SK288207B6 - Spôsob na určenie prognózy pacienta podrobujúceho sa liečbe Alzheimerovej choroby - Google Patents

Abstract

Opisuje sa spôsob na určenie prognózy pacienta podrobujúceho sa liečbe Alzheimerovej choroby zahŕňajúci meranie množstva pacientovej sérovej imunoreaktivity proti Aß peptidu, pričom množstvo pacientovej sérovej imunoreaktivity najmenej štyrikrát väčšie ako kontrolná bazálna hodnota indikuje prognózu zlepšenia vzhľadom na uvedenú Alzheimerovu chorobu.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu na určenie prognózy pacienta podrobujúceho sa liečbe Alzheimerovej choroby.

Doterajší stav techniky

Amyloidóza je všeobecný termín, ktorý zahŕňa množstvo chorôb, ktoré sú charakterizované extracelulárnym ukladaním proteínových vlákien, ktoré tvoria početné amyloidné plaky, ktoré sa môžu objaviť lokálne alebo systemicky. Vláknitá stavba týchto plakov je pre rôzne formy amyloidných ochorení určujúcou charakteristikou. Napríklad intracerebrálne a cerebrovaskuláme plaky zložené prevažne z vlákien β-amyloidného peptidu (β-ΑΡ) sú charakteristikou Alzheimerovej choroby (ako familiálna, tak občasná forma), vlákna ostrovčekového amyloidného polypeptidového proteínu (IAPP amylín) sú charakteristické pre plaky v bunkách pankreatických ostrovčekov spojených s diabetes typu II a β ₂-mikroglobulín je hlavnou zložkou amyloidných plakov, ktoré sa tvoria v dôsledku dlhodobej liečby hemodialýzou. Nedávno boli ako amyloidné ochorenia uznané tiež choroby spojené s priónmi, napríklad Creutzfeld-Jacobova choroba.

Jednotlivé formy choroby sa delia do skupín, väčšinou na základe toho, či amyloidóza je alebo nie je spojená so systemickým ochorením. To znamená, že za primárne sa považujú amyloidózy, u ktorých nie je dôkaz o predchádzajúcej alebo spoluexistujúcej chorobe. Vo všeobecnosti sú primáme amyloidózy charakteristické prítomnosťou proteínových vlákien typu AL (amyloidné ľahké reťazce), takto pomenovaných kvôli homológii

N-koncovej oblasti AL vlákna s variabilným úsekom ľahkého reťazca imunoglobulínu (kappa alebo lambda).

Sekundárna alebo reaktívna amyloidóza je charakterizovaná ukladaním vlákien AA typu odvodených od sérového amyloidného A-proteínu (ApoSSA). Tieto formy amyloidózy sú charakterizované predchádzajúcim výskytom chronického zápalového alebo infekčného stavu (napríklad reumatická artritída, osteomyelitída, tuberkulóza, lepra).

Heredofamiliálne amyloidózy môžu byť sprevádzané neuropatickými, obličkovými alebo kardiovaskulárnymi plakmi ATTR transtyretinového typu. Iné heredofamiliálne amyloidózy zahŕňajú iné syndrómy a môžu mať odlišné amyloidné zložky (napríklad familiálna stredozemná horúčka, ktorá je charakteristická AA vláknami). Iné formy amyloidózy zahŕňajú lokálne formy, ktoré sú charakteristické ohniskovými ložiskami a často usadeninami rakovinového typu, ktoré sa objavujú v izolovaných génoch. Iné amyloidózy sú spojené so starnutím a sú vo všeobecnosti charakterizované tvorbou plakov v srdci a mozgu. Časté sú tiež amyloidné plaky spojené s dlhotrvajúcou hemodialýzou. Tieto a iné formy amyloidných ochorení sú zhrnuté v tabuľke 1. (Tan, S. Y. and Pepys, Histopathology 25: 403 - 414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicíne, 13^th Ed. Isselbalcher, K. J., a kol., eds., McGraw-Hill, San Francisco, 1995).

Často sa stáva, že vlákna tvoriace amyloidný plak sú odvodené z viacerých prekurzorových proteínov a sú obvykle spojené so sulfátovými glykozaminoglykánmi. Amyloidné plaky môžu obsahovať aj minoritné proteíny a peptidy rôznych typov, spolu s inými zložkami, napríklad s proteoglykánmi, gangliozidmi a inými cukrami, čo je podrobnejšie opísané v nasledujúcej časti.

V súčasnosti neexistujú špecifické spôsoby liečby pre žiadne z amyloidných ochorení. V prípadoch, kde sa súčasne vyskytuje aj sprievodné ochorenie, sa zníženie tvorby amyloidného proteínu dosahuje pomocou liečby sprievodného ochorenia. Typickým príkladom môže byť liečba tuberkulózy antibiotikami, čím sa znižuje množstvo mykobaktérií, čo vedie k zmenšeniu zápalu, a tým k zníženiu hladiny SSA proteínu. V prípade AL amyloidu spôsobeného mnohonásobným výskytom myelómu vedie chemoterapia k zníženiu množstva plazmatických buniek, a tým aj k zníženiu hladiny myelómových imunoglobulínov. S poklesom ich hladiny môže zmiznúť aj AL amyloid.

Tabuľka 1

Klasifikácia amyloidných ochorení

Amyloidný proteín/peptid

AA

Proteínový prekurzor Varianty proteínu Klinické prejavy

Sérový amyloidný A proteín (ApoSSA)

Reaktívne (sekundárne) amyloidózy:

Familiálna Stredozemná horúčka Familiálna amyloidná nefropatia so žihľavkou a hluchotou (Muckle-Wellsov syndróm

SK 288207 Β6

AA Sérový amyloidný

A proteín (ApoSSA)

AL ľahké reťazce (kappa, lambda) monoklonálneho imunoglobulínu

AH	IgG (i (γΐ)
ATTR	transtyretín (TTR)
ATTR	transtyretín (TTR)
ATTR	transtyretín (TTR)
Aapol	ApoAI
Agel	gelsolín
Acys	cystatín C
Αβ	β-amyloidný prekurzorový proteín (napríklad β-ΑΡΡ695)
Αβ2Μ	β2-ιηί1αΌβ1ο1ηι1ίη
Acal	(Pro)kalcitonín
AANF	artriálny natriuretický faktor
Αβ	β-amyloidný prekurzorový proteín

	reaktívna systemická amyloidóza spojená so systemickými zápalovými chorobami idiopatická (primárna) amyloidóza spojená s myelómom alebo s makroglobulinémiou; systemická amyloidóza spojená s imunocytmi., dyskrazia., monoklonálna gamopatia., skrytá dyskrazia., lokálna moduláma amyloidóza spojená s chronickými zápalovými chorobami
Αγί	amyloidóza ťažkého reťazca spojená s niekoľkými dyskraziami imunocytov
najmenej 30 známych	familiálna amyloidná polyne-
bodových mutácií	uropatia (napríklad Met 30, portugalská)
napríklad Met 111	familiálna amyloidná kardiomyopatia (dánska)
divoký typ TTR	systemická senilná amyloi-
alebo íle 122	dóza
Arg 26	familiálna amyloidná polyneuroparia
Arg 187	familiálna amyloidóza (fínska)
Gin 68	dedičná cerebrálna hemoragia s amyloidózou (islandská)
rôzne: Gin 618	Alzheimerova choroba Downov syndróm dedičná cerebrálna herorágna amyloidóza (holandská) občasná cerebrálna amyloidná angiopatia zápalová myozitida spojený s chronickou hemodialýzou
(Pro) kalcitonín	medulámy karcinóm štítnej žľazy ohniskové senilné amyloidózy; izolovaný artriálny amyloid mozog

SVEPa Αβ2Μ	β2-ηπ1<κ^1ο1)υ1ίη	semenné vačky prostata
Keratín			primáme lokalizovaný kožný amyloid (makulámy, papulámy)
PrP	priónový prekurzorový protein (33 až 35 kDa bunková forma)	protein klusavky (27 až 30 kDa)	občasná Creutzfeld-Jacobova choroba Kuru (prenosná spongiformná encefalopatía; priónové choroby
AIAPP	ostrovčekový amyloidný peptid (IAPP)	poly-	Langerhansove ostrovčeky diabetes typu II inzulínom
peptidové hormóny, fragmenty	napríklad prekalcitonín		exokrinná amyloidóza spojená s APUDomas

^aSeminálny vačkový protein

Prihlášky patentov US, USSN 09/201 430, podaný 30. novembra 1998, a USSN 09/322 289, podaný 28. mája 1999, odhaľujú, že zaťaženie amyloidným plakom spojené s Alzheimerovou chorobou môže byť výrazne znížené (a môže sa mu predísť) podávaním látok, ktoré vyvolávajú imunitnú odpoveď zameranú na β-amyloidný peptid (Αβ) a jeho fragmenty. Objavom predkladaného vynálezu je to, že indukcia imunitnej odpovede pre rôzne zložky amyloidných plakov je účinná pri liečbe širokého rozsahu amyloidných chorôb.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je zameraný na spôsob na určenie prognózy pacienta podrobujúceho sa liečbe Alzheimerovej choroby, zahŕňajúci meranie množstva imunoreaktivity proti Αβ peptidu vo vzorke séra pacienta, ktorý sa vyznačuje tým, že množstvo pacientovej sérovej imunoreaktivity najmenej štyrikrát väčšie ako kontrolná bazálna hodnota indikuje prognózu zlepšenia vzhľadom na uvedenú Alzheimerovu chorobu.

V predkladanom spôsobe pacientove množstvo sérovej imunoreaktivity proti Αβ je charakterizované sérovým titrom najmenej 1 : 1000 a výhodnejšie 1 : 5000.

V spôsobe podľa vynálezu je pacient symptomatický na Alzheimerovu chorobu, pričom liečba je terapeutická a pacient je symptomatický na Alzheimerovu chorobu.

V spôsobe podľa vynálezu je pacient asymptomatický na Alzheimerovu chorobu, pričom liečba je profylaktická a pacient je asymptomatický na Alzheimerovu chorobu.

V spôsobe podľa vynálezu kontrolná bazálna hodnota sérovej imunoreaktivity je pacientovou bazálnou hodnotou imunoreaktivity proti Αβ peptidu pred podrobením sa liečbe, pričom kontrolná bazálna hodnota sérovej imunoreaktivity sa určí z kontrolnej populácie, ktorej členovia sa nepodrobili predchádzajúcej liečbe.

V spôsobe podľa vynálezu je liečba aktívna imunizácia s Αβ peptidom alebo pasívna imunizácia s anti-Αβ-protilátkou.

Sú tiež opísané farmaceutické prostriedky a spôsoby na liečbu množstva amyloidných ochorení, ktoré ako účinnú zložku obsahujú látku, ktorá je schopná vyvolať imunitnú odpoveď proti amyloidnej zložke v pacientovi. V takýchto prostriedkoch sa budú spravidla nachádzať tiež pomocné látky a v navrhovanom uskutočnení môžu obsahovať adjuvanty. V ďalej navrhovaných uskutočneniach zahŕňajú adjuvans napríklad hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, MPL™, QS-21 (Stimulon™) alebo Freundov nekompletný adjuvans. V navrhovanom uskutočnení môžu takéto farmaceutické prostriedky obsahovať množstvo látok schopných vyvolať v pacientovi imunitnú odpoveď proti viac ako jednej amyloidnej zložke.

V opisovanom uskutočnení je látka schopná vyvolať imunitnú odpoveď zameranú proti vláknitej peptidovej alebo proteínovej amyloidnej zložke. Takýto vláknitý peptid alebo protein je pokiaľ možno odvodený od vláknitého prekurzorového proteínu, o ktorom je známe, že je spojený s určitými formami amyloidných ochorení, ako je tu opísané. Takéto prekurzorové proteíny zahŕňajú, okrem iných, tiež sérový amyloidný proteín A (ApoSSA), ľahký reťazec imunoglobulínu, ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrinogénu, gelsolín, cystatín C, β amyloidný prekurzorový protein (β-ΑΡΡ), β₂-πιΐ1αΌΐοΐΜΐίη, priónový prekurzorový protein (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratín, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový protein), peptidové hormóny a synukleín. Tieto prekurzory zahŕňajú tiež mutantné proteíny, fragmenty a peptidy vzniknuté po proteolýze týchto prekurzorov. V opisovanom uskutočnení je látka schop4

SK 288207 Β6 ná vyvolať imunitnú odpoveď zameranú proti neoepitopu tvorenému vláknitým proteínom alebo peptidom, a to vzhľadom na vláknitý prekurzorový proteín. To znamená, že veľa peptidov alebo proteínov tvoriacich vlákna sú fragmenty týchto prekurzorových proteínov, napríklad tých, ktoré sú uvedené. Pri tvorbe týchto fragmentov, napríklad proteolytickým štepením, môžu byť odhalené epitopy, ktoré na prekurzorovej molekule neboli, z čoho vyplýva, že pokiaľ je fragment časťou prekurzorového proteínu, nie je prístupný imunitnému systému. Látkami zameranými na takéto epitopy môžu byť opisované terapeutické látky, pretože je menej pravdepodobné, že u pacienta vyvolajú autoimunitnú odpoveď.

Opísané farmaceutické prostriedky obsahujú látky zamerané na amyloidné zložky, medzi ktoré patria nielen nasledujúce vláknité peptidy alebo proteíny: AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, A β₂Μ, Ascr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC. Opísané sú celé názvy a zloženie týchto peptidov. V odbore sú dobre známe aj spôsoby prípravy takýchto peptidov, čo je opísané.

V ďalej opisovanom uskutočnení zahŕňajú látky, ktoré sa nachádzajú v takomto farmaceutickom prostriedku, tiež určité sulfatované proteoglykány. V opisovanom uskutočnení je proteoglykán heparín sulfát glykozaminoglykán, najlepšie perlecan, dermatan sulfát, chondroitín-4-sulfát alebo pentozan poly sulfát.

V súlade s ďalším opisovaným hľadiskom zahŕňa vynález spôsob prevencie alebo liečby poruchy charakterizovanej amyloidným plakom u cicavčieho subjektu. V súlade s touto časťou vynálezu sa subjektu podáva účinná látka v dávke schopnej vyvolať imunitnú odpoveď proti amyloidnej zložke charakteristickej pre amyloidnú poruchu, ktorou subjekt trpí. Spôsoby v podstate zahŕňajú podávanie farmaceutických prostriedkov s obsahom imunogénnej amyloidnej zložky (pozri vyššie), špecifickej pre konkrétnu poruchu. Takéto spôsoby sú ďalej charakterizované svojou účinnosťou vo vyvolaní imunogénnej odpovede u subjektu. Podľa predloženého uskutočnenia je spôsob účinný vo vyvolaní imunologickej odpovede, ktorá je charakterizovaná sérovým titrom najmenej 1 : 1000 (podľa amyloidnej zložky, na ktorú je imunogénna látka zameraná). Podľa ďalej opisovaného uskutočnenia je, v závislosti na vláknitej zložke, sérový titer najmenej 1 5000. Podľa opisovaného uskutočnenia je imunitná odpoveď charakterizovaná množstvom sérovej imunoreaktivity, ktorá zodpovedá viac ako štvornásobnej hladine sérovej imunoreaktivity nameranej v kontrolnej vzorke séra pred začiatkom liečby. Naposledy uvedená charakteristika je vhodná najmä v prípade, keď je sérová imunoreaktivita meraná technikou ELISA, pričom sa ale môže použiť na akékoľvek relatívne alebo absolútne meranie sérovej imunoreaktivity. Podľa predloženého uskutočnenia sa imunoreaktivita meria v sére riedenom 1 : 100.

Podľa ďalej opisovaného hľadiska zahŕňa vynález spôsob na určenie prognózy u pacienta, ktorý sa podrobuje liečbe amyloidnej poruchy. V tomto prípade sa u pacienta meria množstvo sérovej imunoreaktivity proti amyloidnej zložke charakteristickej pre konkrétnu poruchu, pričom množstvo sérovej imunoreaktivity najmenej štyrikrát väčšie ako kontrolná bazálna hodnota indikuje prognózu zlepšenia (podľa konkrétnej amyloidnej poruchy). Podľa predložených uskutočnení je množstvo imunoreaktivity proti vybranej amyloidnej zložke, prítomnej v pacientovom sére charakteristickej sérovým titrom najmenej okolo 1 : 1000 alebo najmenej 1 : 5000 (podľa amyloidnej zložky).

Podľa opisovaného hľadiska zahŕňa vynález tiež tzv. pasívnu imunizáciu, t. j. spôsoby a farmaceutické prostriedky na prevenciu alebo liečbu amyloidných ochorení. Podľa tohto hľadiska vynálezu sa pacientom podáva účinné množstvo protilátky, ktorá sa špecificky viaže na vybranú amyloidnú zložku, prednostne však na vláknitú časť prítomnú v amyloidných plakoch charakteristických pre liečenú chorobu. Tieto protilátky sa vyberajú kvôli ich schopnosti špecificky sa viazať na rôzne proteíny, peptidy a zložky opisované v súvislosti s farmaceutickými prostriedkami a spôsobmi opísanými v predchádzajúcich odsekoch tejto časti. Podľa opisovaného uskutočnenia môžu takéto spôsoby a prostriedky obsahovať kombinácie protilátok, ktoré viažu najmenej dve amyloidné vláknité zložky. Vo všeobecnosti sú tieto farmaceutické prostriedky podávané na zvýšenie množstva sérovej imunoreaktivity proti cieľovej amyloidnej zložke, pričom toto zvýšenie je v porovnaní so sérovým množstvom imunoreaktivity v kontrolnej vzorke séra najmenej štvornásobné. Protilátky sa môžu tiež aplikovať s nosičom, čo je tu opísané. Vo všeobecnosti sú takéto protilátky v súlade s týmto vynálezom podávané (alebo pripravované na podanie) peritoneálne, orálnou cestou, intranazálne, subkutánne, intramuskuláme, lokálne alebo intravenózne, pričom však môžu byť podávané (alebo pripravované na podanie) akoukoľvek farmaceutický účinnou cestou (t. j. schopnou zabezpečiť zadané terapeutické hladiny, ktoré sú určené vyššie).

Podľa opisovaného uskutočnenia môžu byť pacientovi terapeutické protilátky aplikované podaním polynukleotidu, ktorý kóduje najmenej jeden reťazec protilátky. V súlade s týmto hľadiskom vynálezu je v pacientovi polynukleotid exprimovaný s výsledkom, ktorý predstavuje vznik reťazca protilátky v účinnom množstve. Takýto polynukleotid môže kódovať ťažký a ľahký reťazec alebo reťazce protilátky, a tým umožniť ich expresiu v pacientovi.

Podľa predložených uskutočnení môžu opísané imunizačné režimy zahŕňať viacnásobné .podávanie látok, ktoré zahŕňajú protilátky. Podania sa takto môžu opakovať napríklad počas šesťmesačného obdobia s tým, že počiatočná imunizácia je v časových intervaloch (napríklad 6 týždňov) nasledovaná posilňovacími injekciami, čo je v odbore dobre známy spôsob, pričom časové intervaly sa môžu upraviť podľa pacientovej potreby (kritériom je dosiahnutá imunologická odpoveď). Alternatívnou alebo aj doplnkovou cestou môžu byť reži5 my, ktoré zahŕňajú použitie prostriedkov s postupným uvoľňovaním účinnej látky, čo je v odbore známy spôsob. Tieto a ostatné predmety a znaky vynálezu budú viac zrejmé, ak sa bude čítať aj detailný opis vynálezu v spojení so sprievodnými výkresmi.

A. Definície

Pokiaľ nie je uvedené inak, majú byť všetky použité termíny chápané tak, ako by im rozumel odborník kvalifikovaný v odbore predkladaného vynálezu. Odborníci sú pre definície, termíny a štandardné spôsoby v odbore biochémie a molekulárnej biológie odkazovaní najmä na Sambrook, a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. a Ausubel, F. M., a kol. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y. Je zrejmé, že tento vynález nie je obmedzený konkrétnou metodológiou, protokolmi a opisovanými reakčnými činidlami, keďže sa môžu na dosiahnutie rovnakého výsledku rôzne meniť.

Termín adjuvans opisuje látku, ktorá pri podaní v spojení s antigénom zvyšuje imunitnú odpoveď proti antigénu, ak je však podaná samotná, tak žiadnu imunitnú odpoveď proti antigénu nevytvára. Adjuvanty môžu zosilňovať imunitnú odpoveď spôsobmi, medzi ktoré patrí posilnenie tvorby leukocytov, stimulácia B- alebo

T-buniek (alebo obidvoch súčasne) a stimulácia makrofágov.

Amyloidnou chorobou alebo amyloidózou sa myslí množstvo porúch, ktoré ako symptóm alebo ako časť svojej patológie majú hromadenie alebo tvorbu amyloidných plakov.

Amyloidný plak je extraceluláma usadenina zložená hlavne z proteínových vlákien. Vo všeobecnosti sú vlákna tvorené jedným prevládajúcim proteínom alebo peptidom. Plaky však môžu byť zložené aj z ďalších peptidových alebo nepeptidových zložiek, čo je tu opísané.

Amyloidnou zložkou je akákoľvek molekula, ktorá sa nachádza v amyloidnom plaku s obsahom antigénnej časti takejto molekuly. Amyloidné zložky zahŕňajú okrem iného proteíny, peptidy, proteoglykány a uhľovodíky. Špecifickou amyloidnou zložkou je myslená molekula, ktorá sa nachádza najmä alebo len v určitom amyloidnom plaku.

Činidlo je chemická molekula syntetického alebo biologického pôvodu. V kontexte predkladaného vynálezu je činidlo najmä molekula, ktorá sa môže použiť vo farmaceutickom prostriedku.

Protiamyloidné činidlo je činidlo, ktoré je u stavovcov v prípade podania technikami pasívnej alebo aktívnej imunizácie schopné vytvárať imunitnú odpoveď proti zložke amyloidného plaku.

Termínom polynukleotid a nukleová kyselina, ktoré sa tu striedavo používajú, sa myslí polymerická molekula s kostrou nesúcou bázy schopné viazať sa vodíkovými väzbami špecificky s inými polynukleotidmi, pričom polymerická kostra predkladá bázy spôsobom, ktorý umožňuje takéto sekvenčne špecifické vodíkové viazanie medzi polymerickou molekulou a komplementárnym polynukleotidom (napríklad jednoreťazcovou DNA). Tieto bázy sú typicky inozín, adenozín, guanozín, cytozín, uracyl a tymidín. Polymerické molekuly zahŕňajú dvoj- alebo jednovláknové RNA a DNA a ich modifikácie, napríklad tie s metylfosfonátovými väzbami.

Termín polypeptid sa používa pre látku tvorenú jedným reťazcom aminokyselinových zvyškov spojených peptidovou väzbou. Termín proteín môže byť synonymom pre termín polypeptid alebo môže opisovať komplex dvoch alebo viacerých polypeptidov.

Termín peptid opisuje tiež látku zloženú z aminokyselinových zvyškov spojených peptidovou väzbou. Vo všeobecnosti sú peptidy zložené zo 100 alebo menej aminokyselín, zatiaľ čo polypeptidy alebo proteíny obsahujú viac ako 100 aminokyselín. Tu používaný termín proteínový fragment môže byť chápaný s rovnakým významom ako peptid.

Vláknitý proteín alebo vláknitý peptid je monoméma alebo agregovaná forma proteínu alebo peptidu, ktoré tvoria vlákna vyskytujúce sa v amyloidných plakoch. Príklady takýchto proteínov a peptidov sú uvedené.

Farmaceutický prostriedok opisuje chemický alebo biologický prostriedok vhodný na podanie do cicavčieho organizmu. Takéto prostriedky sa môžu špecificky pripraviť na podanie jednou cestou alebo viacerými cestami, ktoré zahŕňajú okrem iného aj cestu orálnu, parenterálnu, intravenóznu, intraarteriálnu, subkutánnu, intranazálnu, sublinguálnu, intraspinálnu, intracerebroventrikulámu a pod.

Farmaceutická pomocná látka alebo farmaceutický prijateľná pomocná látka je nosič, obvykle kvapalina, v ktorej je podávané terapeuticky aktívne činidlo. Pomocná látka vo všeobecnosti nedodáva prostriedku žiadnu farmakologickú aktivitu, akokoľvek však môže zabezpečovať chemickú alebo biologickú stabilitu (alebo chemickú aj biologickú stabilitu zároveň) a ovplyvňovať uvoľňovanie aktívnej zložky a pod. Ukážkové prostriedky je možné nájsť napríklad v Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^thEd., Grennaro, A., Ed., 1995.

Glykoproteín je proteín, na ktorý je kovalentné naviazaný najmenej jeden uhľovodíkový reťazec (oligopolysacharid).

Proteoglykán je glykoproteín, v ktorom je najmenej jeden z uhľovodíkových reťazcov glykozaminoglykán, čo je dlhý lineárny polymér zložený z opakujúcich sa disacharidov, v ktorom jedným členom páruje obvykle cukrokyselina (kyselina urónová) a druhým je aminocukor.

Termíny imunologická alebo imunitná, alebo imunogénna odpoveď sa týkajú vzniku humorálnej (sprostredkovanej protilátkami) alebo bunkovej odpovede (sprostredkovanej antigénne špecifickými T-bunkami

SK 288207 Β6 alebo produktmi ich vylučovania), alebo obidvoch typov odpovede zároveň, zameranej proti antigénu v organizme jednotlivého cicavca. Takáto odpoveď môže byť aktívnou odpoveďou indukovanou podaním imunogénu alebo pasívnou odpoveďou indukovanou podaním protilátky alebo primárnych T-buniek. Bunková imunitná odpoveď je vyvolaná predkladaním polypeptidových epitopov v spojení s MHC komplexom triedy I a II s cieľom aktivácie antigénne špecifických CD4 T pomocných buniek alebo CD8 cytotoxických T-buniek (alebo obidvoch typov súčasne). Táto odpoveď môže zahŕňať tiež aktiváciu monocytov, makrofágov, NK buniek, bazofilov, dendritických buniek, astrocytov, mikroglie, eozinofilov alebo ďalších zložiek prirodzenej imunity. Prítomnosť bunkovej sprostredkovanej imunologickej odpovede sa môže určiť štandardnou analýzou proliferácie (CD4 T-bunky) alebo v odbore známymi CTL analýzami (cytotoxické T-lymfocyty). Relatívne príspevky humorálnej a bunkovej odpovede k ochrannému alebo liečebnému účinku imunogénu sa môžu rozlíšiť pomocou oddelenej izolácie frakcií imunoglobulínu (IgG) a T-buniek z imunizovaného syngénneho zvieraťa a meraním ochranného a liečebného účinku u druhého jedinca.

Imunogénne činidlo alebo imunogén alebo antigén je molekula, ktorá je po podaní pacientovi schopná indukovať imunologickú odpoveď proti sebe samotnej, a to buď v spojení, alebo aj bez prítomnosti adjuvantu. Takéto molekuly zahŕňajú napríklad amyloidné vláknité peptidy alebo ich fragmenty konjugované s nosným proteínom, ktorým môže byť hemocyanín z Diodora aspera, Cd3 alebo toxín tetánu.

Epitop alebo antigénna determinanta je časť antigénu, ktorá sa viaže k antigén viažucej časti protilátky.

Termíny Αβ, Αβ peptid a amyloidný β peptid sú synonymá a opisujú jednu alebo viacero peptidových zmesí zložených z 38 až 43 aminokyselín odvodených z β amyloidného prekurzorového proteinu (β-ΑΡΡ). Αβχχ opisuje amyloidný β peptid 1-xx, pričom xx znamená počet aminokyselín v peptide; napríklad Αβ42 je zhodný s Αβ1-42, ktorý je tu opisovaný tiež ako AN1792 a Αβ40 je zhodný s Αβ1-40, ktorý je opisovaný tiež ako ANI578.

Disagregovaný alebo monomémy Αβ znamená rozpustné, monoméme peptidové z Αβ. Jedným zo spôsobov prípravy monomémych Αβ je rozpustenie lyofilizovaného peptidu v čistom DMSO pomocou sonifikácie. Výsledný roztok sa s cieľom odstránenia všetkých nerozpustných častíc centrifuguje. Agregovaný Αβ je zmes oligomérov, v ktorých držia monoméme jednotky spolu nekovalentnými väzbami.

Termín holý polynukleotid znamená polynukleotid bez obsahu koloidných látok. Holé polynukleotidy sú niekedy klonované v plazmidivom vektore.

Termín pacient zahŕňa ľudský alebo cicavčí subjekt, ktorý prekonáva profylaktický alebo liečebný zásah.

Termíny významne odlišný od, štatisticky významný, významne vyšší (alebo nižší) ako a im podobné slovné spojenia opisujú porovnanie rôznych údajov, pričom rozdiely medzi dvomi porovnávanými jednotlivcami alebo skupinami sú školenému pozorovateľovi zjavné alebo dostatočne zrejmé, alebo tiež štatisticky významné (ak spojenie zahŕňa termín štatisticky, alebo keď je prítomný nejaký údaj zo štatistického testu ako napríklad p-hodnota, alebo keď sú údaje po analýze štandardnými štatistickými testami štatisticky rozdielne).

Prostriedky alebo spôsoby, ktoré obsahujú jednu alebo viacero z uvedených zložiek, môžu obsahovať aj iné zložky, ktoré nie sú samostatne uvedené. Napríklad prostriedok, ktorý zahŕňa vláknitú peptidovú zložku, zahŕňa ako peptid samotný, tak aj ako súčasť dlhšej polypeptidovej sekvencie. Zjednodušene sa to môže vyjadriť tak, že prostriedok, ktorý obsahuje zložku A a B, zahŕňa tiež zloženie vymedzené zložkami A, B a C.

B. Amyloidné ochorenia

1. Prehľad a patogenéza

Amyloidné ochorenia alebo amyloidózy zahŕňajú množstvo stavov so širokým spektrom vonkajších príznakov. Spoločným znakom týchto porúch je prítomnosť abnormálnych extracelulámych usadenín tvorených proteínovými vláknami a známymi ako amyloidné usadeniny alebo amyloidné plaky, ktoré majú priemer okolo 10 až 100 pm a sú lokalizované v určitých orgánoch alebo častiach tkaniva. Také plaky sú zložené najmä z prirodzene sa vyskytujúcich rozpustných peptidov alebo proteinov. Tieto plaky (ktoré sú nerozpustné) sú väčšinou zložené z laterálnych agregátov vlákien, ktorých priemer je približne 10 až 15 nm. Amyloidné vlákna tvoria po zafarbení farbou Congo Red v polarizovanom svetle charakteristický, jablkovozelený dvojlom. Tieto poruchy sú triedené podľa majoritnej vláknitej zložky, ktorá tvorí amyloidné usadeniny, čo je uvádzané ďalej.

Peptidy alebo proteiny tvoriace amyloidné plaky vznikajú často z prekurzorového proteinu. Tak je možné povedať, že patogenéza usadenín tvorených amyloidnými vláknami vo všeobecnosti zahŕňa proteolytické štepenie abnormálneho prekurzorového proteinu na jednotlivé fragmenty. Tieto fragmenty sa spravidla zoskupujú do antipararelných β-skladaných listov, avšak u niektorých nedegradovaných foriem prekurzorového proteinu sa zistilo zhlukovanie a tvorba vlákien (rôzne vlákna transtyretínu u familiálnej polyneuropatie a vlákna 152 mikroglobulínu u amyloidózy spojenej s dialýzou, Tan, a kol., 1994, pozri vyššie).

2. Klinické syndrómy

V tejto časti sú opísané hlavné formy amyloidóz s opisom charakteristických vláknitých zložiek, ktoré sa vyskytujú v amyloidnom plaku. Hlavným objavom predkladaného vynálezu je zistenie, že amyloidné ochorenia sa môžu liečiť podávaním činidiel, ktoré stimulujú imunitnú odpoveď zameranú proti špecifickej zložke alebo zložkám (podľa konkrétnej amyloidnej poruchy) rôznych amyloidných plakov. Takéto zložky sú najlepšie súčasťou vlákien, ktoré tvoria plaky, čo je podrobnejšie uvádzané v časti C. Nasledujúca časť slúži na príkladné znázornenie hlavných foriem amyloidóz, pričom jeho cieľom nie je žiadnym spôsobom vymedzovať alebo limitovať možnosti vynálezu.

a. AAA (reaktívna) amyloidóza

AA amyloidóza je väčšinou prejavom množstva chorôb, ktoré spôsobujú trvalú akútnu fázu. Takéto choroby zahŕňajú chronické zápaly, chronické lokálne alebo systemické mikrobiálne infekcie a zhubné nádory.

AA vlákna sú väčšinou zložené z fragmentov s veľkosťou 8000 daltonov (AA peptid alebo protein) vytvorených proteolytickým štepením sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA), čo je cirkulujúci apolipoproteín, ktorý sa vyskytuje v HDL častiach, a ktorý je syntetizovaný v hepatocytoch následne po ich stimulácii cytokínmi (napríklad IL-1, IL-6 a TNF). Amyloidné plaky môžu byť rozšírené po celom tele, prednostne však v orgánoch s parenchymatickou stavbou. Miestom s častým výskytom plakov je slezina, pričom postihnuté môžu byť aj obličky. Plaky sa bežne vyskytujú aj v srdci a gastrointestinálnom trakte.

AA amyloidné ochorenia zahŕňajú okrem iného zápalové ochorenia, ako sú napríklad reumatoidná artritída, juvenilná chronická artritída, ankylózna spondytilída, psoriáza, psoriatická artropatia, Reiterov syndróm, Stillova choroba, Bechterevova choroba a Crohnova choroba. AA usadeniny vznikajú tiež ako výsledok chronických mikrobiálnych infekcií, ako sú napríklad lepra, tuberkulóza, bronchiektáza, dekubitálne vredy, chronická pyelonefritída, osteomyelitída a Whippleova choroba. Určité zhubné nádory môžu byť tiež príčinou vzniku AA vláknitých usadenín. Medzi tieto patria Hodgkinov lymfóm, renálny karcinóm, karcinómy čreva, plúc a urogenitálneho traktu, karcinóm bazálnych buniek a leukémia vlasatých buniek.

b. AL amyloidózy

AL amyloidné usadeniny sú spojené skoro s každou dyskraziou B lymfocytámej línie, ktorá siaha od zhubného bujnenia plazmatických buniek (mnohonásobný myelóm) až k nezhubnej monoklonálnej gamapatii. Prítomnosť amyloidných usadenín môže byť občas prvotným indikátorom prebiehajúcej dyskrazie.

Vlákna AL amyloidných usadenín sa skladajú z ľahkých reťazcov monoklonálneho imunoglobulínu alebo z ich fragmentov. Tieto fragmenty pochádzajú z N-koncovej časti ľahkého reťazca (kappa alebo lambda) a obsahujú tiež celú alebo len časť variabilnej (Vi) domény. Usadeniny sa objavujú najmä v mezenchymatických tkanivách, kde spôsobujú periférnu a autonómnu neuropatiu, syndróm karpálneho tunela, makrogloziu, reštriktívnu kardiomyopatiu, artropatiu veľkých kĺbov, imunitnú dyskraziu, myelómy, rovnako tak ako skryté dyskrazie. Je však nutné poznamenať, že napadnuté môže byť v podstate akékoľvek tkanivo, najmä viscerálne orgány (napríklad srdce).

c. Dedičné systemické amyloidózy

Existuje veľa druhov vrodených systemických amyloidóz. Aj keď sa vyskytujú relatívne vzácne, nástup symptómov v dospelosti a ich dedičné podmienenie (obvykle sú autosomálne dominantné) vedie k pretrvávaniu týchto porúch v celkovej populácii. Syndrómy sa môžu pripísať bodovým mutáciám v prekurzorovom proteíne, ktoré vedú k tvorbe rôznych amyloidogénnych peptidov alebo proteínov. Tabuľka 2 uvádza typické zloženie vlákien druhov týchto porúch.

Údaje uvedené v tabuľke 2 sú len exemplárne a žiadnym spôsobom neobmedzujú rozsah uplatnenia vynálezu. V transtyretíne bolo napríklad opísaných viac ako 40 odlišných bodových mutácií, pričom všetky vedú k vzniku klinicky podobných foriem familiálnej amyloidnej polyneuropatie.

Transtyretín (TTR), ktorý sa často nazýva ako prealbumín, je protein s veľkosťou 14 kilodaltonov. Je vytváraný v pečeni a choroidnom plexe a jeho funkciou je transport tyroidných hormónov a vitamínu A. Za rôzne formy familiálnej amyloidnej polyneuropatie zodpovedá najmenej 50 rôznych foriem proteínu, pričom každá je charakteristická zmenou jedinej aminokyseliny. Napríklad substitúcia prollnu za leucín v pozícii 55 vedie k mimoriadne progresívnej forme neuropatie; substitúcia metionínu za leucín v pozícii 111 viedla u dánskych pacientov k ťažkej neuropatii. Amyloidné usadeniny izolované zo srdcového tkaniva pacientov so systemickou amyloidózou odhalili, že usadeniny sú zložené z heterogénnej zmesi TTR a jeho fragmentov, spoločne nazývané ako ATTR (jeho celá sekvencia už bola určená). Vláknité zložky ATTR sa môžu z takýchto plakov extrahovať a ďalej sa potom môže určiť ich štruktúra a sekvencie, a to podľa v odbore známych spôsobov (napríklad Gustavsson, A., a kol., Laboratory Invest. 73: 703 - 708, 1995; Kametani, F., a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622 - 628, 1984; Pras, M., a kol., PNAS 80: 539 - 42, 1983).

SK 288207 Β6

Fibrilárny peptid/proteín

Transtyretín a fragmenty (ATTR)

Transtyretín a fragmenty (ATTR)

N-koncový fragment apolipoproteínu Al (apoAl)

N-koncový fragment apolipoproteínu A1 (apoAl) Lyzozým (Alys) fragment α reťazca fibrinogénu fragment gelsolínu (Agel) fragment cystatínu C β-amyloidný proteín (Αβ) odvodený z amyloidného prekurzorového proteínu (APP) β-amyloidný proteín (Αβ) odvodený z amyloidného prekurzorového proteínu (APP) β-amyloidný protein (Αβ) odvodený z amyloidného prekurzorového proteínu (APP) priónový proteín (PrP) odvodený od PrP prekurzorového proteínu inzert 51 až 91

Tabuľka 2

Dedíme amyloidózy genetický variant

Met30, veľa ďalších

Thr45, AlaóO, Ser84,

Metl 11, Ilel22

Arg26

Arg26, Arg50, ArgóO, ďalšie

Thr56, Thr 67

Leu554, Val526

Asn 187, Tyr 187

Glu68

Gln93

Ile717, Phe717Gly717

Asn670, Leu671

Leu 102, Aall67 Asnl78, Lys200 klinické príznaky familiálna amyloidná polyneuropatia (FAP), (najmä periférne nervy) predovšetkým srdcová účasť bez neuropatie familiálna amyloidná polyneuropatia (FAP), (najmä periférne nervy) typ Ostertag, bez neuropatie (predovšetkým viscerálna účasť) typ Ostertag, bez neuropatie (predovšetkým viscerálna účasť) typ Ostertag, bez neuropatie (predovšetkým viscerálna účasť) kraniálna neuropatia mriežkovitá komeálna dystrofia dedičná cerebrálna hemoragia (cerebrálna amyloidná angiopatia) - islandský typ dedičná cerebrálna hemoragia (cerebrálna amyloidná angiopatia) - islandský typ familiálna Alzheimerova choroba familiálna demencia - pravdepodobná Alzheimerova choroba familiálna Creutzfeld-Jakobova choroba; Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndróm (dedičná spongiformná encefalopatía, priónové ochorenia)

AA odvodený zo sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA)

AA odvodený zo sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA) familiálna stredozemná horúčka, predovšetkým účasť obličiek (autozomálne recesívna)

Muckle-Wellov syndróm, nefropatia, hluchota, žihlavka, bolesť ramien

Neznámy kardiomyopatia s pretrvávajúcim sieňovým vynechávaním

Neznámy kožné usadeniny (bulózne, papuláme, pustulodermálne)

Údaje boli získané od Tan & Pepys, 1994, pozri vyššie

Osoby s bodovou mutáciou v molekule apolipoproteínu Al (napríklad Gly —» Arg26; Trp —» Arg50; Leu —>Arg60) vykazujú formu amyloidózy (typ Ôstertag) charakteristickú usadeninami proteinu apolipoprotein Al alebo jeho fragmentov (AapoAI). Títo pacienti majú nízke hladiny vysokohustotného lipoproteínu (HDL) a vykazujú periferálnu neuropatiu alebo zlyhávanie obličiek.

Mutácia v α reťazci enzýmu lyzozýmu (napríklad íle —» Thr56 alebo Asp —> His57) je základom inej formy nonneuropatickej dedičnej amyloidózy typu Ôstertag, ktorý sa vyskytuje v anglických rodinách. V tomto prípade sú usadeniny tvorené vláknami mutantného proteínu lyzozýmu (Alys) a pacienti vykazujú väčšinou zhoršenú funkciu obličiek. Tento proteín sa na rozdiel od väčšiny tu opisovaných proteínov tvoriacich vlákna nachádza v nedotknutej (nefragmentovanej) forme (Benson, M. D., a kol. CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).

β-amyloidný peptid (Αβ) je 39 až 43 aminokyselinový peptid, ktorý vzniká proteolýzou veľkého proteínu známeho ako β-amyloidný prekurzorový proteín (βΑΡΡ). Mutácie v βΑΡΡ vedú k vzniku familiálnych foriem Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu alebo senilnej demencie (alebo obidvoch), ktoré sú charakteristické mozgovými usadeninami, ktoré sú zložené z vlákien Αβ a ďalších zložiek opísaných podrobnejšie nižšie. Známe mutácie v APP spojené s Alzheimerovou chorobou sa objavujú blízko miest štepenia β alebo γ-sekretázou alebo vnútri Αβ. Napríklad pozícia 717 je priľahlá miestu štepenia APP γ-sekretázou, pri ktorom vzniká Αβ, a pozícia 670/671 susedí s miestom, kde APP štepí β-sekretáza. Mutácia v akomkoľvek z týchto zvyškov môže viesť k vzniku Alzheimerovej choroby, pravdepodobne vďaka zväčšeniu podielu aminokyselinovej formy 42/43 v celkovom množstve vznikajúceho Αβ z APP. Štruktúry a sekvencie rôznych foriem. Štruktúry a sekvencie rôznych foriem Αβ peptidov sú v odbore dobre známe. Takéto peptidy sa môžu syntetizovať pomocou v odbore známych spôsobov (napríklad Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 885 - 890, 1984; Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122: 1131 - 1135, 1984). Rôzne formy týchto peptidov sú dokonca komerčne dostupné.

Synukleín je proteín, ktorý je podobný apolipoproteínu a vyskytuje sa v značnej miere v cytozolé neurónov a v presynaptickom zakončení. Peptidové fragmenty pochádzajúce z α-synukleínu a nazývané NAC sú tiež zložkami amyloidných plakov, ktoré sa tvoria pri Alzheimerovej chorobe (Clayton, a kol., 1998). Táto zložka slúži tiež ako cieľ pri liečebných metódach založených na imunologických postupoch a zahrnutých v predkladanom vynáleze, čo je opísané nižšie.

Gelsolín je vápnik viažúci proteín, ktorý sa viaže na aktínové filamenty. Mutácia tohto proteínu v pozíciách 187 (napríklad Asp —> Asn, Asp —► Tyr) vedie k vzniku formy dedičnej systemickej amyloidózy, ktorá sa obvykle nachádza u pacientov vo Fínsku, rovnako ako u osôb, ktoré pochádzajú z Holandska alebo Japonska. U postihnutých jedincov pozostávajú vlákna tvorené z fragmentov gelsolínu (Agel) obvykle z aminokyselín 173 až 243 (68 kDa fragment na karboxylovom konci) a sú ukladané v krvných cievach a bazálnych membránach, čo umožňuje vznik komeálnej dystrofie a kraniálnej dystrofie, ktorá sa rozvíja do periférnej neuropatie a vedie k dystrofickým zmenám kože a ukladaniu usadenín v ďalších orgánoch (Kangas, H. a kol. Human Mol. Genet. 59: 1237 - 1243, 1996)).

Iné mutantné proteíny, napríklad mutantný α reťazec fíbrinogénu (AfibA) a mutantný cystatín C (Acys), tiež tvoria vlákna a umožňujú vznik charakteristických vrodených porúch. Vlákna AfibA tvoria usadeniny charakteristické pre nonneuropatické dedičné amyloidózy pri poruchách obličiek; usadeniny vlákien Acys sú charakteristické pre vrodenú cerebrálnu amyloidnú angiopatiu hlásenú na Islande (Isselbacher, a kol., Harrison's Principles of Intemal Medicíne, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, a kol., pozri vyššie). Minimálne u istého množstva pacientov s cerebrálnou amyloidnou angiopatiou (CAA) bolo preukázané, že amyloidné vlákna obsahujú nemutovanú formu cystatínu C v spojení s β proteínom (Nagai, A. a kol., Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63 - 78, 1998)).

Určité formy priónových ochorení (až 15 % prípadov) sa teraz považujú za dedičné, aj keď sa skôr myslelo, že sú predovšetkým infekčného pôvodu (Baldwin, a kol., in Research Advances in Alzheimer' s Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). V prípade takýchto priónových porúch sa u pacientov vytvárajú plaky tvorené abnormálnymi izoformami normálneho priónového proteínu (PrP^sc). Prevládajúca mutantná izoforma (Prp^Sc), nazývaná tiež ako AScr, sa líši od normálneho bunkového proteínu svojou odolnosťou proti degradácii proteázami, nerozpustnosťou po extrakcii pomocou detergentu,ukladaním v sekundárnych lyzozýmoch, posttranslačnou úpravou a vysokým obsahom konformácie β-skladaného listu.

SK 288207 Β6

Genetická príčina bola preukázaná najmenej u piatich mutácií, ktoré vedú k vzniku Creutzfeldt-Jacobovej choroby (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrómu (GSS) a fatálnej familiálnej insomnie (FFI) (Baldwin). Spôsoby extrakcie vláknitých peptidov z vlákien scrapie, určenie sekvencií a syntéza takých peptidov sú v odbore známe (napríklad Beekes, M., a kol., J. Gen. Virol. 76:2567 - 76, 1995).

Napríklad jedna z foriem GSS bola spojená s mutáciou PrP v kodóne 102, zatiaľ čo telencefalická GSS bola segregovaná s mutáciou v kodóne 117. Mutácie v kodónoch 198 ä 217 vedú k vzniku formy GSS, u ktorej neuritické plaky, charakteristické pre Alzheimerovu chorobu, obsahujú PrP namiesto peptidu Αβ. U určitých foriem familiálnej CJD bola preukázaná súvislosť s mutáciami v kodónoch 200 a 210; mutácie v kodónoch 129 a 17 8 boli nájdené ako u familiálnej CJD, tak u familiálnej FFI (Baldwin, pozri vyššie).

d. Senilné systemické amyloidózy

Množstvo systemických aj lokálnych amyloidóz usadenín sa s vekom zvyšuje. Napríklad vlákna divokého typu transtyretínu (TTR) je možné bežne nájsť v srdcovom tkanive starších jedincov, čo môže byť asymptomatické, klinicky tiché alebo môže skončiť s výsledkom srdcového zlyhania. Asymptomatické vláknité lokálne usadeniny sa môžu objaviť tiež v mozgu (Αβ), v corpora amylacea prostaty (Αβ₂ mikroglobulín), v kĺboch a v semenných vačkoch.

e. Mozočkové amyloidózy

Lokálne usadeniny amyloidu sú bežné v mozgu, najmä u starších jedincov. Najčastejší typ amyloidu nachádzajúci sa v mozgu, ktorý je zložený najmä z vlákien peptidu Αβ, vedie k demencii alebo občasnej (nededičnej) Alzheimerovej chorobe. V skutočnosti však výskyt občasných foriem Alzheimerovej choroby ďaleko prevyšuje formy dedičné. Vláknité peptidy tvoriace tieto plaky sú veľmi podobné tým, ktoré už boli opísané v súvislosti s Alzheimerovou chorobou (AD).

f. Amyloidózy spojené s dialýzou

Ll pacientov dlhodobo sa podrobujúcich hemodialýze alebo peritoneálnej dialýze je možné bežne nájsť plaky zložené z vlákien mikroglobulínu (Αβ₂Μ). β₂ mikroglobulín je polypeptid s veľkosťou 11,8 kDa a je ľahkým reťazcom antigénov MHC komplexu triedy I, prítomným na každej bunke s jadrom. Za normálnych okolností sa z bunkových membrán plynulo uvoľňuje a filtruje sa obličkami. Pri poruche očisťovacej schopnosti obličiek, napríklad v prípade zhoršenej funkcie obličiek, dochádza v obličkách a na iných miestach (najmä v kĺbových tkanivách bohatých na kolagén) k jeho ukladaniu. Na rozdiel od iných vláknitých proteínov sú molekuly Αβ₂Μ vo vláknach väčšinou prítomné v nefragmentovanej forme (Benson, pozri vyššie).

g. Amyloidózy odvodené od hormónov

Endokrinné orgány môžu byť sídlom amyloidných usadenín, najmä u starších jedincov. Hormóny vylučujúce tkanivá zasiahnuté tumormi môžu obsahovať amyloidné plaky tiež odvodené od hormónov. Tieto plaky sú tvorené vláknami polypetidových hormónov, akými sú napríklad kalcitonín (medulámy karcinóm štítnej žľazy), IAPP (amylín; ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín; ktorý sa objavuje u väčšiny pacientov s diabetes typu II) a atriálny natriuretický peptid (izolovaná atriálna forma). Sekvencie a štruktúry týchto proteínov sú v odbore dobre známe.

h. Nezaradené amyloidózy

Existuje množstvo ďalších foriem amyloidnej choroby, ktoré sa za normálnych okolností prejavujú lokalizovanými usadeninami amyloidu. Vo všeobecnosti platí, že tieto choroby sú pravdepodobne výsledkom lokalizovanej tvorby a/alebo chýbajúcim katabolizmom určitých vláknitých prekurzorov alebo sklonom určitého tkaniva (ako napríklad kĺb) na ukladanie usadenín. Medzi príklady takýchto idiopatických usadenín je možné zahrnúť modulárne AL amyloidy, kožný amyloid, endokrinný amyloid a amyloid spojený s tumormi.

C. Farmaceutické prostriedky

Objavom predkladaného vynálezu je zistenie, že prostriedky schopné vyvolať alebo vybaviť imunitnú odpoveď zameranú proti určitým zložkám amyloidových plakov sú účinné pri liečbe amyloidných ochorení alebo pri prevencii ich vzniku. Podľa poskytovaného vynálezu ide predovšetkým o možné zabránenie postupu choroby, zlepšenie ich príznakov a/alebo zníženie amyloidného zaťaženia u postihnutých jedincov, to všetko za predpokladu podania imunostimulačnej dávky antiamyloidného činidla alebo zodpovedajúcej protiamyloidnej imunitnej zložky pacientovi. Táto časť opisuje ukážkové protiamyloidné činidlá, ktoré vyvolávajú aktívne alebo pasívne imunitné odpovede proti amyloidným plakom a poskytujú ukážkové údaje znázorňujúce účinok vplyvu týchto prostriedkov na amyloidné zaťaženie.

Protiamyloidné činidlá podľa tohto vynálezu pozostávajú vo všeobecnosti zo špecifickej plakovej zložky, najlepšie zo zložky tvoriacej vlákna. Takáto zložka je obvykle charakteristický proteín, peptid alebo ich fragmenty, čo bolo opísané v predchádzajúcom oddieli a bude doložené príkladmi nižšie. Liečebné činidlá uvá11 dzané v predkladanom vynáleze vyvolávajú alebo ovplyvňujú imunitnú odpoveď proti plaku alebo skôr proti jeho vláknitej zložke. Takéto činidlá teda okrem iného zahŕňajú tieto zložky samotné, ich varianty, analógy a mimetiká týchto zložiek, ktoré indukujú protilátky proti tejto vlastnej zložke a/alebo s nimi krížovo reagujú. Takéto činidlá zahŕňajú ďalej vlastné protilátky alebo T-bunky, ktoré špecificky reagujú s amyloidnou zložkou. Dôležitým znakom je to, že farmaceutické prostriedky neobsahujú nešpecifické zložky, t. j. zložky, ktoré v tele cirkulujú alebo sú v ňom všade prítomné. Príkladom môže byť sérový amyloidný proteín (SAP) ako cirkulujúci plazmatický glykoproteín, ktorý vzniká v pečeni a viaže sa na väčšinu známych foriem amyloidných usadenín. Liečebné prostriedky sú prednostne zamerané na túto zložku.

Vyvolávanie imunitnej odpovede môže byť aktívne ako v prípade podania imunogénu pacientovi, čo následne indukuje T-bunky reagujúce s danou zložkou, alebo pasívne ako v prípade podania samotnej protilátky, ktorá sa špecificky viaže na amyloidnú zložku prítomnú v tele pacienta. Ukážkové činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď proti amyloidným plakom sú opísané v nasledujúcich oddieloch.

Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu okrem imunogénneho činidla alebo činidiel zahŕňať v účinnom množstve tiež adjuvans a/alebo pomocnú látku. Farmaceutický účinné a užitočné adjuvanty a pomocné látky sú v odbore dobre známe a sú podrobnejšie opísané v nasledujúcich oddieloch.

1. Imunostimulačné činidlá (Aktívna imunitná odpoveď)

a. Prostriedky proti vláknam

Jedna z hlavných tried predkladaných protiamyloidných činidiel obsahuje činidlá odvodené z vláknitých amyloidných proteínov. Ako už bolo uvedené, znakom amyloidných ochorení je ukladanie amyloidných plakov (tvorených najmä z vlákien, pričom tieto vlákna sú zostavené najmä z charakteristických vláknitých proteínov alebo peptidov) v orgánoch. Podľa predkladaného vynálezu je takáto vláknitá proteínová alebo peptidová zložka účinným činidlom pri vyvolaní protiamyloidnej imunitnej odpovede.

Tabuľky 1 a 2 zhŕňajú typické vlákna tvoriace proteíny, ktoré sú pre rôzne amyloidné ochorenia charakteristické. V súlade s týmto hľadiskom predkladaného vynálezu má podanie imunostimulačného prostriedku, ktorý obsahuje potrebné vláknité proteíny a ktorý zahŕňa ich homológy alebo fragmenty postihnutých jedincov, liečebné alebo profylaktické účinky.

Príkladom je Αβ, známy tiež ako β-amyloidný peptid alebo peptid A4 (pozri patent US 4 666 829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 113, 1131, 1984), ktorý sa skladá z 37 až 43 aminokyselín, a ktorý je hlavnou zložkou charakteristickou pre plaky u Alzheimerovej choroby. Αβ je tvorený z väčšieho proteínu APP pomocou dvoch enzýmov, nazývaných β- a γ-sekretázy (pozri Hardy, T1NS 20, 154, 1997).

Príklad 1 opisuje výsledky experimentu uskutočneného na podporenie predkladaného vynálezu, v ktorom bol peptid Αβ42 podaný heterozygotným transgénnym myšiam, ktoré exprimovali v nadbytočnom množstve ľudský APP s mutáciou v pozícii 717. Tieto myši, známe ako PDAPP myši, vykazujú patológiu zhodnú s Alzheimerovou chorobou a používajú sa ako zvierací model na štúdium Alzheimerovej choroby (Games, a kol., Náture 373: 523 - 7, 1995). V tomto príklade je opísané, že tieto myši vo svojom mozgu vykazujú zistiteľnú neuropatológiu plaku Afi už od šiesteho mesiaca života, pričom ukladanie plaku s vekom narastá. V opisovaných experimentoch bol myšiam podávaný agregovaný Αβ42 (ANI 1792). Väčšina z liečených myší (7 z 9) nemala na rozdiel od kontrolných myší, ktoré neboli ošetrené alebo im bol aplikovaný len soľný roztok a u ktorých bolo zistené významné množstvo amyloidného zaťaženia, v 13-tom mesiaci života v mozgu žiadne zistiteľné amyloidné plaky (obr. 2). Tieto rozdiely sú ešte viac zrejmé v hipokampe (obr. 3). Liečené myši vykazovali tiež významné titre sérových protilátok pri Αβ (všetky väčšie ako 1 : 1000, 8 z 9 väčšie ako 1 : 10000, obr. 1, tabuľka 3A). Myši, ktorým bol aplikovaný len soľný roztok, vykazovali pri riedení séra 1 : 100 vo všeobecnosti viac ako 4- až 5-krát menšie hladiny protilátok proti Αβ, a to v akomkoľvek sledovanom čase a nevykazovali teda v porovnaní s kontrolou žiadnu významnú odpoveď (tabuľka 3B). Tieto štúdie ukazujú, že injekcia špecifického vláknitého peptidu (Αβ) vedie k ochrane proti ukladaniu Afi amyloidných plakov.

Sérový amyloidný proteín (SAP) je cirkulujúci plazmatický glakoproteín, ktorý je tvorený v pečeni a viaže sa na všetky typy amyloidných vlákien (väzba závisí na prítomnosti vápnika). Medzi tieto vlákna patria aj vlákna cerebrálnych amyloidných plakov u Alzheimerovej choroby. Časťou uskutočnených experimentov bola injekcia SAP skupine myší, pričom u týchto myší došlo k vytvoreniu významných sérových titrov proti SAP (1 : 1000 až 1 : 30000), ale nedošlo k vytvoreniu zistiteľných sérových titrov proti peptidu Afi a došlo k vzniku neuropatológie cerebrálneho plaku (obr. 2).

Ďalšie experimenty (pozri príklad 2) ukázali, že imunogénny účinok injekcií Αβ u myší liečených medzi 5. týždňom a asi 8. mesiacom života je závislý na dávke. U týchto myší došlo s rastúcim počtom imunizácií a so zvyšujúcou sa dávkou aj k zvýšeniu sérového titra proti Αβ. Po štyroch imunizáciách sa sérové titre (v dávkach od 1 do 300 pg) merané vždy päť dní po imunizácií ustálili na hladinách okolo 1 : 10000.

Dodatočné experimenty na podporenie predkladaného vynálezu sú opísané v príklade 3. V tomto príklade bolo PDAPP myšiam v určitom časovom bode (okolo 11. mesiaca veku, čo je čas, v ktorom sú zistiteľné amyloidné plaky v ich mozgu) začaté podávanie Αβ42. V týchto štúdiách boli zvieratá imunizované Αβ42 alebo soľným roztokom, pričom na zistenie ich amyloidného zaťaženia boli usmrtené vo veku 15 alebo 18 mesiacov. Z obr. 7 je vidieť, že 18 mesiacov staré myši vykazovali významne nižšie priemery amyloidného zaťaženia (plakové zaťaženie 0,01 %) ako 18 mesiacov staré kontrolné zvieratá, ktorým bolo aplikované PBS (soľný roztok pufrovaný fosfátom) (plakové zaťaženie 4,7 %), aj ako 12 mesiacov staré neliečené zvieratá (0,28 %), u ktorých sa amyloidné zaťaženie meralo obrazovou analýzou (podobnejšie pozri príklad 3, časť 8). Tieto experimenty ukazujú účinnosť liečebných metód podľa predkladaného vynálezu, definovanú znížením existujúceho plakového zaťaženia, a zabránenie nárastu plakového zaťaženia u jedincov, ktorí nie sú chorí.

Podľa tohto hľadiska vynálezu sú liečebné činidlá odvodené z vláknitých peptidov alebo proteínov, ktoré tvoria plaky charakteristické pre danú chorobu. Týmito činidlami môžu byť aj látky antigénne podobné zložkám plakov do takej miery, aby boli schopné vyvolať imunitnú odpoveď, ktorá tiež krížovo reaguje s vláknitými zložkami plakov. Tabuľky 1 a 2 poskytujú príklady takých vláknitých peptidov a proteínov, pričom ich zloženie a sekvencie sú v odbore známe a môžu sa známymi spôsobmi jednoducho určiť (pozri odkazy citované nižšie a v sekcii B2 pre odkazy, ktoré opisujú špeciálne spôsoby extrakcie a/alebo tvorby rôznych vláknitých zložiek, ďalšie príklady vláknitých zložiek sú opísané nižšie.

Tak bude v súlade s predkladaným vynálezom v prípade určenia diagnózy amyloidného ochorenia (klinicky a/alebo biopsiou) skúsený odborník schopný zistiť zloženie vlákien amyloidnej usadeniny a poskytnúť činidlo, ktoré vyvolá imunitnú odpoveď zameranú proti vláknitým peptidom alebo proteínom.

Ako už bolo opísané, tak liečebným činidlom používaným v prípade liečby Alzheimerovej choroby alebo iných amyloidných ochorení, charakteristických ukladaním vlákien Αβ, môžu byť prirodzene sa vyskytujúce formy peptidu Αβ, mimoriadne však ludské formy (t. j. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43). Sekvencie týchto peptidov a ich príbuznosť s prekurzorom APP sú v odbore známe, resp. v odbore dobre známe (napríklad Hardy a kol., TINS 20, 155 - 158, 1997). Napríklad Αβ42 má sekvenciu: H₂N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-HisAsp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-LeuMet-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID No. 1).

Αβ41, Αβ40 a Αβ39 sa od Αβ42 líši neprítomnosťou Ala, Ala-Ile a Ala-Ile-Val na C-koncovej časti peptidu. Αβ43 sa od Αβ42 líši prítomnosťou treonínového zvyšku na C-konci. Podľa predloženého uskutočnenia vynálezu budú liečebné činidlá vyvolávať imunitnú odpoveď proti časti alebo celej vláknitej zložke danej choroby. Napríklad predložená imunogénna látka proti Αβ je činidlo, ktoré indukuje protilátku špecifickú proti voľnému N-koncu Αβ. Takáto látka má tú výhodu, že nerozoznáva prekurzorový protein, β-ΑΡΡ, a znižuje teda pravdepodobnosť vzniku autoimunitnej reakcie.

V ďalšom príklade, ktorý sa týka pacientov postihnutých chorobami charakteristickými ukladaním vlákien AA (napríklad chronické zápaly, chronické lokálne alebo systemické mikrobiálne infekcie a zhubné nádory), je možné oceniť, že pacienti môžu byť liečení AA peptidom, čo je známy 8 kDa veľký fragment sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA). Medzi typické AA amyloidné poruchy patria okrem iného zápalové ochorenia, ako je napríklad reumatoidná artritída, juvenilná chronická artritída, ankylózna spondytilída, psoriáza, psoriatická artropatia, Reiterov syndróm, Stillova choroba, Bechterova choroba, Crohnova choroba, chronické mikrobiálne infekcie ako sú napríklad lepra, tuberkulóza, bronchiektázia, dekubitálne vredy, chronická pyelonefŕitída, osteomyelitída a Whippleova choroba a rovnako aj zhubné nádory, medzi ktoré patria Hodgkinov lymfóm, renálny karcinóm, karcinómy čreva, pľúc a urogenitálneho traktu, karcinóm bazálnych buniek a leukémia vlasatých buniek.

AA peptid patrí do heterogénnej skupiny peptidov, ktoré vznikajú z N-koncovej časti sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA), začínajúc zvyškom prekurzorového proteínu 1, 2 alebo 3 a končiac kdekoľvek medzi zvyškami 58 a 64; vlákna AA sú zvyčajne zložené zo zvyškov 1 až 76. Presné štruktúry a zloženia sa môžu určiť, pričom následná syntéza príslušných peptidov je možná vďaka v odbore známym metódam (Liepnieks, J. J., a kol. Biochem. Biophys. Acta 1270: 81 -86, 1995).

Fragmenty vzniknuté z N-koncovej časti ľahkého reťazca (kappa alebo lambda reťazec) imunoglobulínu a obsahujúce jeho variabilnú doménu (Vi) alebo jej časť väčšinou tvoria amyloidné usadeniny v mezenchymatických tkanivách, kde spôsobujú periférnu a autonómnu neuropatiu, syndróm karpálneho tunela, makrogloziu, reštriktívnu kardiomyopatiu, artropatiu veľkých kĺbov, imunitnú dyskraziu, myelómy, rovnako ako skryté dyskrazie. Prostriedky podľa vynálezu budú prednostne vyvolávať imunitnú odpoveď len proti časti ľahkého reťazca, prednostne proti neoepitopu (epitop, ktorý vzniká ako výsledok rozpadu materskej molekuly), aby bolo obmedzené prípadné autoimunitné pôsobenie.

Liečebným spôsobom podľa predkladaného vynálezu sú prístupné aj rôzne vrodené amyloidné ochorenia. Také choroby sú opísané v časti B. 2. Napríklad rôzne typy familiálnej amyloidnej polyneuropatie sú dôsledkom existencie viac ako 50 foriem (každá je spôsobená zmenou jedinej aminokyseliny) transtyretínu (TTR), 14 kDa veľkého proteínu tvoreného v pečeni. Veľa typov tejto choroby je rozlíšiteľných na základe svojej špecifickej patológie a/alebo demografického rozšírenia, pričom je možné oceniť, že liečebné prostriedky môžu byť zložené tiež z činidiel vyvolávajúcich imunitnú odpoveď proti viacerým formám TTR ako jednej forme TTR. Takým prostriedkom môže byť zmes dvoch alebo viacerých foriem ATTR, ktorý obsahuje divo13 ký TTR, aje tak v širokej miere použiteľným liečebným prostriedkom.

Amyloidné plaky, ktoré obsahujú AapoAI, sa nachádzajú u osôb s bodovou mutáciou v molekule apolipoproteínu AL Pacienti s týmto typom ochorenia väčšinou vykazujú periferálnu neuropatiu alebo zlyhanie obličiek. Podľa predkladaného vynálezu obsahujú liečebné prostriedky jednu formu AapoAI alebo viacero rôznych foriem AapoAI, opísaných a v odbore známych.

Určité familiálne formy Alzheimerovej choroby sú rovnako ako Downov syndróm výsledkom mutácií v β-amyloidnom prekurzorovom proteíne, čo vedie k ukladaniu plakov zložených hlavne z β-amyloidného peptidu (Αβ). Použitie peptidu Αβ v liečebných prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu je opísané a na príkladoch vysvetlené ďalej.

Uvedené určité postupy liečenia vrodených foriem amyloidóz zahŕňajú prostriedky vyvolávajúce imunitné odpovede proti fragmentom gelsolínu (liečba dedičnej systemickej amyloidózy), mutantnému proteínu lyzozýmu (Alys) (liečba dedičnej neuropatie), mutantnému a reťazcu fibrinogénu (AfibA) (liečba nonneuropatickej formy amyloidózy, ktorá sa prejavuje ako ochorenie obličiek), mutantnému cystatínu C (Acys) (liečba dedičnej cerebrálnej angiopatie, ktorá sa vyskytuje na Islande). Výskytom mutantnej izoformy priónového proteínu (PrP^Sc) sú charakterizované určité dedičné typy priónových ochorení, medzi ktoré patrí napríklad Creutzfeldt-Jacobova choroba (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndróm (GSS) a fatálna familiálna insomnia (FFI). Tento proteín sa môže v súlade s predkladaným vynálezom použiť v prostriedkoch na liečbu alebo prevenciu ukladania plakov PrP.

Ako už bolo diskutované, tvorba amyloidných usadenín (ako systemická tak ohnisková) súvisí so starnutím. Tejto tvorbe je možné podľa ďalšieho hľadiska predkladaného vynálezu predísť alebo zabrániť aplikáciou prostriedkov zložených z jedného proteínu alebo viacerých proteínov spojených so starnutím. Takže plaky zložené z ATTR odvodeného z divokého typu TTR sa môžu často nájsť v srdcovom tkanive starších ľudí. U určitých starších jedincov sa zase môžu v mozgu vyvinúť ohniskové asymptomatické vláknité usadeniny peptidu Αβ. U týchto jedincov je potom liečba peptidom Αβ, ako bolo už opísané, nutná. β₂ mikroglobulín je častou zložkou corpora amylaces prostaty, aje tak podľa predkladaného vynálezu ďalším kandidátom (liečebným činidlom).

Okrem iných existuje množstvo ďalších typov amyloidných ochorení, ktoré nie sú dedičné a ktoré sú vhodnými kandidátmi na liečbu spôsobmi v predkladanom vynáleze. U pacientov dlhodobo sa podrobujúcich hemodialýze alebo peritoneálnej dialýze je možné bežne nájsť plaky zložené z vlákien β₂ mikroglobulínu. Títo pacienti sa môžu v súlade s predkladaným vynálezom liečiť pomocou prostriedkov zameraných proti β₂ mikroglobulínu alebo ešte lepšie proti jeho imunogénnych epitopom.

Hormóny vylučujúce tkanivá zasiahnuté tumormi môžu obsahovať amyloidné plaky odvodené tiež od hormónov, pričom ich zloženie je charakteristickým znakom príslušného zasiahnutého endokrinného orgánu. Tieto plaky sú tvorené vláknami polypeptidových hormónov, akými sú napríklad kalcitonín (medulámy karcinóm štítnej žľazy), IAPP (amylín; ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín; ktorý sa objavuje u väčšiny pacientov s diabetom typu II) a atriálny natriuretický peptid (izolovaná atriálna amyloidóza). Prostriedky zamerané na amyloidné usadeniny tvoriace sa v intime aorty pri ateroskleróze sú tiež zahrnuté v predkladanom vynáleze. Weatermark a kol. opisuje napríklad 69 aminokyselinový fragment N-koncovej časti apolipoproteínu A, ktorý tvorí tieto plaky (Westermark a kol., Am. J. Path. 147: 1186 - 92, 1995); terapeutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú imunologické činidlá zamerané na tento fragment rovnako tak ako fragment samotný.

Predchádzajúca diskusia bola zameraná na vláknité amyloidné zložky, ktoré sa môžu použiť ako činidlá pri liečbe alebo prevencii rôznych typov amyloidných ochorení. Liečebným činidlom môže byť tiež fragment alebo analóg prirodzene sa vyskytujúceho alebo mutantného vláknitého proteínu alebo peptidu, ktorý obsahuje epitop, ktorý po podaní jedincovi vyvolá podobnú ochrannú alebo liečebnú imunitnú odpoveď.

Imunogénne fragmenty obsahujú typicky sekvenciu s najmenej 3, 5, 6, 10 alebo 20 aminokyselinami, ktoré sú aj v prirodzene sa vyskytujúcom peptide. Medzi príkladné imunogénne fragmenty peptidu Αβ patria Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 1-12, 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 a 35-42. V nejakých spôsoboch sa používajú fragmenty, ktorým chýba najmenej jedna C-koncová aminokyselina a niekedy najmenej 5 alebo 10 C-koncových aminokyselín, prítomných v prirodzene sa vyskytujúcich formách tejto vláknitej zložky. Napríklad fragment, ktorému chýba 5 C-koncových aminokyselín z Αβ43, obsahuje prvých 38 aminokyselín z N-koncovej časti Αβ. Fragmenty z N-koncovej polovice Αβ sa v niektorých spôsoboch používajú prednostne. Analógy zahŕňajú alelické, druhové a indukované varianty. Analógy sa od prirodzene sa vyskytujúcich peptidov líšia v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách, často však ide o zámenu konzervatívnu. Analógy vykazujú najmenej 80 až 90 % sekvenčnú zhodu s prirodzeným peptidom. Niektoré analógy obsahujú tiež neprirodzené aminokyseliny alebo modifikácie N- alebo C-koncových aminokyselín. Príklady neprirodzených aminokyselín sú a, a-disubstituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mliečna,

4-hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, γ-Ν,Ν,Ν-trimetyllyzín, γ-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetýlserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, co-N-metylarginín.

Osoba skúsená v odbore ocení, že fragmenty a analógy vytvorené v súlade s týmto hľadiskom vynálezu

SK 288207 Β6 môžu byť testované na to, či krížovo reagujú s prirodzene sa vyskytujúcou vláknitou zložkou, a/alebo na to, aká je ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat (pozri nižšie). Tieto fragmenty alebo analógy sa môžu použiť v liečebných prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu, ale za predpokladu, že ich imunoreaktivita a účinnosť v tomto zvieracom modeli je približne rovnaká alebo väčšia ako v prípade zložiek amyloidných vlákien.

Takéto peptidy, proteíny alebo fragmenty, analógy a ďalšie amyloidogénne peptidy sa môžu pripraviť pomocou syntézy peptidov na tuhej fáze alebo rekombinantnou expresiou, čo sú v odbore dobre známe spôsoby, alebo sa môžu získať z prírodných zdrojov. Ukážkové zloženia vlákien, spôsoby extrakcie vlákien a sekvencie vláknitých peptidov alebo proteínov sú uvedené v publikáciách, ktoré sú citované v spojení s opisom konkrétnej vláknitej zložky. Zloženia ďalších látok, spôsoby ich extrakcie a určenie ich sekvencie sú v odbore dobre známe. Na tvorbu týchto látok sa môžu použiť automatické prístroje na syntézu peptidov, ktoré sú komerčne dostupné u mnohých výrobcov, napríklad Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, Calofomia), pričom postupy pri príprave syntetických peptidov sú v odbore dobre známe. Na rekombinantnú expresiu sa môžu použiť baktérie (napríklad E. coli), kvasinky, hmyzie bunky alebo cicavčie bunky; proteíny sa môžu prípadne vytvoriť použitím in vitro translácie, čo je v odbore známy spôsob. Postupy rekombinantnej expresie sú opísané v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, N. Y 2ed., 1989). Určité peptidy a proteíny sú dostupné tiež komerčne; napríklad niektoré formy peptidu Αβ sa môžu získať napríklad od American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, Califomia alebo Califomia Peptide Research, Inc., Napa, Califomia.

Liečebné činidlá môžu byť zložené tiež z dlhších polypeptidov, napríklad z aktívneho fragmentu vláknitého peptidu alebo jeho analógu, spojeného spolu s ďalšími aminokyselinami. Napríklad peptid Αβ sa môže nachádzať ako intaktný APP proteín alebo jeho časť (napríklad fragment C-100, ktorý začína na N-konci Αβ a pokračuje do konca APP). Tieto polypeptidy môžu byť testované na to, ako je ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat (pozri nižšie). Αβ peptid, jeho analóg, účinný fragment alebo iný polypeptid sa môžu podávať v asociovanej forme (t. j. ako amyloidné plaky) alebo v disociovanej forme. Liečebné činidlá môžu zahŕňať tiež multiméry z monomémych imunogénnych činidiel alebo konjugáty nosných proteínov a/alebo sa môžu s cieľom získania širšieho rozsahu protiamyloidného pôsobenia pridať s inou vláknitou zložkou.

Ďalšou obmenou môže byť predkladanie imunogénneho peptidu (napríklad fragment Αβ) vírusom alebo baktériou ako časťou imunogénneho prostriedku. Nukleová kyselina kódujúca imunogénny peptid je vložená do genómu alebo epizómu vírusu alebo baktérie. Ďalšou možnosťou je zabudovanie nukleovej kyseliny takým spôsobom, že imunogénny peptid je exprimovaný ako sekretovaný proteín alebo ako fúzny proteín s proteínom na vonkajšom povrchu vírusu alebo s transmembránovým proteínom v baktérii, a to tak, aby bol peptid vystavený. Vírusy alebo baktérie použité v týchto spôsoboch by mali byť nepatogénne alebo oslabené. Vhodné vírusy zahŕňajú adenovírus, HSV, vírus venezuelskej konskej encefalitídy a ďalšie a vírusy, vírus vezikulámej stomatitídy a ďalšie rabdovírusy, vírus vakcínie a poxvírusy hydriny. Vhodné baktérie zahŕňajú salmonelu a shigelu. Fúzia imunogénneho peptidu s HBsAg z HBV je predovšetkým vhodná. Liečebné činidlá zahŕňajú tiež peptidy a ďalšie látky, ktoré nevyhnutne nemusia mať v sekvencii aminokyselín s A významnú zhodu, avšak slúžia ako mimetiká Αβ a vyvolávajú podobnú imunitnú odpoveď. Vyskúšať sa môžu napríklad akékoľvek peptidy a proteíny tvoriace β-skladaný list. Anti-idíotypické protilátky proti monoklonálnym protilátkam špecifickým pre Αβ alebo iným amyloidogénnym peptidom sa môžu tiež použiť.

Tieto anti-Id protilátky napodobňujú antigén a vyvolávajú proti nemu imunitnú odpoveď (pozri Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), str. 181). Činidlá odlišné od peptidov Αβ by mali vyvolať imunogénnu odpoveď proti jednej alebo viacerým uprednostňovaným častiam Αβ (pozri vyššie; 1 až 10, 1 až 7, 1 až 3 a 3 až 7). Tieto činidlá vyvolávajú imunogénnu odpoveď zameranú prednostne proti jednej z týchto častí bez toho, že by vyvolali odpoveď proti inej časti Αβ.

Skúšať sa môžu aj peptidy a iné látky z náhodných knižníc (Random Libraries). Pre veľa typov látok, ktoré sa môžu zostaviť po jednotlivých krokoch, sa môžu vytvoriť kombinačné knižnice (Combinatoral libraries). Medzi tieto látky patria polypeptidy, β-skladané mimetiká, polysacharidy, fosfolipidy, hormóny, prostaglandíny, steroidy, aromatické látky, heterocyklické zlúčeniny, benzodiazepíny, oligoméme N-substituované glycíny a oligokarbamáty. Veľké kombinačné knižnice sa môžu zostaviť podľa kódovaných umelých knižníc (encoded synthetic libraries ESL) spôsobom opísaným v Affymax, WO 95/12 608, Affymax WO 93/06 121, Columbia University, WO 94/08 051, Pharmacopeia, WO 95/35 503 a Scripps, WO 95/30 642 (každý z nich je zahrnutý podľa odkazu na všetky účely). Peptidové knižnice sa môžu zostaviť s použitím spôsobov fágového vystavovania (pozri napríklad Devlin, WO 91/18 980).

V kombinačných knižniciach a u ďalších látok sa najskôr zisťuje ich použiteľnosť meraním stupňa schopnosti viazať sa na protilátky alebo na lymfocyty (B alebo T), ktoré sú špecifické pre Αβ alebo iné amyloidogénne peptidy ako napríklad ATTR. Napríklad počiatočné testy sa tak môžu vykonať s akoukoľvek polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou proti Αβ alebo ktorémukoľvek ďalšiemu amyloidogénnemu peptidu, ktorý nás zaujíma. Látky identifikované týmito testami sa potom ďalej analyzujú na schopnosť sti15

SK 288207 Β6 mulovať protilátky alebo lymfocyty špecifické pre Αβ alebo iný amyloidogénny peptid. Mnohonásobné riedenia séra sa môžu napríklad testovať na mikrotitračných doštičkách, ktoré sa vopred pokryli vláknitým peptidom, pričom potom môže nasledovať štandardné ELISA testy na zistenie protilátok špecifických pre Αβ. U látok sa potom môže testovať ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat, predisponovaných pre amyloidné ochorenia, čo je opísané v príkladoch. Tieto zvieratá zahŕňajú napríklad myši s APP mutovanom v pozícii 717 (Games a kol.) a myši so švédskou mutáciou 670/671 v APP (McConlogue a kol., US 5 612 486 a Hsiao a kol., Science 274, 99, 1996; Staufenbiel a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13287 - 13292, 1997; Sturchler-Pierrat a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13287 - 13292, 1997; Borchelt a kol., Neurón 19, 939 - 945, 1997). Rovnaký Študijný prístup sa môže použiť na ďalšie potenciálne činidlá, medzi ktoré patria fragmenty Αβ, analógy Αβ a ďalšie peptidy, ktoré zahŕňajú Αβ.

b. Ďalšie zložky plaku

Imunologické odpovede zamerané proti iným zložkám amyloidného plaku môžu byť tiež účinné pri prevencii, spomalení vývoja alebo zmenšení plakovej usadeniny pri amyloidnom ochorení. Tieto zložky môžu byť menšinovými časťami vlákien, môžu byť spojené s týmito vláknami alebo s tvorbou týchto vlákien tvoriacich plaky. Obmedzením je skutočnosť, že zložky, ktoré sú v tele všadeprítomné alebo sú pre amyloidné usadeniny relatívne nešpecifické, nepredstavujú pre liečebné činidlá najvhodnejší terč.

Ďalším objavom predkladaného vynálezu je tak zistenie, že činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď proti špecifickým zložkám plaku sú účinné pri liečbe alebo zastavení postupu amyloidného ochorenia. Táto kapitola poskytuje základné informácie o niekoľkých typických molekulách, ktoré sú spojené s amyloidným plakom. Liečba vyvolávajúca imunitnú odpoveď proti jednej z týchto molekúl alebo kombinovaná liečba, ktorá zahŕňa spoločnú aplikáciu s imunogénnym liečebným prostriedkom proti akejkoľvek opísanej vláknitej zložke alebo proti akejkoľvek nižšie opísanej nevláknitej zložke plaku, poskytuje podľa predkladaného vynálezu doplnkovú protiamyloidnú liečbu. Časťou predkladaného vynálezu sú aj spôsoby pasívnej imunizácie založené na týchto plakových zložkách, čo je tu opísané.

Príkladom môže byť synukleín, čo je proteín štrukturálne podobný apolipoproteínom, ale nachádza sa v cytozole neurónov, najmä v oblasti presynaptického zakončenia. Existujú najmenej tri formy tohto proteínu, nazvané α, β a γ synukleín. Nedávno bolo preukázané, že a a β synukleín sa u určitých amyloidných ochorení zúčastňuje nukleácie amyloidných usadenín, najmä v prípade Alzheimerovej choroby (Clayton, D. F. a kol., TINS 21(6): 249 - 255, 1998). Fragment NAC domény α a β synukleínu (zvyšky 61 až 95) bol totiž izolovaný z amyloidných plakov u pacientov s AD; tento fragment tvoril v skutočnosti 10 % nerozpustenej formy plaku, čo bolo zistené po rozpustení plaku v SDS (dodecylsulfát sodný) (George, J. M., a kol., Neurosci. News 1: 12 - 17, 1995). Ako α synukleín, tak aj jeho NAC fragment sú známe tým, že in vitro urýchľujú agregáciu β-amyloidného peptidu do nerozpustného amyloidu (Clayton, pozri vyššie).

Ďalšie zložky spojené s amyloidnými plakmi zahŕňajú nepeptidové látky. Napríklad perlecan a od neho odvodené glykozaminoglykány sú veľké proteoglykány odvodené od heparínsulfátu, ktoré sa vyskytujú v amyloidných plakoch s obsahom Αβ (napríklad pri Alzheimerovej chorobe a iných amyloidózach vyskytujúcich sa v CNS alebo systemicky, t. j. napríklad plaky s amylínom spojené s diabetes). U týchto látok bolo preukázané, že pomáhajú pri tvorbe Αβ vlákien. Väzby na Αβ sa zúčastňujú ako proteíny jadra, tak aj glykozaminoglykánové reťazce perlecanu. Ďalšie glykozaminoglykány, konkrétne dermatan sulfát, chondroitín-4-sulfát alebo pentozan polysulfát sa bežne vyskytujú v amyloidných plakoch rôznych typov a bolo preukázané, že tiež pomáhajú pri tvorbe vlákien. Pôsobenie dextransulfátu je rovnaké. Toto pôsobenie je významne znížené po desulfatácii týchto molekúl. Imunogénne lieky zamerané proti sulfatovaným formám glykozaminoglykánov, medzi ktoré patria aj niektoré glykozaminoglykány, tvoria súčasť primárnej alebo sekundárnej liečby doplnkové uskutočnenie predkladaného vynálezu. Vytvorenia takýchto molekúl a rovnako aj liečebných prostriedkov, ktoré obsahujú tieto molekuly, je schopný bežný praktik z odboru.

2. Činidlá vyvolávajúce pasívnu imunitnú odpoveď

Liečebné činidlá podľa tohto vynálezu zahŕňajú tiež imunitné látky (napríklad protilátky), ktoré sa špecificky viažu na vláknité peptidy alebo iné zložky amyloidného plaku. Tieto protilátky môžu byť polyklonálne aj monoklonálne, pričom sa viažu špecificky podľa typu amyloidnej choroby. Liečebné prostriedky aj liečebné režimy môžu zahŕňať protilátky zamerané na jednu väzbovú doménu alebo epitop určitej vláknitej alebo nevláknitej zložky plaku, pričom môžu zahŕňať aj protilátky zamerané proti dvom alebo viacerým epitopom na rovnakej zložke alebo protilátky zamerané na epitopy, ktoré sa nachádzajú na viacerých zložkách plaku.

V pokusoch uskutočnených na podporu predkladaného vynálezu boli PDAPP myšiam starým 8,5 až 10,5 mesiaca aplikované intraperitoneálne (i. p.) injekcie polyklonálnej protilátky proti Αβ42 alebo injekcie monoklonálnej protilátky proti Αβ, špecificky zamerané proti epitopom Αβ peptidu, alebo soľný roztok (pozri príklad 5). V týchto pokusoch boli sledované koncentrácie cirkulujúcich protilátok, pričom na udržanie koncentrácie vyššej ako 1 : 1000 (pomer medzi antigénom a proti nemu špecifickej protilátky) boli aplikované posilňovacie injekcie. Zníženie hladiny celkového Αβ bolo v porovnaní s kontrolou pozorované v hipokam16

SK 288207 Β6 pe, kôre a v mozočku myší liečených protilátkou; maximálne zníženie bolo v týchto pokusoch pozorované u myší liečených polyklonálnou protilátkou.

V ďalších pokusoch uskutočnených na podporu predkladaného vynálezu (prediktívna ex vivo analýza) bola testovaná čistiaca schopnosť protilátky proti fragmentom synukleínu, známemu ako NAC. Synukleín je protein spojený s amyloidným plakom. Protilátka proti NAC bola aplikovaná na vzorku mozgového tkaniva, ktorá obsahovala amyloidné plaky a mikrogliálne bunky. Ako kontrola sa použilo králičie sérum. Nasledujúce preskúmanie ukázalo jasné zníženie množstva a rozmerov plakov a preukázalo tak čistiacu schopnosť tejto protilátky.

Z týchto výsledkov je zrejmé, že amyloidné plaky spojené s AD a ďalšími amyloidnými chorobami môžu byť silno potlačené aplikáciou imunitných činidiel zameraných proti epitopom v peptide Αβ alebo proti fragmentu synukleínu NAC. Ďalej je jasné, že ako súčasť liečebných prostriedkov je použiteľný široký rozsah protilátok. Protilátky, ktoré sa špecificky viažu na agregované formy Αβ bez toho, že by sa viazali na jeho disociované formy sú na použitie v tomto vynáleze vhodné rovnako ako protilátky, ktoré sa špecificky viažu na disociovanú formu Αβ bez toho, že by sa viazali na jeho agregovanú formu. Ďalšie vhodné protilátky sú tie, ktoré sa viažu na obidve jeho formy. Niektoré z týchto protilátok sa viažu na prirodzene sa vyskytujúcu krátku formu Αβ (t. j. Αβ39,40,41) bez toho, že by sa viazali na prirodzene sa vyskytujúcu dlhú formu (t. j. Αβ42 a Αβ43). Niektoré protilátky sa viažu na dlhú formu bez toho, že by sa viazali na krátku formu. Niektoré protilátky sa viažu na Αβ bez toho, že by sa viazali na amyloidný prekurzorový protein s úplnou dĺžkou.

Niektoré protilátky sa viažu na Αβ s väzbovou afinitou väčšou alebo rovnou 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ alebo 10¹⁰ M'¹.

Polyklonálne séra obsahujú zvyčajne zmiešané populácie protilátok, ktoré sa viažu na viacero epitopov po celom Αβ. Monoklonálne protilátky sa viažu špecificky na epitop v Αβ, pričom tento epitop môže byť konformačný alebo nekonformačný. Niektoré monoklonálne protilátky sa viažu na epitop medzi zvyšky 1 až 28 v Αβ (zvyšok 1 znamená N-koncový zvyšok prirodzeného Αβ). Iné monoklonálne protilátky sa viažu na epitop zo zvyškov 1 až 10 v Αβ. Existujú tiež monoklonálne protilátky, ktoré sa viažu na epitop zo zvyškov 1 až 16 v Αβ. Niektoré monoklonálne protilátky sa viažu na epitop z aminokyselín laž5,5ažl0, 10ažl5, 15až 20, 25 až 30, 10 až 20,20, 30 alebo 10 až 25. U protilátok potom môže byťtestovaná ich profylaktická alebo liečebná účinnosť s použitím transgénnych zvierat, čo je opísané v príkladoch.

Podľa poskytnutých návodov si odborník môže navrhnúť, vytvoriť a vyskúšať protilátky zamerané na vláknité proteíny alebo peptidy charakteristické pre ďalšie amyloidné ochorenia, medzi ktoré patria choroby opísané v časti 2, pričom môže použiť opísané látky, rovnako ako protilátky proti iným amyloidným zložkám.

a. Všeobecná charakteristika imunoglobulínov

Základnou stavebnou jednotkou protilátky je tetramér zo štyroch podjednotiek. Každý tetramér je zložený z dvoch rovnakých párov polypeptidových reťazcov, pričom každý pár tvorí jeden ľahký (okolo 25 kDA) a jeden ťažký (okolo 50 až 70 kDA) reťazec. Časť na amínovom konci každého reťazca obsahuje variabilnú oblasť zloženú zo 100 až 110 alebo viacerých aminokyselín, ktoré primáme zodpovedajú za rozpoznanie antigénu. Časť na karboxylovom konci každého reťazca vymedzuje konštantnú oblasť, ktorá primárne zodpovedá za celkové pôsobenie.

Ľahké reťazce sú označované ako kappa alebo lambda. Ťažké reťazce sú označené ako γ, μ, α, δ alebo ε a vymedzujú izotyp protilátky (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE). Variabilné a konštantné oblasti ľahkých a ťažkých reťazcov sú spojené J oblasťou zloženou z asi 12 alebo viacerých aminokyselín s tým, že ťažký reťazec obsahuje tiež D-oblasť, zloženú z asi 10 alebo viacerých aminokyselín (vo všeobecnosti pozri Fundamentan Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 19896, Ch. 7 (zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely).

Variabilné oblasti každého z obidvoch párov tvorených ľahkým a ťažkým reťazcom formujú väzbové miesto protilátky, čo znamená, že funkčná protilátka má dve väzbové miesta. Tieto dve väzbové miesta sú rovnaké (s výnimkou bifuknčných alebo bišpecifických protilátok). Všetky reťazce vykazujú rovnakú základnú stavbu relatívne konzervovaných štruktúrnych oblastí (FR), spojených tromi hypervariabilnými oblasťami, ktoré sa nazývajú tiež oblasti určujúce komplementaritu (CDRs). CDRs z dvoch reťazcov každého páru sú zoradené podľa štruktúrnych oblastí, ktoré umožňujú väzbu na špecifický epitop. Ľahké aj ťažké reťazce pozostávajú od N-konca ku C-koncu z domén FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Postupnosť aminokyselín v každej doméne je opísaná v Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 a 1991) alebo v Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia a kol., Náture 342: 878 - 883 (1989).

b. Tvorba protilátok nepochádzajúcich z človeka

Tvorba protilátok nepochádzajúcich z človeka, napríklad myších, morčacích, králičích alebo krysích, môže byť zabezpečená napríklad imunizáciou zvieraťa zložkou plaku, napríklad Αβ alebo inej vláknitej zložky. Dlhšie polypeptidy, ktoré obsahujú Αβ alebo imunogénny fragment Αβ, alebo antiidiotypické protilátky (protilátky proti protilátke proti Αβ) Αβ sa môžu tiež použiť (pozri napríklad Harlow & Lane, Antibodies, A La17 boratory Manual (CSHP N. Y, 1988)) (zahrnuté podľa odkazu na všetky účely). Taký imunogén sa môže získať z prirodzeného zdroja, syntézou peptidu alebo rekombinantnou expresiou. Niekedy sa môže imunogén podávať s adjuvantom. Niektoré typy týchto adjuvantov sú opísané nižšie. Aplikácia kompletného Freundovho adjuvantu nasledovaná aplikáciou nekompletného Freundovho adjuvantu je pri imunizácii laboratórnych zvierat obľúbenou cestou. Na tvorbu polyklonálnych protilátok sa najčastejšie používajú králiky alebo morčatá. Na prípravu monoklonálnych protilátok sa najčastejšie používajú myši. Protilátky sú testované, či sa špecificky viažu na imunogén. Protilátky sú tiež testované, či sa viažu na špecifickú oblasť imunogénu. Napríklad, ak je imunogénom Αβ, môže sa testovanie uskutočniť určením väzby protilátky na rad mutantov Αβ s deléciou, z čoho sa potom určí, ktoré mutanty sa viažu na protilátku. Väzba sa môže vyhodnotiť napríklad pomocou Westemovej analýzy (Western blott) alebo pomocou ELISA. Najmenší fragment, ktorý vykazuje špecifickú väzbu s protilátkou vymedzuje epitop protilátky. Špecifita epitopu sa môže tiež určiť kompetičnou analýzou, v ktorej skúmaná a referenčná protilátka súťaží o väzbu s určitou zložkou. Ak skúmaná a referenčná protilátka o väzbu súťaží, potom je zrejmé, že sa viažu na rovnaký epitop alebo na epitopy dostatočne blízke na to, aby väzba jednej protilátky narušila väzbu druhej.

c. Chiméme a humanizované protilátky

Chimérne a humanizované protilátky majú rovnakú alebo podobnú špecifitu a afinitu ako protilátky myší alebo ďalšie protilátky nepochádzajúce z človeka, ktoré poskytujú východiskový materiál na konštrukciu chimémych a humanizovaných protilátok. Chimérne protilátky sú protilátky, u ktorých boli gény kódujúce ľahký a ťažký reťazec umelo vytvorené, najčastejšie spôsobmi genetického inžinierstva, z častí imunoglubulínových génov patriacich iným druhom. Napríklad variabilné (V) časti génov kódujúcich myšiu monoklonálnu protilátku môžu byť spojené s ľudskými konštantnými (C) časťami (napríklad IgGl a IgG4). Typická chiméma protilátka je tak hybridným proteínom, ktorý obsahuje V, alebo doménu viažucu antigén, z myšej protilátky a C, alebo aj efektorovú doménu, z ľudskej protilátky.

Humanizované protilátky majú štruktúru variabilnej oblasti v zásade z ľudskej protilátky (akceptorová protilátka) a u oblasti určujúcej komplementaritu z myšej protilátky (donorový imunoglobulín) (pozri Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10033 (1989) a WO 90/07 861, US 5 693 762, US 5 693 761, US 5 585 089, US 5 530 101 a Winter, US 5 225 539 (zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely)). Konštantná oblasť alebo oblasti, pokiaľ sú prítomné, pochádzajú od hlavne alebo úplne ľudského imunoglobulínu. Ľudské variabilné domény sú vyberané z ľudských protilátok, ktorých základná štruktúra vykazuje vysoký stupeň zhody v sekvencii s doménami myšej variabilnej oblasti, z ktorej pochádzajú CDRs. Sekvencie variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca môžu byť odvodené zo sekvencií rovnakej alebo odlišnej ľudskej protilátky. Sekvencie ľudskej protilátky môžu byť sekvenciami prirodzene sa vyskytujúcich ľudských protilátok alebo môžu byť konsenzom sekvencií viacerých ľudských protilátok (pozri Carter a kol., WO 92/22 653). Určité aminokyseliny z ľudskej variabilnej oblasti sú nahradené, čo pramení z ich možného vplyvu na konformáciu CDR a/alebo na väzbu antigénu. Skúmanie týchto možných vplyvov sa uskutočňuje modelovaním, skúmaním vlastností aminokyselín na určitom mieste alebo empirickým pozorovaním účinkov náhrady alebo mutagenézie určitej aminokyseliny.

Keď sa napríklad jedna aminokyselina vo variabilnej oblasti myšej a ľudskej protilátky líši, ľudská aminokyselina by sa mala vymeniť za ekvivalentnú aminokyselinu z myšej protilátky v prípadoch, keď je dôvod očakávať, že aminokyselina:

(1) viaže priamo nekovalentne antigén, (2) nachádza sa neďaleko od CDR oblasti, (3) iným spôsobom interaguje s CDR oblasťou (vyskytuje sa vo vzdialenosti okolo 6 A od CDR oblasti) alebo (4) sa podieľa na vzájomnom vzťahu VL-VH.

Ďalšími kandidátmi na nahradenie sú akceptorové aminokyseliny, ktoré sú v tejto pozícii pre ľudský imunoglobulín neobvyklé. Tieto aminokyseliny môžu byť nahradené aminokyselinami zo zodpovedajúcej pozície myšej donorovej protilátky alebo aminokyselinami zo zodpovedajúcej pozície typickejšej ľudskej protilátky. Štruktúra variabilnej oblasti humanizovaných imunoglobulínov vykazuje obvykle 85 % sekvenčnú zhodu so sekvenciou ľudskej variabilnej oblasti alebo konsenzom takýchto sekvencií.

d. Ľudské protilátky

Ľudské protilátky proti Αβ sa získavajú rôznymi technikami (pozri nižšie). Niektoré ľudské protilátky sa vyberajú v pokusoch s kompetičnou väzbou alebo použitím rovnakej epitopovej špecifity ako určitá myšia protilátka (pozri príklad 5). Ľudské protilátky môžu byť tiež na určitú epitopovú špecifitu testované s použitím fragmentu Αβ ako imunogénu a/alebo určením väzby protilátky na rad mutantov Αβ s deléciou.

(1) Metodika triómu

Základný postup a príkladný partner pre používanú bunkovú fúziu (SPAZ-4) je opísaný v Oestberg a kol., Hybridoma 2: 361 - 367 (1983); Oestberg patent US 4 634 664; a v Engleman a kol., patent US 4 634 666

SK 288207 Β6 (každý z nich je tu zahrnutý podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely). Bunkové línie tvoriace protilátky, ktoré sa môžu získať týmto spôsobom, sa nazývajú triómy; pochádzajú totiž z troch bunkových typov - dvoch ľudských a jedného myšieho. Základom je fúzia buniek myšieho myelómu s ľudským B-lymfocytom, čím vzniká protilátky netvoriaca xenogénna hybridná bunková línia (napríklad SPAZ-4 opísaná Oestberg a kol., pozri vyššie). Xenogénna bunka je potom fuzovaná s imunizovaným ľudským B-lymfocytom, čím vzniká protilátky tvoriaca triómová bunková línia. Bolo zistené, že triómy tvoria protilátky stabilnejšie ako obyčajné hybridómy pripravené z ľudských buniek.

Imunizované B-lymfocyty sa získavajú z krvi, sleziny, lymfatických uzlín a kostnej drene ľudského darcu. Ak sú potrebné protilátky proti špecifickým antigénom alebo epitopu, potom je vhodné použiť tento antigén alebo jeho epitop na imunizáciu. Imunizácia môže prebiehať buď in vivo alebo in vitro. Na in vivo imunizáciu sa najčastejšie používajú B-bunky izolované z ľudí imunizovaných Αβ, jeho fragmentom, väčším polypeptidom s obsahom Αβ alebo jeho fragmentu, alebo antiidiotypickými protilátkami proti Αβ. V niektorých spôsoboch sa používajú B-bunky izolované z rovnakého pacienta, ktorý sa má liečiť podávaním protilátok. Na in vitro imunizáciu sú B-lymfocyty vystavené počas 7 až 14 dní antigénu, v médiu (napríklad RPMI-1640) doplnenom 10 % ľudskou plazmou (Engleman, pozri vyššie).

Imunizované B-lymfocyty sú pomocou známych spôsobov fúzované so xenogénnou hybridnou bunkou (napríklad SPAZ-4). Bunky sú vystavené pôsobeniu 40 % až 50 % polyetylénglykolu (m. v. 1000 až 4000), pri 37 °C počas 5 až 10 minút. Bunky sú oddelené od fuznej zmesi a rozmnožené v médiu vhodnom pre dané hybridy (napríklad HAT alebo AH). Klony, ktoré vylučujú protilátky s požadovanou špecifitou sú určené analýzou kultivačného média triómov. Triómy tvoriace protilátky s požadovanou špecifitou sú ďalej namnožené technikou limitného riedenia a pestovania v in vitro kultúre. U získaných triómových buniek sa ďalej testuje schopnosť viazať Αβ alebo jeho fragment.

Aj keď sú triómy geneticky stabilné, nevytvárajú protilátky vo veľkom množstve. Úroveň expresie sa môže zvýšiť zaklonovaním génu protilátky z triómu do jedného alebo viacerých expresných vektorov a transformovaním vektora do štandardných cicavčích, bakteriálnych alebo kvasinkových bunkových línií, pomocou dobre známych spôsobov v odbore.

(2) Transgénne cicavce

Ľudské protilátky proti Αβ môžu byť tvorené aj v transgénnych cicavcoch, ktoré majú zabudovanú v genóme najmenej časť lokusu ludského imunoglobulínu. Endogénny imunoglobulínový lokus takého zvieraťa je obvykle funkčne inaktivovaný. Časť ludského lokusu zahŕňa najlepšie neusporiadané sekvencie kódujúce časti ľahkého a ťažkého reťazca. Inaktivácia endogénneho génu pre imunoglobulín a zavedenie exogénneho imunoglobulínového génu sa môže uskutočniť cielenou homológnou rekombináciou alebo zavedením YAC chromozómov. Transgénne cicavce, ktorí takto vznikli, sú schopné funkčne usporiadať sekvencie imunoglobulínových zložiek a exprimovať rad protilátok rôznych izotypov, ktoré sú kódované ľudskými imunoglobulínovými génmi bez toho, že by prebiehala expresia endogénnych imunoglobulínových génov. Príprava a charakteristika cicavcov s týmito vlastnosťami sú podrobne opísané napríklad v Lonberg a kol., WO 93/12227 (1993); US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318, US 5 789 650, US 5 770 429, US 5 661 016, US 5 663 425, US 5 625 126, US 5 569 825, US 5 545 806, Náture 148: 1547 - 1553 (1994), Náture Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (každý z nich je zahrnutý podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely). Transgénne myši sú na tieto účely predovšetkým výhodné. Protilátky proti Αβ sa získavajú imunizáciou transgénnych cicavcov (Longberg alebo Kucherlapati, pozri vyššie) Αβ alebo jeho fragmentom. Monoklonálne protilátky sa pripravujú napríklad fúziou B-buniek z týchto cicavcov s vhodnou myelómovou bunkovou líniou, a to s použitím bežnej techniky (Kohler-Milstein). Ľudské polyklonálne protilátky sa môžu vo forme sér získať tiež z ľudí imunizovaných imunogénnym činidlom. Tieto polyklonálne protilátky môžu byť koncentrované pomocou afmitného prečistenia s použitím Αβ alebo iného imunogénneho amyloidného peptidu ako afinitné činidlá.

(3) Spôsoby fágového vystavovania

Ďalším spôsobom získania ľudských protilátok proti Αβ je prehľadávanie DNA knižníc z ľudských B-buniek spôsobmi vo všeobecnosti vymedzenými v Huse a kol., Science 246: 1275 - 1281 (1989). B-bunky sa môžu rovnako ako v prípade triómov získať z ľudí imunizovaných A15, jeho fragmentom, väčším polypeptidom s obsahom Αβ alebo jeho fragmentu, alebo antiidiotypickými protilátkami proti Αβ. V niektorých spôsoboch sa používajú B-bunky izolované z rovnakého pacienta, ktorý sa má liečiť podávaním protilátok. Vybrané sú protilátky, ktoré sa viažu na epitop sledovanej amyloidnej zložky (napríklad Αβ alebo jeho fragment). Sekvencie kódujúce tieto protilátky alebo protilátky viažuce jeho fragment sú potom klonované a namnožené. Protokol opísaný Huseom sa stáva účinnejším v kombinácii s technológiou fágového vystavovania (pozri napríklad Dower a kol., WO 91/17 271 a McCafferty a kol., WO 92/01 047, US 5 877 218, US 5 871 907, US 5 858 657, US 5 837 242, US 5 733 743 a US 5 565 332) (každý z nich je zahrnutý podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely). Tieto spôsoby opisujú tvorbu fágových knižníc, kde členy vystavujú na

SK 288207 Β6 svojom povrchu rôzne protilátky. Protilátky sú obvykle vystavované ako fragmenty Fv alebo Fab. Protilátky s požadovanou špecifitou vystavované fágmi sú získané afinitným prečistením, s použitím Αβ alebo iného imunogénneho amyloidného peptidu ako afmitného činidla.

Obmenou spôsobu fágového vystavovania môžu byť získané ľudské protilátky vykazujúce rovnakú väzbovú špecifitu, ako má vybraná myšia protilátka (pozri Winter, WO 92/20 791). Ako východiskový materiál je v tomto prípade použitá variabilná oblasť ľahkého reťazca alebo ťažkého reťazca vybranej myšej protilátky. Ak je ako východiskový materiál zvolená napríklad variabilná oblasť ľahkého reťazca, potom je fágová knižnica konštruovaná tak, aby jej členovia vystavovali rovnakú variabilnú oblasť ľahkého reťazca a odlišnú variabilnú oblasť ťažkého reťazca. Variabilné oblasti ťažkého reťazca sú získané z knižnice, ktorá obsahuje usporiadané variabilné oblasti ľudského ťažkého reťazca. Vybraný je fág, ktorý vykazuje silnú špecifickú väzbu k sledovanej zložke (napríklad najmenej 10⁸ a najlepšie 10⁹ M'¹). Variabilné oblasti ľudského ťažkého reťazca tohto fágu slúžia ako východiskový materiál na konštrukciu ďalšej fágovej knižnice. V tejto knižnici vystavuje každý fág rovnakú variabilnú oblasť ťažkého reťazca (t. j. oblasť identifikovanú v prvej fágovej knižnici) a odlišnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca. Variabilné oblasti ľahkého reťazca sú získané z knižnice, ktorá obsahuje usporiadané variabilné oblasti ľudského ľahkého reťazca. Opäť je vybraný fág vykazujúci silnú špecifickú väzbu so zvolenou zložkou amyloidného peptidu. Tieto fágy vystavujú variabilné oblasti ľudských protilátok špecifických pre amyloidný peptid. Tieto protilátky majú obvykle rovnakú epitopovú špecifitu ako myšie protilátky, ktoré boli použité ako východiskový materiál.

e. Výber konštantnej oblasti

Variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca chimérnych, humanizovaných alebo ľudských protilátok môžu byť pripojené aspoň k časti ľudskej konštantnej oblasti. Výber konštantnej oblasti záleží čiastočne na tom, či je žiadaná aktivácia komplementu alebo bunkovo sprostredkovanej toxicity (alebo obidvoch súčasne), ktorá závisí na aktivácii protilátkou. Napríklad izotypy IgG 1 a IgG3 komplement aktivujú, izotypy IgG2 a IgG4 túto schopnosť nemajú. Výber izotypu môže často ovplyvniť prechod protilátky do mozgu. Konštantné oblasti ľahkého reťazca môžu byť lambda alebo kappa. Protilátky môžu byť exprimované ako tetraméry, ktoré obsahujú dva ľahké a dva ťažké reťazce, ako samotné ťažké reťazce, ako samotné ľahké reťazce, ako Fab, Fab', F(ab')2 a Fv alebo ako jednoreťazcové protilátky, v ktorých sú variabilné domény ľahkého a ťažkého reťazca spojené medzerníkom (spacer).

f. Expresia rekombinantných protilátok

Chimérické, humanizované a ľudské protilátky sú najčastejšie vytvárané s použitím rekombinantnej expresie. Rekombinantné polynukleotidové konštrukty typicky obsahujú sekvenciu riadiacu expresiu, spojenú so sekvenciou kódujúcou reťazce protilátky, ktoré zahŕňajú prirodzene spojené alebo heterológne promótorové oblasti. Sekvencie riadiace expresiu sú najlepšie eukaryotné promótorové systémy, ktoré sú vo vektoroch schopné transformovať alebo transfektovať eukaryotickú bunku. Akonáhle je vektor zabudovaný do príslušného hostiteľa, je hostiteľ udržiavaný v podmienkach optimálnych pre vysokú úroveň expresie nukleotidových sekvencií a na odber a čistenie krížovo reagujúcich protilátok.

Tieto expresné vektory sa najčastejšie v hostiteľskom organizme replikujú ako epizómy alebo ako integrálna (integrovaná) časť hostiteľskej chromozomálnej DNA. Expresné vektory bežne obsahujú selekčné značky, napríklad odolnosť proti ampicilínu alebo hydromycínu, ktoré umožňujú identifikáciu tých buniek, ktoré boli transformované požadovanými sekvenciami DNA.

E. coli je prokaryotický hostiteľ, ktorý je na klonovanie DNA sekvenciou z predkladaného vynálezu predovšetkým vhodný. Mikroorganizmy, napríklad kvasinky, sú na takú expresiu tiež užitočné. Uprednostňovaným kvasinkovým hostiteľom s vhodnými vektormi, ktoré obsahujú sekvenciu riadiacu expresiu, sekvenciu na začatie replikácie, terminačnú sekvenciu atď., je Saccharomyces. Typické promótory zahŕňajú 3-fosfoglycerát kinázu a ďalšie enzýmy glykolýzy. Indukovatelné kvasinkové promótory zahŕňajú okrem inéhopromótory z alkoholdehydrogenázy, izocytochrómu C a enzýmy zodpovedné za odbúravanie maltózy a galaktózy.

Cicavčie bunky sa prednostne používajú na expresiu nukleotidových sekvencií kódujúcich imunoglobulíny alebo ich fragmenty (pozri Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y, 1987). V tomto odbore bolo vyvinutých veľa použiteľných bunkových línií, schopných vylučovať intaktné heterológne proteíny. Medzi tieto línie patria CHO bunkové línie, rôzne COS bunkové línie, HeLa bunky, L-bunky a myelómové bunkové línie. Expresné vektory pre tieto bunky môžu obsahovať sekvencie riadiace expresiu (napríklad replikačný počiatok), promótor, zosilňovač (enhancer) a miesta nevyhnutné na spracovanie informácií, medzi ktoré patria miesta pre väzbu ribozómu, miesta, kde dochádza k zostrihu RNA, polyadenylačné miesta a sekvencie na termináciu transkripcie. Najčastejšie používané sekvencie riadiace expresiu sú promótory odvodené od endogénnych génov cytomegalovírusu, SV40, adenovírusu, hovädzieho papilomavírusu atď. (pozri Co a kol., J. Immunol. 148: 1149, 1992).

Sekvencie kódujúce protilátky môžu byť vo forme transgénov vstavané tiež do genómu transgénneho zvieraťa, a potom získané z mlieka (napríklad podľa spôsobov opísaných v US 5 741 957, US 5 304 489,

US 5 849 992, všetky tu zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti). Medzi vhodné transgény patrí sekvencia kódujúca ľahké alebo ťažké reťazce (alebo obidva reťazce súčasne) vo funkčnom spojení s promótorom a zosilňovačom, pochádzajúcimi z génu špecifického pre mliečnu žľazu (napríklad kazeín alebo β-laktoglobulín).

Vektory, ktoré obsahujú potrebné časti DNA, sa môžu dobre známymi spôsobmi (záleží na type hostiteľskej bunky) vložiť do hostiteľskej bunky. U prokaryotických buniek sa napríklad používa transfekcia pomocou chloridu vápenatého, zatiaľ čo transfekcia do iných typov buniek využíva pôsobenie fosforečnanu vápenatého, elektroporáciu, lipofekciu a transfekciu pomocou biolistiky alebo vírusu. Ďalšie spôsoby transfekcie buniek používajú polybrén, fúziu protoplastov, lipozómy elektroporáciu a mikroinjekcie (vo všeobecnosti pozri Sambrook a kol., vyššie). Na tvorbu transgénnych zvierat sa môžu transgény mikroinjektovať do oplodnených oocytov alebo môžu byť zabudované do genómu embryonálnych kmeňových buniek a jadrá týchto buniek sa môžu preniesť do enukleovaných oocytov.

Vytvorené protilátky sa môžu očistiť podľa štandardných spôsobov, medzi ktoré patrí HPLC, stĺpcová chromatografia, gélová elektroforéza atď. (vo všeobecnosti Scopes, Proteín Purification, Springer-Verlag, N. Y, 1982).

4. Ďalšie liečebné činidlá

Liečebné činidlá používané v opisovaných spôsoboch zahŕňajú tiež T-bunky, ktoré sa viažu na plakovú zložku (napríklad peptid Αβ). T-bunky môžu byť proti peptidu Αβ aktivované napríklad expresiou génu ľudského MHC triedy I a génu ľudského β2-mikroglobulínu v hmyzej bunkovej línii, čím sa na ich povrchu vytvorí komplex, ktorý sa môže viazať s peptidom Αβ. T-bunky, ktoré sa dostanú do kontaktu s touto bunkovou líniou, sa aktivujú špecificky proti tomuto peptidu (pozri Peterson a kol., US 5 314 813). Hmyzie bunkové línie exprimujúce antigén MHC triedy II sa môžu podobne použiť na aktiváciu CD4 T-buniek.

5. Nosné proteíny

Niektoré činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď obsahujú príslušný epitop, ktorý vyvoláva imunitnú odpoveď proti amyloidným usadeninám, ale sú príliš malé na to, aby boli imunogénne. V tejto situácii môže byť peptidový imunogén spojený s vhodným nosičom, ktorý pomáha vyvolať imunitnú odpoveď. Vhodné nosiče zahŕňajú sérové albumíny, hemocyanín z Diodora aspera, molekuly imunoglobulínu, tyroglobulín, ovalbumín, toxoid tetánu alebo toxoid z inej patogénnej baktérie napríklad diftérie, E. coli, cholera alebo H. pylori alebo oslabený derivát toxínu. Ďalšie nosiče zahŕňajú epitopy T-buniek, ktoré sa viažu na mnohé alely MHC (napríklad najmenej na 75 % všetkých ľudských MHC aliel). Také nosiče sú niekedy v odbore nazývané ako univerzálne epitopy T-buniek. Príklady univerzálnych epitopov T-buniek zahŕňajú:

Chrípkový hemaglutinín: HA₃₀₇.₃i₉PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1),

PADRE: AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2),

Maláriu CS: T3 epitop: EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3),

Povrchový antigén hepatitídy B: HBsAg₁₉.2₈FFLĽTRILTI (SEQ ID NO: 4),

Proteín tepelného šoku 65: hsp65₁₅₃.₁₇₁DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 5),

Bacillus Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO: 6),

Toxoid tetánu: TT₈₃₀.₈₄₄QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7),

Toxoid tetánu: TT₉₄₇.₉₆₇FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ IDNO: 8),

HIV gpl 20 TI: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 9).

Ďalšie nosiče, ktoré stimulujú alebo zosilňujú imunitnú odpoveď, zahŕňajú cytokíny ako IL-1, IL-Ία a β peptidy IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF a chemokíny ako MIP1 a a β a RANTES. Imunogénne činidlá môžu byť spojené tiež s peptidmi, ktoré zvyšujú transport cez tkanivá (pozri O'Mahony, WO 97/17 613 a WO 97/17 614).

Imunogénne činidlá môžu byť napojené na nosiče pomocou chemického spájania. Techniky napojenia imunogénu na nosič zahŕňajú tvorbu disulfidových mostíkov s použitím N-sukcínimidyl-3-(2-pyridyltio) propionátu (SPDP) a sukcínimidyl 4-(N-maleimidometyl) cyklohexán-l-karboxylátu (SMCC) (keď peptidu chýba sulfhydrylová skupina, môže sa mu poskytnúť pridaním cysteínového zvyšku). Tieto látky tvoria disulfidové mostíky medzi sebou a peptidovým cysteínom na jednom proteíne a amidové spojenie cez eta-aminoskupinu lyzínu alebo voľnú aminoskupinu inej aminokyseliny. Rôzne také činidlá, ktoré tvoria disulfidové a amidové spojenia, sú opísané v Immun. Rev. 62, 185 (1982). Iné bifúnkčné spájanie činidlá tvoria skôr ako disulfidové spojenia spojenia tioéterové. Veľa z týchto činidiel tvoriacich tioéterové spojenia sú komerčne dostupné a zahŕňajú reaktívne estery kyseliny 6-maleimidokaprovej, kyseliny brómoctovej, kyseliny 2-jódocotvej a kyseliny 4-(N-maleimidometyl) cyklohexán-1-karboxylovej. Karboxylové skupiny môžu byť aktivované skombinovaním so sukcínimidom alebo so sodnou soľou kyseliny l-hydroxyl-2-nitro-4-sírovej.

Imunogénne peptidy môžu byť exprimované tiež ako proteíny fúzované s nosičmi (t. j. heterológne peptidy). Imunogénny peptid môže byť napojený cez svoj amínový koniec, karboxylový koniec alebo obidvomi koncami na nosič. Imunogénny peptid sa môže vo fúznom proteíne vyskytovať vo viacerých kópiách. Imunogénny peptid môže byť tiež napojený na viacero kópií heterológneho peptidu, napríklad svojím C-koncom aj N-koncom. Niektoré nosné proteíny slúžia na vyvolanie odpovedí pomocných T-buniek proti sebe samým. Aktivované pomocné T-bunky potom obratom vyvolávajú odpoveď B-buniek proti imunogénnemu peptidu pripojenému k nosnému peptidu.

Niektoré činidlá podľa tohto vynálezu obsahujú fúzny proteín, v ktorom je N-koncový fragment Αβ napojený svojím C-koncom k nosnému peptidu. N-koncový zvyšok fúzneho proteínu je v týchto činidlách tvorený N-koncovým zvyškom fragmentu Αβ. Takéto fúzne proteíny účinne pôsobia pri vyvolávaní protilátok, ktoré vyžadujú, aby bol epitop v N-koncovom zvyšku vo voľnej forme. Niektoré z vynájdených činidiel obsahujú v molekule viackrát opakovane N-koncové časti Αβ, ktoré sú svojím C-koncom napojené na jednu kópiu alebo viacero kópií nosného peptidu. N-koncový fragment Αβ, zabudovaný v týchto fuznych proteínoch, začína niekedy v Αβ1-3 a končí v Αβ7-11. Uprednostňovanými fragmentárni Αβ sú Αβ1-7, Αβ1-3, Αβ1-4, Αβ1-5 a Αβ3-7. Niektoré fúzne proteíny obsahujú rôzne N-koncové časti Αβ za sebou. Fúzny proteín môže obsahovať napríklad Αβ1-7 nasledovaný heterológnym peptidom.

V niektorých fuznych proteínoch je N-koncová časť Αβ fúzovaná svojím koncom s heterológnym nosným peptidom. Rovnako rôzne N-koncové fragmenty sa môžu použiť aj na fúzie s C-koncom. Niektoré fúzne proteíny obsahujú heterológny peptid napojený na N-koniec N-koncovej časti Αβ, ktorá je ďalej napojená na jednu N-koncovú časť alebo viacero ďalších N-koncových častí Αβ za sebou.

Niektoré príklady fúznych proteínov vhodných na použitie v tomto vynáleze sú ukázané nižšie. Niektoré z týchto fúznych proteínov obsahujú časti Αβ spojené s epitopmi toxoidu tetánu (pozri US 5 196 512, EP 378 881 a EP 427 347). Niektoré fúzne proteíny obsahujú časti Αβ napojené na nosné peptidy opísané v US 5 736 142. Niektoré heterológne peptidy predstavujú pre T-bunky univerzálne epitopy. V niektorých spôsoboch je činidlo určené na podanie len jednoduchý fuzny proteín s časťou Αβ spojenou s časťou heterológnou v lineárnej konfigurácii. V niektorých spôsoboch je činidlom multimér zložený z fuznych proteínov opísaných vzorcom 2^X, kde X znamená číslo od 1 do 5. X je prednostne 1, 2 alebo 3, pričom 2 sa uprednostňuje najviac. Keď x je 2, obsahuje multimér 4 fúzne páry spojené do konfigurácie známej ako MAP4 (pozri US 5 299 490). Epitopy Αβ sú podčiarknuté.

Konfigurácia MAP4 je zobrazená nižšie. Vetvené štruktúry vznikajú začatím syntézy peptidu ako v N-koncovom amíne lyzínu, tak aj v amíne bočného reťazca lyzínovej molekuly. Na tom, koľkokrát je lyzín v sekvencii zabudovaný a môže sa vetviť, závisí konečné množstvo vzniknutých N-koncov. V tomto prípade vznikajú z rozvetveného lyzínu v jadre molekuly štyri identické N-konce. Táto mnohopočetnosť výrazne zvyšuje schopnosť odozvy B-buniek.

Peptid

Peptid

Peptid

Peptid

AN90549 (ΑβΙ-7/toxoid tetánu 830 - 844 v konfigurácii MAP4): DAEFRHDQYIKÄNSKFIGITEL (SEQ IDNO: 10)

AN90550 (ΑβΙ-7/toxoid tetánu 947 - 967 v konfigurácii MAP4): DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 11)

AN90542 (ΑβΙ-7/toxoid tetánu 830 - 844 + 947 - 967 v lineárnej konfigurácii):

DAEFRHDQY1KANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ IDNO: 12)

AN90576 (Aβ3-9/toxoid tetánu 830 - 844 v konfigurácii MAP4:

EFRHDSGQY1KANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 13)

Peptidy opísané v US 5 736 142 (všetky v lineárnych konfiguráciách:

AN90562 (ΑβΙ-7/peptid):

AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID N: 14)

AN90543 (Αβ1-7 x 3/peptid):

DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15)

Ďalšie príklady fúznych proteínov (imunogénny epitop Αβ je zvýraznený) zahŕňajú:

SK 288207 Β6

AKXVAAWTLKAAADAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRIID (SEQ ID

NO: 16)

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17)

DAEFRHD-ISQAYHAAHAEtNEAGR (SEQIDNO: 18)

FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQIDNO: 19)

EFRHDSC-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ IDNO: 20)

PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID

NO: 21)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQID

NO: 23)

DAEFRHDDAEFRIID-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 24) DAEFRUD-PKYVKQNTLKLAT-EKIÍIAKMEKASSVFNVQYKANSKFlGITEL-FNNFrVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD DAEFRHD-DAEFRIIDDAEFRHD-QY1KANSKFIGITEL·

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQID

NO: 25)

DAEFRHD-QYKANSKFlGrrELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ IDNO: 26)

DAEFRHD-QY1K.\NSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPRVSASHLEDAEFRHD (SEQ IDNO: 27)

DASFRHD-QYIKA.VSKFTGTTEL (SEQ ID NDs 28) naživici s dvomi vetvami peptid

Lys-Gly-Cys peptid

EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (fuzny protein synukleínu v konfigurácii MAP-4; SEQ ID NO: 29).

Rovnaké alebo podobné nosné proteíny a spôsoby ich spojenia sa môžu použiť na tvorbu imunogénov, určených na stimuláciu protilátok proti Αβ pri pasívnej imunizácii. Napríklad Αβ alebo jeho fragment napojený na nosič sa môžu podávať laboratórnym zvieratám, ktoré následne tvoria monoklonálne protilátky proti Αβ.

6. Nukleové kyseliny kódujúce liečebné činidlá

Imunitná odpoveď proti amyloidným usadeninám môže byť vyvolaná tiež podaním nukleových kyselín kódujúcich vybrané peptidové imunogény alebo protilátky a ich reťazce, ktoré sa používajú pri pasívnej imunizácii. Také nukleové kyseliny môžu byť DNA alebo RNA. Časť nukleovej kyseliny kódujúca imunogén je typicky napojená na regulačné prvky (napríklad promótor alebo zosilňovač), ktoré umožňujú expresiu časti DNA vo zvolených cieľových bunkách pacienta. Na expresiu, ktorá je žiadúca na vyvolanie imunitnej odpovede, je vhodné použiť promótor a zosilňovač z génov pre ľahký alebo ťažký reťazec imunoglobulínu alebo hlavný promótor a zosilňovač skorých génov u CMV. Spojené regulačné prvky a kódujúce sekvencie sú často vložené do vektora. Pri podávaní dvojreťazcových protilátok sa môžu dva reťazce vložiť do jedného vektora alebo viacerých oddelených vektorov.

K dispozícii je množstvo vírusových vektorov, medzi ktoré patria retrovírusové vektory (pozri napríklad Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102 - 109, 1993), adenovírusové vektory (pozri napríklad Bett a kol., J. Virol. 67, 5911, 1993), vírusové vektory spojené s adenovírusmi (pozri napríklad Zhou a kol., J. Exp. Med. 179, 1867, 1994), vírusové vektory z rodiny poxvírusov, ako je napríklad vírus vakcínie a vtáčie poxvírusy, vírusové vektory z rodu a vírusov, napríklad vektory odvodené od vírusu Sindibis a vírusu SFV (Semliki forest vírus) (pozri napríklad Dubensky a kol., J. Virol. 70, 508 - 519, 1996), od vírusu venezuelskej konskej encefalitídy (pozri US 5 643 576) a vírusové vektory z rabdovírusov (napríklad vírus vezikulárnej stomatídy, pozri WO 96/34 625) a z papilomavírusov (Ohe a kol., Human Gene Therapy 6, 325 - 333, 1995; Woo a kol., WO 94/12 629 a Xiao & Brandsama, Nucleic Acids. Res. 24, 2630 - 2622).

DNA kódujúce imunogén alebo vektor s touto DNA môžu byť zabalené do lipozómov. Vhodné lipidy a príbuzné analógy sú opísané patentmi US 5 208 036, 5 264 618, 5 279 833 a 5 283 185. Vektory a DNA kódujúce imunogén môžu byť tiež adsorbované alebo napojené na časticové nosiče (napríklad polyméry polymetylmetakrylátu a polylaktidy a poly(laktid-ko-glykozidy) (vo všeobecnosti pozri McGee a kol., J. Micro Encap., 1996).

Vektory pre génovú terapiu alebo samotná DNA môžu byť do pacienta dopravené in vivo s tým, že podanie je najčastejšie systemické (napríklad intravenózne, intramuskulárne, subdermálne alebo intrakraniálne infúzie) alebo lokálne (pozri napríklad US 5 399 346). Tieto vektory môžu ďalej obsahovať zosilňujúce činidlá, napríklad bupivakaín (US 5 593 970). DNA môže byť podávaná použitím génovej zbrane (pozri Xiao &

Brandsma, vyššie). DNA kódujúca imunogén je vyzrážaná na povrchu mikroskopických kovových guličiek. Mikroprojektily sú urýchlené tlakovou vlnou expandujúceho héliového plynu a prenikajú tkanivami do hĺbky niekoľkých bunkových vrstiev. Vhodný je napríklad prístroj The Accel™ Gene Delivery Device (Agrocetus, Inc., Middleton, WI). Holá DNA môže prechádzať kožou do krvného obehu jednoduchou aplikáciou na chemicky alebo mechanicky porušenú kožu (pozri WO 95/05 853).

Vektory kódujúce imunogény sa môžu do buniek dostať ex vivo, ako napríklad do buniek získaných z pacienta (napríklad lymfocyty, vzorky kostnej drene, vzorky tkaniva) alebo do univerzálnych darcovských krvotvomých kmeňových buniek. Nasledujúcim krokom je reimplantácia buniek do pacienta, ktorej predchádza obvykle výber buniek, ktoré prijali vektor.

7. Testovanie očisťovacej schopnosti protilátok

Príklad 7 opisuje spôsoby testovania účinnosti protilátok pri očisťovaní od amyloidných usadenín. S cieľom testovania účinnosti pri očisťovaní od amyloidných usadenín boli z pacientov alebo zvierat trpiacich amyloidózou odobraté vzorky tkaniva (napríklad mozgové tkanivo pri Alzheimerovej chorobe). Vzorky sú skontaktované s fagocytámymi bunkami nesúcimi Fc receptor (napríklad mikrogliálne bunky) a s testovanou protilátkou prítomnou v médiu in vitro. Fagocytárne bunky môžu byť primárnou kultúrou alebo bunkovou líniou (napríklad BV-2, C8-B4 alebo THP-1). Tieto zložky sú na zosilnenie mikroskopického pozorovania skombinované na mikroskopickom sklíčku, pričom veľa pararelných reakcií môže byť uskutočnených v jamkách mikrotitračnej doštičky. V tomto prípade môžu byť jednotlivé miniatúrne mikroskopické sklíčka upevnené do jednotlivých jamiek. Použiť sa môžu tiež iné spôsoby detekcie Αβ (napríklad ELISA). Najčastejšie sa uskutočňuje séria meraní množstva amyloidných usadenín v reakčnej zmesi in vitro, pričom bazálna hodnota znamená množstvo amyloidu v reakčnej zmesi pred začatím reakcie. Antigén môže byť detegovaný farbením (napríklad fluorescenčné označená protilátka proti Αβ alebo inej zložke amyloidného plaku). Protilátka používaná na farbenie môže ale nemusí byť tá istá protilátka, ktorá je testovaná. Znížené množstvo amyloidného plaku vzhľadom k bazálnej hodnote znamená, že testovaná protilátka má očisťovaciu schopnosť. Takého protilátky bývajú užitočné pri prevencii alebo liečbe Alzheimerovej choroby a ďalších amyloidogénnych ochorení. Ako už bolo opísané, pokusy uskutočňované na podporu predkladaného vynálezu a používajúce tieto analýzy odhalili, že protilátky proti NAC fragmentu synukleínu sú účinné pri očisťovaní od amyloidných plakov charakteristických pre Alzheimerovu chorobu.

D. Pacienti podrobujúci sa protiamyloidným liečebným režimom

Pacienti podrobujúci sa liečbe zahŕňajú jedincov s rizikom vzniku choroby, ktorí ešte nevykazujú symptómy choroby, rovnako ako pacienti, u ktorých amyloidóza už prepukla. V prípade Alzheimerovej choroby je potencionálnym budúcim zasiahnutým každý, kto žije dostatočne dlho. Predkladané spôsoby sa môžu teda používať v rámci profylaxie širokou populáciou bez toho, že by bolo nutné zisťovať riziko u jednotlivého pacienta. Predkladané spôsoby sú predovšetkým vhodné pre jedincov, ktorí sú dedične zviazaní s výskytom Alzheimerovej choroby alebo akejkoľvek geneticky danej amyloidnej poruchy. Medzi týchto jedincov patria tí, ktorí majú príbuzných trpiacich takou chorobou, alebo tí, ktorým bolo riziko vzniku choroby oznámené po analýze genetických alebo biochemických indikátorov. Genetické indikátory poukazujúce na možné riziko vzniku Alzheimerovej choroby zahŕňajú mutácie v géne APP, najmä však mutácie v pozícii 717 (Hardyho mutácie) a v pozíciách 670 a 671 (švédska mutácia) (pozri Hardy, TINS, vyššie). Ďalšími indikátormi sú mutácie v génoch presenilínu, PSI a PS2, ApoE4, rodinná história výskytu Alzheimerovej choroby, hypercholesterolémia alebo ateroskleróza. Jedinci, ktorí už Alzheimerovou chorobou trpia, môžu byť rozpoznaní ako podľa charakteristickej demencie, tak podľa prítomnosti opísaných rizikových faktorov. Existuje tiež množstvo diagnostických testov na identifikáciu jedincov s AD, medzi ktoré patrí meranie hladín CSF τ a Αβ42. Zvýšená hladina τ a nízka hladina Αβ znamená prítomnosť AD. Jedinci trpiaci Alzheimerovou chorobou môžu byť diagnostikovaní tiež pomocou kritérií MMSE alebo ADRDA, čo je diskutované v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

U asymptomatických pacientov môže liečba začať v akomkoľvek veku (napríklad 10, 20, 30). Liečba však nie je obvykle nutná, pokiaľ pacient nedosiahne 40, 50 alebo 70 rokov. Typická liečba znamená aplikáciu viacerých dávok počas časového obdobia. Liečba môže byť sledovaná analyzovaním protilátkových alebo T alebo B-bunkových odpovedí na liečebné činidlo (napríklad peptid Αβ) (pozri príklad 1 a 2). Ak odpoveď poklesne, aplikuje sa posilňovacia látka. V prípade rozvinutia Downovho syndrómu môže liečba začať pred narodením, a to podávaním liečebného činidla matke, alebo krátko po narodení.

Ďalšie formy amyloidóz často prebiehajú nediagnostikované, okrem prípadov, keď existuje zvláštne podozrenie pre vznik choroby. Jedným z prvých príznakov je výskyt srdcového alebo obličkového ochorenia u pacientov stredného a staršieho veku, pričom pacienti javia tiež príznaky účasti (ukladania plakov) v ďalších orgánoch. Nízke napätie alebo extrémne odchýlky osi EKG a zväčšené tkanivo srdcovej predsiene môžu byť známkami srdcovej poruchy. Proteinúria je symptómom účasti obličiek. Ak sa pri vyšetrení pacienta zistí hepatomegalia, existuje podozrenie účasti pečene. Periférna neuropatia sa obvykle pri určitých formách amylo24 idóz vyskytuje tiež, pričom autonómna neuropatia, ktorá je charakteristická posturálnou hypotenziou sa môže objaviť tiež. Každý jedinec s progresívnou neuropatiou neurčitého pôvodu by mal byť podozrievaný z výskytu amyloidózy. V prípadoch, keď je nutné, môže sa konečná diagnóza určiť zo vzoriek napadnutého orgánu alebo orgánov. Vzorky sú zafarbené farbou Congo Red, pričom pozitívne vzorky vykazujú v polarizovanom svetle dvoj lom jablko vozelenej farby.

E. Liečebné režimy

Pri profylaktickom použití sa môžu farmaceutické prostriedky alebo lieky podávať pacientovi, ktorý je náchylný na vznik určitej choroby, alebo tu existuje iné riziko pre jej vznik, a to v množstve, ktoré je dostatočné na odstránenie alebo zníženie rizika vzniku ochorenia alebo jeho oddialenie. Pri terapeutickom použití sú liečebné prostriedky alebo lieky podávané pacientovi, u ktorého je podozrenie na výskyt ochorenia alebo ním už trpí, a to v množstve dostatočnom na vyliečenie alebo aspoň na čiastočné potlačenie symptómov choroby a s chorobou spojených komplikácií. Množstvo dostatočné na splnenie práve uvedeného sa nazýva ako terapeuticky alebo farmaceutický účinná dávka. Ako na profylaktické, tak na terapeutické účely sú činidlá obvykle podávané vo viacerých dávkach, a to tak dlho, pokiaľ sa nedosiahne dostatočná imunitná odpoveď. Imunitná odpoveď sa sleduje, a keď začína imunitná odpoveď klesať, sú podávané ďalšie dávky.

Účinné dávky prostriedkov podľa predkladaného vynálezu, určené na liečbu opísaných stavov, sú závislé na mnohých rôznych faktoroch, medzi ktoré patria spôsoby podania, cieľové miesto, fyziologický stav pacienta a to, či je pacientom zviera alebo človek, ďalšie podávané lieky a to, či aplikácia prebieha s cieľom profylaxie alebo terapie. Pacientom je obvykle človek alebo pri niektorých chorobách (napríklad s priónmi spojená choroba šialených kráv) môže byť pacientom iný cicavec ako človek, napríklad hovädzí dobytok. Liečebné dávky je kvôli optimalizácii bezpečnosti a účinku nutné titrovať. Množstvo imunogénu záleží na tom, či sa podáva tiež adjuvant, pričom väčšie dávky sú vo všeobecnosti potrebné pri neúčasti adjuvantu. V závislosti na imunogenicite príslušného imunogénu sa množstvo imunogénu na podanie môže pohybovať od 1 pg do 500 pg na pacienta a od 5 pg do 500 pg na injekciu určenú ľudského pacientovi. Občas sa používajú vyššie dávky, t. j. 0,5 až 5 mg na injekciu. Na injekciu určenú ľudskému pacientovi sa používajú dávky najmenej okolo 10, 20, 50 alebo 100 pg. Čas aplikácie sa môže významne líšiť, a to od frekvencie jedenkrát denne až po frekvenciu jedenkrát ročne alebo až jedenkrát za desať rokov, akokoľvek sú kvôli svojej úspešnosti uprednostňované posilňovacie dávky imunogénu. Podľa uvedených postupov sa môžu účinné dávky sledovať analýzou vzoriek tekutiny z pacienta (najčastejšie vzorky krvného séra) a určením protilátkového titra proti imunogénu, a to s použitím v odbore dobre známych spôsobov, ktoré sa môžu podľa konkrétneho antigénu ďalej prispôsobiť. Najvýhodnejšie je získanie vzorky tkaniva ešte pred aplikáciou prvej dávky, pričom ďalšie vzorky sa potom odoberajú a titrujú po každej imunizácii. Žiadanou je dávka alebo dávkovacie, schémy, ktoré poskytujú titre najmenej štyrikrát vyššie, ako sú kontrolné hladiny alebo hladiny pozadia, pričom sérum je nariedené 1 : 100 a pozadie je definované buď vo vzťahu ku kontrolným vzorkám séra, alebo vo vzťahu k hodnote pozadia u ELISA testov. Podľa predkladaného vynálezu sú žiaduce titre najmenej 1 : 1000 alebo 1 : 5000.

V ktorýkoľvek deň keď dochádza k podaniu imunogénu spolu s adjuvantom, je dávka väčšia ako 1 pg, a ešte lepšie vyššie ako 100 pg. Dávky jednotlivých imunogénov, zvolených v súlade s predkladaným vynálezom, sú určené štandardnými dávkovacími a titrovacími spôsobmi. Typický režim pozostáva z imunizácie nasledovanej v časových intervaloch (napríklad 6 týždňov) posilňovacími injekciami. Iný režim pozostáva z imunizácie nasledovanej posilňovacími injekciami po 1, 2 a 12 mesiacoch. Iný režim zahŕňa injekciu vždy po každých dvoch mesiacoch až do konca života. Posilňovacie injekcie môžu byť v závislosti na zistenom stave imunitnej odpovede podávané nepravidelne.

Pri pasívnej komunikácii s protilátkou majú dávky rozsah od asi 0,0001 do 100 mg/kg a ešte častejšie od 0,01 do 5 mg/kg, a to podľa hmotnosti pacienta. Dávky môžu byť napríklad 1 mg/kg telesnej hmotnosti alebo 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Ukážkový liečebný režim zahŕňa podávanie jedenkrát za dva týždne alebo jedenkrát za mesiac, alebo jedenkrát za tri až šesť mesiacov. Podľa niektorých spôsobov sú súčasne podávané dve monoklonálne protilátky alebo viacero monoklonálnych protilátok s rôznou väzbovou špecifitou, pričom dávky každej z nich sa pohybujú vo vymedzených hraniciach. Protilátka sa obvykle podáva viackrát. Intervaly medzi jednotlivými dávkami môžu byť týždenné, mesačné alebo ročné. Intervaly môžu byť aj nepravidelné, čo je určené meraním hladiny protilátky proti Αβ v krvi pacienta. Protilátka môže byť podávaná tiež vo forme prostriedku s postupným uvolňovaním, čo je prípad, v ktorom môže byť frekvencia aplikácií nižšia. Dávka a frekvencia sa líši v závislosti na polčase života protilátky v pacientovi. Najčastejšie vykazujú najdlhší polčas života ľudské protilátky nasledované humanizovanými protilátkami, chimerickými protilátkami a zvieracími protilátkami. Dávka a frekvencia podávania sa môže líšiť v závislosti na tom, či je liečba profylaktická alebo terapeutická. Pri profylaktickom použití sa v dlhom časovom intervale aplikujú relatívne nízke dávky s relatívne nízkou frekvenciou. Niektorí pacienti sú liečení počas celého zvyšku života. Pri terapeutickom použití sa aplikujú aj relatívne vysoké dávky v relatívne krátkych intervaloch, pretože niekedy sú nevyhnutné na pribrzdenie postupu choroby alebo jej zastavenie, alebo najlepšie na čiastočné alebo úplné vymiz25

SK 288207 Β6 nutie symptómov. Potom môže byť pacient liečený podľa profylaktického režimu.

Dávky nukleových kyselín kódujúcich imunogény sa pohybujú v rozsahu od asi 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 pg do 10 mg alebo 30 pg až 300 pg DNA na pacienta. Množstvá infekčných vírusových vektorov sa pohybujú v rozsahu od 10 do 100 alebo viac viriónov na dávku.

Činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď sa môžu na profylaktické alebo terapeutické použitie podať parenterálne, lokálne, intravenózne, orálnou cestou, subkutánne, intraperitoneáíne, intranazálne alebo intramuskulárne. Typické cesty podania imunogénneho činidla sú cesta intramuskuláma (i. m.), intravenózna (i. v.) alebo subkutánna (s. c.), avšak ostatné cesty môžu byť rovnako účinné. Intramuskuláma injekcia sa najčastejšie aplikuje do svalov ruky alebo nohy. Podľa niektorých spôsobov sa činidlá injektujú priamo do určitého tkaniva, v ktorom došlo k nahromadeniu usadenín (napríklad intrakraniálna infúzia). Intramuskuláme injekcie alebo intravenózne infúzie sú pri podávaní protilátky uprednostňované. Podľa niektorých spôsobov sú určité liečebné protilátky injektované priamo do lebky. Podľa niektorých spôsobov sa protilátky aplikujú ako prostriedky s postupným uvoľňovaním, pričom použiť sa môžu aj zariadenia konštruované na tieto účely (napríklad Medipad ^M).

Činidlá podľa tohto vynálezu sa môžu ľubovoľne podávať v kombinácii s ďalšími činidlami, ktoré sú pri liečbe amyloidogénnej choroby aspoň čiastočne účinné. V prípade Alzheimerovej choroby a Downovho syndrómu, u ktorých sú amyloidné usadeniny v mozgu, môžu sa činidlá podľa tohto vynálezu podávať v spojení s ďalšími činidlami, ktoré zosilňujú prienik činidiel podľa tohto vynálezu cez hematoencefalitickú bariéru. Liečebné koktaily obsahujúce imunogény pripravené tak, že sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti viacerým amyloidným zložkám ako jednej amyloidnej zložke, sú v predkladanom vynáleze zahrnuté tiež, pretože sú kombináciou protilátky zameranej proti jednej plakovej zložke a imunogénu, zameranému proti inej plakovej zložke.

Imunogénne činidlá podľa tohto vynálezu, napríklad peptidy, sa podávajú niekedy v kombinácii s adjuvantom. Na vyvolanie imunitnej odpovede sa môže v kombinácii s peptidom (napríklad Αβ) podávať množstvo adjuvantov. Najlepšie je, keď adjuvanty zosilňujú vnútornú odpoveď na imunogén bez toho, že by spôsobovali konformačné zmeny imunogénu, ktoré by zasiahli kvalitatívnu stránku odpovede. Medzi uprednostňované adjuvanty patria hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, 3 De-O-acetylovaný monofosforyllipid A (MPL™) (pozri GB 2 220 211; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, teraz súčasť Corixa). Stimulon™ QS-21 je triterpenový glykozid alebo saponín, izolovaný z kôry stromu Quillaja Saponaria Molina, ktorý sa nachádza v Južnej Amerike (pozri Kensil a kol., Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; eds. Powell & Newman, Plénum Press, N. Y, 1995; patent US 5 057 540, Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Ďalšími adjuvantami sú emulzie oleja a vody (napríklad skvalenový olej alebo olej z podzemnice olejnej) v ľubovoľnej kombinácii s imunostimulantmi, ako je monofosforyllipid A (pozri Stoute a kol., N. Engl. J. Med. 336, 86 - 91, 1997). Ďalším adjuvantom je CpG (WO 98/40 100). Αβ môže byť niekedy spojené s adjuvantom, pričom takéto spojenie by nemalo žiadnym spôsobom zásadne zmeniť konformáciu Αβ, t. j. nemalo by zmeniť povahu ním vyvolanej imunitnej odpovede. Adjuvanty sa môžu podávať ako zložky liečebného prostriedku spolu s účinným činidlom alebo sa môžu podávať samostatne, a to pred, spolu s alebo po podaní činidla.

Uprednostňovanou skupinou adjuvantov sú soli hliníka (alum), medzi ktoré patria hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a síran hlinitý. Tieto adjuvanty sa môžu použiť buď s imunostimulačnými činidlami alebo bez ďalších imunostimulačných činidiel, akými sú MPL alebo 3-DMP, QS-21, polymérne alebo monomérne aminokyseliny (napríklad kyselina polyglutámová, polylyzín). Ďalšia trieda adjuvantov obsahuje prostriedky na základe emulzie oleja a vody. Tieto adjuvanty sa môžu použiť so špecifickými imunostimulačnými činidlami alebo bez ďalších špecifických imunostimulačných činidiel, medzi ktoré patria muramylpeptidy (napríklad N-acetylmeramyl-L-treonyl-D-izoglutamín (thr-MDP), N-acetyl-normu-ramyl-L-alanyl-D-izoglutamín (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'-di-palmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), N-acetylglukaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid (DTP-DPP), theramide™ alebo iné zložky z bunkovej steny baktérií. Emulzie oleja a vody zahŕňajú (a) MF59 (WO 90/14837), ktorý obsahuje 5 % skvalénu, 0,5 % Tween 80 a 0,5 % Span 85 (voliteľne obsahujúci rôzne množstva MTP-PE), ktoré sú prítomné ako častice s veľkosťou menšou ako 1 pm, čo sa dosiahne pomocou mikrofluidizéru (napríklad model 110Y, Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, ktorý obsahuje 10 % skvalénu, 0,4 % Tween 80, 5 % pluronic-blocked polymér L121 a thr-MDP, ktoré sú upravené mikrofluidizérom tak, aby boli prítomné ako častice s veľkosťou menšou ako 1 pm alebo len premiešané na vortexe (špeciálne laboratórne zariadenie), čo viedlo k tvorbe emulzie s väčšími časticami, a (c) adjuvačný systém s Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), ktorý obsahuje 2 % skvalénu, 0,2 % Tween 80 a jednu zložku alebo viacero zložiek bakteriálnej bunkovej steny, ktorá zahŕňa monofosforyllipid A, dimykolát trehalózy (TDM) a kostru bunkovej steny (CWS), najlepšie však MPL + CWS (Detox™). Ďalšou triedou používaných adjuvantov sú saponínové adjuvanty, napríklad Stimulon™ (QS-21; Aquila, Framingham, MA) alebo z neho vytvorené častice, napríklad ISCOMs (imunostimulačné komplexy) a 1SCOMATRIX. Ďalšie adjuvanty zahŕňajú nekompletný Freundov adjuvant (IFA), cytokíny, napríklad interleukíny (IL-1, IL-2 a IL-12), faktor stimulujúci kolónie makrofágov (M-CSF) a faktor nádorovej nekrózy (TNF). Tieto adjuvanty sú bežne dostupné z komerčných zdrojov.

Adjuvanty sa môžu podávať spolu s imunogénom v jednom prostriedku alebo sa môžu podávať samostatne, a to pred, spolu s alebo podaní imunogénu. Imunogén a adjuvant môžu byť balené a dodávané v rovnakej fľaštičke s tým, že pred použitím budú premiešané. Imunogén a adjuvant sú balené so značkou udávajúcou predpokladané použitie prostriedku. Ak sú imunogén a adjuvant zabalené oddelene, tak balenie obsahuje pokyny na ich zmiešanie pred použitím. Voľba adjuvantu alebo nosiča (alebo obidvoch súčasne) záleží na takých faktoroch, akými sú stabilita prostriedku s obsahom adjuvantu, spôsob podania, dávkovacia schéma a účinnosť adjuvantu u živočíšnych druhov, ktorým sa podáva. U človeka je uprednostňovaným farmaceutický prijateľným adjuvantom látka, ktorá bola na podávanie schválená príslušným riadiacim orgánom. Príklady takýchto adjuvantov zahŕňajú alum, MPL a QS-21. Súčasne sa môžu použiť aj dva adjuvanty alebo viacero adjuvantov. Uprednostňované kombinácie zahŕňajú alum s MPL, alum s QS-21, MPL s QS-21 a alum, MPL a QS-21 spoločne. Použiť sa môže ako nekompletný Freundov adjuvant (Chang a kol., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173 - 186, 1998), prípadne v akejkoľvek kombinácii s alum, MPL a QS-21 alebo ich zmesou.

Činidlá podľa tohto vynálezu sú často podávané ako farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú účinné liečebné činidlo a rad ďalších farmaceutický prijateľných zložiek (pozri Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., 1995). Konečné zloženie závisí na predpokladanom spôsobe podania a na liečebnom určení. Prostriedky môžu v závislosti na predpokladanom zložení obsahovať tiež farmaceutický prijateľné netoxické nosiče a rozpúšťadlá, ktoré sa bežne používajú na prípravu farmaceutických prostriedkov, určených na podanie ľuďom alebo zvieratám. Rozpúšťadlo je vybrané tak, aby neovplyvnilo biologickú účinnosť zmesi. Príklady takýchto rozpúšťadiel sú destilovaná voda, fyziologický roztok solí pufrovaný fosfátom, Ringerove roztoky, roztok dextrózy a Hankov roztok. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať tiež ďalšie nosiče, adjuvanty alebo netoxické, neliečebné, neimunogénne stabilizátory atď.

Farmaceutické prostriedky môžu tiež obsahovať veľké, pomaly metabolizovateľné makromolekuly, medzi ktoré patria proteiny, polysacharidy (napríklad chitozán), polymliečne kyseliny, polyglykolové kyseliny a kopolyméry (napríklad sefaróza, agaróza, celulóza atď.), polyméme aminokyseliny, kopolyméry aminokyselín a lipidové agregáty (olejové kvapôčky alebo lipozómy). Tieto nosiče môžu fungovať tiež ako imunostimulačné činidlá (t. j. adjuvanty).

Pri parenterálnom podaní môžu byť činidlá podľa tohto vynálezu aplikované ako injektovateľné roztoky alebo suspenzie látky vo fyziologicky prijateľnom rozpúšťadle s farmaceutický prijateľným nosičom, ktorým môže byť sterilná kvapalina (napríklad voda, oleje, soli, glycerol alebo etanol). Pomocné látky, ako sú zvlhčovacie alebo emulzifikačné činidlá, povrchovo aktívne činidlá, pufrujúce látky atď., sa môžu v prostriedku tiež nachádzať. Ďalšie zložky farmaceutického prostriedku sa získavajú z ropy, zo zvierat, zo zeleniny alebo sú syntetického pôvodu (napríklad olej z podzemnice olejnej, sójový olej a minerálne oleje). Pre injektovateľné roztoky platí, že uprednostňovanými kvapalnými nosičmi sú glykoly (napríklad propylénglykol alebo polypropylénglykol). Protilátky sa môžu podať vo forme depotných injekcií alebo implantovaného prípravku, ktorý môže byť prispôsobený na postupné uvoľňovanie účinnej látky. Príkladný prostriedok obsahuje monoklonálnu protilátku v množstve 5 mg/ml vo vodnom pufri, ktorý obsahuje 50 mM L-histidín, 150 mM NaCl, pH upravené na 6,0 pomocou HC1.

Prostriedky sa najčastejšie pripravujú ako injektovateľné roztoky alebo suspenzie. Prostriedok môže byť na zvýšenie adjuvančného účinku tiež emulzifikovaný alebo zabalený v lipozómoch alebo v mikročasticiach (napríklad polyaktid, polyglykolid alebo kopolymér), čo je diskutované vyššie (Langer, Science 249, 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97- 119, 1997). Činidlá podľa tohto vynálezu môžu byť podané vo forme depotných injekcií alebo implantovaného derivátu, ktorý môže byť prispôsobený na postupné uvoľňovanie účinnej látky.

Prostriedky sú vhodné aj na ďalšie spôsoby podania, medzi ktoré patria orálne, intranazálne a pulmorálne podanie, čapíky a transdermálne aplikácie.

Čapíky, spájadlá a nosiče obsahujú napríklad polyalkylénglykoly alebo triglyceridy. Čapíky môžu byť vytvorené zo zmesí obsahujúcich účinnú látku v rozsahu od 0,5 % do 10 %, najlepšie však 1 % až 2 %. Prostriedky na orálnu aplikáciu zahŕňajú pomocné látky, medzi ktoré patria manitol, laktóza, škrob, stearan horečnatý, sacharín sodný, celulóza a uhličitan horečnatý. Tieto prostriedky majú podobu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, prípravkov s postupným uvoľňovaním alebo práškov a obsahujú 10 % až 95 % účinnej látky, najlepšie však 25 % až 75 %.

Lokálna aplikácia môže prebiehať transdermálnym alebo intradermálnym podaním. Lokálna aplikácia môže byť zosilnená podaním činidiel alu s toxínom cholery alebo s jeho detoxifíkovanými deravátmi, alebo s ich podjednotkami, alebo s inými podobnými bakteriálnymi toxínmi (pozri Glenn a kol., Náture 391, 851, 1998). Spoločné podanie sa môže dosiahnuť zmiešaním roztokov jednotlivých zložiek alebo spojením ich molekúl chemickým spojením, alebo vytvorením fuzneho proteinu z týchto zložiek.

Transdermálna aplikácia sa môže uskutočniť s použitím náplastí alebo pomocou transferozómov (Paul a kol.,Eur. J. Immunol. 25, 3521 - 24, .1995; Cevc a kol., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201 - 15, 1998).

F. Diagnostické spôsoby

Tento vynález uvádza spôsoby na zistenie imunitnej odpovede proti Αβ u pacienta, ktorý trpí alebo je náchylný na Alzheimerovu chorobu. Tieto spôsoby sú predovšetkým užitočné na sledovanie priebehu liečby pacienta. Tieto spôsoby sa môžu použiť na sledovanie postupu liečby u pacientov so symptómami aj na sledovanie profylaktického postupu u asymptomatických pacientov. Tieto spôsoby sú užitočné na sledovanie aktívnej (napríklad protilátka vytvorená ako odpoveď na podanie imunogénu) a pasívnej imunizácie (meranie hladiny podanej protilátky).

1. Aktívna imunizácia

Niektoré spôsoby zahŕňajú určenie základnej hodnoty imunitnej odpovede pred podaním dávky činidla a jej porovnanie s hodnotou imunitnej odpovede po liečbe. Významné zvýšenie (t. j. väčšie ako je typická experimentálna chyba v opakovaných meraniach rovnakej vzorky, vyjadrená ako štandardná odchýlka priemeru z týchto meraní) hodnoty imunitnej odpovede signalizuje pozitívny výsledok liečby (t. j. podanie činidla vyvolalo alebo posilnilo imunitnú odpoveď). Ak sa hodnota imunitnej odpovede nezmení významne alebo poklesne, je to signálom negatívneho výsledku liečby. U pacientov, ktorí podstupujú liečbu s imunogénnym činidlom, sa s ďalšou dávkou očakáva zvýšená imunitná odpoveď, ktorú potom prípadne dosiahne plató. Podávanie činidla pokračuje väčšinou tak dlho, pokiaľ sa imunitná odpoveď zvyšuje. Dosiahnutie plató je signálom na prerušenie liečby alebo zníženie dávky, alebo frekvencie podávania.

Ďalšími spôsobmi sa určuje kontrolná hodnota (t. j. priemer a štandardná odchýlka) imunitnej odpovede u kontrolnej populácie. Jedinci z kontrolnej populácie neabsolvovali predchádzajúcu liečbu. Odmerané hodnoty imunitnej odpovede u pacienta po podaní liečebného činidla sa potom porovnávajú s kontrolnou hodnotou. Významné zvýšenie v pomere ku kontrole (t. j. väčšia ako jedna štandardná odchýlka priemeru) signalizuje pozitívny výsledok liečby. Neprítomnosť významného zvýšenia alebo pokles odpovede znamená negatívny výsledok liečby. V podávaní činidla sa väčšinou pokračuje, pokiaľ sa hodnota imunitnej odpovede zvyšuje v porovnaní s kontrolnou hodnotou. Dosiahnutie plató je signálom na prerušenie liečby alebo zníženie dávky alebo frekvencie podávania.

Ďalšími spôsobmi sa zisťuje kontrolná hodnota imunitnej odpovede (napríklad priemer a štandardná odchýlka) u kontrolnej populácie jedincov, ktorí sa podrobili liečbe terapeutickým činidlom a ktorých imunitné odpovede dosiahli po liečbe plató. Namerané hodnoty imunitnej odpovede u pacienta sa porovnávajú s kontrolnou hodnotou. Ak nameraná hladina u pacienta nie je významne odlišná (napríklad viac ako jedna štandardná odchýlka) od kontrolnej hodnoty, liečba môže byť prerušená. Ak je pacientova hladina významne pod kontrolnou hodnotou, je zabezpečené ďalšie podávanie činidla. Ak hladina v pacientovi zostane pod kontrolnou hodnotou, je nutné zmeniť napríklad liečebný režim alebo použiť iný adjuvant.

Ďalšími spôsobmi sa sleduje imunitná odpoveď pacienta, ktorý sa v súčasnosti liečbe nepodrobuje, ale prekonal ju už skôr, a to s cieľom zistenia, či nie je potrebné liečbu znovu začať. Nameraná hladina imunitnej odpovede pacienta môže byť porovnaná s hodnotou imunitnej odpovede dosiahnutej u pacienta predchádzajúcou liečbou. Významné zníženie v porovnaní s predchádzajúcim meraním (t. j. väčšia, ako je typická experimentálna chyba v opakovaných meraniach rovnakej vzorky) je znamením nutnosti pokračovať v liečbe. Hodnota nameraná u pacienta sa môže tiež porovnať s kontrolnou hodnotou (priemer plus štandardná odchýlka) zistenou u populácie pacientov po ukončení liečby. Hodnota nameraná u pacienta môže byť porovnaná s kontrolnou hodnotou u populácie profylaktický liečených pacientov, ktorí nevykazujú symptómy choroby, alebo u populácie terapeuticky liečených pacientov, ktorí vykazujú zlepšenie charakteristík ochorenia. Vo všetkých týchto prípadoch je významné zníženie vo vzťahu ku kontrolnej hladine (t. j. viacero ako jedna štandardná odchýlka) znamením toho, že liečba pacienta by sa mala znovu začať.

Analyzované vzorky tkanív pacienta sú typicky krv, plazma, sérum a mukózna alebo cerebrospinálna tekutina. Vo vzorke sa zisťujú známky imunitnej odpovede na sledovanú amyloidnú zložku (napríklad akákoľvek forma peptidu Αβ). Imunitná odpoveď môže byť určená napríklad podľa prítomnosti protilátok alebo Tbuniek, ktoré sa špecificky viažu na sledovanú zložku (napríklad peptid Αβ). Spôsoby ELISA na zistenie protilátok špecifických pre Αβ sú opísané v časti príkladov a môžu sa použiť aj na iné peptidové antigény. Spôsoby zistenia reaktívnych T-buniek sú v odbore dobre známe.

2. Pasívna imunizácia

Postupy na sledovanie pasívnej imunizácie sú väčšinou podobné na postupy na sledovanie aktívnej imunizácie, ktoré boli opísané. Profil protilátky pri pasívnej imunizácii je typický tým, že okamžitý vrchol koncentrácie protilátky je nasledovaný exponenciálnym poklesom. Bez ďalších dávok dosahuje pokles počas dní až mesiacov (v závislosti na polčase života podanej protilátky) hladiny, ktoré boli namerané pred liečbou. Napríklad polčas života niektorých ľudských protilátok sa pohybuje okolo 20 dní.

Podľa niektorých spôsobov sa meranie základnej hladiny protilátky proti Αβ odohráva u pacienta pred prvým podaním činidla, druhé meranie následne po podaní (na určenie vrcholovej hodnoty koncentrácie protilátky) a jedno meranie alebo viacero ďalších meraní sa uskutočňuje v ďalších intervaloch na určenie poklesu hladiny protilátky. Keď hladina protilátky klesne na základnú hladinu alebo do jej blízkosti (napríklad na 50 %, 25 % alebo 10 %), prebehne aplikácia ďalšej dávky protilátky. Podľa niektorých spôsobov sú hodnoty vrcholové a hodnoty zistené v následných meraniach porovnané so skôr nameranými referenčnými hodnotami, ktoré boli stanovené na zabezpečenie užitočných profylaktických alebo terapeutických liečebných režimov u iných pacientov. Keď je nameraná hladina protilátky významne nižšia ako referenčná hladina (napríklad menej ako priemer mínus jedna štandardná odchýlka referenčnej hodnoty v populácii pacientov, u ktorých bola liečba úspešná), je nutné podať ďalšiu dávku protilátky.

3. Diagnostické súpravy

Vynález ďalej opisuje diagnostické súpravy na použitie pri opísaných diagnostických spôsoboch. Taká súprava typicky obsahuje činidlo, ktoré sa špecificky viaže na protilátky proti zložke amyloidného plaku (napríklad Αβ) alebo reaguje s T-bunkami špecifickými pre danú zložku. Súprava môže obsahovať tiež značku. Pri detekcii protilátok proti Αβ je značka typicky vo forme označených antiidiotypických protilátok. Na detekciu protilátky môže byť činidlo dodávané tak, že je vopred ukotvené v tuhej fáze (napríklad v jamkách mikrotitračnej doštičky). Na detekciu reaktívnych T-buniek môže byť značkou ³H-tymidín, pomocou ktorého sa meria proliferatívna odpoveď. Súprava je tiež typicky vybavená označením na jej použitie. Označenie môže zahŕňať tiež tabuľku alebo iné hodnotenie na koreláciu hladiny nameranej značky s hladinou protilátok proti Αβ alebo T-buniek reagujúcich s Αβ. Termín označenia sa vzťahuje k akémukoľvek opísanému alebo inak zaznamenanému materiálu, ktorý je k súprave pripevnený alebo inak pripojený, a to kedykoľvek počas jej výroby, prevozu, predaja a použitia. Termín označenia zahŕňa reklamné letáky a brožúry, baliace materiály, návody, audio- alebo videokazety, počítačové disky, rovnako ako nápisy, ktoré sa nachádzajú priamo na súprave.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Protilátkový titer u transgénnych myší po injekcii Αβ1-42.

Obr. 2: Amyloidné zaťaženie v hipokampe. Percento hipokampálnej oblasti obsadenej amyloidnými plakmi, určenými reaktivitou s Αβ-špecifickou monoklonálnou protilátkou 3D6, bolo určené pomocou počítačovej kvantitatívnej analýzy obrazu. Hodnoty pre jednotlivé myši sú zobrazené v jednotlivých liečebných skupinách. Horizontálna čiara pri každej skupine zobrazuje strednú hodnotu rozdelenia.

Obr. 3: Neuritická dystrofia v hipokampe. Percento hipokampálnej oblasti obsadenej dystrofickými neuritmi, určenými reaktivitou s ľudskou APP-špecifickou monoklonálnou protilátkou 8E5, bolo určené pomocou počítačovej kvantitatívnej analýzy obrazu. Hodnoty pre jednotlivé myši sú zobrazené samostatne pre skupinu vystavenú pôsobeniu AN1792 a kontrolnú skupinu vystavenú pôsobeniu PBS. Horizontálna čiara pri každej skupine zobrazuje strednú hodnotu rozdelenia.

Obr. 4: Astrocytóza v retrospleniálnej kôre. Percento kôrovej oblasti obsadenej astrocytmi pozitívnymi na gliálny vláknitý acidický protein (GFAP) bolo určené pomocou počítačovej kvantitatívnej analýzy obrazu. Hodnoty pre jednotlivé myši sú zobrazené v jednotlivých liečebných skupinách a horizontálna čiara pri každej skupine zobrazuje strednú hodnotu rozdelenia.

Obr. 5: Kvantitatívna analýza obrazu kôrového amyloidného zaťaženia u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo ANI792.

Obr. 6: Kvantitatívna analýza obrazu zaťaženia neuritickými plakmi u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo ANI7 92.

Obr. 7: Kvantitatívna analýza obrazu percenta retrospleniálnej kôry obsadeného astrocytózou u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo ANI792.

Obr. 8: Analýza lymfocytovej proliferácie v bunkách sleziny vystavených pôsobeniu ANI792 (horná časť) alebo PBS (dolná časť).

Obr. 9: Priemerný titer u myší liečených polyklonálnou protilátkou proti Αβ.

Obr. 10: Priemerný titer u myší liečených monoklonálnou protilátkou 10D5 proti Αβ.

Obr. 11: Priemerný titer u myší liečených monoklonálnou protilátkou 2F12 proti Αβ.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Profylaktická účinnosť Αβ proti Alzheimerovej chorobe (AD)

Tieto príklady opisujú podávanie peptidu Αβ42 transgénnej myši overexprimujúci APP s mutáciou v pozícii 717 (APP|7₇_^f, ktorá vedie k neuropatologii zhodnej s Alzheimerovou chorobou. Vytváranie a charakte29

SK 288207 Β6 ristika týchto myší (PDAPP myší) je opísaná v Games a kol., Náture, pozri vyššie. Tieto zvieratá (vo svojej heterozygotnej forme) začínajú ukladať Αβ od šiesteho mesiaca veku. Vo veku 15 mesiacov už vykazujú ukladanie Αβ v hladinách zodpovedajúcich Alzheimerovej chorobe. PDAPP myšiam bol injektovaný agregovaný Αβ42 (agregovaný Αβ42) alebo soľný roztok pufrovaný fosfátom. Agregovaný Αβ42 bol vybraný kvôli svojej schopnosti vyvolať tvorbu protilátok proti viacerým epitopom Αβ.

A. Spôsoby

1. Myši

Tridsať PDAPP heterogénnych myších samíc bolo náhodne rozdelených do nasledujúcich skupín: 10 myší na injekciu agregovaného Αβ42 (jedna zomrela pri prevoze), 5 myší na injekciu PBS/adjuvant alebo PBS a 10 myší ako intaktná kontrola. 5 myšiam boli injektované peptidy odvodené zo sérového amyloidného proteínu (SAP).

2. Príprava imunogénov

Príprava agregovaného Αβ42: 2 mg Αβ42 (US Peptides Inc, lot K.-42-12) sa rozpustili v 0,9 ml vody a objem bol doplnený do 1 ml pridaním 0,1 ml lOx PBS. Získaná zmes sa vortexovala a nechala sa inkubovať pri 37 °C cez noc, čo sú podmienky, za ktorých peptid agregoval. Nepoužitý Αβ sa skladoval ako suchý lyofilizovaný prášok pri -20 °C, a to až do ďalšej injekcie.

Je nutné poznamenať, že pri použití takýchto komerčne dostupných peptidov môže byť v suchej hmotnosti započítaná aj hmotnosť solí; hmotnosti uvádzané vo všetkých opisovaných príkladoch zahŕňajú aj hmotnosti solí (pokiaľ nie je uvedené inak). Presné množstvá peptidov môžu byť stanovené analýzou prostriedku štandardnými spôsobmi, napríklad určením množstva dusíka v porovnaní s prostriedkom so známym obsahom dusíka.

3. Príprava injekcií

V každej injekcii, určenej pre jednu myš, sa nachádzalo 100 pg agregovaného Αβ42 v PBS, emulzifikovaného v pomere 1 : 1 s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) s konečným objemom emulzie určenej na prvú imunizáciu 400 pl. Prvá imunizácia bola po dvoch týždňoch nasledovaná posilňovacou injekciou, ktorá obsahovala rovnaké množstvo imunogénu v nekompletnom Freundovom adjuvante (IFA). Dve ďalšie dávky v IFA boli podané v mesačnom intervale. Následné imunizácie sa uskutočnili podaním v 500 pl PBS. Injekcie boli aplikované intraperitoneálne (i. p.).

PBS bolo injektované podľa rovnakej schémy, pričom myšiam bola injektovaná zmes PBS s adjuvantom v dávke 400 pl na myš alebo 500 pl na myš. Injekcie SAP sa podávali podľa rovnakej schémy, pričom bola použitá dávka 100 pg na injekciu.

4. Titrácia myšej krvi, príprava tkaniva a imunohistochémia

Uvedené spôsoby sú opísané v kapitole všeobecný materiál a spôsoby.

B. Výsledky

PDAPP myšiam bol injektovaný buď agregovaný Αβ42 (agregovaný Αβ42), peptidy SAP, alebo soľný roztok pufrovaný fosfátom. Jedna skupina PDAPP myší - pozitívna kontrola, bola ponechaná intaktná. Myšie titre protilátok proti agregovanému Αβ42 boli sledované každý ďalší mesiac po štvrtej posilňovacej injekcii, a to až do veku jedného roka. Myši boli usmrtené po 13 mesiacoch života. Vo všetkých sledovaných časových bodoch vykazovalo osem z deviatich myší vysoký titer protilátok proti Αβ42, pričom táto hladina zostala vysoká počas celého obdobia podávania injekcií (titre väčšie ako 1 : 10000). Deviata myš mala titer nízky, ale merateľný (okolo 1 : 1000) (obr. 1, tabuľka 3). Myši, ktorým bol injektovaný SAP mali titre od 1 : 1000 do 1 : 30000, pričom hodnotu 1 : 10000 prekročila len jedna myš.

Séra z myší liečených PBS boli titrované proti agregovanému Αβ42 po šiestich, desiatich a dvanástich mesiacoch. V prípade titrovania (v sére riedenom 1 : 100) PBS myší proti agregovanému Αβ42 bola hranica štvornásobku pozadia prekročená len v jednom časovom bode, pričom v ostatných prípadoch nebola táto hranica prekročená v žiadnom časovom bode (tabuľka 3). Odpoveď špecifická pre SAP, bola v týchto časových bodoch zanedbateľná (titre boli menšie ako 1 : 300).

Sedem z deviatich myši zo skupiny liečenej agregovaným Αβ1-42 nevykazovalo v mozgu žiadne zistiteľné amyloidy. Mozgové tkanivo z myší zo skupín liečených SAP a PBS naopak vykazovali početné amyloidné usadeniny v hipokampe rovnako ako vo frontálnej a cingulámej kôre.

SK 288207 Β6

Tabuľka 3A Titre pri 50 % maximálnej O.D. Myši s injektovaným agregovaným Αβ

Vek PDAPP (mesiace)	#100	#101	#102	#103	#104	#105	#106	#107	#108
4	70000	150000	15000	120000	1000	15000	50000	60000	100000
6	15000	65000	30000	55000	300	15000	15000	50000	60000
8	20000	55000	50000	50000	400	15000	18000	50000	60000
10	40000	20000	60000	50000	900	15000	50000	20000	40000
12	25000	30000	60000	40000	2700	20000	70000	25000	20000

Tabuľka 3B Titre pri 50 % maximálnej O.D.

Myši s injektovanými PBS pri riedení obidvoch imunogénov 1/100

Vek PDAPP (mesiace)	#113	#114	#115	#116	#117
6	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg
10	5 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg
12	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg	<4 x bkg

Spôsob usadzovania bol podobný tomu, ktorý bol pozorovaný pri neliečených kontrolách, t. j. s charakteristickou účasťou zraniteľných oblastí, medzi ktoré patria vonkajšia molekulová vrstva hipokampálneho dentátneho gyru. U jednej myši zo skupiny s injektovaným Αβ1-42 bolo pozorované veľké zníženie amyloidného zaťaženia v hipokampe. U inej myši z tej istej skupiny bol pozorovaný osamotený plak.

Kvantitatívne obrazové analýzy amyloidného zaťaženia v hipokampe potvrdili jeho dramatické zníženie dosiahnuté u zvierat liečených Αβ42 (ΑΝ 1792) (obr. 2). Stredné hodnoty amyloidného zaťaženia v skupine liečenej PBS (2,22 %) a vo vôbec neliečenej skupine (2,65 %) boli v porovnaní so skupinou imunizovanou ANI792 (0,00 %, p = 0,0005) významne vyššie. Stredné hodnoty amyloidného zaťaženia dosahovali v skupine imunizovanej SAP peptidmi (SAPP) hodnoty 5,74 %. Mozgové tkanivo z neliečených kontrolných myší obsahovalo početné usadeniny amyloidu Αβ, zviditeľnené pomocou Αβ-špecifickej monoklonálnej protilátky (mAb)3D6 v hipokampe, rovnako ako v retrospleniálnej kôre. Podobný spôsob usadzovania bol pozorovaný tiež u myší imunizovaných SAPP alebo PBS (obr. 2). Tri posledné uvedené skupiny boli charakteristické účasťou zraniteľných podoblastí (čo je typické u AD), medzi ktoré patria vonkajšia molekulová vrstva hipokampálneho dentátneho gyru.

Mozgy, ktoré neobsahovali žiadne amyloidné usadeniny, nemali ani neuritické plaky, ktoré je možné bežne zviditeľňovať pomocou protilátky 8E5 proti ľudskému APP. Všetky mozgy z ostatných skupín (s aplikovaným SAP alebo PBS a kontrolná skupina) mali početné neuritické plaky, typické pre neliečené PDAPP myši. Malé množstvo neuritických plakov bolo prítomné aj u jednej myši liečenej ANI 792 a jeden zhluk neuritických plakov bol pozorovaný aj u druhej myši z tej istej skupiny. Pomocou obrazovej analýzy hipokampu (tiež pozri obr. 3) bola v porovnaní s PBS skupinou (stredná hodnota 0,28 %, p = 0,0005) preukázaná účinná eliminácia dystrofických neuritov u myší liečených ANI792 (stredná hodnota 0,00 %).

U skupín liečených injekciami Αβ1-42 nebola prítomná ani astrocytóza, ktorá je charakteristická pre zápaly spojené s plakmi. Mozgy myší z ostatných skupín obsahovali husté a zhlučené GFAP-pozitívne astrocyty, typické pre gliózu spojenú s plakmi Αβ. Časť sklíčok s astrocytmi pozitívne reagujúcimi na GFAP bola na lokalizáciu plakov Αβ ďalej zafarbená tioflavínom. S GFAP-pozitívne astrocyty bolo spojené s Αβ plakmi u skupín liečených SAP, PBS a v intaktných kontrolách. Žiadne také spojenie nebolo nájdené u myší liečených Αβ1-42, pričom u jednej myši liečenej AN1792 bola zistená minimálna glióza spojená s plakmi.

Obrazové analýzy retrospleniálnej kôry (obr. 4) potvrdili, že zníženie výskytu astrocytózy boli významné, čo je zrejmé, ak porovnáme priemerné hodnoty jej výskytu u myší liečených ANI792 (1,56 %) a myší imunizovaných SAP peptidmi, PBS alebo myší intaktných (všetky tri skupiny > 6 %, p = 0,0017).

Údaje zo vzorky myší, ktorým boli injektované Αβ1-42 a PBS, ukázali, že MHC II imunoreaktivita spojená s plakom sa u Αβ1-42 myší nevyskytovala, čo zodpovedá neprítomnosti zápalovej reakcie spojenej s Αβ.

Na rezoch z myších mozgov sa skúšalo, či pozitívne reagujú s mAb, ktorý predstavuje špecifickú monoklonálnu protilátku proti MAC-1 (proteín v bunkovej membráne). MAC-1 (CD 11 b) patrí do rodiny integrínov a vyskytuje sa spolu s CD 18 ako heterodimér. Komplex CD1 lb/CD18 je prítomný na monocytoch, makrofázach, neutrofiloch a NK-bunkách (prirodzení zabijaci) (Mak a Simard). MAC-1 pozitívne bunkové typy v mozgu sú pravdepodobne mikroglie, čo vyplýva z im podobnej morfológie pozorovanej na rezoch, kde došlo k pozitívnej reakcii s protilátkou proti MAC-1. U myší liečených ANI792 bolo možné v porovnaní s kontrolnou skupinou PBS pozorovať nižší výskyt MAC-1 imunoreaktivity, čo zodpovedá neprítomnosti zápalovej reakcie spojenej s Αβ.

C. Záver

Neprítomnosť plakov Αβ a reaktívnych neuronálnych a gliotických zmien v mozgoch myší, ktorým bol injektovaný Αβ1-42, znamená, že v ich mozgoch nedošlo (alebo len v extrémne malom množstve) k uloženiu amyloidu, pričom s tým súvisí aj absencia patologických následkov prípadného ukladania, t. j. napríklad glióza a neuritická glióza a neuritická patológia. PDAPP myši liečené pomocou A1J1-42 preukázali úplne zhodnú neprítomnosť patológie ako kontrolné netransgénne myši. Injekcie Αβ1-42 sú takto vysoko účinné pri prevencii ukladania alebo očisťovania ľudského Αβ z mozgového tkaniva, a tiež pri odstraňovaní týmto spôsobených neuronálnych a zápalových degeneratívnych zmien. Podávanie peptidu Αβ môže byť teda použité pri prevencii a liečbe AD.

Príklad 2

Preverenie terapeutickej účinnosti proti rozvinutej AD

Táto analýza je určená na testovanie imunogénnych činidiel, konkrétne ich účinnosti zastaviť alebo zvrátiť neuropatologické charakteristiky AD u starých zvierat. Imunizácia so 42 aminokyselín dlhým Αβ (ANI792) začali v čase, keď boli amyloidné plaky v mozgoch PDAPP myší už prítomné.

Počas tejto štúdie vzniklo u neliečených PDAPP myší množstvo neurodegeneratívnych zmien podobných tým, ktoré sa môžu nájsť pri AD (Games a kol., pozri, vyššie a Johnson-Wood a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550 - 1555, 1997). Ukladanie Αβ v amyloidných plakoch je spojené s degeneratívnou neuronálnou odpoveďou, ktorá zahŕňa aberantné axonálne a dendritické elementy, nazývané dystrofické neurity. Amyloidné usadeniny, ktoré sú obklopené a tiež obsahujú dystrofické neurity, sa nazývajú neuritické plaky. U AD aj PDAPP myší majú dystrofické neurity zreteľnú globulámu štruktúru, sú imunoreaktívne s určitými protilátkami rozpoznávajúcimi APP a cytoskeletálne zložky a vykazujú komplexné subceluláme degeneratívne zmeny na ultraštrukturálnej úrovni. Tieto charakteristiky umožňujú s chorobou súvisiace selektívne, reprodukovateľné meranie tvorby neuronálnych plakov v mozgoch PDAPP myší. Dystrofická neuronálna zložka PDAPP neuritických plakov je pomocou protilátky špecifickej pre ľudský APP (monoklonálna protilátka 8E5) ľahko zviditeľňovaná a s pomocou počítačovej analýzy obrazu ľahko merateľná. Okrem merania účinkov ANI7 92 na tvorbu amyloidných plakov sme merali aj účinky tejto liečby na vývoj neuritickej dystrofie.

Astrocyty a mikroglie sú bunky odlišné od neurónov, ktoré zodpovedajú a reagujú na neuronálne poškodenie. GFAP-pozitívne astrocyty a MHC II-pozitívne mikroglie sú pri AD bežne pozorovateľné a ich aktivácia sa zvyšuje so závažnosťou choroby. Preto sme u myší liečených ANI7 92 pozorovali tiež vývoj reaktívnej astrocytózy a mikrogliózy.

A. Materiál a spôsoby samíc heterozygotných PDAPP myší, vo veku od 11 do 11,5 mesiaca a získaných z Charles River Laboratories, bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín: 24 myší na imunizáciu so 100 pg ANI792 a 24 myší na imunizáciu s PBS, v obidvoch prípadoch v kombinácii s Freundovým Adjuvantom. Skupiny s ANI792 a PBS boli opäť rozdelené na dosiahnutie cca 15. mesiaca veku. V 15. mesiaci veku bola približne polovica zvierat z každej skupiny usmrtená (n = 10 pre ANI792 a n = 9 pre PBS), pričom pri druhej polovici (n = 9 preAN1792an= 12 pre PBS) sa pokračovalo v imunizáciách až do 18. mesiaca. 8 zvierat (5 AN1792 a 3 PBS) počas štúdie zomrelo. Okrem imunizovaných zvierat boli na porovnanie ELISA testov na množstvo Αβ a APP v mozgu do štúdie pridané ešte intaktné PDAPP myši staré 1 rok (n = 10), 15 mesiacov (n = 10), 18 mesiacov (n = 10); jednoročné zvieratá boli zahrnuté tiež v imunohistochemických analýzach.

Použitá metodológia bola zhodná ako v príklade 1 (pokiaľ nie je uvedené inak). AN 1792 od US Peptides (kat. č. 12) a Califomia Peptides (kat. č. ME 0339) boli použité na prípravu antigénu určeného na šesť imunizácií uskutočnených pred 15. mesiacom. Výrobky ME0339 a ME0439 od Califomia Peptides boli použité na tri dodatočné imunizácie uskutočnené medzi 15. a 18. mesiacom.

100 pg ANI792 v 200 pl PBS alebo PBS samotné bolo emulzifikované 1 : 1 (obj.) s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) alebo s nekompletným Freundovým adjuvantom (IFA), alebo s PBS s konečným objemom emulzie 400 pl. Adjuvantom pri prvej imunizácii bolo CFA, ďalšie dve dávky boli podané v IFA a posledné štyri dávky v samotnom PBS bez adjuvantu. Celkovo imunizácia prebehla počas sedemmesačného intervalu deväťkrát, pričom prvé tri injekcie v dvojtýždňovom intervale, ďalšia injekcia potom v mesačnom intervale. Skupina liečená len štyri mesiace a usmrtená v 15. mesiaci veku sa podrobila len prvým šiestim imunizáciám.

B. Výsledky

1. Účinok liečby pomocou Αβ42 (AN1792) na amyloidné zaťaženie

Účinky liečby AN 1792 na kôrové amyloidné zaťaženie, určené pomocou kvantitatívnej analýzy obrazu sú uvedené na obr. 5. Priemerná hodnota kôrového amyloidného zaťaženia bola v skupine intaktných 12-mesačných PDAPP myší 0,28 %, čo predstavuje plakové zaťaženie myší pri začatí štúdie. U 18-mesačných PBS myší narástlo amyloidné zaťaženie viac ako 17-krát na 4,87 %, zatiaľ čo u myší liečených AN1792 došlo k veľkému zníženiu amyloidného zaťaženia (0,01 %), čo je v porovnaní s 12-mesačnými intaktnými myšami a 15- a 18-mesačnými myšami liečenými PBS pozoruhodne málo. Amyloidné zaťaženie bolo v 15. (96 % zníženie; p = 0,003) aj v 18. mesiaci (> 99 % zníženie; p = 0,0002) u príjemcov ANI792 významne znížené.

Kôrové ukladanie amyloidu začína u PDAPP myší typicky vo frontálnej a retrospleniálnej kôre (RSC) a pokračuje ventrolaterálnym smerom k temporálnej a entorinálnej kôre (EC). V EC 12 mesiacov starých myší, čo je vek, v ktorom bolo prvýkrát podané ANI792, nebol nájdený amyloid žiadny alebo len v malom množstve. Po štyroch mesiacoch liečby ANI792 bolo zásadne znížené amyloidné ukladanie v RSC, pričom postupné usadzovanie amyloidu v EC bolo podávaním AN1792 úplne eliminované. Naposledy uvedené pozorovanie ukazuje, že ΑΝ 1792 úplne zastavilo postupné ukladanie amyloidu, ktoré by za normálnych okolností postúpilo do temporálnej a ventrálnej kôry. Podávanie ANI792 tiež zastavilo a pravdepodobne aj zvrátilo ukladanie amyloidu v RSC.

Zásadné účinky ANI 792 na postup ukladania amyloidu v kôre u PDAPP myší je ďalej preukázané na 18mesačnej skupine, ktorá bola liečená počas 7 mesiacov. Myš liečená pomocou ANI792 vykazovala skoro úplnú absenciu kôrového amyloidu, úplnú absenciu difúznych plakov a zníženie množstva existujúcich usadenín.

2. Bunkové a morfologické zmeny spojené s liečbou pomocou Αβ42 (ANI792)

V častiach mozgu, ktoré sú typické výskytom amyloidných usadenín, bola nájdená populácia Αβ-pozitívnych buniek. Je pozoruhodné, že u niekoľkých mozgov z myší liečených ANI792 nebolo nájdené žiadne množstvo extracelulámych kovových plakov alebo len malé množstvo. Zdá sa, že väčšina imunoreaktivity bola lokalizovaná na vnútrajšok buniek s veľkým laločnatým alebo zhluknutým somatom. Fenotypicky sa tieto bunky podobali aktivovaným mikrogliám alebo monocytom. Imunoreaktívne protilátky špecificky rozpoznávajúce ligandy exprimované monocytmi a mikrogliou (MHC II a CD1 lb) a boli príležitostne spojené so stenou alebo lumen krvných kapilár. Porovnanie priľahlých rezov označených protilátkami špecifickými pre Αβ a MHC II odhalilo, že obidve protilátky sa viazali na rovnaké typy buniek. Podrobné skúmanie mozgov vystavených pôsobeniu ANI792 viedlo k zisteniu, že výskyt MHC Π-pozitívnych buniek bol u týchto zvierat obmedzený na okolie zvyšných amyloidov. Za použitých podmienok fixácie neboli bunky imunoreaktívne na protilátky špecificky rozpoznávajúce ligandy T-buniek (CD3, CD3e) alebo B-buniek (CD45a, CD45RB) alebo na obvyklý leukocytový antigén (CD45), ale reagovali s protilátkou rozpoznávajúcou leukozialín (CD43), ktorá krížovo reaguje s monocytmi. Žiadne také bunky neboli nájdené u myší vystavených pôsobeniu PBS.

PDAPP myši vytvárajú stále rozsiahle amyloidné usadeniny vo vonkajšej molekulovej vrstve dentátneho gyru. Usadeniny tvoria zreteľný pruh v perforovanej dráhe, čo je podoblasť, ktorá pri AD klasicky obsahuje amyloidné plaky. Charakteristický vzhľad týchto usadenín u myší vystavených pôsobeniu PBS pripomínal ten, ktorý bol už opísaný u neliečených PDAPP myší. Amyloidné usadeniny pozostávali z difúznych aj kompaktných plakov v súvislom pásiku. U mnohých mozgov z myší liečených ANI792 bol naopak tento vzhľad výrazne zmenený. Hipokampálne amyloidné usadeniny už neobsahovali difúzne amyloidy a pásikavé usporiadanie bolo úplne roztrhané. Namiesto toho bolo prítomné množstvo neobvyklých bodkovaných štruktúr, ktoré reagovali s protilátkami proti Αβ, pričom sa zdalo, že niektoré z nich sú bunkami s obsahom amyloidu.

MHC II-pozitívne bunky boli u zvierat liečených ANI792 opakovane pozorované v susedstve extracelulámeho amyloidu. Spôsob združenia Αβ-pozitívnych buniek s amyloidom bol veľmi podobný tomu, ktorý bolo možné pozorovať u niektorých mozgov získaných z myší vystavených pôsobeniu ANI792. Výskyt týchto monocytov bol obmedzený na oblasť prilahlú k amyloidnej usadenine, pričom v iných mozgových oblastiach bez plakov Αβ bol úplne nulový.

Kvantitatívna analýza obrazu rezov označených protilátkami proti MHC I a MHC II odhalila tendenciu opísanú narastajúcou imunoreaktivitou v RSC a v hipokampe u myší vystavených pôsobeniu ANI792, v porovnaní so skupinou myší liečených pomocou PBS, ktoré vykazovali len významné zvýšenie MHC I-imunoreaktivity v hipokampe.

Tieto výsledky sú dôkazom aktívneho, bunkovo sprostredkovaného odstránenia amyloidu z mozgových oblastí, kde sa vyskytoval.

3. Účinky AN1792 na hladiny AU: ELISA testy (a) Hladiny v mozgovej kôre

Priemerná hodnota celkového množstva Αβ v kôre PDAPP myší bola v 12. mesiaci 1600 ng/g a v 15. mesiaci narástla na 8700 ng/g (tabuľka 4). V 18. mesiaci bola táto hodnota 22000 ng/g, čo je od začiatku experimentu viac ako 10-násobný vzostup. Celkové množstvo AU u zvierat liečených PBS bolo v 15. mesiaci 8600 ng/g s tým, že toto množstvo narástlo v 18. mesiaci na 19000 ng/g. Celkové množstvo Αβ u zvierat liečených AN1792 bolo v 15. mesiaci 1600 ng/g, čo je o 81 % menej ako v prípade PBS. U zvierat liečených ANI792 bolo v 18. mesiaci celkové množstvo Αβ 5200 ng/g, čo je v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne menej (o 72 %., p = 0, 0001) (pozri tabuľka 4). Podobné výsledky boli u týchto dvoch skupín nájdené pri porovnávaní hladín Αβ v kôre. V tomto prípade však boli rozdiely hladín Αβ významné v 15. (p = 0,04) aj 18. mesiaci (p = 0,0001, tabuľka 4).

Tabuľka 4

Stredné hodnoty hladín Αβ v kôre (ng/g)

Neliečení PBS ANI 792

Vek	Celkový Αβ42	(n)	Celkový Αβ42	(n)	Celkový Αβ42	(N)
12	1 600 1 300	(10)
15	8 700	8 300	(10)	8 600 7 200	(9)	1 600 1 300*	(10)
18	22 200	18 500	(10)	19 000 15 900	(12)	5 200” 4 000	(9)

”^p = 0,0412 ”^p = 0,0001 (b) Hladiny v hipokampe

U intaktných PDAPP myší boli v 12. mesiaci priemerné hodnoty celkového množstva Αβ 15000 ng/g a v 15. mesiaci narástli na 51000 ng/g a ešte ďalej v 18. mesiaci na 81000 ng/g (tabulka 5). PBS myši vykazovali v týchto časových bodoch hodnoty 40000 ng/g (15. mesiac), resp. 65000 ng/g (18. mesiac). Zvieratá imunizované AN1792 vykazovali nižšie celkové množstvá Αβ, a to 25000 ng/g (15. mesiac) a 51000 ng/g (18. mesiac). Hodnota Αβ bola u skupiny liečenej ANI792 v 18. mesiaci významne nižšia ako u skupiny liečenej PBS (p = 0,0105, tabulka 5). Meranie Αβ42 dávalo výsledky podobného typu, t. j. jeho hladina bola v 18. mesiaci u skupiny AN 1792 v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne nižšia (39000 ng/g v porovnaní s 57000 ng/g, p = 0,002) (tabulka 3).

Tabulka 5

Stredné hodnoty hladín Αβ v hipokampe (ng/g)

Neliečení PBS AN1792

Vek	Celkový	Αβ42	(n)	Celkový	Αβ42	(n)	Celkový	Αβ42	(»)
12	15 000	11 100	(10)
15	51 500	44 400	(10)	40 100	35 700	(9)	24 500	22 100	(10)
18	80 800	64 200	(10)	65 400	57 100	(12)	50 900*	38 900“	(9)

*^p = 0,0105 ”^p = 0, 00221 (c) Hladiny v mozočku

Priemerné hodnoty celkového množstva A* v mozočku boli u neliečených PDAPP myší v 12. mesiaci 15 ng/g (tabulka 6). V 15. mesiaci narástlo toto množstvo na 28 ng/g a v 18. mesiaci na 35 ng/g. U zvierat liečených PBS boli namerané priemerné hodnoty 21 ng/g (15. mesiac) a 43 ng/g (18. mesiac). Zvieratá liečené ANI792 mali v mozočku v 15. mesiaci 22 ng/g celkového Αβ a v 18. mesiaci významne nižšie (p = 0, 002) množstvo ako skupina liečená PBS, a to 25 ng/g (tabulka 6).

Tabuľka 6

Stredné hodnoty hladín Αβ v mozočku (ng/g)

Neliečení PBS AN1792

Vek	Celkový Αβ (n)	Celkový Αβ (n)	Celkový Αβ (N)
12	15.6 (10) 27.7 (10) 35,0 (10)	20,8 (9) 43,1 (12)	21,7 (10) 24,8* (9)
15
18

^p = 0,0018

4. Účinky liečby pomocou ANI792 na hladiny APP

Ako molekula APP-α, tak aj molekula APP s úplnou dĺžkou obsahujú časť alebo celú sekvenciu Αβ, takže môžu byť pri imunitnej odpovedi proti ANI792 potencionálne zasiahnuté. Súčasné štúdie opisujú mierny vzostup hladiny APP ako neuropatológiu u PDAPP myší. Hladiny ΑΡΡ-α/FL (plná dĺžka) alebo APP-α v kôre zostali po liečbe v podstate nezmenené, len v prípade APP-α bola u myší liečených ANI792 v 18. mesiaci nameraná o 19 % nižšia hladina ako u myší liečených PBS. Hodnoty APP u myší liečených AN1792 neboli v 18. mesiaci významne odlišné od hodnôt nameraných u myší neliečených (v 12. a 15. mesiaci) a u myší liečených PBS (v 15. mesiaci). Vo všetkých prípadoch zostali hladiny APP v medziach, ktoré je možné normálne nájsť u PDAPP myší.

SK 288207 Β6

5. Účinky liečby pomocou ANI792 na neurodegeneratívne a gliotické zmeny.

U myší liečených ANI792 došlo vo frontálnej kôre v porovnaní s PBS skupinou k významnému zníženiu neuritického plakového zaťaženia, a to v 15. (84 %; p = 0,03) aj 18. mesiaci (55 %; p = 0,01) (obr. 6). Priemerné hodnoty neuritického plakového zaťaženia narástli u skupiny PBS medzi 15. a 18. mesiacom z 0,32 % na 0,49 %. V skupine liečenej ANI792 však došlo k zásadnému zníženiu množstva neuritických plakov, pričom priemerné hodnoty neuritického plakového zaťaženia boli 0,05 % (15. mesiac) a 0,22 % (18. mesiac).

Imunizácia pomocou ANI792 v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne znížila reaktívnu astrocytózu v RSC, a to v 15. (o 56 %; p = 0,011) aj v 18. mesiaci (o 39 %; p = 0,028) (obr. 5). Priemerné percentuálne hodnoty astrocytózy v PBS skupine narástli medzi 15. a 18. mesiacom zo 4,26 % na 5,21 %. Liečba pomocou AN1792 potlačila vývoj astrocytózy v obidvoch časových bodoch, a to na 1,89 %, resp. na 3,2 %. To znamená, že pri liečebnom procese nedochádzalo k poškodeniu neuropilu.

6. Protilátkové odpovede mesiacov staré, heterozygotné PDAPP myši (N = 24) boli podrobené sérii 5 imunizácíí so 100 pg ANI792 emulzifikovanom vo Freundovom adjuvante, pričom aplikácia prebiehala intraperitoneálne v týždňoch 0, 2, 4, 8 a 12 s tým, že pri šiestej imunizácii (v 16. týždni) bol Freundov adjuvant nahradený PBS. Ako negatívna kontrola slúžilo 24 transgénnych myší rovnakého veku, ktoré boli imunizované PBS emulzifikovanom s rovnakými adjuvantami a v rovnakej časovej schéme. Krv bola zvieratám odoberaná medzi tretím a siedmym dňom po každej imunizácii, začínajúc druhou dávkou. Protilátkové odpovede na ANI792 boli merané pomocou ELISA. Geometrický priemer titrov (GMT) bol u zvierat imunizovaných ANI792 po druhej, tretej a poslednej (šiestej) dávke približne 1900, 7600 a 45000. U kontrolných zvierat neboli po šiestej imunizácii namerané žiadne protilátky špecifické pre Αβ. Približne polovica zvierat bola liečená počas ďalších troch mesiacov, pričom imunizácie prebiehali v 20., 24. a 27. týždni. Každá z týchto dávok bola podaná v samotnom PBS, t. j. bez Freundovho adjuvantu. Priemerné protilátkové titre zostali počas tejto periódy nezmenené. V skutočnosti sa zdalo, že protilátkové titre zostali v období od piatej do deviatej imunizácie nezmenené.

U časti rezov z myší liečených ANI792 a PBS bolo skúšané, či pozitívne reagujú s protilátkou špecifickou pre myší IgG, a to s cieľom zistiť, či Αβ-špecifické protilátky, vyvolané v myšiach pôsobením ANI792, boli tiež spojené s mozgovými amyloidnými plakmi. Na rozdiel od skupiny liečenej PBS, boli Αβ plaky v mozgoch vystavených pôsobeniu ANI792 pokryté endogénnym IgG. Tento rozdiel mohol byť pri obidvoch skupinách pozorovaný v 15. aj 18. mesiaci. Prekvapujúca bola najmä neprítomnosť IgG v skupine liečenej PBS, aj keď mozgy týchto myší obsahovali rozsiahle amyloidné usadeniny. Tieto výsledky ukazujú, že imunizácia pomocou syntetického proteínu Αβ vedie k vzniku protilátok, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na Αβ v amyloidných usadeninách.

7. Bunkovo sprostredkované imunitné odpovede

Z deviatich myší (18 mesačné PDAPP myši) imunizovaných ANI792 a z 12 myší imunizovaných PBS sa sedem dní po deviatej imunizácii vybrali sleziny. Splenocyty boli izolované a kultivované počas 72 h v prítomnosti Αβ40, Αβ42 alebo Αβ40-1 (proteín s obrátenou sekvenciou). Mitogén Con A slúžil ako pozitívna kontrola. Optimálne odpovede sa dosiahli s menej ako 1,7 μΜ proteínom. Bunky so všetkých deviatich zvierat liečených ANI792 odpovedali na aplikáciu proteínu Αβ1-40 alebo Αβ1-42 proliferáciou, pričom hodnoty inkorporácie obidvoch proteínov boli zhodné (obr. 6, horná časť). Aplikáciou reverzného proteínu Αβ40-1 nebola dosiahnutá žiadna odpoveď. Bunky z kontrolných zvierat žiadnym spôsobom nereagovali na žiadny z Αβ proteínov (obr. 6, spodná časť).

C. Záver

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že imunizácia pomocou ANI792 vedie u PDAPP myší, ktoré sa vyznačujú výskytom amyloidných usadenín, k spomaleniu a prevencii postupného ukladania amyloidu, pričom s amyloidom súvisiace neuropatologické zmeny sú tiež odvrátené. Imunizácia s ANI792 podstatne zastavila amyloidné ukladanie v štruktúrach, ktoré by za normálnych okolností podľahli amyloidóze. Podávanie peptidu Αβ je teda prospešné pri liečbe AD.

Príklad 3

Príprava polyklonálnych protilátok na pasívnu ochranu

125 netransgénnych myší bolo imunizovaných Αβ s adjuvantom a usmrtených po 4 až 5 mesiacoch. Krv z každej myši bola odobratá a IgG bolo izolované od ostatných krvných zložiek. Protilátky špecifické pre daný imunogén môžu byť čiastočne prečistené pomocou afinitnej chromatografie. Z každej myši bol získaný priemerne 0,5 až 1 mg pre imunogén špecifickej protilátky, čo celkovo znamenalo 60 až 120 mg.

Príklad 4

Pasívna imunizácia s protilátkami proti Αβ

Skupinám 7- až 9- mesačných PDAPP myší bolo injektované v PBS 0,5 mg/myš polyklonálnej protilátky

SK 288207 Β6 anti-Αβ alebo monoklonálnej protilátky anti-Αβ (pozri nižšie). Všetky prípravky protilátok boli s cieľom nízkej hladiny endotoxínu prečistené. Monoklonálne protilátky proti danému fragmentu sa môžu získať injekciou fragmentu alebo dlhšej formy Αβ do myši, prípravou hybridómov a ich testovaním na protilátku, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný fragment Αβ bez toho, že by sa viazala na iné špecifické fragmenty Αβ.

Tabuľka 7

Protilátka

2H3

10D5

266

21F12 myšia polyklonálna proti ľudskému Αβ42

Epitop

Αβ1-12

Αβ1-12

Αβ13-28

Αβ33-42 proti agregovanému Αβ42 proti agregovanému Αβ42

Myšiam boli počas 4 mesiacov injektované i. p. protilátky proti Αβ42 alebo inému imunogénu tak, aby sa dosiahla hladina cirkulujúcich protilátok s titrom vyšším ako 1 : 1000, čo bolo merané pomocou ELISA. Monitorovanie titrov sa uskutočňovalo uvedeným spôsobom s tým, že myši boli usmrtené na konci 6. mesiaca podávania injekcií. Histochémia, hladiny Αβη a toxikologické analýzy sa uskutočnili posmrtne. V každej skupine bolo 10 myší. Ďalšie štúdie pasívnej imunizácie sú opísané v príkladoch 11 a 12.

Príklad 5

Liečba protilátkami proti Αβ

Pokusy opisované v tejto časti boli uskutočnené preto, aby bolo možné určiť schopnosti rôznych monoklonálnych a polyklonálnych protilátok proti Αβ na inhibíciu hromadenia Αβ v mozgu heterozygotných transgénnych myší.

A. Štúdia 1

1. Schéma štúdie samíc a samcov heterozygotných transgénnych PDAPP myší, vo veku od 8,5 do 10,5 mesiaca, bolo získaných z Charles River Laboratories. Myši boli roztriedené do šiestich skupín vystavených pôsobeniu rôznych protilátok proti Αβ. Zvieratá boli rozdelené tak, aby ich pohlavie, vek a pôvod boli v rámci skupiny čo najmenej odlišné. Ako je vidieť z tabuľky 8, zahŕňali protilátky štyri myšie monoklonálne protilátky špecifické proti Αβ, 2H3 (zameraná na Αβ zvyšky 1 až 12), 10D5 (zameraná na Αβ zvyšky 1 až 16), 266 (zameraná na Αβ zvyšky 13 až 28 a viažuca sa na monomému, ale nie na agregovanú formu AN1792), 21F12 (zameraná na Αβ zvyšky 33 až 42). Piata skupina bola liečená frakciou polyklonálnej protilátky špecifickej proti Αβ (pripravenej imunizáciou agregovaným ANI792). Skupina predstavujúca negatívnu kontrolu dostávala len PBS bez protilátky.

Monoklonálne protilátky boli injektované v dávke okolo 10 mg/kg (za predpokladu, že myši vážili 50 g). Injekcie boli aplikované intraperitoneálne každý siedmy deň tak, aby titre anti-Αβ boli udržiavané nad 1000. Aj keď boli namerané nižšie titre u mAb 266, zrejme z dôvodu zlej väzby na agregovaný ANI792, rovnaký dávkovací postup bol používaný pre celú skupinu. Skupina, ktorá dostávala monoklonálnu protilátku 2H3, bola z pokusu vyradená počas prvých troch týždňov, pretože protilátka bola in vivo príliš rýchlo odbúravaná. Na meranie protilátkových titrov bola zvieratám odoberaná krv vždy pred každou dávkou. Liečba prebiehala 6 mesiacov, celkovo počas 196 dní. Zvieratá boli usmrtené jeden týždeň po poslednej dávke.

Tabuľka 8

Experimentálna stavba štúdie 006

Liečebná skupina	Na	Liečebná protilátka	Špecifita protilátky	Izotyp protilátky
1	9	žiadna (samotné PBS)	NAb	NA
2	10	polyklonálna	Αβ1-4 2	zmiešané
3	0	mAbc2H3	Αβ1-12	IgGl
4	8	mAb 10D5	Αβ1-16	IgGl
5	6	mAb 266	A13-28	IgGl

SK 288207 Β6

Liečebná .

skupina

Liečebná protilátka Špecifita protilátky

8 mAb21F12 A33-42 “Počet myší v skupine pri skončení pokusu. Všetky skupiny mali na začiatku 10 zvierat ^bNA: nemerateľná ^cmAb: monoklonálna protilátka

Izotyp protilátky

IgG2a

2. Materiál a spôsoby

b. Príprava protilátok

Polyklonálna protilátka proti Αβ bola pripravená z krvi získanej z dvoch skupín zvierat. Prvá skupina bola zložená zo 100 samíc myší Swiss Webster, 6 až 8 týždňov starých, ktoré boli v dňoch 0, 15 a 29 imunizované 100 pg AN1792 s CFA/IFA. Štvrtá injekcia, ktorá obsahovala polovičnú dávku AN1792, bola podaná 36. deň. Zvieratá boli po usmrtení (42. deň) zbavené krvi, z ktorej bolo potom izolované sérum. Séra všetkých zvierat boli zmiešané (celkový objem 64 ml). Druhá skupina bola zložená z 24 samíc izogénnych s PDAPP myšami, ale netransfektovaných ľudským APP génom, 6 až 9 týždňov starých, ktoré boli v dňoch 0, 14, 28 a 56 imunizované 100 pg ANI792 s CFA/IFA. Zvieratá boli po usmrtení (63. deň) zbavené krvi, z ktorej bolo potom izolované sérum. Séra všetkých zvierat boli zmiešané (celkový objem 14 ml). Séra z obidvoch skupín boli zmiešané. Protilátková frakcia bola prečistená v dvoch následných zrážacích krokoch pomocou 50 % nasýteného síranu amónneho. Výsledná zrazenina bola dialyzovaná PBS a testovaná na výskyt endotoxínu. Hladina endotoxínu bola menšia ako 1 EU/mg.

Monoklonálne protilátky proti Αβ boli pripravené z ascitovej tekutiny. Ľadovo vychladená ascitová tekutina bola za miešania na ľade najskôr zbavená lipidov pridaním koncentrovaného dextransulfátu sodného s výslednou koncentráciou 0,238 %. Za neustáleho miešania bol pridaný CaCl₂ až do dosiahnutia výslednej koncentrácie 64 mM. Roztok bol centrifugovaný pri 10000 x g a vzniknutá peleta bola potom odstránená. K supematantu bol na ľade kvapkaním pridaný rovnaký objem nasýteného síranu amónneho. Roztok bol znovu centrifugovaný pri 10000 x g a vzniknutá peleta bola potom odstránená. Peleta bola resuspendovaná a dialyzovaná 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Táto frakcia bola nanesená na kolónu Pharmacia FPLC Sepharose Q a vyluhovaná reverzným gradientom od 0,4 M do 0,275 M NaCl v 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Frakcia s maximálnym obsahom protilátky bola po určení meraním absorbancie pri 280 nm zhromaždená. V prípravku s obsahom očistenej protilátky bola zmeraná spôsobom BCA koncentrácia proteínu a jeho čistota pomocou SDS-PAGE. V prípravku sa zisťoval tiež obsah endotoxínu. Hladina endotoxínu bola menšia ako 1 EU/mg. Titre menšie ako 100 boli vyhodnotené ako titre s hodnotou 25.

3. Hladiny Αβ a APP v mozgu.

Po asi šiestich mesiacoch liečby s rôznymi prípravkami protilátok Αβ boli zo zvierat mozgy vybraté a premývané soľným roztokom. Jedna hemisféra bola pripravená na imunohistochemickú analýzu, druhá bola použitá na kvantifikáciu množstva Αβ a APP. Na meranie koncentrácie rôznych foriem Αβ a APP boli v 5 M guanidíne homogenizované hipokampálne, kôrové a mozočkové oblasti vybratej hemisféry. Homogenáty boli rozriedené (sériové riedenie) a následne bolo zistené množstvo amyloidu alebo APP. Kvantifikácia bola založená na porovnaní výsledkov ELISA testov s radom štandardov peptidov Αβ alebo APP so známou koncentráciou.

Množstvo celkového Αβ a Αβ1-42, merané spôsobom ELISA v homogenátoch mozgovej kôry, hipokampe a mozočku je uvedené v tabuľkách 8 a 9. Stredná hodnota koncentrácie celkového Αβ v kontrolnej skupine, naočkovanej PBS, bola 3,6-krát vyššia v hipokampe (stredná hodnota 63389 ng/g) ako v kôre (stredná hodnota 17818 ng/g). Stredná hodnota v mozočku z kontrolnej skupiny (30,6 ng/g) bola viac ako 2000-krát nižšia ako hodnota v hipokampe. Tieto hladiny zodpovedajú hodnotám, ktoré boli pre heterozygotné transgénne myši s rovnakým vekom publikované skôr (Johnson-Woods a kol., 1997).

V kôre vykazovala jedna skupina (zvieratá, ktorým bola aplikovaná polyklonálna protilátka anti-Ab) strednú hodnotu množstva Αβ, meraného ako Αβ1-42, ktorá sa významne líšila od hodnôt kontrolnej skupiny (p < 0,05) (tabuľka 9). Stredná hodnota hladiny Αβ1-42 bola pri tejto skupine znížená v porovnaní s kontrolnou skupinou o 65 %. Stredná hodnota hladín Αβ1-42 bola v porovnaní s kontrolnou skupinou významne znížená (o 55 %) tiež v ďalšej testovanej skupine (zvieratá, ktorým bola aplikovaná mAb 10D5, p = 0,0433).

V hipokampe neboli stredné zníženia celkového Αβ (o 50 %, p = 0,0055), ktoré boli spojené s pôsobením polyklonálnej protilátky anti-Ab tak veľké ako v kôre (o 65 %) (tabuľka 10). Absolútna veľkosť poklesu bola však v hipokampe v porovnaní s kôrou 3-krát väčšia (pokles o 31683 ng/g tkaniva v hipokampe v porovnaní s 11658 ng/g tkaniva v kôre). V prípade merania hladiny Αβ1-42 (viac amyloidná forma Αβ), skôr ako celkového Αβ, dosiahlo zníženie s polyklonálnou protilátkou význam (p = 0,0025). Stredné hladiny v skupinách liečených monoklonálnymi protilátkami 10D5 a 266 boli znížené o 33 %, resp. 21 %.

Celkový Αβ bol meraný aj v mozočku (tabuľka 11). Skupiny, ktorým bola aplikovaná polyklonálna protilátka anti-Ab a mAb

Tabuľka 9

Kôra
Liečebná skupina	N*	Stredné hodnoty	Priemery
		Celkový Αβ	Αβ42	Celk. Αβ	Αβ42
		ELISA hodn?	P hodn.c	% zmeny	ELISA hodn.	P hodn.	% zmeny	ELISA hodnota	ELISA hodnota
PBS	9	17818	NAd	NA	13802	NA	NA	16150+/- 7456e	12621+/-5738
Polyklo- nálna 3ηύ-Αβ42	10	6160	0,0055	-65	4892	0.0071	-65	5912+/- 4492	4454+Z-3347
mAb 10D5	8	7915	0,1019	-56	6214	0.0433	-55	9695+/- 6929	6943+/-3351
mAb 266	6	9144	0,1255	-49	8481	0.1255	-39	9204+/- 9293	7489+/-6921
mAb 21F12	8	15158	0,2898	-15	13578	0.7003	-2	12481+/- 7082	11005+/-6324

a. Počet zvierat v skupine na konci pokusu

b. ng/g tkaniva

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: nemeratelné

e. Štandardná odchýlka

Tabuľka 10

Hypokampus
Liečebná skupina	N*	Stredné	hodnoty	Priméry
		Celkový Αβ	Αβ42	Celk. Αβ	Αβ42
		ELISA hodn?	P hodn?	% zmeny	ELISA hodn.	P hodnota	% zmeny	ELISA hodn.	ELISA hodn.
PBS	9	63389	NA“	NA	54429	NA	NA	58351+/-133086	52801+14701
Polyklo- nálna 3ηύ-Αβ42	10	31706	0,0055	-50	27127	0,0025	-50	30058+/-22454	248 53+/-18262
mAb 10D5	8	46779	0,0675	-26	36290	0,0543	-33	44581+/-18632	36465+/-17146
m Ab 266	6	48689	0,0990	-23	43034	0,0990	-21	36419+/-27304	32919+/-25372
mAb21F12	8	51563	0,7728	-19	47961	0,8099	-12	57327+/-28927	50305+/-23927

a. Počet zvierat v skupine na konci pokusu

b. ng/g tkaniva

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: nemeratelné e. štandardná odchýlka

Tabuľka 11

Mozoček
Liečebná skupina	Na	Stredné hodnoty	Priemery
		Celkový Αβ	Celkový Αβ
		EL1S hodn?	P hodn?	% zmeny	ELISA hodnota
PBS	9	30,64	ŇÄ3	NA	40,00+/-31,896
Polyklonálna anti-AP42	10	17,61	0,0033	-43	18,15+/-4,36
mAb 10D5	S	21,68	0,0675	-29	27,29+/-19,43
mAb 266	6	16,59	0,0184	-46	19,59+/-6,59
mAb21F12	8	29,80	>0,9999	-3	32,88+/-9,90

a. Počet zvierat v skupine na konci pokusu 20 b. ng/g tkaniva

SK 288207 Β6

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: nemerateľné

e. Štandardná odchýlka

266 vykazovali významné zníženia hladín celkového Αβ (o 43 % a o 46 %, p = 0,0033 a p = 0,0184), v skupine liečenej 10D5 bolo zistené takmer významné zníženie (o 23 %, p = 0,0675).

Spôsobom ELISA boli v kôre a v mozočku zvierat liečených protilátkami a kontrolných (len PBS) zisťované aj koncentrácie APP. Na stanovenie APP boli použité dve rôzne analýzy. Prvá, označená APP-a/FL, rozpoznávala APP-α (a, sekretovaná forma APP, ktorá bola vyseknutá z Αβ sekvencie) a formy APP s úplnou dĺžkou (FL), pričom druhá rozpoznáva len APP-α. Na rozdiel od zníženia hladiny Αβ, pozorovanej u časti liečených zvierat, zostali hladiny APP v porovnaní s kontrolami prakticky nezmenené. Tieto výsledky naznačujú, že imunizácia protilátkami proti Αβ spôsobuje zníženie hladiny Αβ bez toho, že by spôsobovala zníženie hladiny APP.

Na záver je možné povedať, že k významnému zníženiu hladín Αβ došlo u zvierat liečených polyklonálnou protilátkou pripravenou imunizáciou a ANI792 v mozgovej kôre, hipokampe a v mozočku. Liečebné účinky v menšej miere preukázali aj monoklonálne protilátky proti časti amínového konca Αβ1-42, konkrétne proti aminokyselinám 1 až 16 a 13 až 28.

4. Histochemické analýzy

U časti myších mozgov zo skupín liečených PBS, polyklonálnou Αβ42, 21F12, 266 a 10D5 bola kvalitatívne porovnávaná morfológia Αβ-imunoreaktívnych plakov s tou u zvierat z predchádzajúcich experimentov, ktoré dodržiavali štandardné imunizačné postupy s Αβ42.

Najväčšia zmena, a to ako v rozsahu, tak aj vo vzhľade amyloidných plakov, bola pozorovaná u zvierat imunizovaných polyklonálnou protilátkou proti Αβ42. Zníženie amyloidného zaťaženia, rozrušená morfológia plaku a bunkovo sprostredkovaná Αβ imunoreaktivita veľmi pripomínali účinky dosiahnuté štandardným imunizačným postupom. Tieto zistenia sú v súlade s výsledkami dosiahnutými ELISA testami, pri ktorých bolo po aplikácii polyklonálnej protilátky proti Αβ42 zaznamenané významné zníženie celkového Αβ a Αβ42.

V prípade skupiny vystavenej pôsobeniu 10D5 sa tiež dosiahlo zníženie amyloidného zaťaženia a zmien morfológie plaku, spolu so známkami bunkovej Αβ imunoreaktivity. V porovnaní s PBS kontrolami neboli v skupinách liečených 21F12 a 266 zistené žiadne väčšie rozdiely.

5. Meranie protilátkových titrov

Trom myšiam náhodne vybraným z každej skupiny bola vždy pred každou intraperitoneálnou injekciou odobratá krv (celkovo 30 odberov). Protilátkové titre boli určené pomocou väzby, stanovenej technikou sendvičovej ELISA protilátky proti Αβ1-42 na Αβ1-42, ktoré bolo umiestnené v plastových viacjamkových (multi-well plates) miskách (podrobnejšie pozri všeobecný materiál a spôsoby). Priemerné titre polyklonálnych protilátok a monoklonálnych protilátok 10D5 a 21F12 pre každý odber sú ukázané na obr. 9 až 11. V prípade polyklonálnych protilátok mali titre priemernú hodnotu 1 : 1000, pričom v prípade monoklonálnych protilátok 10D5 a 21F12 boli mierne nad touto hodnotou.

6. Lymfoproliferatívna odpoveď

Lymfoproliferácia vyvolaná prítomnosťou Αβ bola zisťovaná v slezinných bunkách, zhromaždených približne 8 dní po poslednej imunizácii. Čerstvo získané bunky (10⁵ na jamku) boli pestované v prítomnosti Αβ1-40 v koncentrácii 5pM/stimuláciu počas 5 dní. Ako pozitívna kontrola slúžili bunky pestované v prítomnosti mitogénu T-buniek, PHA, za negatívnu kontrolu boli považované bunky pestované bez peptidu.

Splenocyty zo starých PDAPP myší, pasívne imunizovaných rôznymi protilátkami anti-Αβ boli in vitro stimulované ANI792, následne boli merané proliferatívne a cytokínové odpovede. Cieľom týchto analýz bolo zistiť, či pasívna imunizácia podporuje predkladanie antigénu a vybavuje tak pre ANI792 špecifické odpovede T-buniek. U myší pasívne imunizovaných protilátkami proti Αβ neboli zistené žiadne AAN1792špecifické proliferatívne a cytokínové odpovede.

B. Štúdia 2

V druhej štúdii bola opakovaná liečba protilátkou 10D5, pričom boli testované ešte dve ďalšie monoklonálne protilátky, 3D6 (Αβ_μ5) a 16C11 (Αβ₃₃^₂). Kontrolné skupiny dostávali buď PBS alebo irelevantnú izotypovo zodpovedajúcu protilátku TM2a. Použité myši boli staršie (11,5 až 12 mesiacov staré heterozygotné myši) ako tie v predchádzajúcej štúdii; ostatné experimentálne podmienky zostali zachované. Po šiestich mesiacoch liečby znížila 10D5 v porovnaní s kontrolami plakové zaťaženie viac ako o 80 % (p = 0,003). 3D6 bolo rovnako účinné a vyvolávalo 86 % zníženie (p = 0,003). Protilátka 16C11 nemala, na rozdiel od obidvoch predchádzajúcich, na plakové zaťaženie žiadny účinok. Podobné výsledky sa dosiahli pri Αβ₄₂ ELISA. Tieto výsledky naznačujú, že protilátková odpoveď proti peptidu Αβ je, pri neúčasti imunity sprostredkova39 nej T-bunkami, na zníženie amyloidného ukladania u PDAPP myší dostatočná, aj keď nie všetky protilátky anti-Ab sú účinné. Predovšetkým sú účinné protilátky zamerané proti epitopom Αβ obsahujúcim aminokyseliny 1 až 5 a 3 až 8.

Tieto štúdie dokazujú, že pasívne podanie protilátok proti Αβ znižuje rozsah ukladania plakov u myšieho modelu Alzheimerovej choroby. Pri udržiavaní miernych sérových koncentrácií (25 až 70 pg/ml) sa protilátky do CNS dostávajú v množstve dostatočnom na to, aby zasiahli amyloidné plaky. Vstup protilátok nebol spôsobom abnormálnej priepustnosti hematoencefalickej bariéry, pretože pri meraní Evansovou modrou nebola zistená zvýšená cievna priepustnosť. Koncentrácia protilátky v mozgovom parenchýme starých PDAPP myší bola rovnaká ako u myší netransgénnych, pričom predstavovala 0,1 % z koncentrácie v sére (bez ohľadu na izotyp).

D. Štúdia 3: Sledovanie väzby protilátky

S cieľom zistiť, či protilátky proti Αβ môžu pôsobiť priamo vnútri CNS, boli mozgy myší (premývané soľným roztokom) z konca príkladu 11 skúmané na prítomnosť periférne aplikovaných protilátok. Nefixované mozgové rezy z kryostatu boli vystavené pôsobeniu fluorescenčného činidla proti myšiemu imunoglobulínu (kozí IgG-Cy3 proti myšiemu IgG). Plaky vnútri mozgov zo skupín 10D5 a 3D6 boli silno obalené protilátkami, pričom skupina 16C11 nevykazovala žiadnu fluorescenciu. S cieľom určiť celkovú oblasť obsadenú plakmi bola u sériových rezov z každého mozgu uskutočnená najskôr imunoreakcia s protilátkou anti-Αβ a potom so sekundárnym činidlom. 10D5 a 3D6 dosiahli po aplikácii v periférii väčšinu plakov v CNS. Plakové zaťaženie bolo na rozdiel od skupiny 1601 v týchto liečených skupinách výrazne znížené. Tieto údaje naznačujú, že periférne aplikované protilátky môžu vstúpiť do CNS, kde priamo spúšťajú odbúravanie amyloidov. Je pravdepodobné, že 1601 sa k plakom dostala tiež, ale nebola schopná sa na ne viazať.

Príklad 6

Všeobecný materiál a spôsoby

1. Meranie protilátkových titrov

Myšiam bola odoberaná krv z malého rezu vo chvostovej žile, pričom do mikroskúmavky bolo potom zhromaždených asi 200 pl krvi. Morčatám bola krv po oholení zadnej časti nad priehlavkom odoberaná z metetarzálnej žily ihlou 18 gauge, pričom potom bola zhromaždená do mikroskúmaviek. Krv sa nechala zrážať počas 1 h pri izbovej teplote (RT) a potom bola vortexovaná a centriíúgovaná pri 14000 x g počas 10 minút, s cieľom oddelenia zrazeniny od séra. Sérum bolo prenesené do čistej mikroskúmavky a skladované pri 4 °C až do stanovenia titra. Protilátkové titre boli merané pomocou ELISA. Mikrotitračné doštičky s 96 jamkami (Costar EIA paltes) boli pokryté 100 pl roztoku s obsahom 10 μΙ/ml Αβ42 alebo S APP alebo iných antigénov (uvedené v jednotlivých príkladoch) v pufri na pokrývanie jamiek (0,1 M fosforečnan sodný, pH 8,5, 0,1 % azid sodný) a ponechané cez noc pri RT. Zvyšný roztok v doštičkách bol odsatý a potom bolo do jamiek pridané sérum (počiatočné riedenie 1 : 100) vo vzorkovom rozpúšťadle (0,014 M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,6 % sérový hovädzí albumín, 0,05 % tiomersal). Priamo v doštičkách boli vzorky v siedmich krokoch sériovo nariedené (v násobkoch troch), pričom výsledné riedenie bolo 1 : 218700 a inkubované počas 1 h pri RT. Doštičky boli potom štyrikrát opláchnuté PBS s obsahom 0,05 Tween 20. Druhá protilátka, kozí IgG proti myšiemu IgG konjugovaný s chrenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim), bol pridaný do jamiek ako 100 pl roztoku riedeného vo vzorkovom rozpúšťadle 1 : 3000 a inkubovaný počas 1 h pri RT. Doštičky boli potom znovu štyrikrát opláchnuté v PBS s Tween 20. Na vyvolanie chromogénu bolo do každej jamky pridaných 100 pl Slow TMB (3,3', 5,5'-tetrametylbenzidín, Pierce Chemicals), a potom nasledovalo 15 minút inkubácie pri RT. Reakcia bola zastavená pridaním 25 pl 2 M H₂S0₄. Intenzita zafarbenia bola vyhodnotená pomocou prístroja Vmax (Molecular Devices) pri 450 až 480 nm.

Titre boli definované ako prevrátené hodnoty riedenia séra, ktoré predstavovalo polovicu maximálnej OD. Maximálna OD bola určená pri počiatočnom riedením 1 : 100, čo neplatilo len v prípadoch s veľmi vysokými hodnotami titrov, pre ktoré bolo nutné za maximálnu OD určiť vyššie počiatočné riedenie. Ak 50 % bodov zapadá medzi dve riedenia, potom sa hodnota výsledného titra spočítala pomocou lineárnej extrapolácie. Na spočítanie geometrického priemeru protilátkových titrov boli titre menšie ako 100 vyhodnotené ako titre s hodnotou 25.

2. Analýza proliferácie lymfocytov

Myši boli umŕtvené izofluranom. Sleziny boli odobraté a dvakrát opláchnuté s 5 ml PBS obsahujúcim 10 % tepelne inaktivované fetálne teľacie sérum (PBS-FBS), a potom v 1,5 PBS-FBS počas 10 s pri 100 rpm homogenizované pomocou zariadenia Centricon 50 (Dáko A/S, Denmark) v Medimachine (Dáko). Homogenizát bol potom prefiltrovaný cez nylonovú sieť s pórmi s veľkosťou 100 pm. Splenocyty boli jedenkrát opláchnuté v 15 ml PBS-FBS a peletované centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút. Červené krvinky boli lyzované resuspendovaním pelety v 5 ml pufra (0,15 M NH₄C1, 1 M KHCO₃, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4) počas 5 minút pri RT. Rovnako boli potom prepláchnuté leukocyty. Čerstvo izolované slezinné bunky (10⁵ buniek na jamku) boli pestované v triplikátoch v 96-jamkových mikrotitračných doštičkách, určených pre tkanivové kultúry a s dnom v tvare písmena U (Corning, Cambridge, MA) počas 96 h pri 37 °C. Na pestovanie bolo použité médium RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) doplnené 2,05 mM L-glutamínom, 1 % penicilín/streptomycín a 10 % tepelne inaktivovaným FBS. V štyroch bokoch boli v dávkach od 5 do 0,18 μΜ pridané tiež rôzne Αβ peptidy (Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 alebo proteín s obrátenou sekvenciou Αβ40-1). Bunky v kontrolných jamkách boli pestované s konkanavalínom A (ConA) (Sigma, kat. č. C-5275, 1 pg/ml) bez pridaného proteínu. Na posledných 24 h pestovania bol k bunkám pridaný ³H-tymidín (1 pCi/jamku, Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Potom boli bunky zhromaždené na miskách UniFilter a rádioaktivita spočítaná v zariadení Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Výsledky sú vyjadrené ako cpm (záblesky za minútu) rádioaktivity inkorporovanej do nerozpustných molekúl.

4. Preparácia mozgového tkaniva

Po umŕtvení myší boli ich mozgy vybraté a jedna hemisféra bola pripravená na imunohistochemickú analýzu, druhá bola použitá na kvantifikáciu množstva Αβ a APP v hipokampe, kôre a mozočku pomocou špecifických ELISA (Johnson a kol., pozri vyššie).

Tkanivá určené pre ELISA boli homogenizované v 10 dieloch ľadovo studeného guanidinového pufra (5,0 M guanidín-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenáty boli premiešané jemným miešaním počas 3 h pri RT s použitím prístroja Adams Nutator (Fisher) a pred kvantifikáciou Αβ a APP uchovávané pri -20 °C. Predchádzajúce pokusy ukázali, že analyty boli za týchto skladovacích podmienok stabilné a že proteín zostal čo sa týka množstva zachovaný, čo bolo zistené pridaním syntetického Αβ proteínu (Bachem) do homogenátu mozgov z kontrolných zvierat (Johnson a kol., pozri vyššie).

5. Meranie hladín Αβ

Mozgové homogenáty boli nariedené 1 : 10 s ľadovo studeným kazeínovým rozpúšťadlom (0,25 % kazeín, 0,05 % azid sodný, 20 pg/ml aprotinín, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptín), a potom centrifugované pri 16000 x g počas 20 minút pri 4 °C. Štandardy syntetického proteínu Αβ (1 až 42 aminokyselín) a štandardy APP boli pripravené tak, aby výsledné zloženie obsahovalo 0,5 M guanidínu a 0,1 % hovädzieho sérového albumínu (BSA). Technika sendvičovej ELISA na zistenie totálneho Αβ používala monoklonálnu protilátku 266, špecifickú pre aminokyseliny 13 až 28 v Αβ (Seubert a kol.) ako prichytenú protilátku a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 3D6, špecifickú pre aminokyseliny 1 až 5 (Johnson-Wood a kol.), ako referenčnú (reportér) protilátku. Monoklonálna protilátka 3D6 nerozpoznávala vylučované APP alebo APP s úplnou dĺžkou, ale len formy Αβ s kyselinou asparagovou na amínovom konci. Dolná hranica citlivosti sa v tejto analýze nachádza okolo 50 ng/ml, pričom krížové reakcie s myším endogénnym Αβ proteínom sa neobjavujú až do koncentrácie 1 ng/ml (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie).

Technika sendvičovej ELISA špecifická pre Αβ1-42 používala monoklonálnu protilátku 21F12, špecifickú pre aminokyseliny 33 až 42 v AU (Seubert a kol.) ako prichytenú protilátku a opäť biotinylovanú monoklonálnu protilátku 3D6 ako referenčnú protilátku. Dolná hranica citlivosti je v tejto analýze nižšia a nachádza sa okolo 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood a kol.). Pre ELISA testy Αβ bolo buď 100 pl mAb 266 (10 pg/ml), alebo mAb 21F12 (5 pg/ml) aplikovaných na misky s 96 jamkami určené na imunoanalýzy (Costar) a ponechaných cez noc pri 4 °C. Roztok bol odstránený odsatím a jamky boli blokované pridaním 200 pl 0,25 % ľudského sérového albumínu v PBS pufri počas najmenej 1 h pri RT. Blokovací roztok bol odstránený a misky boli až do použitia uchované vysušené pri 4 °C. Misky boli pred použitím hydratované pomocou oplachovacieho pufra (Tris pufrovaný roztok solí (0,115 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05 % Tween 20). Vzorky a štandardy boli pridané z podielov v triplikátoch, 100 pl na jamku, a potom inkubované cez noc pri 4 °C. Misky boli medzi jednotlivými krokmi v analýze najmenej trikrát opláchnuté pomocou oplachovacieho pufra. Biotinylovaná mAb 3D6, nariedená na 0,5 pg/ml v kazeínovom pufri (0,25 % kazeín, PBS, 0,5 % Tween 20, pH 7,4) bola pridaná a inkubovaná v jamkách počas 1 h pri RT. Konjugát avidínu a chrenovej peroxidázy (Avidin-HRP, Vector, Burlingame, CA), nariedený 1 : 4000 v kazeínovom pufri, bol pridaný do jamiek na 1 h pri RT. Kolorimetrický substrát, Slow TMB-ELISA (Pierce) bol pridaný a ponechaný reagovať 15 minút pri RT. Potom bola enzymatická reakcia zastavená pridaním 25 pl 2 N H₂SO₄. Produkt reakcie bol kvantifikovaný s použitím čítacieho prístroja Vmax (Molecular Devices), ktorý meral rozdiel absorbancií pri 450 a 650 nm.

6. Meranie hladiny APP

Na meranie hladín APP boli použité dve rôzne analýzy. Prvá, označená ΑΡΡ-α/FL, rozpoznávala APP-a (a, sekretovaná forma APP, ktorá bola vyrezaná z Αβ sekvencie a obsahovala prvých 12 aminokyselín Αβ) a formy APP s úplnou dĺžkou (FL), pričom druhá rozpoznáva len APP-a. Keďže referenčná protilátka (2H3) nie je špecifická pre skupinu α-časti vyskytujúcu sa medzi aminokyselinami 612 až 613 v APP695 (Esch a kol., Science 248, 1122 - 1124, 1990); táto analýza tiež rozpoznáva APP s úplnou dĺžkou (APP-FL). Predbežné pokusy, uskutočňované s cieľom očistiť mozgové homogenáty od APP-FL a používajúce imobilizova41

SK 288207 Β6 né APP protilátky špecifické pre cytoplazmatický koniec v APP-FL, naznačili, že približne 30 až 40 % z ΑΡΡ-α/FL je FL (údaje nie sú uvedené). Analýzy ΑΡΡ-α/FL aj APP-α používali monoklonálnu protilátku 8E5, špecifickú pre aminokyseliny 444 až 592 v APP695 (Gamest a kol., pozri vyššie) ako prichytenú protilátku a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 2H3 (APP-a/FL analýza), špecifickú pre aminokyseliny 597 až 608 (Johnson-Wood a kol.), a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 16H9, špecifickú pre aminokyseliny 605 až 611, ako referenčnú protilátku. Dolná hranica citlivosti týchto analýz sa v prípade APP-a/FL nachádza okolo 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie) a v prípade APP-α okolo 22 ng/ml (0,3 nm). V obidvoch APP analýzach bola mAb 8E5 aplikovaná na 96-jamkové misky pre EIA spôsobom opísaným pre mAb 266 (pozri vyššie). Ako referenčný štandard pre analýzy APP-α a APP-a/FL bolo použité prečistené rekombinantné sekretované APP-α (Esch a kol., pozri vyššie). Vzorky s mozgovými homogenátmi v 5 M guanidínu boli nariedené 1 : 10 vo vzorkovom pufri pre ELISA (0,014 M fosfátový pufor, pH 7,4, 0,6 % hovädzí sérový albumín, 0,05 % tiomersal, 0,5 M NaCl, 0,1 % NP40). Potom boli nariedené 1 : 4 vo vzorkovom pufri s 0,5 M guanidínom. Nariedené homogenáty boli potom centrifugované pri 16000 x g počas 15 s pri RT. Vzorky a štandardy APP boli pridané z podielov na misky v duplikátoch a inkubované cez noc pri 4 °C. Biotinylovaná referenčná protilátka 2H3 alebo 16H9 bola inkubovaná so vzorkami počas 1 h pri RT. Konjugát streptavidínu a alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim), riedený 1 : 1000 vo vzorkovom pufri, bol inkubovaný v jamkách počas 1 h pri RT. Na 30 minút v RT bol pridaný fluorescenčný substrát (4-metyl-umbelliferyl-fosfát) a misky boli analyzované fluorimetrom Cytofluor 2350 (Millipore), pričom excitácia pribiehala pri 350 nm a emisia pri 450 nm.

7. Imunohistochémia

Mozgy boli fixované počas 3 dní pri 4 °C v 4 % paraformaldehyde v PBS, a potom dovtedy, kým boli narezané skladované 1 až 7 dní pri 4 °C v 1 % paraformaldehyde v PBS.

Koronálne rezy 40 pm hrubé boli nakrájané na vibratóme pri RT a skladované v kryoprotektante (30 % glycerol, 30 % etylénglykol vo fosfátovom pufri) pri -20 °C predtým, ako boli použité na imunohistochemickú analýzu. Z každého mozgu bolo získaných 6 rezov v oblasti dorzálneho hipokampu (medzera medzi rezmi bola vždy 240 pm), ktoré boli cez noc inkubované s jednou z nasledujúcich protilátok: (1) biotinylovaná antiΑβ (mAb, 3D6, špecifická pre ľudské Αβ) nariedená v koncentrácii 2 pg/ml v PBS s 1 % konským sérom; alebo (2) biotinylovaná mAb špecifická pre ľudské APP, 8E5, nariedená v koncentrácii 3 pg/ml v PBS s 1 % konským sérom; (3) mAb špecifická pre gliálny vláknitý acidický proteín (GFAP, Sigma Chemical Co.), nariedená 1 : 500 v 0,25 % Triton X-100 s 1 % konským sérom v soľnom roztoku pufrovanom Tris, pH 7,4 (TBS); alebo (4) mAb špecifická pre CDllb, MAC-1 antigén (Chemicon International), nariedená 1 : 100 v 0,25 % Triton X-100 s 1 % králičím sérom v TBS; alebo (6) krysia mAb špecifická pre CD43 (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (7) krysia mAB špecifická pre CD45RA (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (8) krysia mAB špecifická pre CD45RB (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (9) krysia mAB špecifická pre CD45 (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (10) biotinylovaná polyklonálna škrečkovská protilátka špecifická pre CD3e (Pharmingen) nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (11) krysia mAb špecifická pre CD3 (Serotec), nariedená 1 : 200 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (12) roztok PBS bez primárnej protilátky a obsahujúci 1 % normálne konské sérum.

Rezy určené na reakciu s roztokmi protilátok 1, 2 a 6 až 12 boli najskôr vystavené pôsobeniu 1 % Triton X-100 a 0,4 % peroxidu vodíka v PBS počas 20 minút pri RT, s cieľom zablokovať endogénnu peroxidázu. Potom boli cez noc inkubované pri 4 °C s primárnou protilátkou. Rezy určené na reakciu s 3D6 alebo 8E5 alebo CD3 boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín spolu s časťami komerčnej súpravy, označenej A a B, ktoré boli nariedené 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burliname, CA). Rezy určené na reakciu s protilátkami špecifickými pre CD45RA, CD45RB, CD45, CD3 a roztok PBS bez primárnej protilátky boli inkubované počas 1 h pri RT s biotinylovaným IgG proti krysiemu IgG (Vector), nariedenému 1 : 75 v PBS a41ebo s biotinylovaným IgG proti myšiemu IgG (Vector), nariedeného 1 : 75 v PBS. Rezy boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín spolu s časťami komerčnej sady označenými A a B, ktoré boli nariedené 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

Rezy boli vyvolané v 0,01 % peroxide vodíka, 0,05 % 3,3'-diaminobenzidíne (DAB) pri RT. Rezy určené na inkubáciu s protilátkami špecifickými pre GFAP, MAC-1, MHC II boli najskôr vystavené pôsobeniu 0,6 % peroxidu vodíka pri RT, s cieľom zablokovať endogénnu peroxidázu, a potom inkubované cez noc pri 4 °C s primárnou protilátkou. Rezy, v ktorých prebehla reakcia s protilátkou proti GFAP, boli inkubované počas 1 h pri RT s biotinylovaným konským IgG proti myšiemu IgG (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) nariedeným 1 : 200 v TBS. Rezy boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenováperoxidáza-avidín-biotín(Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) nariedenému 1 : 1000 v TBS. Rezy inkubované s monoklonálnymi protilátkami špecifickými pre MAC-1 a MHC II boli následne vystavené pôsobeniu biotylovaného králičieho IgG proti myšiemu IgG, nariedenému 1 : 200 v TBS, potom boli počas 1 h

SK 288207 Β6 pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín nariedenému 1 : 1000 v TBS. Rezy inkubované s protilátkami špecifickými pre GFAP, MAC-1 a MHC II boli potom pri RT zviditeľňované pôsobením 0,05 % DAB, 0,01 % peroxidu vodíka, 0,04 % chloridu nikelnatého a TBS počas 4 a 11 minút.

Rezy označené protilátkou boli pripevnené na podložné sklá (VWR, Superfrost slides), cez noc vysušené na vzduchu, prepláchnuté v Propar (Anatec) a prekryté krycími sklíčkami s použitím upevňujúceho média Permount (Fisher).

Aby boli zviditeľnené aj plaky Αβ, bola po imunohistochemickom spracovaní časť GFAP-pozitívnych rezov upevnená na sklíčka Superfrost a inkubovaná v 1 % vodnom tioflavíne S (Sigma) počas 7 minút. Rezy boli dehydratované a umyté v Propar a potom prekryté krycími sklíčkami s použitím upevňovacieho média Permount.

8. Obrazová analýza

Na kvantifikáciu imunoreakcií v rezoch bol používaný systém analýzy obrazu Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) pripojený k CCD kamerou k mikroskopu Nikon Microphot-FX a monitoru Sony Trinitron. Obraz rezu bol uložený a na základe farby a sýtosti bol určený prah na výber a výpočet celkovej oblasti obrazových prvkov zobrazujúcich štruktúry, v ktorých prebehla imunitná reakcia. U každého rezu bol ručne urobený obrys hipokampu, a potom vypočítaný celkový priestor obrazových prvkov zobrazujúcich hipokampus. Percento amyloidného zaťaženia bolo merané ako: (časť hipokampálnej oblasti obsahujúcej usadeniny Αβ zistené imunoreakciou s mAb 3D6) x 100. Podobne bolo merané percento neuritického zaťaženia: (časť hipokampálnej oblasti obsahujúca dystrofické neurity reagujúce s monoklonálnou protilátkou 8E5) x 100. Na zistenie percenta retrospleniálnej oblasti obsadenej GFÄP-pozitívnymi astrocytmi a MAC-1- a MHC II-pozitívnou mikrogliou bol použitý systém C-Imaging (Compix, Inc., Cranberry Township, PA), ktorý pracoval s programom Simple 32 Software Application a bol pomocou kamery Optronics napojený na mikroskop Nikon Microphot-FX. Obraz oblasti, v ktorej prebehla imunitná reakcia, bol uložený a na základe jednej farby bol určený prah na výber a výpočet celkovej oblasti obrazových prvkov zobrazujúcich bunky, v ktorých prebehla imunitná reakcia. V každom reze bol ručne urobený obrys retrospleniálnej kôry (RSC), a potom spočítaný celkový priestor obrazových prvkov zobrazujúcich RSC. Percento výskytu astrocytózy bolo merané ako: (časť RSC oblasti obsadenej GFAP-pozitívnymi astrocytmi) x 100. Podobne bolo merané percento mikrogliózy): (časť RSC oblasti obsadenej MAC-1- alebo MHC II-pozitívnou mikrogliou) x 100. U každého zvieraťa bolo pri kvantifikácii obrazovou analýzou z mozgu vybraných šesť rezov v oblasti dorzálneho hipokampu (medzera medzi rezmi bola vždy 240 pm). V žiadnom z prípadov nebol pozorovateľovi (pracovník uskutočňujúci analýzu obrazu) uvedený stav a uskutočňovaná liečba zvieraťa.

Príklad 7

Analýza ex vivo účinku protilátok na amyloidné usadeniny

Na zistenie účinku protilátok na odbúravanie plakov bola použitá ex vivo analýza, pri ktorej boli primáme mikrogliálne bunky pestované s nezafixovanými rezmi z kryostatu, ktoré pochádzali z mozgov PDAPP myší alebo z ľudských mozgov s AD. Mikrogliálne bunky boli získané z mozgovej kôry novorodených DBA/2N myší (1 až 3 dni staré), kôry boli mechanicky rozrušené v HBSS (Hanks' Balanced Sált Solution, Sigma) s 50 μΙ/ml DNázy I (Sigma). Uvoľnené bunky boli prefiltrované cez 100 pm celí stainer (Sigma) a centrifúgované pri 1000 rpm počas 5 minút. Peleta bola resuspendovaná v rastovom médiu (DMEM s vysokým obsahom glukózy, 10 % FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a bunky boli pestované s hustotou 2 mozgy na plastovú kultivačnú fľašu T-75. Po 7 až 9 dňoch boli fľaše stočené na orbitálnej trepačke pri 200 rpm počas 2 h pri 37 °C.

Bunková suspenzia bola centrifúgovaná pri 1000 rpm a resuspendovaná v analytickom médiu.

pm široké kryostatické rezy z mozgov PDAPP myší alebo z ľudských AD mozgov, ktoré boli získané menej ako 3 h po smrti, sa nechali rozohriať upevnené na guľatom krycom sklíčku pokrytom polylyzínom a boli umiestnené do jamiek (24-jamková kultivačná miska). Sklíčka boli dvakrát opláchnuté analytickým médiom obsahujúcim H-SFM (hybridómové médium bez séra, Gibco BRL) s 1 % FBS, glutamínom, penicilín/streptomycínom a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontrola alebo protilátky Αβ boli pridané koncentrované 2-krát (výsledná koncentrácia 5 pg/ml) na 1 hodinu. Mikrogliálne bunky boli potom vysadené s hustotou 0,8 x 10⁶ buniek/ml analytického média. Kultúry boli udržiavané vo vlhčenom inkubátore (37 °C, 5 % CO₂) počas 24 h alebo dlhšie. Na konci inkubácie boli kultúry fixované so 4 % paraformaldehydom a membrány buniek boli narušené pomocou 0,1 % Triton X-100. Rezy boli vystavené pôsobeniu biotinylovanej 3D6, a potom konjugátu streptavidínu a Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Exogénne mikrogliálne bunky boli zviditeľnené jadrovým farbivom (DAPI). Kultúry boli pozorované v invertovanom fluorescenčnom mikroskope (Nikon, TE300) a mikrofotografie boli urobené digitálnou kamerou SPOŤ, s použitím programu SPOŤ (Diagnostic Instruments). Na Westernovu analýzu boli kultúry extrahované 8 M močovinou, nariedenou 1 : 1 v tricínovanom redukujúcom vzorkovom pufri a aplikované na 16 % tricínový gél (Novex). Po prenose na immobilón boli bloty vystavené pôsobeniu pAbAβ42 (5 pg/ml), a potom konjugátu HRP s protilátkou proti myši a vyvolané s ECM (Amersham).

V prípade analýzy uskutočňovanej s rezmi z PDAPP myší v prítomnosti protilátky 16C11 (jedna z protilátok proti Αβ, ktoré in vivo neboli účinné) zostali β-amyloidné plaky nezmenené a nebola pozorovaná žiadna fagocytóza. Keď však boli priľahlé rezy pestované v prítomnosti 10D5, amyloidné usadeniny sa z väčšej časti stratili a mikrogliálne bunky obsahovali početné fagocytáme mechúriky s obsahom Αβ. Rovnaké výsledky sa dosiahli u rezov z AD mozgov; 10D5 vyvolala fagocytózu AD plakov, zatiaľ čo 16C11 bola neúčinná. Porovnateľné výsledky boli pozorované pri analýzach uskutočnených buď s myšími, alebo ľudskými mikrogliálnymi bunkami, a tiež s myšími, králičími alebo ľudskými protilátkami proti Αβ.

Tabuľka 13 ukazuje výsledky získané s rôznymi protilátkami proti Αβ, porovnáva ich schopnosti vyvolať fagocytózu pri ex vivo analýze a znížiť plakové zaťaženie in vivo pri štúdiách pasívneho prieniku. Aj keď sa 16C11 a 21F12 viazali na agregovaný syntetický Αβ s veľkou ochotou, neboli tieto protilátky schopné reagovať s β-amyloidnými plakmi v nefixovaných mozgových rezoch, neboli schopné spustiť fagocytózu pri ex vivo analýze a neboli účinné ani in vivo. 10D5, 3D6 a polyklonálna protilátka proti Αβ vykazovali vo všetkých troch uvedených bodoch účinné pôsobenie. Protilátka 22C8 sa silnejšie viaže na analóg formy prirodzene sa vyskytujúceho Αβ, ktorý je charakteristický zámenou kyseliny asparagovej z pozíciách 1 a 7 za kyselinu izoasparagovú. Tieto výsledky ukazujú, že in vivo účinnosť sa prejavuje priamym odbúravaním plaku vnútri CNS, sprostredkovaným protilátkami, a že analýza ex vivo predpovedá účinnosť in vivo.

Rovnaká analýza bola použitá pri testovaní očisťovacej schopnosti (sprostredkovania odbúravania plaku) protilátky proti fragmentu synukleínu, nazývanému NAC. U synukleínu sa preukázalo, že je proteínom spojeným s amyloidnými plakmi. Protilátka proti NAC bola opísaným spôsobom aplikovaná na vzorku mozgového tkaniva obsahujúcemu amyloidné plaky a mikrogliálne bunky. Ako kontrola bolo použité králičie sérum. Nasledujúce preskúmanie ukázalo jasné zníženie množstva a rozmeru plakov a preukázalo tak očisťovaciu schopnosť tejto protilátky.

Tabuľka 13

Ex vivo analýza pri predpovedi in vivo účinnosti

Protilátka	Izotyp	Afinita k agregovanému Αβ(ρΜ)	Väzba na β- amyloidné plaky	Ex vivo účinok	In vivo účinok
monoklonálna
3D6	lgG2b	470	+	+	+
10D5	IgGl	43	+	+	+
16C11	IgGl	90	-	-	-
21F12	IgG2a	500	-	-	-
TM2a	IgGl	-	-	-	-
Polyklonálna
1-42	Zmes	600	+	+	+

Pri potvrdení, že Αβ bolo počas ex vivo analýzy intemalizované bol použitý spôsob konfokálnej mikroskopie. V prítomnosti kontrolných protilátok zostávajú exogénne mikrogliálne bunky v konfokálnej rovine nad tkanivom, nie sú vidieť žiadne fagocytické mechúriky s Αβ a plaky v rezoch nie sú porušené. V prítomnosti 10D5 sa nachádzal skoro všetok plakový materiál v mechúrikoch exogénnych mikrogliálnych buniek. Na zistenie ďalšieho osudu intemalizovaného peptidu boli kultúry vystavené pôsobeniu 10D5 v rôznych časoch extrahované 8 M močovinou a preskúmané pomocou Westernovej analýzy. V čase 1 h, keď ešte nebolo možné pozorovať fagocytózu, bol po reakcii s polyklonálnou protilátkou proti Αβ zjavný pásik silný 4 kDa (zodpovedajúci peptidu Αβ). Αβ imunoreaktivita klesla počas prvého dňa a na tretí deň už nebola prítomná. To znamená, že fagocytóza Αβ sprostredkovaná protilátkami vedie k jeho degradácii.

S cieľom zistiť, či fagocytóza v ex vivo analýze prebiehala sprostredkovaná Fc receptormi boli pripravené CF(ab')2 fragmenty protilátky 3D6, špecifickej pre Αβ. Aj keď fragmenty F(ab')2 zachovali úplnú schopnosť viazať sa na plaky, neboli schopné spustiť fagocytózu mikrogliálnych buniek. A ďalej, fagocytóza spustená kompletnou protilátkou mohla byť zastavená látkou blokujúcou myšie Fc receptory (anti-CD 16/32). Tieto výsledky znamenajú, že odbúravanie Αβ in vivo prebieha fagocytózou sprostredkovanou Fc receptormi.

Aj keď predkladaný vynález bol z dôvodu jasnosti a zrozumiteľnosti opísaný podrobnejšie, je zrejmé, že v rozsahu predkladaných nárokov je možné uskutočniť určité modifikácie. Všetky citované publikácie a patentové dokumenty sú tak zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti na všetky účely v rovnakej miere, ako by každý z nich bol jednotlivo označený.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob na určenie prognózy pacienta podrobujúceho sa liečbe Alzheimerovej choroby, zahŕňajúci meranie množstva imunoreaktivity proti Αβ peptidu vo vzorke séra pacienta, vyznačujúci sa tým, že množstvo pacientovej sérovej imunoreaktivity, najmenej štyrikrát väčšie ako kontrolná bazálna hodnota, indikuje prognózu zlepšenia vzhľadom na uvedenú Alzheimerovu chorobu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedené pacientove množstvo sérovej imunoreaktivity proti Αβ peptidu je charakterizované sérovým titrom najmenej 1 : 1000.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedené pacientove množstvo sérovej imunoreaktivity proti Αβ peptidu je charakterizované sérovým titrom najmenej 1 5000.

   tým, že pacient je sympže liečba je terapeuže pacient je asymsa tým, že liečba je profys a t ý m , že kontrolná bazál
4. 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3,vyznačujúci tomatický na Alzheimerovu chorobu.
5. 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž3,vyznačujúci tická a pacient je symptomatický na Alzheimerovu chorobu.
6. 6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3,vyznačujúci ptomatický na Alzheimerovu chorobu.
7. 7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3,vyznačujúci laktická a pacient je asymptomatický na Alzheimerovu chorobu.
8. 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3,vyznačujúci na hodnota sérovej imunoreaktivity je pacientovou bazálnou hodnotou imunoreaktivity proti Αβ peptidu pred podrobením sa liečbe.
9. 9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že kontrolná bazálna hodnota sérovej imunoreaktivity sa určí z kontrolnej populácie.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že členovia kontrolnej populácie sa nepodrobili predchádzajúcej liečbe.
11. 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že liečba je aktívna imunizácia s Αβ peptidom.
12. 12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že liečba je pasívna imunizácia s αηύ-Αβ-ρΓούΙέΐ^η.