PL200458B1 - Kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało i zastosowanie środka immunogennego - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało i zastosowanie środka immunogennego

Info

Publication number
PL200458B1
PL200458B1 PL357182A PL35718200A PL200458B1 PL 200458 B1 PL200458 B1 PL 200458B1 PL 357182 A PL357182 A PL 357182A PL 35718200 A PL35718200 A PL 35718200A PL 200458 B1 PL200458 B1 PL 200458B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
pharmaceutical composition
human
residues
peptide
Prior art date
Application number
PL357182A
Other languages
English (en)
Other versions
PL357182A1 (pl
Inventor
Dale B. Schenk
Frederique Bard
Nicki J. Vasquez
Ted Yednock
Original Assignee
Elan Pharma Int Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23254226&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL200458(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Elan Pharma Int Ltd filed Critical Elan Pharma Int Ltd
Publication of PL357182A1 publication Critical patent/PL357182A1/pl
Publication of PL200458B1 publication Critical patent/PL200458B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Wynalazek dostarcza ulepszonych czynników do leczenia i sposoby leczenia chorób zwi aza- nych z amyloidowymi z logami A ß w mózgu pacjenta. Sposoby takie wymagaj a podawania czynników, które indukuj a korzystn a odpowied z immunogenn a skierowan a przeciw z logom amyloidu. Sposoby te s a u zyteczne w profilaktycznym i terapeutycznym leczeniu choroby Alzheimera. Korzystne czynniki obejmuj a odcinki N-ko ncowe A ß i wiaz ace si e z nimi przeciwcia la. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, w tym chimeryczne przeciwciało ludzkie lub humanizowane oraz zastosowanie środka immunogennego.
Powołanie związanych zgłoszeń
Zgłoszenie to jest kontynuacją w części zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 09/322289, złożonego 28 maja 1999 r., które w całości włączono do niniejszego opisu dla wszelkich celów.
Dziedzina techniki
Wynalazek dotyczy zakresów technicznych immunologii i medycyny.
Tło wynalazku
Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą, której wynikiem jest otępienie starcze, patrz ogólnie Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy i in., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Heurol. 53, 438-447 (1994); Duff i in., Nature 373, 476-477 (1995); Games i in., Nature 373, 523 (1995). Mówiąc szerzej, choroba dzieli się na dwie kategorie: późno zaczynającą się, która występuje w póź nym wieku (65 i wię cej lat) oraz wcześ nie zaczynają c ą się , która rozwija się na dł ugo przed okresem starości, tj. pomiędzy 35 a 60 rokiem. W obu typach choroby patologia jest taka sama, ale w przypadkach zaczynają cych się we wcześ niejszym wieku istnieje tendencja do cięższych i bardziej rozległych nieprawidłowości. Choroba charakteryzuje się co najmniej dwoma typami uszkodzeń w mózgu, płytkami starczymi i splotami neurofibrylarnymi. Płytki starcze są obszarami zdezorganizowanych sieci włókien nerwowych o szerokości do 150 μm z zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidu w środku, widocznymi podczas mikroskopowej analizy skrawków tkanki mózgowej. Sploty neurofibrylarne są wewnątrzkomórkowymi złogami towarzyszącego mikrotubulom białka tau, składającymi się z dwóch filamentów parami splecionych wokół siebie wzajemnie.
Zasadniczym składnikiem płytek jest peptyd nazwany Ae lub peptydem β-amyloidu. Peptyd Ae jest wewnętrznym fragmentem, o długości 39-43 aminokwasów, białka prekursorowego, nazwanego białkiem prekursorowym amyloidu (APP). Kilka mutacji w białku APP skorelowano z występowaniem choroby Alzheimera, patrz, np. Goate i in., Nature 349, 704 (1991) (walina717 na izoleucynę); Chartier Harlan i in., Nature 353, 844 (1991) (walina717 na glicynę); Murrell i in., Science 254, 97 (1991) (walina717 na fenyloalaninę); Mullan i in., Nature Genet. 1, 345 (1992) (podwójna mutacja zamiany Iizyny595-metioniny596 na asparaginę595-leucynę596). Uważa się, że takie mutacje powodują chorobę Alzheimera dzięki zwiększonemu lub zmienionemu przetwarzaniu APP do Ae, szczególnie przetwarzaniu APP w wyniku czego powstają zwiększone ilości długiej postaci Ae (tj. Ae1-42 i Ae1-43). Sądzi się, że mutacje w innych genach, takich jak geny presenilin, PS1 i PS2, pośrednio wpływają na przetwarzanie APP, prowadząc do tworzenia większych ilości długich postaci Ae (patrz Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Obserwacje te wskazują, że Ae, a szczególnie jego długie postacie, są elementem przyczynowym w chorobie Alzheimera.
McMichael, EP 526511, proponuje podawanie homeopatycznych dawek (mniejszych lub równych 10-2 mg/dzień) Ae pacjentom, u których wstępnie rozpoznano AD. U przeciętnego człowieka, mającego osocze o objętości około 5 litrów, nawet dla górnej granicy tej dawki można oczekiwać osiągnięcia stężenia nie wyższego niż 2 pg/ml. Normalne stężenie Ae w osoczu ludzkim pozostaje zazwyczaj w zakresie 50-200 pg/ml (Seubert i in., Nature 359, 325-327 (1992)). Ponieważ dawkowanie proponowane w EP 526511 zmieniałoby w bardzo małym stopniu poziom endogennego Ae w krążeniu i ponieważ EP 526511 nie zaleca stosowania adiuwanta jako immunostymulatora, uzyskanie jakiejkolwiek korzyści terapeutycznej wydaje się niemożliwe.
W przeciwieństwie do powyższego, niniejszy wynalazek ukierunkowany jest między innymi na leczenie choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych przez podawanie pacjentowi fragmentów Ae lub przeciwciała skierowanego przeciw określonym epitopom w Ae, w warunkach, które spowodują powstanie u pacjenta korzystnej odpowiedzi immunologicznej. Wynalazek zaspokaja zatem od dawna istniejącą potrzebę schematów terapeutycznych do profilaktyki lub łagodzenia neuropatologii i, u niektórych pacjentów, upośledzenia funkcji poznawczych związanych z chorobą Alzheimera.
Zgłoszenie to jest związane z W099/27944, złożonym 30 listopada 1998 r., zgłoszeniem patentowym USA nr seryjny 60/067740 złożonym 2 grudnia 1997 r., zgłoszeniem patentowym USA nr seryjny 60/080970 złożonym 7 kwietnia 1998 r. oraz zgłoszeniem patentowym USA nr seryjny
PL 200 458 B1
09/201430 złożonym 30 listopada 1998 r., z których każdy w całości włączono przez odniesienie do niniejszego opisu dla wszelkich celów.
Streszczenie zastrzeganego wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera środek immunogenny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym środek obejmuje:
(i) chimeryczne, ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ;
(ii) przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1; lub (iii) kwas nukleinowy kodujący (i) lub (ii).
Korzystnie przeciwciało to wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-7 Αβ; reszt 1-6 Αβ; reszt 1-4 Αβ; reszt 1-3 Αβ; reszt 3-6 Αβ; lub reszt 3-7 Αβ.
W korzystnej postaci izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG1 lub ludzka IgG4.
W innej korzystnej postaci izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG2 lub IgG3.
Korzystnie przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem zawierającym wolną resztę N-końcową Αβ lub z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ, gdzie reszta 1 i/lub 7 Αβ jest kwasem izoasparaginowym.
W korzystnej postaci przeciwciało jest przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym.
Korzystnie przeciwciało zawiera dwie kopie tej samej pary łańcuchów lekkiego i ciężkiego lub przeciwciało jest przeciwciałem bispecyficznym zawierającym pierwszą parę łańcucha lekkiego i ciężkiego, która wiąże się specyficznie z epitopem Αβ i drugą parę łańcucha lekkiego i ciężkiego, która wiąże się specyficznie z receptorem Fc na komórkach mikrogleju.
Korzystnie łańcuch przeciwciała jest sprzężony z polipeptydem heterologicznym.
W korzystnej postaci przeciwciało wiąże się specyficznie z peptydem Αβ, nie wiążąc się białkiem prekursorowym amyloidu o pełnej długości (APP).
Kompozycja farmaceutyczna może korzystnie zawierać dodatkowo co najmniej jedno inne przeciwciało wiążące się z innym epitopem Αβ.
W korzystnej postaci farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem do podawania pozajelitowego.
Kompozycja farmaceutyczna jest korzystnie przystosowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, donosowego, podskórnego, domięśniowego, miejscowego lub dożylnego.
Korzystnie kompozycja jest przystosowana do podawania w wielu dawkach w ciągu co najmniej sześciu miesięcy lub jest przystosowana do podawania jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.
W korzystnej postaci kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciało będące ludzkim przeciwciałem wytworzonym z użyciem komórek B pochodzących od człowieka immunizowanego peptydem Αβ.
Kompozycja farmaceutyczna korzystnie służy do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Αβ w mózgu pacjenta.
Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało charakteryzujące się tym, że wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1, do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Αβ w mózgu pacjenta.
Wynalazek dotyczy także chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała, charakteryzującego się tym, że wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ, do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Αβ w mózgu pacjenta.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie środka immunogennego do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby związanej z amyloidowymi złogami u pacjenta, przy czym środek stanowi:
(i) chimeryczne, ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ;
(ii) przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1; lub (iii) kwas nukleinowy kodujący (i) lub (ii).
Korzystnie przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-7 Αβ; reszt 1-6 Αβ; reszt 1-4 Αβ; reszt 1-3 Αβ; reszt 3-6 Αβ; lub reszt 3-7 Αβ.
PL 200 458 B1
W korzystnej postaci po podaniu pacjentowi leku kwas nukleinowy ulega ekspresji u pacjenta z wytworzeniem co najmniej jednego łań cucha przeciwciała w pacjencie.
Korzystniej kwas nukleinowy koduje łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała i po podaniu pacjentowi leku kwas nukleinowy ulega ekspresji u pacjenta z wytworzeniem łańcuchów ciężkiego i lekkiego w pacjencie.
Korzystnym zastosowaniem jest zastosowanie, w którym choroba charakteryzuje się upośledzeniem funkcji poznawczych. W szczególności choroba jest chorobą Alzheimera, zespołem Downa lub łagodnym upośledzeniem funkcji poznawczych.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera środek immunogenny skutecznie indukujący odpowiedź immnunogenną obejmującą przeciwciała skierowane przeciw Αβ u pacjenta, przy czym środek obejmuje:
(i) Ae1-7 o sekwencji aminokwasowej DAEFRHD;
(ii) Ae3-7 o sekwencji aminokwasowej EFRHD; lub (iii) multimer (i) lub (ii).
Korzystnie fragment Ae składa się z Ae1-7 lub Ae3-7. Także korzystnie do fragmentu Ae dodano resztę cysteiny.
W korzystnej postaci fragment Ae jest związany z peptydem nośnikowym, przy czym korzystniej peptyd nośnikowy jest związany z końcem C fragmentu Ae lub z końcem N fragmentu Ae.
Korzystnie peptyd nośnikowy jest peptydem ułatwiającym transport przez tkanki.
W korzystnej postaci peptyd wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciw Ae1-7 lub Ae3-7. Korzystniej peptydem nośnikowym jest: albumina surowicy, hemocyjanina skrzypłocza, cząsteczka immunoglobuliny, tyroglobulina, owoalbumina, toksoid bakterii patogennej, uniwersalny epitop komórki T, cytokina lub chemokina. Jeszcze korzystniej, peptydem nośnikowym jest toksoid tężcowy, toksoid maczugowca błonicy, toksoid E. coli, przecinkowca cholery lub toksoid H. pylori, lub atenuowana pochodna toksyny. Najkorzystniej peptyd nośnikowy obejmuje uniwersalny epitop komórki T, którym jest:
hemaglutynina wirusa grypy: HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT);
PADRE (AKXVAAWTLKAAA);
CS zarodźca malarii: epitop T3 (EKKIAKMEKASSVFNV);
antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B: HBsAg19-28 (FFLLTRILTI); białko szoku cieplnego 65: hsp65153-171 (DQSIGDLIAEAMDKVGNEG); laseczka Calmette-Guerin (QVHFQPLPPAVVKL);
toksoid tężcowy: TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL); toksoid tężcowy: TT947-967 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE); gp120 HIV TI: (KQIINMWQEVGKAMYA).
W korzystnej postaci kompozycji fragment Ae jest związany z peptydem nośnikowym przez sieciowanie chemiczne. Także korzystnie, fragment Ae jest eksprymowany jako białko fuzyjne z peptydem nośnikowym.
Kompozycja farmaceutyczna może korzystnie zawierać ponadto jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych składników. Korzystniej kompozycja zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, a ponadto korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant.
Środek immunogenny może być korzystnie sprzężony z adiuwantem. Korzystniej, adiuwant służy do podawania przed lub po środku immunogennym.
W korzystnej postaci środek immunogenny jest prezentowany przez wirusa lub bakterię.
Kompozycja farmaceutyczna jest korzystnie przystosowana do podawania dawki środka immunogennego wię kszej niż 10 mikrogramów.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie środka immunogennego do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby związanej z amyloidowymi złogami u pacjenta, przy czym środek stanowi:
(i) Ae1-7 o sekwencji aminokwasowej DAEFRHD;
(ii) Ae3-7 o sekwencji aminokwasowej EFRHD; lub (iii) multimer (i) lub (ii).
W korzystnym zastosowaniu choroba charakteryzuje się upośledzeniem funkcji poznawczych, jest chorobą Alzheimera, zespołem Downa lub łagodnym upośledzeniem funkcji poznawczych.
Pewne sposoby leczenia obejmują wiązanie się przeciwciała ze złogami amyloidowymi u pacjenta i indukowanie odpowiedzi polegającej na usuwaniu złogów amy-loidowych. Przykładowo taką odpowiedź usuwania można osiągnąć przez fagocytozę z udziałem receptora Fc.
PL 200 458 B1
Sposoby można stosować zarówno w przypadku pacjentów bezobjawowych, jak i tych aktualnie wykazujących objawy choroby. Przeciwciało stosowane w takich sposobach może być przeciwciałem ludzkim, humanizowanym, chimerycznym lub innym niż ludzkie i może być przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym. W niektórych sposobach przeciwciało przygotowuje się izolując je od człowieka immunizowanego peptydem Αβ, przy czym człowiek ten może być pacjentem, który ma być leczony przeciwciałem.
Przeciwciało można podawać z nośnikiem farmaceutycznym w postaci kompozycji farmaceutycznej. Przeciwciało można podawać w dawce od 0,0001 do 100 mg/kg, korzystnie co najmniej 1 mg przeciwciała/kg wagi ciała, niekiedy w wielu dawkach w ciągu długiego okresu, na przykład co najmniej sześciu miesięcy. Przeciwciało można podawać w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, np. dootrzewnowo, doustnie, podskórnie, doczaszkowo, domięśniowo, miejscowo, donosowo lub dożylnie.
Przeciwciało można podawać poprzez podawanie pacjentowi polinukleotydu kodującego co najmniej jeden łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd ulega u pacjenta ekspresji z wytwarzaniem łańcucha przeciwciała. Ewentualnie, polinukleotyd koduje ciężki i lekki łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji u pacjenta z wytwarzaniem ciężkiego i lekkiego łańcucha. Można monitorować poziom podawanego przeciwciała w jego krwi.
N-końcowy odcinek Ae może być połączony swoim końcem C z polipeptydem heterologicznym. N-końcowy odcinek Ae może być połączony swoim końcem N z polipeptydem heterologicznym. N-końcowy odcinek Ae może być połączony swoimi końcami N i C z pierwszym i drugim polipeptydem heterologicznym. N-końcowy odcinek Ae może też być połączony swoim końcem N z polipeptydem heterologicznym, a końcem C z co najmniej jedną dodatkową kopią odcinka N-końcowego. Polipeptyd może obejmować ponadto co najmniej jedną dodatkową kopię odcinka N-końcowego. Polipeptyd może takżee obejmować, od końca N do C, N-końcowy odcinek Ae, szereg dodatkowych kopii odcinka N-końcowego oraz heterologiczny odcinek aminokwasowy. Niekiedy odcinek N-końcowy składa się z Ae1-7 lub Ae3-7.
Fragment może być pozbawiony co najmniej 5 C-końcowych aminokwasów Ae43 lub może obejmować do 10 sąsiednich aminokwasów z Ae. Fragmenty zazwyczaj podaje się w ilości większej niż 10 mikrogramów na dawkę na pacjenta.
Fragment można podawać z adiuwantem, który wzmacnia odpowiedź immunologiczną na peptyd Ae. Adiuwant i fragment można podawać w dowolnej kolejności lub łącznie w postaci kompozycji. Adiuwantem może być np. wodorotlenek glinowy, fosforan glinowy, MPL™, QS-21 (Stimulon™) lub niekompletny adiuwant Freunda.
Przeciwciała można przeszukiwać pod kątem aktywności w leczeniu choroby związanej ze złogami Ae w mózgu pacjenta (np. choroby Alzheimera). Wymaga to kontaktowania przeciwciała z polipeptydem obejmującym co najmniej pięć sąsiednich aminokwasów N-końcowego odcinka Ae, rozpoczynającego się pomiędzy 1 a 3 resztą Ae, przy czym polipeptyd jest pozbawiony C-końcowego odcinka Ae. Następnie określa się, czy przeciwciało specyficznie wiąże się z polipeptydem, gdzie specyficzne wiązanie dostarcza wskazówki, że przeciwciało wykazuje aktywność w leczeniu choroby.
Przeciwciała można także przeszukiwać pod kątem aktywności usuwania jednostki biologicznej związanej z antygenem. Wymaga to łączenia jednostki biologicznej związanej z antygenem, przeciwciała oraz komórek fagocytarnych mających receptory Fc w podłożu. Następnie monitoruje się ilość jednostki biologicznej związanej z antygenem pozostającej w podłożu. Zmniejszenie ilości jednostki biologicznej związanej z antygenem wskazuje, że przeciwciało wykazuje aktywność usuwania wobec jednostki biologicznej związanej z antygenem. Antygen można dostarczyć jako próbkę tkanki lub w postaci wyizolowanej. Przykładowo antygen można dostarczyć jako próbkę tkanki z mózgu pacjenta z chorobą Alzheimera lub ssaka mającego zmiany patologiczne związane z chorobą Alzheimera. Inne próbki tkanek, wobec których można testować przeciwciała pod kątem aktywności usuwania, obejmują próbki tkanek rakowych, próbki tkanek zainfekowanych wirusami, próbki tkanek zawierające komórki zapalne, próbki niezłośliwe wykazujące nienormalny rozrost komórek lub próbki tkanek zawierające nienormalną macierz zewnątrzkomórkową.
Możliwe jest także wykrywanie złogów amyloidalnych u pacjenta. Wymaga to podawania pacjentowi przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-10 Ae oraz wykrywania obecności przeciwciała w mózgu pacjenta. Przeciwciało może wiązać się z epitopem w obrębie reszt 4-10 Ae. Może ono być znakowane znacznikiem paramagnetycznym i wykrywa się je przez tomografię jądrowego rezonansu magnetycznego.
PL 200 458 B1
Możliwe jest stosowanie zestawu diagnostycznego zawierającego przeciwciało, które specyficznie wiąże się z epitopem w obrębie reszt 1-10 Αβ. Zestawy mogą zawierać informację opisującą stosowanie przeciwciała do diagnozowania lub monitorowania choroby Alzheimera in vivo.
Krótki opis rysunków
Figura 1: Miana przeciwciał po wstrzyknięciu Ae1-42 myszom transgenicznym.
Figura 2: Obciążenie amyloidem hipokampa. Procent pola powierzchni regionu hipokampa zajętego przez płytki amyloidowe, zdefiniowany poprzez reaktywność ze specyficznym wobec Ae przeciwciałem monoklonalnym 3D6, określano przez wspomaganą komputerowo analizę obrazów skrawków mózgów poddawanych reakcji immunologicznej. Wartości dla pojedynczych myszy przedstawiono podzielone w zależności od grupy traktowania. Pozioma linia wskazuje wartość mediany rozkładu dla każdej grupy.
Figura 3: Dystrofia neurytów w hipokampie. Procent pola powierzchni regionu hipokampa zajętego przez dystroficzne neuryty, zdefiniowany poprzez reaktywność ze specyficznym wobec ludzkiego APP przeciwciałem monoklonalnym 8E5, określano przez ilościową, wspomaganą komputerowo analizę obrazów skrawków mózgów poddawanych reakcji immunologicznej. Wartości dla pojedynczych myszy przedstawiono dla grupy traktowanej AN1792 oraz grupy kontrolnej traktowanej PBS. Pozioma linia wskazuje wartość mediany rozkładu dla każdej grupy.
Figura 4: Astrocytoza w korze za płatem ciała modzelowatego. Procent pola powierzchni regionu korowego zajętego przez astrocyty dodatnie pod względem glejowego kwaśnego białka fibrylarnego (GFAP) określano przez ilościową, wspomaganą komputerowo analizę obrazów skrawków mózgów poddawanych reakcji immunologicznej. Wartości dla pojedynczych myszy przedstawiono podzielone w zależności od grupy traktowania i poziomymi liniami wskazano wartości mediany dla grupy.
Figura 5: Średnia geometryczna mian przeciwciał skierowanych przeciw Ae1-42 po immunizacji zakresem ośmiu dawek AN1792, zawierających 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11,33, 100 lub 300 μg.
Figura 6: Kinetyka odpowiedzi przeciwciał na immunizację AN1792. Miana wyrażono jako średnie geometryczne wartości dla 6 zwierząt w każdej grupie.
Figura 7: Ilościowa analiza obrazów obciążenia amyloidem kory mózgowej u myszy traktowanych PBS i AN1792.
Figura 8: Ilościowa analiza obrazów obciążenia płytkami starczymi u myszy traktowanych PBS i AN1792.
Figura 9: Ilościowa analiza obrazów procentu kory za płatem ciała modzelowatego objętej astrocytozą u myszy traktowanej PBS i AN1792.
Figura 10: Oznaczenie proliferacji limfocytów dla komórek śledziony ze zwierząt traktowanych AN1792 (część górna) lub PBS (część dolna).
Figura 11: Całkowite poziomy Ae w korze mózgowej. Wykres punktowy poszczególnych profili Ae u myszy immunizowanych pochodnymi Ae lub APP połączonymi z adiuwantem Freunda.
Figura 12: Obciążenie amyloidem w korze mózgowej określano przez ilościową analizę obrazów poddawanych reakcji immunologicznej skrawków mózgów dla myszy immunizowanych koniugatami peptydów Ae: Ae15, Ae1-12 i Ae13-28, agregatami Ae o pełnej długości AN1792 (Ae1-42) i AN1528 (Ae1-40) oraz grupy kontrolnej traktowanej PBS.
Figura 13: Średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych wobec Ae dla grup myszy immunizowanych pochodnymi Ae lub APP połączonymi z adiuwantem Freunda.
Figura 14: Średnie geometryczne mian przeciwciał specyficznych wobec Ae dla grup świnek morskich immunizowanych AN1792 lub jego palmitoilowaną pochodną, połączonymi z różnymi adiuwantami.
Figura 15 (A-E) : Poziomy Ae w korach mózgowych 12-miesięcznych myszy PDAPP traktowanych AN1792 lub AN1528 z różnymi adiuwantami.
Figura 16: Średnie miano dla myszy traktowanych poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae.
Figura 17: Średnie miano dla myszy traktowanych skierowanym przeciw Ae monoklonalnym przeciwciałem 10D5.
Figura 18: Średnie miano dla myszy traktowanych skierowanym przeciw Ae monoklonalnym przeciwciałem 2F12.
Figura 19: Mapa epitopowa: odpowiedź ograniczona do końca N. W 175 dniu surowice makaków jawajskich testowano w oznaczeniu ELISA wobec szeregu 10-merycznych zachodzących na siebie peptydów pokrywających pełną sekwencję AN1792. Zwierzę o numerze F10920M wykazuje
PL 200 458 B1 reprezentatywną odpowiedź ograniczoną do końca N na peptyd DAEFRHDSGY, który obejmuje aminokwasy 1-10 peptydu AN1792, stosowanego jako antygen immunizujący.
Figura 20: Mapa epitopowa: odpowiedź nie ograniczona do końca N. W 175 dniu surowice makaków jawajskich testowano w oznaczeniu ELISA wobec szeregu 10-merowych zachodzących na siebie peptydów pokrywających pełną sekwencję AN1792. Zwierzę o numerze F10975F wykazuje reprezentatywną odpowiedź nie ograniczoną do końca N. Reaktywność występuje wobec dwóch peptydów N-końcowych i jednego peptydu C-końcowego względem peptydu DAEFRHDSGY, który obejmuje aminokwasy 1-10 peptydu AN1792.
Definicje
Określenie „zasadnicza identyczność” oznacza, że sekwencje dwóch peptydów, przy optymalnym przyporządkowaniu, takim jak z zastosowaniem programów GAP lub BESTFIT z domyślnymi ocenami dla przerw wykazują co najmniej 65 procent identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 80 lub 90 procent identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 95 procent identyczności sekwencji lub więcej (np. 99 procentową identyczność sekwencji lub wyższą). Korzystnie, pozycje reszt, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Przy porównywaniu sekwencji zazwyczaj jedna sekwencja stanowi sekwencję odniesienia, z którą porównuje się sekwencje testowane. Przy stosowaniu algorytmu porównywania sekwencji, sekwencje testowaną i odniesienia wprowadza się do komputera, wyznacza się współrzędne subsekwencji, jeśli jest to konieczne i wyznacza się parametry algorytmu programu. Następnie algorytm porównywania sekwencji oblicza procent identyczności sekwencji dla sekwencji testowanej(nych) w stosunku do sekwencji odniesienia w oparciu o wyznaczone parametry programu.
Optymalne ustawienie sekwencji do porównywania można przeprowadzić, np., stosując algorytm homologii lokalnej Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algorytm ustawienia homologicznego Needlemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metodę wyszukiwania podobieństwa Pearsona i Lipmana, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), dzięki komputerowym implementacjom tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), bądź poprzez sprawdzanie wzrokowe (patrz, ogólnie, Ausubel i in., supra). Jednym z przykładów algorytmu, który jest odpowiedni do określania procentowej identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji, jest algorytm BLAST, który opisuje Altschul i in., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Oprogramowanie do prowadzenia analiz BLAST jest powszechnie dostępne w National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Zazwyczaj do prowadzenia porównania sekwencji można stosować domyślne parametry programu, chociaż można również stosować parametry wybierane przez użytkownika. Dla sekwencji aminokwasowych, program BLAST wykorzystuje jako domyślne długość słowa (W) równą 3, oczekiwaną wartość (E) równą 10 oraz macierz oceny BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).
Do celów klasyfikacji podstawień aminokwasowych jako konserwatywne lub niekonserwatywne, aminokwasy grupuje się w następujący sposób: grupa I (hydrofobowe łańcuchy boczne): norleucyna, met, ala, val, leu, ile; grupa II (obojętne hydrofilowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; grupa III (kwaśne łańcuchy boczne): asp, glu; grupa IV (zasadowe łańcuchy boczne) : asn, gln, his, lys, arg; grupa V (reszty wpływające na orientację łańcucha): gly, pro; oraz grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, thr. Podstawienia konserwatywne obejmują podstawienia pomiędzy aminokwasami z tej samej klasy. Niekonserwatywne podstawienia aminokwasowe stanowią zamiany przedstawiciela jednej z tych klas na przedstawiciela innej.
Środki lecznicze według wynalazku są zazwyczaj zasadniczo pozbawione niepożądanych zanieczyszczeń. Oznacza to, że czystość środka zazwyczaj wynosi co najmniej około 50% wag., jak również jest on zasadniczo wolny od białek i przeszkadzających zanieczyszczeń. Niekiedy czystość środka wynosi co najmniej około 80% wag., a korzystniej co najmniej 90 lub około 95%. Jednakże, stosując zwykłe techniki oczyszczania białek, otrzymać można homogenne peptydy o czystości co najmniej 99%.
Specyficzne wiązanie pomiędzy dwoma jednostkami oznacza powinowactwo co najmniej 106, 107, 108, 109 lub 1010 M-1. Korzystne są powinowactwa wyższe od 10 M-1.
Określenie „przeciwciało” lub „immunoglobulina” stosuje się wobec nietkniętych przeciwciał i ich fragnetów wiążących. Zazwyczaj fragmenty współzawodniczą z nietkniętym przeciwciałem, z którego zostały otrzymane, o specyficzne wiązanie z fragmentem antygenu, obejmując oddzielne ciężkie łańcuchy, lekkie łańcuchy, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i Fv. Fragmenty wytwarza się technikami rekombinacji
PL 200 458 B1
DNA lub przez enzymatyczny lub chemiczny podział nietkniętych immunoglobulin. Określenie „przeciwciało” obejmuje również jeden lub więcej łańcuchów immunoglobulin, które skoniugowano chemicznie bądź uzyskano przez ekspresję w postaci białek fuzyjnych z innymi białkami. Określenie „przeciwciało” obejmuje również przeciwciało bispecyficzne. Przeciwciało bispecyficzne lub bifunkcjonalne jest sztucznym przeciwciałem hybrydowym, mającym dwie różne pary łańcuchów ciężkich/lekkich i dwa różne miejsca wiążące. Przeciwciała bispecyficzne można wytwarzać różnymi metodami, obejmującymi fuzję hybrydom lub łączenie fragmentów Fab', patrz, np., Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny i in., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
APP695 APP751 i APP770 odnoszą się, odpowiednio, do kodowanych przez ludzki gen APP polipeptydów o długościach 695, 751 i 770 reszt aminokwasowych, patrz Kang i in., Nature 325, 773 (1987); Ponte i in., Nature 331, 525 (1988) oraz Kitaguchi i in., Nature 331, 530 (1988). Aminokwasom ludzkiego białka prekursorowego amyloidu (APP) nadano numery zgodnie z sekwencją izoformy APP770. Takie określenia jak Ae39, Ae40, Ae41, Ae42 i Ae43 odnoszą się do peptydu Ae obejmującego reszty aminokwasowe 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 i 1-43.
„Antygenem” jest jednostka, z którą specyficznie wiąże się przeciwciało.
Określenie „epitop” lub „determinanta antygenowa” odnosi się do miejsca antygenu, na które odpowiadają komórki B i/lub komórki T. Epitopy dla komórek B mogą tworzyć zarówno sąsiednie aminokwasy, jak i nie sąsiadujące ze sobą aminokwasy umieszczone obok siebie dzięki trzeciorzędowemu ufałdowaniu białka. Epitopy tworzone przez sąsiednie aminokwasy zazwyczaj zachowują się po ekspozycji na rozpuszczalniki denaturujące, podczas gdy epitopy tworzone dzięki trzeciorzędowemu ufałdowaniu zazwyczaj są usuwane w wyniku traktowania rozpuszczalnikami denaturującymi. Epitop zazwyczaj obejmuje co najmniej 3, a częściej co najmniej 5 lub 8-10 aminokwasów o unikalnej konformacji przestrzennej. Metody określania przestrzennej konformacji epitopów obejmują np. krystalografię rentgenowską i dwuwymiarowy jądrowy rezonans magnetyczny, patrz np. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, Glenn E. Morris, red. (1996). Przeciwciała, które rozpoznają ten sam epitop, można zidentyfikować w prostym oznaczeniu immunologicznym, wykazując zdolność jednego przeciwciała do blokowania wiązania innego przeciwciała z antygenem docelowym. Komórki T rozpoznają ciągłe epitopy o długości około dziewięciu aminokwasów w przypadku komórek CD8, lub o długości około 13-15 aminokwasów w przypadku komórek CD4. Komórki T, które rozpoznają epitop, można zidentyfikować w oznaczeniach in vitro, w którym mierzy się zależną od antygenu proliferację, określaną przez inkorporację 3H-tymidyny przez stymulowane antygenem komórki T w odpowiedzi na epitop (Burke i in., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), zależne od antygenu zabijanie komórek (oznaczenie cytotoksycznych limfocytów T, Tigges i in., J. Immunol. 156, 3901-3910) lub wydzielanie cytokin.
Określenie „immunologiczna” lub „odpornościowa” odpowiedź oznacza wywołanie korzystnej humoralnej (z udziałem przeciwciał) i/lub komórkowej (z udziałem specyficznych wobec antygenu komórek T lub wydzielanych przez nie produktów) odpowiedzi skierowanej przeciw peptydowi amyloidu u pacjenta-biorcy. Taka odpowiedź może być odpowiedzią czynną, indukowaną przez podawanie immunogenu, lub odpowiedzią bierną, indukowaną przez podawanie przeciwciała lub pobudzonych komórek T. Komórkową odpowiedź odpornościową wywołuje prezentacja epitopów polipeptydowych związanych z cząsteczkami MHC klasy I lub klasy II aktywująca specyficzne wobec antygenu pomocnicze komórki T CD4+ i/lub cytotoksyczne komórki T CD8+. Odpowiedź może również obejmować aktywację monocytów, makrofagów, komórek NK, granulocytów zasadochłonnych, komórek dendrytycznych, astrocytów, komórek mikrogleju, granulocytów kwasochłonnych lub innych składowych odporności wrodzonej. Występowanie odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek można określać w oznaczeniach proliferacji (komórki T CD4+) lub oznaczeniach CTL (cytotoksyczne limfocyty T) (patrz Burke, supra, Tigges, supra). Względne udziały odpowiedzi humoralnej i cytotoksycznej w ochronnym lub leczniczym działaniu Immunogenu można rozróżnić przez oddzielne wyizolowanie przeciwciał i komórek T z immunizowanego syngenicznego zwierzęcia i pomiar wpływu ochronnego lub leczniczego u drugiego osobnika.
„Czynnik immunogenny” lub „immunogen” jest zdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciw sobie po podaniu ssakowi, ewentualnie łącznie z adiuwantem.
Określenie „nagi polinukleotyd” odnosi się do polinukleotydu nieskompleksowanego z materiałami koloidalnymi. Nagie polinukleotydy niekiedy klonuje się w wektorze plazmidowym.
Określenie „adiuwant” odnosi się do związku, który po podaniu łącznie z antygenem wzmacnia odpowiedź immunologiczną na antygen, ale podawany sam nie wywołuje odpowiedzi immunologiczPL 200 458 B1 nej na antygen. Adiuwanty mogą wzmacniać odpowiedź immunologiczną dzięki kilku mechanizmom, włącznie z rekrutacją limfocytów, stymulacją komórek B i/lub T oraz stymulacją makrofagów.
Określenie „pacjent” obejmuje osobników ludzkich oraz innych gatunków ssaków, których poddaje się terapii profilaktycznej lub leczniczej.
Niezagregowany albo monomeryczny Ae oznacza rozpuszczalne, monomeryczne jednostki peptydowe Ae. Jedna z metod przygotowywania monomerycznego Ae polega na rozpuszczeniu zliofilizowanego peptydu w czystym DMSO z sonikacją. Otrzymany roztwór wiruje się w celu usunięcia wszystkich cząstek nierozpuszczalnych. Zagregowany Ae jest mieszaniną oligomerów, w których jednostki monomeryczne są utrzymywane razem wiązaniami niekowalencyjnymi.
Współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami określa się w oznaczeniu, w którym testowane immunoglobuliny hamują specyficzne wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem, takim jak Ae. Znane są liczne rodzaje oznaczeń współzawodniczego wiązania, np. bezpośrednie lub pośrednie oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) na fazie stałej, bezpośrednie lub pośrednie enzymatyczne oznaczenie immunologiczne (EIA) na fazie stałej, oznaczenie współzawodnictwa podwójnego wiązania (patrz Stahli i in., Methods in Enzymology 9: 242-253 (1983)); bezpośrednie EIA biotyna-awidyna na fazie stałej (patrz Kirkland i in., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)); bezpośrednie oznaczenie znakowania na fazie stałej, oznaczenie znakowania na fazie stałej podwójnego wiązania (patrz Harlow i Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)), bezpośrednie oznaczenie znakowania RIA na fazie stałej z zastosowaniem znacznika I-125 (patrz Morel i in., Molec. Immunol. 25 (1): 7-15 (1988)); bezpośrednie oznaczanie biotyny-awidyny EIA na fazie stałej (Cheung i in., Virology 176: 546-552 (1990)) oraz bezpośrednie RIA znakowania (Moldenhauer i in., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990)). Zazwyczaj oznaczenia takie obejmują stosowanie oczyszczonego antygenu związanego ze stałą powierzchnią lub komórek niosących antygen, nieznakowanej immuglobuliny testowanej i znakowanej immunoglobuliny odniesienia. Współzawodnicze hamowanie mierzy się poprzez określanie ilości znacznika związanego ze stałą powierzchnią lub komórkami w obecności testowanej immunoglobuliny. Zazwyczaj immunoglobułina testowana występuje w nadmiarze. Przeciwciała zidentyfikowane w oznaczeniu współzawodnictwa (przeciwciała współzawodniczące) obejmują przeciwciała wiążące się z tym samym epitopem, co przeciwciało odniesienia oraz przeciwciała wiążące się z sąsiadującym epitopem, dostatecznie blisko do epitopu wiązanego przez przeciwciało odniesienia, aby występowała zawada przestrzenna. Zazwyczaj, gdy przeciwciało współzawodniczące występuje w nadmiarze, hamować będzie wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem o co najmniej 50 lub 75%.
Kompozycje i sposoby „zawierające” jeden lub większą liczbę wymienionych elementów mogą obejmować inne, nie wymienione szczegółowo elementy. Przykładowo, kompozycja, która zawiera peptyd Ae, obejmuje zarówno wyizolowany peptyd Ae, jak i peptyd Ae w postaci składnika większej sekwencji polipeptydowej.
Szczegółowy opis
I. Informacje ogólne
Kilka chorób i stanów amyloidogennych charakteryzuje obecność złogów peptydu Ae zagregowanych w nierozpuszczalną masę w mózgu pacjenta. Choroby takie obejmują chorobę Alzheimera, chorobę Downa i upośledzenie funkcji poznawczych. To ostatnie jest objawem choroby Alzheimera i zespołu Downa, ale może również występować bez innych cech charakterystycznych którejkolwiek z tych chorób. Przykładowo łagodne upośledzenie funkcji poznawczych lub związana z wiekiem utrata pamięci występują u pacjentów, u których jeszcze nie rozwinęła się lub nigdy się nie rozwinie, choroba Alzheimera. Łagodne upośledzenie funkcji poznawczych można zdefiniować, zgodnie ze standardami, na podstawie wyniku testu Mini-Mental State Exam. Choroby takie charakteryzują się agregatami Ae mającymi strukturę pofałdowanej kartki papieru e i wybarwiają się barwnikiem czerwienią Kongo. Zasadnicze podejście do profilaktyki lub leczenia choroby Alzheimera lub innych chorób amyloidogennych przez wywoływanie odpowiedzi immunogennej na składnik złogów amyloidowych opisano w WO 99/27944 (włączonym przez odniesienie). Niniejsze zgłoszenie wielokrotnie powtarza i potwierdza skuteczność zasadniczego podejścia. Niniejsze zgłoszenie jest, jednakże, zasadniczo ukierunkowane na ulepszone odczynniki i sposoby. Te ulepszenia zostały poprzedzone, częściowo, zlokalizowaniem przez autorów niniejszego wynalazku korzystnych epitopów w obrębie Ae, wobec których powinna być skierowana odpowiedź immunogenna. Wynikiem zidentyfikowania korzystnych epitopów w obrębie Ae są czynniki i sposoby o zwiększonej skuteczności, obniżonych potencjalnych skutkach ubocznych i/lub łatwiejsze do wytwarzania, nadawania postaci i podawania.
PL 200 458 B1
II. Środki lecznicze
Odpowiedź iramunogenna może być czynna, gdy podaje się immunogen w celu indukcji u pacjenta przeciwciał reaktywnych wobec Ae, bądź bierna, gdy podaje się przeciwciało, które samo wiąże się z Ae u pacjenta.
1. Środki indukujące czynną odpowiedź odpornościową
Środki lecznicze indukują odpowiedź immunogenną specyficznie ukierunkowaną na określone epitopy w obrębie peptydów Ae. Korzystnymi czynnikami są sam peptyd Ae i jego odcinki. Można również stosować warianty takich odcinków, analogi i mimetyki naturalnego peptydu Ae, które indukują i/lub reagują krzyżowo z przeciwciałami skierowanymi przeciw korzystnym epitopom peptydu Ae.
Ae, znany również jako peptyd e-amyloidowy, bądź peptyd A4 (patrz US 4666829; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), jest peptydem o długości 39-43 aminokwasów, będącym zasadniczym składnikiem charakterystycznych płytek w chorobie Alzheimera. Ae tworzony jest przez przetwarzanie większego białka, APP, przez dwa enzymy, nazwane sekretazami e i γ (patrz Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Znane, związane z chorobą Alzheimera mutacje w APP występują w pobliżu miejsca rozpoznawanego przez sekretazę e lub γ, bądź w obrębie Ae. Przykładowo pozycja 717 znajduje się w pobliżu miejsca rozszczepiania APP przez sekretazę y podczas jego przetwarzania do Ae, a pozycje 670/671 znajdują się w pobliżu miejsca rozszczepiania przez sekretazę e. Uważa się, że mutacje powodują AD przez wpływanie na reakcje rozszczepiania, w których tworzony jest Ae tak, że zwiększa się ilość tworzonych form Ae o długości 42/43 aminokwasów.
Niezwykłą właściwością Ae jest to, że może on utrzymywać i aktywować zarówno klasyczną, jak i alternatywną kaskadę dopełniacza. W szczególności, wiąże się on z Clq i, ostatecznie, z C3bi. Wiązanie to ułatwia wiązanie z makrofagami, prowadzące do aktywacji komórek B. Ponadto, C3bi rozpada się dalej, a następnie wiąże się z CR2 na komórkach B w sposób zależny od komórek T, prowadząc do 10000-krotnego wzrostu aktywacji tych komórek. Mechanizm ten powoduje wywoływanie przez Ae odpowiedzi odpornościowej większej niż w przypadku innych antygenów.
Ae ma kilka naturalnie występujących postaci. Postacie Ae człowieka określa się jako Ae39, Ae40, Ae41, Ae42 i Ae43. Sekwencje tych peptydów oraz ich współzależności z prekursorem APP zilustrowano na fig. 1 w Hardy i in., TINS 20, 155-158 (1997). Przykładowo Ae42 ma sekwencję:
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.
Ae41, Ae40 i Ae39 różnią się od Ae42 brakiem, od końca C, odpowiednio Ala, Ala-Ile i Ala-Ile-Val. Ae43 różni się od Ae42 obecnością reszty treoniny na końcu C.
Immunogenne fragmenty Ae są korzystnie pokrewne nietkniętej cząsteczce z kilku powodów. Po pierwsze, ponieważ tylko niektóre epitopy w obrębie Ae indukują użyteczną odpowiedź immunogenną do leczenia choroby Alzheimera, równa dawka masy fragmentu zawierającego takie epitopy zapewnia wyższe stężenie molowe użytecznych epitopów immunogennych niż dawka nietkniętego Ae. Po drugie, niektóre immunogenne fragmenty Ae wywołują immunogenną odpowiedź przeciw złogom amyloidu bez wywoływania znaczącej odpowiedzi immunogennej przeciw białku APP, z którego Ae pochodzi. Po trzecie, fragmenty Ae są łatwiejsze do wytwarzania niż nietknięty Ae, z powodu ich mniejszej wielkości. Po czwarte, fragmenty Ae nie agregują w taki sam sposób jak nietknięty Ae, co upraszcza przygotowywanie kompozycji farmaceutycznych i ich podawanie.
Niektóre immunogenne fragmenty Ae mają sekwencję co najmniej 2, 3, 5, 6, 10 lub 20 sąsiednich aminokwasów z peptydu naturalnego. Niektóre immunogenne fragmenty mają nie więcej niż 10, 9, 8, 7, 5 lub 3 sąsiednich reszt z Ae. Korzystne są fragmenty z N-końcowej połowy Ae. Korzystne fragmenty immunogenne obejmują Ae1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 i 1-4. Oznaczenie Aep1-5 np. wskazuje fragment obejmujący reszty 1-5 Ae i pozbawiony innych reszt Ae. Szczególnie korzystne są fragmenty zaczynające się od reszt 1-3 Ae i kończące się resztami 7-11 Ae. Można również stosować fragment Ae1-12, ale jest on mniej korzystny. W niektórych sposobach fragmentem jest N-końcowy fragment inny niż Ae1-10. Inne mniej korzystne fragmenty obejmują Ae13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 i 35-42. Fragmenty te przed zastosowaniem wymagają przetestowania pod względem aktywności usuwania lub profilaktyki złogów amyloidu, jak opisano w przykładach. W niektórych sposobach stosuje się fragmenty pozbawione co najmniej jednego, a niekiedy co najmniej 5 lub 10 C-końcowych aminokwasów obecnych w naturalnie występujących postaciach Ae. Przykładowo fragment pozbawiony 5 aminokwasów z końca C Ae43 obejmuje pierwszych 38 aminokwasów z końca N Ae. Do indukcji odpowiedzi immunogennej można również stosować inne składniki płytek amyloidowych, na przykład synukleinę oraz ich epitopowe fragmenty.
PL 200 458 B1
O ile nie wskazano inaczej, odniesienie do Αβ obejmuje wskazane powyżej naturalne ludzkie sekwencje aminokwasowe, jak również ich analogi, włącznie z wariantami allelicznymi, międzygatunkowymi i indukowanymi. Analogi zazwyczaj różnią się od naturalnie występujących peptydów co najmniej jedną, dwiema lub kilkoma pozycjami, często podstawieniami konserwatywnymi. Analogi zazwyczaj wykazują co najmniej 80 lub 90% identyczności sekwencji z naturalnymi peptydami. Niektóre analogi zawierają również aminokwasy nienaturalne lub zmodyfikowane aminokwasy N- lub C-końcowe w jednej, dwóch lub kilku pozycjach. Przykładowo naturalną resztę aminokwasową w pozycji l/lub 7 Ae można zastąpić kwasem izoasparaginowym. Przykładami aminokwasów nienaturalnych są D-aminokwasy, aminokwasy α,α-dipodstawione, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy, 4-hydroksyprolina, γ-karboksyglutaminian, ε-N,N,N-trimetylolizyna, ε-N-acetylolizyna, O-fosfoseryna, N-acetyloseryna, N-formylometionina, 3-metylohistydyna, 5-hydroksylizyna, ω-N-metyloarginina i kwas izoasparaginowy. Fragmenty i analogi można testować pod względem profilaktycznej i terapeutycznej skuteczności w modelach zwierząt transgenicznych, w porównaniu z kontrolami nieleczonymi lub otrzymującymi placebo, jak opisano poniżej.
Ae, jego fragmenty i analogi można syntetyzować stosując syntezę peptydów na fazie stałej lub rekombinacyjną ekspresję, lub można je otrzymywać ze źródeł naturalnych. Automatyczne syntezatory peptydów są dostępne w handlu u licznych dostawców, takich jak Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia. Rekombinacyjną ekspresję można prowadzić w bakteriach, takich jak E. coli, drożdżach, komórkach owadów lub komórkach ssaków. Procedury rekombinacyjnej ekspresji opisali Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY, wyd. 2, 1989). Niektóre postacie peptydu Ae są również dostępne w handlu (np. American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA oraz California Peptide Research, Inc. Napa, CA).
Środki lecznicze obejmują również dłuższe polipeptydy, np. aktywny fragment peptydu Ae razem z innymi aminokwasami. Przykładowo korzystne czynniki obejmują białka fuzyjne zawierające odcinek Ae połączony z heterologiczną sekwencją aminokwasową, która indukuje odpowiedź komórek pomocniczych T na heterologiczną sekwencję aminokwasową, a dzięki temu odpowiedź komórek B na odcinek Ae. Takie polipeptydy można testować pod względem skuteczności profilaktycznej lub terapeutycznej, w porównaniu z kontrolami nieleczonymi lub otrzymującymi placebo, jak opisano poniżej. Peptyd Ae, analog, aktywny fragment bądź inny polipeptyd można podawać w postaci zasocjowanej lub multimerycznej, bądź w postaci zdysocjowanej. Czynniki terapeutyczne obejmują również multimery mono-merycznych czynników immunogennych.
W kolejnym wariancie, peptyd immunogenny, taki jak fragment Ae, może być prezentowany przez wirusa lub bakterię jako część kompozycji immunogennej. Kwas nukleinowy kodujący immunogenny peptyd włącza się do genomu lub episomu wirusa lub bakterii. Ewentualnie, kwas nukleinowy włącza się w taki sposób, że immunogenny peptyd ulega ekspresji jako białko wydzielane lub jako białko fuzyjne z białkiem zewnętrznej powierzchni wirusa, bądź transbłonowe białko bakterii tak, że peptyd jest prezentowany. Wirusy lub bakterie stosowane w takich sposobach powinny być niepatogenne lub atenuowane. Odpowiednie wirusy obejmują adenowirusa, HSV, wirusa wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i inne alfawirusy, wirusa pryszczycy i inne rabdowirusy, wirusa ospy bydlęcej i wirusa ospy ptasiej. Odpowiednie bakterie obejmują Salmonella i Shigella. Szczególnie odpowiednia jest fuzja immunogennego peptydu z HBsAg HBV. Środki lecznicze obejmują również peptydy lub inne związki, które nie koniecznie muszą mieć znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do Ae, ale nie mniej jednak służą jako mimetyki Ae i indukują podobną odpowiedź odpornościową. Przykładowo można testować jakiekolwiek peptydy i białka tworzące strukturę pofałdowanej kartki papieru e pod względem tego, czy są odpowiednie. Można również stosować przeciwciała antyidiotypowe skierowane przeciw przeciwciałom monoklonalnym skierowanym przeciw Ae lub innym peptydom amyloidogennym. Takie przeciwciała antyidiotypowe naśladują antygen i wywołują odpowiedź odpornościową na niego (patrz Essential Immunology (Roit, red., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, wyd. 6), str. 181). Czynniki inne od peptydów Ae powinny indukować immunogenną odpowiedź przeciw jednemu lub więcej z wymienionych powyżej korzystnych odcinków Ae (np. 1-10, 1-7, 1-3 i 3-7). Korzystnie, czynniki takie indukkują odpowiedź immunogenną, która jest specyficznie ukierunkowana wobec jednego z tych odcinków, bez ukierunkowania wobec innych odcinków Ae.
Można również przeszukiwać losowe biblioteki peptydów i innych związków względem tego, czy są odpowiednie. Dla wielu związków, które można syntetyzować w stopniowy sposób, można tworzyć biblioteki kombinatoryczne. Takie związki obejmują polipeptydy, mimetyki skrętów beta, polisacharydy, fosfolipidy, hormony, prostaglandyny, steroidy, związki aromatyczne, związki heterocykliczne, benzo12
PL 200 458 B1 diazepiny, oligomeryczne N-podstawione glicyny i oligokarbaminiany. Duże biblioteki kombinatoryczne związków można konstruować sposobem kodowanych bibliotek syntetycznych (ESL), opisanym w Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 oraz Scripps, WO 95/30642 (z których każdy, dla wszelkich celów, włączono przez odniesienie). Biblioteki peptydów można tworzyć sposobami prezentacji przez fagi, patrz np. Devlin, WO 91/18980.
Biblioteki kombinatoryczne i inne związki wstępnie przeszukuje się, pod względem tego czy są odpowiednie, przez określanie ich zdolności do wiązania z przeciwciałami lub limfocytami (B i T), o których wiadomo, że są specyficzne wobec Ae lub innych peptydów amyloidogennych. Przykładowo wstępne przeszukiwanie można prowadzić stosując jakąkolwiek surowicę poliklonalną lub przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw Ae lub jego fragmentowi. Związki można następnie przeszukiwać pod kątem wiązania ze specyficznym epitopem w obrębie Ae (np. 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 i 3-7). Związki można testować stosując takie same procedury, jak opisane dla mapowania specyficzności przeciwciał wobec epitopów. Związki zidentyfikowane przez takie przeszukiwania analizuje się następnie pod względem zdolności do indukowania przeciwciał lub reaktywnych limfocytów wobec Ae lub jego fragmentów. Przykładowo wielokrotne rozcieńczenia surowic można testować na płytkach do mikromiareczkowania, które uprzednio opłaszczono Ae lub jego fragmentem, a do testowania pod względem reaktywnych przeciwciał skierowanych przeciw Ae lub fragmentowi można prowadzić standardowe oznaczenie ELISA. Związki można następnie testować pod względem skuteczności profilaktycznej i terapeutycznej w zwierzętach transgenicznych predysponowanych do choroby amyloidogennej, jak opisano w przykładach. Takie zwierzęta obejmują np. myszy mające mutację pozycji 717 APP, opisaną przez Gamesa i in., supra, i myszy mających mutację Swedish w pozycjach 670/671 APP, jak opisano w McConlogue i in., US 5612486 i Hsiao i in., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt i in., Neuron 19, 939-945 (1997)). Takie same podejścia przeszukiwania można stosować wobec innych potencjalnych analogów czynników Ae i opisanych powyżej dłuższych peptydów obejmujących fragmenty Ae.
2. Środki indukujące bierną odpowiedź odpornościową
Środki lecznicze według wynalazku obejmują również przeciwciała, które specyficznie wiążą się z Ae lub innymi składnikami płytek amyloidowych. Takie przeciwciała mogą być monoklonalne lub poliklonalne. Niektóre takie przeciwciała wiążą.się specyficznie ze zagregowaną postacią Ae, bez wiązania z postacią zdysocjowaną, niektóre wiążą się specyficznie z postacią zdysocjowaną, bez wiązania z postacią zagregowaną, a niektóre wiążą się zarówno z postacią zagregowaną, jak i zdysocjowaną. Niektóre takie przeciwciała wiążą się z naturalnie występującą krótką postacią Ae (tj. Ae39, 40 lub 41), bez wiązania z naturalnie występującą długą postacią Ae (tj. Ae42 i Ae43). Niektóre przeciwciała wiążą się z długą postacią, bez wiązania z postacią krótką. Niektóre przeciwciała wiążą się z Ae, bez wiązania z pełnej długości prekursorowym białkiem amyloidu. Przeciwciała stosowane w sposobach leczenia zazwyczaj mają nietknięty region stały, bądź co najmniej dostateczną część regionu stałego do oddziaływania z receptorem Fc. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1, ze względu na wykazywanie przez niego najwyższego powinowactwa spośród izotypów ludzkich do receptora FcRI na komórkach fagocytarnych. Można również stosować bispecyficzne fragmenty Fab, w których jedno ramię przeciwciała ma specyficzność wobec Ae, a drugie wobec receptora Fc. Niektóre przeciwciała wiążą się z AP z powinowactwem wiązania wyższym niż lub równym około 106, 107, 108, 109 lub 1010 M-1.
Surowice poliklonalne zazwyczaj zawierają mieszane populacje przeciwciał wiążących się z kilkoma epitopąmi wzdłuż Ae. Jednakże, surowice poliklonalne mogą być specyficzne wobec określonego odcinka Ae, takiego jak Ae1-10. Przeciwciała monoklonalne wiążą się ze specyficznym epitopem w obrębie Ae, który może być epitopem konformacyjnym lub niekonformacyjnym. Profilaktyczną i terapeutyczną skuteczność przeciwciał można testować stosując opisane w przykładach procedury z wykorzystaniem modelu zwierząt transgenicznych. Korzystne przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae (gdzie pierwszą resztę N-końcową naturalnego Ae oznaczono 1). Niektóre korzystne przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-5, a niektóre z epitopem w obrębie reszt 5-10. Niektóre korzystne przeciwciała wiążą się z epitopami w obrębie aminokwasów 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 lub 3-7. Niektóre korzystne przeciwciała wiążą się z epitopem zaczynającym się od reszt 1-3 i kończącym się resztami 7-11 Ae. Mniej korzystne przeciwciała obejmują te wiążące się z epitopami o resztach 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 lub 10-25 Ae. Przed stosowaniem zaleca się przeszukiwanie takich przeciwciał pod kątem aktywności w mysim
PL 200 458 B1 modelu opisanym w przykładach. Przykładowo stwierdzono, że niektóre przeciwciała skierowane przeciw epitopom w obrębie reszt 10-18, 16-24, 18-21 i 33-42 pozbawione są aktywności. W niektórych metodach stosuje się przeciwciała monoklonalne wykazujące specyficzność wiązania z różnymi epitopami. Przeciwciała takie można podawać kolejno lub jednocześnie. Można również stosować przeciwciała skierowane przeciw innym składnikom amyloidu niż Ae. Przykładowo przeciwciała mogą być skierowane przeciw białku towarzyszącemu amyloidowi, synukleinie.
Gdy o przeciwciele stwierdza się, że wiąże się z określonymi resztami, takimi jak na przykład Ae1-5, oznacza to, że przeciwciało specyficznie wiąże się z polipeptydem zawierającym określone reszty (tj. w tym przykładzie, reszty 1-5 Ae). Takie przeciwciało niekoniecznie wchodzi w kontakt z każdą resztą w obrębie reszt 1-5 Ae. Nie oznacza to też, że każde pojedyncze podstawienie lub delecja w Ae1-5 musi wpływać na powinowactwo wiązania. Epitopową specyficzność przeciwciała można określić np. przez utworzenie biblioteki prezentacji przez fagi, której różni przedstawiciele prezentują różne podsekwencje Ae. Bibliotekę prezentacji przez fagi przeszukuje się następnie pod kątem przedstawicieli specyficznie wiążących się z przeciwciałem poddawanym testowaniu. Izoluje się rodzinę sekwencji. Zazwyczaj, rodzina taka zawiera u różnych przedstawicieli wspólną sekwencję rdzeniową i sekwencje flankujące o różnej długości. Najkrótsza sekwencja rdzeniowa wykazująca specyficzne wiązanie definiuje epitop wiązany przez przeciwciało. Przeciwciała można również testować pod kątem specyficzności epitopowej w oznaczeniu współzawodnictwa z przeciwciałem, którego specyficzność epitopową już określono. Przykładowo przeciwciała, które współzawodniczą z przeciwciałem 3D6 o wiązanie z Ae, wiążą się z tym samym lub podobnym epitopem co 3D6, tj. epitopem w obrębie reszt 1-5 Ae. Podobnie, przeciwciała, które współzawodniczą z przeciwciałem 10D5 o wiązanie z Ae, wiążą się z tym samym lub podobnym epitopem co 3D6, tj. epitopem w obrębie reszt 3-6 Ae. Przeszukiwanie przeciwciał pod kątem specyficzności epitopowej jest użyteczne w przewidywaniu ich skuteczności terapeutycznej. Przykładowo przeciwciało, dla którego określono, że wiąże się z epitopem w obrębie reszt 1-7 Ae, prawdopodobnie jest skuteczne w zapobieganiu i leczeniu choroby Alzheimera.
Monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała, które specyficznie wiążą się z korzystnym odcinkiem Ae, bez wiązania z innymi regionami Ae, mają liczne zalety w stosunku do przeciwciał monoklonalnych wiążących się z innymi regionami lub poliklonalnych surowic skierowanych przeciw nietkniętemu Ae. Po pierwsze, dla dawek o równej masie, dawki przeciwciał, które specyficznie wiążą się z korzystnymi odcinkami, mają wyższą zawartość molową przeciwciał skutecznych pod względem usuwania płytek amyloidowych. Po drugie, przeciwciała specyficznie wiążące się z korzystnymi odcinkami, mogą indukować odpowiedź usuwania przeciw złogom amyloidu, bez indukowania odpowiedzi usuwania przeciw nietkniętemu polipeptydowi APP, w ten sposób zmniejszając potencjalne wpływy uboczne.
i. Ogólna charakterystyka immunoglobulin
Wiadomo, że podstawową jednostkę strukturalną przeciwciała stanowi tetramer podjednostek. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych; każda para obejmuje jeden łańcuch „lekki” (około 25 kDa) i jeden „ciężki” (około 50-70 kDa). Aminoterminalna część każdego łańcucha obejmuje region zmienny o długości około od 100 do 110 lub więcej aminokwasów, przede wszystkim odpowiedzialny za rozpoznawanie antygenu. Karboksyterminalna część każdego łańcucha definiuje region stały, przede wszystkim odpowiedzialny za funkcję efektorową.
Łańcuchy lekkie klasyfikuje się albo jako kappa, albo lambda. Łańcuchy ciężkie definiuje się jako gamma, mi, alfa, delta lub epsilon i definiują one izotyp przeciwciała jako odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD lub IgE. W obrębie łańcuchów lekkiego i ciężkiego, regiony zmienny i stały połączone są regionem „J” o długości około 12 lub więcej aminokwasów, ale łańcuch ciężki obejmuje również region „D” o długości 10 lub więcej aminokwasów (patrz, ogólnie, Fundamental Immunology (Paul, W., red., wyd. 2, Raven Press, N.Y., 1989), rozdz. 7 (w całości włączony przez odniesienie dla wszelkich celów).
Regiony zmienne każdej pary łańcuch lekki/ciężki tworzą miejsce wiążące przeciwciała. A zatem, nietknięte przeciwciało ma dwa miejsca wiążące. Z wyjątkiem przeciwciał bifunkcjonalnych lub bispecyficznych, dwa miejsca wiążące są takie same. Wszystkie łańcuchy wykazują taką samą strukturę ogólną stosunkowo konserwatywnych regionów zrębu (FR), połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, nazywanymi także regionami determinującymi komplementarność lub CDR. CDR dwóch łańcuchów każdej pary są ustawione przy regionach zrębu, co umożliwia wiązanie ze specyficznym epitopem. Od końca N do końca C, zarówno łańcuchy lekkie, jak i ciężkie, zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Oznaczenia aminokwasów każdej domeny jest zgodnie
PL 200 458 B1 z definicjami podanymi w Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 i 1991) lub Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i in., Nature 342: 878-883 (1989).
ii. Wytwarzanie przeciwciał innych niż ludzkie
Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych innych niż ludzkie, np. myszy, świnki morskiej, naczelnych, królika lub szczura, można prowadzić przez np. immunizowanie zwierzęcia Αβ. Można również stosować dłuższe polipeptydy obejmujące Ae lub immunogenny fragment Ae, bądź antyidiotypowe przeciwciała skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ae, patrz Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHL NY, 1989) (włączony, dla wszelkich celów, przez odniesienie). Taki immunogen można otrzymać ze źródła naturalnego, przez syntezę peptydu lub rekombinacyjną ekspresję. Ewentualnie, immunogen można poddawać po fuzji lub skompleksowaniu w inny sposób z białkiem nośnikowym, jak opisano poniżej. Ewentualnie, immunogen można podawać z adiuwantem. Można stosować kilka rodzajów adiuwantów, jak opisano poniżej. W przypadku immunizowania zwierząt laboratoryjnych korzystne jest stosowanie kompletnego adiuwanta Freunda, a następnie adiuwanta niekompletnego. Do tworzenia przeciwciał poliklonalnych zazwyczaj stosuje się króliki lub świnki morskie. Do tworzenia przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj stosuje się myszy. Przeciwciała przeszukuje się pod kątem specyficznego wiązania z Ae. Ewentualnie, przeciwciała przeszukuje się dalej pod kątem wiązania z określonym regionem Ae. To ostatnie przeszukiwanie można przeprowadzić przez określenie wiązania przeciwciała ze zbiorem mutantów delecyjnych peptydu Ae i określenie, które mutanty delecyjne wiążą się przeciwciałem. Wiązanie można oceniać np. poprzez hybrydyzację typu Western lub ELISA. Najmniejszy fragment wykazujący specyficzne wiązanie z przeciwciałem definiuje epitop przeciwciała. Alternatywnie, specyficzność epitopową możną określić w oznaczeniu współzawodnictwa, w którym przeciwciała testowane i odniesienia współzawodniczą o wiązanie z Ae. Jeśli przeciwciała testowane i odniesienia współzawodniczą ze sobą, to wiążą się z tym samym epitopem lub epitopami występującymi w pobliżu, aby wiązanie jednego przeciwciała zakłócało wiązanie drugiego. Korzystnym izotypem takich przeciwciał jest izotyp IgG2a myszy lub równoważny izotyp innego gatunku. Mysi izotyp IgG2a jest równoważny ludzkiemu izotypowi IgG1.
iii. Przeciwciała chimeryczne i humanizowane
Przeciwciała chimeryczne i humanizowane mają taką samą lub podobną specyficzność i powinowactwo wiązania, jak przeciwciało myszy lub innego gatunku nie będącego człowiekiem, które dostarcza materiał wyjściowy do konstruowania przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego. Przeciwciała chimeryczne są przeciwciałami, których geny łańcucha lekkiego i ciężkiego zostały skonstruowane, zazwyczaj technikami inżynierii genetycznej, z odcinków genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. Przykładowo odcinki zmienne (V) genów mysiego przeciwciała monoklonalnego można łączyć z ludzkimi odcinkami stałymi (C), takimi jak te IgG1 i IgG4. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Typowe przeciwciało chimeryczne jest zatem białkiem hybrydowym, składającym się z domeny V lub wiążącej antygen przeciwciała mysiego i domeny C lub efektorowej przeciwciała ludzkiego.
Przeciwciała humanizowane mają reszty zrębu regionu zmiennego zasadniczo przeciwciała ludzkiego (nazywanego przeciwciałem akceptorowym), a regiony determinujące komplementarność zasadniczo przeciwciała mysiego (określanego jako przeciwciało donorowe), patrz Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989) oraz WO 90/07861, US 5693762, US 5693761, US 5585089, US 5530101 i Winter, WS 5225539 (w całości włączone do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe dla wszelkich celów). Regiony lub region stały, jeśli obecny, również zasadniczo lub całkowicie pochodzi z immunoglobuliny ludzkiej. Ludzkie domeny zmienne zazwyczaj wybiera się z przeciwciał ludzkich, których sekwencje zrębu wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z domenami mysiego regionu zrębu, z których otrzymano CDR. Reszty zrębu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego można otrzymać z sekwencji tego samego lub innego przeciwciała ludzkiego. Sekwencjami przeciwciała ludzkiego mogą być sekwencje naturalnie występujących przeciwciał ludzkich lub mogą być sekwencjami konsensu dla kilku przeciwciał człowieka, patrz Carter i in., WO 92/22653. Niektóre aminokwasy spośród reszt zrębu ludzkiego regionu zmiennego wybiera się do podstawień w oparciu o ich możliwy wpływ na konformację CDR i/lub wiązanie z antygenem. Badania takich możliwych wpływów polegają na modelowaniu, sprawdzaniu cech charakterystycznych aminokwasów w określonych położeniach lub empirycznym obserwowaniu wpływu podstawienia lub mutagenezy określonych aminokwasów.
Przykładowo, jeśli aminokwas różni się dla reszty zrębu mysiego regionu zmiennego i reszty zrębu wybranego ludzkiego regionu zmiennego, ludzki aminokwas zrębu powinno się zazwyczaj podPL 200 458 B1 stawiać równoważnym aminokwasem zrębu przeciwciała mysiego, jeśli uzasadnione jest oczekiwanie, że aminokwas:
(1) bezpośrednio wiąże antygen niekowalencyjnie, (2) sąsiaduje z regionem CDR, (3) w inny sposób oddziałuje z regionem CDR (np. znajduje się w odległości do około 6 A od regionu CDR) lub (4) uczestniczy w oddziaływaniach VL-VH.
Innymi kandydatami do podstawień są te aminokwasy akceptorowego zrębu ludzkiego, które są niezwykłe w tej pozycji dla immunoglobuliny ludzkiej. Aminokwasy te można podstawiać aminokwasami z równoważnej pozycji mysiego przeciwciała donorowego lub równoważnej pozycji bardziej typowych immunoglobulin ludzkich. Innymi kandydatami do podstawień są aminokwasy akceptorowego zrębu ludzkiego, które są niezwykłe w tej pozycji dla immunoglobuliny ludzkiej. Zręby regionów zmiennych immunoglobulin humanizowanych zazwyczaj wykazują co najmniej 85% identyczności sekwencyjnej z sekwencją zrębu ludzkiego regionu zmiennego lub konsensem takich sekwencji.
iv. Przeciwciała ludzkie
Ludzkie przeciwciała skierowane przeciw Ae dostarcza się licznymi sposobami opisanymi poniżej. Niektóre przeciwciała ludzkie selekcjonuje się dzięki doświadczeniom współzawodniczącego wiązania lub w inny sposób tak, aby miały taką samą specyficzność epitopową, jak określone przeciwciało mysie, takie jak jedno z mysich przeciwciał monoklonalnych opisanych w przykładzie XI. Przeciwciała ludzkie można również przeszukiwać pod kątem określonej specyficzności epitopowej przez stosowanie jako immunogenu tylko fragmentu Ae i/lub przez przeszukiwanie przeciwciał wobec zbioru mutantów delecyjnych Ae. Przeciwciała ludzkie korzystnie mają specyficzność izotypową ludzkiego IgG1.
(1) Metoda triom
Podstawowe podejście oraz przykładowego partnera fuzji komórkowych, SPAZ-4, do stosowania w tym podejściu, opisano w Oestberg i in., Hybridoma 2: 361-367 (1983); Oestberg, US 4 634 664 oraz Engleman i in., US 4 534 666 (z których każdy w całości włączono przez odniesienie do wszelkich celów). Otrzymane tą metodą linie komórek wytwarzających przeciwciała nazywa się triomami, ponieważ pochodzą one od trzech komórek - dwóch ludzkich i jednej mysiej. Najpierw linię szpiczaka mysiego poddaje się fuzji z ludzkim limfocytem B, w celu otrzymania nie wytwarzającej przeciwciał ksenogennej komórki hybrydowej, takiej jak linia komórkowa SPAZ-4, opisana w Oestberg, supra. Komórkę ksenogenną poddaje się następnie fuzji z immunizowanym limfocytem B, w celu otrzymania wytwarzającej przeciwciała linii komórkowej triomy. Stwierdzono, że triomy wytwarzają przeciwciała w bardziej stabilny sposób, niż zwykłe hybrydomy przygotowane z komórek ludzkich.
Immunizowane limfocyty B otrzymuje się z krwi, śledziony, węzłów chłonnych lub szpiku dawcy ludzkiego. Jeśli pożądane są przeciwciała skierowane przeciw określonemu antygenowi lub epitopowi, korzystne jest stosowanie do immunizacji antygenu lub jego epitopu. Immunizację można prowadzić albo in vivo, albo in vitro. W przypadku immunizacji in vivo, komórki B izoluje się zazwyczaj od człowieka immunizowanego Ae, jego fragmentem, większym polipeptydem obejmującym Ae lub fragment, bądź przeciwciałem antyidiotypowym skierowanym przeciw przeciwciału skierowanemu przeciw Ae. W niektórych sposobach komórki B izoluje się od tego samego pacjenta, który ostatecznie będzie poddawany terapii przeciwciałem. W przypadku immunizacji in vitro, limfocyty B zazwyczaj wystawia się na działanie antygenu przez 7-14 dni w podłożu, takim jak RPMI-1640 (patrz Engleman, supra) wzbogacone o 10% osocze ludzkie.
Immunizowane limfocyty B poddaje się fuzji z ksenogenną komórką hybrydową, taką jak SPAZ-4, stosując dobrze znane metody. Przykładowo komórki traktuje się 40-50% glikolem polietylenowym o masie cząsteczkowej 1000-4000 w temperaturze około 37°C w ciągu około 5-10 minut. Komórki wydziela się z mieszaniny fuzyjnej i namnaża w podłożu selekcjonującym pożądane hybrydy (np. HAT lub AH). Klony wydzielające przeciwciała mające wymaganą specyficzność wiązania identyfikuje się przez oznaczanie podłoża hodowlanego triom pod kątem zdolności wiązania z Ae lub jego fragmentem. Triomy wytwarzające przeciwciała ludzkie mające pożądaną specyficzność subklonuje się techniką ograniczających rozcieńczeń i hoduje in vitro w podłożu hodowlanym. Otrzymane linie komórkowe triom testuje się następnie pod kątem zdolności wiązania z Ae lub jego fragmentem.
Chociaż triomy są genetycznie stabilne, nie wytwarzają one przeciwciał na bardzo wysokich poziomach. Poziomy ekspresji można zwiększyć przez klonowanie genów przeciwciał z triomy w jednym lub więcej wektorów ekspresyjnych oraz transformowanie wektorem standardowych linii komórek ssaczych, bakteryjnych lub drożdżowych.
PL 200 458 B1 (2) Transgeniczne ssaki gatunków innych niż człowiek
Ludzkie przeciwciała skierowane przeciw Ae można również wytwarzać w transgenicznych ssakach gatunków innych niż człowiek, mających transgeny kodujące co najmniej odcinek locus ludzkiej immunoglobuliny. Zazwyczaj, endogenne loci immunoglobuliny takich ssaków transgenicznych jest funkcjonalnie zinaktywowane. Korzystnie odcinek ludzkiego locus immunoglobuliny obejmuje nieprzegrupowane sekwencje składników - łańcucha ciężkiego i lekkiego. Zarówno inaktywację endogennych genów immunoglobulin, jak i wprowadzanie egzogennych genów immunoglobulin można uzyskać przez ukierunkowaną rekombinację homologiczną, bądź przez wprowadzanie chromosomów YAC. Uzyskiwane w takim procesie transgeniczne ssaki są zdolne do funkcjonalnego przegrupowywania składowych sekwencji immunoglobuliny i ekspresji zestawu kodowanych przez ludzkie geny immunoglobulin przeciwciał o różnych izotypach, bez ekspresji endogennych genów immunoglobulin. Tworzenie i właściwości ssaków mających te cechy opisano szczegółowo np. w Lonberg i in., WO 93/12227 (1993); US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318, US 5 789 650, US 5 770 429, US 5 661 016, US 5 633 425, US 5 625 126, US 5 569 825, US 5 545 806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (z których każdy w całości włączono przez odniesienie dla wszelkich celów). Szczególnie odpowiednie są myszy transgeniczne. Przeciwciała skierowane przeciw Ae otrzymuje się przez immunizowanie transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem, jak opisano w Lonberg lub Kucherlapati, supra, Ae lub jego fragmentem. Przeciwciała monoklonalne przygotowuje się przez np. poddawanie fuzji komórek B z takich ssaków z odpowiednimi liniami komórek szpiczaka, stosując zwykłą technikę Kohlera-Milsteina. Ludzkie przeciwciała poliklonalne można również dostarczać w postaci surowicy pobieranej od ludzi immunizowanych czynnikiem immunogennym. Ewentualnie, takie przeciwciała poliklonalne można zatężać przez oczyszczanie na zasadzie powinowactwa, jako odczynnik wykazujący powinowactwo stosując Ae lub inny peptyd amyloidu.
(3) Sposoby z zastosowaniem prezentacji przez fagi
Dalszym podejściem do otrzymywania ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw Ae jest przeszukiwanie biblioteki DNA ludzkich komórek B według ogólnego protokołu podanego w Huse i in., Science 246: 1275-1281 (1989). Jak opisano dla metody triom, takie komórki B można otrzymać od ludzi immunizowanych Ae, jego fragmentami, dłuższymi polipeptydami obejmującymi Ae lub fragmenty, bądź przeciwciałami antyidiotypowymi. Ewentualnie, takie komórki B otrzymuje się od pacjenta, który ostatecznie będzie poddawany leczeniu przeciwciałem. Selekcjonuje się przeciwciała wiążące się z Ae lub jego fragmentem. Następnie klonuje się i amplifikuje sekwencje kodujące takie przeciwciała (lub fragmenty wiążące). Protokół opisany przez Huse jest skuteczniejszy w połączeniu z techniką prezentacji przez fagi, patrz np. Dower i in., WO 91/17271 oraz McCafferty i in., WO 92/01047, US 5 877 218, US 5 871 907, US 5 858 657, US 5 837 242, US 5 733 743 i US 5 565 232 (z których każdy w całości włączono przez odniesienie dla wszelkich celów). W sposobach tych tworzy się biblioteki fagów, których poszczególni przedstawiciele prezentują różne przeciwciała na zewnętrznej powierzchni. Przeciwciała są zazwyczaj prezentowane w postaci fragmentów Fv lub Fab. Fagi prezentujące przeciwciała o pożądanej specyficzności selekcjonuje się poprzez wzbogacanie na zasadzie powinowactwa do peptydu Ae lub jego fragmentu.
W wariancie sposobu prezentacji przez fagi można wytwarzać ludzkie przeciwciała wykazujące specyficzność wiązania wybranego przeciwciała mysiego, patrz Winter, WO 92/20791. W sposobie tym jako materiał wyjściowy stosuje się region zmienny łańcucha ciężkiego lub lekkiego wybranego przeciwciała mysiego. Jeśli np. jako materiał wyjściowy wybrano region zmienny łańcucha lekkiego, konstruuje się bibliotekę fagową, której przedstawiciele prezentują ten sam region zmienny łańcucha lekkiego (tj. mysi wyjściowy materiał) i różne regiony zmienne łańcucha ciężkiego. Regiony zmienne łańcucha ciężkiego uzyskuje się z biblioteki przegrupowanych regionów zmiennych ludzkich łańcuchów ciężkich. Selekcjonuje się faga wykazującego silne specyficzne wiązanie z Ae (np. co najmniej 108, a korzystnie co najmniej 10 M-1). Region zmienny ludzkiego łańcucha ciężkiego z tego faga służy następnie jako materiał wyjściowy do konstrukcji kolejnej biblioteki fagowej. W tej bibliotece każdy fag prezentuje ten sam region zmienny łańcucha ciężkiego (tj. region zidentyfikowany w pierwszej bibliotece prezentacji) i różny region zmienny łańcucha lekkiego. Regiony zmienne łańcucha lekkiego uzyskuje się z biblioteki przegrupowanych ludzkich regionów zmiennych łańcuchów lekkich. Ponownie selekcjonuje się fagi wykazującego silne specyficzne wiązanie z Ae. Fagi te prezentują regiony zmienne pełnych ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw Ae. Przeciwciała te wykazują zazwyczaj taką samą lub podobną specyficzność epitopową, jak mysi materiał wyjściowy.
PL 200 458 B1
v. Selekcja regionu stałego
Regiony zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciał chimerycznych, humanizowanych lub ludzkich można łączyć z co najmniej częścią ludzkiego regionu stałego. Wybór regionu stałego zależy częściowo od tego, czy pożądany jest zależny od przeciwciała dopełniacz, czy/lub zależna od komórek toksyczność. Przykładowo izotypy IgG1 i IgG3 mają aktywność dopełniacza, a izotypy IgG2 i IgG4 nie. Wybór izotypu może również wpływać na przedostawanie się przeciwciała do mózgu. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Regiony stałe łańcucha lekkiego mogą być regionami lambda lub kappa. Ekspresję przeciwciał można prowadzić w postaci tetramerów zawierających dwa łańcuchy lekkie i dwa ciężkie, w postaci oddzielnych łańcuchów ciężkich, łańcuchów lekkich, w postaci Fab, Fab', F(ab')2 i Fv, bądź w postaci przeciwciał jednołańcuchowych, w których domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone łącznikiem.
vi. Ekspresja zrekombinowanych przeciwciał
Przeciwciała chimeryczne, humanizowane i ludzkie wytwarza się zazwyczaj przez ekspresję rekombinacyjną. Zrekombinowane konstrukty polinukleotydowe zawierają zazwyczaj sekwencję kontrolującą ekspresję połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami kodującymi łańcuchy przeciwciał, włącznie z naturalnymi lub heterologicznymi regionami promotorowymi. Korzystnie, sekwencjami kontrolującymi ekspresję są eukariotyczne układy promotorowe w wektorach zdolnych do transformowania i transfekowania eukariotycznych komórek gospodarza. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniego gospodarza, gospodarza utrzymuje się w warunkach odpowiednich do wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych oraz zbierania i oczyszczania przeciwciał reaktywnych krzyżowo.
Wektory te są zazwyczaj zdolne do replikacji w organizmie gospodarza albo jako episomy, albo jako integralna część chromosomalnego DNA gospodarza. Najczęściej wektory ekspresyjne zawierają markery selekcyjne, np. oporności na ampicylinę lub oporności na higromycynę, co umożliwia wykrywanie tych komórek, które zostały stransformowanych pożądanymi sekwencjami DNA.
E. coli jest jednym z gospodarzy prokariotycznych szczególnie użytecznych do klonowania sekwencji DNA według niniejszego wynalazku. Do ekspresji użyteczne są również takie mikroorganizmy, jak drożdże. Korzystnym gospodarzem drożdżowym dla odpowiednich wektorów zawierających sekwencje kontrolujące ekspresję, miejsce początku replikacji, sekwencje terminujące i podobne, zależnie od potrzeb, jest Saccharomyces. Typowe promotory obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej i innych enzymów glikolitycznych. Indukowalne promotory drożdżowe obejmują, między innymi, promotory dehydrogenazy alkoholowej, izocytochromu C i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystywanie maltozy i galaktozy.
Komórki ssaków są korzystnymi gospodarzami do ekspresji odcinków nukleotydowych kodujących immunoglobuliny lub ich fragmenty, patrz Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). W dziedzinie tej opracowano liczne odpowiednie linie komórek gospodarza zdolne do wydzielania nietkniętych białek heterologicznych, takie jak linie komórek CHO, różne linie komórek COS, komórki HeLa, komórki L i linie komórek szpiczaka. Korzystnie, komórki nie są komórkami ludzkimi. Wektory ekspresyjne dla tych komórek mogą zawierać sekwencje regulujące ekspresję, takie jak miejsce początku replikacji, promotor, sekwencja wzmacniająca (Queen i in., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) i niezbędne miejsca informacji o modyfikacjach, takie jak miejsca wiążące rybosomy, miejsca składania RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje terminacji transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami regulujące ekspresję są promotory pochodzące z genów endogennych, wirusa cytomegalii, SV40, adenowirusa, wirusa brodawczaka bydła i podobne, patrz Co i in., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Alternatywnie, sekwencje kodujące przeciwciało mogą zostać włączone jako transgeny do wprowadzenia do genomu zwierzęcia transgenicznego, a następnie mogą ulegać ekspresji w mleku tego zwierzęcia (patrz np. US 5 741 957, US 5 304 489, US 5 849 922). Odpowiednie transgeny zawierają sekwencje kodujące łańcuchy lekki i/lub ciężki połączone w sposób umożliwiający działanie z promotorem i sekwencją wzmacniającą z genu specyficznego dla gruczołu sutkowego, takiego jak kazeiny lub laktoglobuliny beta.
Wektory zawierające będące przedmiotem zainteresowania odcinki DNA można przenosić do komórek gospodarza dobrze znanymi metodami, zależnie od rodzaju komórkowego gospodarza. Przykładowo dla komórek prokariotycznych powszechnie stosuje się transfekcję z wykorzystaniem chlorku wapniowego, podczas gdy dla innych gospodarzy komórkowych można stosować traktowanie fosforanem wapniowym, elektroporację, lipofekcję, transfekcję biolistyczną lub transfekcję opartą na wirusach. Inne metody stosowane do transformowania komórek ssaków obejmują stosowanie polibre18
PL 200 458 B1 nu, fuzji protoplastów, liposomów, elektroporacji i mikroiniekcji (patrz Sambrook i in., supra). Przy tworzeniu zwierząt transgenicznych, transgeny można wstrzykiwać do zapłodnionych komórek jajowych lub wprowadzać do genomu zarodkowych komórek macierzystych i jądra takich komórek przenosić do pozbawionych jąder komórek jajowych.
Po ekspresji przeciwciała można oczyszczać zgodnie ze standardowymi procedurami wykorzystywanymi w tej dziedzinie, takimi jak oczyszczanie przez HPLC, chromatografię kolumnową, elektroforezę żelową i podobne (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY 1982)).
3. Białka nośnikowe
Niektóre czynniki do indukowania odpowiedzi odpornościowej zawierają odpowiedni epitop dla indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw złogom amyloidu, ale są zbyt małe, aby były immunogenne. W takiej sytuacji, peptydowy immunogen można łączyć z odpowiednim nośnikiem dla wspomagania wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Odpowiednie nośniki obejmują albuminy surowicy, hemocyjaninę skrzypłocza, cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulinę, owoalbuminę, toksoid tężcowy lub toksoidy innych bakterii patogennych, takich jak maczugowiec błonicy, E. coli, przecinkowiec cholery lub H. pylori, albo atenuowaną pochodną toksyny. Inne nośniki obejmują epitopy komórek T, które wiążą się z wieloma allelami MHC, np. z co najmniej 75% wszystkich alleli ludzkiego MHC. Takie nośniki nazywane są czasem w tej dziedzinie „uniwersalnymi epitopami komórek T”. Przykłady uniwersalnych epitopów komórek T obejmują:
hemaglutyninę wirusa grypy: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT
PADRE (identyczne aminokwasy pogrubiono) AKXVAAWTLKAAA
CS zarodźca malarii: epitop T3 EKKIAKMEKASSVFNV antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B: HBsAg19-28 FFLLTRILTI
Białko szoku cieplnego 65: hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG laseczkę Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL toksoid tężcowy: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL toksoid tężcowy: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE gp120 HIV T1: KQIINMWQEVGKAMYA
Inne nośniki do stymulowania lub wzmacniania odpowiedzi odpornościowej obejmują cytokiny, takie jak IL-1, peptydy α i β IL-1, IL-2, YlNF, IL-10, GM-CSF oraz chemokiny, takie jak MlP1a i β i RANTES. Czynniki immunogenne można także łączyć z peptydami, które wzmacniają transport w tkankach, jak opisano w O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614.
Czynniki iminunogenne można łączyć z nośnikami przez sieciowanie chemiczne. Techniki łączenia immunogenu z nośnikiem obejmują tworzenie wiązań disiarczkowych z zastosowaniem N-sukcynynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionianu (SPDP) lub sukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC) (jeśli peptyd pozbawiony jest grupy sulfhydrylowej, można ją wprowadzić przez dodanie reszty cysteiny). Odczynniki te tworzą wiązanie disiarczkowe z resztami cystein peptydu jednego białka i wiązanie amidowe z grupą ε-aminową lizyny lub inną wolną grupą aminową innych aminokwasów. Wiele takich czynników tworzących wiązania disiarczkowe/amidowe opisano w Immun. Rev. 62, 185 (1982). Inne bifunkcjonalne czynniki sprzęgające tworzą zamiast wiązania disiarczkowego wiązanie tioeterowe. Wiele z tych czynników tworzących wiązania tioeterowe jest dostępnych w handlu i obejmują one reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, kwasu 2-bromooctowego, kwasu 2-jodooctowego i kwasu 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylowego. Grupy karboksylowe można aktywować przez łączenie ich z sukcynimidem lub solą sodową kwasu 1-hydroksylo-2-nitro-4-sulfonowego.
Ekspresję immunogennych peptydów można również prowadzić w postaci białek fuzyjnych z nośnikami (tj. peptydami heterologicznymi). Immunogenny peptyd można łączyć z nośnikiem końcem aminowym, końcem karboksylowym lub oboma końcami. Ewentualnie, w białku fuzyjnym mogą być obecne wielokrotne powtórzenia peptydu immunogennego. Ewentualnie, peptyd immunogenny można łączyć z wieloma kopiami peptydu heterologicznego, na przykład zarówno na końcu N, jak i C. Niektóre peptydy nośnikowe służą do indukowania odpowiedzi pomocniczych komórek T przeciw peptydowi nośnikowemu. Z kolei indukowane pomocnicze komórki T indukują odpowiedź komórek B skierowaną przeciw immunogennemu peptydowi połączonemu z peptydem nośnikowym.
Niektóre środki według wynalazku zawierają białko fuzyjne, w którym N-końcowy fragment Ae połączono końcem C z peptydem nośnikowym. W takich środkach N-końcowa reszta fragmentu Ae stanowi N-końcową resztę białka fuzyjnego. Zgodnie z tym, takie białka fuzyjne są efektywne pod względem indukowania przeciwciał, które wiążą się z epitopem, wymagając N-końcowej reszty Ae
PL 200 458 B1 w wolnej postaci. Niektóre ś rodki wedł ug wynalazku zawierają liczne powtórzenia N-koń cowego odcinka Ae połączone na końcu C z jedną lub więcej kopiami peptydu nośnikowego. N-końcowy fragment AP włączonego do takich białek fuzyjnych zaczyna się niekiedy od Ae1-3, a kończy na Ae7-11. Korzystnymi N-końcowymi fragmentami Ae są Ae1-7, Ae1-3, 1-4, 1-5 i 3-7. Niektóre białka fuzyjne zawierają tandem różnych N-końcowych odcinków Ae. Przykładowo białko fuzyjne może zawierać Ae1-7, po którym następuje Ae1-3, po którym następuje peptyd heterologiczny.
W niektórych białkach fuzyjnych, N-końcowy odcinek Ae łączy się na końcu N z heterologicznym białkiem nośnikowym. Można stosować tu te same N-końcowe odcinki Ae, jak w przypadku fuzji C-końcowych. Niektóre białka fuzyjne zawierają heterologiczny peptyd połączony z końcem N N-końcowego odcinka Ae, który z kolei jest połączony z jednym lub więcej dodatkowych, tandemowo ułożonych N-końcowych odcinków Ae.
Niektóre przykłady białek fuzyjnych odpowiednich do stosowania w wynalazku przedstawiono poniżej. Niektóre z tych białek fuzyjnych zawierają odcinki Ae połączone z epitopami toksoidu tężcowego, takimi jak opisane w US 5 196 512, EP 378 881 i EP 427 347. Niektóre białka fuzyjne zawierają odcinki Ae połączone z peptydami nośnikowymi opisanymi w US 5 736 142.
Niektóre peptydy heterologiczne są uniwersalnymi epitopami komórek T. W niektórych sposobach czynnik do podawania jest po prostu pojedynczym białkiem fuzyjnym z odcinkiem Ae połączonym liniowo z odcinkiem heterologicznym. W niektórych sposobach czynnikiem jest multimer białka fuzyjnego o wzorze 2x, w którym x oznacza liczbę całkowitą z zakresu 1-5. Korzystnie, x wynosi 1, 2 lub 3, najkorzystniej 2. Gdy x wynosi dwa, taki multimer zawiera cztery białka fuzyjne połączone w korzystnej konfiguracji oznaczonej MAP4 (patrz US 5 229 490).
Epitopy Ae podkreślono.
Konfigurację MAP4 przedstawiono poniżej. Struktury rozgałęzione uzyskuje się rozpoczynając syntezę peptydów zarówno na końca N, jak i na grupach aminowych łańcuchów bocznych lizyny. Zależnie od tego, ile razy w sekwencji występuje lizyna umożliwiająca rozgałęzianie, otrzymywana w wyniku struktura bę dzie prezentować wiele koń ców N. W tym przykł adzie utworzono cztery identyczne końce N na rdzeniu zawierającym rozgałęziające lizyny. Takie zwielokrotnienie znacznie zwiększa odpowiedź pokrewnych komórek B.
Peptyd Peptyd Peptyd Peptyd
AN90549 (Ae 1-7/toksoid tężcowy 830-844 w konfiguracji MAP4):
DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL
AN90550 (Ae 1-7/toksoid tężcowy 947-967 w konfiguracji MAP4):
DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
AN90542 (Ae 1-7/toksoid tężcowy 830-844 + 947-967 w konfiguracji liniowej): DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
AN90576: (Ae 3-9)/toksoid tężcowy 830-844 w konfiguracji MAP4):
EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL
Peptyd opisany w US 5 736 142 (wszystkie w konfiguracjach liniowych):
AN90562 (Ae 1-7/peptyd):
AKXVAAWTLKAAADAEFRHD AN90543 (Ae 1-7 x 3/peptyd):
DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA Inne przykłady białek fuzyjnych (immunogenny epitop Ae pogrubiono) obejmują:
PL 200 458 B1
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR
EFRHDSG- ISQAVHAAHAEINEAGR
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRV-PKVSASHLE-DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL na żywicy o 2 odgałęzieniach:
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (białko fuzyjne synukleiny w konfiguracji MAP-4)
Te same lub podobne białka nośnikowe i metody łączenia można stosować do tworzenia przeciwciał skierowanych przeciw Ae do stosowania w immunizacji biernej. Przykładowo Ae lub jego fragment połączony z nośnikiem można podawać zwierzęciu laboratoryjnemu przy wytwarzaniu przeciwciał monoklonalnych do Ae.
4. Kwasy nukleinowe kodujące czynniki terapeutyczne
Odpowiedź odpornościową przeciw złogom amyloidu można również indukować przez podawanie kwasów nukleinowych kodujących odcinki peptydu Ae i ich fragmenty, inne immunogeny peptydowe lub przeciwciała i ich łańcuchy składowe używane do immunizacji biernej. Takimi kwasami nukleinowymi mogą być DNA lub RNA. Odcinek kwasu nukleinowego kodujący immunogen zazwyczaj łączy się z elementami regulującymi, takimi jak promotor i sekwencja wzmacniająca, które umożliwiają ekspresję odcinka DNA w wybranych komórkach docelowych pacjenta. Do ekspresji w komórkach krwi, co jest pożądane przy indukcji odpowiedzi odpornościowej, odpowiednie do kierowania ekspresją są elementy promotorowe i sekwencji wzmacniających z genów łańcuchów lekkich lub ciężkich immunoglobulin lub główny promotor i sekwencja wzmacniająca średnio wczesnych genów CMV. Połączone elementy regulujące i sekwencje kodujące często klonuje się w wektorze. Przy podawaniu przeciwciał dwułancuchowych, oba łańcuchy można klonować w tym samym lub w oddzielnych wektorach.
Dostępne są liczne układy wektorów wirusowych, obejmujące układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); wektory adenowirusowe (patrz Bett i in., J. Virol. 67, 5911 (1993)); wektory pochodzące od wirusów towarzyszących adenowirusom (patrz np. Zhou i in., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny wirusów ospy, obejmujące wirusa ospy bydlęcej i wirusy ospy ptasiej, wektory wirusowe z rodzaju alfawirusów, takie jak te pochodzące od wirusów Sindbis i gorączki Semliki Forest (patrz np. Dubensky i in., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), wirusa wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu (patrz US 5 643 576) i rabdowirusy, takie jak wirus pryszczycy (patrz WO 96/34625) i wirusy brodawczaka (Ohe i in., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo i in., WO 94/12629 oraz Xiao i Brandsma, Nucleic Acids Res. 24, 2630-2622 (1996)).
PL 200 458 B1
DNA kodujący immunogen lub zawierający go wektor, można zamykać w liposomach. Odpowiednie lipidy i zbliżone analogi opisano w US 5 208 036, 5 264 618, 5 279 833 i 5 283 185. Wektory i DNA kodujące immunogen można również adsorbować lub łączyć z nośnikami w postaci cząstek, których przykłady obejmują polimery polimetylometakrylanowe oraz polilaktydy i kopolimery laktydoglikolidowe, patrz np. McGee i in., J. Micro Encap. (1996).
Wektory do terapii genowej lub nagie DNA można dostarczać in vivo przez podawanie pojedynczemu pacjentowi, zazwyczaj przez podawanie ogólnoustrojowe (np. dożylne, dootrzewnowe, donosowe, dożołądkowe, przezskórne, domięśniowe, podskórne lub przez wlew doczaszkowy), bądź przez stosowanie miejscowe (patrz np. US 5 399 346). Takie wektory mogą ponadto zawierać czynniki wspomagające, takie jak bupiwakina (patrz np. US 5 593 970). DNA można również podawać pistoletem genowym, patrz Xiao i Brandsma, supra. DNA kodujący immunogen wytrąca się na powierzchni mikroskopijnych perełek metalowych. Mikropociski przyspiesza się falą uderzeniową lub rozprężającym się helem i wnikają one do tkanek na głębokość kilku warstw komórek. Odpowiednie jest na przykład Accel™ Gene Delivery Device produkowane przez Agacetus, Inc. Middleton, WI. Alternatywnie, nagi DNA może przenikać przez skórę do krwioobiegu po prostu po nakropleniu DNA na skórę i wywołaniu podrażnienia chemicznego lub mechanicznego (patrz WO 95/05853).
W innej wersji, wektory kodujące immunogeny można wprowadzić do komórek ex vivo, takich jak komórki pobrane od pojedynczego pacjenta (np. limfocytów, aspiratów szpiku kostnego, bioptatu tkanki) lub krwiotwórczych komórek macierzystych uniwersalnego dawcy, po czym komórki ponownie wszczepia się pacjentowi, zazwyczaj po wyselekcjonowaniu tych komórek, do których wprowadzono wektor.
III. Przeszukiwanie przeciwciał pod kątem aktywności usuwania antygenu
Możliwe jest przeszukiwanie przeciwciał pod kątem aktywności usuwania złogów amyloidu lub jakiegokolwiek innego antygenu, lub związanej jednostki biologicznej, których usunięcie jest pożądane. W celu przeszukiwania pod kątem aktywności wobec złogu amyloidu, próbkę tkanki z mózgu pacjenta z chorobą Alzheimerą lub zwierzęcego modelu, wykazującego patologię charakterystyczną dla choroby Alzheimerą, kontaktuje się w podłożu in vitro z komórkami fagocytarnymi mającymi receptor Fc, takimi jak komórki mikrogleju, i testowanym przeciwciałem. Komórkami fagocytarnymi może być hodowla pierwotna lub linia komórkowa, taka jak BV-2, C8-B4 lub THP-1, W niektórych sposobach składniki łączy się na szkiełku mikroskopowym, dla ułatwienia śledzenia mikroskopowego. W niektórych sposobach prowadzi się wiele równoległych reakcji w studzienkach płytki do mikromiareczkowania. W takim układzie, w oddzielnych studzienkach można umieszczać oddzielne miniaturowe szkiełka mikroskopowe lub stosować detekcję inną niż mikroskopowa, taką jak wykrywanie Ae w oznaczeniu ELISA. Korzystnie, wykonuje się szereg pomiarów ilości złogów amyloidu w mieszaninie reakcyjnej in vitro, zaczynając od poziomu podstawowego przed rozpoczęciem reakcji i jednej lub więcej wartości oznaczonych podczas reakcji. Antygen można wykrywać przez wybarwianie, na przykład fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae lub innemu składnikowi płytek amyloidowych. Przeciwciałem stosowanym do wybarwiania może być to samo przeciwciało, które testowano pod kątem aktywności usuwania lub inne. Zmniejszenie złogów amyloidu podczas reakcji w stosunku do poziomu wyjściowego wskazuje, że testowane przeciwciało wykazuje aktywność usuwania. Takie przeciwciała prawdopodobnie będą użyteczne w zapobieganiu lub leczeniu choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych.
Analogiczne sposoby można stosować do przeszukiwania przeciwciał pod kątem aktywności usuwania innych rodzajów jednostek biologicznych. Oznaczenie można w zasadzie stosować do wykrywania aktywności usuwania dowolnego rodzaju jednostki biologicznej. Zazwyczaj, jednostka biologiczna odgrywa pewną rolę w chorobie ludzi lub zwierząt. Jednostkę biologiczną można dostarczać jako próbkę tkanki lub w postaci wyizolowanej. Jeśli dostarcza się ją w postaci próbki tkanki, korzystnie nie utrwala się jej, dla umożliwienia łatwego dostępu do składników próbki tkanki i dla uniknięcia związanych z utrwalaniem zmian konformacji składników. Przykłady próbek tkanek, które można testować w takim oznaczeniu, obejmują tkankę rakową, tkankę przedrakową, tkanki zawierające rozrosty łagodne, takie jak brodawki i pieprzyki, tkankę zainfekowaną patogennymi mikroorganizmami, tkankę z naciekiem komórek zapalnych, tkankę zawierającą patologiczną macierz międzykomórkową (np. przy włóknistym zapaleniu osierdzia), tkankę zawierającą nieprawidłowe antygeny i tkankę blizny. Przykłady wyizolowanych jednostek biologicznych, które można stosować obejmują Ae, antygeny wirusowe lub wirusy, proteoglikany, antygeny innych mikroorganizmów patogennych, antygeny nowotworowe i cząsteczki adhezyjne. Takie antygeny można otrzymywać między innymi ze źródeł naturalnych, przez rekombinacyjną ekspresję lub syntezę chemiczną. Próbkę tkanki lub wyizolowaną jed22
PL 200 458 B1 nostkę biologiczną kontaktuje się w podłożu z komórkami fagocytarnymi mającymi receptory Fc, takimi jak monocyty lub komórki mikrogleju oraz testowanym przeciwciałem. Przeciwciało może być skierowane przeciw testowanej jednostce biologicznej lub antygenowi związanemu z tą jednostką. W tej drugiej sytuacji, celem testu jest sprawdzenie, czy jednostka biologiczna jest zastępczo fagocytowana z antygenem. Zazwyczaj, chociaż niekoniecznie, przeciwciało i jednostkę biologiczną (niekiedy z towarzyszącym antygenem) łączy się przed dodaniem komórek fagocytarnych. Następnie mierzy się stężenie pozostającej w podłożu jednostki biologicznej i/lub towarzyszącego antygenu, jeśli jest on obecny. Spadek ilości lub stężenia antygenu lub towarzyszącej jednostki biologicznej w podłożu wskazuje, że przeciwciało w połączeniu z komórkami fagocytarnymi wykazuje odpowiedź usuwania antygenu i/lub towarzyszącej jednostki biologicznej (patrz np. przykład 14).
IV. Pacjenci kwalifikujący się do leczenia
Pacjenci kwalifikujący się do leczenia obejmują osobników, w przypadku których istnieje ryzyko wystąpienia choroby, ale nie wykazujących objawów, jak również pacjentów, obecnie wykazujących objawy. W przypadku choroby Alzheimera, w zasadzie u każdego istnieje ryzyko jej wystąpienia, jeśli żyje dostatecznie długo. Dlatego też niniejsze sposoby można stosować profilaktycznie w całej populacji, bez potrzeby jakiegokolwiek oceniania ryzyka u danego pacjenta. Przedstawiane sposoby są szczególnie użyteczne u osób, u których istnieje rozpoznane genetyczne ryzyko wystąpienia choroby Alzheimera. Osobnicy tacy obejmują tych mających krewnych, którzy doświadczyli tej choroby oraz tych, u których stwierdzono ryzyko przez analizę markerów genetycznych lub biochemicznych. Genetyczne markery ryzyka wystąpienia choroby Alzheimera obejmują mutacje w genie APP, szczególnie mutacje w pozycji 717 oraz pozycjach 670 i 671, odpowiednio mutacjami Hardy i szwedzka (patrz Hardy, TINS, supra). Innymi markerami ryzyka są mutacje w genach presenilin, PS1 i PS2 oraz ApoE4, rodzinne występowanie AD, hipercholesterolemia i miażdżyca tętnic. Osoby obecnie cierpiące na chorobę Alzheimera można rozpoznawać dzięki charakterystycznej demencji, jak również występowaniu opisanych powyżej czynników ryzyka. Ponadto, dostępne są liczne testy diagnostyczne do identyfikowania osobników, którzy mają AD. Obejmują one pomiar poziomu białka tau i Ae42 w płynie mózgowo-rdzeniowym. Podwyższony poziom białka tau i obniżony poziom Ae42 oznacza obecność AD. Osoby cierpiące na chorobę Alzheimera można również diagnozować dzięki kryteriom ADRDA, jak dyskutuje się w części „Przykłady”.
U pacjentów bezobjawowych leczenie można rozpocząć w jakimkolwiek wieku (np. 10, 20, 30 lat). Zazwyczaj, jednakże, nie jest konieczne rozpoczynanie leczenia zanim pacjent nie osiągnie wieku 40, 50, 60 lub 70 lat. Leczenie wymaga zazwyczaj wielu dawek w ciągu pewnego okresu. Leczenie można monitorować przez oznaczanie przeciwciała lub odpowiedzi aktywowanych komórek T lub B na czynnik leczniczy (np. peptyd Ae) w czasie. Kiedy odpowiedź spada, zalecana jest dawka przypominająca. W przypadku pacjentów z potencjalnym zespołem Downa, leczenie można rozpoczynać przed narodzeniem, przez podawanie czynnika terapeutycznego matce lub krótko po porodzie.
V. Schematy terapeutyczne
W zastosowaniach profilaktycznych, kompozycje farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi podatnemu lub w inny sposób narażonemu na chorobę Alzheimera, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub obniżenia ryzyka, złagodzenia ciężkości lub opóźnienia wystąpienia choroby, włącznie z biochemicznymi, histologicznymi i/lub behawioralnymi objawami choroby, jej powikłań i pośrednich fenotypów patologicznych ujawniających się podczas rozwoju choroby. W zastosowaniach terapeutycznych, kompozycje lub leki podaje się pacjentowi podejrzanemu lub już cierpiącemu na taką chorobę, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego powstrzymania objawów choroby (biochemicznych, histologicznych i/lub behawioralnych), włącznie z jej powikłaniami i pośrednimi fenotypami patologicznymi podczas rozwoju choroby. W niektórych sposobach podawanie czynnika zmniejsza lub eliminuje upośledzenie funkcji poznawczych u pacjentów, u których nie rozwinęła się jeszcze charakterystyczna patologia choroby Alzheimera. Ilość odpowiednią do prowadzenia terapii leczniczej i/lub profilaktycznej definiuje się jako dawkę skuteczną profilaktycznie lub leczniczo. W schematach zarówno profilaktycznych, jak i leczniczych, czynniki zazwyczaj podaje się w kilku dawkach, aż do uzyskania wystarczającej odpowiedzi odpornościowej. Zazwyczaj odpowiedź odpornościową monitoruje się i gdy zaczyna ona słabnąć, podaje się kolejne dawki.
Skuteczne dawki kompozycji według niniejszego wynalazku do leczenia opisanych powyżej stanów, zróżnicowane są zależnie od wielu różnych czynników, obejmujących sposób podania, miejsce docelowe, fizjologiczny stan pacjenta, to, czy pacjent jest człowiekiem, czy zwierzęciem, inne podawane leki oraz to, czy leczenie jest profilaktyczne, czy terapeutyczne. Zazwyczaj pacjentem jest
PL 200 458 B1 człowiek, ale można również leczyć ssaki gatunku nie będącego człowiekiem, włącznie z ssakami transgenicznymi. Dawki terapeutyczne muszą mieć określone miano w celu optymalizacji bezpieczeństwa i skuteczności. Ilość immunogenu zależy od tego, czy podaje się również adiuwant, przy czym przy braku adiuwanta wymagane są wyższe dawki. Ilość immunogenu niekiedy waha się od 1 do 500 μg na pacjenta, a częściej od 5 do 500 μg na pojedyncze wstrzyknięcie w przypadku podawania człowiekowi. Czasami stosuje się wyższą dawkę, 1-2 mg na iniekcję. Zazwyczaj, stosuje się 10, 20, 50 lub 100 μg na każdą iniekcję u człowieka. Masa immunogenu zależy również od stosunku masy immunogennego epitopu w immunogenie do całkowitej masy immunogenu. Zazwyczaj stosuje się od 10-3 do 10-5 mikromoli immunogennego epitopu na mikrogram immunogenu. Częstość iniekcji może się znacząco różnić, od jednej dziennie do jednej rocznie lub jednej na dziesięć lat. W każdym dniu, w którym podaje się dawkę immunogenu, jest ona większa niż 1 μg/pacjenta, a zazwyczaj większa niż 10 μg/pacjenta, jeśli podaje się również adiuwant albo większa niż 10 μg/pacjenta, a zazwyczaj większa niż 100 μg/pacjenta przy braku adiuwanta. Typowy schemat składa się z immunizacji, po której następują iniekcje przypominające w odstępach czasu, na przykład odstępach 6 tygodni. Inny schemat składa się z immunizacji, po której następują iniekcje przypominające po 1, 2 i 12 miesiącach. Inny schemat wymaga iniekcji co dwa miesiące przez całe życie. Alternatywnie, iniekcje przypominające można stosować nieregularnie, gdy na ich potrzebę wskazuje monitorowanie odpowiedzi odpornościowej.
Przy immunizacji biernej przeciwciałem dawka pozostaje w zakresie od 0,0001 do 100 mg/kg, a częściej od 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała biorcy. Przykładowo dawki mogą wynosić 1 mg/kg wagi ciała lub 10 mg/kg wagi ciała, bądź mogą pozostawać w zakresie 1-10 mg/kg. Przykładowy schemat leczenia wymaga podawania raz na dwa tygodnie lub raz na miesiąc lub co od 3 do 6 miesięcy. W niektórych sposobach podaje się jednocześnie dwa lub więcej przeciwciał monoklonalnych o różnych specyficznościach wiązania, w którym to przypadku dawki każdego z podawanych przeciwciał mieszczą się w podanych zakresach. Przeciwciało zazwyczaj podaje się w wielu sytuacjach. Odstępy pomiędzy pojedynczymi dawkami mogą być tygodniowe, miesięczne lub roczne. Odstępy te mogą być również nieregularne, podyktowane wynikami pomiaru poziomów przeciwciała skierowanego przeciw Ae we krwi pacjenta. W niektórych sposobach dawki dobiera się w taki sposób, aby uzyskać stężenie przeciwciała w osoczu 1-1000 μg/ml, a w innych sposobach 25-300 μg/ml. Alternatywnie, przeciwciało można podawać w preparacie o przedłużonym uwalnianiu, w którym to przypadku wymagane jest podawanie z mniejszą częstością. Dawkowanie i częstość różnią się zależnie od okresu półtrwania przeciwciała u pacjenta. Generalnie, przeciwciała ludzkie wykazują najdłuższe okresy półtrwania, a przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimeryczne i przeciwciała gatunków innych niż człowiek coraz krótsze. Dawkowanie i częstość podawania różni się zależnie od tego czy leczenie jest profilaktyczne, czy terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych podaje się stosunkowo niskie dawki stosunkowo rzadko przez długi okres. Niektórych pacjentów poddaje się leczeniu przez resztę życia. W zastosowaniach terapeutycznych wymagane są niekiedy stosunkowo wysokie dawki w stosunkowo krótkich odstępach, dopóki nie zmniejszy się lub zahamuje postępów choroby, a korzystnie dopóki pacjent nie wykaże częściowego lub całkowitego ustąpienie objawów choroby. Następnie pacjenta można poddawać schematowi terapeutycznemu.
Dawki kwasów nukleinowych kodujących immunogeny pozostają w zakresach od około 10 ng do 1 g, od 100 ng do 100 mg, od 1 μg do 10 mg lub 30-300 μg DNA na pacjenta. Dawki infekcyjnych wektorów wirusowych pozostają w zakresie od 10 do 100 lub więcej wirionów na dawkę.
W leczeniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym czynniki do indukowania odpowiedzi odpornościowej można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dotętniczo, doczaszkowo, dootrzewnowo, donosowo lub domięśniowo. Najbardziej typową drogą podawania czynnika immunogennego jest podawanie podskórne, chociaż inne sposoby mogą być równie skuteczne. Kolejną najczęściej stosowaną drogą jest iniekcja domięśniowa. Ten rodzaj iniekcji wykonuje się zazwyczaj do mięśni ramienia lub nogi. W niektórych sposobach czynniki wstrzykuje się bezpośrednio do określonej tkanki, w której nagromadzają się złogi, na przykład przez iniekcję doczaszkową. Korzystne do podawania przeciwciała są iniekcja domięśniowa i wlew dożylny. W niektórych sposobach określone przeciwciała terapeutyczne wstrzykuje się bezpośrednio do czaszki. W niektórych sposobach przeciwciała podaje się w kompozycji lub urządzeniu o przedłużonym uwalnianiu, takim jak urządzenie Medipad™.
Czynniki według wynalazku można ewentualnie podawać w kombinacji z innymi czynnikami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby
PL 200 458 B1
Alzheimera i zespołu Downa, w których złogi amyloidu występują w mózgu, czynniki według wynalazku można również podawać w połączeniu z innymi czynnikami, które zwiększają przechodzenie czynników według wynalazku przez barierę krew-mózg.
Immunogenne czynniki według wynalazku, takie jak peptydy, niekiedy podaje się w kombinacji z adiuwantem. W kombinacji z peptydem, takim jak Ae, można stosować różne adiuwanty do wywołania odpowiedzi odpornościowej. Korzystne adiuwanty zwiększają normalną odpowiedź na immunogen, nie powodując konformacyjnych zmian immunogenu, które wpływałyby na jakościową postać odpowiedzi. Korzystne adiuwanty obejmują wodorotlenek glinowy i fosforan glinowy, 3-De-O-acylowany monofosforylowany lipid A (MPL™) (patrz GB 2 220 211 (RIBI Immuno-Chem Research Inc., Hamilton, Montana, obecnie część Corixa). Stimulon™ QS-21 jest glikozydem triterpenowym, czyli saponiną izolowaną z kory Quillaja Saponaria Molina, drzewa występującego w Ameryce Południowej (patrz Kensil i in., w: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (red. Powell i Newman, Plenum Press, NY, 1995); US 5 057 540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Innymi adiuwantami są emulsje olejów w wodzie (takich jak skwalen i olej arachidowy), ewentualnie w kombinacji z czynnikami immunostymulującymi, takimi jak monofosforylowany lipid A (patrz Stoute i in., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Innym adiuwantem jest CpG (WO 98/40100). Alternatywnie, Ae można sprzęgnąć z adiuwantem. Jednakże, takie sprzęganie nie powinno znacząco zmienić konformacji Ae tak, by wpływać na charakter odpowiedzi odpornościowej na niego. Adiuwanty można podawać jako składnik kompozycji terapeutycznej z czynnikiem aktywnym lub można je podawać oddzielnie, przed, równocześnie lub po podaniu czynnika terapeutycznego.
Korzystną klasą adiuwantów są sole glinu (ałun), takie jak wodorotlenek glinowy, fosforan glinowy, siarczan glinowy. Takie adiuwanty można stosować z lub bez innych specyficznych czynników immunostymulujących, takich jak MPL lub 3-DMP, QS-21, polimeryczne lub monomeryczne aminokwasy, takich jak kwas poliglutaminowy lub polilizyna. Inną klasą adiuwantów są preparaty emulsji oleju w wodzie. Takie adiuwanty można stosować z lub bez innych czynników immunostymulujących, takich jak peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1',2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetyloglukosaminylo-N-acetylomuramylo-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksypropyloamido-(DTP-DPP)-teramid TM lub inne składniki bakteryjnej ściany komórkowej.
Emulsje typu olej w wodzie obejmują:
(a) MF59 (WO 90/14837), zawierający 5% skwalen, 0,5% Tween 80 i 0,5% Span 85 (ewentualnie zawierający różne ilości MTP-PE), któremu nadano postać cząstek submikroskopowych z zastosowaniem mikrofluidyzera, takiego jak mikrofluidyizer Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, zawierający 10% skwalen, 0,4% Tween 80, 5% polimer L121 blokowany Pluronic oraz thr-MDP albo poddany mikrofluidyzacji do uzyskania emulsji o cząstkach submikroskopowych, albo wytrząsany w celu uzyskania emulsji o większym rozmiarze cząstek i (c) system adiuwantowy Ribi™ (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) zawierający 2% skwalen, 0,2% Tween 80 i jeden lub wiele składników bakteryjnej ściany komórkowej z grupy składającej się z monofosforylowanego lipidu A (MPL), dimykolanu trehalozy (TDM) i szkieletu ściany komórkowej (CWS), korzystnie MPL + CWS (Detox™).
Inną klasą korzystnych adiuwantów są adiuwanty saponinowe, takie jak Stimulon™ (QS-21, Aquila, Farmingham, MA) lub cząsteczki z nich utworzone, takie jak ISCOM (kompleksy immunostymulujące) i ISCOMATRIX. Inne adiuwanty obejmują kompletny adiuwant Freunda (CFA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA). Inne adiuwanty obejmują cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworów (TNF).
Adiuwant można podawać z immunogenem w postaci pojedynczej kompozycji, bądź można podawać go przed, jednocześnie lub po podaniu immunogenu. Immunogen i adiuwant można pakować i dostarczać w tej samej fiolce lub można je pakować w oddzielnych fiolkach i mieszać przed użyciem. Immunogen i adiuwant zazwyczaj pakuje się z informacją wskazującą zamierzone zastosowanie lecznicze. Jeśli immunogen i adiuwant pakuje się oddzielnie, opakowanie zwykle zawiera instrukcję ich mieszania przed użyciem. Wybór adiuwanta i/lub nośnika zależy od stabilności preparatu immunogenu zawierającego adiuwant, drogi podania, schematu dawkowania, skuteczności adiuwanta u szczepionego gatunku, a w przypadku ludzi, farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest taki, który został zatwierdzony lub może zostać zatwierdzony do stosowania u ludzi przez odpowiednie organy kontrolne. Przykładowo kompletny adiuwant Freunda nie jest odpowiedni do podania ludziom.
PL 200 458 B1
Korzystne są ałun, MPL i QS-21. Ewentualnie, można stosować dwa lub więcej różnych adiuwantów jednocześnie. Korzystne kombinacje obejmują ałun z MPL, ałun z QS-21, MPL z QS-21 oraz ałun, QS-21 i MPL razem. Można również stosować niekompletny adiuwant Freunda (Chang i in., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), ewentualnie w kombinacji z którymkolwiek spośród ałunu, QS-21 i MPL oraz wszystkimi ich kombinacjami.
Czynniki według wynalazku często podaje się jako kompozycje farmaceutyczne zawierające czynnik aktywny terapeutyczny i różne inne składniki dopuszczalne farmaceutycznie. Patrz Remington's Pharmaceutical Science (wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, Pensylwania, 1980). Korzystna postać zależy od planowanego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Kompozycje mogą również zawierać, w zależności od pożądanej postaci, dopuszczalne farmaceutycznie, nietoksyczne nośniki i rozcieńczalniki, które definiuje się jako zaróbki powszechnie stosowane do nadawania postaci kompozycjom farmaceutycznym do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik wybiera się w taki sposób, aby nie wpływał na aktywność biologiczną kompozycji. Przykładami takich rozcieńczalników są woda destylowana, sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i roztwór Hanka. Ponadto, kompozycja lub postać farmaceutyczna może zawierać również inne nośniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nielecznicze i nieimmunogenne stabilizatory i podobne.
Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak chitosan, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe i kopolimery (takie jak SepharoseTM z przyłączonym lateksem, agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidowe (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Ponadto, nośniki te mogą działać jako czynniki immunostymulujące (tj. adiuwanty).
Przy podawaniu pozajelitowym, czynniki według wynalazku można podawać jako dawki iniekcyjne roztworu lub zawiesiny substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku z nośnikiem farmaceutycznym, którym może być jałowy płyn, taki jak woda, oleje, sól fizjologiczna, glicerol lub etanol. Dodatkowo, w kompozycjach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające lub emulgujące, środki powierzchniowo czynne, substancje buforujące pH i podobne. Innymi składnikami kompozycji farmaceutycznych są te pochodzące z ropy naftowej, zwierząt i roślin, bądź pochodzenia syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Generalnie, korzystnymi nośnikami, szczególnie w roztworach do iniekcji, są glikole, takie jak glikol propylenowy i glikol polietylenowy. Przeciwciała można podawać w postaci iniekcji depotu lub preparatu wszczepu, który można formułować w taki sposób, aby umożliwić przedłużone uwalnianie składnika aktywnego. Przykładowa kompozycja zawiera przeciwciało monoklonalne o stężeniu 5 mg/ml, któremu nadano postać w wodnym buforze składającym się z 50 mM L-histydyny, 150 mM NaCl, pH doprowadzone HCl do 6,0.
Zazwyczaj kompozycje przygotowuje się w postaci iniekcyjnej, jako ciekłe roztwory albo zawiesiny; można również przygotowywać postacie stałe odpowiednie do rozpuszczania lub zawieszania w ciekłych zaróbkach przed iniekcją. Preparaty można także emulgować lub zamykać w liposomach lub mikrocząstkach, takich jak polilaktyd, poliglikolid lub kopolimer, dla wzmocnienia wpływu adiuwanta, jak dyskutowano powyżej (patrz Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Środki według tego wynalazku można podawać w postaci iniekcji depotu lub preparatu wszczepu, który można utworzyć w taki sposób, aby umożliwić przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie składnika aktywnego.
Dodatkowe postacie odpowiednie do innych sposobów podawania obejmują postacie doustne, donosowe i dopłucne, czopki i preparaty do podawania przezskórnego.
W czopkach lepiszcza i nośniki obejmują np. glikole polialkilenowe i triglicerydy; takie czopki można tworzyć z mieszanin zawierających składnik aktywny w zakresie od 0,5% do 10%, korzystnie 1%-2%. Preparaty doustne zawierają zarobki, takie jak mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, sól sodowa sacharyny, celuloza i węglan magnezowy o czystości farmaceutycznej. Kompozycje mogą mieć postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10%-95% składnika aktywnego, korzystnie 25%-70%.
Wynikiem stosowania miejscowego może być dostarczenie przez skórę lub do skóry. Podawanie miejscowe można ułatwiać przez jednoczesne podanie czynnika z toksyną cholery lub jej detoksyfikowanymi pochodnymi lub jej podjednostkarni, bądź innymi podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i in., Nature 391, 851 (1998)). Jednoczesne podawanie można osiągnąć przez stosowa26
PL 200 458 B1 nie tych składników jako mieszaniny lub jako związanych cząsteczek uzyskanych dzięki sieciowaniu chemicznemu lub ekspresji w postaci białka fuzyjnego.
Alternatywnie, podanie przezskórne można uzyskać stosując plastry na skórę lub transferosomy (Paul i in., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i in., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).
VI. Sposoby diagnozowania
Możliwe jest wykrywanie odpowiedzi odpornościowej przeciw peptydowi Ae u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera lub na nią podatnych. Jest to szczególnie użyteczne do monitorowania przebiegu leczenia, któremu poddano pacjenta. Sposoby wykrywania odpowiedzi odpornościowej przeciw peptydowi Ae można wykorzystywać zarówno do monitorowania leczenia u pacjentów z objawami, jak i postępowania profilaktycznego u pacjentów bezobjawowych. Sposoby takie są użyteczne zarówno do monitorowania immunizacji czynnej (np. przeciwciała wytwarzanego w odpowiedzi na podawanie immunogenu), jak i immunizacji biernej (np. pomiaru poziomu podawanego przeciwciała).
1. Immunizacja czynna
Niektóre sposoby wymagają określenia wyjściowego poziomu odpowiedzi odpornościowej u pacjenta przed podaniem dawki czynnika i porównania go z poziomem odpowiedzi odpornościowej po leczeniu. Znaczący wzrost (tj., większy niż zwykły margines błędu doświadczalnego dla powtarzanych pomiarów tej samej próbki, wyrażony jako jedno odchylenie standardowe od średniej dla takich pomiarów) poziomu odpowiedzi odpornościowej sygnalizuje pozytywny wynik leczenia (tj. podawanie czynnika wywołało lub wzmocniło odpowiedź odpornościową). Jeśli poziom odpowiedzi odpornościowej nie zmienia się znacząco, bądź obniża się, wskazuje to na wynik ujemny. Ogólnie, u pacjentów przechodzących początkowy etap leczenia czynnikiem immunogennym oczekuje się wzrostu odpowiedzi odpornościowej po kolejnych dawkach, z ewentualnym osiągnięciem plateau. Zazwyczaj, gdy odpowiedź odpornościowa wzrasta, kontynuuje się podawanie czynnika. Osiągnięcie plateau wskazuje, że stosowanie leczenia można przerwać lub ograniczyć pod względem dawki lub częstotliwości podawania.
W innych sposobach określa się wartość kontrolną (tj. średnią i odchylenie standardowe) odpowiedzi immunologicznej dla populacji kontrolnej. Zazwyczaj osobników z populacji kontrolnej nie poddawano uprzednio leczeniu. Mierzone poziomy odpowiedzi immunologicznej u pacjenta po podaniu czynnika terapeutycznego porównuje się następnie z wartością kontrolną. Znaczący wzrost w stosunku do wartości kontrolnej (np. większy niż jedno odchylenie standardowe od średniej) sygnalizuje dodatni wynik leczenia. Brak znaczącego wzrostu, bądź spadek, sygnalizuje negatywny wynik leczenia. Gdy odpowiedź immunologiczna rośnie w stosunku do wartości kontrolnej, podawanie czynnika zazwyczaj kontynuuje się. Tak jak poprzednio, osiągnięcie plateau w stosunku do wartości kontrolnej wskazuje, że leczenie można przerwać lub ograniczyć pod względem dawki lub częstotliwości.
W innych sposobach wartość kontrolną odpowiedzi odpornościowej (np. średnią i odchylenie standardowe) określa się dla populacji kontrolnej osobników, których poddano leczeniu środkiem leczniczym i których odpowiedzi odpornościowe w odpowiedzi na kurację osiągnęły plateau. Mierzone u pacjenta poziomy odpowiedzi odpornościowej porównuje się z wartością kontrolną. Jeśli zmierzony u pacjenta poziom nie jest znacząco różny (np. o więcej niż jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej, leczenie można przerwać. Jeśli poziom u pacjenta jest znacząco niższy od wartości kontrolnej, uzasadnione jest dalsze podawanie czynnika. Jeśli poziom u pacjenta utrzymuje się poniżej wartości kontrolnej, wskazana może być zmiana schematu leczenia, na przykład zastosowanie innego adiuwanta.
W innych sposobach monitoruje się odpowiedź odpornościową u pacjenta, wobec którego aktualnie nie stosuje się leczenia, ale którego leczono uprzednio, dla określenia, czy wymagane jest wznowienie leczenia. Mierzony poziom odpowiedzi odpornościowej u pacjenta można porównywać z poziomem odpowiedzi uzyskanej uprzednio u pacjenta po poprzednim etapie leczenia. Znaczące obniżenie w stosunku do poprzedniego pomiaru (tj. większe od zwykłego marginesu błędu przy powtarzanych pomiarach tej samej próbki) wskazuje, że leczenie można wznowić. Alternatywnie, poziom zmierzony u pacjenta można porównywać z wartością kontrolną (średnia plus odchylenie standardowe) ustaloną dla populacji pacjentów po przebyciu leczenia. Alternatywnie, poziom mierzony u pacjenta można porównywać z wartością kontrolną dla populacji pacjentów leczonych profilaktycznie, którzy pozostają wolni od objawów choroby, bądź populacji pacjentów leczonych terapeutycznie, którzy wykazują złagodzenie objawów choroby. We wszystkich tych przypadkach, znaczący spadek w stosunku do poziomu kontrolnego (tj. większy niż o odchylenie standardowe) wskazuje na potrzebę wznowienia leczenia pacjenta.
PL 200 458 B1
Próbką tkanki do analizy jest zazwyczaj krew, osocze, surowica, śluz lub płyn mózgowo-rdzeniowy pacjenta. Próbkę analizuje się pod kątem odpowiedzi odpornościowej na jakąkolwiek postać peptydu Ae, zazwyczaj Ae42. Odpowiedź odpornościową można określić na podstawie obecności np. przeciwciał lub komórek T, które specyficznie wiążą peptyd Ae. Sposoby wykrywania przeciwciał specyficznych wobec Ae w oznaczeniu ELISA opisano w części „Przykłady”. Sposoby wykrywania reaktywnych komórek T opisano powyżej (patrz „Definicje”). W niektórych sposobach odpowiedź odpornościową określa się stosując oznaczenie usuwania, jak opisano w części III powyżej. W takich sposobach próbkę tkanki badanego pacjenta kontaktuje się ze złogami amyloidu (np. z myszy PDAPP) i komórkami fagocytarnymi mającymi receptory Fc. Następnie monitoruje się usuwanie złogów amyloidu. Występowanie i zakres odpowiedzi usuwania wskazuje na obecność i poziom przeciwciał zdolnych do usuwania Ae w próbce tkanki badanego pacjenta.
2. Immunizacja bierna
Generalnie, procedury monitorowania immunizacji biernej są podobne do tych opisanych powyżej dla monitorowania immunizacji czynnej. Jednakże, profil przeciwciał po immunizacji biernej zazwyczaj wykazuje natychmiastowy pik stężenia przeciwciał, po którym następuje wykładniczy zanik. Bez dalszych dawek, spadek prowadzi do osiągnięcia poziomu sprzed leczenia w ciągu dni lub miesięcy, w zależności od okresu półtrwania podawanego przeciwciała. Przykładowo okres półtrwania niektórych przeciwciał ludzkich jest rzędu 20 dni.
W niektórych sposobach pomiaru wyjściowego poziomu przeciwciał skierowanych przeciw Ae dokonuje się u pacjenta przed podawaniem, drugi pomiar wykonuje się wkrótce po podaniu, aby oznaczyć poziom przeciwciał w piku i jeden lub więcej kolejnych pomiarów wykonuje się w odstępach czasu, aby monitorować spadek poziomu przeciwciał. Gdy poziom przeciwciał spada do poziomu wyjściowego lub określonej wcześniej procentowej różnicy pomiędzy poziomem piku a wyjściowym (np. 50%, 25% lub 10%), podaje się następną dawkę przeciwciała. W niektórych sposobach poziom piku lub kolejne mierzone poziomy, po odjęciu poziomu wyjściowego, porównuje się z poziomami odniesienia, które, jak ustalono wcześniej, stanowią korzystny schemat terapii profilaktycznej lub leczniczej u innych pacjentów. Jeśli zmierzony poziom przeciwciała jest znacząco niższy od poziomu odniesienia (np. niższy od średniej minus jedno odchylenie standardowe poziomu odniesienia w populacji pacjentów, którzy odnieśli korzyść z leczenia), wskazane jest podanie dodatkowej dawki przeciwciała.
3. Zestawy diagnostyczne
Zestawy diagnostyczne służą do przeprowadzania opisanych powyżej sposobów diagnostycznych. Zazwyczaj takie zestawy zawierają czynnik wiążący się specyficznie z przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae. Zestaw może również obejmować znacznik. Dla wykrywania przeciwciał skierowanych przeciw Ae, znacznik ma zwykle postać znakowanych przeciwciał antyidiotypowych. Przy wykrywaniu przeciwciał czynnik można dostarczać w postaci uprzednio związanej z fazą stałą, taką jak studzienki płytki do mikromiareczkowania. Zestawy zazwyczaj zawierają również oznakowanie dostarczające informację o stosowaniu zestawu. Oznakowanie może również obejmować wykres lub inny schemat korelujący poziomy mierzonego znacznika z poziomami przeciwciał skierowanych przeciw Ae. Określenie „oznakowanie” odnosi się do każdego materiału pisanego lub zarejestrowanego, który dołącza się lub w inny sposób łączy z zestawem w dowolnym czasie podczas wytwarzania, transportu, sprzedaży lub stosowania. Przykładowo termin ten obejmuje ulotki reklamowe i broszury, opakowania, instrukcje, kasety audio lub wideo, dyskietki komputerowe, jak również napisy wydrukowane bezpośrednio na zestawach.
Inne zestawy diagnostyczne służą do przeprowadzania obrazowania in vivo. Takie zestawy zazwyczaj zawierają przeciwciało wiążące się z epitopem Ae, korzystnie w obrębie reszt 1-10. Korzystnie, przeciwciało jest znakowane lub zestaw zawiera dodatkowy odczynnik znakujący. Korzystnie, zestaw jest oznakowany instrukcjami dotyczącymi prowadzenia oznaczenia obrazowanie in vivo.
VII. Obrazowanie in vivo
Sposoby obrazowania złogów amyloidu u pacjenta in vivo są użyteczne w diagnozowaniu lub potwierdzeniu diagnozy choroby Alzheimera lub podatności na nią. Przykładowo sposoby można stosować wobec pacjenta z objawami demencji. Jeśli pacjent ma nienormalne złogi amyloidu, prawdopodobne jest, że cierpi na chorobę Alzheimera. Sposoby te można również stosować u pacjentów bezobjawowych. Obecność nienormalnych złogów amyloidu wskazuje na podatność na chorobę z objawami w przyszłości. Sposoby są również użyteczne w monitorowaniu postępów choroby i/lub odpowiedzi na leczenie u pacjentów, u których uprzednio rozpoznano chorobę Alzheimera.
PL 200 458 B1
Sposoby realizuje się przez podawanie pacjentowi odczynnika, takiego jak przeciwciało, który wiąże się z Ae, a następnie wykrywanie związanego czynnika. Korzystne przeciwciała wiążą się ze złogami Ae u pacjenta, bez wiązania z polipeptydem APP o pełnej długości. Szczególnie korzystne są przeciwciała wiążące się z epitopem Ae w obrębie aminokwasów 1-10. W niektórych sposobach przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie aminokwasów 7-10 Ae. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się bez indukowania znacznej odpowiedzi usuwania. W innych sposobach, przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie aminokwasów 1-7 Ae. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się i indukują skierowaną przeciw Ae odpowiedź usuwania. Jednakże, odpowiedzi usuwania można uniknąć stosując fragmenty przeciwciał pozbawione pełnej długości regionu stałego, takie jak Fab. W niektórych sposobach to samo przeciwciało może służyć zarówno jako środek leczniczy, jak i diagnostyczny. Generalnie, przeciwciała wiążące się z epitopami położonymi w kierunku końca C od reszty 10 Ae nie wykazują tak silnego sygnału, jak przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie reszt 1-10, przypuszczalnie dlatego, że epitopy C-końcowe są niedostępne w złogach amyloidu. Zgodnie z tym, takie przeciwciała są mniej korzystne.
Odczynniki diagnostyczne można podawać do ciała pacjenta przez iniekcję dożylną, lub bezpośrednio do mózgu przez iniekcję doczaszkową lub po wywierceniu otworu w czaszce. Dawka odczynnika powinna pozostawać w tym samym zakresie, jak przy sposobach leczniczych. Zazwyczaj odczynnik jest znakowany, chociaż w niektórych sposobach pierwszy odczynnik, o powinowactwie do Ae, jest nieznakowany i stosuje się drugi odczynnik znakowany, wiążący pierwszy odczynnik. Wybór znacznika zależy od sposobu detekcji. Przykładowo znacznik fluorescencyjny jest odpowiedni do detekcji optycznej. Stosowanie znaczników paramagnetycznych jest odpowiednie do tomograficznej detekcji bez interwencji chirurgicznej. Znaczniki promieniotwórcze można wykrywać przy użyciu PET lub SPECT.
Diagnozowanie przeprowadza się porównując liczbę, rozmiar i/lub intensywność znakowanych miejsc w stosunku do poziomu podstawowego. Wartości poziomu podstawowego odpowiadają średniemu poziomowi w populacji osobników zdrowych. Wartości poziomu podstawowego mogą również stanowić poziomy uprzednio określone u tego samego pacjenta. Przykładowo wartości poziomu podstawowego można określić u pacjenta przed rozpoczęciem leczenia i wartości zmierzone później można porównywać z wartościami poziomu podstawowego. Obniżenie wartości w stosunku do poziomu podstawowego wskazuje na dodatnią odpowiedź na leczenie.
P r z y k ł a d y
I. Profilaktyczna skuteczność Ae wobec AD
Przykłady te opisują podawanie peptydu Ae42 transgenicznym myszom z nadekspresją APP z mutacją w pozycji 717 (APP717V^F), która predysponuje je do rozwoju neuropatologii podobnej do choroby Alzheimera. Tworzenie i charakterystykę tych myszy (myszy PDAPP) opisano w Games i in., Nature, supra. U zwierząt tych, w postaci heterozygotycznej, w wieku sześciu miesięcy zaczynają się tworzyć złogi Ae. W piętnastym miesiącu życia wykazują one poziom złogów Ae równoważny temu obserwowanemu w chorobie Alzheimera. Myszy PDAPP otrzymywały iniekcje ze zagregowanego Ae42 (zagregowany Ae42) lub roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Zagregowany Ae42 wybrano ze względu na jego zdolność do indukowania przeciwciał skierowanych przeciw licznym epitopom Ae.
A. Metody
1. Źródło myszy
Trzydzieści heterozygotycznych samic myszy PDAPP losowo podzielono na następujące grupy: 10 myszy mających otrzymać iniekcje zagregowanego Ae42 (jedna padła w transporcie), 5 myszy mających otrzymać iniekcje PBS/adiuwantu lub PBS oraz 10 myszy kontrolnych, nie otrzymujących żadnej iniekcji. Pięć myszy otrzymało iniekcje peptydów pochodzących z sekwencji białka amyloidu surowicy (SAP).
2. Przygotowywanie immunogenów
Przygotowanie zagregowanego Ae42: dwa miligramy Ae42 (US Peptides Inc, numer serii K-42-12) rozpuszczano w 0,9 ml wody i dopełniano do objętości 1 ml przez dodanie 0,1 ml 10 x PBS. Mieszaninę wytrząsano i umożliwiano inkubację w temperaturze 37°C przez noc, w których to warunkach peptyd agregował. Niewykorzystany Ae przechowywano w postaci suchego, liofilizowanego proszku w temperaturze -20°C do czasu następnej iniekcji.
PL 200 458 B1
3. Przygotowywanie iniekcji
Do każdej iniekcji emulgowano 100 μg zagregowanego Ae42 w PBS z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w stosunku 1:1 w końcowej objętości 400 μl emulsji do pierwszej immunizacji, po której po 2 tygodniach podawano dawkę przypominającą tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA). Dwie kolejne dawki w IFA podawano w odstępach miesięcznych. Kolejne immunizacje podawano w miesięcznych odstępach w 500 μl PBS. Iniekcje podawano dootrzewnowe (i.p.).
Iniekcje PBS wykonywano według tego samego schematu i każda mysz otrzymywała iniekcję 400 μl mieszaniny PBS/adiuwant w stosunku 1:1 lub 500 μl PBS. Iniekcje SAP prowadzone według tego samego schematu, stosując dawkę 100 μg na iniekcję.
4. Miareczkowanie krwi myszy, preparaty tkankowe i immunohistochemia
Powyższe metody opisano poniżej w części „Materiały i metody ogólne”.
B. Wyniki
Myszy PDAPP otrzymywały iniekcje albo agregowanego Ae42 (zagregowany Ae42), albo peptydów SAP, albo roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Pozostawiono również grupę myszy PDAPP bez iniekcji, jako kontrolę dodatnią. Co drugi miesiąc monitorowano u myszy miana przeciwciał skierowanych przeciw Ae42, począwszy od czwartej dawki przypominającej, do czasu, gdy myszy ukończyły pierwszy rok życia. Myszy uśmiercano po 13 miesiącach. We wszystkich badanych punktach czasowych, u ośmiu z dziewięciu myszy otrzymujących zagregowany Ae42 powstawało wysokie miano przeciwciał, które pozostawało wysokie poprzez całą serię iniekcji (miana wyższe niż 1/10000). Dziewiąta mysz mała miano niskie, ale mierzalne, wynoszące około 1/1000 (fig. 1, tabela 1). Myszy otrzymujące SAPP mały miana od 1:1000 do 1:30000 dla tego immunogenu, a tylko u jednej myszy przekraczające 1:100000.
U myszy traktowanych PBS miana przeciwciał skierowanych przeciw zagregowanemu Ae42 mierzono w miesiącu szóstym, dziesiątym i dwudziestym. Przy rozcieńczeniu 1/100, u myszy otrzymujących PBS podczas pomiaru mian przeciwciał skierowanych przeciw zagregowanemu Ae42 tylko w jednym przypadku przekroczyło ono 4-krotność poziomu tła; we wszystkich pozostałych przypadkach były one niższe od czterokrotności wartości tła (tabela 1). Odpowiedź specyficzna wobec SAP we wszystkich tych punktach czasowych była zaniedbywalna, ze wszystkimi mianami niższymi od 300.
Siedem z dziewięciu myszy z grupy traktowanej zagregowanym Ae1-42 nie mało w mózgu wykrywalnego amyloidu. W przeciwieństwie do tego, tkanka mózgowa myszy z grup otrzymujących SAP lub PBS zawierała liczne złogi amyloidu w hipokampie, jak również w korze płatu czołowego i obręczy. Rozmieszczenie złogów było podobne do tego w nietraktowanej grupie kontrolnej, z charakterystycznym udziałem podatnych podregionów, takich jak zewnętrzna warstwa drobinowa zakrętu zębatego hipokampa. Jedna z myszy z grupy otrzymującej iniekcje Ae1-42 wykazywała znacznie niższe obciążenie amyloidem, ograniczone do hipokampa. U innej myszy traktowanej Ae1-42 wykryto pojedynczą płytkę.
Ilościowe analizy obrazów pod względem obciążenia hipokampa amyloidem potwierdziły dramatyczne obniżenie osiągane u zwierząt traktowanych Ae42 (AN1792) (fig. 2). Wartości mediany obciążenia amyloidem w grupie otrzymującej PBS (2,22%) i w nie traktowanej grupie kontrolnej (2,65%) były znacząco wyższe od tych dla zwierząt immunizowanych AN1792 (0,00%, p = 0,0005). W przeciwieństwie do tego, wartość mediany dla grupy immunizowanej peptydami SAP (SAPP) wynosiła 5,74%. Tkanka mózgowa nietraktowanych myszy kontrolnych zawierała liczne złogi amyloidu Ae uwidaczniane specyficznym wobec Ae przeciwciałem monoklonalnym (mAb) 3D6 w hipokampie, jak również w korze za płatem ciała modzelowatego. Podobne rozmieszczenie złogów amyloidu obserwowano u myszy immunizowanych SAPP lub PBS (fig. 2). Ponadto, w tych ostatnich trzech grupach występował charakterystyczny, obserwowany klasycznie w AD, udział podatnych subregionów mózgu, takich jak zewnętrzna warstwa drobinowa zakrętu zębatego hipokampa.
Mózgi, które nie zawierały złogów Ae, były również wolne od płytek starczych, które zazwyczaj uwidaczniane są u myszy PDAPP z przeciwciałem 8E5, skierowanym przeciw ludzkiemu APP. Wszystkie mózgi z pozostałych grup (myszy otrzymujących iniekcje SAP, PBS i myszy nie otrzymujących iniekcji) zawierały liczne płytki starcze, typowe dla nietraktowanych myszy PDAPP. U jednej z myszy traktowanych AN1792 wykryto niewielką liczbę płytek starczych, a u drugiej myszy traktowanej AN1792 stwierdzono pojedyncze zgrupowanie dystroficznych neurytów. Analiza obrazów hipokampa, jak przedstawiono na fig. 3, wykazała w zasadzie całkowitą eliminację dystroficznych neurytów u myszy traktowanych AN1792 (mediana 0,00%), w porównaniu otrzymującymi PBS (mediana 0,28%, p = 0,0005).
PL 200 458 B1
W mózgach grupy otrzymującej iniekcje Ae1-42 nie występowała również astrocytoza charakterystyczna dla zapalenia związanego z płytkami. Mózgi myszy z innych grup zawierały liczne i tworzące zgrupowania astrocyty dodatnie pod względem GFAP, typowe dla glejozy związanej z płytkami Ae. Zestaw preparatów po reakcji z GFAP przeciwwybarwiono również tioflawiną S w celu zlokalizowania złogów Ae. Dodatnie pod względem GFAP były związane z płytkami Ae w kontrolnych grupach SAP, PBS i nie traktowanej. Związku takiego nie stwierdzono u pozbawionych płytek myszy traktowanych Ae1-42, podczas gdy minimalną glejozę związaną z płytkami zidentyfikowano u jednej myszy traktowanej AN1792.
Przedstawione na fig. 4 analizy obrazów kory za płatem ciała modzelowatego potwierdziły, że zmniejszenie astrocytozy w grupie traktowanej AN1792, o wartości mediany 1,56%, było znaczące w porównaniu z tą u grup traktowanych peptydami SAP, PBS lub nie traktowanych, o wartościach mediany wyższych od 6% (p = 0,0017).
Dowody uzyskane dla podgrup myszy otrzymujących iniekcje Ae1-42 i PBS wskazywały, że u myszy otrzymujących iniekcje Ae1-42 brak było związanej z płytkami reaktywności immunologicznej wobec MHC II związanej z płytkami, co jest zgodne z brakiem odpowiedzi zapalnej związanej z Ae.
Skrawki mózgów myszy poddawano również reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi wobec MAC-1, białka powierzchni komórkowych. MAC-1 (CD11b) należy do rodziny integryn i występuje jako heterodimer z CD18. Kompleks CD11b/CD18 występuje na monocytach, makrofagach, granulocytach obojętnochłonnych i komórkach NK (Mak i Simard). Komórki mózgu typu wykazującego reakcję wobec MAC-1 są prawdopodobnie komórkami mikrogleju, w oparciu o podobną morfologię fenotypową w skrawkach po poddanych reakcji immunologicznej wobec MAC-1. Związane z płytkami znakowanie MAC-1 było niższe w mózgach myszy traktowanych AN1792, niż w grupie kontrolnej traktowanej PBS, co jest stwierdzeniem zgodnym z brakiem indukowanej Ae reakcji zapalnej.
C. Wniosek
Brak płytek Ae i reaktywnych zmian neuronalnych i glejowych w mózgach myszy otrzymujących iniekcje Ae1-42 wskazuje, że nie odkłada się w nich amyloid lub odkłada się go bardzo mało i brak jest patologicznych konsekwencji, takich jak glejoza i patologia neurytów. Myszy PDAPP traktowane Ae1-42 wykazują zasadniczo podobny brak patologii, jak kontrolne myszy nietransgeniczne. Dlatego też iniekcje Ae1-42 są wysoce skuteczne w zapobieganiu odkładaniu się lub w usuwaniu ludzkiego Ae z tkanki mózgowej i w eliminacji wynikających z tego degeneracyjnych zmian neuronalnych i zapalnych. A zatem, podawanie peptydu Ae może być korzystne zarówno pod względem zapobiegawczym, jak i terapeutycznym w zapobieganiu AD.
II. Badania dawka-odpowiedź
Grupy pięciotygodniowych samic myszy Swiss Webster (N = 6 na grupę) immunizowano 300, 100, 33, 11,3,7, 1,2, 0,4 lub 0,13 μg podawanego dootrzewnowo Ae w postaci z CFA/IFA. Trzy dawki podawano w odstępach dwutygodniowych, a czwartą dawkę po miesiącu. Pierwszą dawkę emulgowano z CFA, a pozostałe dawki emulgowano z IFA. Krew od zwierząt do pomiarów mian przeciwciał pobierano 4-7 dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej dawki. Części zwierząt z trzech grup, które irnmunizowano 11,33 lub 100 μg antygenu, dodatkowo pobierano krew w odstępach około miesiąca w ciągu czterech miesięcy po czwartej immunizacji, w celu monitorowania zaniku odpowiedzi przeciwciał w zależności od dawki immunogennych preparatów. Zwierzęta te otrzymywały ostatnią, piątą immunizację po siedmiu miesiącach od rozpoczęcia badań. Uśmiercano je tydzień później, w celu pomiaru odpowiedzi przeciwciał na AN1792 i przeprowadzenia analiz toksykologicznych.
W zakresie od 300 do 3,7 μg obserwowano malejącą odpowiedź na dawkę, a przy dwu najniższych dawkach nie obserwowano żadnej odpowiedzi. Średnie miana przeciwciał wynosiły około 1:1000 po 3 dawkach i około 1:10000 po 4 dawkach 11-300 μg antygenu (patrz fig. 5).
Po trzeciej immunizacji miana przeciwciał wzrastały dramatycznie we wszystkich grupach z wyjątkiem tych otrzymujących najniższe dawki, a wzrost GMT wynosił od 5 do 25 razy. Następnie wykrywano niskie odpowiedzi przeciwciał, nawet u zwierząt otrzymujących 0,4 μg. Grupy otrzymujące 1,2 i 3,7 μg mały porównywalne miana, z GMT około 1000, a te otrzymujące cztery najwyższe dawki wykazywały zbliżone miana, z GMT około 25000, z wyjątkiem grupy otrzymującej dawkę 33 μg, z niższym GMT, wynoszącym 3000. Po czwartej immunizacji wzrost miana był u większości grup bardziej umiarkowany. Występowała wyraźna odpowiedź na dawkę w niższym zakresie dawek antygenu, w grupach otrzymujących od 0,14 μg do 11 μg, obejmująca zakres od braku wykrywalnego przeciwciała u zwierząt otrzymujących 0,14 μg do GMT wynoszącego 36000 u myszy otrzymujących 11 μg. Ponownie, miana u czterech grup otrzymujących najwyższe dawki, od 11 do 300 μg, były zbliżone.
PL 200 458 B1
A zatem, po dwóch immunizacjach miano przeciwciał było zależne od dawki antygenu w szerokim zakresie od 0,4 do 300 μg. Po trzeciej immunizacji miana u zwierząt otrzymujących cztery najwyższe dawki były zbliżone i pozostawały wysokie po dodatkowej immunizacji.
Miesiąc po czwartej immunizacji miana w grupie otrzymującej 300 μg były od 2 do 3 razy wyższe niż te mierzone w krwi pobranej pięć dni po immunizacji (fig. 6). Obserwacja ta sugeruje, że pik odpowiedzi anamnestycznej przeciwciał występował później niż w piątym dniu po immunizacji. W tym czasie u grupy otrzymującej 33 μg obserwowano mniejszy wzrost (50%). W grupie otrzymującej 300 μg po dwóch miesiącach od ostatniej dawki GMT spadał szybko o około 70%. Po kolejnych dwu miesiącach spadek był mniej gwałtowny, wynosząc 45% (100 μg) i około 14% przy dawkach 33 i 11 μg. A zatem, szybkość zaniku mian przeciwciał w krążeniu po zaprzestaniu immunizacji wydaje się być dwufazowa, z szybkim zanikiem w pierwszym miesiącu po piku odpowiedzi i późniejszą bardziej umiarkowaną szybkością obniżania.
Miana przeciwciał i kinetyka odpowiedzi u myszy Swiss Webster są zbliżone do obserwowanych u równolegle immunizowanych młodych heterozygotycznych myszy transgenicznych PDAPP. Dawki skuteczne pod względem indukowania odpowiedzi odpornościowej u ludzi są zazwyczaj podobne do dawek skutecznych u myszy.
III. Badanie skuteczności terapeutycznej w rozpoznanej AD
Oznaczenie to jest przeznaczone do testowania czynników immunogennych pod względem zatrzymywania lub odwracania neuropatologicznych cech charakterystycznych AD u starszych zwierząt. Immunizacje Ae o długości 42 aminokwasów (AN1792) rozpoczynano w czasie, gdy w mózgach myszy PDAPP obecne już były płytki amyloidu.
W czasie tych badań u nieleczonych myszy PDAPP rozwinęły się liczne zmiany neurodegeneracyjne przypominające te występujące w AD (Games i in., supra, oraz Johnson-Wood i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Odkładanie Ae w płytkach amyloidu jest związane z degeneracyjną odpowiedzią neuronalną, do której należą nienormalne elementy aksonów i dendrytów, nazywane neurytami dystroficznymi. Złogi amyloidu, które są otoczone i które zawierają dystroficzne neuryty, nazywane są płytkami starczymi. Zarówno w AD, jak i u myszy PDAPP, dystroficzne neuryty mają charakterystyczną strukturę globularną i wykazują reaktywność immunologiczną wobec zestawu przeciwciał rozpoznających APP i składniki cytoszkieletu, oraz wykazują złożone, subkomórkowe zmiany degeneracyjne na poziomie ultrastruktury. Te cechy charakterystyczne umożliwiają istotne dla choroby, selektywne i powtarzalne pomiary tworzenia płytek neurytowych w mózgach myszy PDAPP. Dystroficzną neuronalną składową płytek starczych mózgów myszy PDAPP można łatwo uwidocznić przeciwciałem specyficznym wobec ludzkiego APP (przeciwciało monoklonalne 8E5) i łatwo zmierzyć przez wspomaganą komputerowo analizę obrazów. Dlatego też, poza pomiarami wpływu AN1792 na tworzenie płytek amyloidu, monitorowano wpływ tej terapii na rozwój dystrofii neurytów.
Astrocyty i mikroglej są komórkami nie nerwowymi, które odpowiadają i odzwierciedlają stopień uszkodzenia neuronów. W AD często obserwuje się dodatnie pod względem GFAP astrocyty i dodatnie pod względem MHC II komórki mikrogleju, a ich aktywacja wzrasta wraz ze wzrostem nasilenia choroby. Dlatego też monitorowano również rozwój reaktywnej astrocytozy i mikroglejozy u myszy traktowanych AN1792.
A. Materiały i metody
Czterdzieści osiem heterozygotycznych samic myszy PDAPP w wieku od 11 do 11,5 miesięcy, otrzymanych z Charles River, losowo podzielono na dwie grupy: 24 myszy przeznaczono do immunizacji 100 μg AN1792 i 24 myszy do immunizacji PBS, w obu przypadkach łącznie z adiuwantem Freunda. Grupy otrzymujące AN1792 i PBS podzielono ponownie, gdy osiągnęły wiek około 15 miesięcy. W piętnastym miesiącu życia uśmiercono około połowę zwierząt z grup traktowanych AN1792 i PBS (odpowiednio n = 10 i 9), a resztę nadal immunizowano do chwili zakończenia około 18 miesiąca (odpowiednio n = 9 i 12). Łącznie 8 zwierząt padło podczas badań (5 z grupy AN1792 i 3 z grupy PBS). Oprócz zwierząt immunizowanych, do badań włączono nietraktowane myszy PDAPP w wieku jednego roku (n = 10), 15 miesięcy (n = 10) i 18 miesięcy (n = 10), dla porównania wyników oznaczenia ELISA dla pomiarów poziomów Ae i APP); do analiz immunohistochemicznych włączono również zwierzęta w wieku jednego roku.
Jeśli nie wskazano inaczej, stosowano metodykę jak w przykładzie 1. Do przygotowania antygenu do sześciu immunizacji podawanych przed 15 miesiącem stosowano AN1792 z US Peptides, numer serii 12, oraz California Peptides, numer serii ME0339. Do dodatkowych trzech immunizacji,
PL 200 458 B1 podawanych pomiędzy 15 a 18 miesiącem, stosowano peptyd z California Peptides, numer serii ME0339 i ME0439.
Do immunizacji 100 μg AN1792 w 200 μl PBS lub samą PBS emulgowano w stosunku 1:1 (obj./obj.) z kompletnym adiutantem Freunda (CFA) lub niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA) lub PBS w końcowej objętości 400 pl. Pierwszą immunizację podawano z CFA jako adiuwantem, kolejne cztery dawki podano z IFA, a ostatnie cztery dawki z samym PBS, bez dodawania adiuwanta. W okresie siedmiu miesięcy stosowano łącznie dziewięć immunizacji, co dwa tygodnie dla pierwszych trzech dawek i co cztery tygodnie dla pozostałych iniekcji. Grupa traktowana w ciągu czterech miesięcy i uśmiercona w wieku 15 miesięcy otrzymała tylko pierwszych 6 immunizacji.
B. Wyniki
1. Wpływ traktowania AN1792 na obciążenie amyloidem
Wyniki leczenia AN1792 na obciążenie kory amyloidem określone przez ilościową analizę obrazów przedstawiono fig. 7. Wartość mediany obciążenia kory amyloidem w grupie nie leczonych 12-miesięcznych myszy PDAPP wynosiła 0,28%, co stanowiło wartość reprezentatywną dla obciążenia płytkami u myszy na początku badań. U myszy 18-miesięcznych obciążenie amyloidem w przypadku otrzymywania PBS wzrosło ponad 17 razy do 4,87%, podczas gdy myszy otrzymujące AN1792 wykazywały znaczny spadek obciążenia amyloidem, na poziomie zaledwie 0,01%, znacznie niższym niż u nie leczonych 12-miesięcznych myszy oraz otrzymujących PBS grup myszy zarówno 15-miesięcznych, jak i 18-miesięcznych. U zwierząt otrzymujących AN1792 obciążenie amyloidem było niższe zarówno w 15 (96% obniżenia; p = 0,003), jak i w 18 miesiącu (> 99% obniżenia; p = 0,0002).
Korowe odkładanie amyloidu u myszy PDAPP rozpoczyna się zazwyczaj w korze płatu czołowego i za płatem ciała modzelowatego (RSC) i postępuje w kierunku brzusznobocznym, obejmując korę płatu skroniowego i węchomózgowia (EC). U 12-miesięcznych myszy, a więc w przybliżeniu w wieku, w którym po raz pierwszy podawano AN1792, nie stwierdzano amyloidu, bądź stwierdzano go niewiele. Po 4 miesiącach leczenia AN1792 znacznie, złogi amyloidu znacznie się zmniejszyły w RSC, a rozszerzanie się ich na EC zostało całkowicie wyeliminowane. Ta ostatnia obserwacja wykazała, że AN1792 całkowicie zatrzymywał postępowanie się amyloidu, który normalnie zajmuje korę płatów skroniowych i dolnych, jak również zatrzymywał, a być może odwracał, odkładanie w RSC.
Silne wpływy leczenia AN1792 na powstające obciążenie amyloidem kory mózgowej u myszy PDAPP wykazano ponadto u grupy 18-miesięcznej, którą leczono w ciągu siedmiu miesięcy. U myszy leczonych AN1792 stwierdzono prawie całkowity brak amyloidu w korze, przy całkowitym braku rozproszonych płytek i zmniejszeniu zwartych złogów.
2. Komórkowe i morfologiczne zmiany związane z leczeniem AN1792
W regionach mózgu, które zazwyczaj zawierają złogi amyloidu wykryto populację komórek dodatnich pod względem Ae. Co znaczące, w kilku mózgach myszy otrzymujących AN1792 stwierdzono niewiele, bądź nie stwierdzono wcale zewnątrzkomórkowych płytek amyloidu kory mózgowej. Większość reaktywności immunologicznej wobec Ae okazała się być zlokalizowana wewnątrz komórek o dużych płatowatych lub bryłowatych ciałach komórkowych. Pod względem fenotypowym komórki te przypominały aktywowane komórki mikrogleju lub monocyty. Wykazywały one reaktywność immunologiczną z przeciwciałami rozpoznającymi ligandy ulegające ekspresji na aktywowanych monocytach lub komórkach mikrogleju (MHC II i CD11b) i były niekiedy związane ze ścianą lub światłem naczyń krwionośnych. Porównanie blisko sąsiadujących skrawków seryjnych wybarwionych przeciwciałami specyficznymi wobec Ae i MHC II ujawniło, że obie klasy przeciwciał rozpoznają podobne wzory komórek. Szczegółowe badania mózgów zwierząt traktowanych AN1792 ujawniło, że komórki dodatnie pod względem MHC II były ograniczone do sąsiedztwa ograniczonych ilości amyloidu pozostającego u tych zwierząt. W stosowanych warunkach utrwalania, komórki nie były reaktywne immunologicznie wobec przeciwciał, które rozpoznają ligandy komórek T (CD3, CD3e) lub komórek B (CD45RA, CD45RB), bądź wspólny antygen leukocytów (CD45), ale były reaktywne wobec przeciwciała rozpoznającego leukosialinę (CD43), które reaguje krzyżowo z monocytami. U żadnej z myszy traktowanych PBS nie stwierdzono takich komórek.
U myszy PDAPP niezmiennie powstają obfite złogi amyloidu w zewnętrznej warstwie drobinowej zakrętu zębatego hipokampa. Złogi tworzą odrębną smugę w istocie dziurkowanej, podregionie, w którym typowo występują płytki amyloidu w AD. Charakterystyczny wygląd tych złogów u myszy traktowanych PBS przypominał scharakteryzowany uprzednio obraz u nieleczonych myszy PDAPP. Złogi amyloidu składały się zarówno z płytek rozproszonych, jak i zwartych, tworzących ciągłe pasmo. W przeciwieństwie, w wielu mózgach pochodzących z myszy leczonych AN1792 ten wzór był draPL 200 458 B1 stycznie zmieniony. Złogi amyloidu w hipokampie nie zawierały już rozproszonego amyloidu, a pasmowaty wzór był całkowicie zaburzony. Zamiast tego, obecne były liczne niezwykłe struktury punktowe wykazujące reaktywność immunologiczną z przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae, z których kilka okazało się być komórkami zawierającymi amyloid.
U zwierząt leczonych AN1792 często w sąsiedztwie zewnątrzkomórkowego amyloidu obserwowano komórki dodatnie pod względem MHC II. Wzór towarzyszenia komórek dodatnich pod względem Ae amyloidowi był bardzo podobny w kilku mózgach myszy leczonych AN1792. Rozmieszczenie tych komórek monocytarnych było ograniczone do sąsiedztwa odkładanego amyloidu, a brak ich było zupełnie w innych regionach mózgu, wolnych od płytek Ae. Mikroskopia konfokalna skrawków z wybarwionymi MHCII i Ae wykazała, że materiał płytek był obecny w wielu komórkach monocytarnych.
Ilościowa analiza obrazów skrawków z wybarwionymi MHC II i MAC I ujawniła tendencję do zwiększonej reaktywności immunologicznej w RSC i hipokampie myszy traktowanych AN1792 w porównaniu z grupą PBS, która osiągała istotność dla pomiaru reaktywności MAC I w hipokampie.
Wyniki te wskazują na aktywne zachodzące za pośrednictwem komórek usuwanie amyloidu w zawierających płytki regionach mózgu.
3. Wpływ AN1792 na poziomy Ae: oznaczanie metodą ELISA (a) Poziomy w korze mózgowej
U nieleczonych myszy PDAPP przeciętny poziom całkowitego Ae w korze w 12 miesiącu wynosił 1600 ng/g i wzrastał do 8700 ng/g do 15 miesiąca (tabela 2). W 18 miesiącu wartość ta wynosiła 22000 ng/g, co stanowiło ponad 10-krotny wzrost w czasie trwania doświadczenia. Zwierzęta traktowane PBS miały 8600 ng/g całkowitego Ae w 15 miesiącu, który to poziom wzrastał do 19000 ng/g w miesiącu 18. W przeciwieństwie, zwierzęta traktowane AN1792 mały o 81% mniej całkowitego Ae w 15 miesiącu (1600 ng/g) od grupy immunizowanej PBS. W 18 miesiącu stwierdzono znacząco mniej (p = 0,0001) całkowitego Ae (5200 ng/g) w przy porównaniu grup otrzymujących AN1792 i PBS (tabela 2), co stanowi 72% zmniejszenie ilości Ae, który mógłby być obecny. Podobne wyniki otrzymano, gdy porównywano poziomy Ae42 w korze, a mianowicie grupa traktowana AN1792 zawierała znacznie mniej Ae42, ale w tym przypadku różnice między grupami AN1792 i PBS były znaczące zarówno w 15 miesiącu (p = 0,04), jak i 18 miesiącu (p = 0,0001, tabela 2).
T a b e l a 2
Mediany poziomów Ae (ng/g) w korze mózgowej
Nie traktowane PBS AN1792
Wiek Całkowity Λβ42 (n) Całkowity Ae42 (n) Całkowity Ae42 (n)
12 1600 1300 (10)
15 8700 8300 (10) 8600 7200 (9) 1600 1300* (10)
18 22200 18500 (10) 19000 15900 (12) 5200** 4300** (9)
* p = 0,0412 ** p - 0,0001 (b) Poziomy w hipokampie
U nietraktowanych myszy PDAPP mediana poziomu całkowitego Ae w dwunastym miesiącu życia wynosiła 15000 ng/g i wzrosła do 51000 ng/g w 15 miesiącu i dalej do 81000 ng/g w 18 miesiącu (tabela 3). Podobnie, myszy immunizowane PBS wykazywały wartości 40000 ng/g i 65000 ng/g odpowiednio w 15 miesiącu i 18 miesiącu.
Zwierzęta immunizowane AN1792 wykazywały mniej totalnego Ae, dokładnie 25000 ng/g i 51000 ng/g odpowiednio w wieku 15 miesięcy i 18 miesięcy. Wartość dla 18 miesiąca w grupie traktowanej AN1792 była znacząco niższa niż w grupy traktowanej PBS (p = 0,0105; tabela 3).
Pomiary Ae42 dały ten sam rozkład wyników, a mianowicie poziomy w grupie traktowanej AN1792 były znacząco niższe, niż w grupie PBS (odpowiednio 39000 ng/g wobec 57000 ng/g; p = 0,002) przy oznaczeniach w 18 miesiącu (tabela 3).
PL 200 458 B1
T a b e l a 3
Mediany poziomów Ae (ng/g) w hipokampie
Nietraktowane PBS AN1792
Wiek Całkowity Ae42 (n) Całkowity Ae42 (n) Całkowity Ae42 (n)
12 11500 11400 (10)
15 51500 44400 (10) 40100 35700 (9) 24500 22100 (10)
18 80800 64200 (10) 65400 57100 (12) 50900 38900** (9)
* p = 0,0105 ** p - 0,0022 (c) Poziomy w móżdżku
U 12-miesięcznych nietraktowanych myszy PDAPP mediana całkowitego poziomu Ae w móżdżku wynosiła 15 ng/g (tabela 4). W 15 miesiącu ta mediana wzrastała do 28 ng/g, a w 18 miesiącu podwyższyła się do 35 ng/g. Zwierzęta traktowane PBS w 15 miesiącu wykazywały wartości mediany całkowitego Ae 21 ng/g w 15 miesiącu i 43 ng/g w 18 miesiącu. W zwierząt traktowanych AN1792 stwierdzono 22 ng/g całkowitego Ae w 15 miesiącu i znacząco mniej (p = 0,002) całkowitego Ae w 18 miesiącu (25 ng/g), niż odpowiadająca grupa otrzymująca PBS (tabela 4).
T a b e l a 4
Mediany poziomów Ae (ng/g) w móżdżku
Nietraktowane PBS AN1792
Wiek Całkowity Ae (n) Całkowity Ae (n) Całkowity Ae (n)
12 15,6 (10)
15 22,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10)
18 35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9)
* p = 0,0018
4. Wpływ traktowania AN1792 na poziomy APP
Zarówno APP-α, jak i cząsteczka APP o pełnej długości, zawierają całą lub część sekwencji Ae i dlatego mogłyby pozostawać pod wpływem wywoływania skierowanej przeciw AN1792 odpowiedzi odpornościowej. W dotychczasowych badaniach odnotowano nieznaczny wzrost poziomie APP w miarę wzrostu neuropatologii u myszy PDAPP. W korze mózgowej poziomy zarówno APP-a/FL (o pełnej długości), jak i APP-α pozostawały zasadniczo niezmienione wpływem traktowania, z tym wyjątkiem, że w 18 miesiącu poziom APP-α zmniejszył się o 19% w grupie traktowanej AN1792 w porównaniu z grupą traktowaną PBS. 18-miesięczne wartości APP w grupie traktowanej AN1792 nie różniły się znacząco od wartości dla 12-miesięcznych i 15-miesięcznych grup traktowanych PBS. We wszystkich przypadkach wartości dla APP pozostawały w zakresie stwierdzanym normalnie u myszy PDAPP.
5. Wpływ traktowania AN1792 na patologię neurodegeneracyjną i glejową
Obciążenie płytkami starczymi w korze płatu czołowego było znacząco obniżone u myszy traktowanych AN1792 w porównaniu z grupą PBS, zarówno w 15 miesiącu (84%; p = 0,03), jak i w 18 miesiącu życia (55%; p = 0,01) (fig. 8). Pomiędzy 15 a 18 miesiącem życia wartość mediany obciążenia płytkami starczymi w grupie otrzymującej PBS wzrosła z 0,32% do 0,49%.
Kontrastowało to ze znacznie zmniejszonym rozwojem płytek starczych w grupie AN1792, gdzie wartości median obciążenia płytkami starczymi wynosiły 0,05% i 0,22% w odpowiednio grupach 15 i 18-miesięcznej.
Wydaje się, że immunizacje AN1792 były dobrze tolerowane i reaktywna astrocytoza również ulegała znaczącemu zmniejszeniu w RSC myszy traktowanych AN1792 w porównaniu z grupą PBS, zarówno w 15 (56%; p = 0,011), jak i w 18 (39%; p = 0,028) miesiącu życia (fig. 9). Wartości median procentu astrocytozy w grupie PBS wzrosły między 15 a 18 miesiącem od 4,26% do 5,21%. Podawanie AN1792 zmniejszało rozwój astrocytozy w obu punktach czasowych do, odpowiednio, 1,89% i 3,2%. Sugeruje to, że proces usuwania nie uszkodził sieci włókien nerwowych.
PL 200 458 B1
6. Odpowiedzi przeciwciał
Jak opisano powyżej, heterozygotyczne myszy PDAPP (N = 24) w wieku jedenastu miesięcy otrzymywały serię 5 immunizacji 100 μq AN1792 emulgowanego z adiuwantem Freunda i podawanego dootrzewnowe w tygodniach 0, 2, 4, 8 i 12 oraz szóstą immunizację z PBS (bez adiuwanta Freunda) w 16 tygodniu. Kontrolę negatywną stanowił równoległy zestaw 24 myszy transgeniczne w tym samym wieku, które otrzymywały immunizację PBS emulgowaną z tymi samymi adiuwantami, podawanymi według tego samego schematu. Zwierzętom pobierano krew w trzy do siedmiu dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej dawki. Odpowiedzi przeciwciał na AN1792 mierzono metodą ELISA. Geometryczne średnie mian (GMT) dla zwierząt immunizowanych AN1792 wynosiły 1900, 7600 i 45000 odpowiednio po drugiej, trzeciej i ostatniej (szóstej) dawce. U zwierząt kontrolnych nie mierzono przeciwciał specyficznych dla Ae po szóstej immunizacji.
Około połowę zwierząt traktowano w ciągu dodatkowych trzech miesięcy, stosując immunizację około 20, 24 i 27 tygodnia. Każdą z tych dawek podawano w samym PBS, bez adiuwanta Freunda. W tym okresie średnie miana przeciwciał pozostały niezmienione. W rzeczywistości, miana przeciwciał okazały się pozostawać stabilne od czwartego do ósmego pobrania krwi, które odpowiadały okresowi obejmującemu od piątej do dziewiątej iniekcji.
W celu określenia, czy wywołane przez immunizację przeciwciała specyficzne wobec Ae, które wykrywano w surowicach myszy traktowanych AN1792, były również związane ze złogami amyloidu w mózgu, część skrawków z myszy traktowanych AN1792 i PBS poddano reakcji z przeciwciałem specyficznym wobec IgG myszy. W przeciwieństwie do grupy PBS, płytki Ae w mózgach zwierząt traktowanych AN1792 były opłaszczone endogennymi IgG. Tą różnicę pomiędzy dwiema grupami obserwowano zarówno w grupach 15- jak i 18-miesięcznych. Szczególnie uderzający był brak znakowania w grupie PBS, pomimo obecności wysokiego obciążenia amyloidem u tych myszy. Wyniki te wykazują, że immunizacja syntetycznym białkiem Ae generuje przeciwciała, które rozpoznają i wiążą się in vivo z Ae w płytkach amyloidu.
7. Komórkowe odpowiedzi odpornościowe
Z 18-miesięcznych myszy PDAPP, dziewięciu immunizowanych AN1792 i 12 immunizowanych PBS, usunięto śledziony po 7 dniach od dziewiątej immunizacji. Wyizolowano komórki śledziony i hodowano je w ciągu 72 godzin w obecności Ae40, Ae-42 lub Ae40-1 (białko o odwróconej sekwencji). Jako kontrola dodatnia służył mitogen Con A. Optymalne odpowiedzi uzyskano dla > 1,7 μM białka. Komórki ze wszystkich dziewięciu zwierząt traktowanych AN1792 proliferowały zarówno w odpowiedzi na białko Ae1-40, jak i Ae1-42, z równymi poziomami inkorporacji dla obu białek (fig. 10, część górna). Nie występowała odpowiedź na odwrócone białko Ae40-1. Komórki ze zwierząt kontrolnych nie wykazywały odpowiedzi na żadne z białek Ae (fig. 10, część dolna).
C. Wniosek
Wyniki tych badań wykazują, że immunizacja AN1792 myszy PDAPP mających istniejące złogi amyloidu spowalnia i zapobiega dalszemu odkładaniu amyloidu oraz spowalnia, będące konsekwencją tego procesu, zmiany neuropatologiczne w mózgach starych myszy PDAPP. Immunizacje AN1792 zasadniczo zatrzymały rozwój amyloidu w strukturach, które normalnie ulegają amyloidozie. A zatem, podawanie peptydu Ae jest korzystne terapeutycznie w leczeniu AD.
IV. Selekcja fragmentów Ae
100 myszy PDAPP w wieku 9-11 miesięcy immunizowano 9 różnymi regionami APP i Ae w celu określenia, które epitopy wywołują skuteczną odpowiedź. 9 różnych immunogenów i jedną kontrolę wstrzykiwano dootrzewnowo w sposób opisany powyżej. Immunogeny obejmowały cztery koniugaty ludzkiego peptydu Ae 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, wszystkie sprzęgnięte wiązaniami cysteinowymi z owczym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG myszy; aminokwasy 592-695 polipeptydu APP, zagregowany ludzki Ae 1-40 i zagregowany ludzki Ae 25-35 oraz zagregowany Ae42 gryzoni. Zagregowany Ae42 i PBS stosowano jako odpowiednio kontrole dodatnią i ujemną. Stosowano dziesięć myszy na każdą grupę doświadczalną. Miana monitorowano jak opisano powyżej i myszy zabijano pod koniec 4 miesiąca iniekcji. Post mortem prowadzono badania histochemiczne, poziomów Ae i analizę toksykologiczną.
A. Materiały i metody
1. Przygotowywanie immunogenów
Przygotowywanie sprzęganych peptydów Ae: cztery koniugaty ludzkiego peptydu Ae (reszty aminokwasowe 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42; każdy skoniugowany z owczym przeciwciałem skierowanym
PL 200 458 B1 przeciw IgG myszy) przygotowano przez sprzęganie poprzez syntetyczną cysteinę dodaną do peptydu Ae, wykorzystując odczynnik sieciujący sulfo-EMCS. Zsyntetyzowąno pochodne peptydów Ae o poniższych końcowych sekwencjach aminokwasowych. W każdym przypadku, położenie wstawionej cysteiny wskazano przez podkreślenie. Jak wskazano, pochodna peptydu Ae13-28 ma również dwie reszty glicyny dodane przed karboksyterminalną cysteiną.
Peptyd Ae1-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH
Peptyd Ae1-5 NH2-DAEFRC-COOH
Peptyd Ae33-42 NH2-C-kwas aminoheptanowy-GLMVGGVVIA-COOH
Peptyd Ae13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH
W celu przygotowania reakcji sprzęgania, dziesięć miligramów owczego przeciwciała skierowanego przeciw IgG myszy (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dializowano przez noc wobec 10 mM buforu boranu sodowego, pH 8,5. Następnie dializowane przeciwciało zagęszczano do objętości 2 ml przy użyciu probówki Amicon Centriprep. Dziesięć miligramów sulfo-EMCS [N<-maleimidokuproiloksy)sukcynimid] (Molecular Sciences Co.) rozpuszczano w jednym ml dejonizowanej wody. Do owczego przeciwciała skierowanego przeciw IgG myszy dodawano kroplami, z mieszaniem, 40krotny nadmiar molowy sulfo-EMCS, a następnie roztwór mieszano w ciągu dodatkowych dziesięciu minut. Aktywowane owcze przeciwciało skierowane przeciw IgG myszy oczyszczano i wymieniano bufor przez przepuszczanie przez kolumnę do filtracji żelowej o objętości 10 ml (Pierce Presto Column, otrzymana z Pierce Chemicals) zrównoważoną 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcje zawierające przeciwciało, zidentyfikowane dzięki absorpcji przy długości fali 280 nm, łączono i rozcieńczano do stężenia około 1 mg/ml, jako współczynnik ekstynkcji stosując 1,4 mg na jednostkę gęstości optycznej OD. 40-krotny molowy nadmiar peptydu Ae rozpuszczano w 20 ml 10 mM NaPO4, pH 8,0, z wyjątkiem peptydu Ae33-42, w którego przypadku najpierw rozpuszczono 10 mg w 0,5 ml DMSO, a następnie rozcieńczono do objętości 20 ml 10 mM buforem NaPO4. Każdy z roztworów peptydu dodawano do 10 ml aktywowanego owczego przeciwciała skierowanego przeciw IgG myszy i kołysano w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Uzyskane koniugaty zagęszczano do końcowej objętości poniżej 10 ml stosując probówki Amicon Centriprep i dializowano wobec buforu PBS w celu wymiany buforu i usunięcia wolnego peptydu. Koniugaty przepuszczano przez sączki wyjaławiające o średnicy porów 0,22 μm, a następnie dzielono na próbki po 1 mg i przechowywano zamrożone w temperaturze -20°C. Stężenia koniugatów określano stosując oznaczenie białka BCA (Pierce Chemicals), z krzywą standardową końskiej IgG. Koniugację potwierdzał wzrost masy cząsteczkowej skoniugowanych peptydów w stosunku do aktywowanego owczego przeciwciała skierowanego przeciw IgG myszy. Koniugat Ae 1-5 i owczego przeciwciała skierowanego przeciw IgG myszy otrzymano przez połączenie dwóch koniugacji, pozostałe były pojedynczymi preparatami.
2. Przygotowywanie zagregowanych peptydów Ae
Do przygotowania każdego zestawu iniekcji ze zliofilizowanych proszków przechowywanych ze środkiem suszącym w temperaturze -20°C, świeżo rozpuszczano peptydy: ludzki 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., numer serii ME0541), ludzki 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., numery serii ME0339 i ME0439), ludzki 25-35 i 1-42 gryzoni (California Peptides Inc., numer serii ME0218). W tym celu, dwa mg peptydu dodawano do 0,9 ml wody dejonizowanej i mieszaninę wytrząsano do uzyskania stosunkowo jednorodnego roztworu lub zawiesiny. Spośród czterech peptydów, tylko AN1528 był rozpuszczalny na tym etapie. Następnie dodawano porcję 10 x PBS (1 x PBS: 0,15M NaCl, 0,01M fosforan sodowy, pH 7,5) o objętości 100 pl, co wywoływało wytrącanie AN1528. Zawiesinę ponownie wytrząsano i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C do stosowania następnego dnia.
Przygotowywanie białka pBx6: plazmid ekspresyjny kodujący pBx6, białko fuzyjne składające się ze 100-aminokwasowej N-końcowej sekwencji liderowej polimerazy bakteriofaga MS-2, do której dołączono aminokwasy 592-695 APP (eAPP), skonstruowano w sposób opisany w Oltersdorf i in., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmidem stransfekowano E. coli i ekspresję białka prowadzono po indukcji promotora. Bakterie lizowano w 8M moczniku i pBx6 częściowo oczyszczano przez preparatywną SDS PAGE. Frakcje zawierające pBx6 identyfikowano przez hybrydyzację typu Western, używając króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciw pBx6, łączono, zagęszczano przy użyciu probówki Amicon Centriprep i dializowano wobec PBS. Czystość preparatu określona za pomocą SDS PAGE i barwienia błękitem Coomassie wynosiła około od 5 do 10%.
B. Wyniki i dyskusja
1. Projekt badań
PL 200 458 B1
Sto samców i samic transgenicznych, heterozygotycznych myszy PDAPP w wieku od dziewięciu do jedenastu miesięcy otrzymano z Charles River Laboratory i Taconic Laboratory. Myszy podzielono na dziesięć grup mających otrzymywać immunizacje różnymi regionami Ae lub APP połączonymi z adiuwantem Freunda. Zwierzęta podzielono w taki sposób, aby wszystkie grupy miały podobny skład pod względem płci, wieku i pochodzenia. Immunogeny obejmowały cztery peptydy Ae pochodzące z sekwencji ludzkiej, 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, każdy skoniugowany z owczym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG myszy; cztery zagregowane peptydy Ae, ludzki 1-40 (AN1528), ludzki 1-42 (AN1792), ludzki 25-35 i 1-42 gryzoni oraz polipeptyd fuzyjny, oznaczony pBx6, zawierający reszty aminokwasowe APP 592-695. Dziesiątą grupę, jako kontrolę, immunizowano PBS połączoną z adiuwantem.
Przy każdej immunizacji 100 μg każdego z peptydów Ae w 200 μl PBS lub 200 μg pochodnej APP pBx6 w tej samej objętości PBS, bądź samą PBS emulgowano w stosunku 1:1 (obj./obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w końcowej objętości 400 μl do pierwszej immunizacji, po czym do czterech kolejnych dawek przypominających używano tej samej ilości immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) i w PBS w ostatniej dawce. Immunizacje podawano dootrzewnowo co dwa tygodnie przy pierwszych trzech dawkach, a następnie co miesiąc. Krew zwierząt do oznaczania mian przeciwciał pobierano cztery do siedmiu dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej dawki. Zwierzęta zabijano około jednego tygodnia po ostatniej dawce.
2. Poziom Ae i APP w mózgu
Po około czterech miesiącach immunizacji różnymi peptydami Ae lub pochodną APP, ze zwierząt perfundowanych solą fizjologiczną usuwano mózgi. Jedną półkulę przygotowywano do analizy immunohistochemicznej, a drugą stosowano do oznaczania poziomu Ae i APP. W celu pomiaru stężeń różnych form peptydu beta-amyloidu i białka prekursorowego amyloidu, półkule rozcinano i przygotowano homogenaty regionów hipokampa, kory mózgowej i móżdżku w 5M guanidynie. Homogenaty rozcieńczano i oznaczono metodą ELISA poziomy amyloidu lub APP przez porównanie z serią rozcieńczeń standardów peptydu Ae lub APP o znanym stężeniu.
Mediana stężenia całkowitego Ae w grupie kontrolnej immunizowanej PBS była 5,8 razy wyższa w hipokampie niż w korze mózgowej (mediana 24,318 ng/g tkanki hipokampa w porównaniu z 4,221 ng/g dla kory mózgowej). Poziom mediany dla móżdżku grupy kontrolnej (23,4 ng/g tkanki) był około 1000 razy niższy niż dla hipokampa. Poziomy te były podobne do tych podawanych uprzednio dla heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w podobnym wieku (Johnson-Woods i in., 1997, supra).
W przypadku kory mózgowej, część grup doświadczalnych, te które otrzymywały AN1792, Ae1-42 gryzoni lub koniugat peptydu Ae1-5, miało mediany poziomów całkowitego Ae i Ae1-42 znacząco różne od grupy kontrolnej (p < 0,05), jak przedstawiono na fig. 11. Mediany poziomów całkowitego Ae były obniżone w porównaniu z kontrolami dla tych grup doświadczalnych odpowiednio o 75%, 79% i 61%. W żadnej z tych grup nie występowała dostrzegalna korelacja pomiędzy mianami przeciwciał specyficznych wobec Ae a poziomami Ae w korowym regionie mózgu.
W hipokampie mediana zmniejszenia całkowitego Ae związanego z traktowaniem AN1792 (46%, p = 0,0543) nie była tak duża, jak obserwowano dla kory (75%, p = 0,0021). Jednakże, bezwzględna wielkość zmniejszenia była w hipokampie znacznie wyższa niż w korze; zmniejszenie o 11,186 ng/g tkanki w hipokampie wobec 3,171 ng/g tkanki w korze. Dla grup zwierząt otrzymujących Ae1-42 gryzoni lub Ae1-5, mediany poziomów całkowitego Ae zmniejszyły się odpowiednio o 36% i 26%. Jednakże, ze względu na małe wielkości grup i wysoką zmienność poziomów peptydu amyloidu pomiędzy zwierzętami w tych grupach, obniżenia te nie były znaczące. Gdy poziomy Ae1-42 mierzono w hipokampie, żadne z obniżeń wywołanych traktowaniem nie osiągnęło istotności. A zatem, ze względu na mniejsze obciążenie Ae w korze mózgowej, zmiany w tym regionie są czulszym wskaźnikiem skuteczności traktowania. Zmiany poziomu Ae mierzone w korze metodą ELISA są zbliżone do wyników analizy immunohistochemicznej, ale nie identyczne (patrz niżej).
Całkowity Ae mierzono również w móżdżku, regionie zazwyczaj w stopniu minimalnym dotkniętym patologią AD. Żadna z median stężeń Ae w tym regionie mózgu w żadnej z grup immunizowanych różnymi peptydami Ae lub pochodną APP nie różniła się od grupy kontrolnej. Ten wynik sugeruje, że traktowanie nie wpływa na niepatologiczne poziomy Ae.
Metodą ELISA określono również stężenie APP w korze i móżdżku myszy traktowanych i kontrolnych. Wykorzystywano dwa różne oznaczenia APP. Pierwsze, oznaczone APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (α, wydzielana postać APP, która powstaje w wyniku rozszczepiania w sekwencji
PL 200 458 B1
Ae), jak i postacie APP o pełnej długości (FL), podczas gdy drugie rozpoznaje wyłącznie APP-α. W przeciwieństwie od obserwowanego związanego z traktowaniem zmniejszenia Ae w części grup doświadczalnych, poziom APP pozostał nie zmieniony u zwierząt traktowanych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że immunizacje peptydami Ae nie zmniejszają ilości APP; raczej wpływ traktowania ograniczony jest do Ae.
Podsumowując, podawanie AN1792, Ae 1-42 gryzoni lub koniugatu Ae 1-5, znacząco obniżało poziom całkowitego Ae i Ae 1-42 w korze mózgowej. W hipokampie poziom Ae ulegał obniżaniu tylko przy podawaniu AN1792. Żadne inne związane z traktowaniem zmiany w poziomie Ae lub APP w regionie hipokampa, kory lub móżdżku nie były znaczące.
2. Analizy histochemiczne
Mózgi części zwierząt z sześciu grup: trzech grup immunizowanych koniugatami peptydów Ae, Ae1-5, Ae1-12 i Ae13-28, dwóch grup immunizowanych agregatami Ae o pełnej długości, AN1792 i AN1528 oraz traktowanej PBS grupy kontrolnej, przygotowano do analizy immunohistochemicznej. Wyniki analiz obrazów obciążenia amyloidem w skrawkach mózgów z tych grup przedstawiono na fig. 12. Występowało istotne obniżenie obciążenia amyloidem regionów korowych w trzech grupach traktowanych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Najwyższe obniżenie obciążenia amyloidem obserwowano w grupie otrzymującej AN1792, w której średnia wartość obniżona była o 97% (p = 0,001). Znaczące obniżenia obserwowano również dla zwierząt traktowanych AN1528 (95%, p = 0,005) oraz koniugatem peptydu Ae1-5 (67%, p = 0,02).
Wyniki otrzymane przez pomiary ilości całkowitego Ae lub Ae1-42 metodą ELISA oraz obciążenia amyloidem przez analizę obrazów różnią się w pewnym stopniu. Traktowanie AN1528 wywierało znaczący wpływ na poziom korowego obciążenia amyloidem przy pomiarze przez ilościową analizę obrazów, ale nie na stężenie całkowitego Ae w tym samym regionie, gdy pomiary prowadzono metodą ELISA. Różnica pomiędzy tymi dwoma wynikami jest prawdopodobnie spowodowana specyficznościami oznaczeń. W analizie obrazów mierzy się tylko nierozpuszczalny Ae zagregowany w płytki. W przeciwieństwie, w ELISA mierzy się wszystkie postacie Ae, zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne, monomeryczne i zagregowane. Ponieważ uważa się, że patologia choroby związana jest z nierozpuszczalnymi, związanymi z płytkami postaciami Ae, technika analizy obrazów może być bardziej czuła pod względem ujawniania efektów terapeutycznych. Jednakże, ponieważ ELISA jest szybszym i łatwiejszym oznaczeniem, jest ona bardzo użyteczna do celów badań przesiewowych. Ponadto, może ujawniać ono, że związane z leczeniem obniżanie poziomów Ae jest większe dla związanego z płytkami, niż całkowitego Ae.
W celu określenia, czy specyficzne wobec Ae przeciwciała wywoływane przez immunizację u traktowanych zwierząt reagowały z mózgowymi złogami amyloidu, część skrawków ze zwierząt traktowanych i myszy kontrolnych poddawano reakcji z przeciwciałem specyficznym wobec IgG myszy. W przeciwieństwie do grupy PBS, u zwierząt immunizowanych koniugatami peptydu Ae: Ae1-5, Ae1-12, i Ae13-28 oraz agregatami Ae o pełnej długości, AN1792 i AN1528, płytki zawierające Ae były opłaszczone endogennymi IgG. Mózgów zwierząt immunizowanych innymi peptydami Ae lub peptydem APP, pBx6, nie analizowano w tym oznaczeniu.
3. Pomiar mian przeciwciał
Krew pobierano od myszy od czterech do siedmiu dni po każdej immunizacji, począwszy od immunizacji drugiej; łącznie pobierano ją pięć razy. Miana przeciwciał mierzono jako miana przeciwciał wiążących się z Ae1-42 stosując ELISA typu podwójnego wiązania sandwich w plastikowych wielostudzienkowych płytkach opłaszczonych Ae1-42. Jak przedstawiono na fig. 13, piki mian przeciwciał wywoływane po czwartej dawce tych immunogennych preparatów, które wywoływały najwyższe miana przeciwciał specyficznych wobec AN1792: AN1792 (GMT piku: 94647), AN1528 (GMT piku: 88231), koniugat Ae1-12 (GMT piku: 47216) oraz Ae1-42 gryzoni (GMT piku: 10766). W grupach tych miana obniżały się nieco po piątej i szóstej dawce. W przypadkach pozostałych pięciu immunogenów, piki mian osiągano po piątej lub szóstej dawce i były one znacznie niższe niż dla czterech grup o najwyższych mianach: koniugat Ae1-5 (GMT piku: 2356), pBx6 (GMT piku: 1986), koniugat Ae13-28 (GMT piku: 1183), koniugat Ae33-42 (GMT piku 658), Ae25-35 (GMT piku: 125). Mierzono również miana przeciwciał skierowanych przeciw peptydom homologicznym, stosując takie samo oznaczenie ELISA typu sandwich dla części immunogenów - grup immunizowanych Ae1-5, Ae13-28, Ae25-35, Ae33-42 Ae1-42 gryzoni. Miana te były w przybliżeniu takie same, jak te mierzone wobec Ae1-42, z wyjątkiem immunogenu Ae1-42, w którym to przypadku miana przeciwciał skierowanych przeciw immunogenowi homologicznemu były około dwukrotnie wyższe. Wielkość miana przeciwciał specyficznych wobec
PL 200 458 B1
AN1792 dla pojedynczych zwierząt lub wartości średnie dla grup traktowania nie były skorelowane ze skutecznością mierzoną jako obniżanie poziomu Ae w korze.
4. Odpowiedzi proliferacji limfocytów
Zależną od Ae proliferacji limfocytów mierzono stosując komórki śledziony zebrane około jednego tygodnia po ostatniej, szóstej, immunizacji. Świeżo zebrane komórki, 105 na studzienkę, hodowano w ciągu 5 dni w obecności Ae1-40 o stężeniu 5 μΜ dla uzyskania stymulacji. Komórki części zwierząt z siedmiu spośród dziesięciu grup hodowano również w obecności peptydu o odwróconej sekwencji, Ae40-1. Jako kontrolę dodatnią hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako kontrolę ujemną komórki hodowano bez dodawanego peptydu.
Limfocyty z większości zwierząt proliferowały w odpowiedzi na PHA. Nie występowały znaczące odpowiedzi na peptyd o odwróconej sekwencji, Ae40-1. Komórki ze zwierząt immunizowanych większymi, zagregowanymi peptydami, AN1792, Ae1-42 gryzoni i AN1528 proliferowały silnie po stymulacji Ae1-40, z najwyższymi zliczeniami na minutę (cpm) u biorców AN1792. Komórki jednego zwierzęcia w każdej z grup immunizowanych koniugatem Ae1-12, koniugatem Ae1-28 i AeP25-35 proliferowały w odpowiedzi na Ae1-40. W pozostałych grupach, otrzymujących koniugat Ae1-5, koniugat Ae33-42, pBx6 lub PBS nie występowały zwierzęta z odpowiedzią stymulowaną Ae. Wyniki te podsumowano w tabeli 5 poniżej.
T a b e l a 5
Immunogen Koniugat Aminokwasy Ae Osobniki odpowiadające
Ae1-5 tak 5-mer 0/7
Ae1-12 tak 12-mer 1/8
Ae 13-28 tak 16-mer 1/9
Ae25-35 11-mer 1/9
Ae33-42 tak 10-mer 0/10
Ae1-40 40-mer 5/8
Ae1-42 42-mer 9/9
r Ae1-42 42-mer 8/8
pBx6 0/8
PBS 0-mer 0/8
Wyniki wykazują, że AN1792 i AN1528 stymulują silne odpowiedzi komórek T, najprawdopodobniej o fenotypie CD4+. Brak specyficznej wobec Ae odpowiedzi komórek T u zwierząt immunizowanych Ae1-5 nie jest zaskakujący, ponieważ epitopy peptydowe rozpoznawane przez komórki T CD4+ mają zazwyczaj długość około 15 aminokwasów, chociaż krótsze peptydy mogą niekiedy działać z niższą skutecznością. A zatem, większość epitopów czterech skoniugowanych peptydów dla pomocniczych komórek T prawdopodobnie znajduje się w składowej IgG koniugatu, a nie w regionie Ae. Hipotezę tę potwierdza bardzo niska częstość występowania odpowiedzi proliferacyjnej u zwierząt z każdej z tych grup traktowania. Ponieważ koniugat Ae1-5 był skuteczny pod względem znaczącego obniżania poziomu Ae w mózgu, przy pozornej nieobecności specyficznych wobec Ae komórek T, kluczową efektorową odpowiedzią odpornościową indukowaną przez immunizację tym peptydem okazały się być przeciwciała.
Brak komórek T oraz niska odpowiedź przeciwciał na peptyd fuzyjny pBx6, obejmujący aminokwasy 592-695 APP włącznie ze wszystkimi resztami Ae, może być spowodowana niską immunogennością tego szczególnego preparatu. Niska immunogenność agregatu Ae25-35 jest prawdopodobnie spowodowana tym, że wielkość peptydu jest prawdopodobnie zbyt mała, aby z wysokim prawdopodobieństwem zawierał on dobry epitop dla komórek T do wspomagania indukcji odpowiedzi przeciwciał. Gdyby peptyd ten skoniugowano z białkiem nośnikowym, byłby on prawdopodobnie bardziej immunogenny.
V. Przygotowywanie przeciwciał monoklonalnych do ochrony biernej
125 nie transgenicznych myszy immunizowano 100 μg Ae1-42, plus adiuwant CFA/IFA i uśmiercano w wieku 4-5 miesięcy. Z immunizowanych myszy zbierano krew. Oddzielano IgG od
PL 200 458 B1 innych składników krwi. Przeciwciała specyficzne wobec immunogenu można częściowo oczyścić przez chromatografię powinowactwa. Przeciętnie otrzymuje się około 0,5-1 mg przeciwciał specyficznych wobec immunogenu na mysz, uzyskując łącznie 60-120 mg.
VI. Bierna immunizacja przeciwciałami skierowanymi przeciw Αβ
Grupom myszy PDAPP w wieku 7-9 miesięcy wstrzyknięto 0,5 mg poliklonalnych przeciwciał specyficznych skierowanych przeciw Ae lub przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec Ae w PBS, jak przedstawiono poniżej. Wszystkie preparaty przeciwciał oczyszczono, aby zawierały niskie poziomy endotoksyn. Skierowane przeciw fragmentowi przeciwciała monoklonalne można przygotować przez wstrzyknięcie fragmentu lub dłuższej postaci Ae myszom, przygotowanie hybrydom i przeszukanie hybrydom pod kątem przeciwciała, które specyficznie wiąże się z pożądanym fragmentem Ae, bez wiązania z nie pokrywającymi się fragmentami Ae.
T a b e l a 6
Przeciwciało Epitop
2H3 Αβ 1-12
10D5 Αβ 1-12
266 Αβ 13-28
21F12 Αβ 33-42
Mysie przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw ludzkiemu Αβ Przeciw-zagregowany Αβ42
Przeciwciała wstrzykiwano myszom dootrzewnowo w ciągu okresu 4 miesięcy w miarę potrzeby dla utrzymywania stężenia przeciwciał w krążeniu, mierzonego jako miano w ELISA wobec Ae42 lub innego immunogenu, wyższego niż 1/1000. Miana monitorowano w powyższy stopień i myszy uśmiercano pod koniec 6 miesięcy iniekcji. Po śmieci przeprowadzono badania histochemiczne, poziomów Ae i toksykologiczne. Stosowano dziesięć myszy na grupę. Dodatkowe badania immunizacji biernej opisano w przykładach XI i XII poniżej.
VII. Porównanie różnych adiuwantów
W przykładzie tym porównuje się CFA, ałun i emulsję oleju w wodzie i MPL pod względem zdolno ś ci do stymulowania odpowiedzi odporno ś ciowej.
A. Materiały i metody
1. Projekt badań
Sto samic świnek morskich rasy Hartley w wieku sześciu tygodni, otrzymanych z Elm Hill, podzielono na dziesięć grup przeznaczonych do immunizowania AN1792 lub jego palmitoilowaną pochodną w kombinacji z różnymi adiuwantami. Siedem grup otrzymywało iniekcje AN1792 (33 pg, o ile nie określono inaczej) połączonego z a) PBS, b) adiuwantem Freunda, c) MPL, d) skwalenem, e) MPL/skwalenem, f) niską dawką ałunu lub g) wysoką dawką ałunu (300 pg AN1792). Dwie grupy otrzymywały iniekcje palmitoilowanej pochodnej AN1792 (33 pg) połączonej z a) PBS lub b) skwalenem. Ostatnia, dziesiąta grupa otrzymywała samą PBS bez antygenu lub dodatkowego adiuwanta. W przypadku grupy otrzymującej adiuwant Freunda, pierwszą dawkę emulgowano z CFA, a pozostałe cztery dawki z IFA. Antygen podawano w dawce 33 pg wszystkim grupom z wyjątkiem grupy otrzymującej wysoką dawkę ałunu, której podawano 300 pg AN1792. W przypadku CFA/IFA stosowano iniekcje dootrzewnowe, a we wszystkich pozostałych grupach domięśniowe do mięśnia czworogłowego tylnej kończyny na zmianę po prawej i po lewej stronie. Pierwsze trzy dawki podawano co dwa tygodnie, a następne dwie dawki w odstępach miesięcznych. Krew pobierano od sześciu do siedmiu dni po każdej immunizacji, poczynając od drugiej dawki, w celu pomiaru mian przeciwciał.
2. Przygotowywanie immunogenów
Dwa mg Ae42 (California Peptide, numer serii ME0339) dodano do 0,9 ml wody dejonizowanej i mieszaninę wytrząsano do utworzenia stosunkowo jednolitej zawiesiny. Dodano 100 pl 10X PBS (1 x PBS, 0,15M NaCl, 0,01M fosforan sodu, pH 7,5). Zawiesinę ponownie wytrząsano i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C do stosowania następnego dnia. Niewykorzystany Ae1-42 przechowywano ze środkiem suszącym w postaci zliofilizowanego proszku w temperaturze -20°C.
PL 200 458 B1
Palmitoilowaną pochodną AN1792 przygotowano przez sprzęgnięcie bezwodnika palmitynowego, rozpuszczonego w dimetyloformamidzie, z aminokońcową resztą AN1792 przed usunięciem powstającego peptydu z żywicy przez traktowanie kwasem fluorowodorowym.
W celu przygotowania dawek preparatu z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) (grupa 2), do pierwszej immunizacji 33 μq AN1792 w 200 μl PBS emulgowano w stosunku 1:1 (obj./obj.) z CFA w objętości końcowej 400 gl. Do następnych immunizacji, antygen podobnie emulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA).
W celu przygotowania dawek preparatu z MPL dla grup 5 i 8, liofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) dodawano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy do stężenia końcowego 1 mg/ml i wytrząsano. Mieszaninę ogrzewano do temperatury od 65 do 70°C w ciągu 3 sekund w celu utworzenia lekko opalizującej jednolitej zawiesiny miceli. Roztwór świeżo przygotowywano dla każdego zestawu iniekcji. Dla każdej iniekcji w grupie 5, 33 μg SN1792 w 16,5 μl PBS, 50 μg MPL (50 μ[) i 162 μl PBS mieszano w probówce ze szkła borokrzemianowego bezpośrednio przed użyciem.
W celu przygotowania dawek preparatu z niską zawartością emulsji typu olej w wodzie, AN1792 w PBS dodawano do 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 w PBS, do osiągnięcia końcowego stężenia pojedynczej dawki wynoszącego 33 μg AN1792 w 250 μl (grupa 6). Mieszaninę emulgowano poprzez przepuszczanie 15-20 razy przez dwukomorowe ręczne urządzenie, dopóki kropelki emulsji podczas oglądania pod mikroskopem nie okazały się mieć średnicę w przybliżeniu równą średnicy 1,0 pm standardowych perełek lateksowych. Otrzymana w wyniku mieszanina była opalizująca, o barwie mleczno białej. Emulsje świeżo przygotowywano do każdej serii iniekcji. W przypadku grupy 8, do skwalenu i mieszanin detergentu do emulgowania, jak podano powyżej, dodawano MPL w 0,2% trietyloaminie w stężeniu 50 μg na dawkę. W przypadku pochodnej palmitoilowej (grupa 7), do skwalenu dodawano 33 μg palmitoilo-NH-Ae1-42 na dawkę i mieszaninę wytrząsano. Następnie, w trakcie mieszania, dodawano Tween 80 i Span 85. Mieszaninę tę dodawano do PBS do osiągnięcia stężeń końcowych 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 i mieszaninę emulgowano w sposób podany powyżej.
W celu przygotowania dawek preparatu z ałunem (grupy 9 i 10), AN1792 w PBS dodawano Alhydrogel (żel wodorotlenku glinu, Accurate, Westbury, NY) do osiągnięcia stężeń 33 μg (niska dawka, grupa 9) lub 300 gg (wysoka dawka, grupa 10) AN1792 na 5 mg ałunu w końcowej objętości dawki 250 pl. Zawiesinę delikatnie mieszano w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej.
3. Pomiar mian przeciwciał
Od świnek morskich pobierano krew sześć do siedmiu dni po immunizacji, począwszy od immunizacji drugiej; łącznie pobierano ją cztery razy. Miana przeciwciał skierowanych przeciw Ae42 mierzono metodą ELISA jak opisano w części „Ogólne materiały i metody”.
4. Przygotowywanie tkanek
Po około 14 tygodniach, wszystkie świnki morskie uśmiercono przez podanie CO2. Zebrano płyn mózgowo-rdzeniowy, usunięto mózgi, a trzy regiony mózgowe (hipokamp, korę mózgową i móżdżek) wycięto i stosowano do pomiaru stężenia całkowitego białka Ae metodą ELISA.
B. Wyniki
1. Odpowiedzi przeciwciał
Różne adiuwanty wykazywały szeroki zakres siły działania, gdy mierzono odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciw AN1792 po immunizacji. Jak przedstawiono na fig. 14, gdy AN1792 podawano w PBS, nie wykryto żadnych przeciwciał po dwóch lub trzech immunizacjach, a po dawkach czwartej i piątej wykrywano nieistotne odpowiedzi, o średnich geometrycznych mian (GMT) tylko około 45. Emulsja typu olej w wodzie indukowała niewielkie miana po trzeciej dawce (GMT 255), które utrzymywały się po czwartej dawce (GMT 301) i opadały po ostatniej dawce (GMT 54). Występowała wyraźna odpowiedź na dawkę w przypadku AN1792 związanego z ałunem, przy czym 300 pq było bardziej immunogenne we wszystkich punktach czasowych niż 33 pg. W piku odpowiedzi przeciwciał, po czwartej immunizacji, różnica pomiędzy dwiema dawkami wynosiła 43%, z GMT około 1940 (33 pg) i 3400 (300 pg). Odpowiedź przeciwciał na 33 pg AN1792 plus MPL była bardzo podobna do tej wywoływanej przez prawie dziesięciokrotnie wyższą dawkę antygenu (300 pg) związanego z ałunem. Dodanie MPL do emulsji typu olej w wodzie obniżało siłę działania preparatów w stosunku do tych MPL jako jedynym antygenem aż o 75%. Palmitoilowana pochodna AN1792 była całkowicie nieimmunogenna, gdy podawano ją w PBS i dawała niewielkie miana, gdy podawano ją w emulsji typu olej
PL 200 458 B1 w wodzie, z GMT 340 i 105 dla trzeciego i czwartego pobrania krwi. Najwyższe miana przeciwciał powstawały dla adiuwanta Freunda, z GMT piku wynoszącą około 87000, wartością prawie 30-krotnie wyższą od GMT dla następnych dwóch preparatów o najwyższych siłach działania, MPL i wysokiej dawki AN1792/ałun.
Najbardziej obiecującymi adiuwantami zidentyfikowanymi w tych badaniach są MPL i ałun. Z tych dwóch, MPL wydaje się korzystniejszy, ponieważ 10-krotnie niższa dawka antygenu była wymagana do wywołania takiej samej odpowiedzi przeciwciał, jaką otrzymano dla ałunu. Odpowiedź można zwiększyć przez zwiększenie dawki antygenu i/lub adiuwanta oraz przez optymalizację schematu immunizacji. Emulsja typu olej w wodzie była bardzo słabym adiuwantem dla AN1792 i jej dodawanie do adiuwanta MPL zmniejszało faktyczną aktywność samego MPL jako adiuwanta.
2. Poziomy Ae w mózgu
Po około 14 tygodniach świnki morskie głęboko usypiano, odciągano płyn mózgowo-rdzeniowy i wycinano mózgi ze zwierząt z części grup immunizowanych adiuwantem Freunda (grupa 2), MPL (grupa 5), ałunem z wysoką dawką (300 pg) AN1792 (grupa 10) oraz kontrolnej grupy immunizowanej PBS (grupa 3). Do pomiaru poziomu peptydu Ae wycinano jedną półkulę i przygotowywano homogenaty regionów hipokampa, kory mózgowej i móżdżku w 5M guanidynie. Rozcieńczano je i oceniano ilościowo metodą ELISA przez porównanie z szeregiem rozcieńczeń standardowego białka Ae o znanych stężeniach. Poziomy białka Ae w hipokampie, korze mózgowej i móżdżku były bardzo podobne dla wszystkich czterech grup, pomimo szerokiego zakresu odpowiedzi przeciwciał skierowanych przeciw Ae wywoływanych przez te preparaty. Zmierzono średnie poziomy Ae wynoszące około 25 ng/g tkanki w hipokampie, 21 ng/g w korze mózgowej i 12 ng/g w móżdżku. A zatem, obecność w krążeniu wysokiego miana przeciwciał skierowanych przeciw Ae w ciągu prawie trzech miesięcy u niektórych z tych zwierząt nie zmieniła poziomów całkowitego Ae w ich mózgach. Poziomy Ae w płynie mózgowo-rdzeniowym również były całkiem podobne we wszystkich grupach. Brak dużego wpływu immunizacji AN1792 na poziomy endogennego Ae wskazuje, że odpowiedź odpornościowa ogniskuje się na patologicznych formacjach Ae.
VIII. Odpowiedź odpornościowa na różne adiuwanty u myszy
W badaniach tych stosowano samice myszy Swiss Webster w wieku sześciu tygodni, z 10-13 zwierzętami na grupę. Immunizacje stosowano w dniach 0, 14, 28, 60, 90 i 120 podawano podskórnie w dawkach o objętości 200 pl. We wszystkich preparatach jako bufor stosowano PBS. Krew do analizy mian przeciwciał metodą ELISA pobierano od zwierząt siedem dni po każdej immunizacji, począwszy od drugiej dawki. Schemat traktowania każdej grupy podsumowano w tabeli 7.
T a b e l a 7 Plan doświadczenia
Grupa Na Adiuwantb Dawka Antygen Dawka(pg)
1 2 3 4 5 6
1 10 MPL 12,5 pg AN1792 33
2 10 MPL 25 pg AN1792 33
3 10 MPL 50 pg AN1792 33
4 13 MPL 125 pg AN1792 33
5 13 MPL 50 pg AN1792 150
6 13 MPL 50 pg AN1792 33
7 10 PBS AN1792 33
8 10 PBS brak
9 10 emulgowany skwalen 5% AN1792 33
10 10 domieszany skwalen 5% AN1792 33
PL 200 458 B1 cd tabeli 7
1 2 3 4 5 6
11 10 ałun 2 mg AN1792 33
12 13 MPL + ałun 50 Mg/2 mg AN1792 33
13 10 QS-21 5 μg AN1792 33
14 10 QS-21 10 μg AN1792 33
15 10 QS-21 25AN1792 AN1792 33
16 13 QS-21 25AN1792 AN1792 150
17 13 QS-21 25AN1792 AN1528 33
18 13 QS-21 + MPL 25 μg/50 μg AN1792 33
19 13 QS-21 + ałun 25 μg/2 mg AN1792 33
Przypisy:
a Liczba myszy w każdej grupie na początku doś wiadczenia b Podano adiuwanty. Buforem we wszystkich tych preparatach była PBS. W grupie 8 nie stosowano ż adnego adiuwantu i żadnego antygenu
Otrzymane w ELISA miana przeciwciał skierowanych przeciw Ae42 w każdej grupie przedstawiono w tabeli 8 poniżej.
T a b e l a 8
Średnie geometryczne mian przeciwciał
Tydzień pobrania krwi
Grupa traktowania 2,9 5,0 8,7 12,9 16,7
1 248 1797 2577 6180 4177
2 598 3114 3984 5287 6878
3 1372 5000 7159 12333 12781
4 1278 20791 14368 20097 25631
5 3288 26242 13229 9315 23742
6 61 2536 2301 1442 4504
7 37 395 484 972 2149
8 25 25 25 25 25
9 25 183 744 952 1823
10 25 89 311 513 817
11 29 708 2618 2165 3666
12 198 1458 1079 612 797
13 38 433 566 1080 626
14 104 541 3247 1609 838
15 212 2630 2472 1224 1496
16 183 2616 6680 2085 1631
17 28 201 375 222 1540
18 31699 15544 23095 6412 9059
19 63 243 554 299 441
W tabeli pokazano, że najwyższe miana uzyskano w grupach 4, 5 i 18, w których adiuwantami było 125 μg MPL, 50 μg MPL i QS-21 plus MPL.
PL 200 458 B1
IX. Skuteczność terapeutyczna różnych adiuwantów
Badania skuteczności terapeutycznej prowadzono na transgenicznych myszach PDAPP, stosując zestaw adiuwantów odpowiednich do stosowania u ludzi, w celu określenia ich zdolności do wzmacniania odpornościowych odpowiedzi na Ae oraz do indukcji usuwania dzięki odporności złogów amyloidu w mózgu.
Sto osiemdziesiąt samców i samic transgenicznych, heterozygotycznych myszy PDAPP, w wieku od 7,5 do 8,5 miesięcy, otrzymano z Charles River Laboratories. Myszy podzielono na dziewięć grup, po od 15 do 23 zwierząt na grupę, przeznaczonych do immunizowania AN1792 lub AN1528 w połączeniu z różnymi adiuwantami. Zwierzęta podzielono w taki sposób, aby rozkład płci, wieku i pochodzenia w poszczególnych grupach był na tyle podobny, na ile to możliwe. Adiuwanty obejmowały ałun, MPL i QS-21, z których każdy łączono z oboma antygenami, oraz adiuwant Freunda (FA), połączony tylko z AN1792. Dodatkową grupę immunizowano AN1792 w preparacie z buforem PBS i środkiem konserwującym tymerosalem, bez adiuwantu. Dziewiątą grupę immunizowano samą PBS, jako kontrolę ujemną.
Przygotowywanie zagregowanych peptydów Ae: do przygotowania każdego zestawu iniekcji z liofilizowanych proszków przechowywanych ze środkiem suszącym w temperaturze -20°C, świeżo rozpuszczano peptydy: ludzki Ae1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA, numer serii ME0541) i ludzki Ae1-42 (AN1792; California Peptides Inc., numer serii ME0439). W tym celu, dwa mg peptydu dodawano do 0,9 ml wody dejonizowanej i mieszaninę wytrząsano do uzyskania stosunkowo jednorodnego roztworu lub zawiesiny. AN1528 był rozpuszczalny na tym etapie, w przeciwieństwie do AN1792. Następnie dodawano porcję 10 x PBS (1 x PBS: 0,15M NaCl, 0,01M fosforan sodu, pH 7,5) o objętości 100 pl, co wywoływało wytrącanie AN1528. Zawiesiny ponownie wytrząsano i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C do stosowania następnego dnia.
W celu przygotowania dawek preparatu z ałunem (grupy 1 i 5), peptyd Ae w PBS dodawano do Alhydrogel (dwuprocentowy wodny żel wodorotlenku glinu, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) do osiągnięcia stężeń 100 pg peptydu Ae na mg ałunu. 10 x PBS dodawano do końcowej objętości dawki 200 pl w 1 x PBS. Następnie zawiesinę delikatnie mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu około 4 godzin przed iniekcją.
W celu przygotowania dawek preparatu z MPL (grupy 2 i 6), zliofilizowany proszek (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; numer serii 67039-E0896B) dodawano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy do stężenia końcowego 1 mg/ml i mieszaninę wytrząsano. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze od 65 do 70°C w ciągu 30 sekund dla utworzenia lekko opalizującej jednolitej zawiesiny miceli. Roztwór przechowywano w temperaturze 4°C. Dla każdego zestawu iniekcji, bezpośrednio przed użyciem mieszano 100 pg peptydu na dawkę w objętości 50 pl PBS, 50 pg MPL na dawkę (50 pl) i 100 pl PBS na dawkę w probówce ze szkła borokrzemianowego.
W celu przygotowania dawek preparatu z QS-21 (grupy 3 i 7), zliofilizowany proszek (Aquila, Framingham, MA; numer serii A7018R) dodawano do PBS, pH 6,6-6,7, do stężenia końcowego 1 mg/ml i mieszaninę wytrząsano. Roztwór przechowywano w temperaturze -20°C. Dla każdego zestawu iniekcji, bezpośrednio przed użyciem mieszano 100 pg peptydu na dawkę w objętości 50 pl PBS, 25 μg QS-21 na dawkę w objętości 25 pl PBS i 125 pl PBS na dawkę w probówce ze szkła borokrzemianowego.
W celu przygotowania dawek preparatu z adiuwantem Freunda (grupa 4) do pierwszej immunizacji, 100 pg AN1792 w objętości 200 pl PBS emulgowano w stosunku 1:1 (obj./obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w objętości końcowej 400 pl. Do kolejnych immunizacji, antygen w podobny sposób emulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA). W przypadku preparatów zawierających adiuwanty ałun, MPL lub QS-21, 100 pg AN1792 lub AN1528 na dawkę łączono z ałunem (1 mg/dawkę) lub MPL (50 pg na dawkę), bądź QS-21 (25 pg na dawkę) w końcowej objętości 200 pl PBS i podawano przez podskórną iniekcję na grzbiecie pomiędzy łopatkami. W przypadku grupy otrzymującej FA, 100 pg AN1792 emulgowano w stosunku 1:1 (obj./obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w objętości końcowej 400 pl i podawano dootrzewnowo podczas pierwszej immunizacji, po której następowały immunizacje przypominające taką samą dawką immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) dla pięciu następnych dawek. W przypadku grupy otrzymującej AN1792 bez adiuwanta, 10 pg AN1792 łączono z 5 pg tymerosalu w końcowej objętości 50 pl PBS i podawano podskórnie. Grupa dziewiąta, kontrolna, otrzymywała tylko 200 pl PBS, podawane podskórnie. Immunizacje podawano co dwa tygodnie w przypadku pierwszych trzech dawek, a następnie co miesiąc, w dniach 0, 16, 28, 56, 85 i 112. Krew do pomiaru mian przeciwciał pobierano od zwierząt
PL 200 458 B1 po sześciu do siedmiu dniach po każdej immunizacji, począwszy od drugiej dawki. Zwierzęta uśmiercano około jednego tygodnia po ostatniej dawce. Wynikami były mierzone w oznaczeniu EL^ poziomy Αβ i APP w mózgu oraz przez immunohistochemiczną ocenę obecności płytek amyloidu w skrawkach mózgu. Ponadto, określano miana przeciwciał specyficznych wobec Αβ, zależną od Αβ odpowiedź proliferacyjną oraz odpowiedź cytokin.
W tabeli 9 pokazano, że najwyższe miana przeciwciał skierowanych przeciw Αβ1-42 wywoływane były przez FA i ΑΝ1792, miana te osiągały maksima po czwartej immunizacji (GMT piku: 75386), a następnie obniżały się o 59% po ostatniej, szóstej immunizacji. Średnie miano w piku, wywoływane przez MPL z ΑΝ1792, było o 62% niższe od tego wywoływanego przez FA (GMT piku: 28867) i również występowało wcześnie w schemacie immunizacji, po 3 dawkach, po czym następowało obniżenie do 28% wartości piku po szóstej immunizacji. Średnie miano piku wywoływane przez QS-21 połączony z ΑΝ1792 (GMT: 1511) było około 5-krotnie niższe od tego otrzymanego z MPL. Ponadto, kinetyki odpowiedzi były wolniejsze, ponieważ dodatkowa immunizacja była wymagana do osiągnięcia piku odpowiedzi. Miana wywoływane przez ΑΝ1792 były nieznacznie wyższe niż te otrzymane z QS-21, a kinetyki odpowiedzi były szybsze. W przypadku ΑΝ1792 podawanego w PBS z tymerosalem, częstość i wielkość wykrywalnych mian były niewiele większe niż te dla samej PBS. Piki mian wywoływanych z MPL i ΑΝ1528 (GMT piku: 3099) były około 9-krotnie niższe od tych dla ΑΝ1792. ΑΝ1528 związany z ałunem był bardzo słabo immunogenny, z niskimi mianami występującymi tylko u niektórych zwierząt. Nie obserwowano żadnej odpowiedzi przeciwciał u kontrolnych zwierząt immunizowanych samą PBS.
T a b e l a 9
Średnie geometryczne mian przeciwciała
Tydzień pobierania krwi
Traktowanie 3,3 5,0 9,0 13,0 17,0
Ałun/AN1792 102 1081 2366 1083 572
(12/21)b (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)
MPL/AN1792 6241 28867 11242 5665 8204
(21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/AN1792 30 227 327 1511 1188
(1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18)
CFA/AN1792 10076 61279 75386 41628 30574
(15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)
Ałun/AN1528 25 33 39 37 31
(0/21) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20)
MPL/AN1528 184 2591 1653 1156 3099
(15/21) (20/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/AN1528 29 221 51 820 2994
(1/22) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22)
PBS plus tymerosal 25 33 39 37 47
(0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16)
PBS 25 25 25 25 25
(0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16)
Przypisy:
a Ś rednie geometryczne mian przeciwciał mierzonych wobec Αβ 1-42 b Liczba zwierząt odpowiadających w grupie
Wyniki traktowania ΑΝ1792 lub ΑΝ1528 z różnymi adiuwantami lub tymerosalem, na obciążenie kory amyloidem u myszy w wieku 12 miesięcy określone metodą EL^, przedstawiono na fig. 15. U otrzymujących PBS kontrolnych myszy PDAPP, mediana poziomu całkowitego Αβ w korze w 12 miesiącu wynosiła 1817 ng/g. Znacznie obniżone poziomy Αβ obserwowano u myszy traktowanych ΑΝ1792 plus CFA/IFA, ΑΝ1792 plus ałun, ΑΝ1792 plus MPL oraz QS-21 plus ΑΝ1792. Obniżenie osiągało istotność statystyczną (p < 0,05) tylko dla ΑΝ1792 plus CFA/IFA. Jednakże, jak wykazano
PL 200 458 B1 w przykładach I i III, wpływy immunizacji pod względem obniżania poziomów Ae stają się zasadniczo wyższe u myszy w wieku 15 miesięcy i 18 miesięcy. A zatem oczekuje się, że co najmniej kompozycje AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS-21 osiągać będą istotność statystyczną w traktowaniu starszych myszy. W przeciwieństwie, AN1792 plus środek konserwujący tymerosal wykazywał medianę poziomów Ae w przybliżeniu taką samą, jak ta u myszy traktowanych PBS. Podobne wyniki otrzymano, gdy porównywano poziomy Ae w korze mózgowej. Mediana poziomów Ae42 u kontroli otrzymujących PBS wynosiła 1624 ng/g. U myszy traktowanych AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus ałun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS-21 obserwowano odpowiednio mediany poziomów wynoszące 403, 1149, 620 i 714, przy czym obniżenie osiągnęło istotność statystyczną (p = 0,05 dla grupy traktowanej AN1792 z CFA/IFA. Mediana poziomów u myszy traktowanych AN1792 z tymerosalem wynosiła 1619 ng Ae42/g.
Dalsze badania skuteczności adiuwanta/immunogenu prowadzono na samcach i samicach heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w wieku 9-10,5 miesięcy. Czas trwania badań wynosił 25 tygodni, a grupy traktowania obejmowały 29-40 zwierząt; dlatego też, w chwili zakończenia badań zwierzęta były w wieku 15-16,5 miesięcy. Grupy traktowania przedstawiono w tabeli 10 poniżej.
T a b e l a 10
Adiuwant Immunogen Bufor rozcieńczający Podawanie
Grupa 1: MPL-SE AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
Grupa 2: ISA 51 AN1792-GCS (75 pg) PBS IP (400 pl)
Grupa 3: QS21 AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
Grupa 4: QS21 skrócone AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
Grupa 5: PBS — — SC (250 pl)
Skróty w tabeli 10: MAP - peptyd wieloantygenowy; TT - epitop toksoidu tężcowego rozpoznawany przez komórki T (830-844); SC - podskórnie; IP - dootrzewnowo; PBS - sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami; ISA-51 jest dostępny w handlu adiuwantem podobnym do IFA; GCS jest preparatem glicyna/cytrynian/sacharoza, MPL-SE jest MPL w stabilizowanej emulsji wody i oleju.
Schemat immunizacji był identyczny dla wszystkich grup traktowania, z wyjątkiem grupy 3, czyli grupy, dla której stosowano skrócony schemat immunizacji QS21/AN1792. Iniekcje u myszy stosowano w tygodniach 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, a pobieranie krwi prowadzono w tygodniach 3, 5, 9, 13, 17, 21 i 25. Grupy 1 i 2 otrzymywały osiem iniekcji, a grupa 3 otrzymała cztery iniekcje podczas 25-tygodniowego okresu badań. Grupa 4, dla której stosowano skrócony schemat immunizacji QS21/AN1792, otrzymywała iniekcje tylko w tygodniach 0, 2, 4 i 8. W grupie tej nie stosowano iniekcji podczas pozostałej części badania, chociaż krew pobierano zgodnie z tym samym schematem, jak dla pozostałych grup, w celu śledzenia zaniku miana. W badaniach tych jako kontrole dodatnia i ujemna służyły grupy 3 i 5, odpowiednio QS21/AN1792 i PBS.
Miana określano w oznaczeniu przeciwciał skierowanych przeciw Ae.
W grupie 1, czyli grupie MPL-SE/AN1792, wywołano pik mian o średniej geometrycznej (GMT) wynoszącej 17100 w 9 tygodniu, obniżający się do GMT wynoszącej 10000 w 25 tygodniu. Początkowo miana w grupie MPL/SE wzrastały z nieco większą szybkością, niż w grupie kontrolnej QS21/AN1792 (grupa 4).
W grupie 2, czyli grupie ISA 51/AN1792, powstawały wysokie miana podczas całego badania, osiągające GMT powyżej 100000 podczas ostatnich 9 tygodni badania.
Grupa 3, czyli grupa kontrolna QS21/AN1792, osiągnęła pik mian w 17 tygodniu, o GMT 16000. Następnie miana obniżały się w ciągu następnych 8 tygodni, osiągając GMT wynoszącą 8700. U jednego zwierzęcia z tej grupy miano nie wzrosło podczas całego przebiegu doświadczenia.
Grupa 4, czyli grupa, dla której stosowano skrócony schemat iniekcji QS21/AN1792, osiągnęła pik mian o wysokości 7300 w 13 tygodniu, po pięciu tygodniach od ostatniej iniekcji. Następnie miana obniżały się, do GMT 2100 przy ostatnim pobieraniu krwi (25 tydzień). Tak jak w grupie kontrolnej, u jednego zwierzęcia nie wystąpiły wykrywalne miana, podczas gdy u innego zwierzęcia miano zanikło przy końcu okresu zanikania.
Grupa 5, czyli grupa samej PBS, nie wykazywała żadnych mian.
PL 200 458 B1
W celu oceny poziomów Ae w korze mózgowej, w oznaczeniu ELISA mierzono całkowity Ae oraz Ae1-42. Krótko, z jednej półkuli mózgowej wycięto tkanki kory, hipokampa i móżdżku, a następnie homogenizowano je w buforze z 5M guanidyną i oznaczano pod kątem mózgowych Ae. Wyniki dla całkowitego Ae i Ae42 w korze mózgowej były podobne. Przeprowadzono analizę statystyczną Manna-Whitney'a dla określenia istotności różnic pomiędzy grupami, z wartością p 0,05 wskazującą na znaczącą zmianę poziomów Ae.
We wszystkich grupach traktowania nastąpiło znaczące obniżenie poziomów całkowitego Ae w porównaniu z kontrolną grupą PBS (patrz tabela 11). Grupa MPL-SE/AN1792 wykazywała największe zmiany pod względem Ae i jest ona znacząco lepsza od innych grup traktowania. Grupa, dla której stosowano skrócony schemat immunizacji QS21/AN1792 była podobna pod względem całkowitej zmiany Ae do grupy kontrolnej QS21, która otrzymała wszystkich osiem iniekcji. Poziomy Ae w grupie ISA 51/AN1792 obniżały się podobnie, jak w grupie CFA/IFA:MAP(Ae1-7).
T a b e l a 11
Poziomy Ae w korze mózgowej
PBS MLP-SE ISA QS-21 QS-21 (4)
Mediana (ng/g tkanki) 7335 1236 3026 2389 2996
Zakres (ng/g tkanki) 550-18358 70-3977 23-9777 210-11167 24-16834
wartość p — < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001
N 38 29 36 34 40
Podsumowując, adiuwanty MPL-SE, ISA-51 i QS21, połączone z AN1792, są skuteczne pod względem indukowania dostatecznej odpowiedzi immunologicznej do znaczącego hamowania tworzenia złogów Ae w korze mózgowej.
X. Analiza toksyczności
Tkanki pobierano do badania histopatologicznego po zakończeniu badań opisanych w przykładach 2, 3 i 7. Ponadto, prowadzono badania hematologiczne i chemii klinicznej końcowych próbek krwi z przykładów 3 i 7. Oceniano większość głównych narządów, obejmujących mózg, płuca, układ limfatyczny, układ pokarmowy, wątrobę, nerki, nadnercza i gruczoły płciowe. Chociaż w badaniach zwierząt obserwowano sporadyczne uszkodzenia, brak było oczywistych różnic, zarówno pod względem dotkniętych tkanek, jak i ciężkości uszkodzeń, pomiędzy zwierzętami traktowanymi AN1792 i nietraktowanymi. Nie zaobserwowano unikalnych zmian histopatologicznych u zwierząt immunizowanych AN-1528 w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi PBS lub nietraktowanymi. Brak było również różnic w profilach uzyskanych w chemicznych badaniach klinicznych pomiędzy grupami otrzymującymi adiuwanty i zwierzętami traktowanymi PBS w przykładzie 7. Chociaż występowały znaczące wzrosty kilku parametrów hematologicznych u zwierząt traktowanych AN1792 i adiuwantem Freunda w przykładzie 7 w stosunku do zwierząt traktowanych PBS, efektów tego typu można oczekiwać w przypadku traktowania adiuwantem Freunda oraz towarzyszącego zapalenia otrzewnej i nie wskazują one na żadne niekorzystne wpływy traktowania AN1792. Chociaż nie stanowi to części oceny toksykologicznej, patologię mózgów myszy PDAPP szeroko badano traktując to jako ostateczny punkt badania skuteczności. W żadnym z tych badań nie stwierdzono żadnych oznak związanego z traktowaniem niekorzystnego wpływu na morfologię mózgu. Wyniki te wskazują, że traktowanie AN1792 jest dobrze tolerowane i co najmniej w znaczącym stopniu pozbawione wpływów ubocznych.
XI. Traktowanie terapeutyczne przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae
W przykładzie tym testuje się zdolność różnych monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw Ae do hamowania akumulacji Ae w mózgach heterozygotycznych myszy transgenicznych.
1. Projekt badań
Sześćdziesiąt samców i samic heterozygotycznych myszy transgenicznych PDAPP, w wieku od 8,5 do 10,5 miesięcy, otrzymano z Charles River Laboratory. Myszy podzielono na sześć grup przeznaczonych do traktowania różnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae. Zwierzęta podzielono w taki sposób, aby rozkład płci, wieku i pochodzenia i źródła zwierząt w poszczególnych grupach był na tyle podobny, na ile to możliwe. Jak przedstawiono w tabeli 10, przeciwciała obejmowały cztery
PL 200 458 B1 mysie przeciwciała monoklonalne specyficzne wobec Ae, 2H3 (skierowane przeciw resztom 1-12 Ae), 10D5 (skierowane przeciw resztom 1-16 Ae), 266 (skierowane przeciw resztom 13-28 Ae i wiążące się z monomerycznym, ale nie zagregowanym AN1792) i 21F12 (skierowane przeciw resztom 33-42 Ae). Piątą grupę traktowano frakcją poliklonalnego przeciwciała specyficznego wobec Ae (wywołanego przez immunizację zagregowanym AN1792). Grupa ujemnej kontroli otrzymywała sam rozcieńczalnik, PBS, bez przeciwciała.
Przeciwciała monoklonalne wstrzykiwano w dawce około 10 mg/kg (zakładając, że myszy ważyły 50 g). Iniekcje podawano dootrzewnowe przeciętnie co siedem dni dla utrzymywania mian przeciwciał skierowanych przeciw Ae wyższych od 1000. Chociaż dla przeciwciała monoklonalnego 266 mierzono niższe miana, ponieważ nie wiąże się ono dobrze ze zagregowanym AN1792 stosowanym jako antygen wychwytujący w oznaczeniu, w grupie tej utrzymano ten sam schemat dawkowania. Badania z grupą otrzymującą przeciwciało monoklonalne 2H3 przerwano w ciągu pierwszych trzech tygodni, ponieważ przeciwciało było usuwane zbyt szybko in vivo. Od zwierząt pobierano krew przed każdą dawką w celu pomiaru mian przeciwciał. Traktowanie kontynuowano w ciągu okresu sześciu miesięcy, w sumie w ciągu 196 dni. Zwierzęta uśmiercano jeden tydzień po ostatniej dawce.
T a b e l a 12 Plan doświadczenia
Grupa traktowania Na Stosowane przeciwciało Specyficzność przeciwciała Izotyp przeciwciała
1 9 brak (tylko PBS) NAb NA
2 10 poliklonalne Ae1-42 mieszany
3 0 mAbc2H3 Ae1-12 IgG1
4 8 mAb10D5 Ae1-16 IgG1
5 6 mAb 266 Ae13-28 IgG1
6 8 mAb21F12 Ae33-42 IgG2a
Przypisy:
a Liczba myszy w grupie pod koniec doświadczenia. Na początku wszystkie grupy obejmował y 10 zwierząt b NA: nie dotyczy c mAb: przeciwciało monoklonalne
2. Materiały i metody a. Przygotowywanie przeciwciał
Skierowane przeciw Ae przeciwciało poliklonalne przygotowano z krwi zebranej od dwóch grup zwierząt. Pierwsza grupa składała się ze 100 samic myszy Swiss Webster w wieku od 6 do 8 tygodni. Immunizowano je w dniach 0, 15 i 29 100 μg AN1792 połączonego z CFA/IFA. Czwartą iniekcję, z połową dawki AN1792, podawano w dniu 36. Zwierzęta wykrwawiano po uśmierceniu w dniu 42, przygotowano surowicę i surowice połączono, otrzymując łącznie 64 ml. Druga grupa składała się z 24 samic myszy izogenicznych z myszami PDAPP, ale nie transgenicznych pod względem genu ludzkiej APP, w wieku od 6 do 9 tygodni. W dniach 0, 14, 28 i 56 immunizowano je 100 μg AN1792 połączonego w CFA/IFA. Zwierzęta te również skrwawiano po zabiciu w dniu 63, przygotowano surowice i połączono je, otrzymując łącznie 14 ml. Dwa zestawy surowic połączono. Oczyszczono frakcję przeciwciał stosując dwie kolejne tury wytrącania siarczanem amonu o 50% nasycenia. Ostateczny osad dializowano wobec PBS i testowano pod względem endotoksyny. Poziom endotoksyny był niższy od 1 EU/mg.
Skierowane przeciw Ae przeciwciała monoklonalne przygotowywano z płynu wysiękowego. Płyn najpierw odtłuszczano przez dodawanie, podczas mieszania w lodzie, stężonego siarczanu sodowo-dekstranowego do ochładzanych lodem płynów wysiękowych do osiągnięcia 0,238% stężenia końcowego. Następnie w trakcie mieszania dodawano stężony CaCl2 do osiągnięcia 64 mM stężenia końcowego. Roztwór ten wirowano przy 10000 x g i odrzucano osad. Supernatant mieszano na lodzie z równą objętością wkraplanego nasyconego siarczanu amonu. Roztwór ponownie wirowano przy 10000 x g i odrzucano supernatant. Osad ponownie zawieszano i dializowano wobec 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Frakcję tę naniesiono na kolumnę Sepharose Q w układzie FPLC Pharmacia i eluowano odwróconym gradientem od 0,4M do 0,275M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.
PL 200 458 B1
Pik przeciwciała identyfikowano dzięki absorbancji przy długości fali 280 nm i odpowiednie frakcje połączono. Preparat oczyszczonych przeciwciał charakteryzowano przez pomiar stężenia białka z zastosowaniem metody BCA i czystości z zastosowaniem SDS-PAGE. Połączone frakcje testowano również pod względem endotoksyny. Poziom endotoksyny był niższy od 1 EU/mg. Przy oznaczaniu mian tym niższym od 100 arbitralnie dawano wartość 25.
3. Poziomy Ae i APP w mózgu
Po traktowaniu w ciągu sześciu miesięcy różnymi preparatami przeciwciał skierowanych przeciw Ae, zwierzętom usuwano mózgi po perfuzji solą fizjologiczną. Jedną półkulę przygotowywano do analizy immunohistochemicznej, a drugą stosowano do oceny poziomów Ae i APP. W celu pomiaru stężeń różnych postaci peptydu beta-amyloidu i białka prekursorowego amyloidu (APP), z półkuli wycinano i przygotowywano homogenaty regionów hipokampa, kory mózgowej i móżdżku w 5M guanidynie. Rozcieńczano je kolejno i poziom peptydu amyloidu lub APP oceniano przez porównanie metodą ELISA z szeregiem rozcieńczeń standardów peptydu Ae lub APP o znanych stężeniach.
Zmierzone metodą ELISA poziomy całkowitego Ae i Ae1-42 w homogenatach kory mózgowej i hipokampa oraz poziomy całkowitego Ae w móżdżku przedstawiono odpowiednio w tabelach 11, 12 i 13. Mediana stężenia całkowitego Ae dla grupy kontrolnej, którą inokulowano PBS, była 3,6-krotnie wyższa w hipokampie niż w korze mózgowej (mediana 63389 ng/g tkanki hipokampa w porównaniu z 17818 ng/g dla kory mózgowej. Mediana poziomu w móżdżku grupy kontrolnej (30,6 ng/g tkanki) była ponad 2000 razy niższa niż dla hipokampa. Poziomy te są podobne do tych podawanych uprzednio dla heterozygotycznych myszy transgenicznych PDAPP w tym wieku (Johnson-Wood i in., 1997).
Jak przedstawiono w tabeli 13, w przypadku kory mózgowej jedna z grup traktowania posiadała medianę poziomu Ae, mierzonego jako Ae1-42, która różniła się znacząco od tej dla grupy kontrolnej (p < 0,05); zwierzęta te otrzymywały poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw Ae. Mediana poziomów Ae1-42 była obniżona o 65% w porównaniu z kontrolą dla tej grupy traktowania. Mediana poziomów Ae1-42 była również znacząco obniżona, o 55%, w porównaniu z kontrolą w jednej dodatkowej grupie traktowania; zwierzęta te otrzymywały dawki przeciwciała monoklonalnego 10D5 (p = 0,0433).
T a b e l a 13 Kora mózgowa
Grupa traktowania Na Mediany Średnie
Całk. Ae Ae42 Całk. Ae Ae42
Wartość ELISAb Wartość Pc % zmian Wartość ELISA Wartość P % zmian Wartość ELISA Wartość ELISA
PBS 9 17818 NAd NA 13802 NA NA 16150 ± 7456e 12621 ± 5738
Przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw Ae42 10 6160 0,0055 -65 4892 0,0071 -65 5912 ± 4492 4454 ± 3347
mAb10D5 8 7915 0,1019 -56 6214 0,0433 -55 9695 ± 6929 6943 ± 3351
mAb 266 6 9144 0,1255 -49 8481 0,1255 -39 9204 ± 9293 7489 ± 6921
mAb 21F12 8 15158 0,2898 -15 13578 0,7003 -2 12481 ± 7082 11005 ± 6324
Przypisy:
a liczba zwierzą t w grupie pod koniec doś wiadczenia b ng/g tkanki c analiza Manna Whitney'a d NA: nie dotyczy e odchylenie standardowe
PL 200 458 B1
W hipokampie związane z traktowaniem poliklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae procentowe obniżenie mediany całkowitego Ae (50%, p = 0,0055) nie było tak wysokie, jak to obserwowane w przypadku kory mózgowej (65%) (tabela 14). Jednakże, bezwzględna wielkość obniżenia była prawie 3-krotnie wyższa w hipokampie niż w korze - obniżenie netto w hipokampie wynosi 31683 ng/g tkanki w stosunku do 11658 ng/g tkanki w korze. Przy mierzeniu poziomu bardziej amyloidogennej postaci Ae, Ae1-42, a nie całkowitego Ae, obniżenie uzyskane z zastosowaniem przeciwciała poliklonalnego było istotne (p = 0,0025). Mediana poziomów w grupach traktowanych przeciwciałami monoklonalnymi 10D5 i 266 obniżone były odpowiednio o 33% i 21%.
T a b e l a 14 Hipokamp
Grupa traktowania Na Mediany Średnie
Całk. Ae Ae42 Całk. Ae Ae42
Wartość ELISAb Wartość Pc % zmian Wartość ELISA Wartość P % zmian Wartość ELISA Wartość ELISA
PBS 9 63389 NAd NA 54429 NA NA 58351 ± 13308e 52801 ±14701
Przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw Ae42 10 31706 0,0055 -50 27127 0,0025 -50 30058 ± 22454 24853 ±18262
mAb10D5 8 46779 0,0675 -26 36290 0,0543 -33 44581 ±18632 36465 ±17146
mAb 266 6 48689 0,0990 -23 43034 0,0990 -21 36419 ± 27304 32919 ± 25372
mAb 21F12 8 51563 0,7728 -19 47961 0,8099 -12 57327 ± 28927 50305 ± 23927
Przypisy:
a liczba zwierzą t w grupie pod koniec doś wiadczenia b ng/g tkanki c analiza Manna Whitney'a d NA: nie dotyczy e odchylenie standardowe
Całkowity Ae mierzono również w móżdżku (tabela 15). Te grupy, które otrzymywały dawki skierowanego przeciw Ae przeciwciała poliklonalnego oraz przeciwciała 266 wykazywały znaczące obniżenia poziomów całkowitego Ae (odpowiednio 43% i 46%, p = 0,0033 i 0,0184), a grupa traktowana 10D5 wykazywała obniżenie prawie znaczące (29%, p = 0,0675).
T a b e l a 15 Móżdżek
Grupa traktowania Na Mediany Średnie
Całkowity Ae Całkowity Ae
Wartość ELISAb Wartość Pc % zmian Wartość ELISA
PBS 9 30,64 NAd NA 40,00 ± 31,89e
Przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw Ae42 10 17,61 0,0033 -43 18,15 ± 4,36
mAb10D5 8 21,68 0,0675 -29 27,29 ± 19,43
mAb 266 6 16,59 0,0184 -46 19,59 ± 6,59
mAb21F12 8 29,80 > 0,9999 -3 32,88 ± 9,90
Przypisy:
a liczba zwierzą t w grupie pod koniec doś wiadczenia b ng/g tkanki c analiza Manna Whitney'a d NA: nie dotyczy e odchylenie standardowe
PL 200 458 B1
Metodą ELISA określano również stężenie APP w korze mózgowej i móżdżku myszy traktowanych przeciwciałami i kontrolnych, traktowanych PBS. Wykorzystywano dwa różne oznaczenia APP. Pierwsze, oznaczone APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (α, wydzielana postać APP, która powstaje w wyniku rozszczepiania w sekwencji Ae), jak i postacie APP o pełnej długości (FL), podczas gdy drugie rozpoznaje wyłącznie APP-α. W przeciwieństwie od obserwowanego związanego z traktowaniem zmniejszania Ae w części grup doświadczalnych, poziomy APP pozostawały właściwie niezmienione u wszystkich zwierząt traktowanych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że immunizacje przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae zmniejsza ilość Ae, bez zmniejszania ilości APP.
Podsumowując, poziomy Ae były znacząco obniżone w korze mózgowej, hipokampie i móżdżku zwierząt traktowanych przeciwciałem poliklonalnym wywołanym wobec AN1792. W mniejszym stopniu znaczące efekty traktowania widoczne były również w przypadku przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw aminokońcowemu regionowi Ae1-42, szczególnie aminokwasom 1-16 i 13-28.
4. Analizy histologiczne
Morfologia płytek reaktywnych immunologicznie wobec Ae w części mózgów myszy z grup traktowanych PBS, poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae42, 21F12, 266 oraz 10D5 porównywano ilościowo z tymi z uprzednich badań, w których przeprowadzano standardowe procedury immunizacji Ae42.
Największa zmiana zarówno pod względem wielkości, jak i wyglądu płytek amyloidowych występowała u zwierząt immunizowanych poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae42. Obniżenie obciążenia amyloidem, uszkodzenia morfologii płytek i związana z komórkami reaktywność immunologiczna wobec Ae bardzo przypominały wpływy wywoływane przez standardową procedurę immunizacji. Obserwacje te potwierdzają wyniki otrzymane metodą ELISA, w których uzyskano znaczące obniżenia poziomów zarówno całkowitego Ae, jak i Ae42 dzięki podawaniu poliklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw Ae42.
W podobnych ilościowych ocenach, płytki amyloidu w grupie 10D5 również wykazywały obniżenie pod względem ilości i wygląd z określonymi oznakami związanej z komórkami reaktywności immunologicznej wobec Ae. W stosunku do zwierząt traktowanych kontrolą, poliklonalna frakcja Ig skierowanych przeciw Ae oraz jedno z przeciwciał monoklonalnych (10D5) obniżały obciążenie płytkami o odpowiednio 93% i 81% (p < 0,005). 21F12 okazało się wywierać stosunkowo skromny wpływ na obciążenie płytkami. Mikrografy mózgu po traktowaniu poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae1-42 przedstawiają rozproszone złogi i nieobecność wielu z większych zbitych płytek w grupie traktowanej poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae1-42 w stosunku do zwierząt traktowanych kontrolą.
5. Pomiar mian przeciwciał
Od trzech losowo wybranych myszy z każdej grupy pobierano krew bezpośrednio przed każdą iniekcją dootrzewnową, łącznie 30 pobrań krwi. Miana przeciwciał mierzono jako miana przeciwciał wiążących Ae1-42 stosując ELISA typu podwójnego wiązania w plastikowych wielostudzienkowych płytkach opłaszczanych Ae1-42, jak szczegółowo opisano w „Ogólnych Materiałach i Metodach”. Średnie miana dla każdego pobrania krwi w przypadku przeciwciała poliklonalnego, dla przeciwciał monoklonalnych 10D5 i 21F12 przedstawiono odpowiednio na figurach 16-18. W ciągu tego okresu średnie miana wynosiły około 1000 dla preparatu przeciwciała poliklonalnego, a u zwierząt traktowanych 10D5 i 21F12 były nieznacznie wyższe od tego poziomu.
6. Odpowiedź proliferacji limfocytów
Zależną od Ae proliferację limfocytów mierzono stosując komórki śledziony zebrane około ośmiu dni po ostatniej infuzji przeciwciał. Świeżo zebrane komórki, 105 na studzienkę, hodowano w ciągu 5 dni w obecności Ae1-40 o stężeniu 5 μM dla uzyskania stymulacji. Jako kontrolę dodatnią, dodatkowe komórki hodowano z mitogenem komórek T, PHA, a jako kontrolę ujemną komórki hodowano bez dodawanego peptydu.
Limfocyty śledzionowe ze starych myszy PDAPP biernie immunizowanych różnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae stymulowano in vitro AN1792 i mierzono odpowiedzi proliferacji i cytokin. Celem tych oznaczeń było określenie, czy bierna immunizacja ułatwiała prezentację antygenu, a zatem wyzwalanie specyficznej wobec AN1792 odpowiedzi komórek T. U myszy biernie immunizowanych przeciwciałami skierowanymi przeciw Ae nie obserwowano żadnych specyficznych wobec AN1792 odpowiedzi proliferacyjnej lub cytokin.
PL 200 458 B1
XII. Dalsze badania immunizacji biernej
W drugich badaniach powtórzono traktowanie 10D5 i testowano dwa dodatkowe przeciwciała skierowane przeciw Ae, przeciwciała monoklonalne 3D6 (Ae1-5) i 16C11 (Ae33-42). Grupy kontrolne otrzymywały albo PBS, albo niewłaściwe przeciwciało o takim samym izotypie (TM2a). Myszy były starsze (heterozygoty w wieku 11,5-12 miesięcy) niż w poprzednich badaniach, pod innymi względami projekt badań był taki sam. Ponownie, po sześciu miesiącach traktowania, 10D5 obniżało obciążenie płytkami o więcej niż 80% w stosunku do kontroli albo PBS, albo przeciwciała o takim samym izotypie (p = 0,003). Jedno z innych przeciwciał skierowanych przeciw Ae, 3D6, było równie skuteczne, powodując 86% obniżenie (p = 0,003). W przeciwieństwie do tego, trzecie przeciwciało skierowane przeciw peptydowi 16C11 nie wywierało żadnego wpływu na obciążenie płytkami. Podobne wyniki otrzymano w pomiarach Ae42 metodą ELISA. Wyniki te wykazują, że odpowiedź przeciw peptydowi Ae, przy braku odporności z udziałem komórek T, jest wystarczająca do zmniejszania odkładania amyloidu u myszy PDAPP, ale nie wszystkie przeciwciała skierowane przeciw Ae są skuteczne. Przeciwciała skierowane przeciw epitopom obejmującym aminokwasy 1-5 lub 3-7 Ae są szczególnie skuteczne.
Podsumowując, wykazano, że bierna immunizacja przez podawanie przeciwciał skierowanych przeciw Ae obniżała stopień odkładania płytek w mysim modelu choroby Alzheimera. Jeśli przeciwciała utrzymywano w niewielkich stężeniach w surowicy (25-70 pg/ml), to miały one dostęp do ośrodkowego układu nerwowego na poziomach dostatecznych do wiązania z płytkami e-amyloidu. Wnikanie przeciwciał do ośrodkowego układu nerwowego nie było powodowane przez nieprawidłowe przenikanie przez barierę krew-mózg, ponieważ nie występowało zwiększanie przepuszczalności naczyń, jak mierzono stosując błękit Evansa u myszy PDAPP. Ponadto, stężenie przeciwciała w miąższu mózgu starych myszy PDAPP było takie samo, jak u myszy nie transgenicznych, stanowiąc 0,1% stężenia przeciwciała w surowicy (bez względu na izotyp).
XIII. Monitorowanie wiązania przeciwciał
W celu określenia, czy przeciwciała skierowane przeciw Ae mogą bezpośrednio działać w ośrodkowym układzie nerwowym, mózgi pobierane od myszy perfundowanych solą fizjologiczną po zakończeniu przykładu XII, sprawdzano pod względem obecności przeciwciał podawanych obwodowo. Nieutrwalane, cięte w kriostacie skrawki mózgów eksponowano na fluorescencyjny odczynnik przeciw immunoglobulinom myszy (kozie przeciwciała skierowane przeciw mysim IgG-Cy3). Płytki w mózgu grup 10D5 i 3D6 posiadały wiele związanych przeciwciał, podczas gdy w grupie 16C11 nie było żadnego wybarwiania. W celu ujawnienia pełnego stopnia odkładania płytek, kolejne skrawki z każdego mózgu najpierw poddawano reakcji immunologicznej z przeciwciałem skierowanym przeciw Ae, a następnie z rozpoznającym je odczynnikiem. 10D5 i 3D6, po podawaniu obwodowym, uzyskiwały dostęp do większości płytek w ośrodkowym układzie nerwowym. W tych grupach traktowania obciążenie płytkami było znacząco obniżone w porównaniu z grupą 16C11. Dane te wskazują, że obwodowo podawane przeciwciała mogą wnikać do ośrodkowego układu nerwowego, gdzie mogą bezpośrednio wyzwalać usuwanie amyloidu. Prawdopodobne jest, że 16C11 również miało dostęp do płytek, ale było niezdolne do wiązania się z nimi.
XIV. Oznaczenie przeszukiwania ex vivo pod kątem aktywności przeciwciał skierowanych przeciw złogom amyloidu
Dla sprawdzania wpływu usuwania płytek przeciwciał, opracowano oznaczenie ex vivo, w którym prowadzono pierwotne hodowle komórek mikrogleju z nieutrwalanymi, otrzymywanymi przez cięcie w kriostacie skrawkami mózgów albo myszy PDAPP albo ludzi z AD. Komórki mikrogleju otrzymywano z kory mózgowej noworodków myszy DBA/2N (1-3 dni). Kory mechanicznie dysocjowano w HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa, Sigma) z 50 μg/ml DNAzy I (Sigma). Zdysocjowane komórki sączono przez sączek komórkowy o wielkości porów 100 pm (Falkon) i wirowano przy 1000 obrotach na minutę w ciągu 5 minut. Osad ponownie zawieszano w podłożu wzrostowym (DMEM z wysokim stężeniem glukozy, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) i komórki nanoszono na płytki z gęstością 2 mózgów na plastikową kolbę hodowlaną T-75. Po 7-9 dniach kolby wytrząsano na wytrząsarce obrotowej przy 200 obrotach na minutę w ciągu dwóch godzin w temperaturze 37°C. Zawiesinę komórek wirowano przy 1000 obrotach na minutę i ponownie zawieszano w podłożu do oznaczania.
Cięte w kriostacie skrawki mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD o grubości 10 pm (otrzymywanych w ciągu < 3 godzin po śmierci) osadzano przez rozmrażanie na opłaszczanych polilizyną okrągłych szkiełkach nakrywkowych i umieszczano w studzienkach 24-studzienkowych płytek do hodowli tkankowych. Szkiełka nakrywkowe dwukrotnie przemywano buforem do oznaczania, składającym się z H-SFM (wolne od surowicy podłoże do hybrydom, Gibco BRL) z 1% FBS, glutaminą, penicyPL 200 458 B1 liną/streptomycyną i 5 ng/ml rmGM-CSF (R & D). Przeciwciała kontrolne lub skierowane przeciw Ae dodawano w podwójnym stężeniu (stężenie końcowe 5 pg/ml) w ciągu 1 godziny. Następnie komórki mikrogleju wysiewano z gęstością 0,8 x 106 komórek/ml podłoża do oznaczania. Hodowle utrzymywano w inkubatorze z nawilżaniem (37°C, 5% CO2) w ciągu 24 godzin lub więcej. Po zakończeniu inkubacji hodowle utrwalano 4% paraformaldehydem i permeabilizowano stosując 0,1% Triton-X100. Skrawki wybarwiano biotynylowanym 3D6, a następnie koniugatem streptawidyna/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Egzogenne komórki mikrogleju uwidaczniano przez wybarwianie z użyciem barwnika jądrowego (DAPI). Hodowle obserwowano pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon, TE300) i fotomikrografy wykonywano kamerą cyfrową SPOT, wykorzystując oprogramowanie SPOT (Diagnostic Instruments). Do analizy hybrydyzacji typu Western, hodowle ekstrahowano 8M mocznikiem, rozcieńczano w stosunku 1:1 redukującym buforem tricynowym do próbek i nakładano na 16% żel tricynowy (Novex). Po przeniesieniu na immobilon, bloty eksponowano na poliklonalne przeciwciało skierowane przeciw Ae o stężeniu 5 pm/ml, a następnie skoniugowane z HRP przeciwciało skierowane przeciw immunoglobulinom myszy i wywoływano odczynnikiem ECL (Amersham).
Gdy oznaczenie prowadzono ze skrawkami mózgowymi myszy PDAPP w obecności 16C11 (jedno z przeciwciał skierowanych przeciw Ae, które nie były skuteczne in vivo), płytki e-amyloidu pozostawały nietknięte i nie obserwowano fagocytozy. W przeciwieństwie do tego, gdy sąsiednie skrawki hodowano w obecności 10D5, złogi amyloidu w znacznym stopniu zanikły, a komórki mikrogleju wykazywały liczne, zawierające Ae, pęcherzyki fagocytarne. Identyczne wyniki otrzymano dla skrawków osób z AD; 10D5 indukowało fagocytozę płytek AD, podczas gdy 16C11 było nieskuteczne. Ponadto, oznaczenie dostarczało porównywalne wyniki, gdy prowadzono je z mysimi i ludzkimi komórkami mikrogleju, oraz ze skierowanymi przeciw Ae przeciwciałami myszy, królików i naczelnych.
Tabela 16 przedstawia, czy otrzymano wiązanie i/lub fagocytozę dla kilku różnych specyficzności wiązania przeciwciał. Można stwierdzić, że przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie reszt 1-7 zarówno wiążą, jak i usuwają złogi amyloidu, podczas gdy przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie aminokwasów 4-10 wiążą się bez usuwania złogów amyloidu. Przeciwciała wiążące się z epitopami po C-końcowej stronie reszty 10 ani nie wiążą się, ani nie usuwają złogów amyloidu.
T a b e l a 16
Analiza specyficzności epitopowej
Przeciwciało Wybarwianie Fagocytoza
Epitop Izotyp
1 2 3 4 5
Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw końcowi N
3D6 1-5 IgG2b + +
10D5 3-6 IgG1 + +
22C8 3-7 IgG2a + +
6E10 5-10 IgG1 + -
14A8 4-10 IgG1 szczura + -
resztom 13-28
18G11 10-18 IgG1 szczura - -
266 16-24 IgG1 - -
22D12 18-21 IgG2b - -
Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw końcowi C
2G3 -40 IgG1 - -
16C11 -40/-42 IgG1 - -
21F12 -42 IgG2a - -
PL 200 458 B1 cd tabeli 16
1 2 3 4 5
Surowice odpornościowe
królicza (CFA) 1-6 + +
mysia (CFA) 3-7 + +
mysia (QS-21) 3-7 + +
małpia (QS-21) 1-5 + -
mysia (MAP 1-7) + -
Tabela 17 przedstawia wyniki otrzymane dla kilku przeciwciał skierowanych przeciw Ae, porównując ich zdolności do indukowania fagocytozy w oznaczeniu ex vivo oraz do obniżania obciążenia płytkami in vivo w badaniach biernego przenoszenia. Chociaż 16C11 i 21F12 wiązały się ze zagregowanym syntetycznym peptydem Ae z wysoką zachłannością, przeciwciała te były niezdolne do reagowania z płytkami e-amyloidu w nie utrwalanych skrawkach mózgów, nie mogły wyzwalać fagocytozy w oznaczeniu ex vivo oraz nie były skuteczne in vivo. 10D5, 3D6 oraz skierowane przeciw Ae przeciwciało poliklonalne były aktywne we wszystkich trzech pomiarach. Przeciwciało 22C8 silniej wiąże się z postacią analogu naturalnego Ae, w której kwas asparaginowy w pozycjach 1 i 7 zastąpiono kwasem izoasparaginowym. Wyniki te wykazują, że skuteczność in vivo spowodowana jest bezpośrednim usuwaniem płytek w ośrodkowym układzie nerwowym z udziałem przeciwciał, oraz że oznaczenie ex vivo ma wartość prognostyczną dla skuteczności in vivo.
To samo oznaczenie stosowano do testowania usuwania przez przeciwciało skierowane przeciw fragmentowi synukleiny, określanemu jako NAC. Wykazano, że synukleina jest białkiem towarzyszącym płytkom amyloidu. Przeciwciało skierowane przeciw NAC kontaktowano z zawierającą płytki amyloidu próbką tkanki mózgu i komórkami mikrogleju, jak uprzednio. Jako kontrolę stosowano surowicę króliczą. Przeprowadzone następnie monitorowanie wykazało znaczące obniżenie liczby i wielkości płytek, wskazując, że przeciwciało wykazuje aktywność usuwania.
T a b e l a 17
Oznaczenie ex vivo jako prognostyk skuteczności In vivo
Przeciwciało monoklonalne Izotyp Zachłanność wobec zagregowanego Ae (pM) Wiązanie z płytkami e-amyloidu Skuteczność ex vivo Skuteczność in vivo
3D6 IgG2b 470 + + +
10D5 IgG1 43 + + +
16C11 IgG1 90 - - -
21F12 IgG2a 500 - - -
TM2a IgG1 - - - -
poliklonalne 1-42 mieszany 600 + + +
Dla potwierdzenia, że Ae ulegał internalizacji podczas przebiegu oznaczenia ex vivo, stosowano mikroskopię konfokalną. W obecności przeciwciał kontrolnych, egzogenne komórki mikrogleju pozostawały w płaszczyźnie konfokalnej nad tkanką, nie występowały pęcherzyki fagocytarne zawierające Ae, a płytki pozostawały nietknięte w skrawkach. W obecności 10D5, prawie cały materiał płytek zawarty był w pęcherzykach wewnątrz egzogennych komórek mikrogleju. W celu określenia losów internalizowanego peptydu, hodowle traktowane 10D5 ekstrahowano 8M mocznikiem i sprawdzano przez analizę poprzez hybrydyzację typu Western. W punkcie czasowym jednej godziny, gdy nie występowała jeszcze fagocytoza, reakcja z poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw Ae ujawniła silny prążek o masie cząsteczkowej 4 kD (odpowiadający peptydowi Ae). Reaktywność immunologiczna wobec Ae obniżała się w dniu 1 i była nieobecna w dniu 3. A zatem, zachodząca za pośrednictwem przeciwciała fagocytoza Ae prowadzi do jego degradacji.
PL 200 458 B1
W celu określenia, czy fagocytoza w oznaczeniu ex vivo zachodziła za pośrednictwem Fc, przygotowano fragmenty F(ab')2 skierowanego przeciw Ae przeciwciała 3D6. Chociaż fragmenty F(ab')2 zachowują pełną zdolność do reagowania z płytkami, były niezdolne do wyzwalania fagocytozy przez komórki mikrogleju. Ponadto, fagocytozę z zastosowaniem całego przeciwciała można było zablokować odczynnikiem skierowanym przeciw mysim receptorom Fc (anty-CD16/32). Dane te wskazują, że usuwanie in vivo Ae zachodzi poprzez fagocytozę zależną od receptora Fc.
XV. Przenikanie przeciwciał przez barierę krew-mózg
W przykładzie tym określano stężenie przeciwciała dostarczonego do mózgu po dożylnej iniekcji do tkanek obwodowych albo myszy normalnych, albo PDAPP. Myszy PDAPP albo kontrolne myszy normalne perfundowano 0,9% NaCl. Wycinano regiony mózgu (hipokamp lub korę) i szybko je zamrażano. Mózgi homogenizowano w 0,1% Triton + inhibitory proteaz. Immunoglobuliny w ekstraktach wykrywano stosując oznaczenie ELISA. Płytki do RIA opłaszczano, jako czynnikiem wychwytującym, kozim fragmentem Fab'2 skierowanym przeciw IgG myszy. Surowicę lub ekstrakty mózgowe inkubowano w ciągu 1 godziny. Izotypy wykrywano stosując koniugaty przeciwciało skierowane przeciw IgG1 myszy-HRP, przeciwciało skierowane przeciw IgG2a myszy-HRP lub przeciwciało skierowane przeciw IgG2b myszy-HRP (Caltag). Przeciwciała, bez względu na izotyp, obecne były w ośrodkowym układzie nerwowym w stężeniu wynoszącym 1:1000 tego występującego we krwi. Przykładowo, jeśli stężenie IgG1 było we krwi trzykrotnie wyższe od IgG2a, było ono również trzykrotnie wyższe w mózgu; a oba występowały w ilości 0,1% w stosunku do odpowiednich poziomów we krwi. Wynik ten obserwowano zarówno u myszy transgenicznych, jak i nietransgenicznych - a zatem u myszy PDAPP nie występowało wyjątkowe przenikanie bariery krew-mózg.
XVI. Skuteczność terapeutyczna peptydu Ae w konfiguracji MAP
Badania skuteczności terapeutycznej adjuwanta/immunogenu prowadzono na samcach i samicach heterozygotycznych myszy transgenicznych PDAPP w wieku 9-10,5 miesięcy w celu testowania skuteczności białka fuzyjnego obejmującego Ae1-7 w tetramerycznej konfiguracji MAP, jak opisano powyżej. Czas trwania badań wynosił 25 tygodni, a liczebność grup traktowania 29-40 zwierząt; dlatego też, w chwili zakończenia badań zwierzęta były w wieku 15-16,5 miesięcy. Metodyka stosowana w tych badaniach jest taka sama, jak dla badań skuteczności terapeutycznej różnych adiuwantów w przykładzie VIII powyżej. Grupy traktowania określono w tabeli 18 poniżej.
T a b e l a 18
Adiuwant Immunogen Bufor rozcieńczający Podawanie
Grupa 1: CFA/IFA MAP(Ae1-7:TT) (100 pg) PBS IP (400 pl)
Grupa 2: QS21 AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)
Grupa 3: PBS - - SC (250 pl)
Skróty w tabeli: MAP - peptyd wieloantygenowy; TT - epitop toksoidu tężcowego rozpoznawany przez komórki T (830-844); SC - podskórnie; IP - dootrzewnowo; PBS - sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami; GCS jest preparatem glicyna/cytrynian/sacharoza.
Schemat immunizacji był identyczny dla wszystkich grup traktowania. Myszy otrzymywały iniekcje w tygodniach 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 i 24, a krew pobierano w tygodniach 3, 5, 9, 13, 17, 21 i 25. Grupy 1, 2, 3, 4 i 6 otrzymywały osiem iniekcji, grupa 2 i 3, odpowiednio QS21/AN1792 i PBS, służyły w tych badaniach jako kontrole dodatnia i ujemna.
Miana określano stosując oznaczenie przeciwciał skierowanych przeciw Ae.
Grupa 1, czyli grupa CFA/IFA:MAP(Ae1-7:TT), posiadała niskie poziomy mian. Szczytowe GMT osiągnęło tylko 1200 w 13 tygodniu, obniżając się do GMT 600 w tygodniu 25. U 3 myszy z 30 nie powstały żadne miana, a u 7 dalszych myszy miana nie przekroczyły 400 na końcu badań.
Grupa 2, czyli grupa kontrolna QS21/AN1792, osiągnęła szczytową wartość mian w 17 tygodniu, przy GMT 16000. Następnie miana obniżały się w ciągu następnych 8 tygodni, na końcu osiągając GMT 8700. U jednego zwierzęcia z tej grupy nie stwierdzono miana w ciągu całego przebiegu doświadczenia.
Grupa 3, czyli grupa samej PBS, nie posiadała żadnych mian.
Obie grupy traktowania wykazywały znaczące obniżenie korowych poziomów Ae w porównaniu z grupą kontrolną PBS (patrz tabela 19). W grupie CFA/IFA:MAP(Ae1-7) znacząco obniżył się
PL 200 458 B1 poziom Ae w porównaniu z grupą kontrolną, pomimo stosunkowo niskich mian przeciwciał skierowanych przeciw Ae.
T a b e l a 19
Poziomy Ae w korze mózgowej
PBS MAP QS-21
Mediana (ng/g tkanki) 7335 3692 2389
Zakres (ng/g tkanki) 550-18358 240-10782 210-11167
Wartość p — 0,0003 < 0,0001
N 38 30 34
Podsumowując, immunogen Ae1-7MAP jest skuteczny pod względem indukowania wystarczającej odpowiedzi odpornościowej do znaczącego hamowania odkładania Ae w korze mózgowej.
XVII. Mapowanie epitopowe immunogennej odpowiedzi przeciw Ae u małp W przykładzie tym analizowano odpowiedź u naczelnych na immunizację AN1792 (tj. Ae1-42).
Jedenaście grup małp (4/płeć/grupę) immunizowano AN1792 (75 lub 300 pg/dawkę) w połączeniu z adiuwantem QS-21 (50 lub 100 pg/dawkę) lub 5% jałową dekstrozą w wodzie (D5W, grupa kontrolna). Wszystkie zwierzęta otrzymywały iniekcje domięśniowe zgodnie z jednym z trzech schematów iniekcji, jak przedstawiono w tabeli 20, obejmujących w całości 4, 5 lub 8 dawek. Próbki surowic (od 4 małp/płeć/grupę), pobrane w 175 dniu badań oraz próbki płynu mózgowo-rdzeniowego (od 3 małp/płeć/grupę) pobrane w 176 dniu badań) oceniano pod względem zdolności do wiązania z peptydem Ae1-40 i APP.
T a b e l a 20
Podział grup i poziomy dawek
Numer grupy Schemat3 Liczba małp (samce/samice) Dawka AN 1792 (pg/dawkę) Dawka QS-21 (pg/dawkę) Droga podawania
1b 1 4/4 0 0 domięśniowa
2 1 4/4 zaróbkac 50 domięśniowa
3 1 4/4 zaróbka 100 domięśniowa
4 1 4/4 75 50 domięśniowa
5 1 4/4 300 50 domięśniowa
6 1 4/4 75 100 domięśniowa
7 1 4/4 300 100 domięśniowa
8 2 4/4 75 100 domięśniowa
9 2 4/4 300 100 domięśniowa
10 3 4/4 75 100 domięśniowa
11 3 4/4 300 100 domięśniowa
a b
c
Schemat 1, dni podawania dawek 1, 15, 29, 57, 85, 113, 141, 169; schemat 2, dni podawania dawek 1, 29, 57, 113, 169; schemat 3, dni podawania dawek 1, 43, 85, 169 Grupa kontrolna, iniekcja D5W
Zaróbka składa się z buforu glicyna/cytrynian/sacharoza, który jest zaróbką dla AN1792
Dokładny układ liniowych peptydów rozpoznawanych przez przeciwciała w próbkach surowic zwierząt immunizowanych AN1792 określano w oznaczeniu ELISA, w którym mierzono wiązanie tych przeciwciał z zachodzącymi na siebie peptydami, które pokrywały całą sekwencję Ae1-42. Biotynylowane peptydy o częściowych sekwencjach AN1792 otrzymano z Chiron Technologies jako 10-aminokwasowe peptydy o 9 aminokwasach zachodzących i kroku jednej reszty na peptyd (synteza nr 5366, nr 5331 i nr 5814). Pierwsze 32 peptydy (od pozycji ośmiu aminokwasów przed końcem N AN1792 do dwudziestego czwartego aminokwasu AN1792) biotynylowane były na końcu C z łącznikiem GGK.
PL 200 458 B1
Ostatnich 10 peptydów (z powtórzeniem trzydziestego drugiego peptydu z poprzedniej serii) biotynylowanych było na końcu N z łącznikiem obejmującym EGEG). Zliofilizowane biotynylowane peptydy rozpuszczano w 5 mM stężeniu w DMSO. Te roztwory podstawowe peptydów rozcieńczano do stężenia 5 pM w TTBS (0,05% Tween 20, 25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 5,1 mM KCl, pH 7,5). Próbki tego 5 pM roztworu, o objętości 100 pl, dodawano w dwóch powtórzeniach do 96-studzienkowych płytek uprzednio opłaszczonych streptawidyną (Pierce). Płytki inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej, a następnie cztery razy przemywano TTBS. Próbki surowic rozcieńczano w rozcieńczalniku do próbek bez azydku dla normalizacji mian i dodawano 100 pl na studzienkę. Płytki te inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przemywano cztery razy TTBS. Skoniugowane z HRP kozie przeciwciało skierowane przeciw immunoglobulinom ludzkim (Jackson Immuno-Research) rozcieńczano w stosunku 1:10000 w rozcieńczalniku do próbek bez azydku i dodawano 100 pl na studzienkę. Płytki ponownie inkubowano i przemywano. W celu wywołania reakcji barwnej, dodawano TMB (Pierce) w ilości 100 pl na studzienkę i inkubowano w ciągu 15 minut przed dodaniem 30 pl 2N H2SO4 dla zatrzymania reakcji. Gęstość optyczną mierzono przy długości fali 450 nm w kolorymetrycznym czytniku płytek Vmax lub Spectramax.
Wynikiem immunizacji AN1792 było wytwarzanie przeciwciał u 100% zwierząt we wszystkich grupach dawkowania w dniu 175. Średnie miana w grupach pozostawały w zakresie od 14596 do 56084. Istniała tendencja do podwyższania mian przy schemacie immunizacji z obecnością wyższego stężenia antygenu i/lub adiuwanta, ale nie można było wykazać żadnych różnic istotnych statystycznie z powodu wysokiej zmienności odpowiedzi na immunizacje u poszczególnych zwierząt.
Surowice, które były dodatnie pod względem przeciwciał skierowanych przeciw AN1792, były również dodatnie pod względem przeciwciał skierowanych przeciw Ae-40. Średnie miana w grupach pozostawały w zakresie 36867-165991 i, jak w przypadku mian przeciwciał skierowanych przeciw AN1792, w dniu 175 nie wykazywały istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami. Wiązanie z AN1792 wykazywało silną dodatnią korelację (test Spearmana, r = 0,8671) z wiązaniem z Ae1-40.
Spośród 48 małp immunizowanych AN1792 zgodnie z różnymi schematami, od 33 otrzymano próbki płynu mózgowo-rdzeniowego o objętości i jakości odpowiednich do analizy. Trzydzieści dwie (97%) z tych małp posiadało miana dodatnie wobec AN1792. Miana pozostawały w zakresie 2-246, ze średnią 49,44 ± 21,34. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciw AN1792 w płynach mózgowo-rdzeniowych wynosiły 0,18 ± 0,11% tych mierzonych w surowicach i wykazano silną dodatnią korelację (test Spearmana, r = 0,7840) z mianami surowic. Nie występowały żadne różnice pomiędzy grupami lub pomiędzy płciami pod względem procentu przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym. Poziomy przeciwciał w płynach mózgowo-rdzeniowych są zgodne z biernym przenikaniem przeciwciał wytwarzanych obwodowo przez barierę krew-mózg do ośrodkowego układu nerwowego.
Testowanie części dodatnich pod względem przeciwciał skierowanych przeciw Ae próbek płynów mózgowo-rdzeniowych wykazało, że podobnie jak przeciwciała w próbkach surowic, przeciwciała w płynach mózgowo-rdzeniowych reagują krzyżowo z Ae1-40. Miana wobec Ae1-40 wykazywały silną korelację (test Spearmana, r = 0,9634) z odpowiadającymi im mianami AN1792. Testowanie części próbek płynów mózgowo-rdzeniowych o najwyższych mianach wobec AN1792 nie wykazało żadnego wiązania z APP, jak w przypadku przeciwciał surowic.
Gdy otrzymane w dniu 175 surowice testowano wobec szeregu zachodzących na siebie 10-merowych peptydów, przeciwciała od wszystkich małp wiązały się z peptydem, którego sekwencja pokrywała aminokwasy 1-10 peptydu AN1792 (aminokwasy 653-672 APP). U niektórych zwierząt był to jedyny peptyd, wiązanie z którym można było zmierzyć (patrz fig. 19).
U innych zwierząt można było mierzyć inne reaktywności, ale we wszystkich przypadkach dominująca była reaktywność wobec N-końcowej sekwencji peptydu. Dodatkowe reaktywności można podzielić na dwie grupy. Pierwszą i najbardziej powszechną było wiązanie z peptydami skupiającymi się wokół N-końcowych reszt 1-10 peptydu AN1792 (fig. 20). Wiązanie tego typu było skierowane wobec peptydów pokrywających aminokwasy 1-8, 1-9 i 2-11 peptydu AN1792. Reaktywności te, łącznie z tą wobec peptydu 1-10, stanowiły zdecydowaną większość reaktywności u wszystkich zwierząt. Mapowanie epitopowe dla pojedynczych zwierząt w czasie wskazuje, że reaktywność przeciwciał wobec peptydu 1-10 poprzedza reaktywność obejmującą sąsiadujące peptydy. Wykazuje to silne ukierunkowanie odpowiedzi odpornościowej wobec końca N peptydu AN1792 z jego wolną końcową resztą kwasu asparaginowego. Drugą, niższą, wykrywalną aktywnością u niektórych zwierząt było wiązanie z peptydami położonymi po C-końcowej stronie od głównego regionu i skupiało się ono wokół pep58
PL 200 458 B1 tydów pokrywających aminokwasy 7-16, 11-20 i 16-25 peptydu AN1792. Reaktywności te obserwowano tylko u 10-30% małp.
Zmienność odpowiedzi pomiędzy różnymi zwierzętami (np. to, czy aminokwasy 1-10 były wyłącznymi, czy dominującymi epitopami) nie jest skorelowana z dawką antygenu/adiuwanta, schematem dawkowania lub mianem przeciwciał, a prawdopodobnie odzwierciedla cechy genetyczne poszczególnych zwierząt.
XVIII. Zapobieganie i leczenie u ludzi
Jednodawkową, próbę I fazy przeprowadza się w celu określenia bezpieczeństwa u ludzi. Wzrastające dawki czynnika terapeutycznego podaje się różnym pacjentom, rozpoczynając od 0,01 przypuszczalnego poziomu skutecznego i zwiększając je trzykrotnie, do osiągnięcia poziomu około 10-krotnie wyższego od dawki skutecznej u myszy.
Próbę II fazy prowadzi się w celu oceny skuteczności terapeutycznej. Wybiera się pacjentów z wczesną do średnio zaawansowanej chorobą Alzheimera zdefiniowaną z zastosowaniem kryteriów Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ADRDA) jako prawdopodobna AD. Odpowiedni pacjenci otrzymują ocenę w zakresie 12-26 w Mini-Mental State Exam (MMSE). Inne kryteria selekcji obejmują prawdopodobieństwo, że pacjenci przeżyją czas trwania badania oraz brak zakłócających problemów, takich jak stosowanie współistniejącego leczenia, które może powodować zakłócenia. Dokonuje się oszacowania wyjściowego stanu pacjenta z zastosowaniem klasycznych pomiarów psychometrycznych, takich jak MMSE oraz ADAS, które zapewniają wyczerpującą skalę do oceny stanu i funkcjonowania pacjentów z chorobą Alzheimera. Te skale psychometryczne pozwalają mierzyć rozwój choroby Alzheimera. Do monitorowania leczenia można również stosować odpowiednie skale oceniające jakość życia. Postępy choroby można również monitorować przez MRI. Można również monitorować profil krwi pacjentów, obejmujący oznaczenia odpowiedzi specyficznych wobec immunogenów przeciwciał i komórek T.
Po ocenie wyjściowej rozpoczęto leczenie pacjentów. Dzieli się ich losowo i traktuje albo czynnikiem terapeutycznym, albo placebo. Pacjentów monitoruje się co najmniej co sześć miesięcy. Skuteczność określa się dzięki znaczącemu obniżeniu rozwoju choroby w grupie leczonej w stosunku do grupy otrzymującej placebo.
Drugą próbę fazy II przeprowadza się w celu oceny przechodzenia pacjentów ze stanu wczesnej utraty pamięci nie związanej z chorobą Alzheimera, niekiedy określanej jako upośledzenie pamięci związane z wiekiem (AAMI) lub łagodnego upośledzenia pojmowania (MCI) do stanu prawdopodobnej choroby Alzheimera, jak określa się na podstawie kryteriów ADRDA. Pacjentów z wysokim ryzykiem przejścia w stan choroby Alzheimera wybiera się z populacji nieklinicznej przez badania przesiewowe populacji odniesienia pod kątem wczesnych oznak utraty pamięci lub innych problemów związanych objawami wczesnymi choroby Alzheimera, historii choroby Alzheimera w rodzinie, genetycznych czynników, wieku, płci i innych cech, co do których stwierdzono, że niosą ze sobą wysokie ryzyko rozwoju choroby Alzheimera. Zbiera się punktację wyjściową z odpowiednich pomiarów, włącznie z MMSE i ADAS, razem z innymi testami pomiarowymi przeznaczonymi do oceny bardziej normalnej populacji. Te populacje pacjentów dzieli się na odpowiednie grupy; porównawczą otrzymującą placebo i otrzymujące różne dawki czynnika. Te populacje pacjentów monitoruje się w odstępach około sześciu miesięcy, i punktem końcowym oceny każdego pacjenta jest to, czy pod koniec obserwacji on lub ona przeszli w stadium prawdopodobnej choroby Alzheimera, zgodnie z oceną podstawie kryteriów ADRDA.
XIX. Ogólne materiały i metody
1. Pomiar mian przeciwciał
Myszom pobierano krew przez wykonanie małego nacięcia w żyle ogonowej i zbieranie około 200 pl krwi do probówki do mikrowirówki. Świnkom morskim krew pobierano przez najpierw wygolenie obszaru tylnej pęciny, a następnie wprowadzanie igły numer 18 do nacięcia żyły śródstopia i zbieranie krwi do probówek do mikrowirówki. Umożliwiano krzepnięcie krwi w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej (RT), wytrząsano, a następnie wirowano przy 14 000 x g w ciągu 10 minut w celu oddzielenia skrzepu od surowicy. Następnie surowice przenoszono do czystej probówki do mikrowirówki i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu oznaczania miana.
Miana przeciwciał mierzono metodą ELISA. 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania (płytki EIA Costar) oplaszczano stosując 100 pl roztworu zawierającego albo 10 pg/ml Ae42 lub SAPP, albo innych antygenów, jak podano w każdym z poszczególnych raportów, w buforze do opłaszczania płytek (0,1M fosforan sodu, pH 8,5, 0,1% azydek sodu) i trzymano przez noc w temperaPL 200 458 B1 turze pokojowej. Zawartość studzienek odsysano i dodawano do nich surowice, zaczynając od rozcieńczenia 1/100 w rozcieńczalniku próbek (0,014M fosforan sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% albumina surowicy bydlęcej, 0,05% tymerosal). Siedem kolejnych rozcieńczeń próbek wykonywano bezpośrednio w płytkach w trzech etapach, do osiągnięcia końcowego rozcieńczenia 1/218700. Rozcieńczenia inkubowano w studzienkach oplaszczonych płytek w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemywano cztery razy PBS zawierającą 0,05% Tween 20. Do studzienek dodawano drugie przeciwciała, kozie przeciwciało skierowane przeciw Ig myszy skoniugowane z peroksydazą chrzanu (otrzymane z Boehringer Mannheim), jako 100 μl rozcieńczenia 1/3000 w rozcieńczalniku próbek i inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemywano cztery razy PBS z Tween 20. W celu wywołania chromogenu, do każdej studzienki dodawano 100 μl Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna, otrzymana z Pierce Chemicals) i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 25 μl 2M H2SO4. Intensywność barwy odczytywano następnie w Vmax, Molecular Devices (450-650 nm).
Miana definiowano jako odwrotność rozcieńczenia dającego połowę maksymalnej gęstości optycznej. Jako maksymalną gęstość optyczną przyjmowano gęstość początkowego rozcieńczenia 1/100, z wyjątkiem przypadków bardzo wysokich mian, gdy wyższe początkowe rozcieńczenie były konieczne do ustalenia maksymalnej gęstości optycznej. Jeśli punkt 50% wypadał pomiędzy dwoma rozcieńczeniami, do obliczenia ostatecznego miana stosowano ekstrapolację liniową. Przy obliczaniu średnich geometrycznych mian, mianom niższym od 100 arbitralnie przypisywano wartość miana 25.
2. Oznaczenie proliferacji limfocytów
Myszy usypiano izofluranem. Pobierano śledziony i dwukrotnie przemywano je 5 ml PBS zawierającej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (PBS-FBS), a następnie homogenizowano w 50° jednostce Centricon (Dako A/S, Dania) w 1,5 ml PBS-FBS w ciągu 10 sekund przy 100 obrotach na minutę w Medimachine (Dako), a następnie sączono przez siatkę nylonową o wielkości porów 100 mikronów. Limfocyty śledzionowe przemywano raz 15 ml PBS-FBS, następnie osadzano przez wirowanie przy 200 x g w ciągu 5 minut. Krwinki czerwone lizowano przez ponowne zawieszanie osadu w 5 ml buforu zawierającego 0,15M NH4Cl, 1M KHCO3, 0,1M NaEDTA, pH 7,4 w ciągu pięciu minut w temperaturze pokojowej. Leukocyty przemywano następnie w taki sam sposób, jak powyżej. Świeżo wyizolowane komórki śledziony (105 na studzienkę) hodowano w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, do traktowania hodowli tkankowych, o studzienkach o dnie w kształcie litery U (Corning, Cambridge, MA) w podłożu RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wzbogaconym o 2,05 mM L-glutaminę, 1% penicylinę/streptomycynę i 10% inaktywowaną termicznie FBS, w ciągu 96 godzin w temperaturze 37°C. Dodawano również różne peptydy Ae - Ae1-16, Ae1-40, Ae1-42 lub Ae40-1, o odwróconej sekwencji białka - w dawkach pozostających w zakresie od 5 do 0,18 mikromolowym w czterech etapach.
Komórki w studzienkach kontrolnych hodowano z konkanawaliną A (Con A) (Sigma, nr kat. C-5275, w stężeniu 1 mikrogram/ml) bez dodawanego białka. Komórki traktowano impulsowo w ciągu końcowych 24 godzin 3H-tymidyną ^Ci/studzienkę, otrzymaną z Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Następnie komórki zbierano na płytki UniFilter i promieniotwórczość zliczano w Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Wyniki wyrażano jako zliczenia na minutę (cpm) promieniotwórczości wprowadzonej do nierozpuszczalnych makrocząsteczek.
4. Preparaty tkanki mózgowej
Po uśmierceniu, mózgi usuwano i jedną półkulę przygotowywano do analizy immunohistochemicznej, podczas gdy z drugiej półkuli wycinano trzy regiony mózgu (hipokamp, korę mózgową i móżdżek) i stosowano do pomiaru stężenia różnych postaci białek Ae i APP, stosując specyficzne oznaczenia ELISA (Johnson-Wood i in., supra).
Tkanki przeznaczone do oznaczeń ELISA homogenizowano w 10 objętościach schłodzonego lodem buforu z guanidyną (5M chlorowodorek guanidyny, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenaty mieszano z delikatnym wytrząsaniem stosując Adams Nutator (Fisher) w ciągu od trzech do czterech godzin w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywano w temperaturze -20°C przed ilościową oceną Ae i APP. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że próbki do analizy były stabilne w tych warunkach przechowywania i że syntetyczne białko Ae (Bachem) można było ilościowo odzyskiwać po wzbogacaniu homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej myszy z jednego miotu (Johnson-Wood i in., supra).
PL 200 458 B1
5. Pomiary poziomów Ae
Homogenaty mózgów rozcieńczano w stosunku 1:1 schłodzonym lodem rozcieńczalnikiem kazeinowym (0,25% kazeina, PBS, 0,05% azydek sodu, 20 pg/ml aprotyniny, 5 mM EDTA, pH 8,0, 10 Hg/ml leupeptyny), a następnie wirowano przy 16000 x g w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C. Wzorce syntetycznego białka Ae (aminokwasy 1-42) oraz standardy APP przygotowano w taki sposób, aby zawierały w końcowym składzie 0,5M guanidynę i 0,1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA). W oznaczeniu ELISA typu podwójnego wiązania całkowitego Ae wykorzystuje się przeciwciało monoklonalne 266, specyficzne wobec aminokwasów 13-28 Ae (Seubert i in.) jako przeciwciało wychwytujące, oraz biotynylowane przeciwciało monoklonalne 3D6, specyficzne wobec aminokwasów 1-5 Ae (Johnson-Wood i in.), jako przeciwciało reporterowe. Przeciwciało monoklonalne 3D6 nie rozpoznaje wydzielanego APP lub APP o pełnej długości, a wykrywa tylko postacie Ae o aminokońcowym kwasie asparaginowym. Dolna granica czułości tego oznaczenia wynosi około 50 ng/ml (11 nM) i nie wykazuje ono reaktywności krzyżowej z endogennym białkiem Ae myszy przy stężeniach do 1 ng/ml (Johnson-Wood i in., supra).
W specyficznym wobec Ae1-42 oznaczeniu ELISA typu podwójnego wiązania wykorzystuje się mAe 21F12, specyficzne wobec aminokwasów 33-42 Ae (Johnson-Wood i in.), jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane przeciwciało monoklinalne mAe 3D6 jest przeciwciałem reporterowym również w tym oznaczeniu, które posiada niższą granicę czułości, wynoszącą około 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood i in.). W przypadku oznaczenia ELISA dla Ae, studzienki 96-studzienkowych płytek do oznaczeń immunologicznych (Costar) opłaszczano 100 pl albo przeciwciała monoklonalnego mAe 266 (o stężeniu 10 pg/ml), albo przeciwciała monoklonalnego mAe 21F12 (o stężeniu 5 pg/ml) przez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór usuwano przez odsysanie i studzienki blokowano w ciągu co najmniej jednej godziny w temperaturze pokojowej przez dodanie 200 pl 0,25% albuminy surowicy ludzkiej w buforze PBS. Roztwór blokujący usuwano i płytki przechowywano wysuszone w temperaturze 4°C do chwili użycia. Przed użyciem płytki ponownie nawadniano buforem do przemywania [sól fizjologiczna zbuforowana Tris (0,15M NaCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,5) plus 0,05% Tween 20]. Próbki i wzorce dodawano w trzech powtórzeniach w ilości 100 pl na studzienkę, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po każdym etapie oznaczenia płytki przemywano co najmniej trzy razy buforem do przemywania. Dodawano biotynylowane przeciwciało monoklonalne mAe 3D6, rozcieńczone do stężenia 0,5 pg/ml kazeinowym buforem do oznaczania (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubowano w studzienkach w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Do studzienek dodawano na jedną godzinę w temperaturze pokojowej koniugat awidyna-peroksydaza chrzanowa (awidynę HRP otrzymano z Vector, Burlingame, CA), rozcieńczony 1:4000 w kazeinowym buforze do oznaczania. Dodawano substrat kolorymetryczny, Slow TMB-ELISA (Pierce) i umożliwiano reagowanie w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym reakcję enzymatyczną zatrzymywano przez dodanie 25 pl 2N H2SO4. Produkt reakcji oceniano ilościowo stosując Vmax, Molecular Devices, przez pomiar różnicy absorbancji przy długościach fali 450 nm i 650 nm.
6. Pomiar poziomów APP
Wykorzystywano dwa różne oznaczenia APP. Pierwsze, oznaczone APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (α), jak i postacie APP o pełnej długości (FL). Drugie oznaczenie jest specyficzne wobec APP-α. Oznaczenie APP-a/FL rozpoznaje wydzielane APP, obejmujące pierwszych 12 aminokwasów Ae. Ponieważ przeciwciało reporterowe (2H3) nie jest specyficzne wobec miejsca wiązania α, występującego pomiędzy aminokwasami 612-613 APP695 (Esch i in., Science 248, 1122-1124 (1990)), oznaczenie to rozpoznaje również APP o pełnej długości (APP-FL). Wstępne doświadczenia z zastosowaniem immobilizowanych przeciwciał skierowanych przeciw APP, specyficznych wobec cytoplazmatycznej części APP-FL, do usuwania APP-FL z homogenatów mózgu sugeruje, że około 30-40% APP-a/FL APP stanowi postać FL (dane nie przedstawione). Przeciwciałem wychwytującym zarówno w oznaczeniu APP-a/FL, jak i APP-α, jest przeciwciało monoklonalne 8E5, wywołane przeciw aminokwasom od 444 do 592 postaci APP695 (Games i in., supra). Reporterowym przeciwciałem monoklonalnym w oznaczeniu APP-a/FL jest przeciwciało monoklonalne 2H3, specyficzne wobec aminokwasów 597-608 APP695 (Johnson-Wood i in., supra), a przeciwciałem reporterowym w oznaczeniu APP-a jest biotynylowana pochodna monoklonalnego przeciwciała 16H9, wywołanego przeciw aminokwasom od 605 do 611 APP. Dolna granica czułości oznaczenia APP-aFL wynosi około 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood i in.), a ta oznaczenia specyficznego wobec APP-a wynosi około 22 ng/ml (0,3 nM). W przypadku obu oznaczeń APP, studzienki 96-studzienkowych płytek EIA opłaszczano przeciwciałem monoklonalnym 8E5, w sposób opisany powyżej dla przeciwciała monoklonalPL 200 458 B1 nego 266. Oczyszczone, rekombinowane wydzielane APP-α stosowano jako standard odniesienia w oznaczeniu APP-α i oznaczeniu APP-α/FL (Esch i in., supra). Próbki homogenatów mózgów w 5M guanidynie rozcieńczano w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku próbek do EL^ (0,014M bufor fosforanowy, pH 7,4, 0,6% albumina surowicy bydlęcej, 0,05% tymerosal, 0,5M NaCl, 0,1% NP40). Następnie rozcieńczano je w stosunku 1:4 w rozcieńczalniku do próbek zawierającym 0,5M guanidynę. Rozcieńczone homogenaty wirowano następnie przy 16000 x g w ciągu 15 sekund w temperaturze pokojowej. Wzorce APP i próbki dodawano do płytek w dwóch powtórzeniach i inkubowano w ciągu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Biotynylowane przeciwciało reporterowe 2H3 lub 16H9 inkubowano z próbkami w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Streptawidynę - alkaliczną fosfatazę (Boehringer Mannheim), rozcieńczoną w stosunku 1:1000 w rozcieńczalniku do próbek, inkubowano w studzienkach w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Fluorescencyjny substrat fosforan 4-metyloumbeliferylu dodawano na czas inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej i płytki odczytywano we fluorymetrze CytofluorTM 2350 (Millipore) ze wzbudzeniem przy długości fali 365 nm i emisją przy długości fali 450 nm.
7. Immunocytochemia
Mózgi najpierw utrwalano w ciągu trzech dni w temperaturze 40°C w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie przechowywano w ciągu od jednego do siedmiu dni w temperaturze 4°C w 1% paraformaldehydzie w PBS, do czasu cięcia skrawków. Wieńcowe skrawki o grubości czterdziestu mikronów cięto w temperaturze pokojowej stosując wibratom i przechowywano w środku chroniącym przed zamrożeniem (30% glicerol, 30% glikol etylenowy w buforze fosforanowym) w temperaturze -20°C przed obróbką immunocytochemiczną. Dla każdego mózgu sześć skrawków na poziomie grzbietowym hipokampa, rozdzielonych o kolejne odstępy 240 pm, inkubowano przez noc z jednym z następujących przeciwciał:
(1) biotynylowanym przeciwciałem skierowanym przeciw Αβ (przeciwciało monoklonalne 3D6, specyficzne wobec ludzkiego Αβ) rozcieńczonym do stężenia 2 pg/ml w PBS i 1% surowicy końskiej; lub (2) biotynylowanym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec ludzkiego APP, 8E5, rozcieńczonym do stężenia 3 pg/ml w PBS i 1,0% surowicą końską; lub (3) monoklonalnym przeciwciałem specyficznym wobec wobec fibrylarnego kwaśnego białka glejowego (GFAP; Sigma Chemical Co.) rozcieńczonym 1:500 0,25% Tritonem Χ-100 i 1% surowicą końską w zbuforowanej Tris soli fizjologicznej, pH 7,4 (TBS); lub (4) przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD11b, antygenu MAC-I (Chemicon International), rozcieńczonym 1:100 0,25% Tritonem X-100 i 1% surowicą króliczą w TBS; lub (5) przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec antygenu MHC-II (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 0,25% Tritonem X-100 i 1% surowicą króliczą w TBS; lub (6) szczurzym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD 43 (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 0,25% Tritonem X-100 z 1% surowicą króliczą w PBS; lub (7) szczurzym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD 45RA (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 1% surowicą króliczą w PBS; lub (8) szczurzym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD 45RB (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 1% surowicą króliczą w PBS; lub (9) szczurzym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD 45 (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 1% surowicą króliczą w PBS; lub (10) biotynylowanym poliklonalnym przeciwciałem chomika specyficznym wobec CD3e (Pharmingen), rozcieńczonym 1:100 1% surowicą króliczą w PBS; lub (11) szczurzym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec CD3 (Serotec), rozcieńczonym 1:200 1% surowicą króliczą w PBS; lub (12) roztworem PBS pozbawionym pierwszego przeciwciała, zawierającym 1% normalną surowicę końską.
Skrawki poddawane reakcji z roztworami przeciwciał wymienionymi powyżej w 1, 2 i 6-12 traktowano wstępnie 1,0% Tritonem X-100, 0,4% nadtlenkiem wodoru w PBS w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Następnie inkubowano je przez noc w temperaturze 4°C z pierwszym przeciwciałem. Skrawki poddawane reakcji z przeciwciałem monoklonalnym 3D6, 8E5 lub skierowanym przeciw CD3e, poddawano następnie reakcji w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze składnikami „Α” i „B” zestawu, rozcieńczonymi 1:75 PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Skrawki poddawane reakcji z przeciwciałami specyficznymi wobec CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i roztworem PBS bez pierwszego przeciwciała inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze
PL 200 458 B1 pokojowej z odpowiednio biotynylowanym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG szczura (Vector), rozcieńczonym 1:75 PBS lub biotynylowanym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG myszy (Vector), rozcieńczonym 1:75 PBS. Skrawki poddawano następnie reakcji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze składnikami „A” i „B” zestawu, rozcieńczonymi 1:75 PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).
Skrawki wywoływano w 0,01% nadtlenku wodoru, 0,05% 3,3'-diaminobenzydynie w temperaturze pokojowej. Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwciałami specyficznymi wobec GFAP, MAC-l i MHC II traktowano wstępnie 0,6% nadtlenkiem wodoru w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy, a następnie inkubowano przez noc z pierwszym przeciwciałem w temperaturze 4°C. Skrawki poddawane reakcji z przeciwciałem skierowanym przeciw GFAP inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z końskim przeciwciałem skierowanym przeciw IgG myszy (Vector Laboratories, Vectastain Elite ABC Kit), rozcieńczonym 1:200 TBS. Skrawki poddawano następnie reakcji w ciągu 1 godziny z kompleksem awidyna-biotyna-pe-roksydaza (Vector Laboratories, Vectastain Elite ABC Kit), rozcieńczonym 1:1000 TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec MAC-l lub MHC-II jako pierwszym przeciwciałem poddawano następnie reakcji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z króliczym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG szczura, rozcieńczonym 1:200 TBS, a następnie inkubowano w ciągu 1 godziny z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza, rozcieńczonym 1:1000 TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami specyficznymi wobec GFAP, MAC-1 i MHC II poddawano następnie wizualizacji przez traktowanie w temperaturze pokojowej 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu i TBS w ciągu odpowiednio 4 i 11 minut.
Wyznakowane immunologicznie skrawki osadzano na szkiełkach (VWR, szkiełka Superfrost), suszono na powietrzu przez noc, zanurzano w Propar (Anatech) i przykrywano szkiełkami nakrywkowymi stosując Permount (Fisher) jako podłoże osadzające.
W celu przeciwwybarwienia płytek Ae, po obróbce immunohistochemicznej część skrawków dodatnich pod względem GFAP osadzano na szkiełkach Superfrost i inkubowano w wodnym 1% roztworze Thioflavin S (Sigma) w ciągu 7 minut. Skrawki odwadniano następnie i oczyszczano w Propar, a następnie przykrywano szkiełkami nakrywkowymi stosując Permount.
8. Analiza obrazów
Do ilościowej oceny szkiełek poddawanych reakcjom immunologicznym stosowano Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), połączony z mikroskopem Nikon Microphot-FX poprzez kamerę wideo CCD i monitor Sony Trinitron. Obraz skrawka przechowywano w buforze wideo i określano progowe poziomy barwy i nasycenia do selekcji i obliczania całkowitego pola powierzchni pikseli zajętych przez struktury wyznakowane immunologicznie. Dla każdego skrawka, hipokamp obwodzono manualnie i obliczano całkowite pole powierzchni pikseli zajętych przez hipokamp. Procent obciążenia amyloidem mierzono jako: (część pola powierzchni hipokampa zawierająca złogi Ae reaktywne immunologicznie wobec przeciwciała monoklonalnego 3D6) x 100. Podobnie, procent obciążenia płytkami neurytowymi mierzono jako: (część pola powierzchni hipokampa zawierająca dystroficzne neuryty reaktywne wobec przeciwciała monoklonalnego 8E5) x 100. C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) obsługiwany przez program Simple 32 Software Application połączony był z mikroskopem Nikon Microphot-FX poprzez kamerę Optronics i wykorzystywano go do ilościowej oceny procentu kory za płatem ciała modzelowatego zajętego przez dodatnie pod względem GFAP astrocyty oraz dodatnie pod względem MAC-l i MHC-II komórki mikrogleju. Obraz skrawka poddanego reakcji immunologicznej przechowywano w buforze wideo i określano monochromatyczny poziom progowy do selekcji obliczania całkowitego pola powierzchni pikseli zajętych przez komórki wyznakowane immunologicznie. Dla każdego skrawka, korę za płatem ciała modzelowatego (RSC) obwodzono manualnie i obliczano całkowite pole powierzchni pikseli zajętych przez RSC. Procent astrocytozy definiowano jako: (część RSC zajęta przez astrocyty reaktywne pod względem GFAP) x 100. Podobnie, procent mikroglejozy definiowano jako: (część RSC zajęta przez reaktywne wobec MAC-l lub MHC II komórki mikrogleju) x 100. Dla każdej analizy obrazu oceniano ilościowo sześć skrawków na poziomie grzbietowym hipokampa, rozdzielonych o kolejne odstępy 240 pm, dla każdego zwierzęcia. We wszystkich przypadkach status leczenia zwierząt był nieznany obserwatorowi.
Chociaż powyższy wynalazek opisano szczegółowo w celu jego wyjaśnienia i umożliwienia zrozumienia, będzie oczywiste, że w zakresie dołączonych zastrzeżeń można dokonywać pewnych modyfikacji. Wszystkie publikacje i dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie w całości włąPL 200 458 B1 czono do niego poprzez odniesienie, dla wszelkich celów, w takim samym stopniu, jakby każdą z nich pojedynczo odnotowano.
Na podstawie powyższego będzie oczywiste, że wynalazek dostarcza licznych zastosowań. Na przykład, wynalazek dostarcza zastosowanie któregokolwiek z opisanych powyżej przeciwciał skierowanych przeciw Ae w leczeniu, profilaktyce lub diagnozowaniu choroby amyloidogennej, bądź w produkowaniu leku lub kompozycji diagnostycznej do stosowania w takich samych celach. Podobnie, wynalazek dostarcza zastosowanie któregokolwiek z opisanych powyżej epitopowych fragmentów Ae do leczenia lub profilaktyki choroby amyloidogennej, bądź w produkowaniu leku lub kompozycji diagnostycznej do stosowania w takich samych celach.
T a b e l a 1
Miano przy 50% maksymalnej gęstości optycznej
Zagregowany A 3 wstrzykiwany myszom
Wiek mysz mysz mysz mysz mysz mysz mysz mysz mysz
PDAPP 100 101 102 103 104 105 106 107 108
4 70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 80000 100000
6 15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000
8 20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000
10 40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000
12 25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000
PBS wstrzykiwana myszom przy obu immunizacjach przy 1 :100
Wiek mysz mysz mysz mysz mysz
PDAPP 113 114 115 116 117
6 < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło
10 5 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło
12 < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło < 4 x tło
Zastrzeżenia patentowe

Claims (58)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera środek immunogenny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym środek obejmuje:
    (i) chimeryczne, ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae;
    (ii) przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1; lub (iii) kwas nukleinowy kodujący (i) lub (ii).
  2. 2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-7 Ae; reszt 1-6 Ae; reszt 1-4 Ae; reszt 1-3 Ae; reszt 3-6 Ae; lub reszt 3-7 Ae.
  3. 3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz.1, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG1.
  4. 4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz.1, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG4.
  5. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG1.
  6. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG4.
  7. 7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz.1, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG2 lub IgG3.
    PL 200 458 B1
  8. 8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że izotypem chimerycznego, ludzkiego lub humanizowanego przeciwciała jest ludzka IgG2 lub IgG3.
  9. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem zawierającym wolną resztę N-końcową Ae.
  10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae, gdzie reszta 1 i/lub 7 Ae jest kwasem izoasparaginowym.
  11. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym.
  12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało zawiera dwie kopie tej samej pary łańcuchów lekkiego i ciężkiego.
  13. 13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem bispecyficznym zawierającym pierwszą parę łańcucha lekkiego i ciężkiego, która wiąże się specyficznie z epitopem Ae i drugą parę łańcucha lekkiego i ciężkiego, która wiąże się specyficznie z receptorem Fc na komórkach mikrogleju.
  14. 14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że łańcuch przeciwciała jest sprzężony z polipeptydem heterologicznym.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało wiąże się specyficznie z peptydem Ae, nie wiążąc się białkiem prekursorowym amyloidu o pełnej długości (APP).
  16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że zawiera dodatkowo co najmniej jedno inne przeciwciało wiążące się z innym epitopem Ae.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem do podawania pozajelitowego.
  18. 18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania dootrzewnowego, doustnego, donosowego, podskórnego, domięśniowego, miejscowego lub dożylnego.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania w wielu dawkach w ciągu co najmniej sześciu miesięcy.
  20. 20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu.
  21. 21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem wytworzonym z użyciem komórek B pochodzących od człowieka immunizowanego peptydem Ae.
  22. 22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1-8, znamienna tym, że służy do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Ae w mózgu pacjenta.
  23. 23. Przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1, do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Ae w mózgu pacjenta.
  24. 24. Chimeryczne, ludzkie lub humanizowane przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae, do stosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej z amyloidowymi złogami Ae w mózgu pacjenta.
  25. 25. Zastosowanie środka immunogennego do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby związanej z amyloidowymi złogami u pacjenta, przy czym środek stanowi:
    (i) chimeryczne, ludzkie lub humanizowane przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae;
    (ii) przeciwciało, które wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-10 Ae, gdzie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1; lub (iii) kwas nukleinowy kodujący (i) lub (ii).
  26. 26. Zastosowanie według zastrz. 25, w którym przeciwciało wiąże się specyficznie z epitopem w obrębie reszt 1-7 Ae; reszt 1-6 Ae; reszt 1-4 Ae; reszt 1-3 Ae; reszt 3-6 Ae; lub reszt 3-7 Ae.
  27. 27. Zastosowanie według zastrz. 26, w którym po podaniu pacjentowi leku kwas nukleinowy ulega ekspresji u pacjenta z wytworzeniem co najmniej jednego łańcucha przeciwciała w pacjencie.
  28. 28. Zastosowanie według zastrz. 27, w którym kwas nukleinowy koduje łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała i po podaniu pacjentowi leku kwas nukleinowy ulega ekspresji u pacjenta z wytworzeniem łańcuchów ciężkiego i lekkiego w pacjencie.
    PL 200 458 B1
  29. 29. Zastosowanie według zastrz. 25-28, w którym choroba charakteryzuje się upośledzeniem funkcji poznawczych.
  30. 30. Zastosowanie według zastrz. 25-28, w którym choroba jest chorobą Alzheimera.
  31. 31. Zastosowanie według zastrz. 25-28, w którym choroba jest zespołem Downa.
  32. 32. Zastosowanie według zastrz. 25-28, w którym choroba jest łagodnym upośledzeniem funkcji poznawczych.
  33. 33. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera środek immunogenny skutecznie indukujący odpowiedź immnunogenną obejmującą przeciwciała skierowane przeciw Ae u pacjenta, przy czym środek obejmuje:
    (i) Ae1-7 o sekwencji aminokwasowej DAEFRHD;
    (ii) Ae3-7 o sekwencji aminokwasowej EFRHD; lub (iii) multimer (i) lub (ii).
  34. 34. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że fragment Ae składa się z Ae1-7 lub Ae3-7.
  35. 35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że do fragmentu Ae dodano resztę cysteiny.
  36. 36. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33-35, znamienna tym, że fragment Ae jest związany z peptydem nośnikowym.
  37. 37. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36, znamienna tym, że peptyd nośnikowy jest związany z końcem C fragmentu Ae.
  38. 38. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36, znamienna tym, że peptyd nośnikowy jest związany z końcem N fragmentu Ae.
  39. 39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36-38, znamienna tym, że peptyd nośnikowy jest peptydem ułatwiającym transport przez tkanki.
  40. 40. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36-38, znamienna tym, że peptyd wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciw Ae1-7 lub Ae3-7.
  41. 41. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 40, znamienna tym, że peptydem nośnikowym jest: albumina surowicy, hemocyjanina skrzypłocza, cząsteczka immunoglobuliny, tyroglobulina, owoalbumina, toksoid bakterii patogennej, uniwersalny epitop komórki T, cytokina lub chemokina.
  42. 42. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 41, znamienna tym, że peptydem nośnikowym jest toksoid tężcowy, toksoid maczugowca błonicy, toksoid E. coli, przecinkowca cholery lub toksoid H. pylori, lub atenuowana pochodna toksyny.
  43. 43. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 42, znamienna tym, że peptyd nośnikowy obejmuje uniwersalny epitop komórki T, którym jest:
    hemaglutynina wirusa grypy: HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT);
    PADRE (AKXVAAWTLKAAA),
    CS zarodźca malarii: epitop T3 (EKKIAKMEKASSVFNV);
    antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B: HB-sAg19-28 (FFLLTRILTI); białko szoku cieplnego 65: hsp65153-171 (DQSIGDLIAEAMDKVGNEG); laseczka Calmette-Guerin (QVHFQPLPPAVVKL);
    toksoid tężcowy: TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL); toksoid tężcowy: TT947-967 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE); gp120 HIV TI: (KQIINMWQEVGKAMYA).
  44. 44. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36-38, znamienna tym, że fragment Ae jest związany z peptydem nośnikowym przez sieciowanie chemiczne.
  45. 45. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 36-38, znamienna tym, że fragment Ae jest eksprymowany jako białko fuzyjne z peptydem nośnikowym.
  46. 46. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33-36, znamienna tym, że zawiera ponadto jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych składników.
  47. 47. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 46, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  48. 48. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 46, znamienna tym, że zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant.
  49. 49. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 47, znamienna tym, że zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant.
    PL 200 458 B1
  50. 50. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 49, znamienna tym, że środek immunogenny jest sprzężony z adiuwantem.
  51. 51. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że adiuwant służy do podawania przed lub po środku immunogennym.
  52. 52. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 46-51, znamienna tym, że środek immunogenny jest prezentowany przez wirusa lub bakterię.
  53. 53. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 46-51, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania dawki środka immunogennego większej niż 10 mikrogramów.
  54. 54. Zastosowanie środka immunogennego do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby związanej z amyloidowymi złogami u pacjenta, przy czym środek stanowi:
    (i) Ae1-7 o sekwencji aminokwasowej DAEFRHD;
    (ii) Ae3-7 o sekwencji aminokwasowej EFRHD; lub (iii) multimer (i) lub (ii).
  55. 55. Zastosowanie według zastrz. 54, w którym choroba charakteryzuje się upośledzeniem funkcji poznawczych.
  56. 56. Zastosowanie według zastrz. 54, w którym choroba jest chorobą Alzheimera.
  57. 57. Zastosowanie według zastrz. 54, w którym choroba jest zespołem Downa.
  58. 58. Zastosowanie według zastrz. 54, w którym choroba jest łagodnym upośledzeniem funkcji poznawczych.
PL357182A 1999-05-28 2000-05-26 Kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało i zastosowanie środka immunogennego PL200458B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/322,289 US7964192B1 (en) 1997-12-02 1999-05-28 Prevention and treatment of amyloidgenic disease
PCT/US2000/014810 WO2000072880A2 (en) 1999-05-28 2000-05-26 Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL357182A1 PL357182A1 (pl) 2004-07-26
PL200458B1 true PL200458B1 (pl) 2009-01-30

Family

ID=23254226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL357182A PL200458B1 (pl) 1999-05-28 2000-05-26 Kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało i zastosowanie środka immunogennego

Country Status (38)

Country Link
US (6) US7964192B1 (pl)
EP (3) EP1185298B1 (pl)
JP (2) JP5580504B2 (pl)
KR (2) KR100961485B1 (pl)
CN (2) CN1359301B (pl)
AR (1) AR024074A1 (pl)
AT (1) ATE434444T1 (pl)
AU (1) AU5303100A (pl)
BG (2) BG65882B1 (pl)
BR (1) BR0011000A (pl)
CA (1) CA2370311C (pl)
CL (1) CL2010000018A1 (pl)
CO (1) CO5170495A1 (pl)
CZ (1) CZ304876B6 (pl)
DE (2) DE60042451D1 (pl)
EA (2) EA021614B1 (pl)
EE (1) EE05671B1 (pl)
ES (1) ES2624908T3 (pl)
GB (2) GB2368794B (pl)
HK (1) HK1045116B (pl)
HR (2) HRP20010877B1 (pl)
HU (1) HU230550B1 (pl)
IL (2) IL146435A0 (pl)
IS (1) IS6154A (pl)
MX (1) MXPA01011621A (pl)
MY (1) MY132784A (pl)
NO (3) NO337301B1 (pl)
NZ (1) NZ515403A (pl)
PE (1) PE20010191A1 (pl)
PL (1) PL200458B1 (pl)
SG (3) SG147273A1 (pl)
SK (1) SK287513B6 (pl)
TR (2) TR200202231T2 (pl)
TW (1) TWI263503B (pl)
UA (1) UA81215C2 (pl)
UY (1) UY26182A1 (pl)
WO (1) WO2000072880A2 (pl)
ZA (1) ZA200109487B (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4185612A4 (en) * 2020-07-23 2024-12-25 Othair Prothena Limited Anti-abeta antibodies

Families Citing this family (185)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
CA2286305A1 (en) * 1997-04-09 1998-10-15 Mindset Ltd. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, dna encoding and methods of use thereof
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
CA2349434A1 (en) * 1999-09-03 2001-03-15 Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
IL149976A0 (en) 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
EP1752472A3 (en) * 1999-12-08 2007-04-25 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
KR20080017471A (ko) 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
ME00183B (me) * 2000-02-21 2011-02-10 Pharmexa As Novi postupak za deregulaciju amiloida
DE1257584T1 (de) 2000-02-24 2003-05-28 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper, die amyloid beta peptid demarkieren
AU7487301A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Univ New York Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
AU1225702A (en) * 2000-09-19 2002-04-02 Evotec Neurosciences Gmbh Methods and compounds for treating brain amyloidosis
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
EP1434988A4 (en) 2001-02-23 2005-12-14 Elan Pharm Inc TRANSGENIC ANIMALS KNOCKOUT WITH GENE BACE-1 INACTIVE
DE60229051D1 (de) 2001-04-30 2008-11-06 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper
ATE420114T1 (de) * 2001-04-30 2009-01-15 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper die das beta-amyloid peptid erkennen& x9;
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
WO2003015691A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
US20040241164A1 (en) * 2001-08-17 2004-12-02 Bales Kelly Renee Use of antibodies having high affinity for soluble ab to treat conditions and diseases related to ass
US7771722B2 (en) 2001-08-17 2010-08-10 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
JP2005503789A (ja) * 2001-08-17 2005-02-10 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗Ａβ抗体
PT1416965E (pt) * 2001-08-17 2008-04-01 Lilly Co Eli Método de ensaio para a doença de alzheimer
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
CA2466841A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
EP1975179A1 (en) * 2001-12-26 2008-10-01 Araclon Biotech, S.L. Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
EP2292247A3 (en) * 2002-03-05 2011-10-05 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the beta-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20070134247A9 (en) * 2002-04-12 2007-06-14 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
WO2003089460A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological methods and compositions for the treatment of alzheimer's disease
AU2003223474B2 (en) * 2002-04-25 2008-09-04 Eli Lilly And Company Method for treating anxiety and mood disorders in older subjects
CA2487528A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with beta-amyloid formation and/or aggregation
US9535076B2 (en) * 2002-09-12 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
BR0315157A (pt) * 2002-10-09 2005-08-09 Rinat Neuroscience Corp Métodos de tratar doença de alzheimer empregando-se anticorpos direcionados contra peptìdeo beta amilóide e composições deste
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
FR2846667B1 (fr) * 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
UA87453C2 (ru) 2003-02-01 2009-07-27 Вайет Применения фрагмента ав для лечения болезни альцгеймера
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
WO2004083251A2 (en) * 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
EP1480041A1 (en) * 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP4888876B2 (ja) * 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
KR101157694B1 (ko) 2003-12-17 2012-06-20 와이어쓰 엘엘씨 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
MY144231A (en) * 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
AT500483B1 (de) 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
US20060024667A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Karen Manucharyan Compositions and methods for Alzheimer's disease
SG190665A1 (en) 2004-07-30 2013-06-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
CA2576768A1 (en) * 2004-08-11 2006-03-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of reducing the effects of a.beta. and compositions therefore
EP1787998A4 (en) * 2004-08-11 2008-08-27 Mitsubishi Chem Corp ANTIBODIES AND THEIR USE
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
TWI364458B (en) 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
EP1797182A2 (en) * 2004-10-05 2007-06-20 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Methods and compositions for improving recombinant protein production
WO2006066089A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
TW200636066A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TW200635608A (en) * 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
CA2604675A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-26 The University Of Tennessee Research Foundation Diagnostic and therapeutic potential of immune globulin intravenous (igiv) products
MY148086A (en) 2005-04-29 2013-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
CA2607868A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
CN101213211A (zh) * 2005-06-17 2008-07-02 惠氏公司 纯化含Fc区蛋白的方法
CN101506236B (zh) 2005-11-30 2012-12-12 雅培制药有限公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
SI1976877T1 (sl) * 2005-11-30 2014-05-30 Abbvie Inc. Monoklonska protitelesa proti amiloidnemu beta proteinu in njihove uporabe
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
RU2551782C2 (ru) 2005-12-12 2015-05-27 Ац Иммуне Са Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами
CN101351476B (zh) 2005-12-12 2013-04-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体可变区的糖基化
WO2007090126A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Invitrogen Corporation Compositions and methods for detecting and quantifying toxic substances in disease states
CN101384279B (zh) * 2006-02-24 2012-02-22 奇斯药制品公司 抗淀粉样蛋白免疫原性组合物、方法和用途
PL2004688T5 (pl) 2006-03-23 2014-09-30 Bioarctic Neuroscience Ab Ulepszone przeciwciała wobec protofibryli oraz ich zastosowania
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
EP2035448A4 (en) * 2006-06-01 2010-11-03 Elan Pharm Inc NEUROACTIVE FRAGMENTS OF APP
EP3988566A1 (en) * 2006-07-14 2022-04-27 AC Immune SA Humanized antibody against amyloid beta
KR20150087435A (ko) * 2006-07-14 2015-07-29 에이씨 이뮨 에스.에이. 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체
TWI551607B (zh) * 2006-07-14 2016-10-01 Ａｃ免疫公司 人類化抗體
BRPI0719763A2 (pt) * 2006-10-02 2014-01-28 Ac Immune Sa Anticorpo, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição, mistura, uso de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura, métodos para a preparação de uma composição farmacêutica ou de uma mistura, para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de uma doença, de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente e de determinação do grau da carga de placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada, linhagem de célula, gene de anticorpo, e, métodos para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, para prevenir a degradação de neurônio induzida por abeta, para diagnosticar uma predisposição a uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, para monitorar doença residual mínima em um paciente, para prognosticar a responsividade de um paciente que é tratado com um anticorpo ou uma composição de vacina, para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, para diminuir a quantidade total de abeta solúvel no cérebro de um animal e para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero.
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
HRP20140049T1 (hr) 2007-01-05 2014-02-28 University Of Zürich Anti beta-amiloid antitijela i njihova upotreba
ES2439490T3 (es) * 2007-01-05 2014-01-23 University Of Zurich Anticuerpo anti-beta amiloide y usos del mismo
AU2008206555B2 (en) 2007-01-18 2013-07-04 Eli Lilly And Company Pegylated Abeta Fab
ES2546863T3 (es) 2007-02-23 2015-09-29 Prothena Biosciences Limited Prevención y tratamiento de enfermedad sinucleinopática y amiloidogénica
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
JP5558834B2 (ja) 2007-02-23 2014-07-23 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ）の予防および処置
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
EP2481408A3 (en) 2007-03-01 2013-01-09 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
WO2008128985A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
AU2008248780B2 (en) 2007-05-02 2013-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for stabilizing a protein
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
EP2020602A1 (en) * 2007-08-02 2009-02-04 Araclon Biotech High sensitivty immunoassays and kits for the determination of peptides and proteins of biological interest
RU2482876C2 (ru) 2007-10-05 2013-05-27 Дженентек, Инк. Применение антитела против амилоида-бета при глазных заболеваниях
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EA028356B1 (ru) 2007-12-28 2017-11-30 Протена Байосайенсиз Лимитед Лечение и профилактика амилоидоза
EP2106802A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-07 SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. Modified peptides as synthetic vaccines in amyloid-associated disease
AT506819B1 (de) * 2008-06-12 2011-06-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit
AT506820B1 (de) 2008-06-12 2011-07-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzine gegen alzheimer-krankheit
EP2145898A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-20 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
CA2746778C (en) 2008-12-19 2019-04-23 University Of Zurich Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
US8614297B2 (en) 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
AU2010221418B2 (en) 2009-03-02 2015-06-04 Dignity Health Diagnostic devices and methods of use
CA2772488C (en) 2009-09-11 2018-04-17 Probiodrug Ag Heterocyclic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
UY33253A (es) 2010-03-03 2011-09-30 Boehringer Ingelheim Int Polipéptidos de unión a a-beta
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
NZ602312A (en) 2010-03-10 2014-02-28 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
JP5945532B2 (ja) 2010-04-21 2016-07-05 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
WO2012055933A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Ac Immune S.A. Liposome-based construct comprising a peptide modified through hydrophobic moieties
DK2646462T3 (en) * 2010-11-29 2017-07-03 Akershus Univ METHODS AND COMPOSITIONS FOR MONITORING PHAGOCYTIC ACTIVITY
EP2686313B1 (en) 2011-03-16 2016-02-03 Probiodrug AG Benzimidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
US9771617B2 (en) 2011-06-27 2017-09-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Microrna biomarkers indicative of alzheimer's disease
US9926353B2 (en) 2011-07-19 2018-03-27 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
US8906382B2 (en) 2011-07-19 2014-12-09 New York University Method for treating amyloid disease
GB201113570D0 (en) 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CN107880123A (zh) * 2011-10-28 2018-04-06 普罗典娜生物科学有限公司 识别α‑突触核蛋白的人源化抗体
CA2862999A1 (en) 2012-01-11 2013-07-18 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific antibody fragments for neurological disease proteins and methods of use
MX366972B (es) * 2012-01-20 2019-08-01 Ananth Annapragada Metodos y composiciones para caracterizar imagenes medicas en forma objetiva.
JP2015526409A (ja) * 2012-07-03 2015-09-10 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー Ｃ−末端及び中心エピトープａ−ベータ抗体
EP3320914B1 (en) * 2012-09-10 2020-12-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science T-helper 1 adjuvant for treating amyotrophic lateral sclerosis
CA2902026C (en) 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
US9102752B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
EP2873680A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligopeptide and methods for producing conjugates thereof
EP2873679A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Camelid single-domain antibody directed against amyloid bêta and methods for producing conjugates thereof
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
ES2953381T3 (es) * 2014-04-29 2023-11-13 Advantage Therapeutics Inc Tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer (AD)
CN104122400B (zh) * 2014-07-01 2016-03-02 上海依科赛生物制品有限公司 一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途
AU2015286824A1 (en) * 2014-07-07 2017-02-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Immunogenic products based on mutein amyloid SS (ASS) amino acid sequences and uses thereof
JO3537B1 (ar) 2014-07-10 2020-07-05 Bioarctic Neuroscience Ab أجسام مضادة لييفية أولية لاميلويد بيتا الببتيد ab المحسنة
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
IL302486A (en) 2015-06-24 2023-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114057885A (zh) 2015-10-02 2022-02-18 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
CN108350053A (zh) * 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β表位及其抗体
JP7448174B2 (ja) 2015-11-09 2024-03-12 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータ中間領域エピトープおよびそれに対する立体配座選択的抗体
US10772969B2 (en) 2015-11-09 2020-09-15 The University Of British Columbia N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
US10752679B2 (en) 2016-05-02 2020-08-25 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
AU2017299858B2 (en) 2016-07-18 2024-07-25 Promis Neurosciences, Inc. Antibodies to Amyloid beta
CN110352252B (zh) * 2016-09-22 2024-06-25 威廉马歇莱思大学 用于复杂序列捕获和分析的分子杂交探针
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
MX2019013045A (es) 2017-05-02 2020-02-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
US12286469B2 (en) 2017-07-18 2025-04-29 The University Of British Columbia Humanized antibodies binding to amyloid-beta (A-beta)
KR20250053967A (ko) 2017-08-22 2025-04-22 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 항-베타 아밀로이드 항체를 함유하는 약제학적 조성물
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
UA129124C2 (uk) 2018-11-08 2025-01-22 Протена Біосайєнсіс Лімітед Антитіла, що розпізнають тау
AU2020231366A1 (en) 2019-03-03 2021-08-12 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2021055670A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Avx Corporation Somatic cell-based electrical biosensor
WO2025032070A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-a-beta protein antibodies, methods and uses thereof

Family Cites Families (364)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE878999A (fr) * 1979-09-26 1980-03-26 Herstal Sa Canon composite et procede pour sa fabrication
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5158769A (en) 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5417986A (en) 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4713366A (en) 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5278049A (en) 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US4879213A (en) 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4912206A (en) 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
JPS63245689A (ja) * 1987-03-31 1988-10-12 Suntory Ltd ヒトアミロイド関連蛋白モノクロ−ナル抗体
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5641474A (en) 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5869054A (en) 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5571500A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5645820A (en) 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5571499A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5089603A (en) 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
WO1990005142A1 (en) 1988-11-10 1990-05-17 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Polypeptides
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
US5227159A (en) * 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991016628A1 (en) 1990-04-24 1991-10-31 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
CA2081482C (en) 1990-04-27 2000-11-21 Ellis L. Kline Method and composition for treatment of central nervous system disease states associated with abnormal amyloid beta protein molecular organization
GB9009548D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
AU646877B2 (en) 1990-06-15 1994-03-10 Scios Nova Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
WO1991019795A1 (en) 1990-06-19 1991-12-26 Immuvax Nonpathogenic variant virus
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5780587A (en) 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US6506728B2 (en) 1990-09-25 2003-01-14 Genentech, Inc. Methods using a novel neurotrophic factor, NT-4
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
GB9023352D0 (en) 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
JP3510244B2 (ja) 1991-01-21 2004-03-22 エラン ファーマシューティカルス，インコーポレイテッド アルツハイマー病に関するテストおよびモデル
DE69231232T2 (de) 1991-03-01 2001-01-04 Merial, Lyon Verfahren zur Immunoneutralisierung von nichtkastrierten männlichen Haustieren gegen LMRH und Peptide dafür
US5192753A (en) 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
CA2086831C (en) 1991-05-08 1999-03-16 Reinhard Gluck Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
ES2097925T3 (es) 1991-09-18 1997-04-16 Affymax Tech Nv Metodo para sintetizar diversas colecciones de oligomeros.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5679348A (en) 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
EP0911036A3 (en) 1992-02-11 2001-05-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5441870A (en) 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5851787A (en) 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
ES2142346T3 (es) 1992-06-18 2000-04-16 Harvard College Adn, polipeptido, celula, composicion y vacunas contra la toxina de la difteria.
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5766846A (en) 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
NZ255256A (en) 1992-08-27 1997-02-24 Deakin Res Ltd Synthetic peptide antigen analogues with retro, inverso or retro-inverso modification, their use and antibodies against them
US5958883A (en) 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
PT665897E (pt) 1992-10-01 2003-11-28 Trustees Of Columbia U In The Bibliotecas quimicas combinatorias complexas codificadas com etiquetas
WO1994009364A1 (en) 1992-10-13 1994-04-28 Duke University Method of inhibiting binding of amyloid precursor protein to beta-amyloid protein
PT667959E (pt) 1992-10-26 2003-12-31 Lilly Co Eli Metodos para identificar inibidores da producao do peptido beta-amiloide
US5605811A (en) 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US5972336A (en) 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
AU685776B2 (en) 1993-01-22 1998-01-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Ganglioside-KLH conjugate vaccines with QS-21
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
US5750349A (en) 1993-01-25 1998-05-12 Takeda Chemical Industries Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
US5358708A (en) 1993-01-29 1994-10-25 Schering Corporation Stabilization of protein formulations
US5472693A (en) 1993-02-16 1995-12-05 The Dow Chemical Company Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
CA2115900A1 (en) * 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
EP0689551B1 (en) 1993-03-17 2008-02-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
ATE270111T1 (de) 1993-03-18 2004-07-15 Cytimmune Sciences Inc Zusammensetzung und methode zur reduktion der toxizität von biologisch-aktiven faktoren
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
AU676340B2 (en) 1993-05-25 1997-03-06 Wyeth Holdings Corporation Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
DK0700445T3 (da) 1993-06-04 2002-05-13 Whitehead Biomedical Inst Stressproteiner og anvendelser deraf
US5464823A (en) 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
CA2146667A1 (en) 1993-08-18 1995-02-23 Adolf Hoess Lipopolysaccharide-binding and neutralizing peptides
JPH09501936A (ja) 1993-08-26 1997-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組成物および装置
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
PL180125B1 (pl) 1993-09-07 2000-12-29 Smithkline Beecham Corp Bialko fuzyjne o swoistosci wiazania przeciwko ludzkiej IL-4, PL PL PL PL PL PL
US5652334A (en) 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
DK0735893T3 (da) 1993-09-14 2009-03-09 Pharmexa Inc PAN DR-bindende peptider til styrkelse af immunsvaret
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
CA2172507C (en) 1993-10-22 2008-12-02 Jeffrey L. Cleland Methods and compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines
AU703472B2 (en) 1993-11-02 1999-03-25 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
US5877399A (en) 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
EP0742831B1 (en) 1994-01-27 2004-09-29 The Regents Of The University Of Minnesota Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease
US5935927A (en) 1994-02-03 1999-08-10 The Picower Institute For Medical Research Compositions and methods for stimulating amyloid removal in amyloidogenic diseases using advanced glycosylation endproducts
AUPM411994A0 (en) 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6270757B1 (en) 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
DE69521700T2 (de) * 1994-05-25 2001-10-25 John Mcmichael Mittel und methoden zur behandlung von plaque-krankheiten
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6417178B1 (en) 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
EP0769963A4 (en) 1994-07-27 1999-07-28 Commw Scient Ind Res Org POLYEPITOPE VACCINES
CA2200097A1 (en) 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the mc3 anti-ba46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
US5872005A (en) 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
US6114133A (en) 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
ATE216590T1 (de) 1995-02-06 2002-05-15 Genetics Inst Arzneimittelformulierungen für il-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
ES2175083T3 (es) 1995-03-14 2002-11-16 Praecis Pharm Inc Moduladores de la agregacion de amiloides.
US6303567B1 (en) 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5817626A (en) 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
US5854215A (en) 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US5928913A (en) 1995-03-23 1999-07-27 Efstathiou; Stacey Vectors for gene delivery
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69633175T2 (de) 1995-05-23 2005-08-11 Morphosys Ag Multimere proteine
US5948763A (en) 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
US5910427A (en) 1995-06-22 1999-06-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigen non-specific glycosylation inhibiting factor derivatives
SI0750907T1 (en) 1995-06-30 2002-08-31 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
WO1997003192A2 (en) 1995-07-07 1997-01-30 Darwin Molecular Corporation Chromosome 1 gene and gene products related to alzheimer's disease
AUPN443995A0 (en) 1995-07-27 1995-08-17 Csl Limited Papillomavirus polyprotein
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
AU6898996A (en) 1995-08-21 1997-03-12 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
EP1416280A3 (en) 1995-09-14 2005-08-10 The Regents of the University of California Antibodies specific for native PrPsc
US5731284A (en) 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5985242A (en) 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
EP1281718A3 (en) 1995-11-10 2005-01-19 ELAN CORPORATION, Plc Peptides which enhance transport across tissues
WO1997018855A1 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Eduard Naumovich Lerner Device for enhanced delivery of biologically active substances and compounds in an organism
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) * 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
US5770700A (en) 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
JP2000505306A (ja) 1996-02-26 2000-05-09 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト ２つまたはそれ以上の相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列の新規同定方法
US6150091A (en) 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
CA2250041A1 (en) 1996-03-29 1997-10-09 University Of Otago Parapoxvirus vectors
EP0954324A4 (en) 1996-04-03 2000-11-02 Anergen Inc CYCLIC PEPTID VACCINES FOR DIABETES TREATMENT AND PREVENTION
EP0904365A1 (en) 1996-04-19 1999-03-31 The Government of the United States Of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Antigenically reactive regions of the hepatitis-a virus polyprotein
US6284533B1 (en) 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
WO1998002462A1 (en) 1996-07-16 1998-01-22 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
JP2000516090A (ja) 1996-07-26 2000-12-05 スローン―ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 遺伝子的免疫化のための方法と試薬
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
JP2001500852A (ja) 1996-08-27 2001-01-23 プレーシス ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド Ｄ―アミノ酸を含むβ―アミロイドペプチド凝集のモジュレーター
US6057367A (en) 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
US6022859A (en) 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US6218506B1 (en) 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DK0966447T3 (da) 1997-03-03 2003-06-23 Boehringer Ingelheim Pharma Anvendelige små molekyler til behandling af betændelsessygdomme
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
ATE441432T1 (de) 1997-03-10 2009-09-15 Ottawa Hospital Res Inst Verwendung von nicht-methyliertem cpg dinukleotid in kombination mit aluminium als adjuvantien
US20020086847A1 (en) 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US8173127B2 (en) 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
CA2286305A1 (en) * 1997-04-09 1998-10-15 Mindset Ltd. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, dna encoding and methods of use thereof
US6787319B2 (en) 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
DE69838294T2 (de) 1997-05-20 2009-08-13 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten
JP3919235B2 (ja) 1997-06-13 2007-05-23 ジェネンテク，インコーポレイテッド 抗体製剤
WO1999000150A2 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Regents Of The University Of California Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
DE69842048D1 (de) 1997-08-01 2011-01-27 Max Planck Gesellschaft Zusammensetzung und verfahren zum nachweis von krankheiten in zusammenhang mit der bildung von amyloid-ähnlichen fibrillen oder protein-aggregaten
JP2002501721A (ja) 1997-08-01 2002-01-22 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ
CA2654522C (en) 1997-08-29 2014-01-28 Antigenics Inc. Compositions comprising the adjuvant qs-21 and polysorbate or cyclodextrin as exipient
US6175057B1 (en) 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US20010016053A1 (en) * 1997-10-10 2001-08-23 Monte A. Dickson Multi-spectral imaging sensor
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2312475C (en) 1997-12-03 2010-08-03 Brigham And Women's Hospital Method of suppressing .beta.-amyloid-related changes in alzheimer's disease
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
EP1073464B1 (en) 1998-04-28 2004-10-06 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6727349B1 (en) 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6126967A (en) * 1998-09-03 2000-10-03 Ascent Pediatrics Extended release acetaminophen particles
DE69918146T2 (de) 1998-10-05 2005-07-07 Pharmexa A/S Verfahren zur therapeutischen impfung
EP1150688A4 (en) 1998-10-19 2004-06-16 Yeda Res & Dev TREATMENT OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS BY NEGATIVE REGULATION OF THE AUTO-IMMUNE RESPONSE TO AUTOANTIGENS
US7112661B1 (en) 1998-10-30 2006-09-26 The Research Foundation Of State University Of New York Variable heavy chain and variable light chain regions of antibodies to human platelet glycoprotein Ib alpha
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
CN101362518A (zh) 1999-01-19 2009-02-11 法玛西雅厄普约翰美国公司 γ-照射消毒的聚乙烯包装
CA2361124A1 (en) 1999-01-22 2000-07-27 Matthew John During Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
US7282570B2 (en) 1999-04-20 2007-10-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2388092A1 (en) 1999-05-05 2000-11-16 Neurochem, Inc. Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AR024558A1 (es) 1999-06-01 2002-10-16 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
EP1409654B1 (en) 1999-06-16 2008-08-20 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of beta-amyloid levels in vivo
CA2379354A1 (en) 1999-07-15 2001-01-25 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-115
JP4796725B2 (ja) 1999-08-04 2011-10-19 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア アミロイドβタンパク質（球状アセンブリー及びその使用）
CA2349434A1 (en) 1999-09-03 2001-03-15 Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
BR0016022A (pt) 1999-11-29 2002-08-06 Neurochem Inc Vacina para a prevenção e tratamento da doença de alzheimer e doenças relacionadas ao amilóide
IL149976A0 (en) 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
US6399314B1 (en) 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
KR20080017471A (ko) 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
ME00183B (me) 2000-02-21 2011-02-10 Pharmexa As Novi postupak za deregulaciju amiloida
DE1257584T1 (de) 2000-02-24 2003-05-28 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper, die amyloid beta peptid demarkieren
CA2404237C (en) 2000-04-05 2010-01-26 University Of Tennessee Research Corporation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
ES2309064T3 (es) 2000-04-13 2008-12-16 Corixa Corporation Composiciones inmunoestimulantes que comprenden un fosfato de aminoalquil glucosaminida y qs-21.
KR100360985B1 (ko) 2000-04-26 2002-11-18 주식회사 동진쎄미켐 레지스트 스트리퍼 조성물
AU7487301A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Univ New York Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
US20020009445A1 (en) 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20030092145A1 (en) 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
US7067133B2 (en) 2000-09-06 2006-06-27 Aventis Pharma S.A. Methods and compositions for diseases associated with amyloidosis
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
US7668586B2 (en) 2000-11-02 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostic detection and imaging of a neurodegenerative disease
WO2002042462A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Praecis Pharmaceuticals Inc. Therapeutic agents and methods of use thereof for treating an amyloidogenic disease
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
AU2002246734A1 (en) 2000-12-27 2002-08-12 University Of Texas Health Science Center Houston Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
FI20002897L (fi) * 2000-12-29 2002-06-30 Nokia Corp Elektroninen laite ja välineet irrotettavan yksikön varmistamiseksi toiminta-asentoon
US20020160394A1 (en) 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
DE60121729T2 (de) 2001-04-19 2007-11-29 Dr. Hermann Schätzl Prion Proteindimere für Impfungen
ATE420114T1 (de) 2001-04-30 2009-01-15 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper die das beta-amyloid peptid erkennen& x9;
DE60229051D1 (de) 2001-04-30 2008-11-06 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
AU2002345843A1 (en) 2001-06-22 2003-01-08 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
CA2454587C (en) 2001-07-25 2012-11-13 Protein Design Labs, Inc. Stable lyophilized pharmaceutical formulation of igg antibodies
US20030135035A1 (en) 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
JP2005503789A (ja) 2001-08-17 2005-02-10 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗Ａβ抗体
US20040241164A1 (en) 2001-08-17 2004-12-02 Bales Kelly Renee Use of antibodies having high affinity for soluble ab to treat conditions and diseases related to ass
WO2003015691A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
US7002711B2 (en) * 2001-08-31 2006-02-21 Kabushiki Kaisha Toshiba Image reading device and method
US7781413B2 (en) 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
IL161677A0 (en) 2001-11-08 2004-09-27 Protein Design Labs Stable liquid pharmaceutical formulation of igg antibodies
CA2466841A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
US20050227941A1 (en) 2001-12-17 2005-10-13 Karen Duff Sequestration of ass in the periphery in the absence of immunomodulating agent as a therapeutic approach for the treatment or prevention of beta-amyloid related diseases
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
EP1485130A4 (en) 2002-02-21 2006-11-22 Univ Duke REAGENTS AND THERAPEUTIC METHODS OF AUTOIMMUNE DISEASES
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
AU2003250110C1 (en) 2002-07-19 2008-05-29 Novartis Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
CA2487528A1 (en) 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with beta-amyloid formation and/or aggregation
WO2004031400A2 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Northwestern University Amyloid beta-derived diffusible ligands (addls), addl-surrogates, addl-binding molecules, and uses thereof
US20060019850A1 (en) 2002-10-31 2006-01-26 Korzenski Michael B Removal of particle contamination on a patterned silicon/silicon dioxide using dense fluid/chemical formulations
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
US20040191243A1 (en) 2002-12-13 2004-09-30 Bei Chen System and method for stabilizing antibodies with histidine
US6787129B1 (en) 2003-01-13 2004-09-07 Zenitech Llc Castor polyester as gloss agents in anionic systems
UA87453C2 (ru) 2003-02-01 2009-07-27 Вайет Применения фрагмента ав для лечения болезни альцгеймера
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
DK2335725T3 (en) 2003-04-04 2017-01-23 Genentech Inc Highly concentrated antibody and protein formulations
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20060182321A1 (en) 2003-07-07 2006-08-17 Agency For Science, Technology And Research Method and apparatus for extracting third ventricle information
WO2005014041A2 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
WO2005026211A2 (en) 2003-09-05 2005-03-24 Eli Lilly And Company Anti-ghrelin antibodies
CA2445743A1 (en) 2003-10-08 2005-04-08 The University Of British Columbia Methods for modulating neuronal responses
MY144231A (en) 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
KR101157694B1 (ko) 2003-12-17 2012-06-20 와이어쓰 엘엘씨 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
SG190665A1 (en) 2004-07-30 2013-06-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EP1797182A2 (en) 2004-10-05 2007-06-20 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Methods and compositions for improving recombinant protein production
US20060160161A1 (en) 2004-10-26 2006-07-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
WO2006066089A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
WO2006066118A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Contextual fear test for predicting efficacy of alzheimer immunotherapeutic treatment
TW200636066A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TW200635608A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
US20060240486A1 (en) 2004-12-15 2006-10-26 Johnson-Wood Kelly L Immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
AU2006207901A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Wyeth Stabilized liquid polypeptide formulations
CN101213211A (zh) 2005-06-17 2008-07-02 惠氏公司 纯化含Fc区蛋白的方法
FR2887558B1 (fr) 2005-06-28 2007-08-17 Aubert & Duval Soc Par Actions Composition d'acier inoxydable martensitique, procede de fabrication d'une piece mecanique a partir de cet acier et piece ainsi obtenue
AU2006270084B2 (en) 2005-07-18 2011-08-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Spiropiperidine beta-secretase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease
WO2010044803A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
WO2008131298A2 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Elan Pharma International Limited Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EA028356B1 (ru) * 2007-12-28 2017-11-30 Протена Байосайенсиз Лимитед Лечение и профилактика амилоидоза

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4185612A4 (en) * 2020-07-23 2024-12-25 Othair Prothena Limited Anti-abeta antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EA200101251A1 (ru) 2002-06-27
EA006630B1 (ru) 2006-02-24
UA81215C2 (en) 2007-12-25
BG65882B1 (bg) 2010-04-30
ZA200109487B (en) 2003-02-17
CN1814287A (zh) 2006-08-09
HK1045116B (en) 2009-12-31
JP2007269804A (ja) 2007-10-18
NO20015773L (no) 2002-01-25
TWI263503B (en) 2006-10-11
JP2003517461A (ja) 2003-05-27
NO20015773D0 (no) 2001-11-27
US20140341911A1 (en) 2014-11-20
NZ515403A (en) 2004-05-28
WO2000072880A2 (en) 2000-12-07
SK16982001A3 (sk) 2002-11-06
US20040219146A1 (en) 2004-11-04
GB0417096D0 (en) 2004-09-01
CN1359301A (zh) 2002-07-17
JP5580504B2 (ja) 2014-08-27
AU5303100A (en) 2000-12-18
US20040265308A1 (en) 2004-12-30
PL357182A1 (pl) 2004-07-26
IL146435A0 (en) 2002-07-25
EP2305302A3 (en) 2012-01-04
EP2305302B1 (en) 2017-12-20
CA2370311C (en) 2014-12-02
GB2368794B (en) 2004-10-20
CZ304876B6 (cs) 2014-12-29
EE05671B1 (et) 2013-08-15
AR024074A1 (es) 2002-09-04
DE10084643T1 (de) 2002-07-11
NO337301B1 (no) 2016-03-07
GB2368794A (en) 2002-05-15
IS6154A (is) 2001-11-09
KR100961485B1 (ko) 2010-06-08
HRP20090510A2 (hr) 2009-12-31
HK1045116A1 (en) 2002-11-15
KR20020038585A (ko) 2002-05-23
EP2108376A3 (en) 2012-04-18
BG66083B1 (bg) 2011-03-31
EP1185298A2 (en) 2002-03-13
US7964192B1 (en) 2011-06-21
KR101058482B1 (ko) 2011-08-24
KR20090068386A (ko) 2009-06-26
HRP20010877A2 (en) 2005-04-30
PE20010191A1 (es) 2001-02-14
CN1359301B (zh) 2012-10-10
TR200103447T2 (tr) 2002-04-22
US20090297511A1 (en) 2009-12-03
EP1185298B1 (en) 2009-06-24
EP2108376B1 (en) 2017-03-01
SG147273A1 (en) 2008-11-28
DE60042451D1 (de) 2009-08-06
IL187526A0 (en) 2008-03-20
HUP0201250A2 (en) 2002-08-28
CZ20013824A3 (cs) 2002-11-13
NO20100264L (no) 2002-01-25
NO340768B1 (no) 2017-06-19
UY26182A1 (es) 2000-12-29
BG106241A (bg) 2002-08-30
TR200202231T2 (tr) 2002-11-21
US20110306756A1 (en) 2011-12-15
CA2370311A1 (en) 2000-12-07
BR0011000A (pt) 2002-02-19
CO5170495A1 (es) 2002-06-27
JP5039432B2 (ja) 2012-10-03
MY132784A (en) 2007-10-31
BG110407A (bg) 2009-11-30
WO2000072880A3 (en) 2001-05-31
CL2010000018A1 (es) 2010-06-04
SG143032A1 (en) 2008-06-27
HUP0201250A3 (en) 2005-06-28
MXPA01011621A (es) 2005-06-22
NO20160043A1 (no) 2002-01-25
HRP20010877B1 (hr) 2011-02-28
IL187526A (en) 2013-08-29
HU230550B1 (hu) 2017-02-28
EA021614B1 (ru) 2015-07-30
ATE434444T1 (de) 2009-07-15
EP2305302A2 (en) 2011-04-06
EE200100626A (et) 2003-02-17
EA200501560A1 (ru) 2006-04-28
EP2108376A2 (en) 2009-10-14
SG140456A1 (en) 2008-03-28
ES2624908T3 (es) 2017-07-18
SK287513B6 (sk) 2010-12-07
GB0130969D0 (en) 2002-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6743427B1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6787637B1 (en) N-Terminal amyloid-β antibodies
EP2305302B1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) Passive immunization treatment of Alzheimer&#39;s disease
US8034348B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059591A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) Treatment of amyloidogenic disease
HK1137655A (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2005200811A1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
HK1155366B (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
HK1137655B (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
HK1155366A (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease