SK17182001A3 - Farmaceutický prostriedok, spôsoby prevencie a prognózy - Google Patents

Description

Farmaceutický prostriedok na liečbu amyloidných stavov

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka prostriedkov a spôsobov na liečbu amyloidných stavov u ľudí a stavovcov.

Doterajší stav techniky

Amyloidóza je všeobecný termín, ktorý zahŕňa množstvo chorôb, ktoré sú charakterizované extracelulárnym ukladaním proteínových vlákien, ktoré tvoria početné amyloidné plaky, ktoré sa môžu objaviť lokálne alebo systemicky. Vláknitá stavba týchto plakov je pre rôzne formy amyloidných ochorení určujúcou charakteristikou. Napríklad intracerebrálne a cerebrovaskulárne plaky zložené prevažne z vlákien β amyloidného peptidu (β-ΑΡ) sú charakteristikou Alzheimerovej choroby (ako familiálna tak občasná forma), vlákna ostrovčekového amyloidného polypeptidového proteinu (IAPP amylín) sú charakteristické pre plaky v bunkách pankreatických ostrovčekov spojených s diabetes typu II a B₂-mikroglobulín je hlavnou zložkou amyloidných plakov, ktoré sa tvoria v dôsledku dlhodobej liečby hemodialýzou. Nedávno boli ako amyloidné ochorenia uznané tiež choroby spojené s priónmi, napríklad Creutzfeld-Jacobova choroba.

Jednotlivé formy choroby sa delia do skupín, väčšinou na základe toho, či amyloidóza je alebo nie je spojená so systemickým ochorením. To znamená, že za primárne sa považujú amyloidózy, u ktorých nie je dôkaz o predchádzajúcej alebo spoluexistujúcej chorobe. Vo všeobecnosti sú primárne amyloidózy charakteristické prítomnosťou proteínových vlákien typu AL (amyloidné ľahké reťazce), takto pomenovaných kvôli homológii N-koncovej oblasti AL vlákna s variabilným úsekom ľahkého retazca imunoglobulínu (kappa alebo lambda).

Sekundárna alebo reaktívna amyloidóza je charakterizovaná ukladaním vlákien AA typu odvodených od sérového amyloidného A proteinu (ApoSSA). Tieto formy amyloidózy sú charakterizované predchádzajúcim výskytom chronického zápalového alebo reumatická artritída, môžu byť sprevádzané kardiovaskulárnymi plakmi infekčného stavu (napríklad osteomyelitída, tuberkulóza, lepra).

Heredofamiliálne amyloidózy neuropatickými, obličkovými alebo

ATTR transtyretinového typu. Iné heredofamiliálne amyloidózy zahŕňajú iné syndrómy a môžu mať odlišné amyloidné zložky (napríklad familiálna stredozemná horúčka, ktorá je charakteristická AA vláknami). Iné formy amyloidózy zahŕňajú lokálne formy, ktoré sú charakteristické ohniskovými ložiskami a často usadeninami rakovinového typu, ktoré sa objavujú v izolovaných génoch. Iné amyloidózy sú spojené so starnutím a sú vo všeobecnosti charakterizované tvorbou plakov v srdci a mozgu. Časté sú tiež amyloidné plaky spojené s dlhotrvajúcou hemodialýzou. Tieto a iné formy amyloidných ochorení sú zhrnuté v tabuľke 1. (Tan, S. Y. and Pepys, Histopathology 25: 403 - 414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicíne, 13^th

Ed. Isselbalcher, K. Francisco, 1995) .

Často sa stáva,

J., a kol., eds., McGraw-Hill, San že vlákna tvoriace amyloidný plak sú odvodené z viacerých prekurzorových proteínov a sú obvykle spojené so sulfátovými glykozaminoglykánmi. Amyloidné plaky môžu obsahovať aj minoritné proteíny a peptidy rôznych typov, spolu s inými zložkami, ako napríklad s proteoglykánmi, gangliozidmi a inými cukrami, čo je podrobnejšie opísané v nasledujúcej časti.

V súčasnosti neexistujú špecifické spôsoby liečby pre žiadne z amyloidných ochorení. V prípadoch, kde sa súčasne vyskytuje aj sprievodné ochorenie, sa zníženie tvorby amyloidného proteínu dosahuje pomocou liečby sprievodného ochorenia. Typickým príkladom môže byť liečba tuberkulózy antibiotikami, čím sa znižuje množstvo mykobaktérií, čo vedie k zmenšeniu zápalu a tým k zníženiu hladiny SSA proteínu. V prípade AL amyloidu spôsobeného mnohonásobným výskytom myelómu, vedie chemoterapia k zníženiu množstva plazmatických buniek a tým aj k zníženiu hladiny myelómových imunoglobulínov. S poklesom ich hladiny môže zmiznúť aj AL

ω

O

(ti

•K

C

'(Ú

'(ti

tn

-1—1

d

d

>1

l-l

(ti C

44

g

P

o

'(0

44 tj

1

U

oj

(ti

'to

'(ti

H

n]

TJ

>υ ·η

Φ

•rl

C

P

g

d

g

•n

c

'd o

r~l

g

φ

O

•H

φ

O 'φ

Φ

p

P r-l

44

g

Φ

•ri

P

P

•o

P d

M

44

0 >1

(0

U

Ό

-P

O

o

A

O

Φ -rl

A

Φ

x: g

P

tn

A

X!

A

r—1 i—1

W

(0

P

S

Ό

>1

tn

H

U

tn

<ti d

'Φ

—

•.

'<ti

O

C

tn

g

'(ti

P

44

> rO

C (ti to

44

>>

os

'>1

•H

44

to

g o

0

Φ

N C

g C -H

>

d

ω

(0

N

44

g

υ

N

0 r-l

•H

c

Ό ι—i

Φ r-1 -P

(ti

0

d

Ό

υ

>1

•r|

Ό

g CP

C

>

X) 'rt

N '(0 (0

r“H

P

>

>

T)

•H

>

4-1

TJ

Ό O

•H

'rl

•H -H

o -h a

P

0

o

Ή

-rl

g

O

(ti

H

i—1 P

H

4-)

O rH

Ό r-| O

•H

x:

tn

4-1

o

Φ

rH

A

o

Φ 44

S

44

»—1 Ή

Φ -H M

>N

υ

1—{

44

i—1

4-1

fO

o

r—1

>1 (ti

(ti

>i e

P g P

d

r~H

fO

>1

tn

A

•H

>1

g g

Φ

e φ

-P (0 Φ

O

r~H

Φ

Φ

g

>1

'(ti

Ό

g

P

(0 Uj

W h C

ω

p

s

P

(ti

tn

N

•rl

(ti

tn tn

systemická amyloidóza n>

H

P s

H »rl

C (D

M

O

Λ

O

O

X!

υ '>1 c

Ό •rl

O

Klasifikácia p

c

Ή

Φ

P

O

M (Í

C

Λ •rl

M

O

M			- λ
0			to φ
N			A d
M	x—.	X	A r-l
d			(ti '(ti
44	'>i ω	'>1 W	44 d
Φ	d cn	d ω	— O
P	TJ o	TJ o	r-l	d
A	-r| (O,	•rl d	Φ 44	d
O <	O <	υ o	Ή
'r*1	r“H	(“i	N C	i-H
>	>1		(0 o	d
0	g d	g d	p g	P
C	(ti Ή	rti Ή	Φ	o
	Φ	Φ	P —	f-H
Φ	'>1 P	'> P	(ti	en
-P	> O	> 0	'φ TI	o
0	O P	O P	44 P	d
M	P A	P A	X! g	d
A	'Φ	'Φ	(ti (ti	g
	ω <	ω <	Γ—( r—J	•rd

S g

i >

dyskrazia; monokloná na gamopatia; skrytá dyskrazia; lokálna

H

0

05

tí

-H

x

'05

'05

'03

N

e

>Ί

C

C

C

Ό

X

(0

o

U

X

-

X

'05

X

Ό

U

X)

x

O

•H

o

•H

tí

•H

•H

H

o

oj

tí

0

co

0

<—1

O

O

C

5-1

X

'05

tí

t—1

f-1

•H

rH

t—1

O

O

>N

tí

g

>1

05

x

>,

o5

tí

>1

05

>1

L

X

05

φ

•H

g

•H

φ

g

•H

Φ

g

•H

e

X

o

X

•I—i -H

03

X

S —

oi

X

tn

05

tí

03

O

O g

-H

0!

'05

03

03

•H

05

a &

g

0!

a x x

05

a

'05

Π3

03

a

(Ú

to

g

N

en x

01

tí

o

05 W

tí

0

X

N

C

o

c

Ό

r—|

•tí

1“1

5-1

1—1 ·—1

r—1

>,

o

Ό

<—1

L

(q

'(ú

>

X

03 O

N

'(TJ

tí

x oj

'(TJ

g

05

•H

X

'(0

tí

'<ΰ

tí

o

•H

O X

05

•H

(U

Ή tP

•H

o

X

g

•H

•H

tu

r—i

0)

i—1

0

n φ

tí

i—1

tí

5-1 tí

rH

•H

tn

Φ

0

i—1

tí

3

•m

(Ú

i—H

fO Ή

λ;

H

a x

•H

x

tí

x

i—1

H

>1

Ό

O

a

>1 X tí

tn

g

i—1

0) 5-1

g

5-1

'05

tn

>1

g

H

0

a

'03

g

o

>1

05

0

tí O

05

05

X

>1

g

(0

o

é

tn

N

(0

M tn

X

X

a

— a

x

X

—

tn

05

x

a

x
o
>1	i—1
g 'tí	Γ—1
'fO Ή	tH
tí o		et
N '05	x	Eh CM
X	Φ	E-ι CM
O tí	S	iH
m g		a
	X	>1 Φ
i—i X	0)	X i—1
Φ U	i—1	H
tí >1	X	'>1
Φ >	Ή	X O	CM
g o	tí	O X
m X	a	> Φ	tP
05 O	05	•tí X	tí
tí X	tí	X o)

	(Z Eh Eh	Pd Eh Eh	cd Eh Eh
	tí	tí	tí
	Ή	Ή	Ή
	x	x	x
f j	Φ	Φ	Φ
	tí	tí	tí
	>	>1	>1
H	X	x	X
—	tn	tn	tn	M
	tí	C	tí
o	03	Π3	03	o
Cn	tí	tí	tí	a
M	X	x	x

od	od	od	H O
Eh	Eh	Eh	a
H	Eh	Eh	0)
		<	<

Agel gelsolin Arg 187 familiálna amyloidóza (fínska) s amyloidózou (islandská)

Φ

<ϋ

φ

β

β

n

Ν

Η

Ο

φ

o

<0

Ό

φ

X

Φ

X

g

>

β

β

Ό

β

Φ

Ό

υ

Ό

'Φ

Ο Ό

o

'—1

•Η

ι—1

a

X

X

β

β

'—1 Ή

x

ο

'φ

ο

4->

β

•Η

ι—1

ο ο

u

g

β

ι—1

β

Η

•Η

Ο

u

Ή

N r-Η

Ό

Λ

XI

θ'

Ν

β

β >1

β

Η >

Φ

Hl

Φ

g

Φ

β

0

X

β

Φ Ν

φ

g

>

Ό

β

φ

—-

β

Φ

υ

0

X φ

φ

·» φ

o

C

Φ

'Φ

Φ

g

Ν

PH

>1

β

>1

υ

φ

X

υ

'Φ

φ

'>

>ι >Ν

'φ

Ν >ι

O

Φ

β

φ

β

>φ

1-1

β

>

'0 β

g

'Φ

θ'

Ό

'Φ

Ό

>

>>ι

(ϋ

β -π

Ο

Ό X

•H

>

β

'φ

β

β

•β

Ο

β

•rd

'Φ Φ

X

Η 'Φ

ω

O

>ο

β

Φ

ω

0

ι—1

φ

Ό

<-4 β

φ

Ο X

θ'

x

C

•Η

ο

ι—1

φ

ι—I

Φ

ΓΊ

Ο

β X

•Η

>—1 β

ο

N

S

Ό

β

ο

>υ

>1

a

Ο

g

Ό X

β

>ι X

Ν

r—|

o

Φ

φ

X

χ

g

'φ

Λ

Φ

Φ X

X

g β

ο

Q

Ό

χ:

ο

Φ

Ν

φ

X

g >Φ

0

Φ Φ

g

d

00	Ή
τ—4	β
CO	Ο X
β	•Η
ι—1	υ
Ο	ι—1 Φ
..	X
Φ
β	Ο
Ν	β
<ο	(X
β

β			β	β
Ή <—*			ο	X
ω S			X	φ
x S			X	X
Ο a	£		φ	ο
β ιχ	Ή	β	X	β
α <	r-1	χ		a
I	£	β	'>1
'>1 X	Λ	Ο	X	Ί>ί
'> >	ο	X	υ	'> >
β Ο Ό	γΉ	X	χ	β ο
Ό β Φ		υ	>ι X	Ό β
•Η Ο Ή	ο	ι—1	β Φ	X Ο
Ο N X		Φ	ι—1 β	Ο Ν
<—1 β X		X	'Φ β	X β
>1 β β	•Η		X X	>1 β
g x a	g	ο	β β	g χ
φ φ φ	Γ—I I	β	χ χ	Φ Φ
β β	CM	a	β Φ	β
χ a	X	—-	Φ β	x a

CN (0 u

SVEP^a fi₂-mikroglobulin semenné vačky

Αβ₂Μ prostata

Keratin primárne lokalizovaný kožný amyloid (makulárny, papulárny) (Ú

I N

Ό Ό W

I-i										n	(0
o	(0				>1			1—1		•H	g
m	Λ				X)			M		o	0
N	O	'(0		• v	o					i-1	Q
4-1	G	X)		(0	Cl	Φ		G		>1	G>
d	O	W	'(0	•H	O	>		cm		β	CM
Φ	XI	o	C	4-)	X!	O		£		(0
M	O	G	g	(0	O	W	>Ί	4-1
u		ω	G	CM		G	,χ		g	'(0	W
	(0	G	O	O	'Φ	<0	Φ	w	Ό	G
	>	CM	M-l	i—1	>	XI	>u	Φ	G	G	'(0
C	O		•H	(0	0	G	>	4-1	•H	•H	G
w	X)		(T	M-l	G	Φ	O	Φ	r—1	G	Φ
(0	o	0	C	Φ	Ό	tn	G	XI	G	x	•ΓΊ
>o	o	>4	O	O	•H	C	4-i	(0	N	o	O
Λ	(0		CM	C	Ci	(0	cn	•H	C	x	CM
O	E)		ω	Φ	CM	XI	0	Ό	•H	Φ	ω

>1 ,x

>
(0	(0
cn	Q
G	x
i-J
X	o
	m
G
	>N
Φ	tO
4->
O	r-
G	CM
CM
'>,	ÍÚ	G
>	Q	Ό
O	x	•H
G		0
O	m	c—1 -
N	co	>i CM
G		g CM
G	>N —x	(tí <
X	(0 10	1—1
Φ	e
G	CO Í-I	>
CM	CO O	O Ό
	m	X -H
'>1		Φ 4-1
>	G '(tí	>U CM
0	Ή >	> Φ
G	Φ O	O CM
Ό	4-i x	G S
H	0 G	•P iH
G	G G	W o
CM	CM XI	O CM

cm

G

CM

CM

CM

M

	G	G
	Ή	Ή
	G	Φ
	O	4->
Ό	4-1	0
ctí	H	G
i—1	0	CM
x	i—1
Ή	(0
G	X	G
CM	Φ	G
(0	G	•H
G	CM	G
K		x o x Φ '>1 >
>1		O
G		X
Ό		>o
E		(0
G		>
O x:
'Φ		G l—l
>	4-1	'fÚ
o	G	£
Ό	Φ	•r4
•H	β	g
-P	tj*	Φ
CM	10	ω
Φ	G
CM	M-l	«3

amyloid. Prihlášky patentov US, USSN 09/201 430, podaný 30. novembra 1998 a USSN 09/322 289, podaný 28. mája 1999, odhaľujú, že zaťaženie amyloidným plakom spojené s Alzheimerovou chorobou môže byť výrazne znížené (a môže sa mu predísť) podávaním látok, ktoré vyvolávajú imunitnú odpoveď zameranú na β-amyloidný peptid (Αβ) a jeho fragmenty. Objavom predkladaného vynálezu je to, že indukcia imunitnej odpovede pre rôzne zložky amyloidných plakov je účinná pri liečbe širokého rozsahu amyloidných chorôb.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je zameraný na farmaceutické prostriedky a spôsoby na liečbu množstva amyloidných ochorení. Podľa jedného hladiska zahŕňa vynález farmaceutické prostriedky, ktoré ako účinnú zložku obsahujú látku, ktorá je schopná vyvolať imunitnú odpoveď voči amyloidnej zložke v pacientovi. V takýchto prostriedkoch sa budú spravidla nachádzať tiež pomocné látky a v navrhovanom uskutočnení môžu obsahovať adjuvanty. V ďalej navrhovaných uskutočneniach zahŕňajú adjuvans napríklad hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, MPL™, QS-21 (Stimulon™) alebo Freundov nekompletný adjuvans. V navrhovanom uskutočnení môžu takéto farmaceutické prostriedky obsahovať množstvo látok schopných vyvolať v pacientovi imunitnú odpoveď voči viac ako jednej amyloidnej zložke.

V opisovanom uskutočnení je látka schopná vyvolať imunitnú odpoveď zameranú proti vláknitej peptidovej alebo proteínovej amyloidnej zložke. Takýto vláknitý peptid alebo proteín je pokial možno odvodený od vláknitého prekurzorového proteínu, o ktorom je známe, že je spojený s určitými formami amyloidných ochorení, ako je tu opísané. Takéto prekurzorové proteíny zahŕňajú okrem iných tiež sérový amyloidný proteín A (ApoSSA), lahký reťazec imunoglobulínu, ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrinogénu, gelsolin, cystatin C, β amyloidný prekurzorový proteín (β-ΑΡΡ), L₂-mikroglobulín, priónový prekurzorový proteín (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratin, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín), peptidové hormóny a synukleín. Tieto prekurzory zahŕňajú tiež mutantné proteíny, fragmenty a peptidy vzniknuté po proteolýze týchto prekurzorov. V opisovanom uskutočnení je látka schopná vyvolať imunitnú odpoveď zameranú voči neoepitopu tvorenému vláknitým proteínom alebo peptidom, a to vzhľadom na vláknitý prekurzorový proteín. To znamená, že veľa peptidov alebo proteínov tvoriacich vlákna sú fragmenty týchto prekurzorových proteínov, napríklad tých, ktoré sú uvedené vyššie. Pri tvorbe týchto fragmentov, napríklad proteolytickým štepením, môžu byť odhalené epitopy, ktoré na prekurzorovej molekule neboli, z čoho vyplýva, že pokial je fragment časťou prekurzorového proteínu, nie je prístupný imunitnému systému. Látkami zameranými na takéto epitopy môžu byť opisované terapeutické látky, pretože je menej pravdepodobné, že u pacienta vyvolajú autoimunitnú odpoveď.

V opisovanom uskutočnení zahŕňajú farmaceutické prostriedky podlá vynálezu látky zamerané na amyloidné zložky, medzi ktoré patria nielen nasledujúce vláknité peptidy alebo proteíny: AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, Ascr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC. Celé názvy a zloženie týchto peptidov sú tu opísané. V odbore sú dobre známe aj spôsoby prípravy takýchto peptidov, čo je tu opísané.

V ďalej opisovanom uskutočnení zahŕňajú látky, ktoré sa nachádzajú v takomto farmaceutickom prostriedku, tiež určité sulfatované proteoglykány. V opisovanom uskutočnení je proteoglykán heparín sulfát glykozaminoglykán, najlepšie perlecan, dermatan sulfát, chondroitín-4-sulfát alebo pentozan polysulfát.

V súlade s ďalším opisovaným hľadiskom zahŕňa vynález spôsob prevencie alebo liečby poruchy charakterizovanej amyloidným plakom u cicavčieho subjektu. V súlade s touto časťou vynálezu sa subjektu podáva účinná látka v dávke schopnej vyvolať imunitnú odpoveď proti amyloidnej zložke charakteristickej pre amyloidnú poruchu, ktorej subjekt trpí. Spôsoby v podstate zahŕňajú podávanie farmaceutických prostriedkov s obsahom imunogénnej amyloidnej zložky (viď.

predloženého imunologickej vyššie), špecifickej pre konkrétnu poruchu. Takéto spôsoby sú ďalej charakterizované svojou účinnosťou vo vyvolaní imunogénnej odpovede u subjektu. Podľa uskutočnenia je spôsob účinný vo vyvolaní odpovede, ktorá je charakterizovaná sérovým titrom najmenej 1 : 1000 (podľa amyloidnej zložky, na ktorú je imunogénna látka zameraná). Podľa ďalej opisovaného uskutočnenia je, v závislosti na vláknitej zložke, sérový titer najmenej 1 :

5000. Podľa opisovaného uskutočnenia je imunitná odpoveď charakterizovaná množstvom sérovej imunoreaktivity, ktorá zodpovedá viac ako štvornásobnej hladine sérovej imunoreaktivity nameranej u kontrolnej vzorky séra pred začiatkom liečby. Naposledy uvedená charakteristika je vhodná najmä v prípade, keď je sérová imunoreaktivita meraná technikou ELISA, pričom sa ale môže použiť na akékoľvek relatívne alebo absolútne meranie sérovej imunoreaktivity. Podľa predloženého uskutočnenia sa imunoreaktivita meria u séra riedeného 1 : 100.

Podľa ďalej opisovaného hľadiska zahŕňa vynález spôsob na určenie prognózy u pacienta, ktorý sa podrobuje liečbe amyloidnej poruchy. V tomto prípade sa u pacienta meria množstvo sérovej imunoreaktivity proti amyloidnej zložke charakteristickej pre konkrétnu poruchu, pričom množstvo sérovej imunoreaktivity najmenej štyrikrát väčšie ako kontrolná bazálna hodnota indikuje prognózu zlepšenia (podľa konkrétnej amyloidnej poruchy). Podľa predložených uskutočnení je množstvo imunoreaktivity proti vybranej amyloidnej zložke, prítomnej v pacientovom sére charakteristickej sérovým titrom najmenej okolo 1 : 1000 alebo najmenej 1 : 5000 (podľa amyloidnej zložky).

Podľa opisovaného hľadiska zahŕňa vynález tiež tzv. pasívnu imunizáciu, t.j. spôsoby a farmaceutické prostriedky na prevenciu alebo liečbu amyloidných ochorení. Podľa tohto hľadiska vynálezu sa pacientom podáva účinné množstvo protilátky, ktorá sa špecificky viaže na vybranú amyloidnú zložku, prednostne však na vláknitú časť prítomnú v amyloidných plakoch charakteristických pre liečenú chorobu. Tieto protilátky sa vyberajú kvôli ich schopnosti špecificky sa viazať na rôzne proteíny, peptidy a zložky opisované v súvislosti s farmaceutickými prostriedkami a spôsobmi opísanými v predchádzajúcich odsekoch tejto časti. Podľa opisovaného uskutočnenia môžu takéto spôsoby a prostriedky obsahovať kombinácie protilátok, ktoré viažu najmenej dve amyloidné vláknité zložky. Vo všeobecnosti sú tieto farmaceutické prostriedky podávané na zvýšenie množstva sérovej imunoreaktivity proti cieľovej amyloidnej zložke, pričom toto zvýšenie je v porovnaní so sérovým množstvom imunoreaktivity v kontrolnej vzorke séra najmenej štvornásobné. Protilátky sa môžu tiež aplikovať s nosičom, čo je tu opísané. Vo všeobecnosti sú takéto protilátky, v súlade s týmto vynálezom, podávané (alebo pripravované na podanie) peritoneálne, orálnou cestou, intranazálne, subkutánne, intramuskulárne, lokálne alebo intravenózne, pričom však môžu byť podávané (alebo pripravované na podanie) akoukoľvek farmaceutický účinnou cestou (t.j. schopnou zabezpečiť zadané terapeutické hladiny, ktoré sú určené vyššie).

Podľa opisovaného uskutočnenia môžu byť pacientovi terapeutické protilátky aplikované podaním polynukleotidu, ktorý kóduje najmenej jeden reťazec protilátky. V súlade s týmto hladiskom vynálezu je v pacientovi polynukleotid exprimovaný s výsledkom, ktorý predstavuje vznik reťazca protilátky v účinnom množstve. Takýto polynukleotid môže kódovať ťažký a lahký reťazec alebo reťazce protilátky, a tým umožniť ich expresiu v pacientovi.

Podľa predložených uskutočnení môžu vyššie opísané imunizačné režimy zahŕňať viacnásobné podávanie látok, ktoré zahŕňajú protilátky. Podania sa takto môžu opakovať napríklad počas šesťmesačného obdobia s tým, že počiatočná imunizácia je v časových intervaloch (napríklad 6 týždňov) nasledovaná posilňovacími injekciami, čo je v odbore dobre známy spôsob, pričom časové intervaly sa môžu upraviť podľa pacientovej potreby (kritériom je dosiahnutá imunologická odpoveď). Alternatívnou alebo aj doplnkovou cestou môžu byť režimy, ktoré zahŕňajú použitie prostriedkov s postupným uvoľňovaním účinnej látky, čo je v odbore známy spôsob.

Tieto a ostatné predmety a znaky vynálezu budú viac zrejmé, ak sa bude čítať aj detailný opis vynálezu v spojení so sprievodnými výkresmi.

A. Definície

Pokiaľ nie je uvedené inak, majú byť všetky tu použité termíny chápané tak, ako by im rozumel odborník kvalifikovaný v odbore predkladaného vynálezu. Odborníci sú pre definície, termíny a štandardné spôsoby v odbore biochémie a molekulárnej biológie odkazovaní najmä na Sambrook, a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. a Ausubel, F. M., a kol. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Je zrejmé, že tento vynález nie je obmedzený konkrétnou metodológiou, protokolmi a opisovanými reakčnými činidlami, keďže tieto sa môžu na dosiahnutie rovnakého výsledku rôzne meniť.

Termín adjuvans opisuje látku, ktorá pri podaní v spojení s antigénom zvyšuje imunitnú odpoveď voči antigénu, ak je však podaná samotná, tak žiadnu imunitnú odpoveď voči antigénu nevytvára. Adjuvanty môžu zosilňovať imunitnú odpoveď spôsobmi, medzi ktoré patrí posilnenie tvorby leukocytov, stimulácia B alebo T-buniek (alebo obidvoch súčasne) a stimulácia makrofágov.

Amyloidnou chorobou alebo amyloidózou sa myslí množstvo porúch, ktoré ako symptóm alebo ako časť svojej patológie majú hromadenie alebo tvorbu amyloidných plakov.

Amyloidný plak je extracelulárna usadenina zložená hlavne z proteínových vlákien. Vo všeobecnosti sú vlákna tvorené jedným prevládajúcim proteínom alebo peptidom. Plaky však môžu byť zložené aj z ďalších peptidových alebo nepeptidových zložiek, čo je tu opísané.

Amyloidnou zložkou je akákoľvek molekula, ktorá sa nachádza v amyloidnom plaku s obsahom antigénnej časti takejto molekuly. Amyloidné zložky zahŕňajú okrem iného proteíny, peptidy, proteoglykány a uhľovodíky. Špecifickou amyloidnou zložkou je myslená molekula, ktorá sa nachádza najmä alebo len v určitom amyloidnom plaku.

Činidlo je chemická molekula syntetického alebo biologického pôvodu. V kontexte predkladaného vynálezu je činidlo najmä molekula, ktorá sa môže použiť vo farmaceutickom prostriedku.

Protiamyloidné činidlo je činidlo, ktoré je u stavovcov v prípade podania technikami pasívnej alebo aktívnej imunizácie schopné vytvárať imunitnú odpoveď proti zložke amyloidného plaku.

Termínom polynukleotid a nukleová kyselina, ktoré sa tu striedavo používajú, sa myslí polymerická molekula s kostrou nesúcou bázy schopné viazať sa vodíkovými väzbami špecificky s inými polynukleotidmi, pričom polymerická kostra predkladá bázy spôsobom, ktorý umožňuje takéto sekvenčne špecifické vodíkové viazanie medzi polymerickou molekulou a komplementárnym polynukleotidom (napríklad jednoreťazcovou DNA) . Tieto bázy sú typicky inozín, adenozín, guanozín, cytozín, uracyl a tymidín. Polymerické molekuly zahŕňajú dvoj alebo jednovláknové RNA a DNA a ich modifikácie, napríklad tie s metylfosfonátovými väzbami.

Termín polypeptid sa tu používa pre látku tvorenú jedným reťazcom aminokyselinových zvyškov, spojených peptidovou väzbou. Termín proteín môže byť synonymom pre termín polypeptid alebo môže opisovať komplex dvoch alebo viacerých polypeptidov.

Termín peptid opisuje tiež látku zloženú z aminokyselinových zvyškov spojených peptidovou väzbou. Vo všeobecnosti sú peptidy zložené zo 100 alebo menej aminokyselín, zatiaľ čo polypeptidy alebo proteíny obsahujú viac ako 100 aminokyselín. Tu používaný termín proteínový fragment môže byť chápaný s rovnakým významom ako peptid.

Vláknitý proteín alebo vláknitý peptid je monomérna alebo agregovaná forma proteínu alebo peptidu, ktoré tvoria vlákna vyskytujúce sa v amyloidných plakoch. Príklady takýchto proteínov a peptidov sú tu uvedené.

Farmaceutický prostriedok opisuje chemický alebo biologický prostriedok vhodný na podanie do cicavčieho organizmu. Takéto prostriedky sa môžu špecificky pripraviť na podanie jednou alebo viacerými cestami, ktoré zahŕňajú okrem

iného aj cestu	orálnu,	parenterálnu,	intravenóznu,
intraarteriálnu,	subkutánnu,	intranazálnu,	sublinguálnu,
intraspinálnu, intracerebroventrikulárnu	a pod.
Farmaceutická	pomocná	látka	alebo	farmaceutický
prijatelná pomocná	látka je	nosič,	obvykle	kvapalina, v
ktorej je podávané	terapeuticky	aktívne	činidlo.	Pomocná látka
vo všeobecnosti nedodáva prostriedku	žiadnu	farmakologickú

aktivitu, akokoľvek však môže zabezpečovať chemickú alebo biologickú stabilitu (alebo chemickú aj biologickú stabilitu zároveň) a ovplyvňovať uvolňovanie aktívnej zložky a pod. Ukážkové prostriedky je možné nájsť napríklad v Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19^thEd., Grennaro, A., Ed., 1995.

Glykoproteín naviazaný najmenej sacharid).

je proteín, na ktorý je jeden uhlovodíkový reťazec kovalentne (oligopolyProteoglykán je glykoproteín, v ktorom je najmenej jeden z uhľovodíkových reťazcov glykozaminoglykán, čo je dlhý lineárny polymér zložený z opakujúcich sa disacharidov, v ktorom jedným členom páru je obvykle cukrokyselina (kyselina urónová) a druhým je aminocukor.

imunogénna imunitná alebo vzniku humorálnej bunkovej odpovede

Termíny imunologická alebo odpoveď sa týkajú (sprostredkovanej protilátkami) alebo (sprostredkovanej antigénne špecifickými T-bunkami alebo produktmi ich vylučovania), alebo obidvoch typov odpovede zároveň, zameranej proti antigénu v organizme jednotlivého cicavca. Takáto odpoveď môže byť aktívnou odpoveďou indukovanou podaním imunogénu alebo protilátky alebo odpoveď je vyvolaná predkladaním polypeptidových epitopov v spojení s MHC komplexom triedy I a II s cieľom aktivácie antigénne špecifických CD4 T pomocných buniek alebo CD8 cytotoxických T-buniek (alebo obidvoch typov indukovanou podaním Bunková imunitná pasívnou primárnych odpoveďou

T-buniek.

súčasne). Táto odpoveď môže zahŕňať tiež aktiváciu monocytov, makrofágov, astrocytov, prirodzenej

NK buniek, bazofilov, dendritických buniek, mikroglie, eozinofilov alebo ďalších zložiek imunity. Prítomnosť bunkovej sprostredkovanej štandardnou analýzou odbore známymi CTL

Relatívne príspevky imunologickej odpovede sa môže určiť proliferácie (CD4 T-bunky) alebo v analýzami (cytotoxické T lymfocyty).

humorálnej a bunkovej odpovede k ochrannému alebo liečebnému účinku imunogénu sa môžu rozlíšiť pomocou oddelenej izolácie frakcií imunoglobulínu (IgG) a T-buniek z imunizovaného syngénneho zvieraťa a meraním ochranného a liečebného účinku u druhého jedinca.

Imunogénne činidlo alebo imunogén alebo antigén je molekula, ktorá je po podaní pacientovi schopná indukovať imunologickú odpoveď proti sebe samotnej, a to buď v spojení alebo aj bez prítomnosti adjuvantu. Takéto molekuly zahŕňajú napríklad amyloidné vláknité peptidy alebo ich fragmenty konjugované s nosným proteínom, ktorým môže byť hemocyanín z Diodora aspera, Cd3 alebo toxín tetánu.

Epitop alebo antigénna determinanta je časť antigénu, ktorá sa viaže k antigén viažúcej časti protilátky.

Termíny Αβ, Αβ peptid a amyloidný β peptid sú synonymá a opisujú jednu alebo viacero peptidových zmesí zložených z 38 až 43 aminokyselín odvodených z β amyloidného prekurzorového proteínu (β-ΑΡΡ). Αβχχ opisuje amyloidný β peptid 1-xx, pričom xx znamená počet aminokyselín v peptide; napríklad Αβ42 je zhodný s Afil-42, ktorý je tu opisovaný tiež ako AN1792 a Αβ40 je zhodný s Afil-40, ktorý je tu opisovaný tiež ako AN1578.

Disagregovaný alebo monomérny Αβ znamená rozpustné, monomérne peptidové z Αβ. Jedným zo spôsobov prípravy monomérnych Αβ je rozpustenie lyofilizovaného peptidu v čistom DMSO pomocou sonifikácie. Výsledný roztok sa s cieľom odstránenia všetkých nerozpustných častíc centrifuguje. Agregovaný Αβ je zmes oligomérov, v ktorých držia monomérne jednotky spolu nekovalentnými väzbami.

Termín holý polynukleotid znamená polynukleotid bez obsahu koloidných látok. Holé polynukleotidy sú niekedy klonované v plazmidivom vektore.

Termín pacient zahŕňa ľudský alebo cicavčí subjekt, ktorý prekonáva profylaktický alebo liečebný zásah.

Termíny významne odlišný od, štatisticky významný, významne vyšší (alebo nižší) ako, a im podobné slovné spojenia opisujú porovnanie rôznych údajov, pričom rozdiely medzi dvomi porovnávanými jednotlivcami alebo skupinami sú školenému pozorovateľovi zjavne alebo dostatočne zrejmé, alebo tiež štatisticky významné (ak spojenie zahŕňa termín štatisticky, alebo keď je prítomný nejaký údaj zo štatistického testu, ako napríklad p-hodnota, alebo keď sú údaje po analýze štandardnými štatistickými testami štatisticky rozdielne).

Prostriedky alebo spôsoby, ktoré obsahujú jednu alebo viacero z uvedených zložiek, môžu obsahovať aj iné zložky, ktoré nie sú samostatne uvedené. Napríklad prostriedok, ktorý zahŕňa vláknitú peptidovú zložku, zahŕňa ako peptid samotný, tak aj ako súčasť dlhšej polypeptidovej sekvencie. Zjednodušene sa to môže vyjadriť tak, že prostriedok, ktorý obsahuje zložku A a B, zahŕňa tiež zloženie vymedzené zložkami

A, B a C.

B. Amyloidné ochorenia

1. Prehľad a patogenéza

Amyloidné ochorenia alebo amyloidózy zahŕňajú množstvo stavov so širokým spektrom vonkajších príznakov. Spoločným znakom týchto porúch je prítomnosť abnormálnych extracelulárnych usadenín, tvorených proteínovými vláknami a známymi ako amyloidné usadeniny alebo amyloidné plaky, ktoré majú priemer okolo 10 až 100 pm a sú lokalizované v určitých orgánoch alebo častiach tkaniva. Také plaky sú zložené najmä z prirodzene sa vyskytujúcich rozpustných peptidov alebo proteínov. Tieto plaky (ktoré sú nerozpustné) sú väčšinou zložené z laterálnych agregátov vlákien, ktorých priemer je približne 10 až 15 nm. Amyloidné vlákna tvoria po zafarbení farbou Congo Red v polarizovanom svetle charakteristický, jablkovo zelený dvoj lom. Tieto poruchy sú triedené podlá majoritnej vláknitej zložky, ktorá tvorí amyloidné usadeniny, čo je uvádzané ďalej.

Peptidy alebo proteíny tvoriace amyloidné plaky vznikajú často z prekurzorového proteínu. Tak je možné povedať, že patogenéza usadenín tvorených amyloidnými vláknami vo všeobecnosti zahŕňa proteolytické štepenie abnormálneho prekurzorového proteínu na jednotlivé fragmenty. Tieto fragmenty sa spravidla zoskupujú do antipararelných βskladaných listov; avšak u niektorých nedegradovaných foriem prekurzorového proteínu sa zistilo zhlukovanie a tvorba vlákien (rôzne vlákna transtyretínu u familiálnej polyneuropatie a vlákna β₂ mikroglobulínu u amyloidózy spojenej s dialýzou; Tan, a kol., 1994, viď. vyššie).

2. Klinické syndrómy

V tejto časti sú opísané hlavné formy amyloidóz s opisom charakteristických vláknitých zložiek, ktoré sa vyskytujú v amyloidnom plaku. Hlavným objavom predkladaného vynálezu je zistenie, že amyloidné ochorenia sa môžu liečiť podávaním činidiel, ktoré stimulujú imunitnú odpoveď zameranú proti špecifickej zložke alebo zložkám (podlá konkrétnej amyloidnej poruchy) rôznych amyloidných plakov. Takéto zložky sú najlepšie súčasťou vlákien, ktoré tvoria plaky, čo je podrobnejšie uvádzané v časti C. Nasledujúca časť slúži na príkladné znázornenie hlavných foriem amyloidóz, pričom jeho cielom nie je žiadnym spôsobom vymedzovať alebo limitovať možnosti vynálezu.

a. AAA (reaktívna) amyloidóza

AA amyloidóza je väčšinou prejavom množstva chorôb, ktoré spôsobujú trvalú akútnu fázu. Takéto choroby zahŕňajú chronické zápaly, chronické lokálne alebo systemické mikrobiálne infekcie a zhubné nádory.

AA vlákna sú väčšinou zložené z fragmentov s velkosťou 8000 daltonov (AA peptid alebo proteín) vytvorených proteolytickým štepením sérového amyloidného A proteínu (ApoSSA), čo je cirkulujúci apolipoproteín, ktorý sa vyskytuje v HDL častiach, a ktorý je syntetizovaný v hepatocytoch následne po ich stimulácii cytokínmi (napríklad IL-1, IL-6 a TNF). Amyloidné plaky môžu byť rozšírené po celom tele, prednostne však v orgánoch s parenchymatickou stavbou. Miestom s častým výskytom plakov je slezina, pričom postihnuté môžu byť aj obličky. Plaky sa bežne vyskytujú aj v srdci a gastrointestinálnom trakte.

AA amyloidné ochorenia zahŕňajú okrem iného zápalové ochorenia, ako sú napríklad reumatoidná artritída, juvenilná chronická artritída, ankylózna spondytilída, psoriáza, psoriatická artropatia, Reiterov syndróm, Stillova choroba, Bechterevova choroba a Crohnova choroba. AA usadeniny vznikajú tiež ako výsledok chronických mikrobiálnych infekcií, ako sú napríklad lepra, tuberkulóza, bronchiektáza, dekubitálne vredy, chronická pyelonefritída, osteomyelitída a Whippleova choroba. Určité zhubné nádory môžu byť tiež príčinou vzniku AA vláknitých usadenín. Medzi tieto patria Hodgkinov lymfóm, renálny karcinóm, karcinómy čreva, pľúc a urogenitálneho traktu, karcinóm bazálnych buniek a leukémia vlasatých buniek,

b. AL amyloidózy

AL amyloidné usadeniny sú spojené skoro s každou dyskraziou B lymfocytárnej línie, ktorá siaha od zhubného bujnenia plazmatických buniek (mnohonásobný myelóm) až k nezhubnej monoklonálnej gamapatii. Prítomnosť amyloidných usadenín môže byť občas prvotným indikátorom prebiehajúcej dyskrazie.

Vlákna AL amyloidných usadenín sa skladajú z ľahkých reťazcov monoklonálneho imunoglobulínu alebo z ich fragmentov. Tieto fragmenty pochádzajú z N-koncovej časti ľahkého reťazca (kappa alebo lambda) a obsahujú tiež celú alebo len časť variabilnej (Vi) domény. Usadeniny sa objavujú najmä v mezenchymatických tkanivách, kde spôsobujú periférnu a autonómnu neuropatiu, syndróm karpálneho tunela, makrogloziu, reštriktívnu kardiomyopatiu, artropatiu veľkých kĺbov, imunitnú dyskraziu, myelómy, rovnako tak ako skryté dyskrazie.

Je však nutné poznamenať, že napadnuté môže byť v podstate akékoľvek tkanivo, najmä viscerálne orgány (napríklad srdce).

c. Dedičné systemické amyloidózy

Vrodených systemických amyloidóz existuje veľa druhov. Aj keď sa vyskytujú relatívne vzácne, nástup symptómov v dospelosti a ich dedičné podmienenie (obvykle sú autosomálne dominantné) vedie k pretrvávaní týchto porúch v celkovej populácii. Syndrómy sa môžu pripísať bodovým mutáciám v prekurzorovom proteíne, ktoré vedú k tvorbe rôznych amyloidogénnych peptidov alebo proteínov. Tabulka 2 uvádza typické zloženie vlákien druhov týchto porúch.

Údaje uvedené v tabuľke 2 sú len exemplárne a žiadnym spôsobom neobmedzujú rozsah uplatnenia vynálezu. V transtyretíne bolo napríklad opísaných viac ako 40 odlišných bodových mutácií, pričom všetky vedú k vzniku klinicky podobných foriem familiálnej amyloidnej polyneuropatie.

Transtyretín (TTR), ktorý sa často nazýva ako prealbumín, je proteín s veľkosťou 14 kilodaltonov. Je vytváraný v pečeni a choroidnom plexe a jeho funkciou je transport tyroidných hormónov a vitamínu A. Za rôzne formy familiálnej amyloidnej polyneuropatie zodpovedá najmenej 50 rôznych foriem proteínu, pričom každá je charakteristická zmenou jedinej aminokyseliny. Napríklad substitúcia prolínu za leucín v pozícii 55 vedie k mimoriadne progresívnej forme neuropatie; substitúcia metionínu za leucín v pozícii 111 viedla u dánskych pacientov k ťažkej neuropatii. Amyloidné usadeniny izolované zo srdcového tkaniva pacientov so systemickou amyloidózou odhalili, že usadeniny sú zložené z heterogénnej zmesi TTR a jeho fragmentov, spoločne nazývané ako ATTR (jeho celá sekvencia už bola určená). Vláknité zložky ATTR sa môžu z takýchto plakov extrahovať a ďalej sa potom môže určiť ich štruktúra a sekvencie, a to podľa v odbore známych spôsobov (napríklad Gustavsson, A., a kol., Laboratory Invest. 73: 703 - 708, 1995; Kametani, F., a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622 - 628, 1984; Pras, M., a kol., PNAS 80: 539 42, 1983).

ω

d)

d)

•H

•H

•H

4-1

4->

4J

4-1

tn

G

G

G

(0

P,

G

P

G

P G

>U

0

G

0

G

0 G

>1

'G

>1

G

r—1

G

1—1

G .-I

«. >

K

>

G

'G

G

'G

G 'G

oj

—. M

'Ctí

'G

G

d)

G

d)

G

Φ G

G

CM Φ

>

G

dl

d)

G

d)

G

d)

G d)

< G

O

Ό

c

G

U

O

O

>1

•d

P

ϋ

•d

P

N

G

N

G

N G

Aí

o

— (D

Ό

o

d)

d)

•d

d)

G

ω -g

(Ú

<—I

G

G

r—t

G

G

>

X)

>

X3 >

G

>1

CO G

W

φ

>,

G

G

N

β

•H Ό

•d

g

•H

'd)

»*.

g

g

** g

\d

G

4-1 G

S

4-)

G

4-)

G

tn

tn

S,

tn >1

G

(0 Ή

'>1

G

G

•H

G

a:

G

Aí

G A<

Pi

G

a g

a:

Pi

G

Pi

G

4-)

4->

4-)

4-)

4-) 4-)

G

o ω

4-)

O

G

O

d)

G

d)

G

d)

G d)

'd)

r—1

g a

ω

G

r—I

G

Pi

d)

>W

d)

>G

d) >G

Aí

'(0

G

>w

G

'(tí

G

4-)

>

4-J

>

G >

0

G

O :G

>

Φ

•d

d)

:G

W

o —.

G

O

.—,

G O

.___

•d

f—1

8 g

o

G

rd

G

g

O

Ό G

O

T>

4-)

O Ό

4-i

C

•G

>1 -o

T)

•d

•o

d) G

d)

G

d)

G

•d

g

i—1 G

ω

M

g

1—1

G

P

G G

p

G

G

P G

G

i—1

(0

O G

G

d)

(tí

O

G

P >U

S

p,U

>1 P >U

44

G

a —

a Λ

Md

Pi

—'

4->

x— .3

G

—

'G

G —

'G

s amyloidózy '(D

C >0 •d •ú

d)

Q

K

	n			0
	υ	CO		(D
G	'G	G		tn
G	>G	d)		G
(tí	1—(	tZ)
•G	G	(N				<0
G	Ťtí	- (\J			r-	CN
(tí		0 G		0	cd	IZ)
>	G	(O φ		m		1“1
	FG	G 1—1		tn	G	(tí
'>1	(D	rG FG		G	G	>
a;	>			<	E-F
0						*»
•d		t—1		- φ		G·
G	O	LQ rG	CD	(O -G	CD	LD
d)	n	G1 G	CN	CN >G	m	(D
G	4-)	G 4J	tn	tn g	G	G
d)	Φ	G Φ	G	G G	G	Φ
0>	S	H S		< Ť3	H	G

c

Ή

d)

G >1

4-)

G

d)

4-)

G

d)

O a

(0

O

P aj

P	tn
	G	G	G	1	G r—t
Ό	G	G	G		G <		(tí
G	Mg	G	Φ		Φ		U
G			g	G	g G		N
P	G	G	&	G	& G		(tí G t
W			G	Ή	G Ή	w	+J
P	G	G	G	Φ	G Φ		Φ t ,
	'd	Ή	G	G	G G	rd	d	G
>1	G	G		O	O		ä	G
G	Φ	Φ		G	G			'Φ
G	G	G	>	P	> P		G	tn
Mtí	>1	>,	O	O	O O	g	G	O
fd	G —	G —	U	P	υ p	NG	Φ	G
•d	cn tá	w pi	G	•H	G -G	N	g	•G
M	G H	G Eh	O	1—1	O '—1	O	&	G
jQ	G E-i	G Eh	Aí	O	G O	N	G	n
Ή	G <	G <	1	P	l P	>	G	•H
b	H —	Eh -	S	G	S G	G	G	G

(tí

(tí

•rd

a

•rd

P

tn

S

tP

s

(tí

(0

P

(tí

-P

>

Ul

Ul

O

o

'>

O

'>

(0

P

g

x

g

x

>

Φ

1

<0

Φ

'(tí

w

Φ

'(tí

w

o

1

g

x

1

(Ú

c

x

tí

X

X

tí

X

P

•H

i—1

P

•rd

X

X

tí

X

C

(D

(0

0)

Φ

Φ

P

•(tí

•H

(tí

(0

•H

(tí

g

•P

x

4-1

r—1

(tí

Φ

tí

0

r-1

tí

0

|—i

•f—1

o

P

P

• K

w

g

a

C

X

i—1

w

X

i—1

w

Φ

tí

i—1

-P

(tí

w

o

O

Ul

'(tí

•H

'(tí

•H

x:

φ

tí

x

tí

P

H

0

Ui

g

Ui

g

P

g

Φ

o

:(tí

x

3

X

X

(tí

1

X

(0

1

i-1

φ

'(0

P

P

P

c

O

Φ

Φ

X

tí

u

o

4-d

c

'(β

Ul

(0

.—.

Ul

(0

.—.

x

x

w

w

P

Φ

tí

(tí

Φ

tí

(0

oi

(0

o

(tí

u

1

(0

•rd

(Ú

U

<-d

rd

U

r—|

•rd

a

tí

x

tí

tí

P

q

>

rd

'(tí

P

'(0

-P

r—f

r-d

o

r-d

(tí

tí

φ

r—i

O

4-1

(tí

Ul

(0

(0

Ul

(0

'Π3

(0

'(tí

a

Φ

'(0

>

(0

x

'(Ú

x

O

tí

X

a

tí

X

a

Ή

XI

-rd

φ

x

•rd

o

g

tí

•H

>p

P

>U

Φ

o

>U

Φ

0

r-[

0

i—1

x

o

i—1

x

P

•H

C

φ

4-·

•rd

Ul

rd

-rd

Ul

•rd

•H

P

-rd

>

P

•rd

0

w

Φ

(Ú

rd

ω

X

Φ

tn

X

Φ

tn

g

0

g

(d

o

g

x

P

X

P

Ul

>1

Φ

U

tí

Φ

U

C

(0

x

(fl

P

x

(tí

(tí

Φ

o

x

e

X

X

—

(tí

X

—

(0

4-d

u

4-1

a

υ

4-1

tí>

o

(Z)

fragment gelsolinu (Agel) Asnl87, Tyrl87

		r-		r—1	[	o
		i—1		Γ'	MO	o
		r~		LD	r—1	CM
		Φ		tí	i—1	(0
		X		Φ	(fl	>1
		Cl,		X		X
		X		·.		X
		r-	r-	O	CM	00
00	n	i—l	i—1	r~	O	>
>40	cn	r-	r-~	MO	r-d	rd
tí	tí	Φ	>	tí	tí	C
t—1	t—1	í—i	í-J	ω	Φ	w
o	o	M	o		X

I I I

		Φ			Φ	.—.	Φ _
		P	a		P	a	p a
		a	a	,__-	a	a	— a a
	cg			cg			cg <			tí
	rt.	o		rt.	o		pq o “			tí
	-—	x			x		- X	a		Ή
u		•φ	tí		'Φ	tí	'Φ tí	P		Φ
	tí	tí	tí	C	tí	tí	tí tí tí	a		P
tí	Ή	x	Ή	Ή	x	Ή	'rd X Ή	•—		o
tí	Φ	•H	Φ	Φ	•H	Φ	φ ·Η Φ			P
Ή	X	0	P	P	o	P	POP	tí		a
x	O	pH	0	o	i—1	o	OXO	'rd	a		i—l
(tí	P	>1	P	P	>1	P	p >1 P	Φ	P	o	σι
x	a	g	a	a	g	a	aga	P	a	x
ω		(tí			(tí		(0	o		ό	>P
	'>		o	'>		o	'>1 O	P	x	>	(0
u	tí	P	x	tí	P	x	tí N x	a	0	0
	x		'Φ	x		'Φ	X 'Φ			P	r—|
P	•H	'5*1	>	•H	'>	>	•P '> >	'>	'>	o	lO
tí	o	tí	o	o	tí	o	O tí o	>	tí	P
Φ	,—1	Φ	P	,—1	Φ	P	X Φ P	o	φ	P	P
g	>1	X	o	>1	x	o	>1 x o	tí	x	tí	P
&	g	O	P	g	o	P	g O p	Ό	o	x	Φ
(0	(0	>	P	(0	>	P	(tí > P	•rd	>	Φ	P
P	1	x	tí	1	x	tí	1 X tí	P	x	P	tí
x	CQ	0	x	x	o	x	x o x	a	o	a	-rd

(dedičná spongiformná sncefalopatia, priónové

W Φ

		Φ						ε		V	β
		>υ								φ	Γ—|
		'β				β		>		β	'φ
	'φ					Φ		0		Ν	ε
	i	ε φ '>1 β		ε Ό	φ	•Η ε		>β Φ		Ό 1“1	Ll φ
	φ	44 >—1		L	4-)	φ		•Η		β	Ρ
	Ν	4-> 'Φ		Ρ	Ο	Ll		ω		Ρ	ο
	ο	φ ε		β	Ρ						rH
	'0	>Φ ο		>1	ο	4J		ε			β
	φ	> Ν		(0	β	W		•Η		>1	4-1
	Ll	Ο Ο			ι—1	Φ	Φ	υ		β	ω
	4->	Ό 4->		>	Ρ	rH	•Η	ρ		•Η	β
	m	Φ β		Ο		0	4-1	Γ—ι	ε	β	a
		Ll Φ		1—1		Ρ	Φ	Φ		φ
	Φ	a —	—X	ι—1	φ		a	>	β	Ρ
Φ	β		φ	φ	γΗ	*»	ο	'Φ	φ	φ	φ
•Η	Γ—I	_ λ:	β	S:	4->	φ	>,	>	>	w	β
β	'ftí	Φ Φ	>	ι	Φ	44	ε	Ll	'φ	β	Ll
Φ	•Η	44 -Η	Ή	φ	a	>	ο	4-)	Ρ		'Φ
Ll	Γ—1	>υ >υ	W	ι—1	ο	Φ	•Η	Φ	ο	'φ	í—ί
Ο	Ή	'β ·Η	Φ	44	Ll	ŕ—I	Ρ	Li	φ	β	β
X!	e	Ll ι—1	υ	υ	m	Ρ	Li	a	β	>Ν	a
Ο	φ	Ο Ρ	φ	β	φ	•Η	Φ		>,	Ο	φ
ο	Ψ4	Ρ 0	Ll	S	β	>Ν	44	w	>	44	a

Φ

H )W >w >

P •H >

σ σι

ο	ο
Ρ β	Ρ β
'Φ β	'φ β
> »Η	> Ή
0 Φ	Ο Φ
Ll 4-1	Ll 4->
'Φ 0	'Φ Ο
« Ll	ω Li
a	a
ο	ο
Ν <	Ν <
'> ο	'> Ο
β Ρ	β Ρ
φ 'Φ	φ 'Φ
Ρ β —	Ρ β —
Ο Ρ <	Ο Ρ <	>1
> ·η ω	> -Η W	ε
P 0 cn	Ρ ο ω	'Φ
Ο Ή Ο	Ο Μ ο	β
>1 a	> a	Ν
< ε	< ε <	Φ
ρς φ —	ρς Φ —	S

'Φ β

N

Φ

S a

ta

C (0

E-t

P

Ο 'φ β

Φ w

sH

Ν •Η γΗ ο

Ρ

Φ •ΓΊ (0

Ό

Ο

π)

Osoby s bodovou mutáciou v molekule apolipoproteínu Al (napríklad Gly -> Arg26; Trp -> Arg50; Leu -> Arg60) vykazujú formu amyloidózy (typ Ostertag) charakteristickú usadeninami proteínu apolipoproteín Al alebo jeho fragmentov (AapoAI). Títo pacienti majú nízke hladiny vysokohustotného lipoproteínu (HDL) a vykazujú periferálnu neuropatiu alebo zlyhávanie obličiek.

Mutácia v a reťazci enzýmu lyzozýmu (napríklad íle -> Thr56 alebo Asp -> His57) je základom inej formy nonneuropatickej dedičnej amyloidózy typu Ostertag, ktorý sa vyskytuje v anglických rodinách. V tomto prípade sú usadeniny tvorené vláknami mutantného proteínu lyzozýmu (Alys) a pacienti vykazujú väčšinou zhoršenú funkciu obličiek. Tento protein sa na rozdiel od väčšiny tu opisovaných proteínov tvoriacich vlákna nachádza v nedotknutej (nefragmentovanej) forme (Benson, M. D., a kol. CIBA Fdn. Symp. 199: 104 - 131, 1996) .

β-amyloidný peptid (Αβ) je 39 až 43 aminokyselinový peptid, ktorý vzniká proteolýzou veľkého proteínu známeho ako β amyloidný prekurzorový protein (βΑΡΡ). Mutácie v βΑΡΡ vedú k vzniku familiálnych foriem Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu alebo senilnej demencie (alebo obidvoch), ktoré sú charakteristické mozgovými usadeninami, ktoré sú zložené z vlákien Αβ a ďalších zložiek opísaných podrobnejšie nižšie. Známe mutácie v APP, spojené s Alzheimerovou chorobou sa objavujú blízko miest štepenia β alebo γ sekretázou alebo vnútri Αβ. Napríklad pozícia 717 je priľahlá miestu štepenia APP γ-sekretázou, pri ktorom vzniká Αβ a pozícia 670/671 susedí s miestom, kde APP štepí β-sekretáza. Mutácia v akomkoľvek z týchto zvyškov môže viesť k vzniku Alzheimerovej choroby, pravdepodobne vďaka zväčšeniu podielu aminokyselinovej formy 42/43 v celkovom množstve vznikajúceho Αβ z APP. Štruktúry a sekvencie rôznych foriem. Štruktúry a sekvencie rôznych foriem Αβ peptidov sú v odbore dobre známe. Takéto peptidy sa môžu syntetizovať pomocou v odbore známych spôsobov (napríklad Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 885 - 890, 1984; Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122: 1131

- 1135, 1984). Rôzne formy týchto peptidov sú dokonca komerčne dostupné.

Synukleín je proteín, ktorý je podobný apolipoproteínu a vyskytuje sa v značnej miere v cytozole neurónov a v presynaptickom zakončení. Peptidové fragmenty pochádzajúce z ot-synukleínu a nazývané NAC sú tiež zložkami amyloidných plakov, ktoré sa tvoria pri Alzheimerovej chorobe (Clayton, a kol., 1998). Táto zložka slúži tiež ako cieľ pri liečebných metódach založených na imunologických postupoch a zahrnutých v predkladanom vynáleze, čo je opísané nižšie.

Gelsolin je vápnik viažúci proteín, ktorý sa viaže na aktínové filamenty. Mutácia tohto proteínu v pozíciách 187 (napríklad Asp -> Asn; Asp -> Tyr) vedie k vzniku formy dedičnej systemickej amyloidózy, ktorá sa obvykle nachádza u pacientov vo Fínsku, rovnako tak ako u osôb, ktoré pochádzajú z Holandska alebo Japonska. U postihnutých jedincov, pozostávajú vlákna tvorené z fragmentov gelsolinu (Agel) obvykle z aminokyselín 173 až 243 (68 kDa fragment na karboxylovom konci) a sú ukladané v krvných cievach a bazálnych membránach, čo umožňuje vznik korneálnej dystrofie a kraniálnej dystrofie, ktorá sa rozvíja do periférnej neuropatie a vedie k dystrofickým zmenám kože a ukladaniu usadenín v ďalších orgánoch (Kangas, H. a kol. Human Mol. Genet. 5(9): 1237 - 1243, 1996).

Iné mutantné proteíny, ako napríklad mutantný a reťazec fibrinogénu (AfibA) a mutantný cystatin C (Acys) tiež tvoria vlákna a umožňujú vznik charakteristických vrodených porúch. Vlákna AfibA tvoria usadeniny charakteristické pre nonneuropatické dedičné amyloidózy pri poruchách obličiek; usadeniny vlákien Acys sú charakteristické pre vrodenú cerebrálnu amyloidnú angiopatiu hlásenú na Islande (Isselbacher, a kol., Harrison’s Principles of Internal Medicíne, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, a kol., viď. vyššie). Minimálne u istého množstva pacientov s cerebrálnou amyloidnou angiopatiou (CAA) bolo preukázané, že amyloidné vlákna obsahujú .nemutovanú formu cystatinu C v spojení s β proteínom (Nagai, A. a kol., Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63 - 78, 1998).

Určité formy priónových ochorení (až 15 % prípadov) sa teraz považujú za dedičné, aj keď sa skôr myslelo, že sú predovšetkým infekčného pôvodu (Baldwin, a kol., in Research Advances in Alzheimer' s Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). V prípade takýchto priónových porúch sa u pacientov vytvárajú plaky tvorené abnormálnymi izoformami normálneho priónového proteínu (PrP^c) . Prevládajúca mutantná izoforma (Prp^Sc) , nazývaná tiež ako AScr sa líši od normálneho bunkového proteínu svojou odolnosťou proti degradácii proteázami, nerozpustnosťou po extrakcii pomocou detergentu, ukladaním v sekundárnych lyzozýmoch, posttranslačnou úpravou a vysokým obsahom konformácie βskladaného listu. Genetická príčina bola preukázaná najmenej u piatich mutácií, ktoré vedú k vzniku Creutzfeldt-Jacobovej choroby (CJD) , Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrómu (GSS) a fatálnej familiálnej insomnie (FFI) (Baldwin). Spôsoby na extrakciu vláknitých peptidov z vlákien scrapie, určenie sekvencii a syntéza takých peptidov sú v odbore známe (napríklad Beekes, M., a kol., J. Gen. Virol. 762567 - 76, 1995).

Napríklad jedna z foriem GSS bola spojená s mutáciou PrP v kodóne 102, zatial čo telencefalická GSS bola segregovaná s mutáciou v kodóne 117. Mutácie v kodónoch 198 a 217 vedú k vzniku formy GSS, u ktorej neuritické plaky, charakteristické pre Alzheimerovu chorobu obsahujú PrP namiesto peptidu Αβ. U určitých foriem familiálnej CJD bola preukázaná súvislosť s mutáciami v kodónoch 200 a 210; mutácie v kodónoch 129 a 178 boli nájdené ako u familiálnej CJD, tak aj u familiálnej FFI (Baldwin, viď. vyššie).

d. Senilné systemické amyloidózy

Množstvo systemických aj lokálnych amyloidóz usadenín sa s vekom zvyšuje. Napríklad vlákna divokého typu transtyretínu (TTR) je možné bežne nájsť v srdcovom tkanive starších jedincov, čo môže byť asymptomatické, klinicky tiché alebo môže skončiť s výsledkom srdcového zlyhania. Asymptomatické vláknité lokálne usadeniny sa môžu objaviť tiež v mozgu (Αβ), v corpora amylacea prostaty (Αβ₂ mikroglobulín) , v kĺboch a v semenných vačkoch.

c. Mozočkové amyloidózy

Lokálne usadeniny amyloidu sú bežné v mozgu, najmä u starších jedincov. Najčastejší typ amyloidu nachádzajúci sa v mozgu, ktorý je zložený najmä z vlákien peptidu Αβ, vedie k demencii alebo občasnej (nededičnej) Alzheimerovej chorobe. V skutočnosti však výskyt občasných foriem Alzheimerovej choroby ďaleko prevyšuje formy dedičné. Vláknité peptidy tvoriace tieto plaky sú veľmi podobné na tie, ktoré už boli opísané v súvislosti s Alzheimerovou chorobou (AD) vyššie.

f. Amyloidózy spojené s dialýzou

U pacientov dlhodobo sa podrobujúcich hemodiaiýze alebo peritoneálnej dialýze je možné bežne nájsť plaky zložené z vlákien β₂ mikroglobulínu (Αβ₂Μ). β₂ mikroglobulín je polypeptid s veľkosťou 11,8 kDa a je ľahkým reťazcom antigénov MHC komplexu triedy I, prítomným na každej bunke s jadrom. Za normálnych okolností sa z bunkových membrán plynulo uvoľňuje a filtruje sa obličkami. Pri poruche očisťovacej schopnosti obličiek, ako napríklad v prípade zhoršenej funkcie obličiek, dochádza v obličkách a na iných miestach (najmä v na kolagén bohatých kĺbových tkanivách) k jeho ukladaniu. Na rozdiel od iných vláknitých proteínov sú molekuly Αβ₂Μ vo vláknach väčšinou prítomné v nefragmentovanej forme (Benson, viď. vyššie).

g. Amyloidózy odvodené od hormónov

Endokrinné orgány môžu byť sídlom amyloidných usadenín, najmä u starších jedincov. Hormóny vylučujúce tkanivá zasiahnuté tumormi môžu obsahovať amyloidné plaky tiež odvodené od hormónov. Tieto plaky sú tvorené vláknami polypetidových hormónov akými sú napríklad kalcitonín (medulárny karcinóm štítnej žľazy), IAPP (amylín; ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín; ktorý sa objavuje u väčšiny pacientov s diabetes typu II) a atriálny natriuretický peptid (izolovaná atriálna forma). Sekvencie a štruktúry týchto proteínov sú v odbore dobre známe,

h. Nezaradené amyloidózy

Existuje množstvo ďalších foriem amyloidnej choroby, ktoré sa za normálnych okolností prejavujú lokalizovanými usadeninami amyloidu. Vo všeobecnosti platí, že tieto choroby sú pravdepodobne výsledkom lokalizovanej tvorby a/alebo chýbajúcim katabolizmom určitých vláknitých prekurzorov alebo sklonom určitého tkaniva (ako napríklad kĺb) na ukladanie usadenín. Medzi príklady takýchto idiopatických usadenín je možné zahrnúť modulárne AL amyloidy, kožný amyloid, endokrinný amyloid a amyloid spojený s tumormi.

C. Farmaceutické prostriedky

Objavom predkladaného vynálezu je zistenie, že prostriedky schopné vyvolať alebo vybaviť imunitnú odpoveď zameranú proti určitým zložkám amyloidových plakov sú účinné pri liečbe amyloidných ochorení alebo pri prevencii ich vzniku. Podlá tu poskytovaného vynálezu ide možné zabránenie postupu choroby, zlepšenie a/alebo zníženie amyloidného zaťaženia jedincov, to všetko za predpokladu podania predovšetkým o ich príznakov u postihnutých imunostimulačnéj zodpovedaj úcej dávky antiamyloidného činidla alebo protiamyloidnej imunitnej zložky pacientovi. Táto časť opisuje ukážkové protiamyloidné činidlá, ktoré vyvolávajú aktívne alebo pasívne imunitné odpovede proti amyloidným plakom a poskytujú ukážkové údaje znázorňujúce účinok vplyvu týchto prostriedkov na amyloidné zaťaženie.

Protiamyloidné činidlá podlá tohto vynálezu pozostávajú vo všeobecnosti zo špecifickej plakovej zložky, pričom najlepšie zložky tvoriacej vlákna. Takáto zložka je obvykle charakteristický proteín, peptid alebo ich fragmenty, čo bolo opísané v predchádzajúcom oddieli a bude doložené príkladmi nižšie. Liečebné činidlá uvádzané v predkladanom vynáleze vyvolávajú alebo ovplyvňujú imunitnú odpoveď voči plaku alebo skôr proti jeho vláknitej zložke. Takéto činidlá teda okrem iného zahŕňajú tieto zložky samotné, ich varianty, analógy a mimetiká týchto zložiek, ktoré indukujú protilátky proti tejto vlastnej zložke a/alebo s nimi krížovo reagujú. Takéto činidlá zahŕňajú ďalej aj vlastné protilátky alebo T-bunky, ktoré špecificky reagujú s amyloidnou zložkou. Dôležitým znakom je to, že farmaceutické prostriedky neobsahujú nešpecifické zložky, t.j. zložky, ktoré v tele cirkulujú alebo sú v ňom všade prítomné. Príkladom môže byť sérový amyloidný proteín (SAP), ako cirkulujúci plazmatický glykoproteín, ktorý vzniká v pečeni a viaže sa na väčšinu známych foriem amyloidných usadenín. Liečebné prostriedky sú prednostne zamerané na túto zložku.

Vyvolávanie imunitnej odpovede môže byť aktívne, ako v prípade podania imunogénu pacientovi, čo následne indukuje Tbunky reagujúce s danou zložkou alebo pasívne, ako v prípade podania samotnej protilátky, ktorá sa špecificky viaže na amyloidnú zložku prítomnú v tele pacienta. Ukážkové činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď proti amyloidným plakom sú opísané v nasledujúcich oddieloch.

Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu okrem imunogénneho činidla alebo činidiel zahŕňať v účinnom množstve tiež adjuvans a/alebo pomocnú látku. Farmaceutický účinné a užitočné adjuvanty a pomocné látky sú v odbore dobre známe a sú podrobnejšie opísané v nasledujúcich oddieloch.

1. Imunostimulačné činidlá (Aktívna imunitná odpoveď)

a. Prostriedky proti vláknam

Jedna z hlavných tried predkladaných protiamyloidných činidiel obsahuje činidlá odvodené z vláknitých amyloidných proteínov. Ako už bolo uvedené vyššie, znakom amyloidných ochorení je ukladanie amyloidných plakov (tvorených najmä z vlákien, pričom tieto vlákna sú zostavené najmä z charakteristických vláknitých proteínov alebo peptidov) v orgánoch. Podlá predkladaného vynálezu je takáto vláknitá proteínová alebo peptidová zložka účinným činidlom pri vyvolaní protiamyloidnéj imunitnej odpovede.

Tabulky 1 a 2 zhŕňajú typické vlákna tvoriace proteíny, ktoré sú pre rôzne amyloidné ochorenia charakteristické. V súlade s týmto hľadiskom predkladaného vynálezu má podanie imunostimulačného prostriedku, ktorý obsahuje potrebné vláknité proteíny a ktorý zahŕňa ich homológy alebo fragmenty postihnutých jedincov, liečebné alebo profylaktické účinky.

Príkladom je Αβ, známy tiež ako β-amyloidný peptid alebo peptid A4 (viď. patent US 4 666 829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 113, 1131, 1984), ktorý sa skladá z až 43 aminokyselín, a ktorý je hlavnou zložkou charakteristickou pre plaky u Alzheimerovej choroby. Αβ je tvorený z väčšieho proteínu APP pomocou dvoch enzýmov, nazývaných β a γ sekretázy (viď. Hardy, TINS 20, 154, 1997).

Príklad 1 opisuje výsledky experimentu uskutočneného na podporenie predkladaného vynálezu, v ktorom bol peptid Αβ42 podaný heterozygotným transgénnym myšiam, ktoré exprimovali v nadbytočnom množstve iudský APP s mutáciou v pozícii 717. Tieto myši, známe ako PDAPP myši vykazujú patológiu zhodnú s Alzheimerovou chorobou a používajú sa ako zvierací model na štúdium Alzheimerovej choroby (Games, a kol., Náture 373: 523 - 7, 1995). V tomto príklade je opísané, že tieto myši vo svojom mozgu vykazujú zistiteľnú neuropatológiu plaku Αβ už od šiesteho mesiaca života, pričom ukladanie plaku s vekom narastá. V tu opisovaných experimentoch bol myšiam podávaný agregovaný Αβ42 (ANI1792) . Väčšina z liečených myší (7 z 9) nemala na rozdiel od kontrolných myší, ktoré neboli ošetrené alebo im bol aplikovaný len soľný roztok, a u ktorých bolo zistené významné množstvo amyloidného zaťaženia, v 13-tom mesiaci života v mozgu žiadne zistiteľné amyloidné plaky (obr. 2). Tieto rozdiely sú ešte viac zrejmé v hipokampe (obr. 3) . Liečené myši vykazovali tiež významné titre sérových protilátok pri Αβ (všetky väčšie ako 1 : 1000, 8 z 9 väčšie ako 1 : 10000, obr. 1, tabuľka 3A). Myši, ktorým bol aplikovaný len soľný roztok vykazovali pri riedení séra 1 :

100 vo všeobecnosti viac ako 4 až 5-krát menšie hladiny protilátok proti Αβ, a to v akomkoľvek sledovanom čase a nevykazovali teda v porovnaní s kontrolou žiadnu významnú odpoveď (tabuľka 3B). Tieto Štúdie ukazujú, že injekcia špecifického vláknitého peptidu (Αβ) vedie k ochrane proti ukladaniu Αβ amyloidných plakov.

Sérový amyloidný proteín (SAP) je cirkulujúci plazmatický glakoproteín, ktorý je tvorený v pečeni a viaže sa na všetky typy amyloidných vlákien (väzba závisí na prítomnosti vápnika). Medzi tieto vlákna patria aj vlákna cerebrálnych amyloidných plakov u Alzheimerovej choroby. Časťou uskutočnených experimentov bola injekcia SAP skupine myší, pričom u týchto myší došlo k vytvoreniu významných sérových titrov proti SAP (1 : 1000 až 1 : 30000), ale nedošlo k vytvoreniu zistitelných sérových titrov proti peptidu Αβ a došlo k vzniku neuropatológie cerebrálneho plaku (obr. 2).

Ďalšie experimenty (viď. príklad 2) ukázali, že imunogénny účinok injekcií Αβ u myší liečených medzi 5. týždňom a asi 8. mesiacom života je závislý na dávke. U týchto myší došlo s rastúcim počtom imunizácií a so zvyšujúcou sa dávkou aj k zvýšeniu sérového titra proti Αβ. Po štyroch imunizáciách sa sérové titre (v dávkach od 1 do 300 pg) merané vždy päť dní po imunizácií ustálili na hladinách okolo 1 :

10000 (obr. 5).

Dodatočné experimenty na podporenie predkladaného vynálezu sú opísané v príklade 3. V tomto príklade bolo PDAPP myšiam v určitom časovom bode (okolo 11. mesiaca veku, čo je čas, v ktorom sú zistiteľné amyloidné plaky v ich mozgu) zahájené podávanie Αβ42. V týchto štúdiách boli zvieratá imunizované Afi42 alebo soľným roztokom, pričom na zistenie ich amyloidného zaťaženia boli usmrtené vo veku 15 alebo 18 mesiacov. Z obr. 7 je vidieť, že 18 mesiacov staré myši vykazovali významne nižšie priemery amyloidného zaťaženia (plakové zaťaženie 0,01 %), ako 18 mesiacov staré kontrolné zvieratá, ktorým bolo aplikované PBS (soľný roztok pufrovaný fosfátom) (plakové zaťaženie 4,7 %), aj ako 12 mesiacov staré neliečené zvieratá (0,28 %) , u ktorých sa amyloidné zaťaženie meralo obrazovou analýzou (podobnejšie viď. príklad 3, časť 8) . Tieto experimenty ukazujú účinnosť liečebných metód podlá predkladaného vynálezu, definovanú znížením existujúceho plakového zaťaženia a zabránenie nárastu plakového zaťaženia u jedincov, ktorí nie sú chorí.

Podľa tohto hľadiska vynálezu, sú liečebné činidlá odvodené z vláknitých peptidov alebo proteínov, ktoré tvoria plaky charakteristické pre danú chorobu. Týmito činidlami môžu byť aj látky zložkám plakov antigénne podobné do takej miery, aby boli schopné vyvolať imunitnú odpoveď, ktorá tiež krížovo reaguje s vláknitými zložkami plakov. Tabuľky 1 a 2 poskytujú príklady takých vláknitých peptidov a proteínov, pričom ich zloženie a sekvencie sú v odbore známe a môžu sa známymi spôsobmi jednoducho určiť (viď. odkazy citované nižšie a v sekcii B2 pre odkazy, ktoré opisujú špeciálne spôsoby extrakcie a/alebo tvorby rôznych vláknitých zložiek; ďalšie príklady vláknitých zložiek sú opísané nižšie.

Tak bude, v súlade s predkladaným vynálezom, v prípade určenia diagnózy amyloidného ochorenia (klinicky a/alebo biopsiou) skúsený odborník schopný zistiť zloženie vlákien amyloidnej usadeniny a poskytnúť činidlo, ktoré vyvolá imunitnú odpoveď zameranú proti vláknitým peptidom alebo proteínom.

Ako už bolo opísané vyššie, tak liečebným činidlom používaným v prípade liečby Alzheimerovej choroby alebo iných amyloidných ochorení, charakteristických ukladaním vlákien Αβ môžu byť prirodzene sa vyskytujúce formy peptidu Αβ, mimoriadne však ľudské formy (t.j. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a

Αβ43). Sekvencie týchto peptidov a ich príbuznosť s prekurzorom APP sú v odbore známe, resp. v odbore dobre známe (napríklad Hardy a kol., TINS 20, 155 - 158, 1997). Napríklad

Αβ42 má sekvenciu: H₂N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-TyrGlu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-GlySer-Asn-Lys-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID No. 1) .

Αβ41, Αβ40 a Αβ 39 sa od Αβ42 líši neprítomnosťou Ala, Ala-Ile a Ala-Ile-Val na C-koncovej časti peptidu. Αβ43 sa od Αβ42 líši prítomnosťou treonínového zvyšku na C-konci. Podľa predloženého uskutočnenia vynálezu budú liečebné činidlá vyvolávať imunitnú odpoveď proti časti alebo celej vláknitej zložke danej choroby. Napríklad predložená imunogénna látka proti Αβ je činidlo, ktoré indukuje protilátku špecifickú voči voľnému N-koncu Αβ. Takáto látka má tú výhodu, že nerozoznáva prekurzorový proteín, β-ΑΡΡ a znižuje teda pravdepodobnosť vzniku autoimunitnej reakcie.

U ďalšieho príkladu, ktorý sa týka pacientov postihnutých chorobami charakteristickými ukladaním vlákien ΆΆ. (napríklad chronické zápaly, chronické lokálne alebo systemické mikrobiálne infekcie a zhubné nádory) je možné oceniť, že pacienti môžu byť liečení AA peptidom, čo je známy, 8 kDa veľký fragment sérového amyloidného A proteinu (ApoSSA). Medzi typické AA amyloidné poruchy patria okrem iného zápalové ochorenia ako je napríklad reumatoidná artritída, juvenilná chronická artritída, ankylózna spondytilída, psoriáza, psoriatická artropatia, Reiterov syndróm, Stillova choroba, Bechterova choroba, Crohnova choroba, chronické mikrobiálne infekcie ako sú napríklad lepra, tuberkulóza, bronchiektázia, dekubitálne vredy, chronická pyelonefritída, osteomyelitída a Whippleova choroba a rovnako tak aj zhubné nádory, medzi ktoré patria Hodgkinov lymfóm, renálny karcinóm, karcinómy čreva, pľúc a urogenitálneho traktu, karcinóm bazálnych buniek a leukémia vlasatých buniek.

AA peptid patrí do heterogénnej skupiny peptidov, ktoré vznikajú z N-koncovej časti sérového amyloidného A proteinu (ApoSSA), začínajúc zvyškom prekurzorového proteinu 1, 2 alebo 3 a končiac kdekoľvek medzi zvyškami 58 a 64; vlákna AA sú zvyčajne zložené zo zvyškov 1 až 76. Presné štruktúry a zloženia sa môžu určiť, pričom následná syntéza príslušných peptidov je možná vďaka v odbore známym metódam (Liepnieks, J. J., a kol. Biochem. Biophys. Acta 1270: 81 - 86, 1995).

Fragmenty vzniknuté z N-koncovej časti lahkého reťazca (kappa alebo lambda reťazec) imunoglobulínu a obsahujúce jeho variabilnú doménu (VJ alebo jej časť, väčšinou tvoria amyloidné usadeniny v mezenchymatických tkanivách, kde spôsobujú periférnu a autonómnu neuropatiu, syndróm karpálneho tunela, makrogloziu, reštriktívnu kardiomyopatiu, artropatiu veľkých kĺbov, imunitnú dyskraziu, myelómy, rovnako tak ako skryté dyskrazie. Prostriedky podľa vynálezu budú prednostne vyvolávať imunitnú odpoveď len proti časti lahkého reťazca, prednostne proti neoepitopu (epitop, ktorý vzniká ako výsledok rozpadu materskej molekuly), aby bolo obmedzené prípadné autoimunitné pôsobenie.

Liečebným spôsobom podlá predkladaného vynálezu sú prístupné aj rôzne vrodené amyloidné ochorenia. Také choroby sú opísané vyššie, v časti B.2. Napríklad rôzne typy familiálnej amyloidnej polyneuropatie sú dôsledkom existencie viac ako 50 foriem (každá je spôsobená zmenou jedinej aminokyseliny) transtyretínu (TTR), 14 kDa veľkého proteínu tvoreného v pečeni. Veľa typov tejto choroby je rozlíšiteľných na základe svojej špecifickej patológie a/alebo demografického rozšírenia, pričom je možné oceniť, že liečebné prostriedky môžu byť zložené tiež z činidiel vyvolávajúcich imunitnú odpoveď proti viacerým ako jednej forme TTR. Takým prostriedkom môže byť zmes dvoch alebo viacerých foriem ATTR, ktorý obsahuje divoký TTR, a je tak v širokej miere použiteľným liečebným prostriedkom.

Amyloidné plaky, ktoré obsahujú AapoAI sa nachádzajú u osôb s bodovou mutáciou v molekule apolipoproteínu AI. Pacienti s týmto typom ochorenia väčšinou vykazujú periferálnu neuropatiu alebo zlyhanie obličiek. Podľa predkladaného vynálezu obsahujú liečebné prostriedky jednu alebo viacero rôznych foriem AapoAI, opísaných tu a v odbore známych.

Určité familiálne formy Alzheimerovej choroby sú rovnako tak ako Downov syndróm výsledkom mutácií v β amyloidnom prekurzorovom proteíne, čo vedie k ukladaniu plakov zložených hlavne z β-amyloidného peptidu (Αβ). Použitie peptidu Αβ v liečebných prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu je opísané vyššie a na príkladoch vysvetlené ďalej.

Určité postupy liečenia vrodených foriem amyloidóz, diskutované vyššie, zahŕňajú prostriedky vyvolávajúce imunitné odpovede proti fragmentom gelsolinu (liečba dedičnej systemickej amyloidózy), mutantnému proteínu lyzozýmu (Alys) (liečba dedičnej neuropatie), mutantnému a reťazcu fibrinogénu (AfibA) (liečba nonneuropatickej formy amyloidózy, ktorá sa prejavuje ako ochorenie obličiek), mutantnému cystatinu C (Acys) (liečba dedičnej cerebrálnej angiopatie, ktorá sa vyskytuje na Islande). Výskytom mutantnej izoformy priónového proteinu (PrP^Sc) sú charakterizované určité dedičné typy priónových ochorení, medzi ktoré patrí napríklad CreutzfeldtJacobova choroba (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndróm (GSS) a fatálna familiálna insomnia (FFI) . Tento proteín sa môže v súlade s predkladaným vynálezom použiť v prostriedkoch na liečbu alebo prevenciu ukladania plakov PrP.

Ako už bolo diskutované vyššie, tvorba amyloidných usadenín (ako systemická tak ohnisková) súvisí so starnutím. Tejto tvorbe je možné podía ďalšieho hladiska predkladaného vynálezu predísť alebo zabrániť aplikáciou prostriedkov zložených z jedného alebo viacerých proteínov spojených so starnutím. Takže plaky zložené z ATTR odvodeného z divokého typu TTR sa môžu často nájsť v srdcovom tkanive starších ludí. U určitých starších jedincov sa zase môžu v mozgu vyvinúť ohniskové asymptomatické vláknité usadeniny peptidu Αβ. U týchto jedincov je potom liečba peptidom Αβ, ako bolo už opísané vyššie, nutná. β₂ mikroglobulín je častou zložkou corpora amylaces prostaty, a je tak podía predkladaného vynálezu ďalším kandidátom (liečebným činidlom).

Okrem iných existuje množstvo ďalších typov amyloidných ochorení, ktoré nie sú dedičné, a ktoré sú vhodnými kandidátmi na liečbu spôsobmi v predkladanom vynáleze. U pacientov dlhodobo sa podrobujúcich hemodialýze alebo dialýze je možné bežne nájsť plaky zložené mikroglobulinu. Títo pacienti sa môžu v súlade s predkladaným vynálezom liečiť pomocou prostriedkov zameraných proti β₂ mikroglobulinu alebo ešte lepšie, jeho imunogénnych epitopom.

peritoneálnej z vlákien β₂

Hormóny vylučujúce tkanivá zasiahnuté tumormi môžu obsahovať amyloidné plaky odvodené tiež od hormónov, pričom ich zloženie je charakteristickým znakom príslušného zasiahnutého endokrinného orgánu. Tieto plaky sú tvorené vláknami polypeptidových hormónov akými sú napríklad kalcitonín (medulárny karcinóm štítnej žlazy), IAPP (amylín; ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín; ktorý sa objavuje u väčšiny pacientov s diabetom typu II) a atriálny natriuretický peptid (izolovaná atriálna amyloidóza).

Prostriedky zamerané na amyloidné usadeniny tvoriace sa v intime aorty pri ateroskleróze sú tiež zahrnuté v predkladanom vynáleze. Weatermark a kol. opisuje napríklad 69 aminokyselinový fragment N-koncovej časti apolipoproteínu A, ktorý tvorí tieto plaky (Westermark a kol., Am. J. Path. 147: 1186 - 92, 1995); terapeutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú imunologické činidlá zamerané na tento fragment rovnako tak ako fragment samotný.

Predchádzajúca diskusia bola zameraná na vláknité amyloidné zložky, ktoré sa môžu použiť ako činidlá pri liečbe alebo prevencii rôznych typov amyloidných ochorení. Liečebným činidlom môže byť tiež fragment alebo analóg prirodzene sa vyskytujúceho alebo mutantného vláknitého proteínu alebo peptidu, ktorý obsahuje epitop, ktorý po podaní jedincovi vyvolá podobnú ochrannú alebo liečebnú imunitnú odpoveď. Imunogénne fragmenty obsahujú typicky sekvenciu s najmenej 3, 5, 6, 10 alebo 20 aminokyselinami, ktoré sú aj v prirodzene sa vyskytujúcom peptide. Medzi príkladné imunogénne fragmenty peptidu Αβ patria Αβί-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 1-12, 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 a 35-42. V nejakých spôsoboch sa používajú fragmenty, ktorým chýba najmenej jedna a niekedy najmenej 5 alebo 10 C-koncových aminokyselín, prítomných v prirodzene sa vyskytujúcich formách tejto vláknitej zložky. Napríklad fragment, ktorému chýba 5 C-koncových aminokyselín z AB43 obsahuje prvých 38 aminokyselín z N-koncovej časti Αβ. Fragmenty z N-koncovej polovice Αβ sa v niektorých spôsoboch používajú prednostne. Analógy zahŕňajú alelické, druhové a indukované varianty. Analógy sa od prirodzene sa vyskytujúcich peptidov líšia v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách, často však ide o zámenu konzervatívnu. Analógy vykazujú najmenej 80 až 90 % sekvenčnú zhodu s prirodzeným peptidom. Niektoré analógy obsahujú tiež neprirodzené aminokyseliny alebo modifikácie N alebo C-koncových aminokyselín. Príklady neprirodzených aminokyselín sú a, adisubstituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mliečna, 4-hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, γ-Ν,Ν,Νtrimetyllyzín, γ-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N35 formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, ω-Νmetylarginín.

Osoba skúsená v odbore ocení, že fragmenty a analógy vytvorené v súlade s týmto hľadiskom vynálezu môžu byť testované na to, či krížovo reagujú s prirodzene sa vyskytujúcou vláknitou zložkou a/alebo na to, aká je ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat (viď. nižšie). Tieto fragmenty alebo analógy sa môžu použiť v liečebných prostriedkoch podľa predkladaného vynálezu, ale za predpokladu, že ich imunoreaktivita a účinnosť v tomto zvieracom modeli je približne rovnaká alebo väčšia ako v prípade zložiek amyloidných vlákien.

Takéto peptidy, proteíny alebo fragmenty, analógy a ďalšie amyloidogénne peptidy sa môžu pripraviť pomocou syntézy peptidov na tuhej fáze alebo rekombinantnou expresiou, čo sú v odbore dobre známe spôsoby, alebo sa môžu získať z prírodných zdrojov. Ukážkové zloženia vlákien, spôsoby extrakcie vlákien a sekvencie vláknitých peptidov alebo proteínov sú uvedené v publikáciách, ktoré sú citované v spojení s opisom konkrétnej vláknitej zložky. Zloženia ďalších látok, spôsoby ich extrakcie a určenie ich sekvencie sú v odbore dobre známe. Na tvorbu týchto látok sa môžu použiť automatické prístroje na syntézu peptidov, ktoré sú komerčne dostupné u mnohých výrobcov, ako napríklad Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, Calofornia) , pričom postupy pri príprave syntetických peptidov sú v odbore dobre známe. Na rekombinantnú expresiu sa môžu použiť baktérie (napríklad E. coli), kvasinky, hmyzie bunky alebo cicavčie bunky; proteíny sa môžu prípadne vytvoriť použitím in vitro translácie, čo je v odbore známy spôsob. Postupy rekombinantnéj expresie sú opísané v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2ed., 1989). Určité peptidy a proteíny sú dostupné tiež komerčne; napríklad niektoré formy peptidu Αβ sa môžu získať napríklad od American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, California alebo California Peptide Research, Inc., Napa, California.

Liečebné činidlá môžu byť zložené tiež z dlhších polypeptidov, ako napríklad z aktívneho fragmentu vláknitého peptidu alebo jeho analógu, spojeného spolu s ďalšími aminokyselinami. Napríklad peptid Ah sa môže nachádzať ako intaktný APP proteín alebo jeho časť (napríklad fragment C100, ktorý začína na N-konci Ah a pokračuje do konca APP) . Tieto polypeptidy môžu byť testované na to, ako je ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat (viď. nižšie). Ah peptid, jeho analóg, účinný fragment alebo iný polypeptid sa môžu podávať v asociovanej forme (t.j. ako amyloidné plaky) alebo v disociovanej forme. Liečebné činidlá môžu zahŕňať tiež multiméry z monomérnych imunogénnych činidiel alebo konjugáty nosných proteínov a/alebo sa môžu s cielom získania širšieho rozsahu protiamyloidného pôsobenia pridať s inou vláknitou zložkou.

Ďalšou obmenou môže byť predkladanie imunogénneho peptidu (napríklad fragment Ah) vírusom alebo baktériou ako časťou imunogénneho prostriedku. Nukleová kyselina kódujúca imunogénny peptid je vložená do genómu alebo epizómu vírusu alebo baktérie. Ďalšou možnosťou je zabudovanie nukleovej kyseliny takým spôsobom, že imunogénny peptid je exprimovaný ako sekretovaný proteín alebo ako fúzny proteín s proteínom na vonkajšom povrchu vírusu alebo s transmembránovým proteínom v baktérii, a to tak, aby bol peptid vystavený. Vírusy alebo baktérie použité v týchto spôsoboch by mali byť nepatogénne alebo oslabené. Vhodné vírusy zahŕňajú adenovírus, HSV, vírus venezuelskej konskej encefalitídy a ďalšie α vírusy, vírus vezikulárnej stomatitídy a ďalšie rabdovírusy, vírus vakcínie a poxvírusy hydriny. Vhodné baktérie zahŕňajú salmonelu a shigelu. Fúzia imunogénneho peptidu s HBsAg z HBV je predovšetkým vhodná. Liečebné činidlá zahŕňajú tiež peptidy a ďalšie látky, ktoré nevyhnutne nemusia mať v sekvencií aminokyselín s Ah významnú zhodu, avšak slúžia ako mimetiká Ah a vyvolávajú podobnú imunitnú odpoveď. Vyskúšať sa môžu napríklad akékolvek peptidy a proteíny tvoriace h-skladaný list. Anti-idiotypické protilátky proti monoklonálnym protilátkam špecifickým pre Ah alebo iným amyloidogénnym peptidom sa môžu tiež použiť.

Tieto anti-Id protilátky napodobňujú antigén a vyvolávajú proti nemu imunitnú odpoveď (viď. Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), str. 181). Činidlá odlišné od peptidov AB by mali vyvolať imunogénnu odpoveď proti jednej alebo viacerým uprednostňovaným častiam Αβ (viď. vyššie; 1 až 10, 1 až 7, 1 až 3 a 3 až 7) . Tieto činidlá vyvolávajú imunogénnu odpoveď zameranú prednostne proti jednej z týchto častí bez toho, že by vyvolali odpoveď proti inej časti AB.

Skúšať sa môžu aj peptidy a iné látky z náhodných knižníc (Random Libraries). Pre vela typov látok, ktoré sa môžu zostaviť po jednotlivých krokoch, sa môžu vytvoriť kombinačné knižnice (Combinatoral libraries). Medzi tieto látky patria polypeptidy, β-skladané mimetiká, polysacharidy, fosfolipidy, hormóny, prostaglandíny, steroidy, aromatické látky, heterocyklické zlúčeniny, benzodiazepíny, oligomérne Nsubstituované glycíny a oligokarbamáty. Velké kombinačné knižnice sa môžu zostaviť podlá kódovaných umelých knižníc (encoded synthetic libraries ESL) spôsobom opísaným v Affymax, WO 95/12 608, Affymax WO 93/06 121, Columbia University, WO 94/08 051, Pharmacopeia, WO 95/35 503 a Scripps, WO 95/30 642 (každý z nich je zahrnutý podlá odkazu pre všetky účely). Peptidové knižnice sa môžu zostaviť s použitím spôsobov fágového vystavovania (viď. napríklad Devlin, WO 91/18 980).

V kombinačných knižniciach a u ďalších látok sa najskôr zisťuje ich použiteľnosť meraním stupňa schopnosti viazať sa na protilátky alebo na lymfocyty (B alebo T), ktoré sú špecifické pre Αβ alebo iné amyloidogénne peptidy ako napríklad ATTR. Napríklad počiatočné testy sa tak môžu vykonať s akoukoľvek polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou proti AB alebo ktorémukoľvek ďalšiemu amyloidogénnemu peptidu, ktorý nás zaujíma. Látky identifikované týmito testami sa potom ďalej analyzujú na schopnosť stimulovať protilátky alebo lymfocyty špecifické pre AB alebo iný amyloidogénny peptid. Mnohonásobné riedenia séra sa môžu napríklad testovať na mikrotitračných doštičkách, ktoré sa vopred pokryli vláknitým peptidom, pričom potom môže nasledovať štandardné ELISA testy na zistenie protilátok špecifických pre AB. U látok sa potom môže testovať ich profylaktická alebo liečebná účinnosť u transgénnych zvierat, predisponovaných pre amyloidné ochorenia, čo je opísané v príkladoch. Tieto zvieratá zahŕňajú napríklad myši s APP mutovanom v pozícii 717 (Games a kol., viď. vyššie) a myši so švédskou mutáciou 670/671 v APP (McConlogue a kol., US 5 612 486 a Hsiao a kol., Science 274, 99, 1996; Staufenbiel a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13287 - 13292, 1997; Sturchler-Pierrat a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13287 - 13292, 1997; Borchelt a kol., Neurón 19, 939 - 945, 1997). Rovnaký študijný prístup sa môže použiť na ďalšie potenciálne činidlá, medzi ktoré patria fragmenty Αβ, analógy Αβ a ďalšie peptidy, ktoré zahŕňajú Αβ (viď. vyššie).

b. Ďalšie zložky plaku

Imunologické odpovede zamerané proti iným zložkám amyloidného plaku môžu byť tiež účinné pri prevencii, spomalení vývoja alebo zmenšení plakovej usadeniny pri amyloidnom ochorení. Tieto zložky môžu byť menšinovými časťami vlákien, môžu byť spojené s týmito vláknami alebo s tvorbou týchto vlákien tvoriacich plaky. Obmedzením je skutočnosť, že zložky, ktoré sú v tele všadeprítomné alebo sú pre amyloidné usadeniny relatívne nešpecifické, nepredstavujú pre liečebné činidlá najvhodnejší terč.

Ďalším objavom predkladaného vynálezu je tak zistenie, že činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď voči špecifickým zložkám plaku sú účinné pri liečbe alebo zastavení postupu amyloidného ochorenia. Táto kapitola poskytuje základné informácie o niekoľkých typických molekulách, ktoré sú spojené s amyloidným plakom. Liečba vyvolávajúca imunitnú odpoveď proti jednej z týchto molekúl alebo kombinovaná liečba, ktorá zahŕňa spoločnú aplikáciu s imunogénnych liečebným prostriedkom proti akejkoľvek vyššie opísanej vláknitej zložke, alebo proti akejkoľvek nižšie opísanej nevláknitej zložke plaku, poskytuje podľa predkladaného vynálezu doplnkovú protiamyloidnú liečbu. Časťou predkladaného vynálezu sú aj spôsoby pasívnej imunizácie založené na týchto plakových zložkách, čo je tu opísané.

Príkladom môže byť synukleín, čo je proteín štrukturálne podobný apolipoproteínom, ale nachádza sa v cytozole neurónov, najmä v oblasti presynaptického zakončenia. Existujú najmenej tri formy tohto proteínu, nazvané α, β a γ synukleín. Nedávno bolo preukázané, že α a β synukleín sa u určitých amyloidných ochorení zúčastňuje nukleácie amyloidných usadenín, najmä v prípade Alzheimerovej choroby (Clayton, D. F. a kol., TINS 21(6): 249 - 255, 1998). Fragment NAC domény α a β synukleínu (zvyšky 61 až 95) bol totiž izolovaný z amyloidných plakov u pacientov s AD; tento fragment tvoril v skutočnosti 10 % nerozpustenej formy plaku, čo bolo zistené po rozpustení plaku v SDS (dodecylsulfát sodný) (George, J. M., a kol., Neurosci. News 1: 12 - 17, 1995). Ako α synukleín, tak aj jeho NAC fragment sú známe tým, že in vitro urýchľujú agregáciu βamyloidného peptidu do nerozpustného amyloidu (Clayton, viď. vyššie).

Ďalšie nepeptidové zložky látky.

glykozaminoglykány tak aj Ďalšie spojené s amyloidnými plakmi zahŕňajú Napríklad perlecan a od neho odvodené sú veľké proteoglykány odvodené od heparínsulfátu, ktoré sa vyskytujú v amyloidných plakoch s obsahom Αβ (napríklad pri Alzheimerovej chorobe a iných amyloidózach vyskytujúcich sa v CNS alebo systemicky, t.j. napríklad plaky s amylínom spojené s diabetes). U týchto látok bolo preukázané, že pomáhajú pri tvorbe Αβ vlákien. Väzby na Αβ sa zúčastňujú ako proteíny jadra, glykozaminoglykánové reťazce perlecanu.

glykozaminoglykány, konkrétne dermatan sulfát, chondroitín-4sulfát alebo pentozan polysulfát sa bežne vyskytujú v amyloidných plakoch rôznych typov a bolo preukázané, že tiež pomáhajú pri tvorbe vlákien. Pôsobenie dextransulfátu je rovnaké. Toto pôsobenie je významne znížené po desulfatácii týchto molekúl. Imunogénne lieky zamerané proti formám glykozaminoglykánov, medzi ktoré patria glykozaminoglykány, tvoria ako súčasť primárnej alebo sekundárnej liečby doplnkové uskutočnenie predkladaného vynálezu. Vytvorenia takýchto molekúl, a rovnako aj liečebných prostriedkov, ktoré obsahujú tieto molekuly, je schopný bežný praktik z odboru.

sulfatovaným aj niektoré

2. Činidlá vyvolávajúce pasívnu imunitnú odpoveď

Liečebné činidlá podlá tohto vynálezu zahŕňajú tiež imunitné látky (napríklad protilátky), ktoré sa špecificky viažu na vláknité peptidy alebo iné zložky amyloidného plaku. Tieto protilátky môžu byť polyklonálne aj monoklonálne, pričom sa viažu špecificky podlá typu amyloidnej choroby. Liečebné prostriedky aj liečebné režimy môžu zahŕňať protilátky zamerané na jednu väzbovú doménu alebo epitop určitej vláknitej alebo nevláknitej zložky plaku, pričom môžu zahŕňať aj protilátky zamerané voči dvom alebo viacerým epitopom na rovnakej zložke alebo protilátky zamerané na epitopy, ktoré sa nachádzajú na viacerých zložkách plaku.

predkladaného 10,5 mesiaca polyklonálnej

V pokusoch uskutočnených na podporu vynálezu boli PDAPP myšiam starým 8,5 až aplikované intraperitoneálne (i.p.) injekcie protilátky proti Αβ42 alebo injekcie monoklonálnej protilátky proti Αβ, špecificky zamerané voči epitopom Αβ peptidu alebo soľný roztok (viď. príklad 11). V týchto pokusoch boli sledované koncentrácie cirkulujúcich udržanie koncentrácie vyššej ako 1 protilátok, pričom na : 1000 (pomer medzi antigénom a proti nemu špecifickej protilátky) boli aplikované posilňovacie injekcie. Zníženie hladiny celkového Αβ bolo v porovnaní s kontrolou pozorované v hipokampe, kôre a v mozočku myší liečených protilátkou; maximálne zníženie bolo v týchto pokusoch pozorované u myší liečených polyklonálnou protilátkou.

V ďalších pokusoch uskutočnených na podporu predkladaného vynálezu (prediktívna ex vivo analýza) bola testovaná čistiaca schopnosť protilátky proti fragmentom synukleínu, známemu ako NAC. Synukleín je proteín spojený s amyloidným plakom. Protilátka proti NAC bola aplikovaná na vzorku mozgového tkaniva, ktorá obsahovala amyloidné plaky a mikrogliálne bunky. Ako kontrola sa použilo králičie sérum. Nasledujúce preskúmanie ukázalo jasné zníženie množstva a rozmerov plakov a preukázalo tak čistiacu schopnosť tejto protilátky.

Z týchto výsledkov je zrejmé, že amyloidné plaky spojené s AD a ďalšími amyloidnými chorobami môžu byť silno potlačené aplikáciou imunitných činidiel zameraných proti epitopom v peptide Αβ alebo proti fragmentu synukleínu NAC. Ďalej je jasné, že ako súčasť liečebných prostriedkov je použiteľný široký rozsah protilátok. Protilátky, ktoré sa špecificky viažu na agregované formy Αβ bez toho, že by sa viazali na jeho disociované formy sú na použitie v tomto vynáleze vhodné, rovnako tak ako protilátky, ktoré sa špecificky viažu na disociovanú formu Αβ bez toho, že by sa viazali na jeho agregovanú formu. Ďalšie vhodné protilátky sú tie, ktoré sa viažu na obidve jeho formy. Niektoré z týchto protilátok sa viažu na prirodzene sa vyskytujúcu krátku formu Αβ (t.j. Αβ39, 40, 41) bez toho, že by sa viazali na prirodzene sa vyskytujúcu dlhú formu (t.j. Αβ42 a Αβ43. Niektoré protilátky sa viažu na dlhú formu bez toho, že by sa viazali na krátku formu. Niektoré protilátky sa viažu na Αβ bez toho, že by sa viazali na amyloidný prekurzorový proteín s úplnou dĺžkou. Niektoré protilátky sa viažu na Αβ s väzbovou afinitou väčšou alebo rovnou 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ alebo 10^1θΜ^_1.

Polyklonálne séra obsahujú zvyčajne zmiešané populácie protilátok, ktoré sa viažu na viacero epitopov po celom Αβ. Monoklonálne protilátky sa viažu špecificky ba epitop v Αβ, pričom tento epitop môže byť konformačný alebo nekonformačný. Niektoré monoklonálne protilátky sa viažu na epitop medzi zvyšky 1 až 28 v Αβ (zvyšok 1 znamená N-koncový zvyšok prirodzeného Αβ). Iné monoklonálne protilátky sa viažu na epitop zo zvyškov 1 až 10 v Αβ. Existujú tiež monoklonálne protilátky, ktoré sa viažu na epitop zo zvyškov 1 až 16 v Αβ. Niektoré monoklonálne protilátky sa viažu na epitop z aminokyselín 1 až 5, 5 až 10, 10 až 15, 15 až 20, 25 až 30, 10 až 20, 20, 30 alebo 10 až 25. U protilátok potom môže byť testovaná ich profylaktická alebo liečebná účinnosť s použitím transgénnych zvierat, čo je opísané v príkladoch.

Podľa tu poskytnutých návodov si praktik môže navrhnúť, vytvoriť a vyskúšať protilátky zamerané na vláknité proteíny alebo peptidy charakteristické pre ďalšie amyloidné ochorenia, medzi ktoré patria choroby opísané v časti 2, pričom môže použiť látky opísané tu, rovnako tak ako protilátky proti iným amyloidným zložkám.

a. Všeobecná charakteristika imunoglobulínov

Základnou stavebnou jednotkou protilátky je tetramér zo štyroch podjednotiek. Každý tetramér je zložený z dvoch rovnakých párov polypeptidových reťazcov, pričom každý pár tvorí jeden lahký (okolo 25 kDA) a jeden ťažký (okolo 50 až 70 kDA) reťazec. Časť na amínovom konci každého reťazca obsahuje variabilnú oblasť zloženú zo 100 až 110 alebo viacerých aminokyselín, ktoré primárne zodpovedajú za rozpoznanie antigénu. Časť na karboxylovom konci každého reťazca vymedzuje konštantnú oblasť, ktorá primárne zodpovedá za celkové pôsobenie.

Ľahké reťazce sú označované ako kappa alebo lambda. Ťažké reťazce sú označené ako γ, μ, α, δ alebo ε a vymedzujú izotyp protilátky (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE). Variabilné a konštantné oblasti lahkých a ťažkých reťazcov sú spojené J oblasťou zloženou z asi 12 alebo viacerých aminokyselín s tým, že ťažký reťazec obsahuje tiež D oblasť, zloženú z asi 10 alebo viacerých aminokyselín (vo všeobecnosti viď. Fundamentall Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 1989Ô, Ch. 7 (zahrnuté podlá odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely).

Variabilné oblasti každého z obidvoch párov tvorených ľahkým a ťažkým reťazcom formujú väzbové miesto protilátky, čo znamená, že funkčná protilátka má dve väzbové miesta. Tieto dve väzbové miesta sú rovnaké (s výnimkou bifuknčných alebo bišpecifických protilátok). Všetky reťazce vykazujú rovnakú základnú stavbu relatívne konzervovaných štruktúrnych oblastí (FR), spojených tromi hypervariabilnými oblasťami, ktoré sa nazývajú tiež oblasti určujúce komplementaritu (CDRs). CDRs z dvoch reťazcov každého páru sú zoradené podlá štruktúrnych oblastí, ktoré umožňujú väzbu na špecifický epitop. Ľahké aj ťažké reťazce pozostávajú od N-konca ku C-koncu z domén FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Postupnosť aminokyselín v každej doméne je opísaná v Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 a 1991) alebo v Chothia & Lesk, J. Mol.

Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia a kol., Náture 342: 878 883 (1989) .

b. Tvorba protilátok nepochádzajúcich z človeka

Tvorba protilátok nepochádzajúcich z človeka, napríklad myších, morčacích, králičích alebo krysích môže byť zabezpečená napríklad imunizáciou zvieraťa zložkou plaku, napríklad AB alebo inej vláknitej zložky. Dlhšie polypeptidy, ktoré obsahujú Αβ alebo imunogénny fragment AB alebo antiidiotypické protilátky (protilátky proti protilátke proti AB) AB sa môžu tiež použiť (viď. napríklad Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (zahrnuté podlá odkazu pre všetky účely). Taký imunogén sa môže získať z prirodzeného zdroja, syntézou peptidu alebo rekombinantnou expresiou. Niekedy sa môže imunogén podávať s adjuvantom. Niektoré typy týchto adjuvantov sú opísané nižšie. Aplikácia kompletného Freundovho adjuvantu nasledovaná aplikáciou nekompletného Freundovho adjuvantu je pri imunizácii laboratórnych zvierat obľúbenou cestou. Na tvorbu polyklonálnych protilátok sa najčastejšie používajú králiky alebo morčatá. Na prípravu monoklonáIných protilátok sa najčastejšie používajú myši. Protilátky sú testované, či sa špecificky viažu na imunogén. Protilátky sú tiež testované, či sa viažu na špecifickú oblasť imunogénu. Napríklad, ak je imunogénom AB, môže sa testovanie uskutočniť určením väzby protilátky na rad mutantov AB s deléciou, z čoho sa potom určí, ktoré mutanty sa viažu na protilátku. Väzba sa môže vyhodnotiť napríklad pomocou Westernovej analýzy (Western blott) alebo pomocou ELISA. Najmenší fragment, ktorý vykazuje špecifickú väzbu s protilátkou vymedzuje epitop protilátky. Špecifita epitopu sa môže tiež určiť kompetičnou analýzou, v ktorej skúmaná a referenčná protilátka súťaží o väzbu s určitou zložkou. Ak skúmaná a referenčná protilátka o väzbu súťaží, potom je zrejmé, že sa viažu na rovnaký epitop alebo na epitopy dostatočne blízke na to, aby väzba jednej protilátky narušila väzbu druhej.

c. Chimérne a humanizované protilátky

Chimérne a humanizované protilátky majú rovnakú alebo podobnú špecifitu a afinitu ako protilátky myší alebo ďalšie protilátky nepochádzajúce z človeka, ktoré poskytujú východiskový materiál na konštrukciu chimérnych a humanizovaných protilátok. Chimérne protilátky sú protilátky, u ktorých boli gény kódujúce lahký a ťažký reťazec umelo vytvorené, najčastejšie spôsobmi genetického inžinierstva, z častí imunoglubulínových génov patriacich iným druhom. Napríklad variabilné (V) časti génov kódujúcich myšiu monoklonálnu protilátku môžu byť spojené s ľudskými konštantnými (C) časťami (napríklad IgGl a IgG4). Typická chimérna protilátka je tak hybridným proteínom, ktorý obsahuje V, alebo doménu viažucu antigén, z myšej protilátky a C, alebo aj efektorovú doménu, z ľudskej protilátky.

Humanizované protilátky majú štruktúru variabilnej oblasti v zásade z ľudskej protilátky (akceptorová protilátka) a u oblasti určujúcej komplementaritu z myšej protilátky (donorový imunoglobulín) (viď. Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10033 (1989) a WO 90/07 861, US 5 693 762, US 5 693 761, US 5 585 089, US 5 530 101 a Winter, US 5 225 539 (zahrnuté podlá odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely). Konštantná oblasť alebo oblasti pokial sú prítomné, pochádzajú od hlavne alebo úplne ľudského imunoglobulínu. Ľudské variabilné domény sú vyberané z ľudských protilátok, ktorých základná štruktúra vykazuje vysoký stupeň zhody v sekvencií s doménami myšej variabilnej oblasti, z ktorej pochádzajú CDRs. Sekvencie variabilnej oblasti ťažkého a lahkého reťazca môžu byť odvodené zo sekvencií rovnakej alebo odlišnej ludskej protilátky. Sekvencie ludskej protilátky môžu byť sekvenciami prirodzene sa vyskytujúcich ľudských protilátok alebo môžu byť konsenzom sekvencií viacerých ludských protilátok (viď. Carter a kol., WO 92/22 653. Určité aminokyseliny z ludskej variabilnej oblasti sú nahradené, čo pramení z ich možného vplyvu na konformáciu CDR a/alebo na väzbu antigénu. Skúmanie týchto možných vplyvov sa uskutočňuje modelovaním, skúmaním vlastností aminokyselín na určitom mieste alebo empirickým pozorovaním účinkov náhrady alebo mutagenézie určitej aminokyseliny.

Keď sa napríklad jedna aminokyselina vo variabilnej oblasti myšej a ľudskej protilátky líši, ľudská aminokyselina by sa mala vymeniť za ekvivalentnú aminokyselinu z myšej protilátky v prípadoch, keď je dôvod očakávať, že aminokyselina:

(1) viaže priamo nekovalentne antigén, (2) nachádza sa neďaleko od CDR oblasti, (3) iným spôsobom interaguje s CDR oblasťou (vyskytuje sa vo vzdialenosti okolo 6 A od CDR oblasti) alebo kandidátmi ktoré sú neobvyklé.

(4) sa podieľa na vzájomnom vzťahu VL-VH.

Ďalšími aminokyseliny, imunoglobulin nahradené aminokyselinami donorovej protilátky alebo pozície typickejšej ľudskej na nahradenie sú akceptorové v tejto pozícii pre ľudský Tieto aminokyseliny môžu byť zo zodpovedajúcej pozície myšej aminokyselinami zo zodpovedajúcej protilátky. Štruktúra variabilnej oblasti humanizovaných imunoglobulínov vykazuje obvykle 85 % sekvenčnú zhodu so sekvenciou ľudskej variabilnej oblasti alebo konsenzom takýchto sekvencií.

d. Ľudské protilátky

Ľudské protilátky proti Αβ sa získavajú rôznymi technikami (viď. nižšie). Niektoré ludské protilátky sa vyberajú v pokusoch s kompetičnou väzbou alebo použitím rovnakej epitopovej špecifity ako určitá myšia protilátka (viď. príklad 11) . Ľudské protilátky môžu byť tiež na určitú epitopovú špecifitu testované s použitím fragmentu Αβ ako imunogénu a/alebo určením väzby protilátky na rad mutantov Αβ s deléciou.

(1) Metodika triómu

Základný postup a príkladný partner pre tu používanú bunkovú fúziu (SPAZ-4) je opísaný v Oestberg a kol., Hybridoma 2: 361 - 367 (1983); Oestberg patent US 4 634 664; a v

Engleman a kol., patent US 4 634 666 (každý z nich je tu

zahrnutý podľa odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely). Bunkové línie tvoriace protilátky, ktoré sa môžu získať týmto spôsobom sa nazývajú triómy, pochádzajú totiž z troch bunkových typov - dvoch ľudských a jedného myšieho. Základom je fúzia buniek myšieho myelómu s ľudským B-lymfocytom, čím vzniká protilátky netvoriaca xenogénna hybridná bunková línia (napríklad SPAZ-4 opísaná Oestberg a kol., viď. vyššie). Xenogénna bunka je potom fúzovaná s imunizovaným ludským Blymfocytom, čím vzniká protilátky tvoriaca triómová bunková línia. Bolo zistené, že triómy tvoria protilátky stabilnejšie ako obyčajné hybridómy pripravené z ľudských buniek.

Imunizované B-lymfocyty sa získavajú z krvi, sleziny, lymfatických uzlín a kostnej drene ľudského darcu. Ak sú potrebné protilátky proti špecifickým antigénom alebo epitopu, potom je vhodné použiť tento antigén alebo jeho epitop na imunizáciu. Imunizácia môže prebiehať buď in vivo alebo in vitro. Na in vivo imunizáciu sa najčastejšie používajú B-bunky izolované z ludí imunizovaných Ah, jeho fragmentom, väčším polypeptidom s obsahom Ah alebo jeho fragmentu, alebo antiidiotypickými protilátkami proti Ah. V niektorých spôsoboch sa používajú B-bunky izolované z rovnakého pacienta, ktorý sa má liečiť podávaním protilátok. Na in vitro imunizáciu sú Blymfocyty vystavené počas 7 až 14 dní antigénu, v médiu (napríklad RPMI-1640) doplnenom 10 % ľudskou plazmou (Engleman, viď. vyššie).

Imunizované B-lymfocyty sú pomocou známych spôsobov fúzované so xenogénnou hybridnou bunkou (napríklad SPAZ-4). Bunky sú vystavené pôsobeniu 40 % až 50 % polyetylénglykolu (m-.v. 1000 až 4000), pri 37 °C počas 5 až 10 minút. Bunky sú oddelené od fúznej zmesi a rozmnožené v médiu vhodnom pre dané hybridy (napríklad HAT alebo AH). Klony, ktoré vylučujú protilátky s požadovanou špecifitou sú určené analýzou kultivačného média triómov. Triómy tvoriace protilátky s požadovanou špecifitou sú ďalej namnožené technikou limitného riedenia a pestovania v in vitro kultúre. U získaných triómových buniek sa ďalej testuje schopnosť viazať Ah alebo jeho fragment.

Aj keď sú triómy geneticky stabilné, nevytvárajú protilátky vo veľkom množstve. Úroveň expresie sa môže zvýšiť zaklonovaním génu protilátky z triómu do jedného alebo viacerých expresných vektorov a transformovaním vektora do štandardných cicavčích, bakteriálnych alebo kvasinkových bunkových línií, pomocou dobre známych spôsobov v odbore.

(2) Transgénny cicavci

Ľudské protilátky proti Αβ môžu byť tvorené aj v transgénnych cicavcoch, ktorí majú zabudovanú v genóme najmenej časť lokusu ľudského imunoglobulínu. Endogénny je obvykle funkčne zahŕňa najlepšie ľahkého a ťažkého imunoglobulínový lokus takého zvieraťa inaktivovaný. Časť ľudského lokusu neusporiadané sekvencie kódujúce časti reťazca. Inaktivácia endogénneho génu pre imunoglobulín a zavedenie exogénneho imunoglobulínového génu sa môže uskutočniť cielenou homológnou rekombináciou alebo zavedením YAC chromozómov. Transgénny cicavci, ktorí takto vznikli, sú schopný funkčne usporiadať sekvencie imunoglobulínových zložiek a exprimovať rad protilátok rôznych izotypov, ktoré sú kódované ľudskými imunoglobulínovými génmi bez toho, že by prebiehala expresia endogénnych imunoglobulínových génov. Príprava a charakteristika cicavcov s týmito vlastnosťami sú podrobne opísané napríklad v Lonberg a kol., WO 93/12 227 (1993); US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318,

650, US 5 770 429, US 5 661 016, US 5 663 425,

US 5 569 825, US 5 545 806, Náture 148: 1547

US 5 789 US 5 625 126,

1553 (1994),

Náture Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (každý z nich je zahrnutý podľa odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely). Transgénne myši sú na tieto účely predovšetkým výhodné. Protilátky proti Αβ sa získavajú imunizáciou

Kucherlapati,

Monoklonálne transgénnych cicavcov (Longberg alebo viď. vyššie) Αβ alebo jeho fragmentom, protilátky sa pripravujú napríklad fúziou Bbuniek z týchto cicavcov s vhodnou myelomovou bunkovou líniou, a to s použitím bežnej techniky (Kohler-Milstein). Ľudské polyklonálne protilátky sa môžu vo forme sér získať tiež z ľudí imunizovaných imunogénnym činidlom. Tieto polyklonálne protilátky môžu byť koncentrované pomocou afinitného

prečistenia s použitím Αβ alebo iného imunogénneho amyloidného peptidu ako afinitné činidlá.

(3) Spôsoby fágového vystavovania

Ďalším spôsobom získania ľudských protilátok proti Αβ je prehľadávanie DNA knižníc z ľudských B-buniek spôsobmi vo všeobecnosti vymedzenými v Huse a kol., Science 246: 1275 1281 (1989) . B-bunky sa môžu rovnako ako v prípade triómov získať z ludí imunizovaných Αβ, jeho fragmentom, väčším polypeptidom s obsahom Αβ alebo jeho fragmentu, alebo antiidiotypickými protilátkami proti Αβ. V niektorých spôsoboch sa používajú B-bunky izolované z rovnakého pacienta, ktorý sa má liečiť podávaním protilátok. Vybrané sú protilátky, ktoré sa viažu na epitop sledovanej amyloidnej zložky (napríklad Αβ alebo jeho fragment). Sekvencie kódujúce tieto protilátky, alebo protilátky viažuce jeho fragment, sú potom klonované a namnožené. Protokol opísaný Huse-om sa stáva účinnejším v kombinácii s technológiou fágového vystavovania (viď. napríklad Dower a kol., WO 91/17 271 a McCafferty a kol., WO 92/01 047, US 5 877 218, US 5 871 907, US 5 858 657, US 5 837 242, US 5 733 743 a US 5 565 332 (každý z nich je zahrnutý podlá odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely). Tieto spôsoby opisujú tvorbu fágových knižníc, kde členovia vystavujú na svojom povrchu rôzne protilátky. Protilátky sú obvykle vystavované ako fragmenty Fv alebo Fab. Protilátky s požadovanou špecifitou vystavované fágmi sú získané afinitným prečistením, s použitím Αβ alebo iného imunogénneho amyloidného peptidu ako afinitného činidla.

Obmenou spôsobu fágového vystavovania môžu byt získané ludské protilátky vykazujúce rovnakú väzbovú špecifitu ako má vybraná myšia protilátka (viď. Winter, WO 92/20 791) . Ako východiskový materiál je v tomto prípade použitá variabilná oblasť ľahkého reťazca alebo ťažkého reťazca vybranej myšej protilátky. Ak je ako východiskový materiál zvolená napríklad variabilná oblasť ľahkého reťazca, potom je fágová knižnica konštruovaná tak, aby jej členovia vystavovali rovnakú variabilnú oblasť ľahkého reťazca a odlišnú variabilnú oblasť ťažkého reťazca. Variabilné oblasti ťažkého reťazca sú získané z knižnice, ktorá obsahuje usporiadané variabilné oblasti ľudského ťažkého reťazca. Vybraný je fág, ktorý vykazuje silnú špecifickú väzbu k sledovanej zložke (napríklad najmenej 10⁸ a najlepšie 10⁹ M'¹) . Variabilné oblasti ludského ťažkého reťazca tohto fágu slúžia ako východiskový materiál na konštrukciu ďalšej fágovej knižnice. V tejto knižnici vystavuje každý fág rovnakú variabilnú oblasť ťažkého reťazca (t.j. oblasť identifikovanú v prvej fágovej knižnici) a odlišnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca. Variabilné oblasti ľahkého reťazca sú získané z knižnice, ktorá obsahuje usporiadané variabilné oblasti ludského ľahkého reťazca. Opäť je vybraný fág vykazujúci silnú špecifickú väzbu so zvolenou zložkou amyloidného peptidu. Tieto fágy vystavujú variabilné oblasti ľudských protilátok špecifických pre amyloidný peptid. Tieto protilátky majú obvykle rovnakú epitopovú špecifitu ako myšie protilátky, ktoré boli použité ako východiskový materiál.

e. Výber konštantnej oblasti

Variabilné oblasti ťažkého a lahkého reťazca chimérnych, humanizovaných alebo ľudských protilátok môžu byť pripojené aspoň k časti ľudskej konštantnej oblasti. Výber konštantnej oblasti záleží čiastočne na tom, či je žiadaná aktivácia komplementu alebo bunkovo sprostredkovanej toxicity (alebo obidvoch súčasne), ktorá závisí na aktivácii protilátkou. Napríklad izotypy IgGl a IgG3 komplement aktivujú, izotypy IgG2 a IgG4 túto schopnosť nemajú. Výber izotypu môže často ovplyvniť prechod protilátky do mozgu. Konštantné oblasti ľahkého reťazca môžu byť lambda alebo kappa. Protilátky môžu byť exprimované ako tetraméry, ktoré obsahujú dva lahké a dva ťažké reťazce, ako samotné ťažké reťazce, ako samotné lahké reťazce, ako Fab, Fab', F(ab’)2 a Fv alebo ako jednoreťazcové protilátky, v ktorých sú variabilné domény lahkého a ťažkého reťazca spojené medzerníkom (spacer).

f. Expresia rekombinantných protilátok

Chimerické, humanizované a ludské protilátky sú najčastejšie vytvárané s použitím rekombinantnej expresie. Rekombinantné polynukleotidové konštrukty typicky obsahujú sekvenciu riadiacu expresiu, spojenú so sekvenciou kódujúcou

reťazce protilátky, ktoré zahŕňajú prirodzene spojené alebo heterológne promótorové oblasti. Sekvencie riadiace expresiu sú najlepšie eukaryotné promótorové vektoroch schopné transformovať eukaryotickú bunku.

príslušného hostiteľa, pre vysokú a na odber optimálnych sekvencií, protilátok.

Tieto organizme

Akonáhle je je hostiteľ úroveň systémy, ktoré sú vo alebo transfektovať vektor zabudovaný do udržiavaný v podmienkach expresie nukleotidových a čistenie krížovo reagujúcich expresné vektory sa najčastejšie v hostiteľskom replikujú ako epizómy alebo ako integrálna (integrovaná) časť hostitelskej chromozomálnej DNA. vektory bežne obsahujú selekčné značky, napríklad voči ampicilínu alebo hydromycínu, ktoré

Expresné odolnosť umožňujú identifikáciu tých buniek, požadovanými sekvenciami DNA.

ktoré boli transformované

E. coli je prokaryotický hostiteľ, ktorý je na klonovanie DNA sekvenciou z predkladaného vynálezu predovšetkým vhodný. Mikroorganizmy, ako napríklad kvasinky, sú na takú expresiu tiež užitočné. Uprednostňovaným kvasinkovým hostiteľom s vhodnými vektormi, ktoré obsahujú sekvenciu riadiacu expresiu, sekvenciu ma začatie replikácie, terminačnú sekvenciu atď., je Saccharomyces. Typické promótory zahŕňajú 3-fosfoglycerát kinázu a ďalšie enzýmy glykolýzy. Indukovatelné kvasinkové promótory zahŕňajú okrem iného promótory z alkoholdehydrogenázy, izocytochrómu C a enzýmy zodpovedné za odbúravanie maltózy a galaktózy.

Cicavčie bunky sa prednostne používajú na expresiu nukleotidových sekvencií kódujúcich imunoglobulíny alebo ich fragmenty (viď. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, 1987). V tomto odbore bolo vyvinutých vela použitelných bunkových línií, schopných vylučovať intaktné heterológne proteíny. Medzi tieto línie patria CHO bunkové línie, rôzne COS bunkové línie, HeLa bunky, L bunky a myelómové bunkové línie. Expresné vektory pre tieto bunky môžu obsahovať sekvencie riadiace expresiu (napríklad replikačný počiatok), promótor, zosilňovač (enhancer) a miesta nevyhnutné na spracovanie informácií, medzi ktoré patria miesta pre väzbu ribozómu, miesta, kde dochádza k zostrihu RNA, polyadenylačné miesta a sekvencie na termináciu transkripcie. Najčastejšie používané sekvencie riadiace expresiu sú promótory odvodené od endogénnych génov cytomegalovírusu, SV40, adenovírusu, hovädzieho papilomavírusu atď. (viď. Co a kol., J. Immunol. 148: 1149, 1992).

Sekvencie kódujúce protilátky môžu byť vo forme transgénov vstavané tiež do genómu transgénneho zvieraťa, a potom získané z mlieka (napríklad podľa spôsobov opísaných v US 5 741 957, US 5 304 489, US 5 849 992, všetky tu zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti). Medzi vhodné transgény patrí sekvencia kódujúca ľahké alebo ťažké reťazce (alebo obidva reťazce súčasne) vo funkčnom spojení s promótorom a zosilňovačom, pochádzajúcimi z génu špecifického pre mliečnu žľazu (napríklad kazeín alebo β-laktoglobulín).

Vektory, ktoré obsahujú potrebné časti DNA, sa môžu dobre známymi spôsobmi (záleží na type hostiteľskej bunky) vložiť do hostiteľskej bunky. U prokaryotických buniek sa napríklad používa transfekcia pomocou chloridu vápenatého, zatiaľ čo transfekcia do iných typov buniek využíva pôsobenie fosforečnanu vápenatého, elektroporáciu, lipofekciu a transfekciu pomocou biolistiky alebo vírusu. Ďalšie spôsoby transfekcie buniek používajú polybrén, fúziu protoplastov, lipozómy elektroporáciu a mikroinjekcie (vo všeobecnosti viď. Sambrook a kol., vyššie). Na tvorbu transgénnych zvierat sa môžu transgény mikroinjektovať do oplodnených oocytov alebo môžu byť zabudované do genómu embryonálnych kmeňových buniek a jadrá týchto buniek sa môžu preniesť do enukleovaných oocytov.

Vytvorené protilátky sa môžu očistiť podľa štandardných spôsobov, medzi ktoré patrí HPLC, stĺpcová chromatografia, gélová elektroforéza atď. (vo všeobecnosti Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982).

4. Ďalšie liečebné činidlá

Liečebné činidlá používané v opisovaných spôsoboch zahŕňajú tiež T-bunky, ktoré sa viažu na plakovú zložku (napríklad peptid Αβ). T-bunky môžu byť proti peptidu Αβ

aktivované napríklad expresiou génu ľudského MHC triedy I a génu ľudského fi₂-mikroglobulínu v hmyzej bunkovej línii, čím sa na ich povrchu vytvorí komplex, ktorý sa môže viazať s peptidom Αβ. T-bunky, ktoré sa dostanú do kontaktu s touto bunkovou líniou, sa aktivujú špecificky proti tomuto peptidu (viď. Peterson a kol., US 5 314 813). Hmyzie bunkové línie exprimujúce antigén MHC triedy II sa môžu podobne použiť na aktiváciu CD4 T-buniek.

5. Nosné proteíny

Niektoré činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď obsahujú príslušný epitop, ktorý vyvoláva imunitnú odpoveď proti amyloidným usadeninám, ale sú príliš malé na to, aby boli imunogénne. V tejto situácii môže byť peptidový imunogén spojený s vhodným nosičom, ktorý pomáha vyvolať imunitnú odpoveď. Vhodné nosiče zahŕňajú sérové albumíny, hemocyanín z Diodora aspera, molekuly imunoglobulínu, tyroglobulín, ovalbumín, toxoid tetánu alebo toxoid z inej patogénnej baktérie napríklad diftérie, E. coli, cholera alebo H. pylori) alebo oslabený derivát toxínu. Ďalšie nosiče zahŕňajú epitopy T-buniek, ktoré sa viažu na mnohé alely MHC (napríklad najmenej na 75 % všetkých ľudských MHC aliel). Také nosiče sú niekedy v odbore nazývané ako univerzálne epitopy T-buniek. Príklady univerzálnych epitopov T-buniek zahŕňajú:

Chrípkový hemaglutinín: HA307-319PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1), PADRE: AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2),

Maláriu CS: T3 epitop: EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3),

Povrchový antigén hepatitídy B: HBsAgi9_₂₈FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 4),

Protein tepelného Šoku 65: hsp65i₅₃-i7iDQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 5),

Bacillus Calmette-Guerin QVHFQPLPPAWKL (SEQ ID NO: 6),

Toxoid tetánu: TT₈₃₀-844QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7),

Toxoid tetánu: TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 8),

HIV gpl 20 TI: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 9).

Ďalšie nosiče, ktoré stimulujú alebo zosilňujú imunitnú odpoveď zahŕňajú cytokíny ako IL-1, IL-Ια a β peptidy IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF a chemokíny ako MIP1 α a β a RANTES. Imunogénne činidlá môžu byť spojené tiež s peptidmi, ktoré zvyšujú transport cez tkanivá (viď. O'Mahony, WO 97/17 613 a WO 97/17 614).

Imunogénne činidlá môžu byť napojené na nosiče pomocou chemického spájania. Techniky napojenia imunogénu na nosič zahŕňajú tvorbu disulfidových mostíkov s použitím Nsukcínimidyl-3-(2-pyridyltio) propionátu (SPDP) a sukcínimidyl 4-(N-maleimidometyl) cyklohexán-l-karboxylátu (SMCC) (keď peptidu chýba sulfhydrylová skupina, môže sa mu poskytnúť pridaním cysteínového zvyšku). Tieto látky tvoria disulfidové mostíky medzi sebou a peptidovým cysteínom na jednom proteíne a amidové spojenie cez eta-aminoskupinu lyzínu alebo volnú aminoskupinu inej aminokyseliny. Rôzne také činidlá, ktoré tvoria disulfidové a amidové spojenia sú opísané v Immun. Rev. 62, 185 (1982). Iné bifunkčné spájanie činidlá tvoria skôr ako disulfidové spojenia, spojenia tioéterové. Vela z týchto činidiel tvoriacich tioéterové spojenia sú komerčne dostupné a zahŕňajú reaktívne estery kyseliny 6-maleimidokaprovej, kyseliny brómoctovej, kyseliny 2-jódocotvej a kyseliny 4-(Nmaleimidometyl) cyklohexán-l-karboxylovej. Karboxylové skupiny môžu byť aktivované skombinovaním so sukcinimidom alebo so sodnou soľou kyseliny l-hydroxyl-2-nitro-4-sírovej.

Imunogénne peptidy môžu byť exprimované tiež ako proteíny fúzované s nosičmi (t.j. heterológne peptidy). Imunogénny peptid môže byť napojený cez svoj amínový koniec, karboxylový koniec alebo obidvomi koncami na nosič. Imunogénny peptid sa môže vo fúznom proteíne vyskytovať vo viacerých kópiách. Imunogénny peptid môže byť tiež napojený na viacero kópií heterológneho peptidu, napríklad svojim C-koncom aj N-koncom. Niektoré nosné proteíny slúžia na vyvolanie odpovedí pomocných T-buniek voči sebe samým. Aktivované pomocné T-bunky potom obratom vyvolávajú odpoveď B-buniek proti imunogénnemu peptidu pripojenému k nosnému peptidu.

Niektoré činidlá podlá tohto vynálezu obsahujú fúzny proteín, v ktorom je N-koncový fragment Αβ napojený svojím Ckoncom k nosnému peptidu. N-koncový zvyšok fúzneho proteínu je v týchto činidlách tvorený N-koncovým zvyškom fragmentu Αβ. Takéto fúzne proteíny účinne pôsobia pri vyvolávaní protilátok, ktoré vyžadujú, aby epitop v N-koncovom zvyšku bol vo volnej forme. Niektoré z vynájdených činidiel obsahujú v molekule viackrát opakovane N-koncové časti Αβ, ktoré sú svojím C-koncom napojené na jednu alebo viacero kópií nosného peptidu. N-koncový fragment Αβ, zabudovaný v týchto fúznych proteínoch začína niekedy v Αβ1-3 a končí v Αβ7-11. Uprednostňovanými fragmentárni Αβ sú Αβ1-7, Αβ1-3, Αβ1-4, Αβ1-5 a Αβ3-7. Niektoré fúzne proteíny obsahujú rôzne N-koncové časti Αβ za sebou. Fúzny proteín môže obsahovať napríklad Afil7 nasledovaný heterológnym peptidom.

V niektorých fúznych proteínoch je N-koncová časť Αβ fúzovaná svojím koncom s heterológnym nosným peptidom. Rovnako rôzne N-koncové fragmenty Αβ sa môžu použiť aj na fúzie s Ckoncom. Niektoré fúzne proteíny obsahujú heterológny peptid napojený na N-koniec N-koncovej časti Αβ, ktorá je ďalej napojená na jednu alebo viacero ďalších N-koncových častí Αβ za sebou.

Niektoré príklady fúznych proteínov vhodných na použitie v tomto vynáleze sú ukázané nižšie. Niektoré z týchto fúznych proteínov obsahujú časti Αβ spojené s epitopmi toxoidu tetánu (viď. US 5 196 512, EP 378 881 a EP 427 347) . Niektoré fúzne proteíny obsahujú časti Αβ napojené na nosné peptidy opísané v US 5 736 142. Niektoré heterológne peptidy predstavujú pre Tbunky univerzálne epitopy. V niektorých spôsoboch je činidlo určené na podanie len jednoduchý fúzny proteín s časťou Αβ spojenou s časťou heterológnou v lineárnej konfigurácii. V niektorých spôsoboch je činidlom multimér zložený z fúznych proteínov opísaných vzorcom 2^X, kde X znamená číslo od 1 do 5. x je prednostne 1, 2 alebo 3, pričom 2 sa uprednostňuje najviac. Keď x je 2, obsahuje multimér 4 fúzne páry spojené do konfigurácie známej ako MAP4 (viď. US 5 299 490) . Epitopy Αβ sú podčiarknuté.

Konfigurácia MAP4 je zobrazená nižšie. Vetvené štruktúry vznikajú zahájením syntézy peptidu ako v N-koncovom amíne lyzínu, tak aj v amíne bočného reťazce lyzínovej molekuly. Na tom, koľkokrát je lyzín v sekvencií zabudovaný a môže sa vetviť, závisí konečné množstvo vzniknutých N-koncov. V tomto prípade vznikajú z rozvetveného lyzínu v jadre molekuly štyri identické N-konce. Táto mnohopočetnosť výrazne zvyšuje schopnosť odozvy B-buniek.

AN90549 (ΑβΙ-7/toxoid tetánu 830-844 v konfigurácii MAP4): DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 10)

AN90550 (ABl-7/toxoid tetánu 947-967 v konfigurácii MAP4): DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKV5A5HLE (SEQ ID NO: 11)

AN90542 (ΑβΙ-7/toxoid tetánu 830-844 + 947-967 v lineárnej konfigurácii):

DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12) AN90576 (AB3-9/toxoid tetánu 830-844 v konfigurácii MAP4): EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 13)

Peptidy opísané v US 5 736 142 (všetky v lineárnych konfiguráciách):

AN90562 (ΑβΙ-7/peptid) :

AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID NO: 14)

AN90543 (Afil-7 x 3/peptid):

DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKÄAA (SEQ ID NO: 15)

Ďalšie príklady fúznych proteínov (imunogénny zvýraznený) zahŕňajú:

epitop Αβ je

AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ IDNO: 16)

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17)

DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 18) FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 19) EFRHDSG-ISQAVHAAHAEÍNEAGR (SEQ ID NO: 20) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ IDNO: 21)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 23)

DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 24)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 25)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELC

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 26)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELC

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 27) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 28) 2 včtve

Lys-Gly-Cys

EQVTNVGGAISOAVHAAHAEINEAGR (fúzny proteín v konfigurácii MAP-4; SEQ ID NO: 29).

Rovnaké alebo podobné nosné proteíny a spojenia sa môžu použiť na tvorbu imunogénov, stimuláciu protilátok proti Αβ pri pasívnej synukleínu spôsoby ich určených na imunizácii.

Napríklad /di alebo jeho fragment napojený na nosič sa môžu podávať laboratórnym zvieratám, ktoré následne tvoria monoklonálne protilátky proti Αβ.

6. Nukleové kyseliny kódujúce liečebné činidlá

Imunitná odpoveď proti amyloidným usadeninám môže byť vyvolaná tiež podaním nukleových kyselín kódujúcich vybrané peptidové imunogény alebo protilátky a ich reťazce, ktoré sa používajú pri pasívnej imunizácii. Také nukleové kyseliny môžu vyť DNA alebo RNA. Časť nukleovej kyseliny kódujúca imunogén je typicky napojená na regulačné prvky (napríklad promótor alebo zosilňovač), ktoré umožňujú expresiu časti DNA vo zvolených cieľových bunkách pacienta. Na expresiu, ktorá je žiadúca na vyvolanie imunitnej odpovede, je vhodné použiť promótor a zosilňovač z génov pre ľahký alebo ťažký reťazec imunoglobulínu alebo hlavný promótor a zosilňovač skorých génov u CMV. Spojené regulačné prvky a kódujúce sekvencie sú často vložené do vektora. Pri podávaní dvojreťazcových protilátok sa môžu dva reťazce vložiť do jedného alebo viacerých oddelených vektorov.

K dispozícii je množstvo vírusových vektorov, medzi ktoré patria retrovírusové vektory (viď. napríklad Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102 - 109, 1993); adenovírusové vektory (viď. napríklad Bett a kol., J. Virol. 67, 5911,

1993); vírusové vektory spojené s adenovírusmi (viď. napríklad Zhou a kol., J. Exp. Med. 179, 1867, 1994), vírusové vektory z rodiny poxvírusov, ako je napríklad vírus vakcínie a vtáčie poxvírusy, vírusové vektory z rodu a vírusov, napríklad vektory odvodené od vírusu Sindibis a vírusu SFV (Semliki forest vírus) (viď. napríklad Dubensky a kol., J. Virol. 70, 508 - 519, 1996), od vírusu venezuelskej konskej encefalitídy (viď. US 5 643 576) a vírusové vektory z rabdovírusov (napríklad vírus vezikulárnej stomatídy, viď. WO 96/34 625) a z papilomavírusov (Ohe a kol., Human Gene Therapy 6, 325 333, 1995); Woo a kol., WO 94/12 629 a Xiao & Brandsama,

Nucleic Acids. Res. 24, 2630 - 2622).

DNA kódujúce imunogén alebo vektor s touto DNA môžu byť zabalené do lipozómov. Vhodné lipidy a príbuzné analógy sú opísané patentami US 5 208 036, 5 264 618, 5 279 833 a 5 283 185. Vektory a DNA kódujúce imunogén môžu byť tiež adsorbované alebo napojené na časticové nosiče (napríklad polyméry polymetylmetakrylátu a polylaktidy a poly(laktid-ko-glykozidy) (vo všeobecnosti viď. McGee a kol., J. Micro Encap., 1996).

Vektory pre génovú terapiu alebo samotná DNA môžu byť do pacienta dopravené in vivo s tým, že podanie je najčastejšie systemické (napríklad intravenózne, intramuskulárne, subdermálne alebo intrakraniálne infúzie) alebo lokálne (viď. napríklad US 5 399 346). Tieto vektory môžu ďalej obsahovať zosilňujúce činidlá ako napríklad bupivakaín (US 5 593 970) . DNA môže byť podávaná použitím génovej zbrane (viď. Xiao & Brandsma, vyššie). DNA kódujúca imunogén je vyzrážaná na povrchu mikroskopických kovových guličiek. Mikroprojektily sú urýchlené tlakovou vlnou expandujúceho héliového plynu a prenikajú tkanivami do hĺbky niekoľkých bunkových vrstiev. Vhodný je napríklad prístroj The Accel™ Gene Delivery Device (Agrocetus, Inc., Middleton, WI) . Holá DNA môže prechádzať kožou do krvného obehu jednoduchou aplikáciou na chemicky alebo mechanicky porušenú kožu (viď. WO 95/05 853).

Vektory kódujúce imunogény sa môžu do buniek dostať ex vivo, ako napríklad do buniek získaných z pacienta (napríklad lymfocyty, vzorky kostnej drene, vzorky tkaniva) alebo do univerzálnych darcovských krvotvorných kmeňových buniek. Nasledujúcim krokom je reimplantácia buniek do pacienta, ktorú predchádza obvykle výber buniek, ktoré prijali vektor.

7. Testovanie očisťovacej schopnosti protilátok

Príklad 14 opisuje spôsoby testovania účinnosti protilátok pri očisťovaní od amyloidných usadenín. S cielom testovania účinnosti pri očisťovaní od amyloidných usadenín, boli z pacientov alebo zvierat trpiacich amyloidózou odobraté vzorky tkaniva (napríklad mozgové tkanivo pri Alzheimerovej chorobe. Vzorky sú skontaktované s fagocytárnymi bunkami nesúcimi Fc receptor (napríklad mikrogliálne bunky) a s testovanou protilátkou prítomnou v médiu in vitro. Fagocytárne bunky môžu byť primárnou kultúrou alebo bunkovou líniou (napríklad BV-2, C8-B4 alebo THP-1). Tieto zložky sú na zosilnenie mikroskopického pozorovania skombinované na mikroskopickom sklíčku, pričom vela pararelných reakcií môže byť uskutočnených v jamkách mikrotitračnej doštičky. V tomto prípade môžu byť jednotlivé miniatúrne mikroskopické sklíčka upevnené do jednotlivých jamiek. Použiť sa môžu tiež iné spôsoby detekcie Αβ (napríklad ELISA). Najčastejšie sa uskutočňuje séria meraní množstva amyloidných usadenín v reakčnej zmesi in vitro, pričom bazálna hodnota znamená množstvo amyloidu v reakčnej zmesi pred začatím reakcie. Antigén môže byť detegovaný farbením (napríklad fluorescenčné označená protilátka proti Αβ alebo inej zložke amyloidného plaku). Protilátka používaná na farbenie môže, ale nemusí byť tá istá protilátka, ktorá je testovaná. Znížená množstva amyloidného plaku vzhladom k bazálnej hodnote znamená, že testovaná protilátka má očisťovaciu schopnosť. Takého protilátky bývajú užitočné pri prevencii alebo liečbe Alzheimerovej choroby a ďalších amyloidogénnych. ochorení. Ako už bolo opísané vyššie, pokusy uskutočňované na podporu predkladaného vynálezu a používajúce tieto analýzy odhalili, že protilátky proti NAC fragmentu synukleínu sú účinné pri očisťovaní od amyloidných plakov, charakteristických pre Alzheimerovu chorobu.

D. Pacienti podrobujúci sa protiamyloidným liečebným režimom

Pacienti podrobujúci sa liečbe zahŕňajú jedincov s rizikom vzniku choroby, ktorí ešte nevykazujú symptómy choroby, rovnako tak ako pacienti, u ktorých amyloidóza už prepukla. V prípade Alzheimerovej choroby je potencionálnym budúcim zasiahnutým každý, kto žije dostatočne dlho. Predkladané spôsoby sa môžu teda používať v rámci profylaxie širokou populáciou bez toho, že by bolo nutné zisťovať riziko u jednotlivého pacienta. Predkladané spôsoby sú predovšetkým vhodné pre jedincov, ktorí sú dedične zviazaní s výskytom Alzheimerovej choroby alebo akejkolvek geneticky danej amyloidnej poruchy. Medzi týchto jedincov patria tí, ktorí majú príbuzných trpiacich takou chorobou alebo tí, ktorým bolo riziko vzniku choroby oznámené po analýze genetických alebo biochemických indikátorov. Genetické indikátory poukazujúce na možné riziko vzniku Alzheimerovej choroby zahŕňajú mutácie v •ť.··

géne APP, najmä však mutácie v pozícii 717 (Hardyho mutácie) a v pozíciách 670 a 671 (švédska mutácia) (viď. Hardy, TINS, vyššie). Ďalšími indikátormi sú mutácie v génoch presenilínu, PSI a PS2, ApoE4, rodinná história výskytu Alzheimerovej choroby, hypercholesterolémia alebo ateroskleróza. Jedinci, ktorí už Alzheimerovou chorobou trpia, môžu byť rozpoznaní ako podlá charakteristickej demencie, tak aj podlá prítomnosti vyššie opísaných rizikových faktorov. Existuje tiež množstvo diagnostických testov na identifikáciu jedincov s AD, medzi ktoré patrí meranie hladín CSF x a AE42. Zvýšená hladina x a nízka hladina Αβ znamená prítomnosť AD. Jedinci trpiaci Alzheimerovou chorobou môžu byť diagnostikovaní tiež pomocou kritérií MMSE alebo ADRDA, čo je diskutované v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

U asymptomatických pacientov môže liečba začať v akomkoľvek veku (napríklad 10, 20, 30) . Liečba však nie je obvykle nutná pokial pacient nedosiahne 40, 50 alebo 70 rokov. Typická liečba znamená aplikáciu viacerých dávok počas časového obdobia. Liečba môže byť sledovaná analyzovaním protilátkových alebo T alebo B-bunkových odpovedí na liečebné činidlo (napríklad peptid Αβ) (viď. príklad 1 a 2). Ak odpoveď poklesne, aplikuje sa posilňovacia látka. V prípade rozvinutia Downovho syndrómu môže liečba začať pred narodením, a to podávaním liečebného činidla matke, a alebo krátko po narodení.

Ďalšie formy amyloidóz často prebiehajú nediagnostikované, okrem prípadov, keď existuje zvláštne podozrenie pre vznik choroby. Jedným z prvých príznakov je výskyt srdcového alebo obličkového ochorenia u pacientov stredného a staršieho veku, pričom pacienti javia tiež príznaky účasti (ukladania v plakov v) ďalších orgánov. Nízke napätie alebo extrémne odchýlky osy EKG a zväčšené tkanivo srdcovej predsiene môžu byť známkami srdcovej poruchy. Proteinúria je symptómom účasti obličiek. Ak sa pri vyšetrení pacienta zistí hepatomegalia, tak existuje podozrenie účasti pečene. Periférna neuropatia sa obvykle pri určitých formách amyloidóz vyskytuje tiež, pričom autonómna neuropatia, ktorá je charakteristická posturálnou hypotenziou sa môže objaviť tiež. Každý jedinec s progresívnou neuropatiou neurčitého pôvodu by mal byť podozrievaný z výskytu amyloidózy. V prípadoch, keď je nutné, môže sa konečná diagnóza určiť zo vzoriek napadnutého orgánu alebo orgánov. Vzorky sú zafarbené farbou Congo Red, pričom pozitívne vzorky vykazujú v polarizovanom svetle dvoj lom jablkovo zelenej farby.

E. Liečebné režimy

Pri profylaktickom použití sa môžu farmaceutické prostriedky alebo lieky podávať pacientovi, ktorý je náchylný k vzniku určitej choroby alebo tu existuje iné riziko pre jej vznik, a to v množstve, ktoré je dostatočné na odstránenie alebo zníženie rizika vzniku ochorenia alebo jeho oddialenie. Pri terapeutickom použití sú liečebné prostriedky alebo lieky podávané pacientovi, u ktorého je podozrenie z výskytu ochorenia alebo ním už trpí, a to v množstve dostatočnom na vyliečenie alebo aspoň na čiastočné potlačenie symptómov choroby a s chorobou spojených komplikácií. Množstvo dostatočné na splnenie práve uvedeného sa nazýva ako terapeuticky alebo farmaceutický účinná dávka. Ako pre profylaktické, tak aj pre terapeutické účely sú činidlá obvykle podávané vo viacerých dávkach, a to tak dlho, pokial sa nedosiahne dostatočná imunitná odpoveď. Imunitná odpoveď sa sleduje, a keď začína imunitná odpoveď klesať, sú podávané ďalšie dávky.

Účinné dávky prostriedkov podľa predkladaného vynálezu, určené na liečbu vyššie opísaných stavov, sú závislé na mnohých rôznych faktoroch, medzi ktoré patria spôsoby podania, cieľové miesto, fyziologický stav pacienta a to, či je pacientom zviera alebo človek, ďalšie podávané lieky a to, či aplikácia prebieha s cieľom profylaxie alebo terapie. Pacientom je obvykle človek, alebo u niektorých chorôb (napríklad s priónmi spojená choroba šialených kráv) môže byť pacientom iný cicavec ako človek, napríklad hovädzí dobytok. Liečebné dávky je kvôli optimalizácii bezpečnosti a účinku nutné titrovať. Množstvo imunogénu záleží na tom, či sa podáva tiež adjuvant, pričom väčšie dávky sú vo všeobecnosti potrebné pri neúčasti adjuvantu. V závislosti na imunogenicite príslušného imunogénu sa množstvo imunogénu na podanie môže pohybovať od 1 pg do 500 pg na pacienta a od 5 pg do 500 pg na injekciu určenú ľudského pacientovi. Občas sa používajú vyššie dávky, t.j. 0,5 až 5 mg na injekciu. Na injekciu určenú ľudskému pacientovi sa používajú dávky najmenej okolo 10, 20, 50 alebo 100 pg. Čas aplikácie sa môže významne líšiť, a to od frekvencie jedenkrát denne až po frekvenciu jedenkrát ročne alebo až jedenkrát za desať rokov, akokoľvek sú kvôli svojej úspešnosti uprednostňované posilňovacie dávky imunogénu. Podľa tu uvedených postupov sa môžu účinné dávky sledovať analýzou vzoriek tekutiny z pacienta (najčastejšie vzorky krvného séra) a určením protilátkového titra proti imunogénu, a to s použitím v odbore dobre známych spôsobov, ktoré sa môžu podľa konkrétneho antigénu ďalej prispôsobiť. Najvýhodnejšie je získanie vzorky tkaniva ešte pred aplikáciou prvej dávky, pričom ďalšie vzorky sa potom odoberajú a titrujú po každej imunizácii. Žiadanou je dávka alebo dávkovacie, schémy, ktoré poskytujú titre najmenej štyrikrát vyššie ako sú kontrolné hladiny alebo hladiny pozadia, pričom sérum je nariedené 1 : 100 a pozadie je definované ako vo vzťahu ku kontrolným vzorkám séra alebo vo vzťahu k hodnote pozadia u ELISA testov. Podlá predkladaného vynálezu sú žiadúce titre najmenej 1 : 1000 alebo 1 : 5000.

V ktorýkoľvek deň, keď dochádza k podaniu imunogénu spolu s adjuvantom, je dávka väčšia ako 1 pg na pacienta, a ešte lepšie vyššia ako 100 pg na pacienta. Keď je adjuvant neprítomný, tak je množstvo imunogénu na pacienta vyššie ako 10 pg, a ešte lepšie vyššie ako 100 pg. Dávky jednotlivých imunogénov, zvolených v súlade s predkladaným vynálezom, sú určené štandardnými dávkovacími a titrovacími spôsobmi. Typický režim pozostáva z imunizácie nasledovanej v časových intervaloch (napríklad 6 týždňov) posilňovacími injekciami. Iný režim pozostáva z imunizácie nasledovanej posilňovacími injekciami po 1, 2 a 12 mesiacoch. Iný režim zahŕňa injekciu vždy po každých dvoch mesiacoch až do konca života. Posilňovacie injekcie môžu byť v závislosti na zistenom stave imunitnej odpovede podávané nepravidelne.

U pasívnej imunizácie s protilátkou majú dávky rozsah od asi 0,0001 do 100 mg/kg a ešte častejšie od 0,01 do 5 mg/kg, a to podlá hmotnosti pacienta. Dávky môžu byť napríklad 1 mg/kg telesnej hmotnosti alebo 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Ukážkový liečebný režim zahŕňa podávanie jedenkrát za dva týždne alebo jedenkrát za mesiac alebo jedenkrát za tri až šesť mesiacov. Podlá niektorých spôsobov sú súčasne podávané dve alebo viacero monoklonálnych protilátok s rôznou väzbovou špecifitou, pričom dávky každej z nich sa pohybujú vo vymedzených hraniciach. Protilátka sa obvykle podáva viackrát. Intervaly medzi jednotlivými dávkami môžu byť týždenné, mesačné alebo ročné. Intervaly môžu byť aj nepravidelné, čo je určené meraním hladiny protilátky proti Αβ v krvi pacienta. Protilátka môže byť podávaná tiež vo forme prostriedku s postupným uvoľňovaním, čo je prípad, v ktorom môže byť frekvencia aplikácií nižšia. Dávka a frekvencia sa líši v závislosti na polčase života protilátky v pacientovi. Najčastejšie vykazujú najdlhší polčas života ludské protilátky nasledované humanizovanými protilátkami, chimerickými protilátkami a zvieracími protilátkami. Dávka a frekvencia podávania sa môže líšiť v závislosti na tom, či je liečba profylaktická alebo terapeutická. Pri profylaktickom použití sa v dlhom časovom intervale aplikujú relatívne nízke dávky s relatívne nízkou frekvenciou. Niektorí pacienti sú liečení počas celého zvyšku života. Pri terapeutickom použití sa aplikujú aj relatívne vysoké dávky v relatívne krátkych intervaloch, pretože niekedy sú nevyhnutné na pribrzdenie postupu choroby alebo jej zastavenie, a alebo najlepšie, na čiastočné alebo úplné vymiznutie symptómov. Potom môže byť pacient liečený podľa profylaktického režimu.

Dávky nukleových kyselín kódujúcich imunogény sa pohybujú v rozsahu od asi 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 pg do 10 mg alebo 30 pg až 300 pg DNA na pacienta. Množstvá infekčných vírusových vektorov sa pohybujú v rozsahu od 10 do 100 alebo viac viriónov na dávku.

Činidlá vyvolávajúce imunitnú odpoveď sa môžu na profylaktické alebo terapeutické použitie podať parenterálne, lokálne, intravenózne, orálnou cestou, subkutánne, intraperi64 toneálne, intranazálne alebo intramuskulárne. Typické cesty podania imunogénneho činidla sú cesta intramuskulárna (i.m.), intravenózna (i.v.) alebo subkutánna (s.c.), avšak ostatné cesty môžu byť rovnako účinné. Intramuskulárna injekcia sa najčastejšie aplikuje do svalov ruky alebo nohy. Podlá niektorých spôsobov sa činidlá injektujú priamo do určitého tkaniva, v ktorom došlo k nahromadeniu usadenín (napríklad Intramuskulárne injekcie alebo sú pri podávaní protilátky

Podlá niektorých spôsobov sú určité liečebné protilátky injektované priamo do lebky. Podľa niektorých spôsobov sa protilátky aplikujú ako prostriedky s postupným uvoľňovaním, pričom použiť sa môžu aj zariadenia konštruované na tieto účely (napríklad Medipad™) .

intrakraniálna intravenózne uprednostňované infúzia) infúzie

Činidlá podľa tohto vynálezu sa môžu ľubovoľne podávať v kombinácii s ďalšími činidlami, ktoré sú pri liečbe amyloidogénnej choroby aspoň čiastočne účinné. V prípade Alzheimerovej choroby a Downovho syndrómu, u ktorých sa amyloidné usadeniny obsahujú v mozgu, môžu sa činidlá podlá tohto vynálezu podávať v spojení s ďalšími činidlami, ktoré zosilňujú prienik činidiel podľa tohto vynálezu cez hematoencefalitickú bariéru. Liečebné koktaily obsahujúce imunogény pripravené tak, že sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti viacerým ako jednej amyloidnej zložke, sú v predkladanom vynáleze zahrnuté tiež, pretože sú kombináciou protilátky zameranej proti jednej plakovej zložke a imunogénu, zameranému proti inej plakovej zložke.

Imunogénne činidlá podľa tohto vynálezu, ako napríklad peptidy, sa podávajú niekedy v kombinácii s adjuvantom. Na vyvolanie imunitnej odpovede sa môže v kombinácii s peptidom (napríklad Αβ) podávať množstvo adjuvantov. Najlepšie je, keď adjuvanty zosilňujú vnútornú odpoveď na imunogén bez toho, že by spôsobovali konformačné zmeny imunogénu, ktoré by zasiahli kvalitatívnu stránku odpovede. Medzi uprednostňované adjuvanty patria hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, 3 De-Oacetylovaný monofosforyllipid A (MPL™) (viď. GB 2 220 211; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, teraz súčasť Corixa). Stimulon™ QS-21 je triterpenový glykozid alebo saponín, izolovaný z kôry stromu Quillaja Saponaria Molina, ktorý sa nachádza v Južnej Amerike (viď. Kensil a kol., Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; eds. Powell & Newman, Plénum Press, NY, 1995; patent US 5 057 540, Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA) . Ďalšími adjuvantami sú emulzie oleja a vody (napríklad skvalenový olej alebo olej z podzemnice olejnej), v lubovolnej kombinácii s imunostimulantami ako je monofosforyllipid A (viď. Stoute a kol., N. Engl. J. Med. 336, 86 - 91, 1997). Ďalším adjuvantom je CpG (WO 98/40 100). Αβ môže byť niekedy spojené s adjuvantom, pričom takéto spojenie by nemalo žiadnym spôsobom zásadne zmeniť konformáciu Αβ, t.j. nemalo by zmeniť povahu ním vyvolanej imunitnej odpovede. Adjuvanty sa môžu podávať ako zložky liečebného prostriedku spolu s účinným činidlom alebo sa môžu podávať samostatne, a to ako pred, spolu s alebo aj po podaní činidla.

Uprednostňovanou skupinou adjuvantov sú soli hliníka (alum), medzi ktoré patria hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a síran hlinitý. Tieto adjuvanty sa môžu použiť buď s lebo bez ďalších imunostimulačných činidiel, akými sú MPL alebo 3-DMP, QS-21, polymérne alebo monomérne aminokyseliny (napríklad kyselina polyglutámová, polylyzín). Ďalšia trieda adjuvantov obsahuje prostriedky na základe emulzie oleja a vody. Tieto adjuvanty sa môžu použiť s alebo bez ďalších špecifických imunostimulačných činidiel, medzi ktoré patria muramylpeptidy (napríklad N-acetylmeramyl-L-treonyl-D-izoglutamín (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-izoglutamín (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín2-(ľ,2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), N-acetylglukaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-izoglu-LAla-dipalmitoxypropylamid (DTP-DPP), theramide™ alebo iné zložky z bunkovej steny baktérií. Emulzie oleja a vody zahŕňajú (a) MF59 (WO 90/14837), ktorý obsahuje 5 % skvalénu, 0,5 % Tween 80 a 0,5 % Span 85 (voliteľne obsahujúci rôzne množstva MTP-PE) , ktoré sú prítomné ako častice s veľkosťou menšou ako 1 μπι, čo sa dosiahne pomocou mikrof luidizéru (napríklad model 110Y, Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, ktorý obsahuje 10 % skvalénu, 0,4 % Tween 80, 5 % pluronic66 blocked polymér L121 a thr-MDP, ktoré sú upravené mikrofluidizérom tak, aby boli prítomné ako častice s veľkosťou menšou ako 1 μπι alebo len premiešané na vortexe (špeciálne laboratórne zariadenie), čo viedlo k tvorbe emulzie s väčšími časticami, a (c) adjuvačný systém s Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), ktorý obsahuje 2 % skvalénu, 0,2 % Tween 80 a jednu alebo viacero zložiek bakteriálnej bunkovej steny, ktorá zahŕňa monofosforyllipid A, dimykolát trehalózy (TDM) a kostru bunkovej steny (CWS), najlepšie však MPL + CWS (Detox™) . Ďalšou triedou používaných adjuvantov sú saponínové adjuvanty, ako napríklad Stimulon™ (QS-21; Aquila, Framingham, MA) alebo z neho vytvorené častice, ako napríklad ISCOMs (imunostimulačné komplexy) a ISCOMATRIX. Ďalšie adjuvanty zahŕňajú nekompletný Freundov adjuvant (IFA), cytokíny, ako napríklad interleukíny (IL-1, IL-2 a IL-12), faktor stimulujúci kolónie makrofágov (M-CSF) a faktor nádorovej nekrózy (TNF). Tieto adjuvanty sú bežne dostupné z komerčných zdrojov.

Adjuvanty sa môžu podávať spolu s imunogénom v jednom prostriedku alebo sa môžu podávať samostatne, a to ako pred, spolu s alebo aj po podaní imunogénu. Imunogén a adjuvant môžu byť balené a dodávané v rovnakej flaštičke s tým, že pred použitím budú premiešané. Imunogén a adjuvant sú balené so značkou udávajúcou predpokladané použitie prostriedku. Ak sú imunogén a adjuvant zabalené oddelene, tak balenie obsahuje pokyny na ich zmiešanie pred použitím. Voľba adjuvantu alebo nosiča (alebo obidvoch súčasne) záleží na takých faktoroch, akými sú stabilita prostriedku s obsahom adjuvantu, spôsob podania, dávkovacia schéma a účinnosť adjuvantu u živočíšnych druhov, ktorým sa podáva. U človeka je uprednostňovaným farmaceutický prijateľným adjuvantom látka, ktorá bola na podávanie schválená príslušným riadiacim orgánom. Príklady takýchto adjuvantov zahŕňajú alum, MPL a QS-21. Súčasne sa môžu použiť aj dva alebo viacero adjuvantov. Uprednostňované kombinácie zahŕňajú alum s MPL, alum s QS-21, MPL s QS-21 a alum, MPL a QS-21 spoločne. Použiť sa môže ako nekompletný Freundov adjuvant (Chang a kol., Advanced Drug Delivery

- 67 Reviews 32, 173 - 186, 1998), prípadne v akejkolvek kombinácii s alum, MPL a QS-21 alebo ich zmesou.

Činidlá podlá tohto vynálezu sú často podávané ako farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú účinné liečebné činidlo a rad ďalších farmaceutický prijatelných zložiek (viď. Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., 1995). Konečné zloženie závisí na predpokladanom spôsobe podania a na liečebnom určení. Prostriedky môžu v závislosti na predpokladanom zložení obsahovať tiež farmaceutický prijatelné netoxické nosiče a rozpúšťadlá, ktoré sa bežne používajú na prípravu farmaceutických prostriedkov, určených na podanie luďom alebo zvieratám. Rozpúšťadlo je vybrané tak, aby neovplyvnilo biologickú účinnosť zmesi. Príklady takýchto rozpúšťadiel sú destilovaná voda, fyziologický roztok solí pufrovaný fosfátom, Ringerove roztoky, roztok dextrózy a Hankov roztok. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať tiež ďalšie nosiče, adjuvanty alebo netoxické, neliečebné, neimunogénne stabilizátory atď.

Farmaceutické prostriedky pomaly metabolizovatelné proteíny, polysacharidy kyseliny, polyglykolové sefaróza, môžu tiež obsahovať velké, makromolekuly, medzi ktoré patria (napríklad chitozán), polymliečne kyseliny a kopolyméry (napríklad agaróza, celulóza atď.), polymérne aminokyseliny, kopolyméry aminokyselín a lipidové agregáty (olejové kvapôčky alebo lipozómy). Tieto nosiče môžu fungovať tiež ako imunostimulačné činidlá (t.j. adjuvanty).

Pri parenterálnom podaní môžu byť činidlá podlá tohto vynálezu aplikované ako injektovateľné roztoky alebo suspenzie látky vo fyziologicky prijatelnom rozpúšťadle s farmaceutický prijateľným nosičom, ktorým môže byť sterilná kvapalina (napríklad voda, oleje, soli, glycerol alebo etanol). Pomocné látky ako sú zvlhčovacie alebo emulzifikačné činidlá, povrchovo aktívne činidlá, pufrujúce látky atď. sa môžu v prostriedku tiež nachádzať. Ďalšie zložky farmaceutického prostriedku sa získavajú z ropy, zo zvierat, zo zeleniny alebo sú syntetického pôvodu (napríklad olej z podzemnice olejnej, sójový olej a minerálne oleje). Pre injektovatelné roztoky platí, že uprednostňovanými kvapalnými nosičmi sú glykoly (napríklad propylénglykol alebo polypropylénglykol). Protilátky sa môžu podať vo forme depotných injekcií alebo implantovaného prípravku, ktorý môže byť prispôsobený na postupné uvoľňovanie účinnej látky. Príkladný prostriedok obsahuje monoklonálnu protilátku v množstve 5 mg/ml vo vodnom pufri, ktorý obsahuje 50 mM L-histidín, 150 mM NaCl, pH upravené na 6,0 pomocou HCI.

Prostriedky sa najčastejšie pripravujú ako injektovatelné roztoky alebo suspenzie. Prostriedok môže byť na zvýšenie adjuvančného účinku tiež emulziíikovaný alebo zabalený v lipozómoch alebo v mikročasticiach (napríklad polyaktid, polyglykolid alebo kopolymér), čo je diskutované vyššie (viď. Langer, Science 249, 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97 - 119, 1997) . Činidlá podľa tohto vynálezu môžu byť podané vo forme depotných injekcií alebo implantovaného derivátu, ktorý môže byť prispôsobený na postupné uvolňovanie účinnej látky.

Prostriedky sú vhodné aj pre ďalšie spôsoby podania, medzi ktoré patria orálne, intranazálne a pulmorálne podanie, čapíky a transdermálne aplikácie.

Čapíky, spájadlá a nosiče obsahujú napríklad polyalkylénglykoly alebo triglyceridy. Čapíky môžu byť vytvorené zo zmesí obsahujúcich účinnú látku v rozsahu od 0,5 % do 10 %, najlepšie však 1 % až 2 %. Prostriedky na orálnu aplikáciu zahŕňajú pomocné látky, medzi ktoré patria manitol, laktóza, škrob, stearan horečnatý, sacharín sodný, celulóza a uhličitan horečnatý. Tieto prostriedky majú podobu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, prípravkov s postupným uvoľňovaním alebo práškov a obsahujú 10 % až 95 % účinnej látky, najlepšie však 25 % až 75 %.

Lokálna aplikácia môže prebiehať transdermálnym alebo intradermálnym podaním. Lokálna aplikácia môže byť zosilnená podaním činidiel alu s toxínom cholery alebo s jeho detoxifikovanými derivátmi alebo s ich podjednotkami alebo s inými podobnými bakteriálnymi toxínmi (viď. Glenn a kol., Náture 391, 851, 1998). Spoločné podanie sa môže dosiahnuť zmiešaním roztokov jednotlivých zložiek alebo spojením ich molekúl chemickým spojením alebo vytvorením fúzneho proteínu z týchto zložiek.

Transdermálna aplikácia sa môže uskutočniť s použitím náplastí alebo pomocou transferozómov (Paul a kol., Eur. J. Immunol. 25, 3521 - 24, 1995; Cevc a kol., Biochem. Biophys.

Acta 1368, 201 - 15, 1998).

F. Diagnostické spôsoby

Tento vynález uvádza spôsoby na zistenie imunitnej odpovede proti AB u pacienta, ktorý trpí alebo je náchylný na Alzheimerovu chorobu. Tieto spôsoby sú predovšetkým užitočné na sledovanie priebehu liečby pacienta. Tieto spôsoby sa môžu použiť na sledovanie postupu liečby u pacientov so symptómami aj na sledovanie profylaktického postupu u asymptomatických pacientov. Tieto spôsoby sú užitočné na sledovanie aktívnej protilátka vytvorená ako odpoveď na podanie imunizácie (meranie hladiny (napríklad imunogénu) protilátky).

1. Aktívna imunizácia

Niektoré spôsoby pasívnej podanej hodnoty zahŕňajú určenie základnej imunitnej odpovede pred podaním dávky činidla a jej porovnanie s hodnotou imunitnej odpovede po liečbe. Významné zvýšenie (t.j. väčšie ako je typická experimentálna chyba v opakovaných meraniach rovnakej vzorky, vyjadrená ako štandardná odchýlka priemeru z týchto meraní) hodnoty imunitnej odpovede signalizuje pozitívny výsledok liečby (t.j. podanie činidla vyvolalo alebo posilnilo imunitnú odpoveď). Ak sa hodnota odpovede nezmení významne alebo poklesne, je to negatívneho výsledku liečby. U pacientov, ktorí podstupujú liečbu s imunogénnym činidlom sa s ďalšou dávkou očakáva zvýšená imunitná odpoveď, ktorú potom prípadne dosiahne plató. Podávanie činidla pokračuje väčšinou tak dlho, pokial sa imunitná odpoveď zvyšuje. Dosiahnutie signálom na prerušenie liečby alebo zníženie dávky, frekvencie podávania.

imunitnej signálom plató je alebo

ΊΟ

Ďalšími spôsobmi sa určuje kontrolná hodnota (t.j. priemer a štandardná odchýlka) imunitnej odpovede u kontrolnej populácie. Jedinci z kontrolnej populácie neabsolvovali predchádzajúcu liečbu. Odmerané hodnoty imunitnej odpovede u pacienta po podaní liečebného činidla sa potom porovnávajú s kontrolnou hodnotou. Významné zvýšenie v pomere ku kontrole (t.j. väčšia ako jedna štandardná odchýlka priemeru) signalizuje pozitívny výsledok liečby. Neprítomnosť významného zvýšenia alebo pokles odpovede znamená negatívny výsledok liečby. V podávaní činidla sa väčšinou pokračuje, pokiai sa hodnota imunitnej odpovede zvyšuje v porovnaní s kontrolnou hodnotou. Dosiahnutie plató je signálom na prerušenie liečby alebo zníženie dávky alebo frekvencie podávania.

Ďalšími spôsobmi sa zisťuje kontrolná hodnota imunitnej odpovede (napríklad priemer a štandardná odchýlka) u kontrolnej populácie jedincov, ktorí sa podrobili liečbe terapeutickým činidlom a ktorých imunitné odpovede dosiahli po liečbe plató. Namerané hodnoty imunitnej odpovede u pacienta sa porovnávajú s kontrolnou hodnotou. Ak nameraná hladina u pacienta nie je významne odlišná (napríklad viac ako jedna štandardná odchýlka) od kontrolnej hodnoty, liečba môže byť prerušená. Ak je pacientova hladina významne pod kontrolnou hodnotou, je zabezpečené ďalšie podávanie činidla. Ak hladina v pacientovi zostane pod kontrolnou hodnotou, tak je nutné zmeniť napríklad liečebná režim alebo použiť iný adjuvant.

Ďalšími spôsobmi sa sleduje imunitná odpoveď pacienta, ktorý sa v súčasnosti liečbe nepodrobuje, ale prekonal ju už skôr, a to s cieľom zistenia, či nie je potrebné liečbu znovu zahájiť. Nameraná hladina imunitnej odpovede pacienta môže byť porovnaná s hodnotou imunitnej odpovede dosiahnutej u pacienta predchádzajúcou liečbou. Významné zníženie v porovnaní s predchádzajúcim meraním (t.j. väčšia ako je typická experimentálna chyba v opakovaných meraniach rovnakej vzorky) je znamením nutnosti pokračovať v liečbe. Hodnota nameraná u pacienta sa môže tiež porovnať s kontrolnou hodnotou (priemer plus štandardná odchýlka) zistenou u populácie pacientov po ukončení liečby. Hodnota nameraná u pacienta môže byť porovnaná s kontrolnou hodnotou u populácie profylaktický liečených pacientov, ktorí nevykazujú symptómy choroby alebo u populácie terapeuticky liečených pacientov, ktorí vykazujú zlepšenie charakteristík ochorenia. Vo všetkých týchto prípadoch je významné zníženie vo vzťahu ku kontrolnej hladine (t.j. viacero ako jedna štandardná odchýlka) znamením toho, že liečba pacienta by sa mala znovu začať.

Analyzované vzorky tkanív pacienta sú typicky krv, plazma, sérum a mukózna alebo cerebrospinálna tekutina. Vo vzorke sa zisťujú známky imunitnej odpovede na sledovanú amyloidnú zložku (napríklad akákoľvek forma peptidu Αβ) . Imunitná odpoveď môže byť určená napríklad podľa prítomnosti protilátok alebo T-buniek, ktoré sa špecificky viažu na sledovanú zložku (napríklad peptid Αβ). Spôsoby ELISA na zistenie protilátok špecifických pre Αβ sú opísané v časti príkladov a môžu sa použiť aj na iné peptidové antigény. Spôsoby zistenia reaktívnych T-buniek sú v odbore dobre známe.

2. Pasívna imunizácia

Postupy na sledovanie pasívnej imunizácie sú väčšinou podobné na postupy na sledovanie aktívnej imunizácie, ktoré boli vyššie opísané. Profil protilátky pri pasívnej imunizácii je typický tým, že okamžitý vrchol koncentrácie protilátky je nasledovaný exponenciálnym poklesom. Bez ďalších dávok dosahuje pokles počas dní až mesiacov (v závislosti na polčase života podanej protilátky) hladiny, ktoré boli namerané pred liečbou. Napríklad polčas života niektorých ludských protilátok sa pohybuje okolo 20 dní.

Podlá niektorých spôsobov sa meranie základnej hladiny protilátky proti Αβ odohráva u pacienta pred prvým podaním činidla, druhé meranie následne po podaní (na určenie vrcholovej hodnoty koncentrácie protilátky) a jedno alebo viacero ďalších meraní sa uskutočňuje v ďalších intervaloch na určenie poklesu hladiny protilátky. Keď hladina protilátky klesne na základnú hladinu alebo do jej blízkosti (napríklad na 50 %, 25. % alebo 10 %), prebehne aplikácia ďalšej dávky protilátky. Podľa niektorých spôsobov sú hodnoty vrcholové a hodnoty zistené v následných meraniach porovnané so skôr nameranými referenčnými hodnotami, ktoré boli stanovené na zabezpečenie užitočných profylaktických alebo terapeutických liečebných režimov u iných pacientov. Keď je nameraná hladina protilátky významne nižšia ako referenčná hladina (napríklad menej ako priemer mínus jedna štandardná odchýlka referenčne j hodnoty v populácii pacientov, u ktorých bola liečba úspešná), je nutné podať ďalšiu dávku protilátky.

3. Diagnostické súpravy

Vynález ďalej opisuje diagnostické súpravy na použitie pri vyššie opísaných diagnostických spôsoboch. Taká súprava typicky obsahuje činidlo, ktoré sa špecificky viaže na protilátky proti zložke amyloidného plaku (napríklad Αβ) alebo reaguje s T-bunkami špecifickými pre danú zložku. Súprava môže obsahovať tiež značku. Pri detekcii protilátok proti Αβ je značka typicky vo forme označených anti-idiotypických protilátok. Na detekciu protilátky môže byť činidlo dodávané tak, že je vopred ukotvené v tuhej fáze (napríklad v jamkách mikrotitračnej doštičky). Na detekciu reaktívnych T-buniek môže byť značkou ³H-tymidín, pomocou ktorého sa meria proliferatívna odpoveď. Súprava je tiež typicky vybavená označením na jej použitie. Označenie môže zahŕňať tiež tabulku alebo iné hodnotenie na koreláciu hladiny nameranej značky s hladinou protilátok proti Αβ alebo T-buniek reagujúcich s Αβ. Termín označenia sa vzťahuje k akémukoľvek opísanému alebo inak zaznamenanému materiálu, ktorý je k súprave pripevnený alebo inak pripojený, a to kedykoľvek počas jej výroby, prevozu, predaja a použitia. Termín označenia zahŕňa reklamné letáky a brožúry, baliace materiály, návody, audio alebo videokazety, počítačové disky, rovnako tak ako nápisy, ktoré sa nachádzajú priamo na súprave.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Protilátkový titer u transgénnych myší po injekcii Afil-42.

Obr. 2: Amyloidné zaťaženie v hipokampe. Percento hipokampálnej oblasti obsadenej amyloidnými plakmi, určenými reaktivitou s Αβ-špecifickou monoklonálnou protilátkou 3D6, bolo určené pomocou počítačovej kvantitatívnej analýzy obrazu. Hodnoty pre jednotlivé myši sú zobrazené v jednotlivých liečebných skupinách. Horizontálna čiara u každej skupiny zobrazuje strednú hodnotu rozdelenia.

Obr. 3: Neuritická dystrofia v hipokampe. Percento hipokampálnej oblasti obsadenej dystrofickými neuritmi, určenými reaktivitou s ľudskou APP-špecifickou monoklonálnou protilátkou 8E5, bolo určené pomocou počítačovej kvantitatívnej analýzy obrazu. Hodnoty pre jednotlivé myši sú zobrazené samostatne pre skupinu vystavenú pôsobeniu AN1792 a kontrolnú skupinu vystavenú pôsobeniu PBS. Horizontálna čiara u každej skupiny zobrazuje strednú hodnotu rozdelenia.

Obr. 4: Astrocytóza v retrospleniálnej kôre. Percento kôrovej oblasti obsadenej astrocytmi vláknitý acidický proteín (GFAP) počítačovej kvantitatívnej analýzy jednotlivé myši sú zobrazené v pozitívnymi na gliálny bolo určené pomocou obrazu. Hodnoty pre jednotlivých liečebných skupinách a horizontálna čiara strednú hodnotu rozdelenia.

u každej skupiny zobrazuje

Obr. 5: Geometrické priemery protilátkových titrov proti AB42 po imunizácii pohybujúcej sa v rozsahu 8 dávok AB42 (ANI1792) obsahujúcich 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 alebo 300 pg.

Obr. 6: Kinetika protilátkovej odpovede na imunizáciu pomocou AN1792. Titre sú vyjadrené ako geometrické priemery každej skupiny so 6 zvieratami.

Obr. 7: Kvantitatívna analýza obrazu kôrového amyloidného zaťaženia u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo AN1792.

Obr. 8: Kvantitatívna analýza obrazu zaťaženia neuritickými plakmi u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo AN1792.

Obr. 9: Kvantitatívna analýza obrazu percenta retrospleniálnej kôry obsadeného astrocytózou u myší vystavených pôsobeniu PBS alebo AN1792.

Obr. 10: Analýza lymfocytovej proliferácie v bunkách sleziny vystavených pôsobeniu AN1792 (horná časť) alebo PBS (dolná časť).

Obr. 11: Totálne hladiny Αβ v mozgovej kôre. Bodový diagram jednotlivých Αβ profilov u myší imunizovaných s Αβ alebo APP derivátmi kombinovanými s Freundovým adjuvantom.

Obr. 12: Amyloidné zaťaženie v kôre určené pomocou kvantitatívnej analýzy obrazu mozgových rezov u myší imunizovaných s konjugátmi Αβ peptidu (Αβ1-5, Αβ1-12 a Αβ1228); Αβ agregáty s plnou dĺžkou - Αβ42 (AN1792) a Afil-40 (AN1528) a liečebná skupina vystavená pôsobeniu PBS.

Obr. 13: Geometrické priemery titrov protilátky špecifické pre Αβ u skupín myší imunizovaných s Αβ alebo APP derivátmi kombinovanými s Freundovým adjuvantom.

Obr. 14: Geometrické priemery titrov protilátky špecifické pre Αβ u skupín morčiat imunizovaných s AN1792 alebo jeho palmytoilovaným derivátom s rôznymi adjuvantami.

Obr. 15 (A - E) : Hladiny Αβ v kôre 12 mesiacov starých PDAPP myší vystavených pôsobeniu AN1792 alebo AN1528 s rôznymi adjuvantami.

Obr. 16: Priemerný protilátkou proti Αβ.	titer	u	myší	liečených	polyklonálnou
Obr. 17: Priemerný protilátkou 10D5 proti Αβ	titer	u	myší	liečených	monoklonálnou
Obr. 18: Priemerný	titer	u	myší	liečených	monoklonálnou

protilátkou 2F12 proti Αβ.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Profylaktická účinnosť Αβ proti Alzheimerovej chorobe (AD)

Tieto príklady opisujú podávanie peptidu AB42 transgénnej myši overexprimujúci APP s mutáciou v pozícii 717 (APP_X77->f) , ktorá vedie k neuropatologii zhodnej s Alzheimerovou chorobou. Vytváranie a charakteristika týchto myší (PDAPP myší) je opísaná v Games a kol., Náture, viď. vyššie. Tieto zvieratá (vo svojej heterozygotnej forme) začínajú ukladať Αβ od šiesteho mesiaca veku. Vo veku 15 mesiacov už vykazujú

- 75 ukladanie Αβ v hladinách zodpovedajúcich Alzheimerovej chorobe. PDAPP myšiam bol injektovaný agregovaný Αβ42 (agregovaný Αβ42) alebo soľný roztok pufrovaný fosfátom. Agregovaný Αβ42 bol vybraný kvôli svojej schopnosti vyvolať tvorbu protilátok proti viacerým epitopom Αβ.

A. Spôsoby

1. Myši

Tridsať PDAPP heterogénnych myších samíc bolo náhodne rozdelených do nasledujúcich skupín: 10 myší na injekciu agregovaného Αβ42 (jedna zomrela pri prevoze), 5 myší na injekciu PBS/adjuvant alebo PBS a 10 myší ako intaktná kontrola. 5 myšiam boli injektované peptidy odvodené zo sérového amyloidného proteínu (SAP).

2. Príprava imunogénov

Príprava agregovaného Αβ42: 2 mg Αβ42 (US Peptides Inc, lot K-42-12) sa rozpustili v 0,9 ml vody a objem bol doplnený do 1 ml pridaním 0,1 ml lOx PBS. Získaná zmes sa vortexovala a nechala sa inkubovať pri 37 °C cez noc, čo sú podmienky, za ktorých peptid agregoval. Nepoužitý Αβ sa skladoval ako suchý lyofilizovaný prášok pri -20 °C, a to až do ďalšej injekcie.

Je nutné poznamenať, že pri použití takýchto komerčne dostupných peptidov môže byť v suchej hmotnosti započítaná aj hmotnosť solí; hmotnosti uvádzané vo všetkých tu opisovaných príkladoch zahŕňajú aj hmotnosti solí (pokial nie je uvedené inak). Presné množstvá peptidov môžu byť stanovené analýzou prostriedku štandardnými spôsobmi, ako napríklad určením množstva dusíka v porovnaní s prostriedkom so známym obsahom dusíka.

3. Príprava injekcií

V každej injekcii, určenej pre jednu myš, sa nachádzalo 100 pg agregovaného Αβ42 v PBS, emulzifikovaného v pomere 1 : 1 s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) s konečným objemom emulzie určenej na prvú imunizáciu 400 μΐ. Prvá imúnizácia bola po dvoch týždňoch nasledovaná posilňovacou injekciou, ktorá obsahovala rovnaké množstvo imunogénu v nekompletnom Freundovom adjuvante (IFA). Dve ďalšie dávky v IFA boli podané

- 76 v mesačnom intervale. Následné imunizácie sa uskutočnili podaním v 500 pl PBS. Injekcie boli aplikované intraperitoneálne (i.p.)

PBS bolo injektované podlá rovnakej schémy, pričom myšiam bola injektovaná zmes PBS s adjuvantom v dávke 400 μΐ na myš alebo 500 pl na myš. Injekcie SAP sa podávali podlá rovnakej schémy, pričom bola použitá dávka 100 pg na injekciu.

4. Titrácia myšej krvi, príprava tkaniva a imunohi-stochémia

Vyššie uvedené spôsoby sú opísané nižšie v kapitole všeobecný materiál a spôsoby.

B. Výsledky

PDAPP myšiam bol injektovaný buď agregovaný AB42 (agregovaný Αβ42), peptidy SAP alebo soľný roztok pufrovaný fosfátom. Jedna skupina PDAPP myší - pozitívna kontrola, bola ponechaná intaktná. Myšie titre protilátok proti agregovanému Αβ42 boli sledované každý ďalší mesiac po štvrtej posilňovacej injekcii, a to až do veku jedného roka. Myši boli usmrtené po 13 mesiacoch života. Vo všetkých sledovaných časových bodoch vykazovalo osem z deviatich myší vysoký titer protilátok proti AB42, pričom táto hladina zostala vysoká počas celého obdobia podávania injekcií (titre väčšie ako 1 : 10000). Deviata myš mala titer nízky, ale meratelný (okolo 1 : 1000) (obr. 1, tabuľka 3). Myši, ktorým bol injektovaný SAP mali titre od 1 : 1000 do 1 : 30000, pričom hodnotu 1 : 10000 prekročila len j edna myš.

Séra z myší liečených PBS boli titrované proti agregovanému AE42 po šiestich, desiatich a dvanástich mesiacoch. V prípade titrovania (v sére riedenom 1 : 100) PBS myší proti agregovanému AE42 bola hranica štvornásobku pozadia prekročená len v jednom časovom bode, pričom v ostatných prípadoch nebola táto hranica prekročená v žiadnom časovom bode (tabuľka 3) . Odpoveď špecifická pre SAP bola v týchto časových bodoch zanedbateľná (titre boli menšie ako 1 : 300).

Sedem z deviatich myší zo skupiny liečenej agregovaným Αβί-42 nevykazovalo v mozgu žiadne zistiteľné amyloidy. Mozgové tkanivo z myší zo skupín liečených SAP a PBS naopak oo c

ro

o	o	o	O	o
o	o	o	O	o
o	o	o	O	o
o	o	o	O	o
o	o	N0	Tt	CM
—
o	o	O	O	O	O
o	o	O	o	O	o
o	o	O	o	o	t-I
o	o	O	o	x
x	m	m	CM	CM	i—1

r~ r-H

Cfl

X

X

M

V

Titre pri 50 % maximálnej O.D. Myši s injektovaným agregovaným Αβ

	O	O	O	o	o
NO o	O	o	o	o	o
O	o	o	o	o
	o	ir>	00	o	o
%	m			vn	r-
	O	O	o	o	o
1/7	o	o	o	o	o	Q
O	o	o	o	o	o	•
	m	m	UC	NT)	o	O
3t			1—>		CM

>

o c

'Φ

Cn

O

C		cn
□
e	<5	X)
H		x
x	%	TT v

υ o

>

Ό •H

Φ

C

TT o	O o o	O o rn	O o TT	O o CN	o o c~	m	•H 'rt e	AM 0 iH
=&					CM	cn	•H N	C Φ Ό Φ		CO -X
	o	o	O	O	O	nJ 44	nJ E	m	X) x
	o	o	O	O	o	ŕH	dP	H
ΓΌ	o	o	o	O	o	P	M	%	V
O	o	un	o	o	o	Λ
%	CM	υη	m	m	Tt	m Eh	O m	H l i

	O	o	o	o	o
	o	o	o	o	o
Γ4 o	o	o	o	o	o
	un	o	o	o	o
%	—·	m	m	x	x

•H

M α

φ

M x

•H

Eh

O ít

o	O	o	o	O
o	o	o	o	o
o	o	o	o	o
o	ι/Ί	on	o	o
v~>	NO	wn	CM	ro

a

W m

cu £

c >

o

X

Φ m

C •H

TT —H %

Ofl

J4 x

tT v

U) o

o o

o

Γ' o

o o

o

CM o

o o

o tT o

o o

X

CM •H >w

CO i—1 —i

4t

Ofl

-X

X

Tt

V x bkg <4 x bkg <4 x bkg <4 x bkg <4 x bkg

Φ í>

(i a

§

Φ υ

Φ

-H

W

Tt X OO

CM

Φ >

(i £i g

Λ

NO

CM vykazovali početné amyloidné usadeniny v hipokampe, rovnako tak ako vo frontálnej a cingulárnej kôre. Spôsob usadzovania bol podobný tomu, ktorý bol pozorovaný u neliečených kontrol, t.j. s charakteristickou účasťou zraniteľných oblastí, medzi ktoré patria vonkajšia molekulová vrstva hipokampálneho dentátneho gyru. U jednej myši zo skupiny s injektovaným Afil42 bolo pozorované veľké zníženie amyloidného zaťaženia v hipokampe. U inej myši z tej istej skupiny bol pozorovaný osamotený plak.

Kvantitatívne obrazové analýzy amyloidného zaťaženia v hipokampe potvrdili jeho dramatické zníženie dosiahnuté u zvierat liečených AB42 (AN1792) (obr. 2). Stredné hodnoty amyloidného zaťaženia v skupine liečenej PBS (2,22 %) a vo vôbec neliečenej skupine (2,65 %) boli v porovnaní so skupinou imunizovanou AN1792 (0,00 %, p = 0,0005) významne vyššie. Stredné hodnoty amyloidného zaťaženia dosahovali v skupine imunizovanej SAP peptidmi (SAPP) hodnoty 5,74 %. Mozgové tkanivo z neliečených kontrolných myší obsahovalo početné usadeniny amyloidu AB, zviditeľnené pomocou Αβ-špecifickej monoklonálnej protilátky (mÄb)3D6 v hipokampe, rovnako tak ako aj v retrospleniálnej kôre. Podobný spôsob usadzovania bol pozorovaný tiež u myší imunizovaných SAPP alebo PBS (obr. 2) . Tri posledné uvedené skupiny boli charakteristické účasťou zraniteľných podoblastí (čo je typické u AD), medzi ktoré patria vonkajšia molekulová vrstva hipokampálneho dentátneho gyru.

Mozgy, ktoré neobsahovali žiadne amyloidné usadeniny, nemali ani neuritické plaky, ktoré je možné bežne zviditelňovať pomocou protilátky 8E5 proti ľudskému APP. Všetky mozgy z ostatných skupín (s aplikovaným SAP alebo PBS a kontrolná skupina) mali početné neuritické plaky, typické pre neliečené PDAPP myši. Malé množstvo neuritických plakov bolo prítomné aj u jednej myši liečenej AN1792 a jeden zhluk neuritických plakov bol pozorovaný aj u druhej myši z tej istej skupiny. Pomocou obrazovej analýzy hipokampu (tiež viď. obr. 3) bola v porovnaní s PBS skupinou (stredná hodnota 0,28 %, p = 0,0005) preukázaná účinná eliminácia dystrofických neuritov u myší liečených AN1792 (stredná hodnota 0,00 %).

- 79 U skupín liečených injekciami ΑβΙ-42 nebola prítomná ani astrocytóza, ktorá je charakteristická pre zápaly spojené s plakmi. Mozgy myší z ostatných skupín obsahovali husté a zhlučené GFAP-pozitívne astrocyty, typické pre gliózu spojenú s plakmi Αβ. Časť sklíčok s na GFAP pozitívne reagujúcimi astrocytmi bola na lokalizáciu plakov Αβ ďalej zafarbená tioflavínom. S. GFAP-pozitívne astrocyty boli spojené s Αβ plakmi u skupín liečených SAP, PBS a v intaktných kontrolách. Žiadne také spojenie nebolo nájdené u myší liečených AB1-42, pričom u jednej myši liečenej AN1792 bola zistená minimálna glióza spojená s plakmi.

Obrazové analýzy retrospleniálnej kôry (obr. 4) potvrdili, že zníženie výskytu astrocytózy boli významné, čo je zrejmé, ak porovnáme priemerné hodnoty jej výskytu u myší liečených AN1792 (1,56 %) a myší imunizovaných SAP peptidmi,

PBS alebo myší intaktných (všetky tri skupiny > 6 %, p = 0,0017) .

Údaje zo vzorky myší, ktorým boli injektované ABl-42 a PBS ukázali, že MHC II imunoreaktivita spojená s plakom sa u ABl-42 myší nevyskytovala, čo zodpovedá neprítomnosti zápalovej reakcie spojenej s Αβ.

Na rezoch z myších mozgov sa skúšalo, či pozitívne reagujú s mAb, ktorý predstavuje špecifickú monoklonálnu protilátku proti MAC-1 (proteín v bunkovej membráne). MAC-1 (CDllb) patrí do rodiny integrínov a vyskytuje sa spolu s CD18 ako heterodimér. Komplex CDllb/CD18 je prítomný na monocytoch, makrofázach, neutrofiloch a NK-bunkách (prirodzený zabíjači) (Mak a Simard). MAC-1 pozitívne bunkové typy v mozgu sú pravdepodobne mikroglie, čo vyplýva z im podobnej morfológie pozorovanej na rezoch, kde došlo k pozitívnej reakcii s protilátkou proti MAC-1. U myší liečených AN1792 bolo možné v porovnaní s kontrolnou skupinou PBS pozorovať nižší výskyt MAC-1 imunoreaktivity, čo zodpovedá neprítomnosti zápalovej reakcie spojenej s Αβ.

C. Záver

Neprítomnosť plakov Αβ a reaktívnych neuronálnych a gliotických zmien v mozgoch myší, ktorým bol injektovaný ABl80 znamená, že v ich mozgoch nedošlo (alebo len v extrémne malom množstve) k uloženiu amyloidu, pričom s tým súvisí aj absencia patologických následkov prípadného ukladania, t.j. napríklad glióza a neuritická glióza a neuritická patológia. PDAPP myši liečené pomocou Afil-42 preukázali úplne zhodnú neprítomnosť patológie ako kontrolné netransgénne myši. Injekcie Αβ1-42 sú takto vysoko účinné pri prevencii ukladania alebo očisťovania ľudského Αβ z mozgového tkaniva, a tiež pri odstraňovaní týmto spôsobených neuronálnych a zápalových degeneratívnych zmien. Podávanie peptidu Αβ môže byť teda použité pri prevencii a liečbe AD.

Príklad 2

Štúdia závislosti na dávke

Skupiny samíc Swiss Webster starých 5 týždňov (N = 6 v skupine) boli imunizované 300, 100, 33, 11, 3, 7, 1,2, 0,4 alebo 0,13 pg Αβ pripraveným v CFA/IFA a podaným intraperitoneálne. Tri dávky boli podané v štrnásťdenných intervaloch, štvrtá dávka bola podaná o mesiac neskôr. Prvá dávka bola emulzifikovaná s CFA, ďalšie dávky boli emulzifikované s IFA. Zvieratám bola na meranie titra protilátok odobratá krv vždy 4 až 7 dní po každej imunizácii tak, že prvý odber sa uskutočnil po druhej dávke. Časti zvierat z každej z troch skupín, ktoré boli imunizované 11, 33 alebo 300 pg antigénu, bola krv odoberaná ešte v štyroch mesačných intervaloch následne po štvrtej imunizácii, s cielom sledovania poklesu protilátkovej odpovede v prípade rôznych dávok imunogénneho prostriedku. Tieto zvieratá dostali poslednú piatu imunizáciu v siedmom mesiaci po zahájené štúdie. O týždeň neskôr sa zvieratám merali protilátkové odpovede proti AN1792 a uskutočnili sa toxikologické analýzy.

U dávok od 300 do 3,7 pg bola pozorovaná odpoveď klesajúca s dávkou, pričom u dvoch najnižších dávok nebola pozorovaná žiadna odpoveď. Priemerné protilátkové titre boli po 3 dávkach okolo 1 : 1000 a po 4 dávkach 11 až 300 pg antigénu okolo 1 : 10000 (obr. 5).

Protilátkové titre u všetkých skupín (okrem skupiny s najnižšou dávkou) po tretej imunizácii dramaticky narástli s tým, že zvýšenie geometrického priemeru titrov (GMT) bolo 5až 25-násobné. Nízka protilátková odpoveď bola zistitelná dokonca aj u recipientov, ktorí dostali dávku 0,4 pg. Skupiny s dávkami 1,2 a 3,7 pg mali porovnateľné titre s GMT okolo 1000, štyri skupiny s najvyššími obdržanými dávkami sa spojili do GMT okolo 25000, s výnimkou skupiny s dávkou 33 pg, ktorej GMT bol 3000. Po štvrtej imunizácii bol u všetkých skupín nárast titra viac pozvoľný. Jasná závislosť na dávke bola pozorovaná u skupín s nižšími dávkami antigénu (od 0,14 pg do 11 pg) siahajúca od žiadnej zistitelnej odpovede (u 0,14 pg) až k GMT 36000 (11 pg) . Titre štyroch najvyšších skupín (11 až 300 pg) splývali opäť dohromady. Po dvoch imunizáciách teda protilátkový titer vykazoval závislosť na dávke antigénu u skupín od 0,4 do 300 pg. Po tretej imunizácii boli titre štyroch najvyšších skupín porovnateľné a po ďalšej imunizácii tvorili plató.

Mesiac po štvrtej imunizácii boli u skupiny s 300 pg titre 2- až 3-krát vyššie, ako keď boli stanovované z krvi odobratej päť dní po imunizácii (obr. 6). Toto zistenie napovedá, že najvyššia protilátková odpoveď sa objavuje neskôr ako 5 dní po imunizácii. Miernejší (50 %) vzostup bol v rovnakom čase pozorovaný u skupiny s dávkou 33 pg. Po dvoch mesiacoch po poslednej dávke klesli GMT u skupiny s 300 pg prudko o 70 t Po ďalšom mesiaci bol pokles miernejší, a to 45 % (100 pg) a asi 14 % (33 a 11 pg). Rýchlosť poklesu cirkulujúcich protilátkových titrov po ukončení imunizácie sa zdá mať bifázový priebeh s prudkým poklesom v prvom mesiaci po najvyššej protilátkovej odpovedi, nasledovaný, potom miernejším poklesom.

Protilátkové titre a kinetika odpovedí myší Swiss Webster sú podobné tým, ktoré sú pozorované u mladých heterozygotných PDAPP transgénnych myší, imunizovaných paralelným spôsobom. Dávky schopné vyvolať u človeka imunitnú odpoveď sú podobné dávkam účinným u myši.

Príklad 3

Preverenie terapeutickej účinnosti proti rozvinutej AD

Táto analýza je určená na testovanie imunogénnych činidiel, konkrétne ich účinnosti zastaviť alebo zvrátiť neuropatologické charakteristiky AD u starých zvierat. Imunizácia so 42 aminokyselín dlhým Αβ (AN1792) začali v čase, keď boli amyloidné plaky v mozgoch PDAPP myší už prítomné.

Počas tejto štúdie vzniklo u neliečených PDAPP myší množstvo neurodegeneratívnych zmien podobných tým, ktoré sa môžu nájsť pri AD (Games a kol., viď. vyššie a Johnson-Wood a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550 - 1555, 1997). Ukladanie Αβ v amyloidných plakoch je spojené s degeneratívnou neuronálnou odpoveďou, ktorá zahŕňa aberantné axonálne a dendritické elementy, nazývané dystrofické neurity. Amyloidné usadeniny, ktoré sú obklopené a tiež obsahujú dystrofické neurity, sa nazývajú neuritické plaky. U AD aj PDAPP myší majú dystrofické neurity zreteľnú globulárnu štruktúru, sú imunoreaktívne s určitými protilátkami rozpoznávajúcimi APP a cytoskeletálne zložky a vykazujú komplexné subcelulárne degeneratívne zmeny na ultraštrukturálnej úrovni. Tieto charakteristiky umožňujú s chorobou súvisiace selektívne, reprodukovateľné meranie tvorby neuronálnych plakov v mozgoch PDAPP myší. Dystrofická neuronálna zložka PDAPP neuritických plakov je pomocou protilátky špecifickej pre ľudský APP (monoklonálna protilátka 8E5) lahko zviditeľňovaná a s pomocou počítačovej analýzy obrazu lahko meratelná. Okrem merania účinkov AN1792 na tvorbu amyloidných plakov sme merali aj účinky tejto liečby na vývoj neuritickej dystrofie.

Astrocyty a mikroglie sú bunky odlišné od neurónov, ktoré zodpovedajú a reagujú na neuronálne poškodenie. GFAP-pozitívne astrocyty a MHC II-pozitívne mikroglie sú pri AD bežne pozorovateľné a ich aktivácia sa zvyšuje so závažnosťou choroby. Preto sme u myší liečených AN1792 pozorovali tiež vývoj reaktívnej astrocytózy a mikrogliózy.

A. Materiál a spôsoby samíc heterozygotných PDAPP myší, vo veku od 11 do 11,5 mesiaca a získaných z Charles River Laboratories, bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín: 24 myší na imunizáciu so 100 pg AN1792 a 24 myší na imunizáciu s PBS, v obidvoch prípadoch v kombinácii s Freundovým Adjuvantom. Skupiny s AN1792 a PBS boli opäť rozdelené na dosiahnutie cca 15. mesiaca veku. V 15. mesiaci veku bola približne polovica zvierat u každej skupiny usmrtená (n = 10 pre AN1792 a n = 9 pre PBS), pričom u druhej polovice (n = 9 pre AN1792 a n = 12 pre PBS) sa pokračovalo v imunizáciách až do 18. mesiaca. 8 zvierat (5 AN1792 a 3 PBS) počas štúdie zomrelo. Okrem imunizovaných zvierat boli na porovnanie ELISA testov na množstvo Αβ a APP v mozgu do štúdie pridané ešte intaktné PDAPP myši staré 1 rok (n = 10), 15 mesiacov (n = 10), 18 mesiacov (n = 10) ; jednoročné zvieratá boli zahrnuté tiež v imunohistochemických analýzach.

Použitá metodológia bola zhodná ako v príklade 1 (pokial nie je uvedené inak). AN 1792 od US Peptides (kat. č. 12) a California Peptides (kat. č. ME 0339) boli použité na prípravu antigénu určeného pre šesť imunizácii uskutočnených pred 15. mesiacom. Výrobky ME0339 a ME0439 od California Peptides boli použité pre tri dodatočné imunizácie uskutočnené medzi 15. a 18. mesiacom.

100 μg AN1792 v 200 μΐ PBS alebo PBS samotné bolo emulzifikované 1 : 1 (obj.) s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) alebo s nekompletným Freundovým adjuvantom (IFA) alebo s PBS s konečným objemom emulzie 400 μΐ. Adjuvantom pri prvej imunizácii bolo CFA, ďalšie dve dávky boli podané v IFA a posledné štyri dávky v samotnom PBS bez adjuvantu. Celkovo imunizácia prebehla počas sedemmesačného intervalu deväťkrát, pričom prvé tri injekcie v dvojtýždňovom intervale, ďalšia injekcia potom v mesačnom intervale. Skupina liečená len štyri mesiace a usmrtená v 15. mesiaci veku sa podrobila len prvým šiestim imunizáciám.

B. Výsledky

1. Účinok liečby pomocou AB42 (AN1792) na amyloidné zaťaženie

Účinky liečby AN1792 na kôrové amyloidné zaťaženie, určené pomocou kvantitatívnej analýzy obrazu sú uvedené na obr. 7. Priemerná hodnota kôrového amyloidného zaťaženia bola u skupiny intaktných 12-mesačných PDAPP myší 0,28 %, čo predstavuje plakové zaťaženie myší pri začatí štúdie. U 18mesačných PBS myší narástlo amyloidné zaťaženie viac ako 17krát na 4,87 %, zatial čo u myší liečených AN1792 došlo k veľkému zníženiu amyloidného zaťaženia (0,01 %), čo je v porovnaní s 12-mesačnými intaktnými myšami a 15- a 18mesačnými myšami liečenými PBS pozoruhodne málo. Amyloidné zaťaženie bolo v 15. (96 % zníženie; p = 0,003) aj v 18. mesiaci (> 99 % zníženie; p = 0,0002) u príjemcov AN1792 významne znížené.

Kôrové ukladanie amyloidu začína u PDAPP myší typicky vo frontálnej a retrospleniálnej kôre (RSC) a pokračuje ventrolaterálnym smerom k temporálnej a entorinálnej kôre (EC). V EC 12 mesiacov starých myší, čo je vek, v ktorom bolo prvýkrát podané AN1792, nebol nájdený amyloid žiadny alebo len v malom množstve. Po štyroch mesiacoch liečby AN1792 bolo zásadne znížené amyloidné ukladanie v RSC, pričom postupné usadzovanie amyloidu v EC bolo podávaním AN1792 úplne eliminované. Naposledy uvedené pozorovanie ukazuje, že AN1792 úplne zastavilo postupné ukladanie amyloidu, ktoré by za normálnych okolností postúpilo do temporálnej a ventrálnej kôry. Podávanie AN1792 tiež zastavilo a pravdepodobne aj zvrátilo ukladanie amyloidu v RSC.

Zásadné účinky AN1792 na postup ukladania amyloidu v kôre u PDAPP myší je ďalej preukázané na 18-mesačnej skupine, ktorá bola liečená počas 7 mesiacov. Myš liečená pomocou AN1792 vykazovala skoro úplnú absenciu kôrového amyloidu, úplnú absenciu difúznych plakov a zníženie množstva existujúcich usadenín.

2. Bunkové a morfologické zmeny spojené s liečbou pomocou AB42 (AN1792)

V častiach mozgu, ktoré sú typické výskytom amyloidných usadenín, bola nájdená populácia Αβ-pozitívnych buniek. Je pozoruhodné, že u niekolkých mozgov z myši liečených AN1792 nebolo nájdené žiadne množstvo extracelulárnych kovových plakov alebo len malé množstvo. Zdá sa, že väčšina imunoreaktivity bola lokalizovaná na vnútrajšok buniek s velkým laločnatým alebo zhluknutým somatom. Fenotypicky sa tieto bunky podobali aktivovaným mikrogliám alebo monocytom. Imunoreaktívne protilátky špecificky rozpoznávajúce ligandy exprimované monocytmi a mikrogliou (MHC II a CDllb) a boli príležitostne spojené so stenou alebo lumen krvných kapilár. Porovnanie prilahlých rezov označených protilátkami špecifickými pre Αβ a MHC II odhalilo, že obidve protilátky sa viazali na rovnaké typy buniek. Podrobné skúmanie mozgov vystavených pôsobeniu AN1792 viedlo k zisteniu, že výskyt MHC II-pozitívnych buniek bol u týchto zvierat obmedzený na okolie zvyšných amyloidov. Za použitých podmienok fixácie neboli bunky imunoreaktívne na protilátky špecificky rozpoznávajúce ligandy T-buniek (CD3, CD3e) alebo B-buniek (CD45a, CD45RB) alebo na obvyklý leukocytový antigén (CD45), ale reagovali s protilátkou rozpoznávajúcou leukozialín (CD43) , ktorá krížovo reaguje s monocytmi. Žiadne také bunky neboli nájdené u myší vystavených pôsobeniu PBS.

PDAPP myši vytvárajú stále rozsiahle amyloidné usadeniny vo vonkajšej molekulovej vrstve dentátneho gyru. Usadeniny tvoria zreteľný pruh v perforovanej dráhe, čo je podoblasť, ktorá pri AD klasicky obsahuje amyloidné plaky. Charakteristický vzhľad týchto usadenín u myši vystavených pôsobeniu PBS pripomínal ten, ktorý bol už skôr opísaný u neliečených PDAPP myší. Amyloidné usadeniny pozostávali z difúznych aj kompaktných plakov v súvislom pásiku. U mnohých mozgov z myší liečených AN1792 bol naopak tento vzhľad výrazne zmenený. Hipokampálne amyloidné usadeniny už neobsahovali difúzne amyloidy a pásikavé usporiadanie bolo úplne roztrhané. Namiesto toho bolo prítomné množstvo neobvyklých bodkovaných štruktúr, ktoré reagovali s protilátkami proti Αβ, pričom sa zdalo, že niektoré z nich sú bunkami s obsahom amyloidu.

MHC II-pozitívne bunky boli u zvierat liečených AN1792 opakovane pozorované v susedstve extracelulárneho amyloidu. Spôsob združenia Αβ-pozitívnych buniek s amyloidom bol velmi podobný tomu, ktorý bolo možné pozorovať u niektorých mozgov získaných z myší vystavených pôsobeniu AN1792. Výskyt týchto monocytov bol obmedzený na oblasť priľahlú k amyloidnej usadenine, pričom v iných mozgových oblastiach bez plakov Αβ, bol úplne nulový.

Kvantitatívna analýza obrazu rezov označených protilátkami proti MHC I a MHC II odhalila tendenciu opísanú narastajúcou imunoreaktivitou v RSC a v hipokampe u myší vystavených pôsobeniu AN1792, v porovnaní so skupinou myší liečených pomocou PBS, ktoré vykazovali len významné zvýšenie MHC I-imunoreaktivity v hipokampe.

Tieto výsledky sú dôkazom aktívneho, bunkovo sprostredkovaného odstránenia amyloidu z mozgových oblastí, kde sa vyskytoval.

3. Účinky AN1792 na hladiny Αβ: ELISA testy (a) Hladiny v mozgovej kôre

Priemerná hodnota celkového množstva Αβ v kôre PDAPP myší bola v 12. mesiaci 1600 ng/g a v 15. mesiaci narástla na 8700 ng/g (tabuľka 4). V 18. mesiaci bola táto hodnota 22000 ng/g, čo je od začiatku experimentu viac ako 10-násobný vzostup. Celkové množstvo Αβ u zvierat liečených PBS bolo v 15. mesiaci 8600 ng/g s tým, že toto množstvo narástlo v 18. mesiaci na 19000 ng/g. Celkové množstvo Αβ u zvierat liečených AN1792 bolo v 15. mesiaci 1600 ng/g, čo je o 81 % menej ako v prípade PBS. U zvierat liečených AN1792 bolo v 18. mesiaci celkové množstvo Αβ 5200 ng/g, čo je v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne menej (o 72 p = 0, 0001) (viď. tabulka 4). Podobné výsledky boli u týchto dvoch skupín nájdené pri porovnávaní hladín Αβ v kôre. V tomto prípade však boli rozdiely hladín Αβ významné v 15. (p = 0,04) aj 18. mesiaci (p = 0,0001, tabuľka 4).

Os

Γ4		o	o
CT	Ol	o	o
r-	Tt	m	o
F-·	co.	Ί
Z	<
<

CM		o
Os	CN	o
t	’tf
.H	CO.
Z	<	(N CN

o o

o

CO m

Stredné hodnoty hladín AB v kôre (ng/g)

·>.		•			o	» O
>	O	o			o	O
o	o	o		o	ΙΖΊ	O\
	Ό	(N	tn		N*	o
o	t	Μ'Ί	(D	CN	ι/Ί
U			tn	U

σι

CM

CN	o	o
xt	o	o
CO.	CM	Os
<	r~~	in	m

	S	o	CN
		o	o
		o	O
(Λ	CN —4»	Γ-
m	XJ CO.	tn	r-
Cl.	c	m	vn

o o

U

O

O

SO

O

O

Q~1

Os (0

Λ!

ŕH

P n

nJ

H

C

Ό nJ >1

4J

	o	O
>	o	O
o		Tt
.—•4	o	ir>
<υ	N“	VO
u

		o	O	o	o C		Έ'	O	o	o
c (D					Ό 0 Λ	sH C Φ
>U					Ό	>□		O	o	o
Φ	CN	o	o	o	Φ	CN	o	o	o
•H	*3	o	o	o	C	•H	N		TJ·	CM
r—1	cO_	Γ*Ί	m	m	Ό		CO.		TT	<φ
d)	<		oo	oo	Φ	Φ	<	—·		SO
2					M +J	2

ω

> o	o	O	o
N	o	o	o
S	SO	Γ-	CN
U		ΟΟ	CN CN

«U fN > CM — — O TJ- O O O θ' θ' II II n, o.

>	o	O	o
o	o	o	o
	ι/Ί	ir>	oo
OJ	tT)		o
U			00

.ID >

CM

0,0105

0,00221

CL. Q.

ο —i O\ tn c

CO.

<

o

TJ

U p~ oo r-Γ T}oi oj

Λ!

>U

O _

N 'C

O e

>

O\

OJ ω

nl

Λί ŕH

Λ m

H

c	CZ3
	tt
Ό	tt	CO.
m		<
r-·1 x		t' o
P		’o
0 c Ό 0 x:		CJ

m ’Φ '0) c

Ό <11

M

4J ω

c Φ >u Φ •H f—I Φ z co.

<

o

t)

U \D

ΙΤΊ ro

OI

C5

IO m

oo o

o o

><D >

OJ

Q.

mesiaci priemerne a v 15. mesiaci (b) Hladiny v hipokampe

U intaktných PDAPP myší boli v 12. hodnoty celkového množstva Αβ 15000 ng/g narástli na 51000 ng/g a ešte ďalej v 18. mesiaci na 81000 ng/g (tabulka 5). PBS myši vykazovali v týchto časových bodoch hodnoty 40000 ng/g (15. mesiac), resp. 65000 ng/g (18. mesiac). Zvieratá imunizované AN1792 vykazovali nižšie celkové množstvá Αβ, a to 25000 ng/g (15. mesiac) a 51000 ng/g (18. mesiac). Hodnota Αβ bola u skupiny liečenej AN1792 v 18. mesiaci významne nižšia ako u skupiny liečenej PBS (p = 0,0105, tabuľka 5). Meranie Αβ42 dávalo výsledky podobného typu, t.j. jeho hladina bola v 18. mesiaci u skupiny AN1792 v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne nižšia (39000 ng/g v porovnaní s 57000 ng/g, p = 0,002) (tabulka 3).

(C) Hladiny v mozočku

Priemerné hodnoty celkového množstva Αβ v mozočku boli u neliečených PDAPP myší v 12. mesiaci 15 ng/g (tabulka 6). V 15. mesiaci narástlo toto množstvo na 28 ng/g a v 18. mesiaci na 35 ng/g. U zvierat liečených PBS boli namerané priemerné hodnoty 21 ng/g (15. mesiac) a 43 ng/g (18. mesiac). Zvieratá liečené AN1792 mali v mozočku v 15. mesiaci 22 ng/g celkového Αβ a v 18. mesiaci významne nižšie (p = 0,002) množstvo ako skupina liečená PBS, a to 25 ng/g (tabulka 6).

4. Účinky liečby pomocou AN1792 na hladiny APP

Ako molekula APP- a, tak aj molekula APP s úplnou dĺžkou obsahujú časť alebo celú sekvenciu Αβ, takže môžu byť pri imunitnej odpovedi proti AN1792 potencionálne zasiahnuté. Súčasné štúdie opisujú mierny vzostup hladiny APP ako neuropatológiu u PDAPP myší. Hladiny APP-α/FL (plná dĺžka) alebo APP-a v kôre zostali po liečbe v podstate nezmenené, len v prípade APP-a bola u myší liečených AN1792 v 18. mesiaci nameraná o 19 % nižšia hladina ako u myší liečených PBS. Hodnoty APP u myší liečených AN1792 neboli v 18. mesiaci významne odlišné od hodnôt nameraných u myší neliečených (v 12. a 15. mesiaci) a u myší liečených PBS (v 15.mesiaci) . Vo všetkých prípadoch zostali hladiny APP v medziach, ktoré je možné normálne nájsť u PDAPP myší.

5. Účinky liečby pomocou AN1792 na neurodegeneratívne a gliotické zmeny

U myší liečených AN1792 došlo vo frontálnej kôre v porovnaní s PBS skupinou k významnému zníženiu neuritického plakového zaťaženia, a to v 15. (84 p = 0,03) aj 18.

mesiaci (55 %; p = 0,01) (obr. 8). Priemerné hodnoty neuritického plakového zaťaženia narástli u skupiny PBS medzi 15. a 18. mesiacom z 0,32 % na 0,49 %. U skupiny liečenej

AN1792 však došlo k zásadnému zníženiu množstva neuritických plakov, pričom priemerné hodnoty neuritického plakového zaťaženia boli 0,05 % (15. mesiac) a 0,22 % (18. mesiac).

Imunizácia pomocou AN1792 v porovnaní so skupinou liečenou PBS významne znížila reaktívnu astrocytózu v RSC, a to v 15. (o 56 %; p = 0,011) aj v 18. mesiaci (o 39 %; p = 0,028) (obr. 9). Priemerné percentuálne hodnoty astrocytózy v PBS skupine narástli medzi 15. a 18. mesiacom zo 4,26 % na 5,21 %. Liečba pomocou AN1792 potlačila vývoj astrocytózy v obidvoch časových bodoch, a to na 1,89 %, resp. na 3,2 %. To znamená, že pri liečebnom procese nedochádzalo k poškodeniu neuropilu.

6. Protilátkové odpovede mesiacov staré, heterozygotné PDAPP myši (N = 24) boli podrobené sérii 5 imunizácií so 100 pg AN1792 emulziíikovanom vo Freundovom adjuvante, pričom aplikácia prebiehala intraperitoneálne v týždňoch 0, 2, 4, 8 a 12 s tým, že pri šiestej imunizácií (v 16. týždni) bol Freundov adjuvant nahradený PBS. Ako negatívna kontrola slúžilo 24 transgénnych myší rovnakého veku, ktoré boli imunizované PBS emulzifikovanom s rovnakými adjuvantami a v rovnakej časovej schéme. Krv bola zvieratám odoberaná medzi tretím a dňom po každej imunizácií, začínajúc druhou

Protilátkové odpovede na AN1792 boli Geometrický priemer titrov (GMT)

AN1792 po druhej, tretej a poslednej (šiestej) dávke približne 1900, 7600 a 45000. U kontrolných zvierat neboli po šiestej imunizácií namerané žiadne protilátky špecifické pre Αβ. Približne polovica zvierat bola liečená počas ďalších troch siedmim dávkou.

merané pomocou ELISA.

bol u zvierat imunizovaných mesiacov, pričom imunizácie prebiehali v 20., 24. a 27. týždni. Každá z týchto dávok bola podaná v samotnom PBS, t.j. bez Freundovho adjuvantu. Priemerné protilátkové titre zostali počas tejto periódy nezmenené. V skutočnosti sa zdalo, že protilátkové titre zostali v období od piatej do deviatej imunizácie nezmenené.

U časti rezov z myší liečených AN1792 a PBS bolo skúšané, či pozitívne reagujú s protilátkou špecifickou pre myší IgG, a to s cielom zistenia, či Αβ-špecifické protilátky, vyvolané v myšiach pôsobením AN1792, boli tiež spojené s mozgovými amyloidnými plakmi. Na rozdiel od skupiny liečenej PBS, boli Αβ plaky v mozgoch vystavených pôsobeniu AN1792 pokryté endogénnym IgG. Tento rozdiel mohol byť u obidvoch skupín pozorovaný v 15. aj 18. mesiaci. Prekvapujúca bola najmä neprítomnosť IgG u skupiny liečenej PBS, aj keď mozgy týchto myší obsahovali rozsiahle amyloidné usadeniny. Tieto výsledky ukazujú, že imúnizácia pomocou syntetického proteínu Αβ vedie k vzniku protilátok, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na Αβ v amyloidných usadeninách.

7. Bunkovo sprostredkované imunitné odpovede

Z deviatich myší (18 mesačné PDAPP myši) imunizovaných AN1792 a z 12 myší imunizovaných PBS sa sedem dní po deviatej imunízácii vybrali sleziny. Splenocyty boli izolované a kultivované počas 72 h v prítomnosti Αβ40, Αβ42 alebo Αβ40-1 (proteín s obrátenou sekvenciou). Mitogén Con A slúžil ako pozitívna kontrola. Optimálne odpovede sa dosiahli s menej ako 1,7 μΜ proteínom. Bunky so všetkých deviatich zvierat liečených AN1792 odpovedali na aplikáciu proteínu Αβ1-40 alebo Αβ1-42 proliferáciou, pričom hodnoty inkorporácie obidvoch proteínov boli zhodné (obr. 10, horná časť). Aplikáciou reverzného proteínu Αβ40-1 nebola dosiahnutá žiadna odpoveď. Bunky z kontrolných zvierat žiadnym spôsobom nereagovali na žiadny z Αβ proteínov (obr. 10, spodná časť).

C. Záver

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že imúnizácia pomocou ANI792 vedie u PDAPP myší, ktoré sa vyznačujú výskytom amyloidných usadenín, k spomaleniu a prevencii postupného ukladania amyloidu, pričom s amyloidom súvisiace neuropatologické zmeny sú tiež odvrátené. Imunizácia s AN1792 podstatne zastavila amyloidné ukladanie v štruktúrach, ktoré by za normálnych okolností podľahli amyloidóze. Podávanie peptidu Αβ je teda prospešné pri liečbe AD.

Príklad 4

Štúdia fragmentov Αβ

100 PDAPP myší vo veku od 9 do 11 mesiacov bolo s cieľom určenia epitopov vedúcich k účinnej odpovedi imunizovaných pomocou fragmentov APP a Αβ, ktoré obsahovali 9 rôznych oblastí týchto molekúl. Injekcie obsahujúce 9 rôznych imunogénov a kontrolu boli aplikované i.p. Imunogény zahŕňali štyri ludské konjugáty peptidu Αβ, a to 1 až 12, 13 až 28, 32 až 42, 1 až 5, pričom všetky boli cysteínovými mostíkmi pripojenými k ovčiemu IgG špecifickému proti myšiemu, ďalej APP polypeptid s aminokyselinami 592 až 695, agregovaný ľudský Αβ1-40, a agregovaný ľudský Αβ25-35, a agregovaný hlodavčí Αβ42. Agregované Αβ42 a PBS boli použité ako pozitívne resp. negatívne kontroly. Každú liečebnú skupinu tvorilo desať myší. Titre boli monitorované ako už bolo uvedené vyššie a myši boli usmrtené na konci štvrtého mesiaca podávania injekcií. Histochémia, hladiny Αβ a toxikologické analýzy boli uskutočnené posmrtne.

A. Materiál a spôsoby

1. Príprava imunogénov

Príprava spojených Αβ peptidov: štyri konjugáty ľudského Αβ (aminokyselinové zvyšky 1 až 5, 1 až 12, 13 až 28 a 33 až 42, každý konjugovaný s ovčím IgG špecifickým proti myšiemu) boli pripravené spojením cez cysteín (syntetický) , ktorý bol k peptidu Αβ pridaný pomocou spojovacieho činidla sulfo-EMCS. Deriváty Αβ peptidu boli nasyntetizované s nižšie uvedenou výslednou sekvenciou. U každej sekvencie je podčiarknutím zvýraznený vložený cysteínový zvyšok. Derivát Αβ13-28 mal pred koncovým cysteínom na karboxylovom konci ešte dva cysteínové zvyšky, čo je tiež znázornené.

ΑβΙ-12 peptid NH2-DAEFRHDSGYEVC-C00H (SEQ ID NO: 30)

AB1-5 peptid NH2-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO: 31)

ΑΛ33-42 peptid NH2-C-kyselina aminoheptanoiková-GLMVGGWIA-COOH (SEQ ID NO: 32)

AJ313-28 peptid Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 33)

Pri príprave spojovacej reakcie bolo 10 mg ovčieho IgG špecifickému proti myšiemu (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dialyzované cez noc s pufrom (10 mM boritan sodný, pH 8,5). Dialyzovaná protilátka bola potom s použitím skúmavky Amicon Centriprep skoncentrovaná do konečného objemu 2 ml. 10 mg sulfo-EMCS [N (γ-maleimidokuproyloxy) sukcínimidu] (Molecular Sciences Co.) bolo rozpustených v 1 ml deionizovanej vody. 40-násobný molárny prebytok sulfo-EMCS bol za stáleho miešania po kvapkách pridaný k ovčiemu IgG špecifickému proti myšiemu a potom bol roztok miešaný počas ďalších 10 minút. Aktivovaný ovčí IgG špecifický proti myšiemu bol prečistený prechodom cez 10 ml gélovú filtračnú kolónu (Pierce Presto Column, získaná od Pierce Chemicals) naplnenú 0,1 M NaPO₄, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcie obsahujúce protilátku, identifikované pomocou absorbancie pri 280 nm, boli zhromaždené a zriedené do koncentrácie približne 1 mg/ml, a to s použitím pomeru 1,4 mg/OD ako extinkčného koeficienta. 40násobný molárny prebytok Αβ peptidu bol rozpustený v 20 ml 10 mM NaPO₄, pH 8,0, pričom výnimkou bol peptid AÔ33-42, ktorý bol najskôr rozpustený v 0,5 ml DMSO a potom doplnený do 20 ml pomocou 10 mM NaPO₄ pufra. Roztok každého peptidu bol pridaný k 10 ml aktivovaného ovčieho IgG špecifického proti myšiemu a daný na 4 h do miešačky (pri izbovej teplote). Výsledné konjugáty boli s použitím skúmavky Amicon Centiprep skoncentrované do konečného objemu menšieho ako 10 ml a potom dialyzované PBS, s cielom výmeny pufra a odstránenia voľného peptidu. Konjugáty boli s cielom sterilizácie prefiltrované cez filter s pórmi s veľkosťou 0,22 pm a potom rozdelené do podielov po 1 mg, zmrazené a skladované pri -20 °C. Koncentrácie konjugátov boli určené pomocou BCA proteínovej analýzy (Pierce Chemicals) s použitím konského IgG pre štandardnú krivku. Konjugáciu bolo možné doložiť nárastom molekulárnej molekulárnej špecifického hmotnosti konjugovaných peptidov vztiahnutú k hmotnosti samotného aktivovaného ovčieho IgG proti myšiemu. Konjugát Αβ1-5 a ovčieho IgG špecifického proti myšiemu bol zhromaždený z dvoch konjugácii, ostatné konjugáty boli získané z jedinej konjugačnej reakcie.

2. Príprava agregovaných Αβ peptidov

Ľudské peptidy 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., kat. č. ME0541), 1-42 (ÄN1792; California Peptides Inc., kat.

č. ME0339 a ME0439), 25-35, a hlodavčí 1-42 (California

Peptides Inc., kat. č. ME0218) boli za čerstvá rozpustené s cielom prípravy jednotlivých injekcií; injekcie boli pripravené z lyofilizovaných práškov, ktoré boli skladované vysušené pri -20 °C. Takto boli teda pridané 2 mg peptidu k 0,9 ml deionizovanej vody a zmes bola následne vortexovaná až do vytvorenia relatívne uniformného roztoku alebo suspenzie. V tejto fáze bol z týchto štyroch jediným rozpustným peptidom AN1528. V okamihu, keď sa začal AN1528 zrážať, bol pridaný 100 μΐ podiel lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenzia bola potom znovu vortexovaná a inkubovaná cez noc pri 37 °C, pričom druhý deň sa už mohla použiť.

Príprava proteínu pBx6: Expresný plazmid kódujúci pBx6, čo je fúzny protein, ktorý sa skladá zo 100 aminokyselinovej N-koncovej vedúcej sekvencie bakteriofágnej polymerázy MS-2 nasledovanej aminokyselinami 592 až 695 z ΑΡΡ (βΑΡΡ), bol skonštruovaný spôsobom opísaným v Oltersdorf a kol., J. Biol. Chem. 265, 4492 - 4497 (1990) . Plazmid bol transfektovaný do E. coli a protein bol exprimovaný po indukcii promótora. Baktérie boli lyzované v 8 M močovine a pBx6 bolo čiastočne purifikované pomocou preparatívnej SDS PAGE. Frakcie obsahujúce pBx6 boli identifikované s použitím králičej polyklonálnej protilátky proti pBx6 na membráne pre Westernovú analýzu, zhromaždené, skoncentrované pomocou skúmavky Amicon Centiprep a dialyzované PBS. Čistota prípravy, určená na SDS PAGE zafarbenej Coomasie Blue, bola asi 5 až 10 %.

- 95 B. Výsledky a diskusia

1. Schéma štúdie

Sto samíc a samcov (vo veku 9 až 11 mesiacov) heterozygotných transgénnych PDAPP myší sa získalo od Charles River Laboratory a Taconic Laboratory. Myši boli rozdelené do desiatich skupín a každá skupina bola určená na imunizáciu rôznymi oblasťami Αβ alebo APP skombinovanými s Freundovým adjuvantom. Zvieratá boli rozdelené tak, aby ich pohlavie, vek, pôvod a zdroj zostali v rámci skupiny čo najmenej odlišné. Imunogény zahŕňali štyri peptidy Αβ odvodené z ľudskej sekvencie (1 až 5, 1 až 12, 13 až 28, a 33 až 42), každý konjugovaný s ovčím IgG špecifickým proti myšiemu; štyri agregované peptidy, ľudský 1 až 40 (AN1528), ľudský 1 až 42 (AN1792), ludský 25 až 35 a hlodavčí 1 až 42; a fúzny polypeptid (pBx6), ktorý obsahuje 592 až 695 aminokyselinové zvyšky z APP. Desiata skupina (kontrola) bola imunizovaná PBS kombinovaným s adjuvantom.

Pre jednotlivé imunizácie bolo 100 pg každého Αβ peptidu, rozpusteného v 200 pl PBS alebo 200 pg derivátu APP (pBx6) rozpusteného v 200 pl PBS alebo PBS samotné, emulzifikované 1 : 1 (obj.) s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) tak, aby konečný objem emulzie určenej na prvú imunizáciu bol 400 pl. Ďalšie štyri imunizácie prebehli s imunogénom emulzifikovaným v nekompletnom Freundovom adjuvante (IFA) a konečná dávka imunogénu bola podaná v PBS. Imunizácie boli aplikované intraperitoneálne, a to vždy po dvoch týždňoch (prvé tri dávky) a potom v mesačných intervaloch. Zvieratám bola na meranie titra protilátok odoberaná krv vždy 4 až 7 dní po každej imunizácii, a to tak, že prvý odber bol uskutočnený po druhej dávke. Zvieratá boli usmrtené približne týždeň po poslednej imunizácii.

2. Hladiny Αβ a APP v mozgu

Po štyroch mesiacoch imunizácie s rôznymi Αβ peptidmi alebo derivátom APP boli mozgy zo zvierat dialyzovaných soľným roztokom vybraté. Jedna hemisféra bola pripravené na imunohistochemickú analýzu, druhá bola použitá na kvantifikáciu množstva Αβ a APP. Na meranie koncentrácie rôznych foriem Αβ a APP boli v 5 M guanidíne homogenizované hipokampálne, kôrové a mozočkové oblasti vybratej hemisféry. Homogenáty boli zriedené (sériové riedenie) a následne bolo zistené množstvo amyloidu alebo APP. Kvantifikácia bola založená na porovnaní výsledkov ELISA testov s radom štandardov peptidov Αβ alebo APP so známou koncentráciou.

Priemerná koncentrácia Αβ v kontrolnej skupine imunizovanej PBS bola 5,8-krát vyššia v hipokampe ako v kôre (24318 ng/g v porovnaní so 4221 ng/g). Priemerná koncentrácia v mozočku (23,4 ng/g) bola u kontrolnej skupiny asi 1000-krát nižšia ako v hipokampe. Tieto hladiny zodpovedajú hodnotám, ktoré boli pre heterozygotné transgénne PDAPP myši rovnakého veku publikované skôr (Johnson-Woods a kol., 1997, viď. vyššie) .

V mozgovej kôre boli u skupín liečených AN1792, hlodavčou AB1-42 alebo konjugátom Afil-5 peptidu v porovnaní s kontrolnou skupinou, zistené významne nižšie stredné hodnoty množstva (p < 0,05) Αβ a ΑβΙ-42 (obr. 11). Stredné hodnoty hladín celkového Αβ boli znížené o 75 %, 79 % a 61 %, a to v porovnaní s kontrolnou skupinou. V kôrovej oblasti zvierat z akejkolvek skupiny neboli nájdené žiadne súvislosti medzi hladinou Αβ a titrom Αβ-špecifických protilátok.

V prípade hipokampu, nebola stredná hodnota zníženia množstva Αβ spojená s liečbou AN1792 tak velká (o 46 %, p = 0, 0543) ako v prípade kôry (o 75 %, p = 0,0021). Absolútna veľkosť tejto redukcia však bola ovela väčšia v hipokampe ako v kôre. Čisté zníženie bolo o 11186 ng/g tkaniva v hipokampe v porovnaní s 3171 ng/g tkaniva v kôre. Skupiny zvierat, ktoré dostávali hlodavčiu AB1-42 alebo AB1-5, vykazovali zníženie stredných hodnôt množstva celkového Αβ o 36 % resp. 26 %.

Vďaka malým množstvám zvierat v skupinách a vysokej variabilite hladín amyloidného peptidu medzi jednotlivými zvieratami v obidvoch skupinách, však neboli tieto zníženia významné. Pri meraní hladín ΑβΙ-42 nedosiahlo žiadne zo zistených znížení významnú mieru. Môžeme teda povedať, že vďaka menšiemu množstvu Αβ zaťaženia v kôre, sú zmeny v tejto mozgovej oblasti citlivejším indikátorom liečebných účinkov.

- 97 Zmeny Αβ hladín v kôre merané pomocou ELISA sú podobné, nie však identické, s výsledkami obdržanými pri imunohistochemickej analýze (viď. nižšie).

Celkové množstvo Αβ bolo merané aj v mozočku, čo je oblasť, ktorá je patológiou AD zasiahnutá minimálne. Žiadna zo stredných hodnôt koncentrácií Αβ u žiadnej zo skupín imunizovaných rôznymi peptidmi alebo derivátom APP nebola odlišná od hodnôt nameraných v rovnakej oblasti u kontrolnej skupiny. Tieto výsledky napovedajú, že nepatologické hladiny Αβ nie sú liečbou zasiahnuté.

V kôre a v mozočku liečených a kontrolných myší boli ELISA technikou určované aj koncentrácie APP. Na určenie množstva APP boli použité dve odlišné analýzy. Prvá, nazvaná ΑΡΡ-α/FL, rozpoznávala APP-a (a, sekretovaná forma, ktorá vznikla štepením vnútri Αβ sekvencie) a formy APP s úplnou dĺžkou (FL), zatial čo druhý typ analýzy rozpoznával len APPa. Na rozdiel od úbytku Αβ u časti z liečených skupín, zostali hladiny APP u liečených aj kontrolných zvierat nezmenené. Tieto výsledky ukazujú, že imunizácia s Αβ peptidmi neznižuje množstvo APP alebo lepšie, že liečebné účinky sú špecifické pre Αβ.

Celkovo je teda možné povedať, že hladiny Αβ a Αβ1-42 v koži zvierat liečených AN1792, hlodavčou Αβ1-42 alebo Afil-5 konjugátom, boli významne znížené. V hipokampe došlo k významnému zníženiu Αβ len u skupiny liečenej AN1792. Žiadne ďalšie významné zmeny v hladinách Αβ alebo APP súvisiace s použitým spôsobom, neboli v hipokampe, mozgovej kôre alebo v mozočku pozorované.

2. Histochemické analýzy

Mozgy z časti zvierat zo šiestich skupín boli pripravené na imunohistochemickú analýzu, tri skupiny boli imunizované konjugátmi Αβ peptidov Αβ1-5, Αβ1-12 a Αβ 12-28, dve skupiny boli imunizované s Αβ agregátmi s úplnou dĺžkou AN1792 a AN1528; kontrolná skupina bola ošetrená len PBS. Výsledky obrazovej analýzy amyloidného zaťaženia u mozgových rezov z týchto skupín sú vidieť na obr. 12. Významný pokles amyloidného zaťaženia v porovnaní s kontrolnými zvieratami bol pozorovaný v kôrových oblastiach. Najväčšie zníženie amyloidného zaťaženia bolo zaznamenané u skupiny liečenej AN1792 (o 97 %, p = 0,001). Významné zníženie sa dosiahlo tiež u zvierat liečených AN1528 (o 95 %, p = 0,005) a konjugátom AB1-5 peptidu (o 67 %, p = 0,02).

Výsledky získané kvantifikáciou celkového Αβ alebo ΑβΙ-42 technikou ELISA a množstvo amyloidného zaťaženia zistené obrazovou analýzou, sa do istej miery líši. Z hodnotenia pomocou kvantitatívnej analýzy obrazu vyplýva, že liečba s AN1528 mala významný vplyv na hladinu kôrového amyloidného zaťaženia, z výsledkov ELISA analýzy však vyplýva, že celková koncentrácia Αβ zostala v tejto oblasti nezmenená. Rozdiel medzi týmito dvomi výsledkami je pravdepodobne spôsobený špecifikami jednotlivých analýz. Obrazová analýza meria len nerozpustné Ά&, agregované do plakov. ELISA testy sú naopak schopné merať všetky formy Αβ, t.j. rozpustnú aj nerozpustnú, monomérnu aj agregovanú. Keďže patológia choroby sa zdá byť spojená skôr s nerozpustnou formou AB, asociovanou s plakmi, je teda možné, že technika analýzy obrazu by v tomto prípade mohla podať presnejšiu interpretáciu účinkov liečby. ELISA technika je však rýchlejšia a jednoduchšia analýza, a tak je pre analytické účely veľmi vhodná a môže dokonca odhaliť, či zníženie Αβ, ktoré je spojené s liečbou, je väčšie u Αβ v plakoch alebo u celkového Αβ.

S cielom zistenia, či Αβ-špecifická protilátka vyvolaná imunizáciou pokusných zvierat reagovala s uloženým mozgovým amyloidom, bola časť rezov z liečených aj kontrolných zvierat inkubovaná s protilátkou proti myšiemu IgG. U zvierat imunizovaných konjugátmi Αβ, a to Αβ1-5, ΑβΙ-12 a Αβ13-28, bolo na rozdiel od zvierat liečených PBS zistené, že plaky obsahujúce Αβ sú pokryté endogénnym IgG. To isté platí aj pre Αβ agregáty s úplnou dĺžkou (AN1792 a AN1528). Mozgy zo zvierat imunizovaných inými Αβ peptidmi alebo APP peptidom pBx6 neboli podrobené tejto analýze.

3. Meranie protilátkových titrov

Krv bola myšiam odoberaná vždy 4 až 7 dní po každej imunizácii, a to tak, že prvý odber bol uskutočnený po druhej dávke a celkový počet odberov bol rovný piatim. Protilátkové titre boli určené pomocou väzby (stanovenej technikou sendvičovej ELISA) protilátky proti ΑβΙ-42 na Afil-42, ktoré bolo umiestnené v multijamkových (multi-well plates) miskách). Najvyššie hodnoty protilátkových titrov (merané boli protilátky proti AN1792) boli u týchto štyroch prostriedkov vyvolané po štvrtej imunizácii: AN1792 (medzný GMT: 94467), AN1528 (medzný GMT: 88231), konjugát AB1-12 (medzný GMT: 47216) a hlodavčí ΑβΙ-42 (medzný GMT: 10776). Po piatej a šiestej imunizácii hodnoty titrov týchto skupín trochu klesli. U zvyšných piatich imunogénov boli medzné hodnoty dosiahnuté po piatej a šiestej imunizácii, aj keď tieto hodnoty boli v porovnaní so štyrmi vyššie uvedenými skupinami ovela nižšie: konjugát ΑΒ1-5 (medzný GMT: 2356, pBx6 (medzný GMT: 1986), konjugát Αβ13-28 (medzný GMT: 1183), konjugát ΑΒ33-42 (medzný GMT: 658), Αβ 25-35 (medzný GMT: 125). Protilátkové titre boli technikou sendvičovej ELISA stanovované tiež proti ďalším homológnym peptidom, konkrétne proti Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 alebo hlodavčiemu ΑβΙ-42. Tieto titre boli skoro rovnaké ako v prípade ΑβΙ-42, len s výnimkou hlodavčieho ΑβΙ42, v prípade ktorého boli protilátkové titre približne dvakrát vyššie. Hodnoty AN1792-špecifického protilátkového titra u jednotlivých zvierat alebo jeho priemerné hodnoty u jednotlivých skupín nekorelovali s účinnosťou opisovanou znížením množstva Αβ v kôre.

4. Lymfoproliferatívne odpovede

Lymfoproliferácia vyvolaná prítomnosťou Αβ bola zisťovaná v slezinných bunkách, zhromaždených približne 1 týždeň po šiestej imunizácii. Čerstvo získané bunky (10⁵ na jamku) boli pestované v prítomnosti Αβί—40 v koncentrácii 5 μΜ/stimuláciu počas 5 dní. Časť buniek zo 7 skupín (celkovo bolo 10 skupín) bola pestovaná tiež v prítomnosti reverzného peptidu Αβ40-1. Ako pozitívna kontrola slúžili bunky pestované v prítomnosti mitogénu T-buniek, PHA, za negatívnu kontrolu boli považované bunky pestované bez peptidu.

U väčšiny zvierat reagovali lymfocyty na prítomnosť PHA proliferáciou. Žiadna významná proliferácia nebola pozorovaná

100 u skupiny s Αβ40-1. Bunky zo zvierat imunizovaných väčšími agregovanými peptidmi, AN1792, hlodavčími AB1-42 a AN1528 v odpovedi na stimuláciu s AA40 výrazne proliferovali, pričom najviac skupina imunizovaná AN1792. Jedno zviera v každej skupine imunizované konjugátom Αβ1-12, konjugátom Αβ13-28 a AAB25-35 reagovalo na aplikáciu Αβ1-40 proliferáciou. Ostatné skupiny imunizované konjugátom Αβ1-5, konjugátom Αβ33-42, pBx6 alebo PBS neobsahovali žiadne zviera, ktoré by na stimuláciu Αβ reagovalo. Tieto výsledky sú zhrnuté v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Imunogén	konjugát	aminokyseliny v Αβ	odpovede
Αβ1-5	áno	5	0/7
Αβ1-12	áno	12	1/8
Αβ13-28	áno	16	1/9
AB23-35		11	1/9
AB33-42	áno	10	0/10
Αβ1-40		40	5/8
Αβ1-42		42	9/9
r Afil-42		42	8/8
ρΒχ6		0/8
PBS		0	0/8

Tieto výsledky ukazujú, že imunizácie s AN1792 a AN1528 viedli k silným odpovediam T-buniek, najskôr s fenotypom CD4+. Neprítomnosť Αβ-špecifickej odpovede, sprostredkovanej Tbunkami u zvierat imunizovaných s Afil-5 nebola prekvapujúca, pretože peptidové epitopy rozpoznávané CD4+ T-bunkami sú obvykle dlhé asi 15 aminokyselín, aj keď kratšie peptidy môžu niekedy fungovať s nižšou účinnosťou. Väčšina epitopov T pomocných buniek je v prípade štyroch konjugovaných peptidov pravdepodobne naviazaná na IgG polovicu konjugátu a nie na Afi oblasť. Túto hypotézu podporuje veľmi nízky výskyt proliferatívnych odpovedí u zvierat v týchto skupinách. Keďže konjugát AB1-5 bol pri znižovaní hladiny Αβ v mozgu účinný, a to aj za zjavnej neprítomnosti Αβ-špecifických T-buniek, kľúčovým faktorom v mechanizme peptidom vyvolanej imunitnej odpovede sa zdá byť protilátka.

101

Neprítomnosť T-buniek a nízka protilátková odpoveď po aplikácii peptidu pBx6 (obsahuje aminokyseliny 592 až 695 z APP, zahŕňajúc všetky AB zvyšky) môže byť spôsobená nízkou imunogenicitou konkrétneho prípravku. Nízka imunogenicita agregátu AB25-35 je pravdepodobne spôsobená tým, že peptid je príliš krátky na to, aby pre T-bunku predstavoval epitop schopný pomôcť vyvolať imunitnú odpoveď. Predpokladá sa, že konjugácia tohto proteínu s nosným proteínom by mohla zvýšiť jeho imunogenicitu.

Príklad 5

Príprava polyklonálnych protilátok na pasívnu ochranu

125 netransgénnych myší boli imunizovaných AB s adjuvantom a usmrtených po 4 až 5 mesiacoch. Krv z každej myši bola odobratá a IgG bolo izolované od ostatných krvných zložiek. Protilátky špecifické pre daný imunogén môžu byť čiastočne prečistené pomocou afinitnej chromatografie. Z každej myši bolo získaných priemerne 0,5 až 1 mg pre imunogén špecifickej protilátky, čo celkovo znamenalo 60 až 120 mg.

Príklad 6

Pasívna imunizácia s protilátkami proti AB

Skupinám 7 až 9 mesačných PDAPP myší bolo injektované v PBS 0,5 mg/myš polyklonálnej protilátky anti-AB alebo monoklonálnej protilátky anti-AB (viď. nižšie). Všetky prípravky protilátok boli s cielom nízkej hladiny endotoxínu prečistené. Monoklonálne protilátky proti danému fragmentu sa môžu získať injekciou fragmentu alebo dlhšej formy AB do myši, prípravou hybridómov a ich testovaním na protilátku, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný fragment AB bez toho, že by sa viazala na iné špecifické fragmenty AB.

102

Tabuľka 8

Protilátka

Epitop

2H3

10D5

266

21F12 myšia polyklonálna proti ľudskému Αβ42

ΑβΙ-12

ΑβΙ-12

AB13-28

Αβ33-42 proti agregovanému Αβ42 proti agregovanému Αβ42

Myšiam boli počas 4 mesiacov injektované i.p. protilátky proti AE42 alebo inému imunogénu tak, aby sa dosiahla hladina cirkulujúcich protilátok s titrom vyšším ako 1 : 1000, čo bolo merané pomocou ELISA. Monitorovanie titrov sa uskutočňovalo vyššie uvedeným spôsobom s tým, že myši boli usmrtené na konci 6. mesiaca podávania injekcií. Histochémia, hladiny Αβη a toxikologické analýzy sa uskutočnili posmrtne. V každej skupine bolo 10 myší. Ďalšie štúdie pasívnej imunizácie sú opísané v príkladoch 11 a 12.

Príklad 7

Porovnanie rôznych adjuvantov

V tomto príklade sú s cieľom zistenia schopnosti stimulácie imunitnej odpovede porovnávané CFA, alum, emulzia olej-voda a MPL.

A. Materiál a spôsoby

1. Schéma štúdie

100 samíc morčiat kmeňa Hartley (Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA) vo veku 6 týždňov bolo roztriedených do desiatich skupín s cieľom imunizácie pomocou AN1792 alebo jeho palmitoylovaného derivátu, kombinovaného s rôznymi adjuvantami. Sedem skupín dostalo injekcie AN1792 (33 pg pokial nie je inak upresnené) v kombinácii s a) PBS, b) Freundovým adjuvantom, c) MPL, d) skvalénom, e) MPL/skvalénom, f) nízkou dávkou alum, g) vysokou dávkou alum (300 pg AN192). Dve skupiny dostali injekcie palmitoylovaného derivátu ÄN1792 (33 pg) s a) PBS alebo b) skvalénom. Posledná, desiata skupina

103 dostala samotné PBS bez antigénu alebo ďalšieho adjuvantu. U skupiny, ktorá dostávala Freundov adjuvant bola prvá dávka emulzifikovaná s CFA, ďalšie štyri dávky s IFA. U všetkých skupín bol antigén podaný v dávke 33 pg, s výnimkou skupiny s vysokou dávkou alum, ktorá obdržala 300 pg AN1792. Injekcie boli aplikované intraperitoneálne (CFA/IFA) alebo intramuskulárne (ostatné skupiny) do zadnej strany kvadricepsu, alternatívne do lavej alebo pravej. Prvé tri dávky boli aplikované v 14-denných intervaloch, ďalšie dve dávky mesačne. Krv určená na meranie titrov bola odobratá 6 až 7 dní po každej imunizácii, pričom prvý odber prebehol po druhej dávke.

2. Príprava imunogénov

K 2 mg Αβ42 (California Peptide, kat. č. ME0339) sa pridalo 0,9 ml deionizovanej vody a zmes bola následne vortexovaná až do vytvorenia relatívne uniformnej suspenzie. Bol pridaný 100 pl podiel lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCI, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenzia bola potom znova vortexovaná a inkubovaná cez noc pri 37 °C, pričom druhý deň už mohla byť použitá. Nespotrebovaný AB42 bol skladovaný s dezikantom ako lyofilizovaný prášok pri -20 °C.

Palmitoylovaný derivát AN1792 bol pripravený pripojením anhydridu kyseliny palmitovej, rozpusteným v dometylformamide, k zvyšku na amínovom konci AN1792 a potom bol nascentný peptid zo živice získaný pomocou kyseliny fluorovodíkovej.

Na prípravu zmesi imunogénu a kompletného Freundovho adjuvantu (CFA) (skupina 2) bolo 33 pg AN1792 v 200 pl PBS emulzifikované 1 : 1 (obj.) s CFA, pri konečnom objeme emulzie určenej na prvú imunizáciu 400 pl. Prípravy na ďalšie imunizácie prebehli zhodným spôsobom, namiesto CFA sa však použilo IFA.

Na prípravu dávok v MPL (skupiny 5 a 8) bolo MPL vo forme lyofilizovaného prášku (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) pridané k 0,2 % vodného roztoku trietylamínu v takom množstve, aby výsledná koncentrácia bola 1 mg/ml. Potom bola zmes vortexovaná. Zmes bola následne zahriata na 65 až 70 °C počas 30 sekúnd, čím došlo k vzniku mierne svetielkujúcej

104 uniformnej suspenzie miciel. Zmes bola čerstvo namiešaná pre každú sériu injekcií. Pre každú injekciu v skupine 5 bolo v borosilikátovej skúmavke tesne pred použitím zmiešaných 33 pg AN1792 v 16,5 pl PBS, 50 pg MPL (50 pl) a 162 pl PBS.

Na prípravu dávok v slabej suspenzii olej-voda bolo AN1792 v PBS pridané k 5 % skvalénu, 0,5 % Tween 80, 0,5 % Span 85 v PBS tak, aby výsledná koncentrácia pre jednu dávku bola 33 pg AN1792 v 250 pl (skupina 6) . Zmes bola emulzifikovaná prechodom cez dvojkomorový ručne ovládaný prístroj tak dlho (15 až 20 otočení), pokiaľ kvapôčky emulzie nezískali približne rovnaký priemer ako štandardizované gumové bublinky s priemerom 1 pm, čo bolo určené pomocou mikroskopu. Výsledná emulzia bola svetielkujúca, mliečne biela. Emulzie boli čerstvo namiešané pre každú sériu injekcií. U skupiny 8 bolo k zmesi skvalénu a detergentov (viď. vyššie) na každú dávku pridaných 50 pg MPL v 0,2 % trietylamínu. Zmes bola potom emulzifikovaná, ako bolo opísané vyššie. U palmitoylovaného derivátu (skupina 7) pridaných 33 pg palmitoyl-NH-ABl-42 na vortexovaná. Potom boli pridané Tween 80 a Span 85 a zmes bola vortexovaná. K tejto zmesi bol pridaný PBS tak, aby výsledná koncentrácie boli: skvalén 5%, Tween 80 0,5 % a Span 85 0,5 %. Zmes bola potom emulzifikovaná ako bolo opísané vyššie.

bolo dávku k skvalénu a zmes bola

Na prípravu dávok s alum (skupiny 9 a 10) bol k Alhydrogelu (gél hydroxidu hlinitého, Accurate, Westbury, NY) pridaný AN1792 v PBS tak, aby výsledné koncentrácie boli 33 pg (nízka dávka, skupina 9) alebo 300 pg (vysoká dávka, skupina 10) na 5 mg alum pri výslednom objeme dávky 250 pl. Suspenzia bola počas 4 h jemne miešaná pri izbovej teplote.

3. Meranie protilátkových titrov

Krv bola morčatám odobratá 6 až 7 dní po každej imunizácii, pričom prvý odber prebehol po druhej imunizácii s tým, že odbery boli celkom štyri. Titre protilátok proti AB42 boli merané technikou ELISA (viď. všeobecný materiál a spôsoby).

105

4. Tkanivové reparácie

Asi po 14 dňoch boli všetky morčatá usmrtené aplikáciou CO2. Mozgovomiechový mok bol odčerpaný, mozgy boli vybraté a potom nasledovala izolácia troch mozgových oblastí (hipokampus, kôra a mozoček), ktoré boli ďalej použité na meranie celkovej koncentrácie Αβ proteínu technikou ELISA.

B. Výsledky

1. Protilátkové odpovede

Pri meraní protilátkovéj odpovede po imunizácií s AN1792 bol u rôznych adjuvantov zistený v potenciách velký rozdiel. Ako je vidieť na obr. 14, po aplikácii AN1792 v PBS nebola po dvoch alebo troch imunizáciách zistená v krvi žiadna protilátka. Zanedbateľnú odpoveď bolo možné detegovať až po štvrtej a piatej dávke, pričom geometrické priemery titrov (GMTs) dosahovali hodnoty len okolo 45. Emulzia olej-voda vyvolala po tretej dávke mierne zvýšenie (GMT 255), ktoré bolo zachované aj po štvrtej dávke (GMT 301), ale kleslo po konečnej dávke (GMT 54) . Jasná antigénna koncentračná závislosť bola nájdená u AN1792 viazaného na alum, keď aplikácia 300 pg antigénu mala vo všetkých meraných časových bodoch väčší imunogénny účinok ako aplikácia 33 pg. V bode najvyššej protilátkovej odpovede, t.j. po štvrtej imunizácií, boli rozdiely medzi dávkami 43 % s GMTs okolo 1940 (33 pg) a

3400 (300 pg). Protilátkové odpoveď na 33 pg AN1792 s MPL bola velmi podobná tej, ktorá bola pozorovaná u viac ako desaťnásobného množstva antigénu (300 pg) viazaného v alum. Pridanie MPL k emulzii olej-voda znížilo potenciu tohto prostriedku v porovnaní s prostriedkom obsahujúcim ako jediný adjuvant MPL o 75 %. Palmitoylovaný derivát AN1792 bol pri podaní v PBS úplne neimunogénny, pri podaní v emulzii olejvoda vykazoval mierne imunogénne pôsobenie s GMTs 340 (po štvrtej dávke) a 105 (po piatej dávke). Najvyššie protilátkové titre boli dosiahnuté s Freundovým adjuvantom s najvyšším GMT okolo 87000, čo je hodnota takmer 30-krát vyššia ako GMTs dvoch ďalších najúčinnejších prostriedkov, MPL a vysoká dávka AAN1792/alum.

106

Najsľubnejšie vyzerajúcimi adjuvantami, identifikovanými v tejto štúdii sú MPL a alum. Z týchto dvoch vyzerá lepšie MPL, pretože na dosiahnutie rovnakého účinku bola potrebná 10krát nižšia dávka antigénu ako v prípade alum. Odpoveď môže byť zvýšená zvýšením dávky antigénu a/alebo adjuvantu a tiež optimalizáciou imunizačného postupu. Emulzia olej-voda bola v prípade AN1792 veľmi slabým adjuvantom a jej pridanie k MPL malo za následok vymiznutie adjuvančnej schopnosti samotného PBL.

2. Hladiny Αβ v mozgu

Častiam zvierat zo skupín imunizovaných Freundovým adjuvantom (skupina 2), MPL (skupina 5), alum s vysokou dávkou, 300 pg AN1792 (skupina 10) a kontrolnej skupine imunizovanej PBS (skupina 3) bol približne po 14 týždňoch pri hlbokej narkóze odobratý mozgovomiechový mok (CSF) a potom im boli vybraté mozgy. Na meranie koncentrácie Αβ peptidov boli v 5 M guanidínu homogenizované hipokampálne, kôrové a mozočkové oblasti jednej z vybratých hemisfér. Kvantifikácia bola založená na porovnaní výsledkov ELISA testov s radom štandardov peptidov Αβ so známou koncentráciou. Hladiny proteinu Αβ v hipokampe, kôre a mozočku boli, bez ohladu na rozdielne protilátkové odpovede proti Αβ vyvolané týmito prostriedkami, u všetkých štyroch skupín velmi podobné. Priemerné množstvá Αβ boli v hipokampe 25 ng/g tkaniva, v kôre 21 ng/g tkaniva a v mozočku 12 ng/g tkaniva. Prítomnosť vysokého titra protilátok proti Αβ počas takmer 3 mesiacov tak u niektorých zvierat nezmenila celkové množstvo Αβ v mozgu. Množstvo Αβ v CSF bolo u rôznych skupín tiež podobné. Neprítomnosť väčšieho imunizačného účinku AN1792 na endogénny Αβ naznačuje, že imunitná odpoveď je zameraná na patologickú tvorbu Αβ.

Príklad 8

Imunitná odpoveď na rôzne adjuvanty meraná u myši

V tejto štúdii boli používané 6 týždňov staré samice myší Swiss Webster, 10 až 13 zvierat/skupinu. Imunizácie prebiehali v dňoch 0, 14, 28, 60, 90 a 200, pričom aplikácia prebiehala subkutánne, s objemom jednej dávky 200 μΐ. Ako pufor bol u

107 všetkých prostriedkoch použitý PBS. Zvieratám bola na meranie titra protilátok ELISA testom odoberaná krv sedem dní po každej imunízácii a to tak, že prvý odber sa uskutočnil po

druhej dávke.	Liečebné	postupy	pre každú	skupinu	sú zhrnuté v
tabuľke 9.
Tabuľka 9
Skupina	Na	Adjuvantb	Dávka	Antigén Dávka(pg)
1	10	MPL	12,5 pg	ANI 792	33
2	10	MPL	25 pg	ANI 792	33
3	10	MPL	50 pg	ANI 792	33
4	13	MPL	125 pg	ANI 792	33
5	13	MPL	50 pg	ANI 792	150
6	13	MPL	50 Pg	ANI 528	33
7	10	PBS		ANI 792	33
8	10	PBS		žádný	33
9	10	Skvalen	5 %	ANI 792	33
10	10	/ Skvalen+	5 %	ANI 792	33
11	10	Alum 2 mg		ANI 792	33
12	13	MPL + Alum	50 pg/2 mg	ANI 792	J J
13	10	QS-21	5 Pg	ANI 792	33
14	10	QS-21	10pg	AN 1792	33
15	10	QS-21	25 ANI792	ANI 792	33
16	13	QS-21	25 ANI792	ANI 792	150
17	13	QS-21	25 ANI792	ANI 528	33
18	13	QS-21 + MPL	25 pg/50pg	ANI 792	33
19	13	QS-21 + Alum	25 pg/2mg	ANI 792	33

108 ³ Počet myší v skupine pri zahájení pokusu ^c Adjuvanty sú uvedené. Pufrom vo všetkých prostriedkoch bol PBS. V skupine 8 nebol žiadny adjuvant ani antigén.

Titre protilátok proti Αβ42 každú skupinu, sú uvedené v tabulke	(určené 10.	pomocou	ELISA)
Tabuľka 10
Geometrické	priemery protilátkových	titrov
		Týždne odberu	krvi
Skupina 2,9	5,0	8,7	12,9	16,7
1	248	1797	2577	6180	4177
2	598	3114	3984	5287	6878
3	1372	5000	7159	12333	12781
4	1278	20791	14368	20097	25631
5	3288	26242	13229	9315	23742
6	61	2536	2301	1442	4504
7	37	395	484	972	2149
8	25	25	25	25	25
9	25	183	744	952	1823
10	25	89	311	513	817
11	29	708	2618	2165	3666
12	198	1458	1079	612	797
13	38	433	566	1080	626
14	104	541	3247	1609	838
15	212	2630	2472	1224	1496
16	183	2616	6680	2085	1631
17	28	201	375	222	1540
18	31699	15544	23095	6412	9059
19	63	243	554	299	441

109

Tabuľka ukazuje, že najvyššie titre boli získané u skupín 4, 5 a 18, v ktorých boli adjuvanty 125 pg MPL, 50 pg MPL a QS-21 S MPL.

Príklad 9

Liečebná účinnosť rôznych adjuvantov

Štúdie použitie u myšiach, s terapeutickej účinnosti adjuvantov vhodných na ludí sa uskutočňovali na transgénnych PDAPP cieľom stanovenia ich schopnosti potenciovať imunitnú odpoveď proti Αβ a vyvolať imunitou sprostredkované odstránenie amyloidných usadenín v mozgu.

180 samíc a samcov heterozygotných transgénnych PDAPP myší, vo veku od 7,5 do 8,5 mesiaca bolo získaných z Charles River Laboratories. Myši boli roztriedené do deviatich skupín (15 až 23 zvierat v skupine) a imunizované AN1792 alebo AN1528 v kombinácii s rôznymi adjuvantami. Zvieratá boli rozdelené tak, aby ich pohlavie, vek a pôvod boli v rámci skupiny čo najmenej odlišné. Adjuvanty zahŕňali alum, MPL a QS-21, každý z nich kombinovaný s obidvomi antigénmi, A Freundov adjuvant (FA) kombinovaný len s AN1792. Ďalšia skupina bola imunizovaná s AN1792 pripravenom v PBS s tiomersalom a neobsahovala adjuvant. Deviata skupina bola imunizovaná len samotným PBS a predstavovala negatívnu kontrolu.

Príprava agregovaných Αβ peptidov: ľudský Αβ11-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA, kat. č. ME0541) a ľudský AB1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Napa, CA, kat. č. ME0439 peptid boli pri príprave každej série injekcií čerstvo rozpustené z lyofilizovaných práškov, ktoré boli skladované vysušené pri -20 °C. Potom boli pridané 2 mg peptidu k 0,9 ml deionizovanej vody a zmes bola následne vortexovaná až do vytvorenia relatívne uniformného roztoku alebo suspenzie. V tomto kroku bol rozpustný len AN1528. V okamihu, keď sa AN1528 začal zrážať, bol pridaný 100 μΐ podiel lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCI, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenzie boli potom znovu vortexované a inkubované cez noc pri 37 °C, pričom druhý deň sa už mohli použiť. Na prípravu dávok s alum (skupiny 5 a 9) bol k Allyhydrogelu (2 % vodný gél hydroxidu hlinitého, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) pridaný

110

Αβ peptid v PBS tak, aby výsledná koncentrácia bola 100 pg Αβ na 1 mg alum. lOx PBS bol potom pridaný tak, aby vo výslednom objeme dávky 200 pl bol ako lx PBS. Suspenzia bola pred injekciou 4 h jemne miešaná pri izbovej teplote.

Na prípravu dávok v MPL (skupiny 2 a 6)bolo MPL vo forme lyofilizovaného prášku (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) pridané k 0,2 % vodnému roztoku trietylamínu v takom množstve, aby výsledná koncentrácia bola 1 mg/ml. Potom bola zmes vortexovaná. Zmes bola následne zahriata na 65 až 70 °C počas 30 s, čím došlo k vzniku mierne svetielkujúcej uniformnej suspenzie miciel. Roztok bol skladovaný pri 4 °C. Pre každú sériu injekcií bolo v borosilikátovej skúmavke tesne pred použitím zmiešané na jednu dávku 100 pg peptidu v 50 pl PBS, 50 pg MPL (50 pl) a 1000 pl PBS.

Na prípravu dávok v QS-21 (skupiny 3 a 7) , bolo QS-21 vo forme lyofilizovaného prášku (Aquila, MA; kat. č. A7018R) pridané k PBS, pH 6,6 až 6,7, v takom množstve, aby výsledná koncentrácia bola 1 mg/ml. Potom bola zmes vortexovaná. Roztok bol skladovaný pri -20 °C. Pre každú sériu injekcií bolo v borosilikátovej skúmavke tesne pred použitím zmiešané na jednu dávku 100 pg peptidu v 50 pl PBS, 25 pg QS-21 v 25 pl a 125 pl PBS.

Na prípravu dávok s Freundovým adjuvantom (skupina 4) bolo 100 pg AN1792 v 200 pl PBS emulzif i kovaných 1 : 1 (obj.) s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) pri konečnom objeme emulzie pre prvú imunizáciu 400 pl. Prípravy na ďalšie imunizácie prebehli zhodným spôsobom, namiesto CFA bol však použité IFA. Na prostriedky obsahujúce alum alebo QS-21 bolo AN1792 (100 pg/dávku) alebo AN1528 (100 pg/dávku) zmiešané s alum (1 mg/dávku) alebo s MPL (50 pg/dávku) alebo s QS-21 (25 pg/dávku) tak, aby konečný objem v PBS bol 200 pl. Tieto prostriedky boli aplikované naočkovaním pod kožu medzi lopatkami. U skupiny s FA bolo 100 pg AN1792 emulzifikovaných 1 : 1 (obj.) s kompletným Freundovým adjuvantom (CFA) s konečným objemom 400 pl. Prvá imunizácia prebehla intraperitoneálnym podaním, pričom následné posilňovacie injekcie (5 dávok) obsahovali rovnaké množstvo imunogénu,

111 namiesto CFA však bolo použité IFA. U skupiny, ktorej bol podaný AN1792 bez adjuvantu, bolo 10 pg AN1792 zmiešaných s 5 pg tiomersalu tak, aby konečný objem v PBS bol 50 pl. Tento prostriedok bol aplikovaný subkutánne. Deviata, kontrolná skupina dostala subkutánne len 200 pl PBS. Imunizácie prebiehali u prvých troch dávok v štrnásťdenných intervaloch a potom v mesačných intervaloch v deň 0, 16, 28, 56, 85 a 112. Zvieratám bola na meranie titra protilátok ELISA testom odoberaná krv šesť až sedem dní po každej imunizácii a to tak, že prvý odber sa uskutočnil po druhej dávke. Zvieratá boli usmrtené približne jeden týždeň po poslednej dávke. Hladiny Αβ a APP v mozgu boli stanovené pomocou ELISA testu a pomocou imunohistochemického vyhodnotenia prítomnosti amyloidných plakov v mozgových rezoch. Ďalej boli určené titre Αβšpecifických protilátok a proliferatívne a cytokínové odpovede závislé na Αβ.

Tabuľka 10 ukazuje, že najvyššie protilátkové titre proti ΑβΙ-42 boli vyvolané s AN1792 vo FA, pričom medzné hodnoty boli dosiahnuté po štvrtej imunizácii (medzný GMT: 75386) s tým, že po poslednej, šiestej imunizácii klesla táto hodnota o 59 %. Najvyšší protilátkový titer vyvolaný AN1792 s MPL bol v porovnaní s FA o 62 % nižší (medzný GMT: 28867), medzné hodnoty sa dosiahli po tretej imunizácii s tým., že po šiestej imunizácii klesla táto hodnota na 28 % medzného GMT. Najvyšší protilátkový titer vyvolaný AN1792 s QS-21 (GMT: 1511) bol v porovnaní s MPL 5-krát nižší. Kinetiky odpovedí boli pomalšie, pretože na dosiahnutie medzných hodnôt odpovedí boli potrebné dodatočné imunizácie. Titre vyvolané na alum viazaným AN1792 prekračovali len o málo titre získané s QS-21, pričom kinetika odpovedí bola rýchlejšia. U AN1792 aplikovaného v PBS s tiomersalom bola frekvencia a velkosť titrov len o málo väčšia ako u samotného PBS. Najväčšie titre vyvolané u MPL s AN1528 (medzný GMT: 3099) boli približne 9-krát nižšie ako s AN1792. AN1528 viazaný v alum bol len slabo imunogénny a dával nízke titre, a to ešte len u niektorých zvierat. U kontrolných zvierat imunizovaných len PBS neboli pozorované žiadne protilátkové odpovede.

112

Tabulka 11

Geometrické priemery protilátkových titrov³ Týždne odberu krvi

Liečba	3,3	5,0	9,0	13,0	17,0
Alum/ ANI 792	102 (12/21)b	1081 (17/20)	2366 (21/21)	1083 (19/21)	572 (18/21)
MPL/ ANI 792	6241 (21/21)	28867 (21/21)	11242 (21/21)	5665 (20/20)	8204 (20/20)
QS-21/ ANI 792	30 (1/20)	227 (10/19)	327 (10/19)	1511 (17/18)	1188 (14/18)
CFA/ ANI 792	10076 (15/15)	61279 (15/15)	75386 (15/15)	41628 (15/15)	30574 (15/15)
Alum/ ANI 528	25 (0/21)	33 (1/21)	39 (3/20)	37 (1/20)	31 (2/20)
MPL/ ANI 528	184 (15/21)	2591 (20/21)	1653 (21/21)	1156 (20/20)	3099 (20/20)
QS-21/ ANI 528	29 (1/22)	221 (13/22)	51 (4/22)	820 (20/22)	2994 (21/22)
PBS + Tiomersal	25 (0/16)	33 (2/16)	39 (4/16)	37 (3/16)	47 (4/16)
PBS	25 (0/16)	25 (0/16)	25 (0/15)	25 (0/12)	25 (0/16)

³ Geometrické priemery protilátkových titrov merané proti ΑβΙ42 ^bMnožstvo reagujúcich zvierat v skupine

Účinky liečby AN1792 alebo AN1528 spolu s rôznymi adjuvantami alebo tiomersalom na kôrové amyloidné zaťaženie u dvanásťmesačných myší, určené spôsobom ELISA, sú zobrazené na obr. 15. U kontrolných PDAPP myší boli stredné hodnoty celkového Αβ v kôre v dvanástom mesiaci 1817 ng/g. Významne znížené hladiny Αβ boli pozorované u myší liečených AN1792 s CFA/IFA, AN1792 s alum, AN1792 s MPL a AN1792 s QS-21.

113

Zníženie dosiahlo štatistický význam na hladine p < 0,05 len v prípade AN1792 s CFA/IFA. Avšak, ako je opísané v príkladoch 1 a 3, redukcia hladín Αβ následkom imunizácie u 15 a 18 mesačných myší nadobudla postupne veľkosť. Predpokladá sa teda, že ďalšie prostriedky, najmä AN1792 s alum, AN1792 s MPL a AN1792 s QS-21 poskytnú pri liečbe starších myší pozitívnejšie výsledky. Naproti tomu, ÄN1792 s konzervačnou látkou tiomersalom vyvolal skoro rovnakú hladinu Αβ ako samotné PBS. Obdobné výsledky sa získali v prípade porovnania kôrových hladín Αβ42. Priemerná hladina Αβ42 u PBS kontrol bola 1624 ng/g. Významné zníženie priemerných hladín bolo zistené u myší liečených AN1792 s CFA/IFA (403 ng/g), AN1792 s alum (1149 ng/g), AN1792 s MPL (620 ng/g) a u AN1792 s QS-21 (714 ng/g), pričom zníženie dosiahlo v prípade skupiny liečenej AN1792 s CFA/IFA štatistický význam na hladine p = 0,05. Priemerná hladina Αβ42 u myší liečených AN1792 s tiomersalom bola 1619 ng/g.

Príklad 10

Analýza toxicity

Po ukončení štúdií opísaných v príkladoch 2, 3 a 7 boli tkanivá zhromaždené na histopatologické preskúmanie. U krvných vzoriek z príkladov 3 a 4 sa uskutočnili ešte hematologické a klinické testy. Preskúmaná bola väčšina hlavných orgánov ako sú mozog, pľúca, lymfatické tkanivá, gastrointestinálny trakt, pečeň, obličky, nadobličky a gonády. Okrem občasných lézií u zvierat liečených ANI792 neboli medzi liečenými a intaktnými zvieratami pozorované žiadne zjavné rozdiely v poškodení tkanív alebo vážnosti lézií. U zvierat imunizovaných AN1528 neboli v porovnaní so zvieratami liečenými PBS alebo neliečenými zvieratami zaznamenané žiadne zvláštne histopatologické lézie. Žiadne rozdiely neboli zaznamenaní ani pri porovnaní klinických chemických testov medzi skupinami zvierat s adjuvantami a s PBS (príklad 6) . Aj keď došlo k významnému zvýšeniu niektorých hematologických parametrov u zvierat liečených AN1792 s Freundovým adjuvantom v porovnaní so zvieratami liečenými PBS (príklad 6) , toto pôsobenie bolo možné pripísať účinku Freundovho adjuvantu a sprievodnej

114 peritonitíde, a neimplikuje žiadne nepriaznivé pôsobenie liečby s AN1792. Na posúdenie dopadu liečenia boli u PDAPP myší dôkladne preskúmané aj prípadné patologické zmeny v mozgu. Žiadny nepriaznivý účinok liečby na morfológiu mozgu nebol však v žiadnej z týchto štúdií zaznamenaný. Tieto výsledky naznačujú, že liečba s AN1792 je dobre prijímaná a nesprevádzajú ju žiadne vedľajšie účinky (aspoň nie zásadné).

Príklad 11

Liečba protilátkami proti Αβ

Pokusy opisované v tejto časti boli uskutočnené preto, aby bolo možné určiť schopnosti rôznych monoklonálnych a polyklonálnych protilátok proti Αβ na inhibíciu hromadenia Αβ v mozgu heterozygotných transgénnych myší.

A. Štúdia 1

1. Schéma štúdie samíc a samcov heterozygotných transgénnych PDAPP myší, vo veku od 8,5 do 10,5 mesiaca bolo získaných z Charles River Laboratories. Myši boli roztriedené do šiestich skupín vystavených pôsobeniu rôznych protilátok proti Αβ. Zvieratá boli rozdelené tak, aby ich pohlavie, vek a pôvod boli v rámci skupiny čo najmenej odlišné. Ako je vidieť z tabuľky 12, zahŕňali protilátky štyri myšie monoklonálne protilátky špecifické proti Αβ, 2H3 (zameraná na Αβ zvyšky 1 až 12), 10D5 (zameraná na Αβ zvyšky 1 až 16), 266 (zameraná na Αβ zvyšky 13 až 28 a viažuca sa na monomérnu, ale nie na agregovanú formu AN1792), 21F12 (zameraná na Αβ zvyšky 33 až 42). Piata skupina bola liečená frakciou polyklonálnej protilátky špecifickej proti Αβ (pripravenej imunizáciou agregovaným AN1792). Skupina predstavujúca negatívnu kontrolu dostávala len PBS bez protilátky.

Monoklonálne protilátky boli injektované v dávke okolo 10 mg/kg (za predpokladu, že myši vážili 50 g) . Injekcie boli aplikované intraperitoneálne každý siedmi deň tak, aby titre anti-Αβ boli udržiavané nad 1000. Aj keď boli namerané nižšie titre u mAb 266, zrejme z dôvodu zlej väzby na agregovaný AN1792, rovnaký dávkovací postup bol používaný pre celú

115 skupinu. Skupina, ktorá dostávala monoklonálnu protilátku 2H3 bola z pokusu vyradená počas prvých troch týždňov, pretože protilátka bola in vivo príliš rýchlo odbúravaná. Na meranie protilátkových titrov bola zvieratám odoberaná krv vždy pred každou dávkou. Liečba prebiehala 6 mesiacov, celkovo počas 196 dní. Zvieratá boli usmrtené jeden týždeň po poslednej dávke.

Tabuľka 12

Experimentálna stavba	štúdie 006
Liečebná	Na	Liečebná	Špecifita	Izotyp
skupina		protilátka	protilátky	protilátky
		žiadna
1	9		NAb	NA
		(samotné PBS)
2	10	polyklonálna	ΑβΙ-42	zmiešané
3	0	mAbc2H3	Afil-12	IgGl
4	8	mAb 10D5	ΑβΙ-16	IgGl
5	6	mAb 266	A13-28	IgGl
6	8	mAb 21F12	A33-42	IgG2a
a Počet myší	v skupine	pri skončení pokusu. Všetky	skupiny mali
na začiatku	10 zvierat

^b NA: nemerateľná ^cmAb: monoklonálna protilátka

2. Materiál a spôsoby

b. Príprava protilátok

Polyklonálna protilátka proti Αβ bola pripravená z krvi získanej z dvoch skupín zvierat. Prvá skupina bola zložená zo 100 samíc myší Swiss Webster, 6 až 8 týždňov starých, ktoré boli v dňoch 0, 15 a 29 imunizované 100 μς AN1792 s CFA/IFA.

Štvrtá injekcia, ktorá obsahovala polovičnú dávku AN1792, bola podaná 36. deň. Zvieratá boli po usmrtení (42. deň) zbavené krvi, z ktorej bolo potom izolované sérum. Séra všetkých zvierat boli zmiešané (celkový objem 64 ml) . Druhá skupina bola zložená z 24 samíc izogénnych s PDAPP myšami, ale netransfektovaných ľudským APP génom, 6 až 9 týždňov starých,

116 ktoré boli v dňoch 0, 14, 28 a 56 imunizované 100 pg AN1792 s CFA/IFA. Zvieratá boli po usmrtení (63. deň) zbavené krvi, z ktorej bolo potom izolované sérum. Séra všetkých zvierat boli zmiešané (celkový objem 14 ml) . Séra z obidvoch skupín boli zmiešané. Protilátková frakcia bola prečistená v dvoch následných zrážacích krokoch pomocou 50 % nasýteného síranu amónneho. Výsledná zrazenina bola dialyzovaná PBS a testovaná na výskyt endotoxínu. Hladina endotoxínu bola menšia ako 1 EU/mg.

Monoklonálne protilátky proti Αβ boli pripravené z ascitovej tekutiny. Ľadovo vychladená ascitová tekutina bola za miešania na ľade najskôr zbavená lipidov pridaním koncentrovaného dextransulfátu sodného s výslednou koncentráciou 0,238 %. Za neustáleho miešania bol pridaný CaCl₂ až do dosiahnutia výslednej koncentrácie 64 mM. Roztok bol centrifugovaný pri 10000 x g a vzniknutá peleta bola potom odstránená. K supernatantu bol na lade kvapkaním pridaný rovnaký objem nasýteného síranu amónneho. Roztok bol znovu centrifugovaný pri 10000 x g a vzniknutá peleta bola potom odstránená. Peleta bola resuspendovaná a dialyzovaná 20 mM Tris-HCI, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Táto frakcia bola nanesená na kolónu Pharmacia FPLC Sepharóse Q a vyluhovaná reverzným gradientom od 0,4 M do 0,275 M NaCl v 20 mM Tris-HCI, pH 7,5.

Frakcia s maximálnym obsahom protilátky bola po určení meraním absorbancie pri 280 nm zhromaždená. V prípravku s obsahom očistenej protilátky bola zmeraná spôsobom BCA koncentrácia proteínu a jeho čistota pomocou SDS-PAGE. V prípravku sa zisťoval tiež obsah endotoxínu. Hladina endotoxínu bola menšia ako 1 EU/mg. Titre menšie ako 100 boli vyhodnotené ako titre s hodnotou 25.

3. Hladiny Αβ a APP v mozgu

Po asi šiestich mesiacoch liečby s rôznymi prípravkami protilátok Αβ boli zo zvierat mozgy vybraté a premývané soľným roztokom. Jedna hemisféra bola pripravená na imunohistochemickú analýzu, druhá bola použitá na kvantifikáciu množstva Αβ a APP. Na meranie koncentrácie rôznych foriem Αβ a APP boli v 5 M guanidíne homogenizované

117 hipokampálne, kôrové a mozočkové oblasti vybratej hemisféry. Homogenáty boli rozriedené (sériové riedenie) a následne bolo zistené množstvo amyloidu alebo APP. Kvantifikácia bola založená na porovnaní výsledkov ELISA testov s radom štandardov peptidov Αβ alebo APP so známou koncentráciou.

Množstvo celkového Αβ a Αβ1-42, merané spôsobom ELISA v homogenátoch mozgovej kôry, hipokampe a mozočku sú uvedené v tabuľkách 11, 12 a 13. Stredná hodnota koncentrácie celkového Αβ v kontrolnej skupine, naočkovanej PBS, bola 3,6-krát vyššia v hipokampe (stredná hodnota 63389 ng/g) ako v kôre (stredná hodnota 17818 ng/g). Stredná hodnota v mozočku z kontrolnej skupiny (30,6 ng/g) bola viac ako 2000-krát nižšia ako hodnota v hipokampe. Tieto hladiny zodpovedajú hodnotám, ktoré boli pre heterozygotné transgénne myši s rovnakým vekom publikované skôr (Johnson-Woods a kol., 1997).

V kôre vykazovala jedna skupina (zvieratá, ktorým bola aplikovaná polyklonálna protilátka anti-Ab) strednú hodnotu množstva Αβ, meraného ako Αβ1-42, ktorá sa významne líšila od hodnôt kontrolnej skupiny (p < 0,05) (tabuľka 13). Stredná hodnota hladiny Αβ1-42 bola u tejto skupiny znížená v porovnaní s kontrolnou skupinou o 65 %. Stredná hodnota hladín Αβ1-42 bola v porovnaní s kontrolnou skupinou významne znížená (o 55 %) tiež v ďalšej testovanej skupine (zvieratá, ktorým bola aplikovaná mAb' 10D5, p = 0, 0433).

V hipokampe neboli stredné zníženia celkového Αβ (o 50 %, p = 0,0055), ktoré boli spojené s pôsobením polyklonálnej protilátky anti-Ab tak veľké, ako v kôre (o 65 %) (tabuľka 14). Absolútna veľkosť poklesu bola však v hipokampe v porovnaní s kôrou 3-krát väčšia (pokles o 31683 ng/g tkaniva v hipokampe v porovnaní s 11658 ng/g tkaniva v kôre). V prípade merania hladiny AĎ1-42 (viac amyloidná forma Αβ), skôr ako celkového Αβ, dosiahlo zníženie s polyklonálnou protilátkou význam (p = 0,0025). Stredné hladiny u skupín liečených monoklonálnymi protilátkami 10D5 a 266 boli znížené o 33 %, resp. 21 %

Celkový Αβ bol meraný aj v mozočku (tabuľka 15). Skupiny, ktorým bola aplikovaná polyklonálna protilátka anti-Ab a mAb

118 fO

Λί rH

XI ns

H

Π)

M <0 tt φ

g φ

•t—ι 3 Oj

OO	tt
			r<s	Γ-	—	—	ΓΝ
			r-	TT	VS	Ol	r*S
			»zs	rs	rs	o	O
		2	+1	rs	rs	vo	+1
CN	<	o		+1	+1	+1	vo
tT	CZ)	c	ΓΝ	TT	rs	Cb	o
rn		Ό	sO	vs	tt	oo	O
<		O	CN	tt	Os	TT	—
uj	_C		tt	Ό	r-	—

CO_			Ό				CN
<ť			VS	CN	Os	rs	00
		K3	TT	Os	CN	Os	o
	< CZ)	O c	r* +1	tt TT	Os SO	CN Os	Γ- Η
o	ľj UJ	T3 O	o vs	+1 CN	+1 •ZS Os	+1 tT O	oo tT
			SO	OS	SO	CN	CN
U				Vs	Os	Os	—*

		'ζ ox	-’J E CN	< z	O vs	rs rs 1	CN 1	CN 1
			«3
			O			rs	•ZS	rs
+J o c	CN TJ*	CL	C Ό O	< z	r- o <o	rs tt CO	•ZS CN	O O r-
C2L <		.C 03		o*	θ’	θ'	o
τ)		<	O	Γ4	CN			oo
O		00	C	o	Os		00	r*·
JZ		J ω	Ό O JZ	oo ro	00 tT	CN \O	TT oo	•ZS rs
-Φ
C			X
T5 Φ 3 4-)			c tu	<	vs	SO	Os	•ZS
cn. <			Z	so 1	VS 1	tT	1
ω	zs		W«J *-» o r-	Ό <ť	vs VS	Os	vs •zs	00 Os

tn .x

O d

u c

o λ:

c φ

c •H

X)

Z

O

CN

d

ro

S

Ä

o

O

θ'

O

3

cN

u

x;

'>

«3

tn

•—1

< o

oo

00

ro

w c

o

vs

TT

vs

>

3

φ

Ό ·—J O

00 r-

SO

Os

TT

vs

ro

3

Ul θ' r

so

r-

Os

—«

4-J

Π3

Π3

>1

Φ

M

>

φ

4->

Φ

•H

c

ro

G3

o

•H

c

4->

3

z

ov

oo

VO

00

>

fO

rN

φ

CN

JZ

e

ro

4-J

s

φ

c

trs

CN

4-J

1

3

'(0

i—1

Q

sO

U-l

<3.>

Cn

3

c ro

'03

CN

o

SO

>3

3

XI 3

c

TT

CN

OJ

O

d

ro

<

(U -H

o

cCJ

X

X

X

Cu

c

s

z

>u n, <D 3

C/J CO

Λί

1

<

li

-π λ;

Cu

>1

•ι—1

s

Π3

X)

υ

Ό

3J tn

•—1

4-J

štandardná odchýlka o

cu c

ro

119

CM tJCO.

<

<

c/) x

ω

	o Γ~~ TT	CM Ό CM 00	Ό ΤΓ Γ-	CM r- m m CM	Γ- CM Os ro Cl
<d	+1	+1	+1	+1	+1
O	—	m	ΙΖΊ	Os	vs
C	O	<ZS	sO		O
o	00	00	tT	Os	m
o	CM	Tt	sO	CM	O
-C	SZS	CM	m	C*“l	sr»

Liečebná N^a Stredné hodnoty Priemery s kupina

CO.			00 o	tt ι/Ί	ΓΜ ΓΊ	Tt o	r~ CM
<			m	tT	SO	m	Os
	td	m	CM	00	C	00
	<	Q	—	CM	—-	CM	CM
	<Z>	c	+1	+1	+1	+1	+1
o <1 s	J ω	-o o	trs m	00 »n O	00 i/s	Os Tt	Γ- CM f*S
Uz			00	O	TT	Ό	r-
U				ΓΊ	tT	m	tn

<	O	Os	SO
CO	c	OO	O
	O	m	r**
·—Í SJ	o O	m
ω o	s J=	SO	m

CM

I

CM

Γ*Ί

Tf

ΙΖΊ

O o“ o

CM sO

ΠΊ o

Os o

o.

o“

Os

Os o

oo θ'

Tt m

O m

Tt so

Os cTt so m Os

CM CM —

I I I

UO O OO r- os cm so os c<o o θ' θ' θ'

Os Os m r- oo so r- so sn

SO OO — tt Tt vn

O

σ\	—		oo	vo
	(0
	c		tn
	r—1	CM	G	VO
	'(ti	o	VO
	G	TT	—·	CM
en	O r—H		X3	X)
CQ	44	1		S
A	>1	•1“1	C	C
	í—1	4-1
	o	C
	Cb	(ti

CM (X

CM

G ω

G

O

A ♦rH

U c

o (ti

C o

c •H

A (ti

O N '>

r-| (ti > C 'OJ (ti c

4-1 IH (ti (ti >ι Φ

U > Φ 4-1

Φ -H C (ti

-H C 4-1 S-l > (0 -H φ

N 44 g

4-1 g Φ 44 I G Φ O> C >0 \ C ·· O A (D < Oj C S S štandardná odchýľka <ti n u ό φ

- 120 -

			Os		m
			oo	KO	st	Ok	o
K.	co_		X	m	Ch	wn	ok
r>1 « ,	<		m		—	KO	cK
W Φ		< 2	+1	4-1	+1	+1	+1
6	>	CO o	o	LT)	o	Ok	oo
Φ	o	•í c	<3	»—1	CM	vry	CO
•H		tí Ό	θ'	00	X	O?	CM
q	o	tí o	•ό-		Ol	.—1	Γ*Ί
CL	U	Λ

		>»
		-P
		0
		c Ό 0	CO. <
m		x	f
rd n)	44 Φ >U	'Φ c Ό	o x 3
44 r-4 P Λ fO	0 N 0 2	Φ P x ω	U
H

m 'ď

OK KO

CN Tŕ i i

w	Os
		m	v>		Os
O		m	r-	00	Os
β	x>	o	SO	«—1
Ί3	<	q	<3	<o	θ'
O	z	o”	θ'	θ'	Λ

.a < 5 CO o « H tí Ό tí O

X

		oo	OS	O	P ω P 44
	X	ko	sn	oo	o
θ’			so	ok	CL
m		cN		CN	Ή U C o 44

(ú q

Ή a

P

W 'fO

C x

Φ >0

Φ •H

	O	tá tá
Os		00	KO	oo	Φ
					c
					-H
					CL	tá
					P	N		os
					44	'>		44
					tn	r—1		1-1
						(Ό		'>
					>	q	'Φ	x
						(Ú	q	u
					4-1		r—i	Ό
					<υ	(0 >,	<υ	O
					P	> ω	4-J
	tá				Φ	h q	fO	'(0
				•H	q 4-)	q	q
	c				>	(0 -H	<u	Ό
	r-H				N	44 x	e	q
	'tá CkJ			(N		4-1 S	φ·	q
	Č				4-1	1	q	Ό
	o cg	Q	KO	U-.	<υ	cr q		q
	1-1	o	KO		>u	\ q	..	m
	44 1	»—*	CN	CN	0	O1 Φ	<	4-J
CO	>, Ή ,—1 4-1	X	X»	X	Cl,	q s	s	>(O
CQ	O c	S	c	Sa	.	.	Ό	•
Ol,	Oj fO	c	C	E	(Ú	x o	φ

121

266 vykazovali významné zníženia hladín celkového Αβ o 46 %, p = 0,0033 a p = 0,0184), u skupiny liečenej zistené takmer významné zníženie (o 23 %, p = 0,0675) (o 43 % a 10D5 bolo

Spôsobom ELISA boli v kôre a v mozočku zvierat liečených protilátkami a kontrolných (len PBS) zisťované aj koncentrácie APP. Na stanovenie APP boli použité dve rôzne analýzy. Prvá, označená ΑΡΡ-α/FL, rozpoznávala APP-a (a, sekretovaná forma APP, ktorá bola vyseknutá z Αβ sekvencie) a formy APP s úplnou dĺžkou (FL), pričom druhá rozpoznáva len APP-a. Na rozdiel od zníženia hladiny Αβ, pozorovanej u časti liečených zvierat, zostali hladiny APP v porovnaní s kontrolami prakticky nezmenené. Tieto výsledky naznačujú, že imunizácia protilátkami proti Αβ spôsobuje zníženie hladiny Αβ bez toho, že by spôsobovala zníženie hladiny APP.

Na záver je možné povedať, že k významnému zníženiu hladín Αβ došlo u zvierat liečených polyklonálnou protilátkou pripravenou imunizáciou a ANI792 v mozgovej kôre, hipokampe a v mozočku. Liečebné účinky v menšej miere preukázali aj monoklonálne protilátky proti časti amínového konca Αβ1-42, konkrétne proti aminokyselinám 1 až 16 a 13 až 28.

4. Histochemické analýzy

U časti myších mozgov zo skupín liečených PBS, polyklonálnou AB42, 21F12, 266 a 10D5 bola kvalitatívne porovnávaná morfológia Αβ-imunoreaktívnych plakov s tou u zvierat z predchádzajúcich experimentov, ktoré dodržiavali štandardné imunizačné postupy s Αβ42.

Zníženie amyloidného plaku a bunkovo

Najväčšia zmena, a to ako v rozsahu, tak aj vo vzhľade amyloidných plakov, bola pozorovaná u zvierat imunizovaných polyklonálnou protilátkou proti Αβ42.

zaťaženia, rozrušená morfológia sprostredkovaná Αβ imunoreaktivita veľmi pripomínali účinky dosiahnuté štandardným imunizačným postupom. Tieto zistenia sú v súlade s výsledkami dosiahnutými ELISA testami, pri ktorých bolo po aplikácii polyklonálnej protilátky proti Αβ42 zaznamenané významné zníženie celkového Αβ a Αβ42.

122

V prípade skupiny vystavenej pôsobeniu 10D5 sa tiež dosiahlo zníženie amyloidného zaťaženia a zmien morfológie plaku, spolu so známkami bunkovej Αβ imunoreaktivity. V porovnaní s PBS kontrolami neboli u skupín liečených 21F12 a 266 zistené žiadne väčšie rozdiely.

5. Meranie protilátkových titrov

Trom myšiam náhodne vybraným z každej skupiny bola vždy pred každou intraperitoneálnou injekciou odobratí krv (celkovo 30 odberov). Protilátkové titre boli určené pomocou väzby, stanovenej technikou sendvičovej ELISA protilátky proti Αβ1-42 na AB1-42, ktoré bolo umiestnené v plastových viacjamkových (multi-well plates) miskách (podrobnejšie viď. všeobecný materiál a spôsoby). Priemerné titre polyklonálnych protilátok a monoklonálnych protilátok 10D5 a 21F12 pre každý odber sú ukázané na obr. 16 až 18. V prípade polyklonálnych protilátok mali titre priemernú hodnotu 1 : 1000, pričom v prípade monoklonálnych protilátok 10D5 a 21F12 boli mierne nad touto hodnotou.

6. Lymfoproliferatívna odpoveď

Lymfoproliferácia vyvolaná prítomnosťou Αβ bola zisťovaná v slezinných bunkách, zhromaždených približne 8 dní po poslednej imunizácii. Čerstvo získané bunky (10⁵ na jamku) boli pestované v prítomnosti Αβ1-40 v koncentrácii 5pM/stimuláciu počas 5 dní. Ako pozitívna kontrola slúžili bunky pestované v prítomnosti mitogénu T-buniek, PHA, za negatívnu kontrolu boli považované bunky pestované bez peptidu.

Splenocyty zo starých PDAPP myší, pasívne imunizovaných rôznymi protilátkami anti-Αβ boli in vitro stimulované AN1792, následne boli merané proliferatívne a cytokínové odpovede. Cielom týchto analýz bolo zistiť, či pasívna imunizácia podporuje predkladanie antigénu a vybavuje tak pre AN1792 špecifické odpovede T-buniek. U myší pasívne imunizovaných protilátkami proti Αβ neboli zistené žiadne AAN1792-špecifické proliferatívne a cytokínové odpovede.

123

B. Štúdia 2

V druhej štúdii bola opakovaná liečba protilátkou 10D5, pričom boli testované ešte dve ďalšie monoklonálne protilátky, 3D6 (Túii-s) a 16C11 (Αβ₃3-4₂) · Kontrolné skupiny dostávali buď PBS alebo irelevantnú izotypovo zodpovedajúcu protilátku TM2a. Použité myši boli staršie (11,5 až 12 mesiacov staré heterozygotné myši) ako tie v predchádzajúcej štúdii; ostatné experimentálne podmienky zostali zachované. Po šiestich mesiacoch liečby znížila 10D5 v porovnaní s kontrolami plakové zaťaženie viac ako o 80 % (p = 0,003). 3D6 bolo rovnako účinné a vyvolávalo 86 % zníženie (p = 0,003). Protilátka 16C11 nemala, na rozdiel od obidvoch predchádzajúcich, na plakové zaťaženie žiadny účinok. Podobné výsledky sa dosiahli pri Αβ₄₂ ELISA. Tieto výsledky naznačujú, že protilátková odpoveď proti peptidu Αβ je, pri neúčasti imunity sprostredkovanej Tbunkami, na zníženie amyloidného ukladania u PDAPP myší dostatočná, aj keď nie všetky protilátky anti-Ab sú účinné. Predovšetkým účinné sú protilátky zamerané proti epitopom Αβ obsahujúcim aminokyseliny 1 až 5 a 3 až 8.

Tieto štúdie dokazujú, že pasívne podanie protilátok proti Αβ znižuje rozsah ukladania plakov u myšieho modelu Alzheimerovej choroby. Pri udržiavaní miernych sérových koncentrácií (25 až 70 pg/ml) sa protilátky do CNS dostávajú v množstve dostatočnom na to, aby zasiahli amyloidné plaky. Vstup protilátok nebol spôsobom abnormálnej priepustnosti hematoencefalickej bariéry, pretože pri meraní Evansovou modrou nebola zistená zvýšená cievna priepustnosť. Koncentrácia protilátky v mozgovom parenchýme starých PDAPP myší bola rovnaká ako u myší netransgénnych, pričom predstavovala 0,1 % z koncentrácie v sére (bez ohľadu na izotyp).

D. Štúdia 3: Sledovanie väzby protilátky

S cieľom zistenia, či protilátky proti Αβ môžu pôsobiť priamo vnútri CNS, boli mozgy myší (premývané soľným roztokom) z konca príkladu 11 skúmané na prítomnosť periférne aplikovaných protilátok. Nefixované mozgové rezy z kryostatu boli vystavené pôsobeniu fluorescenčného činidla proti myšiemu

124 imunoglobulínu (kozí IgG-Cy3 proti myšiemu IgG). Plaky vnútri mozgov zo skupín 10D5 a 3D6 boli silno obalené protilátkami, pričom skupina 16C11 nevykazovala žiadnu fluorescenciu. S cielom určenia celkovej oblasti obsadenej plakmi bola u sériových rezov z každého mozgu uskutočnená najskôr imunoreakcia s protilátkou anti-Αβ a potom so sekundárnym činidlom. 10D5 a 3D6 dosiahli po aplikácii v periférii väčšinu plakov v CNS. Plakové zaťaženie bolo na rozdiel od skupiny 16C11 v týchto liečených skupinách výrazne znížené. Tieto údaje naznačujú, že periférne aplikované protilátky môžu vstúpiť do CNS, kde priamo spúšťajú odbúravanie amyloidov. Je pravdepodobné, že 16C11 sa k plakom dostala tiež, ale nebola schopná sa na ne viazať.

Príklad 12

Prevencia a liečba ludí

Jednofázová skúška fázy I je uskutočnená na zistenie bezpečnosti u ľudí. Liečebné činidlo je podávané v narastajúcich dávkach, pričom sa začína na jednej stotine hladiny predpokladanej účinnosti a pokračuje sa takým spôsobom, že každá ďalšia dávka je trojnásobkom dávky predošlej, pokial sa nedosiahne desaťnásobok dávky účinnej u myši.

Skúška fázy II je uskutočňovaná na určenie liečebnej účinnosti. Vybraní sú pacienti s lahkou až strednou Alzheimerovou chorobou, čo je určené podlá kritérií Asociácie pre Alzheimerovu chorobu a príbuzné choroby (ADRDA). Vhodní pacienti dosahujú v mentálnom teste MMSE (Mini-Menta State Exam) 12 až 26 bodov. Medzi ďalšie výberové kritériá je možné zahrnúť aj pravdepodobnosť, s kou pacienti prežijú čas trvania štúdie a neprítomnosť komplikujúcich faktorov, ku ktorým patrí napríklad nutnosť užívania iných liekov, ktoré môžu liečbu narúšať. Základné hodnotenia pacientových funkcií sa uskutočňujú pomocou klasických psychometrických meraní, napríklad MMSE a ADAS (Alzheimer's Disease Assessment Scale). Tieto psychometrické rozsahy poskytujú mieru postupu Alzheimerovej choroby. Vhodné rozsahy určujúce kvalitu života môžu byť tiež použité na sledovanie liečby. Postup choroby

125 môže byť sledovaný aj pomocou MRI. Krvné profily pacientov môžu byť tiež sledované (analýzy výskytu protilátok proti imunogénu a odpovede T-buniek).

Na zistenie základných údajov začína liečba pacientov. Pacienti sú náhodne rozdelení a sú liečení buď liečebným činidlom alebo placebom (bez toho, že by o tom vedeli). Pacienti sú sledovaní najmenej každých šesť mesiacov. Účinnosť je stanovená podľa významného spomalenia postupu choroby u pacientov v liečebnej skupine pri porovnaní so skupinou, ktorá dostáva placebo.

Skúška fázy II je uskutočňovaná na určenie prechodu pacientov s predčasnou pamäti nespôsobenou AD, niekedy opisovanou ako so starnutím spojené oslabenie pamäti (AAMI) alebo mierne kognitívne oslabenie, k predpokladanej Alzheimerovej chorobe, definovanej ADRDA kritériami. Pacienti s vysokým rizikom prechodu k Alzheimerovej chorobe sú vyberaní z normálnej populácie pomocou sledovania začínajúcich známok straty pamäti alebo iných ťažkosti prejavujúcich sa symptomatologicky ako stavy pred vznikom AD, podľa predchádzajúceho výskytu AD v rodine, rizikových genetických faktorov, veku, pohlaví a ďalších znakov, ktoré poukazujú na vysoké riziku vzniku AD. Zhromaždené sú základné výsledky jednotlivých potrebných testov, zahŕňajúcich MMSE spolu s výsledkami ďalších testov, ktoré hodnotia populáciu. Títo pacienti sú rozdelení do skupín s alebo s liečebným činidlom a sú sledovaní najmenej každých šesť mesiacov, pričom liečba končí v bode, keď u nich príde či nepríde k prechodu k predpokladanej AD, definovanej ADRDA kritériami.

a ADAS, normálnu placebom

Príklad 13

Všeobecný materiál a spôsoby

1. Meranie protilátkových titrov

Myšiam bola odoberaná krv z malého rezu vo chvostovej žile, pričom do mikroskúmavky bolo potom zhromaždených asi 200 μΐ krvi. Morčatám bola krv po oholení zadnej časti nad priehlavkom odoberaná z metetarzálnej žily ihlou 18 gauge,

126 pričom potom bola zhromaždená do mikroskúmaviek. Krv sa nechala zrážať počas 1 h pri izbovej teplote (RT) a potom bola vortexovaná a centrifúgovaná pri 14000 x g počas 10 minút, s cielom oddelenia zrazeniny od séra. Sérum bolo prenesené do čistej mikroskúmavky a skladované pri 4 °C až do stanovenia titra. Protilátkové titre boli merané pomocou ELISA. Mikrotitračné doštičky s 96 jamkami (Costar EIA paltes) boli pokryté 100 μΐ roztoku s obsahom 10 μΙ/ml AB42 alebo SAPP alebo iných antigénov (uvedené v jednotlivých príkladoch) v pufri na pokrývanie jamiek (0,1 M fosforečnan sodný, pH 8,5, 0,1 % azid sodný) a ponechané cez noc pri RT. Zvyšný roztok v doštičkách bol odsatý a potom bolo do jamiek pridané sérum (počiatočné riedenie 1 : 100) vo vzorkovom rozpúšťadle (0,014 M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,6 % sérový hovädzí albumín, 0,05 % tiomersal) . Priamo v doštičkách boli vzorky v siedmich krokoch sériovo nariedené (v násobkoch troch), pričom výsledné riedenie bolo 1 : 218700 a inkubované počas 1 h pri RT. Doštičky boli potom štyrikrát opláchnuté PBS s obsahom 0,05 Tween 20. Druhá protilátka, kozí IgG proti myšiemu IgG konjugovaný s chrenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim), bol pridaný do jamiek ako 100 μΐ roztoku riedeného vo vzorkovom rozpúšťadle 1 : 3000 a inkubovaný počas 1 h pri RT. Doštičky boli potom znovu štyrikrát opláchnuté v PBS s Tween 20. Na vyvolanie chromogénu bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ Slow TMB (3,35,5'-tetrametylbenzidín, Pierce Chemicals) a potom nasledovalo 15 minút inkubácie pri RT. Reakcia bola zastavená pridaním 25 μΐ 2 M H₂SO₄. Intenzita zafarbenia bola vyhodnotená pomocou prístroja Vmax (Molecular Devices) pri 450 až 480 nm.

Titre boli definované ako prevrátené hodnoty riedenia séra, ktoré predstavovalo polovicu maximálnej OD. Maximálna OD bola určená pri počiatočnom riedením 1 : 100, čo neplatilo len u prípadov s veľmi vysokými hodnotami titrov, pre ktoré bolo nutné za maximálnu OD určiť vyššie počiatočné riedenie. Ak 50 % bodov zapadá medzi dve riedenia, potom sa hodnota výsledného titra spočítala pomocou lineárnej extrapolácie. Na spočítanie geometrického priemeru protilátkových titrov boli titre menšie ako 100 vyhodnotené ako titre s hodnotou 25.

127

2. Analýza proliferácie lymfocytov

Myši boli umŕtvené izofluranom. Sleziny boli odobraté a dvakrát opláchnuté s 5 ml PBS obsahujúcim 10 % tepelne inaktivované fetálne teľacie sérum (PBS-FBS) a potom v 1,5 PBS-FBS počas 10 s pri 100 rpm homogenizované pomocou zariadenia Centricon 50 (Dáko A/S, Denmark) v Medimachine (Dáko). Homogenizát bol potom prefiltrovaný cez nylonovú sieť s pórmi s veľkosťou 100 pm. Splenocyty boli jedenkrát opláchnuté v 15 ml PBS-FBS a peletované centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút. Červené krvinky boli lyzované resuspendovaním pelety v 5 ml pufra (0,15 M NH₄C1, 1 M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4) počas 5 minút pri RT. Leukocyty boli potom prepláchnuté rovnako ako vyššie. Čerstvo izolované slezinné bunky (10⁵ buniek na jamku) boli pestované v triplikátoch v 96-jamkových mikrotitračných doštičkách, určených pre tkanivové kultúry a s dnom v tvare písmena U (Corning, Cambridge, MA) počas 96 h pri 37 °C. Na pestovanie bolo použité médium RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) doplnené 2,05 mM L-glutamínom, 1 % Penicilín/Streptomycín a 10 % tepelne inaktivovaným FBS. V štyroch krokoch boli v dávkach od 5 do 0,18 pM pridané tiež rôzne Αβ peptidy (Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 alebo proteín s obrátenou sekvenciou AB40-1). Bunky v kontrolných jamkách boli pestované s konkanavalínom A (ConA) (Sigma, kat. č. C-5275, 1 pg/ml) bez pridaného proteinu. Na posledných 24 h pestovania bol k bunkám pridaný ³H-tymidín (1 pCi/jamku, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) . Potom boli bunky zhromaždené na miskách UniFilter a rádioaktivita spočítaná v zariadení Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL) . Výsledky sú vyjadrené ako cpm (záblesky za minútu) rádioaktivity inkorporovanej do nerozpustných molekúl.

4. Preparácia mozgového tkaniva

Po umŕtvení myší boli ich mozgy vybraté a jedna hemisféra bola pripravená na imunohistochemickú analýzu, druhá bola použitá na kvantifikáciu množstva Αβ a APP v hipokampe, kôre a mozočku pomocou špecifických ELISA (Johnson a kol., viď. vyššie).

128

Tkanivá určené pre ELISA boli homogenizované v 10 dieloch ľadovo studeného guanidinového pufra (5,0 M guanidín-HCl, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Homogenáty boli premiešané jemným miešaním počas 3 h pri RT s použitím prístroja Adams Nutator (Fisher) a pred kvantifikáciou Αβ a APP uchovávané pri -20 °C. Predchádzajúce pokusy ukázali, že analyty boli za týchto skladovacích podmienok stabilné, a že protein zostal čo sa týka množstva zachovaný, čo bolo zistené pridaním syntetického Αβ proteínu (Bachem) do homogenátu mozgov z kontrolných zvierat (Johnson a kol., viď. vyššie).

5. Meranie hladín Αβ (1 až 42 tak, aby a 0,1 %

Mozgové homogenáty boli nariedené 1 : 10 s ladovo studeným kazeínovým rozpúšťadlom (0,25 % kazeín, 0,05 % azid sodný, 20 pg/ml aprotinín, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptin) a potom centrifugované pri 16000 x g počas 20 minút pri 4 °C. Štandardy syntetického proteínu Αβ aminokyselín) a štandardy APP boli pripravené výsledné zloženie obsahovalo 0,5 M guanidínu hovädzieho sérového albumínu (BSA). Technika sendvičovej ELISA na zistenie totálneho Αβ používala monoklonálnu protilátku 266, špecifickú pre aminokyseliny 13 až 28 v Αβ (Seubert a kol-) ako uchytenú protilátku a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 3D6, špecifickú pre aminokyseliny 1 až 5 (JohnsonWood a kol.) ako referenčnú (reportér) protilátku. Monoklonálna protilátka 3D6 nerozpoznávala vylučované APP alebo APP s úplnou dĺžkou, ale len formy Αβ s kyselinou asparagovou na amínovom konci. Dolná hranica citlivosti sa u tejto analýzy nachádza okolo 50 ng/ml, pričom krížové reakcie s myším endogénnym Αβ proteínom sa neobjavujú koncentrácie 1 ng/ml (Johnson-Wood a kol., viď. vyššie az do

Technika sendvičovej ELISA špecifická pre AB1-42 používala monoklonálnu protilátku 21F12, špecifickú pre aminokyseliny 33 až 42 v Αβ (Seubert a kol.) ako uchytenú protilátku a opäť biotinylovanú monoklonálnu protilátku 3D6 ako referenčnú protilátku. Dolná hranica citlivosti je u tejto analýzy nižšia a nachádza sa okolo 125 pg/ml (28 pM, JohnsonWood a kol.). Pre ELISA testy Αβ bolo buď 100 pl mAb 266 (10

129 pg/ml) alebo mAb 21F12 (5 pg/ml) aplikovaných na misky s 96 jamkami určené na imunoanalýzy (Costar) a ponechaných cez noc pri 4 °C. Roztok bol odstránený odsatím a jamky boli blokované pridaním 200 μΐ 0,25 % ľudského sérového albumínu v PBS pufri počas najmenej 1 h pri RT. Blokovací roztok bol odstránení a misky boli až do použitia uchované vysušené pri 4 °C. Misky boli pred použitím hydratované pomocou oplachovacieho pufra [Tris pufrovaný roztok solí (0,115 M NaCI, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5), plus 0,05 % Tween 20], Vzorky a štandardy boli pridané z podielov v triplikátoch, 100 μΐ na jamku a potom inkubované cez noc pri 4 °C. Misky boli medzi jednotlivými krokmi v analýze najmenej trikrát opláchnuté pomocou oplachovacieho pufra. Biotinylovaná mAb 3D6, nariedená na 0,5 pg/ml v kazeínovom pufri (0,25 % kazeín, PBS, 0,5 % Tween 20, pH 7,4) bola pridaná a inkubovaná v jamkách počas 1 h pri RT. Konjugát avidínu a chrenovej peroxidázy (Avidin-HRP, Vector, Burlingame, CA) , neriedený 1 : 4000 v kazeínovom pufri, bo pridaný do jamiek na 1 h pri RT. Kolorimetrický substrát, Slow TMB-ELISA (Pierce) bol pridaný a ponechaný reagovať 15 minút pri RT. Potom bola enzymatická reakcia zastavená pridaním 25 μΐ 2 N H₂SO₄ · Produkt reakcie bol kvantifikovaný s použitím čítacieho prístroja Vmax (Molecular Devices), ktorý meral rozdiel absorbancií pri 450 a 650 nm.

6. Meranie hladiny APP

Na meranie hladín APP boli použité dve rôzne analýzy. Prvá, označená ΑΡΡ-α/FL, rozpoznávala APP-a (a, sekretovaná forma APP, ktorá bola vyrezaná z Αβ sekvencie a obsahovala prvých 12 aminokyselín Αβ) a formy APP s úplnou dĺžkou (FL) , pričom druhá rozpoznáva len APP-a. Keďže referenčná protilátka (2H3) nie je špecifická pre skupinu α-časti vyskytujúcu sa medzi aminokyselinami 612 až 613 v APP695 (Esch a kol., Science 248, 1122 - 1124, 1990) ; táto analýza tiež rozpoznáva APP s úplnou dĺžkou (APP-FL). Predbežné pokusy, uskutočňované s cielom očistenia mozgových homogenátov od APP-FL a používajúce imobilizované APP protilátky špecifické pre cytoplazmatický koniec v APP-FL, naznačili, že približne 30 až 40 % z ΑΡΡ-α/FL je FL (údaje nie sú uvedené). Analýzy APP-a/FL aj APP-a používali monoklonálnu protilátku 8E5, špecifickú pre

130 aminokyseliny 444 až 592 v APP695 (Gamest a kol., viď. vyššie) ako uchytenú protilátku a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 2H3 (ΑΡΡ-α/FL analýza), špecifickú pre aminokyseliny 597 až 608 (Johnson-Wood a kol.) a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 16H9, špecifickú pre aminokyseliny 605 až 611, ako referenčnú protilátku. Dolná hranica citlivosti týchto analýz sa v prípade ΑΡΡ-α/FL nachádza okolo 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood a kol., viď. vyššie) a v prípade APP-a okolo 22 ng/ml (0,3 nm). V obidvoch APP analýzach bola mAb 8E5 aplikovaná na 96-jamkové misky pre EIA spôsobom opísaným pre mAb 266 (viď. vyššie). Ako referenčný štandard pre analýzy APP-a a ΑΡΡ-α/FL bolo použité prečistené rekombinantné sekretované APP-a (Esch a kol., viď. vyššie). Vzorky s mozgovými homogenátmi v 5 M guanidínu boli nariedené 1 : 10 vo vzorkovom pufri pre ELISA (0,014 M fosfátový pufor, pH 7,4, 0,6 % hovädzí sérový albumín, 0,05 % tiomersal, 0,5 M NaCI, 0,1 % NP40) . Potom boli nariedené 1 : 4 vo vzorkovom pufri s 0,5 M guanidínom. Nariedené homogenáty boli potom centrifugované pri 16000 x g počas 15 s pri RT. Vzorky a štandardy APP boli pridané z podielov na misky v duplikátoch a inkubované cez noc pri 4 °C. Biotinylovaná referenčná protilátka 2H3 alebo 16H9 bola inkubovaná so vzorkami počas 1 h pri RT. Konjugát streptavidínu a alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim), riedený 1 : 1000 vo vzorkovom pufri, bol inkubovaný v jamkách počas 1 h pri RT. Na 30 minút v RT bol pridaný fluorescenčný substrát (4-metyl-umbelliferylfosfát) a misky boli analyzované fluorimetrom Cytofluor 2350 (Millipore), pričom excitácia pribiehala pri 350 nm a emisia pri 450 nm.

7. Imunohistochémia

Mozgy boli fixované počas 3 dní pri 4 °C v 4 % paraformaldehyde v PBS a potom dovtedy, kým boli narezané skladované 1 až 7 dní pri 4 °C v 1 % paraformaldehyde v PBS. Koronálne rezy 40 pm hrubé boli nakrájané na vibratóme pri RT a skladované v kryoprotektante (30 % glycerol, 30 % etylénglykol vo fosfátovom pufri) pri -20 °C predtým, ako boli použité na imunohistochemickú analýzu. Z každého mozgu bolo získaných 6 rezov v oblasti dorzálneho hipokampu (medzera

131 medzi rezmi bola vždy 24 0 μπι), ktoré boli cez noc inkubované s jednou z nasledujúcich protilátok: (1) biotinylovaná anti-Αβ (mAb, 3D6, špecifická pre ľudské Αβ) nariedená v koncentrácii 2 pg/ml v PBS s 1 % konským sérom; alebo (2) biotinylovaná mAb špecifická pre ľudské APP, 8E5, nariedená v koncentrácii 3 pg/ml v PBS s 1 % konským sérom; (3) mAb špecifická pre gliálny vláknitý acidický proteín (GFAP, Sigma Chemical Co.), nariedená 1 : 500 v 0,25 % Triton X-100 s 1 % konským sérom v soľnom roztoku pufrovanom Tris, pH 7,4 (TBS); alebo (4) mAb špecifická pre CDllb, MAC-1 antigén (Chemicon International), nariedená 1 : 100 v 0,25 % Triton X-100 s 1 % králičím sérom v TBS; alebo (6) krysia mAb špecifická pre CD43 (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (7) krysia mAB špecifická pre CD45RA (Pharmingen) , nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (8) krysia mAB špecifická pre CD45RB (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (9) krysia mAB špecifická pre CD45 (Pharmingen), nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (10) biotinylovaná polyklonálna škrečkovská protilátka špecifická pre CD3e (Pharmingen) nariedená 1 : 100 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (11) krysia mAb špecifická pre CD3 (Serotec), nariedená 1 : 200 s 1 % králičím sérom v PBS; alebo (12) roztok PBS bez primárnej protilátky a obsahujúci 1 % normálne konské sérum.

Rezy určené na reakciu s roztokmi protilátok 1, 2 a 6 až 12 boli najskôr vystavené pôsobeniu 1 % Triton X-100 a 0,4 % peroxidu vodíka v PBS počas 20 minút pri RT, s cieľom zablokovania endogénnej peroxidázy. Potom boli cez noc inkubované pri 4 °C s primárnou protilátkou. Rezy určené na reakciu s 3D6 alebo 8E5 alebo CD3 boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín spolu s časťami komerčnej súpravy, označenej A a B, ktoré boli nariedené 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burliname, CA) . Rezy určené na reakciu s protilátkami špecifickými pre CD45RA, CD45RB, CD45, CD3 a roztok PBS bez primárnej protilátky boli inkubované počas 1 h pri RT s biotinylovaným IgG proti krysiemu IgG (Vector), nariedenému 1 : 75 v PBS a41ebo s biotinylovaným IgG proti myšiemu IgG

132 (Vector) , neriedeného 1 : 75 v PBS. Rezy boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidázaavidín-biotín spolu s časťami komerčnej sady označenými A a B, ktoré boli nariedené 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

Rezy boli vyvolané v 0,01 % peroxide vodíka, 0,05 % 3,3’diaminobenzidíne (DAB) pri RT. Rezy určené na inkubáciu s protilátkami špecifickými pre GFAP, MAC-1, MHC II boli najskôr vystavené pôsobeniu 0,6 % peroxidu vodíka pri RT, s cielom zablokovania endogénnej peroxidázy a potom inkubované cez noc pri 4 °C s primárnou protilátkou. Rezy, u ktorých prebehla reakcia s protilátkou proti GFAP boli inkubované počas 1 h pri RT s biotinylovaným konským IgG proti myšiemu IgG (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) nariedeným 1 : 200 v

TBS. Rezy boli potom počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín (Vector

Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) nariedenému 1 : 1000 v inkubované s monoklonálnymi protilátkami

TBS.

Rezy špecifickými pre MAC-1 a MHC II boli následne vystavené pôsobeniu biotylovaného králičieho IgG proti myšiemu IgG, nariedenému 1 : 200 v TBS, potom boli počas 1 h pri RT vystavené pôsobeniu komplexu chrenová peroxidáza-avidín-biotín nariedenému 1 : 1000 v TBS. Rezy inkubované s protilátkami špecifickými pre GFAP, MAC-1 a MHC II boli potom pri RT zviditelňované pôsobením 0,05 % DAB, 0,01 % peroxidu vodíka,

0,04 % chloridu nikelnatého a TBS počas 4 a 11 minút.

Rezy označené protilátkou boli pripevnené na podložné sklá (VWR, Superfrost slides), cez noc vysušené na vzduchu, prepláchnuté v Propar (Anatec) a prekryté krycími sklíčkami s použitím upevňujúceho média Permount (Fisher).

Preto, aby boli zviditelnené aj plaky Αβ, bola po imunohistochemickom spracovaní časť GFAP-pozitívnych rezov upevnená na sklíčka Superfrost a inkubovaná v 1 % vodnom tioflavíne S (Sigma) počas 7 minút. Rezy boli dehydratované a umyté v Propar a potom prekryté krycími sklíčkami s použitím upevňovacieho média Permount.

133

8. Obrazová analýza

Na kvantifikáciu imunoreakcií v rezoch bol používaný systém analýzy obrazu Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) pripojený k CCD kamerou k mikroskopu Nikon Microphot-FX a monitoru Sony Trinitron. Obraz rezu bol uložený a na základe farby a sýtosti bol určený prah na výber a výpočet celkovej oblasti obrazových prvkov zobrazujúcich štruktúry, v ktorých prebehla imunitná reakcia. U každého rezu bol ručne urobený obrys hipokampu a potom vypočítaný celkový priestor obrazových prvkov zobrazujúcich hipokampus. Percento amyloidného zaťaženia bolo merané ako: (časť hipokampálnej oblasti obsahujúcej usadeniny Αβ zistené imunoreakciou s mAb 3D6) x 100. Podobne bolo merané percento neuritického zaťaženia: (časť hipokampálnej oblasti obsahujúca dystrofické neurity reagujúce s monoklonálnou protilátkou 8E5) x 100. Na zistenie percenta retrospleniálnej oblasti obsadenej GFAPpozitívnymi astrocytmi a MAC-1- a MHC II-pozitívnou mikrogliou bol použitý systém C-Imaging (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) , ktorý pracoval s programom Simple 32 Software Application a bol pomocou kamery Optronics napojený na mikroskop Nikon Microphot-FX. Obraz oblasti, v ktorej prebehla imunitná reakcia bol uložený a na základe jednej farby bol určený prah na výber a výpočet celkovej oblasti obrazových prvkov zobrazujúcich bunky, v ktorých prebehla imunitná reakcia. U každého rezu bol ručne urobený obrys retrospleniálnej kôry (RSC) a potom spočítaný celkový priestor obrazových prvkov zobrazujúcich RSC. Percento výskytu astrocytózy bolo merané ako: (časť RSC oblasti obsadenej GFAPpozitívnymi astrocytmi) x 100. Podobne bolo merané percento mikrogliózy): (časť RSC oblasti obsadenej MAC-1- alebo MHC IIpozitívnou mikrogliou) x 100. U každého zvieraťa bolo pri kvantifikácii obrazovou analýzou z mozgu vybraných šesť rezov v oblasti dorzálneho hipokampu (medzera medzi rezmi bola vždy 240 pm) . V žiadnom z prípadov nebol pozorovateľovi (pracovník uskutočňujúci analýzu obrazu) uvedený stav a uskutočňovaná liečba zvieraťa.

134

Príklad 14

Analýza ex vivo účinku protilátok na amyloidné usadeniny

Na zistenie účinku protilátok na odbúravanie plakov bola použitá ex vivo analýza, pri ktorej boli primárne mikrogliálne bunky pestované s nezafixovanými rezmi z kryostatu, ktoré pochádzali z mozgov PDAPP myší alebo z ľudských mozgov s AD. Mikrogliálne bunky boli získané z mozgovej kôry novorodených DBA/2N myší (1 až 3 dni staré). kôry boli mechanicky rozrušené v HBSS (Hanks’ Balanced Sált Solution, Sigma) s 50 μΙ/ml DNázy I (Sigma) . Uvoľnené bunky boli prefiltrované cez 100 pm celí stainer (Sigma) a centrifugované pri 1000 rpm počas 5 minút. Peleta bola resuspendovaná v rastovom médiu (DMEM s vysokým obsahom glukózy, 10 % FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a bunky boli pestované s hustotou 2 mozgy na plastovú kultivačnú fľašu T75. Po 7 až 9 dňoch boli fľaše stočené na orbitálnej trepačke pri 200 rpm počas 2 h pri 37 ’C. Bunková suspenzia bola centrifugovaná pri 1000 rpm a resuspendovaná v analytickom médiu.

pm široké kryostatické rezy z mozgov PDAPP myší alebo z ľudských AD mozgov, ktoré boli získané menej ako 3 h po smrti, sa nechali rozohriať upevnené na guľatom krycom sklíčku pokrytom polylyzínom a boli umiestnené do jamiek (24-jamková kultivačná miska). Sklíčka boli dvakrát opláchnuté analytickým médiom obsahujúcim H-SFM (hybridómové médium bez séra, Gibco BRL) s 1 % FBS, glutamínom, penicilín/streptomycínom a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontrola alebo protilátky Αβ boli pridané koncentrované 2-krát (výsledná koncentrácia 5 pg/ml) na 1 hodinu. Mikrogliálne bunky boli potom vysadené s hustotou 0,8 x 10⁶ buniek/ml analytického média. Kultúry boli udržiavané vo vlhčenom inkubátore (37 ’C, 5 % C0₂) počas 24 h alebo dlhšie. Na konci inkubácie boli kultúry fixované so 4 % paraformaldehydom a membrány buniek boli narušené pomocou 0,1 % Triton X-100. Rezy boli vystavené pôsobeniu biotinylovanej 3D6 a potom konjugátu streptavidínu a Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Exogénne mikrogliálne bunky boli zviditeľnené jadrovým farbivom (DAPI). Kultúry boli pozorované v invertovanom fluorescenčnom mikroskope (Nikon, TE300) a

135 mikrofotografie boli urobené digitálnou kamerou SPOŤ, s použitím programu SPOŤ (Diagnostic Instruments). Na Westernovu analýzu boli kultúry extrahované 8 M močovinou, nariedenou 1 : 1 v tricínovanom redukujúcom vzorkovom pufri a aplikované na 16 % tricínový gél (Novex). Po prenose na immobilón boli bloty vystavené pôsobeniu pAbAB42 (5 pg/ml) a potom konjugátu HRP s protilátkou proti myši a vyvolané s ECM (Amersham).

V prípade analýzy uskutočňovanej s rezmi z PDAPP myší v prítomnosti protilátky 16C11 (jedna z protilátok proti AB, ktoré in vivo neboli účinné) zostali β-amyloidné plaky nezmenené a nebola pozorovaná žiadna fagocytóza. Keď však boli priľahlé rezy pestované v prítomnosti 10D5, amyloidné usadeniny sa z väčšej časti stratili a mikrogliálne bunky obsahovali početné fagocytárne mechúriky s obsahom AB. Rovnaké výsledky sa dosiahli u rezov z AD mozgov; 10D5 vyvolala fagocytózu AD plakov, zatiaľ čo 16C11 bola neúčinná. Porovnateľné výsledky boli pozorované pri analýzach uskutočnených buď s myšími alebo ľudskými mikrogliálnymi bunkami, a tiež s myšími, králičími alebo ľudskými protilátkami proti AB.

Tabuľka 16 ukazuje výsledky získané s rôznymi protilátkami proti AB, porovnáva ich schopnosti vyvolať fagocytózu pri ex vivo analýze a znížiť plakové zaťaženie in vivo pri štúdiách pasívneho prieniku. Aj keď sa 16C11 a 21F12 viazali na agregovaný syntetický AB s veľkou ochotou, neboli tieto protilátky schopné reagovať s B-amyloidnými plakmi v nefixovaných mozgových rezoch, neboli schopné spustiť fagocytózu pri ex vivo analýze a neboli účinné ani in vivo. 10D5, 3D6 a polyklonálna protilátka proti AB vykazovali vo všetkých troch uvedených bodoch účinné pôsobenie. Protilátka 22C8 sa silnejšie viaže na analóg formy prirodzene sa vyskytujúceho AB, ktorý je charakteristický zámenou kyseliny asparagovej z pozíciách 1 a 7 za kyseliny izoasparagovú. Tieto výsledky ukazujú, že in vivo účinnosť sa prejavuje priamym odbúravaním plaku vnútri CNS, sprostredkovaným protilátkami, a že analýza ex vivo predpovedá účinnosť in vivo.

136

Rovnaká analýza bola použitá pri testovaní očisťovacej schopnosti (sprostredkovania odbúravania plaku) protilátky proti fragmentu synukleínu, nazývanému NAC. U synukleínu sa preukázalo, že je proteínom spojeným s amyloidnými plakmi. Protilátka proti NAC bola vyššie opísaným spôsobom aplikovaná na vzorku mozgového tkaniva obsahujúcemu amyloidné plaky a mikrogliálne bunky. Ako kontrola bolo použité králičie sérum. Nasledujúce preskúmanie ukázalo jasné zníženie množstva a rozmeru plakov a preukázalo tak očisťovaciu schopnosť tejto protilátky.

Pri potvrdení, že Αβ bolo počas ex vivo analýzy internalizované bol použitý spôsob konfokálnej mikroskopie. V prítomnosti kontrolných protilátok zostávajú exogénne mikrogliálne bunky v konfokálnej rovine nad tkanivom, nie sú vidieť žiadne fagocytické mechúriky s Αβ a plaky v rezoch nie sú porušené. V prítomnosti 10D5 sa nachádzal skoro všetok plakový materiál v mechúrikoch exogénnych mikrogliálnych buniek. Na zistenie ďalšieho osudu internalizovaného peptidu boli kultúry vystavené pôsobeniu 10D5, vo rôznych časoch extrahované 8 M močovinou a preskúmané pomocou Westernovej analýzy. V čase 1 h, keď ešte nebolo možné pozorovať fagocytózu, bol po reakcii s polyklonálnou protilátkou proti Αβ zjavný pásik silný 4 kDa (zodpovedajúci peptidu Αβ) . Αβ imunoreaktivita klesla počas prvého dňa a tretí deň už nebola prítomná. To znamená, že fagocytóza Αβ sprostredkovaná protilátkami vedie k jeho degradácii

S cieľom zistenia, či fagocytóza v ex vivo analýze prebiehala sprostredkovaná Fc receptormi boli pripravené CF(ab')2 fragmenty protilátky 3D6, špecifickej pre Αβ. Aj keď fragmenty F(ab’)2 zachovali úplnú schopnosť viazať sa na plaky, neboli schopné spustiť fagocytózu mikrogliálnych buniek. A ďalej, fagocytóza spustená kompletnou protilátkou mohla byť zastavená látkou blokujúcou myšie Fc receptory (anti-CD16/32) . Tieto výsledky znamenajú, že odbúravanie Αβ in vivo prebieha fagocytózou sprostredkovanou Fc receptormi.

137 a;

d^- + vivo analýza pri predpovedi in vivo účinnosti

O ’·*«

Ai

O

C •H >0 '3

C

rt	Ό •r4
c	0
rt	f-1 >1	>1
n	e	AÍ
N	ro	ro
:Π5	1	rd
>	cq	d

A!

rtJ

-P •H c

rt

O di (i

c	Q) —	o	o	o
id	P	r-	m	o	O	o
M	d> cq		tt	σ\	un i	VO

rfj ro

S

P o

N

H

CM

O oo

O ►—H

CN

O

O ω

o g

N (0

Al

-P 'rt i-d ‘H

4-)

P (A (0

C '(0 C O r—I a; o c o g

	'íti
VO Q	oo Q o	u vo	<N U-.	CÚ (N 2	C 0 <-1	CM -st 1
m			CN	H		T—

>! I—I o

d

138

Príklad 15

Prechod protilátok cez hematoencefalickú bariéru

Nižšie opísané pokusy boli vykonané s cielom získania informácií o schopnosti protilátok prechádzať po periférnej intravenóznej injekcii do mozgu a na zabezpečenie spôsobov na meranie koncentrácie protilátky v mozgu po intravenóznej injekcii do periférneho tkaniva, a to ako u normálnych, tak aj u PDAPP myší. Takéto merania sú užitočné pri predpovedi a určení účinných dávok.

Myši PDAPP alebo kontrolné myši boli perfundované 0,9 % NaCI. Mozgové oblasti (hipokampus alebo kôra) boli vybraté a rýchlo zmrazené. Mozgy boli homogenizované v 0,1 % Triton s inhibítormi proteáz. Imunoglobulín v extraktoch bol detegovaný technikou ELISA. Kozí F(ab’)2 IgG proti myšiemu F(ab’)2 IgG, predstavujúci uchytenú protilátku, bol aplikovaný na RIA misky. Sérové alebo mozgové extrakty boli inkubované počas 1 h. Izotypy boli detegované protimyšími protilátkami IgGl-HRP, IgG2a-HRP alebo IgG2b-HRP (Caltag). Protilátky, bez ohľadu na izotyp, sa v CNS vyskytovali v koncentrácii 1 : 1000 v pomere ku koncentrácii v krvi. Napríklad, keď koncentrácia IgGl bola krvi trojnásobná ako koncentrácia IgG2a, tak pomer ich koncentrácii zostal v mozgu zachovaný, pričom koncentrácie obidvoch látok v mozgu predstavovali 0,1 % ich hladiny v krvi. Tieto výsledky boli pozorované ako u transgénnych, tak aj u normálnych myší, z čoho vyplýva, že PDAPP myši nemajú neobvykle priepustnú hematoencefalickú bariéru.

Aj keď predkladaný vynález bol z dôvodu jasnosti a zrozumiteľnosti opísaný podrobnejšie, je zrejmé, že v rozsahu predkladaných nárokov je možné uskutočniť určité modifikácie. Všetky tu citované publikácie a patentové dokumenty sú tak zahrnuté podľa odkazu vo svojej celistvosti pre všetky účely v rovnakej miere, ako by každý z nich bol jednotlivo označený.

Claims (56)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje činidlo, ktoré je schopné v tele pacienta vyvolať imunitnú odpoveď proti amyloidnej zložke a farmaceutickú pomocnú látku.
2. 2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že amyloidná zložka je peptid alebo proteín.
3. 3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že amyloidná zložka je odvodená od vláknitého prekurzorového proteínu vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje proteíny alebo peptidy, medzi ktoré patria sérový amyloidný A proteín (ApoSSA), ľahký reťazec imunoglobulínu, ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrinogénu, gelsolin, cystatín C, β amyloidný prekurzorový proteín (β-ΑΡΡ), B₂-mikroglobulín, priónový prekurzorový proteín (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratin, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín), peptidové hormóny a synukleín, pričom mutantné proteíny, fragmenty proteínov a peptidy vzniknuté po ich proteolýze sú v nej tiež zahrnuté.
4. 4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo vyvoláva imunitnú odpoveď zameranú proti neoepitopu tvorenému uvedenými vláknitými proteínmi alebo peptidmi, a to podľa vláknitého prekurzorového proteínu.
5. 5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedená amyloidná zložka patrí do skupiny, ktorá zahŕňa AA, TYL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.
6. 6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo patrí do skupiny činidiel, ktorá zahŕňa AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.

   140
7. 7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok obsahuje činidlo, ktoré je schopné vyvolať imunitnú odpoveď najmenej proti dvom rôznym amyloidným zložkám.
8. 8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo je peptid spojený s nosným proteínom.
9. 9. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že prostriedok obsahuje adjuvant.
10. 10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený adjuvant je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje QS21, MPL, alum a Freundov adjuvant.
11. 11.Spôsob prevencie alebo liečby poruchy charakterizovanej ukladaním amyloidu v cicavčom subjekte, ktorý zahŕňa podanie činidla subjektu v dávke schopnej vyvolať imunitnú odpoveď proti amyloidnej zložke charakteristickej pre danú poruchu.
12. 12.Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená amyloidná zložka je vláknitý protein alebo peptid.
13. 13.Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedená imunitná odpoveď je zameraná na vláknitú zložku odvodenú od prekurzorového proteínu vybraného zo skupiny, do ktorej patrí sérový amyloidný A protein (ApoSSA), ľahký reťazec imunoglobulínu, ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrínogénu, gelsolin, cystatin C, β amyloidný prekurzorový protein (β-ΑΡΡ), β₂mikroglobulín, priónový prekurzorový protein (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratin, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový protein), peptidové hormóny a synukleín, pričom mutantné proteíny, fragmenty proteínov a peptidy vzniknuté po ich proteolýze sú v nej tiež zahrnuté.
14. 14.Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo vyvoláva imunitnú odpoveď zameranú proti neoepitopu tvorenému uvedenou amyloidnou zložkou, a to podľa uvedeného prekurzorového proteínu.

    141
15. 15.Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedená amyloidná zložka patrí do skupiny, ktorá zahŕňa AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.
16. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo patrí do skupiny, ktorá zahŕňa ΆΑ, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.
17. 17.Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok obsahuje činidlo, ktoré je schopné vyvolať imunitnú odpoveď najmenej proti dvom rôznym amyloidným zložkám.
18. 18. Spôsob podía nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie zahŕňa podávanie najmenej dvoch amyloidných vláknitých zložiek.
19. 19.Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedené činidlo je peptid spojený s nosným proteínom.
20. 20.Spôsob podía ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 19, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie zahŕňa adjuvant.
21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že uvedený adjuvant je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje QS21, MPL, alum a Freundov adjuvant.
22. 22.Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená imunologická odpoveď je charakterizovaná sérovým titrom najmenej 1 : 1000, a to podlá danej amyloidnej zložky.
23. 23.Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že uvedený sérový titer je najmenej 1 : 5000, a to podía danej vláknitej zložky.
24. 24. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená imunologická odpoveď je charakterizovaná množstvom sérovej imunoreaktivity, ktoré zodpovedá viac ako štvornásobnej hladine sérovej imunoreaktivity nameranej u kontrolnej vzorky séra pred začatím liečby.

    142
25. 25. Spôsob podlá nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedené sérové množstvo imunoreaktivity je merané v séru riedenom asi 1 : 100.

    Spôsob na určenie prognózy pacienta podrobujúceho amyloidnéj pacientovej amyloidnej pacientovej väčšie ako poruchy a zahŕňajúci meranie sérovej imunoreaktivity proti zložke, vyznačujúci sa tým, že sérovej imunoreaktivity, najmenej kontrolná bazálna hodnota indikuje sa liečbe množstva vybranej množstvo štyrikrát prognózu zlepšenia (podľa konkrétnej amyloidnej poruchy)
26. 27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že uvedené pacientovo množstvo sérovej imunoreaktivity proti uvedenej vybranej amyloidnej zložke je charakterizované sérovým titrom najmenej 1 : 1000.
27. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že uvedené pacientovo množstvo sérovej imunoreaktivity proti uvedenej vybranej amyloidnej zložke je charakterizované sérovým titrom najmenej 1 : 5000.
28. 29. Spôsob prevencie alebo liečby poruchy charakterizovanej ukladaním amyloidu v tele pacienta, ktorý zahŕňa podanie účinnej dávky protilátky viažúcej sa špecificky na amyloidnú zložku prítomnú v uvedenej usadenine alebo jej fragmentu pacientovi.
29. 30.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, amyloidné zložka je zložka vláknitá.

    že uvedená
30. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že uvedená protilátka alebo jej fragmenty sa viažu na epitop uvedenej vláknitej zložky.
31. 32.Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo fragment protilátky sa špecificky viažu na uvedenú vláknitú zložku bez toho, že by sa viazali na prekurzor uvedenej vláknitej zložky.
32. 33.Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že protilátka je ľudská protilátka proti uvedenej vláknitej zložke, pripravená z ľudských B-buniek imunizovaných epitopom vláknitej zložky.

    143
33. 34. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že vláknitá amyloidná zložka je odvodená od vláknitého prekurzorového proteínu vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje proteíny alebo peptidy, medzi ktoré patria sérový amyloidný A proteín (ApoSSA), ľahký reťazec imunoglobulínu, ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrinogénu, gelsolin, cystatin C, β amyloidný prekurzorový proteín (β-ΑΡΡ), B₂-mikroglobulín, priónový prekurzorový proteín (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratin, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín), peptidové hormóny a synukleín, pričom mutantné proteíny, fragmenty proteínov a peptidy vzniknuté po ich proteolýze sú v nej tiež zahrnuté.
34. 35.Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že uvedená vláknitá amyloidná zložka patrí do skupiny, ktorá zahŕňa AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, .Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.
35. 36.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie zahŕňa podávanie protilátok, ktoré sa viažu najmenej na dve amyloidné vláknité zložky.
36. 37.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že uvedená účinná dávka je charakterizovaná množstvom pacientovej sérovej imunoreaktivity proti uvedenej amyloidnej zložke, ktoré zodpovedá viac ako štvornásobnej hladine sérovej imunoreaktivity proti uvedenej zložke nameranej u kontrolnej vzorky séra pred začatím liečby.
37. 38.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo jej fragment sú podávané spolu s nosičom, čím tvoria farmaceutický prostriedok.
38. 39.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo jej fragment sú podávané intraperitoneálne, orálnou cestou, intranazálne, subkutánne, intramuskulárne, lokálne alebo intravenózne.
39. 40.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že protilátka je aplikovaná podaním polynukleotidu kódujúceho najmenej jeden reťazec protilátky do tela pacienta, a vyznačujúci sa

    144 tým, že polynukleotid je v pacientovi exprimovaný, čo vedie k vzniku reťazca protilátky.
40. 41.Spôsob podlá nároku 40, vyznačujúci sa tým, že polynukleotid kóduje ťažký a ľahký reťazec protilátky a jeho následná expresia tak v tele pacienta zabezpečuje vznik ťažkého a ľahkého reťazca protilátky.
41. 42.Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo jej fragment sú podávané vo viacerých dávkach počas najmenej šiestich mesiacov.
42. 43. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že protilátka je podávaná vo forme postupne sa uvoľňujúceho prostriedku.
43. 44. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že je určený na prevenciu alebo liečbu poruchy charakterizovanej ukladaním amyloidu v tele pacienta, zahŕňajúci podanie účinnej dávky protilátky viažúcej sa špecificky na amyloidnú zložku prítomnú v uvedenej usadenine alebo jej fragmentu pacientovi.
44. 45. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedená amyloidná zložka je vláknitá.
45. 46. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že uvedená protilátka sa viaže na epitop vláknitej zložky.
46. 47. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo fragment protilátky sa špecificky viažu na uvedenú vláknitú zložku bez toho, že by sa viazali na prekurzor uvedenej vláknitej zložky.
47. 48. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že protilátka je ľudská protilátka proti uvedenej vláknitej zložke, pripravená z ľudských B-buniek imunizovaných epitopom vláknitej zložky.
48. 49. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že vláknitá amyloidná zložka je odvodená od vláknitého prekurzorového proteínu vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje proteíny alebo peptidy, medzi ktoré patria sérový amyloidný A proteín (ApoSSA), ľahký reťazec imunoglobulínu,

    145 ťažký reťazec imunoglobulínu, ApoAI, transtyretín, lyzozým, a reťazec fibrinogénu, gelsolin, cystatin C, β amyloidný prekurzorový proteín (β-ΑΡΡ) , β₂-mikroglobulín, priónový prekurzorový proteín (PrP), artriálny natriuretický faktor, keratin, IAPP (ostrovčekový amyloidný polypeptidový proteín) , peptidové hormóny a synukleín, pričom mutantné proteíny, fragmenty proteínov a peptidy vzniknuté po ich proteolýze sú v nej tiež zahrnuté.
49. 50. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 49, vyznačujúci sa tým, že uvedená vláknitá amyloidná zložka patrí do skupiny, ktorá zahŕňa AA, AL, ATTR, AApoAI, Alys, Agel, Acys, Αβ, Αβ₂Μ, AScr, Acal, AIAPP a fragment synukleín-NAC.
50. 51. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie zahŕňa podávanie protilátok, ktoré sa viažu najmenej na dve amyloidné vláknité zložky.
51. 52. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedená účinná dávka je charakterizovaná množstvom protilátok alebo ich fragmentov, schopných vyvolať v tele pacienta také množstvo sérovej imunoreaktivity proti uvedenej amyloidnej zložke, ktoré zodpovedá viac ako štvornásobnej hladine sérovej imunoreaktivity proti uvedenej zložke nameranej u kontrolnej vzorky séra pred začatím liečby.
52. 53. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že farmaceutické zloženie zahŕňa nosič.
53. 54. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický prostriedok je určený na podanie intraperitoneálne, orálne, intranazálne, subkutánne, intramuskulárne, lokálne alebo intravenózne.
54. 55. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 44, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický prostriedok obsahuje polynukleotid kódujúci najmenej jeden reťazec protilátky, ktorý je následne schopný sa v pacientovi exprimovať, čo vedie k vzniku reťazca protilátky.
55. 56. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 55, vyznačujúci sa tým, že polynukleotid kóduje ťažký a ľahký reťazec

    146 protilátky a je následne v tele pacienta schopný zabezpečiť vznik ťažkého a lahkého reťazca protilátky.
56. 57. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický prostriedok je pripravený tak, že dochádza k jeho postupnému uvoľňovaniu.