DE69821913T2

DE69821913T2 - Verfahren zur behandlung der hautpigmentierung

Info

Publication number: DE69821913T2
Application number: DE69821913T
Authority: DE
Inventors: S. Stanley SHAPIRO; Susan Niemec; John Kung; Miri Seiberg
Original assignee: Johnson and Johnson Consumer Companies LLC
Current assignee: Johnson and Johnson Consumer Inc
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2018-07-24
Also published as: HUP0000216A2; IL129090A0; PL333284A1; TW557216B; JP2001502360A; US20120027706A1; AR016780A1; JP4401441B2; BR9806118A; EP0948308A1; CN1234735A; ES2215317T3; WO1999004752A3; KR100691395B1; ATE260083T1; CA2267077A1; BR9816322B1; JP2009114187A; US8039026B1; EP0948308B1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Herbeiführen von Hautpigmentierung und/oder zur Erzeugung von Haut-Depigmentierung. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf Verbindungen, die die Melanogenese beeinflussen und als depigmentierende Agenzien oder als Agenzien zur Dunklung der Haut verwendet werden können.
2. Hintergrund der Erfindung
Mit der Hautfärbung befaßt sich der Mensch seit vielen Jahren. Insbesondere die Fähigkeit, eine Hyperpigmentierung zu entfernen, wie sie z. B. bei Altersflecken, Sommersprossen oder beim Altern der Haut im allgemeinen vorkommt, ist für Personen von Interesse, die sich einen gleichmäßigen Teint wünschen. In bestimmten Regionen der Welt ist das allgemeine Bleichen des Körpers erwünscht. Es gibt ebenso Hypopigmentationsstörungen und Hyperpigmentationsstörungen, bei denen eine Behandlung erwünscht ist. Ebenso ist die Befähigung, ein gebräuntes Erscheinungsbild ohne eine Photoschädigung durch Sonneneinstrahlung hinnehmen zu müssen, für viele Personen wichtig. Es sind viele Verfahren vorgeschlagen worden, um eine Depigmentierung zu erreichen, ebenso, wie um eine Dunklung der Haut zu erzielen. Zum Beispiel wurden für die Depigmentierung Kojisäure, Hydrochinon, Retinoide und andere chemische Verbindungen verwendet. Dihydroxyaceton und ähnliche chemische Verbindungen wurden aufgrund ihrer Fähigkeit verwandt, der Haut einen „Teint" zu verleihen, ohne sie der Sonne auszusetzen.
Viele dieser früheren Lösungen wurden als nicht-akzeptabel befunden. Es gibt häufig eine deutliche Grenzlinie zwischen den Bereichen der Haut, auf die solche früheren Zusammensetzungen aufgebracht worden sind. Deshalb ist das genaue Aufbringen all dieser Verbindungen notwendig, um das erwünschte Ergebnis zu erzielen. Bei vielen dieser Verbindungen ist herausgefunden worden, daß sie relativ irritierend für die Haut und deshalb zur Verwendung unerwünscht sind.
Das Verständnis der chemischen und enzymatischen Grundlage der Melanogenese ist hinreichend dokumentiert. Melanozyten wandern aus der embryonalen Neuralleiste in die Haut, um sekretorische Granula, Melanosomen, zu erzeugen, die Melanin herstellen. Die Melanogenese geschieht innerhalb des Melanosoms und das Melanin wird später an die Keratinozyten über die Dendrite der Melanozyten verteilt. Das Schlüsselenzym der Melanogenese ist die Tyrosinase, welche eine Kaskade von Reaktionen initiiert, die Tyrosin zu dem Biopolymer Melanin umwandeln. Es sind zwei Tyrosinase-verwandte Proteine (TRP's) bekannt, TRP-1 und TRP-2. Diese Proteine weisen mit der Tyrosinase eine Homologie von ungefähr 40% auf und besitzen sowohl katalytische Aktivitäten als auch eine regulatorische Funktionen in der Melanogenese. TRP-1 ist das häufigste Glycoprotein in Melanozyten.
Trotz der Testsache, daß die chemischen und enzymatischen Grundlagen der Melanogenese gut dokumentiert sind, ist ihre Regulierung auf zellulärem Niveau nur teilweise verstanden. Tyrosinase und die TRP's teilen strukturelle und biologische Eigenschaften mit der Genfamilie der Lysosomal-assoziierten Membranproteine (LAMP) und daher könnte ihr zielgerichteter Transport in die melanosomale Membran ihre Aktivierung induzieren. Eine Phosphorylierungs/Dephosphorylierungsreaktion an den zytoplasmatischen Anhängen dieser Proteine könnte in die Regulierung der Melanogenese involviert sein. Es ist gezeigt worden, daß die beta-Isoform der Proteinkinase C (PKC)-Familie die humane Melanogenese über die Tyrosinaseaktivierung reguliert. Die Genexpression der Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 ist aufeinander abgestimmt. Alle drei Enzyme werden in der humanen Epidermis exprimiert. In Melanozyten, die mit Keratinozyten co-kultiviert wurden, sind diese Transkripte in einem entsprechenden Verhältnis von 45 : 45 : 10 exprimiert worden. In Melanozyten, die alleine kultiviert wurden, sind nur TRP-1-Transkripte vorhanden, was nahelegt, daß ein Keratinozytenentstammendes Signal in die aufeinander abgestimmte Expression dieser Gene involviert ist. Die Regulierung der Keratinozyten-Melanozyten-Interaktionen und der Mechanismus des Melanosomentransfers in die Keratinozyten ist bisher noch nicht verstanden.
Der Protease-aktivierte Rezeptor-2 (PAR-2) ist ein Sieben-Transmembran-G-Proteingekoppelter Rezeptor, der zwar mit den Thrombinrezeptoren verwandt ist (TR, auch PAR-1 und PAR-3 genannt), sich aber von diesen in seiner Sequenz unterscheidet. Beide Rezeptoren werden proteolytisch durch eine Arginin-Serien-Spaltung an der extrazellulären Domäne aktiviert. Der neu erzeugte N-Terminus aktiviert dann diese Rezeptoren als gebundene Ligan den. Beide Rezeptoren können durch Trypsin aktiviert werden, aber nur die TRs werden durch Thrombin aktiviert. Nur PAR-2 wird durch Mastzellen-Tryptase aktiviert. Beide Rezeptoren können also durch die Peptide aktiviert werden, die ihren neuen N-Termini entsprechen, unabhängig von der Rezeptorspaltung. SLIGRL, das PAR-2-aktivierende Peptid aus Maus, ist bei der Aktivierung des humanen Rezeptors gleich stark. Während die Funktion des TR gut dokumentiert ist, ist die Biologie des PAR-2 noch nicht vollständig identifiziert worden. Eine Rolle für die PAR-2-Aktivierung bei der Inhibition von Keratinozytenwachstum und -differenzierung ist kürzlich beschrieben worden (Derian et al., „Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth and Differentiation by a Novel Family of Proteaseactivate Receptors", Cell Growth & Differentiation, Vol. 8, pp. 743–749, July 1997).
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung haben wir ein Verfahren zur Beeinflussung von Veränderungen in der Pigmentierung von Säugetierhaut gefunden, das die topische Applikation einer Verbindung auf die Haut eines Säugetieres umfaßt, die den PAR-2-Weg beeinflußt. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können eine oder mehrere Verbindungen enthalten, die als Trypsin, als Tryptase, als Serinprotease oder als PAR-2-Agonist fungieren und zu einem Anstieg der Pigmentierung führen. Alternativ können sie ein oder mehrere Verbindungen enthalten, die als Serinproteaseinhibitoren, Trypsininhibitoren, Thrombininhibitoren, Tryptaseinhibitoren, als PAR-2-Weg-Inhibitoren oder als ein PAR-2-Agonist zur Verminderung der Pigmentierung oder „Depigmentierung" fungieren.
Wie hierin verwendet bedeutet „Säugetier" jedes Mitglied der höheren Vertebraten, umfassend die Klasse „Mammalia", wie in Webster's Medical Desk Dictionary 407 (1986) definiert ist und beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Menschen. Wie hierin verwendet soll „Rezeptor" sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Rezeptoren beinhalten und soll solche Moleküle meinen, die in der Lage sind, ein Signal zu empfangen und umzuwandeln. Der Begriff „PAR-2" bezieht sich auf den Protease-aktivierten Rezepor-2 oder einen verwandten Protease-aktivierten Rezeptor. Der Protease-aktivierte Rezeptor-2 (im folgenden „PAR-2") ist ein Serinprotease-aktivierter Rezeptor, der in zahlreichen Geweben exprimiert wird, einschließlich Keratinozyten und Fibroblasten. Der Thrombinrezeptor (auch genannt PAR-1, im folgenden „TR") ist ein Serinprotease-aktivierter Rezeptor, der in zahlreichen Geweben exprimiert wird, einschließlich Keratinozoyten. Die biologischen Funktionen von PAR-2 und TR in der Haut sind nicht vollständig bekannt. Wir haben jedoch herausgefunden, daß Interaktionen zwischen Keratinozyten und Melanozyten über den PAR-2-Weg die Melanogenese beeinflussen. Wir haben herausgefunden, daß Thrombininhibitoren und/oder Tryptaseinhibitoren und/oder Trypsininhibitoren und PAR-2-Antagonisten als depigmentierende Agenzien verwendet werden können, ohne die Haut zu reizen. PAR-2-Agonisten und Serinproteasen wie beispielsweise Trypsin und Tryptase können als Verdunklungsagenzien verwendet werden. Desweiteren könnte PAR-2 als Ziel für Bleich- und Verdunklungsagenzien verwendbar sein.
JP 09 025214 A offenbart ein äußerlich anwendbares dermales Agens zur Behandlung von Sommersprossen etc., welches einen Extrakt aus Yawar Piri-Piri enthält und von welchem angenommen wird, daß es als Hauptbleichungsmittel und Proteaseinhibitor verwendbar ist.
JP 04 169514 A offenbart ein äußerlich anwendbares Hautagens, welches rauher Haut vorbeugt und die Haut bleicht, und welches mindestens einen Proteaseinhibitor und mindestens eine Ketose enthält.
JP 09 025212 A offenbart ein äußerlich anwendbares dermales Agens, von dem angenommen wird, daß es zur Bleichung der Haut verwendbar ist, und welches ein Extrakt aus einer Pflanze enthält, die zur Familie der Apocymaceae gehört.
JP 08 099891 A offenbart ein Melanin-inhibierendes Agens, welches ein Extrakt aus Cucurbitaceae-Saat enthält.
JP 08 012560 A offenbart ein Agens zur Hautbehandlung, welches ein Extrakt aus der Copaiba-Pflanze enthält, und welches als Hautmelanozyteninhibitor verwendbar ist.
Chemical Abstracts, Vol. 123, Nr. 21, 20. November 1995 Columbus Ohio US; Abstract Nr. 281641 und RJ Santulli et al., (1995) P. N. A. S. USA, Vol. 92 (20): 9151–9155 legen das Vorhandensein eines Protease-aktivierten Rezeptors nahe, der sich vom Thrombinrezeptor in humanen Keratinozyten unterscheidet.
EP 473 502 offenbart eine Waschzusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen enthält, die eine Proteaseinhibitoraktivität zusammen mit dermatologisch akzeptablen Bestandteilen enthält.
US 4,906,457 offenbart Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung des Risikos auf Hautkrebs; die Zusammensetzungen beinhalten mindestens einen Proteaseinhibitor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine graphische Darstellung, die das Ansteigen oder Absinken der relativen Pigmentierung von epidermalen Äquivalenten darstellt, die Melanozyten enthalten, die mit bekannten pigmentierenden und depigmentierenden Agenzien im Einklang mit den Verfahren dieser Erfindung behandelt worden sind.
1B ist eine graphische Darstellung, die das Ansteigen oder Absinken der relativen Pigmentierung in epidermalen Äquivalenten darstellt, die Melanozyten enthalten, die im Einklang mit den Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden sind.
2 ist eine Gruppe von Bildern epidermaler Äquivalente, die Melanozyten enthalten, die mit PAR-2-Agonisten und Verbindung I behandelt worden sind.
3 ist eine graphische Darstellung, die das Ansteigen oder Absinken der relativen Pigmentierung in epidermalen Äquivalenten darstellt, die Melanozyten enthalten, die im Einklang mit den Verfahren und den Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden sind.
4A ist eine graphische Darstellung, die die Dosis/Reaktion im Hinblick auf die Pigmentierung in epidermalen Äquivalenten darstellt, die Melanozyten enthalten, wenn sie mit Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden sind.
4B ist eine graphische Darstellung, die die Reaktion von epidermalen Äquivalenten darstellt, die Melanozyten enthalten, nachdem sie ultraviolettem Licht ausgesetzt worden sind, gefolgt von einer Behandlung mit Zusammensetzungen dieser Erfindung.
5A ist ein Photo, das Gele darstellt, die die Expression von TR und PAR-2 in der Haut, Melanomzellen und epidermalen Äquivalenten zeigen, die Melanozyten enthalten.
5B ist ein Photo, das Gele darstellt, die die Expression von TR und PAR-2 in primären humanen Melanozyten zeigen.
6A und 6B sind Photos, die Gele darstellen, die die Expression von verschiedenen Genen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Verbindung I und SLIGRL zeigen.
7 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen verschiedener Zusammensetzungen dieser Erfindung auf die Helligkeit und Pigmentierung der Zitzen von Meerschweinchen zeigt.
8 ist ein Photo der Haut von Yucatan-Schweinen, die mit Zusammensetzungen dieser Erfindung zur Depigmentierung der Haut behandelt worden ist.
9 ist eine graphische Darstellung, die die Helligkeit der Haut von Yucatan-Schweinen während des Behandlungsverlaufs im Einklang mit den Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung darstellt.
10A, 10B, 10C und 10D sind Photographien von F&M-gefärbten histologischen Schnitten der Haut von Yucatan-Schweinen, behandelt mit Zusammensetzungen, die die Verbindung I im Einklang mit den Verfahren dieser Erfindung in entsprechenden Konzentrationen von 0, 10 μM, 50 μM und 250 μM enthalten.
11A, 11B und 11C sind Photographien elektronenmikroskopischer Ansichten auf epidermale Äquivalente, die Melanozyten enthalten, die mit Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden sind.
11E, 11F und 11H sind Photographien elektronmikroskopischer Ansichten auf die Haut von Yucatan-Schweinen, behandelt mit Zusammensetzungen dieser Erfindung.
11D und 11G sind Photographien elektronenmikroskopischer Ansichten unbehandelter Stellen der Haut von Yucatan-Schweinen.
12A, 12B, 12C, 12D und 12E sind Photograhien histologischer F&M-gefärbter Schnitte der Haut von Yucatan-Schweinen, wie folgt: 12A zeigt unbehandelte Haut; 12B zeigt die Haut, die mit Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden ist, acht Wochen nach der Behandlung; 12C zeigt die Haut eine Woche nach der Beendigung der Behandlung; 12D zeigt die Haut zwei Wochen nach der Beendigung der Behandlung und 12E zeigt die Haut vier Wochen nach der Beendigung der Behandlung.
13 ist eine Photographie von F&M-gefärbten histologischen Schnitten, entnommen der Haut von Yucatan-Schweinen, behandelt mit Zusammensetzungen dieser Erfindung.
14 enthält digitale Photographien mit ultraviolettem und sichtbarem Licht von humaner Haut vor der Behandlung und nach der Behandlung mit Zusammensetzungen dieser Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wir haben herausgefunden, daß Trypsin, Tryptase und PAR-2-Agonisten verwendet werden können, um die Pigmentierung zu steigern, und daß Trypsininhibitoren und/oder Tryptaseinhibitoren und/oder Thrombininhibitoren und PAR-2-Antagonisten zu einer Verminderung der Pigmentierung in der Säugetierhaut führen. Unserer Meinung nach sind einige der in US-Patent Nr. 5,523,308 beschriebenen Verbindungen in Verfahren dieser Erfindung verwendbar und verhalten sich wie Thrombin- und/oder Trypsin- und/oder Tryptaseinhibitoren. Einige dieser Verbindungen sind auch bei Costanzo, et al., „Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S₁' Subsite: Tripeptide Transition State Analogues Based on a Heterocycle-Activated Carbonyl Group", J. Med. Chem., 1996, Vol. 39, pp. 3039–3043 beschrieben und haben die folgende Strukturformel:
wobei:
A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_1-8-Alkyl, Carboxy-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxycarbonyl-C_1-4-Alkyl, Phenyl-C_1-4-Alkyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus ein oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Formyl, C_1-4-Alkoxycarbonyl, C_1-2-Alkylcarbonyl, Phenyl-C_1-4-Alkoxycarbonyl, C_3-7-Cycloalkylcarbonyl, Phenylcarbonyl, substituiertes Phenylcarbonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Di-Alkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), C_1-4-Alkylsulfonyl, C_1-4-Alkoxysulfonyl, Perfluor-C_1-4-Alkylsulfonyl, Phenylsulfonyl, substituiertes Phenylsulfonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 10-Camphersulfonyl, Phenyl-C_1-4-Alkylsulfonyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylsulfonyl, C_1-4-Alkylsulfinyl, Perfluor-C_1-4-Alkylsulfinyl, Phenylsulfinyl, substituiertes Phenylsulfinyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Phenyl-C_1-4-Alkylsulfinyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylsulfinyl, 1-Naphthylsulfonyl, 2-Naphthylsulfonyl oder substituiertes Naphthylsulfonyl (wo die Naphthylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, Carboxyl oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1-Naphthylsulfinyl, 2-Naphthylsulfinyl oder substituiertes Naphthylsulfinyl (wo die Naphthylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl);
eine D- oder L-Aminosäure, die an ihrem Carboxyterminus an den in Formel I dargestellten Stickstoff gebunden ist und ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus Alanin, Asparagin, 2-Azetidincarbonsäure, Glycin, N-C_1-8-Alkyglycin, Prolin, 1-Amino-1-cyclo-C_3-8-Alkylcarbonsäure, Thiazolidin-4-carbonsäure, 5,5-Dimethylthiazolidin-4-carbonsäure, Oxazo lidin-4-carbonsäure, Pipecolinsäure, Valin, Methionin, Cystein, Serin, Threonin, Norleucin, Leucin, tert-Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, 1-Naphthalamin, 2-Naphthalamin, 2-Thienylalanin, 3-Thienylalanin, [1,2,3,4]-Tetrahydroisochinolin-1-carbonsäure und [1,2,3,4]-Tetrahydroisochinolin-2-carbonsäure
wo der Aminoterminus der Aminosäure an ein Mitglied gebunden ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C_1-4-Alkyl, Tetrazol-5yl-C_1-2-Alkyl, Carboxyl-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxycarbonyl-C_1-4-Alkyl, Phenyl-C_1-4-Alkyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1,1-Diphenyl-C_1-4-Alkyl, 3-Phenyl-2-hydroxypropionyl, 2,2-Diphenyl-1-hydroxyethylcarbonyl, [1,2,3,4]-Tetrahydroisochinolin-1-carbonyl, [1,2,3,4]-Tetrahydroisochinolin-3-carbonyl, 1-Methylamino-1-cyclohexancarbonyl, 1-Hydroxy-1-cyclohexancarbonyl, 1-Hydroxy-1-phenylacetyl, 1-Cyclohexyl-1-hydroxyacetyl, 3-Phenyl-2-hydroxypropionyl, 3,3-Diphenyl-2-hydroxypropionyl, 3-Cyclohexyl-2-hydroxypropionyl, Formyl, C_1-4-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkylcarbonyl, Phenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1,1-Diphenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl, substituiertes 1,1-Diphenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Perfluor-C_1-4-Alkylsulfonyl, C_1-4-Alkysulfonyl, C_1-4-Alkoxysulfonyl, Phenylsulfonyl, substituiertes Phenylsulfonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 10-Camphersulfonyl, Phenyl-C_1-4-Alkylsulfonyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylsufonyl, Perfluor-C_1-4-Alkysulfinyl, C_1-4-Alkylsulfinyl, Phenylsulfinyl, substituiertes Phenysulfinyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1-Naphthylsulfonyl, 2-Naphthylsulfonyl, substituiertes Naphthylsulfonyl (wobei die Naphthylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1-Naphthylsulfinyl, 2-Naphthylsulfinyl und substituiertes Naphthylsulfinyl (wo die Naphthylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl): oder ein Polypeptid, das zwei Aminosäuren umfaßt, wo die erste Aminosäure eine D- oder L-Aminosäure ist, gebunden über ihren Carboxyterminus an den in Formel I dargestellten Stickstoff und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycine, N-C_1-8-Alkylglycin, Alanin, 2-Azetidincarbonsäure, Prolin, Thiazolidin-4-carbonsäure, 5,5-Dimethylthiazolidin-4-carbonsäure, Oxazolidin-4-carbonsäure, 1-Amino-1-cyclo-C_3-8-Alkylcarbonsäure, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-(C_1-4-Alkoxy)prolin, 4-(C_1-4-Alkoxy)prolin, 3,4-Dehydroprolin, 2,2-Dimethyl-4-thiazolidincarbonsäure, 2,2-Dimethyl-4-oxazolidin-carbonsäure, Pipecolinsäure, Valin, Methionin, Cystein, Asparagin, Serin, Threonin, Leucin, tert-Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, 1-Naphthalanin, 2-Naphthalanin, 2-Thienylalanin, 3-Thienylalanin, [1,2,3,4]-Tetrahydroisochinolin-2-carbonsäure, Asparaginsäure-4-C_1-4-Alkylester und Glutaminsäure-5-C_1-4-Alkylester und die zweite D- oder L-Aminosäure ist an den Aminoterminus der ersten Aminosäure gebunden, und sie ist ausgewählt aus der Gruppe besthend aus Phenylalanin, 4-Benzoylphenylalanin, 4-Carboxyphenylalanin, 4-(Carboxy-C_1-2-Alkyl)phenylalanin, substituiertes Phenylalanin (wo die Phenylsubstituienten unabängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 3-Benzothienylalanin, 4-Biphenylalanin, Homophenylalanin, Octahydroindol-2-carbonsäure, 2-Pyridylalanin, 3-Pyridylalanin, 4-Tiazolylalanin, 2-Thienylalanin, 3-(3-Benzothienyl)alanin, 3-Thienylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Asparagin, 3-tri-C_1-4-Alkylsilylalanin, Cyclohexylglycin, Diphenylglycin, Phenylglycin, Methioninsulfoxid, Methioninsulfon, 2,2-Dicyclohexylalanin, 2-(1-Naphthylalanin), 2-(2-Naphthylalanin), Phenyl-substituiertes P henylalanin (wo die Substituenten ausgewählt sind aus C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Asparaginsäure, Asparaginsäure-4C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Asparaginsäure, Asparaginsäure-4-C_1-4-Alkylester Glutaminsäure, Glutaminsäure-5-C_1-4-Alkylester, Cyclo-C_3-8-Alkylalanin, substituiertes Cyclo-C_3-8-Alkylalanin (wo die Ringsubstituenten Carboxy, C_1-4-Alkylcarboxy, C_1-4- Alkoxycarbonyl oder Aminocarbonyl sind), 2,2-Diphenylalanin und alle alpha-C_1-5-Alkyle aller Aminosäurederivaten derselben, wo der Aminoterminus an der zweiten Aminosäure nicht substituiert ist oder mit einem Mitglied der Gruppe monosubstituiert ist, bestehend aus Formyl, C_1-12-Alkyl, Tetrazol-5-yl-C_1-2-Alkyl, Carboxy-C_1-8-Alkyl, Carboalkoxy-C_1-4-Alkyl, Phenyl-C_1-4-Alkyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1,1-Dipehnyl-C_1-4-Alkyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl, Phenyl-C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-2-Alkylcarbonyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl-C_0-4-Alkylcarbonyl, Phenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylcarbonyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylaminn, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1,1-biphenyl-C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxycarbonyl), 10-Camphersulfonyl, Phenyl-C_1-4-Alkylsulfonyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylsulfonyl, C_1-4-Alkysulfinyl, Perfluor-C_1-4-Alkylsulfinyl, Phenylsulfinyl, substituiertes Phenylsulfinyl (wo die Phenylsubstituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), Phenyl-C_1-4-Alkylsulfinyl, substituiertes Phenyl-C_1-4-Alkylsulfinyl, 1-Naphthylsulfonyl, 2-Naphthylsulfonyl, substituiertes Naphthylsulfonyl (wo der Naphthylsubstituent ausgewählt ist aus C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl), 1-Naphthylsulfinyl, 2-Naphthylsulfinyl und substituiertes Naphthylsulfinyl (wo der Naphthylsubstituent ausgewählt ist aus C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-DiAlkylamino, Carboxy oder C_1-4-Alkoxycarbonyl); R₁ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Alkyl; R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-C_2-8-Alkyl, Guanidino-C_2-5-Alkyl, C_1-4-Alkylguanidino-C_2-5-Alkyl, di-C_1-4-Alkylguanidino-C_2-5-Alkyl, Amidino-C_2-5-Alkyl, C_1-4-Alkylamidino-C_2-5-Alkyl, di-C_1-4-Alkylamidino-C_2-5-Alkyl, C_1-3-Alkoxy-C_2-5-Alkyl, Phenyl, substituiertes Phenyl (wo die Substituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Amino, Amidino, Guanidino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Halogen, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkyl, C_1-3-Alkoxy oder Nitro), Benzyl, Phenyl-substituiertes Benzyl (wo die Substituenten unabhängig ausgewählt sind aus einem oder mehreren von Amino, Amidino, Guanidino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Halogen, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4- Alkyl, C_1-3-Alkoxy oder Nitro), Hydroxy-C_2-5-Alkyl, C_1-5-Alkylamino-C_2-5-Alkyl, C_1-5-Dialkylamino-C_2-5-Alkyl, 4-Aminocyclohexyl-C_0-2-Alkyl und C_1-5-Alkyl;
p 0 oder 1 ist;
B
ist,
wo N 0–3 ist, R₃ H oder C_1-5-Alkyl ist und die Carbonyleinheit von B an E gebunden ist;
E ein Heterozyklus ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oxazolin-2-yl, Oxazol-2-yl, Thiazol-2-yl, Thiazol-5-yl, Thiazol-4-yl, Thiazolin-2-yl, Imidazol-2-yl, 4-Oxo-2-chinoxalin-2-yl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, Benzo(b)thiophen-2-yl, Triazol-4-yl, Triazol-6-yl, Pyrazol-2-yl, 4,5,6,7-Tetrahydrobenzothiazol-2-yl, Naphtho[2,1-d]thiazol-2-yl, Naphtho[1-2-d]thiazol-2-yl, Chinoxalin-2-yl, Isochinolin-1-yl, Isochinolin-3-yl, Benzo[b]furan-2-yl, Pyrazin-2-yl, Chinazolin-2-yl, Isothiazol-5-yl, Isothiazol-3-yl, Purin-8-yl, und ein substituierter Heterozyklus wo die Substituenten ausgewählt sind aus C_1-4 von C_1-4-Alkyl, Perfluor-C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Amido, Nitro, Amino, C_1-4-Alkylamino, C_1-4-Dialkylamino, Carboxy, C_1-4-Alkoxycarbonyl, Hydroxy oder Phenyl-C_1-4-Alkylaminocarbonyl;
oder pharmazeutisch akzeptable Salze derselben.
Insbesondere sollten nach unserer Auffassung einige der Verbindungen der vorangegangenen Formeln, die ein d-Phenylalanin-Prolin-Arginin-Motiv enthalten, bei der Inhibierung des PAR-2-Wegs wirksam sein und eine Depigmentierung herbeiführen. Eine besonders bevor zugte Verbindung, die als ein Thrombin- und Thrypsininhibitor wirkt und bei der Depigmentierung von Säugetierhaut wirksam ist, ist (S)-N-Methyl-D-phenylalanyl-N-[4-[aminoiminomethyl)amino]-1-(2-benzothiazolylcarbonyl)butyl]-L-prolinamid (Name der Chemical Abstracts) (im folgenden als „Verbindung I" bezeichnet). Wir schlagen vor, daß andere Verbindungen die Analoga sind oder ähnlich zu Verbindung I funktionieren und im US-Patent Nr. 5,523,308 dargestellt sind, bei den Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung wirksam sind. Andere Verbindungen, die Trypsin inhibieren, wie beispielsweise Serinproteaseinhibitoren, und insbesondere Sojabohnentrypsininhibitor (STI) werden ebenfalls bei Verfahren dieser Erfindung verwendbar sein. Sojabohnen-, Limabohnen-, Schwarzbohnenextrakte und andere natürliche Produkte, hergestellt aus diesen Bohnen, wie beispielsweise aber nicht beschränkt darauf Bohnenmilch, Bohnenpaste, Miso und ähnliches, dienen ebenfalls dazu, die Pigmentierung mit Hilfe dieses Mechanismus zu reduzieren.
Weitere Quellen von Serinproteaseinhibitoren können aus den Spezies extrahiert werden, die zu den folgenden Pflanzenfamilien zählen: Solanaceae (beispielsweise Kartoffel, Tomate, Tomatilla und ähnliche); Gramineae (beispielsweise Reis, Buchweizen, Hirse, Weizen, Gerste, Hafer und ähnliche); Curcurbitaceae (beispielsweise Gurken, Kürbis, Flaschenkürbis, Luffa und ähnliche); und, bevorzugt, Leguminosae (beispielsweise Bohnen, Erbsen, Linsen, Erdnüsse und ähnliche).
Während die Erfindung nicht durch die folgende Theorie gebunden sein soll, schlagen wir vor, daß die Verbindungen, die in der Lage sind, die Pigmentierung der Haut zu beeinflussen, dies durch direkte oder indirekte Interaktion mit dem Keratinozyten-PAR-2 oder mit seiner aktivierenden Protease bewerkstelligen und dabei die Melanogenese, direkt oder indirekt, beeinflussen. Möglicherweise induzieren im Falle einer erhöhten Pigmentierung oder reduzieren im Falle einer verminderten Pigmentierung die Verbindungen dieser Erfindung das Signal zum Transport der Melanosomen durch die Melanozyten oder den Empfang von Melanosomen durch Keratinozyten in der Haut.
Die Verbindungen, die in den Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung aktiv sind, können durch jedes Mittel, das einem Fachmann bekannt ist, topisch verabreicht werden. Falls die Verabreichungsparameter des topisch aktiven pharmazeutischen oder kosmetischen Agens es notwendig machen, kann die topisch aktive Zusammensetzung dieser Erfindung weiterhin bevorzugt aus einem pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptablen Träger bestehen, der in der Lage ist, als ein Darreichungssystem zu funktionieren, das in der Lage ist, das Eindringen des topisch aktiven Agens in die Haut zu ermöglichen.
Ein akzeptabler Träger zur topischen Darreichung einiger der Zusammensetzungen dieser Erfindung, insbesondere Proteine wie beispielsweise Trypsin und STI, kann Liposomen enthalten. Die Liposomen sind besonders bevorzugt nicht-ionisch und enthalten a) Glycerindilaurat (bevorzugt in einer Menge zwischen ungefähr 5 Gew.-% und ungefähr 70 Gew.-%); b) Verbindungen, die das Steroidrückgrat haben, das in Cholesterin gefunden wird (bevorzugt in einer Menge zwischen ungefähr 5 Gew.-% und ungefähr 45 Gew.-%); und c) ein oder mehrere Fettsäureester, die ungefähr 12 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatome besitzen (bevorzugt in einer Menge, die gemeinsam zwischen ungefähr 5 Gew.-% und ungefähr 70 Gew.-% liegt), wobei die einzelnen Verbindungen der Liposomen bevorzugt in einem Verhältnis von ungefähr 37,5 : 12,5 : 33,3 : 16,7 liegen. Liposomen, die Glycerindilaurat/Cholesterin/Polyoxyethylen-10-Stearylether/Polyoxyethylen-9-laurylether (GDL-Liposomen) umfassen, sind am stärksten bevorzugt. Bevorzugt sind die Liposomen in einer Menge vorhanden, abhängig vom Gesamtvolumen der Zusammensetzungen, von ungefähr 10 mg/ml bis ungefähr 100 mg/ml, und besonders bevorzug von ungefähr 20 mg/ml bis ungefähr 50 mg/ml. Ein Verhältnis von ungefähr 37,5 : 12,5 : 33,3 : 16,7 ist am meisten bevorzugt. Geeignete Liposomen können bevorzugt in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das in Beispiel 1 dargestellt ist, hergestellt werden, wobei auch andere Verfahren, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden, ebenfalls akzeptabel sind. Die oben beschriebene Zusammensetzung kann durch Vermischen der erwünschten Verbindungen in einem geeigneten Behälter und durch Mischen derselben bei Umgebungsbedingungen in jedem herkömmlichen Mixer mit hohen Scherkräften, wie im Stand der Technik zur Herstellung nicht-ionischer Liposomen gut bekannt, wie solche, die bei Niemiec et al., „Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model," 12 Pharm. Res. 1184–88 (1995) („Niemiec") offenbart sind und welche durch Referenz in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden, hergestellt werden. Wir haben herausgefunden, daß das Vorhandensein dieser Liposomen in den Zusammensetzungen dieser Erfindung die Depigmentierungsfähigkeiten einiger der Zusammensetzungen dieser Erfindung verstärken kann.
Andere bevorzugte Formulierungen können beispielsweise Sojabohnenmilch oder andere flüssige Formulierungen enthalten, die direkt aus Hülsenfrüchten oder anderen geeigneten Pflanzen stammen. Beispielsweise kann solch eine Formulierung einen großen Anteil an So jabohnenmilch, einen Emulgator, der die physikalische Stabilität der Sojabohnenmilch erhält und wahlweise ein chelatisierendes Agens, Konservierungsmittel, Weichmacher, Feuchthaltemittel und/oder Verdickungsmittel oder Geliermittel enthalten.
Es können ebenfalls Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Lösungsmittelbasierende Formulierungen und wäßrige Gele, wie sie für einen Fachmann bekannt sind, als Träger zur Verabreichung der Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden.
Die Quelle der aktiven Verbindung, die formuliert werden soll, wird im allgemeinen von der jeweiligen Form der Verbindung abhängen. Kleine organische Moleküle und Peptidylfragmente können chemisch synthetisiert und in einer reinen Form zur Verfügung gestellt werden, die zur pharmazeutischen/kosmetischen Verwendung geeignet ist. Produkte aus natürlichen Extrakten können entsprechend der im Stand der Technik bekannten Verfahren extrahiert werden. Rekombinante Quellen von Verbindungen stehen dem Fachmann ebenso zur Verfügung.
In alternativen Ausführungsformen kann die topisch aktive pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung wahlweise mit anderen Bestandteilen wie z. B. Feuchtigkeitscremes, kosmetische Hilfsstoffe, Antioxidationsmittel, Bleichmittel, Tyrosinaseinhibitoren und andere bekannte depigmentierende Agenzien, Tenside, schaumbildende Agenzien, Pflegemittel, Feuchthaltemittel, Duftstoffe, Verdickungsmittel, puffernde Agenzien, Konservierungsmittel, Sonnenschutzmittel und ähnliches kombiniert werden. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können ebenfalls aktive Mengen an Retinoiden (d. h. Verbindungen, die an irgendein Mitglied der Familie von Retinoidrezeptoren binden), einschließlich beispielsweise Tretinoid, Retinol, Ester von Tretinoid und/oder Retinol und ähnliches, enthalten.
Die topisch aktive pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung sollte in einer wirksamen Menge aufgebracht werden, um Veränderungen in der Pigmentierung der Säugetierhaut hervorzurufen. Wie hierin verwendet bedeutet „wirksame Menge" eine Menge, die ausreichend ist, den Bereich der Hautoberfläche abzudecken, in der eine Veränderung der Pigmentierung erwünscht ist. Bevorzugt wird die Zusammensetzung frei auf die Hautoberfläche so aufgebracht, daß, basierend auf einem Quadratzentimeter Hautoberfläche, von ungefähr 2 μl/cm² bis ungefähr 20 μl/cm² des topisch aktiven Agens vorhanden sind, wenn eine Veränderung in der Pigmentierung erwünscht ist. Falls ein Thrombin- und Trypsininhibitor wie bei spielsweise Verbindung I oder seine Analoga verwendet werden, gleichgültig, ob diese in der Formulierung synthetischen oder natürlichen Ursprungs sind, sollte solch eine aktive Verbindung in der Menge von ungefähr 0,0001% bis ungefähr 15% bezogen auf Gewicht/Volumen der Zusammensetzung vorhanden sein. Bevorzugt sollte sie in einer Menge von ungefähr 0,0005% bis ungefähr 5% der Zusammensetzung vorhanden sein; besonders bevorzugt sollte sie in einer Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 1% der Zusammensetzung vorhanden sein. Natürlich sind diese Bereiche Vorschläge für die vorangegangenen Verbindungen. Von den unteren Werten der Bereiche wird angenommen, daß sie für Agonisten/Antagonisten und/oder Inhibitoren des PAR-2-Weg wirksam sind, die hohe therapeutische Indizes haben, und die keine wesentlich größeren Konzentrationen oder Dosen benötigen, um in den Verfahren dieser Erfindung wirksam zu sein. Solche Verbindungen können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein.
Flüssige Derivate und natürliche Extrakte, die direkt aus Pflanzen oder botanischen Quellen hergestellt worden sind, können in den Zusammensetzungen dieser Erfindung in einer Konzentration (w/v) von ungefähr 1 bis ungefähr 99% verwendet werden. Die Fraktionen natürlicher Extrakte und Proteaseinhibitoren natürlicher Herkunft wie beispielsweise STI können einen anderen bevorzugten Bereich von ungefähr 0,01% bis ungefähr 20% und besonders bevorzugt von ungefähr 1% bis ungefähr 10% der Zusammensetzung aufweisen. Natürlich können Gemische der aktiven Agenzien dieser Erfindung vereinigt und zusammen in derselben Formulierung verwendet oder in aufeinander folgenden Anwendungen der verschiedenen Formulierungen verwendet werden.
Wir haben unerwarteterweise herausgefunden, daß bei topisch aktiven Agenzien wie beispielsweise PAR-2-Agonisten und/oder -Inhibitoren und Trypsin und/oder Thrombin und/oder Tryptase und/oder ihren Inhibitoren wenn sie topisch auf eine Tierhaut aufgebracht werden, eine signifikante Veränderung in der Pigmentierung erreicht wurde. Bevorzug werden depigmentierende Agenzien (ebenso wie andere Agenzien dieser Erfindung, die die Pigmentierung beeinflussen) auf die Haut von einem Säugetier in einer relativ hohen Konzentration und Dosis (von ungefähr 0,005% bis ungefähr 1% von Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes aufweisen, wie beispielsweise die Verbindung I und verwandte Verbindungen; von ungefähr 20% bis ungefähr 99% für flüssige Derivate und Extrakte botanischer Materialien; und von ungefähr 1% bis ungefähr 20% für Fraktionen natürlicher Extrakte und Proteaseinhibitoren natürlicher Herkunft wie beispielsweise STI oder Gemische derselben) zwi schen ein- und zweimal täglich für eine Zeitdauer aufgetragen, bis die Haut eine Veränderung der Pigmentierung aufweist. Dies kann ungefähr 4 bis ungefähr 10 Wochen oder länger dauern. Danach, wenn die Veränderung der Pigmentierung erreicht worden ist, kann eine niedrige Konzentration und Dosis (von ungefähr 0,00001% bis ungefähr 0,005% für Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes haben, wie beispielsweise Verbindung I und verwandte Verbindungen; von ungefähr 10% bis ungefähr 90% für flüssige Derivate und Extrakte botanischer Materialien; und von ungefähr 0,01% bis ungefähr 5% für Fraktionen natürlicher Extrakte und Proteaseinhibitoren natürlicher Herkunft wie beispielsweise STI oder Gemische derselben) des aktiven Bestandteils in einem weniger stark frequentierten Zeitplan aufgebracht werden, z. B. ungefähr einmal pro Tag oder ungefähr zweimal pro Woche. Die Wirkungen der aktiven Agenzien dieser Erfindung sind reversibel und deshalb sollte, um diese Wirkungen aufrecht zu erhalten, eine kontinuierliche Anwendung oder Verabreichung durchgeführt werden. Die hierin in darstellender Weise offenbarte Erfindung kann geeigneterweise bei Abwesenheit irgendeiner Komponente, eines Bestandteils oder eines Schritts, der hierin nicht speziell offenbart ist, durchgeführt werden.
Im folgenden sind mehrere Beispiele dargestellt, um die nähere Art der Erfindung und die Art ihrer Durchführung zu erläutern.
Beispiel 1: Proteaseinhibitoren beeinflussen die Pigmentierung
Um die möglichen Rollen des PAR-2-Wegs bei der Pigmentierung untersuchen zu können, wurde in vitro ein epidermales Äquivalentsystem verwendet. Das verwendete epidermale Äquivalentsystem enthielt Melanozyten. Ein epidermales Äquivalentsystem, das zur Durchführung dieser Studien verwendbar ist, ist das MelanoDerm-System, das kommerziell von MatTek Co. zu erwerben ist. Dieses System enthält normale humane Melanozyten, zusammen mit normalen epidermalen Keratinozyten menschlicher Herkunft, die zur Bildung eines mehrschichtigen, hochdifferenzierten Modells der humanen Epidermis kultiviert worden waren. In den folgenden Beispielen wurden Äquivalente mit Testverbindungen für drei Tage behandelt, und am 4. Tag nach Beginn der Behandlung wurden Proben entnommen. Die geernteten Äquivalente wurden mit DOPA (einem Substrat für Tyrosinase) und H&E (einem histologischer Standardfarbstoff] oder mit einer Fontana-Mason (F&M)-Färbung, eine andere dem Fachmann bekannte Färbung, gefärbt. Die F&M-Färbung ist eine Silberfärbungstechnik, die klar und deutlich Melanine markiert, die eine hohe Silbernitrat-reduzierende Aktivität aufwei sen. Mehrschichtige humane epidermale Äquivalente, die Melanozyten enthalten, wurden als ein in vitro-Modellsystem verwendet, um die Wirkung der Proteaseinhibitoren auf die Melanogenese zu untersuchen. Die verwendeten epidermalen Äquivalente wurden kommerziell als MelanoDerm von MatTek Ashland, MA, bezogen. Diese Äquivalente sind dafür bekannt, auf ultraviolette B-Strahlung („UVB") und bekannte Bleichungsagenzien wie beispielsweise Benzaldehyd und Hydrochinon durch entsprechendes Ansteigen oder Absinken der Pigmentierung zu reagieren. Die epidermalen MelanoDerm-Äquivalente wurden Benzaldehyd (zu beziehen von Sigma aus St. Louis, MO), Hydrochinon (zu beziehen von Sigma) und UVB-Strahlung ausgesetzt. Die UV-Strahlung wurde mit Hilfe einer UVB-FS-Lichtquelle in einer Bestrahlungskammer durchgeführt, wobei die Plattendeckel entfernt wurden und eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, von Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) in der unteren Kammer vorhanden war. Die UVB-Intensität wurde mit einem UVX-Radiometer (UVP Inc., San Gabriel, CA) gemessen. Die Äquivalente wurden mit 0,1–0,12 J/cm² behandelt. Es wurde kein Verlust der Lebensfähigkeit der Äquivalente beobachtet, die mit bis zu 0,3 J/cm² behandelt worden waren.
Am vierten Tag der Behandlung mit den Testverbindungen/ultravioletter Strahlung wurden die Äquivalente fixiert, geschnitten und gefärbt oder als ganzes gefärbt, ohne sie zu schneiden. Die MelanoDerm-Äquivalente wurden mit Formalin fixiert, in Paraffinblöcke gegeben und die Schnitte der MelanoDerm-Äquivalente wurden in Übereinstimmung mit den folgenden Standardverfahren gefärbt: (1) H&E, (2) DOPA + H&E und (3) Fontana-Mason („F&M") unter Verwendung von Standardtechniken, wie sie einem Fachmann bekannt sind. Alternativ wurden ganze MelanoDerm-Äquivalente gefärbt und ihre Bilder zur Bildanalyse aufgenommen. Es wurden mindestens drei Schnitte pro Äquivalent und drei Äquivalente pro Experimente bearbeitet. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt. DOPA ist ein Substrat für Tyrosinase. F&M weist Silbernitrat-reduzierende Moleküle nach und identifiziert primär Melanine. F&M-gefärbte Schnitte wurden zur Bildanalyse unter Verwendung von einem Optomax Image Analysis Systems von Optomax Inc., Hollis, NH, verwendet. Alternativ wurde eine Empire Images database 1.1 auf einem Gateway 2000 P5-100 Computer (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) zur Erzeugung der Bilder verwendet. Die Image Pro Plus Version 4.0 wurde zur Bildanalyse verwendet. Die gemessenen Parameter waren wie folgt: (1) Grad der Pigmentierung innerhalb einzelner Melanozyten und (2) Anzahl der pigmentierten Melanozyten pro Feld des Optomax Systems, oder (1) der Oberflächenbereich von Silberablagerungen innerhalb der Melanozyten und (2) die Anzahl pigmentierter Melanozyten des Image Pro- Systems. Bei Verwendung des Optomax-Systems wurde der Oberflächenbereich an Silberablagerungen innerhalb einzelner Melanozyten in 60 Melanozyten unter Verwendung mehrfacher Schnitte von Äquivalenten, in dreifacher Ausführung pro Behandlung, gemessen. In diesen Schnitten wurde die Anzahl der Melanozyten pro Feld berechnet. Ein „Pigmentierungsfaktor" wurde als der durchschnittliche Oberflächenbereich an Silberablagerungen innerhalb eines einzelnen Melanozyten definiert, multipliziert mit der Anzahl pigmentierter Melanozyten pro Feld. Ein Wert von eins wurde unbehandelnden Kontrollen zugeordnet und Werte behandelter Gruppen wurden mit ihren entsprechenden Kontrollen normalisiert. Unter Verwendung des Image Pro-Systems wurden der Oberflächenbereich der Silbernitratablagerungen und die Anzahl an Melanozyten für die ganzen Äquivalente gemessen. Ein Wert von eins wurde den unbehandelten Kontrollen zugeordnet und Werte behandelter Gruppen wurden mit ihren entsprechenden Kontrollen normalisiert.
1A ist eine graphische Darstellung, die den Anstieg oder den Abfall der relativen Pigmentierung darstellt, gemessen und berechnet durch das ganze Äquivalent/Image Pro-System, wie oben dargestellt, nachdem es Benzaldehyd (50 ☐M), Hydrochinon (50 ☐M) und UVB-Strahlung (0,12 J/cm²) ausgesetzt worden war.
Die humanen epidermalen Äquivalente wurden ebenfalls Gemischen von Proteaseinhibitoren ausgesetzt, wobei die Proteaseinhibitoren in Tabelle A unten dargelegt sind. Die Proteaseinhibitoren konnten von Boehringer Mannheim aus Indianapolis, IN, bezogen werden. Es wurden die Complete^® Proteaseinhibitor Cocktail-Tabletten, zu beziehen von Boehringer Mannheim, verwendet, die Inhibitoren gegen Chymotrypsin, Thermolysin, Papain, Pronase, Pankreasextrakt und Trypsin enthalten. Sojabohnentrypsininhibitor („STI") war von Sigma erhältlich und in einem 50 mg/ml Liposomenträger oder in 1 × PBS gelöst. Alle anderen Proteaseinhibitoren die in diesen in vitro-Beispiel verwendet wurden, wurden in 1 × PBS gelöst. GDL-Liposomen wurden, wie oben bei Niemic, et al., dargestellt, hergestellt, mit dem Unterschied der folgenden Veränderungen: die nicht-ionische liposomale Formulierung enthielt Glycerindilaurat (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/Cholesterin (Croda)/Polyoxyethylen-10-stearylether (Brij76, ICI)/Polyoxyethylen-9-laurylether in einem Verhältnis von 37,5 : 12,5 : 33,3 : 16,7. Hepespuffer, 0,05 M, pH 7,4 (Gibco-BRL aus Gaithersburg, MD) wurde als die wäßrige Phase bei der Herstellung der Liposomen verwendet. Diese Gemische aus Proteaseinhibitoren und verschiedenen Kombinationen von Serinproteaseinhibitoren wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Melanogenese zu beeinflussen. Wie in 1B darge stellt, waren einige der Serinproteaseinhibitoren, insbesondere STI (Sojabohnentrypsininhibitor) bei der Inhibierung der Melanogenese sehr wirksam.
TABELLE A
Beispiel 2: Ein Protease-aktivierter Rezeptor ist in die Pigmentierung involviert
Beispiel 1 zeigt, daß STI die Pigmentierung reduziert. STI inhibiert Trypsin. Da Trypsin dafür bekannt ist, TR und PAR-2 zu aktivieren, haben wir die mögliche Beteiligung von TR und PAR-2 bei der Pigmentierung untersucht. Humane epidermale MelanoDerm-Äquivalente wurden mit den TR- und PAR-2-Agonisten und -Antagonisten, wie unten in Tabelle B dargestellt, täglich für drei Tage behandelt. Am vierten Tag wurden die Proben geerntet, fixiert und DOPA-, H&E- oder F&M-Färbungen durchgeführt. Histologische und Ganz-Äquivalent-Untersuchungen ergaben Veränderungen in der Pigmentierung nach den Behandlungen. 2 beschreibt die Ergebnisse dieses Beispiels. Wie hierin gezeigt, induzierte der PAR-2-Peptidagonist SLIGRL die Pigmentierung in einzelnen Melanozyten. Die Behandlung mit Verbindung I, einem Inhibitor von Thrombin und Trypsin, ergab ein Absinken der Pigmentierung.
3 zeigt die Ergebnisse dieser in diesem Beispiel dargestellten Studien und gibt den Grad der Pigmentierung in MelanoDerm-Äquivalenten an, die mit TR- und PAR-2-Reagenzien behandelt wurden. SLIGRL, ein PAR-2-Agonist, erhöhte die Pigmentierung wesentlich, was nahelegt, daß PAR-2 an der Pigmentierung beteiligt sein könnte. Hirudin, ein Thrombinspezifischer Inhibitor und TFLLRNPNDK, ein TR-selektiver Agonist, hatten keine Auswirkung auf die Pigmentierung. SFLLRN, ein weniger spezifischer TR-Agonist, zeigte jedoch eine Tendenz, die Pigmentierung aufzuhellen oder diese zu reduzieren. Dies legt nahe, daß TR weniger wahrscheinlich bei der Pigmentierung beteiligt ist.
TABELLE B
Beispiel 3: Dosis-Antwort-Verhältnis zwischen Protease-aktivierter Rezeptorsignalgebung und Melanogenese
MelanoDerm-Äquivalente wurden mit steigenden Konzentrationen an SLIGRL, dem PAR-2-Peptid-Agonisten, bei 0, 10 und 50 μm in derselben Weise wie in Beispiel 2 dargestellt behandelt. Eine F&M-Färbung wurde am vierten Tag durchgeführt. Wie in 4A gezeigt, ergaben steigende Konzentrationen von SLIGRL, dem PAR-2-Aktivator, eine gesteigerte Pigmentierung. Trypsin, ein PAR-2-Aktivator, hatte dieselbe Wirkung. Die Behandlung mit steigenden Konzentrationen der Verbindung I, dem Thrombin- und Trypsininhibitor, von 0,1 pM bis 1 μM ergab eine absinkende Pigmentierung (siehe 4A). Eine Vorbehandlung der Äquivalente mit UVB-Strahlung steigerte die Melanogenese, relativ zu den unbehandelten Kontrollen. Die Verbindung I war in der Lage, diese UVB-induzierte Pigmentierung ebenso zu reduzieren (4B). Dieses Beispiel zeigt ein Dosis-Antwort-Verhältnis für ansteigende und absinkende Pigmentierung mit der Veränderung der PAR-2-Signalgebung. Dieses Beispiel zeigt auch, daß die Verbindung I die Pigmentierung inhibieren kann und einer UV-induzierten Pigmentierung vorbeugt.
Beispiel 4: PAR-2 wird in Keratinozyten exprimiert, aber nicht in Melanozyten
Die PAR-2- und TR-Expression sind zuvor in Keratinozyten und Fibroblasten gezeigt worden. Dieses Beispiel zeigt, daß PAR-2 in Keratinozyten exprimiert wird, aber nicht in Melanozyten. Desweiteren zeigt es, daß TR sowohl in Keratinozyten als auch in Melanozyten exprimiert wird. Um dies zu zeigen, wurden humane epidermale MelanoDerm-Äquivalente, humane primäre Melanozytenkulturen (neonatal und adult von Clonetics aus San Diego, CA) und Cloudman S91-Melanomzellen aus Maus von ATCC aus Rockville, MD, kultiviert und Gesamt-RNAs unter Verwendung des „RNA Stat-60"-Reagenz, zu beziehen von „Tel-Test B", Incorporated, wie bei Chomczymski, „Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction," 162 Anal. Biochem. 156–69 (1987) beschrieben, extrahiert. Eine ausreichende Menge an RNase-freier DNase, zu beziehen von Promega Corporation unter dem Markennamen „RQ1 RNase-free DNase" wurde dann zu der extrahierten RNA aus jeder Probe hinzugefügt, so daß jedes entsprechende Produkt 200 ng mit DNase behandelte RNA unter Verwendung des in „RNase-free DNase" dargestellten Verfahrens, das Protokoll publiziert von PromegaCorporation (Mai, 1995), ergab. Die erhaltenen 200 ng mit DNase behandelte RNA wurden mit Hilfe des in „Superscript II Reverse Transcriptase" dargestellten Verfahrens revers transkribiert („RT"), einem Protokoll, das von Gibco-BRL publiziert wurde (nun Life Technologies, Incorporated) (April 1992), unter Verwendung von Zufallshexameren wie beispielsweise den Zufallsprimern, die kommerziell von Life-Technologies, Incorporated, zu beziehen sind.
Die erhaltenen RT-Produkte wurden dann mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion („PCR") unter Verwendung von ungefähr 0,5 Einheiten (pro 100 μl Reaktion) einer thermostabilen DNA-Polymerase, die kommerziell von Perkin-Elmer-Cetus Corporation unter dem Markennamen „Taq Polymerase" zu beziehen ist, und ungefähr 0,1 μmol/Reaktion TR- und PAR-2-spezifischen Primern, wie in Tabelle C und bei Marthinuss et al., 1995, deren Veröffentlichung hierin durch Referenz aufgenommen wird oder mit Glycerinaldehyd-3-phosphat dehydrogenase (G3PDH)-Primern, zu beziehen von Clontech Laboratories, Inc. aus Palo Alto, CA, in Übereinstimmung mit den Verfahren, die bei Marthinuss et al., 1995, beschrieben worden sind oder in den begleitenden Protokollen der Primer von Clontech Laboratories dargestellt sind, amplifiziert.
Die PCR-Produkte wurden dann auf 2%-igen Agarose/Ethidiumbromid-Gelen entsprechend der im Stand der Technik bekannten Verfahren analysiert, um den Grad der Expression bestimmter Gene in Keratinozyten und Melanozyten zu analysieren. Falls für die bessere Sichtbarmachung notwendig, wurden die erhaltenen PCR-Produkte mit Ethanol entsprechend der im Stand der Technik bekannten Verfahren präzipitiert. Wenn die Primer für G3PDH verwendet wurden, wurden nur 10% der PCR-Reaktionsprodukte eingesetzt. Eine RNA-Probe aus epidermalen Äquivalenten, die nicht revers-transkribiert worden war, wurde als Negativkontrolle für jede PCR-Amplifikation verwendet. Das Fehlen genomischer DNA-Kontaminationen wurde durch das Fehlen einer Bande in der entsprechenden Spur der Gele angezeigt. Eine humane Haut-RNA-Probe, die revers transkribiert worden war, wurde als Positivkontrolle verwendet, wenn kommerzielle Positivkontrollen nicht zur Verfügung standen. Die Wanderung der RT-PCR-Produkte auf den Gelen war immer identisch zu derjenigen der positiven Kontrollen und zu der der beschriebenen Größe der Amplifikationsprodukte.
Die relative Qualität jedes entsprechenden RT-PCR-Reaktionsprodukts wurde dann durch Analysieren der mRNA-Höhe der G3PDH, einem „Haushalts"-Gen, in jedem entsprechenden Produkt verglichen. Wie in 5 und 6 dargestellt, wurde herausgefunden, daß die G3PDH-Genexpression zu allen untersuchten Zeitpunkten ähnlich war, was daher den Vergleich des relativen Grads der Genexpression für die erwünschten Gene ermöglichte.
5A zeigt, daß wie erwartet TR und PAR-2 in der ganzen Haut und in den MelanoDerm-Äquivalenten („MD") exprimiert sind. S91-Melanomzellen („S91") exprimierten jedoch PAR-2 oder TR nicht. Um dieses weiter zu untersuchen, haben wir primäre neugeborene („mel-NB") und adulte („mel-A") Melanozyten auf TR- und PAR-2-Expression hin untersucht. Wie in 5B gezeigt, exprimieren primäre humane Melanozyten TR, aber nicht PAR-2. Deshalb haben wir vorgeschlagen, daß PAR-2-Agonisten und -Antagonisten in den MelanoDerm-Äquivalenten mit Keratinozyten aber nicht mit Melanozyten interagieren können, und daß TR-Agonisten und -Antagonisten sowohl mit Keratinozyten als auch mit Melanozyten interagieren können. Eine Keratinozyten-Melanozyten-Interaktion liegt deshalb vor schlagsweise dann vor, während das Keratinozyten-PAR-2-Signal in einen Pigmentierungsendpunkt umgewandelt wird.
Tabelle C stellt einige der verwendeten DNA-Primer, die Menge an für die PCR-Reaktion benötigtem MgCl₂ und die Länge der PCR-Zyklen dar.
Tabelle C: DNA-Primer, verwendet im RT-PCR-Test
Beispiel 5: Keratinozyten-Melanozyten-Kontakt ist für die depigmentierende Wirkung der Verbindung I notwendig
Die Ergebnisse des Beispiels 4 legen nahe, daß Melanozyten allein nicht auf die Depigmentierungswirkung von PAR-2-Antagonisten reagieren können. Tatsächlich wurde der Grad der Pigmentierung humaner primärer Melanozyten oder Choleratoxin-induzierter S91-Zellen, welcher durch Hydrochinon und Benzaldehyd reduziert worden war, nicht durch die Verbindung I beeinflußt.
Da PAR-2 nicht in Melanozyten exprimiert wird, haben wir die möglichen Notwendigkeiten der Keratinozyten-Melanozyten-Interaktionen für die depigmentierende Wirkung der Verbindung I untersucht. Es wurden primäre Melanozytenkulturen mit identischen Kulturen verglichen, die unter epidermalen Äquivalenten plattiert worden waren (EpiDerm, Fehlen von Melanozyten), um eine Co-Kultur zu erzeugen, bei der kein Kontakt zwischen Keratinozyten und Melanozyten besteht. Diese wurden ebenfalls mit den MelanoDerm-Äquivalenten verglichen, bei denen Melanozyten in der Basisschicht der Äquivalente vorhanden sind. Die Kulturen wurden für 3 Tage mit der Verbindung I, mit dem PAR-2-Agonisten SLIGRL und mit dem TR-Agonisten TFLLRNPNDK, wie in Tabelle D dargestellt, behandelt und am vierten Tag mit DOPA gefärbt. In Tabelle D sind Keratinozyten durch „K" bezeichnet, Melanozyten sind durch „M" bezeichnet und das Fehlen von Keratinozyten-Melanozyten-Kontakt ist durch „kein K-M-Kontakt" dargestellt. Wie in Tabelle D gezeigt, wurde keine Wirkung auf die Pigmentierung in primären Melanozyten und in mit diesen Agenzien behandelten Co-Kulturen beobachtet. In MelanoDerm-Äquivalenten reduzierte die Verbindung I die Pigmentierung und SLIGRL induzierte dieselbe, während TFLLRNPNDK keine Wirkung hatte. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Keratinozyten-Melanozyten-Kontakt für die Wirkung des PAR-2 auf die Pigmentierung notwendig ist.
TABELLE D
Beispiel 6: Die Verbindung I beeinflußt die Melanozyten-Genexpression
MelanoDerm-Äquivalente wurden mit steigenden Konzentrationen der Thrombin- und Trypsininhibitoren, Verbindung I oder mit steigenden Konzentrationen des PAR-2-Agonisten SLIGRL behandelt. Die aus unbehandelten und mit Verbindung I behandelten Äquivalenten extrahierten RNAs wurden auf die Genexpression hin mit Hilfe der RT-PCR in der oben in Beispiel 4 dargestellten Weise analysiert. Es wurden, wie in der Tabelle C oben dargestellt, Gen-spezifische Primer entworfen und Clontech-Primer für die humane G3PDH wie in Beispiel 4 verwendet. Die auf den Grad der Expression hin untersuchten Melanin-bildenden Gene waren Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2.
Ein dosisabhängiges Absinken der TRP-1- und ein dosisabhängiges Ansteigen der TRP-2-mRNA-Mengen wurde in mit Verbindung I behandelten Proben, wie in 6A gezeigt, beobachtet. Die Tyrosinaseexpression wurde jedoch nicht beeinflußt. Diese Veränderungen korrelierten mit der dosisabhängigen Bleichwirkung dieses Inhibitors. Beide Muster der Genexpression ergaben eine aufhellende Bleichwirkung. TRP-2-Enzym setzt Dopachinone in 5,6-Dihydroxyindolcarbonsäure (DHICA) eher um, als in 5,6-Dihydroxyindol (DHI).
Dieses Verfahren führt zu braunem, fein verteiltem Eumelanin, im Gegensatz zum unlöslichen schwarzen Eumelanin und ergibt einen helleren Hautton. TRP-1 stabilisiert den Melanin-bildenden Komplex und ermöglicht die Pigmentproduktion. Reduzierte Mengen an TRP-1 führen zu einer reduzierten Tyrosinaseaktivität und reduzierten Pigmentierung. Das Fehlen dieses Proteins führt zum Albinisimus. Steigende Konzentrationen an FLIGRL beeinflussen jedoch die Melanin-bildende Genexpression nicht (6B).
TRP-1 und TRP-2 sind Melanozyten-spezifisch. Die Verbindung I inhibiert Trypsin und Thrombin. Hirudin, ein spezifischer Thrombininhibitor, hat keinen Einfluß auf die Pigmentierung, wie in Beispiel 2 oben gezeigt wurde. Somit haben wir entschieden, zu untersuchen, ob Trypsin und Thrombin in der Haut exprimiert werden. Eine Sonde, die entworfen worden ist, um Trypsine aus dem Gehirn und dem Verdauungstrakt zu detektieren, wie in Tabelle C beschrieben, detektierte die Expression beider mRNAs in mRNA-Probe aus ganzer Haut, zu beziehen von Invitrogen aus Carlsbad, CA, ebenso, wie in MelanoDerm-Äquivalenten. Dasselbe Expressionsmuster wurde für Thrombin detektiert. Sowohl Trypsin als auch Thrombin wurden nicht in normalen Melanozyten exprimiert (5A, B). Diese Daten lassen vermuten, daß, wenn Trypsin PAR-2 aktiviert, es nur von den Keratinozyten erzeugt werden kann. Wie in 6A gezeigt, ergab die Behandlung mit der Verbindung I eine erhöhte Expression an Trypsin. SLIGRL, das die Genexpression der Melanogenese nicht beeinflußt (6B), erhöhte ebenfalls die Trypsinexpression in den Äquivalenten. Wir haben daraus geschlossen, daß, während Trypsin ein möglicher natürlicher Aktivator von PAR-2 in der Haut ist und möglicherweise die Pigmentierung beeinflußt, sein mRNA-Niveau nicht mit der Pigmentierung korreliert. Dies läßt vermuten, daß eine andere, bisher nicht identifizierte Serinprotease, die durch die Verbindung I, STI und ähnliches inhibiert wird, der natürliche Aktivator von PAR-2 in der Epidermis ist. Verbindungen, die diese Protease induzieren oder inhibieren, würden als entsprechende verdunkelnde und aufhellende Agenzien dienen.
Beispiel 7: Thrombin- und Trypsininhibitoren und PAR-2 Agonisten beeinflussen die Pigmentierung In Vivo
Zwei Meerschweinchen wurden zweimal täglich fünf Tage/Woche für sieben Wochen mit der Verbindung I mit 1 und 10 μM in 70 : 30 Ethanol : Propylenglykol-Träger auf einer pigmentierten Zitze behandelt. Die andere Zitze jeden Tieres wurde mit dem Träger allein behandelt und diente als Kontrolle. Chromametermessungen nach sieben Wochen der Behandlung ergaben eine Dosis-abhängige Aufhellungswirkung von jeweils +9,6 L* und annähernd 18 L* Einheiten. Es wurden keine sichtbaren Zeichen einer Reizung zu diesem Zeitpunkt beobachtet.
Vier Gruppen von je drei Meerschweinchen wurden entsprechend mit der Verbindung I, SFLLRN, FSLLRN und SLIGRL mit 10 μM zweimal täglich über fünf Tage pro Woche für acht Wochen behandelt. Chromametermessungen nach sechs Wochen zeigten eine Aufhellungswirkung bei der Verbindung I und eine Verdunklungswirkung bei SLIGRL, dem PAR-2-Agonisten. Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in 7 dargestellt.
Beispiel 8: Thrombin- und Trypsininhibitoren und PAR-2-Agonisten beeinflussen die Pigmentierung In Vivo
Ein Yucatan-Zwergschwein wurde mit der Verbindung I, SFLLRN, FSLLRN und SLIGRL mit 10 μM behandelt. Jede Verbindung wurde an zwei Stellen des Schweins zweimal täglich, fünf Tage pro Woche für acht Wochen aufgebracht. Nach acht Wochen Behandlung wurden Chromametermessungen durchgeführt. Die Applikation der Verbindung I ergab eine sichtbare Aufhellungswirkung. Der PAR-2-Agonist SLIGRL ergab eine Verdunklungswirkung, wie sie durch das Chromameter gemessen wurde. SFLLRN und FSLLRN hatten keine signifikanten Wirkungen.
Zwei Yucatan-Schweine wurden für siebeneinhalb Wochen oder für zehn Wochen zweimal täglich fünf Tage pro Woche mit steigenden Konzentrationen der Verbindung I behandelt. Fünf Konzentrationen der aktiven Verbindung wurden wie folgt verwendet: 0, 10, 50 und 250 μM. Zwei Stellen pro Konzentration waren an einander gegenüberliegenden Stellen des Schweinerückens gelegen. Es wurden Chromametermessungen durchgeführt, bevor die Behandlung begonnen hatte und alle zwei Wochen danach. Die Bilder wurden in periodischen Abständen und am Ende des Experiments gemacht. Eine sichtbare Aufhellungswirkung wurde während der vierten, fünften und sechsten Woche der Behandlung für die entsprechenden 250, 50 und 10 μM-Behandlungen beobachtet. In der achten Woche war die aufhellende Wirkung der zwei höchsten Dosen gleich. Diese Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Die Chromametermessungen (L*, Messung der Helligkeit) während der Behandlungsdurchfüh- rung eines Schweins sind in 9 dargestellt. Es wurde eine saturierende Wirkung beobachtet, welche zeit- und konzentrationsabhängig ist. Dieses Beispiel zeigt eine sichtbare depigmentierende Wirkung der Verbindung I in dem Tiermodellsystem, das am meisten der pigmentierten Menschenhaut gleicht.
Am Ende dieser Experimente wurden für histologische und elektronenmikroskopische (EM) Analysen Biopsieproben entnommen. Die histologischen Proben wurden mit H&E und F&M gefärbt. Die H&E-Färbung zeigte, daß es keine Reizungen, Entzündungsreaktion oder Veränderungen in der Hautarchitektur gab, was die Sicherheit der Verwendung von Verbindung I über längere Zeitperioden demonstriert. Die F&M-Färbung zeigte, daß es eine reduzierte Pigmentierung in den behandelten Proben gab, die sowohl in der Basalschicht als auch bis zur Epidermis reichte. Diese Ergebnisse sind in 10 dargestellt. Unbehandelte und mit Träger behandelte Proben (10A) waren identisch und am dunkelsten. Die 10 μM-Behandlungen (10B) zeigten eine reduzierte Pigmentierung und die Behandlungen mit 50 und 250 μM (entsprechend 10C, 10D) waren die Hellsten.
Die Ergebnisse dieses Experiments lassen vermuten, daß die maximale Aufhellungswirkung der Verbindung I mit einer höheren Konzentration über eine kürzere Zeitdauer oder mit einer niedrigeren Konzentration über eine längere Zeitdauer erreicht werden kann. Somit können mindestens zwei verschiedene Behandlungspläne verwendet werden, um die erwünschten Aufhellungsergebnisse der Haut zu erreichen.
Beispiel 9: Ultrastrukturelle Studien zeigen die Wirkung der Verbindung I auf die Haut In Vitro und In Vivo
Es wurden an MelanoDerm-Äquivalenten und Schweinehautstellen, die mit der Verbindung I behandelt worden waren, ultrastrukturelle Untersuchungen durchgeführt. Die MelanoDerm-Äquivalente, die mit der Verbindung I behandelt worden waren, wurden auf die Bildung von Melanosomen und deren Verteilung unter Verwendung der Elektronenmikroskopie analysiert. Die behandelten Proben enthielten innerhalb der Melanozyten, relativ zu den unbehandelten Kontrollen, mehr Melanosomen, aber weniger reife Melanosomen, das heißt, Melanosomen, die offenkundig ihre Melaninproduktion reduziert hatten (11A, 11B). Dentrite, die Melanosomen enthalten, wurden leicht innerhalb behandelter Keratinozyten identifiziert ( 11C), aber waren schwierig innerhalb der Kontrollkeratinozyten zu finden. Dies läßt auf eine unnormale Melanosomenbildung und langsamen oder verhinderten Melanosomentransfer in die Keratinozyten der behandelten Proben schließen.
Hautproben vom Yucatan-Schwein, behandelt mit der Verbindung I für acht Wochen, wie in Beispiel 8 beschrieben, wurden ebenfalls mit Hilfe der Elektronenmikroskopie untersucht. Die Melanosomen innerhalb der Keratinozyten behandelter Stellen waren im Vergleich zu den Kontrollen kleiner und schwächer pigmentiert (11D, 11E und 11F). Vielmehr war die Verteilung der Melanosomen innerhalb der behandelten Haut unnormal. Die Melanosomen wurden hauptsächlich an der epidermal-dermalen Grenze detektiert, im Vergleich zu einer Zufallsverteilung in unbehandelten Kontrollen (11G, 11H). Während wir andere Mechanismen nicht ausschließen können, schlagen wir vor, daß mit der Verbindung I behandelte Keratinozyten nicht in der Lage waren, aktiv Melanosomen von den vorhandenen Dentriten aufzunehmen oder zu erhalten.
Beispiel 10: Die in vivo-Depigmentierungswirkung der Verbindung I ist reversibel
Ein Yucatan-Schwein wurde mit der Verbindung I, 250 ☐M, für acht Wochen zweimal täglich fünf Tage pro Woche an acht Stellen behandelt. Alle Stellen zeigten am Ende des Behand lungszeitraums sichtbare Depigmentierungen, wie in 12B dargestellt ist. Für die folgenden vier Wochen (Beginn in Woche neun des Experiments) wurde die Farbe der behandelten Stellen beobachtet und zwei Biopsieproben jede Woche von zwei behandelten Stellen entnommen. Aus nicht-behandelten Stellen wurden ebenfalls Biopsieproben entnommen. Die depigmentierende Wirkung konnte in der ersten und zweiten Woche nach der Behandlung sichtbar gemacht werden und eine vollständige Erholung wurde in der vierten Woche beobachtet. Histologische Untersuchungen der F&M-gefärbten Hautschnitte bestätigten die visuell beobachtete Repigmentierung (wie in 12 angegeben). Bereits eine Woche nach der Behandlung wurde die Repigmentierung histologisch gezeigt. Die visuellen Beobachtungen korrelieren mit dem histologischen Befund der Pigmentierung des Stratum corneums. Dieses Beispiel zeigt, daß die Verbindung I keine permanente Schädigung der Pigmentierungsmaschinerie hervorruft und ihre Wirkung in vivo reversibel ist. Die 12A zeigt zwei histologische F&M-gefärbte Schnitte von Stellen, die nicht mit der Verbindung I behandelt worden waren. Die 12B zeigt zwei histologische F&M-gefärbte Schnitte von Stellen, die mit der Verbindung I für acht Wochen behandelt worden waren. Die 12C zeigt Schnitte von Stellen, die für acht Wochen mit der Verbindung I behandelt worden waren, eine Woche, nachdem die Behandlung gestoppt worden war. 12D zeigt Schnitte von Stellen, die für acht Wochen mit der Verbindung I behandelt worden waren, zwei Wochen, nachdem die Behandlung gestoppt worden war. 12E zeigt Schnitte von Stellen, die für acht Wochen mit der Verbindung I behandelt worden waren, vier Wochen, nachdem die Behandlung gestoppt worden war. Wie in 12E angegeben, waren die Schnitte vier Wochen nach dem Ende der Behandlung vollständig repigmentiert.
Beispiel 11: Herstellung von Produkten natürlichen Ursprungs, die STI enthalten
Das Beispiel 1 zeigt, daß das Vorhandensein von Sojabohnentrypsininhibitor in einer aufhellenden Formulierung für ihre depigmentierende Aktivität wünschenswert ist. Basierend auf analytischen Untersuchungen ist bestimmt worden, daß Sojabohnenmilch und Sojabohnenpaste gute Quellen an Sojabohnentrypsininhibitor sind.
Um Sojabohnenpaste herzustellen, wurden die Sojabohnen zuerst in deionisiertem oder gereinigtem Wasser für mehrere Stunden eingeweicht. Die Sojabohnen wurden gemahlen, nachdem sie vollständig hydratisiert waren, wobei geringe Mengen an Wasser zugegeben wurden, falls notwendig, um die Paste geschmeidig zu machen. Um Sojabohnenmilch herzustellen, wurde dasselbe Verfahren durchgeführt, wobei mehr Wasser zugefügt wurde. (Der Mahlprozeß ermöglicht es, die Sojabohnenmilch zu extrahieren). Nach dem Sammeln wurde die Sojabohnenmilch filtriert, um alle restlichen Bestandteile der Bohnenhülsen zu entfernen.
Sojabohnenmilch, Sojabohnenpaste und Miso wurden hergestellt, um als Materialien natürlichen Ursprungs zu dienen, die STI enthalten und in der Lager sind, die Hautfarbe aufzuhellen.
Beispiel 12: Behandlung mit Materialien natürlicher Herkunft, die den PAR-2-Weg beeinflussen, induzieren die Depigmentierung
Zwei Yucatan-Schweine wurden für acht und zehn Wochen zweimal täglich für fünf Tage die Woche mit verschiedenen Produkten aus Sojabohnen und Limabohnen behandelt. Diese natürlichen Produkte umfassen Sojabohnenpaste, saures Sojabohnenproteinhydrolysat, Miso, native und gekochte Sojabohnenmilch und ein kommerziell zur Verfügung stehendes Extrakt aus Sojabohnen (Actiphyte^TM of Active Organics, Dallas Texas), ebenso wie gereinigter STI und verschiedene Zubereitungen von Trypsininhibitoren aus Sojabohnen und Limabohnen. In der siebten Woche der Behandlung waren alle Stellen sichtbar heller als die umgebende Haut, mit Ausnahme der Stellen, die mit der gekochten Sojabohnenmilch und dem sauren Sojabohnenproteinhydrolysat behandelt worden waren. Histologische Analysen von Biopsieproben aus den behandelten Stellen bestätigten nach der F&M-Färbung die depigmentierende Wirkung der Sojabohnen- und Limabohnenprodukte. Ein Beispiel solcher histologischen Daten ist in 13 angegeben. Das Fehlen eine depigmentierenden Aktivität in der gekochten Sojabohnenmilch und in dem sauren Sojabohnenproteinhydrolysat kann jeweils durch die Denaturierung oder die Degradierung der Sojaproteine in diesen Zubereitungen erklärt werden. Wir haben die Theorie, daß die aktiven Agenzien Depigmentierung in den Sojabohnen- und Limabohnenprodukten jeweils Sojabohnentrypsininhibitor (STI) und Limabohnentrypsininhibitor sind. (Beispiel 1 zeigt die depigmentierende Wirkung von STI in vitro). Dieses Beispiel zeigt, daß natürliche Extrakte, die eine Trypsininhibitoraktivität enthalten, als aufhellende Agenzien verwendet werden können, die den PAR-2-Weg beeinflussen.
Beispiel 13: Ein STI in Liposomenformulierung kann menschliche Alterflecken aufhellen
Eine Person mit drei Altersflecken auf ihrem Handrücken wurde für acht Wochen zweimal täglich mit dem folgenden behandelt: Der Altersfleck, der dem Arm am nähesten war, wurde mit einem Placebo, enthaltend 20 mg/ml Liposomen behandelt. Der mittlere Altersfleck wurde nicht behandelt. Der dritte Altersfleck wurde mit STI, 1%, in Lipsomen (20 mg/ml) behandelt.
GDL-Liposomen wurden wie bei Niemiec, et al., oben dargestellt, zubereitet, mit Ausnahme der folgenden Veränderung: die nicht-ionische lipsomale Formulierung enthielt Glycerindilaurat (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/Cholesterin (Croda)/Polyoxyethylen-10-stearylether (Brij76, ICI)/Polyoxyethylen-9-laurylether in einem Verhältnis von 37,5 : 12,5 : 33,3 : 16,7. Es wurde Hepespuffer, 0,05 M, pH 7,4 (Gibco-BRL aus Gaithersburg, MD) als wäßrige Phase bei der Zubereitung der Liposomen verwendet. Es wurden zu den Zeitpunkten 0, 4 und 8 Wochen der Behandlung digitale Aufnahmen unter UV- und sichtbarem Licht aufgenommen. L* (Helligkeits)-Werte wurden von den Bildern unter Verwendung von Adobe Photoshop berechnet.
Wie in 14 gezeigt, wurde der Altersfleck, der mit STI behandelt worden war, in den folgenden acht Wochen der Behandlung heller. 14 ist eine Zusammenstellung von vier Bildern. Die linke Gruppe zeigt die Bilder der Hand in sichtbarem Licht, bevor (oben) und nach (unten) acht Wochen der Behandlung. Bei dieser Orientierung ist der oberste Altersfleck der mit Placebo behandelte, der mittlere Altersfleck ist nicht behandelt, und der unterste Altersfleck ist der mit STI behandelte. Die rechte Gruppe zeigt dieselbe Hand zum selben Zeitpunkt unter Verwendung von UV-Photographie. Das UV-Licht ermöglicht die Visualisierung von Pigmenten, die tiefer in der Haut sitzen, und zeigt, daß die STI-aufhellende Wirkung nicht oberflächlich war. Die 14 zeigt deutlich, daß die STI-Formulierung in der Lage war, den unteren Altersfleck aufzuhellen. Ein Anstieg von 15 L*-Einheiten wurde für diese STI-behandelte Stelle berechnet, was weiterhin die Leistungsfähigkeit dieser Behandlung zeigt, Altersflecken aufzuhellen.
Beispiel 14: Depigmentierende Formulierungen mit Sojabohnenmilch
Bei der Herstellung der Sojabohnenmilch wurde beobachtet, daß die starke beruhigende Wirkung der Milch in einer Hautschutzformulierung wünschenswert wäre. Da Wasser als der hauptsächliche Bestandteil jeder Öl-in-Wasser-Emulsion und in vielen anderen Hautschutz formulierungen verwendet wird, haben wir angenommen, daß die Sojamilch verwendet werden kann, um das deionisierte Wasser in solchen Formulierungen zu ersetzen. Wir haben jedoch angenommen, daß diese Art von Formulierung aufgrund der fehlenden Mischbarkeit von Öl- und Wasserkomponenten der Sojabohnenmilch physikalisch instabil sei. Überraschenderweise haben wir herausgefunden, daß das Ersetzen von Wasser durch Sojabohnenmilch physikalisch stabil war. Formulierungen, die Sojabohnenmilch verwenden, sollten zwischen ungefähr 1% und ungefähr 99% Sojabohnenmilch enthalten, besonders bevorzugt von ungefähr 80% bis ungefähr 95% Sojabohnenmilch. Bevorzugt sollten diese und ähnliche Formulierungen einen Viskositätsstabilsator in einer Menge von ungefähr 0% bis ungefähr 5% (besonders bevorzugt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2%), ein oder mehrere Weichmacher in einer Menge bis zu ungefähr 20% und/oder Emulgatoren in einer Menge von ungefähr 0,1% bis ungefähr 10% (besonders bevorzugt von ungefähr 3 bis ungefähr 5%) und wahlweise ein Verteilungsmittel in einer Menge von ungefähr 0 bis ungefähr 5% (besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis ungefähr 2%), ein Konservierungsmittel, ein chelatisierendes Agens oder ein Feuchthaltemittel enthalten. Das Konservierungsmittel sollte in einer wirksamen Menge vorhanden sein, um die Beständigkeit der Milch und das Erhalten der Aktivität der Zusammensetzung zu bewahren. Ausreichender Verdicker sollte vorhanden sein, um der Formulierung Stärke zu verleihen, ohne daß sie so viskos wird, daß ihre Verteilbarkeit leidet, zum Beispiel von ungefähr 0 bis ungefähr 10%, besonders bevorzugt von ungefähr 3 bis ungefähr 5%. Sonnenschutz, Antioxidationsmittel, Vitamine, andere depigmentierende Agenzien und andere hautschützende topische Bestandteile können ebenfalls den Zusammensetzungen dieser Erfindung beigefügt werden.
Ein besonders bevorzugtes Beispiel einer depigmentierenden Formulierung, die Wasser durch Sojamilch ersetzt, ist in der Tabelle E unten gezeigt.
TABELLE E
STI, Sojabohnenpaste und andere Trypsininhibitor-enthaltende natürliche Extrakte, können in solche Formulierungen aufgenommen werden, um erhöhte Konzentrationen des Serinproteaseinhibitors zur Verfügung zu stellen. Verwendete Mengen dieser hinzugefügten aktiven Bestandteile können zwischen 0,01% bis 15% in einer Formulierung schwanken. Andere depigmentierende Agenzien, einschließlich PAR-2-Inhibitoren, Tyrosinaseinhibitoren, Hydrochinone, Sojaprodukte, Ascorbinsäure und ihre Derivate ebenso wie andere Bestandteile mit hautschützenden Eigenschaften können ebenfalls dieser Formulierung hinzugefügt werden.
Beispiel 15: Eine depigmentierende Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung
Zwei Beispiele einer depigmentierenden Formulierung mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion sind in Tabelle F aufgeführt. Eine Formulierung mit STI, wo STI durch andere Serinproteaseinhibitoren natürlicher Herkunft oder durch jedes Extrakt natürlicher Herkunft oder Fraktion derselben, die Serinproteaseinhibitoren beinhaltet, ersetzt werden kann, ist in Säule 4 der Tabelle F beschrieben. Eine ähnliche Formulierung mit der Verbindung I ist in der Säule 5 der Tabelle F dargestellt. Die Verbindung I in dieser Zusammensetzung kann durch ähnliche Verbindungen oder durch Serinproteaseinhibitoren oder durch alle PAR-2-Inhibitormaterialien, die einen hohen therapeutischen Index haben, gleichgültig, ob sie synthetischer oder natürlicher Herkunft sind, als der aktive Bestandteil ersetzt werden. Vorgeschlagene Bereiche für diese Bestandteile in solchen Formulierungen sind ebenfalls in Tabelle F aufgeführt. Der Gehalt an deionisiertem Wasser in diesen Formulierungen kann durch Sojabohnenmilch ersetzt werden.
TABELLE F
Um diese Formulierung herzustellen, wurden die Bestandteile der Lipidphase vereinigt und bei 85°C gemischt und dann auf 60°C abgekühlt. In einem getrennten Gefäß wurde das Carbopol langsam zum Wasser oder der Sojabohnenmilch hinzugegeben. Nach dem Durchmischen von 10 Minuten wurde der Rest der Bestandteile der wäßrigen Phase hinzugegeben und das Gemisch auf 60°C erwärmt. Die zwei Phasen wurden dann vereinigt, für 10 Minuten durchmischt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Natürlich können ein oder mehrere depigmentierende Agenzien innerhalb derselben Formulierung in diesem Beispiel und in den folgenden Beispielen und anderen Ausführungsformen der Verfahren und Zusammensetzung dieser Erfindung kombiniert werden.
Beispiel 16: Depigmentierende Zusammensetzung (Öl-in-Wasser-Emulsion)
Zwei weitere Beispiele einer depigmentierenden Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung sind in Tabelle G dargestellt. Eine Formulierung mit STI, wo STI durch jeden Serinproteaseinhibitor natürlicher Herkunft oder durch ein Extrakt oder eine Fraktion natürlicher Herkunft derselben, die Serinproteaseinhibitoren enthält, ersetzt werden kann, ist in Säule 3 der Tabelle G beschrieben. Eine ähnliche Formulierung mit der Verbindung I ist in Säule 4 der Tabelle G dargestellt. Die Verbindung I in dieser Zusammensetzung kann durch ähnliche Verbindungen oder durch einen Serinproteaseinhibitor oder durch jedes PAR-2-Inhibitormaterial, das hohe therapeutische Indizes hat, egal, ob es synthetischer oder natürlicher Herkunft ist, als der aktive Bestandteil ersetzt werden. Für diese Bestandteile vorgeschlagene Bereiche in solchen Formulierungen sind ebenfalls in der Tabelle G aufgeführt. Der Inhalt an detionsisiertem Wasser dieser Formulierungen kann durch Sojabohnenmilch ersetzt werden.
TABELLE G
Um diese Formulierungen herzustellen, wurde Hydroxyethylcellulose langsam zu dem Wasser oder der Sojabohnenmilch hinzugegeben und solange gerührt, bis sie vollständig gelöst war. In einen getrennten Behälter wurden Acrylate/C10-30-Alkylacrylatkreuzpolymer gegeben und solange gerührt, bis sie vollständig gelöst waren. Der Inhalt der zwei Behälter wurde vereinigt und für 20 Minuten durchmischt. Das Vitamin E-Acetat wurde dann hinzugegeben und durchmischt, gefolgt vom Hinzufügen des Isohexadecans und Panthenols (98%). Nach dem Durchmischen für 5 Minuten wurden der STI oder der natürliche Extrakt oder die Verbindung I zusammen mit dem Propylenglycol hinzugefügt und für 5 Minuten gerührt. Anschließend wurde Glycerin hinzugegeben und die Formulierung für 20 Minuten gerührt. Schließlich wurde der pH mit Natriumhydroxid auf 8 für STI (Bereich ist 6–8,5) oder auf 7 für die Verbindung I (Bereich ist 5,5–8,5) eingestellt.
Beispiel 17: Depigmentierende Zusammensetzung (Wasser-in-Öl-Emulsion)
Ein Beispiel für eine depigmentierende Formulierung mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion ist in Tabelle H dargestellt. Eine Formulierung mit STI, wo STI durch jeden Serinproteaseinhibitor natürlicher Herkunft oder durch jedes Extrakt oder jede Fraktion desselben natürlicher Her kunft, das Serinproteaseinhibitoren enthält, ersetzt werden kann, ist in Säule 4 der Tabelle H beschrieben. Eine ähnliche Formulierung mit der Verbindung I ist in der Säule 5 der Tabelle H dargestellt. Die Verbindung I in dieser Zusammensetzung kann durch ähnliche Verbindungen oder durch einen Serinproteaseinhibitor oder durch alle PAR-2-Inhibitormaterialien, die einen hohen therapeutischen Index haben, gleichgültig, ob sie synthetischer oder natürlicher Herkunft sind, als der aktive Bestandteil ersetzt werden. Vorgeschlagene Bereiche für diese Bestandteile in solchen Formulierungen sind ebenfalls in Tabelle H aufgeführt. Der Gehalt an deionisiertem Wasser in diesen Formulierungen kann durch Sojabohnenmilch ersetzt werden.
TABELLE H
Um diese Formulierungen herzustellen, wurden der Stearylalkohol und das Mineralöl bei 70°C geschmolzen. Die anderen Bestandteile der Ölphase wurden hinzugefügt und das Ge misch auf 75°C erhitzt. Die Bestandteile der wäßrigen Phase, die zuvor in der Hauptphase Wasser oder Sojamilch gelöst und auf 70°C erwärmt worden waren, wurden dann hinzugefügt und das Gemisch solange gerührt, bis es erstarrt war.
Beispiel 18: Depigmentierende Zusammensetzung (wäßriges Gel)
Zwei Beispiele einer depigmentierenden Formulierung mit wäßrigem Gel sind in der Tabelle J dargestellt. Eine Formulierung mit STI, wo STI durch jeden Serinproteaseinhibitor natürlicher Herkunft oder durch jedes Extrakt oder jede Fraktion desselben natürlicher Herkunft, das Serinproteaseinhibitoren enthält, ersetzt werden kann, ist in Säule 3 der Tabelle J beschrieben. Eine ähnliche Formulierung mit der Verbindung I ist in Säule 4 der Tabelle J dargestellt. Die Verbindung I in dieser Zusammensetzung kann durch ähnliche Verbindungen oder durch einen Serinproteaseinhibitor oder durch alle PAR-2-Inhibitormaterialien, die einen hohen therapeuitischen Index aufweisen, gleichgültig, ob sie synthetischer oder natürlicher Herkunft sind, als der aktive Bestandteil ersetzt werden. Vorgeschlagene Bereiche für die Bestandteile in solchen Formulierungen sind ebenfalls in der Tabelle J aufgeführt. Der Gehalt an deionsisiertem Wasser dieser Formulierungen kann durch Sojabohnenmilch ersetzt werden.
TABELLE J
Der Gehalt an deionsiertem Wasser dieser Formulierungen kann durch Sojabohnenmilch ersetzt werden.
TABELLE K
Zur Herstellung dieser Formulierung wurde die Verbindung I in Wasser gelöst. Das Ethanol und das Propylenglycol wurden gemischt und mit der wäßrigen Lösung, die Verbindung I enthält, vereinigt.
I. Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß die Aktivierung des Keratinozytenrezeptors PAR-2 zu einer ansteigenden Pigmentierung führt. Bevorzugt kann eine solche Aktivierung durch die Verwendung von Trypsin oder SLIGRL oder SLIGKVD oder andere SLIGRL- oder SLIGKVD-Derivate erreicht werden. Wir haben ebenfalls gezeigt, daß eine Aufhellung durch die Verwendung von Serinproteaseinhibitoren oder PAR-2-Antagonisten, ebenso wie durch blockierende Agenzien des Melanosomentransfers erreicht werden kann. Andere dem Fachmann bekannte Verbindungen, die den Melanosomentransfer in die Keratinozyten inhibieren, können ebenfalls als depigmentierende Agenzien verwendet werden.
Die Verbindung I, ein Trypsin- und Thrombininhibitor, inhibiert beispielsweise den Melanosomentransfer zu den Keratinozyten. STI funktioniert nach demselben Mechanismus. Die Akkumulation nicht ablieferbarer Melanosome in den Melanozyten kann einen negativen Rückkopplungs-Mechanismus induzieren, der die Bildung neuer Melanosome verlangsamt. Die Herstellung von TRP-1, dem hauptsächlichen Glycoprotein in Melanozyten, ist herunterreguliert, was zu einer Destabilisierung der Tyrosinase führt. Das führt zu einer reduzierten Melaninbildung und zu einem Farbwandel in ein helleres Braun, wenn das Verhältnis von TRP-1 : TRP-2 reduziert ist. Die Anreicherung der Melanosome in den Melanozyten nach der Behandlung mit Verbindung I oder nach der Behandlung mit STI reduziert und verändert deshalb den Melaningehalt, was zu der aufhellenden Wirkung der Verbindung I oder STI hinzukommt.

Claims

Verwendung einer zur Veränderung der Pigmentierung wirksamen Menge einer Verbindung, die ist: (i) ein PAR-2-Antagonist, der an PAR-2 bindet oder dieses blockiert, es aber nicht aktiviert; oder (ii) ein PAR-2-Agonist, der an PAR-2 bindet und es aktiviert; zur Herstellung eines Medikaments zum Bewirken von Veränderungen in der Pigmentierung von Säugetierhaut.
Ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung eines Säugetiers, wobei das Verfahren das Bewirken von Veränderungen in der Pigmentierung von Säugetierhaut umfaßt, indem an das Säugetier eine zur Veränderung der Pigmentierung wirksamen Menge einer Verbindung verabreicht wird, die (i) ein PAR-2-Antagonist, der an PAR-2 bindet oder dieses blockiert, es aber nicht aktiviert; oder (ii) ein PAR-2-Agonist, der an PAR-2 bindet und es aktiviert, ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Antagonisten, basierend auf SLIGRL, die an PAR-2 binden oder dieses blockieren, es aber nicht aktivieren, Antagonisten, basierend auf SLIGKVD, die an PAR-2 binden oder dieses blockieren, es aber nicht aktivieren, und Mischungen davon.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SLIGRL, SLIGKVD und Derivaten von SLIGRL und SLIGKVD, die an PAR-2 binden und dieses aktivieren, und Mischungen davon.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament ein topisches Medikament ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die zur Veränderung der Pigmentierung wirksame Menge der Verbindung topisch verabreicht wird.