代之1，1-二苯基C!·4烷羰基(其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：烷基、全氟 Cm烧基、q·4院氧基、經基、鹵素、醢胺基 '硝基、胺基、CV4烷胺基、c1-4二烷胺朞、羧基或cN4烷氧羰基）、全氟CV4烧確醯基、Cw烧續酿基、Cm烧氧確醯基、笨磺醯基、經取代之苯磺醯基（其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：cM烷基、全氟cN4烷胺基、cM二 ^ 烷胺基、羧基或CK4烷氧羰基）、10-樟腦磺醯基、苯基Ci. 4烷磺醯基、經取代之苯基烷磺醯基、全氟cM烷亞磺醯基、C〗·4烷亞磺醯基、苯亞磺醯基、經取代之苯亞績醯基(其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：CM 垸基、全氟CM烧基、烧氧基、羥基、南素、醯胺基、硝基、胺基、烷胺基、cv4二烷胺基、羧基或Ci_ 4烷氧羰基）、1-萘磺醯基、2-萘磺醯基、經取代之萘績醯基(其中萘基取代基分別選自下列一個或多個基團·· C1_4烷基、全氟c^4烧基、cM烧氧基、經基、齒素、酿胺基、 -12- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS)A4規格（21〇Χ2ϋϋ* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

557216 A7 Η 7 五、發明説明（η ) 硝基、胺基、Cm烷胺基、Cm二烷胺基、羧基或Cw烷氧羰基）、1-萘亞磺醯基、2-萘亞磺醯基、及經取代之萘亞磺醯基(其中萘基取代基分別選自下列一個或多個基團： ci-4烷基、全氟CN4烷基、CM烷氧基、羥基、i素、醯胺基、硝基、胺基、Cle4烷胺基、Cm二烷胺基、羧基或 Ci-4烷氧羰基）；或含2個胺基酸之多肽，其中第一個胺基酸為利用其羧基末端與式I中之氮鍵結之D-或L-胺基酸，其係選自：甘胺酸、N-CV8烷基甘胺酸、丙胺酸、2-吖丁啶羧酸、脯胺酸、噻唑啶-4-羧酸、5,5_二甲基噻唑啶-4-羧酸、噚唑啶-4-羧酸、1-胺基-1-環C3_8烷基羧酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、3-(Cm烷氧基)脯胺酸、4_(Cm烷氧基) 脯胺酸、3,4-去氳脯胺酸、2,2-二甲基-4-噻唑啶羧酸、2,2-二甲基-4-嘮唑啶羧酸、2-六氫吡啶甲酸、纈胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、白胺酸、第三白胺酸、異白胺酸、苯基丙胺酸、1-萘丙胺酸、2-萘丙胺酸、2-噻吩基丙胺酸、3-噻吩基丙胺酸、〔1，2，3， 4〕-四氫異喳咁-2-羧酸、天冬胺酸-4-CV4烷基酯及麩胺酸院基酯，及第二個D或L-胺基酸則鍵結該第一個胺基酸之胺基末端、且係選自：苯基丙胺酸、4-苯曱醯基苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、4-(羧基C1-2烷基）苯基丙胺酸、經取代之苯基丙胺酸（其中苯基取代基分別選自下列一個 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规彳Μ 210X297公势） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 557216 經濟部中央標率局貝工消費合作社印製 A7 五、發明説明（12 ) 或多個基團：Cw烷基、全氟Cl.4烷基、cN4烷氧基、羥基、函素、醯胺基、硝基、胺基、Cw烷胺基、CV4二烷胺基、羧基或C1-4烷氧羰基）、3.苯并噻吩基丙胺酸、4-聯笨基丙胺酸、高碳苯基丙胺酸、八氫吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙胺酸、3-吡啶基丙胺酸、4-噻唑基丙胺酸、2-噻吩基丙胺酸、3-(3-苯并噻吩基）丙胺酸、3_噻吩基丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、3-三CV4烷矽烷基丙胺酸、環己基甘胺酸、二苯基甘胺酸、苯基甘胺酸、甲硫胺酸亞艰、甲硫胺酸砚、2,2·二環己基丙胺酸、2-(2-萘丙胺酸）、 2-(萘丙胺酸）、笨基經取代之苯基丙胺酸(其中取代基係選自：Cw烷基、全氟烷基、Ci4烷氧基、羥基、鹵素、醯胺基、硝基、胺基、c14烷胺基、Cl.4二烷胺基、緩基或CM烷氧羰基）、天冬胺酸、天冬胺酸_4-CN4烷基、全氟C1-4烧基、（γ4院氧基、經基、函素、醯胺基、确基、胺基、CN4烷胺基、cl 4二烷胺基、羧基或Ci 4烷氧羰基）、天冬胺酸、天冬胺酸-4-Cm烷基酯、麩胺酸、麩胺酸-5-CV4烷基酯、環c3-8烷基丙胺酸、經取代之環 Cw烷基丙胺酸（其中環取代基為羧基、cy4烷基酯、環 CM烷基丙胺酸、經取代之環c3.8烷基丙胺酸(其中環取代基為叛基、CN4烧致基、烧氧戴基或胺魏基）、2,2-二苯基丙胺酸及其所有胺基酸衍生物之所有q：-Ci_5烷基，其中該第二個胺基酸之胺基末端末取代或經選自下列族群之一個基團單取代：曱醯基、Cm2烷基、四唑_5-基_ -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規拮（210X297公餘） ——γ-------^-丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂經濟部中央標率局負工消費合作社印^ 557216 A7 B7 五、發明説明（13 )

Cw烧基、叛基CN8烧基、烧酯基CN4烧基、苯基（^_4烧基、經取代之苯基CM烧基(其中苯基取代基分別選自下列個或多個基團· Cw娱*基、全氟Cy烧基、CN4院氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、CM烷胺基、C14 二烧胺基、羧基或C"烷氧羰基）、1，1-二苯基烧基、 Ck烧氧幾基、苯基c1-6烧氧幾基、c1-2烧幾基、全氟cM 院基CG·4院羰基、笨基cM烧羰基、經取代之苯基4烧羰基(其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團·· 烧基、全氟Cw烧基、cv4院氧基、羥基、鹵素、醯胺基、硝基、胺基、cM烷胺基、cN4二烷胺基、羧基或cM 烧氧Ik基）、1，1-一苯基C1-4统基、全氟c1-4烧基、CV4烧氧羰基）、10-樟腦磺醯基、笨基CV4烷磺醯基、經取代之苯基c^4烧確醯基、cN4烧亞續酿基、全氟c1-4烧亞績酿基、苯亞磺醯基、經取代之苯亞磺醯基（其中苯基取代基分別選自下列一個或多個基團：CY4烷基、全氟Cm烷基、C^4烧氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、烷胺基、CM二烷胺基、羧基或Ci 4烷氧羰基）、苯基c14 烷亞磺醯基、經取代之苯基（γ4烷亞磺醯基、^萘磺醯基、2-萘磺醯基、經取代之萘磺醯基(其中萘基取代基係選自：cM烷基、全氟cM烷基、〇v4烷氧基、羥基、鹵素、醯胺基、硝基、胺基、（^4烷胺基、二烷胺基、羧基或Ci·4烷氧羰基）、1-萘亞磺醯基、孓萘亞磺醢基及經取代之萘亞磺醯基(其中萘基取代基係選自：CM烷基、全 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x297公^ ； --------,訂------#· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 557216 五、發明説明（Η ) 氟CV4烧基、Cm烧氧基、羥基、齒素、酿胺基、確基、胺基、CV4烷胺基、Cw二烷胺基、羧基或〇Υ4烷氧羰基）；&係選自氫及烷基；、 R2係選自·胺基〇2·5烧基、脈基匚2-5烧基、Cm烧基 v 胍基C2_5烷基、二Cle4烷基-胍基C2.5烷基、脒基c2.5烷基、Cm烷基脒基Cw烷基、二_CV4烷基脒基c2.5烷基、 CM烷氧基C2·5烷基、苯基、經取代之苯基(其中取代基分別選自一個或多個下列基團：胺基、脒基、胍基、q 4烧胺基、Cw二烷胺基、齒素、全氟CM烷基、4烷基、 Cu烧氧基或鎖基）’下基、本基經取代之+基(其中取代基分別選自一個或多個下列基團··胺基'脒基、脈基、 C1-4烧胺基、C!-4 一烧胺基、彘素、全氟C 、jΓ校基、Cw烧氧基或梢基），經基ο,.5烷基、胺基^2·5 烷基、C〗·5二烷胺基C2·5烷基、4-胺基環已基Cu烷基及 C 1.5姨*基， p為0或1 ; B為 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂經濟部中央標準局貝工消費合作社印^ y

ο 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規彳Μ 210Χ 297ϋ"7 557216 A7 __B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印紫五、發明説明（15 ) ' · 其中η為〇至3，&為1^或（：1-5烷基且B之羰基部份與Ε鍵結；、 Ε為選自下列之雜環：畤唑啉_2-基、畤唑基、噻唑-2_基、噻唑-5-基、噻唑_4_基、噻唑咁基、咪唑-2_ 基、4-氧-2-喳噚咁基、孓吡啶基、弘吡啶基、苯并[b]硫苯-2_基、三唑_4_基、三唑_6-基、吡唑-2_基、4,5,6,7_四氫苯并噻唑-2_基、萘并[2，1-(1]噻唑基、萘并噻唑· 2-基、喳$咁_2-基、異喳啉“-基、異喳咁_3_基、笨并[的呋喃-2-基、吼啡-2-基、4峻咐-2-基、異喧唾_5_基、異嗔唑-3-基、嘌呤-8-基及經取代之雜環，其中取代基選自： C〗·4烷基、全氟CM烷基、Cm烷氧基、羥基、齒素、醯胺基、硝基、胺基、Cm烷胺基、Cm二烷胺基、羧基、 CM烧氧.基、經基、或苯基c14燒胺幾基；或其醫藥上可接受之鹽。更特定言之，吾等認為某些含有心苯基丙胺酸_脯胺乂酸-精胺酸主體之上式化合物應可有效抑制PARj途〃徑且< 進而脫除色素。一種具有凝血酶及胰蛋白酶抑制劑作用且對哺乳動物皮膚具有脫除色素活性之特別佳化合物為（s)_ N-甲基-D-本基丙胺醢基-N-〔4-〔（胺基亞胺甲基）胺基〕 -1-(2-本并嗔吐幾基）丁基〕一L-脯胺醯胺（化學摘要 (Chemical Abstracts)名稱)(下文中稱為“化合物Γ，）。吾等認為其他化合物I類似物或功能上類似化合物I之化人物及說明於美國專利案No· 5,523,308之化合物可能在本 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规枱（210X29?公勢） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -一口广 ^9·. 557216 A7 B7 五、發明説明（16 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製發明方法及組合物中具有活性。其他可抑制胰蛋白酶之化合物，如：絲胺酸蛋白酶抑制劑，及特定言之，大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)亦適用於本發明方法。大豆、賴馬豆及黑豆萃物，及由此等豆類製備之其他天然產物，如（但不限於）·且奶、豆糊、味噌，等等，亦可利用此機轉減少色素形成。其他絲胺酸蛋白酶抑制劑來源可自屬於下列植物科名之⑽種中萃取：#科（例如：馬鈴薯、㈣、t_她，等等）·，禾本科（例如··稻、蕎麥、高梁、小麥、大麥、燕麥，等等）；㈣科（例如：胡瓜、南瓜、韻蘆'絲瓜，等等）；及較佳者，豆科（例如：青豆、碗豆、扁豆、花生，等等）。雖然不希望受下列理論限制，吾等在理論上認為可影響皮膚色素形成之化合物係直接或間接與角質細胞par_2 或與其活化蛋白酶交互作用，.進而直接或間接影響黑色素形成。本發明化合物可能誘發（若欲增加色素形成時）或減少（若欲減少色素形斜）黑細胞運送黑色體之訊號，或皮膚中角質細胞接收黑色體之訊號。 —本發明組合物及方法中之活性化合物可採用相關技專家們s知之任何方法局部傳送。如果需要局部活性藥劑或化粧品敵傳送魏時，本發明之局部職組合物最好另包含醫藥上或化粧品上可接受㈣傳㈣統功能之劑，以使局部活性劑滲入皮膚中。 -18- 冰張尺度適用中酬家— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 Φ 藝劑 0 ml· ml* ^Mtl· 557216 A7 五、發明説明（17 ) 一種本發明某些組合物可接受之局部傳送載劑，特定言之蛋白質如：胰蛋白酶及STI，可包含微脂粒。微脂粒為離子性更佳，且包含a)二月桂酸甘油酯（含量為約5至約70重量％較佳）’b)具有出現在膽固醇中之類固醇主幹之化合物（含量為約5至約45重量％較佳）；及幻一種或多種含有約12至約18個碳原子之脂肪酸謎（總含量為約5至70重量％較佳），其中微脂粒之組成份化合物之較佳比例為約37·5 · 12·5 : 33.3 : 16.7。以由二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯_10_硬脂醚/聚氧乙烯月桂基醚組成之微脂粒（GDL微脂粒）最佳。微脂粒之較佳含$佔組合物‘艎積約1〇毫克/毫升至約毫克/毫升，以約20毫克/毫升至約5〇毫克/毫升更佳。最佳比例為約37·5 ·· 12.5 : 33.3 : 16·7。合適之微脂粒最好根據實例1之方法製備，但相關技藝中常用之其他方法亦可接受。上述組合物之製法可由所需成於合適容器中組合，於周圍條件下，於非離子性微脂粒製法之相關技藝中習知之任何高剪力混合裝置混合，如彼等述於尼米亞克 (Niemiec)等人之“非離子性微脂粒組合物對肽藥物局部傳送至毛囊皮脂腺單位之影響：倉鼠耳部模式之活體内研究法（Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units:

An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model)，12 Pharm·

Res· 1184-88 (1995)( “尼米亞克”），該案已完全併為 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（210X 297^"^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局負工消費合作社印製 557216 Μ Β7 五、發明説明（18 ) 本文之參考文獻，吾等已發現本發明組合物中含有之此等微脂粒可加強本發明某些組合物之脫除色素能力。其也較佳調配物可包含例如··大豆奶或直接衍生自豆類或其他合適植物之其他液體調配物。例如：此等調配物可包含大量大豆奶、維持大豆奶物理安定性之乳化劑、及視需要選用之螯合劑、防腐劑、軟化劑、保濕劑及/或稠化劑或膠凝劑。相關技藝專家習知之水包油性乳液、油包水性乳液、以溶劑為主之調配物及水性凝膠亦可用為傳送本發明組合物之載劑。所調配之活性化合物來源通常依特定化合物之型式而異。小型有機分子及肽基片斷可利用化學合成，並以適合醫藥/化粧品用途之純型提供。天然萃物之產物可根據相關技藝上已知之技術純化。化合物之重組體來源亦可由相關技藝專家們取得。經濟部中央標準局员工消f合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本百〇另一項體實施例中，局部活性醫藥或化粧品組合物可視需要與其他成份組合，如：濕化劑、化粧品輔劑、抗氧化劑、漂白劑、酪胺酸酶抑制劑、及其他已知之脫除色素劑、界面活性劑、發泡劑、調和劑、保濕劑、香料、枯稍劑、緩衝劑、防腐劑、防晒劑、等等。本發明組合物亦可包含活性量之類視黃素（亦即可與類視黃素受體族群中任何成員結合之化合物），包括例如：類視黃酸 (tretinoin)、視黃醇、類視黃酸及/或視黃醇之酯，等 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公# ) 經漪部中央標率局貝工消费合作社印製 557216 五、發明説明（19 ) 等。局部活性醫藥或化粧品組合物之施用量為有效改變哺乳動物皮膚之色素形成作用之量。本文採用之“有效量” 應指足以覆蓋需改變色素形作用之皮膚表面區域之量。較佳者，組合物自由塗佈在皮膚表面上·使得每平方公分皮膚表面之局部活性劑含量為約2微升/平方公分約2〇〇微升/平方公分，以改變色素形成作用。當調配物中使用凝血酶及胰蛋白酶抑制劑如化合物I或其類似物時，不論合成物或天然物，此等活性化合物之含量應約00001至約 15重量體積組合物。更佳者，其含量應佔組合物約 0.0005%至約5% ;最佳者，其含量應佔組合物約〇001 %至約1 %。當然，此等範圍係上述成份之建議範圍。較低之範圍係對PAR-2途徑促效劑/拮抗劑及/或醫療指數高之抑制劑有效，且不需要顯著較高濃度或劑量即可在本發明方法中有效。此等化合物可為合成物或天然物。本發明組合物中可使用直接來自植物或植物來源之液體衍生物及天然萃物，濃度（w/v)為約1至約99%。天然萃取物部份及來自天然之蛋白酶抑制劑（如：STI)可佔不同之較佳範圍，佔組合物約0·01%至約20%，更佳者’約1%至約10%。當然，可組合使用本發明活性劑之混合物且共同用於相同調配物中，或於不同調配物中一系列施用。吾等已意外地發現，當局部活性劑如·· PAR-2促效劑 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210Χ297ϋ"Τ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 Φ. 557216 Α7 Β7 五、發明説明（2〇 ) 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與/或抑制劑及胰蛋白酶與/或凝血酶與/或類胰蛋白酶及/或其抑制劑局部施用至動物皮膚時，可使色素形成作用達到顯著的變化。較佳者，在哺乳動物皮膚上施用相當高濃度及劑量之脫除色素劑（及本發明其他影響色素形成之製劑，對醫療指數高之化合物如：化合物I及相關化合物，為約0.005%至約1 % ;對液體衍生物及植物材料萃物，為約20%至約99% ;及對天然萃物部份及衍生自天然之蛋白酶抑制劑如STI或其混合物，為約1 %至約20 %)，每天施用1至2次，直到皮膚之色素形成作用顯著改變為止。此期間可能長約4週至約10週或更久。之後’ 一旦改變了色素形成作用後，即可施用較低濃度與劑 s之活性成份（對醫療指數高之化合物如化合物I及相關化合物，為約0·00001%至約0.005% ;對液體衍生物及植物材料萃物為約10%至約90%;及對天然萃物部份及衍生自天然之蛋白酶抑制劑如：sti或其混合物，為約〇〇1 至約5 % )，且施用頻率可以減少，例如··約每天_次至約每週2次。本發明活性劑之效果為可逆性，因此為了維持此等效果，應持續施用或投藥。本文說明之本發明即使 tmlf m —Bito— 在缺少本文未明確說明之任何組成、成份或步驟下亦可操作。、下文出示數項實例說明本發明之性質及其進行方气但並未限制本發明方法及組合物之範圍。 -22- 適度尺張紙本準標家

S N 公 557216 五、發明説明（21 ) 實例1 ··蛋白酶抑制劑影響色素形成作用為了探討PAR-2途徑在色素形成作用中可能扮演的角色，採用試管内表皮同等物系統。所採用之表皮同等物系統含有黑細胞。一種適用於進行此研究之表皮同等物系統為美拉諾達姆(Melano Derm)系統，其可自MatTek公司取得商品。此系統含有人類正常黑細胞，及來自人類之正常表皮角質細胞，其已經過培養形成多層高度分化之人類表皮模式。下列實例中，以試驗化合物處理同等物3天，第4天開始處理後即收穫樣本。收穫之同等物經d〇pa (酪胺酸酶之受質）及H&E (標準組織學染色劑）或以佛塔納一馬森(pontana_Mas〇n)(F&M)(係相關技藝已知之另種染色劑）染色。F&M染色法為一種銀染色技術，經濟部中央標率局貝工消費合作社印製 :π楚地標出具有高度硝酸銀還原活性之黑色素。試管内模式系統中使用含黑細胞之多層人類表皮同等物來研究蛋白酶抑制劑對黑色素形成作用之效果。所採用之表皮同等，為自MatTek公司（Ashland，ΜΑ)取得之美拉諾達姆商品。已知此等同等物可隨紫外線B(“UVB”)照射及已知之〕、齊1如·笨曱齡及氫g昆而反應，可分別增加及減少色素、用使美拉諾達姆表皮同等物曝露到苯甲酸（來自 :::公司（sigmaofst Louis MO)) ' 氫醌(來自希源了公司）及UVB照射。UV照射法係使用UVB Fs光 =生於曝光室中，拿掉上蓋，於下隔間中含有魏鹽緩衝理食鹽水（PBS，來自奇布可公司（Gibe()_BRL， -23- t紙張尺度適用中國-------- α'华（CNS ) Λ视枱（210X 297公龄） 557216 經滴部中央標唪局員工消費合作社印 A7 B7 五、發明説明（22 )

Gaithersburg，MD))之存在下進行。以uvx放射計 (UVP 公司（UVP Inc” San Gabriel，CA))測定 UVB 強度。以0·1-0·12焦耳/平方公分處理同等物。接受至、高〇·3焦耳/平方公分處理之同等物並未出現存活力喪失之情形。曝露到試驗化合物/紫外光照射後第四天·，同等物固定，切片丞染色，或不切片即完全染色。美拉諾達姆同等物經雙ϋ色色’置入石壤塊内，自美拉諾達姆同等物上切下切片，並依下列標準方法染色：（l)H&E，(2)D〇PA + H&E及(3)佛塔納一馬森（f&m)，其係採用相關技藝上已知之標準技術進行。或煮，將整個美拉諾達姆同等物染色’並照像’進行影像分析。每個同等物;^至少三#切一 #，每項實驗處理三個同等物。每禎實驗重覆三次。 DOPA為酪胺酸酶之受質。F&M可鏗別硝酸銀還原性分子，丼主要鑑別黑色素。採用F&M染色之切片，使用

Optomax 影像分析系統(Optomax Image Analysis Systems， from Optomax Inc·，Hollis，NH)分析影像。或者，於

Gateway 2000 P5-100 電腦（Media Cybermetics，Silver Springs，MD)上使用 Empire Images database 1.1 照像。採用Image Pro Plus 4.0版分析影像，測定之變數如下： Optomax系統測定⑴個別黑細胞内之色素形成程衰及⑺ 每個視界之形成色素之黑細胞數目，Image Pro系‘測定> (1)黑細胞内銀沈積之表面積，及(2)有色素形成之黑細胞 -24- ^ 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公势） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *訂 557216 A7 B7 五、發明説明（23 ) 數目。採用Optomax系統，每處理使用三重覆同等物之多份切片，測定60個黑細胞中，各黑細胞内之銀沈積表面積。計算此等切片中每個視界内之黑細胞數>。“色素形成作用因數”之定義為各黑細胞内銀沈積之平均表面積，采以每個視界有色素形成之黑細胞數。將未處理之對照值數值定為1 ,處理組之數值則相對於其對照組標準化。採用Image Pro系統，可測定整個同等物之硝酸銀沈積表面積及黑細胞數目。將未處理之對照組數值定為i，處理組之數值則相對於其對照組標準北。圖1A說明當曝露到苯甲醛(5〇/zM)、氫醌(5〇//M)及 UVB照射（0.12焦耳/平方公分）處理時，由整個同等物/Image Pro系統測定及計算相對色素形成作用增加或減少之結果。使人類表皮同等物亦曝露到蛋白酶抑制劑混合物處理，該蛋白酶抑制劑示於下圖A。蛋白酶抑制劑可來自百靈公司（Boehringer Mannheim of Indianapolis，in)。採用來經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 自百靈公司之Complete®蛋白酶抑制劑混合物（Pr〇tease Inhibitor Cocktail)藥錠，其含有胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰萃取物及胰蛋白酶。大豆胰蛋白酶抑制劑（“STI”）可來自希格馬公司，且溶於50毫克/毫升微脂粒載劑或1XPBS中。此試管内實例所採用之所有其他蛋白酶抑制劑均溶於1 X PBS 中。GDL微脂粒之製法述於上述尼米亞克等人之文獻中， -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公餘） 557216 Α7 Β7 五、發明説明（24 ) 但改變下列幾點：非離子性微脂粒調配物含有二月桂酸甘油酯(伊姆林特公司Emulsynt GDL，ISP Van Dyk)/膽固醇 (克洛達公司（Cr〇da)) /聚氧乙烯-10-硬脂醚(Brij 716, ICI)/聚氧乙稀_9·月桂醚，比例為37 5:12 5:33 3:16 7。採用Hepes緩衝劑，〇.05Μ，ρΗ 7·4 (奇布可公司⑺比⑺-BRL of Gaithersburg，MD)作為製備微脂粒之水相。此等蛋白酶抑制劑之混合物與絲胺酸蛋白酶抑制劑之不同組合均用於試驗其影響黑色素形成作用之能力。如圖1B所示，有些絲胺酸蛋白酶，尤指STI(大豆胰蛋白酶抑制劑）對抑制黑色素形成作用非常有效。〜表 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j -訂經濟部中央標準局貝工消费合作社印製試驗調配物Complete®Mix-1Mix-2

STI 成份完全蛋白酶抑制劑混合物-x25 絲胺酸蛋白酶抑射劑_9〇微克/毫升苯曱基-績醯基財‘PMSF”)及 50微克/毫升L-1-氣-3-〔4-甲苯磺醯胺基〕-4-苯基丁酮(“TPCK”）. 絲胺酸蛋白酶抑制劑_〇·1微克/毫升抗蛋白酶肽， 50微克/毫升大豆胰蛋白酶抑制劑 (sti ) ’ 5〇微克/毫升抗纖維蛋白酶狀與〇·25微克/毫升(l_1-氣-3-〔4-曱苯續醯胺基〕-7-胺基-2-庚終HC〇(“TLCK，，)、大豆胰蛋白酶抑制劑-1毫克/毫升 -26- 本紙張尺度適用中國國家標唪（CNS)A4規彳Μ 210X 297公筇） 557216 A7 B7 五、發明説明（25 ) 實例2 :色素形成作用中涉及一植暴在鱗活化之受艘一實例1證實STI減少色素形成作用。STT抑制胰蛋白酶。因為已知胰蛋白酶會活化TR與PAR-2，因此吾等試驗TR及PAR-2在色素形成作用中可能涉及之程度。美拉諾達姆人類表皮同等物每天經TR及PAR-2促效劑及下表 B所示之拮抗劑處理，共3天。第4天時，收穫樣本，固定，並進行DOPA、H&E或F&M染色。由組織學及完整之同等物檢查結果發現處理後之色素形成作用發生變化。圖2說明本實例之結果。如圖所示，PAR-2狀:促效劑· SLIGRL在各黑細胞中誘發色素形成作用。以北合物）） ' r (一種凝血酶與胰蛋白酶之抑制劑）處理後，則減少色# 形成作用。 \ . 圖I出示本案實例之實驗結果，代表美拉諾達姆同夺物經1¼及PAR-2試劑處理後之色素形成作用程度。、 1 ' 經滴部中央標率局貝工消费合作社印^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SUGRL· (—種PAR-2促效劑）大幅增加色素开>成作用各表示PAR-2可能涉及色素形成作用。水蛭素（一種凝土酶專一性抑制劑）及TFLLRNPNDK (—種TR選擇性促效劑）對色素形成作用沒有效應。然而SFLLRN (—種專一性較低之TR促效劑）則展現淡化或減少色素形成作用之傾向。此表示TR涉及色素形成作用之程度較低。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规枱（210X297公垃） 557216 Α7 Η 7 五、發明説明（26 )

表B 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 TR與PAR-2試劑說明凝血酶活化TR 胰蛋白酶活化TR與PAR-2 TFLLRNPNDK TR肽促效劑-僅活化TR SLIGRL PAR-2肽促效劑-僅活化PAR-2 SFLLRN TR肽促效劑-活化TR，與PAR-2 交叉反應、 FSLLRN 混合肽-無活性水蛭素凝血酶之專一性抑制劑 / 化合物I 凝血酶與腺蛋白酶抑制劑實例3:蛋白酶活化受體訊號舆黑色素形成作用之間之劑量-效應&係依實例2之相同方式，以0、10及50μΜ逐漸增加濃度之SLIGRL (PAR-2肽促效劑)處理美拉諾達姆同等物。第四天時進行F&M染色。如圖4Α所示，SLIGRL ( PAR- 2活化劑）濃度增加，造成色素形成作用增加。胰蛋会酶 (種PAR_2活化劑）亦有相同效果。以ο ! pM斧I" Μ逐漸提高濃度之化合物I (凝血酶與胰蛋白酶抑制劑）處理，則捧成色素形成作用減少（見圖4Α)。接受UVB 照射同等物進行前處理，則相對於未處理對照組增加黑色 -28- 、、 ”、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4规枱（210X 297公垃） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 Φ. • Hr I —ΙΓ 557216 經漪部中央標準局員工消费合作社印製 A7 Η 7 五、發明说明（27 ) 素形成作用。化合物I亦可以減少UVB所誘發之色素瑕成作用（圖4B)。此實例證明PAR-2訊號所調節色素形成作用增加及減少效果具有劑量-效應關係。此實例亦證實化合物1可抑制色素形成作用並防止UV誘發色素形成作用。 - 實例4 : PAR-2表現在角質細胞中而非黑細胞中先前技藝曾證實PAR-2與TR表現在角質細胞與纖維母細胞中。本實例證明PAR_2表現在角質細胞中而非黑細胞中。此外，亦證明TR同時表現在角質細胞與黑細胞中。為了證明此點，使美拉諾達姆人類表皮同等物、人類原發黑細胞培養物（新生兒與成人，來自克隆尼克公司， Clonetics of San Diego，CA)及克勞曼(Cloudman S91 小白鼠黑色素瘤細胞，（來自ATCC (ATCC of Rockville，MD)) 於培養基中生長，並採用來自"Tel-Test B"之"RNA Stat-60"試劑’依克姆辛斯基(Chomczymski)述於"利用酸硫氰酸胍-苯酚-氣仿萃取法分離RNA之步驟法"（Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidium Thiocyanate-Phenol-Chloroform extraction) 5 162 Anal, Biochem, 156-69 (1987))之方法萃取總RNA。添加足量之不含RNase之 DNase (來自普美加公司，promega Corporation)，商標名稱 "RQ1 RNase-free DNase"至各樣本所萃取出之rnA中， -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4WL彳μ 210X 297公 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-T1J 557216 經漪部中央標率局貝工消费合作社印裝 A7 137 五、發明説明.（28 ) 使得各產物中產生200毫微克DNased-RNA，其係使用美加公司1995年5月出版之"不含RNase之DNase，，(RNase-free DNase)之方法測定。所得之200毫微克DNased_RNA 依奇布可公司（GIBCO-BRL，現稱為生命技術公司（Life Technologies，Incorporated) 1992 年 4 月公佈之方法"上標 Π 逆轉錄酶”（Superscript II Reverse Transcriptase)進行逆轉錄("RT")其係使用隨機六聚體如：自生命技術公司購得之隨機引子進行。所得之RT產物再利用聚合酶鏈反應（"pcr”），使用約〇·5單位(每1〇〇微升反應)熱安定之DNA聚合酶(購自柏金艾瑪-希圖斯公司，perkin-Elmer-Cetus Corporation)。商品為”Tacl聚合酶"(Taq Polymerase))及約〇·1微莫耳/反應TR與PAR_2專一性引子（述於表^及馬休斯 (Marthinuss)等人，1955,該文獻已併為本文之參考文獻）或戊二搭-3-磷酸酯脫氫酶(G3PDH)引子（來白克隆特實驗室，

Clontech Laboratories，Inc· of Palo Alto, CA))根馬休斯等人1955年所述之方法或克隆特實驗室提供該引子之方法進行擴增。 PRC產物再使用2〇/〇瓊脂糖/溴化_3,8二胺基乙基_ 6-苯基菲啶錆凝膠，使用相關技藝已知之方法分析，以比較某些基因在角質細胞及黑細胞中之表現程度。當需要進 -30- 本紙張尺度適用中國國豕榡準（CNS )八4規枋（210X29?公棼） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :訂經满部中央標準局貝工消費合作社印裝 557216 A7 ----- ΙΠ 五、發明説明（29 ) 一步檢視時，根據習知方法，以乙醇使所得之PCR產物沈殿’當使用G3Pdh引子時，僅使用10% PCR反應產物。採用未經逆轉錄之來自表皮同等物之RNA樣本作為各pCR擴增作用之陰性對照組。當凝膠上未出現相關條帶時，則表示缺乏基因組DNA雜質。若無法自商品購得時，採用經逆轉錄之人類皮膚RNA樣本作為陽性對照組。RT-PCR產物在凝膠上之移動總是與陽性對照組相同’且與報告中提出之擴增物大小相同。各RT-PCR反應產物之相對量則藉由分析各產物中 G3PDH("家管基因"(housekeeping gene)之 mRNA 含量進行比較。如圖5與6所示，所有進行檢視之時間點下，發現 G3PDH基因表現均相似，因此可由所需基因比較基因表現之相對表現程度。圖5A出示TR與PAR-2如所預料地表現在所有皮膚中及美拉諾達姆同等物（"MD”）中。而S91黑色素瘤細胞 ("S91”)則未表現PAR-2或TR。為了進一步探討，吾等測試原發新生兒(”mel_NB")與成人("mel-A")黑細胞之TR與 PAR-2表現。如圖5B所示’原發人類黑細胞表現tr但不表現PAR-2。因此’吾等$忍為PAR-2促效劑與拮抗劑可與美拉諾達姆同等物中之角質細胞交互作用，但不與黑細胞交互作用，而TR促效劑及拮抗劑可同時與角質細胞及黑細胞交互作用。因此認為當角質細胞-PAR-2訊號轉 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公龄） IJ, #1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

V1T 557216 經滴部中央標率局貝工消费合作社印裝五 Μ _____ Η7 ' … ---- 11 —發明説明（3〇 ) 換成色素形成作用終點時，表示有角質細胞-黑細胞交互作用。表C出示所使用之一些dna引子，PCR反應所需之 MgCl2用量，及PCR循環時間。表C RT-PCR分析法採用之DNA引子引子 (見序列附表） MgCl2用量 (mM) 循環 (分鐘） @°C No. of Cuycles 循環次數 DNA 序列 ID No. 酷胺酸酶有意義引子 TCAGCCCAGC ATCCTTCTTC 1.25 1@94 2@55 3@72 35 1 酪胺酸酶反義引子 CAGCCATTGT TCAAAAATAC-TGTCC 1.25 1@94 2@55 3@72 35 2 TRP-1有意義引子 5，CC ACTCTAATAAGCCCAAAC 2.5 1@94 2@55 3@72 35 3 TRP-1反義引子 5，CTCAGCCATTCATCAAAGAC 2.5 1@94 2@55 3@72 35 4 TRP-2有意義引子 5，AAAAGACATACGAGATTGCC 2.5 1@94 2@55 3@72 35 5 TRP-2反義引子 59CACAAAAAGACCAACCAAAG 2.5 1@94 2@55 3@72 35 6 -32- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *訂 Φ. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（ 210X 297公焓） 557216 五、發明説明（3i ) 胰蛋白酶有意義引子 5，AT〇yrACTCCTGATCCTTACC 2.5 1@94 2@45 3@72 35 7 胰蛋白酶反義引子 1@94 5，TGTCATTGTT/CCAGAGTCT/- 2.5 2@45 35 8 CT/GC/GC 3@72 PAR-2有意義引子 5@94 GGGAAAGGGGTTGGGGTAGAA 2.5 1@55 30 9 CCAGGCTTTTCC(55) 3@72 PAR-2反義引子 5@94 GGCCAACGGCGATGTTTGCCTT 2.5 1@55 30 10 CTTCCTGGGG(3，） 3@72 TR-有意義引子 5@94 CCTCTGAGTGCCAGAGGTACG- 2.5 1@55 30 11 TCTACAG(5，） 3@72 TR-反義引子 5@94 CCTAAGTTAACAGCinrTTTGTAT 2.5 1@55 30 12 ATGCTGTTATTC AGG(3，） 3@72 凝血酶有意義引子 5@94 AACCTGAAGGAGACGTGGAC(3, 2.5 1@55 3@72 30 13 凝血酶反義引子 5@94 CAGGAGCCCAGAATATGAGTC( 2.5 1@55 3@72 30 14 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例5:化合物I之色素形成效果所需之角質細胞-黑細胞接觸作用實例4結果顯示，單獨黑細胞無法反應PAR-2拮抗劑 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X29*7公梦） 557216 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（3¾ ) 之脫除色素效果。事實上，可因氫醌及苯甲醛減少人類原發黑細胞或受霍亂弧菌素毒素誘發之s6l钿胞之色素形成作用程度並未受化合物I影響。由於PAR-2未表現在黑細胞中，吾等測試化合物I之脫除色素作用效果可能需要之角質細胞-黑細胞交互作用，由原發黑細胞培養物塗佈在表皮同等物(EpiDern，缺少黑細胞）下，造成一種不含與角質細胞及黑細胞接觸之共培養物’與相同之原發黑細胞培養物比較。亦與美拉諾達姆同等物比較，後者之黑細胞則出現在同等物之基底層中。以化合物I、PAR-2促效劑SLIGRL及TR促效劑 TFLLRNPNDK(示於表D)處理續養物3天，第4天時，以 DOPA染色。表D中，角質細胞以"κ”表示，黑細胞以 f’M"表示而缺少角質細胞-黑細胞接觸者則以”無K-m接觸’’表示。如表D所示，經此等處理之在原發黑細胞及共培養物中未觀察到對色素形成作用之影響。在姜拉諾達姆同等物中，化合物I減少色素形成而SLIGRL誘發色素形成，但TFLLRNPNDK則無效果。此等結果證明PAR-2對色素形成作用之效果需要角質細胞-黑細胞接觸。 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X297公餘） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂 557216 五、發明説明（33 ) A7 J37

表D 處理黑細胞(無K) 共培養 (無K_M接觸) 美拉諾達姆 (K：_M接觸）化合物I 無效果無效果淡化 SLIGRL 無效果無效果加深 TFLLRNPNDK 無效果無效果無效果 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本声)

實例6:影響黑細胞基因表現之化合物I 以逐漸提高濃度之凝血酶與胰蛋白酶抑制劑，化合物 Ϊ或逐漸提高濃度之PAR-2促效劑SLIGRL處理美拉諾達姆同等物。依上述實例4之方法，採用RT-PCR法分析自未處理及經化合物I處理之同等物萃取之RNA之基因表現。指定之基因專一性引子示於上表C，且以人類 G3PDH之克隆特引子用於實例4。用於試驗表現程度之黑色素形成基因為酪胺酸酶、TRP-1與TRP-2。如圖6A所示，在經化合物I處理之樣本中觀察到 TRP-1中mRNA含量隨劑量增加而減少之結果，而TpR-2 中mRNA含量隨劑量增加而增加之結果。但酪胺酸酶之表現不受影響。此等變化與此抑制劑之隨劑量變化之美白效果呈相關性。這兩種基因表現形態均造成美白效果。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规梠（210X29*7公f ) 訂經濟部中央標準局負工消費合作社印聚 557216 經濟部中央標率局貝工消费合作社印製 A7 137 五、發明説明（34 ) TRP-2酵素使胺基二氧環己二烯丙酸轉化成5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)而非5,6-二羥基吲哚(DHI)。此過程產生褐色之微細分佈之真黑素，而非不可溶解之黑色真黑素，因而造成較淡之皮膚色調。TRP-1可安定形成黑色素之複合物，可以產生色素。TRP-1含量減少則降低了酪胺酸酶活性並減少色素形成。缺少此蛋白質則造成白化症。然而增加SLIGRL濃度卻未影響黑色素形成基因之表現（圖 6B)。 TRP-1與TRP-2為黑細胞專一性。化合物I抑制胰蛋白酶與凝血酶。水蛭素為凝丘酶專一性抑制劑，但對色素形成作用沒有影響，此點可見於上述實例2。因此吾等決定測定蛋白酶與凝血酶是否可於皮膚中表現。設計一種可同時探測腦部與胃部胰蛋白酶之探針（如表C所述）來探測得自因維基因公司（Invitrogen of Carlsbad，CA)之總皮膚mRNA樣本及美拉諾達姆同等物之mRNA之表現。在凝血酶中可探測到相同表現形態。胰蛋白酶與凝血酶均未表現在正常黑細胞中（圖5A，B)-此等數據顯示，若胰蛋白酶活化PAR-2，則僅由角質細胞產生。如圖6A所示，以化合物I處理會提高胰蛋白酶之表現。不影響黑色素形成作用基因表現之SLIGRL(如圖6B)亦在同等物中增加胰蛋白酶表現。吾等之結論為雖然胰蛋白酶可能為皮 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公# ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -•訂 557216 A7 經濟部中央標率局負工消費合作社印奴五、發明说明（35 ) 膚中PAR-2之天然活化劑，進而可能影響色素形成作用，但其mRNA含量並未與色素形成作用具有相關性。此點表示，表皮中另有一種受化合物I、STI等等抑制之未鑑別出之絲胺酸蛋白酶為PAR-2之天然活化劑。誘發或抑制此蛋白酶之化合物即可分別作為膚色加深劑及淡化劑。實例7:於活體内影響色素形成作用之凝血酶舆胰蛋白酶抑制劑與PAR-2促效劑取兩隻天竺鼠，於每隻一邊有色素形成之乳頭上，以含1及10//M化合物I之7〇 : 30乙醇：丙二醇載劑處理，一天2次，一週處理5天，歷時7週。每隻動物之另一邊乳頭則僅以載劑處理，並作為對照組。處理7週後、，色度計測定顯示隨劑量變化之淡化效果分別為+9.6L*單位及幾近18L*單位，同時未觀察到可見之刺激症狀。每組三隻天竺鼠，共四組，分別接受1〇βΜ化合物 I、SFLLRN、FSLLRN 及 SLIGRL 處理，一天二次，每週五天，歷時八週。六週後之色度計測定證明化合物I有淡化效果，SLIGRL (係PAR-2促效劑）則有加深膚色效果。本實例結果示於圖7。 -37- 本紙張尺度適用巾國國^^YCNS)峨彳& (21Gx297g^ '——- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

• -、1T άφ. 557216 Α7 Β7 五、發明説明（36 ) 實例8:於活體内影響色素形成作用之凝血酶舆胰蛋白酶抑制劑及PAR-2

以 10化合物 I、SFLLRN、FSLLRN 及 SLIGRL 處理Yucatan迷你豬。在豬之兩個部位施用各化合物一天二次，每週五天，歷時八週。處理八週後，測定色度，施用化合物I之結果造成可見之淡化效果。由色度計決定之結果可知，PAR-2促效劑SLIGRL造成加深膚色之效果。SFLLRN及FSLLRN則無顯著效果。經濟部中央標率局貝工消費合作社印紫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 兩隻Yucatan豬接受濃度逐漸提高之化合物I處理，一天兩次，每週五天，歷時七週半或十週。採用下列四種活性化合物濃度：〇、10、50及25〇βΜ。每種濃度施用在豬背部相對兩側。開始處理前及處理後每週二次測定色度。定期及實驗結束時均照像。在處理第4週、第5週及第6週時，分別在250、50及ΙΟμΜ處理組觀察到可見之淡化效果。第八週時，兩種最高劑量之美白效果相似。此4結果示於圖8。一隻豬於處理期間之色度計讀數 (L*’測定亮度）示於圖9。觀察到飽和效果，此效果隨時間及濃度變化。此實例證明在最類似有色素形成之人類皮膚之動物模式系統中，化合物I有顯著可見之脫除色素之效果。此等實驗結束時，取活體組織進行組織學及電子顯微 -38- 本紙張尺度通用肀國國豕標準（CNS ) Λ4規格（210χ 297公漦） 557216 A7 Η 7 經滴部中央標隼局貝工消費合作社印製五、發明説明（37 鏡（EM)分析。組織樣本經H&E及F&M染色。H&E染色法顯示皮膚結構中沒有刺激，發炎反應或變化，證明長期使用化合物I之安全性。F&M染色法證明經處理樣本之表皮基底層至表皮中之色素形成作用均減少。此等結果示於圖10中。未處理樣本及載劑處理樣本（圖l〇A)均相同且顏色最深。10/zM處理組（圖10B)顯示色素形成作用減少，而50及250//M處理組（分別為圖1〇c及 10D)則顯示顏色最淡。本實例結果顯示化合物I以較高濃度處理較短期時間或以較低濃度處理較長期時間時，可達到最大美白效果。因此可採用至少二種不同範圍來達到所需美白皮膚之結果。實例9 ··試管内及活«内之超結構性研究證實化合物1對皮膚之效果。於經過化合物I處理之美拉諾達姆同等物及豬皮膚位置進行超結構性分析。使用電顯微鏡，為經過化合物I處理之美拉諾達姆同等物分析黑色體之形成及分佈。經處理之樣本比未處理之對照組含有較多黑色體，但較少成熟之黑色體，亦即在黑細胞中顯著減少黑色素生產之黑色體 (圖ΙΙΑ’ΙΙΒ)。含黑色體之樹突很容易在經處理角質細胞中鑑定（圖11C)，但很難在對照組之角質細胞中發 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規梠（210X297公龄） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、-0 經漪部中央標率局貝工消f合作社印1i 557216 A7 B7 ^__一五、發明説明（38 ) 現。此結果表示有不正常之黑色體形成，且有緩慢或受損之黑色體移至經處理之樣本之角質細胞中。亦利用電子顯微鏡分析接受化合物I處理八週之 Yucatan豬之皮膚樣本（如實例8所述）。處理部位之角質細胞内之黑色體比對照組小且色素較少（圖11d、Ue 與11F)。此外，經處理皮膚内黑色體之分佈不正常。黑色體主要出現在表皮-真皮邊緣，而未處理對照組則隨機分佈（圖11G，11H)。雖然吾等無法歸納出其他機轉，但吾等認為經化合物I處理之角質細胞無法自現有之樹突中活性取得或接收黑色體。實例10 :化合物I之活體内脫除色素作用效果為可逆性以250 μ Μ處理Yucatan豬，一天二次，一週五天，歷時八週，共處理八個部位。由圖12 B可見，處理結東時，所有部位均展現可見之脫除色素作用。隨後四週（在實驗第九週時開始），追踪處理部位之顏色變，每週自二個處理部位取得二個活組織檢體。未處理部位亦取得活組織檢體。處理後一週及兩週目視觀察到脫除色素效果，第四週時則得到完全相反的結果。由經過F&M染色之皮膚切片之組織學檢查結果證實目視觀察到之色素再度形成作用（如圖12所示）。早在處理後一週時，由組織學證明色素再度形成作用。目視觀察結果與角質層色素形成作用 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规梏（21〇><297公^7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ":訂 557216 A7 Η 7 五、發明説明（39 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之組織學結果呈相關性。此實例證實化合物I不會對色素形成機轉誘發永久性傷害，且其效果在活體内具可逆性。圖12A出示未接受化合物I處理之部位之二個f&m染色之組織切片。圖12B出示接受化合物I處理八週之部位之二個F&M染色之組織切片。圖12C出示接受化合物！處理八週後，停止處理一週後之部位之切片。圖12D出示接受化合物I處理八週後，停止處理二週後之部位之切片。圖12E出示接受化合物I處理八週後，停止處理四週後之部位之切片。由圖12E可見，在處理後四週時，切片完全再度形成色素。實例11 :含ST1之天然衍生產物之製法實例1證明任何淡化膚色之調配物均需含有大豆胰蛋白酶抑制劑以提供其脫除色素活性。根據分析試驗，已測得大豆奶及大豆糊為大豆胰蛋白酶抑制劑之豐富來源。經漓部中央標率局貝工消費合作社印紫大豆糊之製法為先使大豆浸泡在去離子水或純水中數小時。研磨大豆使之完全水合化後，若需要時，加少量水使豆糊平滑。大豆奶之製法則依相同方式進行，但加較多量水。（研磨過程使大豆奶被萃取出）。收集到之大豆奶過濾，以去除任何殘留之種皮部份。製備大豆奶、大豆糊及味噌，用為含STI之天然材料，且可淡化膚色。 -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 枱（210X 297公穿） 557216 A7 B7 五、發明説明（40 ) 實例12 ··以影響PAR-2途經誘發色素脫除作用之天然材料處理經满部中央標攀局負工消费合作社印^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以衍生自大豆與賴馬豆之不同產物處理兩隻Yucatan 豬，一天二次，一週五天，分別歷時八週及十週。此等天然產物包括大豆糊、大豆蛋白質酸水解物、味噌、未煮沸大豆奶及經煮沸大豆奶、及市售大豆萃物產品（Actiphyte TM ’活性有機公司（Active Organics，Dallas，Texas)及純化 STI與來自大豆及賴馬豆之不同胰蛋白酶抑制劑製品。處理七週時，所有部位經目視觀查結果，均比週圍皮膚顏色淡’但接受煮沸過之大豆奶及大豆蛋白質酸水解物處理之部位除外。經處理部位之活組織檢體繼F&M染色後之組織分析結果證實大豆及賴馬豆產物有脫除色素效果。此等組織學數據實例示於圖13。煮沸過之大豆奶及大豆蛋白質水解物中缺少脫除色素活性之原因為此等製劑中之大豆蛋白質變性或降解所致。吾等之理論認為大豆及賴馬豆產物中之脫除色素活性劑分別為大豆胰蛋白酶抑制劑 (STI)及賴馬豆胰蛋白酶抑制劑（實例1出示STI於試管内之脫除色素效果）。本實例證實含胰蛋白酶抑制劑之天然萃物可用為影響PAR-2途徑之美白劑。實例13 ··微脂粒調配物中STI可淡化人類老年斑一位手背上出現三塊老年斑之患者接受下列處理，一 -42- 用中國國家標率（CNS)/Wjj^ (2丨ox297公处）經滴部中央標举局貝工消費合作社印^ 557216 A7 _______— B7 五、發明説明（41 ) ’ 一^ 天二次，共八週；最靠近臂之老年斑接受含2〇毫克/毫升微脂粒之安慰劑處理。中間的老年斑不處理。第三塊老年斑以含1% STI之微脂粒（20毫克/毫升）處理。GDL 微脂粒之製法依上述尼米亞克（Niemiec)等人所述，但改變下列幾點：非離子性微脂粒調配物含有二月桂基甘油酯（伊姆林特公司，Emulsynt GDL，ISD Van Dyk) /膽固醇（克洛達，Croda) /聚氧乙烯-ίο-硬脂醚（Brij %，ICI /聚氧乙稀-9-月桂基喊，比例37.5 : 12.5 : 33.3 : 16.7。採用Hepes緩衝液，〇·〇5Μ，ρΗ7·4，奇布可公司，Gibco BRL of Gaithersburg，MD)作為製備微脂粒之水相。於處理第〇、4及8週時，取得UV及可見光數位照片。採用

Adobe photoshop得到影像，計算L* (亮度）值。如圖14所示，經STI處理之老年斑於處理八週後變淡。圖14為四張照片之綜合圖。左圖八週處理（上圖）及處理後（下圖）之手部之可見光照片•依此方向，上面的老年斑為安慰劑處理組，中間的老年斑未處理，而下面的老年斑為STI處理組。右圖出示相同的手部在相同時點之 UV照像圖。uv光可以看見皮膚較深處之色素，此圖證實 STI之美白效果不是表面效果。圖14清楚地證實STI調配物可以淡化下面的老年斑。此STI處理部位經計算增加了 15個L*單位，進一步證實此處理可淡化老年斑之能力。 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210Χ 297公势） (請先閱讀背面之注意事項蒋填寫本ιίο l·訂 f 經濟部中央標準局貝工消費合作社印¾ 557216 __ 五、發明説明（42 ) 實例14 :含大豆奶之脫除色素調配物於製造大豆奶時發現，皮膚保養調配物需要極富柔軟性的豆奶。由於水係用為任何水包油性乳液之主要成份，因此吾等推想許多其他皮膚保養調配物中可使用大豆奶來替代此等調配物中之去離子水。然而，吾等認為此類調配物可能不具物理安定性，因為大豆奶中之油成份及水成份不互溶。但吾等卻驚人地發現，以此大豆奶替化水時，仍具物理安定性。使用大豆奶之調配物應含約1%至約99〇/〇大豆奶，以約80%至約95%大豆奶更佳。較佳者，此調配物及類似調配物應包含約〇%至5%粘性組份（約〇·ι至約 2%更佳），至多約20%之一種或多種軟化劑及/或約〇1 至約10%乳化劑（約3至約5。/❶更佳），及視需要選用約〇至約5%塗佈劑（約1至約2%更佳）、及防腐劑、螯合劑或保濕劑。防腐劑之含量應可有效完全防止豆奶腐敗並保持組合物之活性。其中並應包含足量稠化劑，以賦與調配物堅實度’不致於過粘影響塗佈性，例如含約〇至約10〇/〇，約3至約5%更佳。本發明組合物中亦可包含防晒劑、抗氧化劑、維生素或其他脫除色素劑及其他皮膚保養局部用成份。以大豆奶替代水之脫除色素調配物之特別佳實例示於下表Ε。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公郑） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 557216 A7 ΒΊ 五、發明説明（43 成份功能重量/%重量大豆奶載劑，脫除色素 84.9% 澱粉辛烯基琥珀酸鋁粘性組份 0.75% 環甲基矽酮塗佈劑 2% PEG 6-癸酸/辛酸三甘油酯軟化劑/乳化劑 3% 苯氧乙醇防腐劑 0.75% 蔗糖椰子酸酯軟化劑/乳化劑 1 % Na2EDTA 螯合劑 0.1% 甘油保濕劑 2.5% 聚丙烯醯胺；異鏈烷烴；月桂醇喊（laureth)-7 稠化劑 5 % (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經漓部中央標準局貝工消費合作社印繁 STI、大豆糊及其他含腺蛋白酶抑制劑之天然萃物可加至此等調配物中，以提高絲胺酸蛋白酶抑劑濃度。添加之活性成份用量範圍可佔調配物0.01%至15%。其他脫除色素劑（包括PAR-2抑制劑、酪胺酸抑制劑、氫醌、大豆產物、抗壞血酸及其衍生物，及其他有利於皮膚保養之成份亦可加至此調配物中。 -45-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公ITT 557216 A7 B7 五、發明説明（44 ) 實例15 :水包油性脫除色素調配物表F出示二種含水包油性乳液之脫除色素調配物，表 F第4欄出示含STI之調配物，其中STI可改由任何天然絲胺酸蛋白酶抑制劑或其含絲胺酸蛋白酶抑制劑之任何天然萃物或部份替代。含化合物I之類似調配物示於表F第 5攔。本組合物之化合物I可改由類似化合物或絲胺酸蛋白酶抑制劑或任何具有高醫療指數之PAR-2抑制劑物質替化(不論天然或合成物均可)作為活性成份。此等調配物中之成份建議含量範圍亦列於表F。此等調配物之去離子水含量亦可由大豆奶替代。

表F 相 CTFA名稱功能油鯨蠛硬脂基葡糖苷界面活性劑

Cnu烧基苯甲酸酯界面活性劑羥基硬脂酸辛酯軟化劑

-一甲基咬嗣塗佈齊J

環甲基梦_ 塗佈齊J 氣?壤基醇軟化齊！丁基化幾基曱苯抗氧化劑甲氧基肉桂酸辛酯防晒劑對氧苯甲酸丙酯防腐劑維生素E乙酸鹽抗氧化劑生育紛乙酸鹽抗氧化劑 -46- 本紙張尺賴财關家標^T^NS ) Λ4規;(“ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *7 Ή °/〇W/W %W/W 範圍 1.4 1.4 0.1-2.8 4.0 4.0 1-6 1.0 1.0 0-5 1.0 L0 0-5 1.0 1.0 0-5 2.5 2.5 0-4 1.0 1.0 0-0.5 6.0 6.0 0-10 0.5 0.1 0-0.5 0.5 0.5 0-0.5 0.5 0.5 0-0.5 經满部中央標準局員工消费合作社印奴 557216 A7 Η 7 五、發明説明（45 ) 甘油保濕劑 3.0 3.0 0-20 D-泛醯醇維生素原 0.5 0.5 0-5 EDTA 二納螯合劑，美白劑 0.1 0.1 0.01-1 對氧苯甲酸曱酯. 防腐劑 0.2 0.2 0-0.3 聚羧乙烯稠化劑 0.35 0.35 0-3 去離子水或大豆奶載體/美白劑 7635 77.5 50-80 STI或天然萃取物美白劑 1.0 0 0-15 化合物I 美白劑 0 0.25 0-1 (請先閱讀背面之注意事項蒋填寫本頁) 此調配物之製法為組合脂相之成份，於85°C下滿合，然後冷卻至60°C。在另一個容器中，緩緩添加聚羧乙烯至水或大豆奶中。混合10分鐘後，添加其餘水相成份’混合物加熱至60°C。合併兩相，混合10分鐘後，冷卻至室溫。當然，本實例及下列實例及本發明方法與組合物之其他具體實施例中，可在相同調配物中組合一種或多種脫除色素劑。實例16 :脫除色素作用組合物（水包油性乳液）表G出示另二項水包油性乳液脫除色素調配物實例。表G第3欄出示含STI調配物，其中STI可改用任何天然絲胺酸蛋白酶抑制劑或其含絲胺酸蛋白酶抑制劑之 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規桔（210X29?公势）争經濟部中央標準局員工消f合作社印製 557216 Μ 五 '發明説明（46 何天然萃物或部份替代。化合物I之類似調配物示於表 G第4欄中v合組合物之化合物〖可改用類似化合物或絲胺酸蛋白酶抑制劑或任何具高醫療指數之pAR-2抑制劑物質（不論天然或合成物均可）作為活性成份^此等調配物中之成份含量建議範圍亦列於表G。此等調配物中之去離子水含量可改用大豆奶替代。 f

表G (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 CTFA名稱功能％w/w %w/w較佳範圍乙醇溶劑 12.0 12.0 5-20 丙二醇溶劑 3.0 3.0 1_10 羥乙基纖維素稠化劑/聚合物 0.2 0.2 0-3 丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交鏈聚合物稠化劑/聚合物 1.0 1.0 0-3 泛醯醇(98%) 維生素原/保濕劑1.5 1.5 0.1-3 香料香料 0.5 0.5 0-0.5 異十六烷塗佈劑 4.0 4.0 0-5 維生素Ε乙酸鹽抗氧化劑 1.0 1.0 0-2 氫氧化納中和劑 0.35 0.35 〇.1-0.5 甘油保濕劑 3.0 3.0 0-20 去離子水或大豆奶載體/美白劑 72.2 71.95 60-80 化合物I 美白劑 0 0.25 (Μ STI或天然萃物美白劑 1.0 0 0-15 -48- 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（21〇χ297公筇）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 557216 五、發明説明（47 ) ---- _此調配物之製法為緩緩添加經乙基纖維素至水或大中肖拌至凡全溶解，在另—個容器内添加丙稀酸醋〇·30烧基丙_s旨交鏈合物，㈣至完全溶解。合併 :個容器内之成份，混合20分鐘，添加維生素E乙酸 ’見合後’添加異十六烧及泛醯醇（98%)。混合5分 :^、同添加STI或天然萃物化合物I與丙二醇，攪拌〃刀鐘。隨後，添加甘油，授拌調配物2Q分鐘。最後以氫氧化納調至_ (含STI者，範圍為6〜8·5)或PH7 (化合物1者，範圍為5·5〜8·5)。】17 ·脫除色素組合物（油包水性乳液）表Η出示一種含油包水性乳液之脫除色素調配物實例。表Η第4攔出示含STI調配物，其中STI可改用任何天然絲胺酸蛋白酶抑制劑或其含絲胺酸蛋白酶抑制劑之可天然萃物或部份替代。含化合物I之類似調配物示於表Η第5攔中。本組合物之化合物j可改用類似化合物或、、、糸胺酸蛋白酶抑制劑或任何具高醫療指數之pAR_2抑制劑物質替代（不論天然或合成物均可）作為活性成份。此等調配物中之成份含量建議範圍亦列於表H。此等調配物中之去離子永含量可改用大豆奶替代。 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準 ( CNS ) Λ4規格（210乂297公1^"7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

557216 A7 —__ B7 五、發明説明（48 ) 表Η 相CTFA名稱功能 %w/w %w/w 較佳範圍油礦物油軟化劑 25.0 25.0 40-80 山梨糖醇fif單油酸醋界面活性劑 5.0 5.0 1-6 硬脂醇軟化劑 25.0 25.0 20-60 二曱基矽酮塗佈劑 1·0 1.0 ν 1-5 鯨蠟醇軟化劑 2.0 2.0 0.1-10 氫化卵填脂抗氧化劑 3.0 3.0 0-10 Parsol MCX 防晒劑 3.0 3.0 0-10 對氧苯甲酸曱酯防腐劑 0.5 0.5 0.01-0.5 維生素E乙酸鹽抗氧化劑 0.5 0.5 0.01-0.5 甘油保濕劑 3.0 3.0 0-20 對氧笨甲酸丙酯防腐劑 0.2 0.2 0.01-0.3 水或大豆奶載體/美白劑 30.8 31.55 20-45 ST1 美白劑 1.0 0 0-10 化合物I 美白劑 0 0.25 0-1 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製此調配物之製法為取硬脂醇及礦物油於70〇c熔化。t添加其他油相成份，混合物加熱至75〇c。然後添加已先溶於水或大豆奶中且加熱至70°C之水相成份中，混合物授摔至凝結。 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规枱（210X 297^1^ 557216 ΑΊ _____Β7 五、發明説明（49 ) 實例18 ··脫除色素组合物（水性凝膠）表J出示二種含水性凝膠之脫除色素調配物實例。表 J第3欄出示含STI之調配物，其中STI可改由任何天然絲胺酸蛋白酶抑制劑或其含絲胺酸蛋白抑制劑之任何天然萃物或部份替代。含化合物I之類似調配物示於表J第4 攔。本組合物之化合物I可改由類似化合物或絲胺酸蛋白酶抑制劑或任何具有高醫療指數之PAR-2抑制劑物質替化(不論天然或合成物均可)作為活性成份。此等調配物中之成份建議含量範圍亦列於表J。此等調配物之去離子水含量亦可由大豆奶替代。

表J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經漪部中央標準局員工消费合作社印製 CTTA名稱功能％W/W %W/W較佳範圍 Octoxynol-13 界面活性劑 0.2 0.2 0.05-0.5 2,4-己二烯酸防腐劑 0-1 0.1 0-0.3 苯甲醇防腐劑 1.0 1.0 0-2 EDTA 二鈉螯合劑/防腐劑 0.05 0.05 0.01-0.2 抗壞血酸抗氧化劑 0.1 0.1 0-0.2 偏亞硫酸氮納抗氧化劑 0.2 0.2 0-0.3 聚羧乙烯稠化劑 1.5 1.5 0-3.0 20% NaOH 溶液中和劑 2.45 2.45 0.1-5 去離子水或大豆奶載體/美白劑 93.4 94.15 85-98 STI或天然萃物美白劑 1.0 0 0-15 化合物I 美白劑 0 0.25 0-1 -51- 本紙張尺度適财關家料.（CNS ) ( 2l0^2^^n 557216 A7 Η 7 經漪部中央標率局貝工消费合作社印製五、發明説明（50 ) 此調配物之製法為緩緩添加EDTA -細仏一奶、偏亞硫酿虱鈉及抗壞血酸至水中或大豆奶中，並授摔至6全六、止。然後添加STI、天然萃物或化合物丨，並緩緩為分鐘。然後提高攪拌速度，添加聚羧乙烯。組合2合2 30分鐘或至勻散液中沒有"魚眼"為止。（"房眼合勻散之透明結塊物），加熱至50。(：。在另一袖—、礼未牡为一個容器内，合併Octoxynol-13、2,4-己二烯酸，及笨甲醇，於。攪拌ίο分鐘，製成漿物。漿物再緩緩加至水相中5()c 合，冷卻至45。〇採用观氫氧化納溶液調整組合物= PH7。（範圍為5·5-8·5)。採用攪拌法或槳桿容器二人均勻止。 σ至實例19 :以溶劑為主之脫除色素組合物表Κ出示一種含溶劑之脫除色素調配物實例，表第3攔出示含STI之調配物，其中STI可改由任何天然絲胺酸蛋白酶抑制劑或其含絲胺酸蛋白抑制劑之任何天然萃物或部份替代〇含化合物Ϊ之類似調配物示於表κ第欄。本組合物之化合物〗可改由類似化合物或絲胺酸蛋酶抑制劑或任何具有高醫療指數之PAR_2抑制劑物質管化(不論天然或合成物均可)作為活性成份。此等調配物中之成份建議含量範圍亦列於表K。此等調配物之去離子水含量亦可由大豆奶替代。 -52- 本紙張尺度適用中HU家標準（CNS )爾彳& ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j -IL ϋ —I τ 、-口 K 絲 4 白替 557216 A7 五、發明説明（ 51 表κ CTTA名稱功能 %w/w 較佳範圍乙醇溶劑(1) 70 40-90 丙二醇溶劑(2) 29 1-40 去離子水載體適量 1-40 STI 美白劑 0 化合物I 美白劑 ΙβΜ 0.0000Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製此調配物之製法為取化合物J溶於水中。混合乙醇與丙二醇，與含化合物I之水溶液組合。總言之，吾等已證實角質細胞受體PAR-2之活化作用會提高色素形成作用。較佳者，此等活化作用可利用膜蛋白酶或SLIGRL或SLIKVD或其他SLIGRL或 SLIGKVD衍生物完成。吾等亦證實美白效果可利用絲胺酸蛋白酶抑制劑或PAR-2拮抗劑，及利用黑色體轉移阻斷劑達成。其他相關技藝上已知可抑制黑色體轉移至角質細胞中之化合物亦可用為脫除色素劑。化合物I ’ 一種姨蛋白酶及凝血酶抑制劑，可例如抑制黑色體轉移至角質細胞中。STI依相同機轉進行作用。未傳送之黑色體於黑細胞中累積即可能誘發負回饋機轉，延緩新的黑色體形成。TRR-1(黑色體中主要醣蛋白）之產 -53- 本紙張尺度適用中_家縣（CNS) Λ4·( 21GX297々#)

、1T • —L. n —l· 0 557216 A7 Η 7 五、發明説明（52 ) 生受到負向調節，造成酪胺酸酶不安定化。結果減少黑色素形成，使膚色轉呈淡褐色，因為TRR-1對TRP-2之比例下降了。接受化合物I處理後或STI處理後，黑細胞中之黑色體累積量因而減少，並改變了黑色素含量，提高了化合物I或ST1之美白效果。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規桔（210X297公§ )

Claims

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丨公告 ' —. 1 六、申請專利範圍專利申請案第87112280號 ROC Patent Appln. No. 87112280 修正之申請專利範圍中文本-附件（一） Amended Claims in Chinese - Enel· (I) (民國91年12月2日送呈） (Submitted on December 2, 2002) — L 一種用於減少哺乳動物皮膚色素形成之化妝組成物，其包含減少皮膚色素形成作用有效量之PAR-2拮抗劑為活性成分，其中該PAR-2拮抗劑係選自未變性大豆、大豆胰蛋白酶抑制劑或（S)-N-甲基-0-苯基丙胺醯基-N-[4-[(胺基亞胺甲基）胺基]-1-(2-苯并噻唑羰基）丁基]七-脯胺醢胺。 2·根據申請專利範圍第1項之化妝組成物，其中該PARee 2拮抗劑包含d-苯基丙胺酸-脯胺酸-精胺酸主體。 3·根據申請專利範圍第i項之化妝組成物，其中該PAR_ 2拮抗劑為黑色體轉移抑制劑。 4· 一種增加哺乳動物皮膚色素形成之化妝組成物，其包含增加皮膚色素形成作用有效量之PAR-2促效劑為活性成分’其中該PAR-2促效劑係以SLIGRL或胰蛋白酶為主。，經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 5·根據申請專利範圍第4項之化妝組成物，其中該Par_ 2促效劑為黑色體轉移加強劑。 6·根據申請專利範圍第1或4項之化妝組成物，其中該活性成分含量佔該醫藥組合物約0.0001%至約15%重量 /體積比。 7·根據申請專利範圍第6項之化妝組成物，其中該活性成分之含量佔該醫藥組合物約0.001至約5%。 -55 - 87294Β 本紙張尺度適用中國國家標準_)Μ規格（2ig χ29?公楚） 557216 A8 B8

8.根據申請專利範圍第7項之化妝組成物，其中該活性成分之含量佔該醫藥組合物約0.005至約1〇/。。 9_根據申請專利範圍第丨或4項冬化妝組成物，其包含約1至約99重量％之豆奶。 ^各 ι〇·根據申睛專利範圍第1項之化妝組成物，其包含大豆騰蛋白酶抑制劑，含量約0.01至約20重量％。 11·根據申請專利範圍第丨項之化妝組成物，其包含該影響色素形成作用之活性成分及化粧品上可接受之載劑。 12·根據申請專利範圍第u項之化妝組成物，其中該組成物尚包含其他色素脫除劑。 13·根據申請專利範圍第12項之化妝組成物，其中該組成物尚包含酪胺酸酶抑制劑。 14·根據申請專利範圍第1或4項之化妝組成物，其中該組成物尚包含微脂粒。 15·根據申請專利範圍第η項之化妝組成物，其中該組成物包含二月桂酸甘油酯、膽固醇、聚氧乙烯-10_硬脂基醚及聚氧乙烯-9-月桂基醚。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 16·根據申請專利範圍第1項之化妝組成物，其中該組成物尚包含抗氧化劑。 17.根據申請專利範圍第1項之化妝組成物，其中該組成物尚包含防晒劑。 18·根據申請專利範圍第丨或4項之化妝組成物，其中該組成物包含約1至約99%豆奶，约0.1至約20%乳化劑及有效量防腐劑。 .56 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 557216 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 19.根據申請專利範圍第1或4項之化妝組成物，其中該組成物尚包含選自下列之化合物：抗氧化劑、防晒劑、濕潤劑、漂白劑、色素脫除劑、界面活性劑、發泡劑、調和劑、保濕劑、香料、粘稠劑、緩衝劑、防腐劑及其混合物。 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）