CZ302971B6

CZ302971B6 - Farmaceutický prostredek pro lécbu amyloidních onemocnení, zpusoby prevence a prognózy

Info

Publication number: CZ302971B6
Application number: CZ20014154A
Authority: CZ
Inventors: B. Schenk@Dale
Original assignee: Elan Pharma International Limited
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2012-01-25
Also published as: CA2375104A1; IL207166A0; NZ587223A; TR200103469T2; IS6170A; AU5316300A; EP2364719B1; EE05492B1; CN1377278A; UA81216C2; CA2375104C; ATE495755T1; EP2364719A1; NO20015758L; KR20020025884A; EA200101250A1; BG65756B1; CY1111639T1; IL207166A; US20080248029A1

Abstract

Farmaceutický prostredek pro prevenci nebo lécbu rady amyloidních onemocnení, mezi než patrí Alzeimerova choroba, prionová onemocnení, familiální amyloidní neuropatie atd. Farmaceutické prostredky obsahují imunologicky úcinná množství amyloidních vláknitých složek tvorících vlákna. Popsány jsou také lécebné prostredky a zpusoby, které užívají imunitní cinidla reagující s temito vláknitými složkami.

Description

Oblast techniky

Tento vynález popisuje prostředky a metody pro léčbu amyloidních stavů u lidí a obratlovců.

Dosavadní stav techniky

Amyloidóza je obecný termín zahrnující množství nemocí jež jsou charakterizovány extraceluiámím ukládáním proteinových vláken, která tvoří početní „amy lo i dní plaky“, jež se mohou objevit lokálně nebo systemicky. Vláknitá konstituce těchto plaků je pro různé formy amyloidních onemocnění určující charakteristikou. Například intracerebrální a cerebrovaskulámí plaky složené převážně z vláken beta amyloidního peptidu (β-APjjsou charakteristikou Alzheimerovy choroby (jak familiální tak sporadická forma), vlákna ostrůvkového amyloidního polypeptidového proteinu (IAPP - amylin) jsou charakteristická pro plaky v buňkách pankreatických ostrůvků spojených s diabetes typu II a p2-mikroglobulin je hlavní složkou amyloidních plaků, tvořících se následkem dlouhodobé léčby hemodialýzou. Nedávno byly jako amyloidní onemocnění uznány také nemoci spojené s priony, například Creutzfeld-Jacobova nemoc.

Jednotlivé formy nemoct jsou děleny do skupin, většinou na základě toho jestli amyloidóza je nebo není spojena se systémickým onemocněním. To znamená, že za primární jsou považovány amyloidózy, u kterých není důkaz o předcházející nebo koexistující nemoci. Obecně jsou primární amyloidózy charakteristické přítomností proteinových vláken typu AL (amyloidní lehké řetězce), takto pojmenovaných pro homologii N-koncové oblasti AL vlákna s variabilním úsekem lehkého řetězce imunoglobulinu (kappa nebo lambda).

Sekundární neboli reaktivní amyloidóza je charakterizována ukládáním vláken AA typu odvozených od sérového amyloidního A proteinu (ApoSSA). Tyto formy amyloidózy jsou charakterizovány předcházejícím výskytem chronického zánětlivého nebo infekčního stavu (např. revmatoidní artritida, osteomyelitida, tuberkulóza, lepra).

Heredofamiliální amyloidózy mohou být doprovázeny neuropatickými, ledvinovými nebo kardiovaskulárními plaky ATTR transhyretinového typu. Jiné heredofamiliální amyloidózy zahrnují jiné syndromy a mohou být odlišné amyloidní složky (např. familiální Středozemní horečka, která je charakteristická AA vlákny). Jiné formy amyloidózy zahrnují lokální formy, které jsou charakteristické ohniskovými ložisky a často usazeninami rakovinového typu, objevujícími se v izolovaných orgánech. Jiné amyloidózy jsou spojeny se stárnutím a jsou všeobecně charakterizovány tvorbou plaků v srdci a mozku. Časté jsou také amyloidní plaky spojené s dlouhotrvající hemodialýzou. Tyto a jiné formy amyloidních onemocnění jsou shrnuty v tabulce 1. (Tan, S.Y. and Pepys, Histopathology 25:403-414, 1994; Harisson’s Handbook of Intemal Medicine, 13^thEd. Isselbalcher, K.J. et al, eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995).

Často se stává, že vlákna tvořící amyloidní plak jsou odvozena od vícero prekurzorových proteinů a jsou obvykle spojena se sulfátovanými gly kosám inogly kaný. Amyloidní plaky mohou obsahovat i minoritní proteiny a peptidy různých typů, společně s jinými složkami jako třeba s proteoglykany, gangliozidy a jinými cukry, což je detailněji popsáno v následující části.

V současnosti neexistují specifické způsoby léčby pro žádné z amyloidních onemocnění.

V případech kde se současně vyskytuje i doprovodné onemocnění, je snížení tvorby amyloidogenního proteinu docilováno pomocí léčby doprovodného onemocnění. Typickým příkladem může být léčba tuberkulózy antibiotiky, čímž se snižuje množství mykobakterií což vede k zmenšení zánětu a tím ke snížení hladiny SSA proteinu. V případě AL amyloidu způsobeného mnoho- 1 CZ 302971 B6 násobným výskytem myelomu, vede chemoterapie k snížení množství plazmatických buněk, a tím i ke snížení hladiny myelomových

Tabulka 1

Klasifikace amyloidních onemocnění *

s (Λ *E

Λ >

β ’5Ϊ ’Μ

O

Ul fi.

£· i I s -3

O u u pul fi.

^k3 00

O O.

§ .a

2* tZ3 <

ll o fi.

§ .3 ř-s 2 & 38 <

• Mt

Ό ** fi.

<u fi. fi.

-2CZ 302971 B6 dyskrazie;

monoklonální

Jš ‘<u £

KU a

=§ jo _ω g-a'3

Cfl «3 >v g-a 8 >o S 3 &-S •a ^3 ₌ o

IO <L>

8.ŠŽ ‘03

Ή bp

li s 3S ε o % s >> 5 m ca «Γ

o s

>uJ s* a

cú £

.3 £

>>

O bO o

*>» <u

I l

(O.

‘O

O a

?2 12 § ,s i£

H CN
&2
+- <D		r-
	SO	oo
	CN
§ 3 8		c cc <

í*—

É .3 <D

O ω

bů <

Acys Cystatin C Gin 68 dědičná cerebrální

-3CZ 302971 B6 β amyloidní různé: Gin 618 Alzheimerova prekurzorový protein choroba (např. β-ΑΡΡ₆₉₅) Downův syndrom x>

Z '§ S >o o 'S £

I3s-aXJ TJ .2 53 Ώ 'S C m 2 o. £ cu já o o § *8 -SE *3

.3 o

řX

CQ.

<

s rs

CQ.

<

MO

Rt § 3

S co O <o u. to CX c

fX, 2

S >

(Zl

-4 CZ 302971 B6

o

-·> 2 sa a « S

I ° a3 ° ri £· »

tí <U (Λ

JÍ š

« |>s o rdl 'w' «1 <S

I a

C4f^

Pg il o, o,x>

XI m

’3 (β <S

XJ o íC

0-1

c oli

CLi

imunoglobulinu. S poklesem jejich hladiny může zmizet i AL amyloíd. Přihlášky patentů US. USSN, 09/201 430, podaný 28. května 1999 odhalují, že zatížení amyloidním plakem spojené s Alzheimerovou chorobou může být značně snížena (a předejita) podáváním látek, které vyvolávají imunitní odpověď na β-amyloidní peptid (Αβ) ajeho fragmenty. Objevem předkládaného vynálezu je to, že indukce imunitní odpovědi pro různé složky amyloidních plaků je účinná při léčbě široké škály amyloidních onemocnění.

-5CZ 302971 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká farmaceutického prostředku, který obsahuje Činidlo, které je schopno v těle pacienta vyvolat imunitní odpověď proti amyloidní složce, a farmaceutickou pomocnou látku a adjuvans, kde amyloidní složka je odvozená z vláknitého prekurzorového proteinu vybraného ze skupiny obsahující těžký řetězec imunolgobulinu, ApoAl, transhyretin, lysozym, gelsolin, p2-mikroglobulin, atriální natřiuretický faktor, ostrůvkový amyloidní polypeptid. (pro)kalcitonin a synuklein.

Předkládaný vynález je zaměřen na farmaceutické prostředky a metody pro léčbu řady amyloidních onemocnění. Podle jednoho hlediska zahrnuje vynález farmaceutické prostředky, které jako účinnou složku obsahují látku, jež je schopna vyvolat imunitní odpověď vůči amyloidní složce v pacientovi. V takovýchto prostředcích budou zpravidla obsaženy také pomocné látky a v navrhovaném provedení mohou obsahovat adjuvanty. V dále navrhovaných provedeních zahrnují adjuvanty například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, MPL™, QS-21 (Stimulon™) nebo Freundův nekompletní adjuvant. V navrhovaném provedení mohou takovéto farmaceutické prostředky obsahovat množství látek schopných vyvolat v pacientovi imunitní odpověď vůči více než jedné amyloidní složce.

V popisovaném provedení je látka schopna vyvolat imunitní odpověď zaměřenou proti vláknité peptidové nebo proteinové amyloidní složce. Takovýto vláknitý peptid nebo protein je pokud možno odvozen od vláknitého prekurzorového proteinu, o němž je známo, že je spojen s určitými formami amyloidních onemocnění, jak je zde popsáno. Takovéto prekurzorové proteiny zahrnují kromě jiných také těžký řetězec imunoglobulinu, ApoAl, transthyretin, lysozym, gelsolin, β2mikroglobutin, prionový prekurzorový protein (PrP), atriální natři uretický faktor, keratin, IAPP (ostrůvkový amyloidní polypeptidový protein), (pro)kalcitonin a synuklein. Tyto prekurzory zahrnují také mutantní proteiny, fragmenty proteinů a peptidy vzniklé po proteolýze těchto prekurzorů. V popisovaném provedení je látka schopna vyvolat imunitní odpověď zaměřenou vůči neoepitopu tvořenému vláknitým proteinem nebo peptidem, a to podle s ohledem na vláknitý prekurzorový protein. To znamená, že mnoho peptidů nebo proteinů tvořících vlákna jsou fragmenty těchto prekurzorových proteinů, například těch co jsou vyjmenovány výše. Při tvorbě těchto fragmentů, například proteolytickým štěpením, mohou být odhaleny epitopy, jež na prekurzorové molekule nebyly, z čehož plyne, že dokud je fragment částí prekurzorového proteinu není přístupný imunitnímu systému. Látkami zacílenými na takovéto epitopy mohou být popisované terapeutické látky, jelikož je méně pravděpodobné, že u pacienta vyvolají autoimunitní odpověď.

V popisovaném provedení zahrnují farmaceutické prostředky vynálezu látky zacílené na amyloidní složky, mezi něž patří nejen následující vláknité peptidy nebo proteiny: AH, ATTR, Agel, Acys, Αβ₂Μ, Ascr, Acal, AIAPP a fragment synuklein-NAC. Celé názvy a složení těchto peptidů jsou zde popsány. V oboru jsou dobře známy i metody přípravy takovýchto peptidů, což je zde popsáno.

V dále popisovaném provedení zahrnují látky obsažené v takovémto farmaceutickém prostředku také určité sulfatované proteoglykany. V popisovaném provedení je proteoglykan heparin sulfát glykosaminoglykan, nejlépe perlecan, dermatan sulfát, chondroítin—4—sulfát nebo pentosan polysulfát.

Ve shodě s dalším popisovaným hlediskem zahrnuje vynález metodu prevence nebo léčby poruchy charakterizované amyloidním plakem u savčího subjektu. Ve shodě s touto částí vynálezu je subjektu podávána účinná látka v dávce schopné vyvolat imunitní odpověď proti amyloidní složce charakteristické pro amyloidní poruchu, jíž subjekt trpí. Metody v podstatě zahrnují podávání farmaceutických prostředků obsahujících imunogenní amyloidní složku (viz výše), specifickou pro konkrétní poruchu. Takovéto metody jsou dále charakterizovány svou účinností ve vyvolání imunogenní odpovědi u subjektu. Podle předloženého provedení je metoda účinná ve

-6CZ 302971 B6 vyvolání imunologické odpovědi, jež je charakterizována sérovým titrem nejméně 1:1000 (podle amyloidní složky, vůči níž je imunogenní látka zacílena). Podle dále popisovaného provedení je, v závislosti na vláknité složce, sérový titr nejméně 1:5000. Podle popisovaného provedení je imunitní odpověď charakterizována množstvím sérové imunoreaktivity, odpovídající více než čtyřnásobné hladině sérové imunoreaktivity naměřené u kontrolního vzorku séra před započetím léčby. Naposledy zmíněná charakteristika je vhodná zvláště v případě když je sérová ímunoreaktivita měřena technikou ELISA, přičemž ale může být využita k jakémukoli relativnímu nebo absolutnímu měření sérové imunoreaktivity. Podle předloženého provedení je imunoreaktivita měřena u séra ředěného 1:100.

Podle dále popisovaného hlediska zahrnuje vynález metodu pro určení prognózy u pacienta podrobujícího se léčbě amyloidní poruchy. V tomto případě je u pacienta měřeno množství sérové imunoreaktivity proti amyloidní složce charakteristické pro konkrétní poruchu, přičemž množství sérové imunoreaktivity nejméně čtyřikrát větší než kontrolní bazální hodnota indikuje prognózu zlepšení (podle konkrétní amyloidní poruchy). Podle předložených provedení je množství imunoreaktivity proti vybrané amyloidní složce, přítomné v pacientově séru charakteristické sérovým titrem nejméně okolo 1:1000 nebo nejméně 1:5000 (podle amyloidní složky).

Podle popisovaného hlediska zahrnuje vynález také takzvanou pasivní imunizaci, tj. metody a farmaceutické prostředky pro prevenci nebo léčbu amyloidních onemocnění. Podle tohoto hlediska vynálezu je pacientům podáváno účinné množství protilátky, která se specificky váže na vybranou amyloidní složku, přednostně však na vláknitou část přítomnou v amyloidních plácích charakteristických pro léčenou nemoc. Tyto protilátky jsou vybírány pro jejich schopnost specificky se vázat na různé proteiny, peptidy a složky popisované v souvislosti s farmaceutickými prostředky a metodami popsanými v předchozích odstavcích této části. Podle popisovaného provedení mohou takovéto metody a prostředky obsahovat kombinace protilátek, které vážou nejméně dvě amyloidní vláknité složky. Obecně jsou tyto farmaceutické prostředky podávány pro zvýšení množství sérové imunoreaktivity proti cílové amyloidní složce, přičemž toto zvýšení je oproti sérovému množství imunoreaktivity v kontrolním vzorku séra nejméně čtyřnásobné. Protilátky mohou být také aplikovány s nosičem, což je zde popsáno. Obecně jsou takovéto protilátky, ve shodě s tímto hlediskem vynálezu, podávány (nebo připravovány pro podání) peritoneálně, orální cestou, intranasálně, subkutánně, intramuskulámě, lokálně nebo intravenózně, přičemž však mohou být podávány (nebo připravovány pro podání) jakoukoli farmaceuticky účinnou cestou (tj, schopnou zajistit udané terapeutické hladiny, jež jsou určeny výše).

Podle popisovaného provedení mohou být pacientovi terapeutické protilátky aplikovány podáním polynukleotídu, jež kóduje nejméně jeden řetězec protilátky. Ve shodě s tímto hlediskem vynálezu je v pacientovi polynukleotid exprimován s výsledkem představujícím vznik řetězce protilátky v účinném množství. Takovýto polynukleotid může kódovat těžký a lehký řetězec nebo řetězce protilátky, a tím umožnit jejich expresi v pacientovi.

Podle předložených provedení mohou výše popsané imunízační režimy zahrnovat vícenásobné podávání látek zahrnujících protilátky. Podání se takto mohou opakovat například během šestiměsíční periody s tím, že počáteční imunizace je v časových intervalech (např. 6 týdnů) následována posilovacími injekcemi, což je v oboru dobře známá metoda, přičemž časové intervaly se mohou upravit podle pacientovy potřeby (kritériem je dosažená imunologická odpověď). Alternativní nebo i doplňkovou cestou mohou být režimy zahrnující použití prostředků s postupným uvolňováním účinné látky. Což je v oboru známá metoda.

Tyto a ostatní předměty a znaky vynálezu se stanou více zřejmými, jestliže bude čten i detailní popis vynálezu ve spojení s doprovodnými výkresy.

-7CZ 302971 B6

A. Definice

Pokud není známo jinak, mají být všechny zde použité termíny chápány tak, jak by jim rozuměl odborník kvalifikovaný v oboru předkládaného vynálezu. Odborníci jsou pro definice, termíny a standardní metody v oborech biochemie a molekulární biologie odkazováni hlavně na Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. a Ausubel, F.M., et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Je zřejmé, že tento vynález není omezen konkrétní io metodologií, protokoly a popisovanými reagenciemi, jelikož tyto mohou být pro dosažení stejného výsledku různě měněny.

Termín ..adjuvant“ popisuje látku, která pri podání ve spojení s antigenem zvyšuje imunitní odpověď vůči antigenu, je-li však podána samotná tak žádnou imunitní odpověď vůěi antigenu nevytváří. Adjuvanty mohou zesilovat imunitní odpověď způsoby mezi něž patří posílení tvorby leukocytů, stimulace B nebo T-buněk (nebo obou zároveň) a stimulace makrofágů.

„Amyloidní nemocí“ nebo „amyloidózou“ je míněno množství poruch, které jako symptom nebo jako část své patologie mají hromadění nebo tvorbu amyloidních plaků.

„Amyloidní plak“je extracelulámí usazenina složená hlavně z proteinových vláken. Obecně jsou vlákna tvořena jedním převládajícím proteinem nebo peptidem. Plaky však mohou být složeny i z dalších peptidových nebo nepeptidových složek, což je zde popsáno.

„Amyloidní složkou“ je jakákoli molekula, která je přítomna v amyloidním plaku obsahujícím anti gen ní část takovéto molekuly. Amyloidní složky zahrnují mimo jiné proteiny, peptidy, proteoglykany a uhlovodíky. „Specifickou amyloidní složkou“ je míněna molekula, jež se zejména nebo pouze v určitém amyloidním plaku.

„Činidlo“ je chemická molekula syntetického nebo biologického původu. V kontextu předkládaného vynálezu je činidlo hlavně molekula, která může být použita ve farmaceutickém prostředku.

„Protiamyloidní činidlo“ je činidlo, které je u obratlovců v případě podání technikami pasivní nebo aktivní imunizace schopno vytvářet imunitní odpověď proti složce amyloidní ho plaku.

Termínem „polynukleotid“ a „nukleová kyselina“, jež jsou zde střídavě používány, je míněna polymerická molekula s páteří nesoucí báze schopné vázat se vodíkovými vazbami specificky s jinými póly nukleotidy, přičemž polymerická páteř předkládá báze způsobem umožňujícím takovéto sekvenčně specifické vodíkové vázání mezi polymerickou molekulou a komplementár40 ním polynukleotidem (např. jednoretězcovou DNA). Tyto báze jsou typicky inosin, adenosin, guanosin, cytosin, uracyl a thymidin. Polymerické molekuly zahrnují dvou nebo jednovláknové RNA a DNA a jejich modifikace, například ty s methy Ifosfonátovými vazbami.

Termín „polypeptid“ je zde používán pro látku tvořenou jedním řetězcem aminokyselinových zbytků, spojených peptidovou vazbou. Termín „protein“ může být synonymem pro termín „polypeptid“ nebo může popisovat komplex dvou či více polypeptidů.

Termín „peptid“ popisuje také látku složenou z aminokyselinových zbytků spojených peptidickou vazbou. Obecně jsou peptidy složeny ze 100 ěi méně aminokyselin, zatímco polypeptidy nebo proteiny obsahují více než 100 aminokyselin. Zde používaný termín „proteinový fragment“ může být čten se stejným významem jako peptid.

„Vláknitý protein“ či „vláknitý peptid“ je monomemí nebo agregovaná forma proteinu nebo peptidu, jež tvoří vlákna vyskytující se v amyloidních plácích. Příklady takovýchto proteinů a pepti55 dů jsou zde uvedeny.

-8CZ 302971 B6 „Farmaceutický prostředek“ popisuje chemický nebo biologický prostředek vhodný pro podání do savčího organismu. Takovéto prostředky mohou být specificky připraveny pro podání jednou nebo více cestami, zahrnujícími mimo jiných i cestu orální, parenterální, intravenózní, intraarteriální, subkutánní, intranasální, sublingvální, intraspinální, intracerebroventrikulámí apod.

„Farmaceutická pomocná látka“ nebo „farmaceuticky přijatelná pomocná látka“ je nosič, obvykle kapalina, ve které je podáváno terapeuticky aktivní činidlo. Pomocná látka obecně nedodává prostředku žádnou farmako logickou aktivitu, jakkoli však může zajišťovat chemickou nebo biologickou stabilitu (nebo chemickou i biologickou stabilitu zároveň) a ovlivňovat uvolňování aktivní složky apod. Ukázkové prostředky mohou být nalezeny například v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 19^th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995.

„Glykoprotein“ je protein, na který je kovalentně navázán nejméně jeden uhlovodíkový řetězec (oligopolysacharid).

„Proteoglykan“ je glykoprotein, ve kterém je nejméně jeden z uhlovodíkových řetězců glykosaminoglykan, což je dlouhý lineární polymer složený z opakujících se disacharidů, v němž jedním členem páruje obvykle „cukrokyselina“ (kyselina uronová) a druhým je aminocukr.

Termíny „imunologická“ nebo „imunitní“ nebo „imunogenní“ odpověď se týkají vzniku humorální (zprostředkované protilátkami) nebo buněčné dopovědi (zprostředkované antigenně specifickými T-buňkami nebo produkty jejich sekrece), nebo obou typů odpovědi zároveň, zaměřené proti antigenu v organismu jednotlivého obratlovce. Takováto odpověď může být aktivní odpovědí indukovanou podáním imunogenu nebo pasivní odpovědí indukovanou podáním protilátky nebo primárních T-buněk. Buněčná imunitní odpověď je vyvolána předkládáním polypeptidových epitopů ve spojení s MHC komplexem třídy I a II za účelem aktivace antigenně specifických CD4 T pomocných buněk nebo CD8 cytotoxických T-buněk (nebo obou typů zároveň). Tato odpověď může zahrnovat také aktivaci monocytů, makrofágů, NK buněk, bazofilů, dendritických buněk, astrocytů, mikroglie, cosinofilů nebo dalších složek přirozené imunity. Přítomnost buněčné zprostředkované imunologické odpovědi může být určeno standardní analýzou proliferace (CD4 T-buňky) nebo v oboru známými CTL analýzami (cytotoxické T lymfocyty). Relativní příspěvky humorální a buněčné odpovědi k ochrannému nebo léčebnému účinku imunogenu mohou být odlišeny pomocí oddělené izolace frakcí imunoglobulinu (IgG) a T-buněk z imunizovaného syngenního zvířete a měřením ochranného a léčebného účinku u druhého jedince.

„Imunogenní činidlo“ nebo „imunogen“ nebo „antigen“ je molekula, která je po podání pacientovi schopna indukovat imunologickou odpověď proti sobě samé, a to buď ve spojení, nebo i bez přítomnosti adjuvantu. Takovéto molekuly zahrnují například amyloidní vláknité peptidy nebo jejich fragmenty konjugované s nosným proteinem, jímž může být hemocyanin zDiodora aspera, Cd3 nebo toxin tetanu.

„Epitop“ nebo „antigenní determinanta“ je část antigenu, která se váže k antigen vázající části protilátky.

Termíny ,,Αβ“, ,,Αβ peptid“ a „Amyloidní β“ peptid jsou synonymní a popisují jednu nebo více peptidových směsí složených z 38 až 43 aminokyselin odvozených od Beta amyloidního prekurzorového proteinu (β-ΑΡΡ). ,,Αβχχ“ popisuje amyloidní β peptid 1-xx, přičemž xx značí počet aminokyselin v peptidu; např., Αβ42 je shodný s Αβ1^2, který je zde popisován také jako „ANI 792“ a Αβ4(^ε shodný s ΑβΙ^ΙΟ, který je zde popisován také jako „ANI 578“

Disagregovaný nebo monomemí Αβ značí rozpustné, monomemí peptidové z Αβ. Jednou z metod přípravy monomemích Αβ je rozpuštění lyofilizovaného peptidu v čistém DMSO pomocí sonikace. Výsledný roztok je za účelem odstranění všech nerozpustných částic centrifugo ván.

-9CZ 302971 B6

Agregovaný Αβ je směs oligomerů, ve kterých drzí monomemí jednotky pohromadě nekovalentními vazbami.

Termín „nahý polynukleotid'⁴ značí polynukleotid bez obsahu koloidních látek. Nahé polynukleotidy jsou někdy klonovány v plazmidovém vektoru.

Termín „pacient“ zahrnuje lidský nebo savčí subjekt, který prodělává profylaktický nebo léčebný zásah.

Termíny „významně odlišný od“, „statisticky významný“, „významně vyšší (nebo nižší) než“, a jim podobná slovní spojení popisují porovnání různých dat, přičemž rozdíly mezi dvěma porovnávanými jednotlivci nebo skupinami jsou školenému pozorovateli zjevně nebo dostatečně zřejmé, nebo také statisticky významné (jestliže spojení zahrnuje termín „statisticky“, nebo když je přítomen nějaký údaj ze statistického testu, jako třeba p-hodnota, nebo když jsou data po analýze standardními statistickými testy statisticky rozdílná).

Prostředky nebo metody obsahující jednu nebo více z uvedených složek mohou obsahovat i jiné složky, jež nejsou zvlášť uvedeny. Například prostředek, který zahrnuje vláknitou peptidovou složku, zahrnuje jak peptid samotný, tak i jako součást delší polypeptidové sekvence. Zjednodušeně to lze vyjádřit tak, že prostředek obsahující složku A a B, zahrnuje také složení vymezené složkami A, B a C.

B. Amyloidní onemocnění

1. Přehled a patogeneze

Amyloidní onemocnění nebo amyloidózy zahrnují množství stavů s širokým spektrem vnějších příznaků. Společným znakem těchto poruch je přítomnost abnormálních extracelulámích usazenin, tvořených proteinovými vlákny a známými jako „amyloidní usazeniny“ nebo „amyloidní plaky“, jež jsou velké v okolo 10 až 100 pm v průměru a jsou lokalizovány v určitých orgánech nebo částech tkáně. Takové plaky jsou složeny hlavně z přirozeně se vyskytujících rozpustných peptidů nebo proteinů. Tyto plaky (jež jsou nerozpustné) jsou většinou složeny z laterálních agregátů vláken, jejichž velikost je přibližně 10 až 15 nm v průměru. Amyloidní vlákna tvoří po obarvení barvou Congo Red v polarizovaném světle charakteristický, jablečně zelený dvoj lom. Tyto poruchy jsou tříděny podle majoritní vláknité složky, jež tvoří amyloidní usazeniny, což je rozebráno dále.

Peptidy nebo proteiny tvořící amyloidní plaky vznikají často z prekurzorového proteinu. Lze tak říci, že patogeneze usazenin tvořených amyloidními vlákny obecně zahrnuje proteolytické štěpení „abnormálního“ prekurzorového proteinu na jednotlivé fragmenty. Tyto fragmenty se zpravidla seskupují do anti paralelních β-skládaných listů; nicméně u některých nedegradovaných forem prekurzorového proteinu bylo zjištěno shlukování a tvorba vláken (různá vlákna transthyretinu u familiální polyneuropatie a vlákna p2-mikroglobulinu u amyloidózy spojené s dialýzou; Tan, et al., 1994, viz výše).

2. Klinické syndromy

V této části jsou popsány hlavni formy amyloidóz s popisem charakteristických vláknitých složek vyskytujících se v amyloidním plaku. Hlavním objevem předkládaného vynálezu je zjištění, že amyloidní onemocnění mohou být léčena podáváním činidel, která stimulují imunitní odpověď zacílenou proti specifické složce nebo složkám (podle konkrétní amyloidní poruchy) různých amyloidních plaků. Takovéto složky jsou nejlépe součásti vláken, jež tvoří plaky, což je podrobněji diskutováno v oddílu C. Následující oddíl slouží k příkladnému znázornění hlavních forem amyloidóz, přičemž jeho cílem není nijak vymezovat či limitovat možnosti vynálezu.

- 10CZ 302971 B6

a. AA (reaktivní) amyloidóza

A A amyloidóza je většinou projevem množství nemocí, které způsobují trvalou akutní fázi. Takovéto nemoci zahrnují chronické záněty, chronické lokální nebo systemické mikrobiální infekce a zhoubné nádory.

AA vlákna jsou většinou složena z fragmentů o velikosti 8000 daltonů (AAS peptid nebo protein) vytvořených proteolytickým štěpením sériového amyloidního A proteinu (ApoSSA), což je cirkulující apolípoprotein, jenž se vyskytuje v HDL částicích, a který je syntetizován v hepatocytech io následně po jejich stimulaci cytokiny (např. IL-1, 1L-6 a TNF). Amyloidní plaky mohou být rozšířené po celém těle, přednostně však v orgánech s parenchymatickou stavbou. Místem s častým výskytem plaků je slezina, přičemž postiženy mohou být i ledviny, Plaky se běžně vyskytují i v srdci a gastrointestinálním traktu.

A A amyloidní onemocnění zahrnují mimo jiné zánětlivá onemocnění, jako jsou třeba revmatoidní artritida, juvenilní chronická artritida, ankylózní spondylitida, psoriáza, psoriatická arthropatie, Reiterův syndrom, Stillova choroba, Bechtěrevova nemoc a Crohnova nemoc. AA usazeniny vznikají také jako výsledek chronických mikrobiálních infekcí, jakojsou třeba lepra, tuberkulóza, bronchiektazie, dekubitální vředy, chronická pyelonefritida, osteomyelitida a Whipplova nemoc.

Určité zhoubné nádory mohou být také příčinou vzniku AA vláknitých usazenin. Mezi tyto patří Hodgkinův lymfom, renální karcinom, karcinomy střeva, plic a urogenitálního traktu, karcinom bazálních buněk a leukémie vlasatých buněk.

b. AL amyloidózy

AL amyloidní usazeniny jsou spojeny se skoro každou dyskrazií B lymfocytámí linie, sahající od zhoubného bujení plazmatických buněk (mnohonásobný myelom) až k nezhoubné monoklonální gamapatii. Přítomnost amyloidních usazenin může být občas prvotním indikátorem probíhající dyskrazie.

Vlákna AL amyloidních usazenin jsou složena z lehkých řetězců monoklonálního imunoglobulinu nebo z jej ich fragmentů. Tyto fragmenty pocházejí zN-koncové části lehkého řetězce (kappa nebo lambda) a obsahují též celou nebo pouze část variabilní (Vi) domény. Usazeniny se objevují zejména v mesenchymatických tkáních, kde způsobují periferní a autonomní neuropatii, syndrom karpálního tunelu, makroglosii, restriktivní kardiomyopatie, arthropatii velkých kloubů, imunitní dyskrazií, myelomy, stejně tak jako skryté dyskrazie. Je však nutno poznamenat, že napadena může být v podstatě jakákoli tkáň, zvláště ale viscerální orgány (např. srdce).

c. Dědičné systemické amyloidózy

Vrozených systemických amyloidóz existuje mnoho druhů. Přestože se vyskytují relativně vzácně, nástup symptomů v dospělosti a jejich dědičné podmínění (obvykle jsou autosomálně dominantní) vede k přetrvávání těchto poruch v celkové populaci. Syndromy lze většinou přisoudit bodovým mutacím v prekurzorovém proteinu, jež vedou k tvorbě různých amyloidogenních peptidů nebo proteinů. Tabulka 2 shrnuje typické složení vláken druhů těchto poruch.

Údaje uvedené v tabulce 2 jsou pouze exemplární a není jimi zamýšleno nějak omezovat rozsah uplatnění vynálezu. V transthyretinu bylo například popsáno více než 40 odlišných bodových mutací, přičemž všechny vedou ke vzniku klinicky podobných forem familiální amyloidní poly50 neuropatie.

Transthyretin (TTR), který je často nazýván jako prealbumin, je protein o velikosti 14 kilodaltonů. Je vytvářen v játrech a v choroidním plexu a jeho funkcí je transport thyroidních hormonů a vitaminu A. Za různé formy familiální amyloidní polyneuropatie zodpovídá nejméně 50 různých forem proteinu, přičemž každá je charakteristická změnou jediné aminokyseliny. Například subi

- 11 CZ 302971 B6 stituce prolinu za leucin v pozici 55 vede k obzvláště progresivní formě neuropatie; substituce methioninu za leucin v pozici 111 vedlo u dánských pacientů k těžké neuropatii. Amyloidní usazeniny izolované ze srdeční tkáně pacientů se systémickou amyloidózou odhalilo, že usazeniny jsou složeny z heterogenní směsi TTR a jeho fragmentů, společně nazývané jako ATTR (jeho celá sekvence již byla určena). Vláknité složky ATTR mohou být z takovýchto plaků extrahovány a dále pak určena jejich struktura a sekvence, a to podle v oboru známých metod (např., Gustavsson, A. et al., Laboratory Invest. 73:703 až 708, 1995; Kametani, F., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 125:622 až 628, 1984; Praš, M., et ak, PNAS 80:539 až 42, 1983).

- 12CZ 302971 B6

>o <u

X3

4> Vi cú !

>en ž

3ž s &x>

*i3 +λ 3 S^:s n ω <U Q X) SO íi u ΧΛ

4= > w u O T3 &.£ ω o a s *3 ^K*-<

S i

N <U O O .22 ďO

S.S s *>

<4 ω O Ί3 č5s£>

Tabulka 2

Dědičné amyloidózy

Λ >w a 42 •S 1 * 2

S

O

I

C <0 ω

M

M00 (-1 <u o

vd o

\o

Ofl

CN		*1
CN		o
		Ι<ύ
u		CO

i—l
Τ’-Ή	VD	VO
	CN	CN	íw rt X5
υ 2		2

Γ~~

VO

Vi •wM n

O

CN in >

Λ

MΙΛ •3 o

J

o £ s <

| <3

I <s trt >» !<

ž <

- 13CZ 302971 B6

fragment Gelsolinu (Agel) Asnl87, Tyrl87 kraniální neuropatie s mřížko vitá komeální dystrofie

MU o

OO δ

o xí a ‘-3 £

3.S Šá m

O α

δ <υ -cj (X - Ο Γ- —I ξ £ á ϋ t_1 θ'

Γ— tí tn <

co. ο cx

Prionový Protein (PrP) odvozený Leu 102, Valí67, familiální Creutzfeldod PrP prekurzorového proteinu Asn 178, Lys200 Jakobova nemoc;

insert 51 až 91 Gerstmann-StrausslerScheinker syndrom

- 14CZ 302971 B6

u .</» st >

Tt

O

OS >-.

ft <U ft

JB > 3 g .S (Z) o &

£« fi o 8 «3

O Ja <

> OQ O 00 ft a

<u

Z

H

Ό

O cd (Λ

N

T-.

X) š

Q

Osoby s bodovou mutací v molekule apolipoproteinu Aí (např., Gly->Arg26; Trp->Arg50; Leu—>Arg60) vykazují formu amyloidózy („typ Óstertag“) charakteristickou usazeninami protei5 nu apolipoprotein AI nebo jeho fragmentů (ApapoAI). Tito pacienti mají nízké hladiny vysokodensitního lipoproteinu (HDL) a vykazují periferální neuropatii nebo selhání ledvin.

Mutace v alfa řetězci enzymu lysozymu (např., IIe->Thr56 nebo Asp-*His57) je základem jiné formy nonneuropatické dědičné amyloidózy typu Óstertag, jež se vyskytuje v anglických rodilo nách. V tomto případě jsou usazeniny tvořeny vlákny mutantního proteinu lysozymu (Alys) a pacienti vykazují většinou zhoršenou funkci ledvin. Tento protein je na rozdíl od většiny zde

- 15CZ 302971 B6 popisovaných proteinů tvořících vlákna přítomen v nedotčené (nefragmentované) formě (Benson, M.D., etal.CIBA Fdn. Symp. 199:104 až 131, 1996).

β-amyloidní peptid (Αβ) je 39 až 43 aminokyselinový peptid, jež vzniká proteolýzou velkého proteinu známého jako beta amyloidní prekurzorový protein (βΑΡΡ). Mutace v βΑΡΡ vedou ke vzniku familiálních forem Alzheimerovy nemoci, Downovu syndromu nebo senilní demence (nebo obou), jež jsou charakteristické mozkovými usazeninami, které jsou složeny z vláken Αβ a dalších složek popsaných detailněji níže. Známé mutace v APP, spojené s Alzheimerovou chorobou se objevují poblíž míst štěpení β nebo γ sekretázou nebo uvnitř Αβ. Například pozice io 717 je přilehlá místu štěpení APP γ-sekretázou, při němž vzniká Αβ a pozice 670/671 je v sousedství místa kde APP štěpí β-sekretáza. Mutace v jakémkoli z těchto zbytků může vést ke vzniku Alzheimerovy choroby, pravděpodobně díky zvětšení podílu aminokyselinové formy 42/43 v celkovém množství vznikajícího Αβ z APP. Struktury a sekvence různých forem Αβ peptidů jsou v oboru dobře známy. Takovéto peptidy mohou být syntetizovány pomocí v oboru známých metod (např., Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 885 až 890, 1984; Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122:1131 až 1135, 1984). Různé formy těchto peptidů jsou dokonce komerčně dostupné.

Synuklein je protein podobný apolipoproteinu a vyskytující se hojně v cytosolu neuronů a v pre20 synaptickém zakončení. Peptidové fragmenty pocházející z α-synukleinu a nazývané NAC jsou také složkami amyloidních plaků tvořících se při Alzheimerově chorobě (Clayton, et al„ 1998). Tato složka slouží také jako cíl při léčebných metodách založených na imunologických postupech a zahrnutých v předkládaném vynálezu, což je popsáno níže.

Gelsolin je vápník protein, který se váže na aktinová filamenta. Mutace tohoto proteinu v pozicích 187 (např., Asp—>Asn; Asp—>Tyr) vede ke vzniku formy dědičné systemické amyloidózy, obvykle se nacházející u pacientů ve Finsku, stejně tak jako u osob pocházejících z Holandska nebo Japonska. LI postižených jedinců, sestávají vlákna tvořená z fragmentů gelsolinu (Agel) obvykle z aminokyselin 173 až 243 (68 kDa fragment na karboxylovém konci) a jsou ukládána v krevních cévách a bazálních membránách, což dává vznik komeální dystrofii a kraniální neuropatii, která se rozvíjí v periferní neuropatii a vede k dystrofickým změnám kůže a ukládání usazenin v dalších orgánech (Kangas, H., et al. Human Mol. Genet. 5(9):1237 až 1243, 1996).

Jiné mutantní proteiny, jako třeba mutantní alfa řetězec fibrinogenu (AfibA) a mu tan tni cystatin

C (Acys) také tvoří vlákna a dávají vznik charakteristickým vrozeným poruchám. Vlákna AfibA tvoří usazeniny charakteristické pro nonneuropatické dědičné amyloidózy při poruchách ledvin; usazeniny vláken Acys jsou charakteristické pro vrozenou cerebrální amyloidní angiopatíí hlášenou na Islandu (Isselbacher, et al., Harrisonů Principles of Intemal Medícine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, et al, viz výše). Minimálně u jistého množství pacientů s cerebrální amyloidní angiopatíí (CAA) bylo prokázáno, že amyloidní vlákna obsahují nemutovanou formu cystatinu C ve spojení s beta proteinem (Nagai, A., et al., Molec. Chem. Neuropathol. 33:63 až 78, 1998).

Určité formy prionových onemocnění (až 15 % případů) se nyní považují za dědičné, i když dříve se myslelo, že jsou především infekčního původu (Baldwin, et al., in Research Advances in Alzheimer Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). V případě takovýchto prionových poruch se u pacientů vytváří plaky tvořené abnormálními isoformami normálního prionového proteinu (PrP^c). Převládající mutantní isoforma (PrP^), nazývá také jako AScr se liší od normálního buněčného proteinu svou resistencí proti degradaci proteázami, nerozpustností po extrakci pomocí detergentu, ukládáním v sekundárních lysozymech, posttranslační úpravou a vysokým obsahem konformace β-skládaného listu. Genetická příčina byla prokázána nejméně u pěti mutací vedoucích ke vzniku Creutzfeldt-Jacobsovy choroby (CJD), Gerstmann—Stráussler—Scheinker syndrom (GSS) a fatální familiální insomnie (FFI) (Baldwin).

- 16CZ 302971 Β6

Metody pro extrakci vláknitých peptidů z vláken scrapie, určení sekvencí a syntéza takových peptidů jsou v oboru známy (např., Beekes, M., et ak, J. Gen. Virol. 76:256 až 76, 1995).

Například jedna z forem GSS byla spojena s mutací PrP v kodonu 102, zatímco telencefalická GSS byla segregována s mutací v kodonu 117. Mutace v kodonech 198 a 217 vedou ke vzniku formy GSS, u které neuritické plaky, charakteristické pro Alzheimerovu chorobu obsahují PrP namísto peptidu Αβ. U určitých forem familiální CJD byla prokázána souvislost s mutacemi v kodonech 200 a 210; mutace v kodonech 129 a 178 byly nalezeny jak u familiální CJD, tak i u familiální FF1 (Baldwin, viz výše).

d. Senilní systemické amyloidózy

Množství systemických i lokálních amyloidních usazenin se s věkem zvyšuje. Například vlákna divokého typu transthyretinu (TTR) je možno běžně nalézt v srdeční tkáni starších jedinců, což může být asymptomatické, klinicky „tiché“ nebo skončit s výsledkem srdečního selhání. Asymptomatické vláknité lokální usazeniny se mohou objevit také v mozku (Αβ), v corpora amylacea prostaty (Αβ₂ mikroglobulin), v kloubech a v semenných váčcích.

e. Mozečkové amyloidózy

Lokální usazeniny amyloidu jsou běžné v mozku, zvláště u starších jedinců. Nejčastější typ amylotdu nacházejícího se v mozku, jenž složen hlavně z vláken peptidu Αβ, vede kdemenci nebo sporadické (nedědičné) Alzheimerově chorobě. Ve skutečnosti však výskyt sporadických forem Alzheimerovy choroby daleko převyšuje formy dědičné. Vláknité peptidy tvořící tyto plaky jsou velmi podobné těm, jenž byly popsány v souvislosti s Alzheimerovou chorobou (AD) výše.

f. Amyloidózy spojené s dialýzou

U pacientů dlouhodobě se podrobujících hemodíalýze nebo peritoneální dialýze je možno běžně nalézt plaky složené z vláken β₂ mikroglobulinu (Αβ₂Μ). β₂ mikroglobulin je polypeptid o velikosti ll,8kDa aje lehkým řetězcem antigenů MHC komplexu třídy 1, přítomným na každé buňce s jádrem. Za normálních okolností je z buněčných membrán plynule uvolňován a filtrován ledvinami. Při poruše očišťovací schopnosti ledvin, jako například v případě zhoršené funkce ledvin dochází v ledvinách a na jiných místech (zejména v na kolagen bohatých kloubních tkáních) kjeho ukládání. Na rozdíl od jiných vláknitých proteinů jsou molekuly Αβ₂Μ ve vláknech většinou přítomny v nefragmentované formě (Benson, viz výše).

g. Amyloidózy odvozené od hormonů

Endokrinní orgány mohou být sídlem amyloidních usazenin, zvláště u starších jedinců. Hormony vylučující tkáně zasažené tumory mohou obsahovat amyloidní plaky odvozené od hormonů také. Tyto plaky jsou tvořeny vlákny polypeptidových hormonů jakými jsou třeba kalcitonin (medulámí karcinom štítné žlázy), IAPP (amylín; ostrůvkový amyloidní polypeptidový protein; objevující se u většiny pacientů s diabetem typu II) a atriální natriuretický peptid (izolovaná atriální amyloidóza). Sekvence a struktury těchto proteinů jsou v oboru dobře známé.

h. Nezařazené amyloidózy

Existuje množství dalších forem amyloidní choroby, které se za normálních okolností projevují lokalizovanými usazeninami amyloidu. Obecně platí, že tyto nemoci jsou pravděpodobně výsledkem lokalizované tvorby a/nebo chybějícím katabolismem určitých vláknitých prekurzorů nebo sklonem určité tkáně (jako třeba kloub) k ukládání usazenin. Mezi příklady takovýchto idiopatic- 17CZ 302971 B6 kých usazenin lze zahrnout nodulámí AL amyloidy, kožní amyloid, endokrinní amyloid a amyloid spojený s tumory.

C. Farmaceutické prostředky

Objevem předkládaného vynálezu je zjištění, že prostředky schopné vyvolat nebo vybavit imunitní odpověď zaměřenou proti určitým složkám amyloidních plaků jsou účinné při léčbě amyloidních onemocnění nebo při prevenci jejich vzniku. Podle zde poskytovaného vynálezu jde především o možné zabránění postupu choroby, zlepšení jejích příznaků a/nebo snížení amyloidní zátěže u postižených jedinců, to vše za předpokladu podání imunostimulační dávky antiamyloidního činidla nebo odpovídající protiamyloidní imunitní složky pacientovi. Tato část popisuje ukázková protiamyloidní činidla, jež vyvolávají aktivní nebo pasivní imunitní odpovědi proti amyloidním plakům a poskytují ukázkové údaje znázorňující účinek vlivu těchto prostředků na amyloidní zátěž.

Protiamyloidní činidla tohoto vynálezu sestávají obecně ze specifické plakové složky, přičemž nejlépe složky tvořící vlákna. Takováto složka je obvykle charakteristický protein, peptid nebo jejich fragmenty, což bylo popsáno v předchozím oddílu a bude doloženo příklady níže. Léčebná činidla uváděná v předkládaném vynálezu vyvolávají nebo ovlivňují imunitní odpověď vůči plaku nebo spíše proti jeho vláknité složce. Takováto činidla tudíž mimo jiné zahrnují tyto složky samy, jejich varianty, analogy a mimetika těchto složek, jež indukují protilátky proti této vlastní složce a/nebo s nimi křížově reagují. Takováto činidla zahrnují dále i vlastní protilátky nebo T-buňky, které specificky reagují s amyloidní složkou. Důležitým znakem je to, že farmaceutické prostředky neobsahují nespecifické složky, tj. složky, které v těle cirkulují a nebojsou v něm všudypřítomné. Příkladem může být sérový amyloidní protein (SAP), což cirkulující plazmatický glykoprotein, který vzniká v játrech a váže se na většinu známých forem amyloidních usazenin. Léčebné prostředky jsou přednostně zaměřeny na tuto složku.

Vyvolání imunitní odpovědi může být aktivní, jako v případě podání imunogenu pacientovi, což následně indukuje T-buňky reagující s danou složkou nebo pasivní, jako v případě podání samotné protilátky, jež se specificky váže na amyloidní složku přítomnou v těle pacienta. Zakázková činidla vyvolávající imunitní odpověď proti amyloidním plakům jsou popsána v následujících oddílech.

Farmaceutické prostředky předkládaného vynálezu mohou kromě imunogenního činidla nebo činidel zahrnovat v účinném množství také adjuvant a/nebo pomocnou látku. Farmaceuticky účinné a užitečné adjuvanty a pomocné látky jsou v oboru dobře známy a jsou detailněji popsány v následujících oddílech.

1. Imunostimulační činidla (Aktivní imunitní odpověď) a. Prostředky proti vláknům

Jedna z hlavních tříd předkládaných protiamyloidních činidel obsahuje činidla odvozená od vláknitých amyloidních proteinů. Jak již bylo zmíněno výše, znakem amyloidních onemocnění je ukládání amyloidních plaků (tvořených hlavně z vláken, přičemž tato vlákna jsou sestavena hlavně z charakteristických vláknitých proteinů nebo peptidů) v orgánech. Podle předkládaného vynálezu je takováto vláknitá proteinová nebo peptidová složka účinným činidlem při vyvolání protiamyloidní imunitní odpovědi.

Tabulky 1 a 2 shrnují typické vlákna tvořící proteiny, jež jsou pro různá amyloidní onemocnění charakteristické. Ve shodě s tímto hlediskem předkládaného vynálezu má podání imunostimulačního prostředku, obsahujícího patřičné vláknité proteiny a zahrnujícího jejich homology nebo fragmenty postiženým jedincům, léčebné nebo profylaktické účinky.

- 18CZ 302971 B6

Příkladem je Αβ, známý také jako β-amyloidní peptid nebo peptid A4 (viz patent US 4 666 829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 113, 1131, 1984), jenž se skládá z 37 až 43 aminokyselin, a který je hlavní složkou charakteristickou pro plaky u Alzheimerovy choroby. Αβ je tvořen z většího proteinu APP pomocí dvou enzymů, zvaných β a γ sekretázy (viz s Hardy, TINS 20, 154, 1997).

Příklad 1 popisuje výsledky experimentu provedeného pro podepření předkládaného vynálezu, a ve kterém byl peptid Αβ42 podán heterozygotním transgenním myším, jež exprimovaly v nadbytečném množství lidský APP s mutací v pozici 717. Tyto myši, známé jako „PDAPP myši“ ío vykazují patologii shodnou s Alzheimerovou chorobou a jsou používány jako zvířecí model pro studium Alzheimerovy choroby (Games, et al., Nátuře 373:523 až 7, 1995). V tomto příkladu je popsáno, že tyto myši ve svém mozku vykazují zjistitelnou neuropatologií plaku Αβ už od šestého měsíce života, přičemž ukládání plaku s věkem roste. Ve zde popisovaných experimentech byl myším podáván agregovaný Αβ42 (ΑΝ 1792). Většina z léčených myší (7 z 9) neměla na rozdíl od kontrolních myší, jež nebyly nijak ošetřeny nebojím byl aplikován pouze solný roztok, a u nichž bylo zjištěno významné množství amyloidní zátěže, ve 13. měsíci života v mozku žádné zjistitelné amyloidní plaky (obr. 2). Tyto rozdíly byly ještě více patrné v hipokampu (obr. 3). Léčené myši vykazovaly také významné titry sérových protilátek proti Αβ (všechny větší než 1:1000, 8 z 9 větší než 1:10 000; obr. 1, tabulka 3A). Myší, jimž byl aplikován pouze solný roztok vykazovaly při ředění séra 1:100 obecně víc než 4 až 5krát menší hladiny protilátek proti Αβ, a to v jakémkoli sledovaném čase a nevykazovaly tedy oproti kontrole žádnou významnou odpověď (tabulka 3B). Tyto studie ukazují, že injekce specifického vláknitého peptidu (Αβ) vede k ochraně proti ukládání Αβ amyloidních plaků.

Sérový amyloidní protein (SAP) je cirkulující plazmatický glykoprotein, jenž je tvořen v játrech a váže se na všechny typy amyloidních vláken (vazba závisí na přítomnosti vápníku). Mezi tato vlákna patří i vlákna cerebrálních amyloidních plaků u Alzheimerovy choroby. Částí uskutečněných experimentů byla injekce SAP skupině myší, přičemž u těchto myší došlo k vytvoření významných sérových titrů proti SAP (1:1000 až 1:30 000), ale nedošlo kvytvoření zjistitelných sérových titrů proti peptidu Αβ a došlo k vzniku neuropatologie cerebrálního plaku (obr, 2).

Další experimenty (viz příklad 2) ukázaly, že imunogenní účinek injekcí Αβ u myší léčených mezi 5 týdnem a asi 8 měsícem života je závislý na dávce, U těchto myší došlo s rostoucím počtem imunizací a se zvyšující se dávkou i k zvýšení sérového titru proti Αβ. Po čtyřech imuniza35 cích se sérové titry (v dávkách od 1 do 300 pg) měřené vždy pět dní po imunizaci ustálily na hladinách okolo 1:10 000 (obr. 5).

Dodatečné experimenty pro podpoření předkládaného vynálezu jsou popsány v příkladu 3.

V tomto příkladu byl PDAPP myším v určitém časovém bodu (okolo 11 měsíce věku, což je doba, ve které jsou již zjistitelné amyloidní plaky vjejich mozku) zahájeno podávání Αβ42,

V těchto studiích byla zvířata imunizována Αβ42 nebo solným roztokem, přičemž pro zjištění jejich amyloidní zátěže byla usmrcena ve věku 15 nebo 18 měsíců. Z obrázku 7 je vidět, že 18 měsíců staré myši vykazovaly významně nižší průměry amyloidní zátěže (plaková zátěž, 0,01 %) než 18 měsíců stará kontrolní zvířata, jimž bylo aplikováno PBS (solný roztok pufrovaný fosfátem) (plaková zátěž, 4,7 %), i než 12 měsíců stará neléčena zvířata (0,28 %), u nichž byla amyloidní zátěž měřena obrazovou analýzou (podrobněji viz příklad 3, část 8). Tyto experimenty ukazují účinnost léčebných metod předkládaného vynálezu, definovanou snížením existující ptákové zátěže a zabránění vzrůstu plakové zátěže u nemocných jedinců.

Podle tohoto hlediska vynálezu, jsou léčebná činidla odvozená z vláknitých peptidu nebo proteinů, které tvoří plaky charakteristické pro danou chorobu. Těmito Činidly mohou být i látky složkám plaků antigenně obdobné do takové míry, aby byly schopny vyvolat imunitní odpověď, která také křížově reaguje s vláknitými složkami plaků. Tabulky 1 a 2 poskytují příklady takovýchto vláknitých peptidu a proteinů, přičemž jejich složení a sekvence jsou v oboru známy a mohou být

- 19CZ 302971 Bó známými metodami jednoduše určeny (viz odkazy citované níže a v Sekci B2 pro reference, které popisují speciálně metody extrakce a/nebo tvorby různých vláknitých složek; další příklady vláknitých složek jsou popsány níže.

Takto bude, ve shodě s předkládaným vynálezem, v případě určení diagnózy amyloidního onemocnění (klinicky a/nebo biopsií) zkušený praktik schopen zjistit složení vláken amyloidní usazeniny a poskytnout činidlo, které vyvolá imunitní odpověď zaměřenou proti vláknitým peptidům nebo proteinům.

io Jak již bylo popsáno výše, tak léčebným činidlem užívaným v případě léčby Alzheimerovy choroby nebo jiných amyloidních onemocnění, charakteristických ukládáním vláken Αβ mohou být přirozeně se vyskytující formy peptidů Αβ, obzvláště však lidské formy (tj. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43). Sekvence těchto peptidů ajejich příbuznost sprekurzorem APP jsou v oboru známy resp. v oboru dobře známa (např., Hardy et al., TINS 20, 155 až 158, 1997).

Například Αβ42 má sekvenci: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-ValHis-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-MetValCIy-Gly-Val-Val-Ile-Ala—OH. (SEQ IDNo.l).

Αβ41, Αβ40 a Αβ39 se od Αβ42 liší nepřítomností Ala-Ala-Ile a Ala-Ile-Val na C-koncové části peptidů. Αβ43 se od Αβ42 liší přítomností threon i nového zbytku na C-konci. Podle předloženého provedení vynálezu budou léčebná činidla vyvolávat imunitní odpověď proti části nebo celé vláknité složce dané nemoci. Například předložená imunogenní látka proti Αβ je činidlo, které indukuje protilátku specifickou vůči volnému N-konci Αβ. Takováto látka má tu výhodu, že nerozeznává prekurzorový protein β-ΑΡΡ a snižuje tedy pravděpodobnost vzniku autoimunit25 ní reakce.

U dalšího příkladu týkajícího se pacientů postižených nemocemi charakteristickým ukládáním vláken A A (např. chronické záněty, chronické lokální nebo systemické mikrobiální infekce a zhoubné nádory) lze ocenit, že pacienti mohou být léčeni AA peptidem, což je známý, 8 kDa velký fragment sérového amyloidního A proteinu (ApoSSA). Mezi typické AA amyloidní poruchy patří mimo jiné zánětlivá onemocnění jako třeba revmatoidní artritida, ju ven i lni chronická artritida, ankylózní spondylitida, psoriáza, psoriatická arthropatie, Reiterův syndrom, Stillova choroba, Bechtěrevova nemoc, Crohnova nemoc, chronické mikrobiální infekce jako jsou třeba lepra, tuberkulóza, bronchiektazie, dekubitální vředy, chronická pyelonefritida, osteomyelitida a

Whippleova nemoc a stejně tak i zhoubné nádory mezi něž patří Hodgkinův lymfom, renální karcinom, karcinomy střeva, plic a urogenitálního traktu, karcinom bazálních buněk a leukémie vlasatých buněk.

AA peptid patří do heterogenní skupiny peptidů vznikajících z N-koncové části sérového amy40 loidního A proteinu (ApoSSA), počínajíce zbytkem prekurzorového proteinu 1, 2 nebo 3 a končíce kdekoli mezi zbytky 58 a 84; vlákna AA jsou obyčejně složena ze zbytků 1 až 76. Přesné struktury a složení mohou být určeny, přičemž následná syntéza příslušných peptidů je možná díky v oboru dobře známým metodám (Liepnieks, J. J., et al. Biochem. Biophys. Acta 1270:81 až 86, 1995).

Fragmenty vzniklé z N-koncové části lehkého řetězce (kappa nebo lambda řetězec) imunoglobulinu a obsahující jeho variabilní (V,) doménu nebo její část, většinou tvoří amyloidní usazeniny v mesenchy matických tkáních, kde způsobují periferní a autonomní neuropatii, syndrom karpálního tunelu, makroglosii, restriktivní kardiomyopatie, arthropatii velkých kloubů, imunitní dyskra50 zii, myelomy, stejně tak jako skryté dyskrazie. Prostředky vynálezu budou přednostně vyvolávat imunitní odpověď pouze proti části lehkého řetězce, přednostně proti „neoepitopu“ (epitop, který vzniká jako výsledek rozpadu mateřské molekuly), aby bylo omezeno případné autoimunitní působení.

-20CZ 302971 B6

Léčebným metodám předkládaného vynálezu jsou přístupná i různá vrozená amyloidní onemocnění. Takovéto choroby jsou popsány výše, v části B.2. Například různé typy familiální amyloidní polyneuropatie jsou důsledkem existence více než 50 forem (každá je způsobena změnou jediné aminokyseliny) transthyretinu (TTR), 14kDa velkého proteinu tvořeného vjátrech. Mnoho typů této nemoci je rozlišitelný na základě své specifické patologie a/nebo demografického rozšíření, přičemž lze ocenit, že léčebné prostředky mohou být složeny také z činidel vyvolávajících imunitní odpověď proti více než jedné formě TTR. Takovým prostředkem může být směs dvou ěi více forem ATTR, jež obsahuje divoký TTR, aje tak široce využitelným léčebným prostředkem.

Amyloidní plaky obsahující AapoAI se nalézají u osob s bodovou mutací v molekule apolipoproteinu AL Pacienti s tímto typem onemocnění většinou vykazují periferální neuropatii nebo selhání ledvin. Podle předkládaného vynálezu obsahují léčebné prostředky jednu nebo více různých forem AapoAI, popsaných zde a v oboru známých.

Určité familiální formy Alzheimerovy choroby jsou stejně tak jako Downův syndrom výsledkem mutací v beta amyloidním prekurzorovém proteinu, což vede k ukládání plaků složených hlavně z β-amyloidního peptidu (Αβ). Užití peptidu Αβ v léčebných prostředcích předkládaného vynálezu je popsáno výše a na příkladech vysvětleno dále.

Určité postupy léčení vrozených forem amyloidóz, diskutované výše, zahrnují prostředky vyvolávající imunitní odpovědi proti fragmentům gelsolinu (léčba dědičné systemické amyloidózy), mutantnímu proteinu lysozymu (Alys) (léčba dědičné neuropatie), mutantnímu alfa řetězci fibrinogenu (AfibA) (léčba nonneuropatické formy amyloidózy projevující se jako onemocnění ledvin), mutantnímu cystatinu C (Acys) léčba dědičné cerebrální angiopatie vyskytující se na Islandu). Výskytem mutantní isoformy prionového proteinu (PrP^&) jsou charakterizovány určité dědičné typy prionových onemocnění, mezi něž patří např. Creutzfeldt-Jacobsova choroba (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrom (GSS) a fatální familiální insomnie (FFI). Tento protein může být ve shodě s předkládaným vynálezem použit v prostředcích pro léčbu nebo prevenci ukládání plaků PrP.

Jak již bylo diskutováno výše, tvorba amyloidních usazenin (jak systemická tak ohnisková) souvisí se stárnutím. Této tvorbě může být podle dalšího hlediska předkládaného vynálezu předejito nebo zamezeno aplikací prostředků složených z jednoho či více proteinů spojených se stárnutím. Takže plaky složené z ATTR odvozeného od divokého typu TTR je možno často nalézt v srdeční tkáni starších lidí. U určitých starších jedinců se zas mohou v mozku vyvinout ohniskové asymptomatické vláknité usazeniny peptidu Αβ. U těchto jedinců je pak léčba peptidem Αβ, jak bylo již popsáno výše, nutná. β2 mikroglobulin je častou složkou corporata amylacea prostaty, aje tak podle předkládaného vynálezu dalším kandidátem (léčebným činidlem).

Kromě jiných existuje množství dalších typů amyloidních onemocnění, které nejsou dědičné, a které jsou vhodnými kandidáty pro léčbu metodami v předkládaném vynálezu. U pacientů dlouhodobě se podrobujících hemodíalýze nebo peritoneální dialýze je možno běžně nalézt plaky složené z vláken β₂ mikroglobulinu. Tito pacienti mohou být ve shodě s předkládaným vynálezem léčení pomocí prostředků zaměřených proti β₂ mikroglobulinu nebo ještě lépe, jeho imunogenních epitopů.

Hormony vylučující tkáně zasažené tumory mohou obsahovat amyloidní plaky odvozené od hormonů také, přičemž jejich složení je charakteristickým znakem příslušného zasaženého endokrinního orgánu. Tyto plaky jsou tvořeny vlákny polypeptidových hormonů jakými jsou třeba kalcitonin (medulámí karcinom štítné žlázy), IAPP (amylin; ostrůvkový amyloidní polypeptidový protein; objevující se u většiny pacientů s diabetem typu II) a atriální natriuretický peptid (izolovaná atriální amyloidóza). Prostředky zaměřené na amyloidní usazeniny tvořící se v int i mě aorty při atheroskleróze jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty také. Westermark et al. popisuje například 69 aminokyselinový fragment N-koncové části apolipoproteinu A, který tvoří tyto

-21 CZ 302971 Β6 plaky (Westermark et al., Am. J. Path. 147:1186 až 92, 1995); terapeutické prostředky předkládaného vynálezu zahrnují imunologická činidla zaměřená na tento fragment, stejně tak jako fragment samotný.

Předcházející diskuze byla zaměřena na vláknité amyloidní složky, které mohou být použity jako činidla při léčbě nebo prevenci různých typů amyloidních onemocnění. Léčebným činidlem může být také fragment nebo analog přirozeně se vyskytujícího nebo mutantního vláknitého proteinu nebo peptidu, jenž obsahuje epitop, který po podání jedinci vyvolává obdobnou ochrannou nebo léčebnou imunitní odpověď. Imunogenní fragmenty obsahují typicky sekvenci o nejméně 3, 5, 6, 10 nebo 20 aminokyselinách, jež jsou i v přirozeně se vyskytujícím peptidu. Mezi příkladné imunogenní fragmenty peptidu Αβ patří Αβί až 5, 1 až 6, 1 až 7, 1 až 10, 3 až 7, 1 až 3, l až 4, 1 až 12, 13 až 28, 17 až 28, 1 až 28, 25 až 35, 35 až 40 a 35 až 42. V nějakých metodách jsou používány fragmenty, jimž chybí nejméně jedna a někdy nejméně 5 nebo 10 C-koncových aminokyselin, přítomných v přirozeně se vyskytujících formách této vláknité složky. Například fragment postrádající 5 C-koncových aminokyselin z Αβ43 obsahuje prvních 38 aminokyselin zNkoncové části Αβ. Fragmenty z N-koncové poloviny Αβ jsou v některých metodách používány přednostně. Analogy zahrnují alelické, druhové a indukované varianty. Analogy se od přirozeně se vyskytujících peptidu liší v jedné nebo více aminokyselinových pozicích, často však jde o záměnu konzervativní. Analogy vykazují nejméně 80 až 90% sekvenční shodu s přirozeným peptidem. Některé analogy obsahují též nepřirozené aminokyseliny nebo modifikace N nebo C koncových aminokyselin. Příklady nepřirozených aminokyselin jsou α-, α-d i substituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mléčná, 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, γ-Ν,Ν,Ν-trimethyllyzin, γ-N-acetylIyzin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3methylhistidin, 5-hydroxylyzin, ω-N-methylarginin.

Osoba zkušená v oboru ocení, že fragmenty a analogy vytvořené ve shodě s tímto hlediskem vynálezu mohou být testovány na to, zda křížově reagují s přirozeně se vyskytující vláknitou složkou a/nebo na to, jaká je jejich profylaktická či léčebná účinnost u transgenních zvířat (viz níže). Tyto fragmenty nebo analoga mohou být použity v léčebných prostředcích předkládaného vynálezu, ale za předpokladu, že jejich imunoreaktivita a účinnost v tomto zvířecím modelu je zhruba stejná nebo větší než v případě složek amyloidních vláken.

Takovéto peptidy, proteiny nebo fragmenty, analogy a další amyloidogenní peptidy mohou být připraveny pomocí syntézy peptidu na pevné fázi nebo rekombinantní expresí, což jsou v oboru dobře známé metody, nebo mohou být získány z přírodních zdrojů. Ukázková složení vláken, metody extrakce vláken a sekvence vláknitých peptidů nebo proteinů jsou uvedeny v publikacích, jež jsou citovány ve spojení s popisem konkrétní vláknité složky. Složení dalších látek, metody jejich extrakce a určení jejich sekvence jsou v oboru dobře známé. Pro tvorbu těchto látek mohou být použity automatické přístroje pro syntézu peptidů, jež jsou komerčně dostupné u mnoha výrobců, jako například Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, Califomia), přičemž postupy pri přípravě syntetických peptidů jsou v oboru dobře známy. Pro rekombinantní expresi mohou být využity bakterie (např. £. coli), kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky; proteiny mohou být eventuálně vytvořeny použitím in vitro translace, což je v oboru známá metoda. Postupy rekombinantní exprese jsou popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2 ed., 1989). Určité peptidy a proteiny jsou dostupné také komerčně; například některé formy peptidu Αβ je možné získat třeba od American Peptides Company, lne., Sunnyvale, Califomia nebo Califomia Peptide Research, lne., Napa, Califomia.

Léčebná činidla mohou být složena také z delších polypeptidů, jako například z aktivního fragmentu vláknitého peptidu nebo jeho analoga, spojeného dohromady s dalšími aminokyselinami. Například peptid Αβ může být přítomen jako intaktní APP protein nebo jeho část (např. fragment C-100, který začíná na N-konci Αβ a pokračuje do konce APP). Tyto polypeptidy mohou být testovány na to, jaká je jejich profylaktická či léčebná účinnost u transgenních zvířat (viz níže). Αβ peptid, jeho analog, účinný fragment nebo jiný polypeptid mohou být podávány v asociované

-22CZ 302971 B6 formě (tj. jako amyloidní peptidy) nebo v disociované formě. Léčebná činidla mohou zahrnovat také multimery z monomemích imunogenních činidel nebo konjugáty nosných proteinů a/nebo mohou být za účelem získání širšího pole protiamyloidního působení přidány s jinou vláknitou složkou.

Další obměnou může být předkládání imunogenního peptidu (např. fragment Αβ) virem nebo baktérií jako části imunogenního prostředku. Nukleová kyselina kódující imunogenní peptid je vložena do genomu nebo epizómu viru ěi baktérie. Další možností je zabudování nukleové kyseliny takovým způsobem, že imunogenní peptid je exprimován jako sekretovaný protein nebo jako fúzní protein s proteinem na vnějším povrchu viru nebo s transmembránovým proteinem v baktérii, a to tak, aby peptid byl vystaven. Viry nebo baktérie použité v těchto metodách by měly být nepatogenní nebo oslabené. Vhodné viry zahrnují adenovirus, HSV, virus venezuelské koňské encefalitidy a další alfa viry, virus vesikulámí stomatitidy a další rhabdoviry, virus vakcinie a drůbeží poxviry. Vhodné baktérie zahrnují salmonelu a shigelu. Fúze imunogenního peptidu s HBsAg z HBV je zvláště vhodná. Léčebná činidla zahrnují také peptidy a další látky, které nutně nemusí mít v sekvenci aminokyselin s Αβ významnou shodu, nicméně však slouží jako mimetika Αβ a vyvolávají obdobnou imunitní odpověď. Vyzkoušeny mohou být třeba jakékoli peptidy a proteiny tvořící β-skládaný list. Anti-idiotypické protilátky proti monoklonálním protilátkám specifickým pro Αβ nebo jiným amyloidogenním peptidům mohou být použity také.

Tyto anti-Id protilátky napodobují antigen a vyvolávají proti němu imunitní odpověď (viz Essentíal Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), p. 181). Činidla odlišná od peptidů Αβ by měla vyvolat imunogenní odpověď proti jednomu či více upřednostňovaných částí Αβ (viz výše; 1 až 10, 1 až 7, 1 až 3 a 3 až 7). Tato činidla vyvolávají imunogenní odpověď zaměřenou přednostně proti jedné z těchto částí, aniž by vyvolaly odpověď proti jiné části Αβ.

Zkoušeny mohou být i peptidy a jiné látky z náhodných knihoven (Random Libraries). Pro mnoho typů látek, jež lze sestavit po jednotlivých krocích, mohou být vytvořeny kombinační knihovny (Combinatoral libraries). Mezi tyto látky patří polypeptidy, β-skládaná mimetika, polysacharidy, fosfolipidy, hormony, prostaglandiny, steroidy, aromatické látky, heterocyklické sloučeniny, benzodiazepiny, oligomemí N-substituované glyciny a oligokarbamáty. Velké kombinační knihovny mohou být sestaveny podle kódovaných umělých knihoven (encoded synthetic libraries ESL) metodou popsanou v Affymax, WO 95/12608, Afíymax WO 93/06 121, Columbia University, WO 94/08 051, Pharmacopeia, WO 95/35503 a Scripps, WO 95/30 642 (každý z nich je zahrnut podle odkazu pro všechny účely). Peptidové knihovny mohou být sestaveny s použitím metod fágového vystavování (viz např. Devlin, WO 91/18 980).

V kombinačních knihovnách a u dalších látek je zpočátku zjišťována jejich použitelnost měřením stupně schopnosti vázat na protilátky nebo na lymfocyty (B nebo T), jež jsou specifické pro Αβ nebo jiné amyloidogenní peptidy jako třeba ATTR. Například zahajovací testy tak mohou být vykonány sjakoukoli polyklonální nebo monoklonální protilátkou proti Αβ nebo kterémukoli dalšímu amylotdogennímu peptidu, jež nás zajímá. Látky identifikované těmito testy jsou pak dále analyzovány pro schopnost stimulovat protilátky nebo lymfocyty specifické pro Αβ nebo jiný amyloidogenní peptid. Mnohonásobná ředění séra mohou být například testována na mikrotitračních destičkách, které byly předem pokryty vláknitým peptidem, přičemž poté mohou následovat standardní ELISA testy pro zjištění protilátek specifických pro Αβ. U látek pak může být testována jejich profy taktická či léčebná účinnost u transgenních zvířat, predisponovaných pro amyloidogenní onemocnění, což je popsáno v příkladech. Tato zvířata zahrnují například myši s APP mutovaném v pozici 717 (Games et al., viz výše) a myši se Švédskou mutací 670/671 v APP (McConlogue et al,, US 5 612 486 a Hsiao et al., Science 274, 99, 1996; Staufenbiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 13287 až 13292, 1997; Sturchler-Pierrat et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 13287 až 13292, 1997; Borchlet et al, Neuron 19, 939 až 945, 1997). Stejný

-23CZ 302971 B6 studijní přístup může být použit na další potenciální činidla, mezi něž patří fragmenty Αβ, analoga Αβ a delší peptidy zahrnující Αβ (viz výše).

b. Další složky plaku

Imunologické odpovědi zaměřené proti jiným složkám amyloidního plaku mohou být také účinné v prevenci, zpomalení vývoje nebo zmenšení plakové usazeniny při amyloidním onemocnění. Tyto složky mohou být menšinovými částmi vláken, mohou být spojeny s těmito vlákny nebo s tvorbou těchto vláken tvořících plaky. Omezením je fakt, že složky, které jsou v těle všudyio přítomné nebojsou amyloidní usazeniny relativně nespecifické, nepředstavují pro léčebná činidla nejvhodnější terč.

Dalším objevem předkládaného vynálezu je tak zjištění, že činidla vyvolávající imunitní odpověď vůči specifickým složkám plaku jsou účinná při léčbě či zastavení postupu amyloidního onemocnění. Tato kapitola poskytuje základní informace o několika typických molekulách, které jsou spojeny s amyloidními plakem. Léčba vyvolávající imunitní odpověď proti jedné z těchto molekul nebo kombinovaná léčba zahrnující společnou aplikaci s imunogenním léčebným prostředkem proti jakékoli výše popsané vláknité složce, či proti jakékoli níže popsané nevláknité složce plaku, poskytuje podle předkládaného vynálezu doplňkovou protiamyloidní léčbu. Částí předkládaného vynálezu jsou i metody pasivní imunizace založené na těchto plakových složkách, což je zde popsáno.

Příkladem může být synuklein, což je protein strukturálně podobný apolipoproteinům, ale nacházející se vcytosolu neuronů, zvláště v oblasti presynaptického zakončení. Existují nejméně tři formy tohoto proteinu, nazvané α, β a γ synuklein. Nedávno bylo prokázáno, že a a β synuklein se u určitých amyloidních onemocnění účastní nukleace amyloidních usazenin, zvláště v případě Alzheímerovy choroby (Clayton, D.F., et al., TlNS2l(6): 249 až 255, 1998). Fragment NAC domény a a β synukleinu (zbytky 61 až 95) byl totiž izolován z amyloidních plaků u pacientů s AD; tento fragment tvořil ve skutečnosti 10% nerozpustné formy plaku, což bylo zjištěno po rozpuštění plaku v SDS (dodecyslulfát sodný) (George, J.M., et al., Neurosci. News 1:12 až 17, 1995). Jak a synuklein, tak i jeho NAC fragment jsou známy tím, že in vitro urychlují agregaci (3-amylotdního peptidu do nerozpustného amyloidu (Clayton, viz výše).

Další složky spojené s amyloidními plaky zahrnují nepeptidové látky. Například perlecan a od něj odvozené glykosaminoglykany jsou velké proteoglykany odvozené od heparinsulfátu, jež se vyskytují v amyloidních plácích obsahujících Αβ (např. při Alzheimerově chorobě a jiných amyloidózáeh vyskytujících se v CNS či systemicky, tj. např. plaky s amylinem spojené s diabetes). U těchto látek bylo prokázáno, že napomáhají tvorbě Αβ vláken. Vazby na Αβ se účastní jak proteiny jádra, tak i glykosaminoglykanové řetězce perlecanu. Další glykosaminoglykany, kon40 krétně dermatan sulfát, chondroitin-4-sulfát nebo pentosan se běžně vyskytují v amyloidních plácích různých typů a bylo prokázáno, že také pomáhají při tvorbě vláken. Působení dextransulfátu je stejné. Toto působení je významně sníženo po desulfataci těchto molekul. Imunogenní léky zaměřené proti sulfatovaným formám gly kosám inoglykanů, mezi něž patří i některé glykosaminoglykany, tvoří jako součást primární nebo sekundární léčby doplňkové pro45 vedení předkládaného vynálezu. Vytvoření takovýchto molekul, a stejně tak i léčebných prostředků obsahujících tyto molekuly, je schopen běžný praktik z oboru.

2. Činidla vyvolávající pasivní imunitní odpověď

Léčebná činidla tohoto vynálezu zahrnují také imunitní látky (např. protilátky), které se specificky váží na vláknité peptidy nebo jiné složky amyloidního plaku. Tyto protilátky mohou být polyklonální i monoklonální, přičemž se váží specificky podle typu amyloidní nemoci. Léčebné prostředky a léčebné režimy mohou zahrnovat protilátky zaměřené najedou vazebnou doménu

-24CZ 302971 B6 nebo epitop určité vláknité nebo nevláknité složky plaku, přičemž mohou zahrnovat i protilátky zaměřené na epitopy, jež se nalézají na více složkách plaku.

V pokusech uskutečňovaných pro podporu předkládaného vynálezu byly PDAPP myším starým

8,5 až 10,5 měsíce aplikovány intraperitoneálně (i.p.) injekce polyklonální protilátky proti Αβ42 nebo injekce mononuklealní protilátky proti Αβ, specificky zaměřené vůči epitopům Αβ peptidu nebo solný roztok (viz příklad 11). V těchto pokusech byly sledovány koncentrace cirkulujících protilátek, přičemž pro udržení koncentrace vyšší než 1:1000 (poměr mezi antigenem a proti němu specifické protilátky) byly aplikovány posilovači injekce. Snížení hladiny celkového Αβ io bylo v porovnání s kontrolou pozorováno v hipokampu, kůre a v mozečku myší léčených protilátkou; maximální snížení bylo v těchto pokusech pozorováno u myší léčených polyklonální protilátkou.

V dalších pokusech uskutečněných pro podporu předkládaného vynálezu (prediktivní ex vivo analýza) byla testována očišťovací schopnost protilátky proti fragmentu synukleinu, známému jakoNAC. Synukleinje protein spojený s amyloidním plakem. Protilátka proti NAC byla aplikována na vzorek mozkové tkáně, jenž obsahoval amyloidní plaky a mikrogliální buňky. Jako kontrola bylo použito králičí sérum. Následující prozkoumání ukázalo jasné snížení množství a rozměru plaků a prokázalo tak očišťovací schopnost této protilátky.

Z těchto výsledků je zřejmé, že amyloidní plaky spojené s AD a dalšími amyloidnímí chorobami mohou být silně potlačeny aplikací imunitních činidel zaměřených proti epitopům v peptidu Αβ nebo proti fragmentu synukleinu NAC. Dále je jasné, že jako součást léčebných prostředků je použitelná široká škála protilátek. Protilátky, jež se specificky váží na agregované formy Αβ tak, aniž by se vázaly na jeho disociované formy jsou pro použití v tomto vynálezu vhodné, stejně tak jako protilátky, které se specificky váží na disociovanou formu Αβ, aniž by se vázaly na jeho agregovanou formu. Další vhodné protilátky jsou ty, které se váží na obě jeho formy. Některé z těchto protilátek se váží na přirozeně se vyskytující krátkou formu Αβ (tj. Αβ39, 40, 41), bez toho, aby se vázaly na přirozeně se vyskytující dlouhou formu Αβ (tj. Αβ42 a Αβ43). Některé protilátky se váží na dlouhou formu, aniž by se vázaly na krátkou formu. Některé protilátky se váží na Αβ, aniž by se vázaly na amyloidní prekurzorový protein plné délky. Některé protilátky se váží na Αβ s vazebnou afinitou větší nebo rovnou 10⁶, 10⁷, 10^s, 10⁹ nebo 10¹⁰ M^_l.

Polyklonální séra obsahují obyčejně smíšené populace protilátek vážících se na více epitopů po celém Αβ. Monoklonální protilátky se váží na specifický epitop v Αβ, přičemž tento epitop může být konformační nebo nekonformační. Některé monoklonální protilátky se váží na epitop mezi zbytky 1 až 28 v Αβ (zbytek 1 značí první N-koncový zbytek přirozeného Αβ). Jiné monoklonální protilátky se váží na epitop ze zbytků l až 10 v Αβ. Existují také monoklonální protilátky, jež se váží na epitop ze zbytků 1 až 16 v Αβ. Některé monoklonální protilátky se váží na epitop z aminokyselin 1 až 5,5 až 10, 10 až 15, 15 až 20, 25 až 30, 10 až 20, 20, 30 nebo 10 až 25. U protilátek pak může být testována jejich profylaktická Či léčebná účinnost za použití transgenních zvířat, což je popsáno v příkladech.

Podle zde poskytnutých návodů si praktik může navrhnout, vytvořit a vyzkoušet protilátky zamě45 rené na vláknité proteiny nebo peptidy charakteristické pro další amyloidní onemocnění, mezí něž patří nemoci popsané v oddílu 2, přičemž může využít látky popsané zde, stejně tak jako i protilátky proti jiným amyloidním složkám.

a. Obecná charakteristika imunoglobulinů

Základní stavební jednotkou protilátky je tetramer ze čtyř podjednotek. Každý tetramer je složen ze dvou stejných párů polypeptidových řetězců, přičemž každý pár tvoří jeden „lehký“ (okolo 25 kDa) a jeden „těžký“ (okolo 50 až 70 kDa) řetězec. Část na aminovém konci každého řetězce obsahuje variabilní oblast složenou ze 100 až 110 nebo více aminokyselin, které primárně zodpo-25CZ 302971 B6 vídají za rozpoznání antigenů. Část na karboxy lovem konci každého řetězce vymezuje konstantní oblast, která primárně zodpovídá za celkové působení.

Lehké řetězce jsou označovány jako kappa nebo lambda. Těžké řetězce jsou označeny jako gama, mí, alfa, delta, nebo epsilon a vymezují izotyp protilátky (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE). Variabilní a konstantní oblasti lehkých a těžkých řetězců jsou spojeny „J“ oblastí složenou z asi 12 nebo více aminokyselin, s tím, že těžký řetězec obsahuje také „D“ oblast, složenou z asi 10 či více aminokyselin (obecně viz Fundamentall Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (zahrnuto podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely).

Variabilní oblasti každého z obou párů tvořených lehkým a těžkým řetězcem formují vazebné místo protilátky, což znamená, že funkční protilátka má dvě vazebná místa. Tato dvě vazebná místa jsou stejná (s výjimkou bifunkčních nebo bi specifických protilátek). Všechny řetězce vykazují stejnou základní stavbu relativně konzervovaných strukturních oblastí (FR), spojených třemi hypervariabilními oblastmi, které se nazývají také oblasti určující komplementaritu (CDRs). CDRs ze dvou řetězců každého páru jsou seřazeny podle strukturních oblastí, jež umožňuji vazbu na specifický epitop. Lehké i těžké řetězce sestávají od N-konce k C-konci domén FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Sled aminokyselin v každé doméně je popsán v Kabat, Sequence of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 a 1991) nebo v Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 až 917 (1987); Chothia et al., Nátuře 342:878 až 883 (1989).

b. Tvorba protilátek nepocházejících z člověka

Tvorba protilátek nepocházejících z člověka, např. myších, morčecích, králičích nebo krysích může být zajištěna například imunizací zvířete složkou plaku, třeba Αβ nebo jiné vláknité složky. Delší polypeptidy obsahující Αβ nebo imunogenní fragment Αβ nebo anti-idiotypické protilátky (protilátky proti protilátce proti Αβ) Αβ mohou být také použity (viz např. Harlow & Lané, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHPNY, 1988) (zahrnuto podle odkazu pro všechny účely). Takový imunogen může být získán z přirozeného zdroje, syntézou peptidu nebo rekombinantní expresí. Někdy může být imunogen podáván s adjuvantem. Některé typy těchto adjuvantů jsou popsány níže. Aplikace kompletního Freundova adjuvantu následovaná aplikací nekompletního Freundova adjuvantu je při imunizaci laboratorních zvířat oblíbenou cestou. Pro tvorbu polyklonálních protilátek se nejčastěji používají králíci nebo morčata. Pro přípravu monoklonálních protilátek se nejčastěji používají myši. Protilátky jsou testovány zda se specificky váží na imunogen. Protilátky jsou také testovány zda se váží na specifickou oblast imunogenu. Například, je-li imunogenem Αβ, může být testování provedeno určením vazby protilátky na řadu mutantů Αβ s delecí, z čehož se pak určí, které mutanty se váží na protilátku. Vazba může být vyhodnocena například pomocí Westernový analýzy (Western blott) nebo pomocí ELISA. Nejmenší fragment, který vykazuje specifickou vazbu s protilátkou vymezuje epitop protilátky. Specifita epitopu může být také určena kom petiční analýzou, ve které zkoumaná a referenční protilátka soutěží o vazbu s určitou složkou. Jestliže zkoumaná a referenční protilátka o vazbu soutěží, pak je zřejmé, že se váží na stejný epitop nebo na epitopy dostatečně blízké na to, aby vazba jedné protilátky narušila vazbu druhé.

c. Chimémí a humanizované protilátky

Chimémí a humanizované protilátky mají stejnou nebo podobnou specífitu a afinitu jako protilátky myší nebo další protilátky nepocházející z člověka, které poskytují materiál pro konstrukci Chimérních a humanizovaných protilátek. Chimémí protilátky jsou protilátky, u nichž byly geny kódující lehký a těžký řetězec uměle vytvořeny, nejčastěji metodami genetického inženýrství, zčásti imunoglobulinových genů patřících jiným druhům. Například variabilní (V) části genů kódujících myší monoklonální protilátku mohou být spojeny s lidskými konstantními (C) částmi (např. IgGl a IgG4). Typická Chimémí protilátka je tak hybridním proteinem obsahujícím V,

-26CZ 302971 B6 neboli doménu vážící antigen, z myší protilátky a C, neboli efektorovou doménu, z lidské protilátky.

Humanizované protilátky mají strukturu variabilní oblasti v zásadě z lidské protilátky (akceptorová protilátka) a u oblasti určující komplementaritu z myší protilátky (donorový imunoglobulín) (viz Queen et af, Proč. Nati Acad. Sci. USA, 86:10 029 až 10 033 (1989) a WO 90/07 861, US 5 693 762, US 5 693 761, US 5 585 089, US 5 530 101 a Winter, US 5 225 539 (zahrnuto podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely). Konstantní oblast nebo oblasti pokud jsou přítomny, pocházejí od hlavně nebo zcela lidského imunoglobulinu. Lidské variabilní domény jsou vybírány z lidských protilátek, jejichž základní struktura vykazuje vysoký stupeň shody v sekvenci s doménami myší variabilní oblasti, ze které pocházejí CDRs. Sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce mohou být odvozeny ze sekvencí stejné nebo odlišné lidské protilátky. Sekvence lidské protilátky mohou být sekvencemi přirozeně se vyskytujících lidských protilátek nebo mohou být konsensem sekvencí více lidských protilátek (viz Carter et al., WO 92/22 653). Určité aminokyseliny z lidské variabilní oblasti jsou nahrazeny, což pramení z jejich možného vlivu na konformaci CDR a/nebo na vazbu antigenu. Zkoumání těchto možných vlivů je uskutečňováno modelováním, zkoumáním vlastností aminokyselin v určitém místě nebo empirickým pozorováním účinků náhrady nebo mutageneze určité aminokyseliny.

Když se kupříkladu jedna aminokyselina ve variabilní oblasti myší a lidské protilátky liší, lidská aminokyselina by měla být vyměněna za ekvivalentní aminokyselinu z myší protilátky v případech, kdy je důvod očekávat, že aminokyselina:

(t) váže přímo nekovalentně antigen (2) nachází se nedaleko CDR oblasti (3) jiným způsobem interaguje s CDR oblastí (vyskytuje se ve vzdálenosti okolo 6 A od CDR oblasti) nebo (4) se podílí na vzájemném vztahu VL-VH

Dalšími kandidáty pro nahrazení jsou akceptorové aminokyseliny, které jsou v této pozici pro lidský imunoglobulín neobvyklé. Tyto aminokyseliny mohou být nahrazeny aminokyselinami zodpovídající pozice myší donorové protilátky nebo aminokyselinami zodpovídající pozice typičtější lidské protilátky. Struktura variabilní oblasti humanizovaných imunoglobulinů vykazuje obvykle 85% sekvenční shodu se sekvencí lidské variabilní oblasti nebo konsensem takovýchto sekvencí.

d. Lidské protilátky

Lidské protilátky proti Αβ jsou získávány různými technikami (viz níže). Některé lidské protilátky jsou vybírány v pokusech s kompetiční vazbou nebo využitím stejné epitopové spec ifity jako určitá myší protilátka (viz příklad 11). Lidské protilátky mohou být také pro určitou epitopovou specifítu testovány použitím fragmentu Αβ jako imunogenu a/nebo určením vazby protilátky na řadu mutantů Αβ s delecí.

(1) Metodika triomu

Základní postup a příkladný partner pro zde používanou buněčnou fúzi (SPAZ-4) je popsán v Oestberg et al., Hybridoma, 2:361 až 367 (1983); Oestberg patent US 4 634 664; a v Engleman et al., patent US 4 634 666 (každý z nich je zahrnut podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely). Buněčné linie tvořící protilátky, jež lze získat touto metodou se nazývají triomy, pocházejí totiž ze tří buněčných typů - dvou lidských a jednoho myšího. Základem je fúze buněk myšího myelomu s lidským B-Iymfocytem, čímž vzniká protilátky netvořící xenogenní hybridní buněčná linie (např. SPAZ-4 popsaná Oestberg et al., viz výše). Xenogenní buňka je pak fúzována s imunizovaným lidským B-lymfocytem, čímž vzniká protilátky tvořící triomová buněčná

-27 CZ 302971 B6 linie. Bylo zjištěno, že triomy tvoří protilátky stabilněji než obyčejné hybridomy připravené z lidských buněk.

Imunizované B-lymfocyty se získávají z krve, sleziny, lymfatických uzlin a kostní dřeně lidského dárce. Jestliže jsou potřeba protilátky proti specifickým antigenům nebo epitopu, pak je vhodné užít tento antigen nebo jeho epitop pro imunizaci. Imunizace může probíhat buď in vivo, nebo in vitro. Pro in vivo imunizaci se nejčastěji používají B-buňky izolované z lidí imunizovaných Αβ, jeho fragmentem, větším polypeptidem obsahujícím Αβ nebo jeho fragment, nebo antiidiotypickými protilátkami proti Αβ. V některých metodách se používají B-buňky izolované ze stejného pacienta, jenž má být léčen podáváním protilátek. Pro in vivo imunizaci jsou B—lymfocyty vystaveny po 7 až 14 dní antigenů, v médiu (např. RPMI-1640) doplněném 10% lidskou plazmou (Engleman, viz výše).

Imunizované B-lymfocyty jsou pomocí známých metod fúzovány s xenogenní hybridní buňkou (např. SPAZ-4). Buňky jsou vystaveny působení 40 až 50% polyethylenglykolu (m.v. 1000 až 4000), při 37 °C po 5 až 10 min. Buňky jsou odděleny od fúzní směsi a rozmnoženy v médiu vhodném pro dané hybridy (např. HAT nebo AH). Klony, jež vylučují protilátky s požadovanou spec i fí tou jsou určeny analýzou kultivačního média triomů. Triomy tvořící protilátky s požadovanou spécifítou jsou dále namnoženy technikou limitního ředění a pěstovány v in vitro kultuře. U získaných triomových buněk je dále testována schopnost vázat Αβ nebo jeho fragment.

Přestože jsou triomy geneticky stabilní, nevytvářejí protilátky ve velkém množství. Úroveň exprese může být zvýšena zaklonováním genu protilátky ztriomu do jednoho či více expresních vektorů a transformováním vektoru do standardních savčích, bakteriálních nebo kvasinkových buněčných linií, pomocí metod v oboru dobře známých.

(2) Transgenní savci

Lidské protilátky proti Αβ mohou být tvořeny i v transgenních savcích, kteří mají zabudovánu v genomu nejméně Část lokusu lidského imunoglobulinu. Endogenní imunoglobulínový lokus takového zvířete je obvykle funkčně inaktivován. Část lidského lokusu zahrnuje nejlépe neuspořádané sekvence kódující části lehkého a těžkého řetězce. Inaktivace endogenního genu pro imunoglobulin a zavedení exogenního imunoglobulinového genu může být provedeno cílenou homologní rekombinaci nebo zavedením YAC chromozomů. Takto vzniklí transgenní savci jsou schopni funkčně uspořádat sekvence imunoglobulinových složek a exprimovat řadu protilátek různých izotypů, které jsou kódovány lidskými imunoglobulinovými geny, aniž by probíhala exprese endogenních imunoglobulinových genů. Příprava a charakteristika savců s těmito vlastnostmi jsou detailně popsány například v Longberg et al., WO 93/12 227 (1993); US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318, US 5 789 650, US 5 770 429, US 5 661 016, US 5 663 425, US 5 625 126, US 5 569 825, US 5 545 806, Nátuře 148:1547 až 1553 (1994), Nátuře Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10 741 (1991) (každý žních je zahrnut podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely). Transgenní myši jsou pro tyto účely zvláště vhodné. Protilátky proti Αβ jsou získávány imunizací transgenních savců (Longberg nebo Kucherlapati, viz výše) Αβ nebo jeho fragmentem. Monoklonální protilátky jsou připravovány například fúzí B-buněk z těchto savců s vhodnou myeiomovou buněčnou linií, a to za použití běžné techniky (Kohler-Milstein). Lidské polyklonální protilátky mohou být ve formě sér získány také z lidí imunizovaných imunogenním činidlem. Tyto polyklonální protilátky mohou byl koncentrovány pomocí afínitního přečištění za použití Αβ nebo jiného imunogenního amyloidního peptidu coby afínitního činidla.

(3) Metody fágového vystavování

Dalším způsobem získání lidských protilátek proti Αβ je prohledávání DNA knihovny z lidských B-buněk metodami obecně vymezenými v Huse et al., Science 246:1275 až 1281 (1989).

-28CZ 302971 B6

B-buňky mohou být stejně jako v případě triomů získány z lidí imunizovaných Αβ, jeho fragmentem, větším polypeptidem obsahujícím Αβ nebo jeho fragment, nebo anti-idiotypickými protilátkami proti Αβ. V některých metodách se používají B-buňky izolované ze stejného pacienta, jenž má být léčen podáváním protilátek. Vybrány jsou protilátky, jež se váží na epitop sledované amyloidní složky (např. Αβ nebo jeho fragment). Sekvence kódující tyto protilátky, nebo protilátky vážící jeho fragment, jsou pak klonovány a namnoženy. Protokol popsaný Husem se stává efektivnějším v kombinací s technologií fágového vystavování (viz např., Dower et al., WO 91/17 271 a McCafferty et al., WO 92/01 047, US 5 877 218, US 5 871 907, US 5 858 657, US 5 837 242, US 5 733 743 a US 5 565 332 (každý z nich je zahrnut podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely). Tyto metody popisují tvorbu fágových knihoven, kde členové vystavují na svém povrchu různé protilátky. Protilátky jsou obvykle vystavovány jako fragmenty Fv nebo Fab. Protilátky požadované specifity vystavované fágy jsou získány afínitním přečištěním, za použití Αβ nebo jiného imunogenního amyloidního peptidu coby afinitního činidla.

Obměnou metody fágového vystavování mohou být získány lidské protilátky vykazující stejnou vazebnou specifitu jako má vybraná myší protilátka (viz Winter, WO 92/20 791). Jako výchozí materiál je v tomto případě využita variabilní oblast lehkého nebo těžkého řetězce vybrané myší protilátky. Jestliže je jako výchozí materiál zvolena například variabilní oblast lehkého řetězce, pak je fágová knihovna konstruována tak, aby její členové vystavovali stejnou variabilní oblast lehkého řetězce a odlišnou variabilní oblast těžkého řetězce. Variabilní oblasti těžkého řetězce jsou získány z knihovny obsahující uspořádané variabilní oblasti lidského těžkého řetězce. Vybrán je fág, který vykazuje silnou specifickou vazbu ke sledované složce (např., nejméně 10⁸ a nejlépe 10⁹M“'). Variabilní oblasti lidského těžkého řetězce tohoto fágu slouží jako výchozí materiál pro konstrukci další fágové knihovny. V této knihovně vystavuje každý fág stejnou variabilní oblast těžkého řetězce (tj. oblast identifikovanou v první fágové knihovně) a odlišnou variabilní oblast lehkého řetězce. Variabilní oblasti lehkého řetězce jsou získány z knihovny obsahující uspořádané variabilní oblasti lidského lehkého řetězce. Opět je vybrán fág vykazující silnou specifickou vazbu se zvolenou složkou amyloidního peptidu. Tito fágové vystavují variabilní oblasti lidských protilátek specifických pro amyloidní peptid. Tyto protilátky mají obvykle stejnou epitopovou specifitu jako myší protilátky, jež byly použity jako výchozí materiál.

e. Výběr konstantní oblasti variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce Chimémích humanizovaných nebo lidských protilátek mohou být připojeny alespoň k Části lidské konstantní oblasti. Výběr konstantní oblasti záleží částečně na tom, zdaje žádána aktivace komplementu nebo buněčně zprostředkované toxicity (nebo obou zároveň), jež závisí na aktivaci protilátkou. Například izotypy IgGl a lgG3 komplement aktivují, izotypy IgG2 a IgG4 tuto schopnost nemají. Výběr izotypu může často ovlivnit přechod protilátky do mozku. Konstantní oblasti lehkého řetězce mohou být lambda nebo kappa. Protilátky mohou být exprimovány jako tetramery obsahující dva lehké a dva těžké řetězce, jako samotné těžké řetězce, jako samotné lehké řetězce, n jako Fab, Fab⁴, F(ab’)2 a Fv nebo jako jednořetězcové protilátky, ve kterých jsou variabilní domény lehkého a těžkého řetězce spojeny „mezemíkem⁴⁴ (spacer).

f. Exprese rekombinantníeh protilátek

Chimérické, humanizované a lidské protilátky jsou nejčastěji vytvářeny za použití rekombinantní exprese. Rekombinantní póly nukleotidové konstrukty typicky obsahují sekvenci řídící expresi, spojenou se sekvencí kódující řetězce protilátky, jež zahrnují přirozeně spojené nebo heterologní promotorové oblasti. Sekvence řídící expresi jsou nejlépe eukaryotní promotorové systémy, které jsou ve vektorech schopné transformovat nebo transfekovat eukaryotickou buňku. Jakmile je vektor zabudován do příslušného hostitele, je hostitel udržován v podmínkách optimálních pro vysokou úroveň exprese nukleopeptidových sekvencí, a pro odběr a čištění křížově reagujících protilátek.

-29CZ 302971 B6

Tyto expresní vektory se nejčastěji v hostitelském organismu replikují jako epizómy nebo jako Íntegrální(integrovaná) část hostitelské chromozomální DNA. Expresní vektory běžně obsahují selekční značky, např. odolnost vůči ampicilinu nebo hygromycinu, které dovolují identifikaci těch buněk, jež byly transformovány požadovanými sekvencemi DNA.

E. coli je prokaryotický hostitel, který je ke klonování DNA sekvencí z předkládaného vynálezu zvláště vhodný. Mikroorganismy, jako třeba kvasinky, jsou pro takovou expresi také užitečné. Upřednostňovaným kvasinkovým hostitelem s vhodnými vektory obsahujícími sekvenci řídící expresi, sekvenci pro početí replikace, terminační sekvenci atd., je Saccharomyces. Typické promotory zahrnují 3-fosfoglycerát kinázu a další enzymy glykolýzy. Indukovatelné kvasinkové promotory zahrnují mimo jiné promotory z alkoholdehydrogenázy, izocytochromu C a enzymy zodpovědné za odbourávání maltózy a galaktózy. Savčí buňky jsou přednostně používány pro expresi neukleotidových sekvencí kódujících imunoglobuliny nebo jejich fragmenty (viz Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, 1987). V oboru bylo vyvinuto mnoho použitelných buněčných linií, schopných vylučovat intaktní heterologní proteiny. Mezi tyto linie patří CHO buněčné linie, různé COS buněčné linie, HeLa buňky, L buňky a myelomové buněčné linie. Expresní vektory pro tyto buňky mohou obsahovat sekvence řídící expresi (např. replikačnt počátek), promotor, zesilovač (enhancer) a místa nezbytná pro zpracování informací, mezi něž patří místa pro vazbu ribozómu, místa kde dochází k sestřihu RNA, polyadenylační místa a sekvence pro terminaci transkripce. Nejčastěji užívané sekvence řídící expresi jsou promotory odvozené od endogenních genů cytomegaloviru, SV40, adenoviru, hovězího papilomaviru atd. (viz Co etal., J. Immunol. 148:1149, 1992).

Sekvence kódující protilátky mohou být ve formě transgenů vestavěny také do genomu transgenního zvířete, a poté získány z mléka (např. podle metod popsaných v US 5 741 957, US 5 304 489, US 5 849 992, všechny zahrnuty podle odkazu ve své celistvosti). Mezi vhodné transgeny patří sekvence kódující lehké nebo těžké řetězce (nebo oba řetězce zároveň) ve funkčním spojení s promotorem a zesilovačem, pocházejícím z genu specifického pro mléčnou žlázu (např. kasein nebo β-laktoglobulin).

Vektory obsahující potřebné části DNA mohou být dobře známými metodami (záleží na typu hostitelské buňky) vloženy do hostitelské buňky. U prokaryotických buněk se například používá transfekce pomocí chloridu vápenatého, zatímco transfekce do jiných typů buněk využívá působení fosforečnanu vápenatého, elektroporaci, lipofekci a transfekci pomocí bio li štiky nebo viru. Další metody transfekce savčích buněk používají polybren, fúzi protoplastů, lipozómy, elektroporaci a mikroinjekce (obecně viz Sambrook et al., výše). Pro tvorbu transgenních zvířat mohou být transgeny mikroinjikovány do oplodněných oocytů nebo mohou být zabudovány do genomu embryonálních kmenových buněk a jádra těchto buněk mohou být přenesena do enukleovaných oocytů,

Vytvořené protilátky mohou být očištěny podle standardních metod, mezi něž patří HPLC, sloupcová chromatografie, gelová elektroforéza atd. (obecně viz Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982).

4. Další léčebná činidla

Léčebná činidla užívaná v popisovaných metodách zahrnují také T-buňky, které se váží na plakovou složku (např. peptid Αβ). T-buňky mohou být proti peptidu Αβ aktivovány například expresí genu lidského MHC třídy 1 a genu lidského β2-mikroglobulinu v hmyzí buněčné linii, čímž se na jejich povrchu vytvoří komplex, který se může vázat s peptidem Αβ. T-buňky, které se dostanou do kontaktu s touto buněčnou linií se aktivují specificky proti tomuto peptidu (viz Peterson et al., US 5 314 813). Hmyzí buněčné linie exprimují antigen MHC třídy H mohou být obdobně použity k aktivaci CD4 T-buněk.

-30CZ 302971 B6

5. Nosné proteiny

Některá činidla vyvolávající imunitní odpověď obsahují příslušný epitop, jenž vyvolává imunitní odpověď proti amyloidním usazeninám, ale jsou příliš malá na to, aby byla imunogenní. V této situaci může být peptidový imunogen spojen s vhodným nosičem, jenž pomáhá vyvolat imunitní odpověď. Vhodné nosiče zahrnují sérové albuminy, hemocyanin z Diodora aspera, molekuly imunoglobulínu, thyroglobulin, ovalbumin, toxoid tetanu nebo toxoid zjiné patogenní baktérie (např. diftérie, E. coli, cholera nebo H. pylori) nebo oslabený derivát toxinu. Další nosiče zahrnují epitopy T-buněk, které se váží na mnohé alely MHC (např. nejméně na 75 % všech lidských MHC alel). Takové nosiče jsou někdy v oboru nazývány jako „univerzální epitopy T-buněk“. Příklady univerzálních epitopů T-buněk zahrnují:

Chřipkový hemagiutinin: HA₃₀₇₄₁₉ PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1)

PADRE : AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2)

Malarie CS: T3 epitop EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3)

Povrchový antigen hepatitidy B: HBsAgi^g FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 4)

Protein tepelného šoku 65: hsp65,₅₃-i7i DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ

ID NO: 5)

Bacillus Calmette-Guerin QVHFQPLPPAWKL (SEQ IDNO: 6)

Toxoid tetanu: TT₈₃₀^,4 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7)

Toxoid tetanu: ΪΤ₉₄7-<*7 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 8)

HIV gp!20 Tl: KQIINMWQEVGKAMYA. (SEQ ID NO: 9)

Další nosiče, jež stimulují nebo zesilují imunitní odpověď zahrnují cytokiny jako 1L-1, IL-la a β peptidy IL-2, ylNF, IL—10, GM-CSF a chemokiny jako ΜΙΡΙα a β a RANTES. Imunogenní činidla mohou být spojena také s peptidy, které zvyšují transport přes tkáně (viz O^Mahony, WO 97/17 613 a WO 97/17 614.

Imunogenní činidla mohou být napojena na nosiče pomocí chemického spojování. Techniky napojení imunogenu na nosič zahrnují tvorbu disulfidových můstků použitím N-sukcinimidyl-3— (2-pyridyl—thio) propionátu (SPDP) a sukcinimidyl 4—(N-maleimídomethyl) cyklohexan-l-karboxylát (SMCC) (když peptid postrádá sulfhydry lovou skupinu, může mu být poskytnuta přidáním cysteinového zbytku). Tyto látky tvoří disulfidové můstky mezi sebou a peptidovým cysteinem na jednom proteinu a amidové spojení přes ε-aminoskupinu lyzinu nebo volnou aminoskupinu jiné aminokyseliny. Různá taková činidla, tvořící dislufidová a amidová spojení jsou popsána v Immun. Rev. 62, 185 (1982). Jiná bifunkční spojovací činidla tvoří spíše než disulfidová spojení, spojení thioéterová. Mnohá z těchto činidel tvořících thioéterová spojení jsou komerčně dostupná a zahrnují reaktivní estery kyseliny 6-maleimidokaprové, kyseliny bromoctové, kyseliny 2-jodoctové a kyseliny 4-(N—maleimidomethyl) cyklohexan-l-karboxylové. Karboxylové skupiny mohou být aktivovány zkombinováním se sukcinimidem nebo se sodnou so 1 í ky se 1 i ny 1 -hydroxy I—2-n i tro-4- s íro vé.

Imunogenní peptidy mohou být exprímovány také jako proteiny fúzované s nosiči (tj. heterologní peptidy), Imunogenní peptid může být napojen přes svůj aminový konec, karboxylový konec nebo oběma konci na nosič. Imunogenní peptid se může ve fúzním proteinu vyskytovat ve více kopiích. Imunogenní peptid může být také napojen na více kopií heterologní ho peptidu, například svým C-koncem i N-koncem. Některé nosné proteiny slouží k vyvolání odpovědi pomocných Z-buněk vůči sobě samým. Aktivované pomocné T-buňky pak obratem vyvolávají odpověď B-buněk proti imunogennímu peptidu připojenému k nosnému peptidu.

Některá činidla tohoto vynálezu obsahují fúzní protein, ve kterém je N-koncový fragment Αβ napojen svým C-koncem k nosnému peptidu. N-koncový zbytek fúzního proteinu je v těchto činidlech tvořen N-koncovým zbytkem fragmentu Αβ. Takovéto fúzní proteiny účinně působí při vyvolání protilátek, které vyžadují, aby epitop v N-koncovém zbytku byl ve volné formě. Někte-31 CZ 302971 B6 rá z vynalezených činidel obsahují v molekule vícekrát opakované N-koncové části Αβ, jež jsou svým C-koneem napojena na jednu či více kopií nosného peptidu. N-koncový fragment Αβ, zabudovaný v těchto fúzních proteinech začíná někdy v Αβί až 3 a končí v Αβ 7 až 11. Upřednostňovanými fragmenty Αβ jsou Αβί až 7, Αβί až 3, Αβί až 4, Αβί až 5 a Αβ3 až 7. Některé fúzní proteiny obsahují různé N-koncové části Αβ za sebou. Fúzní protein může obsahovat například ΑβΙ až 7 následovaný heterologním peptidem.

V některých fúzních proteinech je N-koncová část Αβ fúzována svým koncem s heterologním nosným peptidem. Stejně různorodé N-koncové fragmenty Αβ mohou být použity i pro fúze ío sC-koncem. Některé fúzní proteiny obsahují heterologní peptid napojený na N—konec

N-koncové části Αβ, jenž je dále napojena na jednu nebo více dalších N-koncových částí Αβ za sebou.

Některé příklady fúzních proteinů vhodných pro použití v tomto vynálezu jsou ukázány níže.

Některé z těchto fúzních proteinů obsahují části Αβ spojené sepitopy toxoidu tetanu (viz US 5 196 512, EP 378 881 a EP 427 347), Některé fúzní proteiny obsahují části Αβ napojené na nosné peptidy popsané v US 5 736 142. Některé heterologní peptidy představují pro T-buňky univerzální epitopy. V některých metodách je činidlo určené k podání pouze jednoduchý fúzní protein s částí Αβ spojenou s částí heterologní v lineární konfiguraci. V některých metodách je činidlem multimer složený z fúzních proteinů popsaných vzorcem 2*, kde x značí Číslo od 1 do 5, xje přednostně 1, 2 nebo 3, přičemž 2 bývá upřednostňována nejvíce. Když je x 2, obsahuje multimer 4 fúzní páry spojené do konfigurace známé jako MAP4 (viz US 5 299 490). Epitopy Αβ jsou podtrženy.

Konfigurace MAP4 je zobrazena níže. Větvené struktury vznikají zahájením syntézy peptidu jak v N-koncovém aminu lyzinu, tak i v aminu postranního řetězce lyzinové molekuly. Na tom kolikrát je lyzin v sekvenci zabudován a může se větvit, závisí konečné množství vzniklých N-konců. V tomto případě vznikají z rozvětveného lyzinu vjádře molekuly čtyři identické N-konce. Tato mnohočetnost mocně zvyšuje schopnost odezvy B-buněk.

AN90549 (ΑβΙ-7/toxoid tetanu 830-844 v konfiguraci MAP4):

DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 10)

AN90550 (ΑβΙ-7/toxoid tetanu 947-967 v konfiguraci MAP4): PAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLF (SEQ ID NO: 11) AN90542 (ΑβΙ-7/toxoid tetanu 830-844 + 947-967 v lineární konfiguraci):

-32CZ 302971 B6

DAEFRHDOYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12)

AN90576 (Ap3-9/toxoid tetanu 830-844 v konfiguraci MAP4): EFRHPSGOYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 13)

Peptidy pospané v US 5 736 142 (všechny v lineárních konfiguracích):

AN90562 (ΑβΙ-7/peptid):

AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID NO: 14)

AN90543 (ΑβΙ-7 x 3/peptid):

DAEFRHDDAEFRHDPAEFRHPAKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15)

Další příklady fúzních proteinů (imunogenní epitop Αβ je zvýrazněn) zahrnují:

AKXVAAWTLKAAA-DAEFRIID-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 16)

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17) DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 18) FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 19) EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 20) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 21)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 23)

DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 24) _1θ DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 25)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELC FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 26) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELC

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 27) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 28) 2 větve

-33CZ 302971 B6

Peptid

Lys-Gly-Cys

EQVTNVGGAISOAVHAAHAEINEAGR (fúzní protein synukleinu v konfiguraci MAP-4; SEQ ID NO: 29)

Stejné nebo podobné nosné proteiny a metody jejich spojení mohou být použity pro tvorbu imunogenů, určených pro stimulaci protilátek proti Αβ při pasivní imunizaci. Například Αβ nebo jeho fragment napojený na nosič mohou být podávány laboratorním zvířatům, která následně tvoří monoklonální protilátky proti Αβ.

6. Nukleové kyseliny kódující léčebná činidla

Imunitní odpověď proti amyloidním usazeninám může být vyvolána také podáním nukleových kyselin kódujících vybrané peptidové imunogeny nebo protilátky a jejich řetězce, jež jsou používány při pasivní imunizaci. Takové nukleové kyseliny mohou být DNA nebo RNA. Část nukleové kyseliny kódující imunogen je typicky napojena na regulační prvky (např. promotor a zesilovač), které dovolují expresi části DNA ve zvolených cílových buňkách pacienta. Pro expresi, jež je žádoucí pro vyvolání imunitní odpovědi, je vhodné použít promotor a zesilovač z genů pro lehký nebo těžký řetězec imunoglobulinu nebo hlavní promotor a enhancer ranných genů u CM V. Spojené regulační prvky a kódující sekvence jsou často vloženy do vektoru. Při podávání dvouřetězcových protilátek mohou být dva řetězce vloženy do jednoho či více oddělených vektorů.

K dispozici je množství virových vektorů, mezi něž patří retrovirové vektory (viz např., Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102 až 109, 1993); adenovirové vektory (viz např., Bett et al., J. Virol. 67, 5911, 1993); virové vektory spojené s adenoviry (viz např., Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867, 1994), virové vektory z rodiny poxvirů, jako třeba virus vakcinie a ptačí pox viry, virové vektory z rodu alfa virů, například vektory odvozené od viru Sindbis a viru SFV (Semliki forest virus) (viz např., Dubensky et al., J. Virol. 70, 508 až 519, 1996), od viru venezuelské koňské encefalitidy (viz US 5 643 576) a virové vektory zrhabdovirů (např. virus vesikulámí stomatitidy, viz WO 96/34 625) a z papilomavirů (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325 až 333, 1995); Woo et al., WO 94/12 629 a Xiao & Brandsma, Nucleic Acids Res. 24, 2630 až 2622).

DNA kódující imunogen nebo vektor s touto DNA mohou být zabaleny do lipozomů. Vhodné lipidy a příbuzné analogy jsou popsány patenty US 5 208 036, 5 264 618, 5 279 833 a 5 283 185. Vektory a DNA kódující imunogen mohou být také adsorbovány nebo napojeny na částicové nosiče (např. polymery polymethylmethakrylátu a polylaktidy a poly(laktid-ko-glykosidy) (obecně viz McGee et al., J. Micro Encap., 1996).

Vektory pro genovou terapii nebo samotná DNA mohou být do pacienta dopraveny in vivo, s tím, že podání je nej častěji systém ické (např. intravenózní, intraperitoneální, intranasální, gastrické, intradermáíní, íntramuskulámí, subdermální nebo intrakraniální infúze) nebo lokální (viz např., US 5 399 346). Tyto vektory mohou dále obsahovat zesilující činidla jako třeba bupivakain (US 5 593 970). DNA může být podávána použitím „genové zbraně“ (viz Xiao & Brandsma, výše). DNA kódující imunogen je vysrážená na povrchu mikroskopických kovových kuliček. Mikroprojektily jsou urychleny tlakovou vlnou expandujícího héliového plynu a pronikají tkáněmi do hloubky několika buněčných vrstev. Vhodný je například přístroj The Accel™ Gene Delivery Device (Agrocetus, lne. Middleton, WI). Holá DNA může procházet kůží do krevního oběhu jednoduchou aplikací na chemicky nebo mechanicky porušenou kůží (viz WO 95/05 853).

-34CZ 302971 B6

Vektory kódující imunogeny se mohou do buněk dostat ex vivo, jako třeba do buněk získaných z pacienta (např., lymfocyty, vzorky kostní dřeně, vzorky tkáně) nebo do univerzálních dárcovských krvetvorných kmenových buněk. Následujícím krokem je reimplantace buněk do pacienta předcházená obvykle výběrem buněk, jež přijaly vektor.

7. Testování očišťovacích schopností protilátek

Příklad 14 popisuje metody testování účinnosti protilátek při „očišťování“ od amyloidních usazenin. Za účelem testování účinnosti při očišťování od amyloidních usazenin, byly z pacientů nebo zvířat trpících atnyloidózou odebrány vzorky tkáně (např. mozková tkáň při Alzheimerově chorobě. Vzorky jsou zkontaktovány s fagocytámími buňkami nesoucími Fc receptor (např, mikrogliální buňky) a s testovanou protilátkou přítomnou v médiu in vitro. Fagocytámí buňky mohou být v primární kulturou nebo buněčnou linií (např. BV-2, C8-B4 nebo THP-1). Tyto složky jsou pro zesílení mikroskopického pozorování zkombinovány na mikroskopickém sklíčku, přičemž mnoho paralelních reakcí může být uskutečněno v jamkách mikrotitrační destičky. V tomto pří“ pádě mohou být jednotlivá miniaturní mikroskopická sklíčka upevněna do jednotlivých jamek. Použity mohou být také jiné způsoby detekce Αβ (např. ELISA). Nejčastěji se uskutečňují série měření množství amyloidních usazenin v reakční směsi in vitro, přičemž bazální hodnota značí množství amyloidu v reakční směsi před započetím reakce. Antigen může být detekován barvením (např. fluorescenčně označená protilátka proti Αβ nebo jiné složce amyloidního plaku). Protilátka používaná pro barvení může, ale nemusí být tatáž protilátka, která je testována. Snížení množství amyloidního plaku vzhledem k bazální hodnotě značí, že testovaná protilátka má očišťovací schopnost. Takovéto protilátky bývají užitečné při prevenci nebo léčbě Alzheimerovy choroby a dalších amyloidogenních onemocnění. Jak již bylo popsáno výše, pokusy prováděné pro podporu předkládaného vynálezu a využívající této analýzy odhalily, že protilátka proti NAC fragmentu synukleinu jsou účinné při očišťování od amyloidních plaků, charakteristických pro Alzheimerovu chorobu.

D. Pacienti podrobující se protiamyloidním léčebným režimům

Pacienti podrobující se léčbě zahrnují jedince s rizikem vzniku nemoci, kteří ještě nevykazuji symptomy nemoci, stejně tak jako pacienti, u nichž amyloidóza již propukla. V případě Alzheimerovy choroby je potenciálním budoucím zasaženým každý, kdo žije dostatečně dlouho. Předkládané metody mohou být tedy užívány v rámci profylaxe širokou populací, aniž by bylo nutné zjišťovat riziko u jednotlivého pacienta. Předkládané metody jsou zvláště vhodné pro jedince, kteří jsou dědičně svázáni s výskytem Alzheimerovy choroby nebo jakékoli jiné geneticky dané amyloidní poruchy. Mezi tyto jedince patří ti, kteří mají příbuzné trpící takovou chorobou nebo ti, jimž bylo riziko vzniku nemoci oznámeno po analýze genetických nebo biochemických indikátorů. Genetické indikátory poukazující na možné riziko vzniku Alzheimerovy choroby zahrnují mutace v genu APP, zvláště však mutace v pozici 717 (Hardyho mutace) a v pozicích 670 a 671 (Švédská mutace) (viz Hardy, TINS, výše). Dalšími indikátory jsou mutace v genech presenilinu, PS t a PS2, ApoE4, rodinná historie výskytu Alzheimerovy choroby, hypercholesterolemie nebo atheroskleróza. Jedinci, kteří již Alzheimerovou chorobou trpí, mohou být rozpoznáni jak podle charakteristické demence, tak i podle přítomnosti výše popsaných rizikových faktorů. Existuje také množství diagnostických testů pro identifikaci jedinců s AD, mezi něž patří měření hladin CSF tau a Αβ42. Zvýšená hladina tau a nízká hladina Αβ značí přítomnost AD. Jedinci trpící Alzheimerovou chorobou mohou být diagnostikováni také pomocí kritérií MMSE nebo ADRDA, což je diskutováno v příkladech provedení vynálezu.

U asymptomatických pacientů může léčba začít v jakémkoli věku (např. 10, 20, 30). Léčba ovšem není obvykle nutná dokud pacient nedosáhne 40, 50 nebo 70 let. Typická léčba znamená aplikaci více dávek během časového období. Léčba může být sledována analyzováním protilátkových nebo T nebo B-buněčných odpovědí na léčebné činidlo (např. peptid Αβ) (viz příklad 1 a 2). Jestliže odpověď poklesne, je aplikována posilovači dávka. V případě rozvinutí Downova

-35CZ 302971 Bó syndromu může léčba začít před narozením, a to podáváním léčebného činidla matce, a nebo krátce po narození.

Další formy amyloidóz často probíhají nediagnostikovány, kromě případů, kdy existuje zvláštní podezření pro vznik nemoci. Jedním z prvních příznaků je výskyt srdečního nebo ledvinového onemocnění u pacientů středního a staršího věku, přičemž pacienti jeví také známky účasti (ukládání plaků v) dalších orgánů. Nízké napětí nebo extrémní odchylky osy EKG a zbytnělá tkáň srdeční předsíně mohou být známkami srdeční poruchy. Proteinurie je symptomem účasti ledvin. Jestliže je při vyšetření pacienta zjištěna hepatomegalie, tak existuje podezření účasti jater. Periferní neuropatie se obvykle při určitých formách amyloidóz vyskytuje také, přičemž autonomní neuropatie, jež je charakteristická posturální hypotenzí se může objevit také. Každý jedinec s progresivní neuropatií neurčitého původu by měl být podezříván z výskytu amyloidózy.

V případech kdy je to nutné, může být konečná diagnóza určena ze vzorků napadeného orgánu nebo orgánů. Vzorky jsou obarveny barvou Congo Red, přičemž pozitivní vzorky vykazují v polarizovaném světle dvoj lom jablečně zelené barvy.

E. Léčebné režimy

Při profylaktickém použití mohou být farmaceutické prostředky nebo léky podávány pacientovi, jenž je náchylný ke vzniku určité nemoci nebo zde existuje jiné riziko pro její vznik, a to v množství, které je dostatečné pro odstranění nebo snížení rizika vzniku onemocnění nebo jeho oddálení. Při terapeutickém použití jsou léčebné prostředky nebo léky podávány pacientovi, jenž je podezřelý z výskytu onemocnění nebo jím už trpí, a to v množství dostatečném pro vyléčení nebo alespoň pro částečné potlačení symptomů nemoci a s nemocí spojených komplikací. Množství dostatečné pro splnění právě vyjmenovaného je nazýváno jako terapeuticky nebo farmaceuticky účinná dávka. Jak pro profylaktické, tak i pro terapeutické účely jsou činidla obvykle podávána ve více dávkách, a to tak dlouho, dokud není dosaženo dostatečné imunitní odpovědi. Imunitní odpověď je sledována, a když začíná imunitní odpověď klesat, jsou podávány další dávky.

Účinné dávky prostředků předkládaného vynálezu, určené pro léčbu výše popsaných stavů, jsou závislé na mnoha různých faktorech, mezi něž patří způsoby podání, cílové místo, fyziologický stav pacienta, to, zdaje pacientem zvíře nebo člověk, další podávané léky a to, zda aplikace probíhá za účelem profylaxe či terapie. Pacientem je obvykle člověk, ale u některých nemocí (např. s priony spojená nemoc šílených krav) může být pacientem jiný savec než člověk, například skot. Léčebné dávky je pro optimalizaci bezpečí a účinku nutno titrovat. Množství imunogenu záleží na tom, zdaje podáván také adjuvant, přičemž větších dávek je obecně potřeba při neúčasti adjuvantu. V závislosti na imunogenicitě příslušného imunogenu se množství imunogenu pro podání může pohybovat od 1 do 500 pg na pacienta a od 5 do 500 pg na injekci určenou lidskému pacientovi. občas jsou používány vyšší dávky, tj. 0,5 až 5 mg na injekci. Pro injekci určenou lidskému pacientovi jsou používány dávky nejméně okolo 10, 20, 50 nebo 100 pg. Doba aplikace se může významně lišit, a to od frekvence jednou denně až k frekvenci jednou ročně nebo až jednou za deset let, jakkoli jsou pro svoji úspěšnost upřednostňovány „posilovači“ dávky imunogenu. Podle zde uvedených postupů lze účinné dávky sledovat analýzou vzorku tekutiny z pacienta (nejčastěji vzorku krevního séra) a určením proti látkového titru proti imunogenu, a to za použití v oboru dobře známých metod, které lze podle konkrétního antigenů dále adaptovat. Nejvýhodnější je získání vzorku tkáně ještě před aplikací první dávky, přičemž další vzorky jsou pak odebírány a titrovány po každé imunizaci. Žádanou je dávka nebo dávkovači schémata, která poskytují titry nejméně čtyřikrát vyšší než jsou kontrolní hladiny neboli hladiny „pozadí“, přičemž sérum je naředěno 1:100 a pozadí je definováno jako ve vztahu ke kontrolnímu vzorku séra nebo ve vztahu k hodnotě pozadí u ELISA testů. Podle předkládaného vynálezu jsou žádoucí titry nejméně 1:1000 nebo 1:5000.

V jakýkoli den kdy dochází k podání imunogenu spolu s adjuvantem, je dávka větší než 1 pg na pacienta, a ještě lépe vyšší než 100 pg na pacienta. Když je adjuvant nepřítomen, tak je množství imunogenu na pacienta vyšší než 10 pg, a ještě lépe vyšší než 100 pg. Dávky jednotlivých imu-36CZ 302971 B6 nogenů, zvolených ve shodě s předkládaným vynálezem, jsou určeny standardními dávkovacími a titrovacími metodami. Typický režim sestává z imunizace následované v Časových intervalech (např. 6 týdnů) posilovacími injekcemi. Jiný režim sestává z imunizace následované posilovač ími injekcemi po 1, 2 a 12 měsících. Jiný režim zahrnuje injekci vždy po každých dvou měsících až do konce života. Posilovači injekce mohou být v závislosti na zjištěném stavu imunitní odpovědi podávány nepravidelně.

U pasivní imunizace s protilátkou mají dávky rozpětí od asi 0,0001 do 100 mg/kg a ještě častěji od 0,01 do 5 mg/kg, a to podle hmotnosti pacienta. Dávky mohou být například 1 mg/kg tělesné váhy nebo 10 mg/kg tělesné váhy. Ukázkový léčebný režim zahrnuje podávání jednou za dva týdny nebo jednou za měsíc nebo jednou za tři až šest měsíců. Podle některých metod jsou současně podávány dvě či více monoklonálních protilátek s různou vazebnou specifitou, přičemž dávky každé z nich se pohybují ve vymezených hranicích. Protilátka je obvykle podávána vícekrát. Intervaly mezi jednotlivými dávkami mohou být týdenní, měsíční nebo roční. Intervaly mohou být i nepravidelné, což je určeno měřením hladiny protilátky proti Αβ v krvi pacienta. Protilátka může být podávána také ve formě prostředku $ postupným uvolňováním, což je případ, ve kterém může být frekvence aplikací nižší. Dávka a frekvence se liší v závislosti na poločasu života protilátky v pacientovi. Nejčastěji vykazují nejdelší poločas života lidské protilátky následované humanizovanými protilátkami, Chimérickými protilátkami a zvířecími protilátkami. Dávka a frekvence podávání se může lišit v závislosti na tom, zda je léčba proťylaktická nebo terapeutická. Při proťylaktickém použití jsou v dlouhém časovém intervalu aplikovány relativně nízké dávky s relativně nízkou frekvencí. Někteří pacienti jsou léčeni po celý zbytek života. Při terapeutickém použití jsou aplikovány i relativně vysoké dávky v relativně krátkých intervalech, neboť někdy jsou nezbytné pro zbrzdění postupu nemoci nebo její zastavení, a nebo ještě lépe, pro Částečné nebo celkové vymizení symptomů. Potom může být pacient léčen podle profytaktického režimu.

Dávky nukleových kyselin kódujících imunogeny se pohybují v rozmezí od asi lOng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 gg do 10 mg nebo 30 až 300 gg DNA na pacienta. Množství infekčních virových vektorů se pohybují v rozmezí od 10 do 100 nebo více virionů na dávku.

Činidla vyvolávající imunitní odpověď mohou být pro proťylaktické či terapeutické použití podány parenterálně, lokálně, intravenózně, orální cestou, subkutánně, intraperitoneálně, intranasálně nebo intramuskulámě. Typické cesty podání imunogenního Činidla jsou cesta intramuskulámí (i.m.), intravenózní (i.v.) nebo subkutánní (s.c.), nicméně ostatní cesty mohou být stejně účinné. Intramuskulámí injekce je nej častěji aplikována do svalů ruky či nohy. Podle některých metod jsou činidla injikována přímo do určité tkáně, ve které došlo k nahromadění usazenin (např. intrakraniální infúze). Intramuskulámí injekce nebo intravenózní infúze jsou při podávání protilátky upřednostňovány. Podle některých metod jsou určité léčebné protilátky injikovány přímo do lebky. Podle některých metod jsou protilátky aplikovány jako prostředky s postupným uvolňováním, přičemž použita mohou být i zařízení konstruována pro tyto účely (např. zařízení Medipad™).

Činidla tohoto vynálezu mohou být libovolně podávána v kombinaci s dalšími činidly, jež jsou při léčbě amyloidogenní nemoci alespoň částečně účinná. V případě Alzheimerovy choroby a Downova syndromu, u kterých se amyloidní usazeniny objevují v mozku, mohou být činidla tohoto vynálezu podávána ve spojení s dalšími činidly, která zesilují průnik činidel tohoto vynálezu přes hematoencefalickou bariéru. Léčebné koktejly obsahují imunogeny připravené tak, že jsou schopny vyvolat imunitní odpověď proti více než jedné amyloidní složce, jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty také, jelikož jsou kombinací protilátky zaměřené proti jedné plakové složce a imunogenu, zaměřenému proti jiné plakové složce.

Imunogenní činidla tohoto vynálezu, jako třeba peptidy, se podávají někdy v kombinaci s adjuvantem. Pro vyvolání imunitní odpovědi může být v kombinaci s peptidem (např. Αβ) podáváno množství adjuvantů. Nejlepší je, když adjuvanty zesilují vnitřní odpověď na imunogen, aniž by

-37CZ 302971 B6 působily konformační změny imunogenu, které by zasáhly kvalitativní stránku odpovědi. Mezi upřednostňované adjuvanty patří hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, 3 De-O-acetylovaný monofosforyllipid A (MPL™) (viz GB 2 220 211; RIBI ImmunoChem Research Inc„ Hamilton, Montana, nyní část Corixa). Stimulon™ QS-21 je triterpenový glykosid nebo saponin, izolovaný z kůry stromu Quillaja Saponaria Molina, jenž se nachází v Jižní Americe (viz Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; eds. Powell & Newman, Plenům Press, NY, 1995; patent US 5 057 540, Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Dalšími adjuvanty jsou emulze oleje a vody (např. skvalenový olej nebo olej z podzemnice olejné), v libovolné kombinaci s imunostimulanty jako je monofosforyllipid A (viz Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86 až 91, 1997). Dalším adjuvantem je CpG (WO 98/40 100). Αβ může být také někdy spojeno s adjuvantem, přičemž takovéto spojení by nemělo nijak zásadně změnit konformaci Αβ, tj. nemělo by změnit povahu jím vyvolané imunitní odpovědi. Adjuvanty mohou být podávány jako složky léčebného prostředku spolu s účinným činidlem nebo mohou být podávány zvlášť, a to jak před, spolu s nebo i po podání léčebného činidla.

Upřednostňovanou skupinou adjuvantů jsou soli hliníku (alum), mezi něž patří hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a síran hlinitý. Tyto adjuvanty mohou být použity buď s, nebo bez dalších imunostimulačních činidel, jakými jsou MPL nebo 3-DMP, QS-21, polymemí nebo monomemí aminokyseliny (např. kyselina polyglutamová, polylyzin). Další třída adjuvantů obsahuje prostředky na základě emulze oleje a vody. Tyto adjuvanty mohou být použity s nebo bez dalších specifických imunostimulačních činidel, mezi něž patří muramylpeptidy (např. N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin(nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogIutaminyl-L-alanin-2-( 1 ’-2’-dipaImitoylsn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)-ethylamin (MTP-PE), N-Acetylglukaminyl-N-acetlymuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid (DTP-DPP), theramide™ nebo jiné složky z buněčné stěny bakterií. Emulze oleje a vody zahrnují (a) MF59 (WO 90/14 837), jenž obsahuje 5 % skvalenu, 0,5 % Tween 80 a 0,5 % Spán 85 (volitelně obsahující různá množství MTPPE), které jsou přítomny jako částice o velikosti menší než 1 μπι, což je docíleno pomocí mikrofluidizéru (např. model 110Y, Microfluidies, Newton MA), (b) SAF, jenž obsahuje 10 % skvalenu, 0,4% Tween 80, 5% pluronic-blocked polymer LI21 a thr-MDP, které jsou upravené mikrofluidizérem tak, aby byly přítomny jako částice o velikosti menší než 1 pm nebo pouze promíchány na vortexu (speciální laboratorní míchací zařízení), což vedlo k tvorbě emulze s většími částicemi, a (c) adjuvační systém s Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), jenž obsahuje 2 % skvalenu, 0,2 % Tween 80 a jednu nebo více složek bakteriální buněčné stěny zahrnující monofosforyllipid A, dimykolát trehalózy (TDM) a kostru buněčné stěny (CWS), nejlépe však MPL + CWS (Detox™). Další třídou používaných adjuvantů jsou saponinové adjuvanty, jako třeba Stimulon™ (QS-21; Aquila, Framingham, MA) nebo z něho vytvořené částice, jako například lSCOMs (imunostimulační komplexy) a ISCOMATRIX. Další adjuvanty zahrnují Nekompletní Freundův adjuvant (ÍFA), cytokiny, jako třeba interleukiny (IL-1, IL-2 aIL-12), faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF) a faktor nádorové nekrózy (TNF). Tyto adjuvanty jsou běžně dostupné z komerčních zdrojů.

Adjuvanty mohou být podávány spolu s imunogenem v jednom prostředku nebo mohou být podávány zvlášť, a to jak před, spolu s nebo i po podání imunogenu. Imunogen a adjuvant mohou být baleny a dodávány ve stejné lahvičce nebo mohou být baleny v oddělených lahvičkách, s tím, že před použitím budou promíchány. Imunogen a adjuvant jsou baleny se značkou udávající zamýšlené použití prostředku. Jestliže jsou imunogen a adjuvant zabaleny odděleně, tak balení obsahuje pokyny pro jejich smíšení před použitím. Volba adjuvantu nebo nosiče (nebo obou současně) záleží na takových faktorech, jakými jsou stabilita prostředku obsahujícího adjuvant, způsob podání, dávkovači schéma a účinnost adjuvantu u živočišných druhů, kterým je podáván. U člověka je upřednostňovaným farmaceuticky přijatelným adjuvantem látka, která pro podávání byla schválena příslušným řídicím orgánem. Příklady takovýchto adjuvantů zahrnují alum, MPL a QS-21. Současně mohou být použity i dva či více adjuvantů. Upřednostňované kombinace zahrnují alum s MPL, alum s QS-21, MPL s QS-21 a alum, MPL a QS-21 společně. Použit

-38 CZ 302971 B6 může být i Nekompletní Freundův adjuvant (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173 až 186, 1998), případně v jakékoli kombinaci s alum, MPL a QS-21 nebo jejich směsí.

Činidla tohoto vynálezu jsou často podávána jako farmaceutické prostředky, které obsahují účinné léčebné činidlo a řadu dalších farmaceuticky přijatelných složek (viz Remingtonů Pharmaceutical Science, I9th ed., 1995). Konečné složení závisí na zamýšleném způsobu podání a na léčebném určení. Prostředky mohou v závislosti na zamýšleném složení obsahovat také farmaceuticky přijatelné netoxické nosiče nebo rozpouštědla, která jsou běžně používána pro přípravu farmaceutických prostředků, určených pro podání lidem nebo zvířatům. Rozpouštědlo je vybíralo no tak, aby neovlivnilo biologickou účinnost směsí. Příklady takovýchto rozpouštědel jsou destilovaná voda, fyziologický roztok soli pufrovaný fosfátem, Ringerovy roztoky, roztok dextrózy a Hankův roztok. Farmaceutický prostředek může obsahovat také další nosiče, adjuvanty nebo netoxické, neléčebné, neimunogenní stabilizátory atd.

is Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat velké, pomalu metabolizovatelné makromolekuly, mezi něž patří proteiny, polysacharidy (např. chitosan), polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny a kopolymery (např. sepharóza, agaróza, celulóza atd.), polymemí aminokyseliny, kopolymery aminokyselin a lipidové agregáty (olejové kapičky nebo lipozómy). Tyto nosiče mohou fungovat také jako imunostimulační činidla (tj. adjuvanty).

Při parenterálním podání mohou být činidla tohoto vynálezu aplikována jako injikovatelné roztoky nebo suspenze látky ve fyziologicky přijatelném rozpouštědle s farmaceuticky přijatelným nosičem, jímž může být sterilní kapalina (např. voda, oleje, soli, glycerol nebo ethanol). Pomocné látky jako jsou zvlhčovači nebo emulzifíkační činidla, surfaktanty, pufrující látky atd. mohou být také v prostředku obsaženy. Další složky farmaceutického prostředku jsou získávány z ropy, ze zvířat, ze zeleniny nebojsou syntetického původu (např. olej z podzemnice olejné, sójový olej a minerální oleje). Pro injikovatelné roztoky platí, že upřednostňovanými kapalnými nosiči jsou glykoly (např. propylenglykol nebo polypropylenglykol). Protilátky mohou být podány ve formě depotních injekcí nebo implantovaného preparátu, který může být uzpůsoben pro postupné uvol30 ňování účinné látky. Příkladný prostředek obsahuje monoklonální protilátku v množství 5 mg/ml ve vodném pufru, jenž obsahuje 50mM L-histidin, 150mM NaCI, pH upraveno na 6.0 pomocí HCI.

Prostředky jsou nejčastěji připravovány jako injikovatelné roztoky nebo suspenze. Prostředek může být pro zvýšení adjuvačního účinku také emulzifikován nebo zabalen v lípozómech nebo v mikročásticích (např. polyaktid, polyglykolid nebo kopolymer), což je diskutováno výše (viz Langer, Science 249, 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97 až 119, 1997). Činidla tohoto vynálezu mohou být podána ve formě depotních injekcí nebo implantovaného preparátu, který může být uzpůsoben pro postupné uvolňování účinné látky.

Prostředky jsou vhodné i pro další způsoby podání, mezi něž patří podání orální, intranasální a pulmonámí podání, čípky a transdermální aplikace.

Čípky, pojidla a nosiče obsahují například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy. Čípky mohou být vytvořeny ze směsí obsahujících účinnou látku v rozmezí od 0,5 do 10 %, nejlépe však 1 až 2 %. Prostředky pro orální aplikaci zahrnují pomocné látky, mezi něž patří manitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, sacharin sodný, celulóza a uhličitan hořečnatý. Tyto prostředky mají podobu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, preparátů s postupným uvolňováním nebo prášků a obsahují 10 až 95 % účinné látky, nejlépe však 25 až 75 %.

Lokální aplikace může probíhat transdermálním nebo intradermálním podáním. Lokální aplikace může být zesílena podáním činidel alum stoxinem cholery nebo sjeho detoxifi kovaným i deriváty nebo s jejich podjednotkami nebo s jinými obdobnými bakteriálními toxiny (viz Glenn et al., Nátuře 391, 851, 1998). Společného podání může být dosaženo smísením roztoků jednotlivých

-39CZ 302971 B6 složek nebo spojením jejich molekul chemickým spojením nebo vytvořením fůzního proteinu z těchto složek.

Transdermální aplikace může být provedena s použitím náplastí nebo pomocí transferozómů (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521 až 24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201 až 15, 1998).

F, Diagnostické metody

Tento vynález uvádí metody pro zjištění imunitní odpovědi proti Αβ u pacienta trpícího nebo náchylného k Alzheimerově chorobě. Tyto metody jsou zvláště užitečné pro sledování průběhu léčby pacienta. Tyto metody mohou být použity pro sledování postupu léčby u pacientů se symptomy i pro sledování proťy taktického postupu u asymptomatických pacientů. Tyto metody jsou užitečné pro sledování aktivní (např. protilátka vytvořená jako odpověď na podání imunogenu) a pasivní imunizace (měření hladiny podané protilátky).

1. Aktivní imunizace

Některé metody zahrnují určení základní hodnoty imunitní odpovědi před podáním dávky činidla a její porovnání s hodnotou imunitní odpovědi po léčbě. Významné zvýšení (tj. větší než je typická experimentální chyba v opakovaných měřeních stejného vzorku, vyjádřená jako standardní odchylka průměru z těchto měření) hodnoty imunitní odpovědi signalizuje pozitivní výsledky léčby (tj, podání činidla vyvolalo nebo posílilo imunitní odpověď). Jestliže se hodnota imunitní odpovědi nezmění významně nebo poklesne, je to signálem negativního výsledku léčby. U pacientů podstupujících léčbu s imunogenním činidlem se s další dávkou očekává zvýšení imunitní odpovědi, které pak případně dosáhne plato. Podávání činidla pokračuje většinou tak dlouho, dokud se imunitní odpověď zvyšuje. Dosažení plató je signálem pro přerušení léčby nebo snížení dávky či frekvence podávání.

Dalšími metodami se určuje kontrolní hodnota (tj. průměr a standardní odchylka) imunitní odpovědi u kontrolní populace. Jedinci z kontrolní populace neabsolvovali předchozí léčbu. Změřené hodnoty imunitní odpovědi u pacienta po podání léčebného činidla jsou pak porovnány s kontrolní hodnotou. Významné zvýšení v poměru ke kontrole (tj. větší než jedna standardní odchylka průměru) signalizuje pozitivní výsledek léčby. Nepřítomnost významného zvýšení nebo pokles odpovědi značí negativní výsledek léčby. V podávání činidla se většinou pokračuje dokud se hodnota imunitní odpovědi zvyšuje oproti kontrolní hodnotě. Dosažení plató je signálem pro přerušení léčby nebo snížení dávky či frekvence podávání.

Dalšími metodami se zjišťuje kontrolní hodnota imunitní odpovědi (např. průměr a standardní odchylka) u kontrolní populace jedinců, kteří se již podrobili léčbě terapeutickým činidlem a jejichž imunitní odpovědi dosáhly po léčbě plata. Změřené hodnoty imunitní odpovědi u pacienta jsou porovnány s kontrolní hodnotou. Jestliže změřená hladina u pacienta není významně odlišná (např. více než jedna standardní odchylka) od kontrolní hodnoty, léčba může být přerušena. Jestliže je pacientova hladina významně pod kontrolní hodnotou, je zajištěno další podávání činidla. Jestliže hladina v pacientovi zůstane pod kontrolní hodnotou, tak je nutné změnit například léčebný režim nebo použít jiný adjuvant.

Dalšími metodami se sleduje imunitní odpověď pacienta, který se v současnosti léčbě nepodrobuje, ale prodělal ji už dříve, a to za účelem zjištění, zda není třeba léčbu znovu zahájit. Změřená hladina imunitní odpovědi pacienta může být porovnána s hodnotou imunitní odpovědi dosažené u pacienta předchozí léčbou. Významné snížení v porovnání s předchozím měřením (tj. větší než je typická experimentální chyba v opakovaných měřeních stejného vzorku) je známkou nutnosti pokračování léčby. Hodnota změřená u pacienta může být také porovnána s kontrolní hodnotou (průměr plus standardní odchylka) zjištěnou u populace pacientů po ukončení léčby. Hodnota změřená u pacienta může být porovnána s kontrolní hodnotou u populace profylakticky léčených

-40CZ 302971 B6 pacientů, kteří nevykazují symptomy nemoci nebo u populace terapeuticky léčených pacientů, kteří vykazují zlepšení charakteristik onemocnění. Ve všech těchto případech je významné snížení ve vztahu ke kontrolní hladině (tj. více než jedna standardní odchylka) známkou toho, že léčba pacienta by měla znovu začít.

Analyzované vzorky tkání pacienta jsou typicky krev, plazma, sérum a mukózní nebo cerebrospinální tekutina. Ve vzorku jsou zjišťovány známky imunitní odpovědi na sledovanou amyloidní složku (např. jakákoli forma peptidu Αβ). Imunitní odpověď může být určena například podle přítomnosti protilátek nebo T-buněk, které se specificky váží na sledovanou složku (např. peptid Αβ). Metody ELISA pro zjištění protilátek specifických pro Αβ jsou popsány v části příkladů a mohou být použity i na jiné peptidové antigeny. Metody zjištění reaktivních T-buněk jsou v oboru dobře známy.

2. Pasivní imunizace

Postupy pro sledování pasivní imunizace jsou většinou obdobné postupům pro sledování aktivní imunizace, která byla výše popsána. Profil protilátky při pasivní imunizaci je typický tím, že okamžitý vrchol koncentrace protilátky je následován exponenciálním poklesem. Bez dalších dávek dosahuje během dnů až měsíců (v závislosti na poločasu života podané protilátky) hladin, které byly změřeny před léčbou. Například poločas života některých lidských protilátek se pohybuje okolo 20 dnů.

Podle některých metod se měření základní hladiny protilátky proti Αβ odehrává u pacienta před prvním podáním činidla, druhé měření brzy po podání (pro určení vrcholové hodnoty koncentrace protilátky) a jedno nebo více dalších měření se provádí v dalších intervalech pro určení poklesu hladiny protilátky. Když hladina protilátky poklesne na základní hladinu nebo blízko k ní (např. na 50, 25 nebo 10%), proběhne aplikace další dávky protilátky. Podle některých metod jsou hodnoty vrcholové a hodnoty zjištěné v následných měřeních srovnány s dříve naměřenými referenčními hodnotami, které byly ustaveny pro zjištění prospěšných profyIaktických nebo terapeutických léčebných režimů u jiných pacientů. Když je změřená hladina protilátky významně nižší než referenční hladina (např. méně než průměr mínus jedna standardní odchylka referenční hodnoty v populaci pacientů, u kterých byla léčba úspěšná), je nutno podat další dávku protilátky.

3. Diagnostické sady

Vynález dále popisuje diagnostické sady pro použití při výše popsaných diagnostických metodách. Taková sada typicky obsahuje činidlo, které se specificky váže na protilátky proti složce amyloidního plaku (např. Αβ) nebo reaguje sT-buňkami specifickými pro danou složku. Sada může obsahovat také značku. Při detekci protilátek proti Αβ je značka typicky ve formě označených anti-idiotypických protilátek. Pro detekci protilátky může být činidlo dodáváno předem ukotveno v pevné fázi (např. v jamkách mikrotitrační destičky). Pro detekci reaktivních T-buněk může být značkou ³H-thymidin, pomocí kterého se měří proliferativní odpověď. Sada je také typicky opatřena označením pro její použití. Označení může zahrnovat také tabulku nebo jiné hodnocení pro korelaci hladiny naměřené značky s hladinou protilátek proti Αβ nebo T-buněk reagujících sAp. Termín označení se vztahuje k jakémukoli psanému či jinak zaznamenanému materiálu, který je k sadě připevněn nebojinak připojen, a to kdykoli během její výroby, převozu, prodeje a použití. Termín označení zahrnuje reklamní letáky a brožury, balicí materiály, návody, audio nebo video kazety, počítačové disky, stejně tak jako nápisy nacházející se přímo na sadě.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I: Protilátkový titr u transgenních myší po injekci Αβί až 42.

-41 CZ 302971 Β6

Obr. 2: Amyloidní zátěž v Hipokampu. Procento hipokampální oblasti obsazené amyloidními plaky, určenými reaktivitou s Αβ-specifíckou monoklonální protilátkou 3D6, bylo určeno pomocí počítačové kvantitativní analýzy obrazu. Hodnoty pro jednotlivé myší jsou zobrazeny v jednotlivých léčebných skupinách. Horizontální Čára u každé skupiny zobrazuje střední hodnotu rozdělení.

Obr. 3: Neuritická dystrofie v hipokampu. Procento hipokampální oblasti obsazené dystroťickými neurity, určenými reaktivitou s lidskou APP-specifickou monoklonální protilátkou 8E5, bylo určeno pomocí počítačové kvantitativní analýzy obrazu. Hodnoty pro jednotlivé myši jsou zobrazeny zvlášť pro skupinu vystavenou působení ANI792 a kontrolní skupinu vystavenou působení PBS. Horizontální čára u každé skupiny zobrazuje střední hodnotu rozdělení.

Obr. 4: Astrocytóza v retrospleniální kůře. Procento korové oblasti obsazené astrocyty pozitivními na gliální vláknitý acidický protein (GFAP) bylo určeno pomocí počítačové kvantitativní analýzy obrazu. Hodnoty pro jednotlivé myši jsou zobrazeny v jednotlivých léčebných skupinách a horizontální čára u každé skupiny zobrazuje střední hodnotu rozdělení.

Obr. 5: Geometrické průměry proti látkových titrů proti Αβ42 po imunizaci pohybující se v rozmezí 8 dávek Αβ42 („AN 1792“) obsahujících 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11,33, 100 nebo 300 pg.

Obr. 6: Kinetika protilátkové odpovědi na imunizaci pomocí ANI 792. Titry jsou vyjádřeny jako geometrické průměry každé skupiny čítající 6 zvířat.

Obr. 7: Kvantitativní analýza obrazu korové amyloidní zátěže u myší vystavených působení PBS nebo ANI792.

Obr. 8: Kvantitativní analýza obrazu zatížení neuritickými plaky u myší vystavených působení PBS nebo ANI792.

Obr. 9: Kvantitativní analýza obrazu procenta retrospleniální kůry obsazeného astrocytózou u myší vystavených působení PBS nebo ANI792.

Obr. 10: Analýza lymfocytární proliferace v buňkách sleziny vystavených působení ANI792 (horní část) nebo PBS (dolní část).

Obr. 11: Totální hladiny Αβ v mozkové kůře. Bodový diagram jednotlivých Αβ profilů u myší imunizovaných s Αβ nebo APP deriváty kombinovanými s Freundovým adjuvantem.

Obr. 12: Amyloidní zátěž v kůre určená pomocí kvantitativní analýzy obrazu mozkových řezů u myší imunizovaných s konjugáty Αβ peptidu (Αβί až 5, Αβ13 až 28); Αβ agregáty o plné délce - Αβ42 („AN 1792“) a Αβ 1 až 40 („AN 1528“) a léčebná skupina vystavená působení PBS.

Obr. 13: Geometrické průměry titrů protilátky specifické pro Αβ u skupin myší imunizovaných s Αβ nebo APP deriváty kombinovanými s Freundovým adjuvantem.

Obr. 14: Geometrické průměry titrů protilátky specifické pro Αβ u skupin morčat imunizovaných s ΑΝ 1792 nebo jeho palmitoylovaným derivátem kombinovaným s různými adjuvanty.

Obr. 15 (A-E): Hladiny Αβ v kůře 12 měsíců starých PDAPP myší vystavených působení ANI792 nebo ANI528 s různými adjuvanty.

Obr. 16: Průměrný titr u myší léčených polyklonální protilátkou proti Αβ.

Obr. 17: Průměrný titr u myší léčených monoklonální protilátkou 10D5 proti Αβ.

-42CZ 302971 B6

Obr. 18: Průměrný titr u myší léčených monoklonální protilátkou 2F12 proti Αβ.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 io Proťylaktická účinnost Αβ proti Alzheimerově chorobě (AD)

Tyto příklady popisují podávání peptidu Αβ42 transgenní myši overexprimující APP s mutací v pozici 717 (ΑΡΡγρ ,ρ), která vede k neuropatologií shodné s Alzheimerovou chorobou. Vytváření a charakteristika těchto myší (PDAPP myši) je popsána v Games et al., Nátuře, viz výše.

Tato zvířata (ve své heterozygotní formě) začínají ukládat Αβ od šestého měsíce věku. Ve věku 15 měsíců již vykazují ukládání Αβ v hladinách odpovídajících Alzheimerově chorobě. PDAPP myším byl injikován agregovaný Αβ42 (agregovaný Αβ42) nebo solný roztok pufrovaný fosfátem. Agregovaný Αβ42 byl vybrán pro svoji schopnost vyvolat tvorbu protilátek proti více epitopům Αβ.

A. Metody 1. Myši

2s Třicet PDAPP heterogenních myších samic bylo náhodně rozděleno do následujících skupin: 10 myší pro injekci agregovaného Αβ42 (jedna zemřela pri převozu), 5 myší pro injekci PBS/adjuvant nebo PBS a 10 myší jako intaktní kontrola. 5 myším byly injikovány peptidy odvozené ze sérového amyloidního proteinu (SAP).

2. Příprava imunogenů

Příprava agregovaného Αβ42: miligramy Αβ42 (US Peptides lne, lot K-42-12) byly rozpuštěny v 0,9 ml vody a objem byl doplněn do 1 ml přidáním 0,1 ml lOx PBS, Získaná směs byla vortexována a ponecháno inkubovat v 37 °C přes noc, což jsou podmínky za nichž peptid agregoval.

Nepoužitý Αβ byl skladován jako suchý lyofilizovaný prášek pri -20 °C, a to až do další injekce.

Je nutno poznamenat, že při použití takovýchto komerčně dostupných peptidů může být v suché hmotnosti započítána i hmotnost solí; hmotnosti zmiňované ve všech zde popisovaných příkladech zahrnují i hmotnosti solí (pokud není řečeno jinak). Přesná množství peptidů mohou být stanovena analýzou prostředku standardními metodami, jako třeba určením množství dusíku v porovnání s prostředkem se známý obsahem dusíku.

3. Příprava injekcí

V každé injekci, určené pro jednu myš, bylo obsaženo 100 pg agregovaného Αβ42 v PBS, emulzifikovaného v poměru 1:1 s kompletním Freundovým adjuvantem (CFA) s konečným objemem emulze určené pro první imunizaci 400 pl. První imunizace byla po dvou týdnech následována posilovači injekcí, jež obsahovala stejné množství imunogenu v nekompletním Freundově adjuvantu (IFA). Dvě další dávky v IFA byly podány v měsíčním intervalu. Následné imunizace byly so uskutečněny podáním v 500 μΙ PBS. Injekce byly aplikovány intraperitoneálně (i.p.).

PBS bylo injikováno podle stejného schématu, přičemž myším byla injikována směs PBS s adjuvantem v dávce 400 μΐ na myš nebo 500 μΐ na myš. Injekce SAP probíhaly podle stejného schématu, přičemž byla použita dávka 100 pg na injekci.

-43CZ 302971 B6

4. Titrace myší krve, preparace tkáně a imunohistochemie

Výše zmiňované metody jsou popsány níže v kapitole Všeobecný materiál a metody.

B. Výsledky

PDAPP myším byl i nj i kován buď agregovaný Αβ42 (agregovaný Αβ42), peptidy SAP, nebo solný roztok pufrovaný fosfátem. Jedna skupina PDAPP myší - pozitivní kontrola, byla poneio chána intaktní. Myší titry protilátek proti agregovanému Αβ42 byly sledovány každý další měsíc po čtvrté posilovači injekci, a to až do věku jednoho roku. Myši byly usmrceny po 13 měsících života. Ve všech sledovaných časových bodech vykazovalo osm z devíti myší vysoký titr protilátek proti Αβ42, přičemž tato hladina zůstala vysoká po celou dobu podávání injekcí (titry větší než 1:10 000). Devátá myš měla titr nízký, ale měřitelný (okolo 1:1000) (obr. 1, tabulka 3). Myši, is jimž byl injikován SAP měly titr od 1:1000 do 1:30 000, přičemž hodnotu 1:10 000 překročila pouze jedna myš.

Séra z myší léčených PBS byla titrována proti agregovanému Αβ42 po šesti, deseti a dvanácti měsících. V případě titrování (v séru ředěném 1:100) PBS myší proti agregovanému Αβ42 byla in hranice čtyřnásobku pozadí překročena pouze v jednom časovém bodě, přičemž v ostatních případech nebyla tato hranice překročena v žádném Časovém bodě (tabulka 3). Odpověď specifická pro SAP byla v těchto časových bodech zanedbatelná (titry byly menší než 1:300).

Sedm z devíti myší ze skupiny léčené agregovaným Αβ1-42 nevykazovalo v mozku žádné zjis25 titelné amyloidy. Mozkové tkáně z myší ze skupin léčených SAP a PBS naopak vykazovaly početné amyloidní usazeniny v hipokampu, stejně tak jako ve frontální a cingulámí kůře. Způsob usazování byl podobný tomu, jenž byl pozorován u neléčených kontrol, tj. s charakteristickou účastí zranitelných oblastí, mezi něž patří vnější molekulová vrstva hipokampálního dentátního gyru. U jedné myši ze skupiny s injikovaným Αβί—42 bylo pozorováno velké snížení amyloidní zátěže v hipokampu. U j tné myši z téže skupiny byl pozorován osamocený plak.

Kvantitativní obrazové analýzy amyloidní zátěže v hipokampu potvrdily její dramatické snížení dosažené u zvířat léčených Αβ42 (ΑΝ 1792) (obr. 2). Střední hodnoty amyloidní zátěže ve skupině léčené PBS (2,22 %) a v nijak neléčené kontrolní skupině (2,65 %)

-44CZ 302971 B6 oo o

τΗ r© ti %

O

O o

o o

x>

o o

CM o

o o

o ir>

o o

ΙΛ %

	í	Jř -O
X	X	X
Φ	Φ	Φ
v	v	v

ex < α δ § « Š 'rt U> 8 £ H §> rt ^Λ g

£ 'a © ? «Λ £ £'5* £*=

HS 'O

O w

% in o

Ti

3fc co o

τΐ

4t

CM ©

4fc

4fc ©

o

Ti

4fc

Ρμ ω ^>S S ©

©

O ©

<n ©

© o

ΜΊ ©

© o

oo ©

©

O ©

vs ©

r© ©

©

ΦΊ ©

©

O

ΙΛ ©

© ©

v>

a\ ©

o ©

©

CM ©

© ©

ΙΓΊ

O

O ©

© ©

u-i ©

© ©

©

V) ©

© ©

O rCM vs tm ri %

© ©

m ©

© ©

LTJ <o ©

o ©

VS ©

© ©

s ©

©

Ό ©

o ©

©

Ό ©

©

O ir>

vs ©

© ©

©

CO ©

O ©

©

CM oo

CM \o w

*-4 %

í		eso -X x>
X	X	X
tj-	Φ	Φ
V	v	v

wM X

X>

X

Φ

V

X co tM tM

4fc

X	£	OO .X X
X	X	X
Φ	VS	Φ
v		v

Pm Xí ní > 3 s

CM byly oproti skupině imunizované ANI792 (0,00 %, p = 0,0005) významně vyšší. Střední hodnoty amyloidní zátěže dosahovaly ve skupině imunizované SAP peptidy (SAPP) hodnot 5,74 %.

Mozková tkáň z neléčených kontrolních myší obsahovala četné usazeniny amyloidu Αβ, vizualizované pomocí Αβ-specifické monoklonální protilátky (mAb) 3D6 v hipokampu, stejně tak jako i v retrospleniální kůře. Podobný způsob usazování byl pozorován rovněž u myší imunizovaných SAPP nebo PBS (obr. 2). Tři posledně zmiňované skupiny byly charakteristické účastí zranitelných podoblastí (což je typické u AD), mezi něž patří vnější molekulová vrstva hipokampálního io dentátního gyru.

-45CZ 302971 B6

Mozky, které neobsahovaly žádné amyloidní usazeniny, postrádaly také neuritické plaky, jenž jdou běžně vizualizovat pomocí protilátky 8E5 proti lidskému APP. Všechny mozky z ostatních skupin (s aplikovaným SAP nebo PBS a kontrolní skupina) měly početné neuritické plaky, typické pro ne léčené PDAPP myši. Malé množství neuritických plaků bylo přítomno i u jedné myši léčené ANI792 a jeden shluk neuritických plaků byl pozorován i u druhé myši z téže skupiny. Pomocí obrazové analýzy hipokampu (také viz obr. 3) byla v porovnání s PBS skupinou (střední hodnota 0,28%, p = 0,005) prokázána účinná eliminace dystrofických neuritů u myší léčených ΑΝ 1792 (střední hodnota 0,00 %).

U skupin léčených injekcemi Αβ1-42 nebyla přítomna ani astrocytóza, která je charakteristická pro záněty spojené s plaky. Mozky myší z ostatních skupin obsahovaly husté a shloučené GFAPpozitivní astrocyty, typické pro gliózu spojenou s plaky Αβ. Část sklíček s na GFAP pozitivně reagujícími astrocyty byla pro lokalizaci plaků Αβ dále obarvena Thioflavinem S. GFAP-pozitivní astrocyty byly spojeny s Αβ plaky u skupin léčených SAP, PBS a v intaktních kontrolách. Žádné takové spojení nebylo nalezeno u myší léčených Αβ1-42, přičemž, u jedné myši léčené ANI792 byla zjištěna minimální glióza spojená s plaky.

Obrazové analýzy retrospleniální kúry (obr. 4) potvrdily, že snížení výskytu astrocytózy bylo významné, což je zřejmé jestliže porovnáme průměrné hodnoty jejího výskytu u myší léčených ANI792 (1,56%) a myší imunizovaných SAP peptidy, PBS nebo myší intaktních (všechny tři skupiny > 6 %, p = 0,0017).

Údaje ze vzorku myší, jimž byly injikovány Αβ1^42 a PBS ukázaly, že MHC II Ímunoreaktivita spojená s plakem se u ΑβΙ-42 myší nevyskytovala, což odpovídá nepřítomnosti zánětlivé reakce spojené s Αβ.

Na řezech z myších mozků bylo zkoušeno zda pozitivně reagují s mAb, představující specifickou monoklonální protilátku MAC-1 (protein v buněčné membráně). MAC-1 (CD1 lb) patří do rodiny integrinů a vyskytuje se spolu s CD18 jako heterodimer. Komplex CD1 lb/CD18 je přítomen na monocytech, makrofázích, neutrofilech, a NK-buňkách (přirození zabíječi) (Mak a Simard). MAC-l-pozitivní buněčné typy v mozku jsou pravděpodobně mikroglie, což plyne z jim podobné morfologie pozorované na řezech, kde došlo k pozitivní reakci s protilátkou proti MAC-1. U myší léčených ΑΝ 1792 bylo možno ve srovnání s kontrolní skupinou PBS pozorovat nižší výskyt MAC-1 imunoreaktivity, což odpovídá nepřítomnosti zánětlivé reakce spojené s Αβ.

C. Závěr

Nepřítomnost plaků Αβ a reaktivních neuronálních a gliotických změn v mozcích myší, jimž byl injikován Αβ I-42, značí, že v jejich mozcích nedošlo (nebo pouze v extrémně malém množství) k uložení amyloidu, přičemž s tím souvisí i absence patologických následků případného ukládání, tj. např. glióza a neuritická patologie, PDAPP myši léčené pomocí Αβί—42 prokázaly naprosto shodnou nepřítomnost patologie jako kontrolní netransgenní myši. Injekce Αβ1^42 jsou takto vysoce účinné při prevenci ukládání nebo očišťování lidského Αβ z mozkové tkáně, a také při odstraňování tímto způsobených neuronálních a zánětlivých degenerativních změn. Podávání peptidu Αβ může tedy mít tedy být použito při prevenci a léčbě AD.

Příklad 2

Studie závislosti na dávce

Skupiny samic myší Swiss Webster starých pět týdnů (N = 6 ve skupině) byly imunizovány 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 nebo 0,13 pg Αβ připraveným v CEA/IFA a podaným intraperitoneálně. Tri dávky byly podány ve čtrnáctidenních intervalech, čtvrtá dávka byla podána o měsíc později.

-46CZ 302971 B6

První dávka byla emulziftkována s CFA, další dávky byly emulzifikovány s IFA. Zvířatům byla pro měření titru protilátek odebírána krev vždy 4 až 7 dní po každé imunizaci, tak, že první odběr byl proveden po druhé dávce. Části zvířat z každé ze tri skupin, která byla imunizována 11,33 nebo 300 gg antigenu, byla krev odebrána ještě ve čtyřech měsíčních intervalech následně po čtvrté imunizaci, za účelem sledování poklesu protilátkové odpovědi v případě různých dávek imunogenních prostředků. Tato zvířata obdržela poslední pátou imunizaci v sedmém měsíci po zahájení studie. O týden později byla zvířata za účelem měření proti látkových odpovědí proti ΑΝ 1792 a po provedení toxikologických analýz.

U dávek od 300 do 3,7 pg byla pozorována odpověď klesající s dávkou, přičemž u dvou nejnižších dávek nebyla pozorována odpověď žádná. Průměrné protilátkové titry po 3 dávkách okolo 1:1000 a po 4 dávkách 11 až 300 pg antigenu okolo 1:10 000 (obr. 5).

Protilátkové titry u všech skupin /kromě skupiny s nejnižší dávkou) po třetí imunizaci dramaticky vzrostly, stím že zvýšení geometrického průměru titrů (GMT) bylo 5ti až 25ti násobné. Nízká protilátková odpověď byla zjistitelná dokonce i u recipientů, kteří dostali dávku 0,4 pg. Skupiny s dávkami 1,2 a 3,7 pg měly porovnatelné titry s GMT okolo 1000, skupiny s nejvyššími obdrženými dávkami se spojily do GMT okolo 25 000, s výjimkou skupiny s dávkou 33 pg, jejíž GMT byl 3000. Po čtvrté imunizaci byl u všech skupin vzrůst titru více pozvolný. Jasná závislost na dávce byla pozorována u skupin s nižšími dávkami antigenu (od 0,14 do 11 pg) sahající od žádné zjistitelné odpovědi (u 0,14 pg) až k GMT 36 000 (11 pg). Titry čtyř nejvyšších skupin (11 až 300 mg) splývaly opět dohromady. Po dvou imunizacích tedy protilátkový titr vykazoval závislost na dávce antigenu u skupin od 0,4 do 300 pg. Po třetí imunizaci byly titry čtyř nejvyšších skupin srovnatelné a po další imunizaci tvořily plató.

Měsíc po čtvrté imunizací byly u skupiny s 300 pg titry 2 až 3krát vyšší, než když byly stanovovány z krve odebrané pět dní po imunizaci (obr. 6). Toto zjištění napovídá, že nejvyšší protilátková odpověď se objevuje později než 5 dní po imunizaci. Mírnější (50%) vzestup byl ve stejném čase pozorován u skupiny s dávkou 33 pg. Po dvou měsících po poslední dávce, klesly GMT u skupiny s 300 pg prudce o 70 %. Po dalším měsíci byl pokles mírnější, a to 45% (100 pg) a asi 14% (33 a 11 pg). Rychlost poklesu cirkulujících proti látkových titrů po ukončení imunizace se zdá mít bifázický průběh s prudkým poklesem v prvním měsíci po nejvyšší protilátkové odpovědi, následovaným poté mírnějším poklesem.

Protilátkové titry a k i netiká odpovědi myší Swiss Webster jsou podobné těm pozorovaným u mladých heterozygotních PDAPP transgenních myší, imunizovaných paralelním způsobem. Dávky schopné vyvolat u Člověka imunitní odpověď jsou obdobné dávkám účinným u myši.

Příklad 3

Prověření terapeutické účinnosti proti rozvinuté AD

Tato analýza je určena pro testování imunogenních činidel, konkrétně jejich účinnosti zastavit nebo zvrátit neuropatologické charakteristiky AD u starých zvířat. Imunizace s 42 aminokyselin dlouhým Αβ (ANI792) počaly v čase, kdy byly amyloidní plaky v mozcích PDAPP myší jíž přítomné.

V průběhu této studie vzniklo u neléčených PDAPP myší množství neurodegenerativních změn podobných těm, které lze nalézt při AD (Games et al., viz výše a Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1550 až 1555, 1997). Ukládání Αβ v amyloidních plácích je spojeno s degenerativní neuronální odpovědí zahrnující aberantní axonální a dendritické elementy, nazývané dystrofické neurity. Amyloidní usazeniny, které jsou obklopeny a také obsahují dystrofické neurity, se nazývají neuritické plaky. U AD i PDAPP myši mají dystrofické neurity zretel-47CZ 302971 B6 nou giobulámí strukturu, jsou imunoreaktivní s určitými protilátkami rozpoznávajícími APP a cytoskeletální složky a vykazují komplexní subcelulární degenerativní změny na ultrastrukturální úrovni. Tyto charakteristiky dovolují s nemocí související selektivní, reprod ukováte lné měření tvorby neuronálních plaků v mozcích PDAPP myší. Dystrofická neuronální složka PDAPP neuritických plaků je pomocí protilátky specifické pro lidský APP (monoklonální protilátka 8E5) snadno vizualizovatelná a s pomocí počítačové analýzy obrazu snadno měřitelná. Kromě měření ANI 792 na tvorbu amyloidních plaků jsme měřili i účinky této léčby na vývoj neuritické dystrofie.

Astrocyty a mikroglie jsou buňky odlišné od neuronů, které odpovídají a reagují na neuronální poškození. GFAP-pozitivní astrocyty a MHC (I—pozitivní mikroglie jsou při AD běžně pozorovatelné ajejich aktivace se zvyšuje s vážností onemocnění. Proto jsme u myší léčených ANI 792 pozorovali také vývoj reaktivní astrocytózy a mikrogliózy.

A. Materiál a metody samic heterozygotních PDAPP myší, ve věku od 11 do 11,5 měsíců a získané z Charles River Laboratories, bylo náhodně rozděleno do dvou skupin: 24 myší pro imunizaci se 100 pg ANI792 a 24 myší pro imunizace s PBS, v obou případech v kombinaci s Freundovým adjuvantem. Skupiny s ANI792 a PBS byly opět rozděleny po dosažení cca 15 měsíce věku. V 15 měsíci věku byla přibližně polovina zvířat z každé skupiny usmrcena (n = 10 pro ANI792 a n = 9 pro PBS), přičemž u druhé poloviny (n = 9 pro ΑΝ 1792 a n = ] 2 pro PBS) se pokračovalo v imunizacích až do 18 měsíce. 8 zvířat (5 ANI792 a 3 PBS) během studie zemřelo. Kromě imunizovaných zvířat byly pro porovnání ELISA testů na množství Αβ a APP v mozku do studie přidány ještě intaktní PDAPP myši staré jeden rok (n = 10), 15 měsíců (n = 10), 18 měsíců (η = 10); jednoroční zvířata byla zahrnuta také v imunohistochemických analýzách.

Použitá metodologie byla shodná jako v příkladu 1 (pokud není zmíněno jinak), ANI 792 od US Peptides (kat. č. 12) a California Peptides (kat. č. ME0339) byly použity pro přípravu antigenů určeného pro šest imunizací provedených před 15 měsícem. Výrobky ME0339 a ME0439 od California Peptides byly použity pro tři dodatečné imunizace provedené mezi 15 a 18 měsícem.

100 pg ΑΝ 1792 ve 200 μΐ PBS nebo PBS samotné bylo emulzifíkováno 1:1 (objem) s kompletním Freundovým adjuvantem (CFA) nebo s nekompletním Freundovým adjuvantem (IFA) nebo s PBS s konečným objemem emulze 400 μΙ. Adjuvantem při první imunizaci bylo CFA, další dvě dávky byly podány v IFA a poslední čtyři dávky v samotném PBS bez adjuvantu. Celkově imunizace proběhla během sedm i měsíčního intervalu devětkrát, přičemž první tří injekce ve dvoutýdenním intervalu, další injekce pak v měsíčním intervalu. Skupina léčená pouze čtyři měsíce a usmrcená v 15 měsíci věku se podrobila pouze prvním šesti imunizacím.

B. Výsledky

1. Účinek léčby pomocí Αβ42 (ΑΝ 1792 na amyloidní zátěž

Účinky léčby ANI792 na korovou amyloidní zátěž, určené pomocí kvantitativní analýzy obrazu jsou uvedeny na obr. 7. Průměrná hodnota korové amyloidní zátěže byla u skupiny intaktních 12ti měsíčních PDAPP myší 0,28 %, což reprezentuje plakovou zátěž myší při započetí studie. U 18ti měsíčních PBS myší vzrostla amyloidní zátěž více než 17krát na 4,87 %, zatímco u myší léčených ANI 792 došlo k velkému snížení amyloidní zátěže (0,01 %), což je v porovnání s 12ti měsíčními intaktními myšmi a 15ti a 18ti měsíčními myšmi léčenými PBS pozoruhodně málo. Amyloidní zátěž byla v 15 (96% snížení; p = 0,003) i v 18 (>99% snížení; p - 0,0002) měsíci u příjemců ΑΝ 1792 významně snížena.

Korové ukládání amyloidu začíná u PDAPP myší typicky ve frontální a retrospleniální kůře (RSC) a pokračuje ventrolaterálním směrem ktemporální a entorhinální kůře (EC). V EC 12

-48CZ 302971 B6 měsíců starých myší, což je věk, ve kterém bylo prvně podáno ANI 792, nebyl nalezen amyloid žádný nebo jen v malém množství. Po čtyřech měsících léčby ANI792 bylo zásadně sníženo amyloidní ukládání v RSC, přičemž postupné usazování amyloidu v EC bylo podáváním ANI792 zcela eliminováno. Posledně zmíněné pozorování ukazuje, že ANI792 úplně zastavilo postupné ukládání amyloidu, jež by za normálních okolností postoupilo do temporální a ventrální kůry. Podávání ANI792 také zastavilo a pravděpodobně i zvrátilo ukládání amyloidu v RSC.

Zásadní účinky ΑΝ 1792 na postup ukládání amyloidu v kůře u PDAPP myší je dále doloženo na 18ti měsíční skupině, jež byla léčena po sedm měsíců. Myš léčená pomocí ANI792 vykazovala skoro kompletní absenci korového amyloidu, naprostou absenci d i fuzních plaků a snížení množství existujících usazenin.

3. Buněčné a morfologické změny spojené s léčbou pomocí Αβ42 (ANI792)

V částech mozku, jež jsou typické výskytem amyloidních usazenin byla nalezena populace Αβ-pozitivních buněk. Je pozoruhodné, že u několika mozků z myší léčených ANI792 nebylo nalezeno žádné množství extracelu lamích korových plaků nebo jen malé množství. Zdá se, že většina imunoreaktivity byla lokalizována na vnitřek buněk s velkým laločnatým nebo shlučeným sómatem. Fenotypicky se tyto buňky podobaly aktivovaným mikrogliím nebo monocytům. Imunoreaktivní protilátky specificky rozeznávající ligandy exprimované aktivovanými monocyty a mikroglií (MHC II a CD1 lb) a byly příležitostně spojeny se stěnou nebo lumen krevních kapilár. Porovnání přilehlých řezů označených protilátkami specifickými pro Αβ a MHC II odhalilo, že obě protilátky se vázaly na stejné typy buněk. Podrobné prozkoumání mozků vystavených působení ANI792 vedlo k zjištění, že výskyt MHC II—pozitivních buněk byl u těchto zvířat omezen a okolí zbylých amyloidu. Za použitých podmínek fixace nebyly buňky imunoreaktivní na protilátky specificky rozeznávající ligandy T-buněk (CD3, CD3e) nebo B-buněk (CD45a, CD45RB) nebo na obvyklý leukocytámí antigen (CD45), ale reagovaly s protilátkou rozeznávající leukosialin (CD43), která křížově reaguje s monocyty. Žádné takové buňky nebyly nalezeny u myší vystavených působení PBS.

PDAPP myši vytvářejí stále rozsáhlé amyloidní usazeniny ve vnější molekulové vrstvě dentátního gyru. Usazeniny tvoří zřetelný pruh v perforované dráze, což je podoblast, který pri AD klasicky obsahuje amyloidní plaky. Charakteristický vzhled těchto usazenin u myší vystavených působení PBS připomínal ten, který byl již dříve popsán u neléčených PDAPP myší. Amyloidní usazeniny sestávaly z difúzních i kompaktních plaků v souvislém proužku. U mnoha mozků z myší léčených ANI792 byl naopak tento vzhled drasticky pozměněn. Hipokampální amyloidní usazeniny již neobsahovaly difúzní amyloidy a proužkovité uspořádání bylo zcela roztrháno. Místo toho bylo přítomno množství neobvyklých tečkovaných struktur, které reagovaly s protilátkami proti Αβ, přičemž se zdálo, že některé z nich jsou buňkami obsahujícími amyloid.

MHC Il-pozitivní buňky byly u zvířat léčených ANI792 opakovaně pozorovány v sousedství extracelulámí ho amyloidu. Způsob sdružení Αβ-pozitivních buněk s amyloidem byl velmi podobný tomu, jenž bylo možno pozorovat u některých mozků získaných z myší vystavených působení ANI792. Výskyt těchto monocytů byl omezen na oblast přilehlou k amyloidní usazenině, přičemž v jiných mozkových oblastech postrádajících plaky Αβ, byl zcela nulový.

Kvantitativní analýza obrazu řezů označených protilátkami proti MHC I a MHC II odhalila tendenci popsanou vzrůstající imunoreaktivitu v RSC a v hipokampu u myší vystavených působení ΑΝ 1792, v porovnání se skupinou myší léčených pomocí PBS, jenž vykazovala pouze významné zvýšení MHC I-imunoreaktivity v hipokampu.

Tyto výsledky jsou důkazem aktivního, buněčně zprostředkovaného odstranění amyloidu z mozkových oblastí kde se vyskytoval.

-49CZ 302971 B6

3. Účinky AN] 792 na hladiny Αβ: ELISA testy (a) Hladiny v mozkové kůre

Průměrná hodnota celkového množství Αβ v kůre PDAPP myší byla ve 12 měsíci 1600 ng/g a v 15 měsíci vzrostla na 8700 ng/g (tabulka 4). V 18 měsíci byla tato hodnota 22 000 ng/g, což je od počátku experimentu více než 10ti násobný vzestup. Celkové množství Αβ u zvířat léčených PBS bylo v 15 měsíci 8600 ng/g, s tím, že toto množství vzrostlo v 18 měsíci na 19 000 ng/g. Celkové množství Αβ u zvířat léčených ANI 792 bylo v 15 měsíci 1600 ng/g, což je io o 81 % méně než v případě PBS. U zvířat léčených ANI792 bylo v 18 měsíci celkové množství Αβ 5200 ng/g, což je o v porovnání se skupinou léčenou PBS významně méně (o 72 %, p = 0,0001) (viz tabulka 4). Obdobné výsledky byly u těchto dvou skupin nalezeny při porovnávání hladin Αβ v kůře. V tomto případě však byly rozdíly hladin Αβ významné v 15 (p = 0,04) i měsíci (p = 0,0001, tabulka 4).

(b) Hladiny v hipokampu

U intaktních PDAPP myší byly ve 12 měsíci průměrné hodnoty celkového množství Αβ 15 000 ng/g a v měsíci vzrostly na 51 000 ng/g a ještě dále v 18 měsíci na 81 000 ng/g (tabul20 ka 5). PBS myši vykazovaly v těchto časových bodech hodnoty 40 000 ng/g (15 měsíc) respektive 65 000 ng/g (18 měsíc). Zvířata imunizovaná ANI792 vykazovala nižší celková množství Αβ, a to 25 000 ng/g (15 měsíc) a 51 000 ng/g (18 měsíc). Hodnota Αβ byla u skupiny léčené ANI792 v 18 měsíci významně nižší než u skupiny léčené PBS (p-0,0105, tabulka 5). Měření Αβ42 dávalo výsledky obdobného typu, tj. jeho

-50CZ 302971 B6 ci

CN

CN r- tj·

CX

Z <

o o

o

Tt*

CN

OS r·£· o

O

Tabulka 4

Střední hodnoty hladin Αβ v kůře (ng/g) tí

CN tT

CX

O\ CN

O

CN

CO o

Os in o

o

SO

OO

O o

<ZS

OS m

I rt

H a

'w' a

CL a

« o

o, >

CQ.

.2

Ό

4» (Λ «

Cm o o o —Λ Í —Λ *

O c

Ό o

<u	CN	O	o	O
ÍSÍ	Ν'	O	o	o
Ní	CO.	m	Γ*Ί	ΙΖΊ
	<	t—4	OO	00 τ*·Μ

fl

Ό

4>

>C cz>

fl

V *w

Ní

7Í

o	O	O	O
O	o	o	o
VO	Γ-	CN
—	ΟΟ	CN CN

CN . o

Tf O O O

VS Λ

O o

CN

Ut

CL Cl,

<7		O
&			O
			<
CN Tfr CX		o o	« o o Os
<		CN CN	oo m
		O	» O
	O	O
Q		m	Os
		N*	O
<u		CN	*n
O
'c'		Os	CN

		O	o
CN N		o	o
	Γ-	r—i
CQ.		V)	r-
<		m
		o	o
>		o	o
O			Ν'
£		o	*n
υ		rt	so
O
'fl'	O	O	O
	t—M	t—4	’^—l
	O	O	O
CN	o	O	O
a.		'φ	fN
	xt	Ν’
<	T-^	Ν'	Ό
	O	O	O
o	o	O	o
	ΖΊ	sn	OO
4>	>ZS		O
O	^MM*Í	m	OO
44
XD	CN	W	00
>

= 0,0105 = 0,00221 cx ct «

-51 CZ 302971 B6 os c£X

I <υ

O r-γ oo •Ί

Ol

Os —>

SO

JŽ a

Λ

H

O a
> GX	ζβ
.a Ό OS 43	fe	ex
O		á	00 o
fl		υ
Ό O 43 fl		O	Ol
>U		Ή °	O
w ΐΛ			1“^

m s

Κ» *4Í ·£ ΰ

SO ·%

W>

ft

WO co oo xu >

WO fe hladina byla v 18. měsíci u skupiny léčené ANI792 v porovnání se skupinou léčenou PBS významně nižší (39 000 ng/g oproti 57 000 ng/g, p = 0,002) (tabulka 3).

(c) Hladiny v mozečku

Průměrné hodnoty celkového množství Αβ v mozečku byly u neléčených PDAPP myší ve

12. měsíci 15 ng/g (tabulka 6). V 15 měsíci vzrostlo toto množství na 28 ng/g a v 18 měsíci na io 35 ng/g. U zvířat léčených PBS byly naměřeny průměrné hodnoty 21 ng/g (15 měsíc) a 43 ng/g (18 měsíc). Zvířata léčená ΑΝ 1792 měla v mozečku v 15 měsíci 22 ng/g celkového Αβ a v měsíci významně nižší (p - 0,002) množství než skupina léčená PBS, a to 25 ng/g (tabulka 6).

-52 CZ 302971 B6

4. Účinky léčby pomocí ANI792 na hladiny APP

Jak molekula APP—a, tak i molekula APP plné délky obsahují Část nebo celou sekvenci Αβ, takže mohou být při imunitní odpovědi proti ANI792 potenciálně zasaženy. Současné studie popisují mírný vzestup hladiny APP jako neuropatologii u PDAPP myší. Hladiny APP-a/FL (plná délka) nebo APP-a v kůře zůstaly po léčbě v podstatě nezměněny, pouze v případě APP-ct byla u myší léčených ANI792 v 18 měsíci naměřena o 19 % nižší hladina než u myší léčených PBS. Hodnoty APP u myší léčených ANI792 nebyly v 18 měsíci významně odlišné od hodnot naměřených u myší neléčených (ve 12 a 15 měsíci) a u myší léčených PBS (v 15 měsíci). Ve všech případech zůstaly hladiny APP v mezích, které lze normálně nalézt u PDAPP myší.

5. Účinky léčby pomocí ANI792 na neurodegenerativní a gliotické změny

L myší léčených ΑΝ 1792 došlo ve frontální kůře v porovnání s PBS skupinou k významnému snížení neuritické plakové zátěže, a to v 15 (84%; p = 0,03) i 18 měsíci (55%; p = 0,01) (obr. 8). Průměrné hodnoty neuritické plakové zátěže vzrostly u skupiny PBS mezi 15 a 18 měsícem z 0,32 % na 0,49 %. U skupiny léčené ANI792 však došlo k zásadnímu snížení množství neuritíckých plaků, přičemž průměrné hodnoty neuritické plakové zátěže byly 0,05 % (15 měsíc) a 0,22% (18 měsíc).

Imunizace pomocí ΑΝ 1792 v porovnání se skupinou léčenou PBS významně snížila reaktivní astrocytózu v RSC, a to v 15 (o 56 %; p - 0,011) i v 18 měsíci (o 39 %; p = 0,028) (obr. 9). Průměrné percentuální hodnoty astrocytózy v PBS skupině vzrostly mezi 15. a 18. měsícem z 4,26 % na 5,21 %. Léčba pomocí ANI 792 potlačila rozvoj astrocytózy v obou časových bodech, a to na 1,89 % respektive na 3,2 %. To značí, že pri léčebném procesu nedocházelo k poškození neuropilu.

6. Protilátkové odpovědi měsíců staré, heterozygotní PDAPP myší (n = 24) byty podrobeny sérii 5 imunizací se 100 gg ANI792 emulzifikovaném ve Freundově adjuvantu, přičemž aplikace probíhala intraperitoneálně v týdnech 0, 2, 4, 8 a 12, s tím, že pri šesté imunizaci (v 16 týdnu) byl Freundův adjuvant nahrazen PBS. Jako negativní kontrola sloužilo 24 transgenních myší stejného věku, jež byly imunizovány PBS emulzifíkovaném se stejnými adjuvanty a ve stejném Časovém schématu. Krev byla zvířatům odebírána mezi třetím a sedmým dnem po každé imunizaci, počínaje druhou dávkou. Protilátkové odpovědi na ANI792 nebyly měřeny pomocí ELISA. Geometrický průměr titrů (GMT) byl u zvířat imunizovaných ANI792 po druhé, třetí a poslední (šesté) dávce přibližně 1900, 7600 a 45 000. L kontrolních zvířat nebyly po Šesté imunizaci naměřeny Žádné protilátky specifické pro Αβ. Přibližně polovina zvířat byla léčena po další tří měsíce, přičemž imunizace probíhaly ve 20, 24 a 27 týdnu. Každá z těchto dávek byla podána v samotném PBS, tj. bez Freundova adjuvantu. Průměrné protilátkové titry zůstaly během této periody nezměněny. Ve skutečnosti se zdálo, že protilátkové titry zůstaly v období od páté do deváté imunizace nezměněny.

L části řezů z myší léčených ANI792 a PBS bylo zkoušeno zda pozitivně reagují s protilátkou specifickou pro myši IgG, a to za účelem zjištění zda Αβ-specifické protilátky, vyvolané v myších působením ANI792, byly také spojeny s mozkovými amyloidními plaky. Na rozdíl od skupiny léčené PBS, byly Αβ plaky v mozcích vystavených působení ΑΝ 1792 pokryté endogenním IgG. Tento rozdíl mohl být u obou skupin pozorován v 15. i 18. měsíci. Zvláště překvapující byla nepřítomnost IgG u skupiny léčené PBS, přestože mozky těchto myší obsahovaly rozsáhlé amyloidní usazeniny. Tyto výsledky prokazují, že imunizace pomocí syntetického proteinu Αβ vede ke vzniku protilátek, které rozeznávají a váží se na Αβ v amyloidních usazeninách.

-53 CZ 302971 B6

7. Buněčně zprostředkované imunitní odpovědi

Z devíti myší (18 měsíční PDAPP myši) imunizovaných ANI 792 a z 12 myší imunizovaných PBS byly sedm dní po deváté imunizaci vyjmuty sleziny. Splenocyty byly izolovány a kultivovány po 72 h v přítomnosti Αβ40, Αβ42, nebo Αβ40-1 (protein s obrácenou sekvencí). Mitogen Con A sloužil jako pozitivní kontrola. Optimálních odpovědí bylo dosaženo s méně než 1,7 μΜ proteinem. Buňky ze všech devíti zvířat léčených ANI792 odpovídaly na aplikaci proteinu ΑβΙ až 40 nebo Αβί až 42 proliferaci, přičemž hodnoty inkorporaee obou proteinů byly shodné (obr. 10, homí část). Aplikací reverzního proteinu Αβ40-1 nebylo docíleno žádné odpovědi. Buňky z kontrolních zvířat nijak nereagovaly na žádný z Αβ proteinů (obr. 10, spodní část).

C. Závěr

Výsledky této studie ukazují, že imunizace pomocí ANI792 vede u PDAPP myší, jež se vyznačují výskytem amyloidních usazenin, k zpomalení a prevenci postupného ukládání amyloidu, přičemž s arnyloidem související neuropatologické změny jsou také odvráceny. Imunizace s ANI792 podstatně zastavila amyloidní ukládání ve strukturách, které by za normálních okolností podlehly amyloidóze. Podávání peptidu Αβ je tedy prospěšné při léčbě AD.

Příklad 4

Studie fragmentů Αβ

100 PDAPP myší ve věku od 9 do 11 měsíců bylo za účelem určení epitopů vedoucích k účinné odpovědi pomocí fragmentů APP a Αβ, jež obsahovaly 9 různých oblastí těchto molekul. Injekce obsahující 9 různých imunogenů a kontrolu byly aplikovány i.p. Imunogeny zahrnovaly čtyři lidské konjugáty peptidu Αβ, a to 1 až 12, 13 až 28, 32 až 28, 32 až 42, 1 až 5, přičemž všechny byly cystě i novými můstky připojeny k ovčímu IgG specifickému proti myšímu, dále APP polypeptid s aminokyselinami 592 až 695, agregovaný lidský Αβ1-40, a agregovaný lidský Αβ25-35, a agregovaný hlodavčí Αβ42. Agregované Αβ42 a PBS byly použity jako pozitivní, resp. negativní kontroly. Každou léčebnou skupinu tvořilo deset myší. Titry byly monitorovány jak již bylo uvedeno výše a myši byly usmrceny na konci čtvrtého měsíce podávání injekcí. Histochemie, hladiny Αβ, a toxiko logické analýzy byly provedeny posmrtně.

A. Materiál a metody

1. Příprava imunogenů

Příprava spojených Αβ peptidů: čtyři konjugáty lidského Αβ (aminokyselinové zbytky I až 5, 1 až 12, 13 až 28, a 33 až 42, každý konjugovaný s ovčím IgG specifickým proti myšímu) byly připraveny spojením přes cystein (syntetický), který byl k peptidu Αβ přidán pomocí spojovací Činidlo sulfo-EMCS. Deriváty Αβ peptidu byly nesyntetizovány s níže uvedenou výslednou sekvencí. U každé sekvence je podtržením zvýrazněn vložený cysteinový zbytek. Derivát Αβί3-28 měl před koncovým cysteinem na karboxylovém konci ještě dva glycinové zbytky, což je také znázorněno.

-54CZ 302971 B6

Αβί-12 peptid

Αβ1-5 peptid Αβ33-42 peptid

Αβ13-28 peptid

NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEQ ID NO; 30)

NH2-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO: 31) NH2-C-aminoheptanoiková kyselina -GLMVGGVVIA-COOH (SEQ ID NO: 32) Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 33)

Při přípravě spojovací reakce bylo 10 mg ovčího IgG specifického proti myšímu (Jackson Immu5 noResearch Laboratories) dialyzováno přes noc s pufřem (lOmM boritan sodný, pH 8,5). Dialyzovaná protilátka byla poté za použití zkumavky Amicon Centriprep zkoncentrována do konečného objemu 2 mL 10 mg sulfo-EMCS[N(y-maleimidokuproyloxy)sukcinimidu] (Molecuiar Sciences Co.) bylo rozpuštěno v 1 ml deionizované vody. 40ti násobný molámí přebytek sulfoEMCS byl za stálého míchání po kapkách přidán k ovčímu IgG specifickému proti myšímu a io poté byl roztok míchán po dalších 10 minut Aktivovaný ovčí IgG specifický proti myšímu byl přečištěn průchodem přes 10 ml gelovou filtrační kolonu (Pierce Presto Column, získaná od Pierce Chemicals) naplněnou 0,lM NaPO₄, 5mM EDTA, pH 6,5. frakce obsahující protilátku, identifikované pomocí absorbance při 280 nm, byly shromážděny a naředěny do koncentrace ξ 1 mg/ml, a to za použití poměru 1,4 mg/OD coby extinkčního koeficientu, 40ti násobný molámí přebytek Αβ peptidu byl rozpuštěn v 20 ml 1 OmM NaPO₄, pH 8,0. přičemž výjimkou byl peptid Αβ33-42, který byl nejprve rozpuštěn v 0,5 ml DMSO a poté doplněn do 20 ml pomocí lOmM NaPO₄ pufru. Roztok každého peptidu byl přidán k 10 ml aktivovaného ovčího IgG specifického proti myšímu a dán na 4 h do míchačky (při pokojové teplotě). Výsledné konjugáty byly za použití zkumavky Amicon Centriprep zkoncentrovány do konečného obejmu menšího než

10 ml a poté dialyzovány PBS, za účelem výměny pufru a odstranění volného peptidu. Konjugáty byly za účelem sterilizace přefiltrovány přes filtr s póry o velikosti 0,22 μπι a poté rozděleny do alikvot po 1 mg, zmraženy a skladovány při -20 °C. Koncentrace konjugátů byly určeny pomocí BCA proteinové analýzy (Pierce Chemicals) s použitím koňského IgG pro standardní křivku. Konjugaci bylo možno doložit vzrůstem molekulární hmotnosti konjugovaných peptidů vztaže25 nou k molekulární hmotnosti samotného aktivovaného ovčího IgG specifického proti myšímu. Konjugát Αβί-5 a ovčího IgG specifického proti myšímu byl shromážděn ze dvou konjugací, ostatní konjugáty byly získány z jediné konjugační reakce.

2. Příprava agregovaných Αβ peptidů

Lidské peptidy l až 40 (AN1528; Califomia Peptides lne. kat. č. ME0541), t az 42 (AN1792; Califomia Peptides lne., kat. Č. ME0339 a ME0439), 25 až 35, a hlodavčí 1 až 42 (Califomia Peptides lne., kat. č. ME0218) byly za čerstva rozpuštěny za účelem přípravy jednotlivých injekcí; injekce byly připraveny z lyofilizovaných prášků, jež byly skladovány vysušené při

-20 °C. Takto byly tedy přidány 2 mg peptidu k 0,9 ml deionizované vody a směs byla následně vortexována až do vytvoření relativně uniformního roztoku nebo suspenze. V této fázi byl z těchto čtyř jediným rozpustným peptidem ANI 528. V okamžiku kdy se začal ANI 528 srážet, byl přidán 100 μΐ alikvot lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCl, 0,01M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenze byla poté znovu vortexována a inkubována přes noc při 37 °C, přičemž druhý den již mohla být použita.

Příprava proteinu pBx6: Expresní plazmid kódující pBx6, což je fúzní protein skládající se ze 100 aminokyselinové N-koncové vedoucí sekvence bakteriofágní polymerázy MS-2 následované aminokyselinami 592 až 695 z APP (βΑΡΡ), byl zkonstruován způsobem popsaným

-55CZ 302971 B6 v Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492 až 4497 (1990). Plazmid byl transfekován do E. coli a protein byl exprimován po indukci promotoru. Bakterie byly lyžovány v 8M močovině a pBx6 bylo částečně purifikováno pomocí preparativní SDS PAGE. Frakce obsahující pBx6 byly identifikovány za použití králičí polyklonální protilátky proti pBx6 na membráně pro Westemovu analýzu, shromážděny, zkoncentrovány pomocí zkumavky Amicon Centriprep a dialyzovány PBS. Čistota přípravy, určená na SDS PAGE obarvené Coomasie Blue, byla asi 5 až 10 %.

B. Výsledky a diskuze

1. Schéma studie

Sto samic a samců (ve věku 9 až 11 měsíců) heterozygotních transgenních PDAPP myší bylo získáno od Charles River Laboratory a Taconic Laboratory. Myši byly rozděleny do deseti skupin a každá skupina byla určena pro imunizaci odlišnými oblastmi Αβ nebo APP zkombinovanými s Freundovým adjuvantem. Zvířata byla rozdělena tak, aby jejich pohlaví, stáří, původ a zdroj zůstaly v rámci skupiny co nejméně odlišné. Imunogeny zahrnovaly čtyři peptidy Αβ odvozené od lidské sekvence (1 až 5, 1 až 12, 13 až 28, a 33 až 42), každý konjugovaný s ovčím IgG specifickým proti myšímu; čtyři agregované peptidy, lidský 1 až 40 (ANI528), lidský 1 až 42 (AN1792), lidský 25 až 35, a hlodavci 1 až 42; a fúzní polypeptid (pBx6), obsahující 592 až 695 aminokyselinové zbytky z APP. Desátá skupina (kontrola) byla imunizována PBS kombinovaným s adjuvantem.

Pro jednotlivé imunizace bylo 100 gg každého Αβ peptidu, rozpuštěného ve 200 μΐ PBS nebo 200 gg derivátu APP (pBx6) rozpuštěného ve 200 gl PBS nebo PBS samotné, emulzift kováno 1:1 (objem.) s Kompletním Freundovým adjuvantem (CFA), tak aby konečný objem emulze určené pro první imunizaci byl 400 gl. Další čtyři imunizace proběhly s imunogenem emulzifikovaným v Nekompletním Freundově adjuvantu (IFA) a konečná dávka imunogenu byla podána v PBS. Imunizace byly aplikovány intraperitoneálně, a to vždy po dvou týdnech (první tři dávky) a poté v měsíčních intervalech. Zvířatům byla pro měření titru protilátek odebírána krev vždy 4 až 7 dní po každé imunizaci, a to tak, že první odběr byl proveden po druhé dávce. Zvířata byla usmrcena přibližně týden po poslední imunizaci.

2. Hladina Αβ a APP v mozku

Po čtyřech měsících imunizace s různými Αβ peptidy nebo derivátem APP byly mozky ze zvířat dialyzovaných solným roztokem vyjmuty. Jedna hemisféra byla připravena pro imunohistochemickou analýzu, druhá byla použita pro kvantifikaci množství Αβ a APP. Pro měření koncentrace různých forem Αβ a APP byly v 5M guanidinu homogenizovány hipokampální, korové a mozečkové oblasti vyjmuté hemisféry. Homogenáty byly rozředěny (sériové ředění) a následně bylo zjištěno množství amyloidu nebo APP. Kvantifikace byla založena na porovnání výsledků ELISA testů s řadou standardů peptidů Αβ nebo APP o známé koncentraci.

Průměrná koncentrace Αβ v kontrolní skupině imunizované PBS byla 5,8krát vyšší v hipokampu než v kůře (24 318 ng/g oproti 4221 ng/g). Průměrná koncentrace v mozečku (23,4 ng/g) byla u kontrolní skupiny asi lOOOkrát nižší než v hipokampu. Tyto hladiny odpovídají hodnotám, které byly pro heterozygotní transgenní PDAPP myši stejného věku publikovány dříve (JohnsonWoods et al., 1997, viz výše).

V mozkové kůře byly u skupin léčených ANI792, hlodavčí Αβί až 42 nebo konjugátem Αβί až 5 peptidu v porovnání s kontrolní skupinou, zjištěny významné nižší střední hodnoty množství (p < 0,05) Αβ a Αβί až 42 (obr. 11). Střední hodnoty hladin celkového Αβ byly sníženy o 75, 79 a 61 %, a to v porovnání s kontrolní skupinou. V korové oblasti zvířat z jakékoli skupiny nebyly nalezeny žádné souvislosti mezi hladinou Αβ a titrem Αβ-specifických protilátek.

-56CZ 302971 B6

V případě hipokampu, nebyla střední hodnota snížení množství Αβ spojená s léčbou ΑΝ 1792 tak velká (o 46%, p = 0,0543) jako v případě kůry (o 75%, p = 0,0021). Absolutní velikost této redukce však byla v mnohem větší v hipokampu než v kůře. Čisté snížení bylo o 11 186 ng/g tkáně v hipokampu oproti 3171 ng/g tkáně v kůře. Skupiny zvířat dostávající hlodavci Αβί až 42 nebo Αβί až 5 vykazovaly snížení středních hodnot množství celkového Αβ o 36 resp, 26%. Díky malým množstvím zvířat ve skupinách a vysoké variabilitě hladin amyloidního peptidu mezi jednotlivými zvířaty v obou skupinách, však nebyla tato snížení významná. Při měření hladin Αβί až 42 nedosáhlo žádné ze zjištěných snížení významnosti. Můžeme tedy říct, že díky menšímu množství Αβ zátěže v kůře, jsou změny v této mozkové oblasti citlivějším indikátorem léčebných účinků. Změny Αβ hladin v kůře měřené pomocí ELISA jsou podobné, ne však identické, s výsledky obdrženými při imunohistochemické analýze (viz níže).

Celkové množství Αβ bylo měřeno i v mozečku, což je oblast, která je patologií AD zasažena minimálně. Žádná ze středních hodnot koncentrací Αβ u žádné ze skupin imunizovaných různými peptidy nebo derivátem APP nebyla odlišná od hodnot naměřených ve stejné oblasti u kontrolní skupiny. Tyto výsledky napovídají, že nepato logické hladiny Αβ jsou léčbou nezasaženy.

V kůře a v mozečku léčených a kontrolních myší byly ELISA technikou určovány i koncentrace APP. Pro určení množství APP byly použity dvě odlišné analýzy. První, nazvaná APP-a/FL, rozeznávala APP-alfa (a, sekretovaná forma, která vznikla Štěpením uvnitř Αβ sekvence) a formy APP o plné délce (FL), zatímco druhý typ analýzy rozeznával pouze APP-a. Na rozdíl od úbytku Αβ u části z léčených skupin, zůstaly hladiny APP u léčených i kontrolních zvířat nezměněny. Tyto výsledky ukazují, že imunizace s Αβ peptidy nesnižuje množství APP nebo lépe, že léčebné účinky jsou specifické pro Αβ.

Celkově lze tedy říci, že hladiny Αβ a Αβί až 42 v kůře zvířat léčených AN1792, hlodavci Αβί až 42 nebo Αβί až 5 konjugátem, byly významně sníženy. V hipokampu došlo k významnému snížení Αβ pouze u skupiny léčené ANI792, Žádné další významné změny v hladinách Αβ nebo APP související s použitou léčbou, nebyly v hipokampu, mozkové kůře nebo v mozečku pozorovány.

2. Histochemické analýzy

Mozky z částí zvířat z šesti skupin byly připraveny na imunohistochemickou analýzu, tři skupiny byly imunizovány konjugáty Αβ peptidů Αβί až 5, Αβί až 12, a Αβ13 až 28, dvě skupiny byly imunizovány s Αβ agregáty o plné délce ANI792 a ANI528; kontrolní skupina byla ošetřena pouze PBS. Výsledky obrazové analýzy amyloidní zátěže u mozkových řezů z těchto skupin jsou vidět na obr. 12. Významný pokles amyloidní zátěže v porovnání s kontrolními zvířaty byl pozorován v korových oblastech. Největší snížení amyloidní zátěže bylo zaznamenáno u skupiny léčené ANI792 (o 97 %, p = 0,001). Významných snížení bylo dosaženo také u zvířat léčených ΑΝ 1528 (o 95 %, p = 0,005) a konjugátem Αβί až 5 peptidu (o 67 %, p - 0,02).

Výsledky získané kvantifikací celkového Αβ nebo Αβί až 42 technikou ELISA a množství amyloidní zátěže zjištěné obrazovou analýzou, se do jisté míry liší. Z hodnocení pomocí kvantitativní analýzy obrazu plyne, že léčba s ANI528 měla významný dopad na hladinu korové amyloidní zátěže, z výsledků ELISA analýz však plyne, že celková koncentrace Αβ zůstala v této oblastí nezměněna. Rozdíl mezi těmito dvěma výsledky je pravděpodobně způsoben specifikami jednotlivých analýz. Obrazová analýza měří pouze nerozpustné Αβ, agregované do plaků. ELISA testy jsou naopak schopny měřit všechny formy Αβ, tj. rozpustnou i nerozpustnou, monomemí i agregovanou. Jelikož patologie nemoci se zdá být spojena spíše s nerozpustnou formou Αβ, asociovanou s plaky, je tedy možné, že technika analýzy obrazu by v tomto případě mohla podat přesnější interpretací účinků léčby. ELISA technika je však rychlejší a jednodušší analýza, a tak

-57 CZ 302971 B6 je pro analytické účely velmi vhodná a může dokonce odhalit zda snížení Αβ, jež je spojené s léčbou, je větší u Αβ v plácích nebo u celkového Αβ.

Za účelem zjištění zda Αβ-specifická protilátka vyvolaná imunizací pokusných zvířat reagovala s uloženým mozkovým arnyloidem, byla část řezů z léčených i kontrolních zvířat inkubována s protilátkou specifickou proti myšímu IgG. U zvířat imunizovaných konjugáty Αβ, a to Αβί až 5, Λβΐ až 12, a Αβί3 až 28, bylo na rozdíl od zvířat léčených PBS zjištěno, že plaky obsahující Αβ jsou pokryty endogenním IgG. Totéž platí i pro Αβ agregáty plné délky (ANI792 a ANI528). Mozky ze zvířat imunizovaných jinými Αβ peptidy nebo APP peptidem pBxó nebyly ío podrobeny této analýze.

3. Měření proti látkových titrů

Krev byla myším odebrána vždy 4 až 7 dní po každé imunizaci, a to tak, že první odběr byl pro15 veden po druhé dávce a celkový počet odběrů byl roven pěti. Protilátkové titry byly určeny pomocí vazby (stanovené technikou sendvičové ELISA) protilátky proti Αβί až 42 na ΑβΙ až 42, jež bylo umístěno v „multijamkových“ (multi-well plates) miskách. Nejvyšší hodnoty proti látkových titrů (měřeny byly protilátky proti ANI792) byly u těchto čtyř prostředků vyvolány po čtvrté imunizaci: ANI792 (mezní GMT: 94 467), ANI528 (mezní GMT: 88 231), konjugát Αβί až 12 (mezní GMT: 47 216) a hlodavčí Αβί až 42 (mezní GMT: 10 776). Po páté a šesté imunizaci hodnoty titrů těchto skupin trochu poklesly. U zbývajících pěti imunogenů bylo mezních Hodnot dosaženo po páté a šesté imunizaci, i když tyto hodnoty byly v porovnání se čtyřmi výše uvedenými skupinami mnohem nižší: konjugát Αβί až 5 (mezní GMT: 2356), pBx6 (mezní GMT: 1986), konjugát Αβί 3 až 28 (mezní GMT: 1183), konjugát Αβ33 až 42 (mezní GMT:

658), Αβ25 až 35 (mezní GMT; 125). Protilátkové titry byly technikou sendvičové ELISA stanovovány také proti dalším homologním peptidům, konkrétně proti Αβί až 5, Αβί3 až 28, Αβ25 až 35, Αβ33 až 42 nebo hlodavčímu Αβί až 42. Tyto titry byly skoro stejné jako v případě Αβί až 42, pouze s výjimkou hlodavčího Αβί až 42, v jehož případě byly protilátkové titry zhruba dvakrát vyšší. Hodnoty AN1792-specÍfíckého proti látkového titru u jednotlivých zvířat nebo jeho jo průměrné hodnoty u jednotlivých skupin nekorelovaly s účinností popisovanou snížením množství Αβ v kůře.

4. Lymfoproliferativní odpovědi

Lymfoproliferace vyvolaná přítomností Αβ byla zjišťována ve slezinných buňkách, shromážděných přibližně jeden týden po šesté imunizaci. Čerstvě získané buňky (10^s na jamku) byly pěstovány v přítomnosti Αβί až 40 v koncentraci 5 μΜ/stimulaci po 5 dní. Část buněk ze sedmi skupin (celkově bylo 10 skupin) byla pěstována také v přítomnosti reverzního peptidu Αβ40 až 1. Jako pozitivní kontrola sloužily buňky pěstované v přítomnosti T-buněk. PHA, za negativní kontroly byly považovány buňky pěstované bez peptidu.

U většiny zvířat reagovaly lymfocyty na přítomnost PHA proliferaci. Žádná významná proliferace nebyla pozorována u skupiny s Αβ40 až 1. Buňky ze zvířat imunizovaných většími agregovanými peptidy, ANI792, hlodavčím Αβί až 42 a ANI528 v odpověď na stimulaci s Αβ40 mocně proliferovala, přičemž nejvíce skupina imunizovaná ANI792. Jedno zvíře v každé skupině imunizované konjugátem Αβί až 12, konjugátem Αβΐ3 až 28 a Αβ25 35 reagovalo na aplikaci Αβί až 40 proliferaci. Ostatní skupiny imunizované konjugátem Αβί až 5, konjugátem Αβ33 až 42, pBxó nebo PBS neobsahovaly žádné zvíře, jež by na stimulaci Αβ reagovalo. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 7.

-58CZ 302971 Β6

Tabulka 7

Imunogen	konjugát	aminokyseliny v Αβ	odpovědi
Αβ1-5	ano	5	0/7
Αβ1-12	ano	12	1/8
Αβί 3-28	ano	16	1/9
Αβ23-35		11	1/9
Αβ33-42	ano	10	0/10
Αβί-40		40	5/8
ΑβΙ-42		42	9/9
τΑβΙ-42		42	8/8
ρΒχ6			0/8
PBS		0	0/8

Tyto výsledky ukazují, že imunizace s ANI792 a ANI528 vedly k silným odpovědím T-buněk, nejspíše s fenotypem CD4+. Nepřítomnost Αβ-specifické odpovědi,, zprostředkované T-buňkami u zvířat imunizovaných s Αβί až 5 nebyla překvapující, protože peptidové epitopy rozeznávané CD4+ T-buňkami jsou obvykle dlouhé asi 15 aminokyselin, přestože kratší peptidy mohou někdy fungovat s nižší účinností. Většina epitopů T pomocných buněk je v případě čtyř konjugovaných peptidu pravděpodobně navázána na IgG polovinu konjugátu a ne na Αβ oblast. Tuto hypotézu podporuje velmi nízký výskyt proliferativních odpovědí u zvířat v těchto skupinách. Jelikož konjugát Αβί až 5 byl při snižování hladiny Αβ v mozku účinný, a to i za zjevné nepřítomnosti Αβ-specifických T-buněk, klíčovým faktorem v mechanismu peptidem vyvolané imunitní odpovědi se zdá být protilátka.

Nepřítomnost T-buněk a nízká protilátková odpověď po aplikaci peptidu pBxó (obsahuje aminokyseliny 592 až 695 z APP, zahrnujíc všechny Αβ zbytky) může být způsobena nízkou imunogenicitou konkrétního preparátu. Nízká imunogenicita agregátu Αβ25 až 35 je pravděpodobně způsobena tím, že peptid je příliš krátký na to, aby pro T-buňku představoval epitop schopný pomoci vyvolat imunitní odpověď. Předpokládá se, že konjugace tohoto proteinu s nosným proteinem by mohla zvýšit jeho imunogenicitu.

Příklad 5

Příprava pólyklonálních protilátek pro pasivní ochranu

125 netransgenních myší bylo imunizováno Αβ sadjuvantem a usmrceno po 4 až 5 měsících. Krev z každé myši byla odebrána a IgG bylo izolováno od ostatních krevních složek. Protilátky specifické pro daný imunogen mohou být částečně přečištěny pomocí afinitní chromatografie. Z každé myši bylo získáno v průměru 0,5 až 1 mg pro imunogen specifické protilátky, což celkově znamenalo 60 až 120 mg.

Příklad 6

Pasivní imunizace s protilátkami proti Αβ

Skupinám 7 až 9 měsíčních PDAPP myší bylo injikováno v PBS 0,5 mg/myš polyklonální protilátky anti-Αβ nebo monoklonální protilátky anti-Αβ (viz níže). Všechny preparáty protilátek byly za účelem nízké hladiny endotoxinu přečištěny. Monoklonální protilátky proti danému

-59CZ 302971 B6 fragmentu mohou být získány injekcí fragmentu nebo delší formy Αβ do myši, přípravou hybrídomů a jejich testováním na protilátku, která se specificky váže na požadovaný fragment Αβ, aniž by se vázala najiné specifické fragmenty Αβ.

Tabulka 8

Protilátka

2H3

10D5

266

21F12 myší polyklonální proti lidskému Αβ42

Epitop

Αβ 1-12 Αβ 1-12 Αβ13-28 Αβ33-42 proti agregovanému Αβ42 proti agregovanému Αβ42 io Myši byly po 4 měsíce injikovány i.p. protilátkou proti Αβ42 nebo jinému imunogenu tak, aby byla dosažena hladina cirkulujících protilátek o titru vyšším než 1:1000, což bylo měřeno pomocí ELISA. Monitorování titrů bylo prováděno výše uvedeným způsobem, a s tím, že myši byly usmrceny na konci 6 měsíce podávání injekcí. Histochemie, hladiny Αβ, a toxikologické analýzy byly provedeny posmrtně. V každé skupině bylo 10 myší. Další studie pasivní imunizace jsou is popsány v příkladech 11 a 12.

Příklad 7

Porovnání různých adjuvantů

V tomto přikladu jsou za účelem zjištění schopnosti stimulace imunitní odpovědi porovnávány CFA, alum, emulze olej-voda a MPL.

A. Materiál a metody

I. Schéma studie

100 samic 6 týdnů starých morčat kmene Hartley (Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford,

MA) bylo roztříděno do deseti skupin za účelem imunizace pomocí ANI792 nebo jeho palmitoylovaného derivátu, kombinovaného s různými adjuvanty. Sedm skupin dostalo injekce ANI 792 (33 μg pokud není jinak upřesněno) v kombinaci s a) PBS, b) Freundovým adjuvantem, c) MPL, d) skvalen, e) MPL/skvalen, f) nízkou dávkou alum, g) vysokou dávkou alum (300 μg ANI792). Dvě skupiny dostaly injekce palmitoylovaného derivátu ANI792 (33 μg) v kombinaci s a) PBS nebo b) skvalenem. Poslední, desátá skupina dostala samotné PBS bez antigenů nebo dalšího adjuvantu. U skupiny dostávající Freundův adjuvant byla první dávka emulzifikována s CFA, další čtyři dávky s IFA. U všech skupin byl antigen podán v dávce 33 μg, s výjimkou skupiny s vysokou dávkou alum, jenž obdržela 300 μg ANI792. Injekce byly aplikovány intraperitoneálně (CFA/IFA) nebo intramuskulárně (ostatní skupiny) do zadní strany kvadricepsu, alternativně do levé nebo pravé. První tři dávky byly aplikovány ve 14 denních intervalech, další dvě dávky měsíčně. Krev určená pro měření titrů byla odebírána 6 až 7 dní po každé imunizaci, přičemž první odběr proběhl po druhé dávce.

-60CZ 302971 B6

2. Příprava imunogenu

K 2 mg Αβ42 (Califomia Peptide, kat. č. ME0339) bylo přidáno 0,9 ml deionizované vody a směs byla následně vortexována až do vytvoření relativně uniformní suspenze. Byl přidán 100 μΐ alikvot lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenze byla poté znovu vortexována a inkubována přes noc při 37 °C, přičemž druhý den již mohla být použita. Nespotřebovaný Αβ42 byl skladován s desikantem jako lyofilizovaný prášek při -20 °C.

Palmitoylovaný derivát ANI792 byl připraven připojením anhydridu kyseliny palmitové, rozpuštěném v dimethylformamidu, ke zbytku na aminovém konci ANI792 a poté byl nascentní peptid z pryskyřice získán pomocí kyseliny fluorovodíkové.

Pro přípravu směsi imunogenu a Kompletního Freundova adjuvantu (CFA) (skupina 2) bylo 33 pg ANI792 ve 200 μΙ PBS emulzifikováno 1:1 (objem) s CFA, při konečném objemu emulze určené pro první imunizaci 400 μΐ. Přípravy pro další imunizace proběhly shodným způsobem, místo CFA však bylo použito IFA.

Pro přípravu dávek v MPL (skupiny 5 a 8) bylo MPL ve formě lyofilizováného prášku (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT) přidáno k 0,2% vodnému roztoku triethylaminu v takovém množství, aby výsledná koncentrace byla 1 mg/ml. Poté byla směs vortexována. Směs byla následně zahřáta na 65 až 70 °C po 30 s, čímž došlo ke vzniku mírně opaleskující uniformní suspenze micel. Směs byla čerstvě namíchána pro každou sérii injekcí. Pro každou injekci ve skupině 5 bylo v borosilikátové zkumavce těsně před použitím smíšeno 33 pg ANI792 v 16,5 pl PBS, 50 pg MPL (50 pl) a 162 pl PBS.

Pro přípravu dávek v slabé suspenzi olej-voda bylo AN 1792 v PBS přidáno k 5% skvalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Spán 85 v PBS tak, aby výsledná koncentrace pro jednu dávku byla 33 pg ANI792 v 250 pl (skupina 6). Směs byla emulzifikována průchodem přes dvoukomorový ručně ovládaný přístroj tak dlouho (15 až 20 otočení), dokud kapičky emulze nenabyly přibližně stejného průměru jako standardizované gumové bublinky s průměrem 1 pm, což bylo určeno pomocí mikroskopu. Výsledná suspenze byla opaleskující, mléčně bílá. Emulze byly čerstvě namíchány pro každou sérii injekcí. U skupiny 8 bylo ke směsi skvalenu a detergentů (viz výše) na každou dávku přidáno 50 pg MPL v 0,2% triethylaminu. Směs byla poté emulzifikována jak bylo popsáno výše. U palmitoylovaného derivátu (skupina 7) bylo ke skvalenu přidáno 33 pg palmitoy 1ΝΗ-Αβ1-42 na dávku a směs byla vortexována. Poté byly přidány Tween 80 a Spán 85 a směs byla vortexována. K této směsi byl přidán PBS tak, aby výsledné koncentrace byly: skvalen 5 %, Tween 80 0,5 %, a Spán 85 0,5 %, Směs byla poté emulzifikována jak bylo popsáno výše.

Pro přípravu dávek s alum (skupiny 9 a 10) byl k Alhydrogelu (gel hydroxidu hlinitého, Accurate, Westbury, NY) přidán ANI792 v PBS tak, aby výsledné koncentrace byly 33 pg (nízká dávka, skupina 9) nebo 300 pg (vysoká dávka, skupina 10) na 5 mg alum pri výsledném objemu dávky 250 pl. Suspenze byla po 4 h jemně míchána pri pokojové teplotě.

3. Měření proti látkových titrů

Krev byla morčatům odebírána 6 až 7 dní po každé imunizaci, přičemž první odběr proběhl po druhé imunizaci, s tím, že odběry byly celkem čtyři. Titry protilátek proti Αβ42 byly měřeny technikou ELISA (viz Všeobecný materiál a metody).

4. Tkáňové preparace

Asi po 14 dnech byla všechna morčata usmrcena aplikací CO₂. Mozkomíšní mok byl odčerpán, mozky byly vyjmuty a poté následovala izolace tří mozkových oblastí (hipokampus, kůra a mozeček), které byly dále použity k měření celkové koncentrace Αβ proteinu technikou ELISA.

-61 CZ 302971 B6

B. Výsledky

1. Proti látkové odpovědi

Při měření protilátkové odpovědi po imunizaci sANI792 byl u různých adjuvantů zjištěn v potencích velký rozdíl. Jak je vidět na obr. 14, po aplikaci ANI 792 v PBS nebyla po dvou Či třech imunizacích zjištěna v krvi žádná protilátka. Zanedbatelnou odpověď bylo možno detekovat až po čtvrté a páté dávce, přičemž geometrické průměry titrů (GMTs) dosahovaly hodnot pouze okolo 45. Emulze olej-voda vyvolala po třetí dávce mírné zvýšení (GMT 255), které bylo zachováno i po čtvrté dávce (GMT 301), ale kleslo po konečné dávce (GMT 54). Jasná antigenní koncentrační závislost byla nalezena u ΑΝ 1792 vázaného na alum, kdy aplikace 300 gg antigenu měla ve všech měřených časových bodech větší imunogenní účinek než aplikace 33 gg. V bodě nejvyšší protilátkové odpovědi, tj. po čtvrté imunizaci, byly rozdíly mezi dávkami 43 % s GMTs okolo 1940 (33 gg) a 3400 (300 gg). Protilátková odpověď na 33 gg AN1792 s MPL byla velmi podobná té, jež byla pozorována u více než desetinásobného množství antigenu (300 gg) vázaného v alum. Přidání MPL k emulzi olej-voda snížilo potenci tohoto prostředku v porovnání s prostředkem obsahujícím jako jediný adjuvant MPL o 75 %. Palmitoylovaný derivát ANI 792 byl při podání v PBS naprosto neimunogenní, při podání v emulzi olej-voda vykazoval mírné imunogenní působení s GMTs 340 (po čtvrté dávce) a 105 (po páté dávce). Nejvyšších proti látkových titrů bylo docíleno s Freundovým adjuvantem s nej vyšším GMT okolo 87 000, což je hodnota bezmála 30krát vyšší než GMTs dvou dalších nej účinnějších prostředků, MPL a vysoká dávka AN1792/alum.

Nejslibněji vypadajícími adjuvanty, identifikovanými v této studii jsou MPL a alum. Z těchto dvou vypadá lépe MPL, protože pro dosažení stejného účinku bylo zapotřebí 1 Okřát nižší dávky antigenu než v případě alum. Odpověď může být zvýšena zvýšením dávky antigenu a/nebo adjuvantu a také optimalizací imunizačního postupu. Emulze olej-voda byla v případě ANI 792 velmi slabým adjuvantem a její přidání k MPL mělo za následek vymizení adjuvanční schopnosti samotného MPL.

2. Hladiny Αβ v mozku

Částem zvířat ze skupin imunizovaných Freundovým adjuvantem (skupina 2), MPL (skupina 5), alum o vysoké dávce, 300 gg ΑΝ 1792 (skupina 10) a kontrolní skupina imunizovaná PBS (skupina 3) byl zhruba po čtrnácti týdnech při hluboké narkóze odebrán mozkomíšní mok (CSF) a poté jim byly vyjmuty mozky. Pro měření koncentrace Αβ peptídů byly v 5M guanidinu homogenizovány hípokampální, korové a mozečkové oblasti jedné z vyjmutých hemisfér. Kvantifikace byla založena na porovnání výsledků ELISA testů s řadou standardů peptídů Αβ o známé koncentraci. Hladiny proteinu Αβ v hipokampu, kůře a mozečku byly, nehledě na rozdílné protilátkové odpovědi proti Αβ vyvolané těmito prostředky, u všech čtyř skupin velmi podobné. Průměrná množství Αβ byla v hipokampu 25 ng/g tkáně, v kůře 21 ng/g tkáně, a v mozečku 12 ng/g tkáně. Přítomnost vysokého titru protilátek proti Αβ po skoro tři měsíce tak u některých zvířat nezměnila celkové množství Αβ v mozku. Množství Αβ v CSF bylo u různých skupin také podobné. Nepřítomnost většího imunizačního účinku ANI 792 na endogenní Αβ naznačuje, že odpověď je zaměřena na patologickou tvorbu Αβ.

Příklad 8

Imunitní odpověď na různé adjuvanty měřená u myší

V této studii byly používány šest týdnů staré samice myší Swiss Webster, 10 až 13 zvířat/skupinu. Imunizace probíhaly ve dnech 0, 14, 28, 60, 90 a 200, přičemž aplikace probíhala subkutánně, s objemem jedné dávky 200 gl. Jako pufr byl u všech prostředků použit PBS. Zvířatům byla pro

-62CZ 302971 B6 měření titrů protilátek ELISA testem odebírána krev sedm dní po každé imunizaci a to tak, že první odběr byl proveden po druhé dávce. Léčebné prostupy pro každou skupinu jsou shrnuty v tabulce 9.

Tabulka 9

Skupina	N’	Adjuvant^b	Dávka	Antigen Dávka(pg)
1	10	MPL	12,5 pg	ANI 792	33
2	10	MPL	25 gg	AN1792	33
3	10	MPL	50 gg	AN1792	33
4	13	MPL	125 gg	AN1792	33
5	13	MPL	50 gg	ANI 792	150
6	13	MPL	50 gg	AN1528	33
7	10	PBS		AN1792	33
8	10	PBS		žádný	33
9	10	Skvalen	5%	ANI 792	33
10	10	Skvalen+	5%	ANI 792	33
11	10	Alum 2 mg		AN1792	33
12	13	MPL + Alum	50 gg/2 mg	AN1792	33
13	10	QS-21	5 gg	AN1792	33
14	10	QS-21	10 gg	ANI 792	33
15	10	QS-21	25 AN1792	ANI 792	33
16	13	QS-21	25 ANI 792	AN1792	150
17	13	QS-21	25 AN1792	AN1528	33
18	13	QS-21 + MPL	25 ggZ50gg	ANI 792	33
19	13	QS-21 + Alum	25 gg/2mg	ANI 792	33

^a Počet myší ve skupině při zahájení pokusu ^b Adjuvanty jsou zmíněny. Pufrem ve všech prostředcích byl PBS. Ve skupině 8 nebyl žádný io adjuvant ani antigen.

-63CZ 302971 B6

Titry protilátek proti Αβ42 (určené pomocí ELISA) pro každou skupinu, jsou uvedeny v tabulce

10.

Tabulka 10

Geometrické průměry protilátkových titrů

Týdny odběru krve.

Skupina	2,9	5,0	8,7	12,9	16,7
1	248	1797	2577	6180	4177
2	598	3114	3984	5287	6878
3	1372	5000	7159	12333	12781
4	1278	20791	14368	20097	25631
5	3288	26242	13229	9315	23742
6	61	2536	2301	1442	4504
7	37	395	484	972	2149
8	25	25	25	25	25
9	25	183	744	952	1823
10	25	89	311	513	817
11	29	708	2618	2165	3666
12	198	1458	1079	612	797
13	38	433	566	1080	626
14	104	541	3247	1609	838
15	212	2630	2472	1224	1496
16	183	2616	6680	2085	1631
17	28	201	375	222	1540
18	31699	15544	23095	6412	9059
19	63	243	554	299	441

Tabulka ukazuje, že nej vyšší titry byly obdrženy u skupin 4, 5 a 18, ve kterých byly adjuvanty 125 gg MPL, 50 gg MPL a QS-21 s MPL.

-64CZ 302971 B6

Příklad 9

Léčebná účinnost různých adjuvantu

Studie terapeutické účinnosti adjuvantu vhodných pro užití u lidí byla prováděna na transgenních PDAPP myších, za účelem stanovení jejich schopnosti potenciovat imunitní odpověď proti Αβ a vyvolat imunitou zprostředkované odstranění amyloidních usazenin v mozku.

180 samic a samců heterozygotních transgenních PDAPP myší, ve věku od 7,5 do 8,5 měsíců bylo získáno z Charles River Laboratories. Myši byly roztříděny do devíti skupin (15 až 23 zvířat ve skupině) a imunizovány ANI 792 nebo ANI 528 v kombinaci sráznými adjuvanty. Zvířata byla rozdělena tak, aby jejich pohlaví, stáří a původ zůstaly v rámci skupiny co nejméně odlišné. Adjuvanty zahrnovaly alum, MPL, a QS-21, každý z nich kombinovaný s oběma antigeny, a Freundův adjuvant (FA) kombinovaný pouze s ANI792. Další skupina byla imunizována s ANI792 připraveném v PBS s thiomersalem a neobsahoval adjuvant. Devátá skupina byla imunizována pouze samotným PBS a představovala negativní kontrolu.

Příprava agregovaných Αβ peptidů: lidský Αβί 1 až 40 (AN1528; California Peptides lne., Napa, CA; kat. č, ME0541) a lidský Αβί až 42 (ANI792; California Peptides lne., Napa, CA; kat. č. ME0439) peptid byly při přípravě každé série injekcí čerstvě rozpuštěny z lyofilizovaných prášků, které byly skladovány vysušené při -20 °C. Poté byly přidány 2 mg peptidu k 0.9 ml deinoizované vody a směs byla následně vortexována až do vytvoření relativně uniformního roztoku nebo suspenze. V tomto kroku byl rozpustný pouze ANI528. V okamžiku kdy se ANI528 začal srážet byl přidán ΙΟΟμΙ alikvót lOx PBS (lx PBS: 0,15 NaCl, 0,01M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenze byly poté znovu vortexovány a inkubovány přes noc při 37 °C, přičemž druhý den již mohly být použity. Pro přípravu dávek s alum (skupiny 5 a 9) byl k Alhydrogelu (2% vodný gel hydroxidu hlinitého, Sargeant, lne., Clifton, NJ) přidán Αβ peptid v PBS tak, aby výsledná koncentrace byla 100 gg Αβ peptidu na 1 mg alum. lOx PBS byl poté přidán tak, aby ve výsledném objemu dávky 200 μΐ figuroval jako lx PBS. Suspenze byla před injekcí po 4 h jemně míchána při pokojové teplotě.

Pro přípravu dávek v MPL (skupiny 2 a 6), bylo MPL ve formě lyofilizováného prášku (Ribi ImmunoChem Research, lne., Hamilton, MT) přidáno k 0,2% vodnému roztoku triethylaminu v takovém množství, aby výsledná koncentrace byla 1 mg/ml. Poté byla směs vortexována. Směs byla následně ohřátá na 65 až 70 °C po 30 s, čímž došlo ke vzniku mírně opaleskující uniformní suspenze micek Roztok byl skladován při 4 °C. Pro každou sérii injekcí bylo v borosilikátové zkumavce těsně před použitím smíšeno pro jednu dávku 100 gg peptidu v 50 gl PBS, 50 gg MPL (50 gl)al00 gl PBS.

Pro přípravu dávek v QS-21 (skupiny 3 a 7), bylo QS-21 ve formě lyofílizované ho prášku (Aquila, MA; kat. Č. A7018R) přidáno k PBS, pH 6,6 až 6,7, v takovém množství, aby výsledná koncentrace byla 1 mg/ml. Poté byla směs vortexována. Roztok byl skladová při -20 °C. Pro každou sérii injekcí bylo v borosilikátové zkumavce těsně před použitím smíšeno pro jednu dávku 100 gg peptidu v 50 gl PBS, 25 gg QS-21 v 25 gl a 125 gl PBS.

Pro přípravu dávek s Freundovým adjuvantem (skupina 4) bylo 100 gg ANI792 ve 200 gl PBS bylo emulziftkováno 1:1 (objem) s kompletním Freundovým adjuvantem (CFA) při konečném objemu emulze pro první imunizaci 400 gl. Přípravy pro další imunizace proběhly shodným způsobem, místo CFA však bylo použito IFA. Pro prostředky obsahující alum, MPL nebo QS-21 bylo AN1792 (100 gg/dávku) nebo ANI528 (100 gg/dávku) smícháno s alum (1 mg/dávku) nebo s MPL (50 gg/dávku) nebo s QS-21 (25 gg/dávku) tak, aby konečný objem v PBS byl 200 gl. Tyto prostředky byly aplikovány naočkováním pod kůži mezi lopatkami. U skupiny s FA bylo 100 gg ANI 792 emulzifí kováno 1:1 (objem) s kompletním Freundovým adjuvantem (CFA) při

-65I konečném objemu 400 μΙ. První imunizace proběhla intraperitoneálním podáním, přičemž následně posilovači injekce (5 dávek) obsahovaly stejné množství imunogenu, místo CFA však bylo použito IFA. U skupiny, jíž byl podán ANI792 bez adjuvantu bylo 10 μg ANI792 smícháno s 5 μg thiomersalu tak, aby konečný objem v PBS byl 50 μΙ. Tento prostředek byl aplikován sub5 kutánně. Devátá, kontrolní skupina dostala subkutánně pouze 200 μΙ PBS. Imunizace probíhaly u prvních tří dávek ve čtrnáctidenních intervalech a poté po měsíčních intervalech v 0, 16, 28, 56, 85 a 112 den. Zvířatům byla pro měření titru protilátek ELISA testem odebírána krev šest až sedm dní po každé imunizaci, a to tak, že první odběr byl proveden po druhé dávce. Zvířata byla usmrcena přibližně jeden týden po poslední dávce. Hladiny Αβ a APP v mozku byly stanoveny io pomocí ELISA testu a pomocí imunohistochemického vyhodnocení přítomnosti amyloidních plaků v mozkových řezech. Dále byly určeny titry Αβ-specifických protilátek a proliferativní a cytokinové odpovědi závislé na Αβ.

Tabulka 10 ukazuje, že nejvyšší protilátkové titry proti Αβ1-42 byly vyvolány s ANI792 ve FA, is přičemž mezních hodnot bylo dosaženo po čtvrté imunizaci (mezní GMT: 75 386), stím, že po poslední, šesté imunizaci poklesla tato hodnota o 59 %. Nejvyšší protilátkový titr vyvolaný

AN 1792 s MPL byl v porovnání s FA o 62 % nižší (mezní GMT: 28 867), mezních hodnot bylo dosaženo po třetí imunizaci s tím, že po šesté imunizaci poklesla tato hodnota na 28 % mezního GMT. Nejvyšší protilátkový titr vyvolaný ANI792 sQS-21 (GMT: 1511) byl v porovnání s MPL 5krát nižší. Kinetiky odpovědi byly pomalejší, protože k dosažení mezích hodnot odpovědi bylo zapotřebí dodatečných imunizací. Titry vyvolané na alum vázanými ANI792 překračovaly jen o málo titry získané s QS-21, přičemž kinetika odpovědi byla rychlejší. U ANI792 aplikovaného v PBS s thiomersalem byla frekvence a velikost titrů jen o málo větší než u samotného PBS. Největší titry vyvolané u MPL s AN1528 (mezní GMT: 3 099) byly přibližně 9krát nižší než s ΑΝ 1792. ΑΝ 1528 vázaný v alum byl jen slabě imunogenní a dával nízké titry, a to ještě jen u některých zvířat. LI kontrolních zvířat imunizovaných jen PBS nebyly pozorovány žádné protilátkové odpovědi.

Tabulka 11

Geometrické průměry protilátkových titrů^a

Týdny odběru krve

Léčba	33	5,0	9,0	13,0	17,0
Alum/ ANI 792	102 (12Z21)^h	1081 (17/20)	2366 (21/21)	1083 (19/21)	572 (18/21)
MPL/ ANI 792	6241 (21/21)	28867 (21/21)	11242 (21/21)	5665 (20/20)	8204 (20/20)
QS-21/ AN1792	30 (1/20)	227 (10/19)	327 (10/19)	1511 (17/18)	1188 (14/18)
CFA/ ANI 792	10076 (15/15)	61279 (15/15)	75386 (15/15)	41628 (15/15)	30574 (15/15)
Alum/ AN1528	25 (0/21)	33 (1/21)	39 (3/20)	37 (1/20)	31 (2/20)
MPL/ ANI 528	184 (15/21)	2591 (20/21)	1653 (21/21)	1156 (20/20)	3099 (20/20)

-66CZ 302971 B6

QS-21/ ANI 528	29 (1/22)	221 (13/22)	51 (4/22)	820 (20/22)	2994 (21/22)
PBS +	25	33	39	37	47
Thiomersal (0/16)	(2/16)	(4/16)	(3/16)	(4/16)
PBS	25 (0/16)	25 (0/16)	25 (0/15)	25 (0/12)	25 (0/16)

^a Geometrické průměry proti látkových titrů měřené proti Αβ H2 ^b Množství reagujících zvířat ve skupině

Účinky léčby ΑΝ 1792 nebo ΑΝ 1528 spolu s různými adjuvanty nebo s thiomersalem na korovou amyloidní zátěž u dvanáctiměsíčních myší, určené metodou ELISA, jsou zobrazeny na obr. 15. U kontrolních PDAPP myší byly střední hodnoty celkového Αβ v kůře ve dvanáctém měsíci 1871 ng/g. Významně snížené hladiny Αβ byly pozorovány u myší léčených ANI792 s CFA/IFA, ANI792 salum, ANI792 s MPL a ANI792 sQS-21. Snížení dosáhlo statistické io významnosti na hladině p < 0,05 pouze v případě ANI 792 s CFA/IFA. Nicméně, jak je popsáno v příkladech 1 a 3, redukce hladin Αβ následkem imunizace u 15 a 18 měsících myší nabyla postupně na síle. Předpokládá se tedy, že další prostředky, zvláště ΑΝ 1792 s alum, ΑΝ 1792 s MPL a ANI792 sQS-21 poskytnou při léčbě starších myší pozitivnější výsledky. Naproti tomu, ANI 792 s konzervační látkou thiomersalem vyvolal skoro stejnou hladinu Αβ jako samotné PBS.

Obdobné výsledky byly získány v případě srovnání korových hladin Αβ42. Průměrná hladina Αβ42 u PBS kontrol byla 1624 ng/g. Významné snížení průměrných hladin bylo zjištěno u myší léčených ANI792 s CFA/IFA (403 ng/g), ANI792 salum (1149 ng/g), ANI792 s MPL (620 ng/g) a u ANI792 s QS-21 (714 ng/g), přičemž snížení dosáhlo v případě skupiny léčené ANI792 s CFA/IFA statistické významnosti na hladině p = 0,05. Průměrná hladina Αβ42 u myší léčených AN1792 s thiomersalem byla 1619 ng/g.

Příklad 10

Analýzy toxicity

Po ukončení studií popsaných v příkladech 2, 3 a 7 byly tkáně shromážděny pro histopatologické prozkoumání. U krevních vzorků z příkladu 3 a 4 byly provedeny ještě hematologické a klinické testy. Prozkoumána byla většina hlavních orgánů jako jsou mozek, plíce, lymfatické tkáně, gastrointestinální trakt, játra, ledviny, nadledvinky a gonády. Kromě sporadických lézí u zvířat léčených ANI792 nebyly mezi léčenými a intaktními zvířaty pozorovány žádné zjevné rozdíly v poškození tkání nebo vážnosti lézí. U zvířat imunizovaných ΑΝ 1528 nebyly v porovnání se zvířaty léčenými PBS nebo netečenými zvířaty zaznamenány žádné zvláštní histopatologické léze. Žádné rozdíly nebyly nalezeny ani při porovnání klinických chemických testů mezi skupi35 námi zvířat s adjuvanty a s PBS (příklad 6). Ačkoli došlo k významnému zvýšení některých hematologických parametrů u zvířat léčených ANI792 s Freundovým adjuvantem v porovnání se zvířaty léčenými PBS (příklad 6), toto působení bylo možno přisoudit účinku Freundova adjuvantu a doprovodné peritonitidě, a neimplikuje žádné nepříznivé léčby s ANI792. Pro posouzení dopadu léčení byly u PDAPP myší důkladně prozkoumány i případné patologické změny v mozku. Žádný nepříznivý účinek léčby na morfologii mozku nebyl však v žádné z těchto studií zaznamenán. Tyto výsledky naznačují, že léčba s ANI792 je dobře přijímána a neprovázejí ji žádné vedlejší účinky (alespoň ne zásadní).

Příklad 11

Léčba protilátkami proti Αβ

-67CZ 302971 B6

Pokusy popisované v této části byly provedeny proto, aby bylo možno určit schopnosti různých monoklonálních a polyklonálních protilátek proti Αβ v inhibici hromadění Αβ v mozku heterozygotních transgenních myší.

A. Studie 1

I. Schéma studie samic a samců heterozygotních transgenních PDAPP myší, ve věku od 8,5 do 10,5 měsíců io bylo získáno z Charles River Laboratories, Myši byly roztříděny do šesti skupin vystavených působení různých protilátek proti Αβ. Zvířata byla rozdělena tak, aby jejich pohlaví, stáří a původ zůstaly v rámci skupiny co nejméně odlišné. Jak je vidět z tabulky 12, zahrnovaly protilátky čtyři myší monoklonální protilátky specifické proti Αβ, 2113 (zacílení na Αβ zbytky 1 až 12), 10D5 (zacílená na Αβ zbytky 1 až 16), 266 (zacílená na Αβ zbytky 13 až 28 a vázající se na monomer15 ní, ale ne na agregovanou, formu ΑΝ 1792), 21 Fl2 (zacílená na Αβ zbytky 33 až 42). Pátá skupina byla léčena frakcí polyklonální protilátky specifické proti Αβ (připravené imunizací agregovaným ANI 792). Skupina představující negativní kontrolu dostávala pouze PBS bez protilátky.

Monoklonální protilátky byly injikovány v dávce okolo 10 mg/kg (za předpokladu, že myši 20 vážily 50 g). Injekce byly aplikovány intraperitoneálně každý sedmý den tak, aby titry anti-Αβ byly udržovány nad 1000. Přestože byly naměřeny nižší titry u mAb 266, zřejmě z důvodu špatné vazby na agregovaný ANI 792, stejný dávkovači postup byl používán pro celou skupinu. Skupina dostávající monoklonální protilátku 2H3 byla z pokusu vyřazena během prvních tří týdnů, protože protilátka byla in vivo příliš rychle odbourávána. Pro měření protilátkových titrů byla zvířatům odebírána krev vždy před každou dávkou. Léčba probíhala 6 měsíců, celkově po 196 dní. Zvířata byla usmrcena jeden týden po poslední dávce.

Tabulka 12

Experimentální stavba studie 006

Léčebná	N¹	Léčebná	Specifita	Izotyp
skupina		protilátka	protilátky	protilátky
1	9	žádná (samotné PBS)	NA^b	ΝΑ
2	10	polyklonální	Αβ1-42	smíšené
3	0	mAb^c2H3	Αβ1-12	IgGl
4	8	mAb 10D5	Αβ1-16	IgGl
5	6	mAb 266	Αβ13-28	IgGl
6	8	mAb21F12	Αβ33-42	IgG2a
^a Počet myší ve	skupině pri skončení pokusu. Všechny skupiny měly na počátku 10 zvířat

NA: neměřitelná mAb: monoklonální protilátka

-68CZ 302971 B6

2. Materiál a metody b. Příprava protilátek

Polyklonální protilátka proti Αβ byla připravena z krve získané ze dvou skupin zvířat. První skupina byla složena ze 100 samic myší Swiss Webster, 6 až 8 týdnů starých, které byly v dny 0, 15, a 29 imunizovány 100 gg ANI792 s CFA/IFA. Čtvrtá injekce, jež obsahovala poloviční dávku ANI792 byla podána 36. den. Zvířata byla po usmrcení (42. den) zbavena krve, z níž bylo pak izolováno sérum. Séra všech zvířat byla smíšena (celkový objem 64 ml). Druhá skupina byla io složena ze 24 samic izogenních s PDAPP myšmi, ale netransfekovaných lidským APP genem, 6 až 9 týdnů starých, které byly v dny 0, 14, 28 a 56 imunizovány 100 gg ANI792 s CFA/IFA. Zvířata byla po usmrcení (63. den) zbavena krve, z níž bylo pak izolováno sérum. Séra všech zvířat byla smíšena (celkový objem 14 ml). Séra z obou skupin byla smíšena. Protilátková frakce byla přečištěna ve dvou následných srážecích krocích pomocí 50% nasyceného síranu amonného.

Výsledná sraženina byla dialyzována PBS a testována na výskyt endotoxinu. Hladina endotoxinu byla menší než 1 EU/mg.

Monoklonální protilátky proti Αβ byly připraveny z ascitové tekutiny. Ledově vychlazená ascitová tekutina byla za míchání na ledu nejprve zbavena lipidů přidáním koncentrovaného dextran20 sulfátu sodného s výslednou koncentrací 0,238 %. Za neustálého míchání přidán koncentrovaný CaCl₂ až k dosažení výsledné koncentrace 64mM. Roztok byl centrifugován při 10 000 x g a vzniklý pelet byl poté odstraněn. K supematantu byl na ledu kapáním přidán stejný objem nasyceného síranu amonného. Roztok byl znovu centrifugován pri 10 000 x g a vzniklý pelet byl poté odstraněn. Pelet byl resuspendován a dialyzován 20mM Tris-HCl, 0,4M NaCI, pH 7,5. Tato frakce byla nanesena na kolonu Pharmacia FPLC Sepharose Q a vyluhována reverzním gradientem od 0,4M do 0,275M NaCI v 20mM Tris-HCl, pH 7,5.

Frakce s maximálním obsahem protilátky byla po určení měřením absorbance pri 280 nm shromážděna. V preparátu obsahujícím očištěnou protilátku byla změřena metodou BCA koncentrace proteinu a jeho čistota pomocí SDS-PAGE. V preparátu byl zjišťován také obsah endotoxinu. Hladina endotoxinu byla menší než l EU/mg. Titry menší než 100 byly vyhodnoceny jako titry s hodnotou 25.

3. Hladiny Αβ a APP v mozku

Po asi šesti měsících léčby s různými preparáty protilátek anti-Αβ byly ze zvířat mozky vyjmuty a promývány solným roztokem. Jedna hemisféra byla připravena pro imunohistochemickou analýzu, druhá byla použita pro kvantifikaci množství Αβ a APP. Pro měření koncentrace různých forem Αβ a APP byly v 5M guanidinu homogenizovány hipokampální, korové a mozečkové oblasti vyjmuté hemisféry. Homogenáty byly rozředěny (sériové ředění) a následně bylo zjištěno množství amyloidu nebo APP. Kvantifikace byla založena na porovnání výsledků ELISA testů s řadou standardů peptidů Αβ nebo APP o známé koncentraci.

Množství celkového Αβ a Αβί až 42, měřené metodou ELISA v homogenátech mozkové kůry, hipokampu a mozečku jsou uvedeny v tabulkách 11, 12 a 13. Střední hodnota koncentrace celkového Αβ v kontrolní skupině, naočkované PBS, byly 3,6krát vyšší v hipokampu (střední hodnota 63 389 ng/g) než v kůře (střední hodnota 17 818 ng/g). Střední hodnota v mozečku z kontrolní skupiny (30,6 ng/g) byla více než 2000krát nižší než hodnota v hipokampu. Tyto hladiny odpovídají hodnotám, které byly pro heterozygotní transgenní PDAPP myši stejného věku publikovány drive (Johnson-Woods et al., 1997).

V kůře vykazovala jedna skupina (zvířata, jimž byla aplikována polyklonální protilátka anti-Ab) střední hodnotu množství Αβ, měřeného jako Αβί až 42, která se významně lišila od hodnot kontrolní skupiny (p < 0,05) (tabulka 13). Střední hodnota hladiny Αβί až 42 byla u této skupiny sní-69CZ 302971 B6 žena v porovnání s kontrolní skupinou o 65 %. Střední hodnota hladin Αβί až 42 byla v porovnání s kontrolní skupinou významně snížena (o 55 %) také v další testované skupině (zvířata, jimž byla aplikována mAb 10D5, p = 0,0433).

V hipokampu nebyla střední snížení celkového Αβ (o 50 %, p = 0,0055), jež byla spojena s působením polyklonální protilátky anti-Ab, tak velká jako v kůře (o 65 %) (tabulka 14). Absolutní velikost poklesu byla však v hipokampu ve srovnání s kůrou 3krát větší (pokles o 31 683 ng/g tkáně v hipokampu oproti 11 658 ng/g tkáně v kůře). V případě měření hladiny Αβί až 42 (více amyloidogenní forma Αβ), spíše než celkového Αβ, dosáhlo snížení s polyklonální io protilátkou významnosti (p = 0,0025). Střední hladiny u skupin léčených monoklonálními protilátkami 10D5 a 266 byly sníženy o 33 respektive 21 %.

Celkový Αβ byl měřen i v mozečku (tabulka 16). Skupiny, jimž byla aplikována polyklonální protilátka anti-Ab a mAb 266 vykazovaly významné snížení hladin celkového Αβ (o 43 a o

46 %, p = 0,0033 a p = 0,0184), u skupiny léčené I ODS bylo zjištěno bezmála významné snížení (o 23 %. p - 0.0675).

Metodou ELISA byly v kůře a v mozečku zvířat léčených protilátkami a kontrolních (pouze PBS) zjišťovány i koncentrace APP. Pro stanovení APP byly použity dvě různé analýzy. První, ozna20 čená APP-ot/FL, rozeznávala APP-α (a, sekretovaná forma APP, která byla vyštípnuta z Αβ sekvence) a formy APP o plné délce (FL), přičemž druhá rozeznává pouze APP-α. na rozdíl od snížení hladiny Αβ, pozorované u části léčených zvířat, zůstaly hladiny APP v porovnání s kontrolami prakticky nezměněny. Tyto výsledky naznačují, že

-70CZ 302971 B6 (N

3.

<

á

Eá

I λ

«Π

Ή rs

Γ4 trr m

<n <n fn m

cn

Ό §

Ό o\ n· rr5 m

+1 s

Léčebná N^a Střední hodnoty Průměry skupina

Celkový Αβ Αβ42 Celkový Αβ

Ό

V)

MΓ44

O

W1

O\

ÍN <n rS $

+1 in

O £

m σ\

C4

O>

s

Si £5 o

t44 i—I

Tt

C4 o

<n — Γ4 <N *?

m fn o

<n

Ά

ΓΜ

C4

O

OO ťN

CN

OO tt

OO

Γ'·

Ά en v>

\O

Ό in <

Z

<n	o		OO
in	i—l	•Λ	cn
O	o	n	00
o			Γ4
o	o	θ'	θ'

»n <« o a § ω

r-~ o

\o

O\ f—i

CO

CQ ft

CN r3

I—1 o

OO	<o	OO
		CM
vn
O	X)	ft
O	X)	t—1
1—«	<N	C4
x>	X>	X)

í

a. Počet zvířat ve skupině na konci pokusu

b. ng/g tkáně

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: neměřitelné

e. standartní odchylka

-71 CZ 302971 B6

Léčebná N^a Střední hodnoty Průměry skupina

Celkový Αβ Αβ42 Celkový Αβ Αβ42

o	§	sO	ří	Γ CM
		o	CM		m	o>
		'M'	OQ	Γ-	VI	m
		·““¹	—~	<—<	CM	CM
	2	Ή	-H	-H	+1	Ή
	o	1—1	cn	*Ci	O
co		O	»cs	SO		o
u	o	OO CM	OQ Tt	3	os CM	cs o
tu	-C	SC	CM	m	cn

<	8	00 o m cn	>7i s CM	CM m so oo	s m r~ CM	r~- Í3 Os OO CM
(Λ	1	+1	-H	+1	-H	Ή
-3	Q	T—1	oo		2	c-
W		V)	>n	00		CM
	m oo	O	sn 5	ND	m C-
			cn	m	in

	>>
	>S g		o *?	(*> rO
	a
	O		sn	n
	o	<	CM	*Τ
CL	o	ž	8	VS O
	-e		o	o
< co u	o	OS CM	r~ CM	o Os CM
tu		*n	CM	SO m
	>s
	c
''x	«Ώ	<	O	Ό
g	z	KS 1	CM

	8	<n	<n
CL		m s.	r- SO o
	_c	o	o

cm cn

CM g

o

CM

OS

Os o

OQ o

SO

OS r*>

rr

Os

OQ

CM rro

	O	Os	8	Os	OS	CS
<Λ	«§ o O	OO	r-	O0	SO
H v	m m	r·	C' SO	8	w~í
tu o	n jq	so		ΤΓ	Tj-	Ό

Os

CZl

CQ

CL

	QO	SO	OO
3	in Q	Ό	CM E
CZL	o	SO	t—<·
í		CM	CM
x	X)	X

1 1

CL

a. Počet zvířat ve skupině na konci pokusu

b. ng/g tkáně

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: neměřitelné

e. standartní odchylka

		©		m
		oo	SO	Φ	Os	©
		#s	m	Os	VS Λ	©
		m	Φ		SO	Os
	rt -w	-H	Ή	-H	+1	+1
	9	O	vs	Os	Os	oo
w	fl 9	© Λ §	ri 00	CM r-“	vs *1 o	oo »s CM
O Λ		CM	t—»	m

co

T

Os

CM so

T

Tabulka 15 Mozeček sa ό

o

Λ

O

T3 u

>u ·** «3 ca.

i u

					©
rt		m	vs	Φ	©
o		cn	Γ-	oo	©
rt	o,	©	SO	T-l	©^
*9		©	©_Λ	© r>	©
O	%	©“	©	©	Λ
J3

	rt
tZ)	O	Φ	w—1	oo	©	©
hi	rt	SO	©	so	vy	OO
J	Ό	©	o	n	so“	©
U)	O	en	t—í	CM		CM

SO oo rt .8 cu

JŽ n

-rt a

fi a

>9

-4» s

Cm

vs

Q ©

o

W1

I

ÍX >1—1

G á

rt

G .g

I v

>

cá s

w ω

>9

O pu, rt

b. ng/g tkáně

c. Mann-Whitney analýza

d. NA: neměřitelné

e. standartní odchylka imunizace protilátkami proti Αβ způsobuje snižuje hladinu Αβ, aniž by působilo snížení hladiny APP.

-73CZ 302971 B6

Závěrem lze říci, že k významnému snížení hladin Αβ došlo u zvířat léčených polyklonální protilátkou připravenou imunizací s ANI792 v mozkové kůře, hipokampu a v mozečku. Léčebné účinky v menší míře prokázaly i monoklonální protilátky proti části aminového konce Αβί až 42, konkrétně proti aminokyselinám 1 až 16 a 13 až 28.

4. Histochemické analýzy

U části myších mozků ze skupin léčených PBS, polyklonální Αβ42, 21F12, 266 a 10D5 byla kvalitativně porovnávána morfologie Αβ-imunoreaktivních plaků stou u zvířat z předchozích experimentů, jež dodržovaly standardní imunizační postupy s Αβ42.

Největší změna, a to jak v rozsahu, tak i ve vzhledu amyloidních plaků, byla pozorována u zvířat imunizovaných polyklonální protilátkou proti Αβ42. Snížení amyloidní zátěže, rozrušená morfologie ptáku a buněčně zprostředkovaná Αβ imunoreaktivita blízce připomínaly účinky dosažené standardní imunizační procedurou. Tato zjištění souhlasí s výsledky docílenými ELISA testy, při kterých bylo po aplikaci polyklonální protilátky proti Αβ42 zaznamenáno významné snížení celkového Αβ a Αβ42.

V případě skupiny vystavené působení 10D5 bylo také dosaženo snížení amyloidní zátěže a změn morfologie plaku, spolu se známkami buněčné Αβ imunoreaktivity. V porovnání s PBS kontrolami nebyly u skupin léčených 21F12 a 266 zjištěny žádné větší rozdíly.

5. Měření protilátkových titrů

Třem myším náhodně vybraným z každé skupiny byla vždy před každou intraperitoneální aplikací odebrána krev (celkově 30 odběrů). Protilátkové titry byly určeny pomocí vazby, stanovené technikou sendvičové ELISA) protilátky proti Αβί až 42 na Αβί až 42, jež bylo umístěno v plastových víeejamkových (multi-well plates) miskách (detailněji viz Všeobecný materiál a metody). Průměrné titry polyklonálních protilátek a monoklonálních protilátek 10D5 a 21F12 pro každý odběr jsou ukázány na obr. 16 až 18. V případě polyklonálních protilátek měly titry v průměru hodnotu T.1000, přičemž v případě monoklonálních protilátek 10D5 a 21F12 byly lehce nad touto hodnotou.

6. Lymfoproliferativní odpovědi

Lymfoproliferace vyvolaná přítomností Αβ byla zjišťována ve slezinných buňkách, shromážděných přibližně osm dní po poslední imunizaci. Čerstvě získané buňky (10⁵ najamku) byly pěstovány v přítomnosti Αβί^40 v koncentraci 5 μΜ/stimulací po 5 dní. Jako pozitivní kontrola sloužily buňky pěstované v přítomnosti mitogenu T-buněk, PHA, za negativní kontrolu byly považovány buňky pěstované bez peptidu.

Splenocyty ze starých PDAPP myší, pasivně imunizovaných různými protilátkami anti-Αβ byly in vitro stimulovány ANI792, načež byly měřeny proliferativní a cytokinové odpovědí. Cílem těchto analýz bylo zjistit zda pasivní imunizace podporuje předkládání antigenů a vybavuje tak pro ANI792 specifické odpovědi T-buněk. U myší pasivně imunizovaných protilátkami proti Αβ nebyly zjištěny žádné ΑΝ 1792-specifické proliferativní a cytokinové odpovědi.

B. Studie 2

V druhé studii byla opakována léčba protilátkou 10D5, přičemž byly testovány ještě dvě další monoklonální protilátky, 3D6 (Αβι_₅) a 16C11 Αβ₃^»₂). Kontrolní skupiny dostávaly bud* PBS, nebo irelevantní izotypově odpovídající protilátku TM2a. Použité myši byly starší (11,5 až 12 měsíců staří heterozygoti) než ty v předchozí studii; ostatní experimentální podmínky zůstaly zachovány. Po šesti měsících léčby snížila 10D5 v porovnání $ kontrolami plakovou zátěž více

-74CZ 302971 Β6 než o 80 % (p = 0,003). 3D6 bylo stejně účinné a vyvolávalo 86% snížení (p = 0,003). Protilátka 16C11 neměla, na rozdíl od dvou předchozích, na plakovou zátěž žádný účinek. Obdobných výsledků bylo dosaženo při Αβ₄₂ ELISA. Tyto výsledky značí, že protilátková odpověd' proti peptidu Αβ je, při neúčasti imunity zprostředkované T-buňkami, pro snížení amyloidního ukládání u PDAPP myší dostatečná, i když ne všechny protilátky anti-Ab jsou účinné. Zvláště účinné jsou protilátky zaměřené proti epitopům Αβ obsahujícím aminokyseliny 1 až 5 a 3 až 7.

Tyto studie dokazují, že pasivní podání protilátek proti Αβ snižuje rozsah ukládání plaků u myšího modelu Alzheimerovy choroby. Při udržování mírných sérových koncentrací (25 až 70 pg/ml) se protilátky do CNS dostávají v množství dostatečném proto, aby zasáhly amyloidní plaky. Vstup protilátek nebyl způsoben abnormální propustností hematoencefalické bariéry, protože při měřením Evansovou modří nebyla zjištěna zvýšená cévní propustnost. Koncentrace protilátky v mozkovém parenchymu starých PDAPP myší byla stejná jako u myší netransgenních, přičemž představovala 0,1 % z koncentrace v séru (nehledě na izotyp).

D. Studie 3: Sledování vazby protilátky

Za účelem zjištění zda protilátky proti Αβ mohou působit přímo uvnitř CNS, byly mozky myší (promývané solným roztokem) z konce příkladu 11 zkoumány pro přítomnost periferně aplikovaných protilátek. Nefixované mozkové řezy z kryostatu byly vystaveny působení fluorescenčnímu činidlu proti myšímu imunoglobulínu (kozí IgG-Cy3 proti myšímu IgG). Plaky uvnitř mozků ze skupin 10D5 a 3D6 byly silně obaleny protilátkami, přičemž skupina 16C11 nevykazovala žádnou fluorescenci. Za účelem určení celkové oblasti obsazené plaky byla u sériových řezů z každého mozku provedena nejprve imunoreakce s protilátkou anti-Αβ a poté se sekundárním činidlem 10D5 a 3D6 dosáhly po aplikaci v periférii většinu plaků v CNS. Plaková zátěž byla na rozdíl od skupiny 16C11 v těchto léčebných skupinách silně snížena. Tyto údaje naznačují, že periferně aplikované protilátky mohou vstoupit do CNS, kde přímo spouštějí odbourávání amyloidu. Je pravděpodobné, že 16C11 se k plakům dostala také, ale nebyla schopna se na ně vázat.

Příklad 12

Prevence a léčba u lidí

Jednodávková zkouška fáze I je uskutečňována pro zjištění bezpečnosti u lidí. Léčebné činidlo je podáváno ve vzrůstajících dávkách, přičemž se začíná na jedné setině hladiny zamýšlené účinnosti a pokračuje se takovým způsobem, že každá další dávka je trojnásobkem dávky předešlé, dokud není dosaženo desetinásobku dávky účinné u myši.

Zkouška fáze lije uskutečňována pro určení léčebné účinnosti. Vybírání jsou pacienti s lehkou až střední Alzheimerovou chorobou, což je určeno podle měřítek Asociace pro Alzheimerovu chorobu a příbuzné poruchy (ADRDA). Vhodní pacienti dosahují v mentálním testu MMSE (Mini-Mental State Exam) 12 až 26 bodů. Mezi další výběrová měřítka lze zahrnout i pravděpodobnost s jakou pacienti přežijí dobu trvání studie a nepřítomnost komplikujících faktorů, knimž patří například nutnost užívání jiných léků, které mohou léčbu narušovat. Základní hodnocení pacientových funkcí jsou prováděna pomocí klasických psychometrických měření, například MMSE a ADAS (Alzheimeris Disease Assessment Scale). Tyto psychometrické škály poskytují míru postupu Alzheimerovy choroby. Vhodné škály určující kvalitu života mohou být pro sledování léčby použity také. Postup nemoci může být sledován i pomocí MRL Krevní profily pacientů mohou být také sledovány (analýzy výskytu protilátek proti imunogenu a odpovědi T-buněk).

-75CZ 302971 B6

Po zjištění základních údajů začíná léčba pacientů. Pacienti jsou náhodně rozděleni léčeni buď léčebným činidlem, nebo placebem (aniž by o tom věděli). Pacienti jsou sledováni nejméně každých šest měsíců. Účinnost je stanovena podle významného zpomalení postupu nemoci u pacientů v léčebné skupině při porovnání se skupinou dostávající placebo.

Zkouška fáze II je uskutečňována pro určení přechodu pacientů s předčasnou ztrátou paměti nezpůsobenou AD, někdy popisovanou jako se stárnutím spojené oslabení paměti (AAM1) nebo mírné kognitivní oslabení, k předpokládané Alzheimerově chorobě, definované ADRDA kritérii. Pacienti s vysokým rizikem přechodu k Alzheimerově chorobě jsou vybíráni z normální populace io pomocí sledování začínajících známek ztráty paměti nebo jiných těžkostí projevujících se symptomytologicky jako stavy před vznikem AD, podle předchozího výskytu AD v rodině, rizikových genetických faktorů, věku, pohlaví a dalších znaků, které poukazují na vysoké riziko vzniku

AD. Shromážděny jsou základní výsledky jednotlivých potřebných testů, zahrnujících MMSE a ADAS, spolu s výsledky dalších testů, jež hodnotí normální populaci. Tito pacienti jsou rozděleni do skupin s placebem nebo s léčebným činidlem a jsou sledováni nejméně každých šest měsíců, přičemž léčba končí v bodě, kdy u nich dojde či nedojde k přechodu k předpokládané AD, definované ADRDA kritérii.

Příklad 13

Všeobecný materiál a metody

1. Měření proti látkových titrů

Myším byla odebrána krev z malého řezu v ocasní žíle, přičemž do mikrozkumavky bylo pak shromážděno asi 200 μΐ krve. Morčatům byla krev po obolení zadní části zánártí odebírána z metatarzální žíly jehlou 18 gauge, přičemž poté byla shromážděna do mikrozkumavek. Krev byla ponechána srážet se po 1 h při pokojové teplotě (RT) a pak byla vortexována a centrifugována při 14 000 x g po 10 minut, za účelem oddělení sraženiny od séra. Sérum bylo přeneseno do čisté mikrozkumavky a skladováno při 4 °C až do stanovení titru. Protilátkové titry byly měřeny pomocí ELISA. Mikrotitrační destičky s 96 jamkami (Costar El A plates) byly pokryty 100 μΐ roztoku obsahujícího 10 μΙ/ml Αβ42 nebo SAPP nebo jiné antigeny (uvedeno v jednotlivých příkladech) v pufru pro pokrývání jamek (0,lM fosforečnan sodný, pH 8,5, 0,1% azid sodný) a nechány přes noc při RT. Zbylý roztok v destičkách byl odsát a poté bylo do jamek přidáno sérum (počáteční ředění í: 100) ve vzorkovém rozpouštědle (0,014M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,6% sérový hovězí albumin, 0,05% thiomersal). Přímo v destičkách byly vzorky v sedmi krocích sériově naředěny (v násobcích tří), přičemž výsledné ředění bylo 1:218 700 a inkubovány po 1 h při RT. Destičky byly poté čtyřikrát opláchnuty PBS obsahujícím

0,05% Tween 20. Druhá protilátka, kozí IgG proti myšímu IgG konjugovaný s křenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim), byl přidán do jamek jako 100 μΙ roztoku ředěného ve vzorkovém rozpouštědle 1:3000 a inkubován po 1 h při RT. Destičky byly poté znovu čtyřikrát opláchnuty v PBS s Tween 20. Pro vyvolání chromogenu bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ SIow TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin, Pierce Chemicals) a poté následovalo 15 min inkubace při RT.

Reakce byla zastavena přidáním 25 μΐ 2M H₂SO₄. Intenzita zbarvení byla vyhodnocena pomocí přístroje Vmax (Molecular Devices) při 450 až 480 nm.

Titry byly definovány jako převrácené hodnoty ředění séra, které představovalo polovinu maximální OD, Maximální OD byla určena při počátečním ředění 1:100, což neplatilo pouze u případů s velmi vysokými hodnotami titrů, pro které bylo nutné za maximální OD určit vyšší počáteční ředění. Jestliže 50 % bodů zapadá mezi dvě ředění, pak se hodnota výsledného titru spočítala pomocí lineární extrapolace. Pro spočítání geometrického průměru proti látkových titrů byly titry menší než 100 vyhodnoceny jako titry s hodnotou 25.

-76CZ 302971 B6

2. Analýza proliferace lymfocytů

Myši byly umrtveny isofluranem. Sleziny byly odebrány a dvakrát opláchnuty s 5 ml PBS obsahujícím 10% tepelně inaktivované fetální telecí sérum (PBS-FBS) a poté v 1,5 ml PBS-FBS po 10 s pri 100 rpm homogenizovány pomocí zařízení Centricon 50 (Dako A/S, Denmark) v Medimachine (Dako). Homogenizát byl pak přefiltrován přes nylonovou síť s póry velikosti 100 pm. Splenocyty byly jednou opláchnuty v 15 ml PBS-FBS a peletovány centrifugací při 200 xg 5 min. Červené krvinky byly lyžovány resuspendováním peletu v 5 ml pufru (0,15M NH₄C1, 1M KHCO₃, 0,lM NaEDTA, pH 7,4) po 5 min při RT. Leukocyty byly poté opláchnuty stejně jako výše. Čerstvě izolované slezinné buňky (10⁵ buněk na jamku) byly pěstovány v triplikátech v 96ti jamkových mikrotitraěních destičkách, určených pro tkáňové kultury a s dnem ve tvaru písmene U (Corning, Cambridge, MA), po 96 h při 37 °C. K pěstování bylo použito médium RPMI 1640 (JRH Bioscience, Lenexa, KS) doplněné 2,05mM L-glutaminem, 1% Penicilin/Streptomycin a 10% tepelně inaktivováným FBS. V čtyřech krocích byly v dávkách od 5 do 0,18 μΜ přidány také různé Αβ peptidy (Αβ1-16, Αβί-40. Αβί-42 nebo protein s obrácenou sekvencí Αβ40-1). Buňky v kontrolních jamkách byly pěstovány s konkanavalinem A (Con A) (Sigma, kat. č. C-5275), 1 pg/ml) bez přidaného proteinu. Na posledních 24 h pěstování byl k buňkám přidán ³H-thymidin (1 pCi/jamku, Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Poté byly buňky shromážděny na miskách UniFilter a radioaktivita spočítána v zařízení Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Výsledky jsou vyjádřeny jako cpm (záblesky za minutu) radioaktivity inkorporované do nerozpustných molekul.

4. Preparace mozkové tkáně

Po umrtvení myší byly jejich mozky vyjmuty a jedna hemisféra byla připravena pro imunohistochemickou analýzu, druhá byla použita pro kvantifikaci množství Αβ a APP v hipokampu, kůře a mozečku pomocí specifických ELISA (Johnsnon et al., viz výše).

Tkáně určené pro ELISA byly homogenizovány v 10 dílech ledově studeného guanidinového pufru (5,0M guanidin-HCl, 50mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenáty byly promíchány jemným mícháním po 3 h pri RT za použití přístroje Adams Nutator (Fisher) a před kvantifikací Αβ a APP uchovány v -20 °C. Předchozí pokusy ukázaly, že analyty byly za těchto skladovacích podmínek stabilní, a že protein zůstal co do množství zachován, což bylo zjištěno přidáním syntetického Αβ protein (Bachem) do homogenátu mozků z kontrolních zvířat (Johnson et al., viz výše).

5. Měření hladin Αβ

Mozkové homogenáty byly naředěny 1:10 s ledově studeným kaseinovým rozpouštědlem (0,25% kasein, 0,05% azid sodný, 20 pg/ml aprotinin, 5mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptin) a poté centrifugovány při 16 000 x g po 20 min pri 4 °C. Standardy syntetického proteinu Αβ (1 až 42 aminokyselin) a standardy APP byly připraveny tak, aby ve výsledném složení obsahovaly 0,5M guanidin a 0,1 % hovězího sérového albuminu (BSA). Technika sendvičové ELISA pro zjištění „totálního“ Αβ používala monoklonální protilátku 266, specifickou pro aminokyseliny 13 až 28 v Αβ (Seubert et al., jako uchycenou protilátku a biot inyl ovanou monoklonální protilátku 3D6, specifickou pro aminokyseliny 1 až 5 (Johnson-Wood et al.) jako referenční (reportér) protilátku. Monoklonální protilátka 3D6 nerozeznávala sekretované APP nebo APP plné délky, ale pouze formy Αβ s kyselinou asparagovou na aminovém konci. Dolní hranice citlivosti se u této analýzy nachází okolo 50 ng/ml, přičemž křížové reakce s myším endogenním Αβ proteinem se neobjevují až do koncentrace 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., viz výše).

Technika sendvičové ELISA specifická pro Αβί-42 používala monoklonální protilátku 21F12, specifickou pro aminokyseliny 33 až 42 v Αβ (Seubert et al.) jako uchycenou protilátku a opět

-77CZ 302971 Β6 biotinylovanou monoklonální protilátku 3D6 jako referenční protilátku. Dolní hranice citlivosti je u této analýzy nižší a nachází se okolo 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood et al.). Pro ELISA testy Αβ bylo bud’ 100 pl mAb 266 (10 pg/ml), nebo mAb 21F12 (5 pg/ml) aplikováno na misky s 96 jamkami určené pro imunoanalýzu (Costar) a ponecháno přes noc při 4 °C. Roztok byl odstraněn odsátím a jamky byly blokovány přidáním 200 pl 0,25% lidského sérového albuminu v PBS pufru po nejméně 1 h při RT. Blokovací roztok byl odstraněn a misky byly až do použití uchovány vysušené při 4 °C. Misky byly před použitím rehydratovány pomocí oplachovacího pufru [Tris pufrovaný roztok solí (0,115M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05% Tween 20]. Vzorky a standardy byly přidány z alikvotů v triplikátech, 100 pl na jamku a poté inkubovány pres noc při 4 °C. Misky byly mezi jednotlivými kroky v analýze nejméně třikrát opláchnuty pomocí oplachovacího pufru. Biotinylovaná mAb 3D6, naředěná na 0,5 pg/ml v kaseinovém pufru (0,25% kasein, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4), byla přidána a inkubována v jamkách po 1 h při RT. Konjugát avidinu a křenové peroxidázy (Avidin-HRP, Vector, Burlingame, CA), naředěný 1:4000 v kaseinovém pufru, byl přidán do jamek na 1 h při RT. Kolorimetrický substrát, Slow-TMB-ELISA (Pierce), byl přidán a ponechán reagovat 15 min při RT. Poté byla enzymatická reakce zastavena přidáním 25 pl 2N H₂SO₄. Produkt reakce byl kvantifikován za použití čtecího přístroje Vmax (Molecular Devices), jenž měřil rozdíl absorbanci při 450 a 650 nm.

6. Měření hladin APP

Pro měření hladin APP byly použity dvě různé analýzy. První, označená ΑΡΡ-α/FL (a, sekretovaná forma APP, která byla vyštípnuta z Αβ sekvence a obsahovala prvních 12 aminokyselin Αβ) a formy APP o plné délce (FL), přičemž druhá rozeznává pouze APP-α. Jelikož referenční protilátka (2H3) není specifická pro svorku α-části vyskytující se mezi aminokyselinami 612 až 613 v APP695 (Esch et al., Science 248, 1122 až 1124, 1990); tato analýza také rozeznává APP o plné délce (APP-FL). Předběžné pokusy, prováděné za účelem očištění mozkových homogenátu od APP-FL a používající imobilizované APP protilátky specifické pro cytoplazmatický konec v APP-FL, naznačily, že přibližně 30 až 40 % z ΑΡΡ-α/FL je FL (data neuvedena). Analýzy ΑΡΡ-α/FL i APP-α používaly monoklonální protilátku 8E5, specifickou pro aminokyseliny 444 až 592 v APP695 (Games et al., viz výše) jako uchycenou protilátku a biotinylovanou monoklonální protilátku 2H3 (ΑΡΡ-α/FL analýza), specifickou pro aminokyseliny 597 až 608 (Johnson-Wood et al.) a biotinylovanou monoklonální protilátku I6H9, specifickou pro aminokyseliny 605 až 611, jako referenční protilátku. Dolní hranice citlivosti těchto analýz se v případě ΑΡΡ-α/FL nachází okolo 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al., viz výše) a v případě APP-α okolo 22 ng/ml (0,3 nm). V obou APP analýzách byla mAb 8E5 aplikována na 96ti jamkové misky pro EIA způsobem popsaným pro mAb 266 (viz výše). Jako referenční standard pro analýzy APP-α a ΑΡΡ-α/FL bylo použito přečištěné rekombinantní sekretované APPα (Esch et al., viz výše). Vzorky s mozkovými homogenáty v 5M guanidinu byly naředěny 1:10 ve vzorkovém pufru pro ELISA (0,014M fosfátový pufr, pH 7,4, 0,6% hovězí sérový albumin, 0,05% thiomersal, 0,5M NaCl, 0,1% NP40). Poté byly naředěny 1:4 ve vzorkovém pufru s 0,5M guanidinem. Naředěné homogenáty byly pak centrifugovány při 16 000xg po 15 s při RT. Vzorky a standardy APP byly přidány z alikvot na misky v duplikátech a inkubovány přes noc pri 4 °C. Biotinylovaná referenční protilátka 2H3 nebo 16H9 byla inkubována se vzorky po 1 h při RT. Konjugát streptavidinu a alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim), ředěný 1:1000 ve vzorkovém pufru, byl inkubován v jamkách po 1 h při RT. Na 30 min v RT byl přidán fluorescenční substrát (4-methyl-umbelliferyl-fosfát) a misky byly analyzovány fluorimetrem Cytofluor 2350 (Míllipore), přičemž excitace probíhala při 350 nm a emise pri 450 nm.

7. Imunohistochemie

Mozky byly fixovány po 3 dny při 4 °C ve 4% paraformaldehydu v PBS a pak do doby než byly nařezány skladovány 1 až 7 dní při 4 °C v 1% paraformaldehydu v PBS. Koronální řezy 40 pm silné byly nakrájeny na vibratomu při RT a skladovány v kryoprotektantu (30% glycerol,

-78CZ 302971 B6

30% ethylenglykol ve fosfátovém pufru) při -20 °C než byly použity pro imunohistochemickou analýzu. Z každého mozku bylo pořízeno šest řezů v oblasti dorsálního hipokampu (mezera mezi řezy byla vždy 240 μπι), které byly přes noc inkubovány s jednou z následujících protilátek: (1) biotinylovaná anti-Αβ (mAb, 3D6, specifická pro lidské Αβ) naředěná v koncentraci 2 pg/ml v PBS s 1% koňským sérem; nebo (2) biotinylovaná mAb specifická pro lidské APP, 8E5, naředěná v koncentraci 3 pg/ml v PBS s 1% koňským sérem; (3) mAb specifická pro gliální vláknitý acidícký protein (GFAP, Sigma Chemical Co.), naředěná 1:500 v 0,25% Triton X-100 s 1% koňským sérem v solném roztoku pufrovaném Tris, pH 7,4 (TBS); nebo (4) mAb specifická pro CDllb, MAC-1 antigen (Chemicon International), naředěná 1:100 v 0,25% Triton X-100 s 1% io králičím sérem v TBS; nebo (6) krysí mAb specifická pro CD43 (Pharmingen), naředěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (7) krysí mAb specifická pro CD45RA (Pharmingen), naředěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (8) krysí mAb specifická pro CD45RB (Pharmingen), naředěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (9) krysí mAb specifická pro CD45 (Pharmingen), naředěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (10) biotinylovaná polyklonální křeččí specifická pro CD3e (Pharmingen) naředěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (11) krysí mAb specifická pro CD3 (Serotec), naředěná 1:200 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (12) roztok PBS bez primární protilátky a obsahující 1% normální koňské sérum.

Řezy určené pro reakci s roztoky protilátek l, 2 a 6 až 12 byly nejprve vystaveny působení 1%

Triton X-100 a 0,4% peroxidu vodíku v PBS po 20 min při RT, za účelem zablokování endogenní peroxidázy. Pak byly přes noc inkubovány při 4 °C s primární protilátkou. Řezy určené pro reakci s 3D6 nebo 8E5 nebo CD3e byly pak po 1 h při RT vystaveny působení komplexu křenová peroxidáza-avidin-biotin spolu s částmi komerční sady, označenými „A“ a „B“, které byly naředěny 1:75 v PBS (Vector Elitě Standard Kit, Vector Labs, Buríingame, CA). Řezy určené pro reakci s protilátkami specifickými pro CD45RA, CD45RB, CD45, CD3 a roztok PBS bez primární protilátky byly inkubovány po 1 h při RT s biotinylovaným IgG proti krysímu IgG (Vector), naředěným 1:75 v PBS nebo s biotinylovaným IgG proti myšímu IgG (Vector), naředěným 1:75 v PBS. Řezy byly pak po 1 h při RT vystaveny působení komplexu křenová peroxidázaavidin-biotin spolu s částmi komerčního kitu (komerční sady), označenými „A“ a „B“, které byly naředěny 1:75 v PBS (Vector Elitě Standard Kit, Vector Labs, Buríingame, CA).

Řezy byly vyvolány v 0,01% peroxidu vodíku, 0,05% 3,3*-diaminobenzidinu (DAB) pří RT. Řezy určené pro inkubaci s protilátkami specifickými pro GFAP, MAC-1, MHC II byly nejprve vystaveny působení 0,6% peroxidu vodíku při RT, za účelem zablokování endogenní peroxidázy a pak inkubovány přes noc při 4 °C s primární protilátkou. Řezy, u nichž proběhla reakce s protilátkou proti GFAP byly inkubovány po 1 h při RT s biotinylovaným koňským IgG proti myšímu IgG (Vector Laboratories; Vectastain Elitě ABC Kit) naředěným 1:200 v TBS. Řezy byly pak po 1 h při RT vystaveny působení komplexu křenová peroxidáza-avidin-biotin (Vector Laboratories; Vectastain Elitě ABC Kit) neředěnému 1:1000 v TBS. Řezy inkubované s mono40 klonálními protilátkami specifickými pro MAC-1 a MHC II byly následně vystaveny působení biotinylovanému králičímu IgG proti myšímu IgG, naředěnému 1:200 v TBS, pak byly po 1 h při RT vystaveny působení komplexu křenová peroxidáza-avidin-biotin naředěnému 1:1000 v TBS. Řezy inkubované s protilátkami specifickými pro GFAP, MAC-l a MHC II byly poté při RT vizualizovány působením 0,05% DAB, 0,01% peroxidu vodíku, 0,04% chloridu nikelnatého a

TBS po 4 a 11 min.

Řezy označené protilátkou byly připevněny na podložní skla (VWR, Superfrost slides), přes noc vysušeny na vzduchu, propláchnuty v Propar (Anatech) a překryty krycími sklíčky za použití upevňujícího média Permount (Fisher).

Proto, aby byly zviditelněny i plaky Αβ, byla po imunohistochemickém zpracování Část GFAPpozitivních řezů upevněna na sklíčka Superfrost a inkubována v 1% vodném Thioflavinu S (Sigma) po 7 min. Řezy byly pak dehydratovány a omyty v Propar a pak překryty krycími sklíčky za použití upevňujícího média Permount.

-79CZ 302971 B6

8. Obrazová analýza

Pro kvantifikaci imunoreakcí v řezech byl používán systém analýzy obrazu Videometric 150 (Oncor, lne., Gaithersburg, MD) připojený k CCD kamerou k mikroskopu Nikon Microphot-FX a monitoru Sony Trinitron. Obraz řezu byl uložen a na základě barvy a sytosti byl určen práh pro výběr a výpočet celkové oblasti obrazových prvků zobrazujících struktury, ve kterých proběhla imunitní reakce. U každého řezu byl ručně obrýsován hipokampus a pak spočítán celkový prostor obrazových prvků zobrazujících hipokampus. Procento amyloidní zátěže bylo měřeno jako: (část hipokampální oblasti obsahující usazeniny Αβ zjištěné imunoreakcí s mAb 3D6) x 100. Obdobně bylo měřeno procento neuritické zátěže: (část hipokampální oblasti obsahující dystrofické neurity reagující s monoklonální protilátkou 8E5) x 100. Pro zjištění procent retrospleníální oblasti obsazené GFAP-pozitivními astrocyty a MAC-1- a MHC ll-pozitivní mikroglií byl použit systém C-Imaging (Compix, lne., Cranberry Township, PA), jež operoval s programem Simple 32 Software Application a byl pomocí kamery Optronics napojen na mikroskop Nikon Microphot-FX. Obraz oblasti, v níž proběhla imunitní reakce byl uložen a na základě jedné barvy byl určen práh pro výběr a výpočet celkové oblasti obrazových prvků zobrazujících buňky, ve kterých proběhla imunitní reakce. U každého řezu byl ručně obrýsován retrospleníální kůra (RSC) a pak spočítán celkový prostor obrazových prvků zobrazujících RSC. Procento výskytu astrocytózy bylo měřeno jako: (část RSC oblasti obsazené GFAP-pozitivními astrocyty) x 100. Obdobně bylo měřeno procento mikrogliózy: (část RSC oblasti obsazené MAC-1- nebo MHC ll-pozitivní mikroglií) x 100. U každého zvířete bylo při kvantifikaci obrazovou analýzou z mozku pořízeno šest řezů v oblasti dorsálního hipokampu (mezera mezi řezy byla vždy 240 gm). V žádném z případů nebyl pozorovateli (pracovník provádějící analýzu obrazu) sdělen stav a prováděná léčba zvířete.

Příklad 14

Analýza ex vivo účinku protilátek na amyloidní usazeniny

Pro zjištění účinku protilátek na odbourávání plaků byla použita exvivo analýza, při které byly primární mikrogliální buňky pěstovány s nezafixovanýmí řezy z kryostatu, jež pocházely z mozků PDAPP myší nebo z lidských mozků s AD. Mikrogliální buňky byly získány z mozkové kůry novorozených DBA/2N myší (1 až 3 dny staré). Kůry byly mechanicky rozrušeny v HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solutíon, Sigma) s 50 gl/ml DNázy I (Sigma). Rozvolněné buňky byly přefiltrovány přes 100 gm „cell stainer“ (Sigma) a centrifugovány při 1000 rpm po 5 min. Pelet byl resuspendován v růstovém médiu (DMEM s vysokým obsahem glukózy, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a buňky byly pěstovány v hustotě 2 mozky na plastovou kultivační láhev 7—75. Po 7 až 9 dnech byly lahve stočeny na orbitálním třepadle při 200 rpm po 2 h pří 37 °C. Buněčná suspenze byla centrifugována při 1000 rpm a resuspendována v analytickém médiu.

gm Široké kryostatické řezy z mozků PDAPP myší nebo z lidských AD mozků, jež byly pořízeny méně než 3 h po smrti, byly nechány rozehřát upevněny na kulatém sklíčku pokrytém polylysinem a umístěny do jamek (24ti jamková kultivační miska). Sklíčka byla dvakrát opláchnuta analytickým médiem obsahujícím H-SFM (hybridomové médium bez séra, Gibco BRL) s 1% FBS, glutaminem, penicilin/streptomycinem a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontrola nebo protilátky proti Αβ byly přidány koncentrované 2x (výsledná konc. 5 gg/ml) na 1 h. Mikrogliální buňky byly pak vysazeny v hustotě 0,8 x 10⁶ buněk/ml analytického média. Kultury byly udržovány ve vlhčeném inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) po 24 h nebo déle. Na konci inkubace byly kultury fixovány se 4% paraformaldehydem a membrány buněk narušeny pomocí 0,1% Triton X-100. Řezy byly vystaveny působení biotinylované 3D6 a pak konjugátu streptavidínu a Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Exogenní mikrogliální buňky byly zviditelněny jaderným barvivém (DAPI). Kultury byly pozorovány v invertovaném fluorescenčním mikroskopu (Nikon, TE300) a mtkrofotografie pořízeny digitální kamerou SPOT, za použití programu SPOT (Diagnsotic Instruments). Pro analýzu i Westemovu analýzu byly kultury extrahovány 8M močovinou, naředěnou

-80CZ 302971 B6

1:1 vtricinovém redukujícím vzorkovém pufru a aplikovány a 16% tricinový gel (Novex). Po přenosu na immobilon byly bloty vystaveny působení pAbAp42 (5 pg/ml) a pak konjugátu HRP s protilátkou proti myší a vyvolány s ECM (Amersham).

V případě analýzy prováděné sřezy z PDAPP myší v přítomnosti protilátky 1601 (jedna z protilátek proti Αβ, které in vivo nebyly účinné) zůstaly β-amyloidní plaky nezměněny a nebyla pozorována žádná fagocytóza. Když však byly přilehlé řezy pěstovány v přítomnosti 10D5, amyloidní usazeniny se z větší části ztratily a mikrogliální buňky obsahovaly početné fagocytámí měchýřky obsahující Αβ. Stejných výsledků bylo dosaženo u řezů z AD mozků; 10D5 vyvolala fagocytózu AD plaků, zatímco 16C11 byla neúčinná. Srovnatelné výsledky byly pozorovány při analýzách uskutečněných buď s myšími, nebo lidskými mikrogliálními buňkami, a také s myšími, králičími nebo lidskými protilátkami proti Αβ.

Tabulka 16 ukazuje výsledky získané s různými protilátkami proti Αβ, porovnává jejich schopnosti ve vyvolání fagocytózy při ex vivo analýze a ve snížení ptákové zátěže in vivo při studiích pasivního průniku. Přestože se 16C11 a 21F12 vázaly na agregovaný syntetický Αβ s velkou ochotou, nebyly tyto protilátky schopny reagovat s β-amyloidní mi plaky v nefixovaných mozkových řezech, nebyly schopny fagocytózu při ex vivo analýze a nebyly účinné ani in vivo. 10D5, 3D6 a polyklonální protilátka proti Αβ vykazovaly ve všech třech uvedených bodech účinné působení. Protilátka 22C8 se silněji váže na analog formy přirozeně se vyskytujícího Αβ, kterýje charakteristický záměnou kyseliny asparágové v pozicích 1 a 7 za kyselinu izoasparágovou. Tyto výsledky ukazují, že in vivo účinnost se projevuje přímým odbouráváním plaku uvnitř CNS, zprostředkovaným protilátkami, a že analýza ex vivo předpovídá účinnost in vivo.

Stejná analýza byla použita při testování očišťovací schopnosti (zprostředkování odbourání plaku) protilátky proti fragmentu synukleinu, nazývanému NAC. U syn uk lei nu se prokázalo, že je proteinem spojeným s amyloidními plaky. Protilátka proti NAC byla výše popsaným způsobem aplikována k vzorku mozkové tkáně obsahujícímu amyloidní plaky a mikrogliální buňky. Jako kontrola bylo použito králičí sérum. Následující prozkoumání ukázalo jasné snížení množství a rozměru plaků a prokázalo tak očišťovací schopnost této protilátky.

Při potvrzení, že Αβ bylo v průběhu ex vivo analýzy intemalizováno byla použita metoda konfokální mikroskopie. V přítomnosti kontrolních protilátek zůstávají exogenní mikrogliální buňky v konfokální rovině nad tkání, nejsou vidět žádné fagocytické měchýřky s Αβ a plaky v řezech jsou neporušeny. V přítomnosti 10D5 byl skoro všechen plakový materiál obsažen v měchýřcích exogenních mikrogl iál nich buněk. Pro zjištění dalšího osudu intemal izovaného peptídu byly kultury vystaveny působení 10D5, v různé časy extrahovány 8M močovinou a prozkoumány pomocí Westernový analýzy. V Čase I h, kdy ještě nebylo možno pozorovat fagocytózu, byl po reakci s polyklonální protilátkou proti Αβ patrný proužek silný 4 kDa (odpovídající peptidů Αβ). Αβ imunoreaktivita poklesla během prvního dne a třetí den již nebyla přítomna. To znamená, že fagocytóza Αβ zprostředkovaná protilátkami vede k jeho degradaci.

S cílem zjištění zda fagocytóza v ex vivo analýze probíhala zprostředkována Fc receptory byly připraveny F(ab’)2 fragmenty protilátky 3D6, specifické pro Αβ. Přestože si fragmenty F(ab’)2 zachovaly plnou schopnost vázat se na plaky, nebyly schopny spustit fagocytózu mikrogliálních buněk. A dále, fagocytóza spuštěná kompletní protilátkou mohla být znemožněna látkou blokující myší Fc receptory (anti~CD 16/32). Tyto výsledky značí, že odbourávání Αβ invivo probíhá fagocytózou zprostředkovanou Fc receptory.

-81 CZ 302971 B6

Příklad 15

Iδ .9

C ^>o §

•C ω * ‘9 33

o rTt m

Tt o

o iTi

-O CM		_r	cd CM
δ	O	o	O	O
3P	00 ►—«	00 1—«	oo

<n wD

Průchod protilátek přes hematoencefalickou bariéru

Níže popsané pokusy byly vykonány za účeiem získání informaci o schopnosti protilátek procházet po periferní intravenózní injekci do mozku a pro zajištění způsobů pro měření koncentrace protilátky v mozku po intravenózní injekci do periferní tkáně, a to jak u normálních, tak i u io PDAPP myší. Takováto měření jsou užitečná při předpovědi a určení účinných dávek.

Myši PDAPP nebo kontrolní myši byly perfundovány 0,9% NaCl. Mozkové oblasti (hipokampus nebo kůra) byly vyjmuty a rychle zmraženy. Mozky byly homogen izo vány v 0,1% Triton s inhibitory proteáz. Imunoglobulín v extraktech byl detekován technikou ELISA. Kozí F(ab’)2

- 82CZ 302971 B6

IgG proti myšímu F(ab’)2 IgG, představující uchycenou protilátku, byl aplikován na RIA misky. Sérové nebo mozkové extrakty byly inkubovány po 1 h. Izotypy byly detekovány protimyšími protilátkami IgGl-HRP, IgG2a-HRP nebo IgG2b-HRP (Caltag). Protilátky, nehledě a izotyp, se v CNS vyskytovaly v koncentraci 1:1000 v poměru ke koncentraci v krvi. Například když koncentrace IgGl byla v krvi trojnásobná než koncentrace IgG2a, tak poměr jejich koncentrací zůstal v mozku zachován, přičemž koncentrace obou protilátek v mozku představovaly 0,1 % jejich hladiny v krvi. Tyto výsledky byly pozorovány jak u transgenních, tak i u normálních myší, z čehož plyne, že PDAPP myši nemají neobvykle propustnou hematoencefalickou bariéru.

Přestože předkládaný vynález byl z důvodu jasnosti a srozumitelnosti popsán detailně, je zřejmé, že v rozsahu předkládaných nároků je možné provést určité modifikace. Všechny zde citované publikace a patentové dokumenty jsou takto zahrnuty podle odkazu ve své celistvosti pro všechny účely do stejné míry, jako by každý z nich byl jednotlivě označen.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek obsahující amyloidní složku, schopnou vyvolat imunitní odpověď v těle pacienta, farmaceutickou pomocnou látku, a adjuvans, které podněcuje nebo zvětšuje imunitní odpověď na amyloidní složku, pro použití při léčení poruchy charakterizované amyloidními plaky, vyznačující se tím, že amyloidní složka je zvolena ze skupiny sestávající zAH, AL Lambda řetězce, AApoAl, ATTR, Alys, Agel, Αβ₂Μ, AANF, AIAPP, Acal a synuklein NAC.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku l, vyznačující se tím, že amyloidní složkou je vláknitá složka.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně dvě rozdílné amyloidní složky.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku l, vyznačující se tím, že amyloidní složkou je peptid spojený s nosným proteinem.
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že adjuvans je zvoleno ze skupiny sestávající z QS21, mono fosfory 1 lipidu, alum, a Freundova adjuvans.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku l, vyznačující se tím, že jeho imunitní odpověď je charakterizována sérovým titrem nejméně 1:1000, a to podle dané amyloidní složky.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že sérový titrje nejméně 1:5000, vzhledem k dané složce.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho imunitní odpověď je charakterizována množstvím sérové imunoreaktivity, odpovídající více než čtyřnásobné hladině sérové imunoreaktivity naměřené u kontrolního vzorku séra před započetím léčby.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že zmiňované sérové množství imunoreaktivity je měřeno v séru ředěném asi 1:100.
10. Způsob pro určení prognózy pacienta, podrobujícího se léčbě amyloidní poruchy, zahrnující měření množství imunoreaktivity proti vybrané amyloidní složce ve vzorku séra pacienta, vyznačující se tím, že množství pacientovy sérové imunoreaktivity, nejméně čtyřikrát

-83CZ 302971 B6 větší než kontrolní bazální hodnota sérové imunoreaktivity pacienta před léčbou, indikuje prognózu zlepšení, podle konkrétní poruchy, přičemž amyloidní složka je zvolena ze skupiny sestávající zAH, AL Lambda řetězce, AApoAl, ATTR, Alys, Agel, Αβ₂Μ, AANF, A1APP, Acal a synuklein NAC.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že zmiňované pacientovo množství sérové imunoreaktivity proti zmiňované amyloidní složce je charakterizováno sérovým titrem nejméně 1:1000, výhodně nejméně 1:5000.
12. Protilátka, která se specificky váže na amyloidní složku přítomnou v amyloidním plaku, pro použití při prevenci a léčení poruchy, charakterizované zmiňovaným amyloidním plakem, přičemž amyloidní složka je zvolena ze skupiny sestávající z AH, AL Lambda řetězce, AApoAl, ATTR, Alys, Agel, Αβ₂Μ, AANF, AIAPP, Acal a synuklein NAC,
13. Protilátka podle nároku 12, kde amyloidní složka je vláknitá složka.
14. Protilátka podle nároku 13, kde protilátka se váže na epitop zmiňované vláknité složky.
15. Protilátka podle nároku 14, kde protilátka se specificky váže na jmenovanou vláknitou složku, aniž by se vázala na prekurzor zmiňované vláknité složky.
16. Protilátka podle nároku 15, kde protilátka je lidská protilátka proti zmiňované vláknité složce, připravená z lidských B-buněk imunizovaných epitopem vláknité složky.
17. Protilátka podle nároku 13, kde protilátka je lidská protilátka.
18. Protilátka podle nároku 13, kde protilátka je humanizovaná protilátka.
19. Protilátka podle nároku 13, kde protilátka je chimérická protilátka.
20. Protilátka podle nároku 13, kde protilátka je lidský IgGI izotyp.
21. Farmaceutický prostředek pro použití při prevenci nebo léčbě poruchy, charakterizované ukládáním amyloidního plaku, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároků 12 až 20, která je specificky vázána na amyloidní složku přítomnou v amyloidním plaku, v kombinaci s druhou protilátkou vázající druhou amyloidní složku v amyloidním plaku, přičemž amyloidní složky jsou zvoleny ze skupiny sestávající z AH, AL Lambda řetězce, AApoAl, ATTR, Alys, Agel, Αβ₂Μ, AANF, AIAPP, Acal a synuklein NAC.
22. Protilátka podle alespoň jednoho z nároků 12 až 20 nebo farmaceutický prostředek podle nároku 21, které jsou přizpůsobeny pro intraperitoneální, orální, subkutánni, íntramuskulámí, intranasální, lokální nebo intravenózní podání.
23. Protilátka nebo farmaceutický prostředek podle nároků 12 až 22, které jsou přizpůsobeny pro podávání ve více dávkách po dobu nejméně šesti měsíců.
24. Protilátka nebo farmaceutický prostředek podle nároků 12 až 22, které jsou přizpůsobeny pro podávání jako postupně se uvolňující prostředek.

16 výkresů