HRP20010893A2 - Prevention and treatment of amyloidogenic disease - Google Patents

Description

Ova patentna prijava zahtijeva prioritet privremenoj U.S. patentnoj prijavi 60/137,010, podnesenoj 1. lipnja 1999., koja je ovdje inkorporirana u cijelosti.

Područje izuma

Izum se odnosi na pripravke i postupke liječenja stanja uvjetovana amiloidom kod ljudi i drugih kralježnjaka sisavaca.

Pozadina izuma

Amiloidoza je općeniti pojam koji opisuje niz bolesti karakteriziranih izvanstaničnim naslagama proteinskih fibrila, koji tvore brojne “amiloidne naslage”, koji se mogu pojaviti na lokaliziranim mjestima ili sistemski. Vlaknasti sastav tih naslaga predstavlja identificirajuću karakteristiku za različite oblike amiloidne bolesti. Na primjer, intracerebralne i cerebrovaskularne naslage koje se prvenstveno sastoje od fibrila beta amiloidnog peptida (β-AP), karakteristične su za Alzheimerovu bolest (i za uobičajene i za sporadične oblike), peptid amiloidnog proteina iz otočića (IAPP, amilin) karakterističan je za fibrile amiloidnih naslaga u stanicama pankreasnih otočića povezanih s dijabetesom tipa II, te β2-mikroglobulin predstavlja glavnu komponentu amiloidnih naslaga koje nastaju kao posljedica dugotrajnog liječenja hemodijalizom. Nedavno, bolesti povezane s prionima, poput Creutzfeld-Jacobove bolesti, također su svrstane u amiloidne bolesti.

Različiti oblici bolesti razvrstani su u razrede, većinom na temelju toga da li je amiloidoza povezana s osnovnom sistemskom bolešću. Stoga, se određeni poremećaji smatraju primarnim amiloidozama, kod kojih ne postoji dokaz o postojanju prijašnje bolesti ili popratne bolesti. Općenito, za primarne amiloidoze karakteristično je prisustvo amiloida od proteinskih niti “tipa lakih lanaca” (Al-tip), tako nazvanih radi podudaranja N-terminalnog područja AL fibrila s varijabilnim fragmentima lakog lanca imunoglobulina (kapa ili lambda).

Za sekundarnu ili “reaktivnu” amiloidozu karakteristična je naslaga fibrila AA tipa nastala iz seruma amiloidnog A proteina (ApoSSA). Za te oblike amiloidoze karakteristične su osnovne kronične upalne ili infektivne bolesti (npr. reumatoidni artritis, osteomielitis, tuberkuloza, guba).

Ovdje pripadajuće amiloidoze mogu imati udružene neuropatske, bubrežne ili kardiovaskularne naslage tipa transtiretin ATTR. Ostale ovdje pripadajuće amiloidoze uključuju ostale sindrome i mogu imati različite amiloidne komponente (npr. karakteristična mediteranska groznica koju karakteriziraju AA fibrili). Ostali oblici amiloidoza uključuju lokalne oblike, za koje su karakteristične žarišne naslage, koje često izgledaju poput tumora, a koje se pojavljuju u izoliranim organima. Ostale amiloidoze povezane su sa starenjem, a obično ih karakteriziraju formacije plaka u srcu ili mozgu. Također su uobičajene amiloidne naslage povezane s dugotrajnom hemodijalizom. Ovi i ostali oblici amiloidnih naslaga skupno su navedeni u Tablici 1. (Tan, S. Y. i Pepsy, Histopatology 25:403-414, 1994; Harrison’s Handbook of Internal Medicine, 13. izdanje, Isselbacher. K. J., i suradnici, ured. Mc. Graw-Hill, San Francisco, 1995).

[image] [image] aEgzokrini protein sjemenika

Često, fibrili koji stvaraju masu amiloidnih naslaga dobiveni su iz jednog ili više primarnih prekursora proteina ili peptida, te su uobičajeno povezani s sulfoniranim glikozaminoglikanima. Dodatno, amiloidne naslage mogu uključivati manje proteine i peptide različitih tipova, zajedno s drugim komponentama, kao što su proteoglikani, gangliozidi i drugi šećeri, kao što je iscrpnije opisano u dijelu koji slijedi u nastavku.

Trenutno ne postoje specifična liječenja za amiloidne bolesti koja bi bila usmjerena na amiloid. Gdje postoji karakteristično stanje ili stanje povezano s bolešću, terapijom se smanjuje proizvodnja amiloidnih proteina liječenjem karakterističnih bolesti. To se može objasniti primjerom liječenja tuberkuloze antibioticima, pri čemu dolazi do smanjenja broja mikobakterija, što rezultira smanjenjem upale koja je povezana sa smanjenjem SSA proteina. U slučaju AL amiloida zbog multiplog mijeloma, pacijenti se liječe kemoterapijom koja uzrokuje smanjenje broja plazma stanica i snižavanje razine imunoglobulina mijeloma. Kako se te razine smanjuju, tako se može uklanjati AL amiloid. U.S. patentni zahtjevi u suvlasništvu, USSN 09/201,430, popunjen 30. studenog 1998. i USSN 09/322,289, popunjen 28. svibnja 1999. obznanjuju da se količina amiloidnog plaka povezana s Alzheimerovom bolešću može značajno sniziti (i spriječiti) primjenom tvari koje proizvode ili prenose imunološku reakciju usmjerenu na β-amiloidni peptid (Aβ) i njegove fragmente. Otkriće ovog izuma je da je induciranje imunološke reakcije na različite amiloidne komponente plaka učinkovito u postupku liječenja velikog broja amiloidnih bolesti.

Bit izuma

Ovaj izum usmjeren je na farmaceutske pripravke i postupke liječenja niza amiloidnih bolesti. Prema jednom aspektu, izum uključuje farmaceutske pripravke koji uključuju, kao djelatnu tvar, tvar koja učinkovito inducira imunološku reakciju na amiloidnu komponentu kod pacijenta. Takvi pripravci također općenito uključuju pomoćne tvari, a kod pogodnih proizvoda mogu uključivati pomoćna sredstva. Kod daljnjih pogodnih proizvoda, pomoćna sredstva uključuju, na primjer, aluminijev hidroksid, aluminijev fosfat, MPL™, QS-21 (Stimulon™) ili nekompletno Freundovo pomoćno sredstvo. Prema srodnim proizvodima, takvi farmaceutski pripravci mogu uključivati više tvari koji kod pacijenta učinkovito induciraju imunološku reakciju na više od jedne amiloidne komponente.

Kod srodnih proizvoda, tvar učinkovito proizvodi imunološku reakciju usmjerenu na fibrilarni peptid ili amiloidnu proteinsku komponentu. Pogodno je da takav fibrilarni peptid ili protein nastaje iz fibrilarnog prekursora proteina za kojeg je poznato da je povezan s određenim oblicima amiloidnih bolesti, kao što je ovdje opisano. Takvi prekursori proteina uključuju amiloidni A protein iz seruma (ApoSSA), imunoglobulinski laki lanac, imunoglobulinski teški lanac, ApoAI, transtiretin, lizozim, fibrogen α lanac, gelsolin, cistatin C, amiloidni β prekursor proteina (β-APP), Beta2 mikroglobulin, prekursor prionskog proteina (PrP), atrijski natriuretski faktor, keratin, amiloidni polipeptid otočića, peptidni hormon, te sinuklein, no nisu ograničeni na njih. Takvi prekursori također uključuju mutantne proteine, fragmente proteina, te proteolitičke peptide takvih prekursora. Kod pogodnih proizvoda, tvar učinkovito inducira imunološku reakciju usmjerenu na neoepitop kojeg čine fibrilarni protein ili peptid, s obzirom na fibrilarni prekursor proteina. Kao što je puno iscrpnije opisano, mnogi peptidi ili proteini koje tvore fibrili prekursori su proteina, poput onih gore pobrojanih. Kada se formiraju takvi fragmenti, npr. proteolitičkim cijepanjem, za epitope se može pokazati da nisu prisutni na prekursoru te stoga nisu imunološki dostupni imunološkom sustavu, ako je fragment dio prekursora proteina. Tvari usmjerene na takve epitope mogu biti pogodni terapijski agensi, s obzirom da je manje vjerojatno da oni induciraju autoimunološku reakciju kod pacijenta.

Sukladno srodnim proizvodima, farmaceutski pripravci ovog izuma uključuju agense koji su povezani s amiloidnim komponentama, kao što su komponente odabrane iz skupine koja uključuje slijedeće fibrilarne peptide ili proteine, ali nije ograničena samo na njih: AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP i sinuklein-NAC fragment. Puni nazivi i sastav ovih peptida opisani su ovdje.

Sukladno narednim srodnim proizvodima, agensi koji su sadržani u takvim farmaceutskim pripravcima, također uključuju i sulfonirane proteoglikane. U srodnom ostvarenju, proteoglikan je heparin sulfat glikozaminglikan, odnosno pogodnije perlekan, dermatan sulfat, kondroitin-4-sulfat ili pentoza polisulfat.

Sukladno slijedećem aspektu, izum uključuje postupke sprječavanja ili liječenja poremećaja koji su karakterizirani s amiloidnim naslagama kod sisavaca. U skladu s tim aspektom izuma, subjektu se daje takva doza agensa, koja je učinkovita za izazivanje imunološke reakcije protiv amiloidne komponente karakteristične za amiloidni poremećaj od koje pati taj subjekt. U suštini, postupci uključuju davanje farmaceutskih pripravaka koji sadržavaju imunogene amiloidne komponente koje su specifične za poremećaj, poput gore opisanih. Takvi su postupci nadalje karakterizirani svojom djelotvornošću u pobuđivanju imunogene reakcije kod subjekta. U skladu s preferiranim ostvarenjem, postupak učinkovito inducira imunološku reakciju koju karakterizira titar seruma od najmanje 1:1000 u odnosu na amiloidnu komponentu protiv koje je usmjeren imunogeni agens. U slijedećem pogodnom proizvodu, titar seruma iznosi najmanje 1:5000 u odnosu na fibrilarnu komponentu. Prema odgovarajućem ostvarenju, imunološku reakciju karakterizira količina imunoreaktivnosti u serumu koja je više od četiri puta veća nego razina imunoreaktivnosti izmjerena u kontrolnom uzorku seruma prije liječenja. Takva kasnija karakterizacija posebno je pogodna kada je imunoreaktivnost seruma mjerena ELISA tehnikama, ali se može primijeniti kod bilo kojeg relativnog ili apsolutnog određivanja imunoreaktivnosti seruma. U skladu s pogodnim ostvarenjem, imunoreaktivnost se mjeri kod razrjeđenja seruma od približno 1:100.

Prema slijedećem srodnom aspektu, izum uključuje postupak određivanja prognoze za pacijenta koji je podvrgnut liječenju amiloidnog poremećaja. Ovdje se u serumu pacijenta mjeri imunoreaktivnost na amiloidne komponente karakteristične za izabrani poremećaj, te je imunoreaktivnost seruma tog pacijenta koja je najmanje četiri puta veća od bazne linije koju predstavlja razina imunoreaktivnosti kontrolnog seruma indikativna za predviđanje poboljšanja statusa u odnosu na određeni amiloidni poremećaj. U skladu s pogodnim proizvodima, količina imunoreaktivnosti na odabrane amiloidne komponente, prisutne u serumu pacijenta, okarakterizirana je titrom seruma od najmanje 1:1000, ili najmanje 1:5000, s obzirom na amiloidnu komponentu.

U skladu sa srodnim aspektom, izum također uključuje postupke takozvane “pasivne imunizacije” i farmaceutske pripravke za sprječavanje ili liječenje amiloidnih bolesti. U skladu s tim aspektom izuma, pacijentima se daje djelotvorna doza antitijela koja se specifično vežu za odabranu amiloidnu komponentu, a najpogodnije fibrilarnu komponentu koja je prisutna u amiloidnim naslagama karakterističnim za bolest koja se liječi. Općenito, antitijela se odabiru prema njihovoj sposobnosti da specifično vežu različite proteine, peptide, te spojeve koji su opisani s obzirom na farmaceutske pripravke i postupke opisane u prethodnim paragrafima ovog poglavlja. U skladu sa srodnim ostvarenjem, takvi postupci i pripravci mogu uključivati kombinacije antitijela koje vežu najmanje dvije fibrilarne amiloidne komponente. Općenito, farmaceutski pripravci se primjenjuju kako bi se u serumu osigurala razina imunoreaktivnosti protiv ciljane amiloidne komponente, koja je barem četiri puta viša od imunoreaktivnosti protiv te komponente, izmjerene u kontrolnom uzorku seruma. Antitijela se također mogu primjenjivati s nosačem, kao što je ovdje opisano. Općenito, u skladu s tim aspektom izuma, takva će se antitijela davati (ili oblikovati za primjenu) peritonealno, oralno, intranazalno, subkutano, intramuskularno, lokalno ili intravenski, ali mogu se davati ili oblikovati za davanje na bilo koji farmaceutski djelotvoran način (npr. djelotvoran da proizvede indiciranu terapijsku razinu, kako je pokazano gore i ovdje).

U skladu sa srodnim proizvodima, terapeutska antitijela mogu se primjenjivati davanjem polinukleotida koji kodiraju najmanje jedan lanac antitijela pacijentu. U skladu s tim aspektom izuma, dolazi do ekspresije polinukleotid kod pacijenta kako bi se proizveo lanac antitijela u farmaceutski djelotvornoj količini za pacijenta. Takav polinukleotid može kodirati teške i lake lance antitijela, te producirati teške i lake lance antitijela u pacijentu.

U skladu s pogodnim ostvarenjima, gore opisani režimi imunizacije mogu uključivati davanje tvari, uključujući i antitijela, u višestrukim dozama u vremenskom trajanju dužem od 6 mjeseci, kao što je početna imunizacija nakon koje slijede dodatne injekcije u vremenskim intervalima, kao što su šestotjedni intervali, prema stručno poznatim postupcima ili prema pacijentovoj potrebi, što je određeno imunološkom reakcijom. Alternativno, odnosno dodatno, takvi režimi mogu uključivati uporabu pripravaka “s postupnim otpuštanjem”, poput onih koji su stručno poznati.

Ti i ostali predmeti i značajke izuma postat će jasnije vidljivi kada se pročita iscrpni opis izuma u nastavku, povezan s popratnim crtežima.

Kratki opis slika

Slika 1: Titar antitijela kod transgenični miševa nakon injekcije Aβ1-42.

Slika 2: Količina amiloida u hipokampusu. Postotak površine područja hipokampusa kojeg je okupirao amiloidni plak, definiran pomoću reaktivnosti s Aβ-specifičnim monoklonalnim antitijelima 3D6, određen je kompjutorski kvantitativnom analizom slika sekcija mozga u kojima je došlo do imunološke reakcije. Vrijednosti za pojedinačne miševe prikazane su razvrstane prema liječenim skupinama. Horizontalna crta za svaku skupinu prikazuje srednju vrijednost raspodjele.

Slika 3: Distrofija neurita u hipokampusu. Postotak površine područja hipokampusa kojeg je okupirao distrofični neurit, definiran pomoću njihove reaktivnosti s APP-specifičnim monoklonalnim antitijelom 8E5. određen je kompjutorski kvantitativnom analizom slika sekcija mozga u kojima je došlo do imunološke reakcije. Vrijednosti za pojedinačne miševe prikazane su za AN1792-liječenu skupinu, te PBS-liječenu poredbenu skupinu. Horizontalna crta za svaku skupinu prikazuje srednju vrijednost raspodjele.

Slika 4: Astrocitoza u retrosplenijalnom korteksu. Postotak područja kortikalne regije okupiran astrocitima pozitivnim na glijalne fibrilarne kisele proteine (GFAP) određen je kompjutorski, kvantitativnom analizom slika sekcija mozga u kojima je došlo do imunološke reakcije. Vrijednosti za pojedinačne miševe prikazane su razvrstane prema liječenim skupinama, a srednje vrijednosti za skupine prikazane su horizontalnom crtom.

Slika 5: Geometrijska sredina titra antitijela na Aβ42 nakon čega slijedi imunizacija u području od osam doza Aβ42 (“AN1792”) koje sadržavaju 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 ili 300 μg.

Slika 6: Kinetika reakcije antitijela na AN1792 imunizaciju. Titri su iskazani kao geometrijska sredina vrijednosti za 6 životinja u svakoj skupini.

Slika 7: Kvantitativna analiza slika kortikalne količine amiloida kod liječenih PBS i AN1792 miševa.

Slika 8: Kvantitativna analiza slika količine plaka na neuritu kod liječenih PBS i AN1792 miševa.

Slika 9: Kvantitativna analiza slika postotka retrosplenalnog korteksa okupiranog astrocistozom kod liječenih PBS i AN1792 miševa.

Slika 10: Određivanje proliferacije limfocita na stanicama slezene dobivene od liječenih miševa AN1792 (gornji prikaz) ili PBS (donji prikaz).

Slika 11: Ukupne Aβ razine u cerebralnom korteksu. Raspršeni prikaz pojedinačnih Aβ dijagrama kod miševa imuniziranih s Aβ ili APP derivatima koji su kombinirani s Freundovim pomoćnim sredstvima.

Slika 12: Količina amiloida u korteksu, određena kvantitativnom analizom slike sekcija mozga u kojima je došlo do imunološke reakcije kod miševa imuniziranih s Aβ peptidnim konjugatima Aβ1-5, Aβ1-12 i Aβ13-28; Aβ agregati pune duljine Aβ42 (“AN1792”) i Aβ1-40 (“AN1528”), te PBS liječenja poredbena skupina.

Slika 13: Geometrijska sredina titara Aβ-specifičnih antitijela za skupine miševa imuniziranih s Aβ ili APP derivatima kombiniranim s Freundovim pomoćnim sredstvima.

Slika 14: Geometrijska sredina titara Aβ-specifičnih antitijela zamoraca imuniziranih s AN1792 ili njihovim palmitoiliranim derivatima, kombiniranih s različitim pomoćnim sredstvima.

Slika 15: (A-E): Aβ razine u korteksu 12 mjeseci starih PDAPP miševa liječenih s AN1792 ili AN1528 uz različita pomoćna sredstva.

Slika 16: Srednji titar kod miševa liječenih s poliklonalnim antitijelima na Aβ.

Slika 17: Srednji titar kod miševa liječenih s monoklonalnim antitijelima10D5 na Aβ.

Slika 18: Srednji titar kod miševa liječenih s monoklonalnim antitijelima2F12 na Aβ.

Iscrpni opis izuma

A. Definicije

Ako nije drugačije naznačeno, svi termini koji se ovdje rabe imaju isto značenje kao što bi imali i osobi stručnoj u području ovog izuma. Stručnjaci se posebice upućuju na Sambrooka i suradnike (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (drugo izdanje), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. te Ausubel, F.M. i suradnici (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, za definicije, stručne termine i postupke koji su poznati u biokemijskoj struci i molekularnoj biologiji.. Podrazumijeva se da ovaj izum nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i opisane reagense, s obzirom da oni mogu varirati, a da se postižu isti rezultati.

Pojam “pomoćno sredstvo” odnosi se na spoj koji kod primjene skupa s antigenom povećava imunološku reakciju, ali ako se primjenjuje samostalno ne uzrokuje imunološku reakciju na antigen. Pomoćna sredstva mogu povećati imunološku reakciju pomoću nekoliko mehanizama, uključujući ojačavanje limfocita, stimulaciju B i/ili T stanica i stimulaciju makrofaga.

“Amiloidna bolest” ili “amiloidoza” odnosi se na niz poremećaja čiji je simptom, odnosno dio njihove patologije, akumulacija formacija amiloidnog plaka.

“Amiloidni plak” je naslaga izvan stanice koja se većinom sastoji od proteinskih fibrila. Općenito, fibrili se sastoje od dominantnog proteina ili peptida, no plak može također sadržavati dodatne komponente, peptidne ili ne-peptidne molekule, kao što je ovdje opisano.

“Amiloidna komponenta” je molekulski entitet koji je prisutan u amiloidnom plaku, uključujući količinu antigena takvih molekula. Amiloidna komponenta uključuje proteine, peptide, proteoglikane i ugljikohidrate, no nije ograničena na njih. “Specifična amiloidna komponenta” odnosi se na molekulski entitet koji se prvenstveno ili ekskluzivno nalazi u amiloidnom plaku koji predstavlja područje interesa.

“Agens” (tvar) je kemijska molekula sintetskog ili biološkog podrijetla. U kontekstu ovog izuma, općenito je agens molekula koja se može rabiti za farmaceutski pripravak.

“Anti-amiloidni agens” je tvar koja može prouzrokovati imunološku reakciju na komponentu amiloidnog plaka kod kralježnjaka, ako se primjenjuje pomoću aktivnih ili pasivnih tehnika imunizacije.

Pojmovi “polinukleotid” i “nukleinska kiselina”, koji se ovdje rabe naizmjence, odnose se na polimerne molekule koji imaju kostur kojeg podržavaju baze koje imaju sposobnost vezivanja vodika na tipične polinukleotide, pri čemu polimerni kostur predstavlja baze koje dozvoljavaju takvo vezivanje vodika na sekvenciju specifičnog oblika između polimerne molekule i tipičnog polinukleotida (npr. jednolančana DNA). Takve baze su obično inozin, adenozin, gvanozin, citozin, uracil i timidin. Polimerne molekule uključuju dvolančane i jednolančane RNA i DNA, te modifikacije njihovog kostura, na primjer, metilfosfonatna vezanja.

Pojam “polipeptid” koji se ovdje rabi odnosi se na spoj kojeg tvori jedan lanac aminokiselina povezanih peptidnom vezom. Pojam “protein” može biti istoznačnica s pojmom “polipeptid” ili se može odnositi na kompleks dva ili više peptida.

Pojam “peptid” odnosi se također na spoj koji se sastoji od aminokiselina povezanih peptidnom vezom. Općenito, peptidi se sastoje od 100 ili manje aminokiselina, dok polipeptidi ili proteini imaju više od 100 aminokiselina. Kao što se ovdje rabi, pojam “fragment proteina” također se može iščitati kao peptid.

“Fibrilarni peptid” ili “fibrilarni protein” odnosi se na monomerni ili agregirani oblik proteina ili peptida koji tvori fibrile prisutne u amiloidnom plaku. Ovdje su dani primjeri takvih peptida i proteina.

“Farmaceutski pripravak” odnosi se na kemijski ili biološki pripravak pogodan za primjenu na sisavcima. Takvi pripravci mogu biti tako specifično formulirani za primjenu na jedan ili više načina, uključujući oralnu, parenteralnu, intravensku, intraarterijsku, subkutanu, intranazalnu, sublingvalnu, intraspinalnu, intracerebrovertikularnu primjenu i slično, no bez ograničenja na samo takve načine primjene.

“Farmaceutska pomoćna tvar” ili “prihvatljiva farmaceutska pomoćna tvar” je nosač, obično tekućina, u kojoj se nalazi terapijska tvar. Općenito, pomoćna tvar ne daje formulaciji nikakvo farmakološko djelovanje, iako može osigurati kemijsku i/ili biološku stabilnost, donijeti karakteristiku otpuštanja i sl. Primjeri formulacija mogu se primjerice pronaći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19. izdanje, Grennaro, A., izdano 1995.

“Glikoprotein” je protein s kojim je obično povezan najmanje jedan lanac ugljikohidratni (oligopolisaharid).

“Proteoglikan” je glikoprotein kod kojeg je najmanje jedan od ugljikohidratnih lanaca glikozaminoglikan, koji predstavlja dugi ravni polimer disaharida koji se ponavljaju, kod kojeg je obično jedan član para kiselina nastala od šećera (uronska kiselina), a drugi je aminošećer.

Pojam “imunološka” ili “imuna” ili “imunogena” reakcija odnosi se na razvoj humoralne (upravljane antitijelima) i/ili stanične (upravljane antigen-specifičnim T stanicama ili proizvodima njihove sekrecije) reakcije kod kralježnjaka usmjerene na antigen. Takva reakcija može biti aktivna reakcija inducirana primjenom antitijela ili primarnih T-stanica. Stanična imunološka reakcija izazvana je prisutnošću polipeptidnih epitopa povezanih s MHC molekulama razreda I ili II, čime se aktiviraju antigen-specifične CD4+ T pomoćne stanice i/ili CD8+ citotoksične T stanice. Reakcija također može uključivati aktivaciju monocita, makrofaga, NK stanica, bazofila, dendričkih stanica, astrocita, stanica mikroglija, eozinofila ili drugih komponenti prirođenog imuniteta. Postojanje imunološke reakcije kojom upravljaju stanice može se odrediti stručno poznatim standardnim određivanjima proliferacije (CD4+ T stanice) ili CTL (citotoksični T limfociti) određivanjima. Relativni doprinosi humoralnih i staničnih reakcija zaštitnom ili terapijskom učinku imunogena mogu se razlikovati separiranom izolacijom imunoglobulina (IgG) i frakcija T-stanice dobivenih od imunizirane životinje u reproduktivnoj dobi i mjerenjem zaštitnog ili terapijskog učinka na drugom subjektu.

“Imunogeni agens” ili “imunogen” ili “antigen” je molekula koja može inducirati imunološku reakciju na samu sebe prilikom primjene na pacijentu, sa ili bez pomoćnih sredstava. Takve molekule uključuju na primjer amiloidne fibrilarne peptide ili njihove fragmente povezane s nosačem proteina, poput hemocijanina u pužnoj ključanici? (keyhole limpet), Cd3 ili toksina tetanusa.

“Epitop” ili “antigena determinanta” je dio antigena koji se veže na antigen-vezno područje antitijela.

Pojam “Aβ”, “Aβ peptid” i “amiloid β” peptid su sinonimi, a odnose se na jednu ili više peptidnih smjesa od oko 38-43 aminokiselina dobivenih od Beta amiloidnog prekursora proteina (β-APP), kao što je ovdje opisano. “Aβxx” odnosi se na amiloidni β peptid 1-xx, gdje xx predstavlja broj koji ukazuje na broj aminokiselina u peptidu; npr. Aβ42 je isto što i Aβ-42, što se ovdje također odnosi i na “AN1792”, a Aβ40 je isto što i Aβ-40, što se ovdje također odnosi i na “AN1578”.

Raspadnuti ili monomerni Aβ označava topljivu, monomernu peptidnu jedinicu Aβ. Jedan od načina priprave monomernog Aβ je otapanje liofiliziranog peptida u čistom DMSO uz sonifikaciju. Nastala se otopina centrifugira kako bi se uklonile netopljive čestice. Agregirani Aβ je smjesa oligomera kod kojih su monomerni dijelovi povezani nekovalentnim vezama.

Pojam “goli polinukleotid” odnosi se na polinukleotid koji se ne nalazi u kompleksu s nekoloidnim materijalom. Goli polinukleotidi ponekad se kloniraju u plazmidnom vektoru.

Pojam “pacijent”uključuje ljude i ostale sisavce koji dobivaju profilaksu ili terapijsko liječenje.

Pojam “značajno drukčije od”, “statistički značajno”, “značajno više (ili niže) od” i slične fraze odnose se na uspoređivanje između podataka ili ostalih mjerenja, pri čemu je razlika između dvije uspoređene individue ili skupine očito ili prihvatljivo vidljiva obučenom promatraču, ili na statistički značajno (ako fraza uključuje pojam “statistički” ili ako postoji neka indicija o statističkom testu, poput p-vrijednosti, ili ako analizirani podatak proizvodi statističku razliku stručno poznatim standardnim statističkim testovima).

Pripravci ili postupci “koji uključuju” jedan ili više nabrojenih elemenata, mogu uključivati i druge elemente koji nisu posebno navedeni. Na primjer, pripravak koji uključuje fibrilarnu komponentu peptida sadržava i izolirani peptid, kao i peptid koji je komponenta veće polipeptidne sekvencije. Kao slijedeći primjer, pripravak koji uključuje elemente A i B također sadržava i pripravak koji se sastoji od A, B i C.

B. Amiloidne bolesti

1. Pregled i patogeneza

Amiloidne bolesti ili amiloidoze uključuju više bolesnih stanja koja imaju različite vanjske simptome. Kod takvih se poremećaja obično pojavljuju nenormalne izvanstanične naslage proteinskih fibrila, koje su poznate kao “amiloidne naslage” ili amiloidni plak”, a debljina im je obično 10-100 μm u promjeru, te su lokalizirane u specifičnim organima ili tkivima. Takvi plakovi sastoje se prvenstveno od topljivih proteina ili peptida koji se pojavljuju u prirodi. Ovakve netopljive naslage sastoje se uglavnom od postraničnih nakupina fibrila, te približno iznose 10-15 nm u promjeru. Amiloidni fibrili pod polariziranim svjetlom daju karakterističnu dvostruku refrakciju boje zelene jabuke, nakon bojenja bojom Congo crveno. Poremećaji su razvrstani na temelju glavnih fibrilarnih komponenata koje tvore nakupine plaka, kao što je razjašnjeno dolje.

Peptidi ili proteini koji stvaraju nakupine plaka često nastaju iz većih prekursora proteina. Određenije, patogeneza amiloidnih fibrilarnih naslaga općenito uključuje proteolitičko cijepanje “abnormalnih” prekursora proteina na fragmente. Takvi se fragmenti uglavnom spajaju u anti-paralelne β nabrane strukture; u svakom slučaju, opisano je da podvrste određenih oblika proteina agregiraju, te stvaraju fibrile kod obiteljske polineuropatije (različiti fibrili transtiretina), te amiloidoze povezane s dijalizom (β2 mikroglobulinski fibrili) (Tan, i suradnici, 1994, supra).

2. Klinički sindromi

U ovom poglavlju opisani su glavni tipovi amiloidoza, uključujući sastav njihovih karakterističnih fibrilarnih plakova. Općenito je otkriće ovog izuma da se amiloidne bolesti mogu liječiti davanjem agenasa koji služe pobuđivanju imunološke reakcije na komponentu ili komponente različitih amiloidnih naslaga specifičnih za pojedinu bolest. Kao što je detaljnije objašnjeno niže u Poglavlju C, takve se komponente uglavnom sastoje od fibrila koji stvaraju plak. U poglavlju niže dani su primjeri glavnih oblika amiloidoza, te oni ne ograničavaju izum.

a. AA (reaktivne) amiloidoze

Općenito, AA amiloidoza je manifestacija brojnih bolesti koje izazivaju održavanu reakciju akutne faze. Takve bolesti uključuju kronične upalne poremećaje, kronične lokalne ili sustavne bakterijske infekcije, te maligne neoplazme.

AA fibrili općenito su sastavljeni od fragmenata duljine 8000 daltona (AA peptida ili proteina) koji su nastali proteolitičkim cijepanjem amiloidnog A proteina iz seruma (apoSSA), cirkulirajućeg apolipoproteina koji je prisutan u HDL česticama, te koji se sintetizira u hepatocitima kao reakcija citokina kao što su IL-1, IL-6 te TNF. Do taloženja može doći po cijelom tijelu, posebice na parenhimnim organima. Mjesto taloženja obično je slezena, a mogu biti napadnuti i bubrezi. Također je uobičajeno taloženje na srcu i u gastrointestinalnom traktu.

AA amiloidne bolesti uključuju inflamatorne bolesti kao što su reumatoidni artritis, mladenački kronični artritis, ankiloznu spondilozu, psorijazu, psorijaznu artopatiju, Reiterov sindrom, Stillovu bolest kod odraslih, Behcetov sindrom, te Crohnovu bolest, no nisu ograničene samo na njih. AA naslage nastaju također kao posljedica kroničnih mikrobioloških infekcija kao što su guba, tuberkuloza, bronhiektazija, dekubitusni čir, kronični pielonefritis, osteomielitis, te Whipplova bolest. Neke maligne neoplazme također su posljedica AA fibrilarnih amiloidnih naslaga. One uključuju stanja kao što su Hodgkinov limfom, rak bubrega, rak crijeva, pluća i urogenitalnog trakta, rak bazalnih stanica, te leukemija vlasastih stanica.

b. AL amiloidoza

AL amiloidna naslaga povezana je gotovo sa svim diskrazijma B limfocitne linije, od malignosti plazma stanica (multipli mijelom) pa do benigne monoklonalne gamopatije. Trenutno, prisutnost amiloidnih naslaga može biti primarni pokazatelj teško uočljive diskrazije.

Fibrili AL amiloidnih naslaga sastoje se od monoklonalnih lakih lanaca imunoglobulina ili njihovih fragmenata. Preciznije, fragmenti su dobiveni iz N-terminalne regije lakog lanca (kapa ili lambda) te sadržavaju sve ili dio njihovih različitih domena (VI). Naslage se općenito stvaraju u mezenhimnim tkivima, što uzrokuje perifernu i autonomnu neuropatiju, sindrom karpalnog tunela, makrogloziju, restriktivnu kardiomiopatiju, artopatiju velikih utora, imune diskrazije, mijelome, kao i okultne diskrazije. U svakom slučaju, treba napomenuti da može biti uključeno gotovo svako tkivo, osobito visceralni organi kao srce.

c. Nasljedna sustavna amiloidoza

Postoje mnogi oblici nasljednih sistemskih amiloidoza. Iako su to relativno rijetka stanja, pojava simptoma kod odraslih i nasljeđivanje takvih stanja (uobičajeno dominantno autosomatska) dovode do toga da su takvi poremećaji postojani u općoj populaciji. Općenito sindromi se mogu pripisati točkastim mutacijama na prekursorima proteina, što dovodi do nastajanja različitih amiloidogenih peptida ili proteina. U Tablici 2 sumirane su smjese fibrila za primjere oblika takvih poremećaja.

Tablica 2

Nasljedne amiloidozea

[image] [image] aPodaci preuzeti iz Tan & Pepys, 1994, supra.

Podaci dani u Tablici 2 su primjeri, te ne ograničavaju područje izuma. Na primjer, opisano je više od 40 različitih točkastih mutacija u genu transtiretina, pri čemu sve uzrokuju slične kliničke oblike iz obitelji amiloidne polineuropatije.

Transtiretin (TTR) protein od 14 kilodaltona, te se ponekad također naziva prealbumin. Proizvode ga jetra i koroidni pleksus, a on djeluje s transportnim tireoidnim hormonima i vitaminom A. Najmanje 50 varijanti proteina, pri čemu je svaka okarakterizirana promjenom jedne aminokiseline, odgovorne su različite oblike karakterističnih amiloidnih polineuropatija. Na primjer, zamjena prolina leucinom na položaju 55 rezultira nastajanjem posebno progresivnog oblika neuropatije; zamjena metionina leucinom na položaju 111 rezultira teškom kardiopatijom kod danskih pacijenata. Amiloidne naslage izolirane iz srčanog tkiva pacijenata sa sistemskom amiloidozom pokazale su da su naslage načinjene od heterogene smjese TTR i njegovih fragmenata, koji se skupno nazivaju ATTR, kojoj je okarakterizirana cjelokupna duljina sekvencije. ATTR fibrilarne komponente mogu se ekstrahirati iz takvih plakova, a njihova struktura i sekvencija određuju se prema postupcima koji su stručno poznati (npr. Gustavsson, A. i suradnici, Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F. i suradnici, Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras M. i suradnici, PNAS 80: 539-42, 1983).

Osobe sa točkastim mutacijama u molekuli apolipoproteina AI (npr. Gly→Arg26; Trp→Arg50; Leu→Arg60) imaju oblik amiloidoze ("Östertag oblik”) koju karakteriziraju naslage proteina apolipoproteina AI ili njegovih fragmenata (AApoAI). Ovi pacijenti imaju nisku razinu lipoproteina visoke gustoće (HDL), što se ispoljava s perifernom neuropatijom i oštećenjem bubrega.

Mutacija na alfa uzvojnici enzima lizozima (npr., Ile→Thr56, ili Asp→His57) osnova je drugog oblika "Östertag-tipa ne-neuropatske nasljedne amiloidoze opisane u engleskoj obitelji. U ovom slučaju, fibrili mutiranog proteina lizozima (Alys) stvaraju naslage, a kod pacijenata je općenito oštećena funkcija bubrega. Za razliku od većine ovdje opisanih proteina koji stvaraju fibrile, ovaj je protein obično prisutan u čitavom (nefragmentiranom) obliku (Benson, M.D., i suradnici, CIBA Fdn. Symp. 199:104-131, 1996).

β-amiloidni peptid (Aβ) je peptid koji se sastoji od 39-43 aminokiseline, a dobiven je proteolizom iz velikog proteina koji je poznat kao prekursor beta amiloidnog proteina (βAPP). Mutacije na βAPP uzrokuju karakteristične oblike Alzheimerove bolesti, Downov sindrom ili/i senilnu demenciju koja je karakterizirana cerebralnim naslagama plaka koji je sastavljen od Aβ fibrila i ostalih komponenti, što je detaljnije opisano dolje. Poznate mutacije na APP povezane s Alzheimerovom bolešću pojavljuju se u blizini mjesta cijepanja β ili γ sekretazom, ili unutar Aβ. Na primjer, položaj 717 najbliži je mjestu cijepanja APP γ-sekretazom na njegovom putu do Aβ, a položaji 670/671 u neposrednoj su blizini mjesta cijepanja β-sekretazom. Mutacije na bilo kojem od tih ostataka mogu uzrokovati Alzheimerovu bolest, vjerojatno uzrokujući povećanje količine 42/43 aminokiselinskog oblika Aβ koji je nastao od APP. Struktura i sekvencija Aβ peptida različitih duljina vrlo dobro su poznati u struci. Takvi se peptidi mogu pripraviti prema postupcima poznatima u struci (npr. Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). Nadalje, različiti oblici peptida komercijalno su dostupni.

Sinuklein je protein povezan sa sinapsom koji liči alipoproteinu i kojim je bogat je neuronski citosolom i presinaptičkim završecima. Peptidni fragment nastao od α-sinukleina, nazvan NAC, također je komponenta amiloidnog plaka Alzheimerove bolesti (Clayton i suradnici, 1998). Protiv te komponente također je upereno liječenje na imunološkoj bazi ovog izuma, kao što je iscrpno opisano u nastavku.

Gelsolin je protein koji veže kalcij koji veže i fragmentira niti aktina. Mutacije na položaju 187 (npr. Asp→Asn; Asp→Tyr) proteina rezultiraju oblikom nasljedne sistemske amiloidoze, koja se uobičajeno pronalazi kod pacijenata iz Finske, kao i kod ljudi nizozemskog i japanskog podrijetla. Kod bolesnika, fibrili koji nastaju od fragmenata gelsolina (Agel), uobičajeno se sastoje od aminokiselina 173-243 (68 kDa karboksiterminalni fragment) te se talože u krvnim žilama i membranama, što uzrokuje kornealnu distrofiju i kranijalnu neuropatiju koja progredira do periferne neuropatije, distrofične promjene na koži i naslaga u drugim organima (Kangas, H. i suradnici, Human. Mol. Genet. 5(9): 1237-1243, 1996).

Drugi mutirani proteini, kao što su mutirani alfa lanac fibrinogena (AfibA) i mutirani cistatin C (Acys) također tvore fibrile i uzrokuju karakteristične nasljedne poremećaje. AfibA fibrili tvore naslage karakteristične za nonneuropatski nasljedni amiloid s bolešću bubrega; Acys naslage karakteristične su za nasljednu cerebralnu amiloidnu angiopatiju zabilježenu na Islandu. (Isselbacher i suradnici, Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson i suradnici, supra.). Barem u nekim slučajevima, pokazalo se da pacijenti koji pate od cerebralne amiloidne angiopatije (CAA) imaju amiloidne fibrile koji sadržavaju nemutirani oblik cistatina C povezan s beta proteinom. (Nagai. A. i suradnici, Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78, 1998).

Do 15% slučajeva određenih oblika prionskih bolesti za koje se prije smatralo da su infektivne prirode, sada se smatraju nasljednima (Baldwin i suradnici, Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). Kod takvih prionskih poremećaja, kod pacijenta se razvijaju plakovi koji se sastoje od abnormalnih izomernih oblika normalnog proteina priona (PrPc). Predominantni izomerni oblik PrPSc, koji se također naziva ASCr, razlikuje se od normalnog staničnog proteina po otpornosti na cijepanje proteazom, netopljivosti nakon ekstrakcije s detergentom, taloženju u sekundarnim liposomima, post-translacijskoj sintezi, te velikom udjelu β-nabrane strukture. Genetska povezanost ustanovljena je kod barem pet mutacija koje uzrokuju Creutzfeld-Jacobova bolest (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker sindrom (GSS), te smrtonosnu karakterističnu nesanicu (FFI) (Baldwin). Postupci ekstrakcije fibrilarnih peptida iz fragmentiranih fibrila, određivanje sekvencija i priprava takvih peptida poznati su struci (npr. Beekes, M. i suradnici, J. Gen. Virol. 76: 2567-76, 1995).

Na primjer, jedan oblik GSS povezan je s PrP mutacijom na kodonu 102, dok se telencefalni GSS odvaja mutacijom na kodonu 117. Mutacije na kodonu 198 i 217 dovode do GSS oblika kod kojeg plak na neuritu, karakterističan za Alzheimerovu bolest, sadržava PrP umjesto Aβ peptid. Određeni oblici karakterističnih CJD povezani su s mutacijama na kodonima 200 i 210; mutacije na kodonima 129 i 178 pronađene su i kod karakterističnih skupina CJD i FFI. (Baldwin, supra).

d. Senilna sistemska amiloidoza

Amiloidne naslage, sistemske i fokalne, povećavaju se s godinama. Na primjer, fibrili divljeg tipa transtiretina (TTR) uobičajeno se pronalaze u srčanom tkivu starijih osoba. Oni mogu biti nesimptomatični, bez kliničkih simptoma, ili pak mogu dovesti do srčanih oštećenja. Nesimptomatske fibrilarne fokalne naslage mogu se također pojaviti u mozgu (Aβ), corpora amilacea prostate (Aβ2 mikroglobulin), zglobovima i sjemenicima.

e. Cerebralna amiloidoza

Lokalna naslaga amiloida uobičajena je u mozgu, posebice kod starijih osoba. Najčešći tip amiloida u mozgu prvenstveno se sastoji od Aβ peptidnih fibrila, koji uzrokuju demenciju ili sporadičnu (nenasljednu) Alzheimerovu bolest. U biti, incident sporadične Alzheimerove bolesti znatno nadilazi oblike za koje se pokazalo da su nasljedni. Fibrilarni peptidi koji tvore te plakove vrlo su slični onima opisanima u prijašnjem dijelu, u odnosu na nasljedne oblike Alzheimerove bolesti. (AD).

f. Amiloidoza povezana s dijalizom

Plakovi koji se sastoje od β2 mikroglobulina (Aβ2M) fibrila obično se razvijaju kod pacijenata koji su podvrgnuti dugotrajnoj hemodijalizi ili peritonealnoj dijalizi. β2 mikroglobulin je polipeptid od 11,8 kilodaltona i predstavlja laki lanac razreda I MHC antigena, koji je prisutan na svim stanicama s jezgrom. U normalnim uvjetima on se neprestano ljušti sa staničnih membrana te se u normalnim uvjetima filtrira preko bubrega. Neispravno pročišćavanje, kao kod oštećene bubrežne funkcije, dovodi do naslaga u bubrezima i ostalim mjestima (primarno na tkivima zglobova bogatim kolagenom). Suprotno u odnosu na druge fibrilarne proteine, Aβ2M molekule općenito su prisutne u nefragmentiranom obliku u fibrilima (Benson, supra).

g. Amiloidoze dobivene od hormona

U endokrinim organima mogu se pojaviti amiloidne naslage, posebice kod starijih osoba. Tumori koji luče hormone također sadržavaju amiloidne plakove dobivene od hormona, a njihovi se fibrili sastoje od polipeptidnih hormona kao što je kalcitonin (medularni karcinom štitnjače), amiloidnih polipeptidnih otočića (amilin; javlja se kod većine pacijenata s dijabetesom tip II), te atrijskog natriuretskog peptida (izolirana atrialna amiloidoza). Sekvencije i strukture ovih proteina vrlo dobro su poznate u struci.

h. Različite amiloidoze

Postoji mnoštvo oblika amiloidnih bolesti koje se uobičajeno manifestiraju kao lokalizirane naslage amiloida. Općenito, te su bolesti vjerojatno rezultat lokalizirane proizvodnje i/ili izostanka katabolizma specifičnih prekursora fibrila ili predispozicije odgovarajućih tkiva (poput zglobova) za naslage fibrila. Primjeri ovakvih idiopatskih naslaga uključuju nodularni AL amiloid, kutani amiloid, endokrini amiloid i amiloid povezan s tumorom.

C. Farmaceutski pripravci

Otkriće ovoga izuma je da su pripravci, koji su u stanju izazvati ili omogućiti imunološku reakciju usmjerenu na odgovarajuće komponente amiloidnog plaka, učinkoviti u liječenju ili prevenciji razvoja amiloidnih bolesti. Posebice, prema ovdje navedenom izumu, moguće je spriječiti napredovanje, smanjiti simptome i/ili smanjiti količinu amiloidnog plaka kod bolesnih osoba, tako da se pacijentu da imunostimulatorna doza antiamiloidne tvari, odnosno odgovarajućeg antiamiloidnog imunološkog reagensa. Ovaj odjeljak opisuje primjere anti-amiloidnih tvari koji uzrokuju aktivnu, kao i pasivnu, imunološku reakciju na amiloidni plak i osiguravaju podatke koji služe kao primjeri, a ukazuju na učinkovito liječenje amiloidnog plaka uporabom takvih pripravaka.

Općenito, anti-amiloidni agensi ovog izuma sastoje se od specifične komponente plaka, po mogućnosti komponente koja sačinjava fibril, koja je uobičajeno karakteristični protein, peptid, odnosno njihov fragment, kao što je opisano u prethodnom odjeljku, a čiji se primjeri nalaze u nastavku. Još općenitije, terapeutske tvari koje se rabe u ovom izumu proizvode ili induciraju imunološku reakciju na plak, odnosno još specifičnije, na njegovu fibrilarnu komponentu. Stoga takve tvari uključuju samu komponentu i njene varijante, analoge i slične komponente koji induciraju i/ili unakrsno reagiraju s antitijelima na komponentu, kao i antitijela ili T-stanice koje su specifično reaktivne na amiloidnu komponentu, no nisu ograničeni na njih. Prema važnoj značajci, farmaceutski pripravci nisu izabrani iz skupine nespecifičnih komponenata, što znači, takvih komponenata koje općenito cirkuliraju kroz tijelo ili su sveprisutne u tijelu. Na primjer, amiloidni protein iz seruma (SAP) predstavlja cirkulirajući glikoprotein plazme koji se proizvodi u jetri i veže najpoznatije oblike amiloidnih naslaga. Terapijski pripravci prvenstveno su usmjereni na te komponente.

Indukcija imunološke reakcije može biti aktivna, kada se primjenjuje imunogen koji inducira antitijela ili T stanice koje reagiraju s komponentom koja se nalazi u pacijentu, odnosno pasivna, kada se daju antitijela koja sama vežu na amiloidnu komponentu koja se nalazi u pacijentu. Primjeri takvih agenasa koji induciraju ili proizvode imunološku reakciju na amiloidne plakove opisani su u odjeljku koji se nalazi u nastavku.

Farmaceutski pripravci ovog izuma kao dodatak imunogenoj(im) tvari(ma) mogu uključivati djelotvornu količinu pomoćnog sredstva i/ili pomoćne tvari. Farmaceutski djelotvorna pomoćna sredstva i pomoćne tvari poznati su također u struci, a iscrpnije su opisani u Odjeljcima koji slijede.

1. Imunostimulatorni agensi (aktivna imunološka reakcija)

a. Antifibrilarne komponente

Opća skupina preferiranih antiamiloidnih agenasa sastoji se od tvari koje su nastale od amiloidnih fibrilarnih proteina. Kao što je gore spomenuto, značajka amiloidne bolesti je naslaga u organu ili se organ amiloidnih plakova sastoji većim dijelom od fibrila koji se sastoje od karakterističnih fibrilarnih proteina ili peptida. Prema ovom izumu, takav fibrilarni protein ili takva peptidna komponenta korisni su agensi za induciranje antiamiloidne imunološke reakcije.

U tablicama 1 i 2 sumirani su primjeri proteina koji tvore fibrile, a karakteristični su za različite amiloidne bolesti. Prema ovom aspektu ovog izuma, primjena imunostimulatornog pripravka na oboljeloj ili suspektnoj osobi, koja uključuje odgovarajući fibrilarni protein ili peptid, uključujući njihove homologe i fragmente, osigurava terapiju ili profilaksu s obzirom na amiloidnu bolest.

Na primjer, Aβ, također poznat kao β-amiloidni peptid, odnosno A4 peptid (vidjeti US patent 4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biphys. REs. Commun. 120, 1131 (1984)), je peptid od 39-43 aminokiseline, a predstavlja glavnu komponentu karakterističnih plakova Alzheimerove bolesti. Aβ nastaje reakcijom većeg proteina APP s dva enzima, nazvanih β i gama sekretaze (vidjeti Hardy, TINS 20, 154 (1997)).

Primjer I opisuje rezultate pokusa koji su provedeni kao podrška ovom izumu, te u kojima se Aβ42 peptid primjenjuje na heterozigotnim transgeničnim miševima kod kojih dolazi do prejake ekspresije humanog APP s mutacijom na položaju 717. Ti miševi, poznati kao “PDAPP miševi” ispoljavaju patološka svojstva slična Alzheimerovoj bolesti, te se smatraju životinjskim modelom za Alzheimerovu bolest (Games i suradnici, Nature 373: 523-7, 1995). Kao što je detaljnije opisano u primjeru, ti miševi ispoljavaju detektabilnu neuropatologiju Aβ plaka u svojim mozgovima, počevši od oko 6 mjeseci njihove starosti, pri čemu se naslaga plaka povećava s vremenom. U pokusu koji je ovdje opisan, na miševima je primijenjen Aβ42 (AN1792). Većina tretiranih miševa (7/9) nisu imali nikakav detektabilni amiloid u svome mozgu s 13 mjeseci starosti, suprotno poredbenim miševima (kojima je injektirana otopina soli ili koji nisu tretirani) kod kojih se pokazala signifikantna količina amiloidnog plaka u toj dobi (SLIKA 2). Te su razlike bile još izraženije u hipokampusu (SLIKA 3). Tretirani miševi također imaju signifikantne titre antitijela iz seruma na Aβ (svi su veći od 1:1000, 8/9 veći od 1/10000; SLIKA 1, Tablica 3A). Općenito miševi koji se tretiraju slanom otopinom imaju 4-5 puta manju pozadinsku razinu antitijela na Aβ pri razrjeđenju od 1:100 pri svim provedenim ispitivanjima, te se toga smatra da nemaju signifikantnu reakciju relativno na kontrolu (Tablica 3B). Ta ispitivanja pokazuju da injekcija specifičnog fibrilarnog Aβ peptida omogućava zaštitu od naslaga Aβ amiloidnog plaka.

Amiloidni protein iz seruma (SAP) predstavlja cirkulirajući glikoprotein iz plazme koji se proizvodi u jetri te se veže na sve oblike amiloidnih fibrila u ovisnosti o kalciju, uključujući fibrile cerebralnog amiloidnog plaka kod Alzheimerove bolesti. Kao dio provedenih pokusa, skupini miševa injektiran je SAP; kod tih miševa dolazi do signifikantnog titra seruma na SAP (1:1000-1:30000), ali nisu imali mjerljive titre seruma na Aβ peptide i na razvijene neuropatologije cerebralnog plaka (SLIKA 2).

Naredni pokusi koji su detaljno opisani u Primjeru II, prikazuju ovisnost za imunogenog efekta Aβ injekcija o dozi, kod miševa koji su podvrgnuti tretmanu između 5 tjedana i približno 8 mjeseci starosti. Kod tih miševa, srednja vrijednost titra anti-Aβ peptid antitijela iz seruma povećava se s brojem imunizacija te s povećanjem doze; u svako slučaju, nakon četiri imunizacije, titri seruma izmjeren pet dana nakon imunizacije dosegli su razinu veću od većih doza (1-300 μg) na razinama od oko 1:10000 (SLIKA 5).

Dodatni pokusi koji služe kao potkrjepa ovom izumu opisani su u Primjeru III, u kojem su modelni PDAPP miševi tretirani s Aβ42 počevši u trenutku (u dobi od oko 11 mjeseci) nakon što je već bio prisutan amiloidni plak u njihovim mozgovima. U tim ispitivanjima životinje su imunizirane s Aβ42 ili slanom otopinom, te su likvidirane u dobi od 15 do 18 mjeseci kako bi se ispitivala količina amiloida. Kao što je prikazano na SLICI 7, u dobi od 18 mjeseci, miševi koji su tretirani s Aβ42 imali su značajno manju količinu amiloidnog plaka (količina plaka 0,01%) u odnosu na poredbene 18-mjesečne miševe tretirane s PBS (količina plaka 4,7%) odnosno 12-mjesečnim životinjama koje nisu bile tretirane (0,28%), pri čemu je količina plaka mjerena analizom slike, kao što je iscrpno opisano u Primjeru XIII, dio 8. Ti pokusi pokazuju učinkovitost postupaka liječenja ovog izuma kojima se smanjuje postojeća količina plaka i sprječava napredovanje nastajanja plaka kod bolesnih osoba.

Prema ovom aspektu izuma, terapeutske se tvari dobivaju od fibrilarnih peptida ili proteina koji uključuju plakove, karakteristične za bolesti koje se nalaze u središtu zanimanja. Alternativno, takvi su agensi kao antigeni dovoljno slični takvim komponentama da induciraju imunološku reakciju koja također unakrsno reagira s fibrilarnom komponentom. Tablice 1 i 2 navode primjere takvih fibrilarnih peptida i proteina, pripravaka i sekvencija koji su poznati u struci ili se pak mogu lagano odrediti prema stručno poznatim postupcima. (Vidjeti reference citirane u nastavku i u Odjeljku B2, gdje se posebice navode reference koje opisuju postupke ekstrakcije i/ili pripravke različitih komponenti fibrilarnih peptida; daljnji primjeri fibrilarnih komponenti opisani su u nastavku).

Stoga, prema ovom izumu, ako se na temelju kliničkih određivanja i/ili biopsijom dijagnosticira amiloidna bolest, stručnjak je u stanju odrediti fibrilarni sastav amiloidne naslage te odabrati agens koji inducira imunološku reakciju usmjerenu na fibrilarne peptide ili proteine.

Na primjer, kao što je gore opisano, terapeutska tvar koja se rabi za liječenje Alzheimerove bolesti ili drugih amiloidnih bolesti za koje je karakteristična Aβ fibrilarna naslaga, može biti bilo koji oblik Aβ peptida koji se prirodno pojavljuje, a posebice mogu biti humani oblici (tj., Aβ39, Aβ40, Aβ41 ̧ Aβ42 ili Aβ43). Sekvencije ovih peptida i njihov odnos prema APP prekursoru poznati su u struci i vrlo dobro su poznati u struci (npr. Hardy i suradnici, TINS 20, 155-158 (1997)). Na primjer, Aβ42 ima sekvenciju:

H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH. (identifikacija sekvencije br.: 1).

Aβ41, Aβ40 i Aβ39 razlikuju se od Aβ42 po tome što su redom izostavljeni Ala, Ala-Ile, te Ala-Ile-Val sa C-terminalnog kraja peptida. Aβ43 razlikuje se od Aβ42 po tome što je prisutan treoninski ostatak na C-terminusu. Sukladno pogodnim proizvodima ovog izuma, terapeutski agens inducirat će imunološku reakciju na cjelokupnu fibrilarnu komponentu ciljane bolesti ili na njen dio. Na primjer, pogodni imunogeni pripravak predstavlja tvar koja inducira antitijelo specifično na slobodni N-terminus od Aβ. Prednost takvog pripravka je u tome što ne prepoznaje prekursor proteina, β-APP, pri čemu je manje vjerojatno da će prouzročiti autoimunitet.

Na primjer, poželjno je da se pacijenti koji boluju od bolesti koje karakteriziraju naslage AA fibrila, na primjer, određenih kroničnih upalnih poremećaja, kronične lokalne ili sistemske infekcije mikrobima, te maligne neoplazme, kao što je gore opisano, mogu liječiti AA peptidom, poznatim fragmentom amiloidnog A proteina iz seruma od 8 kilodaltona (ApoSSA). Primjeri AA amiloidnih bolesti uključuju upale kao što su reumatoidni artritis, juvenilni kronični artritis, ankilozni spondilitis, psorijaza, psorijatska artropatija, Reiterov sindrom, Stillova bolest odraslih, Behcetov sindrom, Chronova bolest, kronične infekcije mikrobima, kao što su guba, tuberkuloza, brohiektazija, ulcerozni dekubitus, kronični pielonefritis, osteomielitis, te Whippleova bolest, kao i maligne neoplazme, kao što su Hodgkinova bolest, limfom, karcinom bubrega, karcinomi crijeva, pluća i urogenitalnog trakta, karcinom bazalnih stanica, te nasljedna leukemija stanica, no nisu ograničeni samo na njih.

AA peptid odnosi se na jednu ili više heterogenih skupina peptida nastalih od N-terminusa prekursora proteina amiloida A iz seruma (ApoSSA), počevši na ostatku 1, 2 ili 3 prekursora proteina, te završivši na bilo kojem mjestu između ostataka 58 i 84; uobičajeni AA fibrili sastoje se od ostataka 1-76 od ApoSSA. Precizne strukture i mješavine mogu se odrediti, a odgovarajući peptidi sintetizirati prema postupcima dobro poznatima struci (Liepnieks, J. J. i suradnici, Biochem. Biophys. Acta 1270: 81-86, 1995):

Na primjer, fragmenti dobiveni od N-terminalnog područja koje sadržava cjelokupnu odnosno dio (VL) domene lakih lanaca imunoglobulina (kapa ili lambda lanci) općenito uključuju amiloidne naslage u mesenhimnom tkivu, koje uzrokuju perifernu i autonomnu neuropatiju, karpalni tunel sindrom, makrogloziju, restriktivnu kardiomiopatiju, artropatiju velikih zglobova, imunološku diskraziju, mijelome, kao i okultnu diskraziju. Pripravci ovog izuma proizvode imunološku reakciju na dio lakog lanca po mogućnosti na “neoepitop” - epitop koji nastaje kao rezultat fragmentacije molekule roditelja - čime se smanjuju mogući autoimuni učinci.

Različite nasljedne amiloidne bolesti također su podložne postupcima liječenja ovog izuma. Takvi postupci opisani su u Odjeljku B.2, u gornjem dijelu. Na primjer, različiti oblici karakterističnih polineuropatija rezultat su najmanje pedeset mutiranih oblika transtiretina (TTR), proteina od 14 kilodaltona kojeg proizvodi jetra, pri čemu je svaki okarakteriziran zamjenom jedne amino skupine. Iako se mnogi od tih oblika navedenih bolesti mogu razlikovati na temelju njihovih specifičnih patoloških stanjia i/ili demografskog podrijetla, poželjno je da se terapeutski pripravci sastoje od agenasa koji induciraju imunološku reakciju na više od jednog oblika TTR, poput smjese dva ili više oblika ATTR, uključujući divlji tip TTR, kako bi se osigurao općenito koristan pripravak.

Amiloidne naslage koje sadržavaju AapoAI pronađene su kod osoba s točkastim mutacijama na molekulama apolipoproteina AI. Pacijenti koji boluju od tog oblika bolesti općenito boluju od periferne neuropatije i oštećenja bubrega. Prema ovom izumu, terapeutski pripravci pripravljeni su od jednog ili više različitih oblika AapoAI ovdje opisanih ili poznatih u struci.

Određeni karakteristični oblici Alzheimerove bolesti, kao i Down sindrom rezultat su mutacija na prekursoru beta amiloidnog proteina, što rezultira naslagama plaka koji ima fibrile sastavljene od β-amiloidnog peptida (Aβ). Uporaba Aβ peptida u terapijskim pripravcima ovog izuma opisana je u gornjem dijelu, te ovdje potkrijepljena primjerima.

Ostale formulacije za liječenje nasljednih oblika amiloidoze, o kojima se raspravljalo u gornjem dijelu, uključuju pripravke koji uzrokuju imunološku reakciju na fragmente gelsolina za liječenje nasljedne sistemske amiloidoze, mutirane proteine lizozima (Alys), za liječenje nasljedne neuropatije, mutirane alfa lance fibrinogena (AfibA) za ne-neuropatski oblik amiloidoze koji se manifestira kao bolest bubrega, mutirani cistatin C (Acys) za liječenje oblika cerebralne angiopatije koja je zabilježena na Islandu. Nadalje, određeni nasljedni oblici prionskih bolesti (npr. Creutzfeld-Jacobova bolest (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinkerov sindrom (GSS), te smrtonosna karakteristična nesanica (FFI)) okarakterizirani su mutiranim izomernim oblikom proteina priona, PrPSc. Taj se protein može rabiti u terapeutskim pripravcima za liječenje i prevenciju naslaga PrP plaka, u skladu s ovim izumom.

Kao što je raspravljeno u gornjem dijelu, amiloidna naslaga, bez obzira da li je sistemska ili fokalna, također je povezana sa starenjem. Slijedeći aspekt ovog izuma je da se takve naslage mogu spriječiti ili liječiti primjenom pripravaka koji se sastoje od jednog ili više proteina povezanih sa starenjem na suspektnim osobama. Stoga, plakovi koje sačinjeni od ATTR nastali od divljeg tipa TTR redovito se pronalaze u srčanom tkivu starijih ljudi. Slično, određene starije osobe mogu imati nesimptomatične fibrilarne fokalne naslage Aβ u svome mozgu; kod takvih osoba, kao što je ovdje detaljno opisano, može biti zagarantirano liječenje Aβ peptidom. β2 mikroglobulin predstavlja učestalu komponentu corpora amilacea prostate, te je stoga prema ovom izumu slijedeći potencijalni agens.

Kao slijedeći primjer, no ne kao i ograničenje, postoje mnogobrojni dodatni nenasljedni oblici amiloidnih bolesti koji predstavljaju kandidate za postupke liječenje ovog izuma. β2 mikroglobulin fibrilarni plakovi obično se razvijaju kod pacijenata koji su podvrgnuti dugotrajnoj hemodijalizi ili peritonealnoj dijalizi. Takvi se pacijenti prema ovom izumu mogu liječiti terapeutskim pripravcima usmjerenim na β2 mikroglobulin odnosno, još pogodnije, na njihove imunogene epitope.

Tumori koji luče hormone mogu također sadržavati amiloidne plakove nastale od hormona, čije nastajanje je općenito karakteristično za određeni bolesni endokrini organ. Stoga, takvi fibrili mogu se napraviti od polipeptidnih hormona kao što su kalcitonin (medularni karcinom štitnjače), amiloidnih polipeptidnih otočića (javljaju se kod većine pacijenata s dijabetesom tip II), te atrijskih natriuretskih peptida (izolirana atrijalna amiloidoza). Pripravci usmjereni na amiloidne depozite koji nastaju u intimi aorte kod ateroskleroze također se razmatraju u ovom izumu. Na primjer, Westermark i suradnici opisuju 69 aminokiselina iz N-terminalnih fragmenata apolipoproteina A koji tvori takve plakove (Westermark i suradnici, Am. J. Path. 147: 1186-92, 1995); terapijski pripravci ovog izuma uključuju imunološke reagense usmjerene na takve fragmente, kao i na sami fragment.

Prethodna rasprava usredotočila se na komponente amiloidnih fibrila koje se mogu rabiti kao terapeutski agensi za liječenje ili prevenciju različitih oblika amiloidnih bolesti. Terapeutski agens također može biti aktivni fragment ili analog fibrila koji se prirodno pojavljuje odnosno mutirani fibrilarni peptid ili protein koji sadržava epitop koji inducira sličnu zaštitnu ili terapeutsku imunološku reakciju prilikom davanja čovjeku. Imunogeni fragmenti tipično imaju sekvencije od najmanje 3, 5, 6, 10 ili 20 susjednih aminokiselina iz prirodnog peptida. Primjeri imunogenih fragmenata Aβ peptida uključuju Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 1-12, 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 i 35-42. Fragmenti kojima nedostaje najmanje jedna, te ponekad najmanje 5 ili 10 C-terminalnih aminokiselina, prisutnih u obliku fibrilarne komponente koji se javlja u prirodi, rabe se u nekim postupcima. Na primjer, fragmentu kojem nedostaje 5 aminokiselina na C-terminalnom kraju od Aβ43 uključuje prvih 38 aminokiselina s N-terminalnog kraja od AB. U nekim postupcima preferiranu su fragmenti od N-terminalne polovine Aβ. Analozi uključuju alelne, vrste i inducirane varijante. Za analoge je tipično da se od peptida koji se javljaju u prirodi razlikuju na jednom ili više položaja, često na temelju konzervativne supstitucije: Tipično je da je analozima oko 80 ili 90% sekvencije identično s prirodnim proteinima. Neki analozi također uključuju aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi, ili modifikacije N ili C terminalnih aminokiselina. Primjeri aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi su α,α-disupstituirane kiseline. N-alkilaminokiseline, mliječna kiselina, 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, γ-N,N,N-trimetilizin, γ-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, ω-N-metilarginin.

Općenito, stručne osobe smatrat će vrijednim da se fragmenti i analozi oblikovani u skladu s aspektom ovog izuma mogu ispitati s obzirom na unakrsnu reaktivnost s fibrilarnim komponentama koje se javljaju u prirodi i/ili na učinkovitost profilakse ili liječenja kod transgeničnih modelnih životinja, kao što je opisano u nastavku. Takvi se fragmenti ili analozi mogu rabiti u terapeutskim pripravcima ovog izuma, ako je njihova imunoreaktivnost te učinkovitost na životinjskom modelu približno jednaka ili veća od odgovarajućih parametara mjerenih kod amiloidnih fibrilarnih komponenata.

Takvi peptidi, proteini ili fragmenti, analozi i drugi amiloidogeni peptidi mogu se sintetizirati sintezom peptida na krutom nosaču ili rekombinantnom ekspresijom, prema standardnim postupcima dobro poznatim u struci, odnosno mogu se dobiti iz prirodnih izvora. Primjeri fibrilarnih smjesa, postupaka ekstrakcije fibrila, sekvencija fibrilarnih peptida ili proteina opisani su u mnogim referencama citiranim zajedno s opisima specifičnih fibrilarnih komponenti opisanih ovdje. Dodatno, druge smjese, postupci ekstrakcije i određivanje sekvencija poznati su u struci, dostupni su osobama koje žele napraviti i upotrebljavati takve smjese. Automatski peptidni sintisajzer može se rabiti kako bi se napravile takve smjese, a komercijalno se može nabaviti kod mnogih proizvođača, poput Applied Biosystems (Perkin Elmer; Foster City, California), a postupci za pripravu sintetskih peptida poznati su u struci. Rekombinantna ekspresija može se odvijati u bakterijama poput E. coli, kvasca, stanicama insekata ili stanicama sisavaca; alternativno, proteini se mogu proizvesti uporabom in vitro translacijskog sustava bez uporabe stanice. Postupak rekombinantne ekspresije opisali su Sambrook i suradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY drugo izdanje, 1989). Određeni peptidi i proteini također su dostupni i komercijalno; na primjer, neki oblici Aβ peptida dostupni su kod proizvođača kao što je American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, Kalifornija, te California Peptide Research, Inc. Napa, Kalifornija.

Terapeutski agensi također se mogu sastojati od duljih polipeptida koji uključuju, na primjer, aktivni peptidni fibrilarni fragment ili analog zajedno s drugim aminokiselinama. Na primjer, Aβ peptid može biti prisutan kao intaktni APP protein ili njegov segment, kao što je C-100 fragment koji počinje na N-terminusu od Aβ i nastavlja se do kraja od APP. Takvi polipeptidi ispituju se s obzirom na terapijski i profilaktički učinak na životinjskim modelima, kao što je dolje opisano. Aβ peptid, analog, aktivni fragment ili drugi peptid može se promijeniti u asociranom obliku (tj. kao amiloidni peptid), ili u disociranom obliku. Terapeutski agensi mogu također uključivati multimere monomernih imunogenih agenasa ili konjugata, ili proteine nosače i/ili, kao što je gore spomenuto, mogu se dodati ostalim fibrilarnim komponentama kako bi se osiguralo šire područje djelovanja protiv stvaranja amiloidnog plaka.

Kod slijedećih varijacija, imunogeni peptid, poput fragmenta Aβ, može se prenijeti pomoću virusa ili bakterije kao dio imunogenog pripravka. Nukleinska kiselina koja kodira imunogeni peptid inkorporirana je u genom ili epizom virusa ili bakterije. Eventualno, nukleinska kiselina inkorporirana je u takvom obliku da dolazi do ekspresije imunogenog proteina u obliku izlučenog proteina ili spojenog proteina s vanjskom površinom proteina koja pripada virusu, ili transmembranskog proteina koji pripada bakteriji na taj način da je izložen protein. Virusi ili bakterije koji se rabe u takvim postupcima trebali bi biti nepatogeni ili atenuirani. Odgovarajući viruse uključuju adenoviruse, HSV, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa i druge alfa viruse, virus vezikuklarnog stomatitisa i druge rabdo viruse, kravlje i ptičje boginje. U odgovarajuće bakterije uključene su salmonella i shigella. Posebno je prikladno spajanje imunogenog peptida s HBsAg od HBV posebno je prikladno. Terapijski agensi također uključuju peptide i ostale komponente koje ne moraju nužno imati značajnu sličnost sekvencija sa Aβ, no svejedno oponašaju Aβ i induciraju sličnu imunološku reakciju. Na primjer, bilo koji peptidi i proteini koji sačinjavaju β-nabranu strukturu mogu se ispitivati s obzirom na prikladnost. Također se mogu upotrijebiti anti-idiotipska antitijela monoklonalnih antitijela na Aβ ili druge amiloidogene peptide. Takva anti-Id antitijela oponašaju antigen i proizvode imunološku reakciju na antigen (vidjeti Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6. izdanje ), str. 181). Drukčiji agensi od Aβ peptida trebali bi inducirati imunogenu reakciju na jedan ili više pogodnih segmenata od Aβ koji su navedeni u gornjem dijelu teksta. (npr. 1-10, 1-7, 1-3, te 3-7). Pogodno je da takvi agensi induciraju imunološku reakciju koja je usmjerena specifično na jedan od tih segmenata, a da pri tome nisu usmjereni na druge segmente od Aβ.

Također se može ispitivati prikladnost slučajno odabranih biblioteka peptida ili drugih komponenti. Kombinatorijalne biblioteke mogu se napraviti za raznovrsne tipove spojeva koji se mogu sintetizirati korak po korak. U takve spojeve uključeni su polipeptidi beta-okret mimici, polisaharidi fosfolipidi, hormoni, prostaglandini, steroidi, aromatski spojevi, heterociklički spojevi, benzodiazepini, oligomerni N-supstituirani glicini, te oligokarbamati. Velike kombinatorijalne biblioteke spojeva mogu se izraditi pomoću postupka kodiranih sintetskih biblioteka (ESL) opisanog u Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642 (svaki od njih inkorporiran je kao referenca za bilo koju svrhu). Peptidne biblioteke mogu se također napraviti pomoću postupaka prikaza faga. Vidjeti npr. Devlin, WO 91/18980.

Inicijalno se ispituje prikladnost kombinatorijalnih biblioteka i ostalih spojeva određivanjem njihove sposobnosti vezanja na antitijela ili limfocite (B ili T) za koje se zna da su specifični za Aβ ili druge amiloidogene peptide poput ATTR. Na primjer, inicijalno ispitivanje može se provoditi s bilo kojim poliklonalnim serumima ili monoklonalnim antitijelom na Aβ ili bilo kojim drugim amiloidogenim peptidom koji je predmet zanimanja. Spojevi koji su identificirani prilikom takvih ispitivanja dalje se analiziraju kako bi se odredila sposobnost induciranja antitijela ili reaktivnih limfocita na Aβ ili drugi amiloidogeni peptid. Na primjer, višestruka razrjeđenja seruma mogu se ispitivati na pločama za mikrotitraciju na koje je prethodno nanesen film fibrilarnog peptida, a standardni ELISA test može se primijeniti za ispitivanje reaktivnosti antitijela na Aβ. Tada se spojevima može ispitivati učinkovitost profilakse i liječenja na transgeničnim životinjama koje imaju predispoziciju za amiloidne bolesti, kao što je opisano u Primjerima. U takve životinje uključeni su, na primjer, miševi sa 717 mutacijom na APP, koje su opisali Games i suradnici, supra, te miševi sa 670/671 švedskom mutacijom na APP, kao što su opisali McCologue i suradnici, US 5,612,486 te Hsiao i suradnici, Science 274,99 (1996); Staufenbiel i suradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Struchler-Pierrat i suradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchlet i suradnici, Neuron 19, 939-945 (1997). Isti pristup ispitivanju može se rabiti kod drugih potencijalnih agenasa poput fragmenata od Aβ, kao što je gore opisano.

b. Ostale komponente plaka

Poželjno je da imunološka reakcija usmjerena na ostale komponente amiloidnog plaka može također djelotvorno sprečavati, usporavati i smanjivati naslage plaka kod amiloidnih bolesti. Takve komponente mogu biti minorne komponente fibrila ili pak povezane s fibrilima ili fibrilarnim formacijama u plaku, uz napomenu da su komponente koje su sveprisutne u tijelu, odnosno relativno nespecifične na amiloidne taloge, općenito manje prikladne za uporabu kao terapeutski agensi.

Stoga, slijedeće otkriće ovog izuma je da su tvari koje induciraju imunološku reakciju na specifične komponente plaka pogodne za liječenje ili sprječavanje napredovanja amiloidne bolesti. Ovaj odjeljak opisuje pozadinu nekoliko primjera molekula koje su povezane s amiloidnim plakom. Indukcija imunološke reakcije na bilo koju od tih molekula, pojedinačno ili u kombinaciji s imunogenim terapeutskim pripravcima protiv fibrilarnih komponenti koje su opisane u gornjem dijelu ili pak protiv bilo kojih drugih komponenti koje ne sačinjavaju fibrili, opisani u nastavku teksta, prema ovom izumu omogućava dodatni režim antiamiloidnog liječenja. Pasivni režimi imunizacije također su sastavni čimbenik ovog izuma, a temelje se na takvim komponentama plaka koje su ovdje opisane.

Na primjer, sinuklein je protein koji je strukturno sličan apolipoproteinima, no pronalazimo ga u neuronskom citosolu, posebice u susjedstvu presinaptičkih završetaka. Postoje najmanje tri oblika proteina, a nazivaju se α, β i γ sinuklein. Nedavno se pokazalo da su α i β sinuklein uključeni u nukleaciju amiloidnih naslaga kod određenih amiloidnih bolesti, posebice kod Alzheimerove bolesti. (Clayton. D. F. i suradnici, TINS 21 (6): 249-255, 1998). Još specifičnije rečeno, fragment od NAC domene α i β sinukleina (ostaci 61-95) izoliran je iz amiloidnog plaka kod pacijenata s Alzheimerovom bolešću; te u biti taj fragment sadržava oko 10% plaka koji ostaje netopljiv nakon otapanja s natrijevim dodecilsulfataom (SDS). (George, J.M. i suradnici, Neurosci. News 1: 12-27; 1995). Nadalje, i za α sinuklein cjelokupne duljine i njegov NAC fragment objavljeno je da ubrzavaju agregiranje β-amiloidnog peptida u netopljivi amiloid in vitro. (Clayton, supra).

Dodatne komponente povezane s amiloidnim plakovima uključuju nepeptidne komponente. Na primjer, perlekan i glikozaminoglikani dobiveni od perlekana predstavljaju velike heparin sulfat proteoglikane koji su prisutni u plakovima, koji sadržavaju Aβ, kod Alzheimerove bolesti i ostalih CNS i sistemskih amiloidoza, uključujući amilinske plakove povezane s dijabetesom. Za te se spojeve pokazalo da povećavaju nastajanje Aβ fibrila. Pokazalo se da i središnji protein i glikozaminoglikanski lanci perlekana sudjeluju u vezanju na Aβ. Dodatni glikozaminoglikani, posebice dermatan sulfat, kondroitin-4-sulfat i pentosan sulfat uobičajeno se nalaze u amiloidnim plakovima različitih tipova, te se također pokazalo da povećavaju tvorbu fibrila. Dekstran sulfat također ima isto svojstvo. To povećanje značajno se smanjuje ako dolazi do uklanjanja sulfatne skupine iz molekula. Imunogeni terapeutici usmjereni protiv sulfatnih oblika glikozaminoglikana, uključujući specifične glikozaminoglikane, tvore dodatne proizvode ovog izuma, koji se rabe kod primarnog ili sekundarnog liječenja. Priprava takvih molekula, kao i odgovarajućih terapeutskih pripravaka koji sadržavaju takve molekule, vještine su koje posjeduje uobičajena stručna osoba.

2. Agensi koji uključuju pasivnu imunološku reakciju

Terapeutske tvari ovog izuma također uključuju imunološke reagense, poput antitijela, koja se specifično vežu na fibrilarne peptide ili ostale komponente amiloidnog plaka. Takva antitijela mogu biti monoklonalna ili poliklonalna, te mogu imati svojstvo specifičnog vezanja koje je u skladu s tipom ciljane amiloidne bolesti. Terapeutski pripravci i režimi liječenja mogu uključivati antitijela usmjerena na pojedinu domenu vezanja ili epitop određene fibrilarne ili nefibrilarne komponente plaka, odnosno mogu uključivati antitijela usmjerena na dva ili više epitopa iste komponente ili antitijela usmjerena na epitope više komponenti plaka.

Na primjer, u pokusima koja su provedena kao potkrjepa ovom izumu, 81⁄2 do 101⁄2 mjeseci starim PDAPP miševima dane su intraperitonealne injekcije (i.p.) poliklonalnih anti-Aβ antitijela pripravljenih protiv specifičnih epitopa Aβ peptida, odnosno slane otopine, kao što je iscrpno opisano u Primjeru XI. U tim pokusima, praćena je koncentracija cirkulirajućih antitijela, te su dane dodatne injekcije, s obzirom da se mora održavati koncentracija cirkulirajućih antitijela veća od 1:1000, u odnosu na specifični antigen na kojeg je razvijeno antitijelo. Promatrano je smanjivanje ukupne razine Aβ, u usporedbi s poredbenom skupinom, u korteksu, hipokampusu, i cerebralnim područjima mozga miševa kojima su davana antitijela; najveća smanjenja pokazala su se kod miševa tretiranih s poliklonalnim antitijelima iz ovih ispitivanja.

U slijedećim pokusima koji su provedeni kao potkrjepa ovom izumu, rabljena su predvidljiva ex vivo određivanja (Primjer XIV), kako bi se ispitalo sposobnost antitijela da uklanjaju fragmente sinukleina koji se smatra da je NAC. Pokazalo se da je sinuklein protein povezan s amiloidnim plakom. Antitijela na NAC kontaktirala su sa uzorkom tkiva mozga koji sadržava amiloidni plak i mikroglija stanice. Serum zeca rabljen je kao poredba. Dodatno promatranje pokazalo je značajno smanjenje količine i veličine plakova što je indikativno za aktivnost uklanjanja naslaga koje vrše antitijela.

Iz tih podataka, vidljivo je da se amiloidni plak povezan s Alzheimerovom bolešću i drugim amiloidnim bolestima može značajno ukloniti davanjem imunoloških reagensa usmjerenih na epitope Aβ peptida ili na NAC fragmente sinukleina, koji učinkovito smanjuju količinu amiloidnog plaka. Nadalje, podrazumijeva se da se u takvim pripravcima može rabiti veliko mnoštvo različitih antitijela. Za uporabu u izumu pogodna su antitijela koja se specifično vežu na agregirane oblike od Aβ, a da se pri tome ne vežu disocirane oblike, kao i antitijela koja se specifično vežu na disocirani oblik, a da se pri tome ne vežu na agregirani oblik. Druga pogodna antitijela vežu se i na agregirane i na disocirane oblike. Neka antitijela vežu se kratki oblik Aβ koji se javlja u prirodi (npr. Aβ39, 40 ili 41), a da se pri tome ne vežu na duge oblike od Aβ (npr. Aβ42 i Aβ43). Neka se antitijela vežu na duge oblike, a ne na kratke oblike. Neka se antitijela vežu na Aβ, a da se pri tome ne vežu na amiloidni prekursor proteina cjelokupne duljine. Neka se antitijela vežu na Aβ s afinitetom vezanja većim ili jednakim od oko 106, 107 108, 109 ili 1010 M-1.

Tipično je da poliklonalni serumi sadržavaju miješanu populaciju antitijela koja se vežu na nekoliko tipova epitopa uzduž duljine Aβ. Monoklonalna antitijela vežu se na specifične epitope unutar Aβ, koji mogu biti konformacijski ili nekonformacijski epitopi. Neka monoklonalna antitijela vežu se na epitop s ostatkom 1-28 od Aβ (s prvim N terminalnim ostatkom prirodnog Aβ označenim kao 1). Ostala monoklonalna antitijela vežu se na epitop s ostacima 1-10 od Aβ. Također postoje monoklonalna antitijela koja se vežu na epitopom s ostacima 1-16 od Aβ. Ostala monoklonalna antitijela vežu se na epitop s ostacima 1-25 od Aβ. Neka monoklonalna antitijela vežu se na epitop s aminokiselinama 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 ili 10-25 od Aβ. Djelotvornost profilakse i liječenja antitijelima može se ispitivati uporabom modela transgeničnih životinja, opisanih u Primjerima.

Općenitije, iz naputaka koji su ovdje objavljeni, stručna osoba može oblikovati, pripraviti i ispitati antitijela usmjerena na fibrilarne proteine ili peptide karakteristične za druge amiloidne bolesti, kao što su one ovdje opisane u Odjeljku 2, uporabom ovdje opisanih pripravaka, kao i antitijela protiv drugih amiloidnih komponenata.

a. Općenite karakteristike imunoglobulina

Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitijela uključuje tetramer podjedinica. Svaki tetramer sastoji se od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan “laki” (oko 25 kDa) i jedan “teški” lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni dijelovi svakog pojedinog lanca uključuju varijabilno područje od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni dio svakog pojedinog lanca određuje konstantno područje prvenstveno odgovorno za funkciju efektora.

Laki lanci klasificirani su kao kapa odnosno lambda. Teški su lanci klasificirani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, a definiraju izotope antitijela kao IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Unutar lakih i teških lanaca varijabilni i konstantni dijelovi povezani su s “J” područjem koji se sastoji od oko 12 ili više aminokiselina, s teškim lancem koji također uključuje “D” područje od oko 10 aminokiselina. (vidjeti općenito, Fundamental Immunology (Paul W., drugo izdanje, Raven Press, N.Y., 1989), poglavlje 7 (svaki od njih inkorporiran je kao referenca za bilo koju svrhu).

Varijabilna područja svakog lakog/teškog para lanaca čine vezno mjesto antitijela. Stoga, intaktno antitijelo ima dva vezna mjesta. Osim kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitijela, dva vezna mjesta su jednaka. Lanci imaju istu opću strukturu relativno konzerviranih okvirnih područja (FR) povezanih s tri hipervarijabilna područja, koji se također nazivaju komplementarno determinirajuće regije ili CDRs. CDRs od dva lanca od svakog para poredani su u okvirna područja, čime omogućuju vezanje na specifične epitope. Od N-terminala do C-terminala, i laki i teški lanci uključuju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Označavanje aminokiselina u svaku domenu u skladu je s definicijama navedenim kod Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesasa, MD, 1987 i 1991), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i suradnici, Nature 342:878-883 (1989).

b. Proizvodnja antitijela koja nisu humanog podrijetla

Proizvodnja monoklonalnih antitijela koja nisu humanog podrijetla, npr. mišjih, od zamoraca, zečjih ili od štakora, može se postići, na primjer, imunizacijom životinje s komponentom plaka, kao što su Aβ ili druge fibrilarne komponente. Može se također rabiti dulji polipeptid koji sadržava Aβ ili imunogeni fragment od Aβ ili anti-idiotipska antitijela na antitijelo od Aβ. Vidjeti npr. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (inkorporiran je kao referenca za bilo koju svrhu). Takav imunogen može se dobiti iz prirodnog izvora, sintezom proteina ili rekombinantnom ekspresijom. Po potrebi, imunogen se može primijeniti spojen ili na neki drugi način kompleksiran s proteinom nosačem, kao što je opisano u nastavku. Po potrebi, imunogen se može primijeniti s pomoćnim sredstvom. Može se rabiti nekoliko tipova pomoćnih sredstava, kao što je opisano u nastavku. Za imunizaciju laboratorijskih životinja preferira se kompletno Freundov pomoćno sredstvo nakon čega slijedi nekompletno pomoćno sredstvo. Tipično se rabe miševi kako bi se proizvela monoklonalna antitijela, Ispituju se antitijela s obzirom na specifično vezanje na imunogen. Po potrebi, antitijela se nadalje ispituju s obzirom na vezanje na specifično područje imunogena. Na primjer, ako je imunogen Aβ peptid, ispitivanje se može postići određivanjem vezanja antitijela na zbirku mutantnih Aβ peptida kojima je izbrisan određeni dio te određivanjem koji se takvi mutanti vežu na antitijelo. Vezanje se može odrediti pomoću Western blot ili ELISA. Najmanji fragment koji ukazuje na specifično vezanje na antitijelo definira epitop antitijela. Alternativno, specifičnost epitopa može se odrediti kompetitivnim određivanjem u kojem se ispitivana i referentna antitijela natječu u vezanju komponente. Ako se ispitivana i referentna antitijela natječu, onda se ona vežu na isti epitop ili epitope koji su dovoljno bliski da vezanje jednog antitijela interferira na vezanje drugog.

c. Kimerna i humanizirana antitijela

Kimerna i humanizirana antitijela imaju istu ili sličnu specifičnost i afinitet vezanja kao i mišja i ne-humana antitijela koja osiguravaju početni materijal za pripravu kimernih i humaniziranih antitijela. Kimerna antitijela su antitijela čiji su geni lakih i teških lanaca pripravljeni tipičnim genetskim inženjeringom, od segmenata gena imunoglobulina koji pripadaju različitim specijama. Na primjer, varijabilni (V) segmenti gena iz mišjih monoklonalnih antitijela mogu se spojiti s humanim konstantnim (C) segmentima, poput IgG1 i IgG4. Stoga je tipično kimerno antitijelo hibridni protein koji se sastoji od V ili domene koja veže antigen iz mišjih antitijela, te C ili domene efektora iz humanih antitijela.

Humanizirana antitijela imaju ostatke varijabilnog okvirnog područja prvenstveno od ljudskih antitijela (nazvana akceptori antitijela) i komplementarna determinirajuća područja prvenstveno od mišjih antitijela (nazvani donor imunoglobulina). Vidjeti Queen i suradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) i WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 i Winter, US 5,225, 539 (inkorporiran je kao referenca za bilo koju svrhu). Konstantno(a) područje(a), ako su prisutna, također su prvenstveno ili sveukupno od ljudskog imunoglobulina. Humane varijabilne domene uobičajeno se odabiru od ljudskih antitijela čija okvirna sekvencija ispoljava visoki stupanj identičnosti sekvencije s domenama mišjih varijabilnih područja od kojih su dobiveni CDRs. Ostaci lakih i teških lanaca varijabilnih okvirnih područja mogu se dobiti od istih ili različitih sekvencija humanih antitijela. Sekvencije humanog antitijela mogu biti sekvencije humanog antitijela koje se javlja u prirodi, odnosno predstavljati konsenzus sekvencije nekoliko humanih antitijela. Vidjeti Carter i suradnici, WO 92/22653. Određene aminokiseline od ostataka humanog varijabilnog okvirnog područja odabrane su za supstituciju baziranu na svom mogućem utjecaju na CDR konformaciju i/ili na vezanje antigena. Istraživanje takvih mogućih utjecaja provodi se modeliranjem ispitivanjem karakteristika aminokiselina na odgovarajućim položajima, ili empirijskim promatranjem učinaka supstitucije ili mutageneze odgovarajuće aminokiseline.

Na primjer, ako jedna aminokiselina predstavlja razliku između mišjeg ostataka varijabilnog okvirnog područja i odabranog ostataka humanog varijabilnog okvirnog područja, humana okvirna aminokiselina trebala bi se supstituirati ekvivalentnom aminokiselinom iz mišjeg antitijela, ako se opravdano očekuje da aminokiselina:

(1) direktno nekovalentno veže antigen

(2) susjedna je u odnosu na CDR područje

(3) na drugi način stupa u interakciju s CDR područjem (npr. nalazi se unutar 6 A CDR područja), ili

(4) participira u VL-VH vezi

Ostali kandidati za supstituciju su akceptorske humane okvirne aminokiseline koje su neuobičajene za humani imunoglobulin na tom položaju. Te se aminokiseline mogu supstituirati s aminokiselinama s ekvivalentnog položaja mišjeg donorskog antitijela ili s ekvivalentnog položaja tipičnih humanih imunoglobulina. Ostali kandidati za supstituciju su akceptorske humane okvirne aminokiseline koje su neuobičajene za humani imunoglobulin na tom položaju. Varijabilna okvirna područja humaniziranih imunoglobulina obično imaju 85% identičnu sekvenciju u odnosu na humanu sekvenciju varijabilnog okvirnog područja ili pak na konsenzus takvih sekvencija.

d. Humana antitijela

Humana antitijela na Aβ dobivaju se pomoću različitih tehnika opisanih u nastavku. Neka humana antitijela odabrana su pomoću pokusa kompetitivnog vezanja, ili pak imaju istu specifičnost epitopa kao i određeno mišje antitijelo, poput onog od mišjeg monoklona opisanog u Primjeru XI. Humana se antitijela također mogu ispitivati s obzirom na odgovarajuću specifičnost epitopa uporabom samo fragmenta od Aβ kao imunogen i/ili ispitivanjem antitijela na zbirku mutanata Aβ kojima je izbrisan određeni dio.

(1) Metodologija trioma

Osnovni pristup i primjer sudionika stanične fuzije 37, SPAZ-4; koji se rabe u ovom pristupu opisani su u članku Oestberg i suradnici Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent br. 4,634,664; te Engleman i suradnici, U.S. Patent 4,634,666 (svaki od njih inkorporiran je u cijelosti kao referenca za bilo koju svrhu). Stanične linije koje proizvode antitijela, a koje su dobivena ovim postupkom, nazivaju se triome, jer potječu od tri stanice - dvije humane u jedne mišje. Na početku, mišja mijelomska linija spojena je s humanim B-limfocitima kako bi se dobile ksenogene hibridne stanice koje ne stvaraju antitijela. Ksenogene su stanice zatim fuzionirane s imuniziranim humanim B-limfocitima kako bi se dobila antitijela za proizvodnju trioma stanične linije. Pronađeno je da triome proizvode antitijela stabilnije u odnosu na uobičajene hibridome, napravljene od humanih stanica.

Imunizirani B-limfociti dobiveni su iz krvi, slezene, limfnih čvorova ili koštane srži humanog donora. Ako se žele dobiti antitijela na specifični antigen ili epitop, pogodno je da se za imunizaciju rabi antigen ili njegov epitop. Imunizacija se provodi ili in vivo ili in vitro. Za imunizaciju in vivo tipično je da se B stanice izoliraju iz čovjeka imuniziranog s Aβ, njegovim fragmentom, većim polipeptidom koji sadržava Aβ fragment ili anti-itiotipskim antitijelom na antitijelo na Aβ. U nekim postupcima, B stanice izoliraju se iz istog pacijenta kojem je potrebno dati terapiju antitijelima. Za imunizaciju in vitro, tipično je da se B-limfociti izlože antigenima tijekom 7-14 dana u mediju kao što je RPMI-1640 (vidjeti Engleman, supra) kojem je dodano 10% humane plazme.

Imunizirani B-limfociti spojeni su u ksenogenim hibridnim stanicama, poput SPAZ-4, pomoću vrlo dobro poznatih postupaka. Na primjer, stanice se tretiraju s 40-50%-tnim polietilenglikolom molarne mase od oko 1000-4000, na oko 37 °C, u trajanju od oko 5-10 min. Stanice se odvoje iz fuzijske smjese i propagiraju u mediju selektivnom za željene hibride (npr. HAT ili AH). Klonovi koji luče antitijela, a koji imaju potrebnu specifičnost vezanja, identificirani su određivanjem sposobnosti vezanja na Aβ ili njegov fragment u mediju za uzgoj kulture trioma. Triome koje proizvode humana antitijela, a imaju željenu specifičnost, subklonirane su tehnikom ograničenog razrjeđenja i uzgojeni in vitro u mediju za uzgoj kulture. Zatim je testirana sposobnost dobivenih trioma staničnih linija za sposobnost vezanja Aβ ili njegovih fragmenata.

Iako su triome genetički stabilne one ne proizvode antitijela u vrlo visokim količinama. Razine ekspresije mogu se povisiti kloniranjem gena antitijela od triome u jedan ili više vektora ekspresije, te transformiranjem vektora u standardnim staničnim linijama sisavaca, bakterija ili kvasaca, prema postupcima koji su vrlo dobro poznati u struci.

(2) Transgenični ne-humani sisavci

Humana antitijela na Aβ mogu se također proizvesti od transgeničnih ne-humanih sisavaca sa transgenima koji kodiraju najmanje segment lokusa humanog imunoglobulina. Obično je lokus endogenog imunoglobulina takvih transgeničnih sisavaca funkcionalno inaktiviran. Pogodno je da segment lokusa humanog imunoglobulina uključuje nesređenu sekvenciju komponenata s lakim i teškim lancima. I inaktivacija gena endogenog imunoglobulina i uvođenje gena egzogenog imunoglobulina mogu se postići ciljanom homolognom rekombinacijom, odnosno uvođenjem YAC kromosoma. Transgenični sisavci koji nastaju u ovom procesu mogu funkcionalno preurediti sekvenciju imunoglobulinske komponente, te dovode do ekspresije niza antitijela različitih izotipova kodiranih genom humanog imunoglobulina, pri čemu ne dolazi do ekspresije endogenog gena imunoglobulina. Proizvodnja i svojstava sisavaca koji imaju te karakteristike iscrpno su opisani npr. u Lomberg i suradnici, WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994). Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (svaki od njih inkorporiran je u cijelosti kao referenca za bilo koju svrhu). Transgenični miševi praktično su pogodni s tog stajališta. Anti-Aβ antitijela dobivena su imunizacijom transgeničnih ne-humanih sisavaca, kao što su opisali Lonberg ili Kucherlapati, supra, s Aβ ili njegovim fragmentom. Monoklonalna antitijela pripravljaju se npr. fuzijom B-stanica iz takvih sisavaca u odgovarajućim staničnim linijama mijeloma uporabom konvencionalne Kohler-Milstein tehnologije. Humana poliklonalna antitijela mogu se također pripraviti u obliku humanog seruma imuniziranog imunogenom tvari. Po potrebi, takva poliklonalna antitijela mogu se ukoncentrirati afinitetnim pročišćavanjem uz uporabu Aβ ili drugog imunogenog amiloidnog peptida kao afinitetnog reagensa.

(3) Postupci izlaganja faga

Slijedeći način dobivanja anti-Aβ antitijela je ispitivanje DNA biblioteke s obzirom na humane B stanice prema općenitom protokolu kojeg su objavili Huse i suradnici, Science 246:1275-1281 (1989). Na primjer, kao što je opisano za metodologiju trioma, takve se B stanice mogu dobiti od čovjeka imuniziranog s Aβ fragmentima, duljim polipeptidima koji sadržavaju Aβ ili fragmente, odnosno anti-idiotipskim antitijelima. Po potrebi takve se B stanice dobivaju od pacijenta koji se treba liječiti antitijelima. Odaberu se antitijela koja se vežu na epitop ispitivane amiloidne komponente, poput Aβ ili njegovog fragmenta. Tada se kloniraju i pojačavaju sekvencije koje kodiraju takva antitijela (ili vezujuće fragmente). Protokol kojeg je opisao Huse je učinkovitiji u kombinaciji s postupkom prikazivanja faga. Vidjeti, npr. Dower i suradnici, WO 91/17271 i McCafferty i suradnici, WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871, 907, US 5,858,657, US 5,837, 242, US 5,733,743, te US 5,565,332 (svaki od njih inkorporiran je u cijelosti kao referenca za bilo koju svrhu). U tim postupcima, proizvedene su biblioteke faga u kojima su članovi izloženi različitim antitijelima na njihovoj vanjskoj površini. Antitijela su obično prikazana kao Fv ili Fab fragmenti. Fagovi koji prikazuju antitijela željene specifičnosti izabrani su prema povećanom afinitetu prema Aβ peptidu ili njegovom fragmentu.

U varijanti postupka izlaganja faga, mogu se dobiti humana antitijela koja specifično vežu odabrana mišja antitijela. Pogledati Winter, WO 92/20791. Kod tog postupka, ili teški ili laki lanac varijabilnog područja odabranog mišjeg antitijela koristi se kao polazni materijal. Ako se, na primjer, kao polazni materijal koristi laki lanac varijabilnog područja, konstruira se takva biblioteka faga čiji članovi izlažu istu varijabilnu regiju lakog lanca (npr., polazni mišji materijal) te različito područje teškog lanca. Varijabilna područja teškog lanca dobivena su iz biblioteka prerađenih varijabilnih regija humanog teškog lanca. Odabire se fag koji snažno specifično veže odabranu komponentu (npr., najmanje 108, a pogodnije najmanje 109 M-1). Tada kao polazni materijal za konstrukciju slijedeće biblioteke faga služi varijabilno područje humanog teškog lanca. U toj biblioteci, svaki fag prikazuje istu varijabilnu regiju teškog lanca (npr. regiju identificiranu iz prve biblioteke) te različito varijabilno područje lakog lanca. Varijabilna područja lakog lanca dobivene su iz biblioteka obrađenih varijabilnih područja humanog lakog lanca. Ponovo se odabiru fagi koji pokazuju snažno specifično vezanje za komponentu amiloidnog peptida. Ti fagi prikazuju varijabilno područje kompletnih humanih antitijela protiv amiloidnih peptida. Ta antitijela obično imaju istu ili sličnu specifičnost epitopa kao i polazni mišji materijal.

e. Izbor konstantnog područja

Teški i laki lanci varijabilnih područja kimernih, humaniziranih ili humanih antitijela mogu se vezati najmanje na dio humane konstantnog područja. Izbor konstantnog područja djelomično ovisi o tome da li je potreban komplementarni dio ovisan o antitijelu i/ili toksičnost kojom upravlja stanica. Na primjer, izotipovi IgG1 i IgG3 imaju komplementarnu aktivnost, dok je izotipovi IgG2 i IgG4 nemaju. Izbor izotopa također može utjecati na prolaz antitijela u mozak. Laki lanac konstantnih područja može biti kapa ili lambda. Može doći do ekspresije antitijela u obliku tetramera koji sadržavaju dva laka i dva teška lanca, kao odvojene teške lance, lake lance, kao Fab, Fab’F(ab’)2, i Fv, ili kao jednolančana antitijela kod kojih su teški i laki lanac varijabilne domene povezani razmaknicom.

f. Ekspresija rekombinantnih antitijela

Kimerna, humanizirana i humana antitijela najčešće se dobivaju rekombinantnom ekspresijom. Obično konstruirani rekombinantni polinukleotid uključuje sekvenciju koja vrši kontrolu ekspresije, a koja je operabilno povezana s kodirajućom sekvencijom lanca antitijela, što uključuje prirodno povezanu ili heterolognu regiju promotora. Pogodno je da su sekvencije koje vrše kontrolu ekspresije eukariotski sustavi promotora u vektorima sposobnim za transformiranje ili transfekciju eukariotskih stanica domaćina. Nakon što se vektor ugradi u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava pod uvjetima koji su pogodni za visoki stupanj ekspresije sekvencije nukleotida, te za sakupljanje i čišćenje antitijela dobivenih međusobnom reakcijom.

Ovi vektori ekspresije obično se repliciraju u organizmu domaćina ili kao episomi ili kao integralni dio kromosomske DNA domaćina. Obično, vektori ekspresije sadržavaju markere za selekciju, npr., za rezistenciju na ampicilin ili za rezistenciju na higromicin, kako bi se moglo detektirati koje su stanice promijenjene sa željenom DNA sekvencijom.

E. coli je eukariotski domaćin osobito pogodan za kloniranje DNA sekvencija ovog izuma. Mikrobi, kao što su kvašćeve gljivice, također su korisni za ekspresiju. Takav pogodni domaćin su Saccharomyces, s pogodnim vektorima koji sadržavaju sekvencije za kontrolu ekspresije, original replikacije, sekvenciju za terminaciju, te što je već pogodno. Tipični promotori uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i ostale glikolitičke enzime. Inducibilni promotori kvasca uključuju, između ostalog, promotore iz alkohol dehidrogenaze, izocitokroma C, te enzima odgovornih za iskorištavanje maltoze i galaktoze.

Stanice sisavaca pogodni su domaćini za ekspresiju segmenata nukleotida koji kodiraju imunoglobuline ili njihove fragmente. Pogledati Winnacker From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). U struci je razvijen velik broj pogodnih staničnih linija koje mogu proizvoditi čiste heterologne proteine, a te stanične linije uključuju CHO linije, različite COS stanične linije, HeLa stanice, L stanice, te mijeloma stanične linije. Vektori ekspresije tih stanica mogu uključivati sekvencije za kontrolu ekspresije, kao što su original replikacije, promotor, pojačivač (Queen i suradnici., Immuno. Rev. 89:49 (1986)), te potrebna mjesta procesiranja informacije, kao što su vezna mjesta za ribosome, mjesta za vezanje RNA, mjesta poliadenilacije, te sekvencije za prijepis terminacije. Pogodne sekvencije za kontrolu ekspresije izvedene su iz endogenih gena, citomegalovirusa, SV40, adenovirusa, goveđeg papilomavirusa i sličnih. Pogledati Co i suradnici, J. Immunol. 148:1149 (1992).

Alternativno, sekvencije koje kodiraju antitijelo mogu se ugraditi u transgene za uvođenje u genom transgeničnih životinja nakon čega slijedi ekspresija u mlijeku transgeničnih životinja (npr. prema postupcima opisanim u US 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992, (svaki od njih inkorporiran je u cijelosti kao referenca). Odgovarajući transgeni uključuju kodirajuće sekvencije za lake i/ili teške lance u operabilnom vezanju s promotorom i pojačivačem iz specifičnog gena mliječnih žlijezdi, kao što su kazein ili beta laktoglobulin.

Vektori koji sadržavaju zanimljive segmente DNA mogu se transferirati u stanicu domaćina dobro poznatim metodama, ovisno o tipu stanice domaćina. Na primjer, transfekcija kalcijevog klorida uobičajeno se rabi za prokariotske stanice, dok se tretiranje kalcijevim fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, te biolitička ili virusno bazirana transfekcija mogu rabiti za druge stanične domaćine. Drugi postupci koji se rabe za transformiranje stanica sisavaca uključuju uporabu polibrena, spajanje protoplasta, liposome, elektroporaciju te mikroinjekcije (vidjeti općenito, Sambrook i suradnici, supra). Za proizvodnju transgeničnih životinja, transgeni se mogu mikroinjektirati u oplođene oocite, ili pak mogu biti ugrađeni u genom embrionalnih matičnih stanica, te u jezgre takvih stanica transferirane u oocite kojima je izvađena jezgra.

Nakon ekspresije, antitijela se mogu pročistiti prema standardnim postupcima poznatim u struci, uključujući pročišćavanje pomoću HPLC, kromatografije na stupcu, gel elektroforeze i sl. (vidjeti općenito, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

4. Ostali terapeutici

Terapeutski agensi koji se rabe u ovom postupku uključuju također T-stanice koje se vežu na komponentu plaka, kao što je Aβ peptid. Na primjer, T-stanice mogu se aktivirati protiv Aβ peptida ekspresijom humanog MHC gena klase I, te humanog gena β-2-mikroglobulina iz stanične linije insekta, pri čemu nastaje prazni kompleks na površini stanice koji se može vezati na Aβ peptid. Vidjeti Peterson i suradnici, US 5,314,813. Ekspresija MHC antigen klase II staničnom linijom insekta može se rabiti na sličan način radi aktivacije CD4 T stanica.

5. Proteini nosači

Neki agensi kojima se inducira imunološka reakcija sadržavaju odgovarajući epitop za induciranje imunološke reakcije na amiloidne taloge, ali su premali da bi bili imunogeni. U toj situaciji, imunogeni peptid može se vezati na odgovarajući nosač koji pomaže izazivanju imunološke reakcije. U odgovarajuće nosače uključeni su albumini iz seruma, hemocijanin u obliku pužne ključanice (keyhole limpet), molekule imunoglobulina, tiroglobulin, ovalbumin, toksoid tetanusa ili toksoid iz drugih patogenih bakterija, kao što su difterija, E. coli, kolera ili H. pylori, ili atenuirani derivati toksina. Drugi nosači uključuju epitope T-stanice koji se vežu na višestruke MHC alele, npr. najmanje 75% humanih MHC alela. Takvih nosači u struci se ponekad nazivaju “univerzalni epitopi T-stanice”. Primjeri univerzalnih epitopa T-stanice uključuju:

Influenca hemaglutinin: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (id. br. sek.: 1)

PADRE (uobičajeni ostatci podebljano) AKXVAAWTLKAAA (id. br. sek.: 2)

Malarija CS: T3 epitop EKKIAKMEKASSVFNV (id. br. sek.: 3)

Hepatitis B površinski antigen: HBsAg19-28 FFLLTRILTI (id. br. sek.: 4)

Protein toplinskog šoka 65: hsp65 153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (id. br. sek.: 5)

Bacil Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL (id. br. sek.: 6)

Toksoid tetanusa: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (id. br. sek.: 7)

Toksoid tetanusa: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (id. br. sek.: 8)

HIV gp 120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA. (id. br. sek.: 9)

U ostale nosače za stimuliranje ili povećavanje imunološke reakcije uključuju se citokini poput IL-1, IL-1 α i β peptida, IL-2, γINF, IL-10, GM-CSF, te kemokini, kao što su MIP1α i β i RANTI. Imunogeni se mogu također vezati na peptide koji poboljšavaju transport kroz tkivo, kao što je opisao O’Mahony, WO 97/17613 te WO 97/17614.

Imunogeni se mogu vezati na nosače kemijskim unakrsnim povezivanjem. Tehnike vezanja imunogena na nosač uključuju nastajanje disulfidnih mostova uporabom N-sukcinimidil-3-(2-piridil-tio)propionata (SPDP) i sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilata (SMCC) (ako peptidu nedostaje sulfhidrilna skupina, to se može omogućiti dodatkom cisteinskog ostatka). Ti reagensi stvaraju disulfidni most između sebe i peptidnog cisteinskog ostatka na jednom proteinu i amidnu vezu preko ε-amino na lizinu ili druge slobodne amino skupine kod drugih aminokiselina. Takvi raznovrsni agensi koji stvaraju disuldide/amide opisani su u Immun. Rev. 62, 185 (1982). Drugi bifunkcionalni agensi za spajanje radije tvore tioetere nego disulfidne mostove. Mnogi takvi spojevi koji stvaraju tioetere komercijalno su dostupni, a uključuju reaktivne estere 6-maleimidokapro kiseline, 2-bromooctene kiseline, te 2-jodooctene kiseline, 4-(N-maleimido-metil)cikloheksan-1-karboksilne kiseline. Karboksilna skupina može se aktivirati pomoću sukcinimida ili natrijeve soli 1-hidroksi-2-nitro-4-sulfonske kiseline.

Ekspresija imunogenih peptida može se također vršiti fuzijom proteina s nosačima (npr., heterologni peptidi). Imunogeni peptidi mogu se vezati na njihov amino kraj, karboksilni kraj, ili oba kraja na nosač. Po potrebi, u fuzioniranom proteinu mogu se pojavljivati višestruka ponavljanja imunogenog peptida. Nadalje, imunogeni se peptid može povezati s višestrukim kopijama heterolognog peptida, na primjer, i na N i na C-terminus peptida. Neki nosači peptida služe za pobuđivanje odgovora pomoćnika T-stanica na nosač peptida. Pobuđeni pomoćnici T-stanica uzastopno pobuđuju reakciju B-stanica na imunogeni peptid vezan na peptid nosač.

Neki agensi izuma uključuju fuzionirani protein kod kojeg je N-terminalni fragment Aβ peptida vezan na C-terminus peptida nosača. Kod takvih agenasa, N-terminalni ostatak fragmenta Aβ predstavlja i N-terminalni ostatak fuzioniranog proteina. Sukladno tome, takvi fuzionirani proteini imaju mogućnost pobuđivanja antitijela koja se vežu na epitop, što zahtijeva slobodan N-terminalni ostatak Aβ. Neki agensi izuma uključuju višestruka ponavljanja N-terminalnog segmenta Aβ koji je povezan na C-terminus jedne ili više kopija peptida nosača. N-terminalni fragment Aβ ugrađen u takve fuzionirane proteine ponekad počinje na Aβ1-3 a završava na Aβ7-11. Aβ7-11, Aβ1-3, 1-4, 1-5, te 3-7 preferirani su N-terminalni fragmenti Aβ peptida. Neki fuzionirani proteini uključuju različite N-terminalne segmente Aβ u tandemu. Na primjer, fuzionirani protein može uključivati Aβ1-7, nakon čega slijedi Aβ1-3, nakon čega slijedi heterologni peptid.

Kod nekih fuzioniranih proteina, N-terminalni kraj Aβ spojen je na N-terminalni kraj heterolognog peptida nosača. Može se koristiti isto variranje N-terminalnih segmenata Aβ kao kod C-terminalnih fuzija. Neke fuzije proteina uključuju heterologni peptid povezan na N-terminus N-terminalnog segmenta Aβ, koji je u tandemu uzastopno povezan na jedan ili više dodatnih N-terminalnih segmenata Aβ.

Dolje su prikazani neki primjeri fuzioniranih proteina pogodnih za korištenje u okviru izuma. Neki od ovih fuzioniranih proteina uključuju segmente Aβ povezane na tetanus toksoidne epitope, kao što su oni opisani u US 5,196,512, EP 378,881, EP 427,347. Neki fuzionirani proteini uključuju segmente Aβ povezane na peptide nosače opisane u US 5,736,142. Neki heterologni peptidi su univerzalni epitopi T-stanica. Kod nekih postupaka, agens koji se primjenjuje jednostavno je jedan fuzionirani protein s Aβ segmentom povezanim na heterologni segment u linearnoj konfiguraciji. Kod nekih postupaka, agens je multimer fuzioniranih proteina prikazanih formulom 2x, gdje je x cijeli broj od 1-5. Pogodno je da je x 1, 2 ili 3, a najpogodnije da je 2. Kada je x dva, takav multimer ima četiri fuzionirana proteina, koji su povezani u preferiranu konfiguraciju, opisanu kao MAP4 (pogledati US 5,229,490). Epitopi Aβ su podcrtani.

Dolje je prikazana konfiguracija MAP4, čije su razgranate strukture dobivene inicijalnom sintezom peptida kako na N-terminusu, tako i na amino skupinama bočnih lanaca lizina. Rezultirajuća će struktura imati N-terminusa ovisno o tome koliko je puta lizin ugrađen u sekvenciju, te koliko je puta omogućeno grananje. U ovom primjeru, dobivena su četiri identična N-kraja na razgranatoj jezgri koja sadržava lizin. Takav multiplicitet izuzetno povećava reakciju srodnih B-stanica.

[image]

AN90549 (Aβ 1-7/Tetanus toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji):

DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (id. br. sek.: 10)

AN90550 (Aβ 1-7/Tetanus toksoid 947-967 u MAP4 konfiguraciji):

DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (id. br. sek.: 11)

AN90542 (Aβ 1-7/Tetanus toksoid 830-844 + 947-967 u linearnoj konfiguraciji):

DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (id. br. sek.: 12)

AN90576 (Aβ 3-9/Tetanus toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji):

EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL (id. br. sek.: 13)

Peptidi opisani u US 5,736,142 (svi u linearnoj konfiguraciji):

AN90562 (Aβ 1-7/peptid) AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (id. br. sek.: 14)

AN90543 (Aβ 1-7 × 3/peptid) DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (id. br. sek.: 15)

Ostali primjeri fuzioniranih proteina ( imunogeni epitopi Aβ su podebljani) uključuju:

AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 16)

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (id. br. sek.: 17)

DAEFRHD-ISQAVHAAHEINEAGR (id. br. sek.: 18)

FRHDSGY-ISQAVHAAHEINEAGR (id. br. sek.: 19)

EFRHDSG-ISQAVHAAHEINEAGR (id. br. sek.: 20)

PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (id. br. sek.: 21)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (id. br. sek.: 22)

DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (id. br. sek.: 23)

DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (id. br. sek.: 24)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (id. br. sek.: 25)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (id. br. sek.: 26)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (id. br. sek.: 27)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (id. br. sek.: 28) na smoli; dvije grane

[image]

EQVTNVGGAISQAVHAAHEINEAGR (sinukleinski fuzionirani protein u MAP-4 konfiguraciji; id. br. sek.: 29)

Isti ili slični proteini nosači i postupci vezanja mogu se koristiti za dobivanje imunogena koji se koriste za generiranje antitijela protiv Aβ za uporabu kod pasivne imunizacije. Na primjer, Aβ ili fragment povezan na nosač može se davati laboratorijskim životinjama radi dobivanja monoklonalnih antitijela na Aβ.

6. Terapeutici za kodiranje nukleinskih kiselina

Imunološka reakcija protiv amiloidnih naslaga može se također pobuđivati primjenom nukleinskih kiselina koje kodiraju odabrane peptidne imunogene, ili antitijela i njihove lančaste komponente korištene za pasivnu imunizaciju. Takve nukleinske kiseline mogu biti DNA ili RNA. Segment nukleinske kiseline koji kodira imunogen uglavnom je vezan na regulatorne elemente kao što su promotor ili pojačivač koji dozvoljavaju ekspresiju DNA segmenta na ciljane stanice pacijenta. Kod ekspresije u stanicama krvi, što je poželjno za induciranje imunološke reakcije, za upravljanje ekspresijom pogodni su elementi promotora i pojačivača lakih i teških lanaca imunoglobulinskih gena ili CMV glavni međuprodukt ranog promotora i pojačivača. Povezani regulacijski elementi i sekvencije kodiranja često su klonirani u vektor. Kod primjene antitijela s dvostrukim lancem, dva se lanca mogu klonirati u istom ili odvojenom vektoru.

Dostupni su mnogobrojni viralni vektorski sustavi uključujući retroviralne sustave (vidjeti npr. Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109, 1993); adenoviralne vektore (vidjeti npr. Bett i suradnici, J. Virol. 67, 5911, 1993) adeno-asocirani vektori (vidjeti npr. Zhou i suradnici, J. Exp. Med., 179, 1867, 1994), viralni vektori iz porodice boginja, uključujući virus kravljih boginja, te ptičjih boginja, viralne vektore roda alfa virusa, kao što su oni nastali od Sindbis i Semliki Forest virusa (vidjeti npr. Dubensky i suradnici, J. Virol. 70, 508-519, 1996); virus venecuelanskog konjskog encefalitisa (vidjeti US 5,643,576) i rabdoviruse, poput virusa vaskularnog stomatitisa (vidjeti WO 96/34625), te papilomaviruse (Ohe i suradnici, Human Gene Terapy 6, 325-333, 1995); Woo i suradnici, WO 94/12629 te Xiao & Bransma, Nucleic Acids Res. 24, 2630-2622, 1996).

DNA koja kodira imunogen ili vektor koji ga sadržava može se zapakirati u liposom. Odgovarajući lipidi i srodni analozi opisani su u US 5,208,036 5,264,618, 5,279,833 te 5,283,185. Vektori i DNA koji kodiraju imunogen mogu se također apsorbirati ili povezati s određenim nosačima, kao što su na primjer polimeri polimetilmetakrilata te poliaktidi i poli(laktid-koglikolidi), vidjeti npr. McGee i suradnici, J. Micro Encap. (1996).

Tipičan način davanja vektora genske terapije ili gole DNA in vivo je putem sistemske primjene na pojedinom pacijentu (npr. intravenski, intraperitonealno, intranazalno, gastralno, intradermalno, intramuskularno, subdermalno ili intrakranialnom infuzijom ili lokalnom primjenom (vidjeti npr. US 5,399,346): Nadalje, takvi vektori mogu sadržavati tvari za olakšavanje kao što je bupivacin (US 5,593,970). DNA se također može primijeniti pomoću “genske puške” (gene gun).Vidjeti Xiao & Brandsma, supra. DNA koja kodira imunogen istaloži se na površinu mikroskopskih metalnih kuglica. Mikroprojektili se ubrzaju šok valom ili ekspandirajućim plinovitim helijem, te prodiru u tkivo u dubinu od nekoliko slojeva stanica. Na primjer, pogodno je sredstvo za primjenu gena Accel ™ Gene Delivery Device koje proizvodi Agracetus. Inc., (Middleton, WI). Alternativno, gola DNA može proći kroz kožu u krvotok jednostavnim točkastim nanošenjem DNA na kožu u obliku točke kemijskom ili mehaničkom iritacijom (vidjeti WO 95/05853).

U slijedećoj varijanti, vektori koji kodiraju imunogene mogu se primijeniti u stanice ex vivo, putem stanica koje su eksplantirane iz pojedinog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalnih donorskih hematopoetskih matičnih stanica, nakon čega slijedi reimplantacija stanica u pacijenta, uobičajeno nakon odabira stanica koje si inkorporirale vektor.

7. Ispitivanje antitijela s obzirom na aktivnost uklanjanja

Primjer XIV opisuje postupke skrininga antitijela s obzirom na aktivnost uklanjanja amiloidne naslage. Kako bi se ispitala aktivnost uklanjanja amiloidne naslage, uzorak tkiva pacijenta koji boluje od amiloidoze, poput tkiva mozga s Alzheimerovom bolešću, ili pak životinjski model karakterističnih patoloških svojstava, dovede se u kontakt s fagocitnim stanicama koje nose Fc receptor, poput mikroglija stanica, a ispitivano antitijelo nalazi se u mediju in vitro. Fagocitne stanice mogu biti iz primarne kulture ili stanične linije, poput BV-2, C8-B4 odnosno THP-1. Te se komponente kombiniraju na mikroskopskom objektnom stakalcu, kako bi se olakšalo mikroskopsko promatranje, ili se pak mogu provesti paralelne višestruke reakcije u jažicama posuđa za mikrotitraciju. U tom formatu, odvojena minijaturna mikroskopska objektna stakalca montiraju se u odvojene jažice, odnosno može se rabiti ne-mikroskopski format detekcije, poput ELISA detekcije Aβ. Pogodno je da se naprave serije mjerenja određene količine amiloidnog taloga u in vitro reakcijskoj smjesi, počevši od vrijednosti bazne linije prije nego što se reakcija započne, te jedne ili više ispitivanih vrijednosti za vrijeme reakcije. Antigen se može detektirati pomoću bojanja, na primjer, fluorescentno označenim antitijelom na Aβ ili neku drugu komponentu amiloidnog plaka. Antitijelo koje se upotrijebi za bojanje može ali i ne mora biti isto kao antitijelo za ispitivanje aktivnosti uklanjanja. Smanjenje relativno u odnosu na baznu liniju tijekom reakcije amiloidnih naslaga indicira da ispitano antitijelo ima aktivnost uklanjanja. Takva su antitijela vjerojatno korisna za prevenciju ili liječenje Alzheimerove bolesti i ostalih amiloidogenih bolesti. Kao što je gore opisano, pokusi koji se provode kao potkrjepa ovom izumu otkrili su da su, upotrebljavajući takvo ispitivanje, antitijela na NAC fragment sinukleina učinkovita u uklanjaju amiloidnog plaka karakterističnog za Alzheimerovu bolest.

D. Pacijenti pogodni za režim anti-amiloidnog tretmana

Pacijenti koji su pogodni za liječenje su individue koje pokazuju rizik za bolest, ali nemaju simptome, kao i pacijenti koji već pokazuju simptome amiloidoze. U slučaju Alzheimerove bolesti, gotovo svaka osoba može imati rizik od obolijevanja od Alzheimerove bolesti, ako on ili ona žive dovoljno dugo. Stoga se ovi postupci mogu kao profilaksa primjenjivati na široj populaciji, bez potrebe za procjenom rizika kod pojedinog pacijenta. Ovi postupci su osobito korisni kod osoba koje stvarno imaju poznati genetski rizik od Alzheimerove bolesti ili bilo koje druge nasljedne amiloidne bolesti. Među takve osobe ubrajaju se one koje u obitelji imaju oboljele od te bolesti, kao i osobe čiji je rizik utvrđen analizom genetskih ili biokemijskih markera. Genetski markeri rizika za Alzheimerovu bolest uključuju mutacije na APP genu, posebno mutacije na položaju 717 te na položajima 670 i 671 opisanim kao Hardy i švedske mutacije (pogledati Hardy, TINS, supra). Ostali markeri rizika su mutacije na genima za persenilin, PS1 i PS2, te ApoE4, obiteljska anamneza AB (Alzheimerova bolest), hiperkolesterolemija ili ateroskleroza. Osobe koje boluju od Alzheimerove bolesti prepoznaju se po karakterističnoj demenciji, kao i po faktorima rizika koji su gore opisani. Nadalje, određeni broj dijagnostičkih ispitivanja provode se u srhu identifikacije osoba koje imaju AB. Tu su uključena mjerenja CFS tau te razine Aβ42. Povišene tau i snižene razine Aβ42 označavaju prisustvo AB. Dijagnostika osoba koje pate od Alzheimerove bolesti može se provesti pomoću MMSE ili ADRDA kriterija, kao što je raspravljeno u Primjerima.

Kod asimptomatičnih pacijenata liječenje može početi u bilo kojoj starosnoj dobi (npr. 10, 20, 30). No uobičajeno nije potrebno početi liječenje dok pacijent ne navrši 40, 50, 60 ili 70 godina. Liječenje uobičajeno zahtijeva višestruke doze u određenom vremenskom periodu. Liječenje se može nadzirati ispitivanjem antitijela odnosno reakcijom aktiviranih T-stanica ili B-stanica na terapeutik (npr. Aβ peptid) u vremenskom periodu, prema opisanome u Primjerima I i II. Ako reakcija opada, to ukazuje na potrebu za pojačanom dozom. Ako se radi o potencijalnim pacijentima s Downovim sindromom, liječenje može početi antenatalno davanjem terapeutika majci ili ubrzo nakon porođaja.

Ostali oblici amiloidoza često prolaze nedijagnosticirani, osim ako se ne sumnja na određenu sklonost prema bolesti. Prvi simptom predstavlja pojava srčanih ili bubrežnih bolesti kod pacijenta srednjih godina do starije dobi koji također ima teškoća i s drugim organima. Niska voltaža ili ekstremna odstupanja od osi na elektrokardiogramu i stanjeno ventrikularno tkivo mogu biti indikativni za srčane poteškoće. Proteinuria je simptom kod bubrežnih poteškoća. Također može se sumnjati na jetrene poteškoće ako se ustanovi hepatomegalija fizičkim ispitivanjem pacijenta. Periferna neuropatija također je uobičajena pojava kod određenih oblika amiloidoze; autonomna neuropatija koju karakterizira posturalna hipotenzija može također biti prisutna. Na amiloidozu treba sumnjati kod svakoga tko ima progresivnu neuropatiju nedeterminiranog podrijetla. Konačna dijagnoza može se dobiti uporabom postupaka biopsije tkiva, tamo gdje je(su) dostupan(ni) zahvaćeni organ(i). Kod sistemskih amiloidoza može se rabiti komadić aspirirane masnoće ili rektalna biopsija. Uzorak za biopsiju boja se s Kongo crvenom bojom, pri čemu pozitivni uzorci ispoljavaju svojstvo dvostruke refrakcije pod polariziranim svjetlom mikroskopa.

E. Režimi liječenja

Kod primjene u obliku profilakse, farmaceutski se pripravci ili medikamenti primjenjuju na pacijentima kod kojih se sumnja da postoji rizik od određene bolesti, u takvoj količini koja je dovoljna da eliminira ili smanji rizik ili pak odgodi početak bolesti. Kod terapijske primjene, pripravci ili medikamenti primjenjuju se na pacijentima kod kojih se sumnja na bolest ili koji već pate od takve bolesti, u količini koja je dovoljna da izliječi ili barem djelomično zaustavi simptome bolesti i njezine komplikacije. Količina koja je adekvatna da bi se to postiglo definira se kao terapeutski ili farmaceutski učinkovita doza. U oba režima, profilaksi i liječenju, agensi se primjenjuju u nekoliko doza, dok se ne postigne zadovoljavajuća imunološka reakcija. Uobičajeno je da se imunološka reakcija nadzire, te se ponovno daju doze ako se imunološka reakcija počne opadati.

Učinkovite doze pripravaka ovog izuma, za liječenje stanja koja se opisana u gornjem dijelu, variraju ovisno o mnogo različitih faktora, uključujući sredstva primjene, ciljno mjesto, psihološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovjek ili životinja, o drugim lijekovima koji se primjenjuju, te o tome da li se radi o profilaksi ili liječenju. Uobičajeno je da je pacijent čovjek, no kod nekih bolesti, poput kravljeg ludila koje je povezano s proteinom priona, pacijent može biti ne-humani sisavac, kao što su goveda. Doze koje se primjenjuju u postupku liječenja moraju se titrirati kako bi se optimizirala sigurnost i učinkovitost. Količina imunogena ovisi o tome koje se pomoćno sredstvo primjenjuje s njim, te su bez pomoćnog sredstva uglavnom potrebne više doze. Ovisno o imunogenim svojstvima određene formulacije, količina imunogena može varirati od 1-500 μg po pacijentu, te uobičajeni od 5-500 μg po injekciji za humanu primjenu. Povremeno rabe se veće doze od 0,5-5 mg po injekciji. Uobičajeno se upotrebljava 10, 20, 50 ili 100 μg za svaku humanu injekciju. Vrijeme davanja injekcija može značajno varirati od jednom dnevnom, preko jednom godišnje, do jednom u desetljeću, pri čemu je ponekad pogodno da se sukcesivno daju dodatne doze imunogena. Općenito, prema uputama koje su ovdje obznanjene, učinkovita se doza može promatrati uzimanjem tekućeg uzorka od pacijenta, obično uzorka seruma krvi, te se može odrediti titar antitijela razvijenih na imunogen, uporabom postupaka koji dobro poznati u struci, te koji su odmah primjenjivi za specifične antigena koji se mjere. Idealno je da se uzorak uzme neposredno prije inicijalnog doziranja, a da se uzorci koji slijede uzimaju i titriraju nakon svake pojedine imunizacije. Općenito, poželjno je da doza ili raspored doziranja koji omogućava detektabilni titar budu najmanje četiri puta veći od usporedbe ili “pozadinskih” razina pri razrjeđenju seruma od 1:100, pri čemu je pozadina definirana relativno u odnosu na poredbeni serum ili relativno u odnosu na prag pozadine kod ELISA ispitivanja. Prema ovom izumu pogodni su titri od najmanje 1:1000 ili 1:5000.

Svakog dana primjene doze imunodena, doza je uobičajeno veća od oko 1 μg/pacijentu te po mogućnosti veća od 10μg/pacijentu ako je primijenjeno i pomoćno sredstvo, te veća od 10 μg/pacijentu i uobičajeno veća od 100 μg/pacijentu ako pomoćna tvar nije primijenjena. Doze za pojedinačne imunogene, odabrane prema ovom izumu, određene su prema standardnim postupcima doziranja i titriranja, povezanih s ovdje navedenim napucima Tipični režimi sastoje se od imunizacije nakon koje slijedi dodatne injekcije 1, 2 ili 12 mjeseci nakon toga. Drugi režim zahtijeva injekciju svaka dva mjeseca tijekom života. Alternativno, pojačane injekcije mogu biti dozirane i na nepravilnoj osnovi što je indicirano praćenjem imunološke reakcije.

Za pasivu imunizaciju antitijelima, veličine doze kreću se u području od oko 0,0001 do 100 mg/kg, te uobičajenije 0,01 do 5 mg/kg u odnosu na tjelesnu težinu domaćina. Na primjer, doze mogu biti 1mg/kg tjelesne težine, ili 10 mg/kg tjelesne težine. Tipičan režim liječenja povlači sa sobom primjenu jednom svaka dva tjedna ili jednom mjesečno ili jednom svakih 3 do 6 mjeseci. Kod nekih postupaka, dva ili više monoklonalnih antitijela s različitim osobinama vezanja daju se istovremeno, pri čemu se doziranje svakog antitijela kreće unutar indiciranog područja. Antitijela se obično daju u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti tjedni, mjesečni ili godišnji. Intervali također mogu biti nepravilni, ako je to indicirano mjerenjem količine antitijela na Aβ u krvi pacijenta. U drugom slučaju, antitijela se mogu davati u obliku s postupnim otpuštanjem, pri čemu je potrebna rjeđa primjena. Doziranje i frekvencija ovise o poluživotu antitijela u pacijenta. Općenito, humana antitijela pokazuju najduži poluživot, a zatim slijede humanizirana antitijela, kimerna antitijela, te ne-humana antitijela. Doziranje i frekvencija mogu se mijenjati ovisno o tome da li je primjena profilaktička ili terapeutska. Kod profilaktičke primjene, daju se relativno niske doze u relativno rjeđim intervalima kroz duži vremenski period. Neki pacijenti nastavljaju s primjenom tretmana do kraja života. Kod terapeutske primjene, ponekad su potrebne relativno visoke doze u relativno kratkim intervalima, dok se ne uspori ili ne zaustavi napredovanje bolesti, ili pogodnije dok pacijent ne pokaže djelomično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga se na pacijentu može primjenjivati profilaktički režim.

Doze nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogene kreću se u području od približno 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1μg do 10 mg, ili 30-300 μg DNA po pacijentu. Doze za infektivne viralne vektore kreću se od 10-100 ili više viriona po dozi.

Agensi za izazivanje imunološke reakcije mogu se primjenjivati parenteralno, lokalno, intravenski, oralno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno ili intramuskularno za profilaktičku i/ili terapeutsku primjenu. Tipični načini davanja imunogenog agensa su intramuskularno (i.m.), intravenski (i.v.) ili subkutano (s.c.), iako i drugi načini mogu biti jednako efikasni. Intramuskularne injekcije najčešće se daju u mišić noge ili ruke. Kod nekih postupaka, agensi se injektiraju direktno u određeno tkivo u kojem su se akumulirale naslage, na primjer intrakranialnim injekcijama. Za davanje antitijela preferiraju se intramuskularne injekcije ili intravenska infuzija. Kod nekih postupaka, pojedinačna terapeutska antitijela injektiraju se neposredno u lubanju. Kod nekih postupaka, antitijela se daju u pripravcima ili sredstvima za postupno otpuštanje, kao što je MedipadTM sredstvo.

Agensi ovog izuma mogu se po potrebi primjenjivati u kombinaciji s drugim agensima koji su barem djelomično efikasni u liječenju amiloidogenih bolesti. U slučaju Alzheimerove bolesti il Downovog sindroma kod kojih se amiloidne naslage stvaraju u mozgu, agensi izuma mogu se davati zajedno s drugim agensima koji povećavaju prolaznost agenasa izuma kroz hemolikvornu barijeru. Nadalje, u ovom se izumu također razmatraju terapeutski kokteli koji uključuju imunogene koji su dizajnirani tako da uzrokuju imunološku reakciju protiv više od jedne amiloidne komponente, kao kombinacija antitijela uperenih protiv jedne komponente plaka i imunogena uperenih protiv druge komponente plaka.

Imunogeni agensi izuma, kao što su peptidi, ponekad se primjenjuju u kombinaciji s pomoćnim sredstvom. U kombinaciji s peptidom, kao što je Aβ, mogu se koristiti različita pomoćna sredstva radi izazivanja imunološke reakcije. Pogodna pomoćna sredstva povećavaju stvarnu reakciju na imunogen, bez da uzrokuju konformacijske promjene imunogena što djeluje na kvalitativni oblik reakcije. Pogodna pomoćna sredstva uključuju aluminijev hidroksid i aluminijev fosfat, 3 de-O-acilirani monofosforil lipid A (MPLTM) (pogledati GB 2220211RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana sada dio Corix-a). StimulonTM QS-21 je triterpen glikozid ili saponin izoliran iz kore drveta Quillaja Saponaria Molina pronađenog u Južnoj Americi (pogledati Kensil i suradnici, u Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Patent br. 5,057,540, Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Ostala pomoćna sredstva su ulja u vodenim emulzijama (kao skvalen ili kikirikijevo ulje), po potrebi u kombinaciji s imunim stimulansima kao što je monofosforil lipid A (pogledati Stoute i suradnici, N. Eng. J Med. 336, 86-91 (1997)). Drugo pomoćno sredstvo je CpG (WO 98/40100). Alternativno se Aβ može spojiti s pomoćnim sredstvom. U svakom slučaju, takvo spajanje ne bi trebalo bitno mijenjati konformaciju Aβ, tako da to ne utječe na prirodu imunološke reakcije. Pomoćna se sredstva mogu davati kao komponenta farmaceutskog pripravka s aktivnom tvari, ili se mogu davati odvojeno prije, zajedno ili nakon davanja terapeutika.

Preferirana skupina pomoćnih tvari su stipse, kao što su aluminijev hidroksid, aluminijev fosfat, aluminijev sulfat. Takva pomoćna sredstva mogu se primjenjivati sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih agenasa kao što su MPL ili 3-DMP, QS-21, polimerne ili monomerne aminokiseline kao što su poliglutaminska kiselina ili polilizin. Druga klasa pomoćnih sredstava su formulacije ulja u vodenim emulzijama. Takva pomoćna sredstva mogu se primjenjivati sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih agenasa kao što su muramil peptidi (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MPD), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MPD), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (MPT-PE), N-acetilglukozaminil-N-acetilmuraminil-L-Al-D-izoglu-Ala-dipalmitoksi propilamid (DTP-DPP) teramidTM, ili druge komponente bakterijske stanične stijenke. Emulzije ulja u vodi uključuju (a) MF59 (WO 90/14837), što sadržava 5% skvalena, 0,5% Tween 80, te 0,5% Span 85 (po potrebi sadržava različite količine MTP-PE) formulirane u submikronske čestice pomoću mikrofluidizatora kao što je Model 110Y mikrofluidizator (Microfluids, Newton MA), (b) SAF sadržava 10% skvalena, 0,4% Tween 80, 5%pluronik-blokiranog polimera L121, te thr-MDP, mikrofluidizirane u submikronsku emulziju ili generirane u emulziju s većim česticama, te (c) RibiTM pomoćni sustav (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) što sadržava 2% skvalena, 0,2% Tween 80, te jednu ili više komponenata bakterijske stanične stijenke odabranih iz grupa koju sačinjavaju monofosforil lipid A, trehaloza dimikolat (TDM), te skelet stanične stijenke (CWS), pogodnije MPL + CWS (DetoxTM). Slijedeća skupina pomoćnih sredstava su saponinska pomoćna sredstva, kao StimulonTM (QS-21; Aquila, Framingham, MA), ili iz njih generirane čestice kao što su ISCOMs (imunostimulirajući kompleksi) te ISCOMATRIX. Ostala pomoćna sredstva uključuju nepotpuno Freundovo pomoćno sredstvo (IFA), citokine kao što su interleukini (IL-1, IL-2 i IL-12), stimulirajući faktor kolonije makrofaga (M-CSF), te faktor nekroze tumora (TNF). Takva pomoćna sredstva općenito su dostupna iz komercijalnih izvora.

Pomoćno sredstvo može se davati s imunogenom u jednom pripravku, ili se može davati ranije, zajedno sa imunogenom, ili nakon davanja imunogena. Imunogen i pomoćno sredstvo mogu biti pakirani i pribavljeni u istoj posudici il mogu biti pakirani u odvojenim bočicama i pomiješani prije uporabe. Imunogen i pomoćno sredstvo obično se pakiraju s oznakom koja upućuje svrhu terapeutske aplikacije. Ako su imunogen i pomoćno sredstvo pakirani odvojeno, pakiranje obično uključuje upute za miješanje prije uporabe. Izbor pomoćnog sredstva i/ili nosača ovisi o faktorima kao što su stabilnost pripravka koji sadržava pomoćno sredstvo, o načinu primjene, o rasporedu doziranja, te o efikasnosti pomoćnog sredstva za specije koje se vakciniraju. Kod ljudi preferirano farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo je ono koje su primjerena regulatorna tijela odobrila za humanu primjenu. Primjeri takvih preferiranih pomoćnih sredstava za ljude uključuju stipse, MPL i QS-21. PO potrebi se mogu istovremeno koristiti dva ili više pomoćnih sredstava. Pogodne kombinacije uključuju stipsu s MPL, stipsu s QS-21, MPL sa QS-21, te stipsu, QS-21 i MPL zajedno. Također, može se koristiti nepotpuno Freundovo pomoćno sredstvo (Chang i suradnici, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), po potrebi u kombinaciji s bilo kojom navedenom stipsom, QS-21 i MPL, te svim njihovim kombinacijama.

Agensi ovog izuma često se primjenjuju kao farmaceutski pripravci koji uključuju aktivni terapeutik te raznovrsne druge farmaceutski prihvatljive komponente. Vidjeti Remington’s Pharmaceutical Science (19. izdanje, 1995). Pogodni oblik ovisi o predviđenom načinu davanja te terapeutskoj primjeni. Pripravci također mogu sadržavati, ovisno o željenoj formulaciji, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače i diluense, koji su definirani kao vehikli koji se uobičajeno rabe za pripravu farmaceutskih pripravaka za primjenu na ljudima i životinjama. Diluens se odabire na takav način da ne utječe na biološku aktivnost kombinacije. Primjeri takvih diluensa su destilirana voda, fiziološka slana otopina puferirana s fosfatnim puferom, Ringerova otopina, otopina dekstroze, te Hankova otopina. Nadalje, farmaceutski pripravak ili formulacija mogu također uključivati druge nosače, pomoćna sredstva ili netoksične, neterapeutske, neimunogene stabilizatore i slično.

Farmaceutski pripravci također mogu uključivati velike makromolekule koje se sporo metaboliziraju, kao što su proteini, polisaharidi poput kitosana, polilaktatne kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimere (poput lateks sefroze, agaroze, celuloze i slično), polimerne aminokiseline, kopolimere aminokiselina, te lipidne agregate (poput kapljica ulja ili liposoma). Dodatno, ti nosači mogu funkcionirati kao imunostimulatori (tj. pomoćna sredstva).

Kod parenteralne primjene, agensi ovog izuma mogu se primijeniti kao injekcijske doze u obliku otopine ili suspenzije supstancije koja se nalazi u fiziološki prihvatljivom diluensu s farmaceutskim nosačem, koji može biti sterilna tekućina poput vode, ulja, otopine soli, glicerola ili etanola. Dodatno, u pripravcima mogu biti prisutne pomoćne tvari, kao što su ovlaživači ili emulgatori, surfaktanti, tvari za puferiranje, i slično. Ostale komponente farmaceutskih pripravaka su naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetskog podrijetla, na primjer, kikirikijevo ulje, sojino ulje, te mineralno ulje. Općenito, glikoli poput propilenglikola ili polietilenglikola pogodni su tekući nosači, posebice za injekcijske otopine. Antitijela se mogu primijeniti u obliku depo injekcija ili implantatskih pripravaka koji se mogu tako formulirati da omogućuju postupno otpuštanje djelatne tvari. Primjer pripravka koji uključuje monoklonalno antitijelo u koncentraciji od 5 mg/ml, u vodenom puferu koji sadržava 50 mM L-histidina, 150 mM NaCl, podešenog na pH 6,0 pomoću HCl.

Uobičajeno je da su pripravci pripravljeni u obliku injekcija, ili kao otopine ili kao suspenzije; mogu se također pripraviti kruti oblici pogodni za otapanje, odnosno suspendiranje u tekućem vehiklu prije davanja injekcije. Pripravci također mogu biti u obliku emulzija ili pak inkapsulirani u liposome ili mikro čestice poput polilaktida, poliglikolida ili kopolimera kojima se pojačava učinak pomoćnog sredstva, kao što je raspravljeno u gornjem dijelu (vidjeti Langer, Science 249, 1527 (1990) te Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Agensi ovog izuma mogu se primijeniti u takvom obliku da omogućuju postupno ili pulsirajuće otpuštanje djelatne tvari.

Dodatne formulacije pogodne za ostale načine primjene uključuju oralne, intranazalne i pulmonarne pripravke, supozitorije i transdermalne pripravke.

Kod supozitorija, veziva i nosači uključuju, na primjer, polialkilenglikole ili trigliceride, takvi se supozitoriji mogu pripraviti iz smjesa koje sadržavaju djelatnu tvar u rasponu od 0,5% do 10%, pogodnije od 1%-2%. Oralne formulacije uključuju pomoćne tvari poput manitola farmaceutskog stupnja, laktoze, škroba, magnezijevog stearata, natrijevog saharina, celuloze, te magnezijevog karbonata. Ti se pripravci javljaju u obliku otopina, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, pripravaka za postupno otpuštanje, ili prašaka, a oni sadržavaju 10%-95% djelatne tvari, pogodnije 25%-70%.

Lokalna primjena ostvaruje se pomoću transdermalnog ili intradermalnog prijenosa. Lokalna se primjena može olakšati zajedničkom primjenom agensa s toksinom kolere ili njegovim detoksiciranim derivatima ili podjedinicama (vidjeti Glenn i suradnici, Nature 391, 851 (1998)). Zajedničko davanje može se postići uporabom komponenti u obliku smjese ili u obliku povezanih molekula dobivenih kemijskim unakrsnim vezanjem ili ekspresijom u obliku fuzioniranog proteina.

Alternativno, transdermalna primjena može se postići uporabom kožnih flastera ili uporabom transferosoma (Paul i suradnici. Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i suradnici, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

F. Dijagnostički postupci

Izum opisuje postupke detekcije imunološke reakcije na Aβ peptid kod pacijenata koji boluju od Alzheimerove bolesti ili kod kojih se na nju sumnja. Postupci su posebno pogodni za promatranje slijeda liječenja koje se provodi nad pacijentom. Postupci se mogu upotrijebiti za promatranje terapijskog liječenja simptomatičnih pacijenata, kao i za profilaksu nesimptomatičnih pacijenata. Postupci su pogodni za promatranje i aktivne imunizacije (npr. antitijela proizvedenih kao reakcija na primjenu imunogena) i pasivne imunizacije (npr. mjerenja razine primijenjenih antitijela).

1. Aktivna imunizacija

Neki postupci zahtijevaju određivanje vrijednosti bazne linije imunološke reakcije kod pacijenta prije davanja doze djelatne tvari, te usporedbu te vrijednosti s vrijednošću imunološke reakcije nakon liječenja. Značajno povećanje (tj. veće od tipične granice eksperimentalne pogreške kod ponovljenih mjerenja istog uzorka, izraženo kao standardno odstupanje od srednje vrijednosti takvih mjerenja) vrijednosti imunološke reakcije signalizira pozitivan ishod liječenja (tj. da je primjena djelatne tvari postigla ili povećala imunološku reakciju). Ako se vrijednost imunološke reakcije značajno ne mijenja, ili smanjuje, indiciran je negativan ishod liječenja. Općenito, kod pacijenata koji prolaze kroz postupak početka liječenja imunogenim tvarima očekuje se vidljivo povećanje imunološke reakcije nakon sukcesivnih doza, pri čemu se eventualno doseže plato. Primjena djelatne tvari se nastavlja dok se povećava imunološka reakcija. Postizanje platoa predstavlja indikator da je primjena liječenja može biti prekinuta ili smanjena s obzirom na dozu i učestalost.

U ostalim postupcima, poredbena vrijednost (tj. srednje i standardno odstupanje) imunološke reakcije određena je za usporednu populaciju. Uobičajeno je da osobe u poredbenoj populaciji nisu bile na prethodnom liječenju. Nakon toga uspoređuju se mjerene vrijednosti imunološke reakcije kod pacijenta nakon primjene terapeutika s poredbenim vrijednostima. Signifikantno povećanje relativno u odnosu na poredbenu vrijednost (npr. veće od standardnog odstupanja od sredine) signalizira pozitivan ishod liječenja. Nedostatak signifikantnog povećanja ili smanjenje signalizira negativan ishod liječenja. Primjena djelatne tvari se nastavlja dok se imunološka reakcija povećava relativno u odnosu na poredbenu vrijednost. Kao i prije, dosezanje platoa relativno u odnosu na poredbenu vrijednost indikator je da primjena liječenja može biti prekinuta ili smanjenja s obzirom na dozi i učestalost.

Kod drugih postupaka, poredbene vrijednosti imunološke reakcije (npr. srednje i standardno odstupanje) određuju se na temelju poredbene populacije pojedinaca na kojima je proveden postupak liječenja s terapeutikom, a čija je imunološka reakcija dosegnula plato u odgovoru na liječenje. Mjerene vrijednosti imunološke reakcije kod pacijenta uspoređuju se s poredbenim vrijednostima. Ako izmjerena razina kod pacijenta nije značajno različita (npr. više od jedne standardne devijacije) u odnosu na poredbenu vrijednost, liječenje može biti prekinuto. Ako je razina kod pacijenta značajno niža od poredbene vrijednosti, opravdana je kontinuirana primjena djelatne tvari. Ako razina kod pacijenta ustrajno ostaje ispod poredbene vrijednosti, to ukazuje na potrebu promjene režima liječenja, na primjer uporabe drugačijeg pomoćnog sredstva.

U ostalim postupcima, nadzire se imunološka reakcija pacijenta na kojem se trenutno ne provodi liječenje, ali je prethodno prošao postupak liječenja, kako bi se odredilo da li je potrebno ponovno započinjanje liječenja. Izmjerena vrijednost imunološke reakcije kod pacijenta može se usporediti s imunološkom vrijednosti prethodno postignutom kod pacijenta nakon prethodnog postupka liječenja. Značajno smanjenje relativno u odnosu na prethodno mjerenje (tj. veće od tipične granice pogreške kod ponovljenih mjerenja istog uzorka) ukazuje na to da se postupak treba ponovno započeti. Alternativno, mjerena vrijednost kod pacijenta može se usporediti s poredbenom vrijednosti (npr. srednje i standardno odstupanje) određenom na populaciji pacijenata nakon što su prošli postupak liječenja. Alternativno, mjerena vrijednost kod pacijenta može se usporediti s poredbenom vrijednosti u populaciji pacijenata koji su imali profilaktički tretman, a na kojima nisu primijećeni simptomi bolesti, ili u terapeutski liječenoj populaciji pacijenata kod koje se primjećuje poboljšanje karakteristika vezanih uz bolest. U svim tim slučajevima, značajno smanjenje relativno u odnosu na poredbenu razinu (tj. više od standardnog odstupanja) upućuje na to da se liječenje pacijenta treba nastaviti.

Uobičajeni uzorak tkiva za analizu je plazma, serum, mukus ili likvor pacijenta. Uzorak se analizira kako bi se ukazalo na imunološku reakciju na amiloidnu komponentu koja se nalazi u središtu interesa, poput bilo kojeg oblika Aβ peptida. Imunološka se reakcija može odrediti npr. iz prisustva antitijela, ili T-stanica koja se specifično vežu na zanimljivu komponentu, poput Aβ peptida. ELISA postupci detektiranja antitijela specifičnih za Aβ opisani su u odjeljku Primjeri, a mogu se primijeniti na ostale peptidne antigene. Postupci detekcije reaktiviranih T-stanica su vrlo dobro poznati u struci.

2. Pasivna imunizacija

Općenito, postupci za nadziranje pasivne imunizacije slični su postupcima za nadzor aktivne imunizacije, kao što je opisano u gornjem dijelu. No, dijagram antitijela koji prikazuje pasivnu imunizaciju uobičajeno prikazuje izravni maksimum koncentracije antitijela nakon čega slijedi eksponencijalno nestajanje. Bez daljnjih doza nestajanjem se dosežu razine prije liječenja u vremenskom periodu od nekoliko dana do mjeseci ovisno o poluživotu primijenjenog antitijela. Na primjer, poluživot nekih humanih antitijela je reda veličine od 20 dana.

U nekim postupcima, bazna linija mjerenja antitijela na Aβ kod pacijenta napravi se prije primjene, drugo mjerenje napravi se uskoro nakon toga kako bi se odredio maksimum razine antitijela, a još jedno ili više mjerenja izvode se u intervalima kako bi se nadziralo nestajanje razina antitijela. Kada se razina antitijela spusti na baznu liniju ili prethodno određeni postotak od maksimuma umanjenog za baznu liniju (npr. 50%, 25% ili 10%), ponovno se primjeni doza antitijela. U nekim se postupcima maksimum, odnosno nakon njega mjerene razine umanjene za pozadinu, uspoređuju se s referentnim razinama, prethodno određenim kako bi se načinio pogodni režim profilakse ili terapeutskog liječenja za druge pacijente. Ako je izmjerena razina antitijela signifikantno manja u odnosu na referentnu vrijednost (npr. manje od srednje vrijednosti minus jedna standardna devijacija referentne vrijednosti u populaciji pacijenata kojima pogoduje liječenje), tada to ukazuje na potrebu dodatnog davanja doze antitijela.

3. Dijagnostički kitovi (kompleti)

U izumu se nadalje opisuju dijagnostički kitovi za izvođenje dijagnostičkih postupaka koji su opisani u gornjem dijelu. Uobičajeno je da takvi kitovi sadržavaju agens koji se specifično veže na antitijela na komponentu amiloidnog plaka, poput Aβ ili pak reagira s T-stanicama koje su specifične za komponentu. Kit također može uključivati oznaku. Za detekciju antitijela na Aβ, oznaka se uobičajeno nalazi u obliku označenih antiidiotipskih antitijela. Za detekciju antitijela, agens se može uporabiti tako da je prethodno vezan na krutu fazu, kao što su jažice posude za mikrotitraciju. Za detekciju reaktivnih T-stanica, oznaka može biti 3H-timidin kako bi se mjerio proliferacijski odgovor. Kit također uobičajeno sadržava oznake koje opisuju upute za uporabu kita. Označavanje također može uključiti liječnički karton ili nekakav drugi odgovarajući režim koji dovodi u vezu razine mjerenih oznaka s razinama antitijela na Aβ ili T-stanice koje reagiraju s Aβ. Pojam označavanje odnosi se na bilo koji zapisani ili snimljeni materijal koji je spojen s kitom ili pak na neki drugi način prati kit neprestano za vrijeme proizvodnje, transporta, prodaje ili uporabe. Na primjer, pojam označavanje obuhvaća reklamne letke i brošure, ambalažu, upute, audio ili video kazete, kompjutorske diskove, kao i natpis direktno otisnut na kitovima.

PRIMJERI

I. PROFILAKTIČKA UČINKOVITOST Aβ NA ALZHEIMEROVU BOLEST (AB)

Ovaj primjer opisuje primjenu Aβ42 peptida na transgeničnim miševima kod kojih dolazi do pojačane ekspresije APP s mutacijom na položaju 717 (APP717→F) što im daje predispoziciju da razviju neuropatološko stanje slično Alzheimerovoj bolesti. Proizvodnja i karakteristike tih miševa (PDAPP) opisani su u članku Games i suradnici, Nature, supra. Te životinje, u svom heterozigotnom obliku počinju stvarati naslage Aβ u dobi od 6 mjeseci pa nadalje. U dobi od 15 mjeseci oni imaju razine Aβ naslaga ekvivalentne onima primijećenima kod Alzheimerove bolesti. PDAPP miševima daje se injekcija s agregiranim Aβ42 (agregirani Aβ42) ili s fosfatnim puferom. Agregirani Aβ42 izabran je zbog svoje sposobnosti da inducira antitijela kako bi umnožavali epitope od Aβ.

A. POSTUPCI

1. Izvor miševa

Trideset PDAPP heterogenih ženki miševa nasumce su odvojene u slijedeće skupine: 10 miševa kojima se daje injekcija agregiranog Aβ42 (jedan je uginuo u tranzitu), 5 miševa kojima se daje injekcija PBS/pomoćno sredstvo ili PBS, te 10 poredbenih miševa kojima se ne daje injekcija. Pet miševa primilo je injekciju peptida dobivenog od sekvencije serumskog amiloidnog proteina (SAP).

2. Priprava imunogena

Priprava agregiranog Aβ42: dva miligrama Aβ42 (US Peptides Inc, serija K-42-12) otopi se u 0,9 ml vode i nadopuni do 1 ml dodavanjem 0,1 ml 10 × PBS. Uzorak se stavi na vortex aparat i ostavi se inkubirati preko noći na 37°C, čime se postižu uvjeti pod kojima dolazi do agregiranja peptida. Neupotrebljeni Aβ pohranjuje se u obliku suhog liofilizata na -20°C do slijedeće injekcije.

Mora se napomenuti da kada se rabe takvi komercijalni peptidi, suhe mase mogu uključivati odvage soli; odvage koje su objavljene u svim ovdje navedenim Primjerima, osim ako nije drukčije naznačeno, uključuju odvage soli. Točne mase peptida mogu se odrediti uporabom standardnih ispitivanja pripravaka, poput određivanja dušika, u vezi s poznatim sastavom.

3. Priprava injekcija

Za svaku injekciju, 100 μg agregiranog Aβ42 u PBS po mišu emulgira se 1:1 s potpunim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) u konačnom volumenu od 400 μl emulzije kod prve imunizacije, nakon čega slijedi dodatna količina imunogena u nepotpunom Freundovom pomoćnom sredstvu (IFA) za dva tjedna. Dvije dodatne doze u IFA primjene su u mjesečnim intervalima. Slijedeće imunizacije provode se u mjesečnim intervalima u 500 μl PBS. Injekcije se daju intraperitonealno (i.p.).

PBS injekcije slijede isti raspored davanja a miševima se injektira smjesa PBS/pomoćno sredstvo 1:1 u količini od 400 μl po mišu, ili 500 μl PBS po mišu. SAP injekcije, slično tome, slijede isti raspored pri čemu se rabi 100 μl po injekciji.

4. Titracija mišje krvi, priprava tkiva i imunohistokemija

Gore navedeni postupci opisani su u daljnjem dijelu Općeniti materijali i postupci.

B. REZULTATI

PDAPP miševima injektiraju se agregirani Aβ42 (agregirani Aβ42), SAP peptid ili otopina fosfatnog pufera. Skupina PDAPP miševa kojoj nije injektirana nikakva injekcija ostavljena je za usporedbu,. Titri kod miševa s agregiranim Aβ42 promatrani su svaki drugi mjesec od četvrte dodatne doze, dok miševi nisu imali godinu dana. U dobi od 13 mjeseci miševi su likvidirani. U svim vremenskim trenucima koji su ispitani, kod osam od devet miševa s agregiranim Aβ42 razvio se visoki titar antitijela, koji je ostao visok unutar serije injekcija (titri veći od 1/10000). Deveti miš imao je nizak no mjerljiv titar u iznosu od 1/1000 (SLIKA 1, Tablica 3). Miševi kojima je injektiran SAPP imali su titre od 1:1000 do 1:30000 za taj imunogen, a samo jedan miš prešao je 1.100000.

TABLICA 3A

Titri kod 50% maksimalnog O.D.

Miševi kojima je injektiran agregirani Aβ42

[image]

TABLICA 3A

Titri kod 50% maksimalnog O.D.

Miševi kojima je injektiran PBS na oba imunogena kod 1/00

[image]

Serumi dobiveni od miševa tretiranih s PBS titriraju se na Aβ42 nakon šest, deset i dvanaest mjeseci. Kod razrjeđenja 1/100, PBS miševi su prešli samo 4 puta pozadinu u jednoj točki ako su titrirani na agregirane Aβ42, a inače bili su manji 4 puta od pozadine u svim vremenskim točkama (Tablica 3).

Sedam od devet miševa u skupini kojoj je davan Aβ-42 nisu imali mjerljivu količinu amiloida u svojim mozgovima. Suprotno tome, mozgovno tkivo dobiveno od miševa u SAP i PBS skupini sadržavalo je mnogobrojne naslage u hipokampusu, kao i u frontalnim i cingularnim korama. Uzorak taloga bio je sličan onima dobivenim iz kontrolnih, neliječenih skupina, s karakterističnim teškoćama ranjivih subregija, kao što je vanjski molekularni sloj dentate gyrus hipokampusa. Jedan miš iz skupine kojoj je injektiran Aβ-42 imao je znatno smanjenu količini amiloida, ograničenu na hipokampus. Izolirani plak identificiran je kod drugog miša liječenog s Aβ-42.

Kvantitativna analiza slika količine amiloida u hipokampusu potvrdila je dramatično smanjenje postignuto kod životinja koje su liječene s Aβ42(AN1792) (SLIKA 2). Srednje vrijednosti količine amiloida za PBS skupinu (2,22%), te za poredbenu neliječenu skupinu (2,65%) bile su značajno veće u odnosu na one imunizirane s AN1792 (0,00%, p=0,0005). Suprotno tome, srednja vrijednost za skupinu imuniziranu sa SAP peptidima (SAPP) bila je 5,74%. Mozgovno tkivo neliječenih poredbenih miševa sadržavalo je mnogobrojne Aβ amiloidne naslage vizualizirane s Aβ-specifičnim monoklonalnim antitijelima (mAb) 3D6 u hipokampusu, kao i u retrosplenijalnom korteksu. Sličan uzorak amiloidnih naslaga također je primijećen kod miševa imuniziranih s SAPP ili PBS (SLIKA 2), Nadalje, kod ove zadnje tri skupine, postojale su karakteristične poteškoće ranjivih subregija mozga, klasičnih za AB, kao što je vanjski molekularni sloj dentate gyrus hipokampusa, za sve te tri skupine.

Mozgovi koji nisu sadržavali Aβ naslage bili su lišeni neuritskih plakova koji se uobičajeno uočavaju kod PPAP miševa sa humanim APP antitijelima 8E5. Svi mozgovi preostalih skupina (miševi kojima je injektiran SAP, PBS, te miševi kojima nije ništa injektirano) imali su mnogobrojne neuritske plakove tipične za neliječene PDAPP miševe. Mala količina neuritskih plakova bila je prisutna kod jednog miša liječenog s AN1792, te je pronađen jedan klaster distrofičnih neurita kod drugog miša liječenog s AN1792. Analiza slike hipokampusa, prikazana na SLICI 3, pokazala je virtualno uklanjanje distrofičnih neurita kod miševa liječenih s AN1792 (srednja vrijednost 0,00%) u usporedbi s jedinkama koje su dobile PBS (srednja vrijednost 0,28%, p=0,0005).

Astrocitoza karakteristična za upale povezane s plakovima nije bila prisutna u mozgovima skupine kojoj je injektiran Aβ-42. Mozgovi miševa ostalih skupina sadržavali su obilne GFAP-pozitivne astrocite u obliku klastera tipičnih za glioze povezane s Aβ plakovima. Podskupina objektnih mikroskopskih stakalaca s GFAP bila su obojana s tioflavin S kako bi se lokalizirale Aβ naslage. GFAP pozitivni astrociti bili su povezani s Aβ plakovima kod SAP, PBS i neliječenih kontrolnih miševa. Kod plak-negativnih Aβ1-42 liječenih miševa nije primijećena nikakva takva nakupina, dok je identificirana minimalna glioza povezana s plakom kod jednog miša liječenog s AN1792.

Analiza slike, prikazana na SLICI 4 za retrosplenijalni korteks, potvrdila je značajno smanjenje astrocitoze sa srednjom vrijednošću od 1,56% za miševe liječene s AN1792 naspram srednje vrijednosti veće od 6% za skupinu imuniziranu sa SAP peptidima, PBS ili skupinu neliječenih miševa (p=0,0017).

Dokaz dobiven iz podskupina miševa kojima je injektiran Aβ1-42 i PBS ukazao je da MHC II imunoreaktivnost povezana s plakom nije bila prisutna kod miševa kojima je injektiran Aβ1-42, u skladu s nepostojanjem upalne reakcije povezane s Aβ.

Sekcije mišjeg mozga također se dovode u reakciju s mAb specifičnim na monoklonalna antitijela, specifična na MAC-1, protein sa površine stanice. MAC-1 (CD11b) integralni je član porodice, te egzistira u obliku heterodimera s CD18, CD11b/CD18 kompleks prisutan je kod monocita, makrofaga, neutrofila i prirodnih stanica ubojica (Mak i Simard). Rezidentni MAC-1 reaktivni tipovi stanica smješteni u mozgu vrlo vjerojatno su mikrogliju stanice koja se temelji na sličnoj fenotipskoj morfologiji kod MAC-1 sekcija koje su sudjelovale u imunološkoj reakciji. Označavanje MAC-1 povezanog s plakom bilo je niže u mozgovima miševa koji su liječeni s AN1792 u usporedbi s PBS poredbenom skupinom, što predstavlja pronalazak u skladu s nepostojanjem upalne reakcije povezane s Aβ.

C. ZAKLJUČAK

Nepostojanje Aβ plakova i reaktivnih neuronskih i gliotičkih promjena na mozgu miševa kojima je injektiran Aβ1-42 ukazuje da je u njihovim mozgovima bilo prisutno vrlo malo, ili nimalo amiloidnih naslaga, te nisu bile prisutne patološke posljedice, poput glijoze i patološkog stanja neurita. Kod PDAPP miševa koji su liječeni s Aβ1-42 nisu bila prisutna patološka stanja, isto kao i kod poredbenih netransgeničnih miševa. Stoga, Aβ1-42 injekcije izrazito su djelotvorne u sprječavanju stvaranja naslaga ili kod uklanjanja humanih Aβ iz tkiva mozga, kao i u eliminaciji posljedičnih neuronskih i upalnih degerativnih promjena. Stoga, primjena Aβ peptida može imati dvostruku, preventivnu i terapeutsku prednost u sprečavanju AB.

II. PROUČAVANJE REAKCIJE VEZANE UZ JAČINU DOZE

Skupine pet tjedana starih ženki Swiss Webster miševa (N=6) imunizirane su s 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 ili 0,13 μg Aβ koji se nalazio u intraperitonealno primijenjenoj CFA/IFA formulaciji. Tri doze dane su u dvotjednim intervalima, nakon čega je uslijedila četvrta doza poslije jednog mjeseca. Prva doza emulgirana je s CFA, a preostale su doze emulgirane s IFA. Životinjama je uzimana krv 4-7 dana nakon svake imunizacije počevši nakon druge doze, kako bi se mjerili titri antitijela. Životinjama podijeljenim u tri skupine, koje su imunizirane s 11, 33 ili 300 μg antigena, dodatno se vadila krv u približnim mjesečnim intervalima tijekom četiri mjeseca, nakon čega je uslijedila četvrta imunizacija, kako bi se nadziralo nestajanje reakcije antitijela unutar određenog područja doza imunogenih formulacija. Te životinje dobile su konačnu, petu imunizaciju sedam mjeseci nakon početka proučavanja. Jedan tjedan nakon toga likvidirane su kako bi se mjerila reakcija antitijela na AN1792, te kako bi se provele toksikološke analize.

Opadanje reakcije vezane uz dozu promatrano je od 300 do 3,7 μg, pri čemu nije bilo nikakve reakcije kod dvije najniže doze. Srednja vrijednost titra antitijela je oko 1:1000 nakon 3 doze i oko 1:10000 nakon 4 doze od 11-300 μg antigena (vidjeti SLIKU 5).

Titri antitijela narasli su dramatično za sve skupine osim onih s najmanjim dozama, nakon čega je slijedila treća imunizacija s povećanjem GMTs od 5-25 puta. Nakon toga, mjerljive su bile i imunološke reakcije s malo antitijela u iznosu od 0,4 μg po primatelju. Skupine koje su primile 1,2 i 3,7 μg imale su usporedive titre s GMTs od oko 1000, te su najviše četiri doze skupljena u klaster zajedno s GMT s približno 25000, uz izuzetak skupine od 33 μg, s GMT nižim od 3000.Nakon četvrte imunizacije, povećanje titra bilo je skromnije kod većine skupina. Postojala je jasna reakcija vezana uz jačinu doze unutar skupina s nižim dozama antigena od 0,14 μg do 11 μg, u rasponu od nemjerljivih antitijela kod skupina koje su primale 0,14 μg, do GMT od 36000 za primatelje 11 μg. Ponovno su titri za četiri skupine s najvišim doza od 11 do 300 μg skupljeni u klaster. Zatim su slijedile dvije imunizacije, gdje je titar antitijela ovisio o dozi antigena u širokom rasponu od 0,4 do 300 μg. Kod treće imunizacije, svi titri za četiri najviše doze bili su međusobno usporedivi, a ostali su na platou nakon dodatne imunizacije.

Jedan mjesec nakon četvrte imunizacije, titri su bili 2-3 puta veći u skupini koja je primila 300 μg u odnosu na titre koji su mjereni iz krvi uzete pet dana nakon imunizacije (SLIKA 6). Ta opažanja ukazivala su da se anamnestički maksimum reakcije antitijela javlja više od 5 dana nakon imunizacije. Skromnije povećanje (50%) primijećeno je u istom vremenskom periodu u skupini koja je primila 33 μg. U skupini koja je primila 300 μg dva mjeseca nakon zadnje doze, GMTs postupno je opadao na oko 70%. Nakon još jednog mjeseca, opadanje je bilo manje stupnjevito i iznosilo je 45% (100 μg), te oko 14% za doze od 33 i 11 μg. Stoga, izgleda da je brzina opadanja kod titara cirkulirajućih antitijela nakon prestanka imunizacije dvofazna, sa stupnjevitim padom mjesec dana nakon maksimuma reakcije, nakon čega slijedi manja brzina smanjivanja.

Titri antitijela i kinetika reakcije Swiss Webster miševa slični su onima kod heterozigotnih PDAPP transgeničnih miševa imuniziranih na paralelan način. Uobičajeno je da su doze koje su učinkovite za indukciju imunološke reakcije kod ljudi slične dozama koje su učinkovite za miševe.

III. ISPITIVANJE TERAPEUTSKE UČINKOVITOSTI S OBZIROM NA USTANOVLJENU AB

Ovo određivanje planirano je za ispitivanje imunogenih tvari s obzirom na aktivnost zatvaranja ili reverzije neuropatoloških karakteristika AB kod starijih životinja. Imunizacije s Aβ (AN1792), koji se sastoji od 42 aminokiseline, počele su u trenutku kada su amiloidne naslage već bile prisutne u mozgovima PDAPP miševa.

Tijekom vremenskog perioda ovog ispitivanja, u neliječenim PDPP miševi razvile su se mnogobrojne neurodegerativne promjene, koje sliče onima pronađenim kod AB (Games i suradnici, supra i Johnson-Wood i suradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Taloženje Aβ u amiloidni plak povezano je s degenerativnim neuronskim odgovorom, koji se sastoji od neuobičajenih aksonskih i dendričkih elemenata, nazvanih distrofija neurita. Amiloidne naslage koje sadržavaju distrofične neurite i okružene su njima, nazivaju se neuritski plakovi. I kod AB i kod PDAPP miševa, distrofični neuriti imaju distinktivnu globularnu strukturu, imunološki reagiraju s nizom antitijela koja prepoznaju APP i komponente citoskeleta, te pokazuju kompleksne subcelularne degenerativne promjene na ultrastrukturnoj razini. Te karakteristike dozvoljavaju selektivna i reproducibilna mjerenja neuritske formacije plaka u PDAPP mozgovima, relevantna za bolest. Distrofična neuronska komponenta PDAPP neuritskih plakova jednostavno se vizualizira s antitijelima specifičnim na humani APP (monoklonalna antitijela 8E5), te se jednostavno mjeri kompjutorskom analizom slika. Stoga, uz mjerenje učinaka AN1792 na formiranje amiloidnog plaka, promatrali smo učinke ovog liječenja na razvoj neuritske distrofije.

Astrociti i mikroglije su ne-neuronske stanice koje odgovaraju na neuronsku ozljedu te reflektiraju stupanj neuronske ozljede. GFAP-pozitivni astrociti i MHC II-pozitivni mikroglija uobičajeno se promatraju kod AB, a njihova se aktivacija povećava s jačinom bolesti. Stoga smo također promatrali razvoj reaktivnih astrocita i mikrogliozu kod miševa liječenih s AN1792.

A. Materijali i metode

Četrdeset i osam heterozigotnih ženki PDAPP miševa, u dobi od 11 do 11,5 mjeseci, dobivenih od Charles River, nasumce su podijeljene u dvije skupine: 24 miša koje treba imunizirati sa 100 μg AN1792 i 24 miša koja se trebaju imunizirati s PBS, pri čemu se oba reagensa kombiniraju s Freundovim pomoćnim sredstvom. AN1792 i PBS skupine ponovno su podijeljene kada su dosegle dob od ~15 mjeseci. U dobi od 15 mjeseci približno se polovica svake skupine životinja koje se liječe s AN1792 i PBS eutanazira (redom n=10, te 9), preostale životinje nastavile su dobivati imunizaciju do završetka u dobi od 18 mjeseci (redom n=9, te 12). Ukupno 8 životinja (5 AN1792, 3 PBS) uginulo je za vrijeme ispitivanja. Uz imunizirane životinje, u komparaciju u ELISA su uključeni jednogodišnji (n=10), 15-mjesečni (n=10) i 18-mjesečni (n=10) neliječeni PDAPP miševi, kako bi se mjerile Aβ i APP razine u mozgu; jednogodišnje životinje također su bile uključene u imunohistokemijske analize.

Metodologija je bila ista kao u Primjeru I, osim ako nije drukčije naznačeno. US Peptides serija 12 i California Peptides serija ME0339 od AN1792 rabljene su za pripravu antigena za šest imunizacija, danih prije nego što se dostigne 15-mjesečni period. California Peptides serije ME0339 i ME0439 uporabljene su za tri dodatne imunizacije, dane između 15 i 18 mjeseci.

100 μg AN1792 u 200 μl PBS ili pak sami PBS emulgirani su za imunizacije 1:1 (vol:vol) s kompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) ili nekompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (IFA) ili s PBS do konačnog volumena od 400 μl. Prva imunizacija dana je s CFA kao pomoćnim sredstvom, slijedeće četiri doze dane su s IFA, a konačne četiri doze sa samim PBS bez pomoćnog sredstva. Svih ukupno devet imunizacija dano je tijekom sedmomjesečnog vremenskog perioda u dvotjednom rasporedu za prve tri doze, nakon čega slijedi četverotjedni interval za preostale injekcije. Na skupinama koje su se liječile u trajanju od četiri mjeseca izvršena je eutanazija u dobi od 15 mjeseci starosti, pri čemu su primile samo 6 prvih imunizacija.

B. Rezultati

1. Učinci liječenja s Aβ42 (AN1792) na amiloidne naslage

Rezultati liječenja s AN1792 na količinu kortikalne amiloidne naslage, određene kvantitativnom analizom slika, prikazani su na SLICI 7. Srednja vrijednost količine kortikalnih amiloidnih naslaga iznosila je 0,28% u skupini PDAPP neliječenih miševa koji su stari 12 mjeseci, što je vrijednost reprezentativna za količinu plaka kod miševa na početku ispitivanja, Nakon 18 mjeseci, amiloidna naslaga povećala se 17-ostruko na 4,87% kod miševa liječenih s PBS, dok miševi koji su liječeni s AN1792 imali su znatno smanjenu amiloidnu naslagu u iznosu od samo 0,01%, primjetno manje u odnosu na neliječenu skupinu u dobi od 12 mjeseci, te skupine liječene s PBS u dobi od 15 i 18 mjeseci. Amiloidni talog značajno se smanjio kod primatelja AN1792 u obje skupine i od 15 (96% smanjenje; p=0,003) i 18 (>99% smanjenje; p=0,0002) mjeseci.

Uobičajeno je da kortikalna amiloidna naslaga kod PDAPP miševa nastaje u frontalnim i retrosplenialnim korama (RSC) a progredira u trbušno-bočnom smjeru, čime su obuhvaćene temporalne i entorinalne kore (EC). Malo, ili gotovo ništa amiloida, pronađeno je u EC kod miševa starih 12 mjeseci, što predstavlja prosječnu dob u kojoj se AN1792 prvi put primjenjuje. Četiri mjeseca nakon liječenja s AN1792, amiloidna naslaga značajno se smanjila u RSC, a progresivna teškoća vezana uz EC potpuno je eliminirana liječenjem s AN1792. Kasnija opažanja pokazala su da AN1792 u potpunosti zadržava napredovanje amiloida koji bi u normalnim uvjetima napao temporalne i ventralne kore, kao i da onemogućava ili vrši reverziju naslaga kod RSC.

Bitni učinci liječenja s AN1792 na razvoj kortikalne amiloidne naslage kod PDAPP miševa pokazali su se u skupini od 18 mjeseci starosti, koja je bila liječena tijekom sedam mjeseci. Gotovo potpuno nestajanje kortikalnog amiloida ustanovljeno je kod miševa koji su liječeni s AN179, uz potpuno nepostojanje difuznih plakova, kao i smanjenje kompaktnih naslaga.

2. Aβ42 (AN1792) liječenje povezano sa staničnim i morfološkim promjenama

Populacija Aβ-pozitivnih stanica pronađena je u područjima mozga koja uobičajeno sadržavaju amiloidne naslage. Začuđujuće, u nekoliko mozgova primatelja AN1792 nije pronađeno gotovo ništa ili pak vrlo malo izvanstaničnog kortikalnog amiloidnog plaka. Većina Aβ imunološke reaktivnosti izgledalo je da je sadržano unutar stanica s velikim resičastim ili nakupljenim somima. Fenotipično, izgledalo je da te stanice aktiviraju mikroglije ili monocite. Oni su imunološki reagirali s antitijelima koja prepoznaju ligande, čiju su ekspresiju izvršili aktivirani monociti i mikroglije (MHC II i CD11b), a povremeno su povezani sa stijenkama ili lumenom krvnih žila. Usporedba susjednih sekcija označenih s Aβ i MHC II-specifičnim antitijelima otkrila je da oba razreda antitijela prepoznaju slične uzorke tih stanica. Detaljno ispitivanje mozgova liječenih s AN1792 otkrilo je da su MHC II-pozitivne stanice bile ograničene na susjedstvo ograničenog amiloida koji je preostao u tim životinjama. U primijenjenim uvjetima ispitivanja, stanice nisu imunološki reagirale s antitijelima koja prepoznaju ligande T stanica (CD3, CD3e) ili B stanica (CD45RA, CD45RB) ili leukocite uobičajenog antigena (CD43) koji unakrsno reagiraju s monocitima. Kod miševa koji su liječeni s PBS nisu pronađene takve stanice.

Kod PDAPP miševa nevarijabilno su se razvile značajne amiloidne naslage u vanjskom molekulskom sloju dentate gyrus hipokampusa. Talog tvori određenu prugu unutar probijenog puta, subregije koja uobičajeno sadržava amiloidne plakove kod AB. Karakteristični izgled tih naslaga kod miševa liječenih s PBS ličio je prethodno okarakteriziranim naslagama kod neliječenih PDAPP miševa. Amiloidna naslaga sastojala se i od difuznog i od kompaktnog plaka u kontinuiranoj crti. Nasuprot tome, u nizu mozgova miševa koji su liječeni s AN1792 taj je uzorak bio drastično drukčiji. Amiloidna naslaga kod hipokampusa nije više sadržavala difuzni amiloid, a uzorak u obliku crte bio je u potpunosti narušen. Umjesto toga, bio je prisutan niz neobičnih točkastih struktura, koje su reagirale s anti-Aβ antitijelima, pri čemu je za nekoliko od njih izgledalo da su stanice koje sadržavaju amiloid.

MHC II-pozitivne stanice često su se promatrale u blizini izvanstaničnog amiloida kod životinja koje su liječene s AN1792. Uzorak povezivanja Aβ-pozitivnih stanica s amiloidom bio je vrlo sličan u nekoliko mozgova miševa liječenih s AN1792. Raspodjela tih monocitnih stanica bila je ograničena na blizinu amiloidne naslage, te je u potpunosti bila odsutna iz drugih područja mozga lišenih Aβ plaka.

Kvantitativna analiza slike MHC II i MHC I-označenih sekcija otkrila je da postoji trend povećanja imunološke reaktivnosti u RSC, te hipokampusu kod miševa liječenih s AN1792 u usporedbi sa PBS skupinom koja je postala značajna s mjerom MAC I reaktivnosti u hipokampusu.

Ti rezultati ukazuju na aktivno, stanično-posredovano uklanjanje amiloida iz područja mozga s plakom.

3. AN1792 učinci na Aβ razine: ELISA ispitivanja

(a) Kortikalne razine

Kod neliječenih PDAPP miševa, srednja vrijednost ukupnog Aβ u korteksu starom 12 mjeseci iznosila je 1,600 ng/g, a popela se na 8,700 ng/g kod 15 mjeseci (Tablica 4). U dobi od 18 mjeseci vrijednost je bila 22,000 ng/g, što predstavlja deseterostruko povećanje za vrijeme trajanja eksperimenta. Životinje koje su liječene s PBS imale su 8,600 ng/g ukupnog Aβ u dobi od 15 mjeseci, a iznos se povećao na 19,000 ng/g u dobi od 18 mjeseci. Suprotno tome, životinje koje su liječene s AN1792 imale su 81% manje ukupnog Aβ u dobi od 15 mjeseci (1,600 ng/g) u odnosu na skupinu imuniziranu s PBS. Značajno manje (p=0,0001) ukupnog Aβ (5,200 ng/g) pronađeno je u dobi od 18 mjeseci kada su uspoređene AN1792 i PBS skupine (Tablica 4), što predstavlja 72%-tno smanjenje Aβ koji bi inače bio prisutan. Slični rezultati dobiveni su kada su uspoređene kortikalne razine Aβ42, naime skupina koja je liječena s AN1792 imala je znatno manje Aβ42, no u tom slučaju razlike između AN1792 i PBS skupina bile su značajne i u dobi od 15 mjeseci (p=0,04) i 18 mjeseci (p=0,0001, Tablica 4).

Tablica 4: Srednje razine Aβ (ng/g) u korteksu

NELIJEČENI PBS AN1792

[image] *p=0,0412

**p=0,0001

(b) Hipokampalne razine

Kod neliječenih PDAPP miševa, srednje hipokampalne razine ukupnog Aβ u dobi od dvanaest mjeseci bile su 15,000 ng/g, a povećale su se na 51,000 ng/g u dobi od 15 mjeseci, te nadalje na 81,000 ng/g u dobi od 18 mjeseci (Tablica 5). Slično tome, miševi imunizirani s PBS imali su vrijednosti od 40,000 ng/g i 65,000 ng/g u dobi od 15 mjeseci i 18 mjeseci. Imunizirane životinje s AN1792 imale su manje ukupne vrijednosti za Aβ, točnije 25,000 ng/g, te 51,000 ng/g u određenoj dobi od 15 i 18 mjeseci. Skupina stara 18 mjeseci liječena s AN1792 imala je vrijednost značajno nižu u odnosu na skupinu liječenu s PBS (p=0,0105; Tablica 5). Mjerenjem Aβ42 dobiven je isti uzorak rezultata, naime razine kod skupine liječene s AN1792 bile su značajno niže u odnosu na PBS skupinu (39,000 ng/g naspram 57,000 ng/g: p=0,002) kod vrednovanja u dobi od 18 mjeseci (Tablica 3).

Tablica 5: Srednje razine Aβ (ng/g) u hipokampusu

[image] *p=0,0105

**p=0,0022

(c) Cerebralne razine

Kod neliječenih PDAPP miševa starih 12 mjeseci, srednja cerebralna razina ukupnog Aβ bila je 15 ng/g. U dobi od 15 mjeseci ta se srednja vrijednost povećale na 28 ng/g, te je u dobi od 18 mjeseci narasla na 35 ng/g. Miševi liječeni s PBS imali su srednje vrijednosti ukupnog Aβ od 21 ng/g u dobi od 15 mjeseci i 43 ng/g u dobi od 18 mjeseci. Životinje liječene s AN1792 imale su 22 ng/g ukupnog Aβ u dobi od 15 mjeseci, te značajno niži (p=0,002) ukupni Aβ u dobi od 18 mjeseci (25 ng/g) u odnosu na odgovarajuću PBS skupinu (Tablica 6).

Tablica 6: Srednje razine Aβ (ng/g) u malom mozgu

[image] *p=0,0018

4. Učinci AN1972 liječenja na APP razine

APP-α kao i cijela duljina molekule APP sadržavaju cijelu ili dio Aβ sekvencije, te stoga na njih može utjecati generiranje AN1972-usmjerene imunološke reakcije. U novijim studijama, malo povećanje razine APP koje se označava kao neuropatologija, povećava se kod PDAPP miša. Razine APP-α/FL (puna duljina) ili APP-α u korteksu ne mijenjaju se bitno liječenjem, uz izuzetak APP-α koji je smanjen za 19% nakon 18-mjesečnog AN1972 liječenja u odnosu na skupinu koja je liječena s PBS. APP vrijednosti nakon 18-mjesečnog AN1972 liječenja ne razlikuju se značajno od vrijednosti kod 12 i 15-mjesečnih skupina bez liječenja, te 15-mjesečnih PBS skupina. U svim slučajevima, APP vrijednosti ostale su unutar granica koje su normalno nađene kod PDAPP miševa.

5. Učinci AN1972 liječenja na neurodegenerativnu i gliotičku patologiju

Količine neurotičkih naslage plaka značajno su smanjene u frontalnom korteksu kod miševa liječenih s AN1972 u odnosu na PBS skupinu i kod 15 (84%; p=0,03) te kod 18 (55%; p=0,01) mjeseci starosti (SL. 8). Srednja vrijednost neurotičkih naslaga plaka povećala se od 0,32% do 0,49% u PBS skupini između 15 i 18 mjeseci starosti. To je u suprotnosti s velikim smanjenjem razvoja neurotičkih plakova u AN1972 skupini, gdje su srednje vrijednosti neurotičkih naslaga plaka redom 0,05% i 0,22% kod skupina od 15 i od 18 mjeseci.

Čini se da se imunizacija s AN1972 dobro podnosi, te je reaktivna astrocitoza također značajno smanjena u RSC kod AN1972-tretiranih miševa u odnosu na PBS skupinu kod 15 (56%; p=0,011) te kod 18 (39%; p=0,028) mjeseci starosti (SL. 9). Srednje vrijednosti postotka astrocitoze u PBS skupini povećale su se između 15 i 18 mjeseci od 4,26% na 5,21%. AN1972-liječenje usporava razvoj astrocitoze kod obje starosti na 1,89% te na 3,2%.To upućuje da se neuropil ne uništava procesom čišćenja.

6. Reakcija antitijela

Kao što je opisano gore, heterozigotni jedanaestmjesečni PDAPP miševi (N=24) primili su seriju od 5 imunizacija od po 100 μg AN1792 emulgiranih s Freundovim pomoćnim sredstvom koje su bile primijenjene intraperitonealno u tjednima 0, 2, 4, 8 i 12, te šestu imunizaciju samo s PBS (bez Freundovog pomoćnog sredstva) u šesnaestom tjednu. Kao negativna usporedba, paralelna skupina od 24 transgenična miša iste dobi primila je imunizaciju PBS emulgiranog s istim pomoćnim sredstvom, a davanje je obavljeno po istom rasporedu. Životinjama je vađena krv unutar tri odnosno sedam dana nakon svake imunizacije počevši od druge doze. Reakcija antitijela na AN1792 mjerena je pomoću ELISA. Geometrijske sredine titra (GMT) za životinje koje su imunizirane s AN1792 iznosili su aproksimativno 1900, 7600, te 45000 nakon druge, treće te zadnje (šeste) doze. Nisu izmjerena Aβ-specifična antitijela kod poredbenih životinja nakon šeste imunizacije.

Približno jedna polovica životinja liječena je dodatna tri mjeseca, pri čemu su primali imunizacije oko 20, 24 i 27 tjedna. Svaka od tih doza dana je u PBS vehiklu zajedno s Freundovim pomoćnim sredstvom. Srednji titar antitijela ostao je nepromijenjen tijekom tog perioda. U stvari, izgleda da su titri antitijela ostali stabilni od četvrtog do osmog vađenja krvi, što odgovara periodu koji pokriva od pete do devete injekcije.

Kako bi se odredilo da li su Aβ-specifična antitijela, koja su izazvana imunizacijom, te koja su detektirana u serumima miševa liječenih s AN1792, bila također povezana s naslagama amiloida u mozgu, podgrupa sekcija dobivenih od miševa liječenih s AN1792 i od miševa liječenih s PBS reagirala je s antitijelima specifičnim na mišji IgG. Suprotno u odnosu na PBS skupinu, Aβ plakovi u mozgovima koji su liječeni s AN1792 bili su prekriveni s endogenim IgG. Ta se razlika između dvije skupine primjećuje i u skupini od 15 i 18 mjeseci starosti. Naročito očigledno bilo je nepostojanje označavanja u PBS skupini, usprkos prisustva teške amiloidne naslage kod tih miševa. Ti rezultati pokazuju da imunizacija sa sintetskim Aβ proteinom stvara antitijela koja prepoznaju i vežu se in vivo na Aβ u amiloidnom plaku.

7. Stanično upravljana imunološka reakcija

Slezene su uklonjene iz devet PDAPP miševa imuniziranih s AN1792 i 12 miševa imuniziranih s PBS u dobi od 18 mjeseci, sedam dana nakon devete imunizacije. Izolirani su splenociti i uzgajani 72 h u prisustvu Aβ40, Aβ42, odnosno Aβ40-1 (suprotni poredak proteina). Mitogen Con A poslužio je kao pozitivna poredba. Optimalne reakcije dobivene su s >1,7 μM proteinom. Stanice svih devet životinja koje su bile liječene s AN1792 proliferirale su kao odgovor na Aβ1-40 ili Aβ1-42 protein, s jednakom razinom inkorporacije oba proteina (SLIKA 10, gornji prikaz). Nije bilo nikakve reakcije na Aβ1-40 reverzni protein. Stanice poredbenih životinja nisu odgovarale ni na jedan Aβ protein (SLIKA 10, donji prikaz).

C. Zaključak

Rezultati ovih ispitivanja pokazali su da imunizacija PDAPP miševa koji imaju amiloidne naslage s AN1792 usporava i sprječava napredovanje amiloidne naslage i usporava posljedične neuropatološke promjene u mozgu ostarjelog PDAPP miša. Imunizacija s AN1792 bitno zaustavlja razvoj struktura koje bi u normalnim uvjetima podlegle amiloidozi. Stoga, primjena Aβ peptida ima terapeutsku prednost u liječenju AB.

IV. ISPITIVANJE Aβ FRAGMENATA

100 PDAPP miševa u dobi od 9-11 mjeseci imunizirani su s 9 različitih regija APP i Aβ kako bi se odredilo koji epitopi prenose učinkoviti odgovor. 9 različitih imunogena i jedna poredba injektirani su i.p., kao što je opisano u gornjem dijelu. Imunogeni uključuju četiri humana konjugata Aβ peptida 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, koji su svi spareni s ovčjim anti-mišjim IgG preko cistinske veze; APP polipeptid aminokiseline 592-695, agregirani humani Aβ 1-40 te agregirani humani Aβ 25-35, te agregirani Aβ42 glodavca. Agregirani Aβ42 i PBS upotrebljeni su kao pozitivne i negativne poredbe. Upotrebljavalo se deset miševa po liječenoj skupini. Titri su promatrani kao što je gore opisano, a na miševima je izvršena eutanazija na kraju četvrtog mjeseca od davanja injekcija. Histokemija, razine Aβ, te toksikološka analiza provedeni su post mortem.

A. Materijali i postupci

1. Priprava imunogena

Priprava sparenih Aβ peptida: četiri humana konjugata Aβ peptida (aminokiselinski ostaci 1-5, 1-12, 13-28, 33-42, svaki konjugiran s ovčjim anti-mišjim IgG) pripravljeni su sparivanjem preko artificijelnog cisteina dodanog na Aβ peptid uporabom unakrsnog reagensa sulfo-EMCS. Derivati Aβ peptida sintetizirani sa slijedećim konačnim sekvencijama aminokiselina. U svakom slučaju, položaj ubačenog cisteinskog ostatka naznačen je podcrtavanjem. Derivati Aβ13-28 peptida također imaju dva glicinska ostatka ranije dodana na karboksilni terminal cisteina, kao što je naznačeno.

Aβ1-12 peptid NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (ID. BR. SEK: 30)

Aβ1-5 peptid NH2-DAEFRC-COOH (ID. BR. SEK: 31)

Aβ33-42 peptid NH2-C-aminoheptanska kiselina-GLMVGGVVIA-COOH (ID. BR. SEK: 32)

Aβ13-28 peptid Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (ID. BR. SEK: 33)

Kako bi se provela reakcija sparivanja, deset mg ovčjeg anti-mišjeg IgG (Jackson ImunnoResearch Laboratories) dijalizira se preko noći uz uporabu 10 mM pufera natrijevog borata, pH 8,5. Nakon toga se dijalizirana antitijela ukoncentriraju na volumen od 2 ml uporabom Amicon Centriprep epruvete. 10 mg sulfo-EMCS [N(γ-melemidokuproiloksi)sukcinimid] (Molecular Sciences Co.) otopi se u jednom ml deionizirane vode. Sulfo-EMCS u četrdeseterostrukom molarnom suvišku dokapa se uz miješanje na ovčji anti-mišji IgG, nakon čega se otopina miješa dodatnih 10 minuta. Aktivirani ovčji anti-mišji IgG pročišćen je, a pufer je izmijenjen prolaskom preko 10 ml kolone za gel filtriraciju (Pierce Presto kolona, dobivena od Pierce Chemicals), te se nakon toga ekvilibrira s 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Skupe se frakcije koje sadržavaju antitijela, identificirane pomoću apsorbancije na 280 nm, te razrijede na koncentraciju od oko 1 mg/ml, uporabom 1,4 mg po OD kao ekstinkcijskog koeficijenta. Četrdeseterostruki molarni suvišak Aβ peptida otopi se u 20 ml 10 mM NaPO4, pH 8,0, uz iznimku Aβ33-42 peptida za kojeg se 10 mg prvo otopi u 0,5 ml DMSO, te tada razrijedi do 20 ml s 10 mM puferom NaPO4. Svaka pojedina otopina peptida doda se u 10 ml aktiviranog ovčjeg anti-mišjeg IgG, te se miješa na tresilici tijekom 4 sata na sobnoj temperaturi. Nastali se konjugati ukoncentriraju do konačnog volumena koji je manji od 10 ml uporabom Amicon Centriprep epruvete, nakon čega se dijaliziraju s PBS kako bi se izmijenio pufer i uklonio slobodni peptid. Konjugati se propuste kroz filtre za sterilizaciju veličine pora 0,22 μm, te se nakon toga razdijele u alikvotne frakcije od 1 mg te se pohrane na -20°C. Koncentracije konjugata odrede se pomoću ispitivanja BCA proteina (Pierce Chemicals) s konjskim IgG za standardnu krivulju. Konjugacija se odredi pomoću porasta molekulskih masa konjugiranih peptida relativno u odnosu na koncentracije aktiviranih ovčjih anti-mišjih IgG. Konjugat Aβ 1-5 ovčji anti-mišji konjugat predstavlja skup dva konjugata, a ostatak je iz pojedinačnog pripravka

2. Priprava agregiranih Aβ peptida

Humani 1-40, humani 1-42 (California Peptides Inc, serije ME0339 i ME0439), humani 25-35, te glodavčev 1-42 (California Peptides Inc., serija ME0218) peptidi svježe su otopljeni za pripravu za pojedine setove injekcija iz liofilizata, koji je bio pohranjen u eksikatoru na -20°C. U tu svrhu, 2 mg peptida doda se u 0,9 ml deionizirane vode, a smjesa se promućka na vortex aparatu kako bi se dobila relativno ujednačena otopina ili suspenzija. Od četiri peptida samo AN1528 topljiv je u ovom stupnju. Doda se 100 μl alikvota od 10X PBS (1X PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M natrijevog fosfata, pH 7,5) te se u tom trenutku počinje taložiti AN1528. Suspenzija se ponovno miješa na vortex aparatu, te inkubira preko noći na 37 °C kako bi se upotrijebila slijedeći dan.

Priprava pBx6 proteina: ekspresijski plazmid koji kodira pBx6, a predstavlja fuzijski protein koji se sastoji od N-terminalne vodeće sekvencije od 100 aminokiselina s polimeraznom aktivnošću iz MS-2 bakteriofaga nakon čega slijede aminokiseline 592-695 od APP (βAPP) pripravljen je kao što je opisano u članku Oltersdorf i suradnici, J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmid se transfektira u E. coli nakon čega dolazi do ekspresije proteina, poslije indukcije promotora. Bakterije se razgrađuju u 8 M urei, a pBx6 se djelomično pročišćava pomoću preparativne SDS PAGE. Frakcije koje sadržavaju pBx6 identificiraju se pomoću Western blot uporabom zečjih anti-pBx6 poliklonalnih antitijela, zatim se skupe zajedno, ukoncentriraju pomoću Amicon Centriprep epruvete i dijaliziraju kako bi se uklonio PBS. Čistoća pripravka, koja se određuje pomoću SDS PAGE obojane s Coomassie Blue, iznosi aproksimativno 5 do 10%.

B. Rezultati i rasprava

1. Plan ispitivanja

Sto mužjaka i ženki heterozigotnih PDAPP transgeničnih miševa u dobi od devet do jedanaest mjeseci, dobiveni su iz Charles River Laboratory i Taconic Laboratory. Miševi su razvrstani u deset skupina kako bi se imunizirali s različitim područjima Aβ ili APP u kombinaciji s Freundovim pomoćnim sredstvom. Životinje su raspoređene unutar skupina što je sličnije moguće prema spolu, dobi, srodstvu te izvoru dobivanja životinja. U imunogene su uključena četiri Aβ peptida dobivena iz humane sekvencije, 1-5, 1-12, 13-28, te 33-42, pri čemu je svaki konjugiran s ovčjim anti-mišjim IgG; četiri agregirana Aβ peptida, humani 1-40 (AN1528), humani 1-42 (AN1792), humani 25-35, te glodavčev 1-42; te fuzijski polipeptid označen kao pBx6, koji sadržava APP aminokiselinske ostatke 592-695. Deseta je skupina imunizirana s PBS u kombinaciji s pomoćnim sredstvom kao poredbom.

Za svaku imunizaciju emulgira se 100 μg svakog Aβ peptida u 200 μg PBS ili 200 μg APP derivata pBx6 u istom volumenu PBS ili sam PBS u omjeru 1:1 (vol:vol) s kompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) do konačnog volumena od 400 μl za prvu imunizaciju, nakon čega slijede dodatne injekcije iste količine imunogena u nekompletnom Freundovom pomoćnom sredstvu (IFA) za slijedeće 4 doze, te s PBS za konačnu dozu. Imunizacije se daju intraperitonealno prema dvotjednom rasporedu za prve tri doze, a zatim prema mjesečnom rasporedu. Životinjama se vadi krv četiri do sedam dana nakon svake imunizacije radi mjerenja titra antitijela, a počinje se nakon druge doze. Životinje se eutanaziraju približno tjedan dana nakon posljednje doze.

2. Aβ i APP razine u mozgu

Nakon približno četiri mjeseca imunizacije s različitim Aβ peptidima ili APP derivatima, izvade se mozgovi iz životinja koje su prožete slanom otopinom. Jedna hemisfera preparira se za imunohistokemijsku analizu, dok se druga rabi za određivanje razine Aβ i APP. Radi mjerenja koncentracije različitih oblika beta amiloidnih peptida i prekursora amiloidnih proteina, hemisfera je secirana, te su homogenizirane hipokampalne, kortikalne i cerebralne regije pripravljene u 5 M gvanidinu. One su razrijeđene, te je razina amiloida ili APP određivana usporedbom sa serijom razrjeđenja standarda Aβ peptida ili APP poznate koncentracije u ELISA formatu.

Srednja koncentracija ukupnog Aβ za poredbenu skupinu imuniziranu s PBS bila je 5,8 puta viša u hipokampusu nego u korteksu (srednja vrijednost od 24,318 ng/g tkiva hipokampusa u usporedbi s 4,221 ng/g za korteks). Srednja vrijednost u malom mozgu za poredbenu skupinu (23,4 ng/g tkiva) bila je oko 1,000 puta niža nego u hipokampusu. Ove su vrijednosti slične ranije objavljenima za heterozigotne PDAPP transgeničke miševe iste starosti (Johnson-Woods i suradnici, 1997, supra).

Za korteks, srednje vrijednosti razina totalnog Aβ i Aβ 1-42 za podgrupu liječenih skupina značajno se razlikuju vrijednosti poredbene skupine (p<0,05), a liječene životinje primale su AN1792, glodavčev Aβ1-42 ili Aβ1-5 peptidne konjugate, kao što je prikazano na SL. 11. Srednje vrijednosti totalnog Aβ smanjene su redom za 75%, 79% i 61% u usporedbi s kontrolom ovih liječenih skupina. Nema primjetne korelacije između titra Aβ-specifičnih antitijela i Aβ razina u kortikalnoj regiji mozga za bilo koju od ovih skupina.

U hipokampusu, srednje smanjenje totalnog Aβ povezano s AN1792 liječenjem (46%, p = 0,0543) nije bilo veliko kao smanjenje opaženo u korteksu (75%, p = 0,0021). U svakom slučaju, veličina smanjenje bila je daleko veća u hipokampusu nego u korteksu, neto smanjenje od 11,186 ng/g tkiva u hipokampusu u odnosu na 3,171 ng/g tkiva u korteksu. Za skupine životinja koje su primale glodavčev Aβ1-42 ili Aβ1-5, srednja ukupna razina Aβ smanjena je redom za 36% i 26%. U svakom slučaju, uzimajući u obzir male veličine skupina i veliku varijabilnost razina amiloidnih peptida od životinje do životinje unutar obje skupine, smanjenja nisu značajna. Kada su razine Aβ1-42 mjerene u hipokampusu, niti jedno smanjenje uzrokovano liječenjem nije bilo značajnije. Prema tome, s obzirom da su Aβ naslage u korteksu manje, promjene u toj regiji su osjetljiviji indikator za učinke liječenja. Promjene Aβ razina u korteksu mjerene ELISA testom slične su, ali ne identične rezultatima imunohistokemijske analize (pogledati dolje).

Ukupni Aβ mjeren je i u malom mozgu, regiji koja je obično najmanje pogođena AB patologijom. Niti jedna srednja vrijednost Aβ koncentracije za bilo koju skupinu imuniziranu različitim Aβ peptidima ili APP derivatima nije se razlikovala od vrijednosti kontrolnih grupa za tu moždanu regiju. Taj rezultat upućuje da liječenje ne utječe na nepatološke razina Aβ.

APP koncentracija također je određivana ELISA testom kod liječenih i kontrolnih miševa. Korištena su dva različita APP ispitivanja. Prvo ispitivanje, označeno kao APP-α/FL, prepoznaje i APP-alfa (α, izlučeni oblik APP, koji je dobiven cijepanjem unutar Aβ sekvencije), te oblik cijele dužine (FL) APP, dok drugi test prepoznaje samo APP-α. U kontrastu sa smanjenjem Aβ povezanim s liječenjem u podgrupi liječenih skupina, razine APP ne mijenjaju se kod svih liječenih životinja u usporedbi s kontrolnim. Ti rezultati upućuju da imunizacija s Aβ peptidima ne čisti APP; učinci liječenja su specifični na Aβ.

Sumarno, ukupne razine Aβ i Aβ1-42 značajno su smanjene u korteksu liječenjem s AN1792, glodavčev Aβ1-42 ili Aβ1-5 konjugatima. U hipokampusu, ukupni Aβ smanjen je samo AN1792 liječenjem. Nije bilo drugih značajnih promjena Aβ ili APP razina povezanih s liječenjem u hipokampalnoj, kortikalnoj ili cerebralnoj regiji.

2. Histokemijska analiza

Mozgovi iz podgrupe od šest skupina preparirani su za imunohistokemijsku analizu, tri su skupine imunizirane s Aβ peptidnim konjugatima Aβ1-5, Aβ1-12 i Aβ13-28; dvije skupine imunizirane su s Aβ agregatima pune duljine AN1792 i AN1528, te PBS liječena poredbena skupina. Rezultati analize slika amiloidnih naslaga u sekcijama mozga tih skupina prikazani su na SL. 12. Došlo je do značajnog smanjenja amiloidnih naslaga u kortikalnoj regiji u tri liječene skupine u usporedbi s kontrolnom skupinom. Najveća redukcija amiloidnih naslaga uočena je kod skupine koja je primala AN1792 gdje je srednja vrijednost smanjena za 97% (p = 0,001). Značajna smanjenja također su uočena kod životinja liječenih s AN1528 (95%, p = 0,005) te s Aβ1-5 peptidnim konjugatima (67%, p = 0,02).

Rezultati dobiveni kvantifikacijom ukupnih vrijednosti Aβ i Aβ1-42 dobiveni ELISA testom i analizom slika amiloidnih naslaga razlikuju se u određenom stupnju. Liječenje s AN1528 značajno je utjecalo na stupanj kortikalnih amiloidnih naslaga izmjerenih kvantitativnom analizom slika, ali nije utjecalo na koncentraciju ukupnog Aβ u istoj regiji određenu pomoću ELISA testa. Do razlike između ta dva rezultata vjerojatno je došlo zbog specifičnosti tih ispitivanja. Analizom slika mjere se samo netopljivi Aβ agregati u plaku. S druge strane, ELISA testom mjere se svi Aβ oblici, kako topljivi, tako i netopljivi, monomerni, kao i agregirani. Budući da se čini da je patologija bolesti povezana s netopljivim oblicima Aβ povezanim s plakom, tehnika analize slika mogla bi biti osjetljivija za pokazivanje učinaka liječenja. U svakom slučaju, budući da je ELISA test brži i jednostavniji, veoma je koristan za skrining. Štoviše, on može pokazati da je smanjenje Aβ povezano s liječenjem veće za Aβ povezan s plakom nego za ukupni Aβ.

Kako bi se odredilo da li su Aβ-specifična antitijela dobivena imunizacijom kod tretiranih životinja reagirala s amiloidnim naslagama u mozgu, podgrupa sekcija dobivenih od liječenih životinja i kontrolnih miševa reagirala je sa antitijelima specifičnim za mišji IgG. Za razliku od PBS skupine, plakovi koji sadržavaju Aβ prevučeni su s endogenim IgG za životinje imunizirane s Aβ peptidnim konjugatima Aβ1-5, Aβ1-12 i Aβ13-28; te s Aβ agregatima cijele duljine AN1792 i AN1528. Mozgovi životinja imuniziranih s ostalim Aβ peptidima ili APP peptidom pBx6 nisu analizirani u ovom ispitivanju.

3. Mjerenje titra antitijela

Miševima se vadi krv od četvrtog do sedmog dana nakon svake imunizacije počevši od druge imunizacije, za ukupno pet uzoraka krvi. Titri antitijela mjere se kao Aβ1-42-vezujuća antitijela korištenjem sendvič ELISA pomoću plastičnih ploča s više jažica prevučenih s Aβ1-42. Kao što je prikazano na SLICI 13, maksimalni titri antitijela izazvani su nakon četvrte doze za ona četiri imunizacijska pripravka koja su izazvala najveće titre AN1792-specifičnih antitijela: AN1792 (maksimum GMT: 94,647), AN1528 (maksimum GMT: 88,231), Aβ1-12 konjugat (maksimum GMT: 47,216) i glodavčev Aβ1-42 (maksimum GMT: 10,766). Titri tih skupina smanjili su se nakon pete i šeste doze. Za preostalih pet imunogena, maksimalni titri dosegnuti su nakon pete ili šeste doze, a bili su znatno manje magnitude u odnosu na one od četiri skupine s najvećim titrima: Aβ1-5 konjugat (maksimum GMT: 2,356), pBx6 (maksimum GMT: 1,986), Aβ13-28 konjugat (maksimum GMT: 1,183), Aβ33-42 konjugat (maksimum 658), Aβ25-35 (maksimum GMT: 125). Titri antitijela također su mjereni na homologne peptide uporabom istog ELISA sendvič formata za podskupinu imunogena, pri čemu su te skupine imunizirane s Aβ1-5, Aβ13-28, Aβ25-35, Aβ33-42 ili glodavčevim Aβ1-42. Ti su titri bili gotovo isti kao i oni titri koji su mjereni na Aβ1-42, osim za glodavčev Aβ1-42 imunogen, u čijem su slučaju titri antitijela na homologni imunogen bili oko dva puta veći. Magnituda titra AN1792-specifičnog antitijela za pojedine životinje ili srednje vrijednosti liječenih skupina nisu bili u korelaciji s učinkovitošću mjerenoj kao smanjenje Aβ u kotreksu.

4. Limfoproliferativne reakcije

Limfoproliferacija koja ovisi o Aβ izmjerena je uporabom stanica slezene skupljenih približno jedan tjedan nakon konačne, šeste imunizacije. Svježe prikupljene stanice, 105 po jažici, uzgajane su tijekom 5 dana u prisustvu Aβ1-40 koji služi kao stimulacija, u koncentraciji od 5 μM. Stanice iz podgrupe od sedam od deset skupina također su uzgajane u prisustvu reverznog peptida, Aβ1-40. Kao pozitivna usporedba, uzgojene su dodatne stanice s mitogenom T stanicom, PHA, te kao negativna usporedba, uzgojene su stanice bez dodanog peptida.

Kao reakcija na PHA, došlo je do proliferacije limfocita kod većine životinja. Nije bilo nikakve značajne reakcije na Aβ40-1 reverzni peptid. Stanice životinja imuniziranih s velikim agregiranim Aβ peptidima, AN1792, glodavčevim Aβ1-42 te AN1528 proliferile su u velikoj mjeri kada su stimulirane s Aβ1-40 s najvećim cpm kod primatelja AN1792. Jedna životinja u svakoj grupi imuniziranoj s Aβ1-12 konjugatom, Aβ13-28 konjugatom i Aβ25-35 proliferirala je zbog reakcije na Aβ1-40. U preostalim skupinama kojima su dani Aβ1-5 konjugat, Aβ33-42 konjugat pBx6 ili PBS nije bilo životinja kod kojih je došlo do reakcije stimulirana s Aβ. Ti su rezultati sumarno prikazani u Tablici 7 koja se nalazi u nastavku.

[image]

Ovi rezultati pokazuju da AN1792 i AN1528 stimuliraju jaku reakciju T stanica, najčešće CD4+ fenotipa. Ne iznenađuje odsustvo Aβ-specifičnog odgovora T stanica kod životinja imuniziranih s Aβ1-5, budući da su epitopi peptida koje prepoznaju CD4+ T stanice obično duljine 15 aminokiselina, iako kraći peptidi mogu ponekad funkcionirati manje učinkovito. Stoga se pomagači epitopa T stanica za četiri konjugata peptida većinom nalaze u IgG partneru konjugatu, a ne u Aβ regiji. Ta se hipoteza podržava veoma malim učinkom proliferativne reakcije kod životinja u svakoj od ovih liječenih skupina. Budući da je konjugat Aβ1-5 bio efikasan za značajno smanjenje razine Aβ u mozgu, kod očiglednog nedostatka Aβ-specifičnih T stanica, čini se da su antitijela ključna za imunološki odgovor pobuđen imunizacijom.

Slaba imunogenost ove pojedinačne preparacije može biti uzrok pomanjkanja T stanica, te slabe imunološke reakcije fuzioniranog peptida pBx6, koji sadržava APP aminokiseline 592-695 uključujući sve Aβ ostatke. Razlog slabe imunogenosti Aβ25-35 agregata vjerojatno je u tome što je peptid premalen da bi bilo vjerojatno da sadržava dobre epitope T stanica koji bi pomogli pobuđivanju imunološke reakcije. Može se očekivati da bi konjugacijom na protein nosač taj peptid povratio svoju imunogenost.

V. Priprava poliklonalnih antitijela za pasivnu zaštitu

125 ne-transgenični miševi imunizirani su s Aβ i pomoćnim sredstvom, te eutanazirani u dobi od 4-5 mjeseci. Prikupljena je krv iz imuniziranih miševa. IgG je odvojen od ostalih krvnih komponenata. Antitijela specifična za imunogen mogu se djelomično očistiti afinitetnom kromatografijom. Po mišu je dobiven prosjek od otprilike 0,5-1 mg antitijela specifičnih na imunogen, što čini ukupno 60-120 mg.

VI. Pasivna imunizacija s antitijelima na Aβ

U grupi 7-9 mjeseci starih miševa, svakom mišu injektirano je 0,5 mg poliklonalnih anti Aβ ili specifičnih anti- Aβ monoklonalnih antitijela u PBS, kao što je prikazano dolje. Sve su preparacije antitijela čišćene kako bi imale nisku razinu endotoksina. Monoklonalna se mogu pripraviti protiv fragmenta, tako da se u miša injektira fragment ili duža forma Aβ, pri čemu se prepariraju hibridomi i ispituju hibridomi za antitijela koja se specifično vežu na željeni fragment Aβ, bez da se vežu na ostale fragmente Aβ koji se ne podudaraju sa željenim fragmentima Aβ.

Tablica 8

[image]

Miševima je injektiran ip što je bilo potrebno u periodu preko 4 mjeseca, kako bi se održalo cirkuliranje antitijela u koncentraciji mjerljivoj ELISA titrom većim od 1/1000, definirano pomoću ELISA prema Aβ42 ili drugom imunogenu. Titri su promatrani kao što je opisano gore, a miševi su eutanazirani na kraju 6 mjeseci davanja injekcija. Histokemija, razine Aβ i toksikologija određeni su nakon smrti. Po skupini je korišteno deset miševa. Dodatne studije pasivne imunizacije opisane su dolje u Primjerima XI i XII.

VII. Usporedba različitih pomoćnih sredstava

Ova primjer uspoređuje CFA, stipse te emulzije ulja u vodi i MPL u odnosu na njihov kapacitet stimulacije imunološke reakcije.

A. Materijali i postupci

1. Plan ispitivanja

Stotinu ženki zamoraca pasmine Hartley, starih šest tjedana, dobivenih iz Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA, raspoređeni su u deset skupina radi imunizacije s AN1792 ili njegovim palmitoiliranim derivatom u kombinaciji s različitim pomoćnim sredstvima. Sedam skupina primalo je injekcije AN1792 (33 μg, ukoliko nije drugačije navedeno) u kombinaciji s a) PBS, b) Freundovim pomoćnim sredstvom, c) MPL, d) skvalenom, e) MPL/skvalenom, f) niskim dozama stipse, g) visokim dozama stipse (300 μg AN1792). Dvije skupine primale su injekcije palmitoiliranog derivata AN1792 (33 μg) u kombinaciji s a) PBS, ili b) skvalenom. Završna, deseta skupina primala je sam PBS bez antigena ili dodatnog pomoćnog sredstva. Za skupinu koja je primala Freundovo pomoćno sredstvo, prva se doza emulgirala s CFA, a ostale četiri doze s IFA. Antigen se davao u dozi od 33 μg za sve skupine osim za skupinu s visokim dozama stipse, koja je primala 300 μg AN1792. Injekcije su davane intraperitonealno za CFA/IFA, te za sve ostale skupine intramuskularno u stražnji dio kvadricepsa, naizmjenično u lijevu i desnu stranu. Prve tri doze davane su u dvotjednom rasporedu, nakon čega su slijedile dvije doze u mjesečnom intervalu. Radi mjerenja titra antitijela, vađena je krv šest do sedam dana nakon svake imunizacije, počevši od druge doze.

2. Priprava imunogena

Dva mg Aβ42 (California Peptide, serija ME0339) doda se u 0,9 ml deionizirane vode, te se smjesa stavi na vortex, kako bi se dobila relativno jednolična suspenzija. Doda se 100 μl alikvota 10X PBS (1X PBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M natrijevog fosfata, pH 7,5). Suspenzija se ponovo izmućka na vortex aparatu, te inkubira preko noći na 37°C radi korištenja slijedeći dan. Neiskorišteni Aβ1-42 pohrani se sa sredstvom za sušenje kao liofilizirani prašak na 20°C.

Palmitoilirani derivat od AN1792 pripravljen je sparivanjem palmitinskog anhidrida, otopljenog u formamidu, te amino terminalnog ostatka od AN1792 prije uklanjanja nascentnog peptida iz smole tretiranjem fluoridnom kiselinom.

Kako bi se pripravile doze imunogene formulacije s potpunim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) (skupina 2), 33 μg AN1792 u 200 μl PBS emulgira se 1:1 (vol:vol) s CFA do konačnog volumena od 400 μl za prvu imunizaciju. Za slijedeće imunizacije, antigen se emulgira na sličan način s nekompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom. (IFA).

Kako bi se pripravile doze koje u formulaciji uključuju MPL za skupine 5 i 8, liofilizirani se prašak (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) doda u 0,2% vodenog trietilamina do konačne koncentracije od 1 mg/ml i izmućka na vortex aparatu. Smjesa se zagrijava na 65 do 70 °C tijekom 30 sekundi, kako bi se proizvela neprozirna, jednolična suspenzija micela. Pripravlja se svježa otopina za svaki set injekcija. Za svaku injekciju u skupini 5, 33 μg AN1792 u 16,5 μl PBS, 50 μg MPL (50 μg) te 162 μg PBS miješaju se u borosilikatnoj epruveti odmah nakon uporabe.

Kako bi se pripravile doze koje u formulaciji uključuju emulzije male količine ulja u vodi, AN1792 u PBS doda se u 5% skvalena, 0,5% Tweena 80, 0,5% Spana 85 u PBS, kako bi se postigla konačna koncentracije jedinične doze od 33 μg AN1792 u 250 μl (skupina 6). Smjesa se emulgira propuštanjem 15 do 20 puta kroz dvokomorni uređaj koji se drži u ruci dok kapljice u emulziji ne budu gotovo jednakog promjera od 1,0μm što odgovara promjeru standardnih kapljica lateksa kada se gleda kroz mikroskop. Nastala suspenzija je opalescentna, te mliječno bijela. Pripravljaju se svježe emulzije za svaku seriju injekcija. Za skupinu 8, doda se MPL u 0,2% trietilamina u koncentraciji od 50 μg po dozi u smjesu skvalena i detergenta za emulgiranje, kao što je gore spomenuto. Za palmitoilirani derivat (skupina 7), u skvalen se doda 33 μg palmitoil-NH-Aβ-42 po dozi i mućka na vortex aparatu. Tada se uz mućkanje na vortexa aparatu dodaju Tween 80 i Span 85. Ta se smjesa doda u PBS kako bi se postigla konačna koncentracija od 5% skvalena, 0,5% Tweena 80, 0,5% Spana 85, a smjesa se emulgira kako je gore navedeno.

Kako bi se pripravile doze koje u formulaciji sadržavaju stipsu (skupine 9 i 10), AN1792 u PBS doda se u Alhydrogel (gel aluminijevog hidroksida, Accurate, Westbury, NY) da bi se postigla koncentracija od 33μg (niska doza, skupina 9) ili 300 μg (visoka doza, skupina 10) AN1792 po 5 mg stipsa u konačnoj dozi volumena 250 μl. Suspenzija se polagano miješa tijekom 4 sata na sobnoj temperaturi.

3. Mjerenje titra antitijela

Zamorcima se vadi krv šest do sedam dana nakon imunizacije počevši nakon druge imunizacije do ukupno količine od četiri vađenja krvi. Titri antitijela na Aβ42 mjere se pomoću ELISA, kao što je opisano u Općenitim materijalima i postupcima.

4. Priprema tkiva

Nakon oko 14 tjedana, na svim zamorcima izvršena je eutanazija primjenom CO2. Sakupi se likvor, mozgovi se odvoje te se napravi sekcija dijelova mozga (hipokampus, korteks i mali mozak) koji se rabe za mjerenje koncentracije ukupnog Aβ proteina pomoću ELISA.

B. Rezultati

1. Reakcije antitijela

Postoji široki raspon potencijala različitih pomoćnih sredstava kada se mjere kao reakcija antitijela na AN1792 nakon imunizacije. Kao što je prikazano na SLICI 14, kada se AN1792 primjeni u PBS, nije moguće detektirati nijedno antitijelo nakon dvije ili tri imunizacije, a izmjerene su neznatne reakcije nakon četvrte i pete doze s geometrijskom sredinom titra (GMTs) od približno samo 45. Emulzija ulje/voda prouzrokuje skromne titre nakon treće doze (GMT 255) koji se održavaju nakon četvrte doze (GMT 301) te padaju s posljednjom dozom (GMT 54). Postoji jasna reakcija doze antigena za AN1792 vezanog na stipsu s 300 μg koja je u svakoj vremenskoj točki jače imunogena od 33 μg. Kod maksimuma reakcije antitijela, nakon četvrte imunizacije, razlika između dvije doze iznosi 43% s GMTs od oko 1940 (33 μg) i 3400 (300 μg). Reakcija antitijela na 33 μg AN1792 plus MPL vrlo je slična u odnosu na reakciju koju uzrokuje gotovo deseterostruko veća doza antigena (300 μg) vezanih na stipsu. Dodavanjem MPL u emulziju ulje/voda jakost formulacije povećala se u odnosu na MPL u kombinaciji samo s pomoćnim sredstvom relativno u iznosu većem od 75%. Palmitoilirani derivat AN1792 u potpunosti je neimunogen kada se primjeni u PBS, te ima skromne titre kada je prisutan u emulzijama ulje/voda s GMTs od 240 te 105 za treće i četvrto vađenje krvi. Najveći titri antitijela dobiveni su s Freundovim pomoćnim sredstvom s maksimumom GMT od približno 87,000, što je vrijednost gotovo 30 puta veća od GMTs kod slijedeća dva najbolja pripravka, MPL i visoke doze AN1792/stipse.

U ovoj su studiji kao pomoćna sredstva koja najviše obećavaju identificirani MPL i stipsa. Čini se da je MPL pogodniji od ova dva, zbog toga što je bila potrebna deseterostruko niža doza antigena za istu reakciju antitijela koja je dobivena uz stipsu. Reakcija se može povećati s povećanjem doze antigena i/ili pomoćnog sredstva, te optimiziranjem rasporeda imunizacije. Ulje/voda emulzija vrlo je slabo pomoćno sredstvo za AN1792, te dodatak emulzije ulje/voda MPL pomoćnom sredstvu smanjuje stvarnu aktivnost samog MPL.

2. Razine Aβ u mozgu

Zamorci stari približno 14 tjedana duboko su anestezirani, te im je izvađena cerebrospinalna tekućina (CSF), a životinjama iz podgrupe koje su imunizirane s Freundovim pomoćnim sredstvom (skupina 2), MPL (skupina 5), visokom dozom stipse i 300 μg AN1792 (skupina 10), te iz poredbene podskupine imunizirane s PBS izvađeni su mozgovi. Radi mjerenja razine Aβ peptida, jedna hemisfera je secirana, a homogenizati hipokampalne, kortikalne i cerebralne regije pripravljeni su u 5 M gvanidinu. Pripravci su razrijeđeni i kvantificirani usporedbom sa serijom razrjeđenja standarda Aβ proteina poznate koncentracije u ELISA formatu. Razine Aβ proteina bile su vrlo slične u hipokampusu, korteksu i malom mozgu za sve četiri skupine, usprkos širokom rasponu reakcija antitijela na Aβ izazvanim ovim pripravcima. Srednje razine Aβ od približno 25 ng/g tkiva izmjerene su u hipokampusu, 21 ng/g u korteksu, te 12 ng/g u malom mozgu. Stoga, prisutnost visokog titra cirkulirajućih antitijela na Aβ tijekom gotovo tri mjeseca kod nekih od ovih životinja nije mijenjala ukupnu razinu Aβ u njihovim mozgovima. Razine Aβ u CNS također su bile slične između skupina. Izostanak većeg učinka AN1792 imunizacije na endogeni Aβ upućuje da je imunološka reakcija usmjerena na patološke formacije Aβ.

VIII. Imunološka reakcija na različita pomoćna sredstva kod miševa

Za ovu su studiju korištene ženke Swiss Webster miševa stare šest tjedana, s 10-13 životinja po skupini.

Imunizacije su davane subkutano nultog, 14., 28., 60., 90. i 120. u dozama volumena 200 μl. Kao pufer za sve pripravke korišten je PBS. Životinjama je vađena krv radi analize titra antitijela ELISA testom sedam dana nakon svake imunizacije, počevši od druge doze. Režim liječenja svake skupine dan je u Tablici 9.

Tablica 9.

[image]

Napomene:

aBroj miševa u svakoj skupini na početku eksperimenta

bPomoćna sredstva su označena. Pufer za sve pripravke bio je PBS. Za skupine 8, nije bilo pomoćnog sredstva niti antigena.

ELISA titri antitijela na Aβ42 u svakoj skupini prikazani su niže u Tablici 10.

Tablica 10.

[image] Tablica prikazuje najviše titre dobivene za skupine 4, 5 i 18, gdje su pomoćna sredstva bili 125 μg MPL, 50 μg MPL, te QS-21 plus MPL.

IX. Terapeutska učinkovitost različitih pomoćnih sredstava

Studija terapeutske učinkovitosti provedena je na PDAPP transgeničkim miševima sa setom pomoćnih sredstava pogodnih za humanu uporabu, radi ispitivanja njihove sposobnosti da pojačavaju imunološku reakciju na Aβ, te da pobuđuju imunološki-posredovano uklanjanje amiloidnih naslaga u mozgu.

Stotinu osamdeset muških i ženskih 7,5- do 8,5-mjesečnih heterozigotnih PDAPP transgeničnih miševa dobiveno je iz Charles River Laboratories. Miševi su raspoređeni u devet skupina koje su sadržavale 15 do 23 životinje po skupini, te su imunizirani s AN1792 il AN1528 u kombinaciji s različitim pomoćnim sredstvima. Životinje su raspoređene tako da se unutar skupine podudaraju po spolu, starosti i srodstvu koliko god je to moguće. Pomoćna sredstva uključivala su stipsu, MPL i QS-21, svako u kombinaciji s oba antigena, te Freundovo pomoćno sredstvo (FA) samo u kombinaciji s AN1792. Dodatna skupina imunizirana je s AN1792 formuliranom u PBS puferu, plus konzervans timerosal bez pomoćnog sredstva. Deveta skupina imunizirana je samo s PBS kao negativna kontrola.

Priprava agregiranih Aβ peptida: humani Aβ1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; serija ME0541) i humani Aβ1-42 (AN1792; California Peptides Inc., CA; serija ME0439) peptidi svježe su otopljeni za pripravu svakog seta injekcija iz liofiliziranog praška koji je bio pohranjen uz sredstvo za sušenje na -20°C. Stoga su dva mg peptida dodana u 0,9 ml deionizirane vode, te je smjesa stavljena na vortex aparat kako bi se dobila relativno jednolična otopina ili suspenzija. AN1528 bio je topljiv u tom stupnju, za razliku od AN1792. Dodano je 100 μl alikvota 10X PBS (1X PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M natrijev fosfat, pH 7,5), te je AN1528 počeo taložiti. Suspenzije su ponovo stavljene na vortex, te su inkubirane preko noći na 37°C radi uporabe slijedeći dan.

Kako bi se pripravile doze koje sadržavaju formulacije sa stipsom (Skupine 1 i 5), Aβ peptid u PBS dodan je u Alhydrogel ( dva posto vodenog gela aluminijevog hidroksida, Sargeant, Inc., Clifton, NJ), kako bi se postigla koncentracija 100 μg Aβ peptida na 1 mg stipse. 10X PBS dodan je u finalnu dozu volumena 200 μl u 1X PBS. Tad se suspenzija lagano miješa na sobnoj temperaturi približno 4 sata prije injekcije.

Kako bi se pripravile doze koje sadržavaju formulacije sa MPL (Skupine 2 i 6), liofilizirani prašak (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; serija 67039-E0896B) doda se u 0,2% vodeni trietilamin do konačne koncentracije od 1 mg/ml i stavi na vortex. Smjesa se zagrije na 65 do 70°C tijekom 30 sekundi, te je dobivena tamna jednolična suspenzija micela. Otopina se pohrani na 4°C. Za svaki set injekcija pomiješa se u borosilikatnoj epruveti 100 μg peptida po dozi u 50 μl PBS, 50 μg MPL po dozi (50 μl), te 100 μl PBS po dozi neposredno prije uporabe.

Kako bi se pripravile doze koje sadržavaju formulacije sa QS-21 (Skupine 3 i 7), liofilizirani prašak (Aqilla, Framingham MA; serija A7018R) doda se u PBS, pH 6,6-6,7 do konačne koncentracije od 1 mg/ml te se stavi na vortex. Otopina se pohrani na -20°C. Za svaki set injekcija pomiješa se u borosilikatnoj epruvete 100 μg peptida po dozi u 50 μl PBS, 25 μg QS-21 po dozi u 25 μl PBS, te 125 μl PBS po dozi neposredno prije uporabe.

Kako bi se pripravile doze koje sadržavaju formulacije s Freundovim pomoćnim sredstvom (skupina 4), 100 μg AN1792 u 200 μl PBS emulgira se 1:1 (vol:vol) s kompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) do konačnog volumena od 400 μl za prvu imunizaciju. Za slijedeće imunizacije, antigen se emulgira na sličan način s nekompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (IFA). Za formulacije koje kao pomoćno sredstvo sadržavaju stipsu, MPL ili QS-21, 100 μg AN1792 ili AN1528 po dozi kombiniraju se sa stipsom (1 mg po dozi) ili MPL (50 μg po dozi) ili QS-21 (25 μg po dozi) u konačnom volumenu od 200 μl PBS, te se daju subkutanom inokulacijom u leđa između lopatica. Za skupinu koja prima FA, 100 μg AN1792 emulgira se 1:1 (vol:vol) s kompletnim Freundovim pomoćnim sredstvom (CFA) u konačnom volumenu od 400 μl, te se daje intraperitonealno za prvu imunizaciju, nakon čega se daje ista količina imunogena u nekompletnom Freundovom pomoćnom sredstvu (IFA) za preostalih pet doza. Za skupnu koja je primala AN1792 bez pomoćnog sredstva, 10 μg AN1792 kombinira se s 5 μg timerosala u konačnom volumenu od 50 μl PBS, te se podijeli subkutano. Deveta, poredbena skupina, primila je subkutano samo 200 μl PBS. Imunizacije su za prve tri doze davane u dvotjednom rasporedu, zatim u mjesečnom rasporedu u dane 0, 16, 28, 56, 85 i 112. Životinjama je uzeta krv radi mjerenja titra antitijela šest do sedam dana nakon svake imunizacije, počevši o druge doze. Životinje su eutanazirane približno tjedan dana nakon završne doze. Rezultati su dobiveni ELISA ispitivanjem razine Aβ i APP u mozgu, te imunohistokemijskim određivanjem prisutnosti amiloidnih plakova u sekcijama mozga. Dodatno su određeni titri Aβ-specifičnih antitijela, te Aβ-ovisna proliferativna i reakcija citokinona.

Tablica 10 pokazuje da su najveći titri antitijela na Aβ1-42 izazvani s FA i AN1792, gdje su titri rasli nakon četvrte imunizacije (maksimum GMT: 75,386), a zatim opadali za 59% nakon konačne, šeste imunizacije. Srednja vrijednost maksimuma titra dobivenog s MPL i AN1792 bila je 62% niža od one dobivene s FA (maksimum GMT: 28,867), te je također dosegnuta rano u imunizacijskoj shemi, nakon 3 doze, a zatim je opadala na 28% vrijednosti maksimuma nakon šeste imunizacije. Srednja vrijednost maksimuma titra dobivenog s QS-21 u kombinaciji s AN1792 (GMT: 1,511) bila je približno 5-struko niža od vrijednosti dobivene s MPL. Nadalje, kinetika reakcije bila je sporija, budući da je bila potrebna dodatna imunizacija kako bi se dosegao maksimum odgovora. Titri dobiveni s AN1792 vezanim na stipsu bili su nešto veći od onih dobivenih s QS-21, i kinetika reakcije bila je brža. Za AN1792 u PBS s timerosalom, frekvencija i veličina titra bili su jedva nešto veći nego za sam PBS. Maksimumi titra dobivenih s MPL i AN1528 (maksimum GMT 3099) bili su oko 9 puta manji od onih s AN1792. AN1528 vezan na stipsu bio je veoma slab imunogen, s malim titrima dobivenim samo kod nekih životinja. Nije bilo imunološke reakcije kod kontrolnih životinja koje su imunizirane samo s PBS.

Tablica 11.

[image] Napomene:

aGeometrijska sredina titra antitijela na Aβ1-42

bBroj reakcija po skupini

Rezultati liječenja kortikalnog amiloidnog plaka kod miševa starih 12 mjeseci s AN1792 ili AN1528, uz različita pomoćna sredstva ili tiomersal, određeni su pomoću ELISA te prikazani na SLICI 15. Kod poredbenih PBS miševa, srednja razina ukupnog Aβ u korteksu u dobi od 12 mjeseci iznosila je 1,817 ng/g. Primjetno smanjene razine Aβ primijećeno je kod miševa liječenih s AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus stipsa, AN1792 plus MPL te QS-21 plus AN1792. Smanjenje je doseglo statističku značajnost na p<0,05 razini samo za AN1792 plus CFA/IFA. Uglavnom, kao što je prikazano u Primjerima I i III, učinci imunizacije na smanjenje Aβ razina postaju bitno veći kod miševa u dobi od 15 i 18 mjeseci. Stoga, pretpostavlja se da će dodatne formulacije, posebice pripravci AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS-21 osigurat će još bolje rezultate kod liječenja starijih miševa. Suprotno tome, AN1792 plus konzervans tiomersal imali su srednju razinu Aβ po prilici istu kao kod miševa liječenih s PBS. Slični rezultati dobiveni su kada se usporede kortikalne razine Aβ42. Srednja razina Aβ42 kod PBS kontroli iznosila je 1624 ng/g. Primjetno smanjene razine u iznosu od 403, 1149, 620, te 714 primijećene su redom kod miševa liječenih s AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus stipsa, AN1792 plus MPL te AN1792 plus QS-21, sa smanjenjem koje je dosezalo statističku značajnost (p=0,05) za skupinu liječenu s AN1792 CFA/IFA. Srednja razina kod miševa liječenih s AN1792i tiomersalom bila je 1619 ng/g Aβ42.

X. Analiza toksičnosti

Tkiva za histopatološko ispitivanje sakupljena su na kraju ispitivanja opisanog u Primjerima II, III i VII. Dodatno, ispitivanja vezana uz hematologiju i kliničku kemiju provedena su na zadnjim uzorcima krvi iz Primjera III i VI. Evaluirana je većina glavnih organa, uključujući mozak, pluća, limfoidne te gastrointestinalne organe, jetru, bubrege, adrenalne organe te gonade. Iako su primijećene sporadične lezije kod proučavanja životinja, nije postojala očita razlika s obzirom na zahvaćeno tkivo ili ozbiljnost rane između životinja koje su liječene s AN1792 i neliječenih životinja. Nije bilo nikakvih jedinstvenih histopatoloških lezija kod životinja imuniziranih s AN-1528 u usporedbi sa životinjama liječenih s PBS ili neliječenim životinjama. Također nije bilo nikakve razlike u profilu kliničke kemije između skupina s pomoćnim sredstvima, te životinja liječenih s PBS u primjeru VI. Iako je postojalo značajno povećanje kod nekoliko hematoloških parametara između životinja liječenih s AN1792 i Freundova pomoćnog sredstva u Primjeru VI relativno u odnosu na životinje liječene s PBS, ti tipovi učinaka očekuju se kod liječenja s Freundovim pomoćnim sredstvom, te popratnog peritonitisa te ne upućuju ni na kakve suprotne učinke u odnosu na liječenje s AN1792. Iako ne predstavlja dio toksikološke evaluacije, patologija mozga PDAPP miševa ekstenzivno se ispitivala kao dio efikasnosti završnih točaka. Niti u jednoj studiji nisu primijećeni znakovi suprotnog učinka na morfologiju mozga povezanog s liječenjem. Ti rezultati ukazuju da se liječenje s AN1792 dobro podnosi, te da nema nuspojave.

XI. Terapeutsko liječenje s anti-Aβ antitijelima

Pokusi opisani u ovom odjeljku izvedeni su kako bi se ispitala sposobnost različitih monoklonalnih i poliklonalnih antitijela na Aβ da inhibiraju akumuliranje Aβ u mozgu heterozigotnih transgeničnih miševa.

A. Istraživanje 1

1. Plan istraživanja

Šezdeset mužjaka i ženki, heterozigotnih transgeničnih PDAPP miševa, starih 8,5 do 10,5 mjeseci dobiveni su iz Charles River laboratorija. Miševi su razvrstani u šest skupina koje treba liječiti različitim antitijelima usmjerenim na Aβ. Životinje su raspoređene unutar skupina što je sličnije moguće prema spolu, dobi, srodstvu te izvoru dobivanja životinja. Kao što je prikazano u Tablici 12, antitijela uključuju četiri vrste mišjih specifičnih monoklonalnih antitijela, 2H3 (usmjeren na Aβ ostatke 1-12), 10D5 (usmjeren na Aβ ostatke 1-16), 266 (usmjeren na Aβ13-28 i te se veže na monomerni ali ne i na agregirani AN1792), 21F12 (usmjeren na ostatke 33-42). Peta skupina liječi se s frakcijom Aβ-specifičnih poliklonalnih antitijela (povećanoj imunizacijom s agregiranim AN1792). Negativa usporedna skupina dobiva samo diluens, PBS, bez ikakvih antitijela.

Monoklonalna antitijela injektiraju su u dozi od 10 mg/kg (pod pretpostavkom da miševi teže oko 50 g). Injekcije se primjenjuju intraperitonealno prosječno svakih sedam dana kako bi se održavali titri anti-Aβ iznad 1000. Iako su izmjereni niži titri za mAb s obzirom da se mAb ne veže dobro na agregirani AN1792, koji se rabi kao antigen hvatač kod ispitivanja, za ovu se skupinu rabi isti raspored doziranja. Skupina koja je primila monoklonalna antitijela 2H3 prestala se promatrati unutar prva tri tjedna jer su antitijela prebrzo nestajala in vivo. Životinjama se vadi krv prije svakog doziranja kako bi se mjerili titri antitijela. Liječenje se nastavlja tijekom šest mjeseci u ukupnom trajanju od 196 dana. Na životinjama je izvršena eutanazija jedan tjedan nakon konačne doze.

Tablica 12

[image]

Napomena.

a. Broj miševa u skupini na kraju pokusa. Sve skupine započinju s 10 životinja po skupini.

b. NA: nije primjenjivo

c. mAb: monoklonalno antitijelo

2. Materijali i metode

a. Priprava antitijela

Anti-Aβ poliklonalno antitijelo pripravlja se iz krvi koja se dobiva iz dvije skupine životinja. Prva se skupina sastoji od 100 ženki Swiss Webster miševa, starih 6 do 8 tjedana. Imunizirani su nulti, 15. i 29. dan sa 100 μg AN1792 u kombinaciji s CFA/IFA. Četvrta se injekcija primjeni 36. dan s polovinom doze AN1792. Životinje se puste da iskrvare nakon likvidacije 42. dan, pripravi se serum, a serumi se udruže do ukupne količine od 64 ml. Druga se skupina sastoji od 24 ženke miševa izogeničnih s PDAPP miševima, ali netransgeničnih s humanim APP genom, u dobi od 6 do 9 mjeseci. Imuniziraju se nulti, 14., 28. i 56. dan sa 100 μg AN1792 u kombinaciji s CFA/IFA. Te se životinje puste da iskrvare nakon likvidacije 63. dan, priprave se serumi, te stave skupa do ukupne količine od 14 ml. Dvije serije seruma spoje se zajedno. Frakcija antitijela pročišćava se uporabom dva sekvencijalna kruga taloženja s 50% zasićenim amonijevim sulfatom. Konačni se talog dijalizira uz PBD i ispituje na endotoksin. Razina endotoksina bila je niža od 1 EU/mg.

Anti-Aβ monoklonalna antitijela pripravljena su iz tekućina ascitesa. Fluidu su prvo uklonjeni lipidi dodatkom koncentriranog natrijevog dekstran sulfata u ledeno hladni ascites fluid uz miješanje na ledu, kako bi se dosegla konačna koncentracija od 0,238%. Zatim je dodan koncentrirani CaCl2 uz miješanje dok nije dosegnuta konačna koncentracija 64 mM. Ta je otopina centrifugirana na 10,000 × g, a pelete su odbačene. Supernatant se miješa na ledu s jednakim volumenom zasićenog amonijevog sulfata koji je dodan kap po kap. Otopina se ponovo centrifugira na 10,000 × g, a supernatant se odbaci. Pelete se ponovo suspendiraju i dijaliziraju uz 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Ta se frakcija nanese na Pharmacia FPLC Sepharose Q Column, te eluira s inverznim gradijentom od 0,4 do 0,275 M NaCl u 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Maksimum antitijela identificiran je apsorbancijom na 280 nm, te se spoje odgovarajuće frakcije. Priprava pročišćenih antitijela karakterizirana je mjerenjem koncentracije proteina pomoću BCA postupka i mjerenjem čistoće pomoću SDS-PAGE. Skupljene frakcije ispitane su na endotoksin. Razina endotoksina bila je niža od 1EU/mg titra, a titri manji od 100 proizvoljno su označeni vrijednošću titra 25.

3. Razine Aβ i APP u mozgu

Nakon približno šest mjeseci tretmana različitim pripravcima anti-Aβ antitijela, životinjama su uklonjeni mozgovi nakon slane perfuzije. Jedna hemisfera preparirana je za imunohistokemijsku analizu, a druga je korištena za određivanje razine Aβ i APP. Kako bi se izmjerila razina različitih formi beta amiloidnih peptida i prekursora amiloidnih proteina (APP), hemisfera je secirana i pripravljeni su homogenati hipokampalne, kortikalne i regije malog mozga u 5M gvanidinu. Oni su serijski razrijeđeni, te je razina amiloidnog peptida ili APP određena usporedbom sa serijom razrjeđenja standarda Aβ peptida ili APP poznate koncentracije u ELISA formatu.

Razine ukupnog Aβ i Aβ1-42 mjerene ELISA testom u homogenatima korteksa i hipokampusa, te razina ukupnog Aβ u malom mozgu prikazane su redom u Tablicama 11, 12 i 13. Srednja koncentracija ukupnog Aβ za poredbenu skupinu, cijepljenu s PBA bila je 3,6 puta viša u hipokampusu nego u korteksu (srednja vrijednost 63,389 ng/g hipokampalnog tkiva prema 17,818 ng/g za korteks). Srednja vrijednost za poredbenu skupinu bila je u malom mozgu (30,6 ng/g tkiva) više nego dvostruko niža nego u hipokampusu. Te su razine slične onima ranije opisanim za heterozigotne PDAPP transgeničke miševe iste starosti (Johnson-Woods i suradnici., 1997).

Za korteks, jedna je liječena skupina imala srednju razinu Aβ, mjerenu kao Aβ1-42, koja se značajno razlikovala od poredbene skupine (p<0,05), za životinje koje su primale poliklonalna anti-Aβ antitijela, kao što je prikazano u Tablici 13. Srednja vrijednost Aβ1-42 smanjena je za 65% u odnosu na poredbenu skupinu. Srednje razine Aβ1-42 također su značajno smanjene za 55% u usporedbi s kontrolom jedne dodatne skupine, kod životinja koje su primale mAb 10D5 (p = 0,0433).

[image]

U hipokampusu, srednji postotak smanjenja ukupnog Aβ povezan s liječenjem poliklonalnim anti-Aβ antitijelima (50%, p = 0,0055) nije bio velik kao u korteksu (65%) (Tablica 14). U svakom slučaju, apsolutna vrijednost smanjenja gotovo je trostruko veća u hipokampusu nego u korteksu, s neto smanjenjem od 31,683 ng/g tkiva u hipokampusu prema 11,685 ng/g tkiva u korteksu. Kada je umjesto ukupnog Aβ mjerena razina jače amiloidogenog oblika Aβ, Aβ1-42, došlo je do značajnog smanjenja s poliklonalnim antitijelima (p = 0,0025). Srednje vrijednosti u skupinama liječenim s mAbs 10D5 i 266 smanjene su redom za 33% i 21%.

[image]

Ukupni Aβ također je mjeren u malom mozgu (Tablica 15). Skupine koje su primale poliklonalna Aβ i 266 antitijela pokazale su značajno smanjenje razine ukupnog Aβ (redom 43% i 46%, p = 0,0033 i p = 0,0184), a skupina koja je primala 10D5 imala je slično značajno smanjenje (29%, p = 0,0675).

Tablica 15

[image]

Napomene:

a. Broj životinja po skupini na kraju eksperimenta

b. ng/g tkiva

c. Mann Whitney analiza

d. NU: neuporabljiv

e. Standardna devijacija

APP koncentracije također su određene ELISA testom u korteksu i malom mozgu kod miševa liječenih antitijelima i kontrolnih, liječenih s PBS. Korištena su dva različita ispitivanja APP. Prvo, označeno kao APP-α/FL, prepoznaje oba oblika, APP-alfa (α, izlučeni oblik APP, dobiven cijepanjem unutar APP sekvencije) i cijelu duljinu (FL) APP, dok drugi prepoznaje samo APP-α. Za razliku od smanjenja Aβ uzrokovanog liječenjem u podgrupi liječenih skupina, razine APP prividno se ne mijenjaju kod svih liječenih životinja u usporedbi s kontrolnim. Ti rezultati upućuju da imunizacija Aβ antitijelima uklanja Aβ bez uklanjanja APP.

Sumirano, Aβ razine značajno su smanjene u korteksu, hipokampusu i malom mozgu kod životinja koje su liječene s poliklonalnim antitijelima koja su izazvana s AN1792. Monoklonalna antitijela manje površine u odnosu na amino terminalno područje Aβ1-42, preciznije aminokiseline 1-16 te 13-28 također pokazuju značajne učinke u liječenju.

4. Histokemijske analize

Morfologija Aβ-imunoreaktivnih plakova u podskupinama mozgova dobivenih od miševa iz skupina koje su liječene s PBS, poliklonalnim Aβ42, 21F12, 266 te 10D5 kvantitativno je uspoređena s prijašnjim istraživanjima u kojima su se primjenjivali standardni postupci imunizacije s Aβ42.

Najveća promjena veličine i izgleda amiloidnih plakova javlja se kod životinja imuniziranih s Aβ42 antitijelima. Smanjenja amiloidne naslage, erodirana morfologija plaka, te Aβ imunoreaktivnost povezana sa stanicom izrazito nalikuju učincima prouzrokovanim standardnim postupkom imunizacije. Ta opažanja potkrepljuju ELISA rezultati gdje je postignuto značajno smanjenje ukupnog Aβ i Aβ42 primjenom poliklonalnih Aβ42 antitijela.

U sličnim kvantitativnim evaluacijama, u 10D5 skupini smanjili su se amiloidni plakovi količinski i po izgledu, uz nešto dokaza o Aβ imunoreaktivnosti povezanoj sa stanicom. Glavne razlike nisu uočene kada su uspoređene skupine 21F12 i 266 s PBS kontrolama.

5. Mjerenje titra antitijela:

Podskupini od tri nasumce odabrana miša iz svake skupine vadi se krv prije svake intraperitonealne inokulacije, do ukupnog iznosa od 30 vađenja. Titri antitijela mjere se kao Aβ1-42 vezujuća antitijela uporabom sendvič ELISA s plastičnom pločom koja ima više jažica presvučenih s Aβ1-42, kao što je iscrpno opisano u Općenitim materijalima i postupcima. Srednji titri za svako vađenje krvi prikazani su na slikama 16-18 za poliklonalna antitijela, kao i monoklonalna 10D5 i 21F12. Prosječna vrijednost titara iznosi oko 1:1000 unutar tog perioda za pripravu poliklonalnih antitijela, te su nešto malo iznad te razine za životinje liječene s 10D5 i 21F12.

6. Reakcije limfoproliferacije

Limfoproliferacija koja ovisi o Aβ mjeri se uporabom stanica slezene skupljenih osam dana nakon zadnje infuzije antitijela. Svježe sakupljene stanice, 105 po jažici, uzgajaju se 5 dana u prisustvu Aβ1-40 u koncentraciji od 5 μM za stimulaciju. Kao pozitivna poredba uzgajaju se dodatne stanice s mitogenom T stanica, PHA, te kao negativna poredba uzgajaju se stanice bez dodanog peptida.

Splenociti od ostarjelih PDAPP miševa, pasivno imuniziranih različitim anti-Aβ antitijelima stimuliraju se in vitro s AN1792, te se mjeri proliferativna ili citokina reakcija. Svrha ovih ispitivanja je utvrđivanje da li pasivna imunizacija olakšava prezentaciju antigena, te primarne reakcije T stanica specifičnih za AN1792. Ne primjećuju se nikakve AN1792-specifične proliferativne ili citokine reakcije kod miševa pasivno imuniziranih anti-Aβ antitijelima.

B. Istraživanje 2

U drugom istraživanju, ponavlja se liječenje s antitijelima 10D5 te se ispituju dva dodatna anti-Aβ antitijela, monoklonalna antitijela 3D6 (Aβ1-5) i 16C11 (Aβ33-42). Poredbene skupine dobivaju ili PBS, ili irelevantno antitijelo koje odgovara po izotipu (TM2a). Miševi su stariji (heterozigoti stari 11,5-12 mjeseci) u odnosu na prethodno istraživanje; osim toga, planiranje pokusa je identično. Još jednom, nakon šest mjeseci liječenje, 10D5 smanjio je količinu plaka za više od 80% relativno u odnosu na PBS ili na usporedna antitijela koja odgovaraju po izotipu (p=0,003). Jedno od druga dva antitijela na Aβ, 3D6, također je jednako učinkovito, te proizvodi 86% smanjenje (p=0,003). Suprotno tome, treće antitijelo na peptid, 16C11, nije imalo nikakav učinak na plak. Slični rezultati dobiveni su pomoću Aβ42 ELISA mjerenja. Ti rezultati pokazuju da je reakcija antitijela na Aβ peptid, u odsutnosti imuniteta T stanica, dovoljna da smanji naslagu amiloida kod PDAPP miševa, ali nisu sva anti-Aβ antitijela efikasna. Posebno su učinkovita antitijela usmjerena na epitope koji sadržavaju aminokiseline 1-5 ili 3-7 od Aβ.

Ta istraživanja pokazuju da pasivno primijenjena antitijela na Aβ smanjuju veličinu naslage plaka na mišjem modelu Alzheimerove bolesti. Ako se drže na skromnim koncentracijama seruma (25-70 μg/ml), antitijela uspijevaju doći u CNS u razinama dovoljnim da dekoriraju β-amiloidne plakove. Ulaz antitijela u CNS nije uzrokovan nenormalnim propuštanjem hemolikvorne barijere, jer nema povećanja vaskularne permeabilnosti, kao što je izmjerio Evans Blue kod PDAPP miševa. Nadalje, koncentracija antitijela u parenhimu mozga ostarjelih PDAPP miševa ista je kao i kod ne-transgeničnih miševa, a predstavlja 0,1% koncentracije antitijela u serumu (neovisno o izotipu).

C. Ispitivanje 3: Promatranje vezanja antitijela

Kako bi se odredilo da li antitijela na Aβ mogu djelovati izravno unutar CNS, mozgovi dobiveni od miševa ispunjenih slanom otopinom na kraju Primjera XII, ispitivani su na prisustvo periferno primijenjenih antitijela. Nefiksirane kriostatske sekcije mozga izlažu se fluorescentnom reagensu protiv mišjeg imunoglobulina (kozji anti-mišji IgG-Cy3). Plakovi u mozgovima životinja iz skupina 10D5 i 3D6 jako su dekorirani s antitijelima, a u 16C11 nije bilo nikakvog obojenja. Kako bi se otkrila puna veličina naslage plaka, serija sekcija svakog mozga dovedena je u imunološku reakciju s anti-Aβ antitijelima, a nakon toga sa sekundarnim reagensom. 10D5 i 3D6 su nakon periferne primjene uspjeli ući u većinu plakova unutar CNS. Naslaga plaka znatno se smanjila kod tih liječenih skupina u usporedbi s 16C11 skupinom. Ti podaci ukazuju da periferno primijenjena antitijela mogu ući u CNS tamo gdje mogu izravno izazvati uklanjanje amiloida. Izgleda da 16C11 također ima pristup plakovima ali se ne može na njih vezati.

XII. Prevencija i liječenje ljudi

Pokusna faza I s pojedinačnom dozom izvodi se kako bi se odredila sigurnost za ljude. Terapeutik se primjenjuje u povećanim dozama na različitim pacijentima počevši od oko 0,01 razine pretpostavljene učinkovitosti, te povećavajući za faktor 3, dok se ne dosegne razina oko 10 puta veće od mišje učinkovite doze.

Pokusna faza II izvodi se kako bi se odredila terapeutska učinkovitost. Odabrani su pacijenti s ranim ili srednjim stadijem Alzheimerove bolesti uporabom kriterija Društva oboljelih od Alzheimerove bolesti i srodnih poremećaja (ADRDA) za vjerojatnu AB. Odgovarajući pacijenti kreću se u području 12-26 na Mini-mentalnom državnom ispitu (MMSE). Ostali su kriteriji odabira da će pacijenti poživjeti tijekom ispitivanja te izbjegavanje kompliciranih predmeta poput popratnih lijekova koji mogu interferirati. Osnovna vrednovanja pacijentove funkcije provode se uz pomoć klasičnih psihometrijskih mjerenja, poput MMSE, te ADAS, koji predstavlja opsežnu skalu za evaluaciju pacijenata sa statusom i funkcijom Alzheimerovom bolesti. Te psihometrijske skale omogućavaju mjerenje napredovanja stanja Alzheimerove bolesti. Pogodna kvalitativna životna skala može se također upotrijebiti za nadzor liječenja. Napredovanje bolesti može se također promatrati pomoću MRI. Također se mogu promatrati dijagrami krvi pacijenata, uključujući određivanja odgovora imunogen-specifičnih antitijela i T-stanica.

Nakon osnovnih mjerenja, pacijenti se počinju liječiti. Nasumce su odabrani te se liječe ili s terapeutikom ili dobivaju placebo. Pacijenti se promatraju najmanje svakih šest mjeseci. Učinkovitost se određuje pomoću značajnog smanjenja napredovanja bolesti kod liječene skupine relativno u odnosu na placebo skupinu.

Druga pokusna faza II provodi se kako bi se vrednovala konverzija pacijenata od ranog gubitka pamćenja koje nije povezano s Alzheimerovom bolešću, ponekad se smatra da su to oštećenja vezane uz starenje (AAMI) ili blaga kognitivna oštećenja, do vjerojatne Alzheimerove bolesti, kao što je definirano prema kriterijima ADRDA. Pacijenti s visokim rizikom obolijevanja od Alzheimerove bolesti odabrani su iz ne-kliničke populacije pregledavanjem referentne populacije koja ima rane znakove gubitka pamćenja ili druge poteškoće povezane sa simptomatologijom koja prethodi Alzheimerovoj bolesti, faktor genetskog rizika, dob, spol. te ostale značajke za koje se pronašlo da predviđaju visoki rizik od Alzheimerove bolesti. Skupljeni su osnovni odgovarajući parametri, uključujući MMSE i ADAS, zajedno s ostalim parametrima planiranim za evaluaciju normalnije populacije. Ta populacija pacijenata podijeljena je u odgovarajuće skupine s placebo usporedbom alternativnog doziranja s agensom. Ta populacija pacijenata prati se u intervalima od oko šest mjeseci, a krajnja točka za svakog pacijenta je da li se ili se nije on ili ona razbolio(la) od Alzheimerove bolesti, kao što je definirano prema ADRDA kriterijima na kraju promatranja.

XIII. Općeniti materijali i postupci

1. Mjerenje titra antitijela

Miševima se vadi krv malim zarezivanjem vene na repu, te se prikuplja oko 200 μl krvi u epruvetu za mikrocentrifugu. Zamorcima se vadi krv na taj način da se prvo obrije površina stražnjeg skočnog zgloba, te se nakon toga pomoću standardnom iglom br.18 zareže metatarzalna vena i prikupi krv u epruvete za mikrofugu. Pusti se da se krv zgruša tijekom jednog sata na sobnoj temperaturi (ST), stavi se na vortex aparat, te se centrifugira na 14,000 × g tijekom 10 min kako bi se odvojio ugrušak od seruma. Tada se prenese serum u čistu epruvetu za mikrofugu te pohrani na 4 °C do titriranja.

Titri antitijela mjere se pomoću ELISA. Ploče za mikrotitraciju s 96 jažica (Costar EIA ploče) obložene su s 100 μl otopine koja sadržava ili 10 μl/ml Aβ42 odnosno SAPP, ili druge antigene u puferu kojim se oblažu jažice (0,1 N natrijevog fosfata, pH 8,5, 0,1% natrijevog azida), te se drže na ST preko noći, kao što je navedeno u svakom pojedinačnom izvještaju. Aspiriraju se jažice, te im se dodaju serumi počevši s razrjeđenjem 1/100 u oglednom diluensu (0,014 M natrijevog fosfata, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% goveđeg serumskog albumina, 0,05% timerosala). Sedam serijskih razrjeđenja uzoraka naprave se izravno u ploče u trostrukim stupnjevima kako bi se postiglo konačno razrjeđenje od 1/218700. Razrjeđenja se inkubiraju tijekom jednog sata na ST u obloženim jažicama. Tada se jažice isperu četiri puta s PBS koji sadržava 0,05% Tween 20. Drugo antitijelo, kozji anti-mišji Ig vezan na hren peroksidazu (dobivenu od Boehringer Manhnheim), doda se u jažice u količini od 100 μl uz razrjeđenje od 1/3000 u oglednom diluensu, te se inkubira tijekom 1 sata na ST. Ploče se ponovno ispiru četiri puta s PBS, Tween 20. Kako bi se razvio kromogen, 100 μl TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina dobivenog od Pierce Chemicals) doda se u jažice i inkubira 15 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 25 μl 2 M H2SO4 Tada se očita intenzitet obojenja na Molecular Devices Vmax na (450 nm - 650 nm).

Titri su definirani kao recipročna vrijednost razrjeđenja seruma te daju polovinu maksimuma OD. Maksimalni OD općenito se uzima od početnog razrjeđenja 1/100, osim kod slučajeva s vrlo velikim titrima, te je tada potrebno veće početno razrjeđenje kako bi se dobio maksimalni OD. Ako dođe do 50% pada između dva razrjeđenja, linearnom ekstrapolacijom računa se konačni titar. Kako bi se izračunala geometrijska sredina titra antitijela, titri s manje od 100 proizvoljno su označeni vrijednošću titra 25.

2. Određivanje proliferacije limfocita

Mišev se anesteziraju izofluoranom. Slezene se uklone i isperu dva puta s 5 ml PBS koji sadržava 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (PBS-FBS), te homogeniziraju u 50° Centricon jedinici (Dako A/S, Danska) u 1,5 ml PBS-FBS tijekom 10 sekundi na 100 okr./min. u Medimachine (Dako), nakon čega slijedi filtriranje kroz najlonsko sito veličine pora od 100 mikrona. Splenociti se jednom isperu s PBS-FBS, te se zatim peletiraju centrifugiranjem na 200 × g tijekom 5 min. Crvena krvna zrnca razgrađuju se ponovnim suspendiranjem peleta u 5 ml pufera koji sadržava 0,15 M NH4Cl, 1 M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4 tijekom pet minuta na ST. Tada se ispiru leukociti, kao što je gore opisano. Svježe izolirane stanice slezene (105 stanica po jažici) uzgajaju se u trostrukim setovima na pločama za mikrotitraciju s 96 jažica koje imaju dno U oblika, tretirane kulturom tkiva (Corning, Cambridge, MA) u RPMI 1640 mediju (JRH Biosciences, Lenexa, KS) obogaćenom s 2,05 mM L glutamina, 1% penicilin/streptomicina, te 10% FBS inaktiviranog toplinom, tijekom 96 sati na 37°C. Različiti Aβ peptidi, Aβ1-16, Aβ1-40, Aβ1-42 ili Aβ40-1 protein obrnute sekvencije također se dodaju u dozama koje se kreću od 5 do 0,18 mikromola u četiri stupnja. Stanice u kontrolnim jažicama uzgajaju se s Concavalinom A (Con A) (Sigma, kat. # C-5275, 1 μg/ml) bez dodanog proteina. Stanice pulsiraju tijekom 24 sata s 3H-timidinom (1 μCi/jažici dobiven od Amersham Corp., Arlington Heights IL). Tada se stanice skupe na UniFilter ploče i izbroje u Top Count scintilacijskom brojaču mikroploča (Packard Instruments, Downers Grove, IL) Rezultati su izraženi kao broj radioaktivnih raspada po minuti (cpm) inkorporiran u netopljive makromolekule.

4. Priprava mozgovnog tkiva

Nakon eutanazije, mozgovi se uklanjaju, te se jedna polovica pripravi za imunohistokemijsku analizu, a tri se područja mozga (hipokampus, korteks, mali mozak) sekcijom odvoje od druge polovice, te se rabe za mjerenje koncentracije različitih Aβ proteina i APP oblika uporabom specifičnih ELISA (Johnson-Wood i suradnici, supra).

Tkiva koja su predodređena za ELISA testove homogenizirana su u 10 volumena ledenog pufera gvanidina (5,0 M gvanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogene smjese polagano se miješaju pomoću Adams Nutator (Fisher) tijekom tri do četiri sata na ST, te pohrane na -20°C prije kvantitativnog određivanja Aβ i APP. Prijašnji pokusi pokazali su da su analiti bili stabilni u tim uvjetima pohrane, te da je moguće kvantitativno dovesti u isto stanje sintetski Aβ protein (Bacham) kada se doda u homogenu smjesu poredbenog mozgovnog tkiva miševa (Johnson-Wood i suradnici, supra).

5. Mjerenje Aβ razina

Homogene smjesa mozgovnog tkiva razrijeđene su 1:10 s ledenim kazeinskim diluensom (0,25% kazeina, PBS, 0,05% natrijevog azida, 20 μg/ml aprotinina, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 μg/ml leupeptina), te se centrifugiraju na 16000 × g tijekom 20 min. na 4 °C. Standardi sintetskih Aβ proteina (1-42 aminokiselina) i standardi APP priprave se tako da u konačnom pripravku uključuju 0,5 M gvanidina i 0,1% goveđeg serumskog albumina (BSA). “Ukupni” Aβ sendvič ELISA rabi monoklonalno antitijelo 266, specifično za aminokiseline 13-28 od Aβ (Seubert i suradnici), kao antitijelo hvatača, te biotinilirano monoklonalno antitijelo 3D65, specifično za aminokiseline 1-5 od Aβ (Johnson-Wood i suradnici), kao antitijelo reportera. 3D6 monoklonalno antitijelo ne prepoznaje izlučeni APP ili APP potpune duljine, već samo detektira Aβ vrste koje na amino-termalnom kraju imaju asparaginsku kiselinu. Ovo ispitivanje ima nižu granicu osjetljivosti od ~50 �g/ml (11 �M) te unakrsno ne reagira s endogenim mišjim Aβ proteinom u koncentracijama do 1 ng/ml (Johnson-Wood i suradnici, supra).

Aβ-42 specifični sendvič ELISA test kao antitijelo hvatač rabi mAβ 21F12, specifičan za Aβ aminokiseline 33-42 (Johnson-Wood i suradnici). Biotinilirani mAβ 3D6 također je u tom ispitivanju antitijelo reporter koje ima manju granicu osjetljivosti od oko 125 μg/ml (28 μM, Johnson-Wood i suradnici). Za Aβ ELISAs, jažice koje se nalaze na ploči za imunološko određivanje (Costar) sa 96 jažica oblože se sa 100 μl mAβ 266 (10 μg/ml) ili mAβ 21F12 (5 μg/ml) i inkubiraju preko noći na ST. Otopina se uklanja aspiriranjem i jažice se blokiraju dodatkom 200 μl 0,25% humanog serumskog albumina u PBS puferu tijekom najmanje 1 sata na ST. Blokirajuća otopina se uklanja, a ploče se do uporabe pohranjuju na 4°C u eksikatoru. Ploče se rehidriraju s puferom za pranje (slana otopina s Tris-puferom (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05% Tween 20)) prije uporabe. Uzorci i standardi dodaju se tri puta u alikvotima od 100 μl po jažici, te inkubiraju preko noći na 4°C. Ploče se ispiru najmanje tri puta s puferom za pranje između svakog stupnja ispitivanja. Doda se biotinilirani mAβ 3D6, razrijeđen na 0,5 μg/ml u kazeinskom puferu za određivanje (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubira u jažicama 1 sat na ST. Konjugat avidinina i hren peroksidaze (avidin-HRP dobiven od Vector, Burlingame, CA), razrijeđen 1:4000 u kazeinskom puferu za određivanje, doda se u jažice tijekom 1 sata na ST. Doda se kolorimetrijski supstrat, spori TMB-ELISA (Pierce) i pusti da reagira tijekom 15 minuta na ST, nakon čega se zaustavi enzimatska reakcija dodatkom 25 μl 2 N H2SO4. Produkt reakcije kvantificira se pomoću Molecular Devices Vmax mjerenjem razlike u apsorbanciji na 450 nm, te na650 nm.

6. Mjerenje APP razina

Rabe se dva različita ispitivanja APP. Prvo, označeni kao APP-α/FL, prepoznaje oba oblika, i APP-alfa (α), i oblik potpune duljine (FL). Drugo ispitivanje specifičan je za APP-α. APP-α/FL ispitivanje prepoznaje izlučeni APP, uključujući prvih 12 aminokiselina od Aβ. S obzirom da antitijelo reporter (2H3) nije specifično za α-spojno-mjesto, koje se javlja između aminokiselina 612-613 koje pripadaju APP695 (Esch i suradnici, Science 248, 1122-1124 (1990)); taj uzorak također prepoznaje APP potpune duljine (APP-FL). Preliminarni pokusi u kojima se rabe APP antitijela imobilizirana na rep citoplazme APP-FL radi pražnjenja homogenata mozgova od APP-FL, sugeriraju da je približno 30-40% APP-α/FL APP je FL (podaci nisu prikazani). Antitijelo hvatač i za APP-α/FL i za APP-α ispitivanja je mAb 8E5, koji djeluje protiv aminokiselina 444 do 592 oblika APP695 (Games i suradnici, supra). Reporter mAb za APP-α/FL ispitivanje je mAb 2H3, specifičan za aminokiseline 597-608 od APP695 (Johnson-Wood i suradnici, supra), a antitijelo reporter za APP-α ispitivanje je biotinilirani derivat mAb 16H9, koji djeluje protiv APP aminokiselina 605 do 611. Niža granica osjetljivosti APP-α/FL ispitivanja je oko 11 ng/ml (150 ρM) (Johnson-Wood i suradnici), a za APP-α specifično ispitivanje granica je 22 ng/ml (0,3 nM). Za oba APP ispitivanja, mAb 8E5 prevučen je na jažice EIA ploče s 96 jažica, kao što je gore opisano za mAb 266. Pročišćeni, rekombinantni, izlučeni APP-α rabi se kao referentni standard za APP-α ispitivanje i APP-α/FL ispitivanje (Esch i suradnici, supra). Uzorci dobiveni homogeniziranjem materijala mozga u 5 M gvanidinu razrijeđeni su 1:10 s ELISA oglednim diluensom (0,014 M fosfatnog pufera, pH 7,4, 0,6% goveđeg serumskog albumina, 0,05%timerosala, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Tada se razrjeđuju 1:4 s oglednim diluensom koji sadržava 0,5 M gvanidina. Zatim se razrijeđeni homogenati centrifugiraju na 16000 × g tijekom 15 sekundi na ST. Na ploču se dodaju dvostruki alikvoti APP standarda i uzoraka te se inkubiraju tijekom 1,5 sata na ST. Biotinilirano antitijelo reporter 2H3 ili 16H9 inkubira se sa uzorcima tijekom 1 sata na ST. Streptavidin-alkalna fosfataza (Boehringer Mannheim), razrijeđena 1:1000 u oglednom otapalu, inkubira se u jažicama tijekom 1 sata na ST. Tijekom 30-minutne inkubacije na ST doda se fluorescentni supstrat 4-metil-umbeliferil-fosfat, a ploče se očitavaju na Cytofluor tm 2350 fluorimetru (Millipore) uz ekscitaciju na 365 nm i emisiju na 450 nm.

7. Imunohistokemija

Mozgovi se fiksiraju tijekom tri dana na 40°C u 4% paraformaldehidu u PBS, te se zatim prije seciranja pohrane od jedan do sedam dana na 4°C u 1% paraformaldehidu u PBS. Izrežu se koronalne sekcije debljine četrdeset mikrona na vibratoru na ST, te se pohrane u krioprotektantu (30% glicerola, 30% etilenglikola u fosfatnom puferu) na -20°C prije imunohistokemijskog postupka. Od svakog mozga, šest sekcija leđnog hipokampusa, svaka odvojena u intervalima od 240 μm u nizu, inkubiraju se preko noći s jednim od slijedećih antitijela: (1) biotinilirani anti-Aβ (mAb, 3D6, specifičan za humani Aβ) razrijeđen na koncentraciju 2 μg/ml u PBS, te 1% konjskog seruma; ili (2) biotinilirani mAb specifičan za humani APP, 8E5, razrijeđen na koncentraciju 3 μg/ml u PBS, te 1% konjskog seruma; ili (3) mAb specifičan za glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAPM Sigma Chemical Co.) razrijeđen 1:500 s 0,25% Triton X-100, te 1% konjskog seruma u tris-puferiranoj slanoj otopini, pH 7,4 (TBS); ili (4) mAb specifičan za CD11b, MAC-1 antigen, (Chemicon International) razrijeđen 1:100 s 0,25% Triton X-100, te 1% zečjeg seruma u TBS; ili (5) mAb specifičan za MHC II antigen, (Pharmingen) razrijeđen 1:100 s 0,25% Triton X-100, te 1% zečjeg seruma u TBS; ili (6) mAb štakora specifičan za CD 43 (Pharmingen) razrijeđen 1:100 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili (7) mAb štakora specifičan za CD 45RA (Pharmingen) razrijeđen 1:100 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili (8) monoklonalni Aβ štakora specifičan za CD 45RB (Pharmingen) razrijeđen 1:100 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili (9) monoklonalni Aβ štakora specifičan za CD 45 (Pharmingen) razrijeđen 1:100 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili (10) biotinilirani poliklonalni Aβ hrčka specifičan za CD3e (Pharmingen) razrijeđen 1:100 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili (11) mAb štakora specifičan za CD3 (Serotec) razrijeđen 1:200 sa 1% zečjim serumom u PBS; ili s (12) otopinom PBS bez primarnih antitijela koja sadržava 1% normalnog konjskog seruma.

Sekcije koje su reagirale s otopinama antitijela opisanim gore pod 1,2 i 6-12, prethodno su tretirane s 1,0% Triton X-100, 0,4% vodikovog peroksida u PBS tijekom 20 min na ST radi blokiranja endogene peroksidaze. Nakon toga su inkubirane preko noći na 4°C s primarnim antitijelima. Sekcije koje su reagirale s 3D6 ili 8E5 ili CD3e mAbs reagirale su zatim jedan sat na ST s peroksidaza-avidin-biotin-kompleksom hrena s komponentama kita “A” i “B” razrijeđenim 1:75 u PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Sekcije koje su reagirale s antitijelima specifičnim na CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3, te PBS otopinom bez primarnih antitijela, inkubirane su 1 sat na ST s biotiniliranim anti-štakor IgG (Vector) razrijeđenim 1:75 u PBS ili biotiniliranim anti-mišjim IgG razrijeđenim 1:75 u PBS. Sekcije su zatim reagirale jedan sat na ST s peroksidaza-avidin-biotin-kompleksom hrena s komponentama kita “A” i “B” razrijeđenim 1:75 u PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).

Sekcije su se razvijale u 0,01% vodikovom peroksidu 0,05% 3,3’-diaminobenzidinu (DAB) na ST. Sekcije određene za inkubaciju s GFAP-, MAC-1- i MHC II-specifičnim antitijelima prethodno su tretirane s 0,6% vodikovim peroksidom na RT radi blokiranja endogene peroksidaze, a zatim inkubirane preko noći s primarnim antitijelima na 4°C. Sekcije koje su reagirale s GFAP antitijelima inkubirane su jedan sat na RT s biotiniliranim anti-mišjim IgG dobivenim iz konja (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit), razrijeđenim 1:200 u TBS. Nakon toga su sekcije reagirale jedan sat s avidin-biotin-peroksidaza kompleksom (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) razrijeđenim 1:1000 u TBS. Sekcije koje su inkubirane s MAC-1- ili MHC II-specifičnim monoklonalnim antitijelima kao primarnim antitijelima, reagirale su redom tijekom 1 sat na ST s biotiniliranim anti-štakor IgG dobivenim iz zeca i razrijeđenim 1:200 u TBS, nakon čega su inkubirane jedan sat s avidin-biotin-peroksidaza kompleksom razrijeđenim 1:1000 u TBS. Sekcije inkubirane s GFAP-, MAC-1- i MHC II-specifičnim antitijelima vizualizirane su zatim tretiranjem redom s 0,05% DAB, 0,01% vodikovog peroksida, 0,04% niklovog klorida i TBS tijekom 4 sata i 11 minuta na ST.

Imuno-označene sekcije postavljene su na objektna stakalca (VWR, Superfrost slides), sušene na zraku preko noći, umočene u Propar (Anatech) te prekrivene s pokrovnim stakalcima uz korištenje Permount (Fisher) kao sredstva za postavljanje.

Radi bojanja Aβ plakova, podskupina GFAP-pozitivnih sekcija postavljena je na Superfrost objektna stakalca te inkubirana vodenim 1% tioflavinom (Sigma) tijekom 7 minuta, nakon imunohistokemijeske obrade. Sekcije su zatim dehidrirane i čišćene u Proparu, te prekrivene pokrovnim stakalcima postavljenim pomoću Permounta.

8. Analiza slika

Za kvantifikaciju imunoreaktivnih dijapozitiva korišten je Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) povezan s Nikon Microphot-FX mikroskopom preko CCD video kamere i Sony Trinitron monitora. Prikaz sekcije pohranjen je u video puferu, a određen je ulaz baziran na boji i zasićenju radi odabiranja i računanja ukupnog područja pixela okupiranog s imuno-označenim strukturama. Za svaku sekciju, ručno je ocrtan hipokampus, te je izračunato ukupno područje pixela koje zauzima hipokampus. Postotak amiloidnih naslaga mjeren je kao: (dio hipokampalnog područja koje sadržava Aβ nakupine imunoreaktivne s mAb 3D6)×100. Slično, postotak neuritskih naslaga mjeri se kao: (dio hipokampalnog područja koje sadržava distrofične neurite reaktivne s monoklonalnim antitijelima 8E5)×100. C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) koji koristi Simple 32 Software Application program povezan je na Nikon Microphot-FX mikroskop preko Optronics kamere i korišten je za kvantificiranje postotka retrosplenialnog korteksa koji je okupiran s GFAP-pozitivnim astrocitima i MAC-1- i MAC-II-pozitivnim mikroglijama. Prikaz imunoreaktivne sekcije pohranjen je u video puferu, te je određen monokromni ulaz radi odabiranja i računanja ukupnog područja pixela okupiranog s imuno-označenim stanicama. Za svaku sekciju, ručno je ocrtan retrosplenialni korteks (RSC), te je izračunato ukupno područje pixela koje zauzima RSC. Postotak astrocitoze definiran je kao: (dio RSC zauzet s GFAP-reaktivnim astrocitima)×100. Slično je postotak mikroglijoze definiran kao: (dio RSC okupiran s MAC-1- ili MAC-II-neaktivnim mikroglijama)×100. Za sve analize slika, za svaku je životinju kvantificirano šest sekcija leđnog hipokampusa, svaka odvojena u intervalima od 240 μm u nizu. U svim je slučajevima status liječenja životinje bio nepoznat za istraživača.

XIV: Ex vivo skrining određivanje aktivnosti antitijela na amiloidne naslage

Poduzeto je ex vivo ispitivanje kod kojeg su primarne mikroglija stanice uzgojene s nefiksiranim kriostatskim sekcijama PDAPP miševa ili humanih AD mozgova, kako bi se istražio utjecaj antitijela na uklanjanje plaka. Mikroglija stanice dobivene su iz cerebralnih kora novorođenih DBA/2N miševa (1-3 dana). Kore su mehanički razgrađene u HBSS- (Hanks’ Balanced Salt Solution, Sigma) s 50 μg/ml DNaze I (Sigma). Disocirane stanice filtrirane su kroz 100 μm stanično sito (Falcon) i centrifugirane na 1000 okr./min. tijekom 5 minuta. Nakupine su ponovo suspendirane u mediju za uzgoj (visoka glukoza DMEM, 10%FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF), te je gustoća stanica iznosila 2 mozga po T-75 plastičnoj tikvici za kulture. Nakon 7-9 dana, tikvice su rotirane u orbitalnom mješaču na 200 okr./min. tijekom 2h pri 37°C. Suspenzija stanica centrifugirana je na 1000 okr./min. te ponovo suspendirana u mediju za ispitivanje.

10 μm kriostatske sekcije mozgova PDAPP miševa ili humanih AD mozgova (post-mortalni interval<3 sata) postavljene su na poli-lizinom presvučena okrugla pokrovna stakalca i smještene u jažice na ploče s 24 jažice za uzgoj kulture tkiva. Pokrovna stakalca isprana su dvaput s medijem za ispitivanje koji se sastoji od H-SFM ( Hybridoma-serum free medium, Gibco BRL) s 1% FBS, glutamina, penicilin/streptomicina, te 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Poredbena ili anti-Aβ antitijela dodavana su tijekom 1 sat u koncentraciji 2× (5 μg/ml konačna). Gustoća mikroglija stanica iznosila je 0,8× 106 stanica/ml medija za ispitivanje. Kulture se drže u vlažnom inkubatoru (37°C, 5%CO2) tijekom 24 h ili duže. Na kraju inkubacije, kulture se fiksiraju s 4% paraformaldehidu i permeabiliziraju s 0,1% Triton-X100. Sekcije se oboje s biotiniliranim 3D6, a nakon toga s streptavidin/Cy3 konjugatom (Jackson ImmunoResearch). Egzogene mikroglija stanice vizualiziraju se bojenjem jezgre (DAPI). Kulture se promatraju s invertnim fluorescentnim mikroskopom (Nikon, TE300), te su dobivene fotomikrografije pomoću SPOT digitalne kamere uz SPOT software (Diagnostic instruments). Za Weastern analizu mrlja, kulture se ekstrahiraju s 8M ureom, razrijede 1:1 u reducirajućem tricin uzorku pufera, te nanesu na 16% tricin gel (Novex). Nakon imobiliziranja, mrlje se izlažu 5 μg/ml pabAβ42, a zatim HRP-konjugiranim anti-mišjim antitijelima, te se razvijaju s ELC (Amersham).

Kada je ispitivanje provedeno s sekcijama PDAPP mozgova u prisutnosti antitijela 16C11 (jedno od antitijela na Aβ koje nije bilo učinkovito in vivo), β-amiloidni plakovi su ostali netaknuti, te nije uočena fagocitoze. Nasuprot tome, kada su kulture susjednih sekcija uzgojene u prisutnosti 10D5, amiloidne naslage su uglavnom nestale, te su mikroglija stanice pokazale brojne mjehuriće fagocita koji sadržavaju Aβ. Identični su rezultati dobiveni s AD sekcijama mozga; 10D5 pobuđivali su fagocitozu AD plakova, dok su 16C11 bila neučinkovita. Nadalje, ispitivanja su dala usporedive rezultate kada su provedena i s mišjim i s humanim mikroglija stanicama, te s mišjim, zečjim ili antitijelima primata na Aβ.

U Tablici 16 prikazani su rezultati s raznim antitijelima na Aβ, uz usporedbu njihove sposobnosti za pobuđivanje fagocitoze u ispitivanju ex vivo te za reduciranje in vivo naslaga plaka u studijama pasivnog transfera. Iako se 16C11 i 21F12 vežu na agregirani sintetski Aβ peptid velikim afinitetom, ta antitijela nisu u stanju reagirati s β-amiloidnim plakovima u nefiksiranim sekcijama mozga, te ne mogu inicirati fagocitozu u ex vivo ispitivanju i nisu učinkovita in vivo. 10D5, 3D6 i poliklonalna antitijela na Aβ aktivna su u sva tri mjerenja. 22C8 antitijela vežu se znatno jače na analogni oblik prirodnog Aβ kod kojeg je asparaginska kiselina na položajima 1 i 7 zamijenjena izoasparaginskom kiselinom. Ti rezultati pokazuju da je učinkovitost in vivo uzrokovana izravnim uklanjanjem plaka čime posreduju antitijela unutar CNS, te da se ex vivo ispitivanje može predvidjeti iz in vivo učinkovitosti.

Isto ispitivanje rabi se kako bi se ispitalo uklanjanje antitijela na fragment sinukleina koji se označava kao NAC. Pokazalo se da je sinuklein protein povezan s amiloidnim plakom. Antitijela na NAC dovodi se u kontakt s uzorkom mozgovnog tkiva koje sadržava amiloidne plakove, stanice mikroglija, kao što je prije navedeno. Zečji serum rabi se kao poredba. Daljnjim promatranjem uočeno je značajno smanjenje količine i veličine plaka indikativnog za uklanjanje antitijela.

Tablica 16 Ex vivo ispitivanje u službi određivanja in vivo učinkovitosti

[image]

Konfokalna mikroskopija rabi se kako bi se potvrdilo da se Aβ internalizira tijekom ex vivo ispitivanja. U prisustvu poredbenih antitijela, egzogene mikroglijalne stanice ostaju u konfokalnoj ravnini iznad tkiva, pri čemu nema fagosoma koji sadržavaju Aβ, a plakovi ostaju intaktni unutar sekcije. U prisustvu 10D5, gotovo sav materijal plaka sadržan je u vrećicama unutar egzogenih mikroglijalnih stanica. Kako bi se odredila sudbina internaliziranog peptida, 10D5 tretirane kulture ekstrahiraju se s 8M ureom u različitim vremenskim točkama, te se ispituju pomoću Western blot analize. Nakon jednog sata, dok se još nije pojavila fagocitoza, reakcija s poliklonalnim antitijelima na Aβ dala je jaku 4 kD vrpcu (koja odgovara Aβ peptidu). Aβ imunoreaktivnost smanjila se prvog dana, a trećeg dana nije je ni bilo. Stoga, fagocitoza Aβ kojom upravljaju antitijela dovodi do degradacije.

Kako bi se utvrdilo da li fagocitozom u ex vivo ispitivanju upravlja Fc, pripravljeni su F(ab’)2 fragmenti anti-Aβ antitijela 3D6. Iako F(ab’)2 fragmenti u cijelosti zadržavaju svoje sposobnost da reagiraju s plakovima, oni nisu u stanju inicirati fagocitozu pomoću mikroglija stanica. Nadalje, fagocitoza s cijelim antitijelom može biti blokirana pomoću reagensa na mišje Fc receptore (anti-CD16/32). Ti podaci ukazuju da se in vivo uklanjanje Aβ javlja preko Fc-receptora koji upravljaju fagocitozom.

XV: Prolazak antitijela kroz hemolikvornu barijeru

Eksperimenti opisani ovdje provedeni su kako bi se dobile informacije o sposobnosti antitijela za prolazak u mozak nakon intravenske injekcije, te radi osiguravanja sredstva za mjerenje koncentracije antitijela koja su ušla u mozak nakon intravenske injekcije dane u periferno tkivo kod normalnih kao i kod PDAPP miševa. Takva su mjerenja korisna kako bi se predvidjelo i odredilo učinkovito doziranje.

PDAPP ili kontrolni normalni miševi prožeti su s 0,9% NaCl. Moždane regije (hipokampus ili korteks) secirane su i brzo smrznute. Mozgovi su homogenizirani u 0,1% tritona i inhibitorima proteaze. Imunoglobulin u ekstraktima određen je pomoću ELISA testa. Fab’2 kozji anti-mišji IgG prevučen je na RIA ploču kao reagens za vezanje. Serum ili ekstrakti mozga inkubirani su tijekom 1 h. Izotipovi detektirani su s anti-mišjim IgG1-HRP ili IgG2a-HRP ili IgG2b-HRP (Caltag). Antitijela na izotipove bila su prisutna u CNS u koncentraciji koja je bila 1:1000 u odnosu na koncentraciju nađenu u krvi. Na primjer, kada je koncentracija IgG1 bila trostruko veća od IgG2a u krvi, bila je trostruko veća i od IgG2a u mozgu, a obje su bile prisutne kao 0,1% njihove razine u krvi. Ti su rezultati dobiveni i kod transgeničnih i kod ne-transgeničnih miševa - tako da PDAPP nemaju jedinstveno propusnu hemolikvornu barijeru.

Iako je prethodni izum detaljno opisan da bude jasan i razumljiv, očito je da se mogu primijeniti određene modifikacije unutar okvira patentnih zahtjeva. Pojedinačno su označene sve publikacije i patentna dokumentacija koja je ovdje u cijelosti citirana i ugrađena u obliku višenamjenskih referenci jednake važnosti.

Claims (57)

1. Farmaceutski pripravak, naznačen time da uključuje agens, koji učinkovito pobuđuje imunološku reakciju na amiloidnu komponentu kod pacijenta, te farmaceutski ekscipijens.

2. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 1, naznačen time da je amiloidna komponenta fibrilarni peptid il protein.

3. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 2, naznačen time da je amiloidna komponenta dobivena iz prekursora fibrilarnog proteina odabranog iz skupine koju sačinjavaju proteini ili peptidi u koje se ubrajaju serumski amiloidni A protein (ApoSSA), imunoglobulinski laki lanac, imunoglobulinski teški lanac, ApoAI, transtiretin, lizozim, lanac fibrogen α, gelsolin, cistatin C, prekursor amiloidnog β proteina (β-APP), Beta2 mikroglobulin, prekursor prionskog proteina (PrP), atrijski natriuretski faktor, keratin, amiloidni polipeptid iz otočića, peptidni hormon, te sinuklein; uključujući proteine mutante, fragmente proteina, te njihove proteolitičke peptide.

4. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 3, naznačen time da navedeni agens pobuđuje imunološku reakciju usmjerenu protiv neoepitopa, kojeg čine navedeni protein ili peptid, s obzirom na fibrilarni prekursor proteina.

5. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 3, naznačen time da je navedena amiloidna komponenta odabrana iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

6. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 5, naznačen time da je navedeni agens izabran iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

7. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 1, naznačen time da navedeni pripravak uključuje agens koji učinkovito pobuđuje imunogenu reakciju na barem dvije različite amiloidne komponente.

8. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 1, naznačen time da je navedeni agens peptid vezan na protein nosač.

9. Farmaceutski pripravak iz bilo kojeg od zahtjeva 1-8, naznačen time da navedeni pripravak uključuje pomoćno sredstvo.

10. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 9, naznačen time da je navedeno pomoćno sredstvo odabrano iz skupine koja se sastoji od QS21, monofosforil lipida, stipse, te Freundovog pomoćnog sredstva.

11. Postupak sprječavanja ili liječenja poremećaja kojeg karakteriziraju amiloidne naslage kod sisavaca, naznačen time da uključuje davanje subjektu doze agensa učinkovitog za izazivanje imunološke reakcije na amiloidnu komponentu karakterističnu za navedeni poremećaj.

12. Postupak iz zahtjeva 11, naznačen time da je navedena amiloidna komponenta fibrilarni protein ili peptid.

13. Postupak iz zahtjeva 12, naznačen time da je navedena imunološka reakcija usmjerena protiv fibrilarne komponente dobivene od prekursora proteina odabranog iz skupine koju sačinjavaju serumski amiloidni A protein (ApoSSA), imunoglobulinski laki lanac, imunoglobulinski teški lanac, ApoAI, transtiretin, lizozim, fibrogen α lanac, gelsolin, cistatin C, prekursor amiloidnog β proteina (β-APP), Beta2 mikroglobulin, prekursor prionskog proteina (PrP), atrijski natriuretski faktor, keratin, amiloidni polipeptid iz otočića, peptidni hormon, te sinuklein; uključujući proteine mutante, fragmente proteina, te njihove peptide.

14. Postupak iz zahtjeva 13, naznačen time da navedeni agens pobuđuje imunološku reakciju protiv neoepitopa, kojeg tvori navedena amiloidna komponenta, s obzirom na navedeni prekursor proteina.

15. Postupak iz zahtjeva 13, naznačen time da je navedena amiloidna komponenta odabrana iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

16. Postupak iz zahtjeva 15, naznačen time da je navedeni agens odabran iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

17. Postupak iz zahtjeva 11, naznačen time da navedeni agens učinkovito pobuđuje imunogenu reakciju na najmanje dvije različite amiloidne komponente.

18. Postupak iz zahtjeva 17, naznačen time da navedena primjena uključuje davanje najmanje dvije amiloidne fibrilarne komponente.

19. Postupak iz zahtjeva 11, naznačen time da je navedeni agens peptid vezan na protein nosač.

20. Postupak iz bilo kojeg od zahtjeva 11-19, naznačen time da navedena primjena uključuje pomoćno sredstvo.

21. Postupak iz zahtjeva 20, naznačen time da je navedeno pomoćno sredstvo odabrano iz skupine koja se sastoji od QS21, monofosforil lipida, stipse, te Freundovog pomoćnog sredstva.

22. Postupak iz zahtjeva 11, naznačen time da je navedena imunološka reakcija okarakterizirana titrom seruma od najmanje 1:1000 s obzirom na navedenu amiloidnu komponentu.

23. Postupak iz zahtjeva 22, naznačen time da je navedeni titar seruma najmanje 1:5000 s obzirom na navedenu fibrilarnu komponentu.

24. Postupak iz zahtjeva 11, naznačen time da je navedena imunološka reakcija okarakterizirana količinom imunoreaktivnosti u serumu koja je četiri puta veća od razine imunoreaktivnosti seruma mjerene u kontrolnom uzorku seruma prije liječenja.

25. Postupak iz zahtjeva 24, naznačen time da je količina imunoreaktivnost seruma mjerena pri razrjeđenju seruma od približno 1:100.

26. Postupak za određivanje prognoze za pacijenta koji je podvrgnut liječenju amiloidnog poremećaja, naznačen time da uključuje mjerenje količine imunoreaktivnosti na odabranu amiloidnu komponentu u serumu pacijenta, gdje količina imunoreaktivnosti u serumu pacijenta, koja je barem četiri puta veća od bazne linije kontrolne razine imunoreaktivnosti seruma, upućuje na prognozu poboljšanja statusa s obzirom na navedeni poremećaj.

27. Postupak iz zahtjeva 26, naznačen time da je količina imunoreaktivnosti seruma pacijenta na navedenu odabranu amiloidnu komponentu okarakterizirana titrom seruma od najmanje 1:1000.

28. Postupak iz zahtjeva 27, naznačen time da je količina imunoreaktivnosti seruma pacijenta na navedenu odabranu amiloidnu komponentu okarakterizirana titrom seruma od najmanje 1:5000.

29. Postupak sprječavanja ili liječenja bolesti okarakterizirane amiloidnim naslagama kod pacijenta, naznačen time da uključuje davanje spomenutom pacijentu učinkovite doze antitijela ili fragmenta antitijela koja specifično vežu amiloidnu komponentu prisutnu u navedenoj naslazi.

30. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da je navedena amiloidna komponenta fibrilarna komponenta.

31. Postupak iz zahtjeva 30, naznačen time da se navedena antitijela ili fragmenti antitijela vežu na epitop navedene fibrilarne komponente.

32. Postupak iz zahtjeva 31, naznačen time da se antitijela ili fragmenti antitijela specifično vežu na navedenu fibrilarnu komponentu bez vezanja na prekursor navedene fibrilarne komponente.

33. Postupak iz zahtjeva 30, naznačen time da su antitijela humana antitijela na navedenu fibrilarnu komponentu, pripravljena iz B stanica ljudi imuniziranih s epitopom fibrilarne komponente.

34. Postupak iz zahtjeva 30, naznačen time da je navedena fibrilarna komponenta dobivena od prekursora proteina odabranog iz skupine koju sačinjavaju serumski amiloidni A protein (ApoSSA), imunoglobulinski laki lanac, imunoglobulinski teški lanac, ApoAI, transtiretin, lizozim, fibrogen α lanac, gelsolin, cistatin C, prekursor amiloidnog β proteina (β-APP), Beta2 mikroglobulin, prekursor prionskog proteina (PrP), atrijski natriuretski faktor, keratin, amiloidni polipeptid iz otočića, peptidni hormon, te sinuklein; uključujući mutantne proteine, fragmente proteina, te njihove peptide.

35. Postupak iz zahtjeva 34, naznačen time da je navedena amiloidna fibrilna komponenta odabrana iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

36. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da navedena primjena uključuje davanje antitijela koja vežu najmanje dvije amiloidne fibrilarne komponente.

37. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da je učinkovito doziranje okarakterizirano razinom imunoreaktivnosti na navedenu amiloidnu komponentu u serumu pacijenta, koja je približno četiri puta veća od razine imunoreaktivnosti seruma na navedenu komponentu, mjerenu u kontrolnom uzorku seruma prije liječenja.

38. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da se antitijela ili fragmenti antitijela daju s nosačem kao farmaceutski pripravak.

39. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da se antitijela ili fragmenti antitijela daju intraperitonealno, oralno, subkutano, intramuskularno, intranazalno, lokalno ili intravenski.

40. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da se antitijela primjenjuju davanjem polinukleotida koji kodira barem jedan lanac antitijela pacijentu, te gdje dolazi do ekspresije polinukleotida radi produkcije lanca antitijela u pacijentu.

41. Postupak iz zahtjeva 40, naznačen time da polinukleotid kodira teški i laki lanac antitijela, gdje dolazi do ekspresije polinukleotida radi produkcije teškog i lakog lanca u pacijentu.

42. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da se antitijela ili fragmenti antitijela daju u višestrukim dozama tijekom perioda od najmanje šest mjeseci.

43. Postupak iz zahtjeva 29, naznačen time da se antitijela daju u pripravku s postupnim otpuštanjem.

44. Farmaceutski pripravak za sprječavanje ili liječenje bolesti okarakterizirane amiloidnim naslagama kod pacijenta, naznačen time da uključuje učinkovito doziranje antitijela ili fragmenta antitijela koja se specifično vežu na amiloidnu komponentu prisutnu u navedenoj naslazi.

45. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da je navedena amiloidna komponenta fibrilarna komponenta.

46. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 45, naznačen time da se navedena antitijela vežu na epitop navedene fibrilarne komponente.

47. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 46, naznačen time da se antitijela specifično vežu na navedenu fibrilarnu komponentu bez vezanja na prekursor navedene fibrilarne komponente.

48. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 46, naznačen time da su antitijela humana antitijela na navedenu fibrilarnu komponentu, te su pripravljena iz B stanica ljudi imuniziranih s epitopom fibrilarne komponente.

49. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 45, naznačen time da je navedena amiloidna fibrilarna komponenta dobivena od prekursora proteina odabranog iz skupine koju sačinjavaju amiloidni A protein iz seruma (ApoSSA), imunoglobulinski laki lanac, imunoglobulinski teški lanac, ApoAI, transtiretin, lizozim, fibrogen α lanac, gelsolin, cistatin C, prekursor amiloidnog β proteina (β-APP), Beta2 mikroglobulin, prekursor prionskog proteina (PrP), atrijski natriuretski faktor, keratin, amiloidni polipeptid iz otočića, peptidni hormon, te sinuklein; uključujući mutantne proteine, fragmente proteina, te njihove peptide.

50. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 49, naznačen time da je navedena amiloidna fibrilarna komponenta odabrana iz skupine koja se sastoji od AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP, te sinukleinskog-NAC fragmenta.

51. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da navedeni pripravak uključuje antitijela ili fragmente antitijela koji vežu najmanje dvije amiloidne fibrilarne komponente.

52. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da je učinkovito doziranje okarakterizirano količinom antitijela ili fragmenta antitijela koji učinkovito proizvode količinu imunoreaktivnosti na navedenu amiloidnu komponentu u serumu pacijenta, koja je barem približno četiri puta veća od razine imunoreaktivnosti seruma na navedenu komponentu, mjerene u kontrolnom uzorku seruma prije liječenja.

53. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da farmaceutski pripravak uključuje nosač.

54. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da je farmaceutski pripravak oblikovan za intraperitonealno, oralno, subkutano, intramuskularno, intranazalno, lokalno ili intravensko davanje.

55. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da farmaceutski pripravak uključuje polinukleotid koji kodira barem jedan lanac antitijela učinkovit za ekspresiju lanca antitijela u pacijentu.

56. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 55, naznačen time da polinukleotid kodira teški i laki lanac antitijela, te da polinukleotid ima sposobnost ekspresije za produkciju teškog i lakog lanca u pacijentu.

57. Farmaceutski pripravak iz zahtjeva 44, naznačen time da je navedeni farmaceutski pripravak oblikovan kao pripravak s postupnim otpuštanjem.