Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Fragment Aβ vázaný k nosičovému peptidu, farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidními deposity Aβ v mozku pacienta jej obsahující a jeho použití
CZ304876B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Dale B. Schenk Frederique Bard Nicki J. Vasquez Ted Yednock
Worldwide applications
1999
US
2000
PE
AR
TW
TR
CN
SG
EA
TR
EA
MX
WO
HR
HK
CZ
BR
PL
EP
SK
EP
EE
MY
SG
KR
CA
SG
NZ
DE
AU
UA
AT
JP
HR
EP
CN
ES
DE
HU
GB
CO
IL
KR
UY
2001
IS
ZA
NO
BG
2004
US
US
GB
2007
JP
IL
2008
US
2009
BG
2010
CL
NO
US
2014
US
2016
NO
Application CZ2001-3824A events
2002-11-13
2014-12-29
Description
translated from
Vynález se týká fragmentu Αβ vázaného k nosičo vému peptidu, farmaceutického prostředku pro prevenci nebo léčení onemocnění spojeného s amyloidnfmi deposity Αβ v -mozku pacient». Vynález spadá do oblasti iniuuobgíe a medicíny,
Alzhetrnerova nemoc m progrcvnni onemocnění, které vede k senilní demencí (v obecném případě se popisuje v pubbkaci Seikoe, TINS ib, 4íH-4d9 (1993), Hurdy et aí.. W O 02/: 3 069. Selkoe, JL NeuropathoL Exp. Němot 53, -438-447 (1994), Ouff eí at. Nátuře 373, 476-477 (1995), Games et at. Nátuře 373, 523 <199$)). Obecně řečeno toto onemocnění spadá, do dvou kategorii: vznik onemocnění v pozdějším veku (nad 65 let) a časný vnik onemocněný ke kterému dochází před obdobím semlity, to znamená mezí 35 a 60 lety. U obou typu onemocnění je patologie stejná, -afe abnormality majs tendenci být závažnější v případech začínajících v ranném věku. ..Onemocnění se charakterizuje alespoň dvěma typy léxí v mozku, seniteími plaky » ncurofrbfttórními uzly. Senilní plakyjsou oblasti desorgauízovaných hsurofdtk kdy jejich průměr dosahuje až 150 pm, s exfrahuuěčuýmí arayloidrňtm deposity v centru, které jsou. viditelné mikroskopickou analýzou sekcí mozkové tkáně, Nenroíthrilarní uzle jsou vmtrohuněěné depozity snikroIutoxte spojené $ proteinem m», jenž i-b<ahujc dvě viatora,které omotávají každý drahý v páru.
Základní část plakc je peptid nazvaný Αβ nebo β-amytoidni peptid, Peptid Apjc vnitřní fragment aminokyselin 39-43 prsknrzorověho proteinu nazvaného amyioidní praknrzorový protein (APP). Několik mutací APP koreluje s přítomností Alzheimerovy nemoci (popisuje se v publikaci Goaíe et al., Nátuře .349, /04) (1991) valin Αβ'5 na izoleuem), Chastief Harl&n et &a.. Nátuře íš ý 844 (1991)) (váhu ! na ulycíns, Muncií et aí. %-tenCť 2o4. 97 199:) (váhu na fcnviaU nin), Mullan et al., Nátuře Genet. í, 345 i :992) i dvojitá mutace měniči iyzirf^-methíouin''' na asparagin - ieucitv^'). Uvažuje se, že takové mutace způsobují Alzhehnerovu nemoc zvýšeným ucho změněným zpracováním APP na Αβ, zvláště zpracování APP na zvýšené množství dlouhé formy Αβ fto znamená, Αβ: -42 a ,Αβ'ί-4 3) Ukazuje se, že mutace v jiných genech, jako jsou geny prazenilinu PSI o PS.) nepřímo ovl i v stojí APP za vzniku zvýšeného množství dlouhé fonny Αβ (popisuje se v publikaci Hardy, T1NS20, 154 (199/)). Tato pozorováni ukazuje, že Αβ a, zsjaště ;eho dh-uha forma te u kizhmmerovv nemoct kauza» m element
M.C. Michael s dokumentu LP 526 511 popisuje aplikaci homeopatlckých dávek t které jsou rovné nebo nižší než hodnota 10 *’ mgkism) Αβ pacientům s AD. U typického člověka, který má přibližně 5 litru plazmy, se očekává, že herní limit této dávky vytvoří koncentraci ne vyšší než 2 pg/ml. Normálu: koncentrace Λβ v lidské plazmě je v typickém případě v rozmez! 50 až 200 pg/ml (popisuje se v publikaci Setiberí et a!., Nsture 359. 325-327 {1992 )i. Protože v dokumentu EP 526 Sl 1 se popisuje dávka, která těžko změní množství endogenního cirkulujícil» Αβ n protože v dokumentu EP 526 511 se nedoporučuje použití adjuvans, jako inmnosíimulanttí a zdá se nepravděpodobně. že dojde k jakémukoliv terapeutickému ttomku.
Naopak vynález popisuje léčbu Alzheimerovi nemoci a jiného amyloidogetmího onemocnění ,uniknu ímgnuutu V nebo protilátky kjiSfrm epstoputn Αβ v ptu .vmtov - zr podmínek, které vyvolávají a pacienta pozitivní imunitní odezvu. Vynález dále popisuje dlouhotrvající potřebu terapeutických režimu pro prevencí nebes zmírněni neuropatelogie a u některých pacientu poruchy poznáni spojené s Alzheimerovou nemocí.
CZ 304876 8$
Tefitó 'dokument se vztahuje kdákumedtu WO 99/27 944. podaném 30,11, 1 998, US 60/067 740 jxxbb 2. 12, 1997, US 69/080 979, podaném 7, 4. 1998 a US 09/201 430 podaném 30. 11.
Vynález se týká fragmentu Αβ vázaného k nosmovému peptidu pro použití k vyvolání ímuhitoi odpovědi proti Αβ, a tím pro prevenci nebo tečeni oněmne něm' spojeného s atnyloídnimí deposity i o Αβ v mozku pacienta, přičemž fragment Αβ. sestává z
i) ,Α.βΙ-7 majícího aminokyselinovou sekvencí DAEFRMD, i i) Afi3-7 majícího aminokysel inovou sekvencí FFRHD, nebo lis) muhintéru í) nebo ii),
Sí Taková onemocněni zahrnuji Áizheimerovu nemoc, Downův syndrom a poruchy poznáváni, Později se tnohon vyskytovat snebo bez jiných charakteristik atnyloidogeaního onemocněni. Použití, podle vynálezu tak zahrnuje aplikací účinné dávky protilátky, která se specificky váže ua komponent amyíoidntho depozitu n pacienta. Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou zvláště použitelné při prevenci neb>« léčbě Alzbeimeroví nemoci u lidských pacientu. Farmaceu20 tické prostředky umožňují aplikaci uéhmc dávky protilátky, která se váže na Αβ, Pomoci farmaeeutíckvho prostředku. se aplikuje účinná dávka protilátky, která se specificky váže na epitop $ ohlasu zpytků 1 až Ul kd Někdy se pn-íikitka specifivky váze na epitop v otůaso zbytků ;
Αβ, někdy se protilátka specificky váže na epitop v oblastí zbytků 1 až 5 Αβ, někdy se protilátka specificky váže na epitop v oblasti zbytků i až 7 Αβ, někdy se protilátka specificky váže na epitop v oblasti zbytků 3 už 7 Λβ, někdy se protilátka specificky váže ha epitop v oblasti zbytků 1 až 3 Αβ a někdy sc. protilátka ^.viluAs sáže na epitop v oblasti zbytků 1 až 4Αβ. Někdy se protilátka váže na epitop ebsahmsci solný N teimínúím zbytek Αβ. Někdy se protilátka váže nu epitop v oblastí ?.hy tků i až 10 Αβ. kde zbytek 1 a nebí zbytek 7 Αβ je kyselina aspartová. Někdy se protilátka specificky váže «a peptid Λβ. aniž se váže na amyloidaí prekurzorový protein plné délky ί APP). Někdy je izotyp protilátky lidský IgGI.
Někdy se protilátka váže u pacientu na uiryloidni depozit a vyvolává jasnou odezvu proti smykůdníma depozitu. Například taková zřejmá odezva může být ovlivněna fsgocytdzou zprostředkovanou receptorem Fc,
Farmaceutické prostředky mohou být použity a pacientů, kteří jsou bez. symptomů i se symptomy onemocněni. Proti látka používaná v takových prostředcích může být lidská, humanizovaná, chimérická nebo nelidská protilátka-a může být mrmokkmáirn nebo potyk tonální. V prostředcích se protilátka připravuje z člověka imunizovaného peptídeiu Αβ, kdy člověkem může být pacient léčený protilátkou.
Někdy je protilátka, aplikovaná s farmaceutickým nosičem, jako farmaceutický prostředek. Někdy je protilátka upilkoyauá v dávce 0,0001 až i 00 mg/kg, upřednostňuje se alespoň 1 mgzkg protilátky mi tělesnou hmotnost. U některých problémů se protilátka aplikuje více násobné dávce po
4í dlouhou dobu. například alespoň 6 měsicu, l? některých problémů sc protilátka aplikuje jako prostředek $ postupným uvolňováním. Protilátka se může aplikovat například hmaperiioneáiué, orálně, snbkutánpč, mírakramálné,, inframaskalántč, topicky, inítanasáhtě nebo iftfraveuózně.
V některých merodudi »e protilátku aplikovala aplikaci póly nukleotidu, kterv u pacientu kóduje so alespoň leden prolilútkový řetezec. Potí nukleotid se csprhmijc, přičemž u pacientu i-zrnka protilaikovy iciězec. Poty nukleotid kóduje těžký a Ichks řetězec protilátky s>oly nukleotid se exprsmuje, přičemž n pacienta \zmká těžký lebky řetezec V některých metodách ro v tu ví pa>.seuta monitorovalo množství aplikované protilátky.
- 2 CZ 304876 86
Vynález dále popisuje íarmacetitické prostředky pro prevencí nebo léčbu onemocnění spojeného $ amyloidními depozity Αβ v mozku pacienta. Farmaceutické prostředky se mohou použit například pří léčbě Alzheimerovy nejnpei nebo Downova syndromu nebo poruch poznávání, lakové farmaceutické prostředky zahrnují aplikaci Αβ nebo jeho analogů, které vyvolávají írnuttogeunf odezvu proti jistým ep.ítopnm. v Αβ. Některé metody zahrnují aplikaci pacientovi účinné dávky potspeptfdu který obsahům N-toíromalm togmem alespoň zbytku 1 až s -\β Prsnt ?b)tek Afi >c N--termináini zbytek fxrlypeptidn, kde polypeptid je volný €-Terminální segment Αβ. Některé metody zahrnuji aplikací pacientovi účinné dávky polypeptidu, který obsahuje N-tormmáhií h> segment Αβ» segment,, který začíná zbytkem 1 až 3 Αβ a končící zbytky 7 až Π Αβ, Některé metody zahrnují aplikací pacientovi účinné dávky činidla» která vyvolává. imunogenní odezvu proti N--ternunáfeintn segmentu Αβ Segment obsahuje zbytek I. až 3 Αβ a kouči zbytky 7 až
Αβ, aniž se vyvolává .imunogenní odezva proti epitopu ve zbytcích. 12 až 43 Ap43,
15. V některých shora popsaných metodách N~4erminální segment Αβ je spojen svým C-koucem k hcterolognimn peptidu, V některých shora, uvedených metodách N-tetminální segment Αβ je spojen s N-koncern heieroiogního polypcptidn. V některých shora «vedených metodách Ntermináfoí segment Αβ je spojen svým Na O-kancem k prvnímu a druhému heleroíognimu polypeptidu, V uěktetýeh shora uvedených metodách N-íenninákn segment Αβ je spojen svým N~20' koncem s heteroíogním peptidem a svým C-koticem s alespoň jednou další kopii N-tennmáltdho segmentu, V některých shora popsaných metodách heterolegm polypeptid vyvolává odezvu B~ buněk proti N-terminálnimn segmentu, V některých shora uvedených metodách polypeptid dále obsahuje alespoň jednu další kopií N-termínálního segmentu. V některých shora uvedených metodách polypeptid obsahuje z N~konce k N-konci NMermfeátai segment Αβ» velké množství ss dalších kopii N-mrmínálního segment Αβ a heterulegni aminokyselinový segment. V nekletých shora uvedených metodách NMermínální segment obsahuje ΛβΙ ·7, V některých shora uvede* ných metodách M-ternnníilm segment obsahuje Αβ3-7.
V některých metodách fragment neobsahuje alespoň S aminokyselin C-konce v Αβ43. V někte30 rých metodách fragment obsahuje az 10 kontinuálních aminokyselin z Αβ. Fragmenty se v typickém případě aplikuji v množství vyšším než. 10 mikrogramů v dávce pro jednoho pacienta.
V některých metodách se fragment aplikuje s adjuvans, které zvyšuje imunitní odezvu na peptid Αβ. Adjuvans a fragment se mohou aplikovat v jakémkoliv pořadí nebo společné jako vakcinační ss prostředek. Adjuvans může být například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, MP1?™\ QS-21 (Stunulstion1’5) nebo nekompletní Frenndovo adjuvans.
Vynález dále popisuje farmaceutické prostředky obsahnjíei fragmenty Αβ nebo jejích činidla \v\olávajici imunogenní odezvu na stojné epstopy Αβ, které se popisují shora v tetu, a adjuvans.
-tó Vynalez také popisuje farmaceutické. prostředky obsahující libovolné protilátky popsané shora v textu a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález dále popisuje znúsoby testováni aktivity protilátky při léčbě onemocnění spojené s depozity Αβ v mozkv ocucnte {například Alzheimerova nemoci Takové metody zahrnuji kon45 takt protilátky s polypept <Am, který obsahuje alespoň pét kontinuálních aminokyselin N-terminálniho segment» Αβ, který' začíná zbytkem 1 až 3 Αβ, potypeptide neobsahuje C-tennínální segment Αβ. Pak se stanoví, zda se protilátka specificky váže na polypeptid, přičemž specifické navázáni indikuje, že protilátka je aktivní při léčbě onemocnění.
so Vynález dme popisuje metody testovaní íiktrvny protslmkv prs efrtem biologicko entity spořené s anfigenem. Takové metody zahrnují kombinování biologické entity spojeně s tunigeuem a protilátky a lagocytových buněk nesoncfch receptory Fe v kultivačním médiu. Monitoruje se množství biologické entity' spojené s antigenera, které zůstává v médiu. Redukce muožsni biologické enti·*>
~ Λ ~ fy spojené ? anítgc^efts indikuje. fc protilátka tňá netttrahzačoí aktivitu proti, biologické entitě spojeně s <mugeuem, Aututen $e možné poskytnout jako tkáňový \ zorek nebo v izolované formě, Antigen je možné poskybront jak>' tkáňový vzorek z mozku pacienta f spícího Alzlseimerovey nemoci nebo klen vvk&zu.e Mzhennerevou patolog». Jme \zc-rk\ tkáni, proti ktrnýsu muže b\í tesnwána neutrabzacsu ukíwsfo proíslatks, zahrnuu vzorky U;aně zhoubného Kmeni nemallgm almomú;»' buněčný ju>t nebo tkáňové vzorky obsahuji! abnormální extrabuněčnou matricí.
Vynález popisuje způsoby detekce amyloídmho depozitu u pacienta. Takové metody zahrnují aplikaci protilátky pacientovi, přičemž foto protilátka se zvlášfo váže na epítop v aminokyselinách I až 10 Áp a detekuje přítomnost protilátky v mozku pacienta- V některých metodách se protilátka váže na epítop ve zbytcích 4 až 10 Á0, V některých metodách je protilátka zttacena paramagnetickou značkou a detekuje ae nukleární magnetickou rezonanční tomografií.
Vynález dále popisuje diagnostické kily vhodné pro použiti ve shora popsaných metodách. Takový kit obsahuje protilátko, která se specificky váže na epítop se zbytky 1 a/ 10 Αβ. Některé kdy nesou značku popisující použiti protilátky pro diagnostiku a monitorování Alzbeímerovi nemocí in vivo.
Definice
Termín „.podstatná shora“ znamená, že dvě peptidové sekvence, káv' jsou uspořádány optimálně, například použitím programů GaP nebo BBSTF1T za použiti skmdardm mhy významnosti mezer, sdílí alespoň 6S% shodu sekvencí. Upřednostňuje se aiespóft 80 nebo 90 % shody sekvence, více se upřednostňuje alespoň 95 % shody sekvence nebo více (například 99% sborn sekvence nebo vyšší). Upřednostňují se polohy zbytku, které nejsou shodné a liší se substitucemi aminokyselin.
Při porovnáni sekvencí v typickém případě jedna sekvence působí jako referenční sekvence, se kterou se testovaná sekvence porovnává. Když se použije algoritmus porovnání sekvence, testovaná a referenční sekvence jsou vstupní data, jestli je to nutné, stanoví se subsek veněttí koordináty a navrhnou se programové parametry sekvenčního algoritmu. Algoritmus porovnání sekvence pak vypovím procento shody sekvence v případě testovaných sekvencí vztaženo k referenční sekvenci na základe označených programových parametrů.
Optimální uspořádání sekvencí za účelem porovnání může byt doprovázeno například algoritmem lokální homologie (popisuje se v publikací Smith and Watennan, Adv. Appl. tvknh, 2:482 (198I)}, algoritmem homologíokého uspořádám (popisuje se v publikací Needieman and Wuttsh, J. .Mol. Bíol. 48: 44?> (1970)), vyhledáváním v případě metody podobnosti (popisuje se v publikaci Pearson and Uípman, Proč. ŇatL Acad. Sci, USA 85: 2444 (1988), počítačovou implementaci těchto algoritmu (GAP, BFSTRT, PASTA a T.F.ASTA v softwaru Wisconsín Genetics Software Paekage, Genetics Computer Group, 57S Science Dr.. Madíson, Wl) nebo vizuálně (v obecnět» případě se popisuje v publikaci Ausubel et al,,), Jeden příklad algoritmu, který- je vhodný pro stanoveni procenta sekvenční shody a pro stanovení sekvenční podobnosti je vhodný algoritmus BLAST. který se popisuje v publikaci Altscbui et al., T Mol. Bíol. 215: 403-410 (1990). Software vhodný pro analýzu BI.AS f le veřejně dostupný u instituce National Center for Biotechnology Inlormatíon {hřtprbvwvv.ncbi ninunih.gov·'), V typickém případě standardní parametry programu se mohou použit k porovnání sekvencí, ačkoli je možné také použit parametry klienta. V případě aminokysellriovýcb sekvencí program BLAST používá jako standardní délku slova (W) rovnou třem, pravděpodobnost (E je 10 a skórupei matrici B1..OSUM62 roopisme se v publikací Hunikotí and IlenikolL Proč. Nati. Acad. Sci, USA 89, 10915 11989)1.
Pro účely klasifikace substituci aminokyselin na konzervativní a nekonzervaíwn se aminokyseliny rozdělují následovně: skupina i (hydrofobní postranní řetězce); norleuem, Met, Ala, Vak Leu, ile, Skupina li (neutrální Isydrofilm postranní řetězce): Cys. Ser, Thr. skupina Ul (kyselé postrauCZ 304876 B6 ní řetězce): Asp, Glu, skupina IV (zásadité postrannířetězce): Asn, Gin, His, Lys, Arg, skupina V (zbytky ovlivňující orientaci řetězces: Gly, Pro a skupina VI (aromatické postranní řetězce): Trp, Tyr, Phe. Konzervativní substituce zahrnují substituce mezi aminokysei mánii ve stejně třídě, Nekonzervativní substituce obsahují změny členů jedné z těchto skupin za člena.jiné skupiny.
Terapeutická Činidla podle vynálezu v typickém případě v podstatě neobsahují nežádoucí nečistoty. To znamená, že činidlo je v typickém případě přibližně z 50 % (hmot ./hmot.) cistě, stejné jako je y podstatě bez mterfetgícieh pnVeínů a nečistot. V některéeh případech jsou činidla alespoň přibližně z 80 % (hmpt/hmot.), vfee se upřednostňuje alespoň z 90% nebo přibližně .z 95 % uj C&TOt/bmot.), čistá. Použitím běžného postupu čišíěni protonu se. mohou získat alespoň z 99 % (hmatJhínoL) homogenní peptidy.
Specifické navázáni mezi dvěma entitami znamená -afinitu alespoň 106, 10 ti I0S, ϊδ* M~- nebo
10ίΰ Μ'Λ Freferují se afinity'vyBí než 10* M'\
Termín ..protilátka“ nebo„imunoglokslm^ zahrnuje neporušené protilátky a jejich vazebné fragmenty. V typickém případě fragmenty soutěží s neporušenou protilátkou, ze které se získaly pro spcctikke nava/ání na fiugmeut antigenů zahrnující separované ti/ke rete ve. lebko řetězec Fab, FabT(ab')2. Fabc a Fv, Fragmenty se produkuji metodou ^kombinace DNA nebo enzymatickou ze nebo chemickou separací ?epm ušenývh inmuoglobuhuů. Termín ...proti laika“ také zahrnuje jeden nebo více imauoglobulmmch řetězců, které jsou chemicky konjugovány nebo se exprimují jako
Ihzm proteiny sjtnými ptctěny. 1'enm'n „protilátka“ také zahrnuje hispeeiřfckoa protilátku.
Bispceifkká nebo blhrnkoui protilátka je umělou hybridit! protilátkou, která má dva různé páry těžkého/lehkého řetězce a dvě různá v szebuá místa, Sispecifické protilátky mohou vznikat potíži» íim různých metod, které zahrnujt fúzi hybrldomů nebo spojeni fragmentů Fab’ (popisuje se například v publikací Soňgsivilai and Lachmann. Chrt, Exp. Immunol, 79b 31.5-321 (1990), Kostel» ny et at? X Immunol. 148,1547-1553 (1992)).
APP6 % ΛΡΡ : a APP?7í> odpovídá dlouhým polypeptidům s 995. 751 a 770 aminokyselinovými
3e zbytky kódovanými lidským genem APP (opisuje se v publikaci Kang et nb. Nátuře 325, 773 (1987), Poule et ab, Nátuře 33 L 525 (1988) a Ktíaguchi et aíNátuře 331, 5311 (1988)). Aminokyseliny s lidským amyloidnlm prekurzorovým proteinem (APP) jsou označeny čísly podle sekvence izoformy APP?~0, Tennihy. jako jsou Αβ39, Αβ90., Αβ41, Αβ42 a Αβ43 znamenají peptid Αβ obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 39. I až 40, 1 až 41. I až 42 a 1 až. 43.
3S
Teonín „antigen“-znamená entito, na kterou se protilátka váže specificky.
Termín „epitop“ nebo ..antigenni determinanta znamená místo na antigenů, na které odpovídají buňky B a/nebo T. Epitopy buňky B se mohou tvořit z kontinuálních aminokyselin nebo nekonti40 nuálmeh aminokyselin srovnaných vedle sebe terciárním balením protonu. Epitopy tvořené z kontinuálních jsou v typickém případě vystaveny expozici denaíumčnun rozpouštědlům, zatímco c-pitopy tvořené terciálním balením se v typickém připadá ztrát: ošetřením v denatumčmeh rozpouštědlech. Epitop v typickém případe zahrnuje alespoň 3 a obvy kle v »ce alespoň 5 nebo 8 až 10 aminokyselin v jedinečné prostorové konformaci. Metody stanov upci prostorovou konformaci epifopů zahrnuji například krystalografii pomoci paprsků X a dvou dímenzalní jadernou magnetickou rezonanci (popisuje se například v publikaci Epitop Mapping Protoeois In Methods In .Molecular Biology, Vol. 666, Clenu E. Morris, Ed. (1996)}. Protilátky, které rozeznávají stejný epitop se mohou identifikovat jednoduchým hnunoíestem, který vykazuje schopnost jedné protilátky blokovat navázání jiné protilátky na cílový antigen. T-buňky rozeznávali kontinuální epitoSil py obsahujici přibližně 9 aminokyselin pro buňky CDS nebo přibližně 13 až I5 aminokyselin pro buňky CD4. T buňky, které rozeznávají epitop. sc mohou identifikovat testy to vhrn, které měří prohťeracs zá\ Mou nu anugettu. jak se stanov no začlenémm tib thyntidmem primárních T bunčk při odezvě na epitop (popisuje se v publikaci Burke et aí., b inf. Dis. 170, .1110-19 (1994)} odtuniránim v závislosti na antigenů (test cytotoxicity u lymfoeytů, popisuje se v publikaci
Tigges et aL J. humenci. .156, 3991-3910) nebo vylučováním cytokinů.
- <?
CZ 304876 BS
Termín „imunologická“ nebo „imunní“ odezva je založen na pozitiv® bumorální (té znamená zprostředkované proti látkami) a/nebo buněčné (zprostředkované T-buňkamí specifické prountígen nebo jejich produkty vylučování) odezvy řízené proti amylmdnímu peptidu u recipíenmiho pacienta. Taková odezva muže být aktivní odezva Indukovaná aplikaci imuaogene nebo pasivní
S odezva vyvolaná aplikací protilátky nebo primární T buňkou. Buněčná imunitní odezva se vyvolala přítomností polypeptidových epitopS ve spojení s molekulami MHC třídy I nebo třídy LI; aby se aktivovaly pomocné buňky T Clhf specifické pro antigen a/nebo eýtotóeké T buňky €D8’, Odezva muže taká vyvolat- aktivaci monocytů, makrořágů, buněk NK, bazofdů, dendritlekýeh buněk astrocytů, buněk nukroglla, eozmofliu nebo jiných komponentů přirozené imunity. Příu> tomaosí Imunologické odezvy zprostředkované buňkou se mohou stanovit prolfeačnímí testy (baňky T CD-Γ) nebo testy CTL (eyíotoxleký lytnfocyř T) (popisu ie $e v publikaci Burko et at, I íaf. Dis. nik 1 ί 10-19 <1994), Tigges et al' J; immunol Ϊ5& 3901-39.10)). Relativní příspěvek bnmorální a buněčné odezvy pří oeluanném nebo terapeutickém účinku Imunogenu se může odlišovat separátně izolací protilátek a T-boněk z imtmizóvancbo syngmmího zvířete a měřením, is ochranného neb»· mrapeunckého syngenníl® zvířete a měřením ochranného nebo terapeutického účinku o drahého subjektu,
Tensňt „imunogermí činidlo“ nebo „imunogen“ je schopný vyvolat imunologickou odezvu proti jemu Samému při apOkaéí savci nebo při spojeni s adjuvans.
Termín „samotný polyraskleotíd“ znamená potynukleotid, který· netvoří komplexy s kojoidnňní materiály. Samotné polynukleotídy se někdy klonuji do plazmidového vektoru, lermín „adjuvans ' znamená sloučenin® která, když se aplikuje ve spojení.s antigenem, vyvolává imunitní odezvu na antigen, ale když se aplikuje samotná, nevyvolává Imunitní odezvu na andgen Adjuvans muže vyvolal imunitní odezvu, několika mechanizmy, které zahrnují aktivaci lymíocuů, stimulaci buněk 13 mnebo T a stimulaci makrofágů.
Termín „paeienťť zahrnuje lidské nebo jiné savčí subjekty, které se ošetřily protýbk&ky nebo so terapeuticky.
Termín „desagragov&né“ nebo monomerieké Αβ znamená rozpustné, monomerické pepíidové jednotky Αβ. Jedna metoda přípravy rnonornérnich Αβ zahrnuje rozpuštěni Ivoíílizovaněho peplidu v neředěném DMSO a sonikaci. Výsledný roztok se centrífugoval, aby se odstranily neroz35 pustne částice. Agregované Αβ je směs oíigomérň, ve které monomemí jednotky se uchovávají spolu s nekovalentními vazbami.
Soutěž mezi Αβ protilátkami se stanovila testem, ve kterém testovaný imunogiobulin inhibuje speciřkké navázaní referenční protilátky na běžný antigen, jako je Αβ. Je známa řadu typu kom4č pťteítvnich vazebných restů, například; přímý nebo nepřímý radioinsunologický teši na pevne fázi (RÍAk přimý nebo nepraný enzymatický imunologický test na pevné fázi (EAÍ), sendvičový kompetetivni test < popisuje se v publikaci Stáhli et al., Methods trs enzymology 9; 242-253 (1983)), přimý biofin-avidmový BIA na pevné fázi (popisuje se v publikaci Kírklaod et. al, J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)). přimý značený test na pevne fázi. praný značený sendvičový test na pevné ťáz.i (popisuje se v publikaci Harlow and Lané, „Antibodies, A Laboratory Manuál“, Cold Spring Harbor Press (1988)), přímý značený test RIA na pevne fázi, kdy se jako značka použije 1—125 (popisuje se v publikaci More! et al, Malec. Immunol 25(1): 7-15 {1988)), přímý bíofin-svldinový test Ε1Λ na pevné fázi (popisuje se v publikací Chcung et al. Virology I ?6: 546 552 (19®!)) a přímý značené test RIA íMoldenhanc-r et al, Scand .1 Inununoi )?, 77-8/2 {199(fi) V typickém případě takový test zahrnuje použití čištěného antigen·/ vázaného ns pevný povrch nebo na buňky nesoucí buď neznačený testovaný Imunoglobulin a značený referenční imunoglobulin, koropefetivní inhibice se roéři stanovením množství značky vázané na pevný povrch nebo buněk v přítomností testovaného imunoglobulinu, Obvykle testovaný· .imunogiobulin je přítomen v nadbytku. Protilátky identifikované kompeteiivnim testem (kompetetivm proriiát55 kv) zahrnují protilátky vázající se na samotný epttop jako referenční protilátka a protilátky váza-6jící sc na pMlchiý epitop dostatečně blízký epitopu vázaném na referenční protilátku, .aby se· obje* vila prostorová překážka. Obvykle, když je přítomná kompetoiivní protilátka v nadbytku, bude inhibovat specifické navázání referenční protilátky na běžný antigen alespoň z 50 nebo 75 %, s Kompetiee nebo metody „obssInyicF4 jeden nebo více zmiňovaných elementů mohou zahrnovat jiné elementy, které nejsou specificky uvedeny. Například prostředek, kteří· obsahuje peptid Αβ obsahuje izolovaný peptid Αβ a peptid Αβ. jako komponent větší polypeptidové sekvence.
i. Obecný popis to
Několik amyíoidogennleh onemocnění a stavů se chamkterizovalo přítomnost- depozUú peptidu Λβ, který :\ořr ug»egaty s mmvuusfnou hmotou v mozku paerenta, laková onemocněn? zahrnují Alzheimerovu nemoc, Downův syndrom a poruchy poznávání. Později se vyskytuje symptom Alzheimerovy nemoci a Downova syndromu, ale stav pacienta nemusí vykazovat žádnou ?$ z charakteristik žádného «vedeného onemocnění. Příkladem jsou slabé poruchy poznávání něho ztráta paměti spojená s věkem pacientů, n kletých se ještě nevyvinula nebo nikdy se nevyvine Áizheímerova nemoc. Slabá porucha poznáváni může být definována skóre v těsto „Miní-Msutel State Evanr'* v soulad» v dohodnutými zvyklostmi. Taková onemocnění jseo charakterizována agregáty Αβ„ které mají strukturu skládaného β-lista· a han í se barvivém červeň Congo. Základní přístup prevence nebo léčby Alzheimerovy nemoci nebo jiných smyíoidogcnnich nemoc? vyn ořením ňmmogenni odezvy na komponent amyloídního depozitu u pacienta se popisuje v dokumentu WO 99C? 944 (uvedeno jako citace). Dokument opakuje a potvrzuje účinnost základního přístupu, Dokument se svým principem dotýká zdokonalených činidel, Mětá se používají v metodách. Taková zdokonaleni jsou předpokládány na základě lokalizovaných preíěřovaaýeh '25 epitopů v Αβ proti kterému je řízena imtmogětmiodezva, identifikace preferovaných epitopů v Αβ vede ke vzniku činidel a metod, které mají zvýšenou účinnost, snížený potenciál pro vedlejší účinky a/nebo vedou ke zjednodušeni výroby, tvorby a aplikace,
IL Terapeutická činidla to imunogermí odezva může být aktivní, jako když se imunogen aplikuje za účelem vyvolání protilátek reaktivních s Ap u paciente, nebo může být pasivní, jako když se aplikuje protilátka, která se váže na Αβ u pacienta.
ss 1. Činidla vyvolávající aktivní imnnitoi odezvu·
Terapeutická činidla vyvolávají imunogenní odezvu specificky řízenou na jistě epitopy v peptideeh Αβ. Mezi preferovaná činidla patří samotný peptid Αβ a jeho segmenty,, Také se-mohou použit \annntv takových segmentu, analogů a napodobenin prw/enchu popudu Λβ, které vyvodí lávají protilátky a/nebo sninfi zkříženě reaguji s protilátkami vtevořenými proti preferovaným.
epitopům peptidu Αβ,
Peptid Αβ také známý jako β-amy ioidni peptid nebo peptid Á4 (popisuje se v dokumentu
US 4 666 329, Glanw and Wong. Biochem. Biophys. Res, Commun, 120» i □! (1984)) jo pep4S tid obsahující 39 až 43 aminokyselin, který-je základní komponent charakteristických pinku Al* zheimerevy nemoci. Peptid Ap se vytvořil zpracováním větších proteinu APP dvěma enzymy, které se nazývají sekretázy β a y (popisuje se v publikaci lí&rdy, TIN$ 20, i.54 (1997)), Známé mutace v APP spojeně s Alzheimerosým onemocněním se objevuji v blízkosti místa sekretázy β a γ nebo v Αβ, Poloha 717 je například blízko místa štěpeni ΛΡΡ sekretázou γ při zpracováni se peptidu Αβ a polohy 67Q/67I jsou pribbžnř v místě štěpení sekreíázy β. Věří se, že mutace způsobuji AD Interakci se štěpícími reakevnn. kterými se tvoř? Αβ, tak že vznikne forma peptidu Αβ se zvýšeným množstvím aminokyselin 4294 >.
CZ 304876 86
Αβ má neobvyklé vlastnosti. které se mohou fixovat a aktivovat klasickou a attemativní kaskádou komplimentu Zv iaště se váže na.Clq a hlavně na C3bi. Toto spojení umožňuje navázání na. makroíágy. které sede k aktivací buněk fí, Navíc sě.CSbí dále odbourává a pak se váže na CR2 na 8 baňkách způsobem závislým na.T btmkách, který vede k 10000 zvýšení aktivace těchto buněk. Tento mechanizmus způsobuje, aby Αβ vyuonl tmuaiíní Odezvu: z nadbytkem jiných antigenů.
Αβ vykazuje několik přirozeně se objevujících forem, Lidské formy Λβ ve nazývají Λβ39, Λβ40, Αβ41. Αβ42 a Αβ43, Sekvence těchto peptidů a jejich vztah k prekurzoru APP se {lustruje nu obrázku c. 1 v publikaci Hardy et aí„ TINS 20, .155-158(1997),. Αβ42· má například sekvenci {SEQ ID NO: 42}:
H2N”Ásp--Ala-<iiuQfoe“/irg~His--Asp-^Ser~Gly~TyMjhréVat~-Hís~-.His~jGb-~Lys~Leu~-Vaí;“
Pbe--.PhO“Afe-Afiíu--Ásp“Val~Cdy-~Ser'~Asn-~h,y8--Tfiy~Aia-4íe4íe-Tyiy--Lem-AfofiAfoI---Gi.y-Glv·-Val-Val-ife-Ala-OH,
Αβ41, Αβ40 a Αβ39 se liší od Αβ42 vypuštěním Ala. Ala-Tle, a Ata-tle-Vaí z C-konee. Αβ43 se lišs od Αβ42· přítomností freoníůwého zbytku na C -kuneí
Imunogenní fragmenty Αβ jsou v několika metodách vzhledem k nepizštožení molekule výhodné z. několika důvodů. První důvod jo, že-pouze jisté eptopy v peptidu Αβ vyvolávají použitelnou imtmoganní odezvu při léčbě Alzbcurterova onemos »«e* s utjná dávka fragmentu, který obsahuje takové epitopy poskytuje vvšši molární konéenwau potulných ímtmogermích epitopů ve srovnání s dávkou nepoškozeného Αβ. Za druhé, jisté imunogenní fragmenty Αβ vytvoří imunogenní odezvu proti amyfoidnim depozitům, aniž dojde k podstatné imunogenní odezvě proti proteinu ÁPPj ze kterého je Αβ odvozen. Výroba fragmentu peptidu Αβ je jednodušší ve srovnání s neporušeným Αβ, což způsobuje jejich menši velikost. Za čtvrté, fragmenty Αβ netvoři agregáty s neporušeným A. zjednodušuji přípravu farmaceutických prostředků a jejich aplikaci,
Některé innmogenni fragmenty Αβ mají sekvencí alespoň 2, 3, 5, b, 10 nebo 20 konfinnáSmeb aminokyselin z. přirozeného peptidu. Některé ímunogenm fragmenty nemají vlec než 10, 9, 8, 7. 5 nebo 3 kontinuální zbytky z Αβ. Preferují se fragment) z. N terminála* poloviny Αβ. Preferovaně imunogenní fragmenty zahrnuji Αβί-5, i-é, 1--?, 1-10,3-7,1-3 a 1-4, Označeni fragmentu ΑβΙ~5 například indikuje fragment zahrnující zbytky i až 5 peptidu Αβ a nedostatek jiných zbytků Αβ. Zvláště výhodné jsou fragment)' začínající zbytky 1 až * peptidu Αβ a končics zbytky 7 až. 11. Fragment Αβ !···· 12 se může také použít, ale je méně výhodný. V některých metodách je fragmentem N-terminální fragment, který je jiný než Αβί-10. Jiné méně výhodně fragmenty zahrnují Λβί3 2k. 17- 2$, 1 7á, 75 '15—fc a t$ 42. U těchto fragmentů je nutné před nouzitím testovat aktivitu odstranění nebo prevence amyloidních depozitů, jak se popisuje v sekci Příklady provedeni vynalezte V některých metodách se použijí fragmenty, kterým chybí alespoň jeden a někdy alespoň pět nebo 10 C-terminálnich aminokyselin přítomných v přirozeně se vyskytujících formách Αβ. Například fragment; kterému chybi S aminokyselin C konce Aíí-fo zahrnuje prvních 38 aminokyselin z N -konce Αβ. Jiné komponenty amyloidmeh plaků, jako je například synukiein a jeho epítoplcké fragmenty se mohou také použít při vyvolání ímunogentu odezvy.
Pokud není uvedeno jinak odkaz na Αβ zahrnuje přirozeně lidské aminokyselinové sekvence uvedené shora v textu stejně jako analogy zahrnující aíeiy. druhy a indukované varianty. Analogy se v typickém případě iíšl od přirozeně se vyskytujících peptidů jednou, dvěma nebo několika polohami, často konzervativními substitucemi. Analogy·' v typtekém případě vykazují alespoň 80 nebf! 00 % shodo sekvence s přirozenými peptidy. Některé analogy také zahrnují nepřirozené aminokyseliny nebo modifikace N nebo (' lerminálnich aminokyselin jedné, dvou nebo několika poloh. Například přirozený zbytek kyseliny aspartové v poloze i a/ttebo 7 Αβ může hýl. nahrazen , § .
kyselin.©» ízoaspurtovm. Příklady nepřirozených siumokyseli» jsou D-atnlnokyseliny, a,adisubstituované-.aminokyseliny, N-alkylované ammokyseliny, kyselina mléčná, 4—hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Νtrimethyllysín, c -Ni-acetyllysín, G-fosfoserín, N-acetydserin, Nfbrmylmeíhionin, 3-methylbistidin, 5-bydroxylysín, m-N-methyiarginín a ísoaspartevá kyselina, s U fragmentů a analogů se může testoval profylaktické nebo terapeutická účinnost ttansgemnliu zvířecího modelu y porovnáni s netečenými kontrolamí neb© s placebem, jak se popisuje dále v textu.
Peptid Αβ, jeb© fragmenty a analogy se mohou syntetizovat syntézou peptidů na 'pevné fázi nebo te rekombínanfoí expresí nebí·! se mohou získat z přirozených zdrojů Automatické syntetízálery peptidů jsou běžné dostupné ú řady výrobců, jako je Appbcd Bn‘Systems, h «ster City, Califomia,
Rekombinantní exprese může probíhat v bakteriích, jako je E, cofr, v kvasinkách, v hmyzích nebo savčích buňkách. Postupy rekombinantní exprese se popisuje v publikaci Sambrook et ah, Molectdar Clonni-tg: A Laboratory Manual (C, S, Í1P. Press, NY 2d ed,, 1989). Některé formy pep~ ts ddn Ap-jsou také běžně dostupné (například a firem American Peptídes Company,dne,, Sunnyvale, CA a Califomia Pepíide Research, 1««,, Napa, CÁ),
Terapeutická činidla také zahrnuji delší polypeptidy, které zahrnují například aktivní fragment peptidu Αβ spolu s jiným- aminokyselinami. Preferovaná činidla například zahrnují fózni protei28 ny obsahující segment peptidu Αβ fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí, která vyvolává' odezvu » pomocných T hrnek proti heterologru aminokyselinové sekvenci a tím odezvu T buněk proti hekrotogm aminokyselinové sekvenci a tím odezvu B buněk proti segmentu Αβ. TJ takových polýpepílúů se může testovat prolýlakucká a terapeutická účinnost u zvířecích modelu ve srovnáni s netečený mi kontrolami nebo s placebem, jak se popisuje dále v textu, Pep25· tid Αβ, analog, aktivní fragment nebo jiný polypeptid se může aplikovat vs spojení nebo v multimérm formě nebo v dišocmvané formě. Terapeutická činidlu také zahrnují multhnery monomemfch Imunogenních Činidel,
V dalších variantách muže být íraanogennf peptid, jako je fragment Αβ, prezentován bakterii nebo virem, jako část imunogenního prostředku. Nukleová kyselina kódujici imunogenní peptid je začleněna do genome nebo episnmu víru nebo bakterie. Nukleová kyselina je začleněna tukovým způsobeni, že Imunogenní peptid se exprimuje jako vylučovaný protein nebo jako fúzní protein s vnějším povrchovým proteinem viru nebo s trtrnsmembranovým proteinem bakterie tak, že se vyjadřuje peptid. Viry nebo bakterie používané při takových metodách by měly být nepato35 genni nebo utlumené. Xltodné víry zahrnuji adenovíry, HSV, virus Venezuelské koňské encefalitidy a jiné viry alfa, virus veókuSámí stomatitidy a jiné viry rhahdo, virus vakcinie a neštovic. Vhodné bakterie zahrnují Saimoneila a Sbígelia, Zvláště vhodná je fůze imunogenního peptidu s HbsAg HBV, Terapeutická činidla také .zahrnuji peptidy a jiné sloučeniny, které nepotřebují mit podstatnou aminokyselinovou sekvenci podobnou peptidu Αβ- ale které neslouží jako napodobené oiny Αβ a vyvolávají podobnou imunitní odezvu, U libovolných peptidů a proteinů frořicich skládané β-lísty se testuje jejich vhodnost. Mohou se použít anti-idiotypické protilátky proti tnonokionáinim protilátkám proti Αβ nebo jiným anrykůdogemiím peptidúm. Takové anti Id protilátky napodobují antígen a tvoří proti ním imunitní odezvu (popisuje se s' publikaci Essential Immunoiogv (Roit ed„ Black well Scientific ífrihlieaticmx, Palo Áho, Y“ ed., p.í Si). Činidla jiné ttež peptidy by měly vyvolat imunogenní odezvu proti jednomu nebo více preferovaných segmentů peptidy Αβ uvedených shora v textu (například segmenty i -10, 1-7, 1-3 a 3-7). Taková činidla, výhodné vyvolávají imunogenní odezvu, která je určena jednomu ze. segmentů, amž je určenu jiným segmentům peptidu Αβ.
ss Γ náhodných knihoven peptidů nebo jiných sloneemn se omze také tcVovat jejích vhodnost Kombinační knihovny je možné produkovat v případě řady typů sloučenin, které se mohou syntetizovat postupným cpúsohvm Takové sloučeniny zahrnuji polypeptidy, betn-iečivc napodobeniny, polysachaiídy, icsloiiptdy·, hormony, ptostaglandiny. steroidy, arotnatícké sloučeniny, lícteroeykdeke sloučeniny, henzodiazepiny, oligomčrni glyeiny substituované na Ν-koncl a obgoknr-9CZ 304876 136 bamáty. Velké kombinační knihovny sloučenin se móhóu zkonstruovat způsobem kódovaných syaretickýeh knihoven (FSi Ί popsaných v dokumentu WO 95/1 2 608 (Aťfvmaxt, WO 93/96 121 (Affyntax). WO94 0^ 051 {Columbia University), WO 9505 503 ; fikat mat i‘poetu! a WO 95/30 642 (Seripps). Peptidové knihovny je možné vytvořit metodami vyjadřettemn Ona (popisuje se s v dokumentu WO 9.1 /18 980 (Deviin)).
U kombinačních knihoven a jiných sloučenin se na zaěůiku testuje jejich vhodnost tím»· že se stanoví jejich kapacita vázat protilátky nebo jejich hmíocyts (B nebo T), o kterých se vi, žejsou specifické pro peptid Αβ nebo jiné amyioidogennt peptidy. Například počáteční testováni se můto že provést libovolným polyktonálmm: senem nebo monoklonální protilátkou proti peptidu Αβ nebo jeho fragmentu. U sloučenin se pak může testovat schopnost vázat se na specifický epitop v
Αβ (například 1-10. 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 a 3—7). Sloučeniny se mohou testovat stejnými postupy, které se popisuji při mapováni specifit pro;dárkových epitopů, t sloučenin. určených taktovým trhován m \c p, k o,de m dv?'ue kápnut? vv volat or--tyatk\ neb > reAítvm lymfocyty proti Αβ is nebo jeho fragmenty. Vícenásobné ředění séra se například může testovat na snikrčtitračmeh destičkách, které se předem potáhly peptídem Αβ nebo jeho fragmentem a provedl se standardní test ELISA za účelem testovat reaktivitu protilátek vůči Αβ nebo (ragmernu. U sloučenin se pak testuje profylaktická a terapeutická účinnost u trsnsgermtch z.virat, které utaj i dispozice pro amyioidogenttí onemocněni, jak se popisuje v sekci příkladů. Taková zvířata zahrnují například myší nesoucí mutaci Afifi v poloze 717, jak se popisuje v publikaci Gsrnes et ak, Natoo 373s 523 (1995), a myči nesoucí Čvédskott mutaci Afifi vmistě 670/671 tak, jak se popisuje v dokumentu US 5 61.2 486 (MeConlogoe et al„) a v publikací Hsio et ak, Science 274, 99 (1996), Síáníenhlel et al. Proč, Nati. Acad, Sci. USA 94, 13287-13292 ; 1997). Sturehier-fiiermt et ak. Proč, Natí.. Acad. Sek USA 94, 1.3287-13292 (1997), Sorohelt ei ak. Neuron 19. 939-945 (1997)). Stejný testovací přistup $e použil « jiných analogů potenciálních činidel Αβ a delších peptidů, které zahrnuji fragmenty Αβ. jak se popisuje shora v textu.
2, činidla vyvolávající pasivní imunitot odezvu
30· Terapeutická činidla podle vynákzts zahrnuji protilátky, které se specificky váží na peptid Αβ nebo jiný komponent nmyloidnich plaků. Takové protilátky mohou být-monoklonální nebo -polyklonální. Některé takové protilátky se specificky váži na agregovanou formu Αβ, aniž sc váži na dísoeiov.-mou formu. Některé protilátky sc specificky váži na disociovanou formu, aniž se váži na. agregovanou formu. Některé protilátky se váži na agregovanou a disoeiovanou íbrtnu. Nékteré á$. takové protilátky se váži na přirozené se vyskytující krátkou formu peptidu Αβ (lo je Αβ.?9, 40 nebo 41}, aniž se váži na přirozeně se vyskytujte·' dlouhou formu .Αβ (to je Λβ42 a .413+3}. Některé protilátky se váží na dlouhou formu, aniž se váží na krátkou formu. Nékteré protilátky se váži na Αβ, antž se váži na amyloidní prekurzorový protein plné délky, Protilátky používané při terapeutických metodách malt obvykle neporušenou konstantní oblast nebo alespoň dostatečnou konau smutni oblast k interakcí s receptorem Fc. Preferuje se lidsky tzořyp IgG i, protože vykazuje nejvyšiti afirntu lidských izoíypň pro receptor Fefel na ťřagoeytárm buňky. Mohou se také použít bispeclfieké fragmenty Fab., ve kterých jedno rameno protilátky má speciíltu pro Αβ a druhé rameno je specifické pro Fc receptor. Některé protilátky se vážou na Αβ s vazebnou afinitou vyšší nebo rovnou přibližné hodnotě Ιθ\ 10 2 fiv, IOV nebo IO,líAF!.
Polyklonální sérum v typickém případe obsahuje smíchané populace protilátek vázajících se na několik epitopů v Λβ. Polyklonální sérum vsak nniže být specifické pro určitý segment Αβ, jako je segment ΑβΝΊΟ. Motsoklonálni protilátky sc vážit na specifický epitop v Αβ, který může být konformaěusm nebo nekouformačmm cpltopem. firoíyiakfická a terapeutická účinnost protilátek sc může testovat použitím postupů pro transgenní zviřeei model popsaný v sekci přikladu. Preferované monoklonální protilátky se váží na epitop ve zbytcích i-10 Αβ (s prvním N -tetroméiulro zbytkem přirozeného Ap označeného i). Některé preferované rnottokloná’ní protilátky se váží na epitop v amtnokyschnaeh t až a a ně.ktere naopnop v aminokyselinách a až It.k Neklete preferovaně protilátky sc váži na epitopy v aminokyselinách i až 3, 1 až 4, i až 5, 1 až 6. 1 až 7 mho 3 €2 304876 Bé až 7, Některé preferované protilátky se váží os epitop,, který začíná zbytky i až 3 a kotteí zbytky 7 až 11 peptidů Αβ. Méně výhodné protilátky zahrnuji ty, které se váži na epitopy se zbvtky ld až 15, 15 až 20, 25 až 30, 10 až 20, 20, 30 nebo 10 až 25 peptidů Αβ. Doporučme se, >c u takových protilátek se festaje před použitím aktivita v myším modelu, což se popisuje dále v textu $ v sekci Příklady provedeni vynálezu. Zjistilo se, například že jisté protilátky proti epiíopům ve zbytcích 10 už 18, lb až 24,18 až 21 a 33: až 42 nevykazuji aktivitu. U některých metod se používá více monoklonálnícb protilátek a vykazuje vazebnou specifitu vůči různým cpitopům, Takové protilátky se mohou aplikovat postupně nebo současně. Mohou se také použít protilátky proti amyloidním komponentám, které jsou jiné než Αβ. Například protilátky mohou být řízeny amys o loidním asociovaným proteinem synuktein.
Když se řekne, že protilátky se tah na epitop ve specifikovaných zbytcích, jako je například Αβ 1-5, znamená to, že se protilátka specificky váže na polypeptid obsahující specifikované zbytky (to je v tomto přikladu Αβ I -5), Taková protilátka nepřichází nezbytně do kontaktu $ každým rs zbytkem v Αβ I-5, Vazebnou afinitu ani podstatné neovlivňuje žádná jediná substituce nebo delece aminokyseliny v Αβ 1-5. Specifita epitopu protilátky §c může stanovit například vytvořením knihovny vyjadřujici tapa. ve které různí členové vyjadřují nižně suhsekvenee Αβ. V knihovně vyjadřující laga se pak mohou vybrat čteni, kteří xe SjWÍfieky váží na testovanou protilátku. Izolovala se rodina sekvencí. V typickém případě taková rodina obsahuje běžnou jadernou te sek věnci a různé délky lemujících sekvenci u rozných členů, Nejkr stál jaderná sekvence výkazující specifické navázaní na protilátku definuje epitop vázaný protilátkou. U protilátek. se také testuje spccifita epitopu *, kompetičním teste s protilátkou, jejíž speeifita epitopu se již stanovila.
Například proti látky, které soutěži s protilátkou 3Dti o navázáními Αβ se váží aa. stejný nebo podobný epitop jako protilátka 3D6. ío znamená na zbytky Αβ 1.-5. Podobně, protilátky, které soutěži s protilátkou 10D5 se v ážl na stejný nebo podobný epitop, to je na epitop \e zbytcích Αβ 3-6. Testování protilátek na speelfitu pro epitop je použitelný prediktor terapeutické účinností. Například je pravděpodobně, že protilátka, která se váže na epitop ve zbytcích 1 až 7 Αβ bude účinná při prevenci a léčbě Aizheímetow nemoci,
Monoklonáim nebo polyklonální protilátky, které se specificky váži na preferovaný segment Αβ, aniž se vážou na jiné oblasti Áfi mají rodu vybral vzhledem k monokionalmm protilátkám, které se váží na jiné oblastí nebo polyklonální séra vůči neporušenému peptidů Αβ, Zaprvé, v případě stejné hmotnostní dávky, dávky protilátek, které se specificky váží na výhodné segmenty, obsahuji vyšší molární dávky protilátek účinných při odstraněni amsioidníeh pinku. Za drahé, proti35 látky, které se specificky váži na výhodné segmenty, mohou vyvolat odstraňující odezva proti amykí-dnim depozitum, aniž. vyvolají odstraňující odezva proti neporušenému polypeptidů .ATT, čímž se snižuje potencionální vedlejší účinek.
í„ Obecné charakteristiky ironneglohnlinů
Je známo, že základní strukturální jednotka protilátky obsahuje tetramer podjednotek. Každý teíramér se skládá ze dvou shodných párů pctiypeptidových řetězců, přičemž každý pár má jeden lehký (molekulová hmotnost je přibližné 25 000) a jeden těžký- řetězec {molekulová hmotnost je přibližné 50 bdít až. 70 000). Ammoterntinální část .každého řetězce zahrnuje variabilní oblast, která obsahuje přibližné 100 až 110 nebo více aminokyselin, jenž jsou primárně odpovědné za rozeznáni antigenů. Karboxy-terminálni část každého řetězce definuje konstantní oblast, která je primárně odpovědná za funkci efektoru.
Lehké řetězce se klasifikují buď jako kappa, nebo lambda. Těžké řetězce se klasifikuji jako gamma, alfa, delta nebo epsíion a definují proti látkový izotop, jako je IgG, IgM, IgA, IgD a IgL V lehkém a těžkém řetězci je vanabdnl a konstantní oblast spojena oblastí ,J’‘, která obsahuje 12 nebo více aminokyselin. V těžkém řetězci k tomuto účelu také slouží oblast „DA která obsahuje přibližně o 10 aminokyselin více (popisuje se v publikaci bundamentaí Immunoiogy, Paul, W., ed,, 2:xí ed, Raven Press, N.Y., 1989). Ch. 7).
- H CZ 304876 Bé
Variabilní oblasti každého· páro tehkého/těžkého řetězce tvoři vazebné místo protilátky. Tak neporušená protilátka má dvě vazebná místa. Mimo případu bifenkéňieh nebo bíspecífíckých protilátek jsou tyto dvě vazebná -místa stojná» Všechny řetězce vykazují stejnou obecnou strukturo relativná konzervativních rámcových oblasti (FR) spojených třemi hypervariabilnimi oblastmi s které se také nazývají oblastí stanovující komplementaritu iíebo. CDR. CDR ze dvou řetězců každého pára tvoři oblastí základní struktury (FR.i spojené třemi hypervariabilnimi oblastmi, které se také nazývají oblasti stanovující komplementaritu nebo CDR, CDR ze dvou řetězců každého páro tvoří oblasti základní struktury, což umožňuje,jeho'navázání aa specifický epitop, ZN-teaee do € -konce oba lehký a Rzks rctczcc obsahuje oblasti FR I, CDR!. FR2, t DR2. í Ř.\ CDR3 a FR4, to Přiřazeni aminokyselin ke každé .oblasti je vsouladu. s dtefínicemt podle Kabata (popfenje se v publikací Rabat, Scquences of Protelns of ínunu no logica! Iníerest (National ínstítntes of Health Hethesdři, MD, ΙΜΓ .md >s°b nebo Ornému and 1 csk. J Mot Bwi Wo ‘-Όι-ΟΓ’t !‘hVs Ghothia et ak, Nátuře 34,2; 878-883 (.1989)), ss li. Produkce protilátek».které nejsou lidské
Produkce monoklonálníeh prohlntek, které nejsou lidské, například myší, protilátky moréats. králíci nebe krysí, se může uskutečnit například 'imunizací zvířete s Αβ. Také se mohou použít delší peptidy obsahující Αβ nebo imunogenní fragment Αβ nebo anti -idiotypické protilátky proti pro20. tilátce proti Αβ (popisuje se' v publikaci Harlow- and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHR NY, 1988), Takový ímunogen se může. získat z, přirozeného zdroje,· syntézou peptidů ticho rekombinantní expresí innmogen se může aplikovat jako fúzovaný s nosičovým proteibem nebo s nim tvoří komplex, jak se popisuje déle v textu Imunogen se dáte může aplikovat spolu 8 adjnvans. Může se použit několik typů adjuvans, jak se popisuje dále v textu. Y případě imui»» zaee laboratorních zvířat se preferuje úplně Froundovo adiuvans a pak následuje neúplně adjuvans. Pro přípravy polyk tonálních protilátek se v typickém případě použiji królfci nebo morčata, Při přípravě monoklonálnich protilátek se v typickém případě používají myši. U protilátek se testuje specifické navázání na Αβ, ti protilátek se dále testuje schopnost navázáni na specifickou oblast Αβ, Pozdější testovaní se móže provést stanovením navázání protilátky sta sbírku deleč38 nich mutantů peptidu Αβ a stanovení, které Αβ z detečnich mutantu se váže na protilátku. Navázáni se muže provést například Westernovým hlotem nebo testem ELISA. Nejmenší fragmenty, které vykazu ji specifické navázáni na protilátku, definují epitop protilátky. V jiném případe specifita epitopu se může stanovit kompetetívnim testem, kde testovaste a referenční protilátky soutěží o navázáni na Αβ. jestliže testované a referenční protilátky soutěží, pak se váži na stejný
3S epitop nebo epitopy dostatečně blízké, přičemž, navázáni jedné protilátky interferuje s navázáním druhé protilátky. Výhodným izotopem takových protilátek je myši iz.ožyp IgGz nebo ekvivalentní Izotyp v jiném druhu. Myší izotyp igG2 je ekvivalent, lidského izotypu IgGl, ití, Chimérové.a humanizované protilátky •te
Chiměrové a humanizované protilátky mají stejnou nebo podobnou vazebnou specifiíu a afinitu jako myší noho jiná nelidská protilátka, která poskytuje počáteční materiál pro konstrukcí ehitnerove nebo humanizované protilátky. Chiměrové protilátky jsou protilátky, jejichž geny lehkého a těžkého řetězce se mají /.konstruovat v typickém případě genovou manipulaci ze segmentů genu imunoglobulinu, které patři k různým druhům, Například variabilní segmenty (V) genů z myši monoklonální protilátky se mohou spořit s lidskými konstantními segmemy (O, jako je IgGl a IgGd. Preferuje se lidský izotyp IgGl. Typická chimérová protílátková je tak hybridní protein, kíeiý obsahuje oblast V nebo oblast vázající se na antigen z myší protilátky a oblast C nebo ©lektorovou oblast z lidské protilátky,
Síi
Humanizované protilátky utají zbytky základní struktury variabilní oblasti, které v podstatě pochází z lidské protilátky (nazývá sc akceptorova protilátka) a oblasti stanovující komplementaritu pocházející v podstatě z mysl protilátky (nazývá se Ponorový inmnoglobuihri í popisuje se. \ publikaci Gueen et al.. Pros. Nati. Acad. Ses. DSA 86: 10029-10033 i 1980) a v dokumente {·>
WO 90/0786I, US 5 693 762, US 5 693 761, US 5 585 089, US $ 530 f OI a US 5 225 539 (Winter). Konstantni oblastí i j, j«s?B jsou přítomné^ pocházejí také v podstatě nebo zcela z lidského imunoglobulinu, Lidské-variabilní' oblasti se obvykle vybraly z lidských protilátek, jejíchž sekvence základní struktury vykazují vysoký stupeň sekvenční áhody s oblastní? myších variabilních oblastí, ze kterých se ziskaly COR. Zbytky základní struktury variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce, se mohou získat ze stejných nebo různých sckveaci lidské protilátky. Sekvence- lidské protilátky mohou být sekvence přirozeně se vyskytujících lidských protilátek nebo snohou být konvenčni sekvence několika, lidských protilátek (popisuje se v dokumentu Carter et at, WO 92/22 6531 Jisté aminokyseliny ze zbytků základní struktury lidské variabilní oblastí se tě ty bralo pro substitecí založené? pa jejím možtten? vlivu ha kcmtotmaci COR -a/nebo na navázání na antigen. Zkotmiánl takového možných vlivů se provádí modelováním, testováním charakteristik ammokyselin v určitých polohách nebo empirickým pozorováním účinků substituce nebo mutagenezé určitých aminokyselin.
ts Například když se zbytek základní struktury vanabilní oblastí hší od zbytku základní sřmkénry vybrané lidské variabilní oblasti, pak by se měla aminokyselina základní struktury obvykle substituovat ekvivalencí asninokyseíÍnavot? základní struktury z myší protilátky, když se očekává, že. aminokyselina:
(i) se nekovalentně váže přímo ha antigen,
2C (2) sousedi oblastí CDM, (3) interaguje jiným způsobem s oblastí CDR (napříkted je přihližné v 6 N oblastí CDR) nebo (4) leží v meziproston? v VL-VH
Jinými kandidáty substituce jsou akceptoy lidských atn.raekysehn základní struktury, které jsou v případě lidského imunoglobulinu v'této poloze neobvyklé. Tyto aminokyseliny se mohou substituovat aminokyselinami z ekvivalentní polohy myši donorové protilátky nebo z ekvivaientmeh poloh více typických lidských Imunoglobulinů. Jiní kandidáti substituce jsou akcepíorové lidské aminokyseliny základní struktury, které jsou v případě bdskéhu imunoglobulinu v této poloze neobvyklé. Základní struktury variabilní oblastí humanizovaných imunoglobulinů obvykle vykáau zují alespoň 85 % sekvenční shody se sekvenci základní struktury lidské variabilní oblasti nebo skonvenční sekvenci.
iv. Lidské protilátky
Lidské protilátky proti Αβ se připravuji různými způsoby, které se popisují dále v textu. Takové lidské protilátky se vybraly pomoci komperetivmeh vazebných experimentu nebo když maj- stelnou speciím? k epiíopu. jako určitá ?n)ši protilátka, tak jako jeden z myáích monokionáíů popsaných v přikladu XI. Lidské? protilátky se mohou také testovat za účelem zjištění určité epitopové specifity použitím pouze fragmentu Αβ, jako imunogenu tenebo testováním protilátek proti sou40 boru delečnich mutantu Αβ. Lidské protilátky·· mají s výhodou ízotypovoa -speciftPt lidského IgGl.
(i) Způsob triomň
Základní přistup a příklad buněčného fuzaiho partnera SPAZ—4 vhodného pro použití v tomto přístupu se popisuje v publikaci Oestberg et al,, Hybridoma 2: 361—36? (1983), {Oestberg) US 4 634o6o a tF.ngknw? et ab,.? US 4 634 660. Buněčné linie produkující protilátky Získané touto ínctodou se nazývají triomy, protože potomky tří buněk: dvou lidských buněk a jedné myši. Na začátku se myši Imie myelomu fázuje s lídskýni B-lysrdocytetn, aby se získal xenogenní hybsn řidni buňka, která neprodukuje protilátku, jako je buněčná linie SPAZ--4 popsaná v publikaci Oestberg et al., Hybridoma 2: 361- 367 í 1983 ?. Xenogenní budka se pak íuzujc s imunizovaným Hdským B-lymíocytem, aby se získala buněčná linie produkující triomy. Zjistilo se, že triomy produkuji protilátky, které jsou stabilnější ve srovnání s obyčejnými hybrídomy připravenými z lidských buněk.
CZ 304876 Β6
Imunizované:B Bmfoeyíy se získaly z krve, sleziny, lymfatických žláz nebo z. kostní dřeně lidského donora Jv»thže jsou nutně protiiátfey proti specifickému antigenu nebo epitopů, preferuje se použit tento jejích .epitop nebo antigen při ímunízncí, Imunizace se může provést bnď b vivo, nebo in vitro. V případě imunizace in vi.vo se B-bůňky v typickém případě izolovaly z člověka imunizovaného Αβ. jeho fragmentem. větším polypeptidem, který obsahuje Αβ nebo fragment nebo amíMdiotypickou protilátku vůči protilátce vňci Αβ. V některých snetodách se buňky B izolovaly ze stejného pacienta, ktefomn se aplikovala protílátková terapie, V případě imunizace in vitro. se B-lymfocyty s typickém případě vystavily účinku antigenu po dobu 7 až 14 dní v kultivačním médiu, jako je RPMi-1640 (fingleman et ak) doplněném 10 % lidskou plazmou,. Imunizované Bfoymfocyty se fúzovaly s xenogenní hybridní buňkou, jako je SPA2.--4. Buňky se například ošetřuji 40 až 50% poivetbyleagíykolem s-MW 1 000 až 4 000 při teplotě přibližné 57 % po dobu 5 až 10 minut. Buňky se separovav z fuzní směsi a pomnožily se v kultivačním mediu, které je selektivní pro požadované hybridy (například HAT nebo AM). Klony vylučující protilátky vykazující požadovanou vazebnou specifiku se identifikovaly testováním schopnosti kultivačního média triomů vázat se na Αβ nebo jeho ...fragment. Lidské protilátky produkující triomy vykazující požadovanou specifitu se subklonovaly způsobem limitovaného ředěni a růstem m vitro v kultivačním médiu. U získaných buněčných linií tríornů se- pak testovala schopnost vázat se na Αβ nebo jeho' fragment,
Ačkoli triomy jsou geneticky stabilní, neprodukuji velké množství protilátek. Síla exprese se· může zvýšit klonováním genů protilátek ztriomů do jednoho nebo více expresívníeh vektorů, a transformaci vektoru do standardní savčí, bakteriální nebo kvasinkové buněčné itníe.
(2) Transgenní savci, kteří nezahrnují Člověka
Lidské protilátky proti Αβ mohou býž také produkovány z transgenních savců, kteri obsahují transgeny kódující alespoň segment lidského - imunoglobuhnového lokusu. Obvykle endogenní imunoglobuhnový lokus takových transgenních savců je funkčně deaktivován. Upřednostňuje se, aby segment lidského munoglobuímového lokusu zahrnovat neuspořádané sekvence komponentů těžkého a lehkého řetězce. Deaktivace endogenních imanoglobulímových genů a zavedení exogennich imunogiobuíinových genů se může dosáhnout cílenou homologní rekembinaei nebo zavedením chromozomů YAC. Transgenní zvířata, která vznikají v tomto postupu, jsou schopny funkčně přestavět sekvence imnnoglobuiinového komponentu a exprimovat repertoár protilátek různých izotypu kódovaných lidskými jmunvglobulmovvmi geny, aniž exprimují endogenní imunoglobul lnově geny. Publikace a vlastnosti savců, kteří vykazují tyto vlastností, se popisuji detailněji například v dokumentu Lortbere et al., WO 93/12 22? (1993), US 3 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318. US 5 789 650,’ US 5 770 429. US 5 661016. US 563.1425. US 5 62> 12n, t S 5 ňť>9 825. i S 5 545 SOu a t publikaci Niture s fik 1547 1553 (1994). Natuic Biotechnology 14, 826 (1996). Kucherlapati. WO 91/10 ?4i (1991}. Zvláště vhodné jsou franynemu nryb. !b<<t Jatky přots Ap m> z»rkah mumt/av’ tranvgemnho tak. jfe se popluje v dokumentu Lonbcrg nebo Kucherlaptui uvedených shora v testu a Αβ nebo s jeho fragmentem. Monoklonálni protilátky se připravily například fůzi B-buněk z takových savců a vhodnou buněčnou linií myelornu za použití běžné technologie potíte Kohřers-M liste ina. Lidské polykionáin( protilátky se mohou také připravit ve formě séra z lidi imunizovaných imunogenním činidlem. Takové polyklonální protilátky se mohou Koncentrovat afinitním čištěním použitím ?\p nebo jiného amyloidního peptidu, jako sTínitniho činidla.
(3) Metody vyjadřující íága
Dalším přístupem, jak získat lidské protilátky proti Αβ je testován í knihovny DNA z lidských B b«něk podle obecného protokolu, který se popisuje v publikaci Uuse et al., Science 246; 1275i 281 (1989}. .lak se popisuje v případe metodologie triomw tukové B buňky je možné získat z lidí imunizovaných Αβ, fragmenty, dchnuti polypeptidy, které obsahují Αβ nebo fragmenty nebo anti-idiotypickýnu protilátkami. Takové B buňky se získaly z. pacientů, kterým se aplikovala
-14CZ 304S76 136 protílátková léčba. Vybraly se protilátky vázajfefse na Αβ nebo jejích fingmenty, Sekvence kódující takové protilátky (nebo sazebně fragmenty) se pak klonují a ampiifikup. Protokol popsaný y publikaci kluse et al.. Science 246: 1275-1281 (1989} je účinnější v kombinaci s technologií vyjadřující tága (popisuje se v dokumentu Dower et al„ WO 91/17 27; a McCafferty et ak, WO s 92/01 047, US 5 877 218, US .5 871 907, US 5 858 657. US 5 837 242, US 5 733 743 a US $65 332. V těchto metodách se produkují íagové .knihovny, ve kterých členově tra svém povrchu vykazují různé protilátky. Protilátky se obvykle vykazují jako fragmenty Fy nebo Fab. Proti látky vykazující tága s. požadovanou speciBou jsou vyhrány afinifn tm ohohácerritn péptrdu Αβ nebo jeho fragmentu, i(i
Různé metody vykazující tága produkují lidské protilátky, které máji vazebnou specšťítu vybrané myší protilátky íWtnler WO 92/20 791). V této metodě se jako počáteční materiál používá variabilní oblast buď těžkého, nebo lehkého řetězce vybrané myši protilátky. Jestliže se například jako počáteční materiál vybrala variabilní oblast lehkého řefozce, zkonstruovala sc iagová knihovna, $3 ve které členové vykazuji stejnou variabilní oblast lehkého řetězce (to je .myší počáteční materiál) a od liánou variabilní' oblast těžkého řetězce. Vybrané variabilní oblasti těžkého řetězce se získaly z knihovny znovu uspořádaných variabilních oblasti lidského těžkého řetězce, Fág vykazuje silné specifické navázáni pro Αβ (například alespoň 1:0* a přednostně alespoň l(f? M~’). Variabilní oblast těžkého rotczce z tohoto fuga pak slouží jako počáteční materiál piš konstrukci další lanově to knihovny. V teto knihovně každý tág vykazuje stejnou variabilní oblast těžkého řetězce (to je oblast identifikovanou z první vyjadřující knihovny) a odlišnou variabilní oblast lehkého řetězce. Variabilní oblast: lehkého řetězec se získaly z knihovny znovu uspořádaných. variabilních oblastí lidského lehkého řetězce. Opět se vybral fág, vykazující silné specifické navázání tra Αβ, Tyto fugové vykazují variabilní oblasti zcela lidských protilátek ptotí <Αβ. Tyto protilátky mají obvykle stejnou nebo podobnou specifitu k epitopu jako myši počáteční materiál, v. Výběr konstaníní oblastí
Variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce ehimérovýeh, bnmamzovaných nebo lidských protí30 látek se mohou vázal na alespoň Část lidské konstantní oblasti. Volba konstantní oblastí závisí zčásti na skutečností, zda se požaduje lomplement závislý na protilátce a/nebo toxicita zprostředkovaná buňkou. Například izotypv IgGl a IgG 3 mají aktivitu koroplementn a izotypy lgG2 a lgG4 tuto aktivitu nevykazují. Volba izotypu může také způsobit vstup protilátky do mozku. Preferuje se lidsky izotyp IgGl. Konstantní oblastí lehkého řetězce mohou být lambda nebo kap35. pa. Protilátky se mohou exprimuvaí jako tetraméry. které obsahují dva lehké a dva těžké řetězce, jako separované těžké řetězce, lehké řetczce, jako fragment fab, Fab'F(ab')2 a Fv noho jako jednoňsíězeove protilátky, ve kterých variabilní oblasti lehkého řetězce jsou spojeny snezennkena.
ví. Express rekombmanínieh protilátek
Cbimérové, humanizované a lidské protilátky v typickém případě v zinkají rekombinantní expresí. Rekombinantní po lynu klecí idové konstrukce v typickém případě zahrnují expresi kontrolní sekvence operativně spojené s kódujícími sekvencemi protilátkových řetězců, které znliruují přirozené asociované nebo heterologní promotorové oblasti. Výhodné jo, když expresivni kontrolní sek43 vence jsou eukaryontní promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfekovat eukaryontní hostitelské buňky. Když se vektor začlení do shodného hostitele, hostitel se. udržuje za podmínek vhodných pro silnou expresi nukleotidových sekvencí a pak dochází ke sběru a čištěni zkříženě reagujících protilátek. Tyto expresívui vektory jsou v typickém případě ropukovafelné v hostitelských organizmech buď jako epizomy, nebo jako integrální část hosíitel·
5» ské chromozomální DNA. Božné expresivni vektory obsahuji selekční markéry, jako například rezistence na amplcšlm nebo na hydromycin, aby ss umožnila detekce těchto buněk transformovaných požadovanými sekvencemi DNA.
CZ >4876 Bn
Bakterie £ fcoh'je jeden prokaryoníní hostitel, který je zvláště použitelný při klonováni sekvenci DNA podle vynálezu. Za účelem -exprese je možné použít mikroorganizmy, jako jsou kvasinky, Saccharomyces je preferovaný kvasinkový hostitel s vhodnými ^eMotý. které mají sekvence řídící expresi, počátek replikace., termmačm sekvence a podobně» podle nutností. Typické pnunos tory zahrnuji 3-fosfpglyeetátovou fcmáza. a jiné gíykolytieké eazpuy. Indukovatelné kvasinkové promotory zahrnuji mezi jinými promotory pocházející z dehydtogenázy alkoholu, izocytoehrom
C a enzymy odpovědné za využit? maltózy a galaktózy.
Savčí buňky jsou preferovaným hostitelem vhodným pro expresí nufcfeotidových segmentů, které to kóduji InumoglohulmY nebo yepeh fragmenty (popisuje se v publikaci Winnaeker, Genes and
Cíoncs. (VCH Publishers, NV, 198?)). V oboru se vyvinula řada buněčných linii vhodného hostitele, htere íson schopnu vylučovat neporušené heterologní proteiny, Tyto linie zahrnují CHO, různé buněčné hule €0$. buňky Beta, brníky L a buněčné linie myelontu. Upřednostňuji se buňky, které nejsou lidské, Expresívní vektory pro tylo buňky mohou 'zahrnovat expresíyní kop* is trolní stekvenec. ;ako počátek replikace»· promotor, zesilovač (popisuje se v publikaci Queen et al.» immunol Rev. ř.9; 49 11936,>> a nezbytná informační místa pro zpracování, jako jsou místa pro navázáni ribozómu, místa sestřihu RNA, polyadettylační místa a íerminačnr sekvence transkripce,
Preferovaně sekvence řidiči expresi jsou promotory získané z endogenních genů, eydomegalovira, SV40, adenoviru, bot inního papilornaviru a podobně (popisuje se v publikaci Co et st, J, Immu20 not 148: 1149(1992)}.
V jiném případě sekvence kódující protilátky se mohou začlenit do třansgesů, aby se mohly -zavést do genomu transgcumho zvnfere a na-dedné txprhnovaí v mléku uanspenmbo zvířete popisuje se například v publikaci, US 5 74.1 957» US 5 304 489, US 5 349 992). Vhodné íransgeny
2.5 zahrnují kódující sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce v: operativním spojení s promotora» a zesilovačem z genu. který'je specifický pro pmol žlázu , j ako j e kasein nebo beta laktoglobnfiu.
Vektory obsahující segmenty DNA mohou byt přeneseny do hostitelské buňky dobře známými metodami, které závisí na typu buněčného hostitele. V případě prokarvontníeh buněk se běžně využívá chlorid vápenatý, zatímco v případě jiných buněčných hostitelů se využije aplikace fosforečnanu vápenatého, efektroporaee, lipofokee, hiolistíka nebo nansťekce založená na virech. Jmé metody používané pro transformací savčích buněk zahrnuji použití polvbrenu, provopiaslové fuze, Upozornil, elektroporace a mikroínjekce (v obecném případe se popisuje v publikaci Sambrook et al.,}. Za účelem produkce transgermích zvířat se mohou íransg.eny zavést injekci do oplodněných oocytň nebo se mohou začlenil, do genomu embryonálních kmenových buněk a jádra takových buněk se přenesou do oocytu bez jader.
Když se protilátka exprimuje. může sc čistit podle standardního postupu, který- zahrnuje čistem' HPLC, kolonovou chromatografií. gelovou elektroforézou a podobné (v obecném případě se po4C pišme v publikaci Scopes, Protein Puriílcation (Springer-Vcrlag, NY, i 032)?.
3. Nosičové proteiny
Některá činidla vyvolávající imunitní odezvu zahrnují vhodný ephop pro vyvoláni imunitní ode· zvy proti amyloidním depozitům, ale jsou příliš malé, aby byly tmunogenm. V teto Situaci se pepiidoyý nosíc muže vázat na vhodný nosič, přičemž vyvolá imunitní odezvu. Vhodně nosíce zahrnují sérové albuminy, hemocyanin přilipkovítých plžů, molekuly imunoglobulinu. tyroglobulin, ovaibumim toxoid létánu nebo toxotd z jiné patogenní bakterie, jako je dífterte. £. vo/í. cholera nebo //.py/on nebo utluntený derivát foxínu. Jiné nosiče- zahrnují epitop}· T buňky, které se
5Q váži íí3 vclkc množství afel MHU, například alespoň 75 s« všech lidských ulel MHC Takové nosiče jsou někdy známy v obora, jako univerzální epitopy I-buňky, Rříklady univerzálních epitopň T-buňky zahrnuji:
bemughitinín hdhtenzae; ΗΑ;«·.· (SEQ ID NO; 43) PKYVKQNTLK.LA1 PADRE (běžné zbytky isou tnčasrn písmem) i$l Q ÍD \t> t-Π \KYVA'V% Ή.ΚΑΑΑ medaile Cis, epitop Π {SEQ ID NO: 45) EKKIAK.MEKASSVFNV povrchový antigen hepatítídy B: HBsAg}«, -s (SEQ
- )6 CZ 30487« !íú
ID NO; 46) FFLLTRILTI protein teplotního šoku 63: hsp65 s»,m (SEQ ID NO: 47) DQSIGIM tát 4MDK.VGNBG mikroorganizmus Calmctte-Ouerin (SBQ ID NO: 48) QVMFQPLPPAVVKÍ loroid tetany; TT*^ (SLQ ID NO; 49) QYIKANSKFIGFEBt toxoid teteny: Π >r «c tSEQ ID NO: 50) FNNFFVSFWLRVPKVSASHLE HfV gpl20 TI: (SEQ ID NO: 5i)
KQHNMWQFVOKAMVA
Jiné m>siée vhodné pro stimulaci nebo zesíleni imunitní odezvy zahrnují cytokiny, jako jbIL-ζ popudy IL-1 a a β, IL-2, yíFN, ÍL-IO, GM-CSF a chcmokiny, jako je MIFIa a β a RANTES. htumogcnní činidla mohou být také spojeny s peptidy, které zvyšuji transport skrz tkáň, jak se to popisuje v dokumente 0'Maltony, WO 97/17 613 a· WO 97/17 614.
Imunogenní činidla se mohou vázat na nosiče chemickou vazbou. Metody navázání imuuogertn na nosič zahrnuji tvorbu disulfidových vazeb použitím N~suhcíftimidyP3-<2”pvridy1thio> propionátu (SPDP) a sukeirtÍÍnidyl---4---íN---maieimidomcthyl)eykIohexau-l--karbt>xyh'>’. a kyselina !5 (SMCC) (jestliže peptidů chybt sniřhydnleva skupina, může >c tot<< provést adnu eysremového zbytku}. Tato činidla umožňuji vznik disulfidové vazby mezi činidle® a peptidovými cysteinovýmt zbytky na jednom proteinu a amidové vazby prostřednictvím ε-aminoskupiny na lyzints nebo jiné volně aminoskupiny v jiných aminokyselinách. Rázná činidla tvořící disulfid/amíd se popisuji v publikaci imtnun. Rev. 62,185 (1982), 3má biflnWčm spojovací Činidla tvoři thioether špite než dísulfidovou vazbu. Řada těchto činidel tvořících tteoether Jsou bázně dostupné a zahrnuji reaktivní estery kyseliny 6~maleirnidokapronové, 2- brotnooclové kyseliny a 2-jodoocíové kyseliny, 4-yN-maleimidí.fmethyI)cyklohexan-l-karboxylové kyseliny. Rarbí^xylové skupiny mohou být aktivovány jejich kombinováním se sukcimmidem nebo Sodnou solí l-bydtwyL-2--n itro-4 -stdíonro é kysel lny, zs
Imunogetiot peptidy se mohou také exprimovat jako .luzní proteiny s nosiči (to je heterologní peptidy), Imanogenaí peptid muže být spojen s nosičem svým N~koncem, svým karboxylovým koncem nebo oběma konci. Ve inznim proteinu muže být nepřímo velké množství repetic iumnogennibo peptidů, imunogenní pepiid muže být spojen s velkým množstvím kopii heterologníbo
SO peptidů například na obou koncích. Některé nosičové peptidy slouží k vysedáni odezvy pomocných Γ-buněk proti nosičovéum peptidn. Indukované pomocné buňky T naopak vyvolávají odezvu B-bnňky proti ímnnogěnnimu peptidů spojenému s nosičovým peptidem.
Některá činidla podle vynalezu obsahuji luzní protein, ve krerem N terminalm fragment Αβ je
3.5 spojen svým C-koncem s nosičovým peptidem. U takových činidel N- terminálut zbytek fragmentu AR \tanosuie N-termlnální zbytek fuzniho protein. lákové fu/ni proteiny jsou účinné při vyrobí n pn tretek, které se váží na epítop, který vyžaduje, aby N-terminálni zbytek Αβ byl ve volné tleme. Nécterá činidla podle vynálezu obsahuji velké množství repetic Ň termlnálnlho segmentu Αβ spojeného svým C koncem sjednou nebo více kopli nosíčového peptidů. N40 terminální fragment Αβ začleněný do takových fúztueh proteinu někdy začíná ApL-3 a konči Αβ7-1 L Αβί-7. Αβ! -3, 1.-4, 1-5 a 3-7 jsou preferované N-tetmmátai fragmenty Αβ, Některé fúzni proteiny obsahuji různé N-termioáhn segmenty Αβ v tandemu. Fúzní protein může například obsahovat ΑβΙ -7. pak následuje Αβ 1-3 a pak následuje heterologní peptid.
V některých ffizníeh proteinech N - terminální segment Αβ se fázuje svým N-koncem s heteroleguán nosičovým peptidem. Stejné druhy N-terminálnitíh segmentů Αβ se mohou využit jako v -terminální fuze, Stejné fúzni proteins obsahují heterologní peptid spojeny sN-koncem N~ tenninálního segmentu Αβ který' se naopak váže najeden nebo více dalších N-terminálmeh segmentu Αβ v tandemu,
Některé příklady řůznícb proteinu vhodných pro použiti podle vynálezu jsou zobrazeny dále v textu, Některé tyto fúzní proteiny obsahuji segmenty Αβ spojené s epi-opy toxoídu tetanu, které se popisuji v dokumentu US 5 196 512, EF 378 881 a EF427 347. Některé fúzní proteiny obsahuji segmenty Αβ spojené s nosičovými peptidy popsanými jsou dokumentu US 5 736 142. NěCZ 394876 B6 které heterologní peptidy jsou univerzální epítopy T buněk, V některých metodách činidlo pro aplikaci je jednoduše jediný fúzní protein se segmentem Αβ spojeným $ heterolognim segmentem' v imcáiní konfiguraci. U některých metod je umdio maltimér ložních proteinu reprezentovaný obecný ní v zun em 2\ ve kterém, symbol x jc cele číslo od 1 do 5, Symbol x je s výhodou 1, 2 nebo 3, phčemž nejvýhodnějši je, když symbol, x. je 2. V případě, že symbol x je 2, pak takový mulhmér ma Čtyři fúzní proteiny spojené s výhodou konfigurací, která se nazývá MAF4 (popisuje se v dokumentu OS S 229 490). Epítopy Αβ jsou podtrženy.
Konfigurace MAP4 jé zohnwpa dále v textu, kde se produkují rozvětvené struktury syntézou to počátečního peptidů na N-konci g aminy posuanmeh rvte/cu lyzhm. V závislosti ua počtu násobku lyz.inů je začleněno do sekvence a na možností u>zvětven, výsledná struktura bude prezentovat více N-konců, V tomto příkladu se ha rozvětveném lyzínu, který obsahuje jádro, vytvořily ětyti shodné N-konce, Taková mnohočelnostvelmi zvyšuje odpovědi příbuzných B buněk.
Peptid·'
Peptid
Pepdd
KGG
KA íš
AN90540 (Αβ: f-T/toxcsid tetanu §39-844 v konfigurací MAP4).{SEQ4 ID NO: 52):
daeFRHLD YIKAJÍ sKfx gi tel
ÁN90559 (Ag I-7.ÁoxoÍd tetanu 947-967 v konfiguraci MAP4) (SEQ ID NO; 53):
DAEFRRDF»NFTVSěW«RVPmASHX«£
AN90542 (Ag i -7'toxoid tetanu 839 -844 v 947-967 lineární konfiguraci) (SEQ ID NO: 54):
D AS FRH OQ Yl KAMS KΠ GI TEL FfiMFTVS FWLRVPKVS ASHLE
AN90576 (Ař, 3-9/toxOid tetanu 830-84d v konfiguraci MAP4) (SEQ ID NO: 55):
.to
E FRH PSGQY X KA M S KFIGI TEL
Peptid se popisuj®· v dokumentů US 5 736 142 (všechny lineární konfigurace):
AN90562 (Αβ 1-7/peptid) (SEQ ID NO: 56): AKXVAAWTLKAAÁDAEFRHD
AN90S43 (Αβ 1.-7/) (ŠEQ ID NO: 57): DAEERHDPAEERiJDDABERHDAKXV AA WTÍMAAA
Jiné příklady fózaich-proteinů (imunogenní epitop Αβ je znázorněn tučným písmem) zahrnují: (SEQ ID MO: 58): AKXVAAWTLKAAA-DAíMmB-OAErBHlS-BAEFMro
- lg
CZ 304876 Bó
| (SBQ | IQ NO: | 59) ; | SAEFRHD-AKXVAAWLIAAÁ | |
| (SEQ | ID | NO:: | 60) : | BAFFROD-ISQAVHA.AHAEINEAGR |
| (SEQ | ID | NO; | 61) : | FRIIDSGY-ISQAVKAABAFINFAGR |
| ? ť-í tes ,·-·. t BruJ | ID | NO: | 62) : | EFRímSG-ISQAVHAAHABíNEAGR |
| (SEQ | ID | DO: | 63) : | FKYVKQNTLKLXr-DAEFRKD-ĎAEFRHÍÍ-DíkEFRHD |
| i SEQ | ID | DQ: | 64) s | DAEFRHO-PRYYKQNTIXLAlByAEFRHD |
| (SEQ | ID | NO: | 65) : | DA£FRHM>AEFřIHR’lE4EFRí5ÍWPKYYKQNltKLAF |
| (SEQ | ID | NO; | 66) : | aAEFSinFDAEFROD-FKYYKQNTLKLAT |
| (SEQ | ID | NO: | 67) : | DAEFRHD-PKYYKQTOXtAT-EKKIAKMEKASSVFNY- |
| (SEQ | ID | DO: | 68) : | QYiONSWGm'MH'VSFWRYFKVSASřO4>AEFR0» |
| PAEFRÍiD-DAEFRflB-DAEFRHD-QYIKANSKFÍGlTFL- | ||||
| IWFT9'SFWRVFKYSASHLE | ||||
| (SEQ | ID | NO: | 69) : | |
| / QEXO | τ n | Kli). | ?0i - | OAEFRElO-QYIKANSKFiGrffXCfWnAhFFWtRVFKVSASHtE |
| í | ,i. L·1 | ř QJ Λ | DAF.FR.íiD-QYlKANSKFIGlTEt.GFNNFTVSFWLRVFKVSASHtE~ | |
| daefrrd | ||||
| (SEQ | ID | DO: | 52) : | DASřRSD-QY Σ KMSKFXSIT EL na |
pryskyřici $ dvěma větvemi peptid tys-Giy-Cys peptid (SEQ ID NO: 71) (syaukleisový ftei protein v konfiguraci MAP--4);
EQVTNVCGAÍSQAVHAAHAEWEAGŘ
Při vytvoření imunogenň, které se používají pro vytvoření protilátek proti Αβ, které jsou vhodné m pro využití pří pasivní imunizaci, se používají stejné nebo podobné nosičové proteiny a metody spojení Například Αβ nebo fragment spojený s nosičem se může aplikovat laboratornímu zvířeti při produkci mouokiouálnfch protilátek proti Αβ,
4, Nukleová kyselina kódující. terapeutická činidla ts
Imunitní odezvy proti amyloidhím depozitům se mohou také vyvolat aplikaci nukleových kyselin, které kódují segmenty peptidu Αβ a jejich fragmentů, jiných peptidových imunogenů nebo protilátek a jejich řetězen komponentu užívaných pro p3M\m mmm/aeh Takové nukleové kyseliny mohou být DNA nebo RNA, Segment nukleové kyseliny kódující jmunogen je v typickém
2(i případě spojen s regulačními elementy, jako je promotor a zesilovač, který umožňuje expresi segmentu DNA v požadovaných cílových buňkách pacienta. V případě exprese v krevních buňkách, jestli je to nutné pro vyvolání imunitní odezvy, elementy promotoru a zesilovače z genů lehkého nebo těžkého řetězee imunoglobulinu nebo hlavní intermediální časný promotor a zesilovač CMV jsou vhodné k přímé expresi, V případě aplikace dvouřetězeovyeh protilátek se mo· hon dva řetězce klonovat do stejných nebo separovaných vektorů.
Je dostupná řada virových vektorových systémů, které zahrnuji retovirové systémy (popisuje se například v publikaci kawie and lůmim Car. Opím Genet. Deveíop. 3, 102 109 (1993)), aďeaournvť \ektory i porušují, se na přiklad s publikum Rett et D, i Viral. 67. .‘to ti G99Qi), nde- 19CZ 304876 BS noasoctované virové vektory (popisuje se například v publikaci Zbon et al,, J, Exp, Med. 179, 1867 (1994)). vírové vektory z rodiny neštovic, které zahrnuji virus vakein.te u vin··'planých neštovic, vírové vektory z rodu alfa vi.rt), jako jsou ty získané ze $ mdbiho a Semlíkibo víru (-popisuje se například v publikaci Dubensky et al., J. Vírol. 70, 598-519 (1996)), venezuelsky s, us koňské encefalitidy (popisuje se v dokumentu US 5 643 576) a rhahdoviry, jako je virus vesAulámi stomstitidy (popisuje se v dokumentu WO 96/34 625) a papilomaviry (pop suje se vpublikac? Obe ět--al.„ Human Gene therapy 6, 325-333 (1995), Woo et al.. WO 94/12 629 a Xiao and Brandsma, Nueíeie Acids. Res, 24, 2630-2622 (1996)), m DNA kódující Imunogen nebo vektor obsahující DNA kódující imunogen mohou být baleny do Upozorní), Vhodné lipidy a příbuzné analogy se popisují. v dokumentu US S 208 036, 5 264 618, 5 279 833 a 2 283 185. Vektory a DNA kódující imtmogen se mohou také adsorbovat nebo mohou být spojeny > určitými nosiči, které například, zahrnuj i polymetbylmetbakrydátové polyméry a polvbíkbdy a poiy(laktid -ko gly kol Idy) (popisuje se v publikaci McGee et al,, 3. Micro Encap.
(1996?),
Vektory pro genovou terapii nebo samotná. DNA se mohou, zavést in vivo aplikací jednotlivým pacientům v typickém případe systémovou aplikací (například intravenózně, Íaíraperftoneálné, nasálue. do zaživ .tuho traktu, intrafemálně, lnlramuskulámé5 subderroáloě nebo inttnkranlálně
Inťózsj nebo povrchovou aplikací (popisuje se například v dokumentu US 5 399 346), Takové vektory mohou dále zahrnovat činidla, jako je bupivacín (popisuje se v dokumentu OS 5 593 97Q), DNA múze byt také upltkosana m použiti genové pušky tηοροηηϋ se v publika^· Xsao nud Brandsma, Nueidc Acids. Res, 24, 2630-2622 (1996?) DNA kóduitet imunogen se sráží na povrchu mikroskopických kovových částic, Mikroprojektily se zrychluji šokovou vlnou nebo ex25 panzí plynného hélia a pronikají tkán* do hloubky několika buněčných vrstev (The Acoel* Cíene dělí vety Device, vyrobeno Ágaceťus, lne Middlcton, WI). V jiném připadá samotná DNA prochází kůží do krevního řečiště jednoduše nanesením DNA nu kůži s chemickým nebo mechanickým drážděním (popisuje se v dokumentu WO 95/05 853).
3« V jiném případe vektory kódující imuoogeny se mohou zavést do buněk ex vivo, kterými jsou buňky exploatované z jednotlivého pacienta (například lymtbeyty, aspítáfy kostní dřeně, biopsle tkáně) nebo univerzální donorové bem&fopoieticke kmenové buňky, pak následuje reímpíaniace buněk do pacienta obvykle po výběru buněk které mají začleněný vektor.
Π1. Testovaní protilátek za účelem zjištění odstraňující aktivity
Vynález popisuje metody testováni aktivity protilátky pro odstranění amyloidsího depozitu nebo tof-volného pucho antigenů nebo asociované btotomeke ertňs, v případě které je po/am-vaná aktivita pro odstranění. Aby se testovala aktivita proti amyfotdmmu depozitu, vzorek tkáně·
4ís z mozku pacienta s Atzbeimvrovou nemoci nebo zvířec; model, který vykazuje charakteristickou patologií Alzheimerovy nemoci, ie v kontaktu § řágocytámimi buňkami, které nesou receptor Fc. jako jsou mikrogliálnl buňky, a s testovanou protilátkou v kultivačním médiu tn vitro. Fagoevtárm buňky mohou být primární kulturou nebo buněčnou linií, jako je BV-1, U&--B4 nebo THE-1,0 některých metod se mohou komponenty kombinovat na mikroskopickém sklíčku, přičemž do45 chází k mikroskopickému monitorováni. U některých metod se pnoede paralelně více reakci v prohlubních mikroíiímém destičky. V takovém formátu separované miniaturní mikroskopické sklíčko se muže přenést do oddělených prohlubni nebo na detekční formát, který se detekuje jinak než mikroskopicky, jako je detekce Αβ testem l/LISA, Provedou se série měření množství amyloldního depozitu v reakční směsi m vitro, začíná se ze zakladu i hodnoty, dříve než proběhne se reakce a dále následuje jedna nebo vice testovacích hodnot během reakce. Antigen je možně detekovat barvením, například fluorescenčně ztracenou protilátkou proti Αβ nebo jiného komponentu amyloidmeh plaků. Protilátku používaná jako počáteční materiál muže nebo nemusí bý t stejná jako protilátka, u které se testuje její odstraňující aktivita. Redukce vztažená k základní hodnotě běhen? reakce amyloidmeh depozitu indikuje, že testovaná protilátka ma odstraňuj tet aktivitu.
-20CZ 304876 BS
Takové protilátky mohou být pravuer nebo jiné atnyloíáogennf němost ě použitelné při prevencí nebo léčbě Ál&heimerovy
Analogově metody se mohou použít fc testování protilátek za účelem zjištění aktív iiypři odstranění jiných typů biologických entit. Tento test se muže použít při detekci odstraňující aktivity proti libovolnému typu biologické entity, V typickém případe biologická entitu má nějakou nioby v lidském nebo zvířecím onemocnění. Biologická entita se může připravit jako vzorek tkáně nebo izolovaná torma. Jestliže se vyskytuje jako vzorek tkáně, tento vzorek se s výhodou neíixuje a umožňuje rychlý přistup vzorku tkáně a zabraňuje kooformaci komponentu náchylných k zafixování. Příklady tkáňových vzorku, které se testovaly v tomto testu zalutmjl tkán zhoubného bujeni, pre-karoinogermí tkáň, tkáň obsahující benigní růst, jako jsou bradavice a mateřská znaménka» tkáň Infikovanou patogenímí organizmy, tkáň infiltrovanou záaěthvýmt buňkami, tkáň nesoucí patologické matrice mezi buňkami (například fibrmózm perík3n.bíída}, tkáň nesoucí aberujfcí antígeny a zjizvenou tkáň. Příklady izolovaných biologických entit, které se mohou použit, zahrnují Αβ» virové antígeny nebo vity, proteoglykany, antigeny jiných patogenních mikroorganizmy, nádorově antígeny a adhezivní molekuly. Takové antígeny se mohou získat z přirozených zdrojů» rekomhmarsteí expresi nebo chemiekou syntézou. Vzorek tkáně nebo izolovaná biologická entito přijde do kontaktu s fagocytárnimi buňkami, které nesou receptury bc, jako jsou monocyty nebo míhroglíaím buňky a protilátku, která sv testuje vkulíixačmm mediu, Frolitátka muže byt proti biologické entitě v testu nebo proti antigenů asociovaným $ entitou, Později se u objektu, testuje, zda biologická entita je zástupně fagocytována $ aatigěňems Obvykle, ačkoli to není nutné, protilátka a biologická entita drive než. se přidali fágoeyíícké buňky (někdy spojená s amigenero) jsou vzájemně v kontaktu. Koncentrace biologické entity atitebo asociovaný antigen, je-Ti přítomen, zůstává v kultivačním médiu a pak se monitoruje. Snížení mnozstv i nebo koncentrace antigenů nebo asociované biologické entity v kultivačním médiu «kazme. ze protilátka vykazující' odstraňující odezvu na antageu atitebo.asociovanou biofogíekOa entitu vkoniugaei s; buňkami t popisuje se například v příkladu 14).
IV. Pacienti podrobeni léčbě
Pacienti, kteří se podrobili léčbě, zahrnuji jednotlivce, jimž hrozí onemocnění, ale nevykazují symptomy, stejné jako pacienti, kteří již vykazuji symptomy. V případě Aizheimerovy nemoci se vybral pacient, který· je v nebezpečí, že trpí Alzhetmerovou nemoci, pokud žije dostatečně dlouho. Proto se tyto metody mohou aplikovat profilakticky na obecnou populaci, aniž je potřeba zhodnotit nebezpečí pacienta. Současné metody jsou zvláště použitelné u jednotlivců, které vykazují genetické nebezpečí Aizheimerovy nemocí, Inkovi jedincí zahrnuji ty, kteří máji příbuzný, kuří Ups tnuto onemocněním i ty, jepchž nebezpečí je stanoveno analýzou genetických nebo biochemických markérů, Genetické markéry nebezpečí v případě Aizheimerovy nemocí zahrnují mutace v genu APF, zvláště mutace v poloze 717 a 670 a 671. které jsou známy jako mutace podle ííyrdybo a Swedíshe tHardy, HNS20, 154 (1997)). Jiné markéry nebezpečí jsou mutace v genech pnesenilutu. PSI a P,$2 a ApoE4, historie v rodině týkající se AD, hypercholesterolemie nebo atherosklerózis. Jednotlivci trpící Alzhelmerovou nemoci jsou rozeznávány na základě charakteristické demence. stejně jako přítomností nebezpečných faktoru popsaných shora v textu. Navíc pro identifikaci jednotlivců, kteří trpí AD, je dostupná řada diagnostických testů. Tyto testy zahrnují měřem množství CSG tou a Αβ·*2. Zvýšené množství tou a snížené množství Αβ42 znamená onemocním AD. Jednotlivci trpící Alzheňnerovou nemocí se mohou také diagnostikovat použítun kriteria ADKDA, jak se diskutuje v příkladech.
li pacientů, kteří nevykazují symptomy, muže léčba začit v libovolném stáři (například v deseti, ve dvaceti a ve třiceti letech). Obvykle však nerti začit léčbu dříve, než pacient dosáhne čtyřiceti, padesáti, šedesáti nebo sedmdesáti let. Léčba v typickém případě vyžaduje více dávek v určitém časovém úseku. Léčba může být monitorována testováním protilátek nebo odezvami I - buněk nebo Et baněk na terapeutické Gnidlo (například peptid Afil Jestliže odezva klesá. Indikuje se posilovači dávka, V případě pacientu s Downovým syndromem, léčba muže začít v prenatálním stádiu aplikaci terapeutického činidla matce nebo krátce po narozeni.
•21 CZ 384876 Bé
V. Léčebné režimy
V případě prolytektíckých aplikací se fenaceutjcké prostředky nebo léčiva aphkují pacientovi, který je náchylný neboje v nebezpečí Á&hetnteroyy nemocí v množství. ktero je dostatečné, aby s eliminovalo nebo snížilo nebezpečí, omezilo vážnost onemocnění nebo oddálíte projevy Onemocnění. které zahrnuji biochemické, hístoíogiekě symptomy a/nebo symptomy v chování, komplikace a zprostředkovaně patologické fénotypy, které se projevuji během vývoje onemocnění.
V případě terapeutických aplikaci se prostředky nebo léčiva aplikují pacientovi, který trpí nebo se očekává, že bude trpět nemoct v množství, které je dostatečné pro uzdraveni nebo alespoň časní tečnému zastavení symptomů onemocněni (biochemické, hístotegíeké symptomy a symptomy chování)., které zahrnují komplikace a zprostředkované patologické fěnotypy pri vývoji onemocnění. ti některých metod aplikace činidla redukuje nebo eliminuje myokognítívni poruchy n pacientů, kteří ještě nemají vyvinutou charakteristickou patologii Alžheímeřovy nemoci. Množství udekvatm pro provedení terapeutické nebo profylakíické léčby se definuje jako terapeuticky nebo β prmýíaktícky účinná dávka. V proíylaktíekém nebo terapeutickém režimu se činidla obvykle aplikují v několika dávkách, až: se dostatečně aktivuje imunitní odezva. V typickém případě imunitní odezva se monitoruje, a jestliže imunito! odezva slábne, aplikuje se opakovaná dávka.
Účinné dávky prostředků podle vynálezu pří léčbě shora popsaných stavů kolísají v závislostí na ® řadě různých faktorů, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologický stav pacienta, zda pacient je člověk neb,’ zvíře, zda se aplikuji jiné léky a zda léčba, je profýlakticfeá nebo terapeutická Pacientem je obvyklo úlovek, ale mohou se také léčit zvířata, která zahrnují. transgenní savce. Léčebně dav ky je nutné tiírováí, aby se optimalizovala bezpečnost a účinnost Množství ímunogertu závst na skutečnosti, zda se také aplikuje adjuvans. Pří nepřítomnosti adjuvans je
2S nutné vyšší ttevka. Množství aplikovaného imunogenu někdy kolísá v rozmezí 1 až 500 pg na jednoho pacienta a více obvyklé je rozmezí i až 500 pg na jednoho pacienta a více obvyklé je rozmezí 5 až. 500 pg, což se aplikuje člověku injekci, .lc možné injekci aplikovat I vyšší dávku, ktem se pohybuje v rozmezí 1 az 2 mg. v typickém případě se používá dávka 10. 20, 50 nebo 100 pg. Koncentrace tmunogenu také závisí na hmotnostním poměru epitopu Imunogenu v irnu•o nogenu ku hmotnosti mvitnogemt jako celku, V typickém případě na jeden mikrogram imttnogerm se použije IO’ až 10 ' rnikrornolů epitopu imnnogeny. Časový režim injekci muže v podstatě kolísat jednou denně, jednou za rok a jednou za deset let. V daném dni. kdy se aplikuje dávka ioumogerm, se pacientovi aplikuje dávka vyšší než I pg a obvykle ie vyšší než 10 pg, jestliže se také aplikuje adiuvans a muže být vyšší než 10 pg a. obvykle je vyšší než i 00 pg, když se ad·· ss juvans neaplikuje. Typický režim zahrnuje imunizaci, po které následuji v časových intervalech zesilovací injekce, intervaly mohou být například 6 týdnů. Jiný režim zahrnuje imunizaci následovanou zesilovacími injekcemi, které se provádí o L 2 a 12 měsíců později. Jiný režim zahrnuje aplikaci injekce každé dva měsíce po celý život. V jiném případě se posilující injekce aplikuji nepravidelně na základě monitorování imunitní odezvy.
V případě pasivní imunizace protilátkou rozmezí dávky je od přibližně O.OOfil az íí)0 mg/kg a obvykleji 0,01 až 5 mg kg tělesné hmotnosti hostitele. Dávky například mohou být' I mg/kg tělesně hmotností nebo 10 mg/kg, tělesné hmotnosti nebo v rozmezí I až 10 mg/kg. Přiklad léčebného režimu zahrnuje aplikaci jednou ze každé dva týdny nebo jednou za měsíc nebo jednou za
4,5 každé > až 6 měsíců. Pri některých metodách se dvě nebo dce monoklonálnich proti látek s různými vazebními speeifitami aplikuji současné, přičemž v tomto případě dávka každé aplikované protilátky spada do označeného rozmezí. Protilátka se obvykle aplikuje ve více dávkách, intervaly mezí jednotlivými dávkami mohou být týden, měsíc nebo rok. Intervaly mohou být také nepravidelné, povíte měřeni množství protilátky v krvi pacienta proti Λβ. V některých metodách, se dávka nastavila tak, aby se dosáhla koncentrace protilátky v plazmě i až I 800 gg-tni a u některých metod je to 25 až 300 ng/ml. V jiném případě se protilátka muže aplikovat jako formulace s nepřetržitým uvolněním. Dávka a frekvence kolísá v závislosti na poločasu rozpadu protilátky. V obecném případe lidské protilátky vykazuji uejdelši poteca? rozpadu, pak následuji humanizované protilátky, chiměrové protilátky a protilátky, které nejsou lidské. Dávka a frekvence
- 22 CZ 304876 Βδ aplikace můře kolísat v závislosti na skutečností, zda lěěha je praly laktróká nebo terapeutická. PH profylaktické aplikací se aplikuje relativně nízká dávka v relativně častých intervalech po dlouhý časový úsek. Některým pacientům se aplikuje léčba po zbytek jcueh života. Při terapeutické aplikací je někdy nutná relativné vysoká dávka v relativně krátkých intervalech až do oka5 mžiku, kdy se redukuje nebo ukonči postup onemocnění a s výhodou dokud pacient vykazuje částečné nebo úplné odstranění symptomů onemocněni. Pak roůfc pacient přejít na protýlaktický režim.
Dávky nakleovýeh kyselin kódujících íronnegeny jsou v rozmezí od 10 ng do lg, i00 ng do u> 100 mg, 1 pg do 10 mg nebo 30 až 300 pg DNA v případě jednoho pacienta.. Dávky vhodné pro infekční virové vektory1 kolísají od 10 do 100 nebo více vírionů v jedné dávce, tbrodla vyvolávapcs imunitní odezvu sc «robou aplikovat parenteralnnn, íoprokým, mtravenoz utru. orálním, scbkníánnim, intraarteriálnim, íntrakraniáluhn, bnraperifoneáhnm, iníranasálaíhi
1$ »ebo íntrarou-dmkn-mro způsobem vhodným pro profýlakci a/aebo terapií. Nejvícetyplekýnt způsobem aplikace 'nnmogenmho činidla je stAkutánm aplikace, ačkoli ostatní způsoby mohou, být stejně účinné. fialami bsvnym způsobem jo mtt-amuskulároí injekce. Tento typ injekce se v typiekém případě zavede d«> svah; na paži nebo noze PH některý v h marodách se činidla zavedou injekci přímo do určité tkáně, kde se akumuloval depozit. Příkladem je rotrakraníální injekce. Při zo aplikaci protilátky se preferuje intramuskuiárm injekce na intravenoznt fúzi. PH některých metodách se určité terapeutické protilátky zavádějí ufekci přímo do lebky Pří některých metodách se protilátky aplikuji .jako nepřerušované nvodnosaný prostředek, jako ic například Medlpad”.
Činidla podle vynálezu se mohou aplikovat: v kombinaci s jinými Činidly, které jsou alespoň Čás25 tečně účinné pří léčbě amyloldního onemocnění. V případě Abtóroerova a Dowoova syndromu, kdy se amyloidogenm depozit objevuje v mozku, činidla podle vynálezu se mohou ta^é aplikovat, ve spojeni sjinými činidly; které zvyšují prostup činidel podle vynálezu přes bartern krevntozek.
ta Imunogenní činidla podle vynálezu, jako jsou peptidy, se někdy aplikuji v kombinaci s adjuvans, V kombinaci s pepíidem se mohou použit různá adjuvans,, jako je Αβ. aby se vyvolala imunitní odezva. Výhodné adjuvans zvyšuje íntrínsiekon odezvu na irmmogen, aniž způsobuje kouformaěni změuy v imunogenu, který' ovlivňuje kvalitativní formu odezvy. Výhodná adjuvans zahrnují hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, 3-de-O-aeylovaný monofosforyllipid A (MPL*) (popísn-35 je se v dokumentu GB 2 220 211 (R1BI immunoChem Research lne., Hamilton. Montana, nyní součást Coríxa), Přípravek Stimulem XQS-2 i je trlterpenglykozld nebo sapottm izolovaný z kúry stromu Qudlaja Saponaria Molina, která roste v Jižni Americe (popisuje se v publikaci Poweil and Netvmann, Plenem Press, NY, 1995, v dokumente DS 5 057 5-10 (Aqttila BioPharmaeeuticals, Fťammgharn. MA). .lina adjuvans jsou oleje ve vodních emulzích (jako je skvalen nebo araao šidový olej; v kombinací se stlrnelanty imunity., jako jsou monofosforyllipid A (popisuje se v publikaci Stoute et ah, N. F.ngl. i. Med. 336, 86-91 (1997)). Jiné adjuvans je CpG (popisuje se v dokumentu WO 98/40 100). V jiném případě Αβ se muže spojit » adjuvans. Takové spojeni by však nemělo podstatně změnit kon formací Λβ stejně jako podstatu ímunitei odezvy na Αβ. Adjuvans sc může aplikovat jako komponent, terapeutického prostředku s aktivním Činidlem-nebo se může aplikovat oddělené, jako konkurence terapeutickému činidlu nebo po jeho aplikací .
Preferovaná třída adjuvans jsou sole hliníku (alum). jako hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitý. Taková adjuvans se mohou použít a nebo bez jmých .specifických imunostimulačnlch činidel jako je MPL nebo 3-DMR, QS---21, polymemí nebo monomemí aminokyseliny, jako
SS yc polyglutamová kyselina nebo polylyzin. Jiná třída adjuvans je emulze oleje ve vodě. Taková adjuvans se mohou použít s nebo bez specifických Imunosrimaiacmeh činidel, jako jsou můra· tnylpeptldy (například N-acetYlmuramyl-L-threonyl-D-iscgíutamín íthr-MPD), N-acetylnormurarnyl· L-alanyl-D-ísogluuwtsin (nor-MDlH, N-aeetylmyramyl~L-alaRy|-E>-isogl«tanfinvl-.i..“ahnfin--2-(l ''-Žklípa.imitoyl-sn-glycerrroJ-hydroxyfosforyloxyy-elhyiamin (MTP···
SS PB), N-scetylgluksaminyl-A acetylmurornyl-l.-A 1-D--isoglu-i..Ala--íIipalmitoxypropykunid
CZ 394S7Ů 86 (DTP -DPRtheraurfoTM) nebo jiné komponeiny· buněčně stěny bakterií. Emulze olej ve vodě ohrnuji a) MF59 (popisuje se v dokumentu WO 96/14 §3?) obsahuje 5 % sk valen, 0,5 % Tweeň 80 a 0,5% Spán 85 (obsahuje různé množství MTP-PE), které tvoří sníunikrónové částice za použiti mikroíluidízéru, jako je model ΠΟΥ (Mtcrofluidics, Newton MAt, b) SAE který obsahu5 je 18% skvslen, 0,4 % Tween 80, 5 % pluronieký blokovaný polymer 1-Í21 a thr-MDP, buď mikrofiuidízovaný do snhmikrónové emulze, nebo se rnfehai vorfexem za vzniku emulze s velkými částicemi a e) adjuvaněm systém Ribí* (RAS) (Ribí iuuutmoChem, Hamihon, ΜΓ), který obsahuje 2 % skvalen, 0,2 % Twcen 80 a jeden nebo více komponentů buněčné stěny bakterií ze skupiny zahnmiici mono fosfory! lipid A (MPL), dímykolát trehalosy (TDM) a skleton to buněčně stěny (CWS), přičemž se uprednosfcje MPL + CW$ (Detox''j Jiná třída preferovaných adjuvans je sapettinové adjuvans, jako je Stmwlon“ (QR~2l, Aquíla, Pramingham, MA) nebo z nich vytvořeno částice, jako je ÍSCOM (imunostímulaěni komplexy) a ISCGMATRÍX. Jiná adjuvans zahrnuji úplné Freundovo adjuvans (CPA) a neúplné Freundovo adjuvans (IFA). Jiná adjuvans zahrnují cyfokiny, jako je interleukin (IL-L ÍL-2 a IL-12), faktor stimulujfcí makls rofágové kolonie (M-CSF), faktor nekrózy nádoru íŤNF).
Adjuvans. se. může aplikovat s únnnogenem jako jediný kompozice nebo se muže aplikovat před imunogenem,. nebo jako konkurence a. nebo pop aplikací ímunogeno. imunogen a, adjuvans se mohou dávkovat do stejné zkumavky, nebo se mohou dávkovat do oddělených zkumavek a mízo chat se dohromady před použitím, funmogen a adjuvans se v typickém případě Itali se značkou, která indikuje terapeutickou aplikací. Jestliže se ímunogen a adjuvans balí odděleně, puk jednotlivá balení v typickém případě zahrnují instrukce pro smícháni před použitím. Volba adjuvans a/nebo nosiče záleží un stabilitě Imunogenní formulace, která obsahuje adjuva&s, způsobu aplikace, dávkového plánu, účinností ndjuvnns pro některé vakcínované druhy a a lidi farmaceuticky pfijafsteé adjuvans, je adjuvans vhodné pro aplikaci lidem. Úplně Freundovo adjuvans není vhodné pro aplikaci lidem Výhodně je Alum, MPL a QS--2I. Současné je možné použít dvě nebo více .adjuvans. Preferované kombinace zahrnuji alum s .MPL, alum s QS-21, MPLa Q5---21 a alum, QS-21 a MPL. Můře se také použít neúplné Freundovo adjuvans (popisuje se v publikaci khaugetdí. kfoaneed D.ug Del noty Revtews '2, 17' 18o 119‘>8 n \ kombmac s alum, D9 21
a. MPL aje možné použít v sedmy jejich kombinace.
Činidla podle vynálezu se mohou často aplikovat jako farmaceutické prostředky obsahující aktivní terapeutické činidlo a různé jiné farmaceuticky přijatelné komponenty (popisuje se v publikací Remington s Pharmaeemiea! science (I5th ed., Mack Publishing (.'otupnuv, Easton, Pennsyi 35 \ama Wěo. preferovaná forma závist na módit aplikace a ícmpeutické aplikace Prostředky mohou také zahrnovat v závislosti na požadované formulaci, farmaceuticky přijatelné netoxické nosiče nebo ředidla, která se definují jako nástroje běžně používaná k formulaci farmaceutických prostředků pro aplikaci zvířeti nebo člověku. Ředidlo se vybralo tak. že neovlivňuje biologickou aktiv stu kerobmaec Příklady takových ředidel jsou destilovaná voda, tyooieCKfo ^oztok ptiíro40 vany fosforečnanem, Riagerovy roztoky, roztok dextrózy a Fkmkenúv roztok. Navíc farmaceutický prostředek nebo formulace muže také zahrnovat jiné nosiče, adjuvans nebo netoxické, ueterapeutícké, neímunogenm stabilizátory a podobně.
Farmaceutické prostředky mohou také zahrnovat velké pomalu metabolízované makromolekuly, jako jsou proteiny, póly sacharidy, jako je chitosan, kyselina mléčná, polyglyhoíově kyseliny a kopolymery (Iako je latexem íunkcionalízovaná sefaróza’', agaroza, celulóza a podobně), polymémi aminokyseliny, aminokyselinové kopolyméry a lipidové agregáty (jako je kapky oleje nebo lipozomy). Navíc tyto nosiče mohou fungovat jako hmmoshmuktčm činidla (to je jako adjuvans).
se V případě parenterální aplikace se činidla mohou aplikovat jako dávky roztoku nebo suspenze látky ve fyziologicky přijatelném ředidle s farmaceutickým nosičem, kterým může byt sterilní kapalina, jako je voda, oleje, fyziologický roztok, glycerol nebo etanol, ve vhodné formě pro zavedení injekc í Prostředky mohou navíc obsahovat auxiliámí látky, jako jsou smáěecí a emulzifíkačni činidla, povrchová činidla, látky vhodná pro úpravu pH a podobně, Jiné komponenty far55 maceutíchých prostředků ie minerální olej, zvířecího, rostlujneho nebo syntetického původu- Je
- 24 CZ 304876 fo>
to například arašídový olej,, sójový olej a minerální olej» V obecném případě praferovimýnt kapalným nostčent jsou glykoly, jako je propy lengNko! nebo polyethylenglykol, zvláště x připadl roztoků vhodných pra zavedení injekci, Pretbatky se mohou aplikovat ve formě depotní injekce nebo implantovaného přípravku, který se může vytvořit takovým způsobem, kíetý umožňuje nepřerušované uvolněni aktivní látky. Příklad prostředku obsahuje monoklonální protilátku v koncentrací 5 mg/mí, vytvořenou ve vodném point, který'Obsahuje 50 mM L histidin, ISO mM NaCl, přičemž pH se upravilo HC! na hodnoto 6,0,
V íypfckétn případě se prostředky připravují v i.njektovatelně formě, buď jako kapalné roztoky i« nebo suspenze, pevné formy vhodné pro roztok nebo suspenzí, před aplikací injekce se mohou také připravit kapalné nástroje. Přípravky mohou také byt.vs fbrraě emulze a kapsnlí lipozomů nebo jako mikročástice, jako jsou polyiaktid, polyglykolid nebo kopolymer pro zesílení adjuvančoího účinku, jak se diskutuje shora v textu (popisuje se v publikaci Langer, Science 249, i r?7 11990) a Kaneš, Advanctd Drog Delúery Retlcos 28, «7-{19 (tob?) CšmdU podle vsna55 lezu se mohou aplikovat vv formě depotní injekce nebo implantovaného přípravku, který může být připomeň takovým způsobem, aby se umožnilo nepřerušované nebo pulzatívní uvolnění aktivní složky.
Další prostředky vhodné pro jiné módy aplikace zahrnují orální, iotrenasálm a pulmonáraí prosa středky, činky a transderntábtí aplikace, čípky, vazebná čirudla a nosiči zahrnují například polyalkylenglykoly a tngiyeendy. Takové čípky se mohou vytvořit ze směsí obsahující aktivní látku v rozmezí 0,5 až, 10.·%, přičemž se upřednostňuje 1 až 2 %, Orální fermuíace zahrnuji plnidla, jako je mániích laktózu, škrob, stearát is hořčíku, saeharin stulíků, celulóza a uhličitan hořečnatý, které svou čistotou je vhodný pro farmaeentíckč použití. Tyto prostředky jsou vs formě roztoku, suspenzí, tablet, piluiý fcapsuiý nepřerušované se uvolňujících formulací nebo prášků a obsahuji 10 až 95 % aktivní složky, upřednostňuje se 25 až 70 %,
Povrchová aplikace může vést k transdennálnimu nebo mtradcrmámimu zavedení. Povrchový aplikace se může provést společnou aplikací činidla s íoxinent cholery nebo s detoxidikovanými deriváty'nebo jejich podjednotk&mi nebo jinými podobnými bakteriálními toxiny (popisuje se v publikací Gienn et al... Nátuře 851 (1998)). Společné aplikace se může dosáhnout použitím Komponentů, jako je směs molekul nebo vázané molekuly získané chemickým zesílením nebo express řúzniho proteinu,
V jiném.přšpadč se íransdersnáíMho zavedeni může dosáhnout prostupem kůží nebo použitím transferozómů (popisuje se v publikaci Paul et al., kur. J. Immunol. 25. 3521-24 í i 995 χ Cevc et ak, Biochem. Biophys. Acta 1.368.201-15 (1998)).
VI. Diagnostické metody
Vynález popisuje metody detekce imunitní odezvy proti peptidu Αβ u pacienta trpícího Alzheiměrovou nemocí. Metody jsou zvláště použitelně pít monitorování proběhu aplikované léčby,
Metody se mohou použít při monitorování terapeutické léčby u pacienta se symptomy a u paciente, n kterého se symptomy neprojevují. Metody je možné použit při monitorování aktixní imunizace (napnklad protilátka produkovaná pří tadezvé na aplikaci imunogemR a pasivte intumzuce (například mořem množství aplikované protilátky).
se 1. Aktivní imunizace
Některé metody zahrnuji stanovení základní hodnoty ímunítm odezvy u pacienta před aplikací dávky činidla a porovnáni této hodnoty s hodnotou imunitní odezvy po léčbě. Podstatné zvýšeni' (to je vyšší nez je typická hranice experimentální chyby při opakovaném měřeni stejného vzorku, ss vyjádřeně jako standardní odchylku od průměru takových měření) hodnoty signálů Imunitní ode- 25 ·
CZ 364876 86 zvy výstupu pozitivu léčby (to zihamená» že aplikaci Činidla še dosáhlo mmnitm odezvy nebo se tato imunitní odezva nývU), Jestliže hodnota imunitní odezvy podstatné nemění nebo klesá, indikoval se negaovm vystup- léčby. V obecném případe se očekává, že pacienti, kteří se podrobili počátečnímu průběhu léčby imnnogennjm činidlem, vAa/ují zvýšenou .imunitní odezvu po následujících dávkách. která dosáhne přímky. Aplikace eunoU v obecném případě pokračuje, zatimeo ímumnu odezva roste, Dosaženi stálé hodnoty je mdskatorern skuteénosti, Že aplikovaná léčba může byt* přerušena nebo se muže redukovat dávka nebo frekvence zavedení.
V případě jiných metod kontrolní hodnota (fo je průměrná a standardní odchylka) imunitní odetú zvy se stanoví v případě kontrolní populace. V typickém případe jednotli vci v kontrolní populací nehýb dříve lěěetti. Měřené hodnoty imunitní odezvy u pacienta po aplikaci terapeutického činidla se pak porovnávají s kontrolní hodnotou. Podstatné zvýšení vztaženo ke kontrolní hodnotě ínepfikksd vyšší cvz icdnn standmdns -fdcbslka od průmětu) signálů pozrovmho výstupu léěhv Nedostatek podstatného zvýšeni nebo snížení signálů znamená negativní výstup léčby. Aplikace ís Činidla v obecné® případě pokračuje, zatímco imunitní odezva se zvyšuje ve vztahu ke kontrolní hodnotě Inko pmd dm, dosažení sutic hodnot··, te vtahu ke kontrolním rodn-nám je indikátorem, že aplikace léčby se může přerušit nebo se muže redukovat dávka nebo frekvence aplikace.
V jiných metodách se z kontrolní populace jednotlivců, kteří se podrobili léčbě terapeutickým ta činidle® a jejichž imunitní odezvy un léčbu dosáhly stejné hodnoty, stanov! kontrolní hodnota imunitní odpovědi (například průměrná a standardní odchylka)- .Měřené hodnoty imunit»! odpovědi u pacienta se porovnaly s kontrolní hodnotou. Jestliže se u pacienta naměřené množství podstatně neliší od kontrolní hodnoty (například více než o jednu stnndardtd odchylku), je tpožíté léčbu přerušit, Jestliže imunitní odezva pacienta je podstatně pod kontrolní hodnotou, zaručuje se pokračován? aplikace činidla, .lestiiže hodnota imumtni odezvy přetrvává u pacienta pod komrolrd hodnotou, pak se musí indikovat Změna v režimu léčby, například použití odlišného adjuvans,
1.1 jiných metod se u pacienta, kterému se neaplikuje léčba, ale dříve se podrobil léčbě, monitoruje imunitní odezva, aby se stanovilo, zda je nutné obnovit léčbu Měřená hodnota Imunitní ode30 zvy u pacienta se může porovnat s hodnotou imunitní odezvy, které se dosáhlo u pacienta po předchozím průběhu léčby. Podstatné snížení vztažené k předchozímu měřen? (to je vyšší než typické hranice chyby u opakovaného měření stejného vzorku) indikuje, že léčba snúže byt obnovena. V jiném případě hodnota naměřená u pacienta se může porovnat s kontrolní hodnotou (průměrná. plus standardní odchylka) stanovenou v populaci pacientů po prodělání léčby. V jiném prtpadě numěferu hodnota n ptajertu se mřtže porovnatkontrol® hodnotím ts populac? prutylakticky ošetřených pacientů, kteří zůstávají bez symptomů onemocnění, u populaci terapeuticky ošetřených pacientů, kteří vykázání zmírněni charakteristik onemocněni. Ve všech těchto případech podstatné sníženi vztaženo ke kontrolnímu množství (to je vlče než standardní odchylka) je indikátor, že léčba by meta byt u pacienta obnovena.
V typickém případě vzorky tkáně pro analýzu jsou krev, plazma, séru®, hleny nebo cerebrospináhn kapalina pocházející z pacienta. Vzorek se .analyzoval za účelem stanoveni imunitní odezvy na libovolnou formu peptidu Αβ, v typickém pnpadě ,Αβ-lŽ. Imunitní odezva se může stanovit na základě přítomnosti například protilátek nebo T-buněk. které se specificky váži na peptid Αβ,
Metody E1..ISA detekujid reaktivní í-buňky se popisuji shora v textu (v sekci definice i,
V některých metodách se irratniíni odezva stanov! použitím tes® odstraněni depozitu, jak se popisuje v sekci íll shora v textu, v takových metod se testovaný vzorek tkáně pocházející z pacientu nechá t kontaktu samytoždmm depo/ncm (například zrosši PDAFfi? a >- mgoeytamum buňkami, které nesou receptory Fc. Pak se monitoruje následné odstraněni amyloitfolito depozitu.
ss fixistence a rozsah odstranění poskytuje indikaci existence a množství protilátek účinných při odstraněni Αβ ve vzorku tkáně testovaného pacienta.
.76.
CZ 380 BS
2. Pasivní imunizace
V obecném případě postupy vhodné pro monitorováni pasivn í imunizace jsou podobné těm pro monitorováni aktivní imunizace popsané shora v íextn. Protlládcový profil, který se vytvoří po pasivní imunizaci, v typickém případě ukazuje bezprostřední pík koncentrace protilátek, po němž následuje exponenciální pokles. Aniž se aplikuje další dávka, pokles množství protilátek-dosaženého před léčbou v období od několika dní až měsíců závisí na poločasu rozpadu aplikované protilátky. Například poločas rozpadu některých lidských protilátekje kolem 20 dn í ι o V některých metod se před aplikaci provede u pacienta základní měřeni množství protilátky pro ti
Αβ a druhé měření se provede po aplikaci, aby se stanovil pík množství protilátek, a pak se provedou další měřeni v určitých intervalech, aby se monitoroval pokles množství protilátek. Když množství protilátky poklesne na základní hodnotu nebo na hodnota, která je předem stanoveným, procentem -maximální hodnoty (například 50 %f 25 % nebo 10 %'k aplikuje se další dávka proti35 laiky. Pri některých metodách se maximální hodnota a pak následné měřené množství porovnává s drive stanoveným referenčním množstvím, aby se stanovila výhodný režim profylaktické a terapeutické léčby u jm.ýeh pacientů. Jestliže měřené množství protilátky je podstatně nižší než referenční hodnota (například nižší než průměr minus standardní odchylka referenční hodnoty a populace pacíentó), pak se indikuje aplikace další dávky.
3, Diagnostické kdy
Vynález dále popisuje diagnostické křty pro provedení diagnostických metod popsaných shora v textu. V typickém případě takové kdy obsahují činidlo, které se specificky váže aa protilátky proti Αβ. Kd také zahrnuje značení. V případě detekce protilátek proti Αβ značení je v typickém případě ve formě značených and-idiotypických protilátek. V případě detekce protilátekje činidlo předem vázáno na pevné fázi, jako například v prohlubních titmcnlch destiček. K.ity v typickém případě také obsahuji instrukce pro použiti kitu, Příloha může také zahrnovat graf nebo jiný souhlasný režim odpovídající množství měřené značky s množstvím protilátek proti Αβ, Termín
3« „příloha“ znamená libovolný psaný nebo zaznamenaný materiál, který je přiložen nebo jinak doprovází kit v libovolném čase během výroby, transportu, prodeje a použití. Například termín ,.příloha“ znamená reklamní leták a brožurku, přibalene materiály, instrukce, audio nebo video kazety, počítačově disky, stejné jako texty tištěné přímo na obalu.
3$ Vynález také popisuje diagnostické klty pro provedeni zobrazeni in vivo. Takové klty v typickém případe obsahuji protilátku vázanou na cpitopu Αβ, svýhodou obsahuji zbytky 1 až 10. Upřednostňuje se, ubv protilátka bs ia značena nebo aby kit obsahoval sekundární značící činidlo. Je výhodné, aby byl klf označen instrukcemi pro provedení zobrazovacího testu in vivo,
VIT Zobrazení fe víro
Vynález popisuje metody zobrazeni amvloidnfcb depozitu /« vivo u pacienta. Takové metody jsou použitelné při stanoveni a potvrzení diagnózy Alzheimerova onemocnění nebo náchylnosti k tomuto onemocnění. Metodu je například možné použít u pacienta, kterv vykazuje symptomy
43' demeu.ee. Jestliže pacient vykazuje abnormální amyloidm depozity, pak je pravděpodobné, že trpí Alzheimerovon nemoci. Přítomnost abnormálních depozitů amyioidu indikuje náchylnost k symptomatiekému onemoettení. Metody je možné také použit pro monitorování postupu onemocněni a/nebo odezvy na léčbu pacientů, u kterých se dříve diagnostikovalo Alzheimerovo onemocněni.
Metody fungují na základě aplikace činidla, jako je protilátka, která se- váže na Αβ n pacienta, a po mna/utu ěmmia doeha/f k deteke. Pieťerovaoe pxtoiatk) se vah tsa Jepmoty Αβ u poměrná, aniž se vážou aa polypeptid ΛΡΡ plné délky. Zvláště se preferuji protilátky vázající se na epitop Αβ s aminokyšellnatní 1 až 10, U některých metod se protilátka váže na epitop v amino·· c?
'kyselinách 7 až 10 Αβ, Takové protilátky se· v typickém případě váži, aniž se vyvolá podstatná odezva odstranění. U jiných metod se protilátka váže na epitop vam incky sehnách 1 až 7 Αβ, Takové protilátky se v typickém případě váži a vyvolávají odezvu odstraněni vůči Αβ. Odezvě odstranění se však dá předcházet použitím fragmentů protilátky, kterým chybí konstantní oblast plné délky, jako je fragment Fab, ϋ některých metod některé protilátky mohou sloužit jako léčebné a diagnostické Činidlo, V obecném případě protilátky vázající se na epitopy CHerminálního zbytku 10 Αβ nevykazují silný signa! jako protilátky vázající se na epítópy sc zbytky i až 10, pravděpodobně proto, že C-termlnáhd enitopy jsou v&myloídmm depozitu nepřístupné. Takové protilátky jsou méně výhodné , to
Diagnostická činidla se mohou aplikovat mtravenózní ípjefcel do těla pacienta nebo přímo do mozku tfitekraniální injekci nebo provrtáním díry lebkou. Dávka činidla by měla být ve stejném rozmezí jako v případe lo.ehných metod, V typickém případě se činidlo značí, ačkoli u některých metod se primární činidlo s. afinitou pro Αβ není značeno a sekundární značící činidlo se používá ts k navázání na primární činidlo. Volba značky závisí na způsobu detekce, Ftooreseenění značka je vhodná pro optickou detekci. Použiti paraniagnetíefcýeh značek je vhodné pro íomogrofickou detekcí, aniž je nutné chirurgická intervence. Radioaktivní značky se mohou také detekovat použltmt ΡΕΓ nebo SPÉCT.
Diagnóza se projede pornnanim počtu, velikostí a/nebo intenzity značeného loku s odpovídajícími hodnotami zakladu; linie. Hodnoty základní linie mohou reprezentovat průměrné hodnoty v populací zdravých jcdnmlrien. Hodnoty základní linie mohou také reprezentovat dřívější hodnoty stanovené u stejného pacienta. Hodnoty základní linie se mohou stanovit u pacienta před začátkem léčby a měřené hodnoty se pak srovnávají s hodnotami základní linie. Snížení hodnot.
2S vztažených k signálům základní linie je pozitivní odezva na léčbu,
EréhMob3žtónoýb»g«h
Na obrázku c, 1 je znázorněný títr protilátek proti injekci iransgeum myší s Αβ1~42.
Na obrázku č. 2 je znázorněn amyloidni uzel v hlppoeampusu. Procento oblasti hipokampálm oblasti obsazené nmyloidnimi plnivy definovanými teaktivitou s monoklonální protilátkou 3D6 specifickou pro Αβ se stanovilo počítačovou kvantitativní zobrazující analýzou ímunoteakdvních .w mozkových sekci. Hodnoty u jednotlivých myší se rozdělily podle léčebných skupin. Horizontální čára každé skupiny indikuje střední hodnotu rozděleni.
Na obrázku é. 3 je /.obrozena neuritícká degenerace v híppocatnpasu. Procento oblasti hippocampálni oblasti obsazeně degenerovanými neuritv definovanými jejich reaktivitou s lidskou mono40 klonálni 8F.S specifickou pro APP, se definovalo kvantitativní počPamumoreaktívních mozkových sekci. Hodnoty u jednotlivých myší jsou zobrazeny u skupiny léčené ANI 797 a kontrolní skupiny, které sc aplikovalo PBS- Horizontální čára kuždé sktrpiny označuje středu; hodnotu •tříděni.
Na obrázku ě, 4 jsou zobrazeny astrocyty v retrospleniálrnm kodexu. Procento plochy kottlkátni oblasti obsazeně gliálnim vláknitým kyselým proteinem (GFAP) -pozitivní astroeyty se stanovilo kvantitativní počítačovou zobrazovací analýzou, irnunoreaktivnich mozkových sekcí. Hodnoty u jednotlivých myši jsou rozděleny podle léčené skupiny a střední hodnoty skupin jsou označeny horizontální čarou.
se
Na obrázku č. 5 jsou zobrazeny geometrické průntéry tb.ru protilátek proti Αβ 1 -42 pro imunizaci \ rozsahu osmi dávek ANI792. které obsahuji O.to, 0,4. 1,2, 3,7. 11,33. 100 nebo 300 μη.
~2áObrázek ě, é znázotňtýe kinetiky prothátkové odezvy na imunizaci ANI 792, Tiby se vyjádřil jako geometrleké průměry hodnot pro 6 zvířat v každé skupině.
Obrázek c, 7 znázorňuje kvantitativní analýzu .zobrazení kortikáíníbo amyíoídmho uzlu myši ošetřených PBS a ANI 792,
Obrázek č. 8 znázorňuje kvantitativní analýzu zobrazení neutíového piakověho uzle u myši ošetřených pBS a AN 1792,
Obrázek č. 9 znázorňuje kvantštatívíu analýzu zobrazeni procenta retrospíoníálniho kortexu obsazeného asíroeytózou u myší ošetřených PBS a AN 1792.
Obrázek S, 10 znázorňuje proliíěraěui test lym&cytu na slezinné buňky, které se ošetřily A.N 1792 (horní soubor) nebo ošetřené PBS (spodní soubor).
Obrázek ě, 1.1 znázorňuje: celkové množství Αβ v kortexu. Graf rozptylu jednotlivých profil u u myší imunizovaných deriváty Αβ nebo APPP kombinované s Frenndovým adjuvans.
Obrázek ě, 12 znázorňuje amykndní uzd v koríexu identifikovaný kvantitativní analýzou obrazu ínmnoreakfívnífch mozkových sekci v případě myši imunizovaných peplldovýmí konjugáty Αβί5, Αβ1~12 a Άβ-12.-28. agregáty Αβ plné délky ANI7921Άβϊ~42) a AN1528(Afil»W) a kontrola J skupiny ošetřené PBS,
Obrázek é. 13 znázorňuje geometrické průměry tiírú protilátky specifické pro Αβ v případě skupiny myší ímrmlzovaně deriváty Αβ nebo APP kombinované s Freundovým. adjuvans.
Obrázek č. 14 znázooúye geometrické průměry títrů protilátky specifické pro Αβ v případě skupin morčat imem/nvanvch ANI 792 nebo jeho pahnitoylováným derivátem kombinovaným s adjuvans.
Obrázek é. 15 (A až t-j znázorňuje množství Αβ v koríexu dvanáct mésích starých myší PDÁPP ošetřených AM1792 nebo AN 1528 různými adjuvans..
Obrázek Č, 16 znázorňuje střední hodnotu tkni u myší ošetřených polyklonáhu protilátkou proti Αβ.
Obrázek ě, 17 znázorňuje střední hodnotu títru o myší ošetřených monoklonální protilátkou 10D5 proti Αβ,
Obrázek e, .18 znázorňuje střední hodnotu tiíru u myší ošetřených monoklonálm protilátkou 2F12 proti Λβ,
Obrázek é. 19 znázorňuje mapu epitopm Omezenou N-terminální odezva. Sérum opic eynomolgns odebrané v den 175 sc testovalo testem ELI AS proti sérii 10~-mém.ich přesahujících peptidu (SLQ 10 NO; 1 až 41), které překrývají celou sekvenci .ANI792, Zvuč ě. FI0920M zobrazuje reprezentativní N-termináini omezenou odezvu na peptid 17AEERHDSGY (SEQ ID NO: 9), který překrývá aminokyseliny 1 až IG peptide ANI792, který- se použil jako immúzaění činidlo.
Obrázek č. 20 znázorňuje mapu epitopm neomezenou N-terminální odezvy. Sérum opic cynornolgus odebrané v den i 75 sc testovalo testem ELISA proti sérii 10-mérních přesahujících peptidy (SEC* 10 NO- 1 až 4 O. které ptekryNají celou \ckvems V91 ~<>2 /vrte ě ΓiÍFO5F zobrazuje reprezentativní N-termínální neomezenou odezvu. Rcaktivua je proti dvěma peptídum Ň-terminalmm a jednomu peptidu C-termínalnunu speptídem DAFERHD^GV <xEQ ID NO: který překrývá aminokyseliny 1 až 10 peptidu ANI.792.
n vynálezu
Příklad l: FrofylakticH účinnost Αβ proti.AD
Příklady popisují .aplikaci peptid?? AB42 transge.?mí mysl, která nadměrně exprimuje ÁPP s mutaci v poloze 717 (ÁPp7s?v->rk které vykazují predispozicí k vývoji .oeuropatie podobná Álzheimerově nemoci. Prodnk.ee a charakteristiky těchto myši (myši FDAPP) se popisuji v publikací Gittues et at. Natera 373, 523 (1995)). lato zvířata v jejich beicjozygoíni formě začínají ukládat Αβ ia ve věku šesti, měsíců. Ve věku patnácti městců zvířata, vykazuji mpožslvf depozitu .Αβ ekvivalentní depozitu, který je možná pozorovat u Alzheimerovy nemocí. Myším FDAPP .se injekcí zavedl agregovaný Αβί; nebo fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem. Agregovaný Αβ« se vybral na zak ladě jeho schopnosti vyvolat protilátky proti více epitopům Αβ.
A. Metody 1, Zdroj myší
Třicet heíerogennich samic myši PDAPP se náhodně rozdělilo do následujících skupin: deseti mvším sc injekci zavedl agregovaný Αβ^ (jedna myš zemřela při tranzitu), pěti. myším se injekci zavedlo PBS adjuvans nebo PBS a deset myší slouží jako kontroly, kterým se injekce neaplikovala. Pěti myším se zavedla injekce $ peptidy, které se získaly ze sekvence sérového amyloidniho proteinu (SAP),
2, Připraví? imunogenu
Příprava agregovaného Αβ42: dva miligramy Αβ42 (US Peptides lac., kat. c, K-42-12) se rozpustily v 0,9 ml vody a doplnily se na objem I ml přidáním OJ ml lOx koncentrovaného PBS. Tato směs se míchala na vortexu a nechala se ínkubovat přes noc při teplete 37 °€. což jsou pod30 minky, pří kterých dochází k agregac i peptidů. Nepoužitý Αβ se uchovával jako sušený lyofilizovaný prášek při teplotě -20 CC až do doby aplikace další hňekee.
3. Příprava injekci
V případě 'každé injekce se 100 pg agregovaného Αβ42 v PBS na jedni? myš emulgovalo v poměru 1:1 s úplným Freundovým adjuvans (CFA) do konečného objemu 400 μ,Ι. emulze pro prsní imunizací. po dvou týdnech následuje zesilovací dávka, která obsahuje stejné množství imunogenu v neúplném Freundově adjuvans (1FA). Dvě další dávky se podaly jako 1FA y iuěaíěnm? intervalu. V měsíčním intervalu se uskutečnily následné imunizace s 500 txiikroliíry
-ta PBS. Injekce se zavedly- iauaperitoneálné ibp.).
injekce PBS se aplikovaly podle stejného rozvrhu a myším se injekcí zavedla směs P8S/adjuvans v poměru f:.i -v objemu 400 μΐ pro každou mys nebo 500 μΐ PBS v případě každé myši. Injekce SAP se zaváděli puďte stejného plán?? za použiti dávky 100 μι vjedné injekcí,
4. Titrace myší krve, příprava tkáně a imunohi.stocfe.emie
V názvu uvedené metody se popisuji v sekci. Obecné materiály a metody
B, Výsledky
Myším PDAPP se injekcí zavedl agregovaný Αβ42, peptidy SAP nebo fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, Skupina myší PDAPP se také nechala bez aplikace injekce jako pozitivní kontroly, 'fitry .myší agregovaného Αβ42 se monitorovaly každý měsíc od čtvrté posilovači m- 5U CZ304876 Bé jekce- až do věku myši jeden rok, Myši se usmrtily ve věku 13 měsíců. Ve všech testovaných časech osm z doviti myši, kterým se aplikoval.agregovaný A|342, se vyvinul vysoký titr protilátek, který /uMsoá sterny v proběhu serte injetoí (titry sykáš než i 10 OtiO), Devátá msš měla nv ký, ale měřitelný thr s přibližnou hodnotou i/1 OOO {obrázek ο, 1, tabulka ě. t). Myši, kterým se.
injekci zavedl SAPP méiy titry pro tento imanogea 1 ; 1 OOO až 1 : 30 000, přičemž; pouze jedna myš překročila hodnotu titru 1 ; 10 000,
Myši ošetřené PBS se tipovaly proti agregovartétnu Αβ42 v šestém,, desátém a dvanáctém měsíci. Myši ošetřené PBS v ředění 1/100, když se titrovaly proti agregovanému Αβ42, překročily pouze to Čtyřikrát hodnotu poradí, jinak vykazovaly ve všech časových hodech hodnoty nižší než je čtyřnásobek hodnoty pozadí (tabulka c. li Odezva specifická na SAP by la zanedbatelná v těchto časových bodech v připadá všech titrů nižších, než je hodnota 300,
Sedm z devíti myší ze skupiny ošetřené agregováním A042 -ovs tozuji ve svém mozku dětskost; vatelný amyloíd. Naopak mozková ťtoh z myší ve skupinách cudných SAP a PBS obsahovaly velké množství amyfošdmeh depozitu v hípoecarapttstp stejne pto ř přední části mozku, .Patent uložení byl stejný jako patero, který vykazuji neušetřené kontroly, přičemž zahrnuje ohrožené oblasti, jako vnější molekulovou vrstvu hipoeeampáinlho gyrus dentatns. Jedna myš ze stopiny, které se zavedl injekci ΑβΙ--42, vykazovala velmi redukovaný amyloidní uzel, který se nachází zn v hippoeampusu, ϋ myši ošetřených Αβ 1-42 se identifikovala izolovaná plaka.
Kvantitativní zobrazovací analýza amyloidního uzlu v hippoeampu ověřila dramatickou redukci dosaženou « zvířat ošetřených Αβ42ρΑΝΙ?92) (obr, ě, 2), Střední hodnoty amyloidního uzlu v případě skupiny os<ficno PBS r2,22 ^4 a v případě konirotei skupiny (2,65 %} byly |xxlstateě vyšší než u myši imunÍAromproh AN 1 ?9? (0,00%, p:::0,O00S|. Naopak střední bod nota v případě skupiny imunizované peptidy SAP í SAPP) byla 5, %. Mozková tkán z neošetřených kontrolních myší obsahovala řadu amytoidnieh depozitu Αβ, které se viznalixovaly monoklonální protilátkou specifickou pro Αβ 3D6 v hippoeampusu. stejně jako v roirospleniálnim kortexu, Podobný pateru amyloidního depozitu jo možné také vidět u tnyši Imunizovaných pomocí SAPP nebo PBS (obr. č, 2), Navíc pro tyto pozdější tři skupiny jsou charakteristické ohrozitelné podskupiny mozku, které je možné klasicky vidět y AD, jako je vnější molekulová vrstva híppocarapáfeiho gyrus dentus, ve všech těchto třech skupinách.
Mozky, které neobsahovaly depozity Αβ také neobsahovaly neuritioks plaky, které’jsou v typie35 kom případě v izuabzovány u myši PDAPP »lidským APP protilátkou 8E5. Všechny tnozky ze zbývajících skupin (kterým sc injekcí zavedl SAP, PBS a kterým se neaplikovala žádná injekce) vykazovaly řadu nekritických plato, které jsou typické pro neoše třené myši PDAPP. Malý počet nenritieksch plato vykazuje jednu myš, která bytu ošetřena ΑΝ 1 792 a jedno seskupení dystrotickýeh neuritů sc zjistilo u druhé myši ošetřené .ANI 792. Analýzy zobrazeni hippoeampusu zobra40 zené na obrázku é. 3 demonstrovaly' odstraněni dystrofckých neuríth u myší ošetřených ANI 792 střední hodnota 0,00%) ve srovnání s recipienty ošetřenými PBS (střední hodnota 0,2S %, p: 0,000-7/.
Skupma, které se zavedlo irýekd Αβ 1-42, také v mozku nevykazuje plaky spojené se záměrem, které jsou charakteristické pro astrocyty. Mozky z myši v jiných skupinách obsahovaly nadbytečné a klasteované astrocyty pozitivní na GFAP, které jsou typické pro Αβ plaky spojené s gbozou, Soubor sklíček, které reagovaly s GFAP se obarvily Thioflavmem S, aby bylo možnélokalizovat depozity Αβ. Astrocyty pozitivní na GFAP jsou spojeny splaky Αβ u myši ošetřených SAP. PBS a neošetřených kontrol. Žádné takové spojeni se nezjistilo u tnyši ošetřených su Αβ 1-42. které nevykazuji plaky, zatímco n jedné myši ošetřené AN 1.792 se Identifikovala minimální giíóza spojená s plaky.
Zobrazovací analýza, uvedená na obrázku č, 4, v případě retrosíeníálmho ko.rtcnn, ověřila, že redukce v počtu astroeytn je podstatná, když střední hodnou je 1,56 %, u myší ošetřených
.. t? „
CZ 30487b B6
AN1792 ve srovnáni se střední hodnotou větší ftež 6 %» kferon vykazují skupiny mtmízovaoé peptidy SAP, PBS nebo neušetřené skupiny (p;s0,0017),
Důkaz pocházející z myš- ošetřených <4111-42 a PBS indikuje, že irnun.xeaktíGts MHC 11 spoje5 aá s piaky nefti přítomna u tmsu kunou se injekcí z;ncdl 'MU 42, což ic stejné jako nedostatek zánětlivé odezvy vztažené k Αβ.
Sekce myších mozků také reagovaly s nronokíonáíntmí protilátkami, které jsou specifické pro monoklonální protilátky specifickými pro MAC-], což je buněčný povrchový protein. Protein
MAC 1 (CDiHo čten r. drny mnyrmů i e\)stuje p-Áo hcteřCdjme: ΚοηιρΙοκ CÍU lbCDJ8 je přítomen na monocytcch, makroíagách, nentrofileeh & přirozených žitných buňkách Mak a Strnad). Rezidentní buněčné typy reaktivní s MAC-I v mozku jsou pravděpodobné makrodía založená na podobné fenotypické morfologii v sekcích, které imunologicky .reaguji' s proteinem MAC--I. Značeni MAC-L které sc spojce s pinky, bylo nižší v mozku, myší ošetřených ts ANI792 ve srovnání skontrolní skupinou ošetřenou PBS, přičemž se zjistilo, že souvisí ze skutečností, že nedocházík zánětlivé odezvě vyvolané Αβ,
C. Závor
Nedostatek plaků Αβ á reaktivní neuronáiuí a gliotickě změny v mozku mysl, kterým se injekci zavedlo ΑβΙ-42, indikuje, žě Se v jejích mozku uložilo extrémně málo amyloidn nebo depozit neexistuje, také nedochází k. výskytu patologických následků, jako je glióza,a nenritieká patologie. Myši PDAPP ošetřené ΆβΙ-42 vykazuji v podstatě stejný nedostatek patologických jevů jako kontrolní netransgemm myši. Proto injekce Αβ 1-42 jsou vysoce účinné pří prevenci ukládání js nebo odstranění lidského Λβ» z mozkových tkání a při eliminaci následných neuronálníeh a zánétKvýeh degeneratívnie.h změn. Pak aplikace peptidu Αβ se může použít při prevencí a léčbě AD.
Příklad 2: Studie odezvy na dávku
Skupiny Obsahuj.ici samice myší staré pět týdnu Swiss Webster (N-6) se imunizovaly 300. 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0.4 nebo 0,13 ug Αβ. který se vytvořil íntra peritoneální aplikaci CFA/fPA. Iři dávky se aplikovaly v týdenních intervalech a o měsíc později se aplikovala čtvrtá dávka. První dávka sc emulzifikovala s CI'A 8 zbývající dávky se emuiziťíkovah s IFA, Krev zvířat sc odebra35 la 4. až 7 den po každé imunizací, přičemž tnéreni Otru protilátek sc začalo po druhé dávce. Zvířatům v souboru Iři skupin, která se imunizovala I. i. 33 nebo 300 μη antigenů, sc dále odebírala krev v měsíčních intervalech po dobu čtyř měsíců po čtvrté imunizací, přičemž se monitoroval pokles proti látkové odezvy v rozmezí dávek ímunogcnnlch formulací. Těmto zvířatům se aplikovala konečná pátá imunizace v sedmém ntesieí p<? začátku studie. O týden později se zvířata ušít) utrhla a měřily se proti látkové odezvy sta ΑΝ 1702 a provedly se toxiko logické analýzy.
Pokles odezvy na dávku se pozoroval od 300 do 3,7 pg, aniž dochází k. odezvě na nejnižší dávky. Střední hodnoty litrů protilátek jsou po třeli dávce přibližné 1:1 000 ts po 4, dávce, která obsahovala přibližně I i až 300 pg an tigenů, přibližné .1:10 000 (popisuje se na obrázku č< 5).
Titry protilátek dramaticky rostou ve všech případech. Nízká protilátková odezva se detekovala u myši, kterém se aplikovala dávka 0,4 ug antigenů, Skupiny myší. kterým se aplikovalo 1.2 a 3.7 pg antigenů vykazovaly porovnateinč titry sGMT přibližné hodnoty i 000 a nejvyšřn čtyři dávky spojeně sGMl přibližné 25 OOP s výjimkou skupmy s dávkou 33 pg s nižší hodnotou
GMT 3 OOít Po čtvrté imunizací růst tůro byl u většiny skupin mírnější. Ve skupinách s nižší dávkou autígenu od 0,14 do I I pg je možné vidět jasnou odezvu na dávku, která se pohybuje v rozsahu žádná detekovatelná protilátka v případě recipientů OJ 4 pg až GM Γ tb OttO v případě recipientu 11 ug. litry v případe čtyř skupin s nej vyšší dávkou .1 i až. 50ll pg jsou sdružovány dohromady, Po dvou ňnunizacich titr protilátek, závisí ua dávce antigenů po celém rozmezí od 0,4 • az CZ 304876 B6 do 300 pg, Třetí imunizaci trhy nejvyšších-čtyř dávek byly všechny srovnatelné a po další imunizad zůstaly na stálé hodnotě.
Měsíc po Čtvrté imunizaci 'byly tipy dvakrát až třikrát vyšší ve skupině, které se aplikovalo
S 300 pg ve srovnáni s litry měřenými z krve odebrané pět dni pes imunizaci (obrázek č, 6), Toto pozorování naznačuje, žemaximum .anamněsíieké prorilátkové odezvy se objevilo později než pěl dní po imunizací. Nejmenši zvýšení (50 %) bylo možné zaznamenat ve skupině, které se aplikovalo 33 μρ Yc skupině s dávkou 300 gg ve dvou «těšících po poslední dávce GMT hluboce pokleslo o přibližně 70 %. Po dalším měsíci byl pokles méně prudký přibližně 45 % <100 pg) a to přibližně 14 % v případě dávky 33 a 11 pg. Fak rychlost poklesu tíířů církuhtjieich protilátek následující přerušeni imunizace se jeví, že probíhá ve dvou tazích se strmým poklesem v prvním měsíci po maximální odezvě a pak následuje mírnějšírychlost poklesu.
Tun protilátek a kmenu odezvy n těchto myši Svtiss VUbstér jsou uodobne tem u mladých is heterozygotníeh iransgennteh myši PD/kPP imunizovaných .paralelním způsobem. Dávky účinné pro indukci imunitní odezvy a lidi jsou v typickém případě podobnédávkám účinným u tnyšh
Příklad 3; Testování terapeutické účinností proti AD
Tento test se navrhl tak, aby se u. ímimogenníeh činidel mohla testovat aktivita přetrvávajících nebo vratných nenropatologiékýeh charakteristik AD n starých zvířat Imunizace s Αβ o délce 42 aminokyselin (ANI 792) začala v době, kdy jsou už v mozku myší PDÁPP přítomny amyloldni plaky.
V průběhu léto studie se n nec-šcteených myši PDAPP vyv inula řada nenrodegeneradvmeh změn, které se podobaly těm vyskytujícím se v případě AD (popisuje se v publikaci Oames et ak, Nátuře 373, 523 í 1995} a Johrison-Wood ct ak, Proč. Naft Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 ίΤ9^Β. Ukládáni Αβ do amyloidmeh pinku je spojeno s degeneraíivm neuronálni odezvou, která zahrnu30 je aherantní axonální a dendrItíeké elementy, které se nazývají dystrofíeké neuvity. Amyloldni depozite, které jsou obklopeny a také obsahuji dystrofíeké nemity, se nazývají neurkieke plaky, U myší AD a PDAPP máji dystrofíeké neuriiy odlišnou gleburálm strukturo, jsou inumoreaktivni se souborem protilátek, které rozeznávají APF a eyroskeletevé komponenty a vykazují komplexní subbuněčné degenerativni změny na úrovni uitmstrufctury, Tyto charakteristiky umožňuji selek35 tivnl a reprodukovaieině a pro nemoc relevantní měřeni tvorby neurítiekých pluků v mozku PDAPP. Dyslroftcký neurnnálm komponent neurítíckýeh pisků PDAPP je snadno vizualizovateiný s protilátkou speesltekon pro lidský APP íin/mokloirálm protilátka 8E5t a je snadno měřitelná počítačovou analýzou zobrazeni. Proto vedle měření účinků ANI792 na tvorba amyloidmeh písků se sledovaly účinky této léčby na vývoj neuritické dysírrsfte.
-to
Asirocyty a mikioglía jsou jiné než nenronálm buňky, které odpovídají a odrážejí stupeň poškozeni neuronů. Aslrocjty pozitivní na GFAP a mikroglia pozitivní na AIHC-41 se v případě AD běžně vyskytují ajejich aktivace se zvyšuje spolu s vážnosti onemocněni. Proto jsme také monitorovaly vývoj reaktivní aslrocytózy a míkrogiíózy u myši ošetřených ANI792.
A, Materiál a metody
Z Charles River se získalo R4S hetetozygotních samic myši PDAPP ve věku 11 až 11,,5 měsíců a náhodné se rozdělily do dvou skupin: 24 myši se imunizovalo 'OO pg ANI 792 a 24 myší se- imu56 rozovaio PBS. AN i 792 a PBS se kombinovalo s ITenndovým adjuvans. Skupiny imunizované ANI792 a PBS se daie rozdělily, když dosáhly věku přibližné 15 měsíců. V ;5 měsících věku přibližně poiot ma každé skupím zt Put esetřeosch ΑΝΓ92 a PBb se usmrtil;· (n-: 10 a 9), zbytek pokračoval v imunizaci až do ukončení v přibližně i 8 měsíců (u::::9 a 12 i. Během studie zemřelo celkem 8 zvířat (5 imunizovaných ANI792 a 3 imunizované PBS). Vedle imunizovaných zvířat • :uCZ 304876 96 jsou pro porovnáni v ELIÁŠ testu zahrnuty neočeířětté myší PDAFP ve věku jednoho roku ln::: ΙΟ). 15 .měsíců (n~ 10} & 18 měsíců (u“I0), aby se mohlo změřit množství Αβ a APP v mozku my š ί V m«mobbiochemické analýze· jsou zahrnuta také zvířata stará jeden .rok, $ Pokud není uvedeno jm&k, metodologie byla jako v příkladu 1. Peptidy ANI 792 z OS Peptides lot 12 a Caltforma Peptides lot ME0339 se použily při přípravě antigenů pro Šest imunizací, které se aphkovah před dosažením 15 měsíců. Peptidy Calíforma Peptides lot MEO339 a ΜΕ04.Ί9 se použily pro tří další imunizace, které se aplikovaly mezí 15a 18 měsíci m V případě imunizace 100 pg ANI 792 ve 200 pl PBS nebo vsaínotné PBS se emulgovalo v poměru LI (vokvol) s úplným Freundovým aďjuvans (CPA) nebo s neúplným Pretmdovým adjuvans (IFAs nebo PBS v konečném objemu 400 pl, Prsní Imunizace .se zavedla s CFA, které se použilo jako udjuvans, další čtyři dásky šc aplikovaly s iFA a konečné čtyři dávky se aplikovaly se samotným PBS.. aniž se přidalo adjuváns. V průběhu sedmí městců se aplikovalo celkem is devět imunizaci ve dvoutýdenních intervalech v případě prvních třech dávek a zbývající injekce se aplikovaly v« čtyřtýdenním itnctvalu. Skupiny, které se léčily pouze Čtyři městce, se «smrtily ve věku i 5 měsíců, se podrobily pouze prvním 6 imunizacím,
B. Výsledky
1. Účinky léčby AN I 792 ou amyloídru uzle
Výsledky léčby ANI792 na kortikáhu amyloídni uzel stanovené kvantitativní zobrazovací analýzou jsou uvedeny na obrázku č. 7. Střední hodnota v připadá kortíkáhubo amylosdnfho uzle byla .25 0.28 % ve skupině ncošvocných myší PDAPP ve věku 12 městců. Uvedená hodnota reprezentuje vznsk plaků u myši na začátku studit. Za 18 měsíců se amyloidní uzel zvětšil víc jak 17 krát na 4,8 % u myši ošetřených PBS, zatírnoo u myší ošetřených ANI792 se amyloidm uzel zmenši! pouze o O,0Í %, což je znaíelně méně než u neošvtřeayeh myší ve věku 12 měsíců a ve skupině myši ošetřených PBS ve věku 15 a 18 měsíců. Amyloidm uzel se podstatné redukoval » rociplen30 tu ANI792 pil stáří 15 měsíců í96”t. redukce, p· 0,003) a 18 městců (více jak 99% redukce. p-0,0002).
V typickém případě kortikální amyloidní depozit u myši PDAPP začal v předním a rotrosplemálnim kortiku (RSC) a pokračoval vemralniro-iaterálmro směrem, aby zahrnoval temporáioí a en35 torlnnálm kortiky íEC), V EU u 12 měsíců starých myši se nezjistil žádný nebo pouze malé množství tttnykůdu, což odpovídá věku. pří kterém se poprvé aplikoval ANI 792. Po čtyřech měsících léčby s ANI792 se selíce snížilo ukládáni amyloidu vRSC a postupné zahrnutí EC bylo zcela eliminováno léčbou x ANI/92. Pozdější pozorováni vykazuje, že ΑΝΓ’°2 zcela zastavil postup amyloiduíeh depozitu, které v normálním případě pokračuje v tempomhdm a centrálním kortiku, stejně jako trvalé nebo možné vratné ukládání v P.SC.
Výrazné účinky léčby AN 1792 na vývoj kortíkámiho amyioidnlho uzle u myši PDAPP jsou dále demonstrovány skupimsu myši ve věku 18 měsíců, které se léčily po dobu sedmí měsíců. Skoro úplná absence kortikáhoho amyloidu se zjistila v případe myši ošetřené ANI ?$>2, přičemž úplné chybí diiúz.m pluky stejně.jako se redukovaly zhutněné plaky.
2, Léčba s ANI 792 špojená s buněčnými a morfhlogíekými změnami
V oblastech mozku, které v typickém případě obsahuji amyloidní depozity, se našla populace buněk pozitivních na Αβ. Překvapivě v několika mozcích z recipientu ANI792 se našlo velmi tnálo nebo žádné extrabuněčně kortikálnt amyloidní plaky. Ukázalo se, že většina Λβ intunorenktivity je obsažena v buňkách velkým lobuiármni nebo nahromaděným sóma. Fenotypicky tyto buňky tvoři aktivovaná mikroglia nebo monocyty. Tyto buňky imunologicky reaguji s protilátkami, které rozeznávají ligandy exprtmované aktivovanými monocyty a mikrogliem řMHC H a
Clíí 1b) a jsou příležitostně spojeny se stěnou nebo s lumenem cév. Porovnání přilehlých sekcí
- se CZ 304876 B6 smáčených protilátkami, která jsou specifické Pro Αβ a MHOU «kázalo, že podobné patenty těchto bmtók rozeznávají obě třídy protilátek. Detailní testování mozků ošetřených ANI 792 ukázalo, že buňU pozitivní ná MHC II jsou omezeny aa blízkost limitovaného amyioidu. který zbývá v těchto zvířatech. Pří používaných fixačních podmínkách buňky nejsou hnunoreaktivm s pro$· tilátkami. které rozeznávají Hgandy T buňky (CD3, €D3e) nebo B buňky (GD4SRA, €D45R8) nebo anfigeu běžný pro ieukocyty (CD4S), ále reagovaly s protilátkou, která rozeznává leukosialin (CD43). který- zkřížená reaguje s monocyty. U žádné z myši ořutřeaých-PBS se nennšly takové buňky.
ío Myši PDAPP'-pravidelné vyvíjejí těžký amyloídaí depozit ve vnější molekulové vrstvě h.lppokampáíního gyrusu dentete. Ukládání tvoři zřetelnou brázdu v snboblasti, která v kb>»ehém případě obsahuje amykádm plaky při AD, Charakteristické objeveni těchto depozitů u mysu ošetřených PBS se podobá objevení depozitu dříve charakterizované a neušetřených myší PDAPP, Ukládání amyioidu zahrnuje diíuzní a zhutněné plaky v nepřerušovaném pruhu. Naopak « řady ts mozků z myší ošetřených ANI792 by se měl tento patem drasticky ztsěalt. Ukládáni amyioidu v hippoedmfwu dále neobsahuje difózni mnyloid a pruhový patera byl zcela porušen, Je přítomno řada neobvyklých zvýrazněnýeh struktur, které reagují s protilátkami proti Αβ, několik z nich jsou buňky obsahující amylold.
U zvířat ošetřených ΑΝΠ92 se často pozorovaly buňky pozitivní' na MHO-lí. v blízkosti extrabuněěného amyioidu. Patem buněk, které jsou Αβ pozitivní, byl velmi podobný u několika mozků z myši ošetřeuých ANI792. Distribuce těchto monocytiekých buněk se omezila do blízkosti uloženého amyioidu a byla zcela nepřítomna v jiných oblastech mozku, které neobsahují plaky Αβ, Konfokální mikroskopie sekcí zsaěeuých MHCIÍ a Αβ ukázala, že materiál pisků byl obsa25 žen v mnoha monocyttokých buňkách..
Kvantitativní analýza zobrazení sekcí značených MHC 11 a MAC! ukázala trend směrem ke zvýšené hmmoreaktiviíě vRSC a Mppocarapu myší ošetřených ANI 92 ve srovnání se skupinou ošetřenou PBS, která dosáhla podstataosti při měřeni reaktivity M AC 1 v hlppocampusu.
Tyto výsledky indikují, aktivní odstraněal amyioidu v oblastech mozku nesoucí plaky zprostředkované buňkami
3. Uěiftky ANI 792 na množství Αβ; stanovením v testu ELISA
a) Koriíkáfó množství
U neošefřených myši PDAPP střední hodnota množství celkového Λβ vkortexu ve 12 měsících byla I 600 mýg, v 15 měsících vzrostla na 8 700 ug/g (tabulka c. 2). V 18 mésicích hodnota byla
22 00O ng/g. Během průběhu experimentu hodnota vzrostla vic jak desetkrát. Zvířata ošetřená
PBS vykazuji v '15 měsíc leh celkově množství Αβ 8 600 ngřg. Toto množství vzrostlo na hodnota 19 000 og/g v 1$ měsících. Naopak zvířata ošetřená ANI792 vykazují v 35 měsících o 81 % méně celkového množství Αβ {1 600 ngřg) ve srovnáni se skupinou imunizovanou PBS. Podstatně nižší množství celkového Αβ ίρ-Ο,ΟΟΟΙ) (S 200 ngtg) se zjistilo v 18 měsících, kdy když se porovnávaly skupiny ošetřené ÁN1792 a PBS (tabulku c- 2), což neprezentuje 72 % redukcí množství Αβ, které by bylo jinak přítomno. Podobné výsledky se získaly, když se porovnaly kořfikáini množství Αβ42, jmenovitě skupiny, které se ošetřily AN1792, obsahuje daleko méně Λβ42, ale v tomto případě rozdíly mezi skupinami ošetřenými ANI792 a PBS byly podstatné v 15 měsících (p-0,04} i v 18 měsících (p=0,000í, tabulka é 2}.
so
-35CZ 304S76 86
Tabulka ě, 2; Průměrné množství Λβ (ng/g) v kortevn
| ne o šetře ros | 033 | AB1792 | |||||||
| Věk | c 55 ikem | Αβ42 | ce.tfíUífí | Αβ4·2 | NO | cel km. | ΛΙΜ2 | (ni | |
| 12 | 1 60 0 | I 300 | . ( :143 } | ||||||
| 15 | 8 700 : | 8 300 | <10} | 8 600 | 7 200 | (9) | 1 600 | 1300* | UO) |
| 18 | /2000 | 18500 | Í101 | 19000 | ί 5 900 | 1121 | 5300” | 4000” | (W |
*ρ~·8» 0412 **p-0,0001
b) Množství hippoeanipusu
U «nešetřených myší PDAPP střední hodnota množství celkového Αβ v knrtexu ve 12 měsících hyb 15 OOOng/g, v {5 měsících vzrostla na 51 000. ng/g, V 18 měsících hodnota byla -81 008 ng/g ia (tabulka č. 3), Podobné, zvířata ošetřená PBS vykazuji' v 15 «jásíoloh hodnoty 40 000 ng/g a v 18: městcích hodnotu OS 000 ng(g, Naopak zvířata ošetřená AN I 792 v 18 měsících vykazuji hodnotu podstatně nižší ve srovnání se skupinou imunizovanou PBS <p=N}s<)H)5, tabuíka c, 3),. Měřeni
Á042 dává stejný patera výsledků, Množství ve skupině ošetřené .ANI 792 bylo podstatně nižší než ve skupině ošetřené PS· (39 000 ng/g vurzns 57 000 ng/g,, p«0,002) při 1.8 měsíčním vývoji is (tabulka ě. 3).
Tabulka c. 3; Průměrné množství Ingg) v kodexu
| ne=os ec reně | PBS | ANI792 | |||||||
| věk | cí?;.·!·;/. | Αβ42 | (n i | cel kw | Ap42 · | í:0 | celkem | Άβ42 | tn > |
| 12 | 15500 | i 1100 | 310} | ||||||
| 15 | 51500 | 44400 | (109 | 40100 | 35,70 | 19) | 24,50 | 22100 | (10; |
| 18 | 80800 | 64200 | 73,0} | 65400., | 57/10 | 112} | 50,90 | 38900 | (9) |
*pM), 0.105 **p»0,0u22 (e) Množství v mozečku
U «eošetřených myší PDAFP průměrná hodnota cembelárníhc množství celkového Ap ve 12 as měsících byla 15 000 ng/g (tabulka č, 4), V 15 měsících průměrná hodnota vzrostla na 28 ng/g.
V 18 měsících hodnota byla 35 ng/g (tabulka č. 3). Zvířata ošetřená PBS vykazují v 15 měsících hodnoty 21 ng/g a v 18 měsících hodnotu 43 ng/g. Naopak zvířata ošetřená ANI792 v 15 měsících vykazují hodnotu 22 ug/g celkového Αβ a podstatně nižší (p~0„002) v 18 měsících (25 ng/g) než odpovídající skupina PBS (tabulka c. 4),
CZ 3Θ4876 Bá
Tabulka š, 4: Průměrná množství' Αβ (ng/g) v mozečku
| neošetřené | PBS | ANI792 | ||||
| vek | celkový Αβ | w | celkový Αβ | lni | celkový Αβ | CtoT |
| 12 | 15,6 | (19) | ||||
| 15 | 27 , 7 | 110) | 20,3 | (91 | 21,7 | (10) |
| 18 | 35.9 | (10) | 43,1 | (12) | 24,8* | (9) |
*p=tof9018 s 4, (JČinky léčby ANI 792 na množství APF
Molekula APB-ct a APP celé délky obsahuji celou sekvenci Αβ nebo její Část a tak múze být potencionálně působit vytvořením imunitní odezvy na ΑΝ 1792, Ve studiích se zaznamenalo slabé zvýšení množství APF, jako zvýšeni neumpatologické charakteristiky u myš? PDÁPP. V korm íexu se léčbou množství buď APF-α/FL (plné délky), nebo APP-α se podstatná nezměnilo $ výjimkou, ze množství APP-α se změošilo o 19 % v 18 měsíc s u skupiny ošetřené ÁN1792 ve srovnáni se skup-nou ošetřenou PBS, Hodnoty APF ve skupině ošetřené ANI792 v 1-8 měsících podstatně nevzrostla z hodnoty,.'kterou vykazuje neošetrená skupinu v 12 a 15 měsících a skupina ošetřená PBS v 1 $ měsících. Ve všech případech hodnoty APP zůstaly v rozmezú které se nort s mál rsě zj lstí lo u myši PDA PP,
5. Účinky léčby ANI 792 na netsrmtegeneratívní a gSiotiekou patologii
Neuřítícký pískový uzel se v předním kortexu myši ošetřených ANI 792 podstatně .redukoval ve
2í> srovnáni se skupinou ošetřenou PBS jak ve veku 15 měsíců (84 %, p—0.03) tak i ve věku 1.8 měsíců (55 %, p:::9,0t) (obr. č, 8). Průměrná hodnoto ueuribekého ptákových uzlů se zvýšila z 0,32 % na 0,46 % ve skupině ošetřené PBS mezi věkem 15ti a 18 měsíců věku. Po je v kontrastu s vysoce redukovaným vývojem neuritických plaků ve skupině ošetřené ANI792 s průměrnými hodnotami nekritických plukových uzlů 0,05 a 0,22 % ve skupinách ve věku 15 a i 8 měsí25 cis.
Akt se, ze -mum/uce ΑΝ 17^2 setou dobře tolerována a reaktoru astroeyts se také podstatně redukovaly v RSC myší ošetřených ΑΝΓ’93 \e srovnám se skupinou nát-mmou PBS ve veku 15 t?n p-0.0113 a 1$ 06 %, 0,928) uíčsků věku (obrázek ě, 9) Průměrné hoduAy procentu
3U astrový lezy se stmpmě ošetřené PBS -u, zvvšsB mez? la a 18, mčssccm z-t,2h t?u ,\U % 1 cěba ΑΝΓ792 potlačila vývoj astrocytoxy v obou časových bodech na 1,89 a 3,2 %. To naznačuje, že neuropíl tiebyl poškozen odstraftovacim postupem.
to Protílátkové odezvy
Jak se popisuje shora v textu 12 měsíců starým heterozygotmm myším PDAPP (N:::2«) se aplikovaly série 5 imunizaci 10O ug ΑΝ 1792 cmulziftkovsných s Freundovym adjuvans a aplikovaly se intraperitoneálně v týdnu 0, 2. 4, 8 a 12 a šestá imunizace se provedla v týden 16 samotným? PBS (bez Fretmdova adjuvans). Jako negativní kontrola se použila paralelní sada 24 tmnsgenních myší odpovídající věkem, které se imunizovaly PBS emulgovaným stejnými adjuvans a zavedly ss podle stejného rozvrhu. Zvířatům se odebraly vzorky třetí a sedmý de?t po každé imunizaci, přičemž se začalo po druhé dávce. Testem El.ISA se měřily protilátkově odezvy t?a ANI792. Geometrické průměry tiírů (GMT) v přtpadě zvířat; která se imunizovala AN1792 byly po první.
CŽ drahé a tratí a poslední (šesté) dávce přibližně 1 900, 7 600 a 45 000. U. kontrolních zvířat po šesté Imunizaci se nenaměřlly Žádné protilátky specifické pro Αβ,
Přibližné polovina zvířat se ošetřovala. po dobu dalších tří měsíců. Imunizace se aplikovala přibližné 2(k 24 a 2? týdnů. Každá z těchto dávek se· zavedla v samotném PBS bez Fteundova adjuvans Průměrný titr protilátek zůstal po tuto dobu nezměněn. Ve skutečnosti titry protilátek zůstávají Kubiku od čtvrtého do osmého odběru krve, což odpovídá období přebývající patou az devátou injekcí.
Aby se stanovilo, zda protilátky specifické pro Αβ vyvolané imunizací, které se detekovaly v sera myší ošetřených ANI ?92, jsou také spojené s ukiádániot amyloidu v mozku, tak se soubor sekci z myší ošetřených AN I792 & PBS nechaly reagovat s protilátkou specifickou pro myši IgG. Na rozdíl od skupiny ošetřené PBS se písky Áji v mozku myši ošetřených ANI 792 potáhly endogenním IgG. Tento rozdíl mezi dvěma skupinami je možné spatřit ve věku .15 t 18 měsíců, Žviášim byl nedostatek značeni ve skupině ošetřené PBS navzdory přítomnosti těžkého amyioídního uzlu u těchto myši Tyto výsledky vykazuji. Že tmanizaee se syntetickým proteinem Αβ íyuříproídatk}, které rozeznávají Αβ v amyloldmeh plukách nebo se něj váži.
7. Imunitní odezvy zprostředkované hnětou
Sedmý den po deváté imunizaci se z devíti myší PBAPP imunizovaných ANI 792 a 12 myší imunizovaných PSŠ ve veku .1.8 měsíců, odstranila slezina, izolovaly se splenocyly a kultivovaly se po: dobu '72 hodin v přítomností A&40, A 042 nebo Αβ4<Μ (obrácené pořadí proteinu). Jako pozitivní kontrola sloužil mítogen Cen A. S proteinem skoncentraci vyšší než. 1,7 uM ss dosáhlo optimální odezvy. Budky pocházející ze všech devíti zvířat imunizovaných AN1792 proliferovaly jato odezva na protein Αβ40 nebo ΑβΙ-·42, se stejným množstvím začleněn; obou proteinů (obrázek ě, 10, bonu část). Neexistuje odezva na reverzní protein AB40-1. Baňky kontrolních zvířat neodpovídají na žádný z proteinů Αβ (Obrázek č, 10, spodn í část).
Γ). Závěr
Výsledky této studie ukazují., že imunizace ANI 792 myši FD.APP zpracovávající existující amyloidni depozity zpomaluje a předchází postupnému amykůdmmu ukládání a brzdí následné neuropatologlcké změny v mozku starých myší PD.APP. Imunizace s ANI792 podstatné zastavila ukládání amvloidn ve strukturách, které v .normálním případě ttsíupuji před amyloídózon. Pak aplikace peptidu Αβ má pozitivní účinek pří léčbě AD.
Příklad 4: Testováuí fragmentů Αβ lltb myši FDAPP ve věku 9 až 11 městců se imunizovaly devíti různými oblastmi APF a Αβ, aby se stanovilo, zdacpiíopy umožňují účinnou odpověd*. Devět různých imunogenů a jedna kontrola se zavádějí injekcí (í.p. k jak se popisuje shora v textu. Imunogeny zahrnuji čtyři lidské peptidové konjtígáty Αβ 1-12, 13-28. 32-42. 1-5, všechny jsou spojené s smí-myšími protilátkami IgG prostřednic·viro cysíeinové vazby, jsou to aminokyseliny polypeptidu AFP 592-695, agregovaný lidský Αβ 1-40, agregovaný lidský Αβ 1-40, agregovaný lidský Αβ 25 -35 a agregovaný Áfi42 hlodavců. Agregovaný .4(142 a PBS se použily jako pozitivní a negativní kontroly. V jedna léčebné skupině se použilo deset myši Titry se monitoroval}, jak se uvádí shora v textu a myší se usmrtily na konci 4 měsíce injekcí. Po smrti krys se provedla histochemická a mxikologscká analýza, stanovilo se množství Αβ.
A. Materiály a metody
1, Příprava tmenogenó . ss <.'Z 304876 B6
Příprava spojených peptidů Αβ; čtyři lídské^ptidové konjugáty·1 AP(attfittokyselínové zbytky I5, 1-12. 13-28 a 53-42, každý tvoří konjugát s ovčím aníimyšún IgG) se připravily spojením s umělým cysteinem, který se přidal do peptidn Αβ za použiti sífovadla sulřb-EMCS, Peptidové deriváty Αβ se syntetizovaly s následující konečnou .aminokyselinovou sekvenci. V každém přís páde poloha začleněného eysíeinového zbytků je označena podtrženým. pbtecaete, Peptidový derivát Αβ 13-28 také obsahuje dva gtyeíneve zbytky, které: se přidaly drive ttcž karboxyíový terminalm cystein.
peptid Αβί-12 peptid Αβί-5 peptid Αβ33-42 peptid Αβ .13-28
NH2-DAEFRHDSGYEVMOOH(SEQ ÍD NO: 72)
NFÍ2ADAEFRG-CGOH (SEQ ID NO: 73)
NÍD-C-anmoheptanová kyselina GLMVGOVViA-tWH (SEQ ÍD NO: 74) ,Ae-NFl-NHQKLVFFABDVGSNKGGC---CCM>i(SEQ ÍD NO; 75) rs Aby proběhla kupfovaei reakce., deset miligramů ovčích anfí-myšího IgG Oackson ímmunoResearch Laboratories) se dialyzovato přes noc proti 10 mM' boráte sodnému, pi l 8,5. Dialyzované protilátky se pak koncentrovaly os objem 2 rol za použiti zkumavek Amleon Centriprep. Deset miligramů činidla suito EMCS [N(ř;-maiuímsdok«proy!o>;yisukcíniuudj f Molecular Sciences Co.) se rozpustil v jednom niiltíími deionizované vody. 40 násobný molánn nadbytek činidla sníte -EMCS se přidal po kapkách za stálého mícháni k ovčímu and-myšhnu IgG- a pak se roztok míchal po dalších deset minul Aktivovaný ovčí anti-myší IgG se čistil a pufr se vyměnil pasáží přes gelovou filtrační kolonu o objemu 10 mí (Pletce Presto Coiunro, získanou « firmy Pierce Chemicals), která se uvedla do rovnováhy OJ M NaFEte 5 mM EDTA, pH6,5. Frakce obsahujíc! protilátky identifikované ah.v-rbancí při vlnové délce 280 nm se slily a ředily se ..na koncentraci přibližně 1 mg/ml za použíu j i mg na jednotku OD, jako vxtinkčru ke-eřk-ient. 40 násobný molárni nadbytek peptidn Αβ se rozpustí! ve 20 mi 10 mM NaPOj pHSJ) s výjimkou peptidn Αβ3342, kdy se nejdříve rozpustilo 10 mg peptidů v 0,5 ml DMSO a pak se ředilo ve 20 ml pufru 10 mM NítPO.). Každý roztok peptidů se přidal do 10 ml aktivovaného ovčího anti-mykiho IgG a směs se míchala kolébáním při teploto místnosti při dobu 4 hodin. Vy Jedné konjugáty se zakouše centrovaly na konečný objem, který je menší než 10 ml za použití zkumavek Amicon Centríprep a pak se dialyzovaly proti PES, aby' pufr nahradil pufr a odstranil se volný peptid. Za účelem sterilizace se konjugáty pasážovaly přes filtiy o velikostí pórů 0,22 mikronu a pak se rozdělily na alikvóty do frakci, které obsahuji 1 mg a uchovávaly se zmrazeně při teplotě -20 'C. Koncentrace konjugátu se stanovila za použití proteinových testu EGA (Pierce Chemicals) s koňským igG za účelem vytvořeni standardní křivky. Konjugace se dokumentovala zvýšením molekulové hmotnosti konjugosaných peptidů ve vztahu vztaženo nu aktivovaný ovčí antí.mvší ígG. Ovčí anti-myší konjugát Αβΐ-S je výsledek spojení dvou konjugaci, zbytek byl z. jedné přípravy,
2, Příprava agregovaných peptidů Αβ lidské peptidy 1-40 (ANI528, Calífomia Peptides lne., Lot ME054I), lidské 1-42 (.ANI 702. Caftfonna Peptides lne.., l-ots MF0339 a MF.0439), hdský 25-35 a 1-42 hlodavce iCalifornía Peptides tec., Lot ME02I8) peptidy se rozpustily za účelem přípravy každé sady injekci z íyofiíizovnného prasku, klese se udtžovaly vysusme při teplotě -20 XI Pru tyto ucely se prida45 ly dva miligramy peptidn do 0,9 ml deionizované vody a směs se míchala voslexcro, aby se vytvořil relativně jednotný roztok nebo suspenze. Ze čtyř uvedených peptidů v tomto kroku jediným rozpustným peptidem byl ANI528. Pak se k ANI528 přidalo alikvot 10\ koncentrovaného PBS o objemu I00 ul a v tento okamžik AN! 528 se začal srážel, Suspenze se opět míchala vortexem a Inkubovala se přes noc při teplotě 3? °C a použila se následující den, so
Příprava proteinu pBxb; Zkonstruoval se esprosívni plazmid kbdnjici pBxň, což je fúzní protein rsbsahujfcí N-fermiitalni vedoucí sekvenci bakíeriofagové polytnerázy M8-2 obsahující 100 aminokyselin, po které následují aminokyseliny $92-695 APF tp-APP) se zkonstruovaly, jak se popi- 39 CZ 3ÍM876 Bé •sóje v publikací Oltemdorf et al, X Biok Chem, 265, 4492-449? ť 1990), Plazmid-se přenesl do bakterie dico/í a protein se exprimovaj po indukci promotora, Baktcrte se lyžovala v 8M močovině a pBxé se částečně čistil preparativní SDS PAGE; Frakce obsatajfei pBxó se tdsuti.fi kovaly westernovou analýzou za použití králičích polyklon.thnch protilátek proti ρΒ,χδ, slily se dohro$ mady, použitím zkumavek Amicoo Centriprep -,c zsyšíla koncentrace a dialyzovaly se proti PBS, Čistota přípravku odhadovaná pomocí SDS PAUL obarvenou Cootnassteovon modři byla přibližně S až 10 “/o
B, Výsledky a diskuze j0
i. Návrh studie jedno sto samců a samic heíerozygotníeb transgenn-íeh myší PDÁPP devět až dvanáct měsíců starých se získalo z instituce Charles River Laboratory a Taeonie Laboratory, Myši se rozdělily s5 do dest-h skupin, ahy se imunizovaly různými oblastmi Αβ a APF kombinovanými Prcundovým adjuvans /(ujata w rozdělila tak, aby sivé skupině odpovídala pohlaví, věkem, původem a zdrojem jak, jěn.toje možné, teunogeuy zahrnují čtyři peptidy Αβ získané z lidské sekvence 1 -5, 1 12, 13 -28 a 33--42, přičemž je každý kottjugovaný sověůn and-.myáiut IgG, čtyři agregované repttov Άβ. hdA< ? 4(5 i,\NL'28í hdský í 42 sAN^tí, odsky ,b a i 42 zhlmUcu a
2». fení polypeptid označený jako pBxú, který obsahuje aminokyselinové zbytky APP 592-695, Desátá skuoma. která sloužila jako kontrola, .se Imunizovala PBS kombinovaným s adjuvans.
V případě každé imunizace i 00 pg každého peptidy Αβ ve 200 μί PBS nebo 200 pg derivátu pBx6 APF ve stejném objemu PBS nebo samotné PBS se. emulgovalo s uplitým Frenndovým adjuvans ÍCFA) v objemu Li (objem : objem), přičemž v případě první imunizace konečný objem je 400 pl. pak následovaly 4 zesilující dávky obsahující stejrsé množství nnunogeun v neúplném Freunáovým adjuvans CPA } a konečná dávka obsahovala PBS, V případě prvních třech dávek sc imunizace aplikovala intraperitoneálně ve dvoutýdenních intervalech a pak v intervalu jednoho měsíce. Po čtyřech až sednu dnech po každé imunizaci se zvířatům odebrala krev, při30 čemž sc začalo po druhé dávce, s v krvi sc stanovil títr protilátek. Zvířata se usmrtila přibližně jeden týden po konečné dávce.
I. .Množství Αβ a APF v mozku
Po přsbhžuě čtytcch měsících imunizace různými peptidy Αβ nebo deriváty ΛΡΡ se získal mozek ze z\nat port malovaných fyziologickým roztokem. Jedna hemistěra se připravila imunolusto·· chemickou analýzou a druhá se použila pro kvantifikaci množství Ap a APF. Aby se měřila koncentrace tužných forem amylolduiho peptídu beta a amyloidmho prekurzorováho proteinu, izolovala se hemísřéra a připravil se homogenní hippocampainí, kertíkální a eerehelární oblasti v 5 M guanidinu. Homogenát se nařechl a množstva amyloidu & ÁPP se kvantifikovalo porovnáním sérií ředěni standardů peptídu A|5 nebo APF, jejichž koncentrace jsou známé, v testu ELISA.
Průměrná koncentrace celkového Αβ sr případě kontrolní skupiny imunizované PBS byla 5,8 krát \\ŠN s bíppÍ-eumpusu než v kodexn (průměrná hodnota 24 318 rtg/g hippoeantpálni tkáně ve srovnání s4 221 ng'g vtkáni kortexu). Průměrná hodnota vcerebelhnn kontrolní skupiny (71-5 r.o/p lkané) byla přibližně i 000 krní nižší než. v htppocampusu. lato množstsí jsou podobna mm-žstt j, které bylo dříve zaznameítano v případě heterozygotstíeh transgensícfc myši PD.APP.itedetteho stal - {Johnvon-Wood et al,. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550-4555 (1997}),
V případě konexu subsada léčených skupin vykazovaly průměrnou hodnotu celkového množství Αβ a ΑβΙ-42, které se podstatné liší od hodnot, které vykazuje kontrolní skupina (p je menší než 0.5), těmto zvířatům se aplikoval ANI 792, AB1-42 hlodavců nebo peptídový. konjugát Αβ1~-5, jakje zobrazeno na obrázky é. 11. Průměrná hodnoto množství celkového Αβ se redukovala ve srovnání s kontrolou pro tuto léčenou skupinu o '<’S. ?9 a respektive 61 %. Existují se rozeznatel. uo.
CZ 304876 Rb né korefe.ee mezi titiy protilátek specifickými pro Αβ a množství Αβ v kortikální oblasti mozku v případě libovolné skupiny.
V bippocampusn průměrné smlsni celkového Αβ spojeného s léčbou ANI792 (46 %, p™fi,G543) nebyla. větší, než se pozorovalo v kortexu (75 %, p~8,0O.2i),: .Redukce však nebyla o tolik větší
V .híppoeampnsu než vkortexn, Redukce Αβ hippoeampusu je 11 I86sg/g tkáně vetzus 3 171. ng/g tkáně v kortexu, V případě skupin zvířat kterým se aplikoval A01.-42 nebo Αβ.1-5 hlodavců, se průmětná hodnota množství celkového Αβ redukovala o 36 a 26%. Dáno malou, velikostí skupin a vysokou variabilitou množství amyloidního peptidu od zvířete k zvířeti v obou
W skřípinách, tyto redukce nebyly podstatné, Když se měřilo ΑβΙ-42 v hippoeampusu, žádné redukce indukované léčbou nebyly podstatné, Vzhledem ktnalé velikosti uzlů Αβ v kortexu, zrněny v této oblasti jsou citlivějším indikátorem účinků léčby. Změny množství .Αβ měřené testem ELISA v kortexu jsou podobné, nikoliv identické $ výsledky Imunobtstoehemické analýzy (popišme se dále v textu).
ÍS
Celkové množství Αβ se také měřilo v eerebellum, což je oblast, která je minimálně ovlivněna patologií AD., Žádná z průměrných koncentraci Αβ libovolných skupin bmmizovaných různými peptidy Αβ něho deriváty APF se liší od kontrolní skupiny v této oblasti mozku. Tento výsledek naznačuje, že nepatologické.množství Αβ ηοόί ovlivněno léčbou,
Koncentrace APF v kortexu a v eerefceíu. léčených nebe kontrolních myší se také stanovila testem ELISA. Použily se dva různé testy APF, První test označený APP -α/EL rozeznává jak APP alfa («. vylučovaná tom® APF, která, se štěpila v sekvencí Αβ) a foroty APP v plně délce, (FL), zatímco druhý test rozeznává pouze APP -a. Na rozdíl od úbytku Αβ spojeného s léčbou v sadě léčených skupin, množství APP sc nezměnilo u všech léčených myši ve srovnání s kontrolními zvířaty. Tyto výsledky ukazuji, že imunizace s peptidy .Αβ nesnižuje množství ÁPF, spíše léčebný účinek je specifický pro Αβ.
Celkové množství Αβ a ΑβΙ-42 se v kortexu podstatně redukovalo léčbou ANI792» Αβ .1--42 hlodavce nebo konjugátetn Αβ 1--+2. V hippocampusu se celkové množství Αβ pottstaíaě redukovalo pouze léčbou ANI 792. Žádné jiné změny v množství Αβ nebo APP v híppocampálnk kortlkáhu nebo cerebrální oblasti spojené $ léčbou nebyly podstatné.
2, llistochemlcká analýzu .V
Mozky z podsady šesti skupin se připravily za účelem imanohístochemické analýzy, přičemž tři skupiny se imunizovaly konjugáty peptidu Αβ ΑβΙ-S, ΑβΙ - .12 a ΑβΙ3-28, dvě skupiny se imunizovaly agregáty Αβ pinč délky' ANI792 a ANI528 a kontrolní skupina se ošetřila PBS. Výsledky zobrazovací analýzy amyloidního uzle v mozkových sekcích z těchto skup® jsou zobra40 zeny na obrázku ě. 12. Existuji podstatné redukce amyloidního uzle v kortikahneh oblastech tři léčených skupin ve srovnání s kontrolními zvířaty. Největší redukce amyloidního uzle se pozorovala ve skupině, které se aplikovalo ANI792, kde průměrná hodnota se redukovala z97 % íp:::0,t)01). Podstatné redukce sc také pozorovaly v případě těch zvířat ošetřených AN1528 (95 %, p~ti,0Q5) a peptidovým koniugátem Apl-5 (67 %. p:::6,02),
Výsledky získané kvantifikaci celkového množství .Αβ nebo ΑβΙ -42 testem ELISA a zobrazením amyloidního uzle se v některém rozsahu liší. Léčba pomocí ANI 528 měla podstatný vliv na množství kortíkálniho amyloidního uzlu, když se provedla kvantitativní zobrazovací analýza, ale neměla vliv na koncentraci celkového Αβ ve stejné oblasti, která se stanovila testem ELISA.
Sft Rozdíl mezi těmito dvěma výsledky je pravděpodobně způsoben specíntami testů. Zobrazovací analýza měří pouze nerozpustný Αβ agregovaný do plaků. Naopak test ELISA měří všechny formy Αβ, což znamená rozpustné a nerozpustné, tnonomémi a agregované. Protože se uvažuje, že patologie onemocnění je spojena s formou Αβ spojenou s nerozpustnými plaky, metoda zobra41 CZ 39487b SS zovaeí analýgy je citlivější pro zohrazepí účinků léčby. Protože však test ELISA je rychlejší a jednodušší, hodně se používá pro účely testování -velkého množství vzorku. Může se také ukázat, že redukce Αβ spojená s léčbou, je větší v případě zip spojeného s plaky než celkového Αβ.
Aby se stanovilo, ®da protilátky specifické pro Αβ vyvolané imunizací u léčených zvířat reagovaly $ amvloídem «loženým v mozku, podsada sekcí z léčených zvířat a kontrolních myší se nechaly reagovat s protilátkou specifickou pro myši: ígG, Na rozdíl od stopiny ošetřené PBS, plaky obsahujici Αβ se potáhly endogenním IgG v případě zvířat imunizovaných konjugáty peptidu Αβ, Jsou to Αβί--5, Αβ1--42 a ΑβÍ 3-28 a agregáty Αβ plné délky, jako je ΑΝ-Ί792 a ANI 528. Moz~ ih ky zvířat imunizovaných jinými peptidy Αβ nebo APP pepti.dem pBx6 se tímto testem «analyzovaly.
3, Měření titrů protilátek
Cly H až sedm dní po každé Imunizaci se myším odehnaly vzorky krve, přičemž se začalo, po druhé mmmzaes. Vzorky krve se odebraly celkem pětkrát, l itry protilátek pe měřily jako protilátky vázající se na Αβ-42 za použití sendvičového testu ELISA na plastových destičkách s velkým množstvím prohlubni, které se potáhly -Αβ 1-42, lak se žobrwlo na obrázku e, 13, maximální litry protilátek se vyvolaly po čtvrté dávce mmnogennieh prostředku, které vysola.lv nej vyšší titry protilátek specifických pro ANI 792: ANI 792 (maximum GMT: 94 647), A NI 528 (rnaximumGMT 88 231 i., konjugát ABi-12 (maximum GMT: 47 216.! a ABi -42 hlodavce (maximem GMT: 10 766), Titry u těchto skupin klesají po následující páté a šesté dávce. V případě zbývajících pěti imunogenú maximálních litru se dosáhlo po páté nebo šesté dávce a měly daleko nižší hodnotu, než, jsou titry- čtyř skupin s nejvyšší hodnotot! litrů: konjugát Αβ.1-5 (maximum.GMT: es 2 356), pBx6 {maximum GMT: I 986), konjugát Αβί 3-28 (maximum GMl I 185}, konjugát Αβ33-42 (maximum GMT; 658), A025-35 (maximum GMT: 125). Také se měřily thrv protilátek proti homologním peptidum za použití stejného lestt! ELISA vsendvtěo\em formátu, tyto skupiny se imunizovaly ΑβΙ-5. Αβ13~28, Αβ25--35. Αβ33-42 nebo .Αβί-42 hlodm.ee. Tyto titry byly přibližně stejné jako titry naměřené proti ΛβΙ-42 s výjimkou Íínuuogenu ΑβΙ 42 bio30 dávce, kdy tihy protilátek proti hotnoiognimu irnunogenu f&ou přibližné dvakrát vyšší. Hodnota litru protilátek proti ANI 792 u jednotlivých zvířat nebo průměrné hodnoty léčených skupin nekoreluji s účinnosti měřenou jako redukce Αβ v kortexu.
4. Lymfoprofi&rstívni odezvy tymfoprohferace závislá na AB se měřila použitím buněk sleziny sebraných přibližně jeden týden po konečné Šesté imunlzítci. Čerstvě sklizené buňky v počtu 195 do jedné prohlubně se kultivovaly po dobu 5-tí dní v přítomnosti Apl-40 v koncentrací 5 pM za účelem stimulace. Buňky ze sady sedmi zděsili skupin se také kultivovaly smítogeumu T buňky PHA u jako negativní kontrola so buňky kultivovaly bez přidání peptidu,
Lymfocyty získané z většiny zvířat proii férová iy jako odezva na PILA Nepozorovala se žádná podstatná odezva na reverzní peptid Αβί -40 Buňky ze zvířat imunizované většími agregovanými peptide Λβ ΛΝΊ792, ΑβΙ-42 hlodavců a ANI528 silně prolíferovaly, když sc sfnmilovaly '45 ΑβΙ-40 s vyšším cpnt u recipienta AN I'792. Jedno zvíře v každé skupině imunizované konjugá· tem Αβί- 12, Λβ!3-28 a Αβ25-35 proliterovalo jako odezva na Áfit-40, Zbývajícím skupinám se aplikoval konjugát ΛβΙ-5, konjugát AB33-42 pBxb nebo PBS se neaplikovalo žádnému .zvířeti s odezvou stimulovanou Λβ, Tyto výsledky s« shrnuly v tabulce č. 5 dále v textu.
- á? Tabulka $.5
| Imartogen | Konjugát | aminokyseliny Αβ | . jedincí s odezvou |
| Αβ1-5 | oné | 5-mér | 0/7 |
| Αβ!~Ι2 | ano | Í2-mr | 1/8 |
| Αβ13~28 | ano | 1 6-snér | 1/9 |
| Αβ25-35 | 1.1 -már | 1/9 | |
| Αβ'33-42 | ano | 10-taér | 0/10 |
| Αβ1~40 | 4 0 -mé r | 5/8 | |
| Αβ1~42 | 4:2-mé z | 9/9 | |
| ζ ΑβΧ-42 | 42-tnór | 8/8 | |
| piisě | 0/8 | ||
| PBS | O-trér | 0/8 |
Tyto -výsledky ukazuji, že ΑΝ1792· a ANI 528 stimuluje silní odezvy T buněk, které nej více Odpovídají fenotypu CDdNepřítomnost odezvy specifické pro Αβ u zvířat imunizovaných Apl-5 není překvapující, protože peptidové epitopy rozeznávané T bůtkami CD4-+ obsahuji obvykle přibližné 1$ aminokyselin, ačkoli krst.fi peptidy mohou někdy fiingovat s nižší účinností Pak to většina epitopů pomocných T buněk v případě čtyř konjngovsnýeb peptidu jsou pravděpodobně zbytky v konjugacím partneru IgG, nikoliv v oblasti Αβ. Tuto hypotéz» podporuje velmi nízký výskyt prohtér&tivnfch odezev zvířat v každé ztéehío skupin. Protože konjugát Áfil---5 byl účinný při podstatném omezeni množství- Αβ v mozku při zjevné nepřítomnosti T buněk·;specifických pro Αβ, pak klíčová efektorová imunitní odezva vyvolaná imunizací s tímto peptidem se jeví být i5 protilátka.
Nedostatek I buněk a nízká prou látková odezva na fuzm peptid pBxb, který obsahuje aminokyseliny ΛΡΡ 592 až 695 zahrnující všechny zbytky Αβ může způsobovat nízkou imunogeunost tohoto určitého přípravku. Šlehá imunogennost agregátu Αβ25~35 je pravděpodobně způsobena
2β peptidem.. který' je příliš malý, aby obsahoval správný epitop T buňky, aby pomohl vyvolat protilátkovou odezvu, jestliže by se tento peptid koojugoval nosičovým proteinem, bude pravděpodobně více imunogenní
Příklad 5; Příprava polyklonálnicb protilátek pro pasivní ochranu
125 netrandgenních myši se imunizovalo 100 pg ΑβΙ-4'2 plus adjuvans CFA/IFA a usmrtily se ve véko 4 až 5 měsíce. Z imunizovaných zvířat se odebraly vzorky krve. IgG se separovaly od jiných komponentů krve. Protilátka specifická pro imunogen se může částečně čistit afinitní
M chromatografií, Zjedné myší se průměrně získalo přibližně 0,5 až 1 mg protilátky specifické pro imunogen, celkem se získalo 60 až 120 mg.
43.
CZ 304876 Sě
Příklad ů: Pasivní imunizace protilátkou proti Αβ
Skupinám myší PDAPP ve s«ku 7 až 9 městců se injekcí aplikovalo 0,3 mg pdykfcoální protilátky proti Αβ v PBS nebo specifických monoklonálních protilátek proti Αβ, jak se ukazuje dáte v textu. Všechny protilátky se čistily, aby se dosáhlo nízkého množství endotosínn. Monoktemálm protilátky se mohou připravit proti fragmentu tím, že se do myši injekci zavedl fragment nebo kratší forma Áfk přičemž se připravily hybridoma a testovaly se za účelem zjištěni protilátky, která se specificky váže na požadovaný fragment Αβ, aniž se váže najme přesahující fragmenty Ap.
to
Tabulka ě. 6
| proriiatka | epitep |
| 2H3 | Άβ1~12 |
| 10D6 | Αβ3-12 |
| 266 | Αβ73-23 |
| 21612 | AP33-42 |
| tny š i po 1 y kl on á 1 o i an t i -1 i d s ké Αβ42 | a.nt i -agregovaný Αβ 4 2 |
'15
Myším, je-li potřeba, se aplikovala injekce v období čtyř městců, abs sc udržela koncentrace cirkulujících protilátek měřená testem ELISA vyšší než 1/1000 definované v testu ELISA Αβ42 nebo jinýsn ímunegenem. Tiny se monitorová ty jak se popisuje »ho;a v textu a myši se usmrtily η,Λ kertcí šesti měsíců injekci. Množství Αβ a toxikologie se stanovily po usmrcení myši, V jedné skupme byl·? deset myši. Další studie pasivní imunizace se popisuje v příkladech XI a ΧΠ dáteν' textu.
Přiklad 7: Porovnání různých adjuvans s
Tento příklad porovnává kapacitu stimulovat imunitní odezvu CPA, alum, emulzí obj ve vodě a MPL.
A, Materiál a metody
1, Návrh síndie riJO samse morčat, riarttey ve stáři šesti týdnů získaných z Plut i lil; se rozdělilo do deset- skupin, aby se imunizovalo ANI792 nebo palmitoylovaným derivátem kombinovaným s různým ad* jnvans. Sedmi skupinám se aplikoval injekcí AN1792 (.13 pg pokud nem uvedeno jinak) kombinovaný s a) PHS, b) Freundovýnt adjuvans. o) MPL, dl skvalenem, e) MPL/skvidencm, f) nízkou dávkou ttlttm nebo gl vysokou dávkou aium ťíOO pg ANI792). Dvěma, skupinám se aplikovaly injekce patrnnoCovaneho derivátu ANI792 (33 pg) kombinovaného sa) PBS nebo b) skv&ienem. Nakonec deštně skupině se aplikovalo samotné PBS bez antigenu nebo dalšího adjuvans,
V případě skupiny, které se aplikovalo adjuvans se prvni dávka emulgovala sdA a zbývající čtyři dávky s if A. V případě všech skupin s výjimkou skupiny, které se aplikovalo aium a jenž se aplikovalo W pg ANI aukgut aplikoval v dávce 33 μρ V případě (. í-MíFA upt-ker aplikovaly iutraperitoneálně a mtmmnstedárně do ětyřhiavého svalu bud' tese, nebo pravé zadní . mi
CZ 304876 86 ktmcefiny. Pr-oi ířt davkx se apbko^Ah \e dvoutýdenním ndetvalu a pak uask-duo d\č dávky v měsíčním íntetvalu. Šest až sedm dut po každé imúu.ízaei, začalo se po druhé dávce, se odebraly vzorky krve za účelem stanovení litrů protilátky,
2. Příprava ímunogenů
Dva miligramy Αβ42 (Caísfbrma Peptide, tofME0339) se přidaly do 0,9 mí dejonizované vody a-směs se míchala na vortexu za vzniku relativně jednotné suspenze- Přidal se alikvot 10 x koncentrovaného PBS (lx PBS, 0,15 MNaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH7,S) o oblému 100 pl, us Suspenze se opět zamíchala na vortexu a inkafeovala se pfes: noc při teplotě 37 Ta použila se další den. Nepoužitý ΑβΙ-42 se uchovával s desikautem Inko lyofííízovauý prášek při ieploíč
-20 C.
Fahnitovlovaný derivát ÁN1792 se připravil spojením s anhydridem kyseliny p&lmítové rozpuste těným v dinwtbylforrasmda a ammotermtnálnhn zbytkem AN 1792 před odstraněním nascentaího peptidů z pryskyřice ošetřením kyselinou fluorovodíková». Aby se připravily dávky přípravku s «plnýtn. Fíeuodovým. adjuvans (CFA).(skupina 2) v připadč první Imunizace se 33 pg ANI 792 ve 200 μ! PBS emulgovala v poměry 1:1 (objem : objem) sCf A v konečném objemu 400 μΐ,
V případě další imunizace se antigen podobně emulgoval s neúplným Freundovým adjuvans (ÍFA),
Aby se připravily dávky prostředku s MPt v případě skupinu 5 a 8, lyofilizovaný prášek (Ribí ImmnuoChem Research, lne,, Hamilíón, MT) se přidaly do 0,2 % vodného Iriethylaminu, aby konečná koncentrace byla I mghnl a míchaly se vonexem Směs se zahřála na teplotu 05 at ;25· 70 ®C po dobu 30 vteřin, aby vznikla slabě neprů-svltná jednotná suspenze micek Pro každou sadu injekci byl připraven čerstvý- roztok, V případě každé injekce ve skupině 5 se bezprostředně před použitím v borokřemiěiíě zkumavce smíchalo 33 pg ANI792 v 16,5 ul PBS, 50 ga MPL (50 uh a 162 μί PBS.
Aby se připravily dávky prostředků semulzí olej ve vodě, ANI792 v PBS se přidalo do 5% skoulenu, 0,5 % Tween §0, 0,5 % Spán 85 v PBS, aby se dosáhlo konečné koncentrace 33 pg ANI792 v 250 ug (skupina 6). Směs se emulgovala 15 už 20 násobným průchodem přes dvou komorové ruční zařízeni až průměr kapek emulze odpovídá Id) pm, což je průměr standardní latexové částice, když se pozoruje pod mikroskopem. Výsledná suspenze byla opalescentni mléčně bílá. Pro každou sérii Injekci se připravily čerstvé emulze. V případě skupiny 8 se přidal ke shvaleou v koncentrací 50 ng vJedné dávce MPL v 0,2 % tríetbyiammu a směs detergentů, aby došlo ke vzasku emulze, V případě pa Imhoy levého derivátu (skupina 7} se přidalo 33 p.g palmnoyi-N.H~Apl“42 v jedné dávce ke skvaienu a vše sc míchalo nu vortexu. Směs se pak přidala do PBS, aby se dosáhlo konečných koncentraci 5 % skvalen, 0,5 % Twee» 80, 0,5 %
Spán 85 a směs se emulgovala, jak se uvádí shora v textu.
Aby se připravily dávky prostředků s atom (skupiny 9 a 10). AN I 792 v FBS se přidaly do Alhydtopole tgel hydroxidu hhrmébo, Acxurmc, WcOhury. NY}, aby se dosáhlo koncentrace *3 pg (v případě nízké dávky, -skupina 9} nebo 300 pg í vysoká dávka, skupina 10} AN i 392 v 5 mg almu v konečné dávce o objemu 250 pl. Suspenze se slabě míchala po dobu 4 hodin pří teplotě matností.
„ Měření litrů protilátky so Šest až sedm dni po imunizace se odebraly morčatům vzorky krve, Začalo se po druhé imunizaci a odebraly se celkem čtyři vzorky krve. Tisy protilátek proti A$42 se měřily testem ELISA, jak se popisuje v sekci Obecný materiál a metody.
CZ 304876 86
4, Příprava tkáně
Přibližné po 14 dnech se usmrtila .všechna morčata-aplikací CO2, Sebrala se cerebrospinálnl tekutina a mozky se vyňaly a izolovaly se tři oblasti mozku (hippoeampys, kůra mozková a mozeček) s a použily se ke stanovém' koncentrace celkového proteinu Αβ za použiti-těsto. ELISA.
B, Výsledky
1. Protilátfcové odezvy
ÍO
Existuje široké rozmezí potence různých adjuvans. v případe, že se měří jako protílátková odezva na imunizaci ANI 7*52. Jak je zobrazeno na obrázku o. 14, když. se ÁN1792 aplikuje v PBS, po dvou až třech imunizacích se nedetekovala žádná protilátka aul po čtvrté a pále dávce s geometrie kýtu průměrem titru (GM1) pouze okolo 45 se nedetekovala žádná odezva. Emulze is vyvolala po třetí dávce střední titry B iMT 255), které se udržely i po čtvrté dávce (GMT301) a snížily se po konečné dávce (GMT 54). V případě ANI.792 vázaný na atom. v dávce 300 pg, kleto je-více. imunogenní v daném Čase než dávka 33 pg, existuje jasná odezva ná antigen v závislosti na dávce. Při maximu predtíátkové odezvy po čtvrté imunizaci je rozdíl mezi dvěma dát kanu
43% $ hodnotou GMT přibližné 1940 (v případě dávky 33 pg) a 3 400 (v případe dávky
300 pg). hxitíiáíková odezva v případě dávky 33 p.g ΑΝ 1792 plus: MBL je velmi podobná protiiáíkové odezvě vytvořené na skoro desetkrát vyšší dávku antigenů (300 ug) vázaného na atom, .Přidání MPL k emulzi snižující potenciál prostředku ve srovnáni s potenciálem MPL jako ad-» juvansje 75 % Palmifcyiovany derivát ANI 792 je zcela neimnnogenni, když se aplikoval v PBS & poskytl slabé tiby přítomně v emulzi s hodnotou GMT 340 a 105 v případě třetího a čtvrtého odběru krve. Nejvyšší titry protilátek se vytvořily s Freundovým adjuvans š maximální hodnotou GMT okolo 87 000, hodnota ie skoro 3()--8 násobně vyšší než hodnota GMT dalších dvou nejslinéjšich prostředku, coz je MPL a vysoká dávka AN1792'alum.
Nejslibnější adjuvans Identifikované v této studii jsou MPL a alum. Z těchto dvou sc více prefe30 ruje MPL, protože je nutná desetkrát nižší dávka, aby vznikla stejná protílátková odezva, jako se získala za použiti atom. Odezva se rnďžc zvýšit zvýšením dávky antigenů a/nebo· adjuvans ® optimalizaci imunizačniho rozvrhu. V případe ANI792 je emulze velmi slabé adjuvans a přidáni emulze k adjuvans MPL se snižuje inlrinsieká aktivita samotného MPL,
2 ,. Množství Αβ v mozku
Čtrnáctidenní morčata sc uspala, odebrala se cerebrospinálnl tekutina (CSF) a také se odebraly mozky zvířat ze skupiny, která se Imunizovala Freundovým adjuvans (skupina 2), MPL (skupina 5), alum s vysokou dávkou <300 pg) AN I 792 ískupina 10) a z kontrolní skupiny imunizované
PBS (skupina 3). Aby se stanovilo množství peptidu Αβ, izolovala sc jedna hemíslera a připravily se homogenáty hippocampálný kortikální a cereberálni oblasti v 5 M gmmídtou, Momog«náty se naradily a kvantifikovaly porovnáním série ředěni standardního proteinu AB se známou koncentrací v testu ELISA. Množství proteinu Αβ v hippoeampusu, v kodexu a v mozečku bylo velmi podobné ve všech čtyřech skupinách navzdory širokému rozmezí proílkitkové odezvy vůči « Αβ vyvolané těmito prostředky. Průměrné množství AB přibližné 25 NG/g tkáně se měřilo v hippoeampusu. 21 ng/g v kúře mozkové a 12 ntog v mozečku. Přítomnost vysokého titru cirkulujících protilátek vůči. Αβ po dobu tří měsíců o některých těchto zvířat nezměnila celkové množství Αβ v jejich mozku. Množství Αβ v CSF bylo také v jednotlivých skupinách docela podobné. Nedostatečně velký účinek imunizace ANI792 na tmdrogermi Αβ indikuje, že imunitní odezva se jo zaměřuje na patologické formace Αβ.
. as ·.
CZ 304876 Bé
Příklad 8; ímmutoí odezva na razná adjuvans u myší
Pro stadii se pouztk samice myši Swiss Webster ve věku .šest? týdnů. přičemž jedna skupina obsahuje 10 až 13 zuřat, Imunizace se aplikovala v den 0, 14, 28, 60, 90 a 20 snbkutňuuě a objem dávky je 200 ph PBS se použil jako pufr pra všechny apl ikace. Sedm dni po každé imnmzaei se zvířatům odebrala krev, přičemž po drahé dávce se začalo s analýzou iítra protilátek testem ELISA, Léčebný režim každé skupiny se stanů v tabulce č, 7,
Tabulka č. 7: Návrh experimente
| skupina | Pr | adjuvans’ | dávka | antigen | dávka ipg} |
| 1 | rw | M P i: | 12,5 pg | ABI792 | 33 |
| 2 | 10 | MOL | 25. pg | ANI 752 | 33 |
| 3 | 10 | M?L | 50 pg | AN1732' | 33 |
| 4 | 13 | MEL | 125 pg | AN1792 | 33 |
| 5 | 13 | MPL | 50 pg | AN1792 | ISO |
| 6 | 13 | HPl | 50 pg | ASI 520 | 33 |
| 7 | 10 | PBS | AN1792 | 33 | |
| 8 | 10 | PBS | žádný | 33 | |
| A | 10 | emulgov. skvalen | 5 % | AN1732 | 33 |
| 10 | 10 | minbáný skva l sm | 5 fe | ANI 792 | 3 3 |
| 11 | .10 | aium | 2 mg | ANI 792 | 33 |
| 12 | 13 | CPL ť almu | 50 tep/2 atg | AN5702 | 33 |
| 13 | 10 | gs-2i | 5 pg | ANI792 | 33 |
| 14 | 1.0 | QS-21 | 10 pg | .AN1792 | 33 |
| 15 | 10 | QS-21 | 25 ANI/9? | ΛΝΊ792 | 33 |
| 15 | 13 | QS- 21 | 25 ANI792. | ΑΝ.1Ϊ92 | 150 |
| 1? | '13 | QS-21 | 25 AN1792 | ANI528 | 33 |
| 1® T | 13 | QS-21 + MPL | 25 pg/50 μο | ANI792 | 33 |
| 19 | 13 | QS-21 ·;· a lun | 25 pg/2 rag | ANI792 | 33 |
Poznámka j 8 Počet myši v každé skupině na začátku experimentu
CZ 304876 Bé b Uvedená adjuvans. Pufr v případě všech těchto formulaci je PBS, V případě skupiny 8. se aéaplikovato adjuvans ani antigen,
Titry protilátek získané v testu ÉLJ.SA proti Áp42 v každé skupině jsou zobrazeny v tabulce ě. 8 dále v testu.
Tabulka č, 8; Geometrické průměty litrů protilátek
| 1 | týden | xihe.ru krve | |||
| | léčba skuoina | 2.9 | 5.0 | 8,7 | 12,9 | 16.7 |
| I | 248 | 1797 | 2577 | 6180 | 4177 |
| 2 | 598 | 3114 | 3984 | 5287 | 6878 |
| 3 | 1372 | 5000 | 7159 | 17333 | 12781 |
| 4 | 1278 | 2079.1 | 14388 | 20097 | 25631 |
| 5 ' | 3288 | 26242 | 13229 | 9315 | 23742 |
| 6 | 61 | 2536 | 2301 | 1442 | 4504 |
| 7................... | 37 | 395 -1 | 484 ’ | 972 | 2149 |
| 8 .. | 25 | 25 | 25 | 25 | 35 |
| 9 | 25 | 183 | 744 | 952 | 1823 |
| 10 | 25 | 89 | 311 | 513 | 81? |
| 11 | 29 | 708 | 2818 | 2165 | 3666 |
| 12 | 198 | 1458 | 1079 | 612 | 797 |
| 13 | 38 | 433 | 566 | 1080 | 626 |
| 14 | 104 | 541 | 3247 | 1609 | 838 |
| 15 | 212 | 2630 | 2472 | 1224 | 1496 |
| 16 | 183 | 2616 | 6680 | 2085 | 1631 |
| 17 | 28 | 201 | 375 | 222 | 1540 |
| 18 | 31699 | 15544 | .2.309.5 | 6412 | 9059 |
| 19 | 63 | 243 | 554 | 299 | 441 |
Tabulka ukazuje, že nejvyšší litry se stiskaly ve skupině 4, 5 a 18, ve kterých se jako adjuvans použito 125 ggMPU 50 pgMPL a QS -21-sMFL,
1$
Příklad 9: Terapeutická účinnost různých adjuvans
Stoditím terapeutické účinností sě provedlo na íransgenníeh myších PDA.PP se sadou udjux aas vhodných pro použití u lidi, aby se stanovila jejich schopnost vyvolat imunitní odezvy na Αβ a vy volat odstranění amyloidmeh depozitů v mozku zprostředkované imunitním systémem,
180 samic a samců heterozygotních tmnsgenních myší PDAPP myši ve věku 7,5 až 8,5 městců se získalo z. instituce Charles River Laboratories. Myši se rozdělily do devíti skupin, které obsahují 15 až 23 zvířat v jedné skupině, aby se Imunizovaly s \h 1 792 nebo ANI 528 v kombinaci s různými adjuvans. Zvířata se rozdělila tak, aby zvířata ve skupině sobě co možná nejvíce odpovídala věkem, pohlavím a původem. Adjuvans zahrnuji alum, MPL a QS-21. každý je kombinovaný s oběma antigeny a Freundovo adjuvans (PA) se kombinovalo pouze s AN1792, táalši sku-48 CZ 304876 86 pmas.se Imunizovala. s ANI 792 vytvořeným v pufru PBS plus íhimerosal, které sloužilo jako to.zervační činidlo, a neaplikovalo se adjuvans. Devět skupin se imunizovalo samotným PBS a sloužilo jako negativní kontrola.
Příprava agregovaných peptidů Αβ: peptidy lidský Αβ1™40 {AN1528, Calsfornía Peptides lne,, Napa, CA, Lot MB0541) a lidský Αβ1-~42 (ANI792, Califoroia Peptides lne., Lot ME0439) se čerstvé rozpustily za účelem přípravy každé sady injekci z lyoídiznvanýeh prášků, které se uchovávaly s desikačnim Činidlem pří teplotě -20 ňC. Pro tento účel se do 0,9 ml deionizované vody přidaly dva miligramy péptidu a směs se m.íchala vortexem, přičemž vznikl relativně jednotný ss roztok nebo suspenze. ANI 528 byt v tomto kroku rozpuštěný narozdíl od ANÍ792. Puk se přidal alíkvoí o objetou 100 pl 10 krůt koncentrovaného PBS (K PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, p.H 7,5) a w stejný okamžik začal ΑΝ 1528 predpitovat Suspenze se opětzamíehaty •wtexem a inkubovaly se přes noc při teplotě 37 T a použily se následujíd den, í5 Aby.se připravily dávky formulací salum (skupi.ua 1 a 5), peptid Αβ v PBS se přidaly jako alhydrogel (dvou procentní gel hydroxidu hlinitého, Sargeaní, lne., Clifron, NJ). aby se dosáhlo koncentraci 100 pg peptidu Αβ pa 1 mg áluto. Ke konečnému objemu dávky se přidal 10 x toeentovaný PBS a konečný objem dávky byl 20O μΐ v Ix koncentrovaném PBS. Před injekci se pak suspenze jemně míchala přibližně po dobu 4 hodiny pří teplotě místnosti.
ré
Aby se připravily dávky prostředku v případě MPL (skupina 2 a 6), lyofilízovaný prášek (R íbi ImmunoChem Research, hm., Halmiton, MT, Lot 0?O39~EO896B) se přidal k 0,2% vodnému roztoku friethylarninu, aby konečná. Umceniraee byla 1. mg/tnl a zamíchala se ua voriesn. Směs se zahřála na teplotu 6S až 70 °C po dobu 30 vteřin, aby vznikla slabě opalěscentni jednotná su25 spenze micek Roztok se uchovával při teplotě 4 °C, V případě každé sady injekcí sc bezprostředně před použitím smíchalo v borokřemičité zkumavce pro jednu dávku ISO pg peptidu v 50 μ! PBS,: S0 pg 'MPL (50 μί) a 100 pl PBS.
Aby se připravily dávky prostředku sQS -21 (skupina.3 a 7) iyafilízovaný prášek ÍAquiia, Pralo minp.ham, MA, Lot A7018R} se přidal do PBS, pHň.6 až 6.7, aby konečná koncentrace byla 1 ntg/rol a vše se míchalo na 'vortexn. Roztok se uchovával při teplotě -20 °C. V případe každé sady injekcí se pro jednu dávku bezprostředné před použitím smíchalo I00pg peptidu v 50 μΙ
PBS, 25 pgQS-2J v 25 μΙ PBS a 125 μ! PBS.
as Aby se připravily dávky prostředku sPrenndcvým adjuvans <skupina 4), iOO μη ÁN1792 ve 2©0 μΐ PBS se emulgovalo v objemu 1 . i roh jenu ohicro) s úplným Froundovym adjuvans (CPA) v konečném objemu 40O μΐ v případě první imunizace. V případě následných imunizaci se antigen podobně emulgoval s neúplným Frenudovým adjuvans (1EA) V případě prostředku, které obsahuji adjuvans ahnn. MPL nebo QS-2I. 10O ug AN1792 nebo AN1S28 v jedné dávce se kombinovalo ? almu (I ma v jednu dávce) nebo MPL i 50 pg v jedné dávce) nebo ýPš-21 í25 μρ v jedné dávce) v konečném objemu 200 μΐ PBS a tylo dávky se zavedly subkutánní ínoknlaci v oblasti zad mezí lopatky. V případě skupiny, které se aplikovalo FA, a v případě první imunizace se 100 pg ANI792 emulgovalo v objemu 1:1 fobjemrobjem) s úplným Freundovým adpnars (t 1 A) aby konečný ohrom bvl líh) μ| a injekce se zavedla ímrapentonealnc SaMedup·
Cích pét ze^dovac-eh dávek obsahuje »tdnc mnf>zsřvi ummogenu v neúplném treuudosě adjuvans i IFA). V případě skupiny, které se aplikuje ANI 792 bez adjuvans, se 10 pg ANI 702 kombinovalo s 5 pg íhímerosalu v konečném objemu 50 pi PBS a zavedlo se subkutánně. Deváté kontrolní skupině se subkntármě aplikovalo pouze 290 ul PBS. imunizace se provedla ve dvoutýdenních intervalech v případě prvouk tří dasek. pak jednou měsíčně s den 0, 16, 28. 56, 85 a
5« 112. Šestý a sedmý den po každé imunizaci se zvířatům odebraly vzorky krve. aby se mohly stanovit díry protilátek. $ odběry ss začalo po druhé dávce. Zvířata se usmrtila přibližně jeden týden po konečné dávce. Množství peptidu Αβ a APP v mozku se měřilo testem ELIÁŠ & irounohisto.49CZ 304876 Bé chemickým hodnoes.mm přítomností amyloidních písků v sekcích mozku. Navíc titry protilátek specifická pro Αβ a také se stanovily prolifcratšvní acytoklnové odezvy závislé na Αβ,.
Tabulka Č. 9 ukazuje, že nejvyšší titry protilátek proti Αβί-42 vyvolaly FA a ANI 792, titry, které tvoří piky po čtvrté imunizaci (pik GMT; 7S 386) a po konečné šesté nmmízael hodnota klesají na 59 %. Maximální průměrná hodnota titra vyvolaná MPL pomoci ANI792 byla o 62 % nižší než se vytvořila pomoc; FA (maximální hodnota GMT je 28 867} a také se dosáhla na začátku imunizačního schématu po třech dávkách. Po Šesté imunizaci následuje snížení maximálních hodnot o 28 %, Maximální průmětná hodnota díru vytvořená. QS---2I kombinovaná s ANT792 (GMT je 1 511) byla přibližné 5 krát u.ížšf než, se získala sMPL, Navíc kmetíky odezvy byly pomalejší, protože byla nutná další imunizace, aby se dosáhlo maximální odezvy, Titry1 vytvořené alum vázaných na ΑΝ 1793 byly výrazně vyšší než titry, které se získaly pomoct QS-21 a kinetické odezvy byly rychlejší, V případe ANT 792 zavedených v PB S s thimerosalem, frekvence a velikost otru. byla znecno \\šG než thn \ případe samotného PBS Maximální thrs sMvoieué sMPl. a AMS528 <nms.hnálm GM1 3099} bsly přibližně 9 krát nižší než tiby vytvořené ANI792. Alutn vázaný oa ANI528 byl velmi málo imunogenní s nízkými titry vytvořenými pouze u některých zvířat. Maximální titry vytvořené s MPL a ANI.528 (maximální hodnota GMT je ,1099} byly přibližně 9 krát nižší než titry s stvořené ΑΝ 1792. Alum vázaný na AN i 528 byl sehni málo imunogenní a pouze u některých zvířat došlo k vytvoření nízkého titru. Žádné protdátkové odezvy nebyly pozorovány ukpmroinich zvířat imunizovaných samotným PBS, ~ 50 CZ 30487b B6
Tabulka č, 9: Geometrický průměr bodsot títrů. protilátek* týden odběru krve
Poznámka;
s ^Geometrický průměr titru protilátek měřený proti Αβ 1--43 bPočct zvířat ve skupině. kteří vykazují odezvu.
Výsledky léčby ANI792 nebo ANI528 s různými adjuvans nebo s thimerosaíem u kortíkáhtiho aniyloiániho ode u dvanácti měsíců starých myší se stanovené testem ELIS A se zobrazily na io obrázku č. 15. U kontrolních myší PDAPF ve věku i2 měsíců imunizovaných PBS se průměrná hodnota celkového Αβ v kodexu byla 1 81? ng/g. Znatelně redukované množství ÁB se pozorovalo u myší ošetřených ANI 792 plus CFA/IFÁ, ANI792 plus alma, AN 1792 plus MPL a QS- 21 plus ÁNI792, S Αβ sníženi dosáhlo statistické významnosti (p je menší než 0,05) pouze v připadl4 AN1792 plus CbViFA. Jak je zobrazeno s příkladu 1 a Π, účinky imunizace redukují.15 čího množsívi Αβ je v podstatě syšši u mysl 15 a 18 měsíců starých. Očekává se, že kompozice ANI 'N2 pl«is alum, ANI 7 Ap92 plus MPL a ANI 792 plus QS--2I dosáhnou statistické význam51
CZ 304876 Bd nosit pri léčbě starších tnyšk Naopak ANT792 plus-konzervační čimdlo thimerosai vykazují průměrně množství peptidu Αβ stejné jako se vyskytuji u my<« ošetřených PBS, Podobné výsledky se získaly, když se porovnávalo korhkákn množství A04? proměňte množství Αβ42 u kontrolních zvířat imunizovaných PRS byla 1 624 ng/g. V mv.o <ktetřenýeh ANI792 plus CTAdfA,
AN I792 plas alum, ANI792 plus MPD a AN 1.792 plos qs ? i se pozorovala:snížená průměrná hodnota množství 403, 1149,620 s 714. Průměrné'množství u myši ošetřených ANI 792 athimerosalent bylo 1619 ng)g AJ342,
Další studie účinnosti terapie s adjnvans/ímunogen se provedla a samic a samců heterozygotníeh ta teansgenroeh myši PDAPP ve věku 9 až-10,5 iněsice. Trváni studie bylo 2$ týdnů a provedla $e »29 až. 40 zvířaty v jedné léčené skupině. Zvířata nakonec dosáhla věku 15 až 16,5 měsíce. Léěené skupiny se identifikovaly v tabulce ld dále v textu.
| adjuvans | imuraagen | .ředicí puf-r | aplikace | |
| .skupina 1 | BTL-GA | A01?S2~GCS (75 Ml | .PBS | SC (250 pij |
| skupina 2 | ISA 51 | AN1792~GGS (7 5 pg) | BBS | IP (400 pl) |
| skupina 3 | QS21 | AR1.7 92-GCS (75 pg) | BBS | SC (250 pl.) |
| skupina 4 | QS21 zkrácený | A01792-GC? (75 pg) | FBS | SC (250 pl) |
| skupina 5 | PBS | SC {250 pij |
Í5:
Tabulku č, 10 zkratky: MAP ~ multiantígenni peptid, TT -epitop T-buuky toxoidu tetanu (830 at 840), SQ' - snbfcutártrn, IP - itůraperítoneáloí, PBS ~ fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, ISA—5s je běžné dostupné adjuvans podobné IFA, OCS je formulace glycinéiteár/sachnró2a, MPt-SEje MPL ve stabilizované emulzi voda elej.
Re/srh unororuce Hl xleníicky pro všechnr léčené -skupiny svýjjtnkou skupiny ~ My um se zavedla Injekce v týdnu 0,2, 4, §, | ?,. 16, 20. 24 a vzorky krve se odebraly v týdnu 3, S, 9, j 3. 17, 21 a 2$, Skupinám 1,2 se aplikovalo osm injekci a skupině 3 se aplikovaly 4 injekce během období 25 týdnu, Skupsně 4 vykazujíc! zkrácený rozvrh Imunizace QS21/AN1792 se aplikovala
?.s injekce pouze v týdnu 0,2,4 a 8. l éto skupině se neaplikovala Injekce po zbytek studie, ačkoli se vzorky krve odebíraly podle stejného plánu jako ve zbytku studie, aby se sledoval pokles mm. Skupina 3 a 5 charakterizovaná jako QS21/ANI792 a FBS slouží jako pozitivní a negativu! kontroly této studie.
3o Tůry se stanovily testem pro stanoveni thru proti protilátkám Αβ,
Skupina 1 je skupina charakterizovaná jako MPL-SB/AN1792 s maximální hodnotou geometrického průměru tátů i GMT) 17 100 v devátém týdnu, která se snížila na hodnotu GMT 10 000 v 25. týdnu, Na počátku litry MPL-SE rostly vyšší rychlostí než u kontrolní skupiny eharakteri35 n >vané QS31/A\ I “92 s skupma 4} charakterizovaná jako ISA 51/AN1792, která během studie produkuje vysoké thr» kdy hodnota. GMT je nad 100 000 po dobu alespoň posledních devíti týdnu studie,
-32CZ 3040 B6
ÍO
Skupina 3 je cfearakterizovanájako kontrolní skupina Q521/ÁNT792, která dosáhla niaxsmahnho titru v 17 týdnech s maximální hodnotou G.MT .16 000. Titr pak v dalších 8 týdnech poklesl ns. hodnotu GMT 8700, ϋjednoho zvířete v této skupině se titr vůbec nezvýšil v průběhu celého experimentu.
Skupina 4 charakterizovaná jako QS2I /AN17O2 se zkráceným programem imunizace dosáhlá maximální hodnoty titru 7 300 ve 13.. týdnu, což je pět týdnů po poslední injekci. Hodnota titru se pak snížila. na hodnotu GM.T2 100 (25-íýden). Vkomrolns skupině se njednoho zvířete nevytvořil detekovatelný titr protilátek, zatímco jiné zvíře .ztratilo všechny titry na konci období po. periody.
na 5 je . imunizovaná samotným PBS a nevykazovala žádné titry i látek.
Aby bylo možné hodnotit množství kortikainiho Αβ, měřilo se celkové množství Αβ a Αβίtestem EÍJSÁ. Vyňala se jedna mozková hcmlsféta. za účelem získáni kortíkálni. hippt;eam( a eeteberálni tkáně, pak následovala homogenizace v pufru guanidmu a v mozku se testovafó množství Αβ. Množství kortikáhiího celkového Αβ a Αβ42 je podobně. Za účelem stanovení významnosti mezi skupinami $ hodnotou pMROS mdíkujieí podstatnou změnu v množství Αβ se provedla stetisucká analýza podle Mann-Whiiney, ze
Všechny léčené skupiny j» pdstataČ snížily celkově množství Αβ ve srovnám' s kontrolní skupinou PBS (tabulka c. i >, Skupina MP1 i ΆΊ ukázala nsuvUši změnu t mnozsts i Αβ s ;e podstatně lepši než v jiných léčených skupinách. Skupina se zkrácenou Imuni/ací QS2;' AN i 792 byla podobná ve všech, změnách Ap v kontrolní skupině im unizované QS21, kterým se aplikovalo všech osm injekci. Množství Αβ ve skupině ISA Sí/ANI 792 byly podobně .-mlženy ve srovnáni se skupinou CFA/IFAtMAP (Αβ5..?),
Tabulka, li; množstvíkortikáhiího Αβ
| F83 | 1405-36 | ISA | QS-21 | QS-21 (4) | |
| průměr {np/p tkáně} | 7 335 | 1 236 | 3 026 | 2 389 | 2 996 |
| rozmezí ing/p tkáně) | 550-18 358 | 70-3 977 | 23-9 777 | 210-11 167 | 24-16 834 |
| hodnota p | <0,0001 | <0,0001 | <0,0001 | <0,0001 | |
| 38 | 29 | 36 | 34 | 40 |
Závěrem, adjuvans MEL-SE, ISA-51 a QS21 kombinovaná s AN 1792 jsou účinná při vyvoláni imunitní odezvy a podstatně oddaluji ukládání Αβ v kortexu.
Příklad 10; Analýza toxicityShromáždily se tkáně za účelem histopatologického testu při ukončení studii popsaných v přlkla4» dech 2, 3 a 7. Navíc testy hematologie a klinické chemie se provedly v konečných vzorcích krve z příkladu 3 a 7. Hodnotila se většina hlavních orgánů, které zahrnují mozek, plíce, lymfatické
-53CZ 304876 Βδ žlázy, gastrointestinálni trakt játra, ledviny, hadledviňky a pohlavní žlázy. Ačkoli se při studiu zvířat pozorovaly sporadické- léze, neexistovaly zřejmé rozdíly ani v tkání ani ve vážnosti lézi u zvířat ošetřených ANI. 792 a u zvířat, která nebyla ošetřena. U zvířat imunizovaných ANI 528 se nezjistily žádné hiatopatologické léze ve srovnáni se zvířaty ošetřenými PBS a udeřenými. Mezi skupinami, kterým se aplikovalo adjuvans a zvířaty ošetřenými PBS popsanými v přikladu 7 neexistuji žádné rozdíly v profilu klinické chemie. Ačkoli existuje podstatné zvýšeni několika hematologických parametrů u zvířat ošetřených ΑΝ 1792 ařreundovým adíuvans, jak se popisuje v příkladu 7. ve srovnání se zvířaty ošetřenými PBS. tyto typy účinků se očekávaly od léčby Fteundovým adjuvaw a dále se u léčby ANI 792 nezaznamenaly žádné ji ně nežádoucí účinky, m Ačkoli toto vyšetření nespadá do loxikoiogbkěho hodnocení, patologie mozku myší POAPP se testovaly jako. část konečné účinnosti. V žádné jiné stud ii se nezaznamenal žádný nežádoucí účinek spojený s morfologii mozku. Tyto výsledky indikuji., Že léčba ANI.792 je dobře tolerována a.
je v podstatě bez vedlejších účinků, ts
Přiklad 11.: Léčba protilátkami proti Αβ
Tyto příklady testuji kapacitu různých monoklonálnfch a poiýkionáinleh protilátek proti Αβ ínhibovat akumulaci Αβ v mozku heterbzygotních transgenních ...myší, iň
1, Návrh studie
Šedesát samců a samic heteroxygotnieh transgenroch myši PDAPP ve věku 8,5 až 10,5 měsíců se získalo v instituci Charles River Laboratory. Myší se rozdělily do šesti skupin, aby se ošetřily as protilátkami určenými proti Αβ, Zvířata se rozdělila do skupin tak, aby co nejvíce odpovídala pohlavím, věkem, původem a zdrojem, Jak je uvedeno v tabulce é. W protilátky zahrnovaly čtyři myši monoklonální protilátky specifické pro Αβ, 21-13 (určené proti zbytkům 1 až 12 A8), 10D5 (určené proti zbytkům í až 16 Αβ). 266 (určeně proti zbytkům 13-28 Αβ a váží se na monomer ni, ale ne agregovaný ANI 792), 21ΙΊ2 (určený proti zbytkům 33-42 Aps ůátá skupina se ošetřísa la frakci polykionáiních protilátek specifických pro Αβ (které vznikly imunizací s agregovaným
AN 1792}, Negativní kxmtroíní skropme se aplikovalo ředidlo. PBS bez protilátek
Monoklonální protilátky se zavedly injekci v dávce přibližně 10 mg/kg (předpokládá se. že myši váždy 50 g). Injekce se aplikovaly intraperitoneálně v prámem každých sedm dni, aby se udržev· vály titry protilátek pnutí Αβ na hodnotě kolem 1 000, Ačkoli v případě monoklonální protilátky
266 se naměřily nižší titry, protože se neváže dobře na agregovaný ANI792, který se použil v testu jako značený antigen. v případě uvedené skupiny se udržoval stejný dávkovači režim. Skupině se v prvních třech týdnech přestala aplikovat monoklonální protilátka 2113, protože se in vivo protilátka velmi rychle odstranila. Před každou dávkou určenou pro měřeni protilátek se •a; zx iřatům odebral vzorek kr\e. Léčba pokračovala po dobu šesti měsíců, celkem po dobu 196 dní.
Zvířata se usmrtila jeden týden po konečné dávce.
- 54 ~
CZ 304876 36
Tabulka č, 12: návrh experimentu
| léčena skuplna | N® | použitá protilátka | specii ite, protilátek | isotyp protilátky |
| 1 | 9 | žádné (samotné PBS) | fiAs | NA |
| 2 | 10 | polykionéini | Λβ1~42 | smíšený |
| 3 | 0 | jnAfor-2H3 | «β 1-5.2 | XgSl |
| 4 | 8 | snAb 10B3 | Αβ1-16 | IgGl |
| 5 | 6: | m&b 266 | Αβ13-20 | IgGl |
| 6 | 8: | mAb 21P 1.2 | Αβ33-42 | I'gG2a |
Poznámka:
s a. Počet myšt ve skupině na konci experimentu. Všechny skupiny na xacátkn experimentu zahrnovaly 10 zvířat
b. Zkratka NA znamená, že se protilátka neaplikovala, o, Zkratka m Ab zríamená nsonoktonální protilátka, m 2. Materiál a metody a. Příprava protilátek
Z krve ze dvou skupin zvířat se připravily polyklonálm protilátky proti Αβ. První skupina zahr(5 nuje lOO samic myší Svriss Webster, které jsou 6 až 8 týdnů statě, imunizovaly se v den 0, 15 a 29 se i OO pg ANI 792 kombinovaným s CFA/íFA, čtyři injekce se aplikovaly v den 36 s poloviční dávkou ANI 792. Zvířata se nechala vykrvácet v den 42, připravilo se sérum a séra se smíchala a získal se celkový objem 64 mi. Druhá skupina obsahovala 24 samic myší ízogenmch s myšíma PDAPř, které nejsou v připadě iíds?kéhe genu APP transgenní a jsou ve veku 6 až 9 týdnu. Myši se imunizovaly v den O, 14, 28 a 5h 100 pg A.NÍ792 kombinovaným sCFA/iFA, Tvto zvířata se nechala také vykrvácet v tlen 63, připravily se séra a spojila se, přičemž celkový objem je i 4 ml. Dvě sady sér se spojily. Protilátko', á frakce se čistila ve dvou krocích sráženi s 50% saturovaným síranem amonným. Konečná sraženina se diaiyzovala proti PBS a testovala se přítomnost endotoxmu. Množství endotoxlrm by jo nižší než I Ei vmg,
Monoklonální protilátky proti Αβ se připravily z tekutiny ascítů. Z tekutiny se nejdříve odstranily lipid)' tak, že se k ledem chlazené tekutině přidal koncentrovaný dexíransuifaí sodný, vše se promíchalo na ledu, až se dosáhlo konečné koncentrace 0,238 %. Pak se přidal za stálého mícháni koncentrovaný CaCE az se dosáhlo konečné koncentrace 64 mM. Tento roztok se oemžriťugoval při 10 COC x g a odstranil se pelet. Supematant se míchal na ledu se stejným objemem saturovaného síranu amonného přidávaného po kankách. Roztok se opět centrifugoval oři 10 O0O x g a odstranil se supematant Pelet se resuspendovai a dialyzoval se proti 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCk pi l 7,5. Tato frakce se aplikovala na kolonu FPLC Sepharose Q od firmy Pharmacia a cínovala se reverzním gradientem 0,4 M až 0,275 M NACI v 20 mM Tris-HCl, pH 7,5,
Maximum protilátek se identifikoval absorbanci při vlnové délce 280 nm a vhodné frakce se slily. Přípravek čištěných protilátek se charakterizoval méienítn koncentrace proteinu au použití metody FIC A a stanovením čistoty za použiti SDS-PAGE. G protilátek se také testovala přitomnesa cndotoxínu. Množství eodotoxtnu bylo nižší než I ED/mg. Titry shodnotou nižší než 100 byly označeny jako titr s hodnotou 25,
-55CZ 304876 Bé
3. M nožství Αβ -a APP v mozku
Po. přibližné sesli měsících léčby různými přípravky protilátek proti Αβ se izoloval mozek ze zvířat po perfúzí týziologickým roztokem. Jedna hemísléra se připravila pro immiphístocfeemtes kou analýzu a drahé se použila pro kvantifikaci množství Apa APP. Za účelem .měřeni koncentrací různých, torem ronyloidniho peptidn beta a amyloidníbo prokurzorového proteinu (APP) se izolovala bemlsrára. a připravily se homogenáty híppocampáM kortikalm a cerebelámí oblasti v 5 M guanidinu, Tyto homogenáty se aaředOy a množství arayioidniho peptidn nebo APP se kvantifikovalo porovnáním sérií ředění standardů peptidů Αβ nebo APP známých .koncentrací ve
u) formátu ELISA.
Celkově množství Αβ a ΑβΙ-4.2 se manouIo v homogenátech v kodexu a htppoeampu.su testera ELISA a množství celkového Αβ v mozečku je zobrazeno v tabulce ě. I I, 12 a 13. Průměrná koncentrace celkového Αβ v případě kontrolní skupiny inokulované s PBS byla S/i sávohně ts. vyšší v híppoeámpusu .než v mozkové kúře (průměr je 63 380 ng/g hippocampálnt tkáně ve srovnání s 17 818 ug/g y případě: mozkové kůra). Průměrné množství v mozečku kontrolní skupiny (30,6 ngíg tkáně) bylo víc jak 2-000 krát nižší než v hippocampusn. Tato množství jsou podobná množství, které: jsme dříve zmiňovaly v případě heterozygotuich íransgenuich myši PDA.PP tohoto věku (johnson-Wood etak. Proč, Nati, Acad, Sel, USA 94,1550-1155 (Ί99?)).
V případě mozkové kůry jedna léčená skupina vykazovala průměrné množství Αβ, které so podstatně lišt od množství kontrolní skupiny (hodnota P je menší než 0,005), těmto zvířatům se aplikovaly pólykionálnl protilátky proti Αβ, jak se uvádí y tabulce č. 13, Průměrné množství Αβί-42 se redukovalo na 65 % ve srovnání s kontrolou pro tuto léčenou skupinu. Průměrné množství
ΑβΙ-42 bylo také podstatně sníženo o $5 % ve srovnáni s kontrolou v jedné další léčené skupině. Těmto zvířatům se aplikovala dávka s mAb 1 ODS «hodnota p je rovna 0,0433).
CZ 304876 86
V hippocampus» průměr procentuálního stažení celkového množství Αβ spojeného s léčbou s monoklonálních protilátek pratí Αβ (50 %. p~0sOO55j nebylo, tak velké, jako hodnota* která, se naměřila v kortexu (65 %) (tabulka & 14), Absolutní hodnota redukce však byla skoro 3 krát vyšší v hippocampuyu. než v kůře mozkové (31 683 ng/g. v híppocatppusu versus 11 658 ag/g tkáně v kůře mozkové). Když se měří množství jako vfce ámyloidogemí forma Αβ, .ΑβΙ-42, spíše než jako celkové množství' Αβ snížení dosažené polykfoeátó protilátkou bylo podstatné (p“0,0025). Střední hodnoty ve skupinách ošetřených mÁb i ODS a 266 se redukovaly «a 33 a, 21%.
- 58 CZ 304876 86 abalka č. 14: Hippocampus
59CZ 304876 Bé
Celkové množství. ,A0 se Mé měřilo v mozečku (tabulka Č. IS), Tyfe skupiny se imanfeovždy polyklonální protilátkou proti Αβ'a protilátkou 266, která .vykazuje podstatnou redukcí celkového množství Αβ i 43 a 46 %, hodnota p je íkOOTj respektive 0,6 i 8-4) a dále. X- skupina ošetřená protilátkou 10D5 vykazuje podstatnou redukci (29 %. hodnota p~-ft,()675).
Tabu Ika. č, 15: mozeček
| Í3č-.;ííá skupina | stfedfe, hsdnoty | ||||
| celkový 3$ | c&Ifevý AS | ||||
| SLÍSS* | hodnota | WěTiťi· | hodnota KOlSft. | ||
| ves | 9 | 30, fe | na” | SA | 40 fe Čti 31, 89° |
| po 5. ;·· š : Síftá : Ϊ p- s- < fefe | fe | 17,61 | 6, «033 | -43 | ife .15*4,36 |
| Mfc 2.8B5 | i-------— | 21» 68 | fe OS75 | -39 | 27,29*19., 43 |
| ?,O.U 266 | s | ts, 59 | 0,0184 | -46 | 19,59*6,58 |
| jtókb 21ZÍ2 | a | 29.,80 | >fe 8989 | -3 | 32,68*9, 90 |
te Poznámku
a. Počet zvlníve skupině na koneí experimentu b, tig/g tkáně
c. analýza podle Marní Whiřney d, zkratka NA znamená neaplikováno
e. standardní odchylka
Koncentrace APP v mozkové kůře a v mozečcích, které pocházejí z myši ošetřených protilátkou nebo PBS se také stanovila testem ELISA. Využily se dva různé testy APP. První test označený APF-ot/FI rozeznává ΑΡΡ···α («, vylučovaná forma APP, která se štěpila v sekvenci Λβ) a formy te plné délky (FL) APP., zatímco druhý test. rozeznává pouze APP-α. Na rozdíl od poklesu množ* stel Αβ spojené s léčbou ti subsady léčených skupin, množství APP se nezměnilo a všech ošetřených zvířat ve srovnáni s kontrolními zvířaty. Tyto výsledky indikují, že imunizace s protilátkami proti Αβ snižují množství Αβ, aniž -se snižuje množství APP,
Mnozstv t Αβ v mozkové tkání, hippocampusu a v mozečku zvířat ošetřených polyklonální protilátkou vytvořenou proti ANI792 se podstatné redukovalo. Menší rozsah monokionáhtleh protilátek proti arninoterrninálni oblasti ΑβΙ--42. specificky proti aminokyselinám 1 až 16 a 13 až 28 také vyka/uje podstatné léčebné účinky.
4, Hlstochemické analýzy
Morfologie Αβ-ímunořeaktivních pinku v podsadách mozku z my ši, které jsou zahrnuty'v® lupinách ošetřených PBS,- polyklonální protilátkou, Αβ42, 21F12. 2b6 a 10195 se kvalitativně porovnávalo s morfologii předchozích studii, ve kterých se puu/nrap standardní imunízačni postupy s Αβ42, Redukce amyloidní usazeniny, morfologie orodovaných pluků a ímunoreaktivita Αβ spojená s buhk.n úzce mění účinky způsobené postupem standardní imunizace. Tato pozorování podporuji výsledky testů LL1SA, kdy se aplikací protilátky Αβ42 dosáhlo podstatné redukce jak v množství celkového Αβ tuk Αβ42,
- 60 CZ 304876 86
V podobném kvalitativním hodnocení se «kázalo, že se snížil počet a výskyt amytoiduích plaků ve skupině myší imunizovaných 10DS, přičemž existuje důkaz, že imunpmaktmta Αβ je spojená s buňkou. Vzhledem ke kontrolním léčeným .zvířatům frakce polyklonálního l'g proti Αβ a jedna z rnonoklpnáhifeh protilátek (lODSs redukovala uzle ptáků o 93 % tespektive o 81 21F12 mají relativně malý účinek na pl.ikove «zle. Mikrotbgv mozku po léčbě pahAp: vykazuji dtťuznt usazeniny a nepřítomnost řady větších kompaktních plaká ve skupině myší. ošetřených. ρηύΑβ^ ve srovnáni s kontrolními ošetřenými zviřafy;
S, Měřeni titrů protilátek
Podsadě tří náhodně, vybraných myši z každé skupiny se před každou'intrapeníoheátat inokulací odebral vzorek krve. Celkem se získalo M vzorků jaw. Titry protilátek se měřily jako protilátky vázající se n.a Αβ 1.-42za použiti sendvičového testu ELISA a plastovými destičkami s velký m množstvím prohlubní potážetiýati ΑβΙ-42, jak se popisuje v sekcí Obecné materiály a metody, ts Průměrné titry pro každý vzorek, krve. jso« zobrazeny na obrázku ě, 16 až '18 v případě polsklo náhli protilátky a nionokíonáhu protilátky 1 ODS a 21F12. Průměrně hodnoty titrů v tomto čase jsou přibližně 1 000 v případe polyklonálního proti látkového přípravku a byly slabě aižší-.neŽ-je tato hodnota v případě zvířat ošetřených I0D5 a-2 IF 12, zo 6, Lym&prolifetotivnj odezvy
Lymfoproliferoee závislá na Αβ se stanovila za použiti buněk-sleziny, které se shromáždily osm dni po konečné ínfei protilátek. Čerstvě shromážděné buňky v prtěte KF v prohlubní se kultivovaly po dobu 5 dni \ přítomností Apl —40 v koncentrací 5 μΜ za účelem stimulace. Jako pozitiv2-s ní kontrola se další buňky kulmovaly s mítogeuem. T butiky FHA a jako negativní kontrolá se buňky kultivovaly samotné bez přidání peptídu,
Splenocyty z dospělých myší PDAFP imunizovaných různými protilátkami proti Αβ se stimulovaly ti? v/fro ANI792 a stanovila se prohíeratívni a cyrokinová.odezva. Účelem těchto testů je so stanovit, zda pasivní imunizace umožnila prezentaci antigenů a tak aktivací odezvy T buňky specifické pro ANI 792, li myši pasivně imunizovaných protilátkami proti Αβ se neprojevila žádná proliferativni nebo cyíokinová odezva specifická pro ANI792.
35. Přiklad 12: Další studie pasivní imunizace
Při druhé -studii se opakovala léčba protilátkou 10DS a testovaly se dvě další protilátky proti Αβ, a t<> muookSonalui protilátka 3D6 ιΛβ: β a 16C i I (Αβο ,q). Koutrohtuu skupmám se aplikovalo buď VBb, noh·! protilátku ÍM2a Mysu bviy '-txrší ve srovnaní s předchozí \indit 1 i s,5 az 12 mésíců staré heterozygotni myši), jinak experímetit proběhl stejným způsobem. Po šestí měsících léčby plukové uzle redukované protilátkou lt)Ds byly vet ti uc/ $0% ro srovnám s kontrolami, které se ošetřily PBS nebo protilátkou TM2a (hodnota p je 0,003), Jedna z dalších protilátek proti Αβ protilátka 3D6 byla stejně neuma, přičemž uzle redukovala z $6 % (hodnota p 0,0031. Podobná /jištěni se získala mořením testem ΓΙ loA -> ΛβΑί lve výsledky demonstruji, žs- protnut· as ková odezva proti peptídu Αβ v nepřítomnosti imunity T buňky je dostatečná pro sníženi ;uny~ loidniho depozitu tt myši PDAPP, ale že ttc všechny protilátky proti Αβ jsou účinně. Zvláště účinné jsou protilátky proti epitopům, které obsahují aminokyseliny I až. 5 nebo 3 až 7 Αβ.
Ukázalo se, že- pasivné aplikovaně protilátky proti Αβ redukovaly rozsah pluků v myším modelu
Alzheimerovy nemoci. Kdvž se udržuje v servi nízká koncentrace protilátek (25 až 70 pg/ml), protilátky mají přistup kCNS v množství dostatečném pro dekoraci beta-amvíoidmeh plaků. Vstup protilátky do CNS není způsoben abnormálním přestupem bariéry krev-mozek, protože nedošlo ke zvyšens vaskulann penneabthíy, sak zničí tl Evans Blue u tuyšs PDAPP, Navíc kou centracc protilátky v mozkovém paronchyntu dospělých myši PDAPP byl stejný jako
-61 CZ 304876 86 v «etransgeooich myších, což reprezentuje 0,1 % koncentraci protilátek v séru (s ohledem ha isotyp),
Přiklad 13' Sledování navázání protilátek
Aby se stanovilo, zda protilátky proti Αβ by mohly působit přímo v CNS, se u ntozkó získaných z myši perfuzovaných fyziologickým roztokem popsané na konci přikladu Xlk testovala přítomnost. periferně aplikovaných protilátek, Nefixované kryosfatické mozkové sekce se vyoUwdy pátí) sobení fluorescenčního činidla určenému proti myšímu trannoglobulinu (kozí anti -myši IgGCy3). Plaky v nmzeích skupiny myší ošetřených protilátkou I QDS a ?-D6 hvN ‘ulně překryté protilátkou, zatímco ve skupině myší ošetřených protilátkou íSCI í toto zabarvení neexistuje. Aby se ukázal plný rozsah uloženi plaků,. sériové sekce každého mozku byly ne r»g imusore&ktívm s protilátkou proti Αβ a pak se sekundárním činidlem. Protilátky 1UD5 a. 5 Db, které -vznikly po ts periferní aplikavt, sc vyskytuji v nadbytku ve vétšiné písku v GNS. V těchto léčených skupinách se uzle plakň veimi redukovaly v porovnání se skupinou IbCl 1. Tato data indikuji, že periferně aplikované prortlátky moh«-tt vstupovat do CNS, kde muže přímo docházet k vymizení amyfoidu, ,fe pravděpodobné, že protilátka i bd i má také přistup k plukům, ale.není schopna se vázat.
Příklad 14: 'festy ex vivo pro testováni aktivity protilátky proti amyloidnim depozitům
Aby se testoval účinek protilátek na zmizení pluků, zavedl se test cv vivo, ve kterém se primární rnikrogliálm' buňky kultivovaly x neíixovanými kryoslatickýtm sekcemi mozku myši PDAPP nebo lidi trpících AD. Mikrogliálm bučky se získaly z. cctebrálních koflíků neonatálnich myši
DBA/2a(l až 3 dní), Koríiky se mechanicky dísociovaly v Hfl-SS (Hanksuv rovnovážný roztok soli. Sigma) s 50 pg/ml DNázy I (Sigma t. Disoeiované buňky se filtrovaly přes flitr, který zachytí buňky o průměru 1QQ nm (Faicon) a ccntrifugovniy se při i 000 ot/min po dobu 5 minut. Pelet se resuspendoval v růstovém médiu (DMEM s vysokým obsahem glukózy, 10 % FBS. 25 ng'ntl rmGM-GSl·;- s buňky se nanesly svysokou hustotou do plastové kultivační nádoby 7-75, Po 7 až 9 dnech se nádoby nechaly rotovat na míchačce při 200 οΐ,/min. po dobít 2 hodin při teplete 37 'C. Suspenze buněk se eentrífugovala při 1 000 otfmin. a resuspendovuia v testovaném médiu,
Deseti mikrometrové sekce mozků myši PDAPF nebo člověka trpícího .AD (posmrtný čas je menší než 3 hodiny) se nechaly roztát a nanesly sc na kruhová skleněná mikroskopická sklíčka pobytá pely lyzinem a umístily se do prohlubni tkáňových kultivačních destiček s 24 prohlubněmi, Sklíčka sc dvakrát omyla testovacím médiem, který obsahuje ii-SFM (médium, které neobsahuje sérum hybridornn, Gibco I3X.1..) s 1% FBS, glutaminem, pěnic ílinem/streptonrycinem a 5 ng/ml rntGM-CSF (R&D«. Kontrolní protilátky nebo protilátky proti Αβ se přidaly ve dvou násobné koncentraci (konečná koncentrace je 5 pg/tnl) po dobu jedné hodiny, Mikroglíální buňky se pak nanesly v hustotě 0,8 x i 04 buriék/ml testovaného média. Kultivace se prováděla v hnmidizovaném inkubátore (37 t:C, v atmosféře 5 % CDfl po dobu 24 hodin nebo více. Na konci inkubace sc kultury fixovaly s 4 % pamfbrmaldehydem a jejich prostupnost se zvyšovala 0,1 % 7'rito45 nem-XIQO. Sekce se nechaly reagovat s protilátkou 3D6 značenou hietinem a pak následoval konjugát stieptavídiuu s Cy3 (Jackson ImmunoRržsearch), Exogenní mikroglíální buňky se zviditelnily jaderným barvením (DAPl), Kultury s« pozorovaly v obraceném fluorescenčním mikroskopu (Nikon, 7E300) a řotomikrografy se připravily za použití digitálního fotoaparátu S.1O1 a softwaru SPO T (Diagnostlc Instruments). V případe westernový analýzy se kultury extrahovaly so v 8M močovině ředěné 1:1 v redukčním iriemovérn vzorkovém pufru a nanesl se na 16% tríemový gel (Novex). Po transferu na tmmobiktn se blofy vystavily působení pabAp42 v koncentraci 5 pg/tnl a pak aníi-myšim protilátkám konjngovaným s HR.P a vyvinuly se s ECL (Ámershant).
CZ 304876 86
Když se provedl test se sekcemi mozku myší PDAPP \ ρπν«ηηοοώ protilátky 1601 (jedna z protilátek proti Αβ nebyla účinná r« r/ro), beta-amyiosdíu plaky zůstaly neporušeny a nepozorovala se žádná lagoeytóza, Naopak když se 'kultivoval) přilehlé sekce v přítomností protilátky I0D5. amyloidoí depozity ve velkém rozsahu vymizely a nnkrogííálm buňky vykazují řadu fagoeyrosých vesikul, které obsahuji Αβ. Identické výsledky se získaly se sekcemi mozků člověka trpícího Alzheimerovou nemocí. Protilátka 10DS vyvolala fagoeytóza piaků AD. zatímco protilátka 1601 nebyla účinná. Navíc, test poskytuje porovnatelné výsledky, když se provede buď s myšími, nebo lidskými mikrogliáloími buňkami a s myšími, králičími protilátkami nebo s protilátkami primátů proti Αβ.
Tabulka ě. 16 ukazuje, zda došlo k navázáni a/nebo .fegoeytóze v případě vazebných specšfit několika různých protilátek. Může být vidět, že protilátky vázající se na epitopy v aminokyselinách i až 7 se váží a odstraňuji arayfošdrn depozity, zatímco protilátky vázající se na epitopy v aminokyselinách 4 až 10 odstraňuji amyloidni depozity, .Protilátky vázající se na zbytek 10 v C-termináíním epitopů se neváží ani. oeodsitaňuji amyioidní depozity'.
Tabulka c. 1 & Analýza epitopové speeifity
| protilátku | barveni | fagocytóza | ||
| epitop | isotyp | |||
| N-fcena. r«Ab | ||||
| 306 | 1-5 | lqC2fc | i | > |
| 2 0 05 | 3-6 | IgGl | r | -í |
| 2/C8 | 3-7 | i | + | v |
| 6010 | 5-10 | IgGl | +· | - |
| 2.4A8 | 4-10 | Krysí IgGl | t | |
| 2.3-28 | ||||
| 1.8 Gll | 10-18 | 'krysí IgGl | - | |
| 266 | 2 6-24 | IgGl | - | ... |
| 22022 | 18-21 | loGŽO |
... 63..
| C-ter:?, | ||||
| 2G3 | -40 | IgGl | —< | |
| fýexi | -40/-42 | IgGl | ... | |
| 21F12 | -4.2 | I gG2 a | - | ... |
| imunní sérum | ||||
| králičí ÍCFA1 | 1-0 | 4- | 4 | |
| ttiyM ÍGFA) | .1-7 | ,:4< | 4' | |
| tpyši (QS~ 214 | 3-7 | 4 | 4 | |
| opičí (03- 21} | 3-7 | 4 | 4· | |
| myši (ΜΆΡΙΟ) | 1-5 | 4 | 4 ...... |
Tabulka to 17 ukazuj© výsledky získané s několika protilátkami proti Αβ, kdy se srovnává jejich schopnost vyvolat íágoeyten v testu ex rréu a redukovat plukové uzle u; vivo ve stadiích pasivního transferu. Ačkoli protilátka 16C11 a 21Γ12 se váže na agregovaný syntetický peptid Αβ s vysokou aviditou, tyto protilátky nereaguji $ beta-amyloídnímt pluky v neítxovanýeh sekckh mozku a nemohou způsobit fagocytózu v testu et p/to s nejsou účinně sni A vréo. Protilátka 10|}\ s polvklonébu piotilsíka pn-b Αρ bila aktnnt w všech třech měřenúh 'Noítlatka 22C8 se váže silněji na analogovou formu přirozeného ÁB, ve kterém kyselina aspartová v poloze I a 7 je nahrazena kyselinou iso^aspartovou. Tyto výsledky ukazuj t. že úěmmsst ?« wo je způsobena odstraněním plaka způsobeným přímo protilátkou v CNS a test o vóv předpovídá účinnost ?>? >vm.
Stehy, test se použil při testováni odstraněni protilátky proti fragmentu synucleinn, který se označuje jako NAC. Ukázalo se,že synuckdnje protein spojený s amyloidnimi pinky. Protilátka proti NAC je v kontaktu se vzorkem mozkové tkáně, který obsahuje amyloidm pisky. Jako kontrola se použilo králičí sérum. Následné monitorováni vykazuje značnou redukci počte a velikosti plaků udávající odstraňující aktivitu protilátky.
-64CZ 304876 Βή
Tabulka č. 17; Teší ea vw jako prodikter účinnosti ítiwo
| pror. i látka | isotyp | a vidli; a pro agregovaný Αβ iptei | navázáni na p-assýluidni pln fey | účinnost e.v vi vc | účinnost, in VÍ TO |
| «ftnekieáŠ.iSi | |||||
| 306 | IgOBb | á?0 | 4- | * | |
| 1005 | IgGl | 43 | 4·' | i- | |
| 16C11 | IgGl | SO | - | ||
| zřídl | IqGŽs | 500 | ... | - | |
| TM2a | IgGl | w | - | ||
| pQiyfeioflXtfsi. | |||||
| ---- | cmé u | .600 | 4· | % |
s Konfokální mikroskopie se použita k potvrzení že Αβ se mtematizsvate behem průběhu teste et wu V přítomnosti kotarolmeh protilátek ěxogenm mlkrogliální buňky se uchovaly v koíbkáhti plose nad tkání, kde existovaly nepatogenní veslkuly, které obsahují Αβ, a piáky v sekci zůstávají neporušeně. V přítomnosti protilátky 10D5 skoro všechen materiál byl obsažen ve vesíknlecb v exogemdch mikrogliátakm buňkách. Aby se stanovilo, zda internaltzovaný peptid byl odstrata něn. kultury ošetřené 10DS se extrahovaly v různé době 8 M močovinou a testovaly se westernovou analýzou. V bodě odpovidajidm jedné hodině, kdy se ještě neobjevila tagccytóza, reakce s polyklonákú protilátkou proti Αβ ukázala silný pruh odpovídající molekulovou hmotností 4 k.D (odpovídá, peptidu Αβ), řagocytóza zpros&dkovmtá protilátkou vede k její degradaci.
?5 Aby se stanovilo, zda fagocytóza v testu ar y/w byla zprostředkována Fc, připravily se fragmenty F(abT2 protilátky ?D6 proti Αβ, Ačkoli fragmenty F(ab')2 si ponechaly svou úplnou schopnost reagovat s ptáky, nejsou schopny způsobit ířtgoeytózu pomocí ndkrogiiáhdch buněk. Navíc tagocytč/a s celou protihtkon m mohla být blokována činidlem proti myším receptorům Fc íanti CD i 6/32). Tato data indikuji, že odstranění Αβ íuvmo je zprostředkovaně tágocytózou zpro20 sttedkovanon receptorem Fc.
.Přiklad 15; Průchod protilátek skrz bariéru krev-mozek
Tento příklad stanovme koncentraci protilátky zavedené do mozku, pak následnic iníraventázíd injekce do perí&ráfot tkáně normálních myší nebo myší PDAPP. Myši PDAPP nebo normální kontrolní myš- sc perfůzovalv s 0,9% NaCl. Získaly se oblasti mozku (hippocumpus nebo kúra mozková) a rychle se zamrazily. Mozek se homogenizoval v 0,1% tritonu s inhibitory proteázy. imnnoglohurtn sc detekoval v extraktech testem ELISA. i'a'2 kozí anti-myší IgG se potáhl na destičku RIA páko značte i činidlo. Sérum nebo extrakty mozků se inkubovaly po dobu jedné hodiny. korypy se dcttkosaly s anti-myším IgGl -HR.P nebo I.g.O2a-HRP nebo igG2b IIRP (Caltag). Protilátky bez ohledu na Isoíyp byly přítomny v CNS v koncentraci, která je Id 000, když sc zjišťuje v kru Když Koncentrace igtd byla trojnásobek koncentrace LtG2a \ krvi, byla takt trojnásohek koncentrace l.g.G2a v mozku» obé protilátky tvoři Od % jejích množství v krví. Tento výsledek se pozoroval u transgemdch a netransgenmeh myší.
- 65 CZ 304876 B6
Příklad 16; Terapeutická účinnost peptidu Αβ v konfiguraci MAP
Studie účinnosti terapie adjuvans/iutuuogeti se provedla za použití samic a samců heterozygm» nich tansgermích myši PDAPP ve věku 9 až KkS měsíce, přičemž se testovala účinnost fúzního •5 proteinu, který obsahuje Afil -7 v tetratnérové konfiguraci MAP, jak se popisuj© shora v textu. Trvání studie bylo 25 týdnů a do skupiny se zařadilo 29 až 40 zvířat. Zx íraia na konci studie byla 15 měsíců stará. Metody používané při této studií jsou stejné jako při terapeutické studií s různými adiuvans v přikladu Víří shora v textu. Léčené skupiny se definuji dále v textu v tabulce Č„ ik
Tabulka Č. 18:
| adýova-úš | isiunogsn | ředicí pufr | ap.t iksoe | |
| .skupina i | GFft/tFX | mníAM- 3:TT) G-MW | BBS | w: has pi t |
| skepína 2 | ČíGí | ANI 7 52- GCS pSivyS | PSS | sc: (259 01? |
| bkupina 3 | UBS | - | * | SC i 250 piy |
Zkratky uvedené v tabulce: MAP znamená mulfiantigentd peptid, TT znamená epitop T buňky toxoidu temnu (83()-844), SC znamená subkutánní, IP znamená peritoneální, PBS znamená íy?iologieký roztek putrovaný fosfereénsmem, GCS je formulace giycja/eitrát/sa.chaTt)za.
ímnnizační rozvrh byl pro všechny skupiny stejný. Myším se zavedla Injekce v týdnu tk 2, 4, 8, 12. 16, 20, 24, přičemž se vzorky krxe odebraly v týdnu .3, 5, 9, i 3, 17. 21 a 25. Skupinám 1. 2. .< 4 a 6 se aplikovalo osm injekcí skupina 2 a 3 0821/ANI 792 a PBS sloužily jako pozitivní a negativní kontroly
Tttty se stanovily festem pro stanovení titru protilátky proti Αβ.
Skupina 1 je skupina ΟΆ/ΙΓΑ,ΜΑΡ(Αβ1····7:ΤΓ) vyjadřující nízký thr. Maximální hodnota GMT byla pouze 1 200 v týdnu 13 a v týdnu 25 klesla na 600. 3 z 30 myši, nevykazují žádný titr, a dalších sedm myši nepřekročily na konci studie titr 400.
Skupina 2 je kontrolní skupina QS2I/AN 1792, která dosáhla maximální hodnoty litru v 17, týdnu, přičemž hodnota GMT je tě 990. Tifc pak poklesl během dalších 8 týdnů na hodnotu GMT 8 Oísi Jedno zvíře v teto skupině nelxoíí titr píoubmk v nrůběhu celého experimentu
Skupina 3 se imunizovala samotným PBS a nevykazuje žádný titr protilátek.
Obé léčené skupiny vykazuji podstatné snížení množstx s kortikáhúho Αβ ve srovnání s kontrolní skupinou imunizovanou PBS (tabulka, ě. 19), Skupina < FAfiFA:MAF (Afi!~7) podstatně snížila množství Αβ ve srovnání s kontrolní skupinou PBS navzdory relativně nízkých tirrň protilátek proti Αβ,
- 66 Tabulka č. 19; Množství kortíkálního A0
| PBS | MAP | QS-21 | |
| průměr (rig/g tkáně) | 7 335 | 3 692 | 2 389 |
| rozlezl (ng/g tkáně) | 550-18 358 | 240-10 782 | 210-11 167 |
| hodnota p | 0,0003 | jsongí, než 0 >0001 | |
| Tí | 38 | 30 | 34 |
ítnunogeu Αβ 1-7 MAP je účinný při vyvolání dostatečné imunitní 'odezvy § ohledem na ukládání Αβ v kortexu.
Příklad 17: Mapováni epitópu imunogenní odezvy na Αβ u opic
Tento příklad analyzuje odezvu primáta na imunizaci $ ANI 792 (to je Αβ1~42). 11 skupin opic ίΦ H/pohkrví/skupmaj se tmuaizovaly ANI792 (dávka obsahuje 75 nebo 300 pg) v kombinaci s adjuvans QS-2Í (dávka obsahuje SQ nebo 100 pg) nebo 5 % sterilní dextrózy ve vodé (D5W, kontrolní skupina). Všem zvířatům se aplikovaly IM injekce podle jednoho ze tří rozvrhů, jak je zobrazeno v tabulce c. 20, přičemž se aplikovalo celkem 4, 5 nebo 8 dávek. 175. den studie se shromáždily vzorky séra (z 4 opic/poblnvi/skupina) a vzorky CSF iz 3 opic/pohiasúskupina) zis~ ts kané 176, dcu studie a hodnotila se jejích schopnost vázat se na peptid ΑβΙ-40 a APP.
Tabulka č, 20; Zařazení do skupin a obsah dávky
| skupina ě- | rozvrh* | «opic <M/F) | dávka AW 393 ;,ug/cíávk«) | dávka QS-21 (po/dávka) | způsob aplikace |
| 3h | 1 | 4/4 | 0 | 0 | IM |
| 2 | Ϊ | 4 /4 | prostředek | 50 | TM |
| 3 | Ϊ | 4/4 | prostřédefc | 100 | IM |
| 4 | 1 | 4/4 | 75 | 50 | TM |
| <5 | 1 | 4/4 | 300 | 50 | TM |
| 6 | 1 | 4/4 | 75 | 100 | TM |
| 7 | i | 4/4 | 300 | 100 | IM |
| 8 | 2 | 4/4 | 75 | 100 | TM |
| 9 | 2 | 4/4 | 300 | 100 | IM |
| 10 | 3 | 4/4 | 75 | 100 | TM |
| 11 | 3 | 4/4 | 300 | 100 | IM ~ |
a, rozvrh 1: dávka v den Í,ÍS, 29, 57, 85, 113, 141, 169, rozvrh 2: dávku v den 1, 29, 57, 113, 1.69, rozvrh 3, dávka v den 1,43, 85,169,
- «57 b, kontehu skupině se aplikovala injekcí D5 W
c. prostředek obsahuje pufr giyein/ei.trát/sacharóza, který je excipientem pro ANI 792.
Skutečné «spořádání lineárního peptidu rozeznávaného protilátkami ve vzorcích séra ze zvířat imunizovaných ANI792 se stanovil testem ELÍSA, který měří navázánitěchto protilátek na přesahující st peptidy, které překrývají celou sekvenci Αβ;--42. Peptidy značené hiotioera s částečnou sekvenci ANI792 se získaly z instituce Chlrou Technologies, jako peptidy obsahující. 10 aminokyselin s překryvetn 9 zbytků (syntéza o 5366,. ě. .5331 a é.58 i 4). Prvních 32 peptidů je na Cdkoncí značeno biotinem linkerem GGK. Posledních 10 peptidů jsou značeny blotínem na Nta konci s linkerem, který obsahuje EG EG (SEQ ÍD NG: 70). Eyofdízované-peptidy značené híotiněm se rozpustily v koncentraci 5 rnM v DMSO. Tyto zásobní roztoky peptidů se ředily ua koncentraci 5 uM v TTBS (0,05 % Tvveeu 20, 25 mM Tris HCI, 137'mM NaCl, 5.1 mM K.CE ”7,5). ÁHkvoty o objemu 100 pi tohoto 5μΜ roztoku se přidaly ve dvou provedeních do destiček s 96 prohlubněmi, které jsou potaženy štreptavidinem (Pierec). Destičky se inkubovaly po ts dobu jedné hodiny při teplotě místností, p-ak se promyly čtyřikrát TTBS, Vzorky séra se ředily ředidlem bez azidu, aby sc normalizovaly titry a do každé prohlubně se přidalo 100 μί. Tyto destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě tmsínostt a pak ?e promvlv čtyřikrát 1 TBS Kozí arttiMidske protilátky konjugované s HRP (Juefao.n. ImmunoReseareh) se ředily 1: 10 000 v ředidle bez-, azidu. a do prohlubně se přidalo .100 pk Destičky se opět inkubovaly a promyly.
Aby se vyvinula barevná reakce, do prohlubně se přidalo TMB (Pierce) o objemu 100' pl a vše se inkubovalo po .doba. 15 frtibu a pak se přidalo 30 μΙ 2M H«SQ«, tón se .zastavilareakce. Optická hustota se měřila při vlnové délce 400 am. sta kolorimetrickém čtecím zařízení Ymax nebo Specíramax,
Imunizace s ANI 792 vede k produkci protilátek u 100 % zvířat ve všech skupinách, kterým se aplikovala dávka v den 175. Průměrné hodnoty turu ve skupinách jsou v rozmezí 14 596 az 56 084. Objevuje se trend, že titr,· jsou vyšší, když ve imunizuje s vyšší koncentrací antigenů a/nebo adjuvans, ale nedemonstrovaly se statisticky podstatné rozdíly, které jsou způsobené variabilitou odezvou u jednotlivých zvířat na imunizaci,
3fí
Séra, která jsou pozitivní na protilátky vůči ANI 792 jsou tnké pozitivní v případě protilátek vůči Αβ1-40, Průměrné titry ve skupině jsou v rozmezí 36 86? až 165 991 a jako v případě titrů proti antigenů ANI792 nevykazují statisticky podstatné rozdíly mezi skupinami v den 175, Navázání na ANI792 vykazuje vysoce pozitivní korelaci s navázáním na Αβ1··40 (Spearmas r ~ 0,8671).35
Za 48 ímanízovarsých opic podle různého rozvrhu ANI 792 se získalo 53 vzorků CSF s adekvátním objemem a kvalitou. 32 |9? %) z nich těchto opic vykazují pozitivní titry vůči ANI 792. Hodnoty titru jsou v rozmezí 2 až 246 se střední hodnotou 49,44^21,34, Množství protilátek proti ANI792 v CSE jo 0. iS^O,! I % hodnoty, která se muněuls v séru & vykazuje vysoce pozitivní korelací (Spearman r:::9,?840) s titry v séru. Žádné rozdíly v procentu protilátky nebylo možné vidět ve skupinách nebo mezi pohlavím v CSF. Množství protilátky v CSF je konzistentní s pasivním transferem periferně vy tvořené protilátky·' přes bariéru krev-mosek do centrálního nervového systému,
Testování sady vzorků CSF pozitivních na protilátku proti ANI 792 demonstrovalo, že jako protilátka ve vzorcích séra tak protilátku v CSF zkřížené reaguje s Apl--40. Titry protilátek proti ΑβΙ-40 ukázaly vysokou korelaci (Sparman r:::0,9634) $ titry protilátky proti .ANI 792. Testováni vady vzorku t SF cnejvy^hm titry protilátky v«G AN; 292 ncvvkazupzadně navázaní na APP, jako v případě sérových protilátek.
Kdy'/ w sérum /e dne 175 tevt-oah proti sérum prekrývnucích sc desetiroérmeh peptidu. protilátky ze všech opic vázaných na peptid, jejichž sekvence pokrývá aminokyseliny 1 až 10 peptidu ΑΝ 1792 (aminokyseliny peptidu APP 653 až 672). C některých zvířat to byt pouze jediný peptid, o něhož se dalo měřit navázáni {zobrazme· n& obrázku ě. 19).
-68CZ 304876 fíó ϋ jiných zvířat se· mohou měřit, jiná reaktivita, afe ve všech případech převládá reaktivita s N~ terminální peptidovon sekvencí. Další reaktivity spadají do dvou skupin. První a stejhěžoéjši skupinou je navázaní peptidu kolem N-kouce 1.-10 peptidu ANI 792 (obrázek č, 20). Navázání tohoto typu bylo řízeno aa peptid překrývající aminokyseliny 1 až. 8, 1 až 9 a 2 az II peptidu s ANI 792. Tyto reaktivity kombinované s reaktivitou s peptldem .1 až 10 reprezentuji naprostou většinu reaktivity y všech zvířat. Mapováni epitopu jednotlivých zvířat v čase indikuje, že reaktivita protilátek s peptldem 1 t& 16 postupuje k přilehlým peptidum. i o demonstruje silnou aktivaci immňtol odezvy vůči N-konci peptidu ANI792 sjeho volným termmáínftn zbytkem kyseliny aspartové, Druhá mmoritni detekovafelná aktivita u některých zvířat je navázáni peptidů lokalito zovaných aminokyseliny ? až .16, .11 až 20 a 1.6 až. 25 peptidu ANI 792, Tyto reaktivity je rnožrsě spatřit u pouze. 10 až .10 % opic.
Variabilita odezvy mezi různými zvířaty (například zda aminokyseliny 1 až 10 jsou exkluzivním nebo převládajícím reaktivním epitopem) nekoreluje a dávkou anfigen/adjuvsus, s rozvrhem aplikace dávky nebo s ti trém protilátky a je pravděpodobně odrazem genetického uspořádáni u každého jednotlivého zv iřeíe.
Přiklad 18: Prevence, a léčba člověka se
Aby -se stanovila bezpečnost aplikace pro člověka, provedla se fáze 1 studie. která zahrnuje aplikaci jedině dávky. Terapeutické činidlo se aplikovalo ve vzrůstajících dávkách různým pacientům, přičemž se začalo přibližně n 0,91 množství předpokládané účinnosti a zvyšováni dávky probíhalo s faktorem ?, až se množství přiblížilo desetinásobku účinné myší dávky,
Aby se stanovila terapeutická účinnost, provedla se fáze 11 studie. Vybrali se pacienti trpící časnou nebo střední fází Alzheimerovy nemoci, což se definovalo použitím kritérií uznávaných Instituci Alzheimers disease and Related Disorders Association íAD&DAk Vhodní pacienti dosáhly skóre v testu „Mini-.Mental State Exam“ (MMSR) v rozmezí 12 až 2b. Jiná výběrová kritéria je skutečnost, že pacienti pravděpodobně prožiji trváni studie a nevyskytují se komplikace, jako je užívání léku, které mohou interferovat, Základní hodnoceni funkce pacienta se provádí použitím klasických psyehontetrickýeh standardů, jako je MMSE ADS, které jsou jednotným měřítkem pro hodnoceni pacientů trpících Áizheimerovon nemoci,
Tato psyehometrícká stupnice slouží jako rníra postupu Alzheimerovy nemocí. Vhodné stupnice kvalhatNmiíp žtsom se muže také použit k monitorováni luhý. Postup onemoencm muže bvt dále sledováno MR1. Profily krve pacientů mohou také být monitorovány testy protilátky pro imunogen a odezvy T buněk.
•to Pacienti jsou náhodně rozděleni a léčeni buď terapenfiekým činidlem, nebo placebem. Pacienti se sleduji alespoň každých šest měsíců. Účinnost se stanovila podstatnou redukcí postupu léčené skupiny vztaženo ke skupině, kde se aplikovalo placebo.
Drahá fáze studie se provedla tak. že se hodnotila konverze pacientů s časnou ztrátou paměti,
4S která není způsobena Áizheimerovon nemoct která se nazývá zírám paměti spojená s věkem (ΑΑ,ΜΙ) nebo lehká oiigofřénie (MCI) na možnou Alzheimerovu nemoc, jak se definuje kriterií APR.D.A. Pacienti s vysokým nebezpečím konverze na Alzheimerovu nemoc, se vybraly neklirncké populace testováním referenčních populaci, kde se sledovaly známky ztráty pamětí a jiné obtíže spojené se symptomy ztráty paměti stádia pre-Alzheimerovy nemoci. výskyt Alzheimero50 v> nemocí v r-idíne. faktory gencttckycu předpoMadn pro toto onvnmcněm. věk. pohktvt a une rysy. které znamenají velké nebezpečí vzniku Alzheimerovy nemoci. Vytvořilo se základní skóre získané ve vhodných testech zahrnující MMSE a ADAS spolu sjínýrni stupnicemi navrženými tak, že s;e hodnotí více normální populace. Tyto populace pacientů se sledují v intervalech přibližné šesti městců a konečný bod v případě každého pacienta je zda jeho onemocněni konvertuje na Alzheimerovu nemoc, jak ji definuji kritéria ADRD.A na konci pozorováni.
-69CZ 304876 B6
Příklad 19: Olw.né snateríály a metody 1.. Míření titrú protilátek s Myším se odebrala krev z ocasní žíly o objemu 200 pl do .raikroeentrifogové zkumavky. Morčatům se nejdříve vyholila oblast hlezna a pak ,-e použila jehla 18 gaugé a odebrala se krev z matatarsálni Žily a 'krev se Jímala do mikmentnrugacni zkumavky, krev se nechala srážet po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti (RT), míchala vorteaem a eentrifogovaía se při 14.000 x g po doňu deseti nun.t, am -<c ->epar. vala ze ‘'«ra .ncžeez a Seno se pak pr^eslo co cuté mecoven ιβ trifugační zkumavky a uchovávalo se při teplotě 4 *C až do lítraee.
Titry protilátek se stanovily restem ELISA. Mikrotítrační destičky s 96 prohlubněmi (deštíčky Costar E1A) se potáhly K)0 μ| rozteku, který obsahuje buď 10 pg/mi Αβ42, nebo SÁPP nebo jiné antigeny, jak se píše v každé zprávě v potahovacím pufe (0J M fosforečnan sodný, pH8,5, ís OJ % azid iodný; a uchovávaly se přes trne pří teplotě .místnosti. Prohhibne se vyšály a do pn> hlubnl se přidalo sérum s počátečním ředěním 1/100 v ředicím pufe {0,014 M fosEueénmm sodného pH?«4. 0JS M NaCl, 0,6% albuminu v bovinním sem, u.05 % thiomerosaíu). fedm sérii ředěni vzorku se připravilo přímo na plotny ve. třech kr-sru h. aby se dosáhlo konečného ředěni
1/218 700. Ředěni se inknbovalo v potažených prohlubních destiček po dobu jedné hodiny při
2ě teplotě místností. Deštíčky se pak promyly čtyřikrát FBS. které obsahuje 0,05 % Tweeu 20. Druhá protilátka kozí anti-myší kt konjugované s křenovou peroxídázou (získané od lirmy Boehringer mannhehn) se přidalo do prohlubní jako 100 μΐ tedení 1/3 000 v.ředicím pufe a yse se iakubovalo po dobu jedno bodaný při teplotě místnosti. Destičky se promyly ety říkrát λ FBS, Tsvecn 20. Aby se vyvinul ehromogen, do každé prohlubně se přidal 100 μΙ 1MB (3X5,5% teiramethyibenzídm získaný od firmy Pferee Chemicals) vše se ínkubovalo po dobu 15 minut při teplotě místnosti, Reakce se zastavila přidáním .25 μΐ 2M HjSOj, Intenzita barvy se pak odečítala, na molekulovém zařízení Vmax při vlnové délce 450 nm až 650 nm,
Titry se definovaly jako převrácená hodnota ředění séra dávající jednu polovinu maxima hodnoty
OD, Maximální hodnota OD se v obecném případě odečítala z počátečního ředění Dl 00 s výjimkou případu s velmi vysokými titry, v případě, že vyšší počáteční ředěni je nezbytné k «stanovení maximální hodnoty OD. jestliže 50% bod spadá mezi dvě ředěni, provedla se lineární extrapolace, aby se vypočítal konečný titr. Aby se vypočítal geometrický průměr titru protilátek, tury nižší než 100 se automaticky označily jako titry s hodnotou 2$,
2, Testy proliferace lymfocytů myším se provedla nuesíeze isofíuyanem. Sleziny se odstranily a promyly se dvakrát 5 ml PBS, který obsahuje 10% femlní hovimu sérum deaktivované teplem (PBS-FRS) a pak se homogenito zovalo pří teplotě 50 vyjádřeno v jednotce Centricon (Dako .*VS. Norsko? v 1,5 mi FBS FBS po dobu 10 vteř-n pří 100 ot./min v Medímaehine (Deko), po níž následuje filtrace přes nylonové síto s velikostí pórů 100 mikronu. Splenoeyty se promyly jednou 15 ml FBS- FBS, pak se vytvořil pelet centrifugací pří 2ífe x g po dobu 15 minut. Cervene krevní buňky se lyžovaly tím. ze sc rcsuspenduvaoim peletu eeníriťugecí při 200 x g po dobu 5 minut. Červené krevní buňky se iyzo45 vály tím, že se resuspendoval pelet v 5 ml pufe. který obsahuje 0,15 M NlfiCi, 1 M KHCCfi. 0,1 M NaEDIA, pB7,4 po dobu pěti minut při teplotě místnosti Leokoeyty se pak promyly způsobeni popsaným shora v textu. Čerstvé izolované buňky sleziny 110' buněk v prohlubni) se kultivovalo ve třech provedeních na mik rotí tměních destičkách pro tkáňové kultury s duem ve tvaru lf s 05 prohlubněmi iCormng. Cambridge. MAs v kuluvačnínt mérhu RPMI 1640 ptRH Ifioseí50 ences. Lenexa, KS) doplněném 2,95mM L glutaminem, 1% smést pěnici hnuMreptom ve inu a 10% FBS deaktivovaným teplem po dobu 96 hodin při teplotě 37 l'C. Takové se v rázných (láskách., které jsou v rozmez? 5 až 0.18 mikromolu ve čtyřech krocích přidaly režné peptidy Ap, jsou to například Aph-16, Αβ 1--40, ABI 42 nebo reverzní peptid Αβ40™1. Buňky v kontrolních prohlubních se kultivovaly s Goneanavalmem A (ConÁ) (Sigma, cat. # C--5275, v koncentraci 1
-70.
CZ 304876 Βδ míkrogram/ffll), aniž se přidat protein. K buňkám se přidal na posledttieli 24 hodin 3H~thymidín (do jedné prohlubně přidal 1 μ€ί od firmy Amersham Corp., Arhngton-Heíghís ΪΕ). Buňky se pak sklidily na destičky UníFIlter a počítaly se vzah/em Γορ Lomu Micropiate Scíntíllatíou Counter (Packard ínstramenfe, Dowwrs Otové, IL). kysiedky se expritnovaly jako počet impuls zů radioaktivity za jednu minutu (cpm) začleněných do nerozpuamýdh makromolekul,
4. Příprava mozkové tkáně
Po «smrcení se mozek odstranil a jedna hemisfea se připravila pro ímmtohfeioehsroiekou analýw zu, zatímco tří oblasti mozku (hippocamptss, kortex a mozeček) se získaly z jiné hemísř&y a použilv se k měření koncentrace razných proteinu Αβ a forem -\PO za použiti specifického testu
ELISA íJohnson-Woodet al., Fmp. Nati. Acad, Sci, USA 94, 1550-1555 (1997)}.
Tkáně určené pro lest ELISA se homogenízovaly v 10 objemech guanídtnoveho pufru chlazené15 ho ledem (5,0 M guanidm-HCl, 50 mM Tris-HCl pH8,0). Homogenáty se zamíchaly mírným mícháním za použití Adama Nutafora (Fisher) po dobu tří až čtyř .hodin,. pak se skladovaly při teplotě -20 nC, aby se kvantifikovalo množství Αβ a APP, Dřívější experimenty: se ukazují, že nnalyíy byly stabilní za těchto podmínek uchováváni a že syntetický protein Αβ (Baehem} by se mohl kvantitativné získat když se přidá do homogenátu kontrolní mozkové tkáně z mláďat myší
Oohnson-Woodef al. Proč. Natí. Acad, Sci. USaX 1550-1555 (1997)).
5. Měřeni množství Αβ
Homogenáty mozku se ředily v poměru 1:10 skaseínovým ředidlem chlazeným ledem (0,2$ % kssein, PBS, 0,05 % azid sodný, 20 pg/ml aprofinitm, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg'ml leupeptídinu) a pak se eentrdugovaly pří 16 000 x g po dobu 20 uhnul při teplotě 4 '·(?, Standardy syntooc kého proteinu Αβ (i až 42 aminokyselin) a standardy APP se připravily tak. aby zahrnovaly 0,5 M guanídin. Sendvičový test ELISA pro „celkový“ Αβ využívá monoklonsim protilátku 266, která je specifická pro aminokyseliny 13 až 20 proteinu Αβ (Seubett et al, Nátuře ~59. 525-127
3» 11992)), jako značící protilátka, a monoklonální protilátku 3D6 značenou biotmem. která je specifická pro ammokyseímy i až 5 proteinu Αβ Uohnso.n-Wood et al.. Proč, Nati Acad. Sci. USA 94, 1550 1555 i 199?)) jako reportni protilátku. Monoklouáirh protilátka 3D6 nerozeznává vylučovaný APP nebes APP v celé délce, ale detekuje druhy Αβ s aminotermínální kyselinou asparíovou, Tento tet má nižší limit citlivosti přibližně 50 ng/ml (11 n.M) & nevykazuje zkříženou reak35 tivítu s endogenním myším proteinem Αβ v koncentracích do 1 ng/ml (Johnson™Wood et al, Proč. Natí. Acad. Sci. USA 94, t 55<M555 (1907»,
Sendvičový test ELISA specifický pro ΑβΙ-42 používá πηΑβ 2IPI, která je specifická pro aminokyseliny 33 až 42 peptidů Αβ Johnson Wood et al. Proč. Nati, Acad. Sci. USA 94. 15501555 (1997)) jako značené protilátky. V tomto testu se jako reportni protilátka používá naÁp 3D6, která má nižší limit citlivosti okolo 125 pg/ml (28 pM, johnson-Wood et al., Proč-, Nati, Acad. Sei. USA 94, 1550-1555 (1997)), V případě festu ELISA pro protein Αβ se 100 pl buď mAfi 266 (v koncentraci 10 pg/ml), nebo χηΑβ 21 FI2 v koncentraci 5 pg/ml potáhlo sta dno prohlubni destiček s96 prohlubněmi tCostar) inkubaci přes noc při teplotě místností. Roztok se od45 stranil aspiraci a proltobně se blokovaly přidáním 200 ul 0,25 % lidského sérového albuminu v patru PBS po dobu alespoň jedné hodiny při teplotě místnosti. Blokační roztok sc odstranil a destičky se uchovávaly vysušené při teplotě 4 °C až do použití. Destičky se znovu před použitím hydratovaty vpromývacim pulty (fyzroioglcký .roztok pufrovaný Tris MIS M ŇaCl, 0,01. M Trts -HCi, pH 7,5) plus 0,05 % Tvteen 20). Vzotky a standardy se přidaly do prohlubni so v trojnásobných alihvoteeh o objemu 100 μ! a pak se inkubovaly přes noc oři teplotě 4 V. Destičky se promyly alespoň třikrát v protuývacjm pufru mezi každým krokem testu. Protilátky m 0B3Db zrutoenč bsotmero se ředily na koncentraci OD pgml s kavernovém testovacím pufru (*i.2v % kaseto?., PB*š, Pdh % tvseett 20 pH 7,4) přidaly re do prohlubni a inkubovaly. se ptt
- 71 CZ 394876 B6 dobu jedtté hodiny pří teplotě místeostí. Roujugát «vidinu « křenové peroxídázy (avidín -HRP se získal od firmy Vector, lEuíistg&me, CA) ředěný 1: 40 006 v kaseinovém testovacím pufru přidal se do prohlubní a kultivovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místností, Přidal sě kofotitnetričky substrát SL-OW ΓΜΒ-ELISA fPierce) a nechal se reagovat po dobu 15 minut pří teplotě s mssínostv en/ynsuttcka scukce \c raMxda plulansm ?v ol 5\i 1 !.>/)<, Ecokčto produkt ve Manit fíkoval za použití' moíokuktvého zařízení Vm«x a; změřil se rozdíl v absořhaucj při vlnové délce 450 a 650 nrn,
6. Měření množství APP
R>
Využily se dva různé testy ;pro měření APP. První označený APP-&/FL rozeznává obě fonny APP APP-alfa. («) a APP plné délky (FL). Druhý test se specifikoval pro APP-ot, Test APPrt/FL rozeznává vylučovastý APP zahrnujíei prvních 12 aminokyselin Αβ, Protože reportni protilátka (21-15) není specifická pro místo, α-ciíp, které se vyskytuje .mezí aminokyselinami 612 až
6.13 ÁPP695 (Esch et al,, Science 248, 1122--Í 124. (1090)), tento test také rozeznává ÁPP plné délky {ÁPP-FL}, PředclTOzf experimenty používají imohffixwané protilátky APP $ cytoplazmatíckým ocasem APP--FL, aby vyčerpaly mozkové homogenity ÁPP-FL, což naznačuje, že přibližně 30 až 40 % ΑΡΡ-α/FL APP-jeFL (data nejsou zobrazena), Reporini protilátka v případě obou testů ΑΡΡ-α/FL a APP---a je mAb SES, které -se vytvořily proti aminokyselinové 444 až 592
2.0 formy ÁPP695 (Garnes et al, Nátuře-373, 523 (1995)), Report?) í mAb v případě testu APP-a/FI, je mÁb 2H3, která jě specifická pro úmmokyseliny 597-608 ÁPP695 (dolmsott- Wood et al, Pros. Nati. Acad. Sci, USA 94, 1550-1555 (1997)) a reportni protilátkou v testu pro APP-rx je derivát-tttAb 16119, které vznikl vůči ammokyseliuám 605 až 611 peptidu APP. Nižší limit citlivosti testu APP-aFL je· přibližně 11 ag/ml (150 pM) (johnson-Wood et al., Proč, Nati Acad,
Sel USA 94, 1550-1555 í 1997» a limit culivosfi testu specifického pro APP-α je 22ngml (t\3 nM). V případě <;h>-u restů APP se mAb 8E5 potáhly na prohlubně destiček PIA s 96 prohlubněmi způsobem stejným, jako se popisuje shora v textu v případě rnÁb 266, Čiáténý rekombinantní vylučovaný APP-α se použil jako referenční standard v případě testu APP-α a testu AFP-a/FE (Esch et al., Science 248, 1122-1124. < 1990(). Vzorky homogenátu mozku v 5 M guanídinu se ředily v poměru CIO v ředícím pufru vhodném pro test EI-1SA (9,014 M íesforečnan-.ns puti pH7.4, 0.Ρ fwmm ver-oy albumin, 0,005% thimerosal, WS M NaCl 0.1% \P40) Vzorky se pak ředily v poměru 1:4 ve vzorkovém pufru, které obsahuje 0,5 ,M gnaníoin. Ředěné homogenity se pak eeutrifugovaly při 16 000.x g po dobít 15 vteřin při teplotě místnosti. Standardy APP a vzorky se pak přidaly na destičku ve dvotmásohnýeh alíkvotech a inktthovaly se po dobu 1,5 hodiny pří teplotě místnosti Reportnl protilátka 2H3 nebo 161-19 se ínkubovala se vzorky ρο dobu jedné hodiny při teplotě místností, Konjugát síreptavidin- alkalická Íosfaíáza (Boehrntger Mannheim) se ředily v poměru 1:1 000 ve vzorkovém pufru a inkubovaíy se v prohlubních po dobu jedné hodiny prí teplotě místnosti. Přidal se fluorescenční substrát 4-methv iumbeliferyifosforcčntus a mkufccval se po dobo 30 minut oři teplíte nudností a destičky se odečítaly ra íkrorimetrn (. ytoíluor' 2350 (Mdlipom) pří vlnové dclee 565 nm (excitace) a 450nm i emise).
7. imunoh istočhemie
Mozky se fixovaly po dobu tři dní při <10 *C ve 4% paraformaldehydu v PES a pak se uchovávaly jeden až sedm dní při teplotě 4 °C v 1% parafěrmaldehydu v PBS až do přípravy sekci. Na zařízeni vibratofS se nařezaly koronárn? sekce o tloušťce 4b mikronů při teplotě misínosfi a uchovávaly se s ochmnnern činidle pro hluboké /mazem 130 % glycerol. <0 % ethylenglykol v íusíorečnanosém pufru) při teplotě -20 °C a pak se provedlo imunohistochemické zpracováni. V případě každého mozku se připravilo sesí sekci na úrovni dorzáloího híppocampusu, každý se síí separoval intervaly 240 pm, které se ínkuhovaly přes noc sjednou následující protilátkou; i i protilátka proti Afi (ntAb, 5136, specifické pro lidský Αβ) ředěné na koncentrací 2 pg/tnl v PBS a 1% horském seru nebo 2 i mAb specifické pro lidské ΛΡΡ 8E5 mučeno hioímetn ředěné na koncentraci 3 ug/ml v PES a .1% koňské sérum nebo 3) mAb specifické pro pliá.lni fibrílánu kyselý protesn (Gf AP, Sigma Chemical Co.) ředěný 1:5 s 0,25% Triton X-100 a 1% horským sérem ve
CZ 304876 86 fyziolcgickém roztoku pnťrovaučm Tris p.H 7,4 (TBS) nebo -I) mAb specifické pro CD i lb, antígcn MAC-l (Chemicon Interuafional) ředěné 1:100 sO.25% Triton X-TOO a 1% kráběím sérem v IBS nebo 5) mAb speeifické pro antigen MHC O (Fharnnngen) ředěné v poměru 1:160 sO,25% Triton X--100 a 1% králičím séru v TBS nebe fi) krys! mAb specifické pro CD43 tPhatmíngen) ředěné 1:100 1% králičím sérem v PBS nebo 7} krysí mAb specifické pro CD 45RA íPhamnngen) ředěný .1:100 s l % králičím sérem v PBS nebo 8) krysí monoklonálm' Αβ '.peesfické pro CD 45ŘB (Fharmingen) ředěné 1:100 s 1% králičím sérem v PBS nebo 9) krysí monoktonální protilátky proti Αβ specifické pro CĎG íPImrmitígenJ ředěné 1:160 1% králičím pérem v PBS nebo 10) polyklosálm křeěčí protilátky proti Αβ specifické pro CD3e (Pbarmmgen) ředěné 1:100 s 1% králičím sérem v PBS nebo 11) krysí monoklonální protilátky specifické pro CD4 (Seroíecl ředěné v poměru 1:206 s 1% krabě «η sérem v PBS nebo s 12} roztok PBS,, který neobsahuje primární protilátku obsahující i % normální koňské sérum.
Sekce, které reagovaly s roztoky protilátek popsanými v paragrafech 1, 2 a 6 až· 12 shora v textu se předem ošetřily I % Tritonem X-100, 0,4% peroxidem vodíku v PBS po dobu 26 minut při teplotě místnosti, aby se zabiokovato endogenní peroxidáza. Dále se inkubovaly pres noc při teplotě 4 ®C $ primární protilátkou, Sekce, které reagovaly s mormkkmálmnu protuatka mi 3ΓΜ nebo SES nebí CD3e pak reagovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti $ komplexem, který· zahrnuje křenovou peroxidázu-avidin-biotits, š komponenty kim ,Α“ a ,-B~ ředěném v poměru .1 : 75 v PBS (Vectof Elitě Standard Kit, Veetor Labs, Burimg&me, CA), Sekce, ktere reagovaly s protilátkami specifickými pro CD 4SRA, CD 45RB, ČB45, C.D3, a roztok PBS se mkubovaly po dobu jedné hodiny pri teplotě místnosti s ants-krysún IgG značeným btotinem t Veetor) ředěným 1:75 v PBS nebo s anti-myšini IgG {Veetor i značeným h« «línem a ředěným 1:75 v PBS, Sekce pak reagovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti s komplexem křenová pgroxidáza-avídm-bíotln s komponenty kitu „A“ a „B“ ředěnými v poměru 1:75 v PBS (Veetor Bilte Standard Kit, veetor Labs, Barfmgame, CA),
Sekce se vyvíjely v9.01% peroxidu vodíku, 0,05 % 3,'T-diamínobenzídmu ÍDAB) při teplotě místnosti. Sekce určené pro inkubaci s protilátkami specifickými pro GFAF, MAC-I-AND MHC 11 se předem ošetřily s 0.6% peroxidem vodíku při teplotě místnosti, aby se blokovala endogenní peroxídáza, a pak se inkubovaly přes noc s primární protilátkou při teplotě 4 °C. Sekce, které reagovaly s protilátkou GFAF. se Inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti s anti -myší protilátkou připravenou imunizaci koně ředěné v poměre 1:260 sTBS. Sekce dále reagovaly po dobu jedné hodiny s komplexem avidin-biotiu-pcrosddáza (Veetor Laboratories, Vcctastain Bdíte ABC kit) ředěným LI 600 sTBS. Sckee, které se Inkubovah s monuklonalnt protílátkoti specifickou pro MAC···! nebo MHC1I jako s primární protilátkou následné reagovaly po dobu jedné hodiny př: teplotě místnosti s antí-krysim IgG značeným bioťmet» připraveným v králíkovi ředěným v poměru .1:200 sTBS, pak následuje inkubace po dobu jedné hodiny s komplexem avídin-biotin-jreroxídasa ředěném 1:1 000 sTBS. Sekce se inkubovaly s protilátkami specifickými pro GFÁP, 'MAC-1 a MHC Ha pak se vizualízovuly léčbou při teplotě místnosti s 0,0.5% DAB, 0,01% peroxidem vodíku, 0,04% chloridem nikeinatým, TBS po dobu 4 a 1 i minut.
imunologicky· značené sekce se nanesly na skleněná sklíčka (VWR, sklíčka SuperirostT vzdochem sušená přes noc, namočené v roztoku Fropar tAnatedri a překryta krycími sklíěks za použití média Permouní (Fisher),
Za účelem stanoveni poctu piaků Αβ obarvením podsada GFAP pozitivních sekcí se nanesla na skiicka Stsperfrost a inkubovaly se ve vodném 1 % Thoílavinu S (Sigma) po dobu 7 minut a pak následovalo imunohistochemické zpracování. Sekce se pak dehydratovaly a čistily v roztoku Propar, pak se přidáte médium Permount a přikryly krycími sklíčky.
- 73 CZ 304876 Bii
8. Zobrazovací analýza
Videmnetrícký systém zobrazovací analýzy i 50' (Oncor, Inc,, Gaithersbnrg, MD) spojený $ Nikon MicrophoMFX přes CCD videokameru a monitor Sony Trinitron se použil pro kvantlfis kácí imunoreaktivních sklíček. Zobrazeni sekce se uchovávalo v pufru vhodném pro video & stenpvtlo se prahové-zabarvení a práh saturace, aby se vybral o vypočítal celková plocha. pixetó pokrytých imunologicky značenou strtskíuron, V případě každé sekce \e manneiná načrtl hi~ ppovampus a vypočítala se celková plochá obsažená pixcly. Procentické zastoupeni aruyloidntho uzle se měřilo jako {frakce hjppoeampálm oblasti, která obsahuje usazeniny Αβ imunereaktívrti te s monoklonáhu protilátkou 3D6) x HM). Podobně proeeníové zastoupení nenntického uzle se měřilo jako (trakce hippocampální oblasti, která ohsatmjé dysirofické neurity reaktivní smono» klonálm protilátkou SES) x 100, Systém C-lmaging (Compíx, lne., Crauherry Townshíp, PA) operující a programem. Simple· 32 Software Application jě spojen, s mikroskopem Nikon
Mícrophot-FX prastřednictvim kamery Opmmiesa použil se prš kvantifikaci procenta reírospi.15 náinřho kortexn obsazeném GFAF--pozltivm&m astrOeyty a MAC-Í a. MHC 'H-pozátiynimi mikroglii. Zobrazení itmnoreakíivm sekce se uchovávalo v pufru vhodném pro video a stanovil se práh založený na monochromu, aby se vybral a vypočítáte plocha celkového počtu pixelu obsazených imunologicky značenými buňkami, V případě každé sekce se manuálně načrtl refrospiuáluí knrtex íRSC) a vypočítala se celková plocha pisciú obsazená RSC, Procentické zastoupeni astrocyru se definovalo jako: (frakve FSC obsazená GFÁP-reaktívnůrti nstrocyti) x 100. Podob· ně nfieroglióza vyjádřená s procentech se uefiuwaia jako: (frakce R.8C obsazená MAC-1 nebo MH€ Ih-reaktivuimi míkrogl») < H)U, V případě analýzy zobrazení se v připadá každého zvířete kvantitativně hodnotilo šest sekci na úrovni. íforzálnlho hippoesmpusu, kdy každá je oddělena intervalem 24 pro. V každém případě osoba, která hodnotila sekce, neznala status léčby zvířat,
Z předchozích informaci je zřejmé, že vynález popisuje řsdu použiti. Například vynález popisuje použiti libovolných protilátek proti Αβ popsaných shora v textu při léčbě, profylaxí nebo diagnostice amyloidogemtiho onemocněni nebo při výrobě léku nebo diagnostického prostředku. Podobně vynález popisuje použiti libovolných epítopickych fragmentů Αβ popsaných shora v textu vhodných pro léčbu nebo profylaxí smyloidního onemocnění nebo pří výrobě léku pro použiti stejným způsobem.
Claims (20)
Hide Dependent
translated from
Claims (20)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÍ NÁROKY5 1» Fragment Αβ vázaný knosičovénm peptidů pro použiti k vyvoláni imunitní odpovědi protiΑβ, a tím pro prevenci nebo léčení onemoenění spojeného s amyloidníml deposity Αβ v mozku pacienta, přičemž fragment Αβ sestává zi) Αβ.1-7 majícího aminokyselinovou sekvenci DAEFRE1D, u) Αβ3~7 májkům .«nínokyselmovousekvencí EPRTID, nebo w iii) mnitimérn i) nebo 11),
- 2, Fragment Αβ vázaný k.nosičovémn peptidu. podle nároku 1, kde fragment Αβ sestává z ΑβΙ~7ηο6οΑβ
- 3--7,15 3,. Fragment Αβ vázaný k nosičovémn peptidu podle nároku l nebe 2, kde k fragmentu Αβ je přidaný eysteínnvý zbytek,
- 4. Fragment Αβ vázaný k nosičovému peptidu podlé nároků 1 až 3, kde nosičovy peptid je připojený k C-kenes fragmentu Αβ.to
- 5. Fragment Αβ vázaný k nosicovému peptidu podle některého z nároků I až 3, kde nosičovy peptid je vázaný k N-konci fragmentu Αβ.K Fragment kp suzany k nosičovému pcptsdn podle některého z.nároků 1 az 3, kde nosičovy25 peptid je peptid sterý zvyšme transport přes tkanivo.
- 7, Fragment Αβ vázaný k nosíčověmu peptidu podle některého z nároků 1 až. d, kde nosičovy peptid zvyšuje imunitní odpověď proti ΑβΙ-7 nebo Αβ3-7.30
- 8, Fragment. Αβ vázaný k nosíčověmu peptidu podle nároku 7, kde nosičovy peptid je:sérový albumin, hemoeynanin nrropkovýeh plžů; molekula imunoglobul inu; tyroglobulin;35 ovalbumim.toxoid z patogenní bakterie; univerzální epitop T-huhky; cytokin; nebo chesriokin.
- 9« Fragment Αβ vázaný k aosičovémn peptidu podle nároku 8, kde nosičovy peptid je tetanový toxoid, toxoid diptcrie, A, co/i toxoid, cholerový nebo 77 pyktri toxoid nebo utlumený derivát, toxoído,45 i& Fragment Αβ vázaný k nosičevémn peptidu podle nároku 9, kde nosičový peptid zahrmýe univerzální epitop T-buňky, který je; bemaglntinln inřlnenzue; HAÍU:„^ (PKWKQNTLKLA.T);PADR.E {AKXV AAWTLKAA Ak malárie (?$: epitop T3 (EKK1AKMEK.ÁSSVFNV);50 povrchový antigen hepatitidy B: HBsÁgjy.3$ (FFELTRILTI);-66CZ 304876 Βδ protein tepelného Šoku 65: bsp6S^..m (ÍXŽSIGDUAEAMÍIKVGNEG);tetímový toxolá: TWw (QYíKANSKFIGrrEL);tetanový toxotů: TT^7 (WNFTYSFWtRVf KYSASIM); nete HÍV gpl20 'Π: (KQHNMWQEVGKAMAYF
- 11. Fragment Αβ vázaný k nbsiěovétny peptidu podle některého z nároků i až 10, kde fragment Αβ je vázaný k nosičovému peptidu -chemickou vazbou.
- 12. f m^Ttení Αβ vázaný k nosičovému peptidu podle některého z nároků 1 až 10, kde fragment Λβ je exprimovaný jako fúzní protein: s nosičovým peptidem.B. farmaceutický prostředek, vyznávající »< tím, že obsahme fragment Αβ vázaný k nosičovému peptidu podle některého z nároků 1 až 12 a jedno nebo vsce iamtaeentíeky přijatelných složek,
- 14. Farmaceutický prostředek podle nároku 1.3,. vyznněnjíes se tím» že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič,,
- 15» Fxroweutteký prostředek podle nároku 13 nebo: 14, vyznaěújící se tí m , že obsahuje fannaeeutíeky přijatelné adjuvans.
- 16. Farotaceutieký prostředekpodle nároku 15, vyznačující se tím, že adjuvans je pro podání současně s fragmentem Αβ vázaným k nosičovému peptidu.
- 17. Farmaceutický prostředek podle nároku .16, vyzeaé-aj-íeí se- tím, že fragment Αβ vázaný k nosičovému peptidu je spojený s adjuvans,
- 18. Farmaceuticky prostředek podle nároku 1.7, vyznačuj íeí s-e tím, že adjuvans je pro podání před nebo po fragmentu Αβ vázanému k nosičovému peptidu,
- 19. Farmaceut ický prostředek pod te n ěkterého z nároků 13 až I'8, v y z a a ě u j i c í s e t i m, že fragment Αβ vázaný k nosičovému peptidu je představovaný virem nebo bakterii,
- 20. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 13 až 19. * y a a a č n j I «· í se tím, že je přizpůsobený pro poskytnuti dávky fragmentu Αβ vázaného k peptidovémn nosiči v nmož* ství větším než i 0 mikrogramů,
- 21. Použiti fragmentu Αβ vázaného k nosičovému peptidu podle některého z nároků I až 12 pro výrobu léčiva pro vyvoláni imunitní odpovědi proti Αβ atim na prevenci nebo léčeni onemocnění spojeného s amyloidnítni depozity Αβ v mozku pacienta,
- 22. Fragment Αβ vázaný k nosičovému pepíjda podle některého z nároků 1 až 12 nebo použití podle nárok u 21. kde onemocněním je Aizhefrneroro choroba.
- 23. Fragment Αβ vázaný k nosičovému peptidu nebo použití podle nároku 22, kde pacient je: ssymptomalický: a/nebo má vrozené rizikové faktory indikující náchylnost na Ateheimerovu chorobu; noho nemá známé rizikově faktory pro Alzheimerovn chorobu.