PL202217B1 - Kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie środka skutecznego w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu i zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała specyficznie wiążącego się ze składnikiem amyloidu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych i zastosowa n srodka skutecznego w wytwo- rzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko sk ladnikowi amyloidu oraz przeciwcia la lub fragmentu przeciwcia la specyficznie wiaz acych si e ze sk ladnikiem amyloidu obecnym w z logu amyloidowym do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia licznych chorób zwi azanych z amyloidem, w tym choroby Alzheimera, chorób zwi azanych z prionami, rodzinnych neuropatii zwi azanych z amyloidem itp. Kom- pozycje farmaceutyczne zawieraj a w lókienkowe sk ladniki amyloidu w ilo sciach skutecznych w wywo- lywaniu odpowiedzi immunologicznej, a zw laszcza peptydy lub bia lka tworz ace w lókienka. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie środka skutecznego w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu i zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała specyficznie wiążącego się ze składnikiem amyloidu, do wytwarzania leków.

Skrobiawica jest ogólnym terminem opisującym wiele różnych chorób charakteryzujących się zewnątrzkomórkowym odkładaniem włókienek białkowych, które tworzą liczne „złogi amyloidowe, które mogą pojawić się w konkretnych miejscach lub układowo. Włókienkowy składnik tych złogów jest cechą identyfikującą różne formy choroby amyloidowej. Tak np. wewnątrzmózgowe lub naczyniowomózgowe złogi składające się głównie z włókienek peptydu β-amyloidu (β-AP) są charakterystyczne dla choroby Alzheimera (zarówno w postaci rodzinnej jak i sporadycznej), peptyd wysepkowego białka amyloidu (IAPP; amylina) jest charakterystyczny dla włókienek komórkowych złogów amyloidowych wysepek trzustkowych związanych z cukrzycą typu II, a e2-mikroglobulina jest głównym składnikiem złogów amyloidowych powstających w wyniku długotrwałego leczenia hemodializami. Ostatnio stwierdzono także, że do chorób amyloidowych należą także choroby związane z prionami, takie jak choroba Creutzfelda-Jacoba.

Różne postacie chorób podzielono na klasy, głównie na podstawie tego, czy skrobiawica jest czy nie jest związana z podstawową chorobą ustrojową. Zatem pewne zaburzenia uważa się za pierwotne skrobiawice, w których brak jest dowodu istnienia wcześniejszej lub współwystępującej choroby. Ogólnie pierwotne skrobiawice wśród chorób wyróżniają się obecnością włókienek białkowych „typu lekkiego łańcucha amyloidu (typu AL), nazwanego tak ze względu na homologię N-końcowego regionu włókienek AL ze zmiennym fragmentem lekkiego łańcucha immunoglobulin (κ lub λ).

Wtórne lub „reaktywne skrobiawice charakteryzują się osadzaniem włókienek typu AA pochodzących z surowiczego białka amyloidu A (ApoSSA). U podłoża tych postaci skrobiawicy leżą przewlekłe zapalne lub zakaźne stany chorobowe (np. reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie szpiku, gruźlica, trąd).

W dziedziczno-rodzinnych skrobiawicach mogą występować neuropatyczne, nerkowe lub sercowo-naczyniowe złogi typu transtyretyny ATTR. Inne skrobiawice dziedziczno-rodzinne obejmują inne zespoły i mogą dotyczyć różnych składników amyloidu (np. rodzinna gorączka śródziemnomorska charakteryzuje się włókienkami AA). Inne postacie skrobiawic obejmują postacie lokalne, charakteryzujące się ogniskowymi, często nowotworowo-podobnymi złogami występującymi w oddzielnych narządach. Inne skrobiawice są związane ze starzeniem i często charakteryzują się tworzeniem płytek w sercu lub mózgu. Także częste są złogi amyloidowe związane z długotrwałymi dializami. Te i inne postacie chorób amyloidowych zestawiono w tabeli 1. (Tan, S.Y. i Pepys, Histopathology 25:403-414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicine, wyd. 13, red. Isselbacher, K.J. i inni, McGraw-Hill. San Francisco, 1995).

Tabela 1 Klasyfikacja chorób amyloidowych
1	2	3	4
Białko/peptyd amyloidu	Białko prekursorowe	Odmiany białka	Klinicznie
AA	Surowicze białko amyloidu A (ApoSSA)		Reaktywne (wtórne skrobiawice): rodzinna gorączka śródziemnomorska, rodzinna neuropatia z pokrzywką i głuchotą (zespół Muckle-Wells)
AA	Surowicze białko amyloidu A (ApoSSA)		Reaktywne układowe skrobiawice związane z układowymi chorobami zapalnymi
AL	Łańcuchy lekkie przeciwciał monoklonalnych (κ, λ)	Ak, A, (np. AkIII)	Samoistne (pierwotne) skrobiawice: związane ze szpiczakiem lub makroglobulinemią; układowa skrobiawica związana z dyskrazją immunocytów; gammopatia monoklonalna; utajona dyskrazja; miejscowe guzowate skrobiawice związane z przewlekłymi chorobami zapalnymi

PL 202 217 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
AH	IgG(l(Yl))	AyI	Skrobiawica łańcuchów ciężkich związana z kilkoma dyskrazjami immunocy- tów
ATTR	Transtyretyna (TTR)	Przynajmniej 30 znanych mutacji punktowych	Rodzinna polineuropatia skrobiawicza (np. Met 30, portugalska)
ATTR	Transtyretyna (TTR)	np. Met 111	Rodzinna kardiomiopatia amyloidowa (odmiana duńska)
ATTR	Transtyretyna (TTR)	Dziki typ TTR lub Ile 122	Układowa skrobiawica starcza
AapoAI	ApoAI	Arg26	Rodzinna polineuropatia skrobiawicza
Agel	Gelsolina	Asn 187	Rodzinna skrobiawica (fińska)
Acys	Cystatyna C	Gln 68	Dziedziczny krwotok mózgowy ze skrobiawicą (odmiana islandzka)
Αβ	Prekursor białka amyloidu β (np. e-APP695)	Różne: Gln 618,	Choroba Alzheimera Zespół Downa Dziedziczny krwotok mózgowy ze skrobiawicą (odmiana holenderska) Sporadyczna mózgowa angiopatia amyloidowa Zapalenie mięśni z ciałami inkluzyjnymi
AB2M	Mikroglobulina β2		Związana z przewlekłymi hemodializami
Acal	(Pro)kalcytonina	(Pro)kalcytonina	Rak rdzenia tarczycy
AANF	Przedsionkowy czynnik natriuretyczny		Ogniskowe starcze skrobiawice: izolowana skrobiawica przedsionkowa
Αβ SVEPa AB2M	Białko prekursorowe β-amyloidu mikroglobulina β2		Mózg Pęcherzyk nasienny Prostata
	Keratyna		Pierwotnie zlokalizowany amyloid skórny (plamkowy, grudkowaty)
PrP	Prionowe białko prekursorowe (33-35 kDa postać komórkowa)	Białko scrapie 27-30 kDa	Sporadyczna choroba CreutzfeldtaJacoba Kuru (przenośne gąbczaste encefalopatie, choroby prionowe)
AIAPP	Wysepkowy polipeptyd amyloidu (IAPP)		Cukrzyca typu II wysepek Langerhansa, Gruczolak wysepkowatokomórkowy
Hormony peptydowe, fragmenty	np. prekalcytonina		Zewnątrzwydzielnicze skrobiawice, związane z APUDomami

^aBiałko zewnątrzwydzielnicze pęcherzyków nasiennych

Często włókienka tworzące większą część złogu amyloidowego pochodzą z jednego lub większej ilości pierwotnych białek lub peptydów prekursorowych i zazwyczaj są związane z siarczanowanymi glikozoaminoglikanami. Ponadto, złogi amyloidowe mogą zawierać w mniejszej ilości białka i peptydy róż nych typów, razem z innymi skł adnikami, takimi jak proteoglikany, gangliozydy oraz inne cukry, co opisano bardziej szczegółowo w poniższych sekcjach.

Obecnie brak jest specyficznych, skierowanych do amyloidów terapii dla którejkolwiek z chorób amyloidowych. Gdy jakiś stan chorobowy znajduje się u podłoża choroby lub jest z nią związany, terapię skierowuje się tak by zmniejszyć wytwarzanie białka amyloidogennego przez leczenie choroby

PL 202 217 B1 leżącej u podłoża. Przykładem tutaj może być leczenie gruźlicy antybiotykami, co zmniejsza obciążenie prątkami, a w konsekwencji zmniejsza zapalenie i ilość towarzyszącego mu białka SSA. W przypadku amyloidu AL w szpiczaku mnogim, u pacjentów stosuje się chemioterapię, co wywołuje zmniejszenie liczby komórek osocza i zmniejsza poziom immunoglobulin szpiczakowych. Gdy te poziomy zmniejszają się, amyloid AL także może zniknąć. Zgłoszenia patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki USSN 09/201430 z 30 listopada 1998 r. i USSN 09/322289 z 28 maja 1999 r., ujawniają, że obciążenie płytkami amyloidowymi w chorobie Alzheimera może być znacznie zmniejszone (i można mu zapobiegać) przez podawanie środków wywołujących lub nadających odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko peptydowi β-amyloidu (AP) i jego fragmentom. Odkrycie według wynalazku stanowi to, że indukcja odpowiedzi immunologicznej na różne składniki płytki amyloidowej jest skuteczna w leczeniu szerokiej gamy chorób amyloidowych.

Zatem wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, której cechą jest to, że zawiera, jako składnik czynny, środek skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu u pacjenta oraz farmaceutyczną zaróbkę, przy czym składnik amyloidu pochodzi z włókienkowego białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i proteolitycznymi peptydami.

Korzystnie w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku środek jest skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu, którym jest peptyd włókienkowy lub białko włokienkowe.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera środek wywołujący odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko neoepitopowi utworzonemu przez białko włókienkowe lub peptyd włókienkowy, w odniesieniu do włókienkowego białka prekursorowego.

Zatem, jak to opisano bardziej szczegółowo, wiele tworzących włókienka peptydów lub białek jest fragmentami białek prekursorowych, takich jak wymienione poniżej. Gdy takie fragmenty powstają, np. na drodze trawienia proteolitycznego, możliwe jest, że stwierdzi się, że wystąpią epitopy nie występujące na prekursorze, a zatem nie są one dostępne immunologicznie dla układu immunologicznego, gdy fragment jest częścią białka prekursorowego. Środki skierowane do takich epitopów mogą być korzystnymi środkami leczniczymi, gdyż istnieje mniejsze prawdopodobieństwo, że wywołają odpowiedź autoimmunologiczną u pacjenta.

Korzystnie w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku środek jest skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu wybranemu z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystniej kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera środek wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera środek skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko co najmniej dwóm różnym składnikom amyloidu.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jako środek zawiera peptyd połączony z białkiem nośnikowym.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera adiuwant.

Korzystniej kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera adiuwant wybrany z grupy obejmującej QS21, monofosforylowany lipid, ałun i adiuwant Freunda.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania środka skutecznego w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu charakterystycznemu dla zaburzenia cechującego się odkładaniem amyloidu u osobnika będącego ssakiem do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zaburzenia cechującego się odkładaniem amyloidu, przy czym odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciwko składnikowi włókienkowemu pochodzącemu z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku środek jest skuteczny w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu, którym jest peptyd włókienkowy lub białko włókienkowe.

PL 202 217 B1

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek wzbudzający odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko neoepitopowi utworzonemu przez składnik amyloidu, w odniesieniu do białka prekursorowego.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek skuteczny w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu wybranemu z grupy obejmują cej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko co najmniej dwóm różnym składnikom amyloidu.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek zawierający co najmniej dwa składniki amyloidu.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek, który stanowi peptyd połączony z białkiem nośnikowym.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek, który zawiera ponadto adiuwant.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek zawierający adiuwant wybrany z grupy obejmującej QS21, monofosforylowany lipid, ałun i adiuwant Freunda.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek skuteczny w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu, która to odpowiedź immunologiczna charakteryzuje się mianem w surowicy wynoszącym co najmniej 1:1000 w odniesieniu do skł adnika amyloidu.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku miano w surowicy wynosi co najmniej 1:5000 w odniesieniu do składnika włókienkowego.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się środek skuteczny w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu, która to odpowiedź immunologiczna charakteryzuje się poziomem immunoreaktywności w surowicy odpowiadającym poziomowi wyższemu co najmniej około cztery razy od poziomu immunoreaktywności w surowicy, zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku poziom immunoreaktywności w surowicy jest mierzony w surowicy przy rozcieńczeniu około 1:100.

Ta ostatnia cecha jest szczególnie odpowiednia, gdy immunoreaktywność surowicy mierzy się technikami ELISA, ale może dotyczyć jakichkolwiek względnych lub bezwzględnych pomiarów immunoreaktywności surowicy.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała specyficznie wiążącego się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem amyloidu, który stanowi składnik włókienkowy.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem składnika włókienkowego.

Jeszcze korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

Ponadto korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włokienkowemu, przy czym to ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

PL 202 217 B1

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem amyloidu wybranym z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek, którego skuteczna dawka charakteryzuje się u pacjenta poziomem immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało połączone z nośnikiem.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, której cechą jest to, że zawiera, jako składnik czynny, skuteczną dawkę przeciwciała, które specyficznie wiąże się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym, przy czym ten składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało, które specyficznie wiąże się ze składnikiem amyloidu, którym jest składnik włókienkowy.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało wiążące się z epitopem skł adnika wł ókienkowego.

Korzystniej kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało, będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym to ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało, które specyficznie wiąże się z włókienkowym składnikiem amyloidu wybranym z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera skuteczną dawkę, którą stanowi ilość przeciwciała, skuteczna w wytworzeniu u pacjenta poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera nośnik.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest sformułowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, podskórnego, domięśniowego, donosowego, domiejscowego lub dożylnego.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest sformułowana jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała specyficznie wiążących się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi biał kami, fragmentami biał ek i peptydami.

PL 202 217 B1

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiążące się ze składnikiem amyloidu, którym jest składnik włókienkowy.

Korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążące się z epitopem składnika włókienkowego.

Jeszcze korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

Ponadto korzystniej w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włokienkowemu, przy czym to ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiążące się ze składnikiem amyloidu wybranym z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal i AIAPP.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek, którego skuteczna dawka charakteryzuje się u pacjenta poziomem immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciw składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała połączone z nośnikiem.

Korzystnie w rozwiązaniu dotyczącym zastosowania według wynalazku wytwarza się lek w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, której cechą jest to, że zawiera, jako składnik czynny, skuteczną dawkę przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiążą się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiążą się ze składnikiem amyloidu, którym jest składnik włókienkowy.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało wiążące się z epitopem skł adnika wł ókienkowego.

Korzystniej kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało, będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym to ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiążą się z włókienkowym składnikiem amyloidu wybranym z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal i AIAPP.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera przeciwciała lub fragmenty przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera skuteczną dawkę, którą stanowi ilość przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, skuteczna w wytworzeniu u pacjenta poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera nośnik.

PL 202 217 B1

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest sformułowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, podskórnego, domięśniowego, donosowego, domiejscowego lub dożylnego.

Ponadto korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest sformułowana jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.

Ponadto opisane powyżej tryby immunizacji mogą obejmować podawanie środków, włącznie z przeciwciał ami, w wielokrotnych dawkach, takich jak w okresie ponad 6 miesię cy, takich w których po początkowej immunizacji podaje się dawki wspomagające z przerwami, takimi jak 6-tygodniowe przerwy, zgodnie ze znanymi sposobami lub zgodnie z potrzebami pacjenta, co można stwierdzić na podstawie odpowiedzi immunologicznej. Inaczej lub ponadto, takie tryby immunizacji mogą obejmować stosowanie znanych preparatów o „przedłużonym uwalnianiu.

Te oraz inne przedmioty i cechy wynalazku staną się bardziej oczywiste po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem łącznie z dołączonymi rysunkami.

Na fig. 1 przedstawiono miano przeciwciał u myszy transgenicznych po podaniu Αβ1-42.

Na fig. 2 przedstawiono obciążenie hipokampu amyloidem. Przy pomocy sterowanej komputerowo ilościowej analizy obrazowej sekcji mózgu poddanych reakcji immunologicznej oznaczono procent powierzchni regionu hipokampu zajmowanej przez płytki amyloidowe, określone na podstawie oddziaływania ze specyficznymi dla Ae przeciwciałami monoklonalnymi 3D6. Wartości dla poszczególnych myszy podano jako przyporządkowane do grupy traktowania. Linia pozioma dla każdej z grup wskazuje medianę wartości rozkładu.

Na fig. 3 przedstawiono dystrofię neurytów w hipokampie. Przy pomocy sterowanej komputerowo ilościowej analizy obrazowej sekcji mózgu poddanych reakcji immunologicznej oznaczono procent powierzchni regionu hipokampu zajmowany przez dystroficzne neuryty, określony na podstawie oddziaływania z ludzkimi specyficznymi dla APP monoklonalnymi 8E5. Wartości dla poszczególnych myszy podano jako przyporządkowane do grupy, której podawano AN1792 oraz grupy kontrolnej, której podawano PBS. Linia pozioma dla każdej z grup wskazuje medianę wartości rozkładu.

Na fig. 4 przedstawiono astrocytozę w korze poza płatem ciała modzelowatego. Przy pomocy sterowanej komputerowo ilościowej analizy obrazowej sekcji mózgu poddanych reakcji immunologicznej oznaczono procent powierzchni regionu korowego zajmowany przez astrocyty dodatnie względem kwaśnego włókienkowego białka glejowego (GFAP). Wartości dla poszczególnych myszy podano jako przyporządkowane do grupy traktowania, a mediany wartości dla grupy wskazano poziomymi liniami.

Na fig. 5 przedstawiono średnie geometryczne mian przeciwciał przeciwko Ae42 po immunizacji w zakresie ośmiu dawek Ae42 („AN1792) zawierających 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11,33, 100 lub 300 μg.

Na fig. 6 przedstawiono kinetykę odpowiedzi przeciwciał na immunizację AN1792. Miana wyrażono w postaci średnich geometrycznych wartości dla sześciu zwierząt w każdej z grup.

Na fig. 7 przedstawiono ilościową analizę obrazową obciążenia kory amyloidem u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.

Na fig. 8 przedstawiono ilościową analizę obrazową obciążenia płytkami starczymi u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.

Na fig. 9 przedstawiono ilościową analizę obrazową procentu kory poza płatem ciała modzelowatego, objętej astrocytozą u myszy poddanych działaniu PBS i AN1792.

Na fig. 10 przedstawiono test proliferacji limfocytów na komórkach śledziony myszy poddanych działaniu AN1792 (górny wykres) i PBS (dolny wykres).

Na fig. 11 przedstawiono całkowity poziom Ae w korze mózgowej. Wykres rozrzutu poszczególnych profili Ae u myszy immunizowanych Ae lub pochodnymi APP w połączeniu z adiuwantem Freuda.

Na fig. 12 przedstawiono obciążenie kory amyloidem oznaczone przy pomocy sterowanej komputerowo ilościowej analizy obrazowej sekcji mózgu poddanych reakcji immunologicznej myszy immunizowanych koniugatami peptydu Ae Ae1-5, Ae1-12, Ae13-28, agregatami Ae o pełnej długości Ae42 („AN1792) i Ae1-40 („AN1528) oraz poddanej działaniu PBS grupy kontrolnej.

Na fig. 13 przedstawiono średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych względem Ae dla grup myszy immunizowanych Ae lub pochodnymi APP, w połączeniu z adiuwantem Freuda.

Na fig. 14 przedstawiono średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych względem Ae dla grup świnek morskich immunizowanych AN1792 lub jego palmitoliowaną pochodną, w połączeniu z różnymi adiuwantami.

Na fig. 15 (A-E) przedstawiono poziomy Ae w korze 12-miesięcznych myszy PDAPP, poddanych działaniu AN1792 lub AN1528 z różnymi adiuwantami.

PL 202 217 B1

Na fig. 16 przedstawiono średnie miano myszy poddanych działaniu poliklonalnego przeciwciała przeciwko Λβ.

Na fig. 17 przedstawiono średnie miano myszy poddanych działaniu monoklonalnego przeciwciała 10D5 przeciwko Λβ.

Na fig. 18 przedstawiono średnie miano myszy poddanych działaniu monoklonalnego przeciwciała 2F12 przeciwko Λβ.

Λ. Definicje

O ile nie wskazano inaczej, wszystkie użyte terminy mają to samo znaczenie jakie mają dla specjalisty w dziedzinie wynalazku. Praktyków szczególnie kieruje się do podręczników Sambrook i inni, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 wyd.) Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. i Ausubel, P.M. i inni, (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nowy Jork, NY, gdzie można znaleźć definicje, terminy i standardowe metody znane w dziedzinie biochemii i biologii molekularnej. Należy zdawać sobie sprawę, że wynalazek nie jest ograniczony do konkretnie opisanych metodologii, protokołów i odczynników, ze względu na to, że można je zmieniać by osiągnąć ten sam rezultat.

Termin „adiuwant oznacza związek, który podany razem z antygenem wzmaga odpowiedź immunologiczną na antygen, ale podany oddzielnie nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej na antygen. Adiuwanty mogą wzmagać odpowiedź immunologiczną na drodze kilku różnych mechanizmów, włącznie z rekrutacją limfocytów, stymulacją komórek B i/lub T oraz stymulacją makrofagów.

„Choroba amyloidowa lub „skrobiawica oznacza którekolwiek z wielu zaburzeń, w których jako jeden z objawów lub jako część ich patologii obserwuje się tworzenie płytek amyloidowych.

Termin „płytka amyloidowa oznacza zewnątrzkomórkowy złóg składający się głównie z białkowych włókienek. Ogólnie włókienka składają się z dominującego białka lub peptydu; jednakże, płytki mogą także zawierać dodatkowe składniki będące peptydami lub niepeptydowymi cząsteczkami, jak to podano w opisie.

„Składnik amyloidowy oznacza dowolną cząsteczkę obecną w płytce amyloidowej, włącznie z antygenowymi częściami takich cząsteczek. Składnikami amyloidowymi są, ale nie tylko, białka, peptydy, proteoglikany i węglowodany. „Specyficzny składnik amyloidowy oznacza cząsteczkę znajdywaną głównie lub wyłącznie w danej płytce amyloidowej.

„Środek oznacza cząsteczkę chemiczną pochodzenia syntetycznego lub biologicznego. W kontekście wynalazku środek ogólnie oznacza cząsteczkę, którą można zastosować w kompozycji farmaceutycznej.

„Środek przeciwamyloidowy oznacza środek zdolny do wytwarzania odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi płytki amyloidowej u kręgowca, gdy podaje się go technikami czynnej lub biernej immunizacji.

Terminy „polinukleotyd i „kwas nukleinowy stosowane zamiennie, oznaczają cząsteczkę polimeryczną mającej szkielet niosący zasady zdolne do tworzenia wiązań wodorowych z typowymi polinukleotydami, przy czym polimeryczny szkielet prezentuje zasady w taki sposób, że umożliwia to tworzenie takich wiązań wodorowych w specyficzny dla sekwencji sposób pomiędzy cząsteczką polimeryczną i typowym polinukleotydem (np. jednoniciowym DNA). Zasady takie są to zazwyczaj inozyna, adenozyna, guanozyna, cytozyna, uracyl i tymidyna. Cząsteczki polimeryczne obejmują dwui jednoniciowe RNA i DNA oraz modyfikacje ich szkieletu, np. połączenia metylofosfonianowe.

Termin „polipeptyd w znaczeniu tutaj użytym oznacza związek złożony z pojedynczego łańcucha reszt aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Termin „białko może być synonimem terminu „polipeptyd lub może odnosić się do kompleksu dwóch lub większej liczby polipeptydów.

Termin „peptyd także oznacza związek złożony z reszt aminokwasów połączonych przez wiązania peptydowe. Ogólnie peptydy składają się ze 100 lub mniejszej liczby aminokwasów, podczas gdy polipeptydy i białka zawierają ponad 100 aminokwasów. Użyty tutaj termin „fragment białka można także odczytywać jako oznaczający polipeptyd.

„Peptyd włókienkowy lub „białko włókienkowe oznacza monomeryczną lub zagregowaną postać białka lub peptydu, która tworzy włókienka obecne w płytkach amyloidowych. Przykłady takich peptydów lub białek zamieszczono w opisie.

„Kompozycja farmaceutyczna oznacza chemiczną lub biologiczną kompozycję odpowiednią do podawania ssakowi. Takie kompozycje można specyficznie formułować do podawania jedną lub większą liczbą z wielu dróg, w tym, ale nie tylko, doustnie, pozajelitowo, dożylnym, dotętniczo, podskórnie, donosowo, podjęzykowo, wewnątrzrdzeniowo, do komór mózgowych itp.

PL 202 217 B1 „Zaróbka farmaceutyczna lub „farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka oznacza nośnik, zazwyczaj ciekły, w którym formułuje się czynny środek leczniczy. Zaróbka ogólnie nie wnosi do preparatu jakiejkolwiek aktywności farmaceutycznej, jednakże może ona zapewniać chemiczną i/lub biologiczną trwałość, charakterystykę uwalniania itp. Przykładowe preparaty można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 19, red. Grennaro, A., 1995.

„Glikoproteina oznacza białko do którego dołączony jest kowalencyjnie co najmniej jeden łańcuch węglowodanowy (oligopolisacharyd).

„Proteoglikan oznacza glikoproteinę, w której co najmniej jeden z łańcuchów węglowodanowych jest glikozoaminoglikanem, będący długim, liniowym polimerem powtarzających się disacharydów, w których jednym członem pary jest kwas cukrowy (kwas uronowy), a drugim jest aminocukier.

Termin odpowiedź „immunologiczna, „odpornościowa lub „immunogenna oznacza rozwój humoralnej (pośredniczonej przez przeciwciała) i/lub komórkowej (pośredniczonej przez specyficzne dla antygenu komórki T lub ich produkty wydzielnicze) odpowiedzi skierowanej przeciwko antygenowi u kręgowca. Taka odpowiedź może być czynną odpowiedzią wywołaną przez podanie immunogenu lub bierną odpowiedzią wywołaną przez podanie przeciwciała lub uczulonych komórek T. Komórkowa odpowiedź immunologiczna jest wywoływana przez prezentację epitopów polipeptydowych w połączeniu z cząsteczkami MHC Klasy I lub Klasy II w celu zaktywowania specyficznych dla antygenu pomocniczych komórek T CD4⁺ i/lub cytotoksycznych komórek T CD8⁺. Odpowiedź może także obejmować aktywacje monocytów, makrofagów, komórek NK, granulocytów zasadochłonnych, komórek dendrytycznych, astrocytów, komórek mikrogleju, granulocytów kwasochłonnych lub innych składników odporności wrodzonej. Wystąpienie komórkowej odpowiedzi immunologicznej można oznaczyć w znanych standardowych testach proliferacji (komórek T CD4⁺) lub testach CTL (limfocytów T cytotoksycznych). Względny udział odpowiedzi humoralnej i komórkowej do ochronnego lub leczniczego działania immunogenu można rozróżnić oddzielnie izolując frakcje immunoglobuliny (IgG) i komórek T z immunizowanego syngenicznie zwierzęcia i mierząc ochronne lub lecznicze działanie u drugiego zwierzęcia.

„Środek immunogenny lub „immunogen lub „antygen oznacza cząsteczkę zdolną, po podaniu pacjentowi, do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko sobie samej, w połączeniu z adiuwantem lub w jego nieobecności. Takie cząsteczki obejmują np. włókienkowe peptydy amyloidu lub ich fragmenty połączone z białkiem nośnikowym, takim jak hemocyjaninę z mięczaka z rodzaju Fisurella (ang. keyhole limpet), Cd3 lub toksyna tężca.

Określenie „epitop lub „determinanta antygenowa oznacza część antygenu, która wiąże się z regionem przeciwciała wiążącym antygen.

Terminy „Λβ, „peptyd Ae i peptyd „β amyloidu są synonimami i odnoszą się do jednego lub większej liczby środków peptydowych o długości 38-43 reszt aminokwasów, pochodzących z Białka Prekursorowego Beta Amyloidu (β-APP), jak to podano w opisie. „Αβχχ oznacza peptyd β amyloidu 1-xx, gdzie xx jest liczbą wskazującą liczbę reszt aminokwasów w peptydzie; np. Λβ42 oznacza to samo co Λβ1-42, który w opisie określa się także jako „AN1792, a Λβ40 oznacza to samo, co Λβ1-40, który w opisie określa się także jako „AN1578.

Zdezagregowany lub monomeryczny Λβ oznacza rozpuszczalne, monomeryczne jednostki peptydowe Λβ. Jednym ze sposobów wytworzenia monomerycznych Λβ jest rozpuszczenie liofilizowanego peptydu w czystym DMSO z obróbką ultradźwiękami. Powstały roztwór odwirowuje się aby usunąć jakiekolwiek nierozpuszczalne cząstki. Zagregowany Λβ jest mieszaniną oligomerów w których jednostki monomeryczne są połączone razem przez wiązania niekowalencyjne.

Termin „nagi polinukleotyd oznacza polinukleotyd nieskompleksowany z materiałem koloidalnym. Nagie polinukleotydy czasem klonuje się w wektory plazmidowe.

Określenie „pacjent oznacza człowieka lub ssaka u którego stosuje się profilaktykę lub leczenie.

Terminy „znacząco różny niż, „statystycznie różny, „znacząco wyższy (lub niższy) niż i podobne określenia odnoszą się do porównania pomiędzy danymi lub innymi pomiarami, gdzie różnice pomiędzy dwoma porównywanymi osobnikami lub grupami są oczywiście lub znacząco różne dla wyuczonego obserwatora lub statystycznie różne (jeżeli zdanie zawiera termin „statystycznie lub gdy jest wskazanie na test statystyczny, taki jak wartości p, lub gdy dane, gdy są analizowane, dają statystyczne różnice w znanych standardowych testach statystycznych).

Kompozycje lub sposoby „zawierające/obejmujące jeden lub większą liczbę cytowanych składników mogą także zawierać inne składniki nie wymienione konkretnie. Tak np. kompozycja zawierająca składowy peptyd włókienkowy obejmuje zarówno wyizolowane peptydy, jak i peptyd jako składnik

PL 202 217 B1 większej sekwencji polipeptydowej. W kolejnym przykładzie kompozycja zawierająca składniki A i B obejmuje także kompozycję składającą się z A, B i C.

B. Choroby amyloidowe

1. Przegląd i patogeneza

Choroby amyloidowe lub skrobiawice obejmują szereg stanów chorobowych o różnorodnych objawach zewnętrznych. Cechą wspólną tych zaburzeń jest występowanie nieprawidłowych zewnątrzkomórkowych złogów włókienek białkowych, znanych jako „złogi amyloidowe lub „płytki amyloidowe zazwyczaj o średnicy około 10-100 μm i umiejscowionych w specyficznych narządach lub obszarach tkanek. Takie płytki składają się głównie z naturalnie występującego rozpuszczalnego białka lub peptydu. Te nierozpuszczalne złogi składają się głównie z poprzecznych agregatów włókienek o średnicy około 10-15 nm. Włókienka amyloidowe, po wybarwieniu barwnikiem Congo Red, wykazują w świetle spolaryzowanym charakterystyczną dwójłomność zielonego jabłka (apple-green). Zaburzenia klasyfikuje się w oparciu o główne składniki włókienek tworzących złogi płytkowe, co opisano poniżej.

Peptydy lub białka tworzące złogi płytkowe często powstają z większego białka prekursorowego. W szczególności, w patogenezie włókienkowych złogów amyloidowych zazwyczaj zachodzi cięcie proteolityczne „nieprawidłowego białka prekursorowego na fragmenty. Fragmenty te zazwyczaj łączą się tworząc antyrównoległe struktury β kartek; jednakże, obserwowano, że pewne niezdegradowane postacie białka prekursorowego agregują i tworzą włókienka w rodzinnej polineuropatii skrobiawiczej (włókienka β2 mikroglobuliny) (Tan i inni, 1994, jak wyżej).

2. Zespoły kliniczne

Ta część opisuje główne typy skrobiawic, włącznie z ich charakterystycznymi składnikami włókienek płytkowych. Głównym odkryciem wynalazku jest to, że choroby amyloidowe można leczyć przez podawanie środków służących do stymulacji odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi lub składnikom różnych, specyficznych dla choroby, złogów amyloidowych. Jak to przedyskutowano w części C poniżej, takie składniki są korzystnie składnikami włókienek tworzących płytki. Poniższe części zamieszczono w celu podania przykładów głównych postaci skrobiawic i nie ograniczają one wynalazku.

a. Skrobiawice AA (reaktywne)

Ogólnie, skrobiawica AA występuje jako objaw wielu chorób, które wywołują opóźnienie odpowiedzi fazy ostrej. Takie choroby obejmują przewlekłe zaburzenia zapalne, przewlekłe miejscowe lub ogólnoustrojowe zakażenia drobnoustrojowe oraz nowotwory złośliwe.

Włókienka AA ogólnie składają się z fragmentów 8000 Da (peptydu lub białka AA) powstałych przez cięcie proteolityczne surowiczego białka A amyloidu (apoSSA), apolipoproteiny krążącej w krwi, która występuje w cząstkach HDL i jest syntetyzowana w hepatocytach w odpowiedzi na cytokiny, takie jak IL-1, IL-6 i TNF. Odkładanie w organizmie może być szeroko rozprzestrzenione, z preferencją do narządów miąższowych. Zazwyczaj miejscem odkładania jest śledziona, a także mogą być nim dotknięte nerki. Odkładanie występuje także często w sercu i przewodzie żołądkowo-jelitowym.

Choroby z amyloidem AA obejmują, ale nie tylko, choroby zapalne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, łuszczyca, gościec łuszczycowy, zespół Reitera, choroba Stilla dorosłych, zespół Behęeta i choroba Crohna. Złogi AA tworzą się także w wyniku przewlekłych zakażeń drobnoustrojowych, takich jak trąd, gruźlica, rozstrzenie oskrzelowe, odleżyny, przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie szpiku i choroba Whipple'a. W pewnych złośliwych nowotworach także mogą powstawać złogi amyloidowe włókienek AA. Obejmują one takie stany jak chłoniak Hodgkina, rak nerek, raki jelita, płuc i przewodu moczowo-płciowego, rak podstawnokomórkowy oraz białaczkę kosmatokomórkową.

b. Skrobiawice AL

Odkładanie amyloidu AL jest ogólnie związane z prawie każdą dyskrazją linii limfocytów B, od złośliwości komórek plazmatycznych (szpiczak mnogi) do łagodnych gammopatii monoklonalnych. Czasami występowanie złogów amyloidowych może być pierwotnym wskaźnikiem leżącej u podłoża dyskrazji.

Włókienka złogów amyloidu AL są złożone z łańcuchów lekkich immunoglobulin monoklonalnych lub ich fragmentów. W szczególności fragmenty te pochodzą z N-końcowego regionu łańcucha lekkiego (κ lub λ) i zawierają całą jego domenę zmienną VL lub jej część. Złogi ogólnie występują w tkankach mezenchymalnych i powodują neuropatię obwodową i autonomiczną, zespół kanału nadgarstka, przerost języka, kardiomiopatię restrykcyjną, artropatię dużych stawów, dyskrazje komórek układu immunologicznego, szpiczaki, a także utajone dyskrazje. Jednakże należy zwrócić uwagę, że praktycznie każdy narząd trzewny, taki jak serce, może być dotknięty tą chorobą.

PL 202 217 B1

c. Dziedziczne skrobiawice ustrojowe

Istnieje wiele postaci dziedzicznych skrobiawic ustrojowych. Pomimo, że są one stosunkowo rzadkimi stanami chorobowymi, późne wystąpienie objawów oraz wzór ich dziedziczenia (zazwyczaj autosomalny dominujący) prowadzi do utrwalania się takich zaburzeń w ogólnej populacji. Ogólnie zaburzeniom są przypisywane mutacje punktowe w białku prekursorowym prowadzące do wytwarzania odmiennych peptydów lub białek amyloidogennych. W tabeli 2 zamieszczono podsumowanie składu włókienek w przykładowych postaciach tych zaburzeń.

T a b e l a 2

Dziedziczne skrobiawice*

Peptyd/białko włókienkowe	Wariant genetyczny	Zespół kliniczny
Transtyretyna i fragmenty (ATTR)	Met30, wiele innych	Rodzinna polineuropatia skrobiawicza (FAP), (głównie nerwy obwodowe)
Transtyretyna i fragmenty (ATTR)	Thr45, Ala60, Ser84, Met111, Ile122	Przeważająco związana z sercem bez neuropatii
N-końcowy fragment apolipoproteiny A1 (apoAI)	Arg26	Rodzinna polineuropatia skrobiawicza (FAP), (głównie nerwy obwodowe)
N-końcowy fragment apolipoproteiny A1 (apoAI)	Arg26, Arg50, Arg60, inne	Typu Ostertag, nieneuropatyczna (główny udział trzewi)
Lizozym (Alys)	Thr56, His67	Typu Ostertag, nieneuropatyczna (główny udział trzewi)
Fragment łańcucha α fibrogenu	Leu554, Val 526	Typu Ostertag, nieneuropatyczna (główny udział trzewi)
Fragment gelsoliny (Agel)	Asn187, Tyr187	Czaszkowa neuropatia ze zwyrodnieniem kratowym rogówki
Fragment cystatyny C	Glu68	Dziedziczny krwotok mózgowy (mózgowa angiopatia amyloidowa) - odmiana islandzka
Białko β-amyloidu (Αβ) pochodzące z Białka Prekursorowego Amyloidu (APP)	Gln693	Dziedziczny krwotok mózgowy (mózgowa angiopatia amyloidowa) - odmiana holenderska
Białko β-amyloidu (Ae) pochodzące z Białka Prekursorowego Amyloidu (APP)	Ile717, Phe717, Gly717	Rodzinna choroba Alzheimera
Białko β-amyloidu (Ae) pochodzące z Białka Prekursorowego Amyloidu (APP)	Asn670, Leu671	Rodzinne otępienie - prawdopodobnie choroba Alzheimera
Białko Prionowe (PrP) pochodzące ze wstawki 51-91 białka prekursorowego PrP	Leu102, Val167, Asn178, Lys200	Rodzinna choroba Creutzfeldta- -Jakoba; Zespół Gerstmanna-Strausslera-Scheinkera (dziedziczne encefalopatie gąbczaste, choroby prionowe)
AA pochodzący z surowiczego białka amyloidu A (ApoSSA)		Rodzinna gorączka śródziemnomorska, główny udział w nerkach (autosomatyczna recesywna)
AA pochodzący z surowiczego białka amyloidu A (ApoSSA)		Zespół Muckle-Wella, nefropatia, głuchota, pokrzywka, bóle kończyn
Nieznane		Kardiomiopatia z trwałym unieruchomieniem przedsionków
Nieznane		Skórne złogi (pęcherze, grudki, krosty skórne)

*Dane z Tan i Pepys, 1994, jak wyżej.

PL 202 217 B1

Dane z tabeli 2 zamieszczono przykładowo. Tak np. opisano ponad 40 osobnych mutacji punktowych w genie transtyretyny, które wszystkie powodują powstawanie klinicznie podobnych postaci rodzinnej polineuropatii amyloidowej.

Transtyretyna (TTR) jest białkiem 14 kDa, które także czasem jest nazywane prealbuminą. Jest ona wytwarzana przez wątrobę i splot naczyniówkowy i bierze udział w transporcie hormonów tarczycznych i witaminy A. Przynajmniej 50 różnych postaci tego białka, każda charakteryzująca się zmianą jednego aminokwasu, jest odpowiedzialnych za różne postacie rodzinnej polineuropatii amyloidowej. Tak np. podstawienie leucyny proliną w pozycji 55 wywołuje szczególnie postępującą postać neuropatii; podstawienie leucyny metioniną w pozycji 111 wywołuje ostrą kardiopatię u pacjentów duńskich. Przy badaniu złogów amyloidowych wyizolowanych z tkanki serca pacjentów z układową skrobiawicą stwierdzono, że złogi te składały się z heterogennej mieszaniny TTR i jej fragmentów, zbiorczo nazwanych ATTR, których pełne sekwencje scharakteryzowano. Włókienkowe składniki ATTR można wyekstrahować z takich płytek i określić ich strukturę i sekwencję znanymi sposobami (np. Gustavsson, A. i inni, Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F. i inni, Biochem.

Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras, M. i inni, PNAS 80: 539-42,1983).

U osób z mutacjami punktowymi w cząsteczce apolipoproteiny Al (np. Gly > Arg26; Trp > Arg50; Leu > Arg60) występuje postać skrobiawicy („typu Óstertag) charakteryzująca się złogami białka apolipoproteiny Al lub jego fragmentów (AApoAI). Pacjenci ci mają niskie poziomy lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) i występuje u nich neuropatia obwodowa lub niewydolność nerek.

Mutacja w łańcuchu α enzymu lizozymu (np. Ile > Thr56 lub Asp > His57) leży u podstaw innej rodzinnej skrobiawicy nieneuropatycznej typu Óstertag, obserwowanej u rodzin angielskich. W tym przypadku włókienka zmutowanego białka lizozymu (Alys) są odkładane i pacjenci zazwyczaj wykazują zaburzone działanie nerek. Białko to, inaczej niż większość opisanych tutaj białek tworzących włókienka, jest zazwyczaj obecne w postaci całkowitej (niefragmentowanej) (Benson, M.D. i inni, CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).

Peptyd β-amyloidowy (Αβ) jest peptydem o długości 39-43 reszt aminokwasów, powstałym w wyniku proteolizy dużego białka znanego jako białko prekursorowe β amyloidu (βΑΡΡ). Mutacje w βΑΡΡ wywołują rodzinne postacie choroby Alzheimera, zespół Downa i/lub otępienie starcze, charakteryzujące się odkładaniem w mózgu płytek składających się z włókienek Αβ i innych składników, które zostaną opisane poniżej bardziej szczegółowo. Znane mutacje w ΑΡΡ związane z chorobą Alzheimera występują proksymalnie do miejsc cięcia APP przez β lub γ sekretazy lub w obrębie Αβ. Tak np. pozycja 717 leży proksymalnie do miejsca cięcia ΑΡΡ przez sekretazę γ podczas obróbki do Αβ, a pozycje 670/671 leżą proksymalnie do miejsca cięcia przez sekretazę β. Mutacje w którymkolwiek z tych miejsc mogą spowodować chorobę Alzheimera, prawdopodobnie wywołując wzrost ilości postaci Αβ o 42/43 resztach aminokwasów, wytwarzanej z APP. Struktura i sekwencja peptydów Αβ o różnych długościach są dobrze znane (np. Glenner i Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984; Glenner i Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). Ponadto różne postacie peptydów są dostępne w handlu.

Synukleina jest związanym z synapsami białkiem przypominającym apolipoproteinę i występuje w dużej ilości w cytozolu komórek nerwowych i zakończeniach presynaptycznych. Fragment peptydu pochodzący z α-synukleiny, nazywany NAC, jest także składnikiem płytek amyloidowych w chorobie Alzheimera (Clayton i inni, 1998). Ten składnik także służy jako cel w terapiach o podstawie immunologicznej według wynalazku, co opisano poniżej.

Gelsolina jest białkiem wiążącym wapń, które wiąże się z fragmentami włókienek aktynowych. Mutacje w pozycji 187 (np. Asp > ASN; Asp > Tyr) białka wywołują powstawanie rodzinnej postaci dziedzicznej skrobiawicy układowej, zazwyczaj wykrywanej u pacjentów z Finlandii, a także u osób o pochodzeniu holenderskim i japońskim. U osób dotkniętych chorobą włókienka wytworzone z fragmentów gelsoliny (Agel), zazwyczaj składają się z reszt aminokwasów 173-243 (fragment C-końcowy 68 kDa) i są odkładane w naczyniach krwionośnych i błonach podstawnych, co wywołuje zwyrodnienie rogówki i neuropatię czaszkową postępującą do neuropatii obwodowej, zwyrodnieniowe zmiany skórne i odkładanie w innych narządach. (Kangas, H. i inni, Human Mol. Genet. 5(9): 1237-1243,1996).

Inne zmutowane białka, takie jak zmutowany łańcuch α fibrynogenu (AfibA) i zmutowana cystatyna C (Acys), także tworzą włókienka i powodują charakterystyczne dziedziczne zaburzenia. Włókienka AfibA tworzą złogi charakterystyczne dla nieneuropatycznej dziedzicznej choroby amyloidowej z chorobą nerek; złogi Acys są charakterystyczne dla dziedzicznej mózgowej angiopatii amyloidowej obserwowanej w Islandii. (Isselbacher i inni, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill,

PL 202 217 B1

San Francisco, 1995; Benson, i inni, jak wyżej). Przynajmniej w niektórych przypadkach wykazano, że pacjenci z mózgową angiopatią amyloidową (CAA) posiadają włókienka amyloidu zawierające niezmutowaną postać cystatyny C w połączeniu z białkiem e. (Nagai, A. i inni, Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78,1998).

Obecnie uważa się, że pewne postacie chorób prionowych są dziedziczne, co stanowi do 15% przypadków, które dotychczas uważano za przypadki o podłożu głównie zakaźnym (Baldwin i inni w Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). W takich zaburzeniach prionowych u pacjentów rozwijają się płytki złożone z nieprawidłowych izoform normalnego białka prionowego (PrP^c). Dominująca zmutowana izoforma, Prp^Sc, nazywana także AScr, różni się od normalnego białka komórkowego opornością na degradację proteazami, nierozpuszczalnością po ekstrakcji detergentami, odkładaniem we wtórnych lizosomach, syntezą post-translacyjną i dużą zawartością struktur e kartek. Ustalono związek genetyczny dla przynajmniej pięciu mutacji wywołujących chorobę Creutzfeldta-Jacoba (CJD), zespół Gerstmanna-Strausslera-Scheinkera (GSS) i śmiertelną rodzinną bezsenność (FFI) (Baldwin). Sposoby ekstrahowania włókienek scrapie, wyznaczania sekwencji i wytwarzania takich peptydów są dobrze znane w dziedzinie wynalazku (np. Beekes, M. i inni, J. Gen. Virol. 76: 2567-76,1995).

Tak np. jedną z postaci GSS powiązano z mutacją PrP w kodonie 102, podczas gdy GSS kresomózgowia segreguje z mutacją w kodonie 117. Mutacje w kodonach 198 i 217 wywołują postać GSS, w której płytki starcze charakterystyczne dla choroby Alzheimera zawierają PrP zamiast peptydu Ae. Pewne postacie rodzinnej CJD powiązano z mutacjami w kodonach 200 i 210; mutacje w kodonach 129 i 178 znaleziono zarówno w rodzinnej CJD, jak i w FFI (Baldwin, jak wyżej).

d. Starcza skrobiawica układowa

Odkładanie amyloidu, ustrojowe lub ogniskowe, nasila się z wiekiem. Tak np. włókienka transtyretyny typu dzikiego (TTR) są często znajdywane w tkance serca starszych pacjentów. Odkładanie to może występować bezobjawowo, milcząco klinicznie lub może powodować zawał serca. Bezobjawowe lokalne złogi mogą także wystąpić w mózgu (Ae), ciele skrobiowatym prostaty (mikroglobulina Ae2), stawach i pęcherzykach nasiennych.

e. Skrobiawica mózgowa

Miejscowe odkładanie amyloidu jest częste w mózgu, szczególnie u osób starszych. Najczęstszy typ amyloidu w mózgu składa się głównie z włókienek białkowych Ae, co wywołuje otępienie lub sporadyczną (niedziedziczną) chorobę Alzheimera. Faktycznie częstość sporadycznej choroby Alzheimera znacznie przewyższa częstość postaci, co do których udowodniono podłoże dziedziczne. Peptydy włókienkowe tworzące te płytki są bardzo podobne do opisanych powyżej w odniesieniu do dziedzicznych postaci choroby Alzheimera (AD).

f. Skrobiawice związane z dializami

Płytki złożone z włókienek mikroglobuliny e2 (Ae2M) często rozwijają się u pacjentów otrzymujących długoterminowe hemodializy lub dializy otrzewnowe. Mikroglobulina e2 jest polipeptydem 11,8 kDa i stanowi łańcuch lekki antygenów klasy I MHC, które występują na wszystkich komórkach jądrowych. W normalnych warunkach jest ona ciągle usuwana z błon komórkowych i normalnie filtrowana przez nerki. Zaburzenie klirensu, takie jak w przypadku zaburzenia działania nerek, prowadzi do odkładania w nerkach i innych miejscach (głównie w tkankach stawów bogatych w kolagen). Inaczej niż inne białka włókienkowe, cząsteczki Ae2M są w dużej ilości obecne we włókienkach w postaci niepofragmentowanej (Benson, jak wyżej).

g. Skrobiawice o podłożu hormonalnym

Organy wewnątrzwydzielnicze mogą zawierać złogi amyloidowe, w szczególności u starszych osobników. Guzy wydzielające hormony także mogą zawierać pochodzące od hormonów płytki amyloidowe, których włókienka są utworzone z hormonów polipeptydowych, takich jak kalcytonina (rak rdzeniasty tarczycy), wysepkowy polipetyd amyloidu (amylina; występująca u większości pacjentów z cukrzycą typu II) i przedsionkowy peptyd natriuretyczny (izolowana skrobiawica przedsionkowa). Sekwencje i struktury tych białek są dobrze znane.

h. Różne skrobiawice

Istnieje wiele innych postaci chorób amyloidowych zazwyczaj objawiających się zlokalizowanymi złogami amyloidowymi. Ogólnie choroby te prawdopodobnie wynikają z miejscowego powstawania i/lub braku katabolizmu specyficznych prekursorów włókienkowych lub predyspozycji konkretnej tkanki (takiej jak staw) do odkładania włókienek. Przykłady takiego samoistnego odkładania obejmują guzowaty amyloid AL, amyloid skórny, amyloid wewnątrzwydzielniczy i amyloid związany z nowotworami.

PL 202 217 B1

C. Kompozycje farmaceutyczne

Odkryciem wynalazku jest to, że kompozycje zdolne do wywoływania lub dostarczania odpowiedzi immunologicznej skierowanej do pewnych składników płytek amyloidowych są skuteczne w leczeniu lub profilaktyce rozwoju chorób amyloidowych. W szczególności, według wynalazku możliwe jest zapobieganie postępowi, zmniejszenie objawów i/lub zmniejszenie obciążenia płytkami amyloidowymi u osób dotkniętych chorobą, gdy pacjentowi podaje się immunostymulującą dawkę środka przeciwamyloidowego lub odpowiedniego przeciwamyloidowego czynnika immunologicznego. Ta część opisuje przykładowe środki amyloidowe, które wywołują czynną, a także bierną, odpowiedź immunologiczną na płytki amyloidowe i dostarcza przykładowych danych pokazujących działanie leczenia przy pomocy takich kompozycji na obciążenie płytkami amyloidowymi.

Ogólnie środki przeciwamyloidowe według wynalazku składają się ze specyficznego składnika płytkowego, korzystnie składnika tworzącego włókienka, który zazwyczaj jest charakterystycznym białkiem, peptydem lub jego fragmentem, co opisano w poprzedniej części i poparto przykładami poniżej. Bardziej ogólnie środki lecznicze do zastosowań według wynalazku wytwarzają lub wywołują odpowiedź immunologiczną przeciw płytkom, lub bardziej szczegółowo, przeciwko ich składnikowi włókienkowemu. Zatem takie środki obejmują, ale nie tylko, sam składnik i jego warianty, analogi i mimetyki skł adnika wywoł ują ce odpowiedź przeciwciał i/lub reagują ce krzyż owo z przeciwciał ami przeciw składnikowi, a także przeciwciała lub komórki T, które są specyficznie reaktywne ze składnikiem amyloidu. Zgodnie z istotną cechą, kompozycji farmaceutycznych nie wybiera się z niespecyficznych składników - czyli ze składników ogólnie krążących w krwi lub wszechobecnych w organizmie. Tak np. surowicze białko amyloidu (SAP) jest krążącą w krwi glikoproteiną osoczową wytwarzaną w wątrobie i wiążąc ą się z większością znanych postaci złogów amyloidowych. Kompozycje farmaceutyczne są korzystnie skierowane przeciwko temu składnikowi.

Wywołanie odpowiedzi immunologicznej może być czynne, tak jak w przypadku, gdy podaje się immunogen w celu zaindukowania przeciwciał lub komórek T reagujących z składnikiem u pacjenta, lub bierne, tak jak w przypadku, gdy podaje się przeciwciała, które same wiążą się ze składnikiem amyloidu u pacjenta. Przykładowe środki wywołujące lub wytwarzające odpowiedź immunologiczną przeciwko płytkom amyloidowym opisano w poniższych częściach.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać, dodatkowo poza środkiem immunogennym/środkami immunogennymi, skuteczną ilość adiuwanta i/lub zaróbki. Farmaceutycznie skuteczne i użyteczne adiuwanty i zaróbki są znane i opisano je bardziej szczegółowo w poniższych częściach.

1. Środki immunostymulacyjne (czynna odpowiedź immunologiczna) a. Środki przeciw-włókienkowe

Jedna główna klasa korzystnych środków przeciwamyloidowych obejmuje środki pochodzące z włókienkowych białek amyloidu. Tak jak wspomniano powyż ej, cechą chorób amyloidowych jest odkładanie w narządzie lub narządach płytek amyloidowych zawierających głównie włókienka, które z kolei składają się z charakterystycznych włókienkowych białek lub peptydów. Według wynalazku taki składnik, jakim jest włókienkowe białko lub peptyd, znajduje zastosowanie jako środek do wywoływania przeciwamyloidowej odpowiedzi immunologicznej.

Tabele 1 i 2 zestawiają przykładowe białka tworzące włókienka, charakterystyczne dla różnych chorób amyloidowych. Według tego aspektu wynalazku podawanie osobie dotkniętej chorobą lub podatnej na wystąpienie choroby kompozycji immunostymulującej zawierającej odpowiednie włókienkowe białko lub peptyd, włącznie z ich homologami lub fragmentami, wywołuje skutek terapeutyczny lub profilaktyczny w odniesieniu do choroby amyloidowej.

Przykładowo Αβ, znany także jako peptyd β-amyloidowy lub peptyd A4 (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4666829; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984) jest peptydem o długości 39-43 reszt aminokwasów, który jest główną składową charakterystycznych płytek w chorobie Alzheimera. Ae powstaje przez obróbkę większego białka APP przez dwa enzymy, nazywane sekretazami β i γ (patrz. Hardy, TINS 20, 154 (1997)).

Przykład I opisuje wyniki doświadczeń przeprowadzonych dla poparcia wynalazku, w których peptyd Ae42 podawano heterozygotycznym myszom transgenicznym, które nadeksprymowały ludzkie APP z mutacją w pozycji 717. Myszy te, znane jako „myszy PDAPP wykazywały patologię typu choroby Alzheimera i uważa się je za zwierzęcy model choroby Alzheimera (Games i inni, Nature,

373:523-7, 1995). Jak szczegółowo przedstawiono w przykładzie, myszy te w mózgach posiadały wykrywalną neuropatologię z płytkami Ae, poczynając od wieku 6 miesięcy, z odkładaniem płytek

PL 202 217 B1 postępującym w czasie. W opisanych doświadczeniach myszom tym podawano zagregowany Λβ42 (AN1792). Większość leczonych myszy (7/9) nie miała w swoich mózgach wykrywalnego amyloidu w wieku 13 miesięcy, w odróżnieniu od myszy kontrolnych (którym podawano roztwór soli lub nic nie podawano), z których wszystkie w tym wieku wykazywały znaczne obciążenie mózgu amyloidem (fig. 2). Różnice te były nawet jeszcze wyraźniejsze w hipokampie (fig. 3). Leczone myszy także posiadały w surowicy wysokie miana przeciwciał przeciw Λβ (wszystkie wyższe niż 1:1000, 8/9 wyższe niż 1/10000; fig. 1; tabela 3A). Ogólnie myszy, którym podawano roztwór soli, miały wartości mian przeciwciał przeciw Λβ mniej niż 4-5 krotnie przekraczające poziom podstawowy przy rozcieńczeniu 1:100 we wszystkich momentach badania, a zatem uznano je za nie mające znaczenia w odpowiedzi w porównaniu z kontrolą (tabela 3B). Badania te wykazały, że wstrzykiwanie specyficznego peptydu Λβ tworzącego włókienko zapewnia ochronę przeciw odkładaniu płytek Λβ amyloidowych.

Surowicze białko amyloidu (SAP) jest krążącą w krwi glikoproteiną osocza, która jest wytwarzana w wątrobie i wiąże się w zależny od wapnia sposób ze wszystkimi postaciami włókienek amyloidu, włącznie z włókienkami mózgowych płytek amyloidowych w chorobie Alzheimera. W części wspomnianych doświadczeń grupie myszy podano SAP; u myszy tych obserwowano w surowicy znaczne miana na SAP (1:1000-1:30000), ale nie obserwowano u nich wykrywalnych mian przeciw peptydowi Λβ i rozwinęły się u nich mózgowe neuropatologie płytkowe (fig. 2).

W dalszych doświadczeniach, przedstawionych szczegółowo w przykładzie II, wykazano zależność od dawki efektów immunogenicznych wstrzykiwania Λβ myszom leczonym pomiędzy 5 a 8 miesiącem życia. U tych myszy średnie miana w surowicy przeciwciał przeciw peptydowi Λβ wzrastały z liczbą immunizacji oraz z dawką; jednakże po 4 immunizacjach surowicze miana mierzone 5 dni po immunizacji przy wyższych dawkach (1 - 300 μg) ustabilizowały się na poziomie 1:10000 (fig. 5).

Dodatkowe doświadczenia potwierdzające wynalazek opisano w przykładzie III, gdzie modelowe myszy PDAPP poddano działaniu Λβ42 zaczynając w punkcie czasowym (wiek około 11 miesięcy), gdy płytki amyloidowe były już obecne w ich mózgach. W tych badaniach zwierzęta immunizowano Λβ42 lub roztworem soli i uśmiercano w celu zmierzenia obciążenia amyloidem w wieku 15 lub 18 miesięcy. Jak pokazano na fig. 7, w wieku 18 miesięcy, myszy leczone Λβ42 wykazywały znacznie mniejsze średnie obciążenie płytkami amyloidowymi (obciążenie płytkami, 0,01%) niż 18-miesięczne myszy kontrolne, którym podawano PBS (obciążenie płytkami, 4,7%) lub 12-miesięczne nieleczone zwierzęta (0,28%), przy czym obciążenie płytkami mierzono na podstawie analizy obrazowej, jak opisano w przykładzie XIII, część 8. Doświadczenia te wykazują skuteczność sposobów leczenia według wynalazku w zmniejszaniu istniejącego obciążenia płytkami i zapobieganiu postępowi obciążenia płytkami u chorych osobników.

Według tego aspektu wynalazku środki lecznicze pochodzą z włókienkowych peptydów lub białek zawartych w płytkach charakterystycznych dla danej choroby. Alternatywnie, środki takie są wystarczająco podobne antygenowo do takich składników, by wywołać odpowiedź immunologiczną, która także reaguje krzyżowo ze składnikiem włókienkowym. Tabele 1 i 2 dostarczają przykładów takich włókienkowych peptydów i białek, których skład i sekwencje są znane lub mogą zostać łatwo ustalone znanymi sposobami (patrz pozycje literaturowe cytowane poniżej w części B2 dla odnośników, które specyficznie opisują metody ekstrakcji i/lub skład różnych składników włókienkowych peptydów; dalsze przykładowe składniki włókienkowe opisano poniżej).

Zatem zgodnie z wynalazkiem, gdy wykonuje się diagnostykę choroby amyloidowej, w oparciu o oznaczenia kliniczne i/lub biopsję, doświadczony fachowiec potrafi ocenić skład włókienek złogów amyloidowych i dostarczyć środek wywołujący odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko włókienkowym peptydom lub białkom.

Przykładowo, jak opisano powyżej, środek leczniczy stosowany w leczeniu choroby Alzheimera lub innej choroby amyloidowej charakteryzującej się odkładaniem włókienek Λβ może stanowić dowolna z występujących w naturze postaci peptydu Λβ, a w szczególności ludzkich postaci Λβ (tj. Λβ39, Λβ40, Λβ41, Λβ42 lub Λβ43). Sekwencje tych peptydów i ich pokrewieństwo z prekursorowym APP są dobrze znane (np. Hardy i inni, TINS 20, 155-158 (1997). Tak np. Λβ42 ma sekwencję

H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Thr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-GluAsp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO: 1)

Λβ41, Λβ40 i Λβ39 różnią się od Λβ42 pominięciem odpowiednio Ala, Ala-Ile i Ala-Ile-Val na C-końcu peptydu. Λβ43 różni się od Λβ42 obecnością treoniny na C-końcu. Według korzystnego rozwiązania wynalazku środki lecznicze wywołują odpowiedź immunologiczną przeciwko całości lub części składnika włókienkowego danej choroby. Tak np. korzystnym środkiem Λβ immunogennym jest

PL 202 217 B1 środek indukujący przeciwciało specyficzne dla wolnego N-końca Λβ. Taki środek ma taką zaletę, że nie rozpozna on białka prekursowego, β-APP, co czyni go mniej podatnym do wywołania autoimmunizacji.

W kolejnym przykładzie, zdano sobie sprawę, że pacjenci dotknięci chorobami charakteryzującymi się odkładaniem włókien ΛΛ, takimi jak pewne przewlekłe zaburzenia zapalne, przewlekłe miejscowe lub ustrojowe zakażenia bakteryjne oraz nowotwory złośliwe, jak opisano powyżej, można leczyć peptydem AA, znanym mającym 8 kDa fragmentem surowiczego białka A amyloidu (ApoSSA). Przykładowo zaburzenia z amyloidem ΛΛ obejmują, ale nie tylko, choroby zapalne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, łuszczycę, gościec łuszczycowy, zespół Reitera, choroba Stilla dorosłych, zespół Behęeta, choroba Crohna, przewlekłe zakażenia bakteryjne, takie jak trąd, gruźlica, rozstrzenie oskrzelowe, odleżyny, przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie szpiku, choroba Whipple'a, a także nowotwory złośliwe, takie jak chłoniak Hodgkina, rak nerek, raki jelit, płuc i przewodu moczowo-płciowego, rak podstawnokomórkowy i białaczka kosmatokomórkowa.

Peptyd AA odnosi się do jednego lub większej liczby peptydów z heterogenicznej grupy peptydów pochodzących z N-końca prekursora surowiczego białka amyloidu A (ApoSSA), rozpoczynających się od aminokwasu 1, 2 lub 3 białka prekursorowego i kończących w którymkolwiek punkcie pomiędzy aminokwasem 58 i 84; zazwyczaj włókienka AA składają się z reszt aminokwasów 1-76 ApoSSA. Dokładne struktury i składniki można wyznaczyć i odpowiednie peptydy można zsyntetyzować znanymi sposobami (Liepnieks, J.J. i inni, Biochem. Biophys Acta 1270: 81-86, 1995).

Dalej przykładowo, fragmenty pochodzące z N-końcowego regionu, zawierające całość lub część zmiennej (VL) domeny lekkich łańcuchów immunoglobulin (łańcucha κ lub λ) zazwyczaj zawarte są w złogach amyloidowych w tkankach mezenchymalnych, co powoduje neuropatię obwodową i autonomiczną, zespół cieśni nadgarstka, przerost języka, kardiomiopatię restrykcyjną, artropatię dużych stawów, dyskrazje komórek układu immunologicznego, szpiczaki, a także utajone dyskrazje. Kompozycje według wynalazku korzystnie wywołują odpowiedź immunologiczną przeciw części łańcucha lekkiego, korzystnie przeciw „neoepitopowi - epitopowi tworzącemu się w wyniku fragmentacji cząsteczki macierzystej - tak by zmniejszyć możliwe działanie autoimmunologiczne.

Różne dziedziczne choroby amyloidowe są także podatne na leczenie zgodnie z wynalazkiem. Choroby takie opisano powyżej w części B.2. Tak np. różne postacie rodzinnej polineuropatii amyloidowej są wywoływane przez co najmniej 50 zmutowanych postaci transtyretyny (TTR), białka o 14 kDa, wytwarzanego przez wątrobę, z których każda charakteryzuje się pojedynczą zmianą aminokwasową. Choć wiele z tych postaci tej choroby jest rozróżnialnych na podstawie ich poszczególnych patologii i/lub pochodzenia demograficznego, uważa się, że środki lecznicze mogą także składać się ze środków wywołujących odpowiedź immunologiczną przeciw więcej niż jednej postaci TTR, taką jak przeciw mieszaninie dwóch lub większej liczby postaci ATTR, włącznie z dzikim typem TTR, co dostarcza ogólnie użytecznego środka.

Złogi amyloidowe zawierające AapoAI występują u osób mających mutacje punktowe w cząsteczce apolipoproteiny Al. Pacjenci z tą postacią choroby głównie wykazują neuropatię obwodową lub zaburzenia nerek. Według wynalazku kompozycje lecznicze tworzy się z jednej lub większej liczby różnych postaci AapoAI opisanych tutaj lub znanych.

Pewne rodzinne postacie choroby Alzheimera, a także zespołu Downa, wynikają z mutacji w białku prekursorowym β amyloidu, których wynikiem jest odkładanie płytek posiadających włókienka składające się głównie z peptydu β-amyloidu (Aji). Zastosowanie peptydu Aβ w kompozycjach leczniczych według wynalazku opisano powyżej i poparto przykładami.

Inne preparaty do leczenia dziedzicznych postaci skrobiawicy, opisanych powyżej, obejmują kompozycje wytwarzające odpowiedź immunologiczną przeciwko fragmentom gelsoliny w leczeniu dziedzicznej skrobiawicy układowej, zmutowanemu białku lizozymu (Alys) w leczeniu dziedzicznej neuropatii, zmutowanemu łańcuchowi α fibrynogenu (AfibA) w leczeniu nieneuropatycznej postaci skrobiawicy objawiającej się chorobą nerek, zmutowanej cystatynie C (Acys) w leczeniu postaci dziedzicznej mózgowej angiopatii wykrytej w Islandii. Ponadto pewne dziedziczne postacie chorób prionowych (np. choroby Creutzfeldta-Jacoba (CJD), zespołu Gerstmanna-Straussler-Scheinkera (GSS), śmiertelnej rodzinnej bezsenności (FFI)) charakteryzują się zmutowaną izoformą białka prionowego, PrP^Sc. Białko to można stosować w kompozycjach leczniczych według wynalazku do leczenia i profilaktyki odkładania płytek PrP.

Jak opisano powyżej, odkładanie amyloidu, układowe lub ogniskowe, jest także związane ze starzeniem. W kolejnym aspekcie wynalazku takiemu odkładaniu można zapobiegać lub leczyć je

PL 202 217 B1 przez podawanie podatnym osobnikom kompozycji zawierających jedno lub większą liczbę białek związanych z takim starzeniem. I tak płytki składające się z ATTR pochodzącego z TTR typu dzikiego są często znajdywane w tkance serca osób starszych. Podobnie, u pewnych starszych osobników w mózgach mogą rozwijać się bezobjawowe ogniskowe włókienkowe złogi Ae; przedstawione w opisie leczenie peptydem Ae może być uzasadnione u takich osób. β₂ mikroglobulina jest częstym składnikiem ciałek amyloidowych prostaty, a zatem jest kolejnym potencjalnym środkiem według wynalazku.

Zgodnie z kolejnym przykładem istnieje pewna liczba dodatkowych, niedziedzicznych postaci chorób amyloidowych, które potencjalnie można leczyć zgodnie z wynalazkiem. Płytki włókienek β2 mikroglobuliny często rozwijają się u pacjentów z długotrwałą hemodializą lub dializą otrzewnową. Tacy pacjenci mogą być leczeni przez podawanie kompozycji leczniczych według wynalazku, skierowanych przeciwko β2 mikroglobulinie lub, korzystniej, jej immunogennym epitopom.

Guzy wydzielające hormony także mogą zawierać pochodzące od hormonów płytki amyloidowe, których składniki są ogólnie charakterystyczne dla konkretnego dotkniętego chorobą narządu wewnątrzwydzielniczego. Zatem takie włókienka mogą być utworzone z hormonów polipeptydowych, takich jak kalcytonina (rak rdzeniasty tarczycy), wysepkowy polipetyd amyloidu (amylina; występująca u większości pacjentów z cukrzycą typu II) i przedsionkowy peptyd natriuretyczny (izolowana skrobiawica przedsionkowa). Według wynalazku bierze się także pod uwagę kompozycje skierowane przeciwko złogom amyloidowym tworzącym błonę aortową w miażdżycy tętnic. Tak np. Westermark i inni, opisali 69-aminokwasowy fragment N-końca apolipoproteiny A tworzący takie płytki (Westermark i inni, Am. J. Path. 147: 1186-92, 1995); kompozycje lecznicze według wynalazku obejmują środki immunologiczne skierowane przeciwko takiemu fragmentowi, a także sam fragment.

Powyższy opis skupił się na włókienkowych składnikach amyloidu, które mogą być stosowane jako środki lecznicze w leczeniu lub profilaktyce różnych postaci chorób amyloidowych. Środkiem leczniczym może także być aktywny fragment lub analog występującego naturalnie lub zmutowanego peptydu, zawierający epitop wywołujący podobną ochronną lub leczniczą odpowiedź immunologiczną po podaniu człowiekowi. Immunogenne fragmenty zazwyczaj mają ciągłą sekwencję przynajmniej 3, 5, 6, 10 lub 20 aminokwasów naturalnego peptydu. Przykładowo immunogenne fragmenty peptydu Ae obejmują Ap1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 1-12, 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 i 35-42. W niektórych sposobach stosuje się fragmenty, w których brak jest przynajmniej jednego, a czasami przynajmniej 5 lub 10 aminokwasów obecnych na C-końcu, naturalnie występujących postaci włókienkowego składnika. Tak np. fragment, w którym brak jest 5 aminokwasów z C-końca A343, obejmuje pierwszych 38 reszt aminokwasów z N-końca Ae. Fragmenty z N-końcowej połowy Ae są korzystne w niektórych sposobach. Analogi obejmują warianty alleliczne, gatunkowe i indukowane. Analogi zazwyczaj różnią się od naturalnie występujących peptydów przy jednym lub kilku pozycjach, często przez konserwatywne podstawienia. Analogi zazwyczaj wykazują co najmniej 80 lub 90% identyczności sekwencji z naturalnymi peptydami. Niektóre analogi zawierają także nienaturalne aminokwasy lub modyfikacje swoich N- lub C-końcowych aminokwasów. Przykładami nienaturalnych aminokwasów są α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy, 4-hydroksyprolina, γ-karboksyglutaminian, γ-Ν,Ν,Ν-trimetylolizyna, γ-N-acetylolizyna, O-fosfoseryna, N-acetyloseryna, N-formylometionina, 3-metylohistydyna, 5-hydroksylizyna, ω-N-metyloarginina.

Zwykle fachowcy zdają sobie sprawę, że fragmenty oraz analogi zaprojektowane według tego aspektu wynalazku można badać pod względem reaktywności krzyżowej z naturalnie występującymi składnikami włókienkowymi i/lub profilaktyki lub skuteczności terapeutycznej w modelowych zwierzętach transgenicznych, co opisano poniżej. Takie fragmenty lub analogi można stosować w kompozycjach leczniczych według wynalazku, gdy ich immunoreaktywność i skuteczność w zwierzęcym modelu jest prawie równa lub większa niż odpowiednie parametry zmierzone dla włókienkowych składników amyloidu.

Takie peptydy, białka lub fragmenty, analogi i inne peptydy amyloidogenne można zsyntetyzować drogą syntezy peptydów w fazie stałej lub ekspresji rekombinacyjnej, dobrze znanymi standardowymi sposobami, lub można otrzymać z naturalnych źródeł. Przykładowe środki włókienkowe, sposoby ekstrakcji włókienek, sekwencje włókienkowych składników białkowych lub peptydowych dostarczane są przez wiele pozycji literaturowych cytowanych w powiązaniu z zamieszczonymi opisami specyficznych składników włókienkowych. Ponadto inne środki, sposoby ekstrakcji i wyznaczania sekwencji są znane i dostępne dla osób pragnących wytwarzać i stosować takie środki. Aby wytwarzać takie środki można zastosować automatyczne syntetyzatory peptydów, które są dostępne w handlu od wielu producentów, takich jak Applied Biosystems (Perkin Elmer; Foster City, Kalifornia), a procedury wytwarzania syntetycznych peptydów są znane. Ekspresję rekombinacyjną można przeprowaPL 202 217 B1 dzić w bakteriach, takich jak E. coli, w drożdżach, komórkach owadzich lub komórkach ssaczych; alternatywnie białka można wytwarzać w znanych bezkomórkowych układach translacji in vitro. Procedury ekspresji rekombinacyjnej opisali Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY, 2 wyd., 1989). Niektóre peptydy i białka są także dostępne w handlu; tak np. niektóre postacie peptydu Ae są dostępne od dostawców, takich jak American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, Kalifornia i California Peptide Research, Inc. Napa, Kalifornia.

Środki lecznicze mogą także obejmować dłuższe polipeptydy, zawierające np. aktywny fragment lub analog peptydu włókienkowego, razem z innymi aminokwasami. Tak np. peptyd Ae może być obecny w postaci całego białka APP lub jego segmentu, takiego jak fragment C-100 zaczynający się na N-końcu Ae i biegnący do końca APP. Takie polipeptydy można przebadać pod względem ich działania profilaktycznego lub skuteczności terapeutycznej na modelach zwierzęcych w sposób opisany poniżej. Peptyd Ae, analog, aktywny fragment lub inny polipeptyd można podać w zasocjowanej postaci (tj. jako peptyd amyloidowy) lub w postaci zdysocjowanej. Środki lecznicze, obejmujące także multimeryczne lub monomeryczne środki immunogenne lub koniugaty lub białka nośnikowe i/lub, jak wspomniano powyżej, mogą także być dodawane do innych składników włókienkowych w celu zapewnienia szerszego zakresu aktywności skierowanej przeciw płytkom amyloidowym.

W kolejnej odmianie peptyd immunogenny, taki jak Ae, może być prezentowany przez wirus lub bakterię jako część kompozycji immunogenicznej. Kwas nukleinowy kodujący peptyd immunogenny wprowadza się do genomu lub episomu wirusa lub bakterii. Kwas nukleinowy wprowadza się ewentualnie w taki sposób, że peptyd immunogenny jest eksprymowany jako białko wydzielnicze lub białko fuzyjne z białkiem zewnętrznej powierzchni wirusa lub transbłonowym białkiem bakterii, tak, że peptyd jest eksponowany. Wirusy lub bakterie użyte w takich metodach powinny być niepatogenne lub atenuowane. Odpowiednie wirusy obejmują adenowirusy, HSV, wenezuelski wirus zapalenia mózgu koni i inne alfawirusy, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i inne rabdowirusy, ospę krowią i ospę wietrzną. Odpowiednie bakterie obejmują Salmonella i Shigella. Fuzja peptydu immunogennego z HBsAg HBV jest szczególnie korzystna. Środki lecznicze obejmują także peptydy i inne związki, które nie muszą wykazywać znaczącego podobieństwa sekwencji aminokwasowej z Ae, ale tym niemniej działają jako mimetyki Ae i wywołują podobną odpowiedź immunologiczną. Tak też, np. można sprawdzić pod względem przydatności peptydy i białka tworzące struktury e-kartek. Można także zastosować przeciwciała przeciwidiotypowe przeciwko przeciwciałom monoklonalnym przeciw Ae lub innym peptydom amyloidogennym. Takie przeciwciała przeciw-Id naśladują antygen i wywołują odpowiedź immunologiczną na niego (patrz Essential Immunology (red. Roit, Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, wyd. 6) str. 181). Środki inne niż peptydy Ae powinny wywoływać odpowiedź immunogeniczną przeciwko jednemu lub większej liczbie korzystnych segmentów Ae wymienionych powyżej (np. 1-10, 1-7, 1-3 i 3-7). Korzystnie środki takie wywołują odpowiedź immunogeniczną specyficznie skierowaną przeciw jednemu lub większej liczbie tych segmentów, która jednocześnie nie jest skierowana przeciw innym segmentom Ae.

Można także zbadać pod względem przydatności losowe biblioteki peptydów lub innych związków. Biblioteki kombinatoryjne można wytworzyć dla wielu typów związków, które mogą być syntetyzowane krok po kroku. Związki takie obejmują polipeptydy, mimetyki zakrętu e, polisacharydy, fosfolipidy, hormony, prostaglandyny, steroidy, związki aromatyczne, związki heterocykliczne, benzodiazepiny, oligomeryczne N-podstawione glicyny i oligokarbaminiany. Duże biblioteki kombinatoryjne związków można skonstruować metodą kodowanych syntetycznych bibliotek (ESL) opisaną w Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/0851, Pharmacopeia, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642. Biblioteki peptydowe można także skonstruować metodami ekspozycji fagowej. Patrz, np. Devlin, WO 91/18980.

Początkowo biblioteki kombinatoryjne i inne związki bada się pod względem przydatności, oznaczając ich zdolność do wiązania do przeciwciał lub limfocytów (B lub T) znanych jako specyficzne dla Ae lub innych peptydów amyloidogennych. Tak np. początkowe badania można przeprowadzić stosując jakiekolwiek surowice poliklonalne lub przeciwciała monoklonalne przeciwko Ae lub któremukolwiek peptydowi amyloidogennemu. Następnie związki zidentyfikowane w tych badaniach dalej analizuje się pod względem ich zdolności do zaindukowania przeciwciał lub reaktywnych limfocytów przeciwko Ae lub innym peptydom amyloidogennym. Tak np. można przebadać wielokrotne rozcieńczenia surowicy na płytkach do mikromianowania wcześniej powlekanych peptydem włókienkowym i przeprowadzić standardowy test ELISA w celu wykrycia reaktywnych przeciwciał na Ae. Następnie związki można zbadać pod względem ich profilaktycznej lub terapeutycznej skuteczności na zwierzętach

PL 202 217 B1 transgenicznych predysponowanych do choroby amyloidogennej, co opisano w przykładach. Zwierzęta takie obejmują, np. myszy niosące mutację 717 APP, opisane przez Games i innych, jak wyżej, oraz myszy niosące mutację 670/671 Swedish APP, takie jak opisane przez McConlogue i innych, US 5612486 i Hsiao i innych, Science 274, 99 (1996); Staufenbiel i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Brochelt i innych, Neuron 19, 939-945 (1997). To samo podejście badawcze można zastosować w przypadku innych potencjalnych środków, takich jak opisane powyżej fragmenty Άβ, analogi Άβ oraz dłuższe peptydy zawierające Ae.

b. Inne składniki płytek

Uważa się, że odpowiedzi immunologiczne skierowane przeciwko innym składnikom płytek amyloidowych mogą także być skuteczne w zapobieganiu, opóźnianiu lub zmniejszaniu odkładania płytek w chorobach amyloidowych. Takie składniki mogą być drugorzędnymi składnikami włókienek lub mogą być związane z włókienkami lub tworzeniem włókienek w płytkach, pod warunkiem że składniki, które są powszechne w organizmie lub względnie niespecyficzne dla złogów amyloidowych, są ogólnie mniej odpowiednie do stosowania jako środki lecznicze.

Zatem kolejnym odkryciem wynalazku jest to, że środki wywołujące odpowiedź immunologiczną na specyficzne składniki płytek znajdują zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce postępu choroby amyloidowej. Ta część dostarcza tła dla kilku przykładowych cząsteczek związanych z płytkami amyloidowymi. Wywołanie odpowiedzi immunologicznej przeciw którejkolwiek z tych cząsteczek, samych lub w połączeniu z immunogenicznymi środkami leczniczymi, przeciw składnikom włókienkowym opisanym powyżej lub przeciw któremukolwiek ze składników nie tworzących włókienek opisanych poniżej, dostarcza dodatkowego sposobu leczenia przeciwamyloidowego według wynalazku. Także częścią tworzącą wynalazek jest bierna immunizacja oparta na takich składnikach płytek, jak to podano w opisie.

Przykładowo synukleina jest białkiem strukturalnie podobnym do apolipoprotein, ale znajdywanym w obojętnym cytozolu, w szczególności w pobliżu zakończeń presynaptycznych. Istnieją przynajmniej 3 postacie tego białka, nazwane α, β i γ synukleiną. Ostatnio wykazano, że α i β synukleina są związane z nukleacją złogów amyloidowych w pewnych chorobach amyloidowych, w szczególności chorobie Alzheimera (Clayton, D.F. i inni, TINS 21(6): 249-255, 1998). W szczególności fragment domeny NAC α i β synukleiny (aminokwasy 61 - 95) wyizolowano z płytek amyloidowych od pacjentów z chorobą Alzheimera; w rzeczywistości fragment ten stanowi około 10% płytki, która pozostaje nierozpuszczona po rozpuszczaniu dodecylosiarczanem sodu (SDS) (George, J.M. i inni, Neurosci. News 1: 12-17, 1995). Ponadto stwierdzono, że zarówno pełnej długości synukleina α, jak i jej fragment NAC, przyspieszają agregację peptydu β amyloidu w nierozpuszczalny amyloid in vitro (Clayton, jak wyżej).

Dodatkowe składniki związane z płytkami amyloidowymi obejmują składniki niepeptydowe. Tak np. perlekan i pochodzące od perlekanu glikozaminoglikany są dużymi proteoglikanami siarczanu heparyny obecnymi w płytkach amyloidowych zawierających Ae w chorobie Alzheimera i innych skrobiawicach OUN i układowych, włącznie z płytkami amyloidowymi związanymi z cukrzycą. Wykazano, że te związki wzmacniają tworzenie włókienek Ae. Wykazano, że zarówno białka rdzenia, jak i łańcuchów glikozaminoglikanowych perlekanu uczestniczą w wiązaniu Ae. Dodatkowe glukozaminoglikany, w szczególności siarczan dermatanu i 4-siarczan chondriotyny oraz polisiarczan pentozanu często występują w płytkach amyloidowych różnych typów, a ponadto wykazano, że wzmagają one tworzenie włókienek. Siarczan dekstranu także posiada te właściwości. To wzmaganie jest znacznie obniżone, gdy cząsteczki są odsiarczanowane. Leki immunogeniczne skierowane przeciw siarczanowanym postaciom glikozaminoglikanów, włącznie z samym specyficznym glikozaminoglikanom, tworzą dodatkowe rozwiązanie według wynalazku, w leczeniu pierwotnym lub wtórnym. Wytwarzanie takich cząsteczek, a także odpowiednich kompozycji leczniczych zawierających takie cząsteczki mieści się w zakresie umiejętności fachowca.

2. Środki wywołujące bierną odpowiedź immunologiczną

Środki lecznicze według wynalazku obejmują także środki immunologiczne, takie jak przeciwciała specyficznie wiążące peptydy włókienkowe lub inne składniki płytek amyloidowych. Takie przeciwciała mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi i wykazują specyficzność wiązania zgodną z typem choroby amyloidowej, przeciw której są skierowane. Kompozycje lecznicze i sposoby leczenia mogą obejmować przeciwciała skierowane przeciw pojedynczej domenie wiążącej lub epitopowi na konkretnym włókienkowym lub niewłókienkowym składniku płytki lub mogą obejmować przeciwciała skierowane przeciw epitopom wielu składników płytki.

PL 202 217 B1

Tak np. w doświadczeniach przeprowadzonych jako poparcie wynalazku, 8,5 do 10,5 miesięcznym myszom PDAPP wykonano dootrzewnowo (i.p.) zastrzyki z przeciwciałami poliklonalnymi przeciw-A|i42 lub monoklonalnymi przeciw-Αβ wytworzonymi przeciw specyficznym epitopom peptydu Αβ, lub z roztworu soli, co opisano tutaj szczegółowo w przykładzie XI. W doświadczeniach tych stężenia przeciwciał w krwi monitorowano i podawano zastrzyki przypominające, gdy było to konieczne, aby utrzymać poziom stężenia przeciwciał w krwi wyższy niż 1:1000 w odniesieniu do specyficznego antygenu przeciw któremu wytworzono przeciwciało. Obserwowano obniżenie całkowitego poziomu Αβ w porównaniu z kontrolą w regionach kory mózgowej, hipokampu i móżdżku u myszy, którym podawano przeciwciała; w tych badaniach najwyższe obniżenie osiągnięto u myszy, którym podawano przeciwciała poliklonalne.

W dalszych doświadczeniach przeprowadzonych jako poparcie wynalazku, test przewidywania ex vivo (przykład XIV) zastosowano do zbadania usuwania przeciwciała przeciw fragmentowi synukleiny określanemu jako NAC. Stwierdzono, że synukleina jest białkiem związanym z płytkami amyloidowymi. Przeciwciało przeciw NAC wystawiono na kontakt z próbką tkanki mózgowej zawierającej płytki amyloidowe i komórki mikrogleju. Jako kontrolę zastosowano surowicę króliczą. Wykonywane później monitorowanie wykazało wyraźne zmniejszenie liczby i wielkości płytek, co wskazywało na aktywność usuwania przez przeciwciało.

Z tych danych wyraźnie wynika, że obciążenie płytkami amyloidowymi związane z chorobą Alzheimera i innymi chorobami amyloidowymi może być znacznie zmniejszone przez podawanie środków immunologicznych skierowanych przeciwko epitopom peptydu Αβ lub przeciw fragmentowi NAC synukleiny, które są skuteczne w zmniejszaniu obciążenia płytkami amyloidowymi. Należy ponadto zdawać sobie sprawę, że dużo różnych przeciwciał można zastosować w takich środkach. Przeciwciała wiążące się specyficznie ze zagregowaną postacią Αβ, a nie wiążące się z postacią zdysocjowaną, są odpowiednie do zastosowania w wynalazku, tak jak przeciwciała wiążące się specyficznie z postacią zdysocjowaną, a nie wiążące się z postacią zagregowaną. Inne odpowiednie przeciwciała wiążą się zarówno z postacią zagregowaną, jak i zdysocjowaną. Inne odpowiednie przeciwciała wiążą się z naturalnie występującą krótką postacią Αβ (tj. Αβ39, 40 lub 41), a nie wiążą się z naturalnie występującą długą postacią (tj. Αβ42 i Αβ43). Niektóre przeciwciała wiążą się z Αβ nie wiążąc się z pełnej długości prekursorowym białkiem amyloidu. Niektóre przeciwciała wiążą się z Αβ z powinowactwem wiązania wyższym niż lub równym około 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1.

Surowice poliklonalne zazwyczaj zawierają mieszane populacje przeciwciał wiążących się z kilkoma epitopami leżącymi na całej długości Αβ. Przeciwciała monoklonalne wiążą się ze specyficznym epitopem Αβ, który może być epitopem konformacyjnym lub niekonformacyjnym. Niektóre przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-28 Αβ (z pierwszym N-końcowym aminokwasem naturalnego Αβ oznaczonym 1). Inne przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-10 Αβ. Istnieją także przeciwciała monoklonalne wiążące się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-16 Αβ. Inne przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-25 Αβ. Niektóre przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20-30 lub 10-25 Αβ. Profilaktyczną i terapeutyczną skuteczność przeciwciał można zbadać stosując procedury dla modeli zwierząt transgenicznych opisane w przykładach.

Ogólnie, w oparciu o ujawnienie osoby realizujące wynalazek mogą zaprojektować, wytworzyć i przebadać przeciwciała skierowane przeciw włókienkowym białkom lub peptydom charakterystycznym dla innych chorób amyloidowych, takich jak choroby opisane w części 2, stosując opisane kompozycje, a także przeciwciała przeciw innym składnikom amyloidu.

a. Ogólna charakterystyka immunoglobulin

Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer podjednostek. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, a każda para posiada jeden łańcuch „lekki (około 25 kDa) i jeden łańcuch „ciężki (około 50-70 kDa). Część N-końcowa każdego łańcucha obejmuje zmienny region około zawierający 100-110 lub większą liczbę aminokwasów głównie odpowiedzialnych za rozpoznanie antygenu. Część C-końcowa każdego łańcucha tworzy stały region odpowiedzialny przede wszystkim za funkcję efektorową.

Łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako κ i γ. Łańcuchy ciężkie klasyfikuje się jako γ, μ, α, δ i ε i definiują one izotypy przeciwciał odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. W obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich regiony zmienne i stałe są połączone regionem „J zawierającym około 12 lub większą liczbę reszt aminokwasów, a łańcuch ciężki zawiera ponadto region „D zawierający około 10 lub większą

PL 202 217 B1 liczbę reszt aminokwasów (patrz ogólnie, Fundamental Immunology (red. Paul, W., wyd. 2, Raven Press, N.Y., 1989), rozdział 7.

Zmienne regiony każdego lekkiego/ciężkiego łańcucha łączą się tworząc miejsce wiązania przeciwciała. Zatem normalne przeciwciało zawiera dwa miejsca wiązania. Z wyjątkiem przeciwciał bifunkcyjnych i bispecyficznych dwa miejsca wiązania są takie same. Wszystkie łańcuchy posiadają taką samą strukturę ogólną względnie konserwowanych regionów zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, także nazywanymi regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów każdej pary są dopasowywane przez regiony zrębowe co umożliwia wiązanie ze specyficznym epitopem. Od N-końca do C-końca, zarówno łańcuchy lekkie jak i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów każdej z domen pozostaje w zgodzie z definicjami według Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 i 1991), Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia i inni, Nature 342:878-883 (1989).

b. Wytwarzanie przeciwciał nie-ludzkich

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych nie-ludzkich, np. mysich lub świnek morskich, króliczych lub szczurzych, można osiągnąć przez np. immunizację zwierzęcia z użyciem składnika płytki, takiego jak Ae lub inne składniki włókienkowe. Można zastosować dłuższy polipeptyd zawierający Ae lub immunogenny fragment Ae lub przeciwidiotypowe przeciwciała przeciw Ae. Patrz Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Taki immunogen można otrzymać ze źródła naturalnego przez syntezę peptydów lub ekspresję rekombinacyjną. Dodatkowo immunogen można podawać połączony lub inaczej skompleksowany z białkiem nośnikowym, co opisano poniżej. Dodatkowo, immunogen można podawać z adiuwantem. Można stosować kilka typów adiuwantów, co opisano poniżej. Do immunizacji zwierząt laboratoryjnych korzystne jest podawanie kompletnego adiuwanta Freunda, a następnie niekompletnego adiuwanta. Zazwyczaj do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych stosuje się króliki lub świnki morskie. Do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj stosuje się myszy. Przeciwciała bada się pod względem specyficznego wiązania z immunogenem, Tak np. w przypadku peptydu Ae jako immunogenu, badania można wykonać wyznaczając wiązanie przeciwciała z zestawem mutantów delecyjnych peptydu Ae i określając, które mutanty delecyjne wiążą się z przeciwciałem. Wiązanie można badać, np. przy pomocy analizy typu Western blot lub ELISA. Najmniejszy fragment wykazujący specyficzne wiązanie z przeciwciałem wyznacza epitop dla przeciwciała. Ponadto specyficzność epitopu można wyznaczyć w teście współzawodnictwa, w którym przeciwciała badane i odniesienia współzawodniczą w wiązaniu ze składnikiem. Jeżeli przeciwciała badane i odniesienia współzawodniczą ze sobą, mogą wiązać się z tym samym epitopem lub epitopami wystarczająco bliskimi by to wiązanie przeciwciała przeszkadzało wiązaniu się drugiego przeciwciała.

c. Chimeryczne i humanizowane przeciwciała

Chimeryczne i humanizowane przeciwciała posiadają takie same lub podobne specyficzności wiązania i powinowactwa jak mysie lub inne nie-ludzkie przeciwciało, które stanowi materiał wyjściowy do skonstruowania chimerycznego lub humanizowanego przeciwciała. Przeciwciała chimeryczne są przeciwciałami których geny łańcuchów lekkich i ciężkich zostały skonstruowane, zazwyczaj metodami inżynierii genetycznej, z segmentów genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. Tak np. zmienne (V) segmenty genów z mysiego przeciwciała monoklonalnego mogą zostać połączone z ludzkimi segmentami stałymi (C), takimi jak IgG1 i IgG4. Zatem typowe chimeryczne przeciwciało jest białkiem hybrydowym składającym się z V, czyli domeny wiążącej antygen mysiego przeciwciała i C, czyli domeny efektorowej ludzkiego przeciwciała.

Humanizowane przeciwciała posiadają w regionach zrębowych części zmiennej zasadniczo aminokwasy z ludzkiego przeciwciała (nazywanego przeciwciałem akceptorowym) i regiony determinujące dopasowanie z mysiego przeciwciała (nazywanego donorową immunoglobuliną). Patrz, Queen i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) i WO 90/07861, US 5693762, US 5693761, US 5585089, US 5530101 i Winter, US 5225539. Region(y) stałe, jeżeli są obecne, także zasadniczo lub w całości pochodzą z ludzkich immunoglobulin. Ludzkie domeny zmienne zazwyczaj wybiera się z ludzkich przeciwciał, których sekwencje regionów zrębowych wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z domenami mysich regionów zmiennych, z których pochodzą CDR. Aminokwasy w regionach zrębowych części zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów mogą pochodzić z tych samych lub różnych sekwencji ludzkich przeciwciał. Sekwencje ludzkich przeciwciał mogą być sekwencjami naturalnie występujących ludzkich przeciwciał lub mogą być sekwencjami konsensusu kilku ludzkich przeciwciał. Patrz Carter i inni, WO 92/22653. Pewne aminokwasy z ludzkich regionów zrębowych części

PL 202 217 B1 zmiennych wybiera się do podstawienia w oparciu o możliwość ich wpływu na konformację CDR i/lub wiązanie z antygenem. Badanie takich możliwych wpływów przeprowadza się poprzez modelowanie, badanie charakterystyki aminokwasów w konkretnych miejscach lub empiryczną obserwację wpływu podstawienia lub mutagenezy konkretnych aminokwasów.

Tak np. gdy aminokwas różni się w mysim regionie zrębowym części zmiennej i wybranym ludzkim regionie zrębowym części zmiennej, aminokwas ludzkiego regionu zrębowego powinien być zazwyczaj podstawiony swoim odpowiednikiem aminokwasowym z regionu zrębowego mysiego przeciwciała, gdy są przesłanki by przypuszczać, że aminokwas:

(1) bezpośrednio wiąże antygen niekowalencyjnie, (2) sąsiaduje z regionem CDR, (3) w inny sposób oddziaływa z regionem CDR (np. leży w obrębie 6 A regionu CDR), lub (4) uczestniczy w powierzchni oddziaływania VL-VH.

Innymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego regionu zrębowego, które są nietypowe w tej pozycji dla ludzkich immunoglobulin. Aminokwasy te można podstawić aminokwasami odpowiadającej im pozycji mysiego donorowego przeciwciała lub z odpowiadających im pozycji bardziej typowych ludzkich immunoglobulin. Innymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego regionu zrębowego, które są nietypowe w tej pozycji dla ludzkich immunoglobulin. Regiony zrębowe części zmiennych humanizowanych immunoglobulin zazwyczaj wykazują przynajmniej 85% identyczności sekwencji z ludzkim regionem zrębowym części zmiennych lub konsensusem tych sekwencji.

d. Ludzkie przeciwciała

Ludzkie przeciwciała przeciw Ae wytwarza się różnymi technikami opisanymi poniżej. Niektóre ludzkie przeciwciała wybiera się w doświadczeniach wiązania współzawodniczego lub w inny sposób, tak by posiadały tą samą specyficzność względem epitopu jak konkretne mysie przeciwciało, tak jak jedno z mysich przeciwciał monoklonalnych opisanych w przykładzie XI. Ludzkie przeciwciała można także badać pod względem specyficzności dla konkretnego epitopu stosując tylko fragment Ae jako immunogen i/lub badając przeciwciała względem zestawu mutantów delecyjnych Ae.

(1) Metodologia triomowa

Podstawowe podejście oraz przykładowy partner do fuzji komórkowej, SPAZ-4, do zastosowania w tym rozwiązaniu zostały opisane w Oestberg i inni, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4634664; oraz Engleman i inni, patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4634666. Linie komórkowe wytwarzające przeciwciała uzyskane tą metodą są nazywane triomami, ponieważ pochodzą one od trzech komórek - dwóch ludzkich i jednej mysiej. Początkowo mysią linię szpiczaka poddaje się fuzji z ludzkim limfocytem B, tak by uzyskać nie wytwarzającą przeciwciał ksenogeniczną hybrydową komórkę, taką jak linia komórkowa SPAZ-4 opisaną przez Oestberga, jak wyżej. Następnie ksenogeniczną linię komórkową poddaje się fuzji z immunizowanym ludzkim limfocytem B tak, by uzyskać wytwarzającą przeciwciała triomową linię komórkową. Stwierdzono, że triomy wytwarzają przeciwciała bardziej stabilnie niż normalne hybrydomy tworzone z ludzkich komórek.

Immunizowane limfocyty B uzyskuje się z krwi, śledziony, węzłów chłonnych lub szpiku kostnego dawcy człowieka. Gdy wymagane są przeciwciała przeciw specyficznemu antygenowi lub epitopowi korzystne jest zastosowanie tego epitopu lub antygenu do immunizacji. Immunizację można przeprowadzić in vivo lub in vitro. Do immunizacji in vivo komórki B zazwyczaj pobiera się od ludzi immunizowanych Ae, jego fragmentem, większym polipeptydem zawierającym Ae lub fragment lub przeciwciałem przeciwidiotypowym do przeciwciała przeciw Ae. W niektórych sposobach komórki B izoluje się od tego samego pacjenta, którego ostatecznie będzie leczyć się przeciwciałami. Do immunizacji in vitro, zazwyczaj limfocyty B poddaje się działaniu antygenu przez okres 7 do 14 dni w pożywce takiej jak RPMI-1640 (patrz Engleman, jak wyżej) wzbogaconej 10% ludzkim osoczem.

Immunizowane limfocyty B poddaje się fuzji znanymi metodami z ksenogeniczną komórką hybrydową, taką jak SPAZ-4. Tak np. komórki poddaje się działaniu 40-50% glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 1000-4000, w około 37°C, przez około 5-10 minut. Komórki oddziela się od mieszaniny fuzyjnej i propaguje w pożywce selektywnej względem wymaganych hybryd (np. HAT lub AH). Klony wydzielające przeciwciała o wymaganej specyficzności wiązania identyfikuje się badając pożywkę hodowlaną triom pod względem zdolności do wiązania Ae lub jego fragmentu. Triomy wytwarzające ludzkie przeciwciała o wymaganej specyficzności podklonowuje się na drodze techniki ograni24

PL 202 217 B1 czających rozcieńczeń i hoduje in vitro w pożywce hodowlanej. Następnie uzyskane triomowe linie komórek bada się pod względem zdolności do wiązania Λβ lub jego fragmentu.

Pomimo, że triomy są genetycznie stabilne, nie wytwarzają one przeciwciał w bardzo dużych ilościach. Poziom ekspresji może zostać zwiększony przez sklonowanie genów przeciwciał z triomu do jednego lub większej liczby wektorów ekspresyjnych i transformowanie wektora do standardowych ssaczych, bakteryjnych lub drożdżowych linii komórkowych, znanymi metodami.

(2) Transgeniczne ssaki, z wyłączeniem ludzi

Ludzkie przeciwciała przeciw Λβ mogą być także wytwarzane przez transgeniczne ssaki, z wyłączeniem ludzi, posiadające transgeny kodujące przynajmniej segment ludzkiego locus immunoglobulinowego. Zazwyczaj endogenne locus immunoglobulinowe takich ssaków transgenicznych jest funkcjonalnie unieczynnione. Korzystnie segment ludzkiego locus immunoglobulinowego obejmuje nieprzearanżowane sekwencje składników łańcuchów ciężkich i lekkich. Zarówno inaktywację endogennych genów immunoglobuliny, jak i indukcję egzogennych genów immunoglobuliny można osiągnąć przez ukierunkowaną rekombinację homologiczną lub przez wprowadzenie chromosomów YAC. Ssaki transgeniczne powstałe w wyniku tego procesu są zdolne do funkcjonalnej rearanżacji sekwencji składników immunoglobulin oraz eksprymowania repertuaru przeciwciał o różnych izotypach kodowanych przez ludzkie geny immunoglobuliny bez eksprymowania endogennych genów immunoglobuliny. Wytwarzanie i właściwości ssaków posiadających te właściwości opisano szczegółowo w np. Lonberg i inni, WO93/12227 (1993); US 5877397, US 5874299, US 5814318, US 5789650, US 5770429, US 5661016, US 5633425, US 5625126, US 5569825, US 5545806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991). Pod tym względem szczególnie odpowiednie są myszy transgeniczne. Przeciwciała przeciw Λβ uzyskuje się immunizując transgeniczne ssaki, z wyłączeniem człowieka, tak jak opisał Lonberg lub Kucherlapati, jak wyżej, przy pomocy Λβ lub jego fragmentu. Przeciwciała monoklonalne wytwarza się np. wykonując fuzję komórek B z takich ssaków z odpowiednią linią komórek szpiczaka przy pomocy standardowej techniki Kohler-Milstein. Ludzkie przeciwciała poliklonalne także można otrzymać w postaci surowicy od pacjentów immunizowanych środkiem immunogennym. Ponadto takie przeciwciała poliklonalne można zagęścić drogą oczyszczania na zasadzie powinowactwa stosując Λβ lub inny peptyd amyloidowy jako odczynnik z powinowactwem.

(3) Metody ekspozycji fagowej

Kolejnym rozwiązaniem uzyskania ludzkich przeciwciał przeciw Λβ jest przeszukanie biblioteki DNA ludzkich komórek B według standardowej procedury opisanej przez Huse i inni, Science 246:1275-1281 (1989). Tak np. jak opisano dla metodologii triomowej, takie komórki B można uzyskać z ludzkich przeciwciał immunizowanych Λβ, fragmentami lub dużymi polipeptydami zawierającymi Λβ lub fragmentami lub przeciwciałami przeciw-idiotypowymi. Ponadto, takie komórki B można uzyskać od pacjenta, który ostatecznie będzie otrzymywał terapię przeciwciałami. Wybiera się przeciwciała wiążące epitop danego składnika amyloidu, takiego jak Λβ lub jego fragment. Następnie sekwencje kodujące takie przeciwciała (lub fragmenty wiążące) klonuje się i amplifikuje. Procedura opisana przez Huse staje się bardziej wydajna w połączeniu z technikami ekspozycji fagowej. Patrz np. Dower i inni, WO 91/17271; McCafferty i in., WO 92/01047, US 5877218, US 5871907, US 5858657, US 5837242, US 5733743 i US 5565332. W tych metodach wytwarza się biblioteki fagowe, których elementy eksponują różne przeciwciała na swoich powierzchniach zewnętrznych. Przeciwciała zazwyczaj są eksponowane jako fragmenty Fv lub Fab. Fagi eksponujące przeciwciała o wymaganej specyficzności wybiera się przez wzbogacenie powinowactwa do Λβ lub jego fragmentów.

W odmianie metody ekspozycji fagowej można wytwarzać ludzkie przeciwciała posiadające specyficzność wiązania wybranego przeciwciała mysiego (Winter, WO 92/20791). W metodzie tej jako materiał wyjściowy stosuje się region zmienny ciężkiego lub lekkiego łańcucha wybranego przeciwciała mysiego. Gdy, np. jako materiał wyjściowy wybiera się region zmienny łańcucha lekkiego konstruuje się bibliotekę fagową, w której elementy eksponują ten sam region zmienny łańcucha lekkiego (tj. mysiego materiału wyjściowego) i różne regiony zmienne łańcucha ciężkiego. Regiony zmienne łańcucha ciężkiego uzyskuje się z biblioteki przearanżowanych ludzkich regionów zmiennych łańcucha ciężkiego. Wybierane są fagi wykazujące silne specyficzne wiązanie składnika (np. co najmniej 10⁸, a korzystnie co najmniej 10⁹ M^-1). Następnie ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego z tego faga służy jako materiał wyjściowy do skonstruowania kolejnej biblioteki fagowej. W tej bibliotece każdy fag eksponuje pewien region zmienny łańcucha ciężkiego (tj. region zidentyfikowany w pierwszej bibliotece ekspozycji fagowej) i różny region zmienny łańcucha lekkiego. Regiony zmienne łańcuchów

PL 202 217 B1 lekkich uzyskuje się z biblioteki przearanżowanych ludzkich regionów zmiennych łańcucha lekkiego. Ponownie wybierane są fagi wykazujące silne specyficzne wiązanie ze składnikiem peptydu amyloidowego. Fagi te eksponują zmienne regiony kompletnych ludzkich przeciwciał przeciw peptydowi amyloidowemu. Przeciwciała te zazwyczaj posiadają taką samą lub podobną specyficzność epitopową jak mysi materiał wyjściowy.

e. Wybór regionu stałego

Regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich chimerycznych, humanizowanych lub ludzkich przeciwciał mogą być połączone przynajmniej z częścią ludzkiego regionu stałego. Wybór regionu stałego zależy, częściowo, od tego czy wymagana jest zależna od przeciwciał odpowiedź dopełniacza i/lub kierowana przez komórki toksyczność. Tak np. izotypy IgG1 i IgG3 posiadają aktywność dopełniacza, a IgG2 i IgG4 nie posiadają jej. Wybór izotypu może także wpływać na przejście przeciwciała do mózgu. Regiony stałe łańcucha lekkiego mogą być typu λ lub κ. Przeciwciała można wyrażać w postaci tetramerów zawierających dwa łańcuchy lekkie i dwa ciężkie, jako oddzielne łańcuchy ciężkie, łańcuchy lekkie, jako Fab, Fab', F(ab')2 i Fv lub jako pojedyncze łańcuchy przeciwciał, w których domeny zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich są połączone razem przez przerywnik.

f. Ekspresja zrekombinowanych przeciwciał

Chimeryczne, humanizowane i ludzkie przeciwciała zazwyczaj wytwarza się przy pomocy ekspresji rekombinacyjnej. Konstrukty zrekombinowanych polinukleotydów zazwyczaj zawierają sekwencję kontroli ekspresji funkcjonalnie połączoną z sekwencją kodującą łańcuchy przeciwciał, włącznie z naturalnie związanymi lub heterologicznymi regionami promotorowymi. Korzystnie, sekwencje kontroli ekspresji są eukariotycznymi systemami promotorowymi w wektorach, które mogą transformować lub transfekować eukariotyczne komórki gospodarzy. Gdy wektor zostanie wbudowany do odpowiedniego gospodarza, gospodarz utrzymywany jest w warunkach odpowiednich do wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych oraz zbierania i oczyszczania przeciwciał reagujących krzyżowo.

Te wektory ekspresyjne są zazwyczaj replikowalne w organizmach gospodarza jako episomy lub jako integralna część DNA chromosomalnego gospodarza. Często wektory ekspresyjne zawierają znaczniki selekcyjne np. odporność na ampicylinę lub odporność na higromycynę, aby umożliwić detekcję komórek, które zostały stransformowane wymaganymi sekwencjami DNA.

Prokariotycznym gospodarzem szczególnie użytecznym do klonowania sekwencji DNA według wynalazku jest E. coli. Mikroorganizmy, takie jak drożdże, także są użyteczne do ekspresji. Saccharomyces jest korzystnym gospodarzem drożdżowym, z odpowiednimi wektorami posiadającymi wymagane sekwencje kontroli ekspresji, miejsce startu replikacji, sekwencje terminacji replikacji itp. Typowe promotory obejmują kinazę 3-fosfoglicerynianową i inne enzymy glikolityczne. Indukowalne promotory drożdżowe obejmują, między innymi, promotory dehydrogenazy alkoholowej, izocytochromu C i enzymy odpowiedzialne za zużywanie maltozy i galaktozy.

Komórki ssacze są korzystne jako gospodarze ekspresji segmentów nukleotydowych kodujących immunoglobuliny lub ich fragmenty. Patrz Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Opracowano wiele odpowiednich linii komórek gospodarzy zdolnych do wydzielania całych heterologicznych białek i obejmują one linie komórkowe CHO, różne linie COS, komórki HeLa, komórki L i linie komórek szpiczaka. Wektory ekspresyjne dla tych komórek mogą zawierać sekwencje kontroli ekspresji, takie jak miejsce startu replikacji, promotor, wzmacniacz (Queen i inni, Immunol. Rev. 89:49 (1986)) i potrzebne miejsca informacji o składaniu, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca składania RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje terminacji transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami kontroli ekspresji są promotory pochodzące z genów endogenicznych, wirusa cytomegalii, SV40, adenowirusa, bydlęcego papillomawirusa itp. Patrz Co i inni, J. Immunol. 148:1149 (1992).

Ponadto sekwencje kodujące przeciwciał mogą być wstawione do transgenów do wprowadzenia do genomu zwierzęcia transgenicznego i następującej potem ekspresji w mleku zwierzęcia transgenicznego (np. według sposobów opisanych w US 5741957, US 5304489, US 5849992). Odpowiednie transgeny obejmują sekwencje kodujące łańcuchów lekkich i/lub ciężkich funkcjonalnie połączonych z promotorem lub wzmacniaczem z genu specyficznego dla gruczołu sutkowego, takiego jak gen kazeiny lub β-laktoglobuliny.

Wektory zawierające dane segmenty DNA można przenieść do komórek gospodarza znanymi metodami, zależnie od typu gospodarza komórek. Tak np. dla komórek prokariotycznych często stosuje się transfekcję przy pomocy chlorku wapnia, podczas gdy dla innych gospodarzy komórek można zastosować działanie fosforanem wapnia, elektroporację, lipofekcję, biolizę lub transfekcję przy pomocy wirusów. Inne metody stosowane do transformowania komórek ssaczych obejmują zastosowanie

PL 202 217 B1 filtrów Polybrene, fuzji protoplastów, liposomów, elektroporacji i mikroiniekcji (patrz ogólnie, Sambrook i inni, jak wyżej). Do wytwarzania zwierząt transgenicznych, transgeny można wprowadzić przy pomocy mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów lub można wprowadzić do genomu embrionalnych komórek macierzystych, a jądro takich komórek przenieść do pozbawionych jąder oocytów.

Gdy przeciwciała zostaną wyeksprymowane, mogą zostać oczyszczone standardowymi procedurami, włącznie z oczyszczaniem przy pomocy HPLC, chromatografią kolumnową, elektroforezą w żelu itp. (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

4. Inne środki lecznicze

Środki lecznicze do stosowania w niniejszych sposobach obejmują także komórki T wiążące składnik płytek, taki jak peptyd Ae. Przykładowo komórki T mogą być aktywowane przeciw peptydowi Ae przez wyeksprymowanie ludzkiego genu MHC klasy I i ludzkiego genu e-2-mikroglobuliny z owadziej linii komórkowej, gdzie pusty kompleks jest tworzony na powierzchni komórek i może związać peptyd Ae. Komórki T, które wystawiono na działanie linii komórkowej, stają się specyficznie zaktywowane przeciw peptydowi. Patrz Peterson i inni, US 5314813. Linie komórek owadzich eksprymujące antygen MHC klasy II można w podobny sposób stosować do aktywacji komórek T CD4.

5. Białka nośnikowe

Niektóre środki wywołujące odpowiedź immunologiczną zawierają odpowiedni epitop do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciw złogom amyloidu, ale są zbyt małe, żeby mogły być immunogenne. W tej sytuacji immunogenny peptyd można połączyć z odpowiednim nośnikiem, aby ułatwić wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednie nośniki obejmują albuminy surowicze, hemocyjaninę z mięczaka z rodzaju Fisurella (ang. keyhole limpet), cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulinę, albuminę jaja kurzego, toksynę tężca lub toksynę z innych bakterii patogennych, takich jak błonica, E. coli, cholera lub H. pylori lub atenuowane pochodne toksyn. Inne nośniki obejmują epitopy komórek T, które wiążą wiele alleli MHC np. przynajmniej 75% wszystkich ludzkich alleli MHC. Nośniki takie są czasem określane jako „uniwersalne epitopy komórek T. Przykłady uniwersalnych epitopów komórek T obejmują: Hemaglutyninę grypy: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1)

PADRE (wspólne aminokwasy wytłuszczono) AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2)

CS malarii: epitop T3 EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3)

Antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B:

HBsAg19-28 FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 4)

Białko szoku cieplnego 65: hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 5) prątkowa Calmette-Guerin: QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO: 6)

Toksyna tężca: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7)

Toksyna tężca: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 8)

HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 9).

Inne nośniki do stymulacji lub wzmacniania odpowiedzi immunologicznej obejmują cytokiny, takie jak IL-1, peptydy IL-1 α i e, IL-2, yINF, IL-10, GM-CSF oraz chemokiny, takie jak MlP1a i e oraz RANTES. Środki immunogenne można także połączyć z peptydami polepszającymi transport przez tkanki, co opisano w O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614.

Środki immunogenne można połączyć z nośnikami przez sieciowanie chemiczne. Techniki łączenia immunogenu z nośnikiem obejmują tworzenie disulfidowych mostków z użyciem N-sukcynymidylo-3-(2-pirydylotio)propionianu (SPDP) i 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcynoimidylu (SMCC) (jeżeli w peptydzie nie ma grupy tiolowej, można ją wprowadzić przez dodanie cysteiny). Te reagenty tworzą wiązania disulfidowe między sobą i resztami cysteiny peptydu na jednym białku i wiązanie amidowe przez grupę ε-amidową lizyny lub inną wolną grupą aminową w innych aminokwasach. Wiele z takich środków tworzących mostki disulfidowe/amidowe opisano w Immun. Rev. 62, 185 (1982). Inne dwufunkcyjne środki sprzęgające tworzą raczej tioetery niż mostki disulfidowe. Wiele z tych środków tworzących tioetery jest dostępnych w handlu i obejmują one reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, kwasu 2-bromooctowego, kwasu 2-jodooctowego i kwasu 4-(maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylowego. Grupy karboksylowe można zaktywować łącząc je z imidem kwasu bursztynowego lub solą sodową kwasu 1-hydroksylo-2-nitro-4-sulfonowego.

Peptydy immunogenne można także wyeksprymować jako białka fuzyjne z nośnikami (tj. heterologiczne peptydy). Peptyd immunogenny można połączyć z nośnikiem na N-końcu, C-końcu lub z oboma końcami. Ponadto w białku fuzyjnym mogą być obecne wielokrotne powtórzenia peptydu immunogennego. Ewentualnie peptyd immunogenny może być połączony z wielokrotnymi kopiami peptydu heterologicznego np. zarówno na N- jak i C-końcu peptydu. Niektóre peptydy nośnikowe słuPL 202 217 B1 żą do wywołania indukcji odpowiedzi komórek pomocniczych T przeciw peptydowi nośnikowemu. Z kolei zaindukowane komórki pomocnicze T wywoł ują odpowiedź komórek B przeciw immunogenicznemu peptydowi połączonemu z białkiem nośnikowym.

Niektóre środki według wynalazku obejmują białko fuzyjne, w którym N-końcowy fragment Ae jest połączony na swoim C-końcu z peptydem nośnikowym. W takich środkach N-końcowy aminokwas fragmentu Ae stanowi N-końcowy aminokwas białka fuzyjnego. Zgodnie z tym, takie białka fuzyjne są skuteczne w indukowaniu przeciwciał, które wiążą się z epitopem wymagającym aby N-końcowy aminokwas Ae był w postaci wolnej. Niektóre środki według wynalazku zawierają wielokrotne powtórzenia N-końcowego segmentu Ae połączonego na C-końcu z jedną lub większą liczbą kopii peptydu nośnikowego. N-końcowy fragment Ae włączony do takich białek fuzyjnych czasami zaczyna się od Ae1-3 i koń czy na Ae 7-11. Ae 1-7, Ae 1-3, 1-4, 1-5 i 3-7 są korzystnymi N-końcowymi fragmentami Ae . Niektóre białka fuzyjne obejmują różne N-końcowe segmenty Ae posobnie. Tak np. białko fuzyjne może zawierać Ae1-7, a następnie Ae1-3, a następnie heterologiczny peptyd.

W niektórych biał kach fuzyjnych N-końcowy segment Ae jest fuzyjnie połączony na swoim N-końcu z heterologicznym peptydem nośnikowym. Można zastosować te same różnorodne N-końcowe segmenty Ae jak w fuzjach C-końca. Niektóre białka fuzyjne zawierają heterologiczne peptydy połączone z N-końcem N-końcowego segmentu Ae, który z kolei jest połączony z jednym lub większą liczbą N-końcowych segmentów Ae posobnie.

Niektóre przykłady białek fuzyjnych odpowiednie do zastosowania w wynalazku przedstawiono poniżej. Niektóre z tych białek fuzyjnych zawierają segmenty Ae połączone z epitopami toksyny tężca, takimi jak opisano w US 5196512, EP 378881 i EP 427347. Niektóre białka fuzyjne zawierają segmenty Ae połączone z peptydami nośnikowymi opisanymi w US 5736142. Niektóre peptydy heterologiczne są uniwersalnymi epitopami komórek T. W niektórych sposobach podawany środek jest po prostu pojedynczym białkiem fuzyjnym z segmentem Ae połączonym z heterologicznym segmentem w konfiguracji liniowej. W niektórych sposobach środek jest multimerem białek fuzyjnych, któremu odpowiada wzór 2^x, gdzie x oznacza liczbę całkowitą od 1 - 5. Korzystnie x oznacza 1, 2 lub 3, przy czym 2 jest najbardziej korzystne. Gdy x oznacza 2, taki multimer posiada 4 białka fuzyjne połączone w korzystnej konfiguracji nazwanej MAP4 (patrz US 5229490). Epitopy Ae podkreślono.

Konfigurację MAP4 przedstawiono poniżej, gdzie rozgałęzione struktury powstają przez rozpoczęcie syntezy peptydu na zarówno aminach N-końcowych jak i łańcucha bocznego lizyny. Zależnie od tego, ile razy lizyna zostanie włączona do sekwencji, co umożliwi rozgałęzienie, powstała struktura będzie zawierać więcej N-końców. W tym przykładzie zostały wytworzone cztery identyczne N-końce na rozgałęzionym rdzeniu zawierającym lizyny. Taka wielokrotność znacznie wzmacnia skłonność do odpowiedzi przez odpowiednie komórki B.

AN90549 (Ae1-7/toksyna tężca 830-844 w konfiguracji MAP4):

DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 10)

AN90550 (Ae1-7/toksyna tężca 947-967 w konfiguracji MAP4):

DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 11)

AN90542 (Ae1-7/toksyna tężca 830-844 + 947-967 w konfiguracji liniowej): DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTYSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12) AN90576: (Ae3-9/toksyna tężca 830-844 w konfiguracji MAP4):

EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 13)

Peptyd opisany w US 5736142 (wszystkie w konfiguracjach liniowych): AN90562(Ae1-7/peptyd)AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID NO: 14)

AN90543 (Ap1-7 x 3/peptyd):

DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15)

Inne przykłady białek fuzyjnych (immunogenne epitopy Ae wytłuszczono) obejmują AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 16)

PL 202 217 B1

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17)

DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 18)

FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 19)

EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 20) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 21) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 23) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 24) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 26)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 27) DAEFRHD-QYIKANSKFIGI TEL (SEQ ID NO: 28) na podwójnie rozgałęzionym złożu

EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (Białko fuzyjne synukleiny w konfiguracji MAP4; SEQ ID NO: 29)

Te same lub podobne białka nośnikowe i sposoby łączenia można zastosować do wytwarzania immunogenów stosowanych do wytwarzania przeciwciał przeciw Ae do zastosowania w biernej immunizacji. Tak np. Ae lub fragment połączony z nośnikiem może być podawany zwierzęciu laboratoryjnemu w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych przeciw Ae.

6. Kwas nukleinowy kodujący środki lecznicze

Odpowiedzi immunologiczne skierowane przeciw złogom amyloidowym można także wywołać podając kwasy nukleinowe kodujące wybrane immunogeny peptydowe lub przeciwciała i ich składowe łańcuchy stosowane do biernej immunizacji. Takim kwasem nukleinowym może być DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego kodujący immunogen jest zazwyczaj połączony z elementami regulatorowymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, które umożliwiają ekspresję segmentu DNA w przewidywanych komórkach docelowych pacjenta. Do ekspresji w komórkach krwi, co jest wymagane do wywołania odpowiedzi immunologicznej, do bezpośredniej ekspresji odpowiednie są elementy promotora i wzmacniacza z genów lekkich i ciężkich ł a ń cuchów immunoglobulin lub wczesny promotor i wzmacniacz głównego produktu pośredniego CMV. Połączone elementy regulatorowe i sekwencje kodujące często wklonowuje się do wektora. Przy podawaniu przeciwciał o podwójnym łańcuchu, dwa łańcuchy można wklonować do tego samego wektora lub osobnych wektorów.

Dostępnych jest wiele wirusowych układów wektorowych obejmujących układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)), wektory adenowirusowe (patrz np. Bett i inni, J. Virol. 67, 5911 (1993)), wektory wirusów adenosatelitarnych (patrz np. Zhou i inni, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny ospy obejmujące wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirusowe wektory z rodzaju alfawirus, takie jak pochodzące z wirusów Sindibs i gorą czki Semliki Forest (patrz np. Dubensky i inni, J. Virol. 70, 508-519 (1996)), wenezuelski wirus zapalenia mózgu świń (patrz US 5643576), rabdowirusy, takie jak wirus zapalenia jamy ustnej (patrz WO 96/34625) oraz papillomawirusy (Ohe i inni, Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo i inni, WO 94/12692 i Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 1996)).

DNA kodujący immunogen lub zawierający go wektor można umieścić w liposomach. Odpowiednie lipidy i pokrewne analogi opisano w US 5208036, 5264618, 5279833 i 5283185. Wektory i DNA kodują cy immunogen mogą być takż e zaadsorbowane lub związane z odpowiednimi noś nikami w postaci cząstek, takimi jak np. polimetakrylan metylu, polimleczany i poli(mleczano-ko-glikolidy), patrz, np. McGee i inni, J. Micro Encap. (1996).

Wektory do terapii genowej lub nagi DNA można dostarczyć in vivo podając konkretnemu pacjentowi, zazwyczaj ogólnoustrojowo (np. dożylnie, śródotrzewnowo, donosowo, dożołądkowo, śródskórnie, domięśniowo, podskórnie lub przez wlew wewnątrzczaszkowy) albo miejscowo (patrz np.

PL 202 217 B1

US 5399346). Wektory takie mogą dalej zawierać środki pomocnicze, takie jak bupiwakaina (US 5593970). DNA można także podawać za pomocą działa genowego. Patrz Xiao i Brandsma, jak wyżej. DNA kodujący immunogen osadza się na powierzchni mikroskopijnych metalowych kulek. Mikropociski są przyspieszane przez falę szokową lub rozprężany hel i przenikają do tkanek na głębokość kilku warstw komórek. Odpowiednie jest np. urządzenie The Accel™ Gene Delivery Device wytwarzane przez Agacetus, Inc. (Middleton, WI). Ponadto nagi DNA może przejść przez skórę do krwi, po prostu w wyniku naniesienia DNA na skórę podrażnioną chemicznie lub mechanicznie (patrz, WO 95/05853).

W innej odmianie wektory kodujące immunogeny można dostarczyć do komórek ex vivo, takich jak komórki eksplantowane od pojedynczego pacjenta (np. limfocyty, aspirat szpiku kostnego, biopsja tkankowa) albo uniwersalne donorowe hematopoetyczne komórki macierzyste, a następnie reimplantować te komórki pacjentowi, zazwyczaj po selekcji pod względem komórek, które mają włączony wektor.

7. Badanie przeciwciał pod względem aktywności usuwania

Przykład XIV opisuje sposoby badania przeciwciał pod względem aktywności usuwania złogu amyloidowego. Aby zbadać aktywność przeciw złogowi amyloidowemu próbkę tkanki od pacjenta ze skrobiawicą, takiej jak tkanka mózgowa pacjenta z chorobą Alzheimera lub model zwierzęcy wykazujący charakterystyczną patologię amyloidową poddaje się działaniu komórek fagocytujących posiadających receptor Fc, takich jak komórki mikrogleju i badanego przeciwciała w pożywce in vitro. Komórki fagocytujące mogą być hodowlą pierwotną lub linią komórkową, taką jak BV-2, C8-B4 lub THP-1. Składniki te łączy się na szkiełku mikroskopowym, co umożliwia monitorowanie przy pomocy mikroskopu lub można przeprowadzać wielokrotne powtórzenia reakcji równocześnie w studzienkach płytki do mikromianowania. W takim formacie oddzielne miniaturowe szkiełka mikroskopowe można umieścić w osobnych studzienkach lub można zastosować niemikroskopowy sposób detekcji, taki jak detekcja Λβ przy pomocy testu ELISA. Korzystnie wykonuje się serię pomiarów ilości złogu amyloidowego w mieszaninie reakcyjnej in vitro, zaczynając od wartości podstawowej przed rozpoczęciem reakcji i jedną lub większą liczbą wartości badanych podczas reakcji. Antygen można wykryć wybarwiając np. fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem przeciw Λβ lub innemu składnikowi płytek amyloidowych. Przeciwciało stosowane do wybarwiania może, ale nie musi, być tym samym przeciwciałem co badane pod względem aktywności usuwania. Zmniejszenie złogów amyloidowych podczas reakcji w porównaniu z poziomem podstawowym wskazuje, że badane przeciwciało posiada aktywność usuwania. Takie przeciwciała mogą znaleźć zastosowanie w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera lub innych chorób amyloidogennych. Jak opisano powyżej, doświadczenia przeprowadzone dla poparcia wynalazku wykazały, przy stosowaniu opisanego testu, że przeciwciała przeciw fragmentowi NAC synukleiny są skuteczne w usuwaniu płytek amyloidowych charakterystycznych dla choroby Alzheimera.

D. Pacjenci, których można leczyć terapiami przeciwamyloidowymi

Pacjenci, których można leczyć, stanowią osoby z ryzykiem choroby, ale u których nie wystąpiły objawy, a także pacjenci u których wystąpiły objawy skrobiawicy. Jeśli chodzi o chorobę Alzheimera, praktycznie u każdego występuje ryzyko choroby Alzheimera jeżeli on lub ona żyją dostatecznie długo. Zatem niniejsze sposoby można stosować profilaktycznie do ogólnej populacji, bez określania ryzyka u danego pacjenta. Niniejsze sposoby są szczególnie użyteczne w przypadku pacjentów ze znanym genetycznym ryzykiem choroby Alzheimera lub którejkolwiek innej dziedzicznej choroby amyloidowej. Pacjenci tacy obejmują osoby mające krewnych, u których wystąpiła ta choroba, a także osoby u których ryzyko określa się analizując znaczniki genetyczne i biochemiczne. Znaczniki genetyczne ryzyka choroby Alzheimera obejmują mutacje genu APP, w szczególności mutacje w pozycji 717 oraz pozycjach 670 i 671 nazywane odpowiednio mutacjami Hardy'ego i Swedish (patrz Hardy, TINS, jak wyżej). Innymi znacznikami ryzyka są mutacje genów preseniliny, PS1 i PS2 oraz ApoE4, rodzinna historia AD, hipercholesterolemia lub miażdżyca tętnic. Osoby obecnie cierpiące na chorobę Alzheimera można rozpoznać po charakterystycznym otępieniu, a także po obecności opisanych wyżej czynników ryzyka. Ponadto dostępnych jest wiele testów diagnostycznych do identyfikacji osób z AD. Obejmują one pomiary poziomów CSF τ i Λβ42. Podniesione poziomy τ i obniżone poziomy Λβ42 wskazują na obecność AD. Pacjentów z chorobą Alzheimera można także zdiagnozować pod względem kryteriów MMSE i ADRDA, co opisano niżej w części z przykładami.

U pacjentów, u których nie występują objawy, leczenie można rozpocząć w dowolnym wieku (np. 10, 20, 30). Jednakże zazwyczaj nie jest konieczne rozpoczynanie leczenia zanim pacjent osiągnie 40, 50, 60 lub 70 rok życia. Leczenie zazwyczaj obejmuje podawanie wielu dawek w pewnym

PL 202 217 B1 okresie czasu. Leczenie można monitorować określając odpowiedzi przeciwciał lub aktywowanych komórek T lub B na środek leczniczy (np. peptyd Ae) w czasie, według sposobów opisanych tutaj w przykładach I i II. Jeżeli odpowiedź słabnie, wskazana jest dawka przypominająca. W przypadku pacjentów z potencjalnym zespołem Downa leczenie można rozpocząć przed urodzeniem podając środek leczniczy matce, lub wkrótce po urodzeniu.

Inne postacie skrobiawic często przebiegają bez zdiagnozowania, chyba że podejrzewa się szczególną skłonność do choroby. Pierwotnym objawem jest wystąpienie choroby serca lub nerek u pacjentów w wieku średnim do starszego, u których także występują objawy uczestnictwa w chorobie innych narządów. Wskazaniem udziału serca może być niskie napięcie i odchylenia ekstremów osi w elektrokardiogramie oraz pogrubiona tkanka komory. Objawem udziału nerek jest białkomocz. Można także podejrzewać udział wątroby gdy w badaniu fizykalnym pacjenta wykrywa się powiększenie wątroby. Także często w pewnych postaciach skrobiawic często występuje neuropatia obwodowa; może także zostać stwierdzona neuropatia układowa, charakteryzująca się podciśnieniem ortostatycznym. Skrobiawicę należy podejrzewać u każdego z postępującą neuropatią nieznanego pochodzenia. Definitywną diagnozę choroby można postawić wykonując biopsję tkanek, gdy dostępny jest dotknięty chorobą narząd(y). W przypadku skrobiawic układowych można zastosować próbki z odessanej podkładki tłuszczowej lub biopsji odbytu. Materiał biopsyjny wybarwia się czerwienią Congo, a próbki dodatnie tworzą w świetle spolaryzowanym dwójłomność zielonego jabłka.

E. Tryby leczenia

W zastosowaniach profilaktycznych kompozycje farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi, podatnemu na konkretną chorobę lub z ryzykiem konkretnej choroby, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka lub opóźnienia pojawienia się choroby. W zastosowaniach terapeutycznych kompozycje farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi, u którego podejrzewa się taką chorobę lub u którego już wystąpiła taka choroba, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zahamowania objawów choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednią do osiągnięcia tego definiuje się jako leczniczo lub profilaktycznie skuteczną dawkę. Zarówno w trybie leczenia, jak i profilaktyki środki zazwyczaj podaje się w kilku dawkach do uzyskania wystarczającej odpowiedzi immunologicznej. Zazwyczaj odpowiedź immunologiczną monitoruje się i kolejne dawki podaje się, gdy odpowiedź immunologiczna zaczyna zanikać.

Skuteczne dawki kompozycji według wynalazku do leczenia opisanych powyżej stanów różnią się zależnie od wielu różnych czynników, włącznie z sposobem podawania, docelowym miejscem, stanem fizjologicznym pacjenta, czy pacjent jest człowiekiem czy zwierzęciem, innymi przyjmowanymi lekami, oraz od tego czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. Zazwyczaj pacjent jest człowiekiem, ale w niektórych chorobach, takich jak związana z białkiem prionowym choroba szalonych krów, pacjent może być ssakiem nie będącym człowiekiem, takim jak bydło. Dawki lecznicze powinno się mianować w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności. Ilość immunogenu zależy od tego, czy również podaje się adiuwant, przy czym przy braku adiuwanta wymagane są wyższe dawki. Zależnie od immunogenności konkretnego preparatu, ilość immunogenu do podawania czasami wynosi 1 - 500 μg na pacjenta, a częściej 5 - 500 μg na zastrzyk przy podawaniu ludziom. Czasami stosuje się wyższą dawkę 0,5 - 5 mg na zastrzyk. Zazwyczaj przy podawaniu ludziom stosuje się 10, 20, 50 lub 100 μg na każdy zastrzyk. Okresy wstrzykiwania mogą się znacząco różnić od jednokrotnie na dzień do jednokrotnie na rok, oraz do jednokrotnie na dekadę, z następującymi po sobie dawkami „przypominającymi immunogenu gdy jest to z jakichś względów korzystne. Ogólnie, według sposobów tutaj opisanych, skuteczność dawki można monitorować uzyskując próbkę płynu od pacjenta, ogólnie próbkę surowicy krwi i wyznaczając miano przeciwciał wytworzone przeciw immunogenowi, sposobami dobrze znanymi i dającymi się łatwo dostosować do specyficznego mierzonego antygenu. W idealnym przypadku próbkę pobiera się przed dawką początkową, a kolejne dawki pobiera się i mianuje po każdej immunizacji. Ogólnie wymagane są dawka lub harmonogram dawkowania, które dają wykrywalne miano przynajmniej cztery razy przekraczające poziom kontrolny lub „podstawowy w surowicy w rozcieńczeniu 1:100, gdzie poziom podstawowy definiuje się w odniesieniu do surowicy kontrolnej lub w odniesieniu do tła płytki w teście ELISA. Miana przynajmniej 1:1000 lub 1:5000 są korzystne zgodne z wynalazkiem.

W dowolnym danym dniu, w którym podaje się dawkę immunogenu, dawka jest zazwyczaj większa niż 1 μg na pacjenta, a korzystnie większa niż 10 μg/ml gdy także podaje się adiuwant oraz przynajmniej większa niż 10 μg na pacjenta, a zazwyczaj 100 μg na pacjenta w przypadku braku adiuwanta. Dawki poszczególnych immunogenów, wybrane zgodnie z wynalazkiem, wyznacza się stanPL 202 217 B1 dardowymi sposobami dawkowania i mianowania, biorąc pod uwagę opisane tutaj sposoby. Typowy tryb leczenia obejmuje immunizację, a po niej zastrzyki dawek przypominających z przerwami, takimi jak 6-tygodniowe. Inny tryb leczenia obejmuje immunizację, a następnie zastrzyki dawek przypominających po 1, 2 i 12 miesiącach. Inny tryb leczenia obejmuje zastrzyki co 2 miesiące przez całe życie. Ponadto zastrzyki przypominające mogą być nieregularne, wykonywane w oparciu o monitorowanie odpowiedzi immunologicznej.

Dla biernej immunizacji przeciwciałami dawki wynoszą od około 0,0001 do 100 mg/kg, a częściej 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała biorcy. Tak np. dawki mogą wynosić 1 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała. Przykładowy tryb leczenia obejmuje podawanie raz na dwa tygodnie lub raz na miesiąc lub raz co 3 do 6 miesięcy. W niektórych sposobach dwa lub większą liczbę przeciwciał monoklonalnych o różnych specyficznościach wiązania podaje się równocześnie, w którym to przypadku dawkowanie każdego z podawanych przeciwciał zależy od wyznaczonego zakresu. Przeciwciało zazwyczaj podaje się wiele razy. Przerwy pomiędzy dawkami mogą być tygodniowe, miesięczne lub roczne. Przerwy mogą być nieregularne i są wyznaczane na podstawie pomiaru przeciwciał przeciw Αβ w krwi pacjenta. Ponadto przeciwciała można podawać w postaci preparatu o spowolnionym uwalnianiu, w którym to przypadku wymagane jest rzadsze podawanie. Dawkowanie i jego częstość różnią się zależnie od czasu półtrwania przeciwciała w organizmie pacjenta. Ogólnie najdłuższe czasy półtrwania wykazują ludzkie przeciwciała, a następnie humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała i nie-ludzkie przeciwciała. Dawkowanie i jego częstość różnią się zależnie od tego czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W zastosowaniach do profilaktyki podaje się względnie niskie dawki ze stosunkowo długimi przerwami przez długi okres czasu. U niektórych pacjentów kontynuuje się podawanie leczenia do końca ich życia. W zastosowaniach terapeutycznych czasem wymagane są względnie wysokie dawki ze stosunkowo krótkimi przerwami do czasu gdy postęp choroby zostanie obniżony lub zakończony i korzystnie do czasu gdy pacjent wykaże częściowe lub całkowite polepszenie objawów choroby. Następnie pacjentowi można podawać dawkowanie profilaktyczne.

Dawki kwasów nukleinowych kodujących immunogeny wynoszą od 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 μg do 10 mg lub 30 - 300 μg DNA na pacjenta. Dawki dla infekcyjnych wektorów wirusowych wynoszą od 10 - 100 lub większą liczbę wirionów na dawkę.

Środki do wywoływania odpowiedzi immunologicznej można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dootrzewnowo, donosowo lub domięśniowo przy leczeniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. Najczęstszą drogą podawania środka immunogenicznego jest droga domięśniowa (i.m.), dożylna (i.v.) lub podskórna (s.c), ale inne drogi mogą być równie skuteczne. Zastrzyki domięśniowe najczęściej wykonuje się w mięśnie ręki lub nogi. W niektórych sposobach środki wstrzykuje się bezpośrednio do konkretnej tkanki, w której nagromadziły się złogi np. doczaszkowo. Zastrzyki domięśniowe lub wlewy dożylne są korzystne do podawania przeciwciał. W niektórych sposobach konkretne przeciwciała terapeutyczne wstrzykuje się bezpośrednio do czaszki. W niektórych sposobach przeciwciała podaje się w postaci preparatów lub urządzeń o spowolnionym uwalnianiu, takich jak urządzenie Medipad™.

Ponadto środki według wynalazku można podawać w połączeniu z innymi środkami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby Alzheimera i zespołu Downa, gdzie złogi amyloidowe występują w mózgu, środki według wynalazku można podawać w połączeniu z innymi środkami polepszającymi przenikanie środków według wynalazku przez barierę krew-mózg. Dalej koktajle terapeutyczne zawierające immunogeny zaprojektowane do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw więcej niż jednemu składnikowi amyloidu także objęte są wynalazkiem, tak jak połączenia przeciwciał skierowanych przeciw jednemu składnikowi płytek i immunogenu skierowanemu przeciw innemu składnikowi płytek.

Środki immunogenne według wynalazku, takie jak peptydy, czasami podaje się w połączeniu z adiuwantem. Można stosować wiele różnych adiuwantów w połączeniu z peptydem, takim jak Αβ, aby wywołać odpowiedź immunologiczną. Korzystne adiuwanty wzmacniają wewnętrzną odpowiedź na immunogen nie powodując konformacyjnych zmian immunogenu, które wpływałyby na jakościową postać odpowiedzi. Korzystne adiuwanty obejmują ałun i fosforan glinu, 3 de-O-acylowany monofosforylowany lipid Α (MPL) (patrz GB 2220211) (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, obecnie część Corixa). Stimulon™QS21 jest glikozydem triterpenu lub saponiną wyizolowaną z kory drzew Quillaja Saponaria Molina rosnącego w Południowej Ameryce (patrz Kensil i inni, w Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (red. Powell i Newman, Plenum Press, NY, 1995); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5057540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham,

PL 202 217 B1

MA). Inne adiuwanty to emulsje olej w wodzie (takiego jak skwalen lub olej arachidowy), ewentualnie w połączeniu z immunostymulantami, takimi jak monofosforylowany lipid A (patrz Stoute i inni, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Innym adiuwantem jest CpG (WO 98/40100). Ponadto Aβ może być sprzężony z adiuwantem. Jednakże takie sprzęganie nie powinno zasadniczo zmienić konformacji Aβ tak, że wpłynęłoby to także na naturę odpowiedzi na niego. Adiuwanty można podawać jako składnik kompozycji leczniczej razem ze środkiem czynnym lub osobno, przed podaniem, równocześnie lub po podaniu środka leczniczego.

Korzystną klasą adiuwantów są sole glinu (ałun), takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, siarczan glinu. Takie adiuwanty można stosować z innymi konkretnymi środkami immunostymulującymi albo bez innych konkretnych środków immunostymulujących, takich jak MPL lub

3-DMP, QS21, polimeryczne lub monomeryczne aminokwasy, takie jak polikwas glutaminowy lub polilizyna. Inną klasą adiuwantów są preparaty typu emulsji olej w wodzie. Takie adiuwanty można stosować z innymi konkretnymi środkami immunostymulującymi albo bez innych konkretnych środków immunostymulujących, takich jak peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1',2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetyloglukozaminylo-N-acetylo-muramylo-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksypropyloamid (DTP-DPP) teramid™) lub inne składniki ścian komórek bakteryjnych. Emulsje olej w wodzie obejmują (a) MF59 (WO 90/14837), zawierający 5% skwalenu, 0,5% Tween 80 i 0,5% Span 85 (ewentualnie zawierające różne ilości MTP-PE) w postaci submikronowych cząstek utworzonych z użyciem mikrofluidyzatora, takiego jak mikrofluidyzator Model 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, zawierający 10% skwalenu, 0,4% Tween 80, 5% polimeru blokowego pluronic L121 i thr-MDP, wytworzony w postaci submikronowej emulsji lub poddany wirowaniu w celu wytworzenia emulsji cząstek o większym rozmiarze oraz (c) układ adiuwantowy Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) zawierający 2% skwalenu, 0,2% Tween 80 i jeden lub większą liczbę składników ścian komórek bakteryjnych z grupy obejmującej monofosforylolipid A (MPL), dimikolinian trehalozy (TDM) i szkielet ściany komórkowej (CWS), korzystnie MPL+CWS (Detox™). Inną klasę korzystnych adiuwantów stanowią adiuwanty saponinowe, takie jak Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) lub wytworzone z niego cząstki, takie jak ISCOM (kompleksy immunostymulujące) i ISCOMATRIX. Inne adiuwanty obejmują niekompletny adiuwant Freunda (IFA), cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik pobudzający tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF). Takie adiuwanty są ogólnie dostępne w handlu.

Adiuwant można podawać z immunogenem w jednej kompozycji lub można podawać przed podaniem, równocześnie z podaniem albo po podaniu immunogenu. Immunogen i adiuwant mogą być zapakowane i dostarczane w tej samej fiolce albo mogą być umieszczone w oddzielnych fiolkach i mieszane przed użyciem. Immunogen i adiuwant zazwyczaj pakuje się z etykietką wskazującą zamierzone zastosowanie lecznicze. Jeżeli immunogen i adiuwant są zapakowane osobno, zazwyczaj opakowanie zawiera instrukcje odnośnie mieszania przed użyciem. Wybór adiuwanta i/lub nośnika zależy od takich czynników jak trwałość szczepionki zawierającej adiuwant, droga podawania, harmonogram dawkowania oraz skuteczność adiuwanta u szczepionych gatunków. W przypadku ludzi korzystnym farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest taki, który został dopuszczony do podawania ludziom przez stosowne organy ustawodawcze. Przykłady takich adiuwantów do stosowania u ludzi obejmują ałun, MPL i QS-21. Ewentualnie można równocześnie stosować jeden lub większą liczbę różnych adiuwantów. Korzystne połączenia obejmują ałun z MPL, ałun z QS-21, MPL z QS-21 oraz ałun, QS21 i MPL razem. Ponadto można stosować niekompletny adiuwant Freunda (Chung i inni, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), ewentualnie w połączeniu z jakimkolwiek składnikiem wybranym spośród ałunu, QS21 i MPL i wszystkich ich kombinacji.

Środki według wynalazku często podaje się jako kompozycje farmaceutyczne zawierające środek leczniczo czynny i różne farmaceutycznie dopuszczalne składniki. Patrz Remington's Pharmaceutical Science (wyd. 19, 1995). Korzystna postać zależy od zamierzonej drogi podawania oraz zastosowania leczniczego. Kompozycje mogą także zawierać, zależnie od wymaganego preparatu, farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, które określa się jako nośniki powszechnie stosowane do formułowania kompozycji farmaceutycznych do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik wybiera się tak, żeby nie wpływał na aktywność biologiczną danej kompozycji. Przykładami takich rozcieńczalników są woda destylowana, fizjologiczna sól buforowana fosforanem, płyny Ringera, roztwór dekstrozy oraz płyn Hanksa. Ponadto kompozycja farmaceutyczna lub

PL 202 217 B1 preparat może także zawierać inne nośniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nielecznicze, nieimmunogenne stabilizatory itp.

Kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak chitozan, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe i kopolimery (takie jak funkcjonalizowana lateksem sefaroza, agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidów (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Nośniki te mogą ponadto działać jako środki immunostymulujące (tj. adiuwanty).

Do podawania pozajelitowego środki według wynalazku można podawać jako wstrzykiwane dawki roztworów lub zawiesin substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku z farmaceutycznym nośnikiem, którym może być jałowa ciecz, taka jak woda, oleje, roztwór soli, gliceryna lub etanol. Ponadto w kompozycjach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące, powierzchniowo czynne, substancje buforujące pH itp. Innymi składnikami kompozycji farmaceutycznych są środki pochodzące z ropy naftowej, zwierzęce, roślinne lub syntetyczne, np. olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Ogólnie glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikol polietylenowy, są korzystnymi ciekłymi nośnikami, szczególnie do roztworów do wstrzykiwania. Przeciwciała można podawać w postaci zastrzyków typu depot lub preparatów w postaci wszczepów, które mogą być formułowane tak, że umożliwiają spowolnione uwalnianie składnika czynnego. Przykładowy preparat zawiera przeciwciało monoklonalne w stężeniu 5 mg/ml, sformułowane w roztworze wodnym zawierającym 50 mM L-histydynę, 150 mM NaCl doprowadzonym do pH 6,0 przy pomocy HCl.

Zazwyczaj kompozycje można wytwarzać jako preparaty do wstrzykiwania, jako płynne roztwory lub zawiesiny; można także wytwarzać stałe postacie odpowiednie do rozpuszczania lub zawieszania w ciekłych nośnikach przed wstrzykiwaniem. Preparat może także być zemulgowany lub kapsułkowany w liposomach lub mikrocząstkach, takich jak polilaktyd, poliglikolid lub kopolimer, w celu wzmocnienia działania adiuwanta, co opisano powyżej (patrz Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Środki według wynalazku można także podawać jako zastrzyki typu depot lub preparaty w postaci wszczepów, które można wytwarzać w taki sposób, aby umożliwić przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie składnika czynnego.

Dodatkowe preparaty odpowiednie do innych sposobów podawania obejmują preparaty doustne, donosowe i dopłucne, czopki i preparaty przezskórne.

W przypadku czopków, substancje wiążące i nośniki obejmują np. glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki można wytwarzać z mieszanin zawierających składnik czynny w ilości 0,5 10%, korzystnie 1% - 2%. Doustne preparaty zawierają zaróbki, takie jak mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza i węglan magnezu jakości farmaceutycznej. Kompozycje te mają postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10% - 95% składnika czynnego, korzystnie 25% - 70%.

Podawanie miejscowe można osiągnąć drogą przezskórną lub śródskórną. Podawaniu miejscowemu może sprzyjać równoczesne podawanie środka z toksyną cholery lub jej detoksykowanymi pochodnymi lub podjednostkami, albo z podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i inni, Nature 391, 851 (1998)). Równoczesne podawanie można osiągnąć stosując składniki w postaci mieszaniny lub połączone cząsteczki uzyskane przez chemiczne sieciowanie lub ekspresję białka fuzyjnego.

Alternatywnie dostarczanie przezskórne można osiągnąć stosując plastry na skórę lub transferosomy (Paul i inni, Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i inni, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

F. Sposoby diagnozowania

Możliwe jest wykrywanie odpowiedzi odpornościowej przeciw peptydowi Ae u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera lub na nią podatnych. Sposoby takie są szczególnie przydatne do monitorowania przebiegu leczenia stosowanego u pacjenta. Sposoby można stosować do monitorowania zarówno leczenia terapeutycznego u pacjentów, u których wystąpiły objawy, jak i leczenia profilaktycznego u pacjentów, u których nie wystąpiły objawy. Sposoby znajdują zastosowanie do monitorowania zarówno czynnej immunizacji (tj. przeciwciał wytwarzanych w odpowiedzi na podany immunogen), jak i biernej immunizacji (tj. mierzenia poziomu podanych przeciwciał).

PL 202 217 B1

1. Immunizacja czynna

Niektóre sposoby obejmują ustalenie wartości podstawowej odpowiedzi immunologicznej u pacjenta przed podaniem dawki środka i porównanie jej z wartością odpowiedzi immunologicznej po leczeniu. Znaczący wzrost (tj. wyższy niż typowy margines błędu doświadczalnego w powtarzanych pomiarach tej samej próbki, wyrażony jako jedno odchylenie standardowe od średniej z tych pomiarów) wartości odpowiedzi immunologicznej sygnalizuje pozytywny wynik leczenia (tj. że podanie środka wywołało lub wzmocniło odpowiedź immunologiczną). Jeżeli wartość odpowiedzi immunologicznej nie zmienia się znacząco lub obniża się, wskazuje to na negatywny wynik leczenia. Ogólnie u pacjentów w początkowym okresie leczenia środkiem oczekuje się wzrostu odpowiedzi immunologicznej po kolejno następujących dawkach, która ewentualnie może osiągnąć plateau. Ogólnie podawanie środka kontynuuje się gdy odpowiedź immunologiczna wzrasta. Osiągnięcie plateau wskazuje, że leczenia można dalej nie kontynuować lub zmniejszyć dawkę albo częstość jej podawania.

W innych sposobach ustala się kontrolną wartość (tj. średnią z odchyleniem standardowym) odpowiedzi immunologicznej dla populacji kontrolnej. Zazwyczaj osoby w populacji kontrolnej nie były wcześniej poddawane leczeniu. Wartości odpowiedzi immunologicznej zmierzone u pacjenta po podaniu środka leczniczego porównuje się z wartością kontrolną. Znaczący wzrost w porównaniu z wartością kontrolną (tj. wyższy niż jedno odchylenie standardowe od średniej z tych pomiarów) sygnalizuje pozytywny wynik leczenia. Brak znaczącego wzrostu lub obniżenie sygnalizuje negatywny wynik leczenia. Ogólnie podawanie środka kontynuuje się do czasu gdy odpowiedź immunologiczna zacznie wzrastać w odniesieniu do wartości kontrolnej. Tak jak poprzednio, osiągnięcie plateau w odniesieniu do wartości kontrolnych wskazuje, że leczenia można dalej nie kontynuować lub zmniejszyć dawkę albo częstość jej podawania.

W innych sposobach, wartość kontrolną odpowiedzi immunologicznej (np. średnią i odchylenie standardowe) ustala się z kontrolnej populacji osobników, którzy przeszli leczenie środkiem leczniczym i których odpowiedzi immunologiczne osiągnęły plateau w odpowiedzi na leczenie. Wartości odpowiedzi immunologicznej zmierzone u pacjenta porównuje się z wartością kontrolną. Jeżeli zmierzony u pacjenta poziom nie różni się znacząco (np. więcej niż jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej leczenia można dalej nie kontynuować. Jeżeli poziom u pacjenta jest znacząco niższy od wartości kontrolnej, wskazane jest dalsze podawanie środka. Jeżeli poziom u pacjenta utrzymuje się poniżej wartości kontrolnej wskazana może być zmiana trybu leczenia, np. zastosowanie innego adiuwanta.

W innych sposobach pacjenta, który obecnie nie jest leczony, ale który przeszedł okres leczenia, monitoruje się pod względem odpowiedzi immunologicznej w celu określenia, czy wymagane jest wznowienie leczenia. Wartość odpowiedzi immunologicznej zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością odpowiedzi immunologicznej wcześniej osiągniętej u pacjenta podczas okresu leczenia. Znaczące obniżenie w porównaniu z poprzednimi pomiarami (tj. większe niż typowy margines błędu w powtórzonych pomiarach tej samej próbki) wskazuje, że leczenie należy wznowić. Ponadto wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną (średnia plus odchylenie standardowe) oznaczoną dla populacji pacjentów po przejściu okresu leczenia. Ponadto wartości zmierzone u pacjenta można porównać z wartością kontrolną populacji pacjentów leczonych profilaktycznie, u których nie wystąpiły objawy choroby lub leczonych terapeutycznie, u których wystąpiła poprawa cech charakterystycznych choroby. We wszystkich tych przypadkach znaczące obniżenie w odniesieniu do poziomów kontrolnych (tj. większe niż odchylenie standardowe) wskazuje, że leczenie pacjenta powinno być wznowione.

Tkanką pobieraną od pacjenta do analizy jest zazwyczaj krew, osocze, surowica, śluz lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Próbkę analizuje się pod względem wskaźników odpowiedzi immunologicznej na jakikolwiek dany składnik amyloidu, taki jak jakakolwiek postać Ae. Odpowiedź immunologiczną można określić na podstawie obecności, np. przeciwciał lub komórek T, które specyficznie wiążą dany składnik. Metody ELISA stosowane do wykrywania przeciwciał specyficznie wiążących peptyd Ae opisane w części z przykładami można zastosować do innych antygenów peptydowych. Sposoby wykrywania reaktywnych komórek T są dobrze znane.

2. Immunizacja bierna

Ogólnie procedury monitorowania biernej immunizacji są podobne do opisanych powyżej procedur stosowanych w monitorowaniu czynnej immunizacji. Jednakże profil przeciwciał po biernej immunizacji zazwyczaj wykazuje pośredni szczyt stężenia przeciwciał, a następnie wykładniczy zanik. Bez kolejnej dawki zanik osiąga poziom sprzed rozpoczęcia leczenia przez okres dni lub miesięcy, co

PL 202 217 B1 zależy od czasu półtrwania podanego przeciwciała. Tak np. czas półtrwania pewnych ludzkich przeciwciał jest rzędu 20 dni.

W niektórych sposobach przed podaniem wykonuje się pomiary podstawowego poziomu przeciwciał przeciw Ae, a drugi pomiar wykonuje się wkrótce po podaniu w celu wyznaczenia szczytowego poziomu przeciwciał i dwa lub większą liczbę kolejnych pomiarów wykonuje się z przerwami, aby monitorować zanikanie poziomu przeciwciał. Gdy poziom przeciwciała obniży się do poziomu podstawowego lub do wyznaczonego wcześniej procentu poziomu szczytowego minus poziom podstawowy (np. 50%, 25% lub 10%), podawana jest kolejna dawka środka. W niektórych sposobach poziom szczytowy i kolejne mierzone poziomy minus poziom podstawowy porównuje się z poziomami odniesienia, które wcześniej obserwowano przy korzystnych profilaktycznych lub terapeutycznych trybach leczenia u innych pacjentów. Jeżeli zmierzony poziom przeciwciał jest znacznie niższy niż poziom odniesienia (np. niższy niż średnia minus jedno odchylenie standardowe od wartości odniesienia populacji pacjentów odnoszących korzyści z leczenia) wskazane jest podanie dodatkowej dawki przeciwciała.

3. Zestawy diagnostyczne

Zestawy diagnostyczne służą do przeprowadzania opisanych powyżej sposobów diagnostycznych. Zazwyczaj takie zestawy zawierają środek specyficznie wiążący się z przeciwciałami przeciw składnikowi płytek amyloidowych, takiemu jak Ae, lub reagujący z komórkami T specyficznymi dla tego składnika. Zestaw taki może także zawierać znacznik. Do wykrywania przeciwciał przeciw Ae znacznik jest zazwyczaj w postaci znakowanych przeciwciał przeciw-idiotypowych. Do wykrywania przeciwciał można dostarczyć środek wcześniej związany z fazą stałą, taką jak studzienki na płytce do mikromianowania. Do wykrywania reaktywnych komórek T znacznik można dostarczyć jako ³H-tymidynę w celu zmierzenia odpowiedzi proliferacyjnej. Zestawy także zazwyczaj zawierają etykiety z wskazówkami jak zastosować zestaw. Etykieta może także zawierać wykres lub inną postać korelującą poziomy zmierzonego znacznika z poziomem przeciwciał przeciw Ae lub komórek T reaktywnych z Ae. Określenie etykieta odnosi się do jakiegokolwiek pisanego lub nagranego materiału dołączonego do zestawu lub w inny sposób towarzyszącego zestawowi, w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzedaży lub stosowania. Tak np. określenie etykieta obejmuje ulotki reklamujące oraz broszury, materiały opakowaniowe, instrukcje, kasety audio i wideo, dyskietki komputerowe, a także napisy wydrukowane bezpośrednio na zestawach.

P r z y k ł a d y

I. Profilaktyczna skuteczność Ae wobec choroby Alzheimera (AD)

Przykłady te opisują podawanie peptydu Ae42 transgenicznym myszom z nadekspresją APP z mutacją w pozycji 717 (APP_717V^_F), która predysponuje je do rozwoju neuropatologii podobnej do choroby Alzheimera. Tworzenie i charakterystykę tych myszy (myszy PDAPP) opisano w Games i in., Nature, supra. U zwierząt tych, w postaci heterozygotycznej, w wieku sześciu miesięcy zaczynają się tworzyć złogi Ae. W piętnastym miesiącu życia wykazują one poziom złogów Ae równoważny temu obserwowanemu w chorobie Alzheimera. Myszy PDAPP otrzymywały iniekcje ze zagregowanego Ae42 (zagregowany Ae42) lub roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Zagregowany Ae42 wybrano ze względu na jego zdolność do indukowania przeciwciał skierowanych przeciw licznym epitopom Ae.

A. Metody

1. Źródło myszy

Trzydzieści heterozygotycznych samic myszy PDAPP losowo podzielono na następujące grupy: 10 myszy mających otrzymać iniekcje zagregowanego Ae42 (jedna padła w transporcie), 5 myszy mających otrzymać iniekcje PBS/adiuwantu lub PBS oraz 10 myszy kontrolnych, nie otrzymujących żadnej iniekcji. Pięć myszy otrzymało iniekcje peptydów pochodzących z sekwencji białka amyloidu surowicy (SAP).

2. Przygotowywanie immunogenów

Przygotowanie zagregowanego Ae42: dwa miligramy Ae42 (US Peptides Inc, numer serii K-42-12) rozpuszczano w 0,9 ml wody i dopełniano do objętości 1 ml przez dodanie 0,1 ml 10 x PBS. Mieszaninę wytrząsano i umożliwiano inkubację w temperaturze 37°C przez noc, w których to warunkach peptyd agregował. Niewykorzystany Ae przechowywano w postaci suchego, liofilizowanego proszku w temperaturze -20°C do czasu następnej iniekcji.

Należy zwrócić uwagę, że gdy stosuje się takie dostępne w handlu peptydy, suche masy mogą zawierać masy soli; wszystkie masy podane w przykładach, chyba że stwierdzono inaczej, zawierają

PL 202 217 B1 masy soli. Dokładne masy peptydów można wyznaczyć standardowymi testami wytwarzania, takimi jak wyznaczanie azotu, w połączeniu ze znanym środkiem.

3. Przygotowanie zastrzyków

Do każdego zastrzyku 100 μg zagregowanego Λβ₄2 w PBS na mysz zemulgowano w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl emulsji do pierwszej immunizacji, a następnie podano przypominającą dawkę tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) po 2 tygodniach. Dwie dodatkowe dawki w IFA podano z przerwami miesięcznymi. Kolejne immunizacje wykonywano z miesięcznymi przerwami w 500 μl PBS. Zastrzyki wykonywano śródotrzewnowo (i.p.).

Zastrzyki PBS podawano w takim samym porządku i myszom wstrzyknięto mieszaninę 1:1 PBS/adiuwant w objętości 400 μl na mysz lub 500 μl PBS na mysz. Zastrzyki z SAP podobnie podawano w tym samym porządku stosując dawki 100 μg na zastrzyk.

4. Mianowanie krwi mysiej, preparowanie tkanek i immunohistochemia

Powyższe metody opisano poniżej w Ogólnych Materiałach i Metodach.

B. Wyniki

Myszom PDAPP podano zagregowany Λβ₄2 (zagregowany Λβ₄2), peptydy SAP lub sól buforowaną fosforanem. Jedną grupę myszy traktowano jako kontrolę pozytywną i nie podawano im zastrzyków. Miana z myszy z grupy zagregowanego Λβ₄2 monitorowano każdego miesiąca od czwartej dawki przypominającej aż myszy osiągnęły rok. Myszy uśmiercono w wieku 13 miesięcy. We wszystkich badanych punktach czasowych 8 z 9 myszy z grupy zagregowanego Λβ₄2 rozwinęło wysokie miano przeciwciał, które pozostało wysokie przez serię zastrzyków (miana wyższe niż 1/10000). Dziewiąta mysz miała niskie, ale mierzalne miano około 1/1000 (fig. 1, tabela 3). Myszy, którym wstrzyknięto SAPP miały miana 1:1000 do 1:30000 wobec tego immunogenu, przy czym tylko u jednej myszy miano przekraczało 1:100000.

T a b e l a 3A

Miana przy 50% maksymalnej O.D.

Myszy, którym wstrzykiwano zagregowany Λβ

Wiek PDAPP (miesiące)	mysz 100	mysz 101	mysz 102	mysz 103	mysz 104	mysz 105	mysz 106	mysz 107	mysz 108
4	70000	150000	15000	120000	1000	15000	50000	60000	100000
6	15000	65000	30000	55000	300	15000	15000	50000	60000
8	20000	55000	50000	50000	400	15000	18000	50000	60000
10	40000	20000	60000	50000	900	15000	50000	20000	40000
12	25000	30000	60000	40000	2700	20000	70000	25000	20000

T a b e l a 3B

Miana przy 50% maksymalnej O.D.

Myszy, którym wstrzykiwano PBS z oboma immunogenami w rozcieńczeniu 1/100

Wiek PDAPP (miesiące)	mysz 113	mysz 114	mysz 115	mysz 116	mysz 117
6	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg
10	5x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg
12	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg

U myszy, którym podawano PBS zmierzono miana przeciw zagregowanemu Λβ₄2 w wieku 6, 10 i 12 miesięcy. Miana przeciw zagregowanemu Λβ₄2 myszy PBS w rozcieńczeniach 1/100 przekroczyły tylko 4-krotnie wartość podstawową w jednym punkcie danych, a w pozostałych punktach danych wynosiły mniej niż 4-krotna wartość podstawowa (tabela 3). Odpowiedź specyficzna dla SAP była nieistotna dla tych punktów czasowych i wszystkie miana były mniejsze niż 300.

Siedem z dziewięciu myszy z grupy zagregowanego Λβ1-42 nie miało wykrywalnego amyloidu w mózgach. Natomiast tkanka mózgowa z myszy w grupach SAP i PBS zawierała wiele złogów amyloidowych w hipokampie, a także korach czołowej i obręczowej. Wzór utworzonych złogów był podobPL 202 217 B1 ny jak u nie leczonych myszy kontrolnych, z charakterystycznym występowaniem wrażliwych na uszkodzenie podregionów, takich jak zewnętrzna cząsteczkowa warstwa hipokampowego zakrętu zębatego. Jedna z myszy z grupy, której podawano Ae1-42 miała znacznie zmniejszone obciążenie amyloidem, graniczącym z hipokampem. Zidentyfikowano odizolowaną płytkę u innej myszy leczonej Ae1-42.

Ilościowa analiza obrazu dla obciążenia amyloidem hipokampu wykazała znaczne zmniejszenie osiągnięte u zwierząt leczonych AN1792 (fig. 2). Wartości mediany obciążenia amyloidem dla grupy PBS (2,22%) i dla nieleczonej grupy kontrolnej (2,65%) były znacznie większe niż dla myszy immunizowanych AN1792 (0,00%, p=0,0005). Natomiast wartość mediany dla grupy immunizowanej peptydami SAP (SAPP) wynosiła 5,74%. Tkanka mózgowa nie leczonych myszy kontrolnych zawierała liczne złogi Ae, ujawnione za pomocą specyficznych dla Ae przeciwciał monoklonalnych (mAb) 3D6, w hipokampie, a także w korze poza płatem ciała modzelowatego. Podobny wzór złogów amyloidowych obserwowano także u myszy immunizowanych SAPP lub PBS (fig. 2). Ponadto we wszystkich trzech ostatnich grupach obserwowano znaczący udział wrażliwych na uszkodzenie podregionów mózgu klasycznie obserwowanych w AD, takich jak zewnętrzna cząsteczkowa warstwa hipokampowego zakrętu zębatego.

Mózgi, które nie zawierały złogów Ae, były także pozbawione płytek starczych zazwyczaj widocznych u myszy PDAPP z ludzkim przeciwciałem przeciw APP 8E5. Wszystkie mózgi z pozostałych grup (którym wstrzykiwano SAP, PBS lub którym nie podawano zastrzyków) zawierały wiele płytek starczych typowych dla nie leczonych myszy PDAPP. Niewielka liczba płytek starczych była obecna u jednej z myszy leczonych AN1792 oraz pojedyncze skupisko dystroficznych neurytów znaleziono u drugiej myszy leczonej AN1792. Analiza obrazu dla hipokampu, przedstawiona na fig. 3, wykazała faktyczną eliminację dystroficznych neurytów u myszy leczonych AN1792 (mediana 0,00%) w porównaniu z biorcami PBS (mediana 0,28%, p=0,0005).

Astrocytoza charakterystyczna dla towarzyszącego płytkom zapalenia także nie występowała w mózgach grupy, której podawano Ae1-42. Mózgi myszy z innych grup zawierały znaczną ilość zgrupowanych GFAP-dodatnich astrocytów typowych dla związanej z płytkami Ae glejozy. Część z reagujących z GFAP preparatów histologicznych wybarwiono przeciwnie Tioflawiną S w celu zlokalizowania złogów Ae. GFAP-dodatnie astrocyty były związane z płytkami Ae u myszy SAP, PBS oraz nieleczonych kontrolnych. Nie stwierdzono takiego związku u płytkoujemnych myszy leczonych Ae1-42, podczas gdy minimalną glejozę związaną z płytkami obserwowano u jednej z myszy leczonych AN1792.

Analiza obrazu, przedstawiona na fig. 4 dla kory poza płatem ciała modzelowatego, potwierdziła, że zmniejszenie astrocytozy było znaczące, z wartością mediany 1,56% dla myszy leczonych AN1792 wobec wartości mediany wyższych niż 6% dla grup immunizowanych peptydami SAP, PBS lub nieleczonymi (p=0,0017).

Dane z podzestawu myszy Ae1-42 i PBS wykazały brak związanej z płytkami MHC II immunoreaktywności u myszy Ae1-42, co zgadzało się z brakiem związanej z Ae odpowiedzi zapalnej.

Fragmenty mózgów myszy także poddano działaniu mAe specyficznych dla MAC-1, komórkowego białka powierzchniowego. MAC-1 (CD11b) jest członkiem rodziny integryn i występuje w postaci heterodimeru z CD18. Kompleks CD11b/CD18 występuje na monocytach, makrofagach, neutrofilach i komórkach NK (Mak i Simard). Komórka typu MAC-1-reaktywnego występująca w mózgu jest najprawdopodobniej mikroglejem, w oparciu o podobną morfologię fenotypową w MAC-1 immunoreaktywnych fragmentach. Związane z płytkami znakowanie MAC-1 było niższe w mózgach myszy leczonych AN1792 w porównaniu z kontrolną grupą PBS, przy czym obserwacja ta zgadzała się z brakiem związanej z Ae odpowiedzi zapalnej.

C. Wnioski

Brak płytek Ae i reaktywnych neuronalnych i glejowych zmian w mózgach myszy, którym podano Ae1-42 wskazują, że w ich mózgach amyloid nie odkładał się lub odkładała się jego minimalna ilość oraz, że nie wystąpiły konsekwencje patologiczne, takie jak glejoza i patologia neurytów. Myszy PDAPP leczone Ae1-42 wykazały zasadniczo taki sam brak patologii, co kontrolne myszy nietransgeniczne. Tak więc zastrzyki z Ae1-42 są bardzo skuteczne w zapobieganiu złogom lub w usuwaniu ludzkiej postaci Ae z tkanki mózgowej oraz w eliminacji następujących później neuronalnych lub zapalnych zmian degeneracyjnych. Zatem podawanie peptydu Ae przynosi lecznicze korzyści w zapobieganiu AD.

PL 202 217 B1

II. Badania odpowiedzi na dawkę

Grupy 5-tygodniowych samic myszy Swiss Webster (N=6 na grupę) immunizowano dootrzewnowo 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2,0,4 lub 0,13 μg Αβ przygotowanymi w CFA/IFA. Podano 3 dawki z dwutygodniowymi przerwami, a następnie czwartą dawkę miesiąc później. Pierwszą dawkę zemulgowano z CFA, a pozostałe dawki zemulgowano z IFA. Od zwierząt pobierano krew do pomiaru miana w 4-7 dni po każdej z immunizacji zaczynając po drugiej dawce. Od zwierząt z zestawu trzech grup, immunizowanych 11,33 lub 300 μg antygenu, dodatkowo pobierano krew z około miesięcznymi przerwami przez 4 miesiące po czwartej immunizacji w celu monitorowania zaniku odpowiedzi przeciwciał w różnym zakresie dawek preparatów immunogenicznych. Zwierzętom tym wykonano piątą dodatkową immunizację w 7 miesięcy po rozpoczęciu badania. Zwierzęta uśmiercono tydzień później celem zmierzenia odpowiedzi przeciwciał na AN1792 i przeprowadzenia analizy toksykologicznej.

Przy dawkach od 300 do 3,7 μg obserwowano obniżającą się odpowiedź na dawkę, a przy dwóch niższych dawkach nie obserwowano odpowiedzi. Średnie wartości miana przeciwciał wynosiły około 1:1000 po trzech dawkach i około 1:10000 po czterech dawkach 11-300 μg antygenu (patrz fig. 5).

Miana przeciwciał znacznie wzrastały po trzeciej immunizacji dla wszystkich grup, z wyjątkiem grupy najniższej dawki, ze wzrostem GMT w zakresie od 5 do 25 razy. Niskie odpowiedzi przeciwciał wykryto wtedy nawet u biorców dawek 0,4 μg. Grupy 1,2 i 3,7 μg miały porównywalne miana z GMT około 1000, a cztery najwyższe dawki zgrupowały się razem z GMT około 25000, z wyjątkiem grupy dawki 33 μg z niższą GMT wynoszącą 3000. Po czwartej immunizacji wzrost miana był bardziej umiarkowany dla wszystkich grup. Zaobserwowano wyraźną odpowiedź na dawkę w grupach niższych dawek antygenu od 0,14 μg do 11 μg, wynoszącą od nie wykrywalnych przeciwciał dla biorców 0,14 μg do GMT 36000 dla biorców 11 μg. Ponownie miana czterech najwyższych grup od 11 do 300 μg zgrupowały się razem. Zatem przez dwie kolejne immunizacje miano przeciwciał zależało od dawki antygenu w szerokim zakresie od 0,4 do 300 μg. Po trzeciej immunizacji miana z grup najwyższych czterech dawek były porównywalne i pozostały jako plateau po dodatkowej immunizacji.

Miesiąc po czwartej immunizacji miana były 2- do 3-krotnie wyższe w grupie 300 μg niż miana zmierzone w krwi pobranej 5 dni po immunizacji (fig. 6). Obserwacja ta sugeruje, że szczytowa anamnestyczna odpowiedź przeciwciał wystąpiła później niż 5 dni po immunizacji. Mniejszy (50%) wzrost obserwowano w tym czasie dla grupy 33 μg. W grupie dawki 300 μg po dwóch miesiącach od ostatniej dawki GMT obniżyła się stopniowo o około 70%. Po kolejnym miesiącu miano przeciwciał spadało mniej gwałtowne, o 45% (100 μg) i około 14% dla 33 i 11 μg dawek. Zatem szybkość obniżania miana przeciwciał w krążeniu po zaprzestaniu immunizacji jest dwufazowa z gwałtownym spadkiem w pierwszym miesiącu po szczytowej odpowiedzi, po którym następuje łagodniejszy spadek.

Miana przeciwciał i kinetyka odpowiedzi tych myszy Swiss Webster była podobna jak u młodych, heterozygotycznych, transgenicznych myszy PDAPP, immunizowanych w podobny sposób. Dawki skuteczne w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej u ludzi są zazwyczaj podobne do dawek skutecznych u myszy.

III. Poszukiwanie środków skutecznych leczniczo przeciw występującej AD

Test ten zaprojektowano w celu przebadania środków immunogennych pod względem aktywności w zatrzymywaniu lub odwracaniu charakterystyki neuropatologicznej AD u starych zwierząt. Immunizację Αβ o długości 42 aminokwasów (AN1792) zaczęto w punkcie czasowym w którym płytki amyloidowe były już obecne w mózgach myszy PDAPP.

Z upływem czasu w badaniu u nie leczonych myszy PDAPP rozwinęło się wiele zmian neurodegeneracyjnych przypominających występujące w AD (Games i inni, jak wyżej, oraz Johnson-Wood i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Odkładanie Αβ w płytkach amyloidowych jest związane z degeneracyjną odpowiedzią neuronalną, obejmującą niewłaściwe elementy aksonalne i dendrytyczne, nazywane dystroficznymi neurytami. Złogi amyloidowe otoczone przez i zawierające dystroficzne neuryty nazywane są płytkami starczymi. Zarówno u myszy AD, jak i u myszy PDAPP, neuryty dystroficzne mają wyróżniające się struktury globularne, są immunoreaktywne z zespołem przeciwciał rozpoznających APP i składniki cytoszkieletu i wykazują złożone, wewnątrzkomórkowe zmiany degeneracyjne na poziomie ultrastrukturalnym. Charakterystyki te pozwalają na istotne dla choroby, wybiórcze i powtarzalne pomiary tworzenia płytek starczych w mózgach PDAPP. Dystroficzny składnik neuronalny płytek starczych PDAPP łatwo jest uwidocznić przy pomocy przeciwciał specyficznych dla ludzkiego APP (monoklonalne przeciwciało 8E5) i łatwo jest go zmierzyć przy pomocy komputerowo wspomaganej analizy obrazu. Zatem dodatkowo poza pomiarem działania AN1792 na tworzenie płytek amyloidowych monitorowano wpływ tego leczenia na rozwój dystrofii neurytycznej.

PL 202 217 B1

Astrocyty i mikroglej stanowią nieneuronalne komórki odpowiadające na stopień uszkodzenia neuronalnego i odzwierciedlające go. W AD często obserwuje się astrocyty GFAP-dodatnie i MHC

11- dodatni mikroglej, a ich aktywacja zwiększa się z ostrością choroby. Zatem monitorowano także rozwój reaktywnych astrocytów i mikroglejozy u myszy leczonych AN1792.

A. Materiały i metody

Czterdzieści osiem heterozygotycznych samic myszy PDAPP w wieku 11 do 11,5 miesięcy, otrzymanych z Charles River, losowo podzielono na dwie grupy: 24 myszy immunizowano 100 μg AN1792, a 24 immunizowano PBS, w każdym przypadku w połączeniu z adiuwantem Freunda. Grupy AN1792 i PBS powtórnie podzielono w wieku około 15 miesięcy. W wieku 15 miesięcy zwierzęta z około połowy z każdej z grup AN1792 i PBS uśmiercono (odpowiednio n=10 i 9), a pozostałe nadal otrzymywały immunizację aż do końca w wieku około 18 miesięcy (odpowiednio n=9 i 12). W czasie badań zdechło 8 zwierząt (5 AN1792, 3 PBS). Ponadto, poza immunizowanymi zwierzętami, do doświadczenia włączono nieleczone myszy PDAPP jednoroczne (n=10), 15-miesięczne (n=10) i 18-miesięczne (n=10) dla porównania w testach ELISA pomiarów poziomu Aβ i APP w mózgach; dodatkowo zwierzęta jednoroczne włączono do analizy immunohistochemicznej.

Metodologia była taka jak w przykładzie I, z wyjątkiem przypadków, gdy wskazano inaczej. Do przygotowania antygenu do 6 immunizacji, podawanych przed 15 miesiącem, zastosowano AN1792 z US Peptides seria 12 i California Peptides seria ME0339. Do 3 dodatkowych immunizacji podawanych pomiędzy 15 a 18 miesiącem zastosowano California Peptides serie ME0339 i ME0439.

Do immunizacji zemulgowano 100 μg AN1792 w 200 μl PBS, lub samej PBS, w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) lub niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA) lub PBS w końcowej objętości 400 gl. Pierwszą immunizację wykonano z CFA jako adiuwantem, następne 4 dawki podano z IFA, a końcowe 4 dawki z samą PBS bez dodatku adiuwanta. Łącznie wykonano 9 immunizacji w okresie 7 miesięcy z dwutygodniowymi przerwami dla pierwszych 3 dawek, a następnie z czterotygodniowymi przerwami dla pozostałych dawek. W grupie leczonej przez 4 miesiące, u ś mierconej w wieku 15 miesi ę cy, wykonano tylko pierwszych 6 immunizacji.

B. Wyniki

Wpływ leczenia Aβ (AN1792) na obciążenie amyloidem

Wyniki leczenia AN1792 na obciążenie kory amyloidem oznaczone metodą ilościowej analizy obrazu, przedstawiono na fig. 7. Wartość mediany dla obciążenia amyloidem kory wynosiła 0,28% w grupie nieleczonych 12-miesięcznych myszy PDAPP, która to wartość odpowiadała obciążeniu płytkami u myszy na początku badania. W wieku 18 miesięcy obciążenie amyloidem wzrosło ponad 17-krotnie do 4,87% w myszach leczonych PBS, podczas gdy myszy leczone AN1792 miały znacznie obniżone obciążenie amyloidem wynoszące 0,01%, znacząco mniej niż 12-miesięczne nieleczone myszy i grupy 15- i 18-miesięczne leczone PBS. Obciążenie amyloidem było znacznie obniżone u biorców AN1792 zarówno w 15 (96% zmniejszenia, p=0,003) i 18 (>99% zmniejszenia, p=0,0002) miesiącu.

Zazwyczaj złogi amyloidowe w korze myszy PDAPP zaczynały się w korze czołowej i poza płatem ciała modzelowatego (RSC), postępowały w kierunku brzuszno-bocznym i obejmowały korę skroniową i węchową (EC). Znaleziono niewiele lub wcale nie znaleziono amyloidu w EC myszy

12- miesięcznych, tj. w wieku, około którego podano pierwszą dawkę AN1792. Po 4 miesiącach leczenia AN1792 złogi amyloidowe znacznie zmalały w RSC, a postępujący udział EC został całkowicie wyeliminowany przez leczenie AN1792. Ostatnia obserwacja pokazała, że AN1792 całkowicie zatrzymał postępowanie amyloidu, który normalnie zaatakowałby korę skroniową i węchową, a także zatrzymał i być może cofnął odkładanie w RSC.

Znaczące działanie leczenia AN1792 na rozwój obciążenia kory amyloidem u myszy PDAPP pokazano dla grupy 18-miesięcznej, którą leczono przez 7 miesięcy. Stwierdzono prawie całkowity brak amyloidu w korze u myszy leczonych AN1792, z całkowitym brakiem rozproszonych płytek, a także zmniejszeniem litych złogów.

2. Zmiany komórkowe i morfologiczne towarzyszące leczeniu Aβ (AN1792).

Populację komórek Aβ-dodatnich znaleziono w regionach mózgu zazwyczaj zawierających złogi amyloidowe. Znaczące było to, że w kilku mózgach biorców AN1792 znaleziono bardzo niewiele korowych płytek amyloidowych lub nie znaleziono ich wcale. Większość immunoreaktywności Aβ okazała się być związana z komórkami o dużym, płatkowym lub pozlepianym ciele. Fenotypowo komórki te przypominały aktywowany mikroglej lub monocyty. Były one immunoreaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi ligandy eksprymowane przez aktywowane monocyty i mikroglej (MHC II i CD11b), a czasami były związane ze ścianą lub światłem naczyń krwionośnych. Porównanie blisko sąsiadują40

PL 202 217 B1 cych fragmentów znakowanych przeciwciałami specyficznymi dla Ae i MHC II ujawniło, że podobne wzory tych komórek były rozpoznawane przez obydwie klasy przeciwciał. Szczegółowe badanie mózgów myszy leczonych AN1792 ujawniło, że MHC II-dodatnie komórki były ograniczone do sąsiedztwa ograniczonego amyloidu pozostającego u tych zwierząt. W zastosowanych warunkach utrwalania komórki nie były immunoreaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi ligandy komórek T (CD3, CD3e) lub B (CD45RA, CD45RB) lub zwykłym antygenem leukocytowym (CD45), ale były reaktywne z przeciwciałami rozpoznającymi leukosialinę (CD43), która reaguje krzyżowo z monocytarai. Nie znaleziono takich komórek u żadnej z myszy leczonych PBS.

U myszy PDAPP niezmiennie rozwijały się ciężkie złogi amyloidowe w zewnętrznej warstwie cząsteczkowej hipokampowego zakrętu zębatego. Złogi tworzyły wyraźną smugę w obrębie ścieżki perforacji, regionu zazwyczaj zawierającego płytki amyloidowe w AD. Charakterystyczne występowanie tych złogów u myszy leczonych PBS przypominało wcześniej scharakteryzowane u nieleczonych myszy PDAPP. Złogi amyloidowe składały się z zarówno rozproszonych, jak i z litych płytek w ciągłym paśmie. Natomiast w wielu mózgach myszy leczonych AN1792 wzór ten był znacznie zmieniony. Złogi amyloidowe w hipokampie nie zawierały rozproszonego amyloidu i wzór pasmowy był częściowo zniszczony. Zamiast tego występowało wiele niezwykłych struktur nakrapianych, reagujących z przeciwciałami przeciw-Ae, z których kilka okazało się komórkami zawierającymi amyloid.

Komórki MHC II-dodatnie często obserwowano w sąsiedztwie amyloidu zewnątrzkomórkowego u zwierząt leczonych AN1792. Wzór związania komórek Ae-dodatnich z amyloidem był bardzo podobny w kilku mózgach myszy leczonych AN1792. Rozmieszczenie tych komórek monocytów było ograniczone do sąsiedztwa złogów amyloidowych i było całkowicie nieobecne w innych regionach mózgu pozbawionych płytek Ae.

Ilościowa analiza obrazu fragmentów znakowanych MHC II i MAC I wykazała tendencję w kierunku zwiększonej reaktywności w RSC i hipokampie u myszy leczonych AN1792, w porównaniu z grupą PBS, która osiągnęła wartość znaczącą dla pomiarów reaktywności MAC 1 w hipokampie.

Wyniki te wskazują na aktywne, kierowane przez komórki, usuwanie amyloidu w regionach mózgu w których występują płytki.

3. Działanie AN1792 na poziomy Ae: oznaczenia ELISA (a) Poziomy korowe

U nieleczonych myszy PDAPP mediana poziomu całkowitego Ae w korze w wieku 12 miesięcy wynosiła 1600 ng/g, w wieku 15 miesięcy wzrosła do 8700 ng/g (tabela 4). W wieku 18 miesięcy wartość wynosiła 22000 ng/g, co oznacza, że wzrosła ponad 10-krotnie podczas doświadczenia. Zwierzęta leczone PBS miały 8600 ng/g całkowitego Ae w wieku 15 miesięcy, która to wartość wzrosła do 19000 ng/g w 18 miesiącu. W porównaniu z tym, zwierzęta leczone AN1792 miały 81% mniej całkowitego Ae w wieku 15 miesięcy (1600 ng/g) niż grupa immunizowana PBS. Znacząco mniej (p=0,0001) całkowitego Ae (5200 ng/g) znaleziono w 18 miesiącu porównując grupy AN1792 i PBS (tabela 4), co odpowiadało 72% zmniejszeniu ilości Ae, który by normalnie występował. Podobne wyniki uzyskano porównując korowe poziomy Ae42, gdyż stwierdzono, że grupa leczona AN1792 zawierała znacznie mniej Ae42, ale w tym wypadku różnice pomiędzy grupami AN1792 i PBS były znaczące zarówno w 15 (p=0,04), jak i 18 miesiącu (p=0,0001, tabela 2).

T a b e l a 4: Poziomy mediany Ae (ng/g) w korze

	Nieleczone	PBS	AN1792
Wiek	Całkowity Ae	Ae42	(n)	Całkowity Ae	Ae42	(n)	Całkowity Ae	Ae42	(n)
12	1600	1300	(10)
15	8700	8300	(10)	8600	7200	(9)	1600	1300*	(10)
18	22200	18500	(10)	19000	15900	(12)	5200**	4000**	(9)

*p=0,0412 **p=0,0001 (b) Poziomy w hipokampie

U nieleczonych myszy PDAPP poziomy mediany w hipokampie całkowitego Ae w wieku 12 miesięcy wynosiły 15000 ng/g, która to wartość wzrosła do 51000 ng/g w wieku 15 miesięcy i dalej wzrastała osiągając 81000 ng/g w wieku 18 miesięcy (tabela 5). Podobnie myszy immunizowane PBS miały 40000 ng/g i 65000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesięcy. U zwierząt leczonych AN1792

PL 202 217 B1 stwierdzono mniejszą całkowitą ilość Ae, to znaczy 25000 ng/g i 51000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesięcy. Wartość dla grupy leczonej AN1792 w wieku 18 miesięcy była znacząco niższa niż dla grupy leczonej PBS (p=0,0105; tabela 3). Pomiary Ae42 dały ten sam układ wyników, to znaczy poziomy u grupy leczonej AN1792 były znacząco niższe niż u grupy leczonej PBS (odpowiednio 39000 ng/g wobec 57000 ng/g; p=0,0022) w wieku 18 miesięcy (tabela 5).

T a b e l a 5: Poziomy mediany Ae (ng/g) w hipokampie

	Nieleczone	PBS	AN1792
Wiek	Całkowity Ae	Ae42	(n)	Całkowity Ae	Ae42	(n)	Całkowity Ae	Ae42	(n)
12	15500	11100	(10)
15	51500	44400	(10)	40100	35700	(9)	2450	22100	(10)
18	80800	64200	(10)	65400	57100	(12)	5090*	38900**	(9)

*p=0,0105 **p=0,0022 (c) Poziomy w móżdżku

U 12-miesięcznych nieleczonych myszy PDAPP mediana poziomu całkowitego Ae wynosiła 15 ng/g (tabela 6). W wieku 15 miesięcy mediana ta wzrosła do 28 ng/g, a w wieku 18 miesięcy do 35 ng/g. U zwierząt leczonych PBS wartość mediany całkowitego Ae wynosiły 21 ng/g w wieku 15 miesięcy i 43 ng/g w wieku 18 miesięcy. U zwierząt leczonych AN1792 znaleziono 22 ng/g całkowitego Ae w wieku 15 miesięcy i znacząco mniej (p=0,002) całkowitego Ae w wieku 18 miesięcy (25 ng/g), niż w odpowiadającej im grupie PBS (tabela 6).

T a b e l a 6: Średnie poziomy Ae (ng/g) w móżdżku

	Nieleczone	PBS	AN1792
Wiek (miesiące)	Całkowity Ae	(n)	Całkowity Ae	(n)	Całkowity Ae	(n)
12	15,6	(10)
15	27,7	(10)	20,8	(9)	21,7	(10)
18	35,0	(10)	43,1	(12)	24,8*	(9)

*p=0,0018

4. Wpływ leczenia AN1792 na poziomy APP

APP-α oraz pełnej długości cząsteczka APP zawierają całość lub część sekwencji Ae, a zatem może na nie potencjalnie wpływać wytworzenie odpowiedzi immunologicznej kierowanej przez AN1792. W dotychczasowych badaniach stwierdzono niewielki wzrost poziomów APP wraz ze wzrostem neuropatologii u myszy PDAPP. W korze podczas leczenia poziomy zarówno APP-a/FL (pełnej długości), jak i APP-α pozostały zasadniczo bez zmian, z wyjątkiem tego, że poziom APP-α był zmniejszony o 19% u myszy w wieku 18 miesięcy w grupie leczonej AN1792 wobec grupy leczonej PBS. Wartości APP u 18 miesięcznych zwierząt z grupy AN1792 nie różniły się znacząco od tych wartości dla zwierząt 12- i 15-miesięcznych nieleczonych oraz 15-miesięcznych leczonych PBS. We wszystkich przypadkach wartości APP utrzymywały się w zakresie normalnie występującym u myszy PDAPP.

5. Działanie leczenia AN1792 na patologię neurodegeneracyjną i glejową

Obciążenie płytkami starczymi było znacząco zmniejszone w korze czołowej u myszy leczonych AN1792 w porównaniu z grupą leczoną PBS zarówno w wieku 15 (84%; p=0,03) jak i 18 miesięcy (55%; p=0,01) (fig. 8). Wartości mediany obciążenia płytkami starczymi wzrosły od 0,32% do 0,49% w grupie PBS pomiędzy 15 a 18 miesiącem życia. W odróżnieniu od tego, rozwój płytek starczych w grupie leczonej AN1792 był znacznie zmniejszony, z wartościami mediany obciążenia płytkami starczymi wynoszącymi 0,05% i 0,22% odpowiednio dla wieku 15 i 18 miesięcy.

Immunizacje AN1792 wydawały się być dobrze tolerowane, reaktywna astrocytoza także zmalała znacząco w RSC u myszy leczonych AN1792 w porównaniu z grupą leczoną PBS zarówno w wieku 15 (56%; p=0,011), jak i 18 miesięcy (39%; p=0, 028) (fig. 9). Wartości mediany procentu astrocytozy w grupie PBS wzrosły pomiędzy 15 a 18 miesiącem od 4,26% do 5,21%. Leczenie AN1792 przytłumi42

PL 202 217 B1 ło rozwój astrocytozy w obu punktach czasowych odpowiednio do 1,89% i 3,2%. Sugeruje to, że neuropil nie był niszczony przez proces usuwania.

6. Odpowiedzi przeciwciał

Jak opisano powyżej, 11-miesięczne, heterozygotyczne myszy PDAPP (n=24) otrzymały serię 5 immunizacji, 100 μg AN1792 zemulgowanymi z adiuwantem Freunda, podawanych dootrzewnowo w tygodniach 0, 2, 4, 8 i 12, a szóstą immunizację wykonano samą PBS (bez adiuwanta Freunda) w 16 tygodniu. Jako kontrole negatywne przygotowano zestaw dobranych wiekowo 24 myszy, które immunizowano PBS zemulgowaną z tymi samymi adiuwantami i podawano w takim samym harmonogramie. Od zwierząt pobierano krew 3-7 dni po każdej immunizacji zaczynając od drugiej dawki. Odpowiedzi przeciwciał na AN1792 zmierzono metodą ELISA. Średnie geometryczne mian (GMT) dla zwierząt immunizowanych AN1792 wynosiły około 1900, 7600 i 45000 odpowiednio po drugiej, trzeciej i ostatniej (szóstej) dawce. Po szóstej immunizacji nie stwierdzono specyficznych dla Ae przeciwciał u zwierząt kontrolnych.

Około połowę zwierząt leczono przez kolejne 3 miesiące, immunizujac je około 20, 24 i 27 tygodnia. Każdą z dawek podawano w podłożu samą PBS, bez adiuwanta Freunda. Średnie miana przeciwciał nie zmieniły się przez ten czas. W rzeczywistości miana przeciwciał pozostały stabilne w okresie od czwartego do ósmego pobrania krwi odpowiadającym okresowi od piątej do dziewiątej iniekcji.

Aby stwierdzić, czy przeciwciała specyficzne dla Ae, wytworzone przez immunizację, które wykryto w surowicy u myszy leczonych AN1792, także były związane z amyloidem odłożonym w mózgu, zestaw preparatów histologicznych z myszy leczonych AN1792 i PBS poddano działaniu przeciwciał specyficznych dla mysich IgG. W odróżnieniu od grupy PBS, płytki Ae w mózgach myszy leczonych AN1792 były pokryte endogennymi IgG. Tę różnicę pomiędzy oboma grupami zaobserwowano zarówno dla myszy w wieku 15, jak i 18 miesięcy. Szczególnie rażący był brak znakowania w grupie PBS, pomimo obecności dużego obciążenia amyloidem u tych myszy. Wyniki te pokazują, że immunizacja syntetycznym białkiem Ae wytwarza przeciwciała rozpoznające i wiążące się in vivo z Ae w płytkach amyloidowych.

7. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne

Z dziewięciu myszy immunizowanych AN1792 i 12 immunizowanych PBS myszy PDAPP w wieku 18 miesięcy pobrano śledziony w 7 dni po dziewiątej immunizacji. Wyizolowano limfocyty śledziony i hodowano je przez 72 godziny w obecności Ae40, Ae42 lub Ae40-1 (białko o odwrotnej sekwencji). Mitogen Con A posłużył jako kontrola pozytywna. Optymalne odpowiedzi uzyskano stosując >1,7 μM białko. Komórki ze wszystkich dziewięciu myszy leczonych AN1792 proliferowały w odpowiedzi na białka Ae1-40 lub Ae1-42, z równym poziomem inkorporacji obu białek (fig. 10, górny wykres). Nie stwierdzono odpowiedzi na białko o odwrotnej sekwencji Ae40-1. Komórki ze zwierząt kontrolnych nie odpowiadały na którekolwiek z białek Ae (fig. 10, dolny wykres).

C. Wnioski

Wyniki tego badania wykazały, że immunizacja AN1792 myszy PDAPP mających złogi amyloidowe spowalnia postępujące odkładanie amyloidu i zapobiega mu, oraz hamuje występujące w konsekwencji zmiany neuropatologiczne w mózgach starych myszy PDAPP. Immunizacje AN1792 znacząco hamują rozwój amyloidu w strukturach, które normalnie ulegają amyloidozie. Zatem podawanie peptydu Ae ma pozytywne działanie w leczeniu AD.

IV. Poszukiwanie fragmentów Ae

100 myszy PDAPP w wieku 9-11 miesięcy immunizowano dziewięcioma różnymi regionami APP i Ae w celu oznaczenia, które epitopy uczestniczą w odpowiedzi. Dziewięć różnych immunogenów oraz jeden kontrolny podano i.p., jak opisano powyżej. Immunogeny zawierały 4 koniugaty ludzkich peptydów Ae 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, wszystkie połączone przez łącznik cysteinowy z owczymi przeciwciałami przeciw mysiej IgG, polipeptyd APP aminokwasy 592-695, zagregowany ludzki Ae1-40, zagregowany ludzki Ae25-35 oraz zagregowany Ae42 z gryzoni. Zagregowany Ae42 i PBS zastosowano jako kontrole pozytywne i negatywne. Na każdą z grup badanych przypadało 10 myszy. Miana monitorowano jak wyżej, a myszy uśmiercano na koniec 4-miesięcznych immunizacji. Po śmierci oznaczono histochemię, poziomy Ae oraz toksykologię.

A. Materiały i metody

1. Przygotowanie immunogenów

Przygotowanie sprzężonych peptydów Ae: 4 koniugaty ludzkich peptydów Ae (aminokwasy 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, każdy połączony z owczymi przeciwciałami przeciw mysiej IgG) przygotowano sprzęgając przez cysteinę sztucznie dodaną do peptydu Ae przy pomocy środka sieciującego sulfoPL 202 217 B1

EMCS. Pochodne peptydu Ae zsyntetyzowano z następującymi końcowymi sekwencjami aminokwasowymi. W każdym przypadku umiejscowienie wstawionej cysteiny wskazano przez podkreślenie. Pochodna peptydu Ae13-28 miała również, jak wskazano, dodane dwie glicyny przed C-końcową cysteiną.

peptyd Λβ1-12 NH₂-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEQ ID NO:30) peptyd Λβ1-5 NH₂-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO:31) peptyd Ae33-42 NH₂-C-kwas aminoheptanowy-GLMVGGVVIA-COOH (SEQ ID NO:32) peptyd Ae13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO:33)

W celu przygotowania do reakcji sprzęgania 10 mg owczych przeciwciał przeciw mysiej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dializowano przez noc wobec 10 mM buforu boranu sodu, pH 8,5. Następnie oddializowane przeciwciała zagęszczono do objętości 2 ml z użyciem rurki Amicon Centriprep. Dziesięć mg sulfo-EMCS [N(Y-maleimidokuproiloksy)sukcynimidu] (Molecular Sciences Co.) rozpuszczono w 1 ml dejonizowanej wody. Czterdziestokrotny cząsteczkowy nadmiar sulfoEMCS wkroplono w trakcie mieszania do owczego przeciwciała przeciw mysiej IgG, a następnie roztwór mieszano nadal przez kolejnych 10 minut. Aktywowane owcze przeciwciała przeciw mysiej IgG oczyszczono i wymieniono bufor przez przepuszczanie przez 10 ml kolumnę do filtracji żelowej (Pierce Presto Column, uzyskana z Pierce Chemicals) równoważoną 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcje zawierające przeciwciała, zidentyfikowane przez pomiar absorbancji przy 280 nm, połączono i rozcieńczono do stężenia około 1 mg/ml, z użyciem 1,4 mg na OD jako współczynnik ekstynkcji. Czterdziestokrotny nadmiar cząsteczkowy peptydu Ae rozpuszczono w 20 ml 10 mM NaPO4, pH 8,0, z wyjątkiem peptydu Ae33-42, którego 10 mg najpierw rozpuszczono w 0,5 ml DMSO, a następnie rozcieńczono do 20 ml 10 mM buforem NaPO4. Każdy z roztworów peptydów dodano do 10 ml aktywowanych owczych przeciwciał przeciw mysiej IgG i kołysano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Powstałe koniugaty zagęszczono do końcowej objętości poniżej 10 ml z użyciem rurki Amicon Centriprep, a następnie dializowano wobec buforu PBS, aby wymienić bufor i usunąć wolne peptydy. Koniugaty przepuszczono przez filtry o średnicy porów 0,22 μm w celu wyjałowienia, a następnie podzielono na równe frakcje po 1 mg i przechowywano zamrożone w -20°C. Stężenia koniugatów oznaczono z użyciem białkowego testu BSA (Pierce Chemicals) z końską IgG jako krzywą standardową. Sprzężenie zostało potwierdzone przez wzrost masy cząsteczkowej sprzężonych peptydów w porównaniu z aktywowanymi przeciwciałami przeciw mysiej IgG. Preparat koniugatu Ae1-5 z owczym przeciwciałem przeciw mysiej IgG zawierał połączone koniugaty z dwóch reakcji sprzęgania, reszta stanowiła pojedynczy preparat.

2. Przygotowanie zagregowanych peptydów Ae

Peptydy ludzki 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., seria ME0541), ludzki 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., serie ME0339 i ME0439), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42 (California Peptides Inc., seria ME0218) świeżo solubilizowano do przygotowania każdego z zestawu zastrzyków z liofilizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę wytrząsano, aby wytworzyć względnie jednorodny roztwór lub zawiesinę. Z czterech peptydów jedynym rozpuszczalnym na tym etapie był AN1528. Następnie dodano równe objętości po 100 μl 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zaczął się wytrącać. Zawiesinę ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia.

Przygotowanie białka pBx6: Plazmid ekspresyjny kodujący pBx6, białko fuzyjne składające się z 100 aminokwasowej N-końcowej sekwencji liderowej z polimerazy bakteriofaga MS-2 oraz aminokwasów 592-695 z APP (eAPP) skonstruowano w sposób opisany w Oltersdorf i inni, J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmid transfekowano do E. coli i białko wyeksprymowano po indukcji promotora. Bakterie zlizowano w 8M moczniku i pBx6 częściowo oczyszczono metodą preperatywnej SDS PAGE. Frakcje zawierające pBx6 zidentyfikowano metodą Western blot używając króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciw pBx6, zebrano, zagęszczono za pomocą rurki Amicon Centriprep i dializowano wobec PBS. Czystość preparatu, oznaczona przez wybarwienie Coomassie Blue SDS PAGE, wynosiła około 5 do 10%.

B. Wyniki i ich omówienie

1. Projekt badań

Sto samic i samców, w wieku od 9 do 11 miesięcy, heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP uzyskano z Charles River Laboratory i Taconic Laboratory. Myszy podzielono na 10 grup do immunizacji różnymi regionami Ae lub APP razem z adiuwantem Freunda. Zwierzęta podzielono tak

PL 202 217 B1 by dobrać płeć, wiek, rodziców oraz źródło w obrębie grupy tak blisko jak to było możliwe. Immunogeny obejmowały 4 peptydy Aβ pochodzące z ludzkiej sekwencji, 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, każdy sprzężony z owczym przeciwciałem przeciw mysiej IgG; 4 zagregowane peptydy Aβ, ludzki 1-40 (AN1528), ludzki 1-42 (AN1792), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42; oraz fuzyjny polipeptyd nazwany pBx6, zawierający aminokwasy APP 592-695. Dziesiątą grupę immunizowano PBS w połączeniu z adiuwantem jako kontrolą.

Do każdej immunizacji zemulgowano 100 gg każdego z peptydów Aβ w 200 gl PBS lub 200 gg pBx6 pochodnej APP w tej samej objętości PBS, lub samą PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 gl do pierwszej immunizacji, po czym stosowano dawki przypominające z tą samą ilością immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) w kolejnych czterech dawkach i PBS do końcowej dawki. Immunizacje stosowano śródotrzewnowo w trybie dwutygodniowym przez 3 pierwsze dawki, a następnie w trybie miesięcznym. Od zwierząt pobierano krew w 4-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwciał. Zwierzęta uśmiercono około tydzień po końcowej dawce.

2. Poziomy Aβ i APP w mózgu

Po 4 miesiącach immunizacji różnymi peptydami Aβ lub pochodną APP ze zwierząt perfundowanych solą usunięto mózgi. Jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, a drugą użyto do oznaczenia poziomów Aβ i APP. Aby zmierzyć stężenie różnych postaci peptydu β-amyloidowego i białka prekursorowego amyloidu, półkulę pocięto na części i przygotowano homogenaty regionów hipokampu, kory i móżdżka w 5 M guanidynie. Rozcieńczono je i oznaczono poziom amyloidu lub APP, porównując do serii rozcieńczeń wzorców peptydu Aβ lub APP o znanych stężeniach, w formacie ELISA.

Mediana stężenia całkowitego Aβ dla grup kontrolnych immunizowanych PBS była 5,8-raza większa w hipokampie niż w korze (mediana 24318 ng/g tkanki hipokampu w porównaniu do 4221 ng/g kory). Mediana poziomu w móżdżku grupy kontrolnej (23,4 ng/g tkanki) była około 1000-razy niższa niż w hipokampie. Poziomy te były podobne do wcześniej opisanych dla heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Woods i inni, 1997, jak wyżej).

Dla kory, zestaw grup badanych miały średnie całkowite poziomy Aβ i Aβ1-42 znacznie różniące się od grupy kontrolnej (p<0,05), zwierzęta otrzymujące peptydy AN1792, gryzoni Aβ1-42 lub koniugat Aβ1-5 przedstawiono na fig. 11. Mediany poziomów całkowitego Aβ zmniejszyły się odpowiednio o 75%, 79% i 61% w porównaniu z kontrolą dla tych grup badanych. Nie stwierdzono dostrzegalnych współzależności pomiędzy mianami przeciwciał specyficznych dla Aβ i poziomami Aβ w regionie korowym mózgu dla jakiejkolwiek z tych grup.

W hipokampie mediana zmniejszenia całkowitej ilości Aβ towarzysząca leczeniu AN1792 (46%, p=0,0543) nie była tak duża jak obserwowana w korze (75%, p=0,0021). Jednakże stopień zmniejszenia był znacznie wyższy w hipokampie niż w korze, zmniejszenie netto wynosiło 11186 ng/g tkanki w hipokampie wobec 3171 ng/g tkanki w korze. Dla grup zwierząt otrzymujących Aβ1-42 z gryzoni lub Aβ1-5 mediany całkowitych poziomów Aβ zmniejszyły się odpowiednio o 36% i 26%. Jednakże, biorąc pod uwagę fakt, że grupy były małe oraz ze względu na zmienność poziomów peptydu amyloidowego u poszczególnych zwierząt w grupie, zmiany te nie były znaczące. Przy pomiarach Aβ1-42 w hipokampie żadna ze zmian wywołanych leczeniem nie była znacząca. Zatem, ze względu na niższe obciążenie Aβ kory, zmiany w tym regionie są znacznie czulszym wskaźnikiem skutków leczenia. Zmiany poziomów Aβ zmierzone metodą ELISA w korze były podobne, ale nie takie same, jak wyniki analizy immunohistochemicznej (patrz poniżej).

Całkowity Aβ zmierzono także w móżdżku, regionie zazwyczaj minimalnie dotkniętym patologią AD. Żadne ze średnich stężeń Aβ jakiejkolwiek z grup immunizowanych różnymi peptydami Aβ lub pochodną APP nie różniło się od wartości dla grupy kontrolnej w tym regionie mózgu. Wynik ten sugeruje, że leczenie nie wpływa na niepatologiczne poziomy Aβ.

Stężenie APP oznaczono także metodą ELISA w korze i móżdżku z leczonych i kontrolnych zwierząt. Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, nazwany APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-α (α, wydzielana postać APP, która została przecięta w obrębie sekwencji Aβ), jak i postaci APP pełnej długości (FL), podczas gdy drugi rozpoznaje tylko APP-α. W odróżnieniu od towarzyszącego leczeniu zmniejszenia Aβ w zestawie grup badanych, poziomy APP pozostały bez zmian u wszystkich zwierząt leczonych w porównaniu z kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że immunizacje peptydami Aβ nie usuwają APP, a skutek leczniczy jest raczej specyficzny dla Aβ.

PL 202 217 B1

W podsumowaniu, całkowite poziomy Αβ i Αβ1-42 były znacząco zmniejszone w korze przez leczenie AN1792, Αβ1-42 gryzonia lub koniugatem Αβ1-5. W hipokampie całkowity poziom Αβ był znacznie zmniejszony tylko przez leczenie AN1792. Żadne inne związane z leczeniem zmiany poziomów Αβ lub APP w regionach hipokampu, kory lub móżdżku nie były znaczące.

2. Analiza histochemiczna

Mózgi z podzestawu sześciu grup przygotowano do analizy immunohistochemicznej, 3 grupy immunizowane koniugatami peptydu Αβ - Αβ1-5, Αβ1-12 i Αβ13-28; 3 grupy immunizowane agregatami Αβ pełnej długości - AN1792 i AN1528 oraz grupę kontrolną leczoną PBS. Wyniki analizy obrazu dla obciążenia amyloidem skrawków histologicznych mózgu z tych grup przedstawiono na fig. 12. Stwierdzono znaczące obniżenie obciążenia amyloidem regionów korowych w 3 grupach badanych w stosunku do zwierząt kontrolnych. Największe obniżenie obciążenia amyloidem obserwowano w grupach otrzymujących AN1792, gdzie średnia wartość była zmniejszona o 97% (p=0,001). Znaczące obniżenie obserwowano także dla zwierząt leczonych AN1528 (95%, p=0,005) i koniugatem peptydu Αβ1-5 (67%, p=0,02).

Wyniki uzyskane przez pomiar całkowitego Αβ lub Αβ1-42 metodą ELISA oraz obciążenia amyloidem metodą analizy obrazu w pewnym stopniu różnią się. Leczenie AN1528 miało znaczący wpływ na poziom obciążenia amyloidem kory w pomiarach metodą ilościowej analizy obrazu, ale nie miało wpływu na stężenie całkowitego Αβ zmierzone metodą ELISA w tym samym regionie. Różnica pomiędzy tymi dwoma wynikami prawdopodobnie związana jest ze specyfiką testów. Analiza obrazu mierzy tylko nierozpuszczalne Αβ zagregowane w płytkach. W odróżnieniu od tego ELISA mierzy wszystkie postaci Αβ, zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne, monomeryczne i zagregowane. Ponieważ przypuszcza się, że patologia choroby jest związana z nierozpuszczalną postacią Αβ związaną z płytkami, technika analizy obrazu może mieć większą czułość w ocenie skutków leczenia. Jednakże z uwagi na to, że test ELISA jest szybszym i łatwiejszym testem, jest on bardzo użyteczny do celów poszukiwania nowych leków. Ponadto może to oznaczać, że związane z leczeniem zmniejszenie Αβ jest większe dla związanego z płytkami niż całkowitego Αβ.

Aby stwierdzić, czy specyficzne dla Αβ przeciwciała wytworzone przez immunizację u leczonych zwierząt reagowały z odłożonym w mózgu amyloidem, podzestaw skrawków histologicznych ze zwierząt leczonych i kontrolnych poddano działaniu przeciwciał specyficznych dla mysich IgG. W odróżnieniu od grupy PBS, płytki zawierające Αβ były pokryte endogenną IgG u zwierząt immunizowanych koniugatami peptydów Αβ- Αβ1-5, Αβ1-12 i Αβ13-28; oraz agregatami pełnej długości Αβ - AN1792 i AN1528. Mózgów zwierząt immunizowanych innymi peptydami Αβ lub peptydem APP pBx6 nie analizowano w tym teście.

3. Pomiar mian przeciwciał

Od myszy pobrano krew w 4-7 dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej immunizacji, łącznie 5 razy. Zmierzono miana przeciwciał jako przeciwciała wiążące Αβ1-42 metodą ELISA podwójnego wiązania na wielostudzienkowych płytkach z tworzywa sztucznego, powleczonych Αβ1-42. Jak pokazano na fig. 13, szczytowe miana przeciwciał powstały po czwartej dawce dla tych 4 szczepionek, które wywoływały najwyższe miana przeciwciał specyficznych dla AN1792: AN1792 (szczytowa GMT: 94647), AN1528 (szczytowa GMT: 88231), koniugat Αβ1-12 (szczytowa GMT 47216) i gryzonia Αβ1-42 (szczytowa GMT: 10766). Miana dla tych grup obniżyły się w pewnym stopniu po piątej i szóstej dawce. Dla pozostałych pięciu immunogenów szczytowe miana osiągnięto po piątej i szóstej dawce i były one znacznie mniejsze niż uzyskane dla czterech grup najwyższych mian: koniugat Αβ1-5 (szczytowa GMT: 2356), pBx6 (szczytowa GMT: 1986), koniugat Αβ13-28 (szczytowa GMT: 1183), koniugat Αβ33-42 (szczytowa GMT: 658), Αβ25-35 (szczytowa GMT: 125). Miana przeciwciał zmierzono także wobec homologicznych peptydów stosując ten sam format kanapkowego ELISA dla podzestawu immunogenów, grup immunizowanych Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 i gryzonim Αβ1-42. Miana te były w przybliżeniu takie same, jak zmierzone względem Αβ1-42, z wyjątkiem immunogenu gryzoniego Αβ1-42, dla którego miana przeciwciał względem homologicznego immunogenu były około 2-krotnie wyższe. Wielkość miana przeciwciał specyficznych względem AN1792 u poszczególnych zwierząt lub średnia wartość dla grup badanych nie korelowała ze skutecznością zmierzoną jako zmniejszenie Αβ w korze.

PL 202 217 B1

4. Odpowiedzi limfoproliferacyjne

Zależną od Ae limfoproliferację zmierzono stosując komórki śledziony zebrane około tydzień po końcowej, szóstej, immunizacji. Świeżo zebrane komórki, 10⁵ na studzienkę, hodowano przez 5 dni w obecności Ae1-40 w stężeniu 5 μΜ w celu stymulacji. Komórki z podzestawu siedmiu spośród dziesięciu grup także hodowano w obecności peptydu o odwrotnej sekwencji Ae40-1. Jako pozytywną kontrolę hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako negatywną kontrolę komórki hodowano bez dodanego peptydu.

Limfocyty z większości zwierząt proliferowały w odpowiedzi na PHA. Nie stwierdzono znaczących odpowiedzi na peptyd o odwrotnej sekwencji Ae40-1. Komórki ze zwierząt immunizowanych większymi zagregowanymi peptydami Ae, AN1792, Ae1-42 gryzonia i AN1528 silnie proliferowały po stymulacji Ae1-40 z najwyższymi zliczeniami na minutę u biorców AN1792. U jednego ze zwierząt w każdej z grup immunizowanych koniugatami Ae1-12, Ae13-28 i Ae25-35 komórki proliferowały w odpowiedzi na Ae1-40. W pozostałych grupach otrzymujących koniugaty Ae1-5, Ae33-42 oraz pBx6 lub PBS nie było zwierząt z odpowiedzią stymulowaną Ae. Wyniki te zestawiono w tabeli 7 poniżej.

T a b e l a 7

Immunogen	Koniugat	Aminokwasy Ae	Zwierzęta odpowiadające
Ae1-5	tak	5-mer	0/7
Ae1-12	tak	12-mer	1/8
Ae13-28	tak	16-mer	1/9
Ae25-35		11-mer	1/9
Ae33-42	tak	10-mer	0/10
Ae1-40		40-mer	5/8
Ae1-42		42-mer	9/9
Ae1-42 gryzonia		42-mer	8/8
pBx6			0/8
PBS		0-mer	0/8

Wyniki te wskazują, że AN1792 i AN1528 najsilniej stymulują odpowiedzi komórek T, najprawdopodobniej o fenotypie CD4⁺. Brak specyficznej względem Ae odpowiedzi komórek T u zwierząt immunizowanych Ae1-5 nie jest zaskakująca, gdyż epitopy peptydowe rozpoznawane przez komórki T CD4⁺ mają zazwyczaj długość około 15 aminokwasów, jakkolwiek krótsze peptydy mogą czasem działać z mniejszą skutecznością. Zatem większość epitopów komórek T pomocniczych dla czterech koniugatów peptydów znajduje się w części IgG koniugatu, a nie w regionie Ae. Hipotezę tę potwierdza bardzo niska częstość odpowiedzi proliferacyjnych dla zwierząt z każdej z tych grup badanych. Z uwagi na to, że koniugat Ae1-5 był skuteczny w znaczącym obniżaniu poziomu Ae w mózgu, przy widocznym braku komórek T specyficznych dla Ae, kluczową efektorową odpowiedzią immunologiczną wywołaną przez immunizację tym peptydem okazuje się być przeciwciało.

Brak komórek T oraz niska odpowiedź przeciwciał dla białka fuzyjnego pBx6, zawierającego aminokwasy APP 592-695 włącznie ze wszystkimi aminokwasami Ae, może być spowodowana słabą immunogennością konkretnego preparatu. Słaba immunogenność agregatu Ae25-35 jest prawdopodobnie spowodowana tym, że peptyd jest za mały, aby było prawdopodobne, że zawiera dobry epitop dla komórki T, aby wspomóc indukcję odpowiedzi przeciwciał. Jeżeli peptyd ten byłby sprzężony z białkiem nośnikowym prawdopodobnie byłby bardziej immunogenny.

V. Przygotowanie przeciwciał poliklonalnych do biernej ochrony

125 Nietransgenicznych myszy immunizowanych Ae lub innym immunogenem, dodatkowo z adiuwantem, uśmiercono w wieku 4-5 miesięcy. Zebrano krew immunizowanych myszy. Ewentualnie IgG wydzielono z innych składników krwi. Przeciwciała specyficzne dla immunogenu częściowo oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa. Otrzymano średnio 0,5-1 mg przeciwciał specyficznych dla immunogenu na mysz, co dało łącznie 60-120 mg.

PL 202 217 B1

VI. Bierna immunizacja przeciwciałami na Λβ

Grupom 7-9 -miesięcznych myszy PDAPP podano 0,5 mg w PBS przeciwciał poliklonalnych przeciw-Aji lub specyficznych monoklonalnych przeciw-Aji co pokazano poniżej. Wszystkie preparaty przeciwciał oczyszczono tak, by miały niski poziom endotoksyn. Przeciwciała monoklonalne można przygotować przeciw fragmentowi przez wstrzyknięcie myszy fragmentu lub dłuższej postaci Λβ, przygotowanie hybrydom i przeszukiwanie hybrydom pod względem przeciwciała specyficznie wiążącego wymagany fragment Λβ nie wiążąc przy tym innych niezachodzących fragmentów Λβ.

T a b e l a 8

Przeciwciało	Epitop
2H3	Λβ1-12
10D5	Λβ1-12
266	Λβ13-28
21F12	Λβ33-42
Mysie poliklonalne przeciw-ludzkie Λβ42	przeciw zagregowanemu Λβ42

Zwierzętom podawano przez 4 miesiące śródotrzewnowo preparaty, gdy było to potrzebne, aby utrzymać przeciwciała w krążeniu w stężeniach, mierzonych jako miana ELISA, wyższych niż 1/1000, oznaczanych w ELISA wobec Λβ42 lub innego immunogenu. Miana monitorowano jak wyżej i myszy uśmiercono na koniec 6-miesięcznych wstrzykiwań. Po śmierci wykonano histochemię, oznaczanie poziomów Λβ i toksykologię. W każdej z grup użyto po 10 myszy. Dodatkowe badania biernej immunizacji opisano poniżej w przykładach XI i XII.

VII. Porównanie różnych adiuwantów

Przykłady te porównują CFA, ałun, emulsję olej w wodzie i MPL pod względem ich zdolności stymulowania odpowiedzi immunologicznej.

A. Materiały i metody

1. Projekt badań

Sto samic sześciotygodniowych świnek morskich rasy Hartley, otrzymanych z Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA, podzielono na 10 grup do immunizacji AN1792 lub jego palmitoilowaną pochodną, połączonymi z różnymi adiuwantami. Siedem grup immunizowano przez iniekcję AN1792 (33 μg, o ile nie zaznaczono inaczej) połączonym z a) PBS, b) adiuwantem Freunda, c) MPL, d) skwalenem, e) MPL/skwalenem, f) niską dawką z ałunem lub g) wysoką dawką z ałunem (300 μg AN1792). Dwie grupy immunizowano przez iniekcję palmitoilowaną pochodną AN1792 (33 μg) połączoną z a) PBS lub b) skwalenem. Na koniec, dziesiąta grupa otrzymywała samą PBS, bez antygenu i dodatkowego adiuwanta. Dla grupy otrzymującej adiuwant Freunda pierwszą dawkę zemulgowano z CFA, a pozostałe 4 dawki z IFA. Antygen podawano w dawce 33 μg dla wszystkich grup, z wyjątkiem grupy wysokiej dawki z ałunem, która otrzymywała 300 μg AN1792. Immunizację wykonywano śródotrzewnowo dla CFA/IFA i domięśniowo do mięśnia czterogłowego tylnej łapy, na zmianę po prawej i lewej stronie dla wszystkich innych grup. Pierwsze trzy dawki podawano w trybie dwutygodniowym, a następnie podano dwie dawki z miesięczną przerwą. Krew pobierano 6-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, w celu pomiaru miana przeciwciał.

2. Przygotowanie immunogenów

Dwa mg Λβ42 (California Peptide, seria ME0339) dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę wytrząśnięto, aby utworzyć względnie jednorodną zawiesinę. Dodano 100 μl 10x PBS (1xPBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5). Zawiesinę ponownie wytrząśnięto i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia. Nie zużyte Λβ1-42 przechowywano z osuszaczem jako liofilizowany proszek w -20°C.

Palmitoilowaną pochodną AN1792 otrzymano przez sprzęganie bezwodnika palmitynowego, rozpuszczonego w dimetyloformamidzie, z N-końcowym aminokwasem AN1792, przed usunięciem powstającego peptydu z żywicy przez podziałanie kwasem fluorowodorowym.

Aby przygotować dawki szczepionek z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) (grupa 2) zemulgowano 33 μg AN1792 w 200 μl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z CFA w końcowej objętości 400 μl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie emulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA).

PL 202 217 B1

Aby przygotować dawki szczepionek z MPL dla grup 5 i 8 liofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) dodano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy, do końcowego stężenia 1 mg/ml i całość wytrząśnięto. Mieszaninę podgrzano 65-70°C przez 30 sekund aby wytworzyć lekko nieprzezroczystą jednorodną zawiesinę miceli. Roztwór świeżo sporządzono dla każdego zestawu zastrzyków. Do każdego zastrzyku w grupie 5, zmieszano 33 μg AN1792 w 16,5 μl PBS, 50 μg MPL (50 μθ i 162 μl PBS w probówce borokrzemianowej bezpośrednio przed użyciem.

Aby przygotować dawki szczepionek z małą ilością emulsji olej w wodzie, AN1792 w PBS dodano do 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 w PBS, do końcowego stężenia w pojedynczej dawce 33 μg AN1792 w 250 μl (grupa 6). Mieszaninę zemulgowano przepuszczając przez dwukomorowe ręczne urządzenie 15-20 razy do momentu otrzymania kropelek emulsji o średnicy zbliżonej do standardowej perełki lateksowej o średnicy 1 μm, przy analizie mikroskopowej. Otrzymana zawiesina była opalizująca, mlecznobiała. Emulsje świeżo przygotowywano dla każdej z serii iniekcji. Dla grupy 8 dodano MPL w 0,2% trietyloaminie w stężeniu 50 μg na dawkę do mieszaniny skwalenu w detergencie w celu zemulgowania jak opisano powyżej. Dla pochodnej palmitoilowej (grupa 7), 33 μg na dawkę palmitoilo-NH-Ae1-42 dodano do skwalenu i wytrząśnięto. Następnie dodano Tween 80 i Span 85 i wytrząśnięto. Mieszaninę tę dodano do PBS, aby osiągnąć końcowe stężenia 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 i mieszaninę zemulgowano jak powyżej.

Aby przygotować dawki szczepionek z ałunem (grupy 9 i 10), AN1792 w PBS dodano do Alhydrogel (żel wodorotlenku glinu, Accurate, Wetsbury, NY) do osiągnięcia stężenia 33 μg (niska dawka, grupa 9) lub 300 μg (wysoka dawka, grupa 10) AN1792 na 5 mg ałunu, w końcowej objętości dawki 250 μ!. Zawiesinę delikatnie mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.

3. Pomiary mian przeciwciał

Od świnek morskich pobierano krew 6-7 dni po immunizacji, zaczynając po drugiej immunizacji, wykonując to 4 razy. Miana przeciwciał przeciw Ae42 zmierzono metodą ELISA, jak opisano w ogólnych materiałach i metodach.

4. Preparowanie tkanek

Po około 14 tygodniach wszystkim świnkom morskim podano CO2. Zebrano płyn mózgowo-rdzeniowy i usunięto mózgi, po czym wypreparowano 3 regiony mózgowe (hipokamp, korę i móżdżek), które użyto do pomiarów stężenia całkowitego Ae metodą ELISA.

B. Wyniki

1. Odpowiedzi przeciwciał

Zaobserwowano szeroki zakres skuteczności różnych adiuwantów mierzonej w testach odpowiedzi przeciwciał na AN1792 po immunizacji. Jak pokazano na fig. 14, gdy AN1792 podawano w PBS, nie wykryto przeciwciał po dwóch lub trzech immunizacjach, a niewielkie odpowiedzi wykryto po czwartej i piątej dawce ze średnią geometryczną mian (GMT) zaledwie około 45. Emulsja olej w wodzie wytworzyła umiarkowane miana po trzeciej dawce (GMT 255), które utrzymywały się po czwartej dawce (GMT 301) i spadły po końcowej dawce (GMT 54). Wystąpiła wyraźna odpowiedź antygenowa na dawkę dla AN1792 związanego z ałunem, przy czym 300 μg było bardziej immunogenne we wszystkich punktach czasowych niż 33 μg. W szczytowej odpowiedzi przeciwciał, po czwartej immunizacji, różnica pomiędzy dwoma dawkami wynosiła 43% z GMT około 1940 (33 μg) i 3400 (300 μg). Odpowiedź przeciwciał na 33 μg. AN1792 plus MPL była bardzo podobna do wytworzonej przez prawie 10-krotnie większą dawkę antygenu (300 μg) związanego z ałunem. Dodatek MPL do emulsji olej w wodzie zmniejszył siłę szczepionki w stosunku do szczepionki z MPL, jako jedynym adiuwantem, aż o 75%. Palmitoilowana pochodna AN1792 była całkowicie nieimmunogenna przy podawaniu w PBS i dała średnie miana przy podawaniu w emulsji olej w wodzie z GMT, 340 i 105 dla trzeciego i czwartego pobrania krwi. Najwyższe miana przeciwciał wytworzył adiuwant Freunda z szczytem GMT około 87000, która to wartość była prawie 30-krotnie wyższa niż GMT kolejnych najsilniejszych szczepionek, MPL i wysokiej dawki AN1792/ałun.

Najbardziej obiecującymi adiuwantami zidentyfikowanymi w tym badaniu są MPL i ałun. Z tych dwóch MPL wydaje się być korzystny, gdyż 10-krotnie niższa dawka antygenu była niezbędna do wytworzenia tej samej odpowiedzi przeciwciał, co uzyskana dla ałunu. Odpowiedź można wzmocnić przez zwiększenie dawki antygenu i/lub adiuwanta, oraz optymalizację trybu immunizacji. Emulsja olej w wodzie była bardzo słabym adiuwantem dla AN1792, tak że dodanie emulsji olej w wodzie do adiuwanta MPL zmniejszyło wewnętrzną aktywność samego adiuwanta MPL.

PL 202 217 B1

2. Poziomy Ae w mózgu

W wieku około 14 tygodni świnki morskie głęboko uśpiono, pobrano płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i usunięto zwierzętom mózgi w podzestawie grup immunizowanych adiuwantem Freunda (grupa 2), MPL (grupa 5), ałunem z wysoką dawką, 300 μg AN1792 (grupa 10) i z immunizowanej PBS grupy kontrolnej (grupa 3). Aby zmierzyć poziom peptydu Ae, jedną półkulę wypreparowano i przygotowano homogenaty regionów hipokampu, kory i móżdżku w 5 M guanidynie. Następnie rozcieńczono je i oznaczono przez porównanie z serią rozcieńczeń standardowego białka Ae o znanych stężeniach, w formacie ELISA. Poziomy Ae w hipokampie, korze i móżdżku były bardzo podobne dla wszystkich grup, pomimo szerokiego zakresu odpowiedzi przeciwciał na Ae wywołanej przez te szczepionki. Zmierzono średnie poziomy Ae w tkance, wynoszące około 25 ng/g w hipokampie, 21 ng/g w korze i 12 ng/g w móżdżku. Zatem obecność w krążeniu wysokiego miana przeciwciał przeciw Ae przez prawie 3 miesiące u niektórych z tych zwierząt nie zmieniła całkowitych poziomów Ae w ich mózgach. Poziomy Ae w CFS także były podobne pomiędzy grupami. Brak wyraźnych skutków immunizacji AN1792 na endogenny Ae wskazuje, że odpowiedź immunologiczna jest skupiona na patologicznych postaciach Ae.

VIII. Odpowiedź immunologiczna na różne adiuwanty u myszy

Sześciotygodniowe samice myszy Swiss Webster zastosowano do tych badań z 10-13 zwierzętami na grupę. Immunizacje wykonywano śródotrzewnowo w dniach 0, 14, 28, 60, 90 i 20, w dawkach o objętości 200 pl. Do wszystkich stymulacji jako bufor zastosowano PBS. Od zwierząt pobrano krew w 7 dni po każdej immunizacji, zaczynając po drugiej dawce, do analizy mian przeciwciał w teście ELISA. Tryb leczenia każdej z grup podano w tabeli 9.

T a b e l a 9

Projekt doświadczenia badania 010

Grupa	Na	Adiuwantb	Dawka	Antygen	Dawka (pg)
1	10	MPL	12,5 pg	AN1792	33
2	10	MPL	25 pg	AN1792	33
3	10	MPL	50 pg	AN1792	33
4	13	MPL	125 pg	AN1792	33
5	13	MPL	50 pg	AN1792	150
6	13	MPL	50 pg	AN1528	33
7	10	PBS		AN1792	33
8	10	PBS		-
9	10	zemulgowany skwalen	5%	AN1792	33
10	10	domieszany skwalen	5%	AN1792	33
11	10	ałun	2 mg	AN1792	33
12	13	MPL+ałun	50 pg/2 mg	AN1792	33
13	10	QS21	5 pg	AN1792	33
14	10	QS21	10 pg	AN1792	33
15	10	QS21	25AN1792	AN1792	33
16	13	QS21	25AN1792	AN1792	150
17	13	QS21	25AN1792	AN1528	33
18	13	QS21+MPL	25 pg/50 pg	AN1792	33
19	13	QS21+ałun	25 pg/2 mg	AN1792	33

Odnośniki:

a Liczba myszy w każ dej grupie na począ tku doś wiadczenia b Wskazano adiuwanty. Jako bufor do wszystkich preparatów zastosowano PBS. Grupie 8 nie podano antygenu ani adiuwanta.

Miana ELISA przeciwciał przeciw Ae42 dla każdej grupy przedstawiono w tabeli 10 poniżej.

PL 202 217 B1

T a b e l a 10

Geometryczne średnie mian przeciwciał

Tydzień pobierania krwi
Grupa badana	2,9	5,0	8,7	12,9	16,7
1	248	1797	2577	6180	4177
2	598	3114	3984	5287	6878
3	1372	5000	7159	12333	12781
4	1278	20791	14368	20097	25631
5	3288	26242	13229	9315	23742
6	61	2536	2301	1442	4504
7	37	395	484	972	2149
8	25	25	25	25	25
9	25	183	744	952	1823
10	25	89	311	513	817
11	29	708	2618	2165	3666
12	198	1458	1079	612	797
13	38	433	566	1080	626
14	104	541	3247	1609	838
15	212	2630	2472	1224	1496
16	183	2616	6680	2085	1631
17	28	201	375	222	1540
18	31699	15544	23095	6412	9059
19	63	243	554	299	441

Tabela wykazuje, że najwyższe miana uzyskano dla grup 4, 5 i 18, w których adiuwantami było 125 μg MPL, 50 μg MPL oraz QS21 plus MPL.

IX. Lecznicza skuteczność różnych adiuwantów.

Badania nad skutecznością leczniczą prowadzono na transgenicznych myszach PDAPP, z zestawem adiuwantów odpowiednich do stosowania u ludzi, aby oznaczyć ich zdolność do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciw Ae i wywołać kierowane immunologicznie usuwanie złogów amyloidowych z mózgu.

Sto osiemdziesiąt samców i samic, w wieku 7,5 do 8,5 miesięcy, heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP otrzymano z Charles River Laboratories. Myszy podzielono na 9 grup zawierających po 15 do 23 zwierzęta w grupie, do immunizacji AN1792 i AN1528 w połączeniu z różnymi adiuwantami. Zwierzęta podzielono tak, by dobrać płeć, wiek oraz rodziców zwierząt w obrębie grupy tak blisko jak to tylko było możliwe. Jako adiuwanty zastosowano ałun, MPL i QS-21, każdy w połączeniu z dwoma antygenami, oraz adiuwant Freunda (FA) połączony tylko z AN1792. Dodatkową grupę immunizowano AN1792 w buforze PBS ze środkiem konserwującym tymerozalem bez adiuwanta. Dziewiątą grupę, jako negatywną kontrolę, immunizowano samą PBS.

Przygotowanie zagregowanych peptydów Ae: peptydy ludzki Ae1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; seria ME0541), ludzki Ae1-42 (AN1792; California Peptides Inc., seria ME0439), świeżo solubilizowano do przygotowania każdego z zestawu zastrzyków z liofilizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszaninę wytrząśnięto, aby wytworzyć względnie jednorodny roztwór lub zawiesinę. AN1528 był rozpuszczalny na tym etapie, w odróżnieniu od AN1792. Następnie dodano równe objętości po 100 μl 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zaczął się wytrącać. Zawiesiny ponownie wytrząśnięto i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania następnego dnia.

PL 202 217 B1

Aby przygotować dawki szczepionek z ałunem (grupy 1 i 5), peptyd Aβ w PBS dodano do Alhydrogelu (2% wodny żel wodorotlenku glinu, Sargeant, Inc., Clifton, NJ), do osiągnięcia stężenia 100 gg peptydu Aβ na 1 mg ałunu. Dodano 10x PBS do końcowej objętości dawki wynoszącej 200 gl w 1x PBS. Zawiesinę delikatnie mieszano przez około 4 godziny w temperaturze pokojowej przed wstrzykiwaniem.

Aby przygotować dawki szczepionek z MPL (grupy 2 i 6) liofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; seria 67039-E0896B) dodano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy, do końcowego stężenia 1 mg/ml i wytrząśnięto. Mieszaninę podgrzano do 65 do 70°C przez 30 s, aby otrzymać lekko nieprzezroczystą jednorodną zawiesinę micelli. Roztwór przechowywano w 4°C. Do każdego zestawu iniekcji zmieszano 100 gg peptydu na dawkę w 50 gl PBS, 50 gg MPL na dawkę (50 gl) i 100 gl PBS na dawkę, w probówce borokrzemianowej, bezpośrednio przed użyciem.

Aby przygotować dawki szczepionek z QS21 (grupy 3 i 7) liofilizowany proszek (Aquila, Framingham, MA; seria A7018R) dodano do PBS, pH 6,6-6,7 do końcowego stężenia 1 mg/ml i wytrząśnięto. Roztwór przechowywano w -20 °C. Do każdego zestawu zastrzyków zmieszano 100 gg peptydu na dawkę w 50 gl PBS, 25 gg QS21 na dawkę w 25 gl PBS i 125 gl PBS na dawkę w probówce borokrzemianowej bezpośrednio przed użyciem.

Aby przygotować dawki szczepionek z adiuwantem Freunda (grupa 4) zemulgowano 100 gg AN1792 w 200 gl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 gl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie zemulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA). Do szczepionek zawierających adiuwanty ałun, MPL lub QS21, połączono 100 gg na dawkę AN1792 lub AN1528 z ałunem (1 mg na dawkę) lub MPL (50 gg na dawkę) lub QS21 (25 gg na dawkę), w końcowej objętości 200 gl PBS i podawano szczepiąc podskórnie na boku pomiędzy łopatkami. Dla grupy otrzymującej FA 100 gg AN1792 zemulgowano w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 gl i podawano śródotrzewnowo przy pierwszej immunizacji, a następnie podawano dawki przypominające tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) przez kolejnych pięć dawek. Dla grupy otrzymującej AN1792 bez adiuwanta 10 gg AN1792 połączono z 5 gg tymerozalu w końcowej objętości 50 gl PBS i podawano podskórnie. Dziewiąta grupa kontrolna otrzymywała tylko 200 gl PBS w zastrzykach podskórnych. Immunizacje wykonywano w trybie dwutygodniowym przez 3 pierwsze dawki, a następnie w trybie miesięcznym, a zatem w dniach 0, 16, 28, 56, 85 i 112. Od zwierząt pobierano krew w 6-7 dni po każdej immunizacji, zaczynając od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwciał. Zwierzęta uśmiercono około tygodnia po końcowej dawce. Wyniki oznaczono w teście ELISA mierząc poziomy Aβ i APP w mózgu i na podstawie immunohistochemicznej oceny obecności płytek amyloidowych w skrawkach histologicznych mózgu. Ponadto oznaczono miana specyficznych przeciwciał przeciw Aβ oraz zależne od Aβ odpowiedzi, proliferacyjną i cytokinową.

Z tabeli 11 wynika, że najwyższe miana przeciwciał przeciw Aβ1-42 wytworzył FA z AN1792, miana, które osiągnęły szczyt po czwartej immunizacji (szczytowa GMT: 75386), a następnie spadły o 59% po końcowej, szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwciał wytworzone przez MPL z AN1792 było o 62% niższe niż wytworzone przez FA (szczytowa GMT: 28867) i także zostało osiągnięte wcześnie podczas immunizacji, po trzech dawkach, a następnie spadło do 28% szczytowej wartości po szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwciał wytworzone przez QS21 połączone z AN1792 (GMT: 1511) było około 5-krotnie niższe niż uzyskane dla MPL. Ponadto kinetyka odpowiedzi była wolniejsza, gdyż dodatkowa immunizacja była konieczna do uzyskania szczytowej odpowiedzi. Miana wytworzone przez ałun związany z AN1792 były niewiele wyższe niż uzyskane dla QS-21, a kinetyka odpowiedzi była szybsza. Dla AN1792 podawanego w PBS z tymerozalem częstość i wielkość mian była niewiele wyższa niż uzyskana dla samej PBS. Szczytowe miana wytworzone przez MPL i AN1528 (szczytowa GMT 3099) były około 9-krotnie niższe niż dla AN1792. AN1528 związany z ałunem był w niewielkim stopniu immunogenny, z niskimi mianami wytworzonymi tylko u paru zwierząt. Nie obserwowano odpowiedzi przeciwciał u zwierząt kontrolnych immunizowanych samą PBS.

PL 202 217 B1

T a b e l a 11

Średnie geometryczne mian przeciwciał^a

Tydzień pobierania krwi
Leczenie	3,3	5,0	9,0	13,0	17,0
Ałun/AN1792	102	1081	2366	1083	572
(12/21)b	(17/20)	(21/21)	(19/21)	(18/21)
MPL/AN1792	6241	28867	11242	5665	8204
(21/21)	(21/21)	(21/21)	(20/20)	(20/20)
QS21/AN1792	30	227	327	1511	1188
(1/20)	(10/19)	(10/19)	(17/18)	(14/18)
CFA/AN1792	10076	61279	75386	41628	30574
(15/15)	(15/15)	(15/15)	(15/15)	(15/15)
Ałun/AN1528	25	33	39	37	31
(0/21)	(1/21)	(3/20)	(1/20)	(2/20)
MPL/AN1528	184	2591	1653	1156	3099
(15/21)	(20/21)	(21/21)	(20/20)	(20/20)
QS21/AN1528	29	221	51	820	2994
(1/22)	(13/22)	(4/22)	(20/22)	(21/22)
PBS+tymerozal	25	33	39	37	47
(0/16)	(2/16)	(4/16)	(3/16)	(4/16)
PBS	25	25	25	25	25
(0/16)	(0/16)	(0/15)	(0/12)	(0/16)

Odnośniki:

^a Średnie geometryczne mian przeciwciał zmierzonych względem Αβ1-42.

^b Liczba odpowiadających na grupę.

Wyniki leczenia AN1792 lub AN1592 z różnymi adiuwantami lub tymerozalem na obciążenie kory amyloidem u 12-miesięcznych myszy oznaczone metodą ELISA przedstawiono na fig. 15. U kontrolnych myszy PDAPP z PBS średni poziom całkowitego Αβ w korze w wieku 12 miesięcy wynosił 1817 ng/g. Znacznie obniżone poziomy Αβ obserwowano u myszy leczonych AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL oraz QS-21 plus AN1792. Obniżenie osiągnęło znaczącą statystycznie wartość (p<0,05) tylko dla AN1792 plus CFA/IFA. Jednakże, jak pokazano w przykładach I i III, działanie immunizacji na obniżenie poziomów Αβ było znacząco większe u 15 i 18-miesięcznych myszy. Zatem oczekuje się, że przynajmniej leczenie preparatami AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS-21 osiągnie znaczenie statystyczne u starszych myszy. W porównaniu z tym, AN1792 plus środek konserwujący tymerozal wytwarzał średni poziom Αβ prawie taki sam jak u myszy leczonych PBS. Podobne wyniki uzyskano porównując korowe poziomy Αβ42. Średni poziom Αβ42 w kontrolach PBS wynosił 1624 ng/g. Wyraźnie obniżone średnich poziomów o wartościach 403, 1149, 620 i 714 obserwowano u myszy leczonych odpowiednio preparatami AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS21, ze zmniejszeniem osiągającym znaczenie statystyczne (p=0,05) dla grupy leczonej AN1792 plus CFA/IFA. Wartość średnia w grupie leczonej AN1792 z tymerozalem wynosiła 1619 ng/g Αβ42.

X. Analiza toksyczności

Po zakończeniu badań opisanych w przykładach II, III i VII zebrano tkanki do oceny histopatologicznej. Ponadto w końcowych próbkach krwi z przykładów III i VI wykonano analizy hematologiczną i chemiczną. Oceniono większość głównych narządów, włącznie z mózgiem, płucami, tkanką limfatyczną, przewodem żołądkowo-jelitowym, wątrobą, nerkami, nadnerczami i gruczołami płciowymi. Pomimo, że zaobserwowano sporadyczne uszkodzenia u badanych zwierząt, nie stwierdzono żadnych oczywistych różnic, ani w zaatakowanych tkankach, ani w ostrości uszkodzeń pomiędzy zwierzętami leczonymi AN1792 a nieleczonymi. Nie stwierdzono unikatowych uszkodzeń histopatologicznych u myszy immunizowanych AN1528 w porównaniu z myszami leczonymi PBS lub nieleczonymi. Nie stwierdzono także różnic w profilu analiz chemicznych pomiędzy grupami leczonymi adiuwantem a zwierzętami leczonymi PBS w przykładzie VI. Jakkolwiek zaobserwowano znaczne wzrosty kilku

PL 202 217 B1 parametrów hematologicznych pomiędzy zwierzętami leczonymi AN1792 z adiuwantem Freunda w przykładzie VI w porównaniu do zwierząt leczonych PBS, ale ten typ działania był oczekiwany z leczenia adiuwantem Freunda i towarzyszącego mu zapalenia otrzewnej i nie wskazuje na jakiekolwiek niekorzystne działanie leczenia AN1792. Szczegółowe badania patologii mózgów myszy PDAPP wykonano nie jako część oceny toksykologicznej, ale jako część punktów końcowych badania skuteczności. W żadnym z tych badań nie stwierdzono jakichkolwiek oznak niekorzystnego działania na morfologię mózgu. Wyniki te wskazują, że leczenie AN1792 jest dobrze tolerowane i przynajmniej w znacznym stopniu pozbawione skutków ubocznych.

XI. Leczenie terapeutyczne przeciwciałami przeciw Ae

Doświadczenia opisane w tej części przeprowadzono w celu zbadania zdolności różnych przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych przeciw Ae do hamowania odkładania Ae w mózgu heterozygotycznych myszy transgenicznych.

A. Badanie 1

1. Projekt badań

Sześćdziesiąt samców i samic heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w wieku 8,5 do 10,5 miesięcy uzyskano z Charles River Laboratory. Myszy podzielono na 6 grup do immunizacji różnymi przeciwciałami skierowanymi do Ae. Zwierzęta podzielono tak by dobrać płeć, wiek, rodziców oraz źródło zwierząt w obrębie grupy tak blisko jak to było możliwe. Jak pokazano w tabeli 12 przeciwciała obejmowały 4 mysie przeciwciała monoklonalne specyficzne dla Ae, 2H3 (skierowane przeciw aminokwasom 1-12 Ae), 10D5 (skierowane przeciw aminokwasom 1-16 Ae), 266 (skierowane przeciw aminokwasom 13-28 Ae i wiążące się z monomerycznym, ale nie z zagregowanym AN1792), 21F12 (skierowane przeciw aminokwasom 33-42 Ae). Piątą grupę poddano działaniu frakcji przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Ae (wytworzonych przez immunizację ze zagregowanymi AN1792). Grupa kontroli negatywnej otrzymywała sam rozcieńczalnik PBS bez przeciwciała.

Przeciwciała monoklonalne wstrzyknięto w dawce około 10 mg/kg (szacując, że myszy ważyły 50 g). Zastrzyki podawano dootrzewnowo średnio co 7 dni aby utrzymać miana przeciw Ae na poziomie powyżej 1000. Pomimo, że niższe miana obserwowano dla mAb 266, ze względu na to, że nie wiąże się ono dobrze ze zagregowanym AN1792 stosowanym w teście jako antygen wychwytujący, ten sam harmonogram dawkowania utrzymywano dla tej grupy. Doświadczenia w grupie otrzymującej przeciwciała monoklonalne 2H3 przerwano po pierwszych 3 tygodniach, ze względu na to, że przeciwciało było usuwane zbyt szybko in vivo. Od zwierząt pobierano krew przed każdą dawką w celu zmierzenia mian przeciwciał. Leczenie kontynuowano przez okres 6 miesięcy, przez całkowitą liczbę 196 dni. Zwierzęta uśmiercono tydzień po końcowej dawce.

T a b e l a 12

Projekt badania 006

Grupa badana	Na	Badane przeciwciało	Specyficzność przeciwciała	Izotyp przeciwciała
1	9	brak (sama PBS)	NAb	NA
2	10	poliklonalne	Ae1-42	mieszany
3	0	mAbc 2H3	Ae1-12	IgG1
4	8	mAb10D5	Ae1-16	IgG1
5	6	mAb 266	Ae13-28	IgG1
6	8	mAb21F12	Ae33-42	IgG2a

Odnośniki:

^a Liczba myszy w grupie pod koniec doś wiadczenia. We wszystkich grupach na początku było po 10 zwierząt. ^b NA: nie stosowano ^c mAb: przeciwciał o monoklonalne

2. Materiały i metody a. Wytwarzanie przeciwciał

Poliklonalne przeciwciała przeciw Ae przygotowano z krwi zebranej od dwóch grup zwierząt. Pierwsza grupa składała się ze 100 samic myszy Swiss Webster w wieku 6 do 8 tygodni. Zaszczepiono je w dniu 0, 15 i 29 podając 100 μg AN1792 połączonego z CFA/IFA. Czwarty zastrzyk wykonano dnia 36 podając połowę dawki AN1792. Po uśmierceniu 42 dnia zwierzęta wykrwawiono, pobrano

PL 202 217 B1 surowicę i wszystkie surowice zlano razem dając całkowitą objętość 64 ml. Druga grupa obejmowała 24 samice myszy izogenicznych z PDAPP, ale nie transgenicznych pod względem ludzkiego genu APP w wieku 6 do 9 tygodni. Immunizowano je w dniach 0, 14, 28 i 56 podając 100 μg AN1792 połączonego z CFA/IFA. Zwierzęta te po uśmierceniu 63 dnia także wykrwawiono, pobrano surowicę i wszystkie surowice zlano razem dając całkowitą objętość 14 ml. Obie surowice zlano razem. Frakcje przeciwciał oczyszczono stosując dwie kolejne rundy wytrącania przez wysycenie siarczanem amonu do 50%. Końcowy osad dializowano wobec PBS i testowano pod względem obecności endotoksyny. Poziom endotoksyny był niższy niż 1 EU/mg.

Przeciwciała monoklonalne przeciw Λβ przygotowano z płynu puchlinowego. Początkowo, z płynu usunięto lipidy dodając stężoną sól sodową siarczanu dekstranu do zimnego płynu puchlinowego i mieszając w lodzie do osiągnięcia stężenia 0,238%. Następnie mieszając dodano stężony CaCl2 do końcowego stężenia 64 mM. Roztwór ten odwirowano przy 10000 x g i osad odrzucono. Supernatant zmieszano w lodzie z równą objętością siarczanu amonu dodawanego kroplami. Roztwór odwirowano powtórnie przy 10000 x g i supernatant odrzucono. Osad rozpuszczono i dializowano wobec 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Frakcję tą naniesiono na kolumnę Pharmacia FPLC Sepharose Q Column i wymywano odwrotnym gradientem od 0,4 M do 0,275 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Pik przeciwciał zidentyfikowano monitorując absorpcje przy 280 nm i odpowiednie frakcje zebrano. Oczyszczony preparat przeciwciał scharakteryzowano mierząc stężenie białka metodą BCA i czystość przy pomocy SDS-PAGE. Próbkę także sprawdzono pod względem obecności endotoksyn. Poziom endotoksyn był niższy niż 1 EU/mg. Miana - mianom niższym niż 100 umownie przyjęto wartość miana jako 25.

3. Poziomy Λβ i APP w mózgu

Po 6 miesiącach leczenia różnymi preparatami przeciwciał przeciw Λβ ze zwierząt perfundowanych solą usunięto mózgi. Jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, a drugą użyto do oznaczenia poziomów Λβ i APP. Aby zmierzyć stężenie różnych postaci peptydu β-amyloidowego i białka prekursorowego amyloidu, (APP) półkulę pocięto na części i przygotowano homogenaty regionów hipokampu, kory i móżdżka w 5 M guanidynie. Rozcieńczono je seryjnie i oznaczono poziom amyloidu lub APP, porównując do serii rozcieńczeń wzorców peptydu Λβ lub APP o znanych stężeniach, w formacie ELISA.

Poziomy całkowitych Λβ i Λβ1-42 zmierzone przy pomocy ELISA w homogenatach kory i hipokampu oraz poziom całkowitego Λβ w móżdżku przedstawiono odpowiednio w tabelach 11, 12 i 13. Mediana stężenia całkowitego Λβ dla grupy kontrolnej, zaszczepionej PBS była 3,6-raza większa w hipokampie niż w korze (mediana 63389 ng/g tkanki hipokampu w porównaniu do 17818 ng/g kory). Mediana poziomu w móżdżku grupy kontrolnej (30,6 ng/g tkanki) była ponad 2000-razy niższa niż w hipokampie. Poziomy te były podobne do wcześniej opisanych dla heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Woods i inni, 1997).

Dla kory, jedna z grup badanych miała średnie całkowite poziomy Λβ, zmierzonego jako Λβ1-42 znacznie różniące się od grupy kontrolnej (p<0,05), zwierzęta te otrzymujące poliklonalne przeciwciała przeciw Λβ przedstawiono w tabeli 13. Mediana poziomu Λβ1-42 dla tej grupy badanej zmniejszyła się o 65% w porównaniu z kontrolą. Mediana poziomu Λβ1-42 była także znacznie zmniejszona o 55% w porównaniu z kontrolą w jednej dodatkowej grupie badanej, tym zwierzętom podawano mAb 10D5 (p=0, 0433).

PL 202 217 B1

Tabela 13

NA: me stosowano Odchylenie standardowe

PL 202 217 B1

W hipokampie mediana procentowego zmniejszenia całkowitej ilości Ae związanego z leczeniem poliklonalnymi przeciwciałami przeciw Ae (50%, p=0,0055) nie była tak duża jak obserwowana w korze (65%) (tabela 14). Jednakże bezwzględny stopień zmniejszenia był prawie 3-krotnie wyższy w hipokampie niż w korze, zmniejszenie netto wynosiło 31683 ng/g tkanki w hipokampie wobec 11658 ng/g tkanki w korze. Gdy mierzono bardziej amyloidogenną postać Ae, Ae1-42, niż całkowite Ae, osiągnięte zmniejszenie z poliklonalnym przeciwciałem było znaczące (p=0,0025). Mediana poziomu w grupach leczonych mAb 10D5 i 266 była zmniejszona odpowiednio o 33% i 21%.

PL 202 217 B1

Całkowite Aβ także zmierzono w móżdżku (tabela 15). W grupach którym podawano przeciwciała poliklonalne przeciw Aβ i 266 obserwowano znaczące obniżenie poziomu całkowitego Aβ (odpowiednio 43% i 46%, p = 0,0033 i p = 0,0184), a w grupie której podawano 10D5 obserwowano prawie znaczące obniżenie (29%, p = 0,0675).

T a b e l a 15

Móżdżek

Grupa badana	Na	Mediany	Średnie
Całkowite Aβ	Całkowite Aβ
Wartość ELISA b	Wartość P	% zmiany	Wartość ELISA
PBS	9	30,64	NAd	NA	40,00±31,89e
Poliklonalne przeciw Aβ42	10	17,61	0,0033	-43	18,15±4,36
mAb10D5	8	21,68	0,0675	-29	27,29±19,43
mAb 266	6	16,59	0,0184	-46	19,59±6,59
mAb 21F12	8	29,80	>0,9999	-3	32,88±9,90

Odnośniki:

^a Liczba zwierzą t na grupę pod koniec doś wiadczenia ^b ng/g tkanki ^c analiza Mann Whitney ^d NA: nie stosowano ^e Odchylenie standardowe

Stężenie APP także wyznaczono przy pomocy ELISA w korze i móżdżku u myszy leczonych przeciwciałami i kontrolnych, którym podawano PBS. Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, nazwany APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-α (α, wydzielana postać APP, która została przecięta w obrębie sekwencji Aβ), jak i postaci APP pełnej długości (FL), podczas gdy drugi rozpoznaje tylko APP -α. W odróżnieniu od towarzyszącego leczeniu zmniejszenia Aβ w zestawie grup badanych, poziomy APP pozostały bez zmian u wszystkich zwierząt leczonych w porównaniu z kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że immunizacje przeciwciałami Aβ usuwają Aβ, ale nie usuwają APP.

W podsumowaniu, poziomy Aβ były znacząco zmniejszone w korze, hipokampie i móżdżku u zwierząt leczonych poliklonalnymi przeciwciałami przeciw AN1792. W mniejszym stopniu przeciwciała monoklonalne przeciw N-końcowemu regionowi Aβ1-42, specyficznie przeciw fragmentom obejmującym aminokwasy 1-16 i 13-28, także wywołały znaczące skutki lecznicze.

4. Analiza histochemiczna

Morfologię Aβ-immunoreaktywnych płytek w podzestawach mózgów od myszy z grupy kontrolnej, której podawano PBS oraz z grup leczonych poliklonalnymi Aβ42, 21F12, 266 i 10D5 porównano ilościowo z poprzednimi badaniami, w których przeprowadzano standardowe procedury immunizacji Aβ42.

Największą zmianę zarówno w liczbie jak i wyglądzie płytek amyloidowych zaobserwowano u zwierząt immunizowanych poliklonalnymi przeciwciałami przeciw Aβ42. Zmniejszenie obciążenia amyloidem, morfologia płytek wykazująca erozję oraz związana z komórkami immunoreaktywność Aβ przypominała skutki powstałe w wyniku standardowej procedury immunizacji. Obserwacje te potwierdzają wyniki ELISA w których uzyskano znaczące obniżenie zarówno całkowitego Aβ, jak i Aβ42, przez podawanie poliklonalnych przeciwciał przeciw Aβ42.

W podobnych ocenach ilościowych płytki amyloidowe w grupie 10D5 także zmniejszyły swoją liczbę i wygląd z pewnymi dowodami związanej z komórkami Aβ immunoreaktywności. Nie zauważono dużych różnic gdy grupy 21F12 i 266 porównano z kontrolami PBS.

5. Pomiary mian przeciwciał

Od zestawu trzech losowo wybranych myszy z każdej grupy pobrano krew przed każdym zaszczepieniem dootrzewnowym, co dało całkowitą liczbę 30 pobrań krwi. Zmierzono miana przeciwciał jako przeciwciała wiążące Aβ1-42 metodą ELISA podwójnego wiązania na wielostudzienkowych płytkach z tworzywa sztucznego, powleczonych Aβ1-42 jak opisano w ogólnych materiałach i metodach. Średnie miana dla każdego pobrania krwi przedstawiono na fig. 16-18 odpowiednio dla przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych 10D5 i 21F12. W tym okresie czasu miana osiągnęły średnią wartość około 1:1000 dla preparatu przeciwciał poliklonalnych i były niewiele powyżej tego poziomu u zwierząt leczonych 10D5 i 21F12.

PL 202 217 B1

6. Odpowiedzi limfoproliferacyjne

Zależną od Ae limfoproliferację zmierzono stosując komórki śledziony zebrane 8 dni po końcowej infuzji przeciwciał. Świeżo zebrane komórki, 10⁵ na studzienkę, hodowano przez 5 dni w obecności Ae1-40 w stężeniu 5 μM w celu stymulacji. Jako pozytywną kontrolę hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako negatywną kontrolę komórki hodowano bez dodanego peptydu.

Limfocyty śledziony ze starych myszy PDAPP biernie immunizowanych różnymi przeciwciałami przeciw Ae były stymulowane in vitro AN1792 i zmierzono odpowiedź proliferacyjną i cytokin. Celem tych testów było stwierdzenie, czy bierna immunizacja wpływa na prezentację antygenu, a zatem na wywołanie odpowiedzi komórek T specyficznej względem AN1792. Nie zaobserwowano specyficznej dla AN1792 odpowiedzi proliferacyjnej i cytokin u myszy biernie immunizowanych przeciwciałami przeciw Ae.

B. Badanie 2

W drugim badaniu powtórzono leczenie przeciwciałem 10D5 i zbadano dwa dodatkowe przeciwciała przeciw Ae, przeciwciała monoklonalne 3D6 (Ae1-5) i 16C11 (Ae33-42). Grupy kontrolne otrzymywały PBS lub nie pasujące przeciwciało dobrane izotypowo (TM2a). Myszy były starsze (11,5-12 miesięczne heterozygoty) niż w poprzednim badaniu; w innych przypadkach projekt badania był taki sam. Znowu po sześciu miesiącach leczenia 10D5 obniżyło obciążenie płytkami amyloidowymi o więcej niż 80% w porównaniu z kontrolami PBS lub dobranym izotypowo przeciwciałem (p=0,003). Jedno z innych przeciwciał przeciw Ae, 3D6, było równie skuteczne i wywołało zmniejszenie o 86% (p=0,003). W odróżnieniu od tego trzecie przeciwciało przeciw peptydowi, 16C11, nie wywarło żadnego działania na obciążenie płytkami. Podobne wyniki uzyskano w pomiarach Ae42 ELISA. Wyniki te pokazują, że odpowiedź przeciwciał przeciw peptydowi Ae, przy braku odporności komórek T, wystarcza do obniżenia odkładania amyloidu w myszach PDAPP, ale że nie wszystkie przeciwciała przeciw Ae są skuteczne. Przeciwciała skierowane przeciw epitopom zawierającym aminokwasy 1-5 lub 3-7 Ae są szczególnie skuteczne.

Badania te pokazują, że biernie podawane przeciwciała przeciw Ae obniżają stopień odkładania płytek w mysim modelu choroby Alzheimera. Gdy stężenia utrzymują się na średnim poziomie w surowicy (25-70 μg/ml), przeciwciała uzyskują dostęp do OUN w poziomach wystarczających aby opłaszczać płytki e-amyloidowe. Wejście przeciwciał do OUN nie wynikało z nieprawidłowego przeciekania bariery krew-mózg, ze względu na to, że nie obserwowano wzrostu przepuszczalności naczyń mierzonej przy pomocy Evans Blue u myszy PDAPP. Ponadto stężenie przeciwciał w miąższu mózgu starych myszy PDAPP było takie samo jak u nietransgenicznych myszy i stanowiło 0,1% stężenia przeciwciał w surowicy (bez względu na izotyp).

C. Badanie 3: Monitorowanie wiązania przeciwciał

Aby wyznaczyć czy przeciwciała przeciw Ae mogą działać bezpośrednio w OUN mózgi pobrane od perfundowanych solą myszy pod koniec przykładu XV zbadano pod względem obecności przeciwciał podawanych obwodowo. Nieutrwalone kriostatowe przekroje mózgów wystawiono na działanie odczynnika fluorescencyjnego przeciw mysiej immunoglobulinie (kozia przeciw-mysia IgG-Cy3). Płytki w mózgach grup 10D5 i 3D6 były silnie oblepione przeciwciałami, podczas gdy nie zaobserwowano wybarwienia w grupie 16C11. Aby stwierdzić całkowity rozmiar odkładania płytek kolejne przekroje każdego mózgu poddano reakcji immunologicznej z przeciwciałem przeciw Ae, a następnie z drugim odczynnikiem. 10D5 i 3D6 po podaniu obwodowym uzyskały dostęp do większości płytek w OUN. Obciążenie płytkami było znacznie zmniejszone w tych grupach badanych w porównaniu z grupą 16C11. Wyniki te wskazują, że przeciwciała podawane obwodowo mogą wejść do OUN, gdzie mogą bezpośrednio rozpocząć usuwanie amyloidu. Możliwe jest, że 16C11 także miało dostęp do płytek, ale nie potrafiło się z nimi związać.

XII. Profilaktyka i leczenie pacjentów będących ludźmi

Przeprowadzono I fazę prób z pojedynczą dawką, aby oznaczyć bezpieczeństwo u ludzi. Środek leczniczy podawano w wzrastających dawkach różnym pacjentom zaczynając od dawki około 0,01, poziomu o przypuszczalnej skuteczności, i zwiększano ją 3-krotnie do czasu gdy poziom osiągnął 10-krotność skutecznej mysiej dawki.

Badania fazy II prób przeprowadzono, by oznaczyć skuteczność leczniczą. Wybrano pacjentów we wczesnej do średniej fazie choroby Alzheimera, z użyciem kryterium Alzheimer's disease and Related Disorders Association (ADRDA) na prawdopodobieństwo AD. Odpowiedni pacjenci lokowali się w zakresie 12-26 w badaniach Mini-Mental State Exam (MMSE). Innymi kryteriami wyboru było to, że pacjenci są w stanie przeżyć czas trwania testu oraz brak komplikujących danych, takich jak równoPL 202 217 B1 czesne stosowanie leków, które mogą wpływać na leczenie. Podstawową ocenę funkcjonowania pacjentów wykonano z użyciem klasycznych pomiarów psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, które stanowią ogólną skalę oceny stanu i działania pacjentów z chorobą Alzheimera. Te skale psychometryczne dostarczają miary postępu stanu choroby Alzheimera. Do monitorowania leczenia można także zastosować odpowiednie skale jakości życia. Postęp choroby można także monitorować metodą MRI. Można także monitorować profile krwi pacjentów, włącznie z testami dla specyficznych dla antygenu odpowiedzi przeciwciał i komórek T.

Po podstawowych pomiarach pacjentom zaczęto podawać leczenie. Losowo podzielono ich i leczono środkiem leczniczym lub placebo w sposób ślepy. Pacjentów monitorowano co najmniej 6 miesięcy. Skuteczność oznaczono jako znaczne zmniejszenie postępu w grupie leczonej względem grupy placebo.

Drugą fazę II próby przeprowadzono w celu oceny przejścia pacjentów z nie-alzheimerowskiej wczesnej utraty pamięci, czasami nazywanej upośledzeniem pamięci związanym z wiekiem (AAMI) lub łagodnym upośledzeniem funkcji poznawczych, do prawdopodobnej choroby Alzheimera, określanej na podstawie kryteriów ADRDA. Wybrano pacjentów z wysokim ryzykiem przejścia do choroby Alzheimera z nieklinicznej populacji, przeszukując populacje odniesienia pod względem wczesnych oznak utraty pamięci lub innych trudności związanych z przed-alzheimerowskimi objawami, historii rodzinnej choroby Alzheimera, genetycznych czynników ryzyka, wieku, płci oraz innych cech, które wskazują wysokie ryzyko choroby Alzheimera. Zebrano punkty podstawowe odpowiednich miar włącznie z MMSE i ADAS, razem z innymi miernikami zaprojektowanymi do oceny bardziej normalnej populacji. Populacje tych pacjentów podzielono na dwie odpowiednie grupy z porównaniem placebo wobec wariantów dawek środka. Losy pacjentów z tych populacji śledzono z przerwami około sześciomiesięcznymi, a końcowym punktem dla każdego pacjenta było, czy na koniec obserwacji osoba ta przejdzie do fazy prawdopodobnej choroby Alzheimera oznaczonej na podstawie kryteriów ADRDA.

XIII. Ogólne materiały i metody

1. Pomiary miana przeciwciał

Od myszy pobrano krew robiąc niewielkie nakłucie w żyle ogonowej i zebrano około 200 μl krwi do probówki mikrowirówkowej. Od świnek morskich pobrano krew przez wygolenie najpierw okolicy tylnego golenia, a następnie nakłucie za pomocą igły nr 18 żyły śródstopowej i zebranie krwi do probówek mikrowirówkowych. Krew zostawiono do skrzepnięcia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), wytrząśnięto, a następnie odwirowano przy 14000 x g przez 10 minut, aby oddzielić skrzep od surowicy. Surowicę przeniesiono do czystych probówek mikrowirówkowych i przechowywano w 4°C do czasu oznaczania miana.

Miana przeciwciał zmierzono metodą ELISA. 96-studzienkowe płytki do mikromianowania (płytki Costar EIA) powleczono 100 μl roztworu zawierającego 10 μg/ml Ae42 lub SAPP albo innych antygenów, jak wskazano w każdym z poszczególnych przypadków, w buforze Well Coating Buffer (0,1 M fosforan sodu, pH 8,5, 0,1% azydek sodu) i trzymano przez noc w RT. Z płytek odessano płyn i dodano surowicę do studzienek, zaczynając od rozcieńczenia 1/100 w Specimen Diluent (0,014 M fosforan sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% surowiczej albuminy bydlęcej, 0,05% tymerozalu). Bezpośrednio na płytkach wykonano 7 kolejnych 3-krotnych rozcieńczeń próbek, tak by osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1/218700. Rozcieńczone preparaty inkubowano w powleczonych studzienkach na płytce przez 1 godzinę w RT. Następnie płytki przemyto 4-krotnie za pomocą PBS zawierającej 0,05% Tween 20. Następnie dodano do studzienek drugie przeciwciało, kozie przeciw mysiej Ig, sprzężone z peroksydazą chrzanową (otrzymane z Boehringer Mannheim), w ilości 100 μl rozcieńczenia 1/3000 w Specimen Diluent i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemyto 4-krotnie za pomocą PBS, Tween 20. Aby wywołać chromogen, do każdej studzienki dodano 100 μl Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna otrzymana z Pierce Chemicals) i inkubowano przez 15 minut w RT. Reakcję zatrzymano przez dodanie 25 μl 2M H₂SO₄. Następnie odczytano intensywność barwy w Molecular Devices Vmax przy (450 nm - 650 nm).

Miana zdefiniowano jako odwrotność rozcieńczenia surowicy wywołującego połowę maksymalnej OD. Zazwyczaj maksymalne OD odczytywano z początkowego rozcieńczenia 1/100, z wyjątkiem przypadków bardzo wysokich mian, przy których niezbędne było większe początkowe rozcieńczenie do ustalenia maksymalnej OD. Jeżeli punkt 50% znajdował się pomiędzy dwoma rozcieńczeniami, wykonywano liniową ekstrapolację aby wyznaczyć końcowe miano. Aby policzyć średnią geometryczną mian przeciwciał, miana niższe niż 100 były umownie oznaczane jako wartość miana 25.

PL 202 217 B1

2. Test proliferacji limfocytów

Myszy uśpiono izofluranem. Śledziony usunięto i przepłukano dwukrotnie w 5 ml PBS zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (PBS-FBS), zhomogenizowano w 50° Centricon Unit (Dako A/S, Denmark) w 1,5 ml PBS-FBS przez 10 sekund przy 10 rpm w Medimachine (Dako), a następnie przefiltrowano przez nylonowe sito o średnicy porów 100 μm. Limfocyty śledzionowe przemyto jeden raz 15 ml PBS-FBS, następnie osadzono przez wirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Czerwone krwinki zlizowano zawieszając osad w 5 ml buforu zawierającego 0,15 M NH4Cl, 1M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4 przez 5 minut w RT. Następnie leukocyty przemyto w sposób opisany powyżej. Świeżo wyizolowane komórki śledzionowe (10⁵ na studzienkę) hodowano w 3 powtórzeniach zestawów w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania, do hodowli tkankowych, o dnie w kształcie litery U (Corning, Cambridge, MA) w pożywce RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wzbogaconej 2,05 ml L-glutaminy, 1% penicyliną/streptomycyną oraz 10% inaktywowaną termicznie FBS, przez 96 godzin w 37°C. Dodawano także różne peptydy Λβ, Λβ1-16, Λβ1-40, Λβ1-42 lub o odwrotnej sekwencji aminokwasowej Λβ40-1, w dawkach wynoszących od 5 μM do 0,18 μM w czterech etapach. Komórki w studzienkach kontrolnych hodowano z konkanawaliną A (Con A) (Sigma, nr katalogowy C-5275, w stężeniu 1 μg/ml) bez dodawania białka. Do komórek na ostatnie 24 godziny dodano ³H-tymidynę (1 μCi/studzienkę uzyskanej z Amersham Corp., Arlington Heights IL). Następnie komórki zebrano na płytki UniFilter i zmierzono radioaktywność licznikiem Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Wyniki wyrażono jako impulsy na minutę (cpm) radioaktywności włączonej do nierozpuszczalnych makrocząsteczek.

4. Preparowanie tkanek mózgowych

Po uśmierceniu zwierząt mózgi usunięto i jedną półkulę przygotowano do analizy immunohistochemicznej, a z drugiej półkuli wypreparowano 3 regiony mózgu (hipokamp, korę i móżdżek) i zastosowano do zmierzenia stężeń różnych białek Λβ i postaci APP metodą specyficznych testów ELISA (Johnson-Wood i inni, jak wyżej).

Tkanki przeznaczone do testów ELISA zhomogenizowano w 10 objętościach lodowatego buforu guanidynowego (5,0 M guanidyna-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenaty zmieszano przez delikatne wstrząsanie w aparacie Adams Nutator (Fisher) przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej i przechowywano w -20°C przed oznaczeniem Λβ i APP. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że preparaty analityczne były stabilne w tych warunkach przechowywania, oraz że syntetyczne białko Λβ (Bachem) można ilościowo odzyskać po wkłuciu homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej z miotów mysich (Johnson-Wood i inni, jak wyżej).

5. Pomiar poziomów Λβ

Homogenaty mózgu rozcieńczono w stosunku 1:10 lodowatym Casein Diluent (0,25% kazeina, PBS, 0,05% azydek sodu, 20 μg/ml aprotyniny, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 μg/ml leupeptyny), a następnie odwirowano przy 16000 x g przez 20 minut w 4°C. Wzorce syntetycznego peptydu Λβ (aminokwasy 1-42) i wzorce APP przygotowano tak, by zawierały 0,5 M guanidynę i 0,1% surowiczą albuminę bydlęcą (BSA) w ostatecznym preparacie. W teście kanapkowym ELISA „całkowitego Λβ stosowano monoklonalne przeciwciała 266, specyficzne dla aminokwasów 13-28 Λβ (Seubert i inni) jako przeciwciało wychwytujące oraz biotynylowane przeciwciała monoklonalne 3D6, specyficzne dla aminokwasów 1-5 Λβ (Johnson-Wood i inni) jako przeciwciało reporterowe. Przeciwciało monoklonalne 3D6 nie rozpoznaje wydzielanej APP ani pełnej długości APP, ale wykrywa tylko Λβ z N-końcowym kwasem asparaginowym. Test ten ma niższą granicę czułości ~50 ng/ml (11 nM) i nie wykazuje reaktywności krzyżowej z endogennym mysim białkiem Λβ w stężeniach do 1 ng/ml (Johnson-Wood i inni, jak wyżej).

W specyficznym dla Λβ1-42 teście ELISA stosuje się mΛβ 21F12, specyficzne dla aminokwasów 33-42 Λβ (Johnson-Wood i inni) jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane mA 3D6 jest także przeciwciałem reporterowym w tym teście, który ma niższą granicę czułości, wynoszącą około 125 μg/ml (28 μM, Johnson-Wood i inni). Do testów Λβ ELISA studzienki 96-studzienkowych płytek do immunotestów (Costar) powlekano 100 μl mΛβ 266 (w stężeniu 10 μg/ml) lub mΛβ 21F12 (w stężeniu 5 μg/ml) z inkubowaniem przez noc w RT. Roztwór usunięto przez odessanie i studzienki zablokowano przez dodanie 200 μl 0,25% surowiczej albuminy ludzkiej w buforze PBS na co najmniej 1 godzinę w RT. Roztwór blokujący usunięto i płytki przechowywano wysuszone w 4°C do czasu zastosowania. Płytki przed użyciem nawodniono buforem Wash Buffer [sól buforowana Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05% Tween 20]. Próbki i wzorce dodano w trzech powtórzeniach równych części po 100 μl na studzienkę, a następnie inkubowano przez noc w 4°C. Płytki przemywano co najmniej 3-krotnie buforem Wash Buffer pomiędzy każdym z etapów testu. Dodano biotyPL 202 217 B1 nylowane mAe 3D6, rozcieńczone do 0,5 μΙ/ml w buforze Casein Assay Buffer (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w RT. Koniugat awidynaperoksydaza chrzanowa (Avidin-HRP uzyskana z Vector, Burlingame, CA) rozcieńczony 1:4000 w Casein Assay Buffer dodano na 1 godzinę w TP. Dodano kolorymetryczny substrat, Slow TMBELISA (Pierce) i pozostawiono do reakcji przez 15 minut w RT, po czym reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 25 μΙ 2N H₂SO₄. Produkt reakcji oznaczono stosując Molecular Devices Vmax mierzący różnicę absorpcji przy 450 nm i 650 nm.

6. Pomiar poziomów APP

Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, nazwany APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (α), jak i postacie APP pełnej długości (FL). Drugi test rozpoznaje tylko APP-α. Test APP-a/FL rozpoznaje wydzielaną postać APP włącznie z pierwszymi 12 aminokwasami Ae. Ponieważ przeciwciało reporterowe (2H3) nie jest specyficzne dla miejsca α-klamerki, występującego pomiędzy 612-613 aminokwasem APP695 (Esch i inni, Science 248, 1122-1124 (1990)), test ten rozpoznaje również pełne długości APP (APP-FL). Wstępne doświadczenia z immobilizowanymi przeciwciałami APP przeciw cytoplastycznemu ogonowi APP-FL, w celu usunięcia APP-FL z homogenatów mózgowych zasugerowały, że około 30-40% APP-a/FL APP jest FL (dane nie prezentowane). Przeciwciałem wychwytującym w obu testach APP-a/FL i APP-a jest mAe 8E5 wytworzone przeciw aminokwasom 444 do 592 postacie APP695 (Games i in., jak wyżej). Reporterowym mAe dla testu APP-a/FL jest mAe 2H3, specyficzne dla aminokwasów 597-608 APP695 (Johnson-Wood i inni, jak wyżej), a przeciwciałem reporterowym dla testu APP-α jest biotynylowana pochodna mAe 16H9, wytworzona przeciw aminokwasom 605 do 611 APP. Niższa granica czułości testu APP-a/FL wynosi 11 ng/ml (150 ρΜ) (Johnson-Wood i inni), a testu specyficznego dla APP-a wynosi 22 ng/ml (0,3 nM). Dla obydwu testów APP studzienki 96-studzienkowych płytek EIA powlekano mAe 8E5, jak opisano powyżej dla mAe 266. Oczyszczone, zrekombinowane wydzielane APP-a zastosowano jako wzorzec do testu APP-a i testu APP-a/FL (Esch i in., jak wyżej). Próbki homogenatu mózgu w 5 M guanidynie rozcieńczono 1:10 w ELISA Specimen Diluent (0,014 M bufor fosforanowy, pH 7,4, 0,6% surowicza albumina bydlęca, 0,05% tymerozal, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Następnie rozcieńczono je w stosunku 1:4 w Specimen Diluent zawierającym 0,5 M guanidynę. Rozcieńczone homogenaty następnie odwirowano przy 16000 x g przez 15 sekund w RT. Wzorce APP i próbki dodano do płytek w dwóch powtórzeniach tych samych ilości i inkubowano przez 1,5 godziny w RT. Biotynylowane przeciwciała reporterowe 2H3 i 16H9 inkubowano z próbkami przez 1 godzinę w RT. Streptawidynę-alkaliczną fosfatazę (Boehringer Mannheim) rozcieńczoną 1:1000 w Specimen Diluent inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano fluorescencyjnego substratu, fosforanu 4-metylo-umbeliferylu i inkubowano 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie płytki odczytano w fluorymetrze Cytofluor tm 2350 (Millipore) przy 365 nm pobudzenia i 450 nm emisji.

7. Immunohistochemia

Mózgi utrwalano przez 3 dni w 4°C w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie przechowywano 1-7 dni w 4°C w 1% paraformaldehydzie, PBS przed pocięciem na skrawki. Wieńcowe skrawki histologiczne o grubości 40 mikronów cięto na wibratomie w RT i przechowywano w buforze chroniącym przed zamarznięciem (30% gliceryna, 30% glikol etylenowy w buforze fosforanowym) w -20°C przed obróbką immunohistochemiczną. Dla każdego mózgu 6 fragmentów na poziomie hipokampu grzbietowego, każdy oddzielony kolejnymi przerwami 240 um, inkubowano przez noc z jednym z następujących przeciwciał: (1) biotynylowanym przeciw-Ae (mAe, 3D6, specyficznym dla ludzkiego Ae) rozcieńczonym do stężenia 2 ug/ml w PBS i 1% surowicy końskiej ; lub (2) biotynylowanym mAe, specyficznym dla ludzkiego APP, 8E5, rozcieńczonym do stężenia 3 ug/ml w PBS i 1,0% surowicy końskiej; lub (3) mAe specyficznym dla glejowego włókienkowego białka kwasowego (GFAP; Sigma Chemical Co.) rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 0,25% Triton X-100 i 1% surowicy końskiej w soli buforowanej Tris, pH 7,4 (TBS); lub (4) mAe specyficznym dla CD11b, antygenu MAC-1, (Chemicon International) rozcieńczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (5) mAe specyficznym dla antygenu MHC II, (Pharmigen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (6) szczurzym mAe specyficznym dla CD 43, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (7) szczurzym mAe specyficznym dla CD 45RA, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (8) szczurzym monoklonalnym Ae specyficznym dla CD 45RB, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (9) szczurzym monoklonalnym Ae specyficznym dla CD 45, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy

PL 202 217 B1 w PBS; lub (10) biotynylowanym chomiczym poliklonalnym Ae specyficznym dla CD3e, (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (11) szczurzym mAe specyficznym dla CD3, (Serotec) rozcieńczonym w stosunku 1:200 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub z (12) roztworem PBS nie zawierającym pierwotnych przeciwciał, zawierającym 1% normalną surowicę końską.

Skrawki histologiczne poddane działaniu roztworów przeciwciał wymienionych w 1, 2 i 6-12 powyżej wcześniej traktowano roztworem 1,0% Triton X-100, 0,4% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 minut w RT aby zablokować endogenne peroksydazy. Następnie inkubowano je przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwciałami. Skrawki poddane działaniu 3D6 lub 8E5 lub CD3e mAe następnie poddano przez 1 godzinę w RT reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze składnikami zestawu „A i „B rozcieńczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Skrawki poddane działaniu przeciwciał specyficznych dla CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i roztworem PBS pozbawionym pierwotnych przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT odpowiednio z biotynylowanymi przeciwciałami przeciw-szczurzym IgG (Vector) rozcieńczonymi w stosunku 1:75 w PBS lub biotynylowanymi przeciwciałami przeciw-mysim IgG (Vector) rozcieńczonymi w stosunku 1:75 w PBS. Następnie skrawki przez 1 godzinę w RT poddano reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze składnikami zestawu „A i „B rozcieńczonymi w stosunku 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).

Skrawki wywołano w 0,01% nadtlenku wodoru, 0,05% 3,3'-diaminobenzydynie (DAB) w RT. Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwciałami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wcześniej traktowano 0,6% nadtlenkiem wodoru w RT aby zablokować endogenne peroksydazy, a następnie inkubowano przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwciałami. Skrawki poddane działaniu przeciwciała GFAP inkubowano 1 godzinę w RT z biotynylowanymi przeciwciałami przeciw mysiej IgG, wytworzonymi u koni (Vector Laboratories; zestaw Vectastain Elite ABC Kit) rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w TBS. Następnie skrawki inkubowano przez 1 godzinę z kompleksem peroksydaza-awidynabiotyna (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami specyficznymi dla MAC-1 i MHC II jako pierwotnymi przeciwciałami kolejno poddano reakcji przez 1 godzinę w RT z biotynylowanymi przeciwciałami przeciwszczurzym IgG wytworzonymi w królikach, rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w TBS, następnie inkubowane przez 1 godzinę z kompleksem peroksydaza-awidyna-biotyna rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wywołano inkubując je w RT z 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu, TBS odpowiednio przez 4 i 11 minut.

Wyznakowane immunologicznie skrawki umieszczono na szklanych szkiełkach przedmiotowych (VWR, Superfrost slides), wysuszono na powietrzu przez noc, zanurzono w Propar (Anatech) i nałożono na nie szkiełka nakrywkowe stosując Permount (Fisher) jako środek osadzający.

Aby przeciwnie wybarwić płytki Ae podzestaw GFAP-dodatnich skrawków umieszczono na szkiełkach przedmiotowych Superfrost i inkubowano w wodnej 1% Thioflavin S (Sigma) przez 7 minut po obróbce immunohistochemicznej. Następnie skrawki odwodniono i oczyszczono w Propar, po czym nałożono na nie szkiełka nakrywkowe osadzając je z użyciem Permount.

8. Analiza obrazu

Do oceny ilościowej immunoreaktywnych skrawków zastosowano Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) sprzężony z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę wideo CCD i monitor Sony Trinitron. Obraz skrawków był przechowywany w buforze wideo i oznaczono próg koloru i nasycenia aby wybrać i policzyć całkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie struktury. Dla każdego skrawka hipokamp obrysowano ręcznie i obliczono całkowity obszar pikseli zajmowany przez hipokamp. Procent obciążenia amyloidem zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawierająca złogi Ae immunoreaktywne z mAe 3D6) x 100. Podobnie procent obciążenia neurytycznego zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawierająca dystroficzne neuryty reagujące z monoklonalnymi przeciwciałami 8E5) x 100. C-Imaging System (Comprix, Inc., Cranberry Township, PA) wykorzystujący program Simple 32 Software Application połączono z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę Optronics i zastosowano do ilościowej oceny procentu kory poza płatem ciała modzelowatego zajętej przez GFAP-dodatnie astrocyty i MAC-1i MHC II-dodatni mikroglej. Obraz immunoreaktywnych skrawków przechowywano w buforze wideo i wyznaczono próg monochromatyczny, aby wybrać i policzyć całkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie komórki. Dla każdego skrawka korę poza płatem ciała modzelowatego (RSC) ręcznie obrysowano i obliczono całkowity obszar pikseli zajmowany przez RSC. ProPL 202 217 B1 cent astrocytozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSC zajmowana przez GFAP-reaktywne astrocyty) x 100. Podobnie procent mikroglejozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSC zajmowana przez mikroglej reaktywny z MAC-1 i MHC II) x 100. Do wszystkich analiz obrazu 6 skrawków na poziomie hipokampu grzbietowego, każdy oddzielony kolejnymi 240 pm przerwami, oznaczono ilościowo dla każdego zwierzęcia. We wszystkich przypadkach status leczniczy zwierząt nie był znany obserwatorowi.

XIV: Test przesiewowy ex vivo aktywności przeciwciała przeciw złogom amyloidowym

Opracowano test ex vivo w którym pierwotne komórki mikrogleju były hodowane z nieutrwalonymi kriostatowymi skrawkami mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD, w celu stwierdzenia wpływu przeciwciał na usuwanie płytek. Komórki mikrogleju uzyskano z kor mózgowych noworodków myszy DBA/2N (1-3 dniowych). Kory mechanicznie rozdzielono w HBSS (balansowanym solnym roztworze płynu Hanksa, Sigma) z 50 pg/ml DNazy I (Sigma). Rozdzielone komórki przefiltrowano przez 100 pm filtr do komórek (Falcon) i odwirowano przy 1000 obrotów na minutę przez 5 minut. Osad zawieszono w pożywce hodowlanej (wysokoglukozowy DMEM, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) i komórki wysiano w ilości 2 mózgi na kolbę hodowlaną z tworzywa sztucznego T-75. Po 7-9 dniach kolby obracano w wytrząsarce obrotowej przy 200 obrotach na minutę przez 2 godziny w 37°C. Zawiesinę komórek odwirowano przy 1000 obrotów na minutę i zawieszono w pożywce do testów.

Kriostatowe skrawki 10 pm mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD (przerwa po śmierci < 3 godziny) zostały roztopione i osadzone na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych powlekanych polilizyną i umieszczone w studzienkach 24-studzienkowych płytek do hodowli tkankowych. Szkiełka nakrywkowe dwukrotnie przemyto pożywką do testów zawierającą H-SFM (Hybrydoma-pożywka wolna od surowicy, Gibco BRL) z 1% FBS, glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Dodano przeciwciała kontrolne i przeciw Άβ w stężeniu 2x (końcowe 5 pg/ml) na 1 godzinę. Następnie komórki mikrogleju wysiano w gęstości 0,8 x 10⁶ komórek/ml pożywki do testów. Hodowle utrzymywano w nawilżanym inkubatorze (37°C, 5% CO2) przez 24 godziny lub dłużej. Na koniec inkubacji hodowle utrwalono 4% paraformaldehydem i uczyniono przepuszczalnymi przy pomocy 0,1% Triton-X100. Skrawki wybarwiono biotynylowanym 3D6, a następnie koniugatem streptawidyna/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Egzogenne komórki mikrogleju uwidoczniono przez wybarwienie jąder (DAPI). Hodowle obserwowano w mikroskopie z odwróconą fluorescencją (Nikon, TE300) i wykonano fotomikrografie przy użyciu aparatu cyfrowego SPOT stosując oprogramowanie SPOT (Diagnostic instruments). Do analizy techniką Western blot hodowle ekstrahowano w 8M moczniku, rozcieńczono 1:1 w redukującym buforze trycynowym do próbek i naniesiono na 16% żel trycynowy (Novex). Po transferze na immobilon bloty poddano działaniu 5 pg/ml pabAe42, a następnie przeciwmysich przeciwciał sprzężonych z HRP i wywoływano przy pomocy ECL (Amersham).

Gdy test wykonywano na skrawkach mózgów PDAPP w obecności przeciwciała 16C11 (jednego z przeciwciał przeciw Ae, które nie było skuteczne in vivo), płytki β-amyloidu pozostały nienaruszone i nie obserwowano fagocytozy. W odróżnieniu od tego, gdy przyległe skrawki hodowano w obecności 10D5 złogi amyloidowe w dużej mierze zniknęły i komórki mikrogleju wykazywały liczne pęcherzyki fagocytarne zawierające Ae. Takie same wyniki uzyskano ze skrawkami mózgów AD; 10D5 indukowały fagocytozę płytek AD, a 16C11 były nieskuteczne. Ponadto test dostarczał porównywalnych wyników gdy wykonywano go z mysimi lub ludzkimi komórkami mikrogleju oraz z przeciwciałami przeciw Ae mysimi, króliczymi lub naczelnych.

Tabela 16 przedstawia wyniki uzyskane z kilkoma przeciwciałami przeciw Ae i porównuje ich zdolności do wywoływania fagocytozy w teście ex vivo i w zmniejszaniu in vivo obciążenia płytkami w badaniach biernego przenoszenia. Pomimo, że 16C11 i 21F12 wiązały się z syntetycznym zagregowanym peptydem Ae z dużą zachłannością, przeciwciała te nie były w stanie reagować z płytkami e-amyloidowymi w nieutrwalonych skrawkach mózgu, nie potrafiły wywołać fagocytozy w teście ex vivo i nie były skuteczne in vivo. 10D5, 3D6 poliklonalne przeciwciała przeciw Ae były aktywne we wszystkich trzech pomiarach. Przeciwciało 22C8 wiązało się silniej z analogiem naturalnego Ae, w którym kwasy asparaginowe w pozycjach 1 i 7 zastąpiono kwasami izoaspartanowymi. Wyniki te pokazują, że skuteczność in vivo wynika z bezpośredniego, kierowanego przez przeciwciała, usuwania płytek z OUN oraz, że test ex vivo potrafi przewidzieć skuteczność in vivo.

Ten sam test zastosowano w celu zbadania usuwania przez przeciwciała przeciw fragmentowi synukleiny, nazywanemu NAC. Wykazano, że synukleina jest białkiem związanym z płytkami amyloidowymi. Przeciwciałami przeciw NAC traktowano próbkę tkanki mózgowej zawierającej płytki amyloidowe, komórki miklogleju, jak opisano wcześniej. Jako kontrolę zastosowano surowicę królika. Wyko64

PL 202 217 B1 nany później monitoring wykazał znaczne obniżenie liczby i rozmiaru płytek, co wskazywało na aktywność usuwania przez przeciwciała.

T a b e l a 16: Test ex vivo do przewidywania skuteczności in vivo

Przeciwciało	Izotyp	Zachłanność względem zagregowanego Ae (pM)	Wiązanie z płytkami e-amyloidowymi	Skuteczność ex vivo	Skuteczność in vivo
Monoklonalne
3D6	IgG2b	470	+	+	+
10D5	IgG1	43	+	+	+
16C11	IgG1	90	-	-	-
21F12	IgG2a	500	-	-	-
TM2a	IgG1	-	-	-	-
poliklonalne
1-42	mieszane	600	+	+	+

Do potwierdzenia, że Ae został pochłonięty podczas trwania testu ex vivo zastosowano mikroskopię konfokalną. W obecności kontrolnych przeciwciał egzogenne komórki mikrogleju pozostawały w płaszczyźnie konfokalnej powyżej tkanki i nie obserwowano pęcherzyków fagocytarnych zawierających Ae, a płytki w skrawku pozostawały nienaruszone. W obecności 10D5 prawie cały materiał płytkowy był zawarty w pęcherzykach egzogennych komórek mikrogleju. Aby wyznaczyć rozpad pochłoniętego peptydu hodowle poddane działaniu 10D5 ekstrahowano 8M mocznikiem w różnych punktach czasowych i badano przy pomocy analizy typu Western blot. W punkcie czasowym 1 godziny, gdy jeszcze nie zaczęła zachodzić fagocytoza, reakcja z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw Ae ujawniła silny 4 kD prążek (odpowiadający peptydowi Ae). Immunoreaktywność względem Ae obniżyła się po jednym dniu i zanikła po trzech dniach. Zatem kierowana przez przeciwciała fagocytoza Ae prowadzi do jego degradacji.

Aby wyznaczyć czy fagocytoza w teście ex vivo była kierowana przez Fc, przygotowano fragmenty F(ab')2 przeciwciał 3D6 przeciw Ae. Pomimo, że fragmenty F(ab')2 zachowały swoją pełną zdolność do reagowania z płytkami nie potrafiły one wywołać fagocytozy przez komórki mikrogleju. Ponadto fagocytoza wywoływana przez całe przeciwciała mogła być zablokowana przez przeciwciało przeciw mysim receptorom Fc (przeciw-CD 16/32). Dane te wskazują, że usuwanie Ae in vivo zachodzi przez fagocytozę kierowaną przez receptor Fc.

XV: Przechodzenie przeciwciał przez barierę krew-mózg

Badania tutaj opisane wykonano, aby dostarczyć informacji na temat zdolności przeciwciał do przechodzenia do mózgu po dożylnym podaniu i w celu dostarczenia środków do mierzenia stężenia przeciwciał dostarczanych do mózgu po podaniu dożylnym do tkanki obwodowej myszy normalnych lub PDAPP. Takie pomiary znajdują zastosowanie w przewidywaniu i wyznaczaniu skutecznych dawek.

Myszy PDAPP lub normalne kontrolne perfundowano 0,9% NaCl. Regiony mózgu (hipokamp i korę) wypreparowano i zamrożono szokowo. Mózgi zhomogenizowano w 0,1% tritonie + inhibitory proteaz. Immunoglobuliny wykrywano w ekstraktach przy pomocy ELISA. Fab'2 kozimi przeciw mysim IgG powleczono płytki RIA jako czynnikiem wychwytującym. Surowice lub ekstrakty mózgów inkubowano przez 1 godzinę. Izotypy wykrywano przeciw mysim IgG1-HRP lub IgG2a-HRP lub IgG2b-HRP (Caltag). Przeciwciała, bez względu na izotyp, były obecne w OUN w stężeniach wynoszących 1:1000 stężeń we krwi. Tak np. gdy we krwi stężenie IgG1 było 3-krotnie wyższe od stężenia IgG2a, było ono także 3-krotnie wyższe od stężenia IgG2a w mózgu, a oba z nich były obecne w ilości 0,1% ich poziomów we krwi. Ten wynik obserwowano zarówno u myszy transgenicznych, jak i nietransgenicznych, zatem myszy PDAPP nie posiadają wyjątkowo przepuszczalnej bariery krew-mózg.

Claims (65)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera środek skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu u pacjenta oraz farmaceutyczną zaróbPL 202 217 B1 kę, przy czym składnik amyloidu pochodzi z włókienkowego białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i proteolitycznymi peptydami.

2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że składnikiem amyloidu jest peptyd włókienkowy lub białko włókienkowe.

3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera środek wywołujący odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko neoepitopowi utworzonemu przez białko włókienkowe lub peptyd włókienkowy, w odniesieniu do włókienkowego białka prekursorowego.

4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera środek wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera środek skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko co najmniej dwóm różnym składnikom amyloidu.

7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że jako środek zawiera peptyd połączony z białkiem nośnikowym.

8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6 albo 7, znamienna tym, że zawiera adiuwant.

9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera adiuwant wybrany z grupy obejmującej QS21, monofosforylowany lipid, ałun i adiuwant Freunda.

10. Zastosowanie środka skutecznego w wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko składnikowi amyloidu charakterystycznemu dla zaburzenia cechującego się odkładaniem amyloidu u osobnika będącego ssakiem do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zaburzenia cechującego się odkładaniem amyloidu, przy czym odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciwko składnikowi włókienkowemu pochodzącemu z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym składnikiem amyloidu jest peptyd włókienkowy lub białko włókienkowe.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym środek wzbudza odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko neoepitopowi utworzonemu przez składnik amyloidu, w odniesieniu do białka prekursorowego.

13. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym środek jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

15. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym środek jest skuteczny w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko co najmniej dwóm różnym składnikom amyloidu.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym lek zawiera co najmniej dwa składniki amyloidu.

17. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym środek stanowi peptyd połączony z białkiem nośnikowym.

18. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16 albo 17, w którym lek zawiera ponadto adiuwant.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, w którym adiuwant jest wybrany z grupy obejmującej QS21, monofosforylowany lipid, ałun i adiuwant Freunda.

20. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym odpowiedź immunologiczna charakteryzuje się mianem w surowicy wynoszącym co najmniej 1:1000 w odniesieniu do składnika amyloidu.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym miano w surowicy wynosi co najmniej 1:5000 w odniesieniu do składnika włókienkowego.

PL 202 217 B1

22. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym odpowiedź immunologiczna charakteryzuje się poziomem immunoreaktywności w surowicy odpowiadającym poziomowi wyższemu co najmniej około cztery razy od poziomu immunoreaktywności w surowicy, zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, w którym poziom immunoreaktywności w surowicy jest mierzony w surowicy przy rozcieńczeniu około 1:100.

24. Zastosowanie przeciwciała specyficznie wiążącego się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym składnikiem amyloidu jest składnik włókienkowy.

26. Zastosowanie według zastrz. 25, w którym przeciwciało wiąże się z epitopem składnika włókienkowego.

27. Zastosowanie według zastrz. 26, w którym przeciwciało specyficznie wiąże się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążąc się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

28. Zastosowanie według zastrz. 25, w którym przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

29. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

30. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym przeciwciała wiążą się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

31. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym skuteczna dawka tego leku charakteryzuje się u pacjenta poziomem immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

32. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym przeciwciało jest połączone z nośnikiem.

33. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym lek jest w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.

34. Kompozycja farmaceutyczna do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, znamienna tym, że zawiera skuteczną dawkę przeciwciała, które specyficznie wiąże się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu α, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę β2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że składnikiem amyloidu jest składnik włókienkowy.

36. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 35, znamienna tym, że zawiera przeciwciało wiążące się z epitopem składnika włókienkowego.

37. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36, znamienna tym, że zawiera przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

38. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36, znamienna tym, że zawiera przeciwciało będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 35, znamienna tym, że włókienkowy składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal, AIAPP i fragment NAC synukleiny.

40. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że zawiera przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włokienkowymi składnikami amyloidu.

PL 202 217 B1

41. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że skuteczną dawkę stanowi ilość przeciwciała, skuteczna w wytworzeniu u pacjenta poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

42. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że zawiera nośnik.

43. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że jest sformułowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, podskórnego, domięśniowego, donosowego, domiejscowego lub dożylnego.

44. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że jest sformułowana jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.

45. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała specyficznie wiążących się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu a, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę e2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

46. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym składnikiem amyloidu jest składnik włókienkowy.

47. Zastosowanie według zastrz. 46, w którym przeciwciało lub fragment przeciwciała wiąże się z epitopem składnika włókienkowego.

48. Zastosowanie według zastrz. 47, w którym przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiąże się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążąc się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

49. Zastosowanie według zastrz. 46, w którym przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

50. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal i AIAPP.

51. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym przeciwciała wiążą się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

52. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym skuteczna dawka leku charakteryzuje się u pacjenta poziomem immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

53. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym przeciwciało lub fragment przeciwciała jest połączony z nośnikiem.

54. Zastosowanie według zastrz. 45, w którym lek jest w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.

55. Kompozycja farmaceutyczna do profilaktyki lub leczenia choroby charakteryzującej się złogami amyloidowymi u pacjenta, znamienna tym, że zawiera skuteczną dawkę przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, które specyficznie wiążą się ze składnikiem amyloidu obecnym w złogu amyloidowym, przy czym składnik amyloidu pochodzi z białka prekursorowego wybranego z grupy obejmującej białka lub peptydy obejmujące surowicze białko amyloidu A (ApoSSA), ciężki łańcuch immunoglobuliny, ApoAI, transtyretynę, lizozym, łańcuch fibrogenu a, gelsolinę, cystatynę C, mikroglobulinę e2, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, keratynę, wysepkowy polipeptyd amyloidu, hormon peptydowy i synukleinę; włącznie z ich zmutowanymi białkami, fragmentami białek i peptydami.

56. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że składnikiem amyloidu jest składnik włókienkowy.

57. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 56, znamienna tym, że zawiera przeciwciało wiążące się z epitopem składnika włókienkowego.

58. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 57, znamienna tym, że zawiera przeciwciało specyficznie wiążące się ze składnikiem włókienkowym, nie wiążące się z prekursorem tego składnika włókienkowego.

PL 202 217 B1

59. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 58, znamienna tym, że zawiera przeciwciało będące ludzkim przeciwciałem przeciwko składnikowi włókienkowemu, przy czym ludzkie przeciwciało jest wypreparowane z komórek B od człowieka immunizowanego epitopem składnika włókienkowego.

60. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 56, znamienna tym, że włókienkowy składnik amyloidu jest wybrany z grupy obejmującej AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, AB2M, Acal i AIAPP.

61. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że zawiera przeciwciała lub fragmenty przeciwciała wiążące się z co najmniej dwoma włókienkowymi składnikami amyloidu.

62. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że skuteczną dawkę stanowi ilość przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, skuteczna w wytworzeniu u pacjenta poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy, który jest co najmniej cztery razy wyższy od poziomu immunoreaktywności przeciwko składnikowi amyloidu w surowicy zmierzonego w kontrolnej próbce surowicy pobranej przed leczeniem.

63. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że zawiera nośnik.

64. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że jest sformułowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, podskórnego, domięśniowego, donosowego, domiejscowego lub dożylnego.

65. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że jest sformułowana jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.