BG106140A - Методи и средства за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване - Google Patents
Методи и средства за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване Download PDFInfo
- Publication number
- BG106140A BG106140A BG106140A BG10614001A BG106140A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A BG 10614001 A BG10614001 A BG 10614001A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- amyloid
- antibody
- component
- protein
- fibril
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 130
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 127
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 71
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 52
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 7
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 title description 18
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 title description 18
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 title description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 267
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 35
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 115
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 85
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 76
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 50
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 44
- 102100029290 Transthyretin Human genes 0.000 claims description 38
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 38
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 35
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 34
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 claims description 30
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 30
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 claims description 23
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 22
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 claims description 22
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 22
- 101000772194 Homo sapiens Transthyretin Proteins 0.000 claims description 18
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims description 16
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 claims description 13
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 claims description 12
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 10
- 101710190759 Serum amyloid A protein Proteins 0.000 claims description 10
- -1 ΑροΑΙ Proteins 0.000 claims description 10
- 101710163305 Fibril protein Proteins 0.000 claims description 9
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 9
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 9
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 claims description 8
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims description 8
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 claims description 8
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 claims description 8
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 claims description 8
- 244000207620 Euterpe oleracea Species 0.000 claims description 8
- 235000012601 Euterpe oleracea Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000003650 acai Nutrition 0.000 claims description 8
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 claims description 6
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 6
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 claims description 5
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 4
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 claims description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 claims description 3
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 claims description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 claims 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 abstract description 63
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 51
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 abstract description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 12
- 208000034846 Familial Amyloid Neuropathies Diseases 0.000 abstract description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 155
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 155
- 239000000306 component Substances 0.000 description 107
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 107
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 106
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 100
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 91
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 89
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 87
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 81
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 75
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 74
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 74
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 55
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 48
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 47
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 45
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 33
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 33
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 28
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 25
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 21
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 20
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 16
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 16
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 230000007406 plaque accumulation Effects 0.000 description 15
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 15
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 14
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 14
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 14
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 13
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 13
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 12
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 12
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 11
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 11
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 206010019889 Hereditary neuropathic amyloidosis Diseases 0.000 description 10
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 10
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 10
- 201000007905 transthyretin amyloidosis Diseases 0.000 description 10
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 description 9
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 9
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 8
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 8
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 8
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 8
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 8
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 8
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 8
- 206010002023 Amyloidoses Diseases 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 7
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 7
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 7
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 101000962498 Macropis fulvipes Macropin Proteins 0.000 description 7
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 7
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 7
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 7
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 7
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 6
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 6
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 6
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 6
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 6
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 6
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 6
- HONKEGXLWUDTCF-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-2-methyl-4-phosphonobutanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CCP(O)(O)=O HONKEGXLWUDTCF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 5
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 5
- 102000004878 Gelsolin Human genes 0.000 description 5
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 description 5
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 5
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 5
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 5
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 5
- 102100021794 Microtubule-associated protein 4 Human genes 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 5
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 102100036597 Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein Human genes 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 4
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 4
- 206010016202 Familial Amyloidosis Diseases 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 101000616438 Homo sapiens Microtubule-associated protein 4 Proteins 0.000 description 4
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 4
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 4
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 4
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 4
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 4
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 4
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 4
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 108010049224 perlecan Proteins 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 3
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 3
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010016207 Familial Mediterranean fever Diseases 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 208000005531 Immunoglobulin Light-chain Amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 102000003799 beta-Synuclein Human genes 0.000 description 3
- 108090000182 beta-Synuclein Proteins 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 210000001769 parahippocampal gyrus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034112 Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Human genes 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- 206010002025 Amyloidosis senile Diseases 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 241000272478 Aquila Species 0.000 description 2
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061666 Autonomic neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 208000019736 Cranial nerve disease Diseases 0.000 description 2
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101000799143 Homo sapiens Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 2
- 206010025391 Macroglossia Diseases 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000037196 Medullary thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 206010031256 Osteomyelitis chronic Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 2
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 2
- 206010037601 Pyelonephritis chronic Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- 206010038748 Restrictive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 2
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 208000027207 Whipple disease Diseases 0.000 description 2
- 208000016463 Wild type ABeta2M amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000000848 angular dependent Auger electron spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 229940094517 chondroitin 4-sulfate Drugs 0.000 description 2
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 2
- 201000006368 chronic pyelonephritis Diseases 0.000 description 2
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 206010011005 corneal dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 208000014826 cranial nerve neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000005110 dorsal hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 231100000857 poor renal function Toxicity 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000007342 reactive astrogliosis Effects 0.000 description 2
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000020408 systemic-onset juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 208000013818 thyroid gland medullary carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 2
- XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N trehalose 6,6'-dimycolate Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCC3C(C3)CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)O2)O)O1)O)OC(=O)C(C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)CCCCCCCCCCC1CC1CCCCCCCCCCCCCCCCCC XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N 0.000 description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 6-Maleimidocaproic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023769 AA amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000018282 ACys amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000020687 AH amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023761 AL amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010400 APUDoma Diseases 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010060159 Apolipoprotein E4 Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100016363 Caenorhabditis elegans his-67 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010007509 Cardiac amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000759568 Corixa Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 241001056262 Dendrobium senile Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 201000004449 Diamond-Blackfan anemia Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 101150015163 GPA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- OYRVWOGRRQDEQH-MLVLNPCWSA-N Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(C)CC)C1=CC=CC=C1 OYRVWOGRRQDEQH-MLVLNPCWSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 208000003923 Hereditary Corneal Dystrophies Diseases 0.000 description 1
- 208000032838 Hereditary amyloidosis with primary renal involvement Diseases 0.000 description 1
- 208000032849 Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000699781 Homo sapiens Retrotransposon Gag-like protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 244000237786 Lathyrus tuberosus Species 0.000 description 1
- 108010005832 Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKTNGXVSCZULPO-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DKTNGXVSCZULPO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108010048188 MS2 polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010030317 Macrophage-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710093519 Microtubule-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- 201000002795 Muckle-Wells syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010031127 Orthostatic hypotension Diseases 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000612288 Pinus strobus Putative oxygen-evolving enhancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical class CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 102100029131 Retrotransposon Gag-like protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M Saccharin sodium Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)[N-]S(=O)(=O)C2=C1 WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-N alpha-L-IdopA-(1->3)-beta-D-GalpNAc4S Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000007792 alzheimer disease pathology Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940049706 benzodiazepine Drugs 0.000 description 1
- 150000001557 benzodiazepines Chemical class 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000003295 carpal tunnel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 208000022993 cryopyrin-associated periodic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- AFZSMODLJJCVPP-UHFFFAOYSA-N dibenzothiazol-2-yl disulfide Chemical compound C1=CC=C2SC(SSC=3SC4=CC=CC=C4N=3)=NC2=C1 AFZSMODLJJCVPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000001490 effect on brain Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 201000007891 familial visceral amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003619 fibrillary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 102000004963 gamma-Synuclein Human genes 0.000 description 1
- 108090001121 gamma-Synuclein Proteins 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- 101150086609 groEL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000003688 hormone derivative Substances 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108010024230 influenza hemagglutinin (307-319) Proteins 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 201000003775 lattice corneal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000001872 metatarsal bone Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000008906 neuronal response Effects 0.000 description 1
- 230000007121 neuropathological change Effects 0.000 description 1
- 210000004179 neuropil Anatomy 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- VZXPDPZARILFQX-SCSAIBSYSA-N o-acetylserine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](N)C(O)=O VZXPDPZARILFQX-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001871 perforant pathway Anatomy 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940067631 phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 208000012263 renal involvement Diseases 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 208000027121 wild type ATTR amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Obesity (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до фармацевтични препарати и методи за профилактика или лечение на амилоидни заболявания, като болестта на Алцхаймер, фамилниамилоидни невропатии и подобни. Фармацевтичните препарати включват имунологично реактивни количества от амилоидни фибрилни компоненти, по-специално фибрилоформиращи пептиди или белтъци. Изобретениетосе отнася също до лекарствени препарати и методи,използващи имунни реагенти, които реагират с такива фибрилни компоненти.
Description
Изобретението се отнася за фармацевтични препарати и методи за лечение на амилоид-свързани състояния у хора и други гръбначни бозайници.
Предшествуващо състояние на техниката
Амилоидоза е общ термин, който описва известен брой заболявания, характеризиращи се с извънклетъчно отлагане на белтъчни фибрили образуващи “амилоидни отлагания” (амилоидни възли), които могат да се появяват на локализирани места или системно. Фибриларният състав на тези отлагания е идентифицираща характеристика за различните форми на амилоидно заболяване. Например, интрацеребралните и цереброваскуларните отлагания, съставени първично от фибрили на бета амилоиден пептид (β-ΑΡ) са © характерни за болестта на Alzheimer (фамилни и спорадични форми), островният амилоид протеинов пептид (islet amyloid protein peptide IAPP, amylin) е характерен за фибрилите на амилоидните отлагания в клетките на островчетата на панкреаса, свързани с тип II диабет и β2микроглобулин е главният компонент на амилоидни отлагания, които се образуват като последствие от продължително лечение с хемодиализа. Наскоро, прион-свързани заболявания, като болестта на Creutzfeld-Jacob, също са признати като амилоидни заболявания.
Различните форми на заболяване са разделени в два класа, главно на базата на това дали амилоидозата е свързана или не е свързана с подлежащо системно заболяване. Така, някои известни нарушения са разглеждани като първични амилоидози, при които няма данни за предварително съществуващо или придружаващо заболяване. Общо, първични амилоидози на заболяването се характеризират с наличието на “амилоид лека верига-тип” (AL-тип) белтъчни фибрили, наречени така поради хомология на N-крайния участък на AL фибрилите с променливия фрагмент на имуноглобулинова лека верига (kappa или lambda).
Вторична или “реактивна “амилоидоза се характеризира с отлагания от АА тип фибрили, произхождащи от серумен амилоид А протеин (ApoSSA). Тези форми на амилоидоза се характеризират с подлежащо хронично възпалително или инфекциозно болестно състояние (например, ревматоиден артрит, остеомиелит, туберкулоза, проказа).
Наследствени фамилни амилоидози могат да имат свързани невропатични, бъбречни или сърдечно съдови отлагания от ATTR транстиретинов тип. Други наследствени фамилни амилоидози включват други симптоми и могат да имат различни амилоидни компоненти (например, фамилната Средиземноморска треска, която се характеризира с АА фибрили). Други форми на амилоидози включват локални форми, които се характеризират с огнищни, често тумороподобни отлагания, които се появяват в отделни органи. Други амилоидози са свързани с остаряването, и обикновено се характеризират с образуване на плаки в сърцето или мозъка. Също обичайни са амилоидни отлагания свързани с продължителна хемодиализа. Тези и други форми на амилоидно заболяване са обобщени в Таблица 1. (Tan, S.Y. and Pepys, Histopathology 25:403414,1994; Harrison’s Handbook of Internal Medicine, 13th Ed.lsselbacher,
K.J., etal., eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995).
Таблица 1 ____________Класификация на амилоидни заболявания____________ Амилоид Белтъчен Белтъчни Клиника
Белтък/ предшественик варианти
Пептид__________________.________________________________________
АА Серумен амилоид А Реактивна(вторична)
Белтък (ApoSSA) Амилоидоза:
Фамилна Средиземноморска треска Фамилна амилоидна нефропатия с уртикакария и глухота Muckle-Wells syndrome)
АА | Серумен амилоид А протеин (ApoSSA) | Реактивна системна амилоидоза свързана със системни възпалителни заболявания | |
AL | Моноклонални Имуноглобулинови леки вериги (kappa, lambda) | Ak,A (напр. Aklll) | Идиопатични( първични) амилоидози:миелома или макрогпобулинемия-свързани .системни |
амилоидози свързани с имуноцитна дискразия, моноклонална гамопатия; окултна дискразия, локална нодуларна амилоидоза свързана с хронично възпалително заболяване
АН | igG(i(Ti)) | ΑγΙ | Тежка верига амилоидоза свързана с някои имуноцитни дискразии |
ATTR | Transthyretin(TTR) | най-малко 30 известни точкови мутации | Фамилна амилоидна полиневропатия (напр. Met 30, португалска) |
ATTR | Transthyretin (TTR) | напр. Met 111 | Фамилна амилоидна Кардиомиопатия (датска) |
ATTR | Transthyretin (TTR) | див тип TTR или Не 22 | Системна сенилна амилоидоза |
АароА! | ApoAl | Arg 26 | Фамилна амилоидна полиневропатия |
Agel | Gelsolin | Asn 187 | Фамилна амилоидоза (финландска) |
Acys | Cystatin С | Gin 68 | Наследствена церебрална хеморагия с амилоидоза(ислацдска) |
Αβ | Амилоид β белтъчен прекурсор (напр. β-ΑΡΡ695) | различни: Gin 618, | болест на Alzheimer синдром на Down Наследствена церебрална хеморагична амилоидоза (холандска) Спорадична церебрална амилоидна ангиопатия Inclusion bodies myositis |
AB2M | Beta2 микроглобулин | Свързана с хронична хемодиализа | |
Acai | (Про)калцитонин | (Про)калцитонин | Медуларен карцином на щитовидната жлеза |
AANF | Атриален натриуретичен фактор | Фокални сенилни амилоидози: Изолиран атриален амилоид | |
Αβ SVEP* ABjM | β-амилоид прекурсорен белтък Beta2 микроглобулин | Мозък Семенни мехурчета Простата | |
Кератин | Първично локализиран кожен амилоид (макулозен, папулозен) | ||
PrP | Прион прекурсорен протеин (33-35kDa клетъчна форма) | Scrapie белтък 27-30 kDa | Спорадична болест на Creutzfeld-Jacob Kuru (трансмисивна спонгиоформена енцефалопатия, прион заболявания |
AIAPP | Островен амилоиден полипептид (IAPP) | Островчета на Langerhans, Диабет тип II, Инсулинома) | |
Пептидни напр. прехормони, калцитонин фрагменти | Екзокринна амилоидоза, свързана с APUDomas |
Често, фибрили образуващи голямата част от амилоидното отлагане, произхождат от един или повече първични прекурсорни белтъци или пептиди, и обикновено са свързани със сулфатирани глюкозамингликани. В допълнение, амилоидните отлагания могат да включват минорни белтъци и пептиди от различни типове, заедно с други компоненти, като протеогликани, ганглиозиди и други захари, както е описано по-подробно в разделите, които следват.
Понастоящем няма специфични, насочени срещу амилоид третирания за никое от амилоидните заболявания. Там където има едно основно или свързано със заболяване състояние, терапията е Ф насочена срещу намаляване произвеждането на амилоидогенен белтък, чрез третиране на основното заболяване. Такъв е примерът при лечението на туберкулоза с антибиотици, при което намаление в натрупването на микобактерии, води до намаление на възпалението и до свързано с това намаление на SSA белтъка. В случая с AL амилоид, дължащ се на мултиплена миелома, на пациенти се прилага химиотерапия, която предизвиква намаление на плазмените клетки и понижение нивата на миеломния имуноглобулин. Тъй като тези нива намаляват, AL амилоида може да се изчисти. Съпритежание на U.S. patent applications USSN 09/201,430, представена на 30 ноември 1998 С и USSN 09/322,289, представена на 28 май 1999, разкриват, че натрупването на амилоидни плаки, свързано с болестта на Alzheimer, може значително да бъде намалено (и предотвратено) чрез въвеждане на агенти, които произвеждат или правят един имунен отговор насочен срещу β-амилоиден пептид (Αβ) и негови фрагменти. Откритието на настоящето изобретение е, че индуцирането на имунен отговор срещу различни компоненти на амилоидната плака, е ефективно за лечение на широк кръг амилоидни заболявания.
б
Техническа същност на изобретението
Настоящето изобретение е насочено към фармацевтични препарати и методи за лечение на известен брой амилоидни заболявания. Съгласно един аспект, изобретението включва фармацевтични препарати, които съдържат като активна съставка агент, който е ефективен да индуцира у пациент имунен отговор срещу амилоиден компонент. Такива препарати общо включват ексципиенти и в предпочитани изпълнения могат да включват адюванти. В следващи предпочитани изпълнения, адювантите включват например, алуминиев хидроксид, алуминиев фосфат, MPL™, QS-21 (Stimulon™) или непълен адювант на Freund. Съгласно сродно изпълнение, такива препарати могат да включват множество от агенти, ефективни да индуцират у пациент имунен отговор срещу повече от един амилоиден компонент.
В сродно изпълнение, агентът е ефективен да произвежда имунен отговор, насочен срещу фибрилен пептиден или белтъчен амилоиден компонент. Предпочитано, такъв фибрилен пептид или белтък произхожда от фибрилен прекурсорен белтък, за който е известно, че е свързан с някои форми на амилоидни заболявания, както са описани тук. Такива прекурсорни белтъци включват, но не се ® ограничават до, Серумен ами лой д А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ApoAl, transthyretin, лизозим, фиброген а верига, gelsolin, цистатин С, Амилоид β белтъчен прекурсор (β-ΑΡΡ), Beta2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден пептид, един пептиден хормон и синуклеин. Такива прекурсори включват също мутантни белтъци, белтъчни фрагменти и протеолитични пептиди от такива прекурсори. В едно предпочитано изпълнение, агентът е ефективен да индуцира имунен отговор насочен срещу неоепитоп, образуван от фибрилен белтък или пептид, с оглед на фибрилен прекурсорен белтък. Така както е описано поподробно тук, много фибрили-образуващи пептиди или белтъци са фрагменти на такива прекурсорни белтъци, като изброените по-горе. Когато се образуват такива фрагменти, както при протеолитично разцепване, може да се открие, че няма епитопи в предшественика и следователно не са имунологично на разположение на имунната система, когато фрагментът е част от прекурсорен белтък. Агенти насочени срещу такива епитопи могат да бъдат предпочитани терапевтични агенти, тъй като те по-малко вероятно биха индуцирали автоимунен отговор у пациента.
Съгласно сродно изпълнение, фармацевтичните препарати на изобретението включват агенти насочени срещу амилоидни компоненти, като такива подбрани от група включваща, но без да се ограничава, до следните фибрилни пептиди или белтъци: АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, AB2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент. Пълните имена и състав на тези пептиди са описани тук. Такива пептиди могат да бъдат получени с методи известни на специалиста в тази област, както тук е описано.
Съгласно следващо сродно изпълнение, агенти включени в такива фармацевтични препарати, съдържат също известни сулфатирани протеогликани. В сродно изпълнение, протеогликанът е хепарин сулфат глюкозаминогликан, предпочитано перлекан (perlecan), дерматан сулфат, хондроитин-4-сулфат или пентозан полисулфат.
Съгласно друг сроден аспект, изобретението включва метод за профилактика и лечение на нарушение, характеризиращо се с амилоидно отлагане у индивид-бозайник. В съответствие с този аспект на изобретението, на индивида е давана дозировка от агент, ефективен да произведе имунен отговор срещу амилоиден компонент, характерен за амилоидното нарушение, от което страда индивида. По същество, методите включват въвеждане на фармацевтични препарати, съдържащи имуногенни амилоидни компоненти, специфични за нарушението, като тези описани по-горе. Такива методи по-нататък са характеризирани за тяхната ефективност да индуцират имуногенни отговори у индивида. Съгласно едно предпочитано изпълнение, методът е ефективен да произвежда имунен отговор, който се характеризира със серумен тигър най-малко 1:1000, по отношение на амилоидния компонент, срещу който е насочен имуногенния агент. В следващо предпочитано изпълнение, серумният тигър е най-малко 1:5000 по отношение на фибрилния ® компонент. Съгласно едно сродно изпълнение, имунният отговор е характеризиран със серумно количество имунореактивност, което е четири пъти по-голямо от нивото на серумната имунореактивност, измерена в контролна серумна проба преди третирането. Последното характеризиране е особено подходящо, когато серумната имунореактивност се определя с ELISA техники, но може да бъде приложено за всяко относително или абсолютно измерване на серумната имунореактивност. Съгласно едно предпочитано изпълнение, имунореактивността е измервана при серумно разреждане от около 1:100.
© Съгласно следващ сроден аспект, изобретението включва метод за определяне прогнозата за пациент, подложен на третиране за амилоидно нарушение. Тук е измервано количеството серумна имунореактивност на пациент, срещу амилоиден компонент, характерен за подбраното нарушение и серумно количество имунореактивност на пациент, което е най-малко четири пъти повисоко от изходното контролно ниво на серумната имунореактивност, е показателно за прогнозата на подобрен статус по отношение на определено амилоидно нарушение. Съгласно предпочитани изпълнения, количеството имунореактивност срещу подбран амилоиден компонент, намиращ се в серума на пациент, се характеризира чрез серумен титър от най-малко 1:1000, или най-малко 1:5000, по отношение на амилоидния компонент.
Съгласно сроден аспект, изобретението включва също, така наречените “пасивни имунизационни” методи и фармацевтични препарати за профилактика и лечение на амилоидни заболявания. Съгласно този аспект на изобретението, на пациенти е давана ефективна дозировка от антитяло, което специфично се свързва с подбран амилоиден компонент, предпочитано фибрилен компонент, който се намира в амилоидните отлагания, характерни за болестта, ® която се лекува. Общо, такива антитела са подбрани поради тяхната способност да се свързват специфично с различни белтъци, пептиди и компоненти, описани във връзка с фармацевтичните препарати и методи, описани в предишните параграфи на този раздел. Съгласно едно сродно изпълнение, такива методи и препарати могат да включват комбинации от антитела, които свързват най-малко два амилоидни фибрилни компоненти. Общо, фармацевтични препарати са въвеждани за да се осигури серумно количество имунореактивност срещу прицелен амилоиден компонент, което е най-малко четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу измерваното Ф в контролна серумна проба. Антителата могат също да бъдат въвеждани с носител, както тук е описано. Общо, в съответствие с този аспект на изобретението, такива антитела могат да бъдат въвеждани (или комбинирани за въвеждане) перитонеално, орално, интраназално, подкожно, интрамускулно, топично или интравенозно, но могат да бъдат въвеждани или комбинирани за въвеждане по всякакъв фармацевтично ефективен път (т.е. ефективен да произведе указаните терапевтични нива, както е представено по-горе и тук).
Съгласно едно сродно изпълнение, терапевтични антитела могат да бъдат прилагани чрез въвеждане на полинуклеотид, кодиращ най-малко една антитяло верига у пациента. Съгласно този аспект на изобретението, полинуклеотидът е експресиран у пациента да произвежда антитяло верига във фармацевтично ефективно количество у пациента. Такъв полинуклеотид може да кодира тежки и леки вериги на антитялото, при което се произвеждат тежки и леки вериги у пациента.
Съгласно предпочитани изпълнения, имунизационните схеми, описани по-горе, могат да включват въвеждане на агенти, включително антитела в множествени дозировки, като такива за 6месечен период, такива с начална имунизация, последвана от ® бустерни инжекции на определени интервали от време, като 6седмични интервали, съответно на методите известни в тази област, или съответно на нуждите на пациента, както са определени по имунния отговор. По избор, или в допълнение, такива схеми могат да включват употребата на комбинации ”със забавено освобождаване”, като известните в тази област.
Тези и други цели и особености на изобретението, ице бъдат по-пълно очевидни, когато се прочете следното подробно описание на изобретението във връзка с придружаващите го фигури.
© Кратко описание на фигурите
Фиг.1: Антитяло титър у трансгенни мишки след инжектиране οΑβ1-42.
Фиг.2: Амилоидно натрупване в хипокампа. Процентът от площта на хипокампалната област, заета от амилоидни плаки, определен чрез реактивността с Αβ-специфично моноклонално антитяло 3D6, е определен с компютерен количествен анализ на образи в имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки, са представени подредени по третирана група.
, -- > 'j
Хоризонталната линия за всяко групиране показва медианната стойност на разпределението.
Фиг.З: Невритна дистрофия в хипокампа. Процентът от площта на хипокампалната област, заета от дистрофични неврити, определена по тяхната реактивност с човешко АРР-специфично моноклонално 8Е5, е определена с количествен компютерен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки са показани за AN1792-третираната група и PBSтретираната контролна група. Хоризонталната линия за всяко групиране показва медианната стойност на разпределението.
© Фиг.4: Астроцитоза в ретросплениалната кора (retrosplenial cortex). Процентът от площта на коровата област, зает от глиялен фибриларен кисел белтък (ОЕАР)-положителни астроцити, е определен чрез компютерен количествен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки са представени подредени според третирана група и медианните стойности на групата са показани чрез хоризонтални линии.
Фиг.5: Геометрични средни антитяло титри срещу Αβ42 след имунизация с един диапазон от 8 дози от Αβ42 (“AN1792”), съдържащи 0.14,0.4, 1.2,3.7,11,33,100 или 300 μρ.
© Фиг.6: Кинетика на антитяло отговора срещу AN 1792 имунизация. Титрите са изразени като геометрични средни на стойностите за 6 животни във всяка група.
Фиг.7: Количествен анализ на образи на корови амилоидни натрупания в PBS- и А№792-третирани мишки.
Фиг.8: Количествен анализ на образи на натрупвания от невритни плаки у PBS- и AN1792-третирани мишки.
Фиг.9: Количествен анализ на образи на процента от ретросплениалната кора, зает от астроцитоза у PBS- и AN1792третирани мишки.
Фиг.1О: Тест за лимфоцитна пролиферация на клетки от слезка от АШ792-третирани (горен блок) и PBS-третирани (долен блок) мишки.
Фиг.11: Тотални Αβ нива в мозъчната кора. Графика на разсейване на отделните Αβ профили при мишки, имунизирани с Αβ или АРР производни, комбинирани с адювант на Freund.
Фиг. 12: Амилоидни натрупвания в кората, определени с количествен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези, за мишки имунизирани с Αβ пептидните конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ1328; пълноверижните Αβ агрегати Αβ42 (“ΑΝ1792”) и Αβ1-40 (“ΑΝ1528”) и PBS-третирана контролна група.
Фиг. 13: Геометрични средни титри на Αβ-специфично антитяло за групи от мишки, имунизирани с Αβ или АРР производни, комбинирани с адювант на Freund.
Фиг. 14: Геометрични средни титри на Αβ-специфично антитяло за групи от морски свинчета, имунизирани с AN1792, или негово палмитоирано производно, комбинирани с различни адюванти.
Фиг.15 (А-Е): Αβ нива в кората на 12-месечни PDAPP мишки, третирани с AN1972 или AN1528, с различни адюванти.
Фиг.16: Среден титър на мишки третирани с поликлонално антитяло срещу Αβ.
Фиг. 17: Среден титър на мишки, третирани с моноклонално антитяло 10D5 срещу Αβ.
Фиг. 18: Среден титър на мишки третирани с моноклонално антитяло 2D12 срещу Αβ.
Подробно описание на изобретението
А. Дефиниции
Ако не е специално отбелязано, всички термини тук използувани, имат същото значение, както те биха имали за специалиста в тази област на настоящето изобретение. Практикуващите, специално са насочени към Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. and Ausubel, F.M., et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, за определения, специални термини и стандартни методи, известни в тази област на биохимията и молекулярната биология. Разбираемо е, че това изобретение, не е ограничено до специално описана методология, протоколи и реактиви, тъй като те могат да варират, за получаване на същия резултат.
Терминът “адювант се отнася за съединение, което когато се въвежда заедно с един антиген, повишава имунния отговор срещу антигена, но въведено самостоятелно, не генерира имунен отговор срещу антигена. Адюванти могат да повишават имунния отговор по няколко механизма, включително лимфоцитно възстановяване, стимулация на В и/йли Т клетки и стимулация на макрофаги.
© “Амилоидно заболяване” или “амилоидоза” се отнася за всяко от известен брой нарушения, които имат като симптом или част от патологията, натрупване или формиране на амилоидни плаки.
“Амилоидна плака” е извънклетъчно отлагане, състоящо се главно от протеинни фибрили. Общо, фибрилите са изградени от един доминантен белтък или пептид; обаче, плаката може да включва допълнителни компоненти, които са пептиди или не-пептидни молекули, както е описано тук.
“Амилоиден компонент” е всяка молекулна единица, която се намира в амилоидна плака, включително антигенни части от такива
молекули. Амилоидни комоненти включват, но не се ограничават до белтъци, пептиди, протеогликани и въглехидрати. “Специфичен амилоиден компонент” се отнася за молекулна единица, която се намира първично или изключително в амилоидната плака, която е от интерес.
“Агент” е химична молекула от биологичен или синтетичен произход. В контекста на настоящето изобретение, агент е общо молекула, която може да бъде използувана във фармацевтичен състав.
“Анги-амилоиден агент” е агент, който е способен да произведе имунен отговор срещу компонент на амилоидна плака у гръбначен индивид, когато е въведен чрез техники на активна или пасивна имунизация.
Термините “полинуклеотид и “нуклеинова киселина”, както тук са използувани взаимозаменяемо, се отнасят за полимерна молекула, притежаваща основна верига, която съдържа бази, способни да образуват водородни връзки с типични полинуклеотиди, където полимерната основна верига, представя базите по начин да разрешава образуване на водородни връзки в дадена последователност, по специфичен начин между полимерна молекула и типичен полинуклеотид (например, едноверижна ДНК). Такива бази обикновено са инозин, аденозин, гуанозин, цитозин, урацил и тимидин. Полимерни молекули включват двуверижни и едноверижни РНК и ДНК и техни модификации на основната верига, например метилфосфонатни връзки.
Терминът “полипептид” както тук е използуван, се отнася за съединение състоящо се от единична верига от аминокиселинни остатъци, свързани с пептидни връзки. Терминът “белтък” може да бъде синоним на термина “полипептид” или може да се отнася за комплекс от два или повече полипептиди.
Терминът “пептид” също се отнася за съединение изградено от аминокиселинни остатъци свързани с пептидни връзки. Общо пептидите са изградени от 100 или по-малко аминокиселини, докато полипептиди или белтъци имат повече от 100 аминокиселини. Както тук е използуван, терминът “белтъчен фрагмент” може също да бъде разглеждан като пептид.
Фибрилен пептид” или “фибрилен белтък се отнася за мономерна или агрегирана форма на белтък или пептид, които образуват фибрили, намиращи се в амилоидни плаки. Примери за е такива пептиди и белтъци са представени тук.
“Фармацевтичен състав” се отнася за химичен или биологичен състав, подходящ за въвеждане у бозайник. Такива препарати могат специфично да бъдат комбинирани за въвеждане по един или повече начини, включително, но без да се ограничават до, орален, парентерален, интравенозан, интраартериален, подкожен, интраназален, сублингвален, интраспинален, интрацеребровентрикуларен и подобни начини.
“Фармацевтичен ексципиент” или “фармацевтично приемлив ексципиенг” е носител, обикновено течност, в който е комбиниран активния терапевтичен агент. Общо ексципиентът не придава никаква © фармацевтична активност на комбинацията, въпреки че той придава химична и/йли биологична стабилност, характеристики за освобождаване и подобни. Примерни комбинации могат да бъдат намерени, например в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995.
“Гликопротеин” е белтък, за който коваленгно е закачена наймалко една въглехидратна верига (олигополизахарид).
“Протеогликан” е гликопротеин, където най-малко една от въглехидратните вериги е гликозамингликан, който е дълъг линеен полимер от повтарящи се дизахариди, в които един член на чифта обикновено е захарна киселина (уронова киселина) и другият е аминозахар.
Терминът “имунологичен” или “имунен”, или “имуногенен” отговор, се отнася за развитието на хуморален (антитяло медииран) и/или клетъчен (медииран от антиген-специфични Т клетки или техни секреционни продукти) отговор, насочен срещу антиген у гръбначен индивид. Такъв отговор може да бъде активен отговор, индуциран чрез въвеждане на имуноген или пасивен отговор индуциран чрез въвеждане на антитяло или индуцирани Т-клетки. Клетъчен имунен отговор е предизвикан от представянето на полипептидни епитопи ® свързани с Клас I или Клас II МНС молекули, за активиране на антиген-специфични CD4+ Т помощни (helper) клетки и/или CD8+ цитотоксични Т клетки. Отговорът може да включва активиране на моноцити, макрофаги, NK клетки, базофили, дендритни клетки, астроцити, микроглиялни клетки, еозинофили или други компоненти на вродения имунитет. Наличието на клетъчно-медииран имунен отговор може да бъде определено чрез стандартни пролиферативни тестове (CD4+ Т клетки) или CTL (цитотоксични Т лимфоцити) тестове, известни в тази област. Относителните приноси на хуморалните и клетъчни отговори за профилактичния или терапевтичен ефект на © даден имуноген, могат да бъдат разграничени чрез отделно изолиране на имуноглобулин (IgG) и Т-клетъчни фракции от имунизирани сингенни животни и измерване профилактичния или терапевтичен ефект у друг индивид.
“Имуногенен агент” или “имуноген” или “антиген” е молекула, която е способна да индуцира имунологичен отговор срещу самата себе си при въвеждане у пациент, заедно със или в отсъствие на адювант. Такива молекули включват, например, амилоидни фибрилни пептиди или техни фрагменти, свързани с белтъчен носител, като keyhole limpet hemocyanin, Cd3 или тетанус токсоид.
“Епитоп” или “антигенна детерминанта” е част от антиген, която се свързва с антиген-свързващ участък от антитяло.
Терминът “Αβ”, “Αβ пептид” и “Амилоид β” пептид са синоними и се отнася за един или повече пептидни комбинации от около 38-43 аминокиселини, произхождащи от Beta амилоид прекурсорен протеин (β-ΑΡΡ), както е описано по-горе. “Αβχχ” се отнася за амилоид β пептид 1-хх, където хх е номер показващ броя аминокиселини в пептида, например Αβ42 е същият както Αβ1-42, който тук също е означен като “AN1792” и Αβ4Ο е същия както Αβ1-4Ο, който тук също е означен като “AN1578”.
Дизагрегиран или мономерен Αβ означава разтворими, мономерни пептидни единици на Αβ. Един метод за изготвяне на мономерен Αβ е да се разтвори лиофилизиран пептид в чист DMSO при третиране с ултразвук. Полученият разтвор се центрофугира за отстраняване на неразтворимия материал. Агрегиран Αβ е смес от олигомери, в която мономерните единици са свързани с нековалентни връзки.
Терминът “гол полинуклеотид” се отнася за полинуклеотид, който не е свързан комплексно с колоиден материал. Голи полинуклеотиди понякога са клонирани в плазмидни вектори.
Терминът “пациент” включва човешки индивиди или бозайници, които получават профилактично или лечебно третиране.
Термините “значително различни в сравнение със“, “статистически значими”, “значително по-високи (или по-ниски) в сравнение със “ и подобни фрази се отнасят за сравнения между данни или други измервания, където разликите между два сравнявани индивида или групи, са видимо или основателно различни за тренирания наблюдател, или статистически значими ( ако фразата включва термина “статистически”, или има известна индикация от статистически тест, като р-стойност, или ако данните, когато се анализират, дават статистическа разлика чрез стандартни статистически тестове известни в тази област).
Препарати или методи “съдържащи” един или повече от изброените елементи, могат да включват други елементи, които не са специфично изброени. Например, състав съдържащ фибрилен компонент пептид, обхваща изолирания пептид и пептида, като компонент на по-голяма полипептидна последователност. Като следващ пример, състав, който съдържа елементи А и В също обхваща състав състоящ се от А,В и С.
® В. Амилоидни заболявания
1. Общ преглед и патогенеза
Амилоидни заболявания или амилоидози включват известен брой болестни състояния с голямо разнообразие на външни симптоми. Тези нарушения имат общо наличие на абнормни извънклетъчни отлагания на белтъчни фибрили, известни като “амилоидни отлагания” или “амилоидни плаки”, които обикновено са с диаметър 10-100 цт и са локализирани в специфични органи и тъканни области. Такива плаки са съставени първично от природно срещащ се разтворим белтък или пептид. Тези неразтворими отлагания са съставени от © общо паралелни агрегати от фибрили, които са с приблизително ΙΟΙ 5nm диаметър. Амилоидните фибрили дават характерно ябълково зелено двойно пречупване в поляризирана светлина, когато са оцветени с багрилото Congo Red . Тези нарушения са класифицирани въз основа на главните фибрилни компоненти, образуващи отлаганията на плаки, както е описано по-долу.
Пептидите или белтъците образуващи отлагания на плаки, често са получени от по-голям прекурсорен белтък. По-специално, патогенезата на амилоидните фибрилни отлагания общо включва протеолитично разцепване на “абнормен” прекурсорен белтък на фрагменти. Тези фрагменти общо агрегират в анти-паралелни β нагънати листа; обаче, някои недеградирани форми на прекурсорния белтък е съобщено, че агрегират и образуват фибрили при фамилна амилоидна полиневропатия (вариант на транстиретин (transthyretin) фибрили) и свързана с диализа амилоидоза (β2 микроглобулин фибрили) (Tan et al., 1994, по-горе).
2. Клинични синдроми
Този раздел предоставя описания на основните типове амилоидози, включително техния характерен фибрилен състав на плаките. Общо откритие на настоящето изобретение е, че амилоидните заболявания могат да бъдат третирани чрез въвеждане на агенти, които служат да стимулират имунен отговор срещу един компонент или компоненти на различни специфични за заболяването амилоидни отлагания. Както е обсъдено в по-големи подробности в Раздел С по-долу, такива компоненти предпочитано са съставки на фибрилите, които образуват плаките. Разделите по-долу слукат да представят като примери, основните форми на амилоидоза и не са предвидени да ограничават изобретението.
© а. АА (реактивна) амилоидоза
Общо, АА амилоидозата е демонстрация на известен брой заболявания, които провокират продължителен остра фаза отговор. Такива заболявания включват хронични възпалителни заболявания, хронични локални или системни микробни инфекции и злокачествени неоплазми.
АА фибрили общо са съставени от 8000 далтона фрагменти (АА пептид или белтък), образувани чрез протеолитично разцепване на серумен амилоиден А протеин (apoSSA), един циркулиращ аполипопротеин, който се намира в HDL частици и който се синтезира в хепатоцити в отговор на такива цитокини като IL-1, IL-6 и TNF. Може да има широко пръснато отлагане в тялото, предпочитано в паренхимни органи. Слезката обикновено е место за отлагане, бъбреците също могат да бъдат засегнати. Отлагането също е обичайно за сърцето и стомашно-чревния тракт.
АА амилоидните заболявания включват, но не се ограничават до възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, ювенилен хроничен артрит, анкилозиращ спондилит, псориазис, псориатична артропатия, синдром на Reiter, болест на Still при възрастни, синдром на Behcet и болест на Crohn. АА отлагания също се получават в резултат на хронични микробни инфекции, като проказа, туберкулоза, бронхиектазии, декубитални язви, хроничен пиелонефрит, остеомиелит и болест на Whipple. Някои злокачествени новообразования могат също да доведат до АА фибрилни амилоидни отлагания. Такива са състояния като лимфома на Hodgkin, бъбречен карцином, карцином на червата, белите дробове и уро-гениталните пътища, базално-клетъчен карцином и космато клетъчна левкемия .
b. AL амилоидози
AL амилоидно отлагане общо е свързано с почти всякаква • дискразия от В лимфоцитен произход, в границите от злокачественост на плазмени клетки (мултиплен миел ом) до доброкачествена моноклонална гамопатия. В определен момент, наличието на амилоидни отлагания може да бъде първичен показател за подлежаща дискразия.
Фибрилите на AL амилоидни отлагания са съставени от моноклонални имуноглобулинови леки вериги или техни фрагменти. По-специално, фрагментите произхождат от N-крайната област на леката верига (kappa или lambda) и съдържат целия или част от техния променлив (VL) домен. Отлагания общо се появяват в мезенхимните тъкани, предизвиквайки периферна или автономна невропатия, carpal tunnel syndrome (синдром на миньорска болест на китките), макроглосия, рестриктивна кардиомиопатия, артропатия на големите стави, имунна дискразия, миеломи, както и окултни дискразии. Обаче, трябва да се отбележи, че почти всяка тъкан, поспециално висцерални органи като сърце, могат да бъдат ангажирани.
с. Наследствени системни амилоидози
Има много форми на наследствени системни амилоидози. Въпреки че те са относително редки състояния, появата в зряла възраст на симптоми и техните наследствени характеристики (обикновено автозомна доминанта) водят до съществуване на такива нарушения в цялата популация. Общо, синдромите се приписват на точкови мутации в прекурсорния белтък, които водят до произвеждане на варианти от амилоидогенни пептиди или белтъци. Таблица 2 обобщава фибрилния състав на примерни форми на тези заболявания. Таблица 2
Наследствени амилоидози
Фибрилен пептид/белтък | Генетичен вариант | Клиничен синдром |
Transthyretin и фрагменти (ATTR) | Met30, много други | Фамилна амилоидна полиневропатия (FAP), (главно периферни нерви) |
Transthyretin и фрагменти (ATTR) | Thr45, Ala60,Ser84 Met111,lle122 | Сърдечно засягагане преимуществено без невропатия |
N-краен фрагмент на Аполипопротеин А1 (apoAl) | Arg26 | Фамилна амилоидна полиневропатия (FAP), (главно периферни нерви) |
N-краен фрагмент на Аполипопротеин А1 (AapoAl) | Агд26, Агд50,Агд 60, други | Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане) | |
Лизозим (Alys) | Thr56, His67 | Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане) | |
Фиброген а верига фрагмент | Leu554, Val526 | Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане) | |
• | Gelsolin фрагмент (Agel) | Asn187, Tyr187 | Краниална невропатия с решетъчна корнеална дистрофия |
Цистатин С фрагмент | Glu68 | Наследствена церебрална хеморагия(церебрална амилоидна ангиопатия)-исландски тип | |
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоид прекурсорен протеин (АРР) | Gln693 | Наследствена церебрална хеморагия (церебрална амилоидна ангиопатия)- холандски тип | |
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоиден прекурсорен протеин (АРР) | Ile717, Phe717, Gly717 | Фамилна болест на Alzheimer | |
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоиден прекурсорен протеин (АРР) | Asn670, Leu671 | Фамилна деменция - вероятна болест на Alzheimer | |
Прион протеин (РгР) произхождащ от РгР прекурсорен протеин 51-59 инсерт | Leu102, Val167, . Asn178, Lys200 | Фамилна болест на CreutzfeldtJakob; GerstmannStraussler-Scheinker синдром (нас- |
ледствена спонгиоформена енцефалопатия, прион заболявания)
АА произхождащ от серумен амилоиден А протеин (ApoSSA) | Фамилна Средиземноморска треска, преимуществено бъбречно засягане (автозомен рецесив) |
АА произхождащ от Серумен амилоиден А протеин (ApoSSA) | Muckle-Well’s синдром, нефропатия глухота, уртикария болка в крайниците |
Неизвестен | Кардиомиопатия с перзистиращ атриален застой |
Неизвестен | Кожни отлагания (булозни, папуларни, пустулодермални) |
• Данни взети от Tan & Pepys, 1994, по-горе
Данните представени в Таблица 2 са примерни и не са предвидени да ограничават обсега на изобретението. Например, описани са повече от 40 отделни точкови мутации в transthyretin’oBHfl ген всички, от които водят до клинично подобни форми на фамилна амилоидна полиневропатия.
Transthyretin (TTR) е един 14 килодалтона белтък, който понякога е означаван като преалбумин. Той се произвежда в черния дроб и хороидния плексус и функционира при транспортиране на тиреоидни хормони и витамин А. Най-малко 50 вариантни форми на белтъка, всяка характеризираща се с единична промяна на аминокиселина, са отговорни за различни форми на фамилна амилоидна полиневропатия. Например, замяна на пролин с левцин в позиция 55, води до специално прогресираща форма на невропатия;
замяна на метионин с левцин в позиция 111, води до тежка кардиопатия у датски пациенти. Амилоидни отлагания изолирани от сърдечна тъкан на пациенти със системна амилоидоза разкриват, че отлаганията са изградени от хетерогенна смес на TTR и техни фрагменти, колективно обозначени като ATTR, пълноразмерните последователности, на които са характеризирани. ATTR фибрилните компоненти могат да бъдат екстрахирани от такива плаки и да бъде определена тяхната структура и последователност, с методи известни в тази област (напр. Gustavsson, A., et al., Laboratory Invest. 73:703-708, 1995; Kametani F., et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 125:622-628, ® 1984; Pras, M., et al., PNAS 80:539-42,1983).
Лица, които имат точкови мутации в молекулата на аполипопротеин AI (например Gly -> Arg26; Тгр -> Агд50; Leu -^АгдбО) проявяват една форма на амилоидоза (“Ostertag тип”), характеризираща се с отлагания на белтъка аполипопротеин AI или негови фрагменти (AapoAl). Тези пациенти имат ниски нива липопротеин с висока плътност (HDL) и имат периферна невропатия или бъбречна недостатъчност.
Една мутация на алфа веригата на ензима лизозим (например, lle->Thr56 или Asp-»His57) е основата за друга форма на © Ostertag-тип, не-невропатен наследствен амилоид, съобщен за английски фамилии. Тук, са отложени фибрили на мутантния лизозимен белтък (Alys) и общо пациентите проявяват нарушена бъбречна функция. Този белтък, за разлика от повечето фибрилиобразуващи белтъци описани тук, обикновено е налице в цяла (нефрагментирана) форма (Benson, M.D., et al. CIBA Fdn.Symp. 199: 104-131,1996).
β-амилоиден пептид (Αβ) е 39-43 аминокиселиннен пептид, произхождащ чрез протеолиза от голям белтък, известен като бета амилоиден прекурсорен протеин (βΑΡΡ). Мутации в βΑΡΡ водят до фамилни форми на болестта на Alzheimer, синдром на Down, и/йли сенилна деменция, характеризираща се с мозъчно отлагане на плаки, изградени от Αβ фибрили и други компоненти, които са описани в подробности по-долу. Известни мутации в АРР, свързани с болестта на Alzheimer, се появяват в съседство с местата на разцепване от β или γ секретаза, или в рамките на Αβ. Например, позиция 717 е в съседство с мястото на γ-секретазно разцепване на АРР, при неговото процесиране до Αβ, и позиции 670/671 са в съседство с мястото на β-секретазно разцепване. Мутации при който и да е от тези остатъци, могат да водят до болест на Alzheimer, вероятно като предизвикват нарастване на количеството на 42/43 аминокиселинната форма на Αβ, генериран от АРР. Структурата и последователността на Αβ пептиди с различни дължини, са добре известни в тази област. Такива пептиди могат да бъдат получени съгласно методите известни в тази област (например, Glenner and Wong, Biochem.Biophys.Res.Commun. 129:885890,1984; Glenner and Wong, Biochem.Biophys.Res.Commun. 122: 11311135, 1984). В допълнение, различни форми на пептидите са търговски достъпни.
Синуклеин е свързан със синапсите белтък, който наподобява един аполипопротеин и е в изобилие в невроналния цитозол и пресинаптичните окончания. Пептиден фрагмент произхождащ от асинуклеин, наречен NAC, също е компонент на амилоидни плаки при болестта на Alzheimer. (Clayton et al., 1998). Този компонент служи също като прицелно място за третирания на базата на имуноглобулин, в настоящето изобретение, както е дадено в подробности по-долу.
Gelsolin е калций свързващ белтък, който се свързва със и фрагментира актинови филаменти. Мутации в позиция 187 (например, Asp-» Asn; Asp-> Tyr) на белтъка води до една форма на наследствена системна амилоидоза, обикновено открита у пациенти от Финландия, както и лица от холандски или японски произход. У страдащи индивиди, фибрили образувани от gelsofin’oen фрагменти (Agel), обикновено се състоят от аминокиселини 173-243 (68 kDa карбокситерминален фрагмент) и са отложени в кръвоносни съдове и базални мембрани, което води до корнеална дистрофия и краниална невропатия, която прогресира до периферна невропатия, дистрофични кожни промени и отлагания в други органи. (Kangas, Н., et al. Human Mol.Genet. 5(9): 1237-1243,1996).
Други мутирани белтъци, като мугантна алфа верига на фибриноген (AfibA) и мутантен цистатин С (Acys) също образуват фибрили и предизвикват характерни наследствени нарушения. AfibA w фибрили образуват отлагания, характерни за не-невропатичен наследствен амилоид с бъбречно заболяване; Acys отлагания са характерни за наследствена мозъчна амилоидна ангиопатия, съобщена в Исландия. (Isselbacher, et al., Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San-Francisco, 1995; Benson, et al., norope). Показано е, че поне в няколко случая, пациенти с мозъчна амилоидна ангиопатия (САА) имат амилоидни фибрили, съдържащи една не-мутантна форма на цистатин С, свързан с бета белтък. (Nagai,
A., et al. Molec.Chem. Neuropathol. 33:63-78,1998).
Някои форми на прион заболяване са разглеждани като © наследствени, възлизащи на около 15% от случаите, които преди са считани, че са преимуществено инфекциозни по природа. (Baldwin, et al., in Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). При тези заболявания, пациентите развиват плаки, изградени от абнормни изоформи на нормалния прион протеин (РгРс). Една предоминантна мугантна изоформа, PrPSc, също означена като AScr, се различава от нормалния клетъчен белтък по нейната резистентност към протеазно разграждане, неразтворимост след детергентна екстракция, отлагане във вторични лизозоми, пост-транслационна синтеза и високо съдържание на β-нагънати листа. Генетична връзка е установена за най-малко пет мутации, които водят до болест на Creutzfeldt-Jacob (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker синдром (GSS) и фатална фамилна инсомния (FFI) (Baldwin). В тази област са известни методи за екстрахиране на фибрилни пептиди от scrapie фибрили, определяне на последователности и изготвяне на такива пептиди (например, Beeks, М., et al. J.Gen.Virol. 76:2567-76,1995).
Например, една форма на GSS е свързана с РгР мутация при кодон 102, докато теленцефален GSS сегрегира с мутации при кодон 117. Мутации при кодони 198 и 217 имат за резултат една форма на GSS, при която невритните плаки характерни за болестта на Alzheimer, съдържат РгР вместо Αβ пептид. Някои форми на фамилна CJD са свързани с мутации при кодони 200 и 210; мутации при кодони 129 и 178 са открити при фамилни CJD и FFI. (Baldwin, по-горе).
d. Сенилна системна амилоидоза
Амилоидното отлагане, системно или фокално, нараства с възрастта. Например, фибрили от див тип transthyretin (TTR) обичайно се намират в сърдечна тъкан на по-възрастни индивиди. Те могат да бъдат асимптомни, клинично неизявени или могат да имат за резултат сърдечна недостатъчност. Асимптомни фибриларни фокални отлагания могат също да се появят в мозъка (Αβ), corpora amylacea на простатата (Αβ2 микроглобулин), стави и семенни мехурчета.
e. Мозъчна амилоидоза
Локално отлагане на амилоид е обичайно в мозъка, особено у по-възрастни индивиди. Най-честият тип амилоид в мозъка е изграден първично от Αβ пептидни фибрили, водещи до деменция или спорадична (не-наследствена) болест на Alzheimer. В действителност, появата на спорадична болест на Alzheimer силно превишава формите, представени като наследствени. Фибрилни пептиди формиращи тези плаки са много сходни с тези описани по-горе, с оглед наследствените форми на болестта на Alzheimer (AD).
f. Амилоидоза свързана с диализа
Плаки изградени от β2 микроглобулин (Αβ2Μ) фибрили обикновено се развиват у пациенти, получаващи продължителна хемодиализа или перитонеална диализа. β2 микроглобулин е един
11.8 kDa полипептид и е леката верига на Клас I МНО антигени, които присъствуват във всички ядрени клетки. При нормални условия, той непрекъснато се отделя от клетъчните мембрани и нормално се филтрува от бъбреците. Нарушение в отделянето, както е в случая с нарушена бъбречна функция, води до отлагане в бъбреците и на други места (първично в богатите на колаген тъкани на ставите). За разлика от други фибрилни белтъци, Αβ2Μ молекули общо присъствуват в нефрагментирана форма във фибрилите. (Benson, погоре).
д. Амилоидози производни на хормони
Ендокринните органи могат да задържат амилоидни отлагания, по-специално у възрастни индивиди. Секретиращи хормон тумори могат също да съдържат производни на хормон амилоидни плаки, фибрилите, на които са изградени от полипептидни хормони като калцитонин (медуларен карцином на щитовидната жлеза), островен амилоиден полипептид (амилин; появяващ се у повечето пациенти с Тип II диабет), и атриален натриуретичен пептид (изолиран от атриална амилоидоза). Последователностите и структурите на тези белтъци са добре известни в тази област.
h. Смесени амилоидози
Има различни други форми на амилоидно заболяване, които обикновено се проявяват като локализирани отлагания на амилоид. Общо, тези заболявания вероятно са резултат на локализирано производство и/йли липса на катаболизъм на специфични фибрилни
прекурсори или предразположение на дадена тъкан (като ставите) за фибрилно отлагане. Примери за такова идиопатично предразположение включват нодуларен (възлест) AL амилоид, кожен амилоид, ендокринен амилоид и свързан с тумор амилоид.
С. Фармацевтични препарати
Откритие на настоящето изобретение е, че препарати способни да предизвикат или предоставят имунен отговор, насочен срещу някои компоненти на амилоидни плаки, са ефективни да лекуват или предотвратяват развитието на амилоидни заболявания. В Ф частност, съгласно изобретението, което тук е представено, е възможно да се предотврати прогресирането или да се подобрят симптомите на, и/или да се намалят натрупванията от амилоидни плаки у засегнати индивиди, когато имуностимулаторна доза от един анти-амилоиден агент, или съответен анти-амилоиден имунен реагент, е въведен у пациент. Този раздел описва примерни ангиамилоидни агенти, които произвеждат активни, както и пасивни, имунни отговори срещу амилоидни плаки и предоставя примерни данни, показващи ефекта от третиране, използуващо такива препарати срещу натрупвания на амилоидни плаки.
© Общо, анти-амилоидни агенти на изобретението са изградени от един специфичен за плаката компонент, предпочитано фибрили образуващ компонент, който обикновено е характерен белтък, пептид или техен фрагмент, както е описано в предишния раздел и даден за пример по-долу. По-общо, терапевтични агенти за употреба в настоящето изобретение, произвеждат или индуцират имунен отговор срещу плака или по-специално, неин фибрилен компонент. Такива агенти следователно включват, но не се ограничават до, самия компонент и негови варианти, аналози и миметици на компонента, които индуцират и/йли реагират кръстосано с антитела срещу компонента, както и антитела или Т-клетки, които специфично са реактивни с амилоидния компонент. Съгласно една важна особеност, фармацевтичните препарати не са подбрани от не-специфични компоненти - т.е. от тези компоненти, които са общо циркулиращи или които са повсеместни в тялото. Като пример, Серумен амилоиден протеин (SAP) е цилкулиращ плазмен гликопротеин, който е произведен в черния дроб и се свързва с повечето известни форми на амилоидни отлагания. Лекарствени препарати са предпочитано насочени срещу този компонент.
Индукцията на имунен отговор може да бъде активна, когато е въведен имуноген да индуцира антитела или Т-клетки, реактивни с компонента у пациент, или пасивна, когато е въведено антитяло, което то самото се свързва с амилоидния компонент у пациента. Примерни агенти за индуциране или произвеждане на имунен отговор срещу амилоидни плаки са описано по-долу.
Фармацевтични препарати на настоящето изобретение могат да включват, в допълнение на имуногенен агент(и), ефективно количество от адювант и/йли ексципиент. Фармацевтично ефективни и полезни адюванти и ексципиенти са добре известни в тази област и са описани в по-големи подробности в следващите раздели.
1. Имуностимулаторни агенти (Активен имунен отговор)
А Анти-фибрилни препарати
Един общ клас от предпочитани анти-амилоидни агенти включва агенти, които произхождат от амилоидни фибрилни белтъци. Както бе споменато по-горе, отличителният белег на амилоидни заболявания е отлагането на амилоидни плаки в един орган, състоящи се главно от фибрили, които на свой ред се състоят от характерни фибрилни белтъци или пептиди. Съгласно настоящето изобретение, такъв фибрилен белтък или пептиден компонент, е полезен агент за индуциране на анти-амилоиден имунен отговор.
Таблици 1 и 2 обобщават примерни образуващи фибрили белтъци, които са характерни за различни амилоидни заболявания. В съответствие с този аспект на настоящето изобретение, въвеждането у засегнат или предразположен индивид, на имуностимулаторен състав, който включва съответен фибрилен белтък или пептид, включително хомолози или техни фрагменти, предоставя терапия или профилактика по отношение на амилоидното заболяване.
Като пример Αβ, известен също като β-амилоиден пептид, или А4 пептид (виж US Patent 4,666,829; Glenner & Wong Biochem.Biophys.Res.Commun. 120, 1131 (1984), е пептид от 39-43 аминокиселини, който е главният компонент на характерните плаки за болест на Alzheimer. Αβ е генериран чрез процесиране на по-голям белтък АРР от два ензима, наречени β и γ секретази (виж Hardy, TINS 20,154 (1997)).
Пример I описва резултатите от експерименти, проведени в подкрепа на настоящето изобретение, при които Αβ42 пептид е въведен у хетерозиготни трансгенни мишки, които свръхекспресират човешки АРР, с една мутация в позиция 717. Тези мишки, известни като “PDAPP мишки” проявяват подобна на Alzheimer патология и са разглеждани като животински модел на болестта на Alzheimer (Games, et al., Nature 373: 523-7, 1995). Както е детайлизирано в примера, тези мишки проявяват откриваема неврпатология с Αβ плаки в техните мозъци, с начало на 6-месечна възраст, и отлагането на плаки е прогресиращо с времето. В описаните тук експерименти, агрегиран Αβ42 (AN1792) е въвеждан у мишки. Повечето от третираните мишки(7/9) нямат откриваем амилоид в техните мозъци на 13-месечна възраст, за разлика от контролни мишки (инжектирани с физиологичен разтвор или нетретирани), всички от които показват значителни
мозъчни натрупвания на амилоид на тази възраст (Фиг.2). Тези различия са дори по-силно проявени в хипокампа (Фиг.З). Третирани мишки проявяват също значими серумни антитяло титри срещу Αβ (всичките по-високи от 1:1000, 8/9 по-високи от 1/10,000; Фиг.1, Таблица ЗА). Общо, третираните с физиологичен разтвор мишки проявяват 4-5 пъти по-малки от изходните нива на антитела срещу Αβ при разреждане 1:100, на всички тестирани интервали, и следователно са считани, че нямат значим отговор в сравнение с контролните (Таблица ЗВ). Тези проучвания демонстрират, че • инжектирането със специфичен образуващ фибрили пептид Αβ, осигурява защита срещу отлагане на Αβ амилоидни плаки.
Серумен амилоиден протеин (SAP) е циркулиращ плазмен гликопротеин, които се произвежда в черния дроб и се свързва по калций-зависим начин с всички форми на амилоидни фибрили, включително фибрили на церебралните амилоидни плаки при болестта на Alzheimer. Като част от горните експерименти, една група мишки е инжектирана със SAP; тези мишки развиват значителни серумни титри срещу SAP (1:1000 - 1:30000), но не развиват откриваеми серумни титри срещу Αβ пептид и развиват мозъчна невропатология с плаки (Фиг.2).
© Следващи експерименти, подробно представени в Пример II, демонстрират доза зависимост на имуногенния ефект от Αβ инжектиране на мишки, третирани между 5-седмична и около 8месечна възраст. При тези мишки, средните серумни титри на анти-Αβ пептид антитела нарастват с броя на имунизациите и повишаване на дозировките; обаче след четири имунизации, серумни титри измерени пет дни след имунизация, се изравняват над по-високите дози (1ЗООрд) на нива около 1.10000 (Фиг.б).
Допълнителни експерименти в подкрепа на настоящето изобретение са описани в Пример III, при които PDAPP модел на мишки, са третирани с Αβ42, започвайки в определен период от време (около 11-месечна възраст), след като амилоидните плаки вече съществуват в техните мозъци. При тези проучвания, животните са имунизирани с Αβ42 или физиологичен разтвор и са убити за тестиране на амилоидни натрупвания на 15 или 18-месечна възраст. Както е илюстрирано на фиг.7, на 18-месечна възраст, Αβ42третираните мишки проявяват значимо по-ниско средно натрупване на амилоидни плаки (натрупване на плаки, 0.01%) в сравнение с PBSтретираните 18-месечни контролни (натрупване на плаки 4.7%) или 12месечни нетретирани животни (0.28%), като натрупването на плаки е измерено чрез анализ на образи, както е детайлизирано в Пример XIII, част 8. Тези експерименти демонстрират ефикасността на методите за третиране на настоящето изобретение, за редуциране на съществуващите натрупвания от плаки и предотвратяване прогресирането на натрупване на плаки у заболелите индивиди.
Съгласно този аспект на изобретението, терапевтичните агенти произхождат от фибрилни пептиди или белтъци, които се съдържат в плаките и са характерни за заболяването, което е от интерес. Друга възможност е такива агенти да са антигенно достатъчно сходни с такива компоненти, за индуциране на имунен отговор, който също реагира кръстосано с фибрилния компонент. Таблици 1 и 2 предоставят примери за такива фибрилни пептиди и белтъци, съставът и последователностите, на които са известни в тази област и могат лесно да бъдат определени, съгласно методите в тази област. (Виж цитираните литературни данни по-долу и Раздел В2 за литературни данни, които специфично посочват методи за екстракция и/йли състав на различни фибрилни пептидни компоненти; следващи примерни фибрилни компоненти са описани по-долу).
Така, в съответствие с настоящето изобретение, когато се прави диагноза на амилоидно заболяване, въз основа на клинични и/йли биопсични определения, опитният специалист ще бъде в състояние да установи фибрилния състав на амилоидните отлагания и да предостави агент, който индуцира имунен отговор, насочен срещу фибриларните пептиди или белтъци.
Като пример, както е описано по-горе, терапевтичният агент използуван за лечение на болест на Alzheimer или други амилоидни заболявания, характеризиращи се с Αβ фибрилно отлагане, може да бъде всеки от естествено срещащите се форми на Αβ пептид, и поспециално човешките форми (т.е. Αβ39, Αβ4Ο, Αβ41, Αβ42 или Αβ43). Последователностите на тези пептиди и тяхната взаимозависимост с АРР прекурсора са добре известни в тази област (например, Hardy et al., TINS 20, 155-168 (1997)). Например Αβ42 има последователността:
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-Hls-HisGln-Lys-Leu-VakPhe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lleGly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala-OH. (SEQ ID N0:1)
Αβ41, Αβ40 и Αβ39 се различават от Αβ42 по липсата на Ala, Ala-lle и Ala-lle-Val съответно от С-терминалния край на пептида. Αβ43 се различава от Αβ42 по наличието на треонинов остатък при Скрая. Съгласно едно предпочитано изпълнение на изобретението, терапевтични агенти ще индуцират имунен отговор срещу целия или част от фибрилния компонент на заболяването, което е от интерес. Например, предпочитан Αβ имуногенен състав е агент, който индуцира антитяло специфично срещу свободния N-край на Αβ. Такъв състав има предимството, че няма да разпознава прекурсорния белтък, β-ΑΡΡ, при което ще бъде по-малко възможно да предизвика автоимунитет.
Като следващ пример, правилно се преценява, че пациенти засегнати от заболявания, характеризиращи се с отлагане на АА фибрили, например някои хронични възпалителни заболявания, хронични локални или системни микробни инфекции и злокачествени неоплазми, както е описано по-горе, могат да бъдат третирани с АА пептид, един известен 8 килодалтона фрагмент на Серумен амилоид А протеин (ApoSSA). Примерни АА амилоидни нарушения включват, но не се ограничават до възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, ювенилен хроничен артрит, анкилозиращ спондилит, псориазис, псориатична артропатия, синдром на Reiter, болест на Still при възрастни, синдром на Behcet, болест на Crohn, хронични микробни инфекции като проказа, туберкулоза, бронхиектазии, декубитални язви, хроничен пиелонефрит, остеомиелит и болест на Whipple, както и злокачествени неоплазми като Hodgkin лимфома, бъбречен карцином, карцином на червата, белия дроб и урогениталния тракт, базално клетъчен карцином и космато клетъчна левкемия.
АА пептид се отнася до един или повече от хетерогенна група пептиди, произхождащи от N-края на прекурсорен протеин на серумен амилоид A (ApoSSA), започващ при остатък 1,2 или 3 на прекурсорния белтък и завършващ при която и да е точка между остатъци 58 и 84; обикновено АА фибрили са изградени от остатъци 1-76 на ApoSSA. Могат да бъдат определени прецизните структури и състав, и да бъдат синтезирани съответни пептиди, съгласно методи известни в тази област (Liepnieks, J.J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1270:81-86 (1995).
Като следващ пример, фрагменти произхождащи от Nкрайния участък, който съдържа целия или част от променливия (VL) домен на имуноглобуллиновите леки вериги (kappa или lambda верига), общо включват амилоидни отлагания в мезенхимни тъкани, предизвикващи периферна или автономна невропатия, carpal tunnel синдром (синдром на миньорска болест на китките), макроглосия, рестриктивна кардиомйопатия, артропатия на големите стави, имунна дискразия, миеломи, както и скрита дискразия. Препарати на изобретението предпочитано индуцират имунен отговор срещу част от леката верига , предпочитано срещу “неоепитоп” - един епитоп, който е образуван в резултат на фрагментиране на молекула предшественик - за редуциране на възможни автоимунни ефекти.
Различни наследствени амилоидни заболявания също са податливи за методите на третиране в настоящето изобретение. Такива заболявания са описани в Раздел В.2, по-горе. Например, различни форми на фамилна амилоидна полиневропатия са резултат на най-малко 50 мутантни форми на transthyretin (TTR), един 14 килодалтона белтък, произведен в черния дроб, всяка характеризираща се с единична аминокиселинна промяна. Докато много от формите на това заболяване са различими на базата на тяхната специална патология иЛгли демографски произход, преценява се, че лекарствените препарати могат също да бъдат съставени от агенти, които индуцират имунен отговор срещу повече от една форма на TTR, като смес от две или повече форми на ATTR, включително див тип TTR, за осигуряване на общо приложим лекарствен състав.
AapoAI-съдържащи амилоидни отлагания са намерени у лица, притежаващи точкови мутации в молекулата на аполипопротеин AI. Пациенти с тази форма на заболяване, общо проявяват периферна невропатия или бъбречна недостатъчност. Съгласно настоящето изобретение, лекарствените препарати са изготвени от една или повече от различните форми на AapoAl, описани тук или известни в тази област.
Известни фамилни форми на болестта на Alzheimer, както и синдром на Down, са резултат от мутации в бета амилоид прекурсорен протеин, предизвикващи отлагане на плаки с фибрили, изградени главно от β-амилоиден пептид (Αβ). Употребата на Αβ пептид в лекарствени препарати на настоящето изобретение е описана по-горе и е илюстрирана тук.
3Ί
Други комбинации за третиране на наследствени форми на амилоидози, обсъдени по-горе, включват препарати, които произвеждат имунен отговор срещу фрагменти на gelsolin, за лечение на наследствена системна амилоидоза, мутантен лизозимен белтък (Alys), за лечение на наследствена невропатия, мугантна алфа верига от фибриноген (AfibA) за една не-невропатна форма на амилоидоза, манифестирана като бъбречно заболяване, мутантен цистатинС (Acys) за лечение на една форма на наследствена мозъчна ангиопатия, съобщена в Исландия. В допълнение, известни наследствени форми на прион заболяване (например, болест на Creutzfeldt-Jacob (CJD), синдром на Gerstmann-Staussler-Scheinker (GSS) и фатална фамилна инсомниа (FFI) се характеризират с една мугантна изоформа на прион протеин, PrPSc. Този белтък може да бъде използуван в лекарствени препарати за лечение и профилактика на отлагане на РгР плаки, в съответствие с настоящето изобретение.
Както е обсъдено по-горе, амилоидно отлагане, системно или фокално, също е свързано с остаряването. В един следващ аспект на настоящето изобретение, отлагането може да бъде предотвратено или лекувано чрез въвеждане у податливи индивиди на препарати, състоящи се от един или повече белтъци, свързани с това остаряване. ® Така, плаки изградени от ATTR произхождащ от див тип TTR, често се откриват в сърдечна тъкан на индивиди с напреднала възраст. Подобно на това, някои възрастни индивиди развиват асимптомни фибриларни фокални отлагания на Αβ в техните мозъци; третиране с Αβ пептид, както е детайлизирано тук, може да бъде потвърдено у такива индивиди. β2 микроглобулин е чест компонент на corpora amylacea на простатата, и следователно е един следващ кандидат агент, съответно на настоящето изобретение.
Като следващ пример, но не като ограничение, има известен брой допълнителни, не-наследствени форми амилоидно заболяване, които са кандидати за методите за третиране на настоящето изобретение. β2 микроглобулинови фибриларни плаки обикновено се развиват у пациенти подложени продължително време на хемодиализа или перитонеална диализа. Такива пациенти могат да бъдат лекувани, чрез третиране с лекарствени препарати насочени срещу β2 микроглобулин или по-предпочитано, техни имуногенни епитопи, в съответствие с настоящето изобретение.
Хормон-секретиращи тумори могат също да съдържат хормон-производни амилоидни плаки съставът, на които общо е характерен за дадения засегнат ендокринен орган. Така, такива фибрили могат да бъдат изградени от полипептидни хормони, като калцитонин (медуларен карцином на щитовидната жлеза), островен амилоиден полипептид) появяващ се у повечето пациенти с Тип II диабет) и атриален натриуретичен пептид (изолиран от атриална амилоидоза). Препарати насочени срещу амилоидни отглагания, които се образуват в интимата на аортата при атеросклероза, също са планирани от настоящето изобретение. Например, Westermark et al., описват 69 аминокиселинен N-терминален фрагмент на аполипопротеин А, който образува такива плаки (Westermark, et al., Am.J.Path. 147: 1186-92, 1995); терапевтични препарати на настоящето изобретение включват имунологични реагенти, насочени срещу такъв фрагмент, както и самия фрагмент.
Горното обсъждане е фокусирано върху амилоидни фибрилни компоненти, които могат да бъдат използувани като терапевтични агенти за лечение и профилактика на различни форми на амилоидно заболяване. Терапевтичният агент може също да бъде активен фрагмент или аналог на естествено срещащ се или мугантен фибрилен пептид или белтък, който съдържа епитоп, индуциращ сходен предпазен или терапевтичен имунен отговор при въвеждане у човек. Имуногенните фрагменти обикновено имат една
последователност от най-малко 3, 5, 6, 10 или 20 съседни аминокиселини от природен пептид. Примерни Αβ пептидни имуногенни фрагменти включват Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 112, 13-28, 17-28, 25-35, 35-40 и 35-42. При някои методи са използувани фрагменти, у които липсва поне една, понякога най-малко 5 или 10 С-крайни аминокиселини, които са налице у природно срещащите се форми на фибрилния компонент. Например, един фрагмент, у който липсват 5 аминокиселини от С-терминалния край на Αβ43, включва първите 38 аминокиселини от N-терминалния край на Αβ. Фрагменти от N-терминалната половина на Αβ са предпочитани в някои методи. Аналози включват алелни, видови и индуцирани варианти. Аналозите обикновено се различават от природно срещащите се пептиди при една или няколко позиции, често благодарение на консервативни замени. Аналозите обикновено проявяват най-малко 80 или 90% идентичност на последователността с природни пептиди. Някои аналози включват не-природни аминокиселини или модификации на N или С терминални аминокиселини. Примери за не-природни аминокиселини са α,αдизаместени аминокиселини, N-алкил аминокиселини, млечна киселина, 4-хидроксипролин, γ-карбокси-глутамат, γ-Ν,Ν,Νтриметиллизин, γ-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, Νформилметионин, 3-метилхистидин, 5-хидрокси-лизин, ω-Νметиларгинин.
Общо, специалистите в тази област ще оценят, че фрагменти и аналози, планирани в съответствие с този аспект на изобретението, могат да бъдат подбрани за кръстосана реактивност с природно срещащи се фибрилни компоненти и/йли терапевтична или профилактична ефикасност при трансгенни животински модели, както е описано по-долу. Такива фрагменти или аналози могат да бъдат използувани в терапевтични препарати на настоящето изобретение, ммвм ако тяхната имунореактивност и ефикасност върху животински модел е грубо еквивалентна на, или по-гол яма от съответни параметри, измерени за амилоидните фибрилни компоненти.
Такива пептиди, белтъци или фрагменти, аналози и други амилоидогенни пептиди, могат да бъдат синтезирани чрез твърдофазна пептидна синтеза или рекомбинантна експресия, съгласно стандартни методи известни в тази област, или могат да бъдат получени от природни източници. Примерни фибрилни препарати, методи за екстрахиране на фибрили, последователности на фибрилни пептидни или белтъчни компоненти са предоставени в много от цитираните литературни данни, във връзка с описанията на специфични фибрилни компоненти предоставени тук. В допълнение, други препарати, методи за екстрахиране и определяне на последователности са известни в тази област и са на разположение на лицата, желаещи да ползуват такива препарати. Автоматични пептидни синтезатори могат да бъдат използувани за изготвяне на такива препарати и са търговски достъпни от много производители, като Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, California) и процедури за изготвяне на синтетични пептиди са известни в тази област. Рекомбинантна експресия може да има в бактерии, като E.coli, дрожди, клетки от насекоми или клетки от бозайници; по избор, белтъци могат да бъдат произведени като се използува безклетъчна in vivo система за транслация, известна в тази област. Процедури за рекомбинантна експресия са описани от Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P.Press, NY 2d ed., 1989). Някои пептиди и белтъци също са търговски достъпни; например, някои форми на Αβ пептид се доставят от фирми като American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, и California Peptide Research Inc. Napa, California.
Терапевтични агенти могат също да бъдат съставени от подълги пептиди, които включват например, активен пептиден фибрилен фрагмент или аналог, заедно с други аминокиселини. Например, Αβ може да присъствува като интактен АРР белтък или негов сегмент, като С-100 фрагмента, който започва при N-края на Αβ и продължава до края на АРР. Такива полипептиди могат да бъдат скринирани за профилактична и терапевтична ефикасност върху животински модели, както е описано по-долу. Αβ пептидът, аналог, активен фрагмент или друг полипептид могат да бъдат въведени в асоциирана форма (т.е. ©като амилоиден пептид) или в дисоциирана форма. Терапевтични агенти могат също да включват мултимери на мономерни имуногенни агенти или конюгати, или белтъци носители, и/йли, както е отбелязано по-горе, могат да бъдат добавени към други фибрилни компоненти, за да осигурят по-широк диапазон от анти-амилоидна плака активност.
В следващ вариант, имуногенен пептид, като фрагмент от Αβ, може да бъде представен с вирус или бактерии, като част от имуногенен състав. Нуклеинова киселина, кодираща имуногенния пептид, е включена в генома или епизома на вируса или бактерията. По избор, нуклеиновата киселина е включена по такъв начин, че имуногенният пептид е експресиран като секретиран белтък или като © слет (фузионен) белтък с един белтък от външната повърхност на вирус или трансмембранен белтък на бактерия, така че пептидът да е проявен. Вируси и бактерии използувани в такива методи, трябва да бъдат непатогенни или атенюирани. Подходящи вируси включват аденовирус, HSV, Venezuelan equine encephalitis virus (вирус на венецуелски конски енцефалит) и други алфа вируси, вирус на везикуларния стоматит и други rhabdo вируси, vaccinia и fowl pox (пипка). Подходящи бактерии включват Salmonella и Shigella. Особено подходящо е сливане (фузия) на имуногенен пептид с HBsAg на HBV. Терапевтични агенти включват също пептиди и други съединения, които не притежават обезателно значително сходство на аминокиселинна последователност с Αβ, но независимо от това служат като миметици на Αβ и индуцират сходен имунен отговор. Например, всякакви пептиди и белтъци образуващи β-нагънати листа, могат да бъдат скринирани за пригодност. Могат да бъдат използувани анти-идиотипни антитела срещу моноклонални антитела срещу Αβ или други амилоидогенни пептиди. Такива анти-Id антитела могат да имитират антигена и да предизвикат имунен отговор спрямо него (виж Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, ф Palo Alto, 6th ed.), p.181). Агенти различни от Αβ пептидите ще индуцират имуногенен отговор срещу един или повече от предпочитаните сегменти на Αβ изброени по-горе (например, 1-10, 17, 1-3 и 3-7). Предпочитано, такива агенти индуцират имуногенен отговор, който специфично е насочен срещу един от тези сегменти, без да е насочен срещу други сегменти на Αβ.
Произволни библиотеки от пептиди или други съединения могат също да бъдат скринирани за пригодност. Комбинаторни библиотеки могат да бъдат произведени за много типове съединения, които могат да бъдат синтезирани по начин етап след етап. Такива • съединения включват полипептиди, бета-въртящи миметици, полизахариди, фосфолипиди, хормони, простагландини, стероиди, ароматни съединения, хетероциклични съединения, бензодиазепини, олигомерни-Ь1-заместени глицини и олигокарбамати. Големи комбинаторни библиотеки на съединенията могат да бъдат конструирани чрез метода на кодирани синтетични библиотеки (ESL), описан в Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051. Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (всяка от които тук е включена чрез цитат за всякакви цели). Пептидни библиотеки могат също да бъдат създадени чрез методи на фагов дисплей. Виж например, Devlin, WO 91/18980.
Комбинаторни библиотеки и други съединения в началото са скринирани за пригодност, чрез определяне техния капацитет да се свързват с антитела или лимфоцити (В или Т), които са известни, че са специфични за Αβ или други амилоидогенни пептиди, като ATTR. Например, начален подбор може да бъде направен с всякакви поликлонални серуми или моноклонално антитяло срещу Αβ или друг амилоидогенен пептид от интерес. Съединения идентифицирани с такъв подбор, след това са анализирани за капацитет да индуцират антитела или реактивни лимфоцити срещу Αβ, или друг амилоидогенен пептид. Например, множествени разреждания на серуми могат да бъдат тестирани на микротитрационни платки, които са покрити предварително с фибрилен пептид и може да бъде направена стандартна ELISA , за тестиране на реактивни антитела срещу Αβ. След това съединенията могат да бъдат тестирани за профилактична и терапевтична ефикасност у трансгенни животни, предразположени към амилоидогенно заболяване, както е описано в Примерите. Такива животни включват например, мишки носещи 717 мутация на АРР, описани от Games et al. по-горе и мишки носещи 670/671 Шведска мутация на АРР, както е описана от McConlogue et al., US 5,612,486 и Hsiao et al., Science 274, 99 (1996)] Staufenbiel et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Същият подход за скриниране може да бъде използуван за други потенциални агенти, като фрагменти на Αβ, аналози на Αβ и по-дълги пептиди, включително Αβ, както е описано по-горе.
Ь. Други компоненти на плаката
Преценено е, че имунологични отговори насочени към други амилоидни компоненти на плаката, могат да бъдат ефективни при профилактика, забавяне или намаляване отлагането на плаки при амилоидни заболявания. Такива компоненти могат да бъдат минорни компоненти на фибрили или свързани с фибрили, или фибрилно образуване в плаките, с условието, че компоненти, които са повсеместни в тялото, или относително не-специфични за амилоидното отлагане, общо са по-малко подходящи за употреба като терапевтични прицелни места.
Следователно, следващо откритие на настоящето изобретение е, че агентите, които индуцират имунен отговор спрямо специфични компоненти на плаката, са полезни за третиране или предотвратяване прогресирането на амилоидни заболявания. Този раздел обосновава няколко примерни молекули, свързани с амилоидна плака. Индукция на имунен отговор срещу която и да е от тези молекули, самостоятелно или в комбинация с имуногенни терапевтични препарати срещу фибрилните компоненти, описани погоре, или срещу който и да е от другите не-образуващи фибрили компоненти, описани по-долу, предоставя допълнителен режим на анти-амилоидно третиране, в съответствие с настоящето изобретение. Също формираща част от настоящето изобретение, са схемите за пасивна имунизация, базирани на такива компоненти на плаката, както са тук описаните.
Като пример, синуклеин е белтък, който структурно е сходен с аполипопротеини, но е открит в невронален цитозол, по-специално в съседство със синаптичните окончания. Има най-малко три форми на белтъка, наречени α, β и γ синуклеин. Наскоро беше показано, че а и β синуклеин са ангажирани в нуклеацията на амилоидните отлагания при някои амилоидни заболявания, по-специално болестта на Alzheimer. (Clayton, D.F., et al., TINS 21 (6): 249-255, 1998). Поспециално, един фрагмент от NAC домена на а и β синуклеин (остатъци 61-95) е изолиран от амилоидни плаки при Alzheimer пациенти; този фрагмент съставлява около 10% от плаката, която остава неразтворима след разтваряне с натриев додецил сулфат (SDS). (George, J.M., et al. Neurosci. News 1:12-17,1995). По-нататък е съобщено, че пълноверижният а синуклеин и неговият NAC фрагмент ускоряват агрегацията на β-амилоиден пептид в неразтворим амилоид in vitro. (Clayton, по-горе).
Допълнителни компоненти свързани с амилоидни плаки включват не-пептидни компоненти. Например, перлекан и перлеканпроизводни гликозамингликани са големи хепарин сулфат протеогликани, които присъствуват в Αβ-съдържащи амилоидни плаки е при болестта на Alzheimer и други системни амилоидози на централната нервна система, включително амилинови плаки свързани с диабет. Показано е, че тези съединения повишават образуването на Αβ фибрили. Намерено е, че сърцевинният белтък и гликозаминогликанови вериги на перлекан участвуват в свързването с Αβ. Допълнителни гликозаминогликани, по-специално дерматан сулфат, хондроитин-4-сулфат и пентозан полисулфат, обикновено се намират в амилоидни плаки от различен тип и също е показано, че повишават образуването на фибрили. Декстран сулфат също има това свойство. Това повишение е значително редуцирано, когато молекулите са десулфатирани. Имуногенни терапевтични средства, насочени срещу © сулфатираните форми на гликозаминогликани, включително самите гликозаминогликани, формират допълнително изпълнение на настоящето изобретение, за първично или вторично третиране. Произвеждането на такива молекули, както и съответни лекарствени препарати съдържащи такива молекули, е във възможностите на специалиста в тази област.
2. Агенти индуциращи пасивен имунен отговор
Терапевтични агенти на изобретението включват също имунни реагенти, като антитела, които специфично се свързват с фибрилни пептиди или други компоненти на амилоидните плаки. Такива антитела могат да бъдат моноклонални или поликлонални и имат свързващи специфичности, които съответствуват на типа амилоидно заболяване, което е прицелно. Терапевтични препарати и схеми за третиране могат да включват антитела, насочени срещу един свързващ домен или епитоп на даден фибрил, или не-фибрилен компонент на плаката, или да включват антитела насочени срещу два или повече епитопи на същия компонент, или аантитела насочени срещу епитопи на множество компоненти на плаката.
• Например, в експерименти направени в подкрепа на настоящето изобретение, на 81/2 до 101/гмесечни PDAPP мишки са правени интраперитонеални (i.p.) инжекции с поликлонално анти-Ар42 или моноклонално анти-Αβ антитяло, изготвени срещу специфични епитопи на Αβ пептид, или с физиологичен разтвор, както е детайлизирано тук в Пример XI. В тези експерименти са контролирани концентрациите на циркулиращи антитела и са правени бустерни инжектирания, необходими да подържат концентрацията на циркулиращото антитяло по-висока от 1:1000, по отношение на специфичния антиген, срещу който е направено антитялото. Наблюдавани са понижения на тоталните Αβ нива в сравнение с © контролните, в корови, хипокампални и малкомозъчни области на третирани с антитяло мишки; най-голямо намаление при тези експерименти са показали мишки третирани с поликлонални антитела.
В следващи експерименти направени в подкрепа на изобретението, е използуван предсказващ in v/уотест (Пример XIV) за проверка изчистването с едно антитяло срещу фрагмент от синуклеин, означен като NAC. Показано е, че синуклеин е свързан с белтък от амилоидна плака. Антитяло срещу NAC е поставяно в контакт с проба от мозъчна тъкан, съдържаща амилоидни плаки и микроглиялни клетки. Като контрола е използуван заешки серум. Последващо мониториране показва подчертано намаление броя и големината на плаките, което е показателно за изчистваща активност на антитялото.
От тези данни става ясно, че натрупването на амилоидни плаки, свързано с болестта на Alzheimer или други амилоидни заболявания, може значително да бъде намалено чрез въвеждане на имунни реагенти насочени срещу епитопи на Αβ пептид или срещу NAC фрагмент на синуклеин, които са ефективни за редуциране натрупването на амилоидни плаки. По-нататък е изяснено, че може да бъде използувано голямо разнообразие от антитела за такива препарати. Антитела, които специфично се свързват с агрегираната форма на Αβ без да се свързват с дисоциираната форма, са подходящи за употреба в изобретението, каквито са и антитела, които специфично се свързват с дисоциираната форма, без да се свързват с агрегираната форма. Други подходящи антитела са свързват и с двете- агрегираната и дисоциираната форми. Някои такива антитела се свързват с природно срещащата се къса форма на Αβ (т.е., Αβ39, 40 или 41), без да се свързват с природно срещащата се дълга форма на Αβ (т.е., Αβ42 и Αβ43). Някои антитела се свързват с дълга форма, без да се свързват с къса форма. Някои антитела се свързват с Αβ без да се свързват с пълноверижния амилоиден прекурсорен белтък. Някои антитела се свързват с Αβ, със свързващ афинитет по-голям от или равен на около 10s, 107,10s, 109 или Ю10 М'1.
Поликлонални серуми обикновено съдържат смесени популации от антитела, свързващи се с някои епитопи по дължината на Αβ. Моноклонални антитела се свързват със специфичен епитоп в Αβ, който може да бъде конформационен или неконформационен епитоп. Някои моноклонални антитела се свързват с епитоп в обсега на остатъци 1-28 на Αβ (с първият N терминален остатък на природен Αβ означен 1). Други моноклонални антитела се свързват с епитоп с остатъци 1-10 на Αβ. Има също моноклонални антитела, които се свързват с епитоп с остатъци 1-16 на Αβ. Други моноклонални антитела се свързват с епитоп с остатъци 1-25 на Αβ. Някои моноклонални антитела се свързват с епитоп в обсега на аминокиселини 1-5, 5-10,10-15, 15-20,25-30,10-20, 20, 30 или 10-25 от Αβ. Профилактична и терапевтична ефикасност на антитела може да бъде тестиране като се използуват процедури на трансгенен животински модел, описани в Примери.
По-общо, от данните представени тук, практикуващият специалист може да планира, произведе и тестира антитела насочени срещу фибрилни белтъци или пептиди, характерни за други амилоидни заболявания, като заболяванията описани тук в Раздел 2, като се използуват препарати описани тук, както и антитела срещу други амилоидни компоненти.
а. Общи характеристики на имуноглобулини
Основната антитяло структурна единица е известно, че съдържа един тетрамер от субединици. Всеки тетрамер е съставен от два идентични чифта от полипептидни вериги, всеки чифт притежава една “лека” (около 25 kDa) и една “тежка” верига (около 50-70 kDa). Амино-терминалната част на всяка верига съдържа една променлива област от около 100 до 110 или повече аминокиселини, първично отговорни за антигенното разпознаване. Карбокси-терминалната част на всяка верига определя една константна област, първично отговорна за ефекторната функция.
Леки вериги са класифицирани като kappa или lambda. Тежки вериги са класифицирани като gamma, mu, alpha, delta или epsilon и определят антитяло изотипа като IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, съответно. В леките и тежки вериги, променливите и константни области са свързани с една “J” област от около 12 или повече аминокиселини, с тежката верига включваща също една “D” област от около 10 повече аминокиселини. (Виж общо, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989). Ch.7 (включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели).
Променливите области на всеки лека/гежка верига чифт, формират антитяло свързващото място. Така, едно антитяло има две свързващи места. С изключение при бифункционални или биспецифични антитела, двете свързващи места са еднакви. Целите вериги проявяват същата обща структура на относително консервативни области на рамката (FR), свързани чрез три хиперпроменливи области, наречени също определящи комплементарността области или CDRs. CDRs от двете вериги на всеки чифт са подредени от рамковите области, правещи възможно свързването със специфичен епитоп. От N-края до С-края, и двете лека и тежка вериги, съдържат домените FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Определянето на аминокиселините към всеки домен е в съответствие с дефинициите на Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), или Chothla & Lesk, J.Mol.Bioi. 196: 901-917 (1997); Chothia et al., Nature 342. 878-883 (1989).
b. Получаване на не-човешки антитела
Получаването на не-човешки моноклонални антитела, например, миши, от морски свинчета, заешки или плъши, може да бъда изпълнено например, като се имунизира животно с компонент от плака, като Αβ или други фибрилни компоненти. Може да бъде използуван по-дълъг пептид съдържащ Αβ, или един имуногенен фрагмент на Αβ, или анги- идиотипни антитела срещу едно антитяло срещу Αβ. Виж например, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (включена чрез цитат за всякакви цели). Такъв имуноген може да бъде получен от природен източник, чрез
пептидна синтеза или чрез рекомбинантна експресия. По избор, имуногенът може да бъде въведен слет или комплексиран по друг начин с белтък носител, както е описано по-долу. По избор, имуногенът може да бъде въведен с адювант. Могат да бъдат използувани няколко типа адюванти, както е описано по-долу. Пълен адювант на Freund последван от непълен адювант е предпочитан за имунизации на лабораторни животни. Зайци и морски свинчета обикновено са използувани за получаване на поликпонални антитела. Мишки обикновено са използувани за получаване на моноклонални антитела. Антителата са скринирани за специфично свързване с имуногена. По избор, антителата по-нататък са скринирани за свързване със специфичен участък на имуногена. Например, в случая на Αβ пептид като имуноген, скринирането може да бъде направено чрез определяне свързването на една антитяло с набор от делетирани мутанти на Αβ пептид и определяне кои делетирани мутанти се свързват с антитялото. Свързването може да бъде определено например, чрез Western blot или ELISA. Най-малкият фрагмент, който показва специфично свързване с антитялото, определя епитопа на антитялото. Алтернативно, специфичността на епитопа може да бъде определена чрез конкурентен тест, при който тестирането и референтно антитяло конкурират за свързване с компонента. Ако тестираното и референтното антитела конкурират, тогава те се свързват със същия епитоп или епитопи достатъчно близко, така че свързването на едно антитяло повлиява свързването на другото.
с.Химерни и хуманизирани антитела
Химерни и хуманизирани антитела имат същата или сходна свързваща специфичност и афинитет, както мишо или друго нечовешко антитяло, което предоставя началния материш1 за конструиране на химерно или хуманизирано антитяло. Химерни антитела са антитела, чиито гени за лека и тежка верига са конструирани, обикновено с генно инженерство, от сегменти на имуноглобулинови гени, принадлежащи на различни видове. Например, променливите (V) сегменти на гените от едно мишо моноклонално антитяло, могат да бъдат свързани с човешки константни (С) сегменти, такива като lgG1 и lgG4. Така, типичното химерно антитяло е хибриден белтък, състоящ се от V или антигенсвързващ домен от едно мишо антитяло и С или ефекторен домен от човешко антитяло.
Хуманизирани антитела имат остатъци на променливата регионална рамка главно от човешко антитяло (наречено акцепторно антитяло) и области определящи комплементарността предимно от мишо антитяло (означено като донорен имуноглобулин). Виж, Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 : 10029-10033 (1989) и WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 и Winter, US 5,225,539 (включени чрез цитат в тяхната цялост за всякакви цели). Константната област(и), ако са налице, също са предимно или изцяло от човешки имуноглобулин. Човешките променливи домени обикновено са избрани от човешки антитела, чиито последовател-
ности на рамката проявяват висока степен идентичност на последователността с миши променливи регионални домени, от които произхождат CDRs. Остатъците на тежката и лека верига на променливата регионална рамка, могат да произхождат от същите или различни човешки антитяло последователности. Човешките антитяло последователности могат да бъдат последователностите на природно срещащи се човешки антитела или могат да бъдат консензус последователности на няколко човешки антитела. Виж Carter et al., WO 92/22653. Някои аминокиселини от остатъци на човешка променлива регионална рамка, са подбрани за замени въз основа на тяхното възможно влияние върху CDR конформацията и/йли свързването с антиген. Проучване на такива възможни повлиявания е чрез моделиране, изпитване характеристиките на аминокиселините в специални локализации или емпирично наблюдение на ефектите от замяна или мутагенеза на дадени аминокиселини.
Например, когато една аминокиселина различава между остатък от миша променлива регионална рамка и избран остатък на човешка променлива регионална рамка, аминокиселината на човешка рамка, обикновено ще бъде заменена с еквивалентна аминокиселина от рамката от мишото антитяло, когато основателно се очаква, че аминокиселината:
(1) свързва директно антиген не-ковалентно, (2) е в съседство с CDR област, (3) в друго отношение взаимодействува с CDR област (например е в обсега на около 6 А на CDR област), или (4) участвува в VL-VH граничната повърхност.
Други кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които са необичайни за човешки имуноглобулин в тази позиция. Тези аминокиселини могат да бъдат заменени с аминокиселини от еквивалентна позиция на мишо донорно антитяло или от еквивалентните позиции на по-типични човешки имуноглобулини. Други кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които са необичайни за човешки имуноглобули в тази позиция. Променливите регионални рамки на хуманизирани иммуноглобулини, обикновено показват най-малко 85% идентичност на последователността с последователност на променлива регионална рамка или консензус на такива последователности.
d. Човешки антитела
Човешки антитела срещу Αβ са предоставени с различни техники, описани по-долу. Някои човешки антитела са подбрани чрез експерименти за конкурентно свързване, или другояче, да имат същата специфичност на епитопа както дадено мишо антитяло, такова като мишите моноклонални антитела, описани в Пример XI. Човешки антитела могат също да бъдат подбрани за специфичност на определен епитоп, като се използува само един фрагмент на Αβ като имуноген, и/или чрез подбор на антитела срещу един набор от делетирани мутанти на Αβ.
(1)Триома методология
Основният подход и един примерен участник в клетъчната фузия, SPAZ-4, за приложение при този подход, са описани от Oestberg et a., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664; и Engleman et al., US Patent 4,634,666 (всяка, от които е включена чрез цитат в нейната цялост и за всякакви случаи). Антитяло-произвеждащите клетъчни линии, получени по този метод са наречени триоми, тъй като те са произхождащи от три клетки - две човешки и една миша. Начално, една миша миеломна линия е слята с човешки В-лимфоцит за получаване на не-антитяло-произвеждаща ксеногенна хибридна клетка, като SPAZ-4 клетъчната линия, описана от Oestberg, по-горе. След това ксеногенната клетка е слята с един имунизиран човешки В-лимфоцит, за получаване на ангитялопроизвеждаща триомна клетъчна линия. Намерено е, че триомите произвеждат антитяло по-стабилно, отколкото обичайните хибридоми получени от човешки клетки.
Имунизираните В-лимфоцити са получени от кръв, слезка, лимфни възли или костен мозък на донор човек. Ако са желани антитела срещу специфичен антиген или епитоп, предпочита се да се използува този антиген или негов епитоп за имунизация. Имунизацията може да бъде in vivo или in vitro. За in vivo имунизация, В клетки обикновено се изолират от човек имунизиран с Αβ, негов фрагмент, по-голям пептид съдържащ Αβ или фрагмент, или антиидиотипно антитяло срещу антитяло срещу Αβ. В някои методи, В клетки са изолирани от същия пациент, на когото накрая ще бъде приложена антитяло терапия. За in vivo имунизация, В-лимфоцити обикновено са изложени на антиген за един период от 7-14 часа в среда като RPMI-1640 (виж Engieman, по-горе) допълнена с 10% човешка плазма.
Имунизираните В-лимфоцити са слети с една ксеногенна хибридна клетка като SPAZ-4 , с помощта на добре известни методи. Например, клетките са третирани с 40-50% полиетилен гликол с мол.тегло 1000-4000, при около 37°С за около 5-10 минути. Клетките са отделяни от сместа за фузия и са развивани в селективна среда за желаните хибриди (например, НАТ или АН). Клоновете секретиращи антитела с изискваната свързваща специфичност, са идентифицирани чрез тестиране на триомната култура за способност да се свързва с Αβ или негов фрагмент. Триоми, произвеждащи човешки антитела с желаната специфичност са субклонирани чрез техниката на ограничаващо разреждане и са развивани in vitro в среда за култивиране. Получените триома клетъчни линии след това са тестирани за способност да се свързват с Αβ или негов фрагмент.
Въпреки че триомите са стабилни, те не произвеждат антитела в много високи нива. Експресионните нива могат да бъдат повишени чрез клониране антитяло гените от триома в един или повече експресионните вектори и трансформиране на вектора в стандартни клетъчни линии от бозайници, бактерии или дрожди, съгласно методи добре известни в тази област.
(2) Трансгенни не-човешки бозайници
Човешки антитела срещу Αβ могат също да бъдат получени от не-човешки трансгенни бозайници, притежаващи трансгени, кодиращи най-малко един сегмент от човешкия имуноглобулинов локус. Обикновено, ендогенният имуноглобулинов локус на такива трансгенни бозайници е функционално неактивен. Предпочитано, сегментът от човешкия имуноглобулинов локус включва не-прередени последователности на компоненти от лека и тежка верига. Инактивация на ендогенни имуноглобулинови гени и въвеждане на 0 ендогенни имуноглобулинови гени могат да бъдат постигнати чрез прицелна хомоложна рекомбинация, или чрез въвеждане на YAC хромозоми. Трансгенните животни получени от този процес са способни на функционално пренареждане последователностите на имуноглобулиновия компонент и експресиране на набор антитела от различни изотипове, кодирани от човешки имуноглобулинови гени, без да се експресират ендогенни имуноглобулинови гени. Получаването и свойствата на бозайници, притежаващи тези свойства са описани подробно от например, Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016 US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US ® 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви случаи). Трансгенни мишки са особено подходящи в това отношение. Анти-Αβ антитела са получени чрез инжектиране на трансгенен не-човешки бозайник, какъвто е описан от Lonberg или Kucherlapati, по-горе, с Αβ или негов фрагмент. Моноклонални антитела са получени чрез, например сливане на Вклетки от такива бозайници с подходящи миеломни клетъчни линии, като се използува конвенционална Kohler-Milstein технология. Човешки поликлонални антитела могат също да бъдат предоставени във формата на серум от хора имунизирани с имуногенен агент. По избор, такива поликлонални антитела могат да бъдат концентрирани чрез афинитетно пречистване като се използува Αβ или друг имуноген амилоиден пептид като афинитетен реагент.
(3) Фагов дисплей методи
Следващ подход за получаване на анти-Αβ антитела е да се скринира една ДНК библиотека от човешки В клетки, съгласно общия протокол очертан от Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Например, както е описано за триома методологията, такива В клетки могат да бъдат получени от човек имунизиран с Αβ, фрагменти, поголеми полипептиди съдържащи Αβ или фрагменти, или антиидиотипни антитела. По избор, такива В клетки са получени от пациент, който в крайна сметки ще получи третиране с антитела. Подбрани са антитела свързващи се с епитоп на амилоидния компонент, който представлява интерес, като Αβ или негов фрагмент. След това последователности кодиращи такива антитела (или свързващи фрагменти) са клонирани и амплифицирани. Протоколът описан от Huse е направен по-ефективен в комбинация с фаговдисплей технология. Виж, например Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 7,733,743 и US 5,565,332 (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви случаи). При тези методи, са получени библиотеки на фаги, при които членовете проявяват различни антитела по тяхната външна повърхност.
Антитела обикновено са проявени като Fv или Fab фрагменти. Фаги проявяващи антитела със желана специфичност, са подбрани чрез афинитетно обогатяване срещу един Αβ пептид или негов фрагмент.
В един вариант на фагов-дисплей метод, могат да бъдат получени човешки антитела, притежаващи свързваща специфичност на подбрано мишо антитяло. Виж Winter, WO 92/20791. При този метод е използувана променливата област на тежката или леката верига на подбрано мишо антитяло като изходен материал. Ако например, като изходен материал е избрана променливата област на лека верига, конструирана е фагова библиотека, в която членове проявяват същата променлива област на леката верига (т.е. мишият изходен материал) и една различна променлива област на тежката верига. Променливите области на леката верига, са получени от библиотека на пренаредени променливи области на човешка тежка верига. Подбран е фаг, показващ силна свързваща специфичност за компонента от интерес (например, най-малко 108 и предпочитано най-малко 1О10 М’1). Променливата област на човешка тежка верига от този фаг след това служи като изходен материал за конструиране на следваща фагова библиотека. В тази библиотека, всеки фаг проявява същата променлива област на тежката верига (т.е. областта идентифицирана от първата дисплей библиотека) и различна променлива област на леката верига. Променливите области на леката верига са получени от библиотека на пренаредени човешки променливи области на леката верига. Отново, подбран е фаг проявяващ силна свързваща специфичност за амилоиден пептиден компонент. Тези фаги проявяват променливите области на напълно човешки антиамилоидни пептидни антитела. Тези антитела обикновено имат същата или сходна специфичност на епитопа както мишия изходен материал.
е. Подбор на константна област
Променливите области на тежки и леки вериги на химерни, хуманизирани или човешки антитела, могат да бъдат свързани с наймалко една част от човешка постоянна област. Изборът на константна област зависи отчасти, от това дали е желан антитяло-зависим комплемент и/или клетъчно медиирана токсичност. Например, изотипи lgG1 и lgG3 имат същата активност на комплемента и изотипи lgG2 и lgG4 нямат. Избор на изотип може също да повлияе преминаването на антитяло в мозъка. Константни области на лека верига могат да бъдат lambda или kappa. Антитела могат да бъдат експресирани като тетрамери, съдържащи две леки и две тежки вериги, като отделни тежки вериги, леки вериги, като Fab, Fab’ F(ab’)2 и Fv, или като едноверижни антитела, в които променливи домени на тежка и лека верига са свързани чрез спейсър.
f. Експресия на рекомбинантни антитела
Химерни, хуманизирани и човешки антитела обикновено са произвежани чрез рекомбинантна експресия. Рекомбинантни полинуклеотидни конструкти обикновено включват една контролираща експресията последователност, оперативно свързана с кодиращите последователности на антитяло вериги, включително естественосвързани или хетероложни промоторни области. Предпочитано, контролиращите експресията последователности са еукариотни промоторни системи във вектори, способни да трансформират или трансфектират еукариотни клетки гостоприемници. Веднъж въведен вектора в подходящ гостоприемник, гостоприемникът се подържа в подходящи условия за високо ниво на експресия на нуклеотидните последователности, и събирането и пречистването на кръстосано реагиращи антитела.
Тези експресионни вектори обикновено са реплицируеми в организмите гостоприемници, като епизоми или като интегрална част от хромозомната ДНК на гостоприемника. Обикновено, експресионните вектори съдържат селекционни маркери, например, ампицилин-резистентност или хигромицин-резистентност, което да позволи откриването на клетки, които са трансформирани с желани последователности на ДНК.
E.coli е прокариотен гостоприемник, особено полезен за клониране на ДНК последователности на настоящето изобретение. Микроорганизми, като дрожди също са полезни за експресия. Saccharomyces са предпочитан гостоприемник от дрожди, с подходящи вектори, притежаващи контролиращи експресията последователности, начало на репликация, завършващи последователности и подобни, според желанието. Типични промотори включват 3-фосфоглицерат киназа и други гликолитични ензими. Индуцируеми промотори на дрожди включват, между другото, промотори на алкохол дехидрогеназа, изоцитохром С и ензими, отговорни за оползотворяване на малтоза и галактоза.
Клетки от бозайници са предпочитан гостоприемник за експресиране на нуклеотидни сегменти, кодиращи имуноглобулини или техни фрагменти. Виж Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987). Разработени са известен брой подходящи за гостоприемник клетъчни линии, способни за подбор на интактни хетероложни белтъци и включват СНО клетъчни линии, различни COS клетъчни линии, HeLa клетки, L клетки и миеломни клетъчни линии. Експресионни вектори за тези клетки могат да включват контролиращи експресията последователности, като начало на репликацията, промотор, енхенсер (Queen et al., ImmunoLRev. 89:49 (1986)), и необходими за процесирането информационни места, като свързващи рибозоми места, места за РНКснаждане, места на полиаденилиране и завършващи транскрипцията последователности. Предпочитани контролиращи експресията последователности са промотори, произхождащи от ендогенни гени, цитомегаловирус, SV40, аденовирус, говежди папилома вирус и подобни. Виж, Co et al., JJmmunol. 148:1149(1992).
Алтернативно, антитяло кодиращи последователности могат да бъдат включени в трансгени за въвеждане в генома на трансгенни животни и последваща експресия в млякото на трансгенно животно (например, съгласно методи описани в UD 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992, всички включени тук чрез цитат в тяхната цялост). Подходящи трансгени включват кодиращи последователности за лека и/или тежка верига, в оперативна връзка с промотор или енхенсер от специфичен ген за млечна жлеза, като казеин или бета лактоглобулин.
Вектори съдържащи ДНК сегментите, които представляват интерес, могат да бъдат пренесени в клетката гостоприемник с добре известни методи, в зависимост от типа клетъчен гостоприемник. Например, трасфекция с калциев хлорид обикновено е използувана за прокариотни клетки, докато третиране с калциев фосфат, електропорация, липофекция, biolistics или трансфекция на базата на вирус, могат да бъдат използувани за други клетъчни гостоприемници. Други методи използувани за трансфопмиране клетки от бозайници включват използуването на полибрен, сливане на протопласти, липозоми, електропорация и микроинжектиране (виж общо, Sambrook et al., по-горе). За произвеждане на трансгенни животни, трансгени могат да бъдат микроинжектирани в оплодени ооцити или могат да бъдат включени в генома на ембрионални стволови клетки, и ядрата на такива клетки да бъдат пренесени в енуклеирани ооцити.
Веднъж експресирани, антителата могат да бъдат пречистени съгласно стандартни процедури в тази област, включително HPLC пречистване, колонна хроматография, гелна електрофореза и подобни (виж общо, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
4. Други терапевтични агенти
Терапевтични агенти за приложение в настоящите методи включват също Т-клетки, които се свързват с компонент на плака, като Αβ пептид. Например, Т-клетки могат да бъдат активирани срещу Αβ пептид, чрез експресиране на човешки МНС клас I ген и човешки β-261 микроглобулин ген от една клетъчна линия от насекоми, при което се формира празен комплекс по повърхността на клетките и може да се свързва с Αβ пептид. Т-клетки, които са били в контакт с клетъчната линия стават специфично активирани срещу пептида. Виж Peterson et al., US 5,314,813. Клетъчни линии от насекоми, експресиращи МНС клас II антиген, могат подобно да бъдат използувани да активират CD4 Т-клетки.
5. Носители белтъци
Някои агенти за индуциране на имунен отговор съдържат съответния епитоп за индуциране на имунен отговор срещу амилоидни отлагания, но са твърде малки за да бъдат имуногенни. В такъв случай, пептиден имуноген можа да бъде свързан с подходящ носител за да подпомогне предизвикването на имунен отговор. Подходящи носители включват серумни албумини, keyhole limpet hemocyanin, имуноглобулинови молекули, тироглобулин, овалбумин, тетанус токсоид или токсоид от други патогенни бактерии, като дифтерия, Е.со//, холера или Н.pylori, или атенюирано токсиново производно. Други носители включват Т-клетьчни епитопи, които се свързват с множествени МНС алели, например, най-малко 75% от всички човешки МНС алели. Такива носители понякога са известни в тази област като “универсални Т-клетъчни епитопи”. Примери за универсални Т-клетъчни епитопи включват:
Инфлуенца хемаглугинин: НА307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1)
PADRE (общи остатъци са надебелени) AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2)
Малария CS: ТЗ епитоп EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3)
Хепатит В повърхностен антиген: HBsAgi^s FFLLTRILTI (SEQ ID
NO: 4)
Heat Shock Protein 65: hsp65163.i7i DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 5)
Bacille Calmette-Guerin QVHFQPLPPAWKL (SEQ ID NO: 6) Тетанус токсоид: ΤΤ830.β44 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7) Тетенус токсоид: TWae? FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 8)
HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA. (SEQ ID NO: 9)
Други носители за стимулиране или повишаване на имунния отговор включват цитокини като IL-1, IL-1a и β пептиди, IL-2, yINF, IL10, GM-CSF и хемокини, като М1Р1а и β и RANTES. Имуногенни агенти могат съицо да бъдат свързани с пептиди, които повишават транспорта през тъкани, както е описано в O’Mahony, WO 97/17613 и WO 97/17614.
Имуногенни агенти могат да бъдат свързани с носители чрез химично кръстосано свързване. Техники за свързване на имуноген с носител включват образуване на дисулфидни връзки, като се използува №сукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионат (SPDP) и сукцинимидил 4-(№малеимидометил)цикпохексан-1-карбоксилат (SMCC) (ако пептидът няма сулфхидрилна група, такава може да бъде осигурена чрез добавка на цистеинов остатък). Тези реагенти създават една дисулфидна връзка между тях и пептидни цистеинови остатъци на белтъка и една амидна връзка чрез ε-амино на лизин, или други свободни амино групи в други аминокиселини. Различни такива дисулфид/амид-образуващи агенти са описани в Immun.Rev. 62, 185 (1982). Други бифункционални свързващи агенти образуват по-скоро тиоетер отколкото дисулфидна връзка. Много от тези тио-етеробразуващи агенти са търговски достъпни и включват реактивни естереи на 6-малеимидокапронова киселина, 2-бромоцетна киселина и 2-йодоцетна киселина, 4-(№малеимидо-метил)циклохексан-163 карбоксилова киселина. Карбоксилните групи могат да бъдат активирани чрез комбинирането им със сукцинимид или 1-хидрокси-2нитро-4-сулфонова киселина, натриева сол.
Имуногенни пептиди могат също да бъдат експресирани като слети белтъци с носители (т.е. хетероложни пептиди). Имуногенният пептид може да бъде свързан при неговия амино- край, неговия карбокси- край или и при двата с носител. По избор, множествени повтори на имуногенния пептид могат да бъдат налице в слетия белтък. По избор, имуногенният пептид може да бъде свързан с множествени копия на хетелорожен пептид,например, при двата N и С краищата на пептида. Някои носители пептиди служат да индуцират отговор на помощна Т клетка срещу пептида носител. Индуцираните помощни Т-клетки на свой ред индуцират В-клетъчен отговор срещу имуногенния пептид, свързан с носителя пептид.
Някои агенти на изобретението съдържат слят белтък, в който един N-краен фрагмент от Αβ е свързан при неговия С-край с носител пептид. При някои агенти, N-терминалният остатък на фрагмента от Αβ съставлява N-крайния остатък на слетия белтък. Съответно, такива слети белтъци са ефективни при индуциране на антитела, които се свързват с епитоп, който изисква N-терминалният остатък на Αβ да бъде в свободна форма. Някои агенти на изобретението съдържат множество от повтори на един N-терминален сегмент от Αβ, свързан при С-края с едно или повече копия на носител пептид. N-терминалният фрагмент на Αβ, включен в такива слети белтъци, понякога започва при Αβ1-3 и завършва при Αβ7-11. Αβ1-7, Αβ1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 са предпочитан N-краен фрагмент от Αβ. Някои слети белтъци съдържат различни N-крайни сегменти от Αβ в тандем. Например, един слят белтък може да съдържа Αβ1-7, следван от Αβ1-3, следван от хетероложен пептид.
При някои слети (фузионни) белтъци, N-терминален сегмент от Αβ е слят при неговия N-терминален край с хетероложен носител пептид. Същото разнообразие от N-терминални сегменти от Αβ може да бъде използувано както при С-терминални сливания. Някои слети белтъци съдържат хетероложен пептид, свързан с N-края на един Νтерминален сегмент от Αβ, който на свой ред е свързан с един или повече допълнителни N-терминални сегменти от Αβ в тандем.
Някои примери на слети белтъци, подходящи за приложение в изобретението, са показани по-долу. Някои от тези слети белтъци съдържат сегменти от Αβ свързани с епитопи на тетанус токсоид, такива както са описани в US 5,196,512, ЕР 378,881 и ЕР 427,347. Някои слети белтъци съдържат сегменти от Αβ, свързани с носители пептиди, описани в US 5,736,142. Някои хетероложни пептиди са универсални Т-клетъчни епитопи. В някои методи, агентът за въвеждане е просто единичен слят белтък с един Αβ сегмент, свързан с хетероложен сегмент в линейна конфигурация. В някои методи, агентът е мултимер на слети белтъци, представени с формулата 2Х, в която х е цяло число от 1-5. Предпочитано х е 1,2 или 3, като 2 е найпредпочитано. Когато х е две, такъв мултимер има четири слети белтъци, свързани в предпочитана комбинация, означена като МАР4 (виж US 5,229,490). Епитопите на Αβ са подчертани.
МАР4 конфигурацията е показана по-долу, където разклонените структури са получени чрез иницииране на пептидна синтеза при N терминалните и тези на страничната верига амини на лизин. В зависимост от броя пъти, когато лизин е включен в последователността и има възможност да се разклонява, получената структура ще представя множество N краища. При този пример, са получени четири идентични N краища на разклонената лизинсъдържаща сърцевина. Такава множественост силно повишава готовността за отговор на сродни В клетки.
Пептид-^,
Пептид*^
KGG
Пептид
Пептид
AN90549 (Αβ 1-7/тетанус токсоид 830-844 в МАР4 конфигурация): DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 10)
AN90550 (Αβ 1-7/тетанус токсоид 947-967 в МАР4 конфигурация): DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 11)
AN90542 (Αβ 1-7/гетанус токсоид 830-844+ 947-967 в линейна конфигурация):
DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12)
AN90576: (Αβ 3-9)/гетанус токсоид 830-844 в МАР4 конфигурация):
EFRHDSGQYUKANSKFIGITEL (SEQ ID N0: 3)
Пептид описан в US 5,736,142 (изцяло в линейна конфигурация)
AN90562 (Αβ 1-7/пептид) AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID NO: 14)
ΑΝ90543(Αβ1-7χ3/πβπτπΑ):
DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15)
Други примери на слети белтъци (имуногенен епитоп на Αβ подсилен) включват
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHDzDAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO:
16)
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17)
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 18)
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 19)
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 20)
PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 21)
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO:
23)
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO. 24) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 26)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD (SEQ ID NO: 27)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 238) на една двуразклонена верига пептид lys-Gly-Cys пептид
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (синуклеин слет белтък в МАР-4 конфигурация; SEQ ID NO: 29)
Същите или сходни белтъци носители и методи на свързване могат да бъдат използувани за създаване на иммуногени, за употреба при създаване на антитела срещу Αβ, за приложение при пасивна имунизация. Например, Αβ или един фрагмент, свързани с носител, могат да бъдат въвеждани на лабораторни животни при произвеждането на антитела срещу Αβ.
6. Нуклеинова киселина кодираща терапевтични агенти
Имунни отговори срещу амилоидни отлагания, могат също да бъдат ицдуцирани чрез въвеждане на нуклеинови киселини, кодиращи
подбрани пептидни имуногени, или антитела и техните компоненти вериги да бъдат използувани за пасивна имунизация. Такива нуклеинови киселини могат да бъдат ДНК или РНК. Сегмент на нуклеинова киселина, кодиращ имуноген, обикновено е свързан с регулаторни елементи, като промотор и енхенсер, което позволява експресия на ДНК сегмента в предвидени прицелни клетки на пациент. За експресия в кръвни клетки, както е желателно за индукция на имунен отговор, промоторни и енхенсерни елементи от гени на лека или тежка верига на имуноглобулин или CMV главен междинен ранен промотор и енхенсер, са подходящи за насочване на експресията. Свързаните регулаторни елементи и кодиращи последователности, често са клонирани в един вектор. За въвеждане на двойноверижни антитела, двете вериги могат да бъдат клонирани в един и същи или в отделни вектори.
На разположение са известен брой вирусни вектори, включително ретровирусни системи (виж например, Lawrie and Tumin, Cur.Opin.Genet.Develop. 3, 102-109, 1993); адено-свързани вирусни вектори (виж например, Zhou et al.,J.Exp.Med. 179, 1867, 1994), вирусни вектори от шарковото семейство, включително vaccinia вирус и птичите шаркови вируси, вирусни веектори от alpha virus genus като тези произхождащи от Sindbis and Semiliki Forest Viruses (виж, например, Dubensky et al., J.Virol. 7Q, 508-519, 1996), вирус на венецуелски конски енцефалит (виж US 5,643,576) и рабдовируси, като вируса на везикуларния стоматит (виж WO 96/34625) и папилома вируси (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995)] Woo et al., WO 94/12629 и Xiao & Brandsma, Nucleic Acids Res. 24, 2630-2622, 1996).
ДНК кодираща имуноген, или вектор съдържащ същата, може да бъде пакетирана в липозоми. Подходящи липиди и сродни аналози са описани от US 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 и 5,283,185.
Вектори и ДНК кодиращи имуноген, могат също да бъдат абсорбирани със, или свързани със зърнисти носители, примери за които включват полиметил метакрилат полимери и полилактиди и поли(лактид-когликолиди), виж например, McGee et al., J.Micro Encap. (1996).
Вектори за генна терапия или гола ДНК, могат да бъдат предоставени in vivo чрез въвеждане у пациент, обикновено чрез системно въвеждане (например, интравенозно, интраперитонеално, интраназално, стомашно, интрадермално, интрамускулно, подкожно или чрез интракраниална инфузия) или топично приложение (виж ф например, US 5,399,346). Такива вектори могат по-нататък да включват улесняващи агенти като бупивикаин (US 5,593,970). ДНК може също да бъде въведена като се използува генна пушка. Виж Xiao & Brandsma, по-горе. ДНК кодираща имуноген е преципитирана по повърхността на микроскопични метални зрънца. Микропрожектилите са ускорявани с ударна вълна или разширяващ се газ хелий и проникват в тъканите на дълбочина от няколко клетъчни слоеве. Например, подходящо е The Accel™ Gene Delivery Device произведено от Agracetus, Inc., (Middleton, Wl) . Алтернативно, гола ДНК може да премине през кожата в кръвния ток, просто чрез нанасяне на ДНК върху кожата с химично или механично дразнене ® (виж WO 95/05853).
В следващ вариант, вектори кодиращи имуногени могат да бъдат предоставени на клетките ex vivo, като клетки експлантирани от даден пациент (например, лимфоцити, костно мозъчни аспирати, тъканна биопсия) или универсални донорни хематопоетични стволови клетки, последвано от реимплантация на клетките у пациент, обикновено след подбор за клетки, които имат включен вектор.
7. Скрининг на антитела за очистваща активност
Пример XIV описва методи за подбор на антитяло за активност при очистване на амилоидно отлагане. За да се направи подбор за активност срещу амилоидно отлагане, тъканна проба от пациент с амилоидоза, като например мозъчна тъкан при болест на Alzheimer, или животински модел с характерна амилоидна патология, е поставяна в контакт с патогенни клетки, носещи Fc рецептор, като микроглиялни клетки и антитяло, което е тестирано в среда in vitro. Фагоцитиращи клетки могат да бъдат първична култура или клетъчна линия, като BV-2, С8-В4 или ТНР-1. Тези компоненти са комбинирани върху стъкла за микроскопиране, за улесняване на микроскопския контрол, или множество реакции могат да бъдат проведени паралелно в ямки на микротитрационна платка. В такъв формат отделно миниатюрно стъкло за микроскопиране може да бъде поставено в отделни ямки или в не-микроскопски формат за откриване, като ELISA детектиране на Αβ. Предпочитано са правени серии от измервания на количеството амилоидно отлагане в in vitro реакционна смес, започвайки от изходната стойност преди протичане на реакцията и една или повече тестирани стойности по време на реакцията. Антигенът може да бъде открит чрез оцветяване, например, с флуоресцентно белязано антитяло срещу Αβ или друг компонент на амилоидни плаки. Антитялото използувано за оцветяване може да бъде или да не бъде същото, което ще се тестира за очистваща активност. Намаление по отношение на изходното количество амилоидни отлагания по време на реакцията показва, че тестираното антитяло има очистваща активност. Такива антитела е възможно да бъдат полезни за профилактика или лечение на болест на Alzheimer или други амилоидогенни заболявания. Както е описано по-горе, експерименти проведени в подкрепа на настоящето изобретение, разкриват, използувайки такъв тест, че антитела срещу NAC фрагмент
ΊΟ на синуклеин, са ефективни да изчистват амилоидни плаки, характерни за болестта на Alzheimer.
D. Пациенти податливи на схеми за анти-амилоидно третиране
Пациенти податливи на третиране, включват индивиди с риск от заболяване, но не проявяващи симптоми, както и пациенти които имат проявени симптоми на амилоидоза. В случая с болестта на Alzheimer, в действителност всеки е в риск от заболяване на Alzheimer, ако той или тя живеят достатъчно дълго. Следователно, настоящите методи могат да бъдат прилагани профилактично към общата популация, без да е необходимо от някакво определяне на риска за дадения пациент. Настоящите методи са особено полезни за индивиди, за които е известно, че имат генетичен риск за болест на Alzheimer или някакво наследствено амилоидно заболяване. Такива индивиди включват тези, които имат роднини, които страдат от това заболяване и такива, чийто риск е определен чрез анализ на генетични или биохимични маркери. Генетични маркери за риск от болест на Alzheimer, включват мутации в АРР гена, по-специално мутации в позиция 717 и позиции 670 и 671, означени съответно като Hardy и шведска мутации (виж Hardy, TINS, по-горе). Други маркери за риск са мутации в пресенилните гени, PS1 и PS2 и АроЕ4, фамилна анамнеза за AD, хиперхолестеролемия или атеросклероза. Индивиди страдащи понастоящем от болест на Alzheimer, могат да бъдат разпознати по характерна деменция, както и наличието на рискови фактори, описани по-горе. В допълнение, на разположение са известен брой диагностични тестове за идентифициране на индивиди с AD. Такива включват измерване на CSF tau и Αβ42 нива. Повишен tau и понижени Αβ42 нива означават наличие на AD. Индивиди страдащи от болест на Alzheimer, могат да бъдат диагностицирани с MMSE или ADRDA критерии, както е описано в раздела Примери.
При асимптомни пациенти, третирането може да започне на всякаква възраст (например, 10, 20, 30). Обикновено, обаче не е необходимо да се започне лечение докато пациентът не навърши 40, 50, 60 или 70 години. Третирането обикновено предвижда множество дозировки за известен период от време. Третирането може да бъде контролирано чрез определяне на антитяло или активирани Тклетъчни или В-клетъчни отговори спрямо терапевтичния агент (например, Αβ пептид) за определено време, по указанията описани тук в Пример I и II. Ако липсва отговор, показана е бустерна имунизация. В случая с пациенти с потенциален синдром на Down, третирането може да започне преди раждането чрез въвеждане на терапевтичния агент у майката или непосредствено след раждането.
Други форми на амилоидоза често остават не диагностицирани , независимо, че се подозира специално предразположение за заболяването. Основен симптом е наличието на сърдечно или бъбречно заболяване у пациент на средна до напреднала възраст, който има признаци за друго органно засягане. Нисък волтаж или екстремни отклонения на оста на електрокардиограмата и задебелена камерна тъкан, могат да бъдат показателни за сърдечно засягане. Протеинурия е симптом за бъбречно ангажиране. Може също да се подозира чернодробно засягане, ако се открие хепатомегалия при физикално изследване на пациента. Периферна невропатия също е обичайна проява при някои форми на амилоидози; може също да бъде открита автономна невропатия, характеризираща се с постурална хипотония. Амилоидоза трябва да бъде подозирана у всеки, който е с прогресираща невропатия от неопределен произход. Окончателна диагноза на заболяването може да бъде направена като се използуват биопсични методи, където са достъпни засегнатите орган(и). За системни амилоидози, може да бъде използуван аспириран мастен тампон или проби от ректална биопсия. Биопсичният материал се оцветява с Congo red, като положителните проби проявяват ябълково зелено двойно пречупване под микроскоп с поляризована светлина.
Е. Схеми за третиране
При профилактични приложения, фармацевтични препарати или медикаменти се въвеждат у пациент, предразположен към, или в риск от дадено заболяване, в количество, което е достатъчно да елиминира или да намали риска, или да забави началото на заболяването. При терапевтични приложения, препаратите или медикаментите се въвеждат у пациент, който е подозрителен, или действително страдащ от такова заболяване, в количество, което е достатъчно да лекува, или поне да спре, симптомите на заболяването и неговите усложнения. Количество, което е адекватно да изпълни това, се определя като терапевтично или фармацевтично ефективна доза. И при двата режима - профилактичен и терапевтичен, агентите обикновено се прилагат в няколко дозировки докато се постигне достатъчен имунен отговор. Обикновено имунният отговор е контролиран и повторни дозировки са давани ако имунният отговор започне да намалява.
Ефективните дози на препаратите на настоящето изобретение, за третиране на гореспоменатите условия, варират в зависимост от много различни фактори, включително начина на въвеждане, прицелното място, физиологичното състояние на пациента, дали пациентът е човек или животно, други прилагани медикаменти, и дали третирането е профилактично или терапевтично. Обикновено пациентът е човек, но при някои заболявания, като прион протеин-свързаната болест луда крава, пациентът може да бъде бозайник, като говедо. Дозировките за третиране е необходимо да бъдат титрирани за оптимизиране безопасност и ефикасност. Количеството имуноген зависи от това дали също се въвежда адювант, като при по-високите дозировки обикновено се изисква отсъствие на адювант. В зависимост от имуногенността на дадената комбинация, количеството имуноген за въвеждане може да варира от 1цд-550 цд за пациент и обикновено от 5-500 цд за инжекция при приложение на човек. Понякога се използува по-голяма доза от 0.55 mg за инжекция. Обикновено най-малко около 10, 20, 50 или 100 цд се използуват за всяка инжекция при човек. Сроковете за инжектиране могат значително да варират от един път дневно, до един път годишно, до един път на десет години, с известни предпочитани последователни “бустери” от имуноген. Общо, съгласно предоставените тук указания, ефективните дозировки могат да бъдат контролирани чрез получаване на течна проба от пациента, обикновено проба от кръвен серум, и определяне антитяло тигъра, получен срещу имуногена, като се използуват добре известни методи в тази област и пряко приложими за измерване на специфичен антиген. В идеалния случай, проба се взима преди началното дозиране; последващи проби се взимат и се титруват след всяка имунизация. Общо, схема за доза или дозировка, която осигурява откриваем титър, желателно най-малко четири пъти по-висок от контролните или “изходни” нива при серумно разреждане 1:100, като изходно е дефинирано по отношение на контролния серум или по отношение на изходна платка в ELISA тестове. Предпочитани са титри 1:1000 или 1:5000 съответно на настоящото изобретение.
На какьвто и да е ден, на който се дава дозировка от имуноген, дозировката обикновено е по-висока от около 1цд/пациент и предпочитано по-висока от Юцд/пациент, ако се въвежда също и адювант и най-малко по-висока от 10 цд/пациент и обикновено повисока от 100 цд/пациенг в отсъствие на адювант. Дози за индивидуалните имуногени, подбрани съгласно настоящето изобретение, са определени в съответствие със стандартно дозиране и титрационни методи, приети във връзка с предоставените тук указания. Типичната схема се състои от една имунизация, последвана от бустерни инжекции на периоди от време, като 6-седмични интервали. Друга схема се състои от една имунизация, последвана от бустерни инжекции 1,2 и 12 месеца по-късно. Друга схема включва една инжекция на всеки два месеца от живота. Алтернативно, бустерните инжекции могат да бъдат на неравномерна основа, както се указва чрез мониториране на имунния отговор.
За пасивна имунизация с антитяло, дозировките са в рамките от около 0.0001 до 100mg/kg, по-често 0.01 до 5mg/kg, телесно тегло на гостоприемника. Например дозировките могат да бъдат 1 mg/kg телесно тегло или 10mg/kg телесно тегло. Една примерна схема на третиране включва въвеждане един път на две седмици или един път месечно, или един път на 3 до 6 месеца. При някои методи се въвеждат едновременно две или повече моноклонални антитела с различна свързваща специфичност, в който случай дозировката на всяко въведено антитяло е в указаните граници. Обикновено антитяло се въвежда многократно. Интервалите между отделните дозировки могат да бъдат седмични, месечни или годишни. Интервалите могат също да бъдат неправилни, според данните от измерените кръвни нива на антитяло срещу Αβ у пациента. Алтернативно, антитялото може да бъде прилагано като комбинация със забавено освобождаване, при който случай се изисква по-рядко приложение. Дозировката и честотата варират в зависимост от полуживота на антитялото у пациента. Общо, човешки антитела проявяват по-дълъг полуживот, последвани от хуманизирани антитела, химерни антитела и не-човешки антитела. Дозировката и честотата на приложение могат да варират в зависимост от това дали третирането е профилактично или терапевтично. За профилактично приложение се въвеждат относително ниски дозировки на относително по-редки интервали за дълъг период от време. Някои пациенти продължават да получават третиране за остатъка от техния живот. Терапевтично приложение, в относително висока дозировка на относително по-кратки интервали, понякога се изисква докато се редуцира прогресирането на заболяването или се прекрати, и предпочитано докато пациентът прояви частично или пълно подобрение на симптомите на заболяването. След това на пациента може да бъде приложен профилактичен режим.
Дозите за нуклеинови киселини кодиращи имуногени варират от 10 ng до 1д, 100 ng до 100 mg, 1цд до 10mg или 30-300 дд ДНК на пациент. Дозите за инфекциозни вирусни вектори варират от 10-100 или повече, вириони за доза.
Агенти за индуциране на имунен отговор могат да бъдат прилагани парентерално, топично, интравенозно, орално, подкожно, интраперитонеално, интраназално или интрамускулно за профилактично и/или терапевтично третиране. Типичните начини на въвеждане на имуногенния агент са интрамускулен (i.m.), интравенозен (i.v.) или подкожен (s.c.), въпреки че и други начини могат да бъдат еднакво ефективни. Интрамускулната инжекция найчесто се прави на ръката или в мускулите на крака. При някои методи, агентите се инжектират директно в тъканта, където са натрупани отлаганията, например с интракраниално инжектиране. Интрамускулното инжектиране или интравенозната инфузия са предпочитани за въвеждане на антитяло. При някои методи, дадени терапевтични антитела са инжектирани директно в черепа. При някои методи, антителата са въведени като препарат със забавено освобождаване или устройство, като Medipad™ device.
Агенти на изобретението могат по избор да бъдат прилагани в комбинация с други агенти, които са поне отчасти ефективни за третиране на амилоидогенно заболяване. В случая с болестта на
Alzheimer и синдрома на Down, при който амилоидните отлагания се откриват в мозъка, агентите на изобретението могат също да бъдат въведени в съчетание с други агенти, които повишават преминаването на агентите на изобретението през кръвно-мозъчната бариера. Понататък, терапевтични коктейли съдържащи имуногени, предвидени да провокират имунен отговор срещу повече от един амилоиден компонент, също са планирани от настоящето изобретение, както и комбинация от антитяло насочено срещу компонент на плака и имуноген насочен срещу друг различен компонент на плака.
Имуногенни агенти на изобретението, като пептиди, понякога се въвеждат в комбинация с адювант. Могат да бъдат използувани различни адюванти в комбинация с пептид, като Αβ, за предизвикване на имунен отговор. Предпочитани адюванти увеличават вътрешния имунен отговор срещу имуноген, без да предизвикват конформационни промени в имуногена, който засяга качествената форма на отговора. Предпочитаните адюванти включват алуминиев хидроксид и алуминиев фосфат, ЗОе-О-ацетилиран монофосфорил липид A (MPL™) (виж GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, понастоящем част от Corixa). Stimilon™ QS-21 e тритерпен гликозид или сапонин, изолиран от кората на дървото Quillaja Saponaria Molina в Южна Америка (виж Kensil et al., in Vaccine Design: The Structure and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Patent No. 5,057,540), (Aquila BioPhrmaceuticals, Farmingham, МА). Други адюванти са емулсии масло във вода (като сквален или фъстъчено масло), по избор в комбинация с имунни стимуланти, като монофосфорил липид А (виж Stoute et al., N.Engl.J.Med. 336, 86-91 (1997). Друг адювант е CpG (WO 98/40100). Алтернативно, Αβ може да бъде свързан с адювант. Обаче, такова свързване не трябва съществено да променя конформацията на Αβ, така че да засяга природата на имунния отговор спрямо нея.
Адюванти могат да бъдат въведени като компонент на терапевтичен състав с активен агент или могат да бъдат въведени отделно преди, конкурентно със, или след въвеждане на терапевтичния агент.
Предпочитан клас адюванти са алуминиеви соли (alum), като алуминиев хидроксид, алуминиев фосфат, алуминиев сулфат. Такива адюванти могат да бъдат използувани със или без други имуностимулиращи агенти, като MPL или 3-DMP, QS-21, полимерни или мономерни аминокиселини като полиглугаминова киселина или полилизин. Друг клас адюванти са масло във вода емулсионни комбинации. Такива адюванти могат да бъдат използувани със или без други специфични имуностимулиращи агенти, като мурамил пептиди (например И-ацетилмурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин (thrMDP), Н-ацетил-нормурамил-Ь-аланил-О-изоглугамин (nor-MDP), Nацетилмурамил-1_-аланил-1>изоглутаминил-1--аланин-2-(Т-2’дипалмитоил-8П-глицеро-3-хидроксифосфорилокси)-етиламин (МТР-РЕ), Nацетилглюксаминил-Н-ацетилмуламил-1_-А1-Е)-изоглю-1--Ала-дипалмитокси пропиламид (DTP-DPP) терамид™, или други компоненти на стената на бактериалната клетка. Масло във вода емулсии включват (a) MF59 (WO/4837), съдържащ 5% сквален, 0.5% Tween 80 и 0.5% Span 85 (по избор съдържащ различни количества от МТР-РЕ) комбиниран в субмикронни частици, като се използува микрофлуидайзер като Model 110Y microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, съдържащ 10% сквален, 0.4% Tween 8, 5% плуроновблокиран полимер L121 и thr-MDP, микрофлуидизиран в субмикронна емулсия или разбъркан на вортекс за получаване емулсия с по-големи частици и (с) Ribi™ адювант система (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, МТ), съдържаща 2% сквален, 0.2% Tween 80 и един или повече компоненти на бактериалната клетъчна стена, от група състояща се монофосфорил липид А, трехалоза димиколат (TDM) и скелет на клетъчната стена (CWS), предпочитано MPL + CWS (Detox™). Друг клас предпочитани адюванти са сапонинови адюванти, като Stimulon™ (QS-21; Aquila, Framingham, МА) или частици произведени от него като ISCOMs (имуностимулиращи комплекси) и ISCOMATRIX. Други адюванти включват Непълен адювант на Freund (IFA), цитокини, като интерлевкини (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофаг колониен стимулиращ фактор (M-CSF) и тумор некрозис фактор (TNF). Такива адюванти обикновено са на разположение от търговски източници.
Един адювант може а бъде въведен с имуноген като единичен препарат или може да бъде въведен преди, конкурентно със или след въвеждане на имуногена. Имуноген и адювант могат да бъдат пакетирани и доставени в същото стъкло или могат да бъдат пакетирани в отделни шишета и смесени преди употреба. Имуноген и адювант обикновено са пакетирани с етикет указващ предвиденото терапевтично приложение. Ако имуноген и адювант са пакетирани поотделно, пакетирането обикновено включва инструкции за смесване преди употреба. Изборът на адювант и/или носител зависи от такива фактори като стабилност на комбинацията, съдържаща адюванта, начин на въвеждане, схема за дозировка и ефикасност на адюванта за видовете, които се ваксинират. При хора, предпочитан фармацевтично приемлив адювант е този, който е потвърден за приложение при човек от съответните регулаторни органи. Примери за такива предпочитани адюванти за хора, включват alum, MPL и QS-
21. По избор, два или повече различни адюванти могат да бъдат използувани едновременно. Предпочитани комбинации включват alum с MPL, alum с QS-21, MPL с QS-21 и alum, QS-21 и MPL заедно. Може също да бъде използуван Непълен адювант на Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), по избор в комбинация c всеки от alum, QS-21 и MPL и всички техни комбинации.
. i^-vM.rfrranHaasiia
Агенти на изобретението често са въвеждани като фармацевтични препарати, съдържащи активен терапевтичен агент и различни други фармацевтично приемливи компоненти. Виж Remington's Pharmaceutical Science (19th ed., 1995). Предпочитаната форма зависи от предвидения начин на въвеждане и терапевтичното приложение. Препаратите могат също да включват, в зависимост от желаната комбинация, фармацевтично приемливи, не-токсични носители или разредители, които са определени като вехикулуми, обикновено използувани за комбиниране на фармацевтичните препарати за въвеждане на животни или хора. Разредителят е избиран така, че да не повлиява биологичната активност на комбинацията. Примери за такива разредители са дестилирана вода, физиологичен фосфатно-буфериран разтвор, Ringer’s разтвори, декстрозен разтвор, разтвор на Hank’s. В допълнение, фармацевтичният препарат или комбинация могат да включват също други носители, адюванти или не-токсични, не-терапевтични, неимуногенни стабилизатори и подобни.
Фармацевтичните препарати могат да включват също големи, бавно метаболизируеми макромолекули като белтъци, полизахариди като хитозан, полимлечни киселини, полигликолови киселини и кополимери (като латекс функционализпрана сефароза, агароза, целулоза и подобни), полимерни аминокиселини, аминокиселинни кополимери и липидни агрегати (като маслени капки или липозоми). В допълнение тези носители могат да функционират като имуностимулиращи агенти (т.е. адюванти).
За парентерално въвеждане, агенти на изобретението могат да бъдат въвеждани като инжектируеми дозировки на разтвор или суспензия във физиологично приемлив разредител с фармацевтичен носител, който може да бъде стерилна течност като вода, масла, физиологичен разтвор, глицерол или етанол. В допълнение, спомагателни субстанции, като овлажняващи или емулгиращи агенти, повърхностно активни вещества, pH буфериращи субстанции и подобни могат да присъствуват в препаратите. Други компоненти на фармацевтичните препарати са петрол, от животински, растителен или синтетичен произход например, фъстъчено масло, соево масло и минерално масло. Общо, гликоли като пропилен гликоли и полиетилен гликол са предпочитани течни носители, по-специално за инжекгируеми разтвори. Антитела могат да бъдат въведени във формата на депо инжекции или имплант-препарат, които могат да бъдат коминирани по такъв начин, че да разрешават забавено освобождаване на активната съставка. Един примерен препарат съдържа моноклонално антитяло при 5mg/ml, комбинирано във воден буфер съдържащ 50тМ L-хистидин, 150mM NaCl, доведен до pH 6.0 със HCI.
Обикновено, препаратите са изготвени като инжекгируеми, течни разтвори или суспензии; твърди форми подходящи за разтвори във, или суспензии във, течни вехикулуми могат да бъдат изготвени преди инжектиране. Препаратът може също да бъде емулгиран или инкапсулиран в липозоми или микро частици като полилактид, полигликолид, или кополимер, за повишаване ефекта на адюванта, както е обсъдено по-горе (виж Langer, Science 249, 1527 (1990) и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Агентите на настоящето изобретение могат да бъдат въведени във форма на депо инжекция или имплант-препарат, който може да бъде комбиниран по такъв начин, че да позволява забавено или пулсово освобождаване на активната съставка.
Допълнителни комбинации подходящи за други начини на въвеждане включват орални, интраназални и белодробни комбинации, супозитории и трансдермални форми за приложение.
За супозитории, свързващите вещества и носители включват например, полиалкилен гликоли или триглицериди; такива супозитории могат да бъдат направени от смеси, съдържащи активната съставка в обсега на 0.6% до 10%, предпочитано 1-2%. Оралните комбинации включват ексципиенти, като фармацевтична степен на чистота манитол, лактоза, нишесте, магнезиен стеарат, натриев захарин, целулоза и магнезиев карбонат. Тези препарати са във формата на разтвори, суспензии, таблетки, пилюли, капсули, комбинации със забавено освобождаване или прахове и съдържат 1095% активна съставка, предпочитано 25-75%.
Топичното приложение може да се осъществява чрез трансдермално или инградермално въвеждане. Топичното приложение може да бъде улеснено чрез едновременно въвеждане на агента с холера токсин или детоксикирани деривати, или техни субединици, или други подобни бактериални токсини (виж Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Едновременно въвеждане може да бъде постигнато като се използуват компонентите във вид на смес или като свързани молекули, получени чрез химично кръстосано свързване, или експресия като слет белтък.
Алтернативно, трансдермално въвеждане може да бъде постигнато като се използува кожен пластир или като се използуват трансферозоми (Paul et al., Eur.JJmmunol. 25, 3521-24 (1995; Cevc et al., Biochim.Biophys.Acta 1368,201-15 (1998)).
F. Методи за диагноза
Изобретението предоставя методи за откриване на имунен отговор срещу Αβ пептид у пациент, страдащ от болест на Alzheimer. Методите са особено полезни за мониториране курса на лечение, приложен на пациент. Методите могат да бъдат използувани за контрол на терапевтичното третиране на пациенти със симптоми и за профилактично третиране на безсимптомни пациенти. Методите са полезни за контрол на активна имунизация (например, антитяло получено в отговор на въвеждане на имуноген) и пасивна имунизация (например, измерване ниво на въведено антитяло).
1. Активна имунизация
Някои методи предвиждат определяне изходната стойност на имунен отговор у пациент, преди въвеждане на една дозировка от агент и сравняване на тази стойност със стойност на имунния отговор след третиране. Значително повишение (т.е. по-голямо от обикновената граница на експерименталната грешка при повторни измервания на същата проба, изразено като стандартно отклонение от средната на такива измервания) стойността на имунния отговор, сигнализира за положителен резултат от третирането (т.е. въвеждането на агента е постигнало или повишило имунен отговор). Ако стойността на имунния отговор не се променя значимо, или намалява, това показва отрицателен резултат от третирането. Общо, пациенти подложени на начален курс на третиране с имуногенен агент, се очаква да покажат повишение на имунния отговор с последващи дозировки, който евентуално достига плато. Въвеждането на агент обикновено продължава докато имунният отговор нараства. Достигането на плато е индикатор, че прилагането на третиране може да бъде прекъснато или дозировката или честотата да бъдат намалени.
При други методи, се определя контролна стойност (т.е. средна стойност и стандартно отклонение) на имунния отговор за контролна популация. Обикновено индивидите в контролната популация не са получавали предварително третиране. Измерените стойности за имунен отговор у пациент след въвеждане на терапевтичен агент, са сравнявани с контролната стойност.
Значително повишение в сравнение с контролната стойност (например, по-голямо в сравнение с едно стандартно отклонение на средната стойност) сигнализира за положителен резултат от третирането. Липсата на значимо нарастване или понижение, показват отрицателен резултат от третирането. Въвеждане на агент общо продължава докато нараства имунния отговор в сравнение с контролната стойност. Както преди, достигането на плато в сравнение с контролните стойности е показател, че прилагането на третиране може да бъде прекъснато или намалено по отношение на дозировка и честота.
При други методи, контролна стойност за имунен отговор (например, средна стойност и стандартно отклонение) е определяна за контролна популация от индивиди, които са имали третиране с терапевтичен агент и чийто имунни отговори са достигнали плато в отговор на третиране. Измерените стойности на имунния отговор у пациента, са сравнени с контролната стойност. Ако измереното ниво у пациента на е значимо различно (например, повече от едно стандартно отклонение) от контролната стойност, третирането може да бъде прекъснато. Ако нивото у пациента е значително под контролната стойност, основателно е да се продължи въвеждането на агента. Ако нивото у пациента продължава да бъде под контролната стойност, тогава е индицирана промяна на схемата на третиране, например използуване на друг адювант.
При други методи, пациент, който не получава третиране в момента, но е получил предишен курс на третиране, е контролиран за имунен отговор, за определяне дали е наложително възобновяване на третирането. Измерената стойност за имунния отговор у пациента, може да бъде сравнена със стойност за имунен отговор, достигнат преди от пациента, след предишен курс на третиране. Значително намаление в сравнение с предишно измерване (т.е. по-голямо в сравнение с обикновена граница на грешката при повторни измервания на същата проба), е показател, че третирането може да бъде възобновено. Алтернативно, измерената стойност у пациента, може да бъде сравнена с контролна стойност на популация от профилактично третирани пациенти, които остават безсимптомни от заболяване, или популация от терапевтично третирани пациенти, които показват подобрение на характеристиките на заболяването. Във всички тези случаи, значително намаление по отношение но контролното ниво (т.е. повече от едно стандартно отклонение) е показател, че третирането на пациента трябва да бъде възобновено.
Тъканната проба за анализ обикновено е кръв, плазма, серум, слуз или гръбначно-мозъчна течност от пациента. Пробата е анализирана за индикация за имунен отговор срещу амилоиден компонент, който представлява интерес, като която и да е форма на Αβ пептид. Имунният отговор може да бъде определен по наличието, например, на антитела или Т-клетки, които специфично се свързват с компонента, който е от интерес, като Αβ пептид. ELISA методи за откриване на антитела, специфични срещу Αβ са описани в раздела Примери и могат да бъдат приложени за други пептидни антигени. Методи за откриване на реактивни Т-клетки са известни в тази област.
2. Пасивна имунизация
Общо, процедурите за контролиране на пасивна имунизация са сходни с тези за контрол на активна имунизация, описани по-горе. Обаче, антитяло профилът след пасивна имунизация, обикновено показва един непосредствен пик на антитяло концентрацията, последван от експоненциален спад. Без последваща дозировка, спадът приближава нивата преди третиране за един период от дни до месеци, в зависимост от полу-живота на въведеното антитяло.
Например, полу-животът на някои човешки антитела е от порядъка на 20 дни.
При някои методи, изходното измерване на антитяло срещу Αβ у пациент, е правено преди въвеждане, второ измерване е правено наскоро след това, за определяне максимума на нивото на антитялото и едно или повече следващи измервания са правени на интервали за контрол спада на антитяло нивата. Когато нивото на антитялото е спаднало до изходната стойност или до предварително определен процент от пика под изходната стойност (например, 50%, 25% или 10%), прилагана е следваща дозировка от антитяло. При някои методи, максимум или последващи измерени нива по-малки от изходните, са сравнени с референтни нива, определени предварително, за съставяне на схема за полезно профилактично или терапевтично третиране при други пациенти. Ако измереното антитяло ниво е значително по-ниско от референтното ниво (например, помалко от средната стойност минус едно стандартно отклонение на референгната стойност у популация от пациенти, с подобрение от третиране), индицирано е въвеждане на допълнителна дозировка от антитялото.
3. Диагностични китове
По-нататък изобретението предоставя диагностични китове за изпълнение на диагностични методи, описани по-горе. Обикновено, такива китове съдържат агент, който специфично се свързва с антитела срещу компонент на амилоидна плака, като Αβ , или реагира с Т-клетки, специфични за компонента. Китът може също да съдържа и белег. За откриване на антитела срещу Αβ, белегът обикновено е във формата на белязани анти-идиотипни антитела. За откриване на антитела, агентът може да бъде доставен предварително свързан с твърда фаза, като с ямките на микротитрационна платка. За откриване
НИЩИМ на реактивни Т-клетки, белегът може да бъде доставен като 3Нтимидин, за измерване на пролиферативния отговор. Китовете обикновено съдържат маркировка, предоставяща указания за използуване на кита. Маркировката може също да включва схема или друг съответен режим, свързващ нивата на измерения белег с нивата на антитела срещу Αβ или Т-клетки реактивни с Αβ. Терминът маркировка се отнася до всякакъв писмен или регистриран материал, който е приложен към, или по друг начин придружава кита по всяко време на неговото производство, транспорт, продажба или употреба. Например, терминът маркировка обхваща рекламни листовки и брошури, опаковачен материали, инструкции, аудио или видео касети, компютерни дискове, както и надписи отпечатани директно върху китовете.
ПРИМЕРИ
1. ПРОФИЛАКТИЧНА ЕФИКАСНОСТ НА Αβ СРЕЩУ БОЛЕСТ НА AZHEIMER (AD)
Тези примери описват приложение на Αβ42 на трансгенни мишки, свръхекспресиращи АРР, с една мутация в позиция 717 (APP7i7->f), което ги предразполага към развитие на Alzheimer-подобна © невропатология. Създаването и характеристиката на тези мишки (PDAPP мишки) са описани в Games et al., Nature, по-горе. Тези животни, в тяхната хетерозиготна форма, започват да отлагат Αβ от 6месечна възраст нататък. На 15-месечна възраст, те имат нива на Αβ отлагане, еквивалентни на тези наблюдавани при болест на Alzheimer. PDAPP мишки са инжектирани с агрегиран Αβ42 (агрегиран Αβ42) или фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Агрегиран Αβ42 е подбран поради неговата способност да индуцира антитела срещу множествени епитопи на Αβ.
А. МЕТОДИ
1. Източник на мишки
Тридесет PDAPP хетерогенни женски мишки са разпределени в следните групи: 10 мишки за ижектиране с агрегиран Αβ42 (една междувременно е починала), 5 мишки за инжектиране с PBS/адювант или PBS и 10 неинжектирани контроли. Пет мишки са инжектирани с пептиди, произхождащи от последователността на серумен амилоиден протеин (SAP).
2. Получаване на имуногени
Получаване на агрегиран Αβ42: два милиграма Αβ42 (US Peptides Inc, lot K-42-12) са разтворени в 0.9 ml вода и са доведени до 1 ml чрез добавка на 0.1 ml 10х PBS. Разтворът е разбъркван на вортекс и е инкубиран за една нощ на 37°С, при които условия пептидът агрегира. Неизползуваният Αβ е съхраняван като сух лиофилизиран прах на -20°С до следващата инжекция.
Трябва да се отбележи, че когато са използувани търговски достъпни пептиди, сухите тегла могат да включват соли към теглата; теглата съобщени във всички Примери тук, ако друго не е указано, включват соли към теглата. Точните маси на пептидите могат да © бъдат определени, като се използуват стандартни тестове на препарата, като определяне на азот, във връзка с известния препарат.
3. Изготвяне на инжекции
За всяка инжекция, ЮОцд агрегиран Αβ42 н PBS за мишка, са емулгирани 1:1 с Пълен адювант на Freund (CFA) до краен обем 400μΙ емулсия за първата инжекция, последвана от бустер със същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) на 2 седмици. Две допълнителни дози в IFA са давани на месечни интервали.
Последващите имунизации са правени на месечни интервали в 500μΙ PBS. Инжекциите са правени интраперитонеално (i.p.).
PBS инжекциите следват същата схема и мишките са инжектирани с 1:1 смес от PBS/адювант по 400μ1 на мишка, или 500μΙ PBS на мишка. SAP инжекции следват по подобен начин същата схема, като е използувана дозировка от 100цд за инжекция.
4. Титриране кръвопусканията от мишки, тъканен препарат и имунохистохимия
Горните методи са описани по-долу в Общи материали и методи.
В. РЕЗУЛТАТИ
PDAPP мишки са инжектирани с агрегиран Αβ42 (агрегиран Αβ42), SAP пептиди или фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Една група от PDAPP мишки е оставена като неинжекгирани, положителни контроли. Титрите на мишките срещу агрегиран Αβ42, са контролирани всеки втори месец от четвъртата бустерна имунизация, докато мишките станат на възраст една година. Мишките са убивани на 13 месечна възраст. На всички изследвани периоди от време, осем от деветте с агрегиран Αβ42 мишки, развиват висок антитяло титър, който се запазва висок през целите серии от инжектирания (титри повисоки от 1/10000). Деветата мишка имаше нисък, но измерим титър от около 1/1000 (Фиг.1, Таблица 3). SAP-инжектираните мишки имаха титри от 1:1000 до 1:30,000 за този имуноген , със само една мишка превишаваща 1:100,000.
ТАБЛИЦАЗА
Титри при 50% от максималната O.D. Мишки инжектирани с агрегиран Αβ
Въу / PDAPP (месеци) | #100 | #101 | #102 | #103 | #104 | #105 | #106 | #107 | #108 |
4 | 70000 | 150000 | 15000 | 120000 | 1000 | 15000 | 50000 | 60000 | 100000 |
6 | 15000 | 65000 | 30000 | 55000 | 300 | 15000 | 15000 | 50000 | 60000 |
8 | 20000 | 55000 | 50000 | 50000 | 400 | 15000 | 18000 | 50000 | 60000 |
10 | 40000 | 20000 | 60000 | 50000 | 900 | 15000 | 50000 | 20000 | 40000 |
12 | 25000 | 30000 | 60000 | 40000 | 2700 | 20000 | 70000 | 25000 | 20000 |
ТАБЛИЦА ЗВ Титри при 50% от максималната O.D. PBS инжектирани мишки върху двата имуногена при 1/00
Възраст на PDAPP (месеци) | #113 | #114 | #115 | #116 | #117 |
6 | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg |
10 | 5xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg |
12 | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg | <4xbkg |
Серуми от PBS-третирани мишки са титрирани срещу агрегиран Αβ42 на шест, десет и дванадесет месеца. При 1/100 разреждане, PBS мишките, когато са титрирани срещу агрегиран Αβ42, са малко повече от 4 пъти по-ниски от изходната стойност на определен срок от изследването, или с други думи, те са по-малко от 4 пъти изходната стойност на всички интервали от време (Таблица 3). SAP-специфичният отговор е незначителен на всички тези интервали от време, като всички титри са по-малки от 300.
Седем от деветте мишки в третираната с агрегиран Αβ42 група, нямат откриваем амилоид в техните мозъци. За разлика от тях, мозъчна тъкан от мишки в SAP и PBS групите съдържат многобройни амилоидни отлагания в хипокампа, както и във фронталната кора и в cortex cinguli. Видът на отлагането е сходен с този на нетретираните контроли, с характерно ангажиране на раними субобласти, като външния молекуларен слой и хипокампалния gyrus dentatus. Една мишка от Αβ1-42 инжектираната група има силно намалено амилоидно натрупване, ограничено в хипокампа. Една изолирана плака е идентифицирана в друга ΑβΙ-42-третирана мишка.
Количествен анализ на образи на амилоидното натрупване в хипокампа, потвърждава драматично намаление достигнато в Αβ1-42 (АМ792)-третирани животни (Фиг.2). Медиалните стойности за амилоидното натрупване в PBS групата (2.22%) и за нетретираната контролна група (2.65%), са значително по-високи от тези за имунизирани с AN 1792 (0.00%, р=0.0005). За разлика от това, медианната стойност за групата имунизирана със SAP пептиди (SAPP) е 5.74%. Мозъчна тъкан от нетретирани, контролни мишки, съдържат многобройни Αβ амилоидни отлагания, визуализирани с Αβспецифичното моноклонално антитяло (mAb) 3D6 в хипокампа, както и в cortex retrosplenialis. Сходна картина на амилоидно отлагане е наблюдавана също у имунизирани със SAPP или PBS мишки (Фиг.2). В допълнение, при тези последни три групи има характерно ангажиране на раними субобласти на мозъка, класически наблюдавани при AD, такива като външният молекуларен слой на хипокампалния gyrus dentatus във всичките три групи.
Мозъците, които не съдържат Αβ отлагания, също са свободни от невритни плаки, които обикновено се визуализират у PDAPP мишки с човешкото АРР антитяло 8Е5. Всички мозъци от останалите групи (SAP-инжектирани, PBS и неинжектирани мишки) имат многобройни невритни плаки, типични за нетретирани PDAPP мишки. Малък брой невритни плаки бяха налице в една мишка третирана с AN1792, и единично струпване на дистрофични неврити е открито във втора мишка третирана с AN1792. Анализи на образи в хипокампа и показани във Фиг.З, демонстрират действително елиминиране на дистрофични неврити у А№792-третирани мишки (медиана 0.00%), сравнени с PBS реципиентите (медиана 0.28%, р= 0.0005).
Астроцитозна характеристика на свързано с плаки възпаление, отсъствува също в мозъците на ΑβΙ-42-инжектираната група. Мозъците от мишки в другите групи съдържат обилни и струпани GFAP-положителни астроцити, типични за Αβ свързана с плака глиоза. Една подгрупа от GFAP-реагирали стъкла са контрастно ** оцветени с Thioflavin S за локализиране на Αβ отлагания. GFAPположителните астроцити са свързани с Αβ плаки в SAP, PBS и нетретираните контроли. Липса на такова свързване е намерено в плака-негативните Αβ1-42 третирани мишки, докато минимална свързана с плака глиоза е идентифицирана у една мишка, третирана с ΑΝ1792.
Анализи на образи, представени на Фиг.4 за cortex retrosplenialis, потвърждават че намалението на астроцитозата е значимо с медианна стойност от 1.56% за тези третирани с AN1792, спрямо медианни стойности по-големи от 6% за групи, имунизирани © със SAP пептиди, PBS или нетретирани (р=0.0017).
Данни от една подгрупа от Αβ1-42 и PBS-инжектирани мишки, показва че свързана с плака МНС II имунореактивност отсъства у Αβ1-42 инжектирани мишки, в съответствие с липсата на Αβ-свързан възпалителен отговор.
Срези от мозъци на мишки също са реагирали със специфично mAb, с едно моноклонално антитяло, специфично за МАС-1, белтък на клетъчната повърхност. МАС-1 (CD11b) е член на интегрин семейство и съществува като хетеродимер с CD18. CD11b/CD18 комплексът присъствува по моноцити, макрофаги, неугрофили и естествени клетки убийци (Mak and Simard). Присъщият на мозъка МАС-1-реактивен клетъчен тип изглежда, че е микроглия, въз основа на сходна фенотипна морфология в МАС-1 имунореагирали срези. Свързаното с МАС-1 белязане е по-малко в мозъците на мишки третирани с AN1792, в сравнение с PBS контролната група, едно откритие, което е в съответствие с липсата на Αβ-индуциран възпалителен отговор.
С. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Липсата на Αβ плаки и реактивни невронални и глиялни промени в мозъците на ΑβΙ-42-инжектираните мишки показва, че няма или че изключително малко амилоид е отложен в техните мозъци и отсъстват патологични последствия, като глиоза и невритна патология. PDAPP мишки третирани с Αβ1-42 проявяват по същество същата липса на патология както контролните нетрансгенни мишки. Следователно, Αβ1-42 инжекциите са високо ефективни за предотвратяване отлагането или за очистване на човешки Αβ от мозъчна тъкан, и елиминиране на последващи невронални и възпалителни дегенеративни промени. Така, въвеждането на Αβ пептид може да има профилактичен и терапевтичен благоприятен ефект при профилактиката на AD.
II. ПРОУЧВАНЕ НА ДОЗА ОТГОВОР
Групи от женски Swiss Webster пет седмични мишки (N=6 в група), са имунизирани с 300,100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4 или 0.13 ug Αβ, комбиниран в CFA/IFA, въведен интраперитонеално. Три дози са прилагани на двуседмични интервали, последвани от четвърта доза след един месец. Първата доза е емулгирана с CFA и останалите дози са емулгирани с IFA. За измерване на антитяло титрите е правено кръвопускане на животните 4-7 дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. На животни в една подгрупа от трите групи, тези имунизирани с 11, 33 или 300 pg антиген, е правено допълнително кръвопускане на приблизително месечни интервали, в продължение на четири месеца след четвъртата имунизация, за контрол на намалението на антитяло отговора в рамките на един обхват от дози на имуногенни комбинации. Тези животни получават една последна пета имунизация седем месеца след началото на проучването. Те са убивани една седмица по-късно, за измерване антитяло отговорите срещу AN1792 и за провеждане на А токсикологични анализи.
Наблюдаван е намаляващ доза отговор от 300 до 3.7 pg и отсъствие на отговор при двете най-ниски дози. Средните антитяло титри са около 1:1000 след 3 дози и около 1:10,000 след 4 дози от 11300 pg антиген (виж Фиг.5).
Антитяло титрите нарастват драматично за всички, освен групата с най-ниска доза, след третата имунизация, с нарастване на GMTs от 5 до 25-кратно. Ниски антитяло отговори след това са откриваеми дори у 0.4 pg реципиентите. Групите с 1.2 pg и 3.2 pg имат сравними титри, с GMTs от около 1000 и четирите най-високи дози дават струпвания с GMTs от около 25,000, с изключение на ЗЗрд © групата, с по-нисък GMT от 3000. След четвъртата имунизация, нарастването на титъра е по-умерено за повечето групи. Има ясен доза отговор при групите с по-ниска доза антиген от 0.14 pg до 11 pg, бидейки в границите от неоткриваемо антитяло за реципиенти с 0.14 I pg до GMT от 36,000 за реципиенти с 11 pg. Отново, титри за четирите групи с най-висока доза от 11 до 300 pg образуват струпвания. Така след две имунизации, антитяло тигърът е зависим от дозата на антигена за широкия обхват от 0.4 до 300 pg. При третата имунизация, титрите на четирите най-високи дози са сравними и те остават в плато след допълнителна имунизация.
Един месец след четвъртата имунизация, титрите бяха 2- до
З-пъти по-високи при ЗООрд групата, в сравнение с тези измерени в кръв взета пет дни след имунизация (Фиг.6). Това наблюдение насочва, че максимумът на антитяло отговора се появява след повече от 5 дни след имунизация. Едно по-умерено (50%) нарастване е наблюдаване по това време у ЗЗцд групата. При 300 цд групата, два месеца след последната доза, GMTs стръмно намаляват до около 70%. След още един месец, намалението е по-малко стръмно при 45% (100цд) и около 14% за 33 и 11 pg дозите. Така, степента на намаление на титрите от циркулиращи антитела, след прекъсване на © имунизацията, изглежда че са двуфазни, със стръмно намаление през първия месец след максималния отговор, последвано от по-умерена степен на намаление след това.
Антитяло титрите и кинетиките на отговора на тези Swiss Webster мишки, са сходни с тези на млади хетерозиготни PDAPP I трансгенни мишки, имунизирани по паралелен начин. Дозировки j ефективни да индуцират имунен отговор у хора, обикновено са сходни ’ с дозировките, които са ефективни при мишки.
i III. ПОДБОР ЗА ТЕРАПЕВТИЧНА ЕФИКАСНОСТ СРЕЩУ : Q УСТАНОВЕНА AD
Тази проба е планирана да тестира имуногенни агенти за ! активност при задържане или отменяне невропатологични
J характеристики на AD у възрастни животни. Имунизации с дълъг 42 | аминокиселини Αβ (ΑΝ1792) са започнати в такъв период от време, » когато амилоидни плаки са вече налице в мозъците на PDAPP мишки.
I
През периода от време използуван в това проучване, . нетретирани PDAPP мишки развиват известен брой невродегенеративни промени, които наподобяват тези открити при AD (Games et al., по-горе и Johnson-Wood et al., Proc.NatLAcad.Sci.USA 94, 1550-1555 (1997)). Отлагането на Αβ в амилоидни плаки е свързано с дегенеративен невронален отговор, състоящ се от абнормни аксонални и дендритни елементи, наречени дистрофични неврити. Амилоидни отлагания, които са заобиколени от и съдържат дистрофични неврити, са наречени невритни плаки. При AD и при PDAPP мишката, дистрофичните неврити имат отчетливо глобуларна структура, те са имунореактивни с един блок от антитела, които разпознават АРР и цитоскелетни компоненти, и проявяват комплекс от субклетъчни дегенеративни промени на ултраструктурно ниво. Тези характеристики позволяват съответни на заболяването, селективни и репродуцируеми измервания на образуването на невритна плака у PDAPP мозъци. Дистрофичният невронален компонент на PDAPP невритните плаки лесно се визуализира с антитяло, специфично за човешки АРР (моноклонално антитяло 8Е5) и може директно да бъде измерван с компютерен анализ на образи. Следователно, в допълнение на измерването, ефектите на AN 1792 върху образуването на амилоидна плака, контролирани са ефектите от това третиране върху развитието на невритна дистрофия.
Астроцитите и микроглията са не-невронални клетки, които отговарят и отразяват степента на невронално увреждане. GFAPположителни астроцити и MHC-ll-положителна микроглия обикновено се наблюдават при AD и тяхното активиране нараства с тежестта на заболяването. Следователно, контролирано е също развитието на реактивна астроцитоза и миклоглиоза у AN1792-третирани мишки.
А. Материали и методи
Четиридесет и осем, хетерозиготни женски PDAPP мишки, на възраст 11 до 11-5 месеца, получени от Charles River са произволно разделени на две групи: 24 мишки, които да бъдат имунизирани със 100gg AN1792 и 24 мишки, които да бъдат имунизирани с PBS, всеки
комбиниран с адювант на Freund. AN1792 и PBS групите са разделени отново когато достигнат -15 месечна възраст. На 15-месечна възраст, приблизително половината от всяка група на AN1792-третираните и PBS-третираните животни са евтанизирани (п=10 и 9, съответно), останалите продължават да получават имунизации до приключване на -18-месечна възраст (п=9 и 12, съответно). Общо 8 животни (5 AN 1792, 3 PBS) са умрели по време на проучването. В допълнение към имунизираните животни, са включени едногодишни (п=10), 15месечни (п=10) и 18-месечни (п=10) нетретирани PDAPP мишки, за сравнение на ELISAs за измерване нивата на Αβ и АРР нивата в мозъка; животните на възраст една година също са включени в имунохистохимичните анализи.
Методологията беше както в Пример I, ако друго не е указано. US Peptides lot 12 и California Peptides lot ME0339 на AN1792 са използувани за получаване на антигена за шест имунизации, въведени преди 15-месечния срок. California Peptides lots МЕ0339 и МЕ0439 са използувани за получаване на антиген за шестте имунизации, приложени преди 15-месечния срок. California МЕ0339 и МЕ0439 са използувани за трите допълнителни имунизации, приложени между 15 и 18 месеца.
За имунизации, 100gg AN1792 в 200μΙ PBS или само PBS са емулгирани 1:1 (обем:обем) в Пълен адювант на Freund (CFA) или Непълен адювант на Freund (IFA), или PBS в краен обем 400μΙ. Първата имунизация е предоставена с CFA като адювант, следващите четири дози са приложени с IFA и последните четири дози с PBS, без добавен адютант. Правени са общо девет имунизации за един период от седем месеца, по двуседмична схема за първите три дози, последвана от четири-седмичен интервал за останалите инжекции. Третираната четири месеца група, евтаназирана на 15-месечна възраст, е получила първите 6 имунизации.
В. Резултати
1. Ефекти на Αβ42 (ΑΝ1792) третиране върху амиилоидно натрупване
Резултатите от AN1792 третиране върху коровото амилоидно натрупване, определени с количествен анализ на образи, са представени във Фиг.7. Медианната стойност на коровото амилоидно натрупване е 0.28% в група от нетретирани 12-месечни PDAPP мишки, една стойност, която е представителна за натрупване на плаки у мишки в началото на проучването. На 18 месеца, амилоидното натрупване нараства над 17-кратно до 4.8% у PBS-третираните мишки, докато АИ1792-третираните мишки имат силно намалено амилоидно натрупване от само 0.01% , особено по-малко в сравнение с 12-месечните нетретирани и 15-месечните и 18-месечните PBSтретирани групи. Амилоидното натрупване е значително редуцирано у AN 1792 реципиентите, на 15 (96% намаление; р=0.003) и 18(>99% намаление; р=0.0002) месеца.
Обикновено, коровото амилоидно отлагане у PDAPP мишки започва във фронталната и ретросплениалната кора (RSC) и напредва във вентро-латерално направление, за включване на темпоралната и енториналната кора (ЕС). Малко или никакъв амилоид е намерен в ЕС на 12-месечни мишки, приблизителната възраст, на която AN 1792 е въведен за пръв път. След 4 месеца третиране с AN1792, амилоидното отлагане е силно намалено в RSC и прогресивното ангажиране на ЕС е изцяло елиминирано с AN 1792 третирането. Последното наблюдение показва, че AN1792 напълно спира прогресирането на амилоид, който нормално би навлизал в темпоралната и вентралната кора, както и спира или възможно отменя отлагането в RSC.
Дълбоките ефекти от третирането с AN 1792 върху развитието на корови амилоидни натрупвания у PDAPP мишки, по-нататък са демонстрирани при 18-месечната група, която е третирана в продължение на седем месеца. Почти пълно отсъствие на коров амилоид е намерено у АМ1792-третирана мишка, с тотална липса на дифузни плаки, както и с намаление на компактните отлагания.
2. Клетъчни и морфологични промени свързани с Αβ42 (AN1792) третиране
Намерена е една популация от Αβ-положителни клетки в мозъчни области, които обикновено съдържат амилоидни отлагания. Забележително е, че в някои мозъци от AN 1792 реципиенти, са намерени много малко или никакви екстрацелуларни корови амилоидни плаки. По-голямата част от Αβ имунореактивостта, изглежда че се съдържа в клетките с голяма или със струпвания сома. Фенотипно, тези клетки наподобяват активирана микроглия или моноцити. Те са имунореактивни с антитела, разпознаващи лиганди, експресирани от активирани моноцити и микроглия (МНС II и CD11b) и понякога са свързани със стената или лумена на кръвоносни съдове. Сравнение на съседни срези, белязани с Αβ и МНС П-специфични антитела, разкрива че сходни характеристики на тези клетки се разпознават от двата класа антитела. Детайлно изследване на АИ1792-третирани мозъци разкрива, че МНС ll-положителните клетки са ограничени в съседство на ограничения амилоид, който остава у тези животни. При използуваните условия на фиксация, клетките не са имунореактивни с антитела, които разпознават Т клетъчни (CD3, CD3e) или В клетъчни (CD45RA, CD45RB) лиганди или левкоцитен общ антиген (CD45), но са реактивни с едно антитяло разпознаващо левкосиалин (CD43), който реагира кръстосано с моноцити. Не са намерени такива клетки в никоя от PBS-третираните мишки.
PDAPP мишките неизменно развиват тежко амилоидно отлагане във външния молекуларен слой на хипокампалния gyrus dentatus. Отлагането образува отчетлива ивица в perforant пътя, една област, която класически съдържа амилоидни плаки при AD. Характерният изглед на тези отлагания у PBS-третирани мишки, наподобява този, характеризиран преди у нетретирани PDAPP мишки. Амилоидното отлагане се състои от дифузни и компактни плаки в непрекъсната ивица. За разлика от това, в известен брой мозъци на АИ1792-третирани мишки, тази характеристика е драстично променена. Хипокампалното амилоидно отлагане не съдържа повече дифузен амилоид, характерът на ивици е напълно разкъсан. Вместо това, присъствуват известен брой необичайни точковидни структури, които са реактивни с анти-Αβ антитела, някои от които изглежда, че са амилоид-съдържащи клетки.
МНС ll-положителни клетки често са наблюдавани в съседство с екстрацелуларен амилоид у АИ1792-третирани животни. Картината на свързване на Αβ-положителните клетки с амилоид, е много сходна у няколко мозъци от АМ1792-третирани мишки. Разпространението на тези моноцитни клетки е ограничено в съседство с отложения амилоид и изцяло отсъствува в други мозъчни области, лишени от Αβ плаки.
Количествен анализ на образи на МНС II и МАС 1-белязани срези, разкрива тенденция към повишена имунореактивност в RSC и хипокампа на АИ1792-третирани мишки, сравнена с PBS групата, която достига значимост с измерване на MAC I реактивност в хипокампа.
Тези резултати са показателни за активно, клетъчно-медиирано отстраняване на амилоид в мозъчни области носещи плаки.
100
3. AN1792 ефекти върху Αβ нивата: ELISA определения (а) Корови нива
У нетретирани PDAPP мишки, медианното ниво на тотален Αβ в мозъчната кора на 12 месеца е 1,600ng/g, което нараства до 8,700 ng/g на 15 месеца (Таблица 4). На 18 месеца стойността е 22,000 ng/g, едно нарастване от над 10 пъти по време на експеримента. PBSтретирани животни имат 8,000ng/g тотален Αβ на 15 месеца, който нарастват до 19,000 ng/g на 18 месеца. За разлика от това, AN1792третирани животни имат 81% по-малко тотален Αβ на 15 месеца (1,600 ng/g) в сравнение с PBS-имунизираната група. Значително помалко (р=0.0001) тотален Αβ (5,200 ng/g) е намерен на 18 месеца, когато са сравнени AN1792 и PBS групите (Таблица 4), което представлява 72% намаление на Αβ, който при други условия е налице. Сходни резултати са получени когато са сравнени корови нива на Αβ42, по-точно АМ792-третираната група съдържа по-малко Αβ42, но в този случай разликите между ΑΝ1792 и PBS групите са значителни на 15 месеца (р=0.04) и 18 месеца (р=0.0001, Таблица 4).
Таблица 4: Медианни Αβ нива (ng/g) в мозъчната кора
Нетретирани PBS AN1792
Възраст | Общо | Αβ42 | (η) | Общо | Αβ42 | (η) Общо | Αβ42 | (η) |
12 | 1,600 | 1,300 | (10) | |||||
15 | 8,700 | 8,300 | (10) | 8,600 | 7,200 | (9) 1,600 | 1,300* | (10) |
18 | 22,200 | 18,500 (10) | 19,000 | 15,900 | (12) 5,200** | 4,000** | (9) |
*р = 0.0412 **р= 0.0001 (Ь) Хипокампални нива
При нетретирани PDAPP мишки, медианните хипокампални ниви за тоталния Αβ на 12-месечна възраст са 15,000ng/g, които нарастват до 51,000 ng/g на 15 месеца и по-нататък до 81,000ng/g на 18 месеца (Таблица 5). Подобно, PBS имунизирани мишки показват
101 стойности 40,000 ng/g и 65,000 ng/g на 15 месеца и на 18 месеца, съответно. AN1792 имунизирани животни показват по-малко тотален Αβ, съответно 25,000 ng/g и 51,000 ng/g на съответния 15-месечен и 18-месечен срок. Стойността за 18-месечната АМ1792-третирана група е значително по-ниска от тази на PBS третираната група (р=0.0105; Таблица 5). Измерване на Αβ42 представя същия характер на резултатите, по-точно нивата в АМ1792-третираната група са значително по-ниски от тези в PBS групата (39,000 ng/g спрямо 57,000 ng/g, съответно; р=0.002) на 18-месечното отчитане (Таблица 3).
Таблица 5: Медианни Αβ нива (ng/g) в хипокампа
Нетретирани PBS AN1792
Възраст Общо | Αβ42 (η) Общо Αβ42 (η) Общо | Αβ42 | (Π) | ||||
12 | 15,500 | 11,100 (10) | |||||
15 | 51,500 | 44,400 (10) 40,100 | 35,70 | (9) | 24,50 | 22,100 | (10) |
18 | 80,800 | 64,200 (10) 65,400 | 57,10 (12) 50,90 | 38,900** | (9) |
* р= 0.0105 ** р = 0.0022 (с) Малкомозъчни нива
При 12-месечни нетретирани PDAPP мишки, медианното малкомозъчно ниво на тотален Αβ е 15ng/g (Таблица 6). На 15 месеца, тази медиана нараства до 28 ng/g и на 18 месеца е нараснала до 35 ng/g. PBS-третирани животни представят медианни тотални Αβ стойности от 21 ng/g на 15 месеца и 43 ng/g на 18 месеца. АМ1792-третирани животни е установено, че имат 22ng/g тотален Αβ на 15 месеца и значително по-малко (р=0.002) тотален Αβ на 18 месеца (25 ng/g), в сравнение със съответната PBS група (Таблица 6).
102
Таблица 6: Медианни Αβ нива (ng/g) в малък мозък
Нетретирани | PBS | AN1792 | |||
Възраст | тотален АЬ (п) | тотален АЬ | (П) | тотален АЬ | (П) |
12 | 15.6 (10) | ||||
15 | 27.7 (10) | 20.8 | (9) | 21.7 | (10) |
18 | 35.0 (10) | 43.1 | (12) | 24.8* | (9) |
* р = 0.0018
4. Ефекти от AN1792 третиране върху АРР нива
АРР-а и пълноразмерна АРР молекула съдържат цялата или част от Αβ последователността и биха могли потенциално да бъдат повлияни от генерирането на АМ1792-насочен имунен отговор. В изследвания до момента, е отбелязано леко нарастване нивата на АРР с нарастване на невропатологията у PDAPP мишка. В кората, нива на ΑΡΡ-α/FL (пълноразмерен) или АРР-a по същество не са променени от третиране, с изключение, че АРР-a е редуциран с 19% на 18-месечен срок у АМ1792-третирани, спрямо PBS-третираната група. 18-месечните АМ1792-третирани АРР стойности, не са значимо различни от стойностите за 12-месечни и 15-месечни нетретирани и 15-месечни PBS групи. Във всички случаи АРР стойностите се запазват в границите на нормалните, установени у PDAPP мишки.
5. Ефекти на AN1792 третиране върху невродегенеративната и глиозната патология
Натрупването на невритни плаки е значително редуцирано във фронталната кора на АИ1792-третирани мишки в сравнение с PBS групата на 15 (84%; р=0.03) и 18 (55%; р=0.01) месечна възраст (Фиг.8). Медианната стойност на натрупването от невритни плаки нараства от 0.32% до 0.49% в PBS групата между 15 и 18 месечна възраст. Това се различава от силно намаленото развитие на невритни плаки у AN1792 групата, с медианни стойности за
103 натрупване на невритни плаки от 0.05% и 0.22% при 15 и 18 месечните групи, съответно.
Имунизации с AN1792 изглежда, че се понасят добре и реактивната астроцитоза също значително е намалена в RSC на АМ1792-третирани мишки, в сравнение с PBS групата на 15 (56%; р=0.011) и 18 (39%; р=0.028) месечна възраст (Фиг.9). Медианни стойности на процента астроцитоза у PBS групата нарастват между 15-ия и 18-ия месец от 4.26% до 5.21%. А1М1792-третиране потиска развитието на астроцитоза на двата срока до 1.89% и 3.2%, съответно. Това насочва, че невропилът не е увреден от процеса на очистване.
6. Антитяло отговори
Както е описано по-горе, 11-месечни, хетерозиготни PDAPP мишки (N=24), са получили серия от 5 имунизации със 100цд AN1792, емулгиран с адювант на Freund и въведени интраперитонеално на 0, 2, 4, 8 и 12 седмици и една шеста имунизация само с PBS (без адювант на Freund) на 16-та седмица. Като отрицателна контрола, една паралелна група от 24 съвпадащи по възраст трансгенни мишки, са получили имунизации с PBS емулгиран със същите адюванти и приложен по същата схема. На животните е правено кръвопускане три до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. Антитяло отговори срещу AN1792 са измервани с ELISA. Геометричните средни титри (GMT) за животните, които са имунизирани с AN1792, са приблизително 1,900, 7,600 и 45,000 съответно след втората, третата и поеледната(шеста) дози. Не е измерено Αβспецифично антитяло у контролни животни, след шестата имунизация.
Приблизително половината от животните са третирани допълнително три месеца, получавайки имунизации на около 20, 24 и 27 седмици. Всяка от тези дози е предоставена само в PBS като вехикулум, без адювант на Freund. Много антитяло титри остават
1(М непроменени през този период от време. В действителност, антитяло титрите изглежда, че се запазват стабилни от четвъртото до осмото кръвопускане, съответствуващо на един период покриващ петата до деветата инжекция.
За определяне дали Αβ-специфичните антитела предиз-, виквани чрез имунизация, които се откриват в серуми на AN1792третирани мишки, също са свързани с отложен в мозъка амилоид, една подсерия от срези от AN1792- и PBS-третирани мишки е реагирала с антитяло, специфично за мишо IgG. За разлика от PBS групата, Αβ плаки в АМ792-третирани мозъци, са покривани с ендогенен IgG. Тази разлика между двете групи е наблюдавана в 15- и 18-месечните групи. Особено изненадваща е липсата на белязане в PBS групата, независимо от наличието на тежко амилоидно натрупване в тези мишки. Тези резултати показват, че имунизация със синтетичен Αβ белтък, гени ри ра антитела, които разпознават и се свързват in vivo с Αβ в амилоидни плаки.
7. Кпетъчно-медиирани имунни отговори
Отделяни са слезките от девет AN 1792-имунизирани и 12 PBS-имунизирани 18-месечни PDAPP мишки, седем дни след деветата имунизация. Изолирани са спленоцити и са култивирани за 72 часа в присъствието на Αβ40, Αβ42 или Αβ4Ο-1 (обратно подреждане на белтъка). Митогенът Con А служи като положителна контрола. Получени са оптимални отговори с >1.7μΜ белтък. Клетки от всичките девет АШ792-третирани животни пролиферират в отговор на Αβ1-4Ο или Αβ1-42 белтък, с еднакви ниво на включване за двата белтъка (Фиг. 10, Горен блок). Няма отговор срещу Αβ40-1 обратния белтък. Клетки от контролни животни не отговарят на никой от Αβ белтъците (Фиг. 10, Долен блок).
105
С. Заключение
Резултатите от това проучване показват, че AN 1792 имунизация на PDAPP мишки, притежаващи налични амилоидни отлагания, забавя и предотвратява прогресивно амилоидно отлагане и забавя последващи невропатологични промени у възрастния мозък на PDAPP мишки. Имунизации с AN1792 по същество задържат развитието на амилоид в структури, които нормално са податливи на амилоидоза. Така, въвеждането на Αβ пептид има терапевтично благоприятен ефект при лечение на AD.
® IV. ПОДБОР НА Αβ ФРАГМЕНТИ
100 PDAPP мишки на възраст 9-11 месеца, са имунизирани с 9 различни области от АРР и Αβ, за определяне кой епитоп предава ефикасния отговор. Деветте различни имуногени и една контрола са инжектирани интраперитонеално, както е описано по-горе. Имуногените включват четири човешки Αβ пептидни конюгати 1-12, 13-28, 3242,1-5, всички свързани с овче анти-мишо IgG чрез цистинова връзка; един АРР полипептид аминокиселини 592-695, агрегиран човешки Αβ1-40, агрегиран човешки Αβ 25-35 и агрегиран Αβ42 от гризач. Агрегиран Αβ42 и PBS са използуани съответно като положителна и © отрицателна контроли. Използувани са 10 мишки за третирана група. Титрите са контролирани както по-горе, и мишките са евтаназирани на края на 4 месеца от инжекциите. Хистохимично, Αβ нива и токсикологични анализи са определяни след смъртта.
А. Материали и метод
1. Получаване на имуногени
Получаване на свързани Αβ пептиди: четири човешки Αβ пептидни конюгати (аминокиселинни остатъци 1-5, 1-12,13-28 и 33-42, всеки конюгиран с овчи анти-миши IgG) са получени чрез свързване
106 посредством изкуствено добавен цистеин към Αβ пептида, като е използуван кръстосано-свързващия реагент сулфо-EMCS. Αβ пептидните деривати са синтезирани със следните крайни аминокиселинни последователности. Във всеки случай, локализацията на вмъкнатия цистеинов остатък е указана с подчертаване. Αβ13-28 пептидното производно има също два глицинови остатъка, добавени преди карбоксилния краен цистеин, както е указано.
Αβ1-12 пептид NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEQ ID NO: 30) Αβ1-5 пептид NH2-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO: 31)
Αβ33-42 пептид ИН2-С-амино-хептаноева киселина-GLMVGGWIACOOH (SEQ ID NO: 32)
Αβ13-28 пептид Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 33)
За подготовка на свързваща реакция, десет mg овчи ангимищи IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) са диализирани за една нощ срещу ЮтМ натриев борат буфер, pH 8.5. След това диализираното антитяло е концентрирано до обем от 2 ml, като е използувана Amicon Centriprep tube. Десет mg sulfo-EMCS [И(у-малеимидокупроилокси)сикцинимид] (Molecular Sciences Co.) е разтворен в 1 ml дейонизирана вода. Добавен е на капки 40-кратен моларен излишек от sulfo-EMCS с разбъркване към овчи анти-миши IgG и след това разтворът е разбъркван за още 10 минути. Активираният овчи анти-миши IgG е пречистен и обменен с буфер чрез пропускане през 10ml колона за гел филтрация (Pierce Presto Column, получена от Pierce Chemicals), балансирана с 0.1М NaPO4, 5mM EDTA, pH 6.5. Антитяло съдържащи фракции, идентифицирани по абсорбция при 280nm, са обединявани и разредени до концентрация приблизително 1mg/ml, като са използувани 1.4mg за OD като еикстинкционния
107 коефициент. 40-кратен моларен излишек от Αβ пептид е разтварян в 20 ml 10mM Na РОД, pH 8.0, с изключение на Αβ33-42 пептид, от който 10mg най-напред са разтваряни в 0.5 ml DMSO и след това са разредени до 20ml с ЮтМ NaPO4 буфер. Към всеки от пептидните разтвори са прибавени 10ml активиран овчи анти-миши IgG и са разклащани чрез завъртане на стайна температура за 4 часа. Получените конюгати са концентрирани да краен обем по-малък от 10ml като е използувана Amicon Centriprep tube и след това са диализирани срещу PBS, за буферен обмен на буфера и отстраняване на свободния пептид. Конюгатите са пропускани през филтри с големина на порите 0.22цт за стерилизация и след това са разпределени на фракции от 1 mg и съхранявани замразени на -20°С. Концентрациите на конюгатите са определяни с ВСА protein assay (Pierce Chemicals) c конски IgG за стандартна крива. Конюгирането е документирано с нарастване молекулното тегло на коюгираните пептиди, в сравнение с това на активиран овчи анти-миши IgG. Αβ1-5 овчи анти-миши конюгат е едно обединение от две конюгирания, остатъците са от единичен препарат.
2. Получаване на агрегирани Αβ пептиди
Човешки 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Lot ME0541), човешки 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lots Me0339 и ME0439), човешки 25-35 и от гризачи 1-42 (California Peptides Inc., Lot ME0218) пептиди са свежо разтворени за изготвяне на набор от' инжекции от лиофилизирани прахове, които са били съхранявани изсушени на -20°С. За тази цел, 2mg пептид са добавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс за получаване на относително еднороден разтвор или суспензия. От четирите, AN1528 е единственият пептид, който е разтворим на този етап. Порция от 100 μΙ 10Х PBS (1 X PBS: 0.15 М NaCI, 0.01 Μ натриев фосфат, pH
108
7.5) след това е добавяна на всеки етап когато AN1528 започне да преципитира. Суспензията е разбърквана на вортекс и инкубирана за една нощ на 37°С, за употреба на следващия ден.
Получаване на рВхб белтък: Експресионен плазмид, кодиращ рВхб, един слет белтък състоящ се от 100-аминокиселинна бактериофаг MS-2 полимераза N-терминална лидерна последователност, последвана от аминокиселини 592-695 на АРР (βΑΡΡ) е описан от Oltersdorf et al., J.Biol.Chem. 265, 4492-4497 (1990). Плазмидът е трансфектиран в E.coli и белтъкът е експресиран след индукция на промотора. Бактериите са лизирани в 8М урея и рВхб е w частично пречистен чрез препаративна SDS PAGE. Фракции съдържащи рВхб са идентифицирани чрез Western blot като е използувано заешко анти-рВхб поликлонално антитяло, обединявани са, концентрирани са като е използувана Amicon Centriprep tube и са диализирани срещу PBS. Чистотата на препарата, определена с Coomassie Blue оцветена SDS PAGE , е приблизително 5 до 10%.
В. Резултати и Обсъждане
1. План на изследването
Сто мъжки и женски, 9- до 11-месечни хитирозиготни PDAPP © трансгенни мишки са получени от Charles River Laboratory и Taconic Laboratory. Мишките са разпределени в 10 групи за да бъдат имунизирани с различни участъци от Αβ и АРР, комбинирани с адюванг на Freund. Животните са разпределени така, че да съвпадат по пол, възраст, произход и източник на животните в групи, колкото е възможно по-близо. Имуногените включват четири Αβ пептиди, произхождащи от човешка последователност, 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, всяка конюгирана с овчи анти-миши IgG; четири агрегирани Αβ пептиди, човешки 1-40 (ΑΝ1528), човешки 1-42 (ΑΝ1792), човешки 2535 и от гризачи 1-42; и един слет полипептид, означен като рВхб,
109 съдържащ АРР аминокиселинни остатъци 592-695. Една десета група е имунизирана с PBS, комбиниран с адювант като контролна.
За всяка имунизация, 100gg от всеки Αβ пептид в 200 μΙ PBS или 200цд от АРР производното рВхб в същия обем от PBS, или само PBS, са емулгирани 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) до краен обем 400μΙ за първата имунизация, последвана от бустер на същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) за следващите четири дози и с PBS за последната доза. Имунизациите са правени интраперитонеално по двуседмична схема за първите три дози, след това по месечна схема. За измерване на антитяло титрите, на животните е правено кръвопускане четири до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. Животните са евтанизирани приблизително една седмица след последната доза.
2. Αβ и АРР нива в мозъка
След около четири месеца от имунизацията с различни Αβ пептиди или АРР производни, мозъците са отделяни от перфузирани с физиологичен разтвор животни. Едната хемисфера е обработена за хистохимичен анализ, а втората е използувана за количествено определяне нивата на Αβ и АРР. За измерване концентрацията на различните форми бета амилоиден пептид и амилоиден прекурсорен белтък, хемисферите са сецирани и са изготвяни хомогенати от хипокампална, корова и малкомозъчни области в 5М гуанидин. Те са разредени и нивото на амилоид или АРР е определяно чрез сравнение със серии разреждания от стандарти с известна концентрация на Αβ пептид или АРР в ELISA формат.
Медианната концентрация на тотален Αβ за контролната група, имунизирана с PBS е 5.8 пъти по-висока в хипокампа отколкото в мозъчната кора (медиана 24,318ng/g хипокампална тъкан, сравнена с 4,221 ng/g за мозъчната кора). Медианното ниво в малкия мозък на
110 контролната група (23.4 ng/g тъкан) е около 1000 пъти по-ниско, в сравнение с това в хипокампа. Тези нива са сходни с тези, които сме съобщили по-рано за хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки на същата възраст (Johnson-Woods et al., 1997, по-горе).
За мозъчната кора, една подгрупа от третираните групи има медианни тотални Αβ и Αβ1-42 нива, които се различават значимо от тези на контролната група (р<0.05), тези животни са получили ΑΝ1792, от гризачи Αβ1-42 или Αβ1-5 пептидния конюгат, както е показано на Фиг.11. Медианните нива на тотален Αβ са редуцирани със 75%, 79% и 61%, съответно, сравнени с контролата за тези третирани групи. Няма забележими корелации между Αβ-специфични антитяло титри и Αβ нива в коровата област на мозъка за всяка от групите.
В хипокампа, медианното намаление на тотален Αβ, свързан с ΑΝ1792 третиране (46%, р=0.0543), не е толкова голямо, като това наблюдавано в мозъчната кора (75%, р=0.0021). Обаче, степента на намаление е далеч по-голяма в хипокампа, отколкото в мозъчната кора, чисто намаление от 11,186 ng/g тъкан в хипокампа, спрямо 3,171 ng/g тъкан в мозъчната кора. За групи от животни, които са получавали Αβ1-42 или Αβ1-5 от гризачи, медианните тотални Αβ нива, са намалени съответно с 36% и 26%. Обаче, като се има предвид малкия брой на групата и голямата вариабилност в нивата на амилоиден пептид между отделните животни в рамките на двете групи, това намаление не е значимо. Когато са измерени нивата на Αβ1-42 в хипокампа, никое от индуцираните от третиране намаления не достига значимост. Така, поради по-малкото натрупване на Αβ в мозъчната кора, промените в тази област са по-чувствителен показател за ефектите от третирането. Промените в Αβ нивата, измерени с ELISA в мозъчната кора, са сходни, но не идентични, с резултатите от имунохистохимчния анализ (виж по-долу).
Ill
Измерван е също тотален Αβ в малкия мозък, една област, която обикновено е минимално засегната от AD патология. Никоя от медианните Αβ концентрации, на която и да е от групите, имунизирани с различни Αβ пептиди или АРР производно не се различава от тази на контролната група в тази област на мозъка. Този резултат насочва, че не-патологичните нива на Αβ не са засегнати от третиране.
Определяна е също АРР концентрация с ELISA в мозъчната кора и малкия мозък на третирани и контролни мишки. Използувани са два различни АРР теста. Първият, означен ΑΡΡ-α/FL, разпознава АРРалфа (а, секретираната форма на АРР, която е разцепена в рамките на Αβ последователността), и пълноразмерни форми (FL) на АРР, докато вторият разпознава само АРР-а. За разлика от свързаното с третиране намаление на Αβ в една подгрупа на третираните групи, нивата на АРР са непроменени във всички третирани, в сравнение с контролните животни. Тези резултати показват, че имунизациите с Αβ пептиди не са изчерпващи АРР; по-точно ефектът от третирането е специфичен за Αβ.
В резюме, тоталните Αβ и Αβ1-42 нива са значително намалени в мозъчната кора при третиране с AN 1792, Αβ1-42 или Αβ1-5 конюгат от гризачи. В хипокампа, тоталният Αβ е значително намален само след третиране с AN1792. Никои други свързани с третиране промени в Αβ или АРР нивата в хипокампа, мозъчната кора или малкомозъчни области не са значими.
3. Хистохимични анализи
Мозъци от една подгрупа на шест групи, са обработени за имунохистохимичен анализ, три групи имунизирани с Αβ пептидните конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ13-28; две групи имунизирани с пълноразмерни Αβ агрегати AN1792 и AN1528 и PBS -третираната контролна група. Резултатите от анализи на образи на амилоидно
112 натрупване в мозъчни срези от тези групи са представени на Фиг. 12. Има значими намаления на амилоидното натрупване в корови области на три от третираните групи спрямо контролните животни. Найгол ямото намаление на амилоидното натрупване е наблюдавано в групата получаваща AN1792, където средната стойност е намалена с 97% (р=0.001). Значими намаления са наблюдавани също за животните третирани с AN1528 (95%, р=0.005) и Αβ1-5 пептидния конюгат (67%, р=0.02).
Резултатите получени от количествено определяне на тотален Αβ или Αβ1-42 с ELISA и амилоидно натрупване чрез анализ на образи, се различават в известна степен. Третирането с AN1528 има известно влияние върху нивото на коровото амилоидно отлагане, когато е измерено с количествен анализ на образи, но няма върху концентрацията на тотален Αβ в същата област, когато е измерено с ELISA. Разликата между тези два резултата е възможно да се дължи на спецификите на тестовете. Анализът на образи измерва всички форми на Αβ, разтворима и неразтворима, мономерна и агрегирана. Тъй като се счита, че болестната патология е свързана с неразтворимата, свързаната с плака форма на Αβ, техниката на анализ на образи може да има по-голяма чувствителност за разкриване ефектите от третирането. Обаче тъй като ELISA е по-бърз и по-лесен тест, той е много полезен за целите на скрининга. Освен това той може разкрие, че свързаното с третиране намаление на Αβ е по-голямо за свързания с плака отколкото за тоталния Αβ.
За определяне дали Αβ-специфичните антитела, предизвикани с имунизация у третираните животни, реагират с отложения мозъчен амилоид, една подгрупа срези от третирани животни и контролни мишки са реагирали с антитяло специфично за миши IgG. За разлика от PBS групата, Αβ-съдържащите плаки са покрити с ендогенен IgG за животни, имунизирани с Αβ пептидните из конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ13-28; и пълноразмерните Αβ агрегати ΑΝ1792 и ΑΝ1528. Мозъци от животни имунизирани с другите Αβ пептиди или АРР пептидът рВхб не са анализирани с този тест.
4. Измерване на антитяло титри
Правено и кръвопускане на мишките четири до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората имунизация, за общо пет кръвопускания. Антитяло титрите са измервани като Αβ1-42свързващо антитяло, като е използувана сандвич ELISA с пластмасови много-ямкови платки, покрити с Αβ1-42. Както е показано на Фиг. 13, максимални антитяло титри са предизвикани след четвъртата доза, за тези четири имунизационни комбинации, които предизвикват най-високи титри от АМ1792-специфични антитела: ΑΝ1792 (максимален GMT: 94,647), ΑΝ1528 (максимален GMT: 88,231), Αβ1-12 конюгат (максимален GMT: 47,216) и Αβ1-42 от гризачи (максимален GMT:10,766). Титрите за тези групи намаляват в известна степен след петата и шестата дози. За оставащите пет имуногена, максимални титри са достигнати след петата или шестата доза и не са с много по-ниска величина в сравнение с тези от четирите с най-високи титри групи: Αβ1-5 конюгат (максимален GMT: 2,356), рВхб (максимален GMT: 1,986), Αβ13-28 конюгат (максимален GMT: 1,183), Αβ33-42 конюгат (максимален GMT: 658), Αβ25-35 (максимален GMT: 125). Измерени са също антитяло титри срещу хомоложни пептиди, като е използуван същия сандвич ELISA формат за една подгрупа от имуногени, тези групи, които са имунизирани с Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 или Αβ1-42 от гризачи. Тези титри са приблизително същите като тези измерени срещу Αβ1-42, с изключение на Αβ1-42 имуногена от гризачи, в който случай антитяло титрите срещу хомоложния имуноген са около два пъти по-високи. Величината на АМ1792-специфичният антитяло титър на отделни
114 животни или средните стойности на третираните групи не корелират с ефикасността, измерена като намаление на Αβ в мозъчната кора.
5. Лимфопролиферативни отговори
Αβ-зависима лимфопролиферация е измерена като са използувани клетки от слезка, отделени приблизително една седмица след последната, шеста имунизация. Свежо получени клетки, 105 за ямка, са култивирани за 5 дни в присъствието на Αβ1-40 в концентрация 5μΜ за стимулация. Клетки от една подгрупа на седем от десетте групи, също са култивирани в присъствието на обратния пептид Αβ40-1. Като положителна контрола, допълнително клетки са култивирани с Т клетъчен митоген, РНА и като отрицателна контрола, клетките са култивирани без добавен пептид.
Лимфоцити от едно болшинство животни пролиферират в отговор на РНА. Няма значими отговори срещу Αβ40-1 обратен пептид. Клетки от животни имунизирани с по-големи агрегирани Αβ пептиди, ΑΝ1792, Αβ1-42 от гризачи и ΑΝ1528 силно пролиферират когато са стимулирани с Αβ1-40, с най-високи импулси на минута (срт) у реципиентите на AN 1792. Едно животно във всяка от групите имунизирани с Αβ1-12 конюгат, Αβ13-28 конюгат и Αβ25-35, пролиферира в отговор срещу Αβ1-40. Останалите групи получаващи Αβ1-5 конюгат, Αβ33-42 конюгат рВхб или PBS нямат животни с Αβстимулиран отговор. Тези резултати са обединени в Таблица 7 подолу.
115
Таблица 7
Имуноген | Конюгат | Αβ аминокиселини | Отговарящи |
Αβ1-5 | Да | 5-mer | 0/7 |
Αβ1-12 | Да | 12-mer | 1/8 |
Αβ13-28 | Да | 16-mer | 1/9 |
Αβ25-35 | 11-mer | 1/9 | |
Αβ33-42 | Да | 10-mer | 0/10 |
Αβ1-40 | 40-mer | 5/8 | |
Αβί-42 | 42-mer | 9/9 | |
τΑβΙ-42 | 42-mer | 8/8 | |
рВхб | 0/8 | ||
PBS | O-mer | 0/8 |
Тези резултати показват, че AN1792 и AN1528 стимулират силни Т клетъчни отговори, по-вероятно от CD4+ фенотип. Отсъствието на Αβ-специфичен Т клетъчен отговор у животни имунизирани с Αβ1-5 не е учудващо, тъй като пептидните епитопи разпознати от CD4+ Т клетки, обикновено са с 15 аминокиселини дължина, въпреки че покъси пептиди могат понякога да функционират с по-малко ефикасност. Така болшинството от помощните Т клетъчни епитопи за четирите конюгати пептиди е възможно да присъствуват в IgG конюгата участник, но не в Αβ областта. Тази хипотеза е подкрепена от много ниската честота на пролиферативни отговори за животни, във всяка от тези третирани групи. Тъй като Αβ1-5 конюгатът е ефективен при значително намалено ниво на Αβ в мозъка, при видимото отсъствие на Αβ-специфични Т клетки, ключовият ефекторен имунен отговор, индуциран с имунизация с този пептид, изглежда, че е антитяло.
Липсата на Т-клетъчен и нисък антитяло отговор от слет пептид рВхб, обхващащ АРР аминокиселини 592-695, включително всички от Αβ остатъците, може да се дължи на слабата имуногенност
116 на този специален препарат. Слабата имуногенност на Αβ25-3δ агрегат вероятно се дължи на пептида, който е твърде малък за да е възможно да съдържа добър Т клетъчен епитоп, който да помогне за индуцирането на антитяло отговор. Приема се, че конюгирането на този пептид с носител белтък, може да го направи по-имуногенен.
V. Получаване на поликлонални антитела за пасивна протекция
125 не-трансгенни мишки са имунизирани с Αβ, плюс адювант и са евтаназирани на 4-5 месеца. Взимана е кръв от имунизираните мишки. IgG е отделян от другите кръвни компоненти. Антитялото специфично за имуногена може частично да бъде пречистено с афинитетна хроматография. Получено е средно около 0.5-1 mg имуноген-специфично антитяло за мишка, което общо прави 60120 mg.
VI. Пасивна имунизация с антитела срещу Αβ
Групи от 7-9-месечни PDAPP мишки, всяка инжектирана с 0.5mg в PBS поликлонално анти-Αβ или специфични анти-Αβ моноклонални антитела, както е показано по-долу. Всички препарати от антитела са пречистени, за да са с ниски нива на ендотоксин. Моноклонални антитела могат да бъдат получени срещу един фрагмент, чрез инжектиране фрагмента или по-дълга форма на Αβ у мишка, изготвяйки хибридоми и скрининг на хибридоми за антитяло, което специфично се свързва с желан фрагмент от Αβ, без да се свързва с други не-припокриващи се фрагменти от Αβ.
ϋτ)ΐι«ηΐ№ΐιι
117
Таблица 8
Антитяло | Епитоп |
2НЗ | Αβ 1-12 |
10D5 | Αβ 1-12 |
266 | Αβ 13-28 |
21F12 | Αβ 33-42 |
Мишо поликлонално анти-човешко Αβ42 | Анти-агрегиран Αβ42 |
Мишки са инжектирани интраперитонеално за един период от 4 месеца, за подържане концентрацията на циркулиращо антитяло, © измерен с ELISA тигър по-голям от 1/1000, определен с ELISA срещу Αβ42 или други имуногени. Титрите са контролирани както по-горе и мишките са евтаназирани на края на 6 месеца от инжекциите. Хистохимично, Αβ нива и токсикология са правени след смъртта. Десет мишки са използувани за група. Допълнителни проучвания върху пасивна имунизация са описани в Примери XI и XII по-долу.
VII. Сравнение на различни адюванти
Този пример сравнява CFA, alum, масло-във вода емулсия и MPL за капацитет да стимулират имунен отговор.
р
А. Материали и методи
1. План на изследването
Сто женски Hartley линия, шест-седмични морски свинчета, получени от Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA, ca разпределени в десет групи за да бъдат имунизирани с AN1792 или негово палмитоирано производно, комбинирани с различни адюванти. Седем групи са получили инжекции с AN1792 (33 pg ако друго не е определено) комбиниран с a) PBS, Ь) адювант на Freund, с) MPL, d) сквален, е) MPL/сквален, f) ниска доза alum или д) висока доза alum (300 pg AN1792). Две групи са получили инжекции с палмитоирано
118 производно на AN1792 (33μρ), комбинирано с a)PBS или Ь) сквален. Една последвна, десета група е получила само PBS без антиген или допълнителен адювант. За групата получаваща адювант на Freund, първата доза е емулгирана с CFA и останалите четири дози с IFA. Антиген е прилаган в доза ЗЗцд за всички групи с изключение на групата с висока доза alum, която получава 300 μρ AN1792. Инжекциите са прилагани интраперитонеално за CFA/IFA и интрямускулно в m.qadriceps на задния крак алтернативно на дясната и лявата страна за всички други групи. Първите три дози са давани по двуседмична схема, последвани от две дози на месечен интервал). За измерване на антитяло титрите е правено кръвопускане шест до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза.
2. Получаване на имуногени
Два mg Αβ42 (California Peptide, Lot ME0339) са прибавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс за получаване на относително равномерна суспензия. Добавена е порция от 100μΙ 10Х PBS (1Х PBS, 0.15 М NaCl, 0.01 M натриев фосфат, pH 7.5). Суспензията е разбърквана отново на вортекс и инкубирана за една нощ на 37°С за употреба на следващия ден. Неизползуван Αβ1-42 е съхраняван с осушител като лиофилизиран прах на -20°С.
Палмитоилирано производно на AN1792 е изготвено чрез свързване на палмйтинов анхидрид, разтворен в диметил формамид, с амино крайния остатък на AN1792, преди отстраняването на насцентния пептид от смолата, чрез третиране с хидрофлуорна киселина.
За получаване на имуногенна комбинация, дози с Пълен адювант на Freund (CFA) (група 2), 33 μρ AN1792 в 200μΙ PBS са емулгирани 1:1 (обем:обем) с CFA в краен обем 400 μΙ за първата
119 имунизация. За последващи имунизации, антигенът е емулгиран по подобен начин с Непълен адювант на Freund (IFA).
За изготвяне комбинирани дози с MPL за групи 5 и 8, лиофилизиран прах (Ribi ImmunoChemResearch, Inc., Hamilton, MT) e прибавян към 0.2% воден триетиламин до крайна концентрация 1mg/ml и е разбъркан на вортекс. Сместа е загрята до 65 -70°С за 30 секунди, за създаване на леко опалесцираща, равномерна суспензия от мицели. Разтворът е свежо изготвян за всяка серия от инжектирания. За всяка инжекция в група 5, 33yg AN 1792 в 16.5 μΙ PBS, 50 цд MPL (50μΙ) и 162 μΙ PBS са размесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с ниската масло във вода емулсия, AN1792 в PBS е прибавен към 5% сквален, 0.5% Tween 80, 0.5% Span 85 в PBS за достигане концентрация на крайна единична доза от 33μg AN1792 в 250 μΙ (група 6). Сместа е емулгирана чрез пропускане 15-20 пъти през дву-камерно, ръчно устройство, докато капките на емулсията изглеждат да са приблизително равни на стандартни латексови зърна с диаметър до Ι.Ομτη, когато се наблюдават под микроскоп. Получената суспензия е опалесцентна, млекоподобна. Емулсиите са свежо изготвяни за всяка серия от инжекции. За група 8, MPL в 0.2% триетиламин е прибавян при концентрация 50μg за доза, към сквален и детергентна смес за емулгиране, както е отбелязано по-горе. За палмитоиловото производно (група 7), 33μg за доза палмитоил^Н-Ар1-42 е прибавен към сквален и е разбъркван на вортекс. Добавени са Tween 80 и Span 85 като са разбърквани на вортекс. Тази смес е прибавена към PBS за достигане крайна концентрация от 5% сквален, 0.5% Tween 80, 0.5% Span 85 и сместа е емулгирана както е отбелязано по-горе.
За изготвяне на комбинирани дози с alum (групи 9 и 10), AN1792 в PBS е прибавен към Alhydrogel (алуминиев хидроксид гел,
120
Accurate, Westbury, NY) за достигане концентрация от 33μρ (ниска доза, група 9) или 300gg (висока доза, група 10) AN1792 за 5mg alum в краен обем на дозата 250μΙ. Суспензията внимателно е размесена за 4 часа на стайна температура (RT).
3. Измерване на антитяло титри
Правено е кръвопускане на морски свинчета шест до седем дни след имунизация, започвайки след втората имунизация, общо четири кръвопускания. Антитяло титри срещу Αβ42 са измервани с ELISA, както е описано в Общи материали и методи.
4. Обработка на тъканта
След около 14 седмици, всички морски свинчета са евтаназирани чрез прилагане на СО2. Събирана е гръбначно-мозъчна течност, мозъците са отделяни и са сецирани три мозъчни области (хипокамп, мозъчна кора и малък мозък), които са използувани за измерване концентрацията на тоталния Αβ белтък, като е използувана ELISA.
В. Резултати
1. Антитяло отговори
Има широк обхват за потентността на различни адюванти, когато се определят като антитяло отговор срещу AN1792 след имунизация. Както е показано на Фиг.14, когато AN1792 е въведен в PBS, не е открито антитяло след две или три имунизации и незначителни отговори са открити след четвъртата и петата дози, с геометрични средни титри (GMTs) от около 45. Масло във вода емулсията индуцира умерени титри след третата доза (GMT 255), които са подържани след четвъртата доза (GMT 301) и намаляват с
121 последната доза (GMT 54). Има ясен антиген доза отговор за AN 1792, свързан с alum, като ЗООцд са по-имуногенни за всички срокове в сравнение с ЗЗцд. На максимума на антитяло отговора, след четвъртата имунизация, разликата между двете дози е 43% с GMTs от около 1940 (ЗЗцд) и 3400 (300 цд). Антитяло отговорът срещу ЗЗтд AN 1792 плюс MPL е много сходен с този създаден с почти 10-кратно по-висока доза от антиген (ЗООцд) свързан с alum. Добавянето на MPL към масло във вода емулсията, намалява потентността на комбинацията в сравнение с тази, в която MPL е единствен адювант, с около 75%. Палмитоилирано производно на AN1792 е напълно неw имуногенно, когато е приложено в PBS и дава по-умерени титри, когато е представено в масло във вода емулсия с GMTs 340 и 105 за третото и четвъртото кръвопускане. Най-високи антитяло титри са получени с адювант на Freund, с максимум GMT от около 87,000, една стойност, която е около ЗО-кратно по-голяма в сравнение с GMTs на следващите две най-мощни комбинации, MPL и висока доза AN1792/alum.
Най-обещаващи адюванти, идентифицирани в това проучване са MPL и alum. От двата, MPL изглежда, че е предпочитан поради това, че 10-кратно по-ниска доза антиген е необходима за © получаване на същия антитяло отговор, както този получен с alum.
Отговорът може да бъде повишен чрез повишаване дозата на антиген и/или адювант и чрез оптимизиране на имунизационната схема. Емулсията масло във вода е много слаб адювант за AN1792 и добавянето на масло във вода емулсия към MPL адювант понижава вътрешната активност на адювант MPL самостоятелно.
122
2. Αβ нива в мозъка
На около 14 седмици морските свинчета са дълбоко анестезирани, взимана е гръбначно-мозъчна течност (CSF) и са отделяни мозъците на една подгрупа от групите, имунизирани с адювант на Freund (група 2), MPL (група 5), alum с висока доза, 300μρ, AN 1792 (група 10) и имунизираната с PBS контролна група (група 3). За измерване нивото на Αβ пептид, една хемисфера е сецирана и са правени хомогенати в 5М гуанидин от хипокампална, корова и малкомозъчна области. Те са разредени и количествено са определяни чрез сравнение със серии от разреждания на Αβ стандартен белтък с известни концентрации в ELISA формат. Нивата на Αβ белтък в хипокампа, мозъчната кора и малкия мозък са сходни за всичките четири групи, независимо от широкия диапазон на антитяло отговори срещу Αβ, предизвикани с тези комбинации. Средни Αβ нива от около 25ng/g тъкан са измерени в хипокампа, 21 ng/g в мозъчната кора и 12 ng/g в малкия мозък. Така, наличието на висок титър от циркулиращо антитяло срещу Αβ за почти три месеца у някои от тези животни, не променя общите Αβ нива в техните мозъци. Нивата на Αβ в CSF също са много сходни между групите. Липсата на голям ефект на ΑΝ1792 имунизация върху ендогенния Αβ показва, че имунният отговор е фокусиран върху патологичните образования на Αβ.
VIII. Имунен отговор срещу различни адюванти у мишки
За това проучване са използувани шест-седмични женски
Swiss Webster мишки, с 10-13 животни за група. Имунизации са правени на следните дни -0,14,28,60,90 и 20, приложени подкожно, в обем на дозата 200 μΙ. PBS е използуван като буфер за комбинациите. На животните е правено кръвопускане седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза, за анализ на
123 антитяло титрите с ELISA. Режимът на третиране за всяка група е обобщен в Таблица 9. Таблица 9
Експериментален дизайн на проучване 010
Група | N* | Адювант* | Доза | Антиген | Доза (ug) |
1 | 10 | MPL | 12.5 gg | AN1792 | 33 |
2 | 10 | MPL | 25 gg | AN1792 | 33 |
3 | 10 | MPL | 50 gg | AN1792 | 33 |
4 | 13 | MPL | 125 gg | AN1792 | 33 |
5 | 13 | MPL | 50 gg | AN1792 | 150 |
6 | 13 | MPL | 50 gg | AN1528 | 33 |
7 | 10 | PBS | ANI792 | 33 | |
8 | 10 | PBS | None | ||
9 | 10 | Squalene емулгиран | 5% | AN1792 | 33 |
10 | 10 | Squalene примесен | 5% | AN1792 | 33 |
11 | 10 | Alum | 2 mg | AN1792 | 33 |
12 | 13 | MPL + Alum | 50 gg/2 mg | AN1792 | 33 |
13 | 10 | QS-21 | 5 gg | AN1792 | 33 |
14 | 10 | QS-21 | 10 gg | AN1792 | 33 |
15 | 10 | QS-21 | 25 AN1792 | AN1792 | 33 |
16 | 13 | QS-21 | 25AN1792 | AN1792 | 150 |
17 | 13 | QS-21 | 25AN1792 | AN1528 | 33 |
18 | 13 | QS-21 + MPL | 25 gg/50 gg | AN1792 | 33 |
19 | 13 | QS-21 + Alum | 25 gg/2 mg | AN1792 | 33 |
Забележки: а Брой на мишките във всяка група в началото на експеримента.
ь Отбелязани са адювантите. Буферът за всички комбинации е PBS. За група 8, няма адюванти и няма антиген.
124
ELISA титрите на антитела срещу Αβ42 във всяка група са представени на Таблица 10, по-долу.
Таблица 10
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на к| | зъвопускянс | ||||
Третирана група | 2.9 | 5.0 | 8.7 | 12.9 | 16.7 |
1 | 248 | 1797 | 2577 | 6180 | 4177 |
2 | 598 | 3114 | 3984 | 5287 | 6878 |
3 | 1372 | 5000 | 7159 | 12333 | 12781 |
4 | 1278 | 20791 | 14368 | 20097 | 25631 |
5 | 3288 | 26242 | 13229 | 9315 | 23742 |
6 | 61 | 2536 | 2301 | 1442 | 4504 |
7 | 37 | 395 | 484 | 972 | 2149 |
8 | 25 | 25 | 25 | 25 | 25 |
9 | 25 | 183 | 744 | 952 | 1823 |
10 | 25 | 89 | 311 | 513 | 817 |
11 | 29 | 708 | 2618 | 2165 | 3666 |
12 | 198 | 1458 | 1079 | 612 | 797 |
13 | 38 | 433 | 566 | 1080 | 626 |
14 | 104 | 541 | 3247 | 1609 | 838 |
15 | 212 | 2630 | 2472 | 1224 | 1496 |
16 | 183 | 2616 | 6680 | 2085 | 1631 |
17 | 28 | 201 | 375 | 222 | 1540 |
18 | 31699 | 15544 | 23095 | 6412 | 9059 |
19 | 63 | 243 | 554 | 299 | 441 |
Таблицата показва, че най-високи титри са получени за групи 4, 5 и 18, при които адювантите са 125mg MPL, 50 mg MPL и QS-21 плюс MPL.
IX. Терапевтична ефикасност на различни адюванти
Проучване за терапевтична ефикасност е проведено у PDAPP тренсгенни мишки с един набор от адюванти, подходящи за приложение при хора, за определяне тяхната способност да потенцират имунни отговори срещу Αβ и да индуцират имунномедиирано очистване от амилоидни отлагания в мозъка.
125
Сто и осемдесет мъжки и женски, 7.5 до 8.5 -месечни хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки са получени от Charles River Laboratories. Мишките са разпределени в девет групи, включващи 15 до 23 животни в група, за да бъдат имунизирани с AN1792 или AN1528, комбинирани с различни адюванти. Животните са разпределени така, че да съвпадат по пол, възраст, произход с животните в групата възможно най-близко. Адювантите включват alum, MPL и QS-21, всеки комбиниран с двата антигена и адювант на Freund (FA), комбиниран само с AN 1792. Допълнителна група е имунизирана с AN 1792, комбиниран в PBS буфер плюс кансервант thlmerosal, без адювант. Една девета група е имунизирана само с PBS като отрицателна контрола.
Получаване на агрегирани Αβ пептиди: човешки Αβ1-4Ο (ΑΝ1528; California Peptides Inc., Napa, СА; Lot ME0541) и човешки Αβ1-42 (ΑΝ1792; California Peptides Inc., Lot ME0439) пептиди са свежо разтворени за получаване на всеки набор от инжекции от лиофилизирани прахове, които са съхранявани изсушени на -20°С. За тази цел, 2 mg пептид са прибавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс, за получаване на относително еднороден разтвор или суспензия. AN1528 е разтворим на този етап, за разлика от AN 1792. След това е добавена порция от 10ΟμΙ 10XPBS (1Х PBS. 0.15М NaCl, 0.01 М натриев фосфат, pH 7.5) на който етап AN 1528 започва да преципитира. Суспензиите са разбърквани отново на вортекс и са инкубирани за една нощ на 37°С, за употреба на следващия ден.
За изготвяне комбинирани дози с alum (Групи 1 и 5), Αβ пептид в PBS е добавен към Alhydrogel (2% воден алуминиев хидроксид гел, Saegeant, Inc., Clifton, MJ) за достигане концентрации от 100 цд Αβ пептид за 1 mg alum, Добавен е 10Х PBS до краен обем
126 на дозата 200 μΙ в 1XPBS. След това суспензията е разбърквана внимателно за около 4 часа на RT преди инжектирането.
За изготвяне комбинирани дози с MPL (Групи 2 и 6), лиофилизиран прах (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lot 67039-E0896B) е прибавен към 0.2% воден триетиламин, до крайна концентрация 1mg/ml и е разбъркван на вортекс. Сместа е загрята до 65-70°С за 30 секунди, за създаване на леко опалесцираща еднородна суспензия от мицели. Разтворът е съхраняван на 4°С. За всеки набор от инжекции, 100μg пептид за една доза в 50 μΙ PBS, 50 μg MPL за доза (50μΙ) и 100μΙ PBS за доза, са смесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с QS-21 (Групи 3 и 7), лиофилизиран прах (Aquila, Framingham, МА; Lot A7018R) е прибавен към PBS, pH 6.6-6.7 до крайна концентрация 1mg/ml и са разбъркани на вортекс. Разтворът е съхраняван на -20°С. За всеки набор от инжекции, ЮОрд пептид за доза в 50 μΙ PBS, 25μο QS-21 за доза в 25μΙ PBS и 125μΙ PBS за доза, са смесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с адювант на Freund (Група 4), 100μg AN1792 в 200μΙ PBS е емулгиран 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) в краен обем 400μΙ за първата имунизация. За последващи имунизации, антигенът е емулгиран по подобен начин с Непълен адювант на Freund (IFA). За комбинациите съдържащи адювантите alum, MPL или QS-21, 100 μg за доза AN 1792 или AN1528 е комбиниран с alum (1mg за доза) или MPL (50 μο за доза) или QS-21 (25 μρ за доза) в краен обем 200μΙ PBS и е въведен с подкожна инокулация на гърба между лопатките. За групата получаваща FA, 100 μg AN1792 е емулгиран 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) в краен обем 400 μΙ и въведен интраперитонеално за първата имунизация, последвана от бустер със
127 същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) за следващите пет дози. За групата получаваща AN1792 без адювант, Юцд AN1792 е комбиниран с 5цд thimerosal в краен обем 50μΙ PBS и е приложен подкожно. Деветата, контролна група получава само 200μΙ PBS приложен подкожно. Имунизациите са правени по двуседмична схема за първите три дози, след това по месечна схема, след което на дни 0, 16, 26, 56, 85 и 112. За измерване на антитяло титрите на животните е правено кръвопускане шест до седем дни след всяка имунизация, започвайки от втората доза. Животните са евтаназирани Ф приблизително една седмица след последната доза. Резултатите са определени с ELISA тест за Αβ и АРР нива в мозък и чрез имунохистохимично определяне наличието на амилоидни плаки в мозъчни срези. В допълнение, определяни са Αβ-специфични антитяло титри и Αβ-зависими пролиферативни и цитокинови отговори.
Таблица 10 показва, че най-високи антитяло титри срещу Αβ1-42 са предизвикани с FA и ΑΝ1792, титри, които имат максимум след втората имунизация ( пик GMT: 75,386) и след това намаляват с 59% след последната, шеста имунизация. Максималният среден титър президвикан от MPL с ΑΝ1792 е 62% по-нисък от този ® произведен с FA (пик GMT: 28,867) и е достигнат рано в имунизационната схема, след 3 дози, последван от спад до 28% от максималната стойност след шестата имунизация. Максималният среден титър произведен с QS-21 комбиниран с ΑΝ1792 (GMT: 1,511) е около 5-кратно по-нисък от този получен с MPL. В допълнение, кинетиките на отговора са по-бавни, тъй като се изисква допълнителна имунизация за достигане на максимален отговор. Титри получени от alum-свързан AN 1792 са гранично по-високи, в сравнение с тези получени с QS-21 и кинетикити на отговора са по-бързи. За AN1792 приложен в PBS с thimerosal, честотата и размерът на титрите са
128 малко по-големи в сравнение с този само с PBS. Максималните титри получени с MPL и AN1528 (пик GMT 3099) са около 9-кратно по-ниски от тези с AN1792. Свързан с alum AN1528 е много слабо имуногенен, с ниски титри получени само у някои животни. Не са наблюдавани антитяло отговори у контролни животни, имунизирани само с PBS.
Таблица 11
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на кръвопускане
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на кръвопускане | |||||
Третиране | 3.3 | 5.0 | 9.0 | 13.0 | 17.0 |
Alum/ | 102 | 1,081 | 2,366 | 1,083 | 572 |
AN1792 | (12/21)” | (17/20) | (21/21) | (19/21) | (18/21) |
MPL/ | 6241 | 28,867 | 1,1242 | 5,665 | 8,204 |
AN1792 | (21/21) | (21/21) | (21/21) | (20/20) | (20/20) |
QS-21/ | 30 | 227 | 327 | 1,511 | 1,188 |
AN1792 | (1/20) | (10/19) | (10/19) | (17/18) | (14/18) |
CFA/ | 10,076 | 61,279 | 75,386 | 41,628 | 30,574 |
AN1792 | (15/15) | (15/15) | (15/15) | (15/15) | (15/15) |
Alum/ | 25 | 33 | 39 | 37 | 31 |
AN1528 | (0/21) | (1/21) | (3/20) | (1/20) | (2/20) |
MPL/ | 184 | 2,591 | 1,653 | 1,156 | 3,099 |
AN1528 | (15/21) | (20/21) | (21/21) | (20/20) | (20/20) |
QS-21/ | 29 | 221 | 51 | 820 | 2,994 |
AN1528 | (1/22) | (13/22) | (4/22) | (20/22) | (21/22) |
PBS plus | 25 | 33 | 39 | 37 | 47 |
Thimerosal | (0/16) | (2/16) | (4/16) | (3/16) | (4/16) |
PBS | 25 | 25 | 25 | 25 | 25 |
(0/16) | (0/16) | (0/15) | (0/12) | (0/16) |
Забележки: а Геометрични средни антитяло титри, измерени срещу Αβ1-42 ь Брой на отговарящи за дадена група
129
Резултатите от AN1792 или AN1528 третиране с различни адюванти, или thimerosal върху корово амилоидно натрупване у 12месечни мишки, получени с ELISA, са представени на Фиг.15. У PBS контролните PDAPP мишки, медианното ниво на тотален Αβ в кората на 12 месеца е 1,817 ng/g. Изключително редуцирани нива на Αβ са наблюдавани у мишки третирани с AN1792 плюс CFA/IFA. Обаче, както е показано в Примери I и III ефектите от имунизация за редуциране Αβ нивата, са съществено по-големи у 15-месечни и 18месечни мишки. Така, предвижда се, че допълнителни комбинации, по-специално ΑΝ1792 плюс alum, AN1792 плюс MPL и AN1792 плюс QS-21 препарати, ще осигурят по-положителни резултати при третиране на по-възрастни мишки. За разлика от това, AN1792 плюс консервант thimerosal, показва медианно ниво на Αβ почти същото като това у PBS третираните мишки. Сходни резултати са получени когато са сравнени корови нива на Αβ42. Медианното ниво на Αβ42 у PBS контроли е 1624 ng/g. Изключително редуцирани нива от 403, 1149, 620 и 714 са наблюдавани у мишки третирани с AN 1792 плюс CFA/IFA, AN1792 плюс alum, AN1792 плюс MPL и AN1792 плюс QS-21 съответно, с редукция достигаща статистическа значимост (р=0.05) за AN1792 CFA/IFA третираната група. Медианното ниво у AN1792 thimerosal третираните мишки е 1619 ng/g Αβ42.
X. Анализ за токсичност
Тъкани са взимани за хистопатологично изследване на края на проучванията, описани в Примери II, III и VII. В допълнение, хематология и клинична химия са правени на последни кръвни проби от Примери III и VI. Изследвани са повечето от главните органи, включително мозък, бели дробове, лимфна тъкан, стомашно-чревен тракт, черен дроб, бъбреци, надбъбреци и полови жлези. Въпреки, че са наблюдавани спорадични лезии у изследваните животни, няма
130 очевидни разлики в засегнатите тъкани или тежестта на лезиите, между AN1792 третирани и нетретирани животни. Няма уникални хистопатологични лезии отбелязани у AN1528 -имунизирани животни, в сравнение с PBS-третирани или нетретирани животни. Няма също разлики в клинико-химичния профил между групите с адювант и PBS третираните животни в Пример VI. Въпреки че има значителни повишения на някои от хематологичните параметри между животни третирани с AN1792 и адювант на Freund в Пример VI в сравнение с PBS третирани животни, този тип ефекти са очаквани от третиране с адювант на Freund и придружаващият перитонит и не показват някакви нежелани ефекти от AN1792 третирането. Въпреки че не е част от токсикологичната оценка, мозъчната патология на PDAPP мишка усилено е изследвана като част от крайната ефикасност. Няма данни от третиране, които са свързани с нежелан ефект върху мозъчната морфология, както е отбелязано в някои от проучванията. Тези резултати показват, че AN1792 третиране е добре поносимо и най-малкото е съществено лишено от странични ефекти.
XI. Терапевтично третиране с анти-Αβ антитела
Експериментите описани в този отдел са проведени за да се тестира способността на различни моноклонални и поликлонални антитела срещу Αβ да инхибират натрупването на Αβ в мозъка на хетерогеенни трансгенни мишки.
А. Проучване 1
1. План на проучването
Шестдесет мъжки и женски, хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки, на възраст 8.5 до 10.5 месеца, са получени от Charles River Laboratory. Мишките са разпределени в шест групи за да бъдат третирани с различни антитела насочени срещу Αβ. Животните са
131 разпределени да съвпадат по пол, възраст, произход и източник на животните в групите възможно най-близко. Както е показано на Таблица 12, антителата включват четири миши Αβ-специфични моноклонални антитела, 2НЗ (насочено срещу Αβ остатъци 1-12), 10D5 (насочено срещу Αβ остатъци 1-16), 266 (насочено срещу Αβ остатъци 13-28 и свързващо се с мономерни, но не с агрегиран ΑΝ1792), 21F12 (насочено срещу Αβ остатъци 33-42). Пета група е третирана с фракция от Αβ-специфично поликлонално антитяло (получено чрез имунизация с агрегиран AN 1792). Отрицателна контрола групата е получила разредителя, PBS, самостоятелно без антитяло.
Моноклоналните антитела са инжектирани в доза около 10mg/kg (приемайки, че мишките са с тегло 50д). Инжекциите са прилагани интраперитонеално всеки седем дни, средно да подържат анти-Αβ титри над 1000. Въпреки че по-ниски титри са измерени за mAb 266, тъй като то не се свързва добре с агрегирания AN1792, използуван като захващащ антиген в теста, същата схема за дозировка е подържана за тази група. Групата получаваща моноклонално антитяло 2НЗ е прекъсната в рамките на първите три седмици, тъй като антитялото се изчиства твърде бързо in vivo. На животните е правено кръвопускане преди всяко дозиране, за измерване на антитяло титрите. Третирането е продължило за период от 6 месеца, общо 196 дни. Животните са евтаназирани една седмица след последната доза.
132
Таблица 12
Експериментален дизайн на проучване 006
Третирана група | N* | Третиране антитяло | Антитяло Специфичност | Антитяло И30ТИП |
1 | 9 | попе (PBS само) | NAb | ΝΑ |
2 | 10 | Поликлонално | ΑβΙ-42 | смесен |
3 | 0 | mAbc2H3 | Αβ1-12 | IgGl |
4 | 8 | mAb 10D5 | Αβ1-16 | IgGl |
5 | б | mAb 266 | Αβ13-28 | IgGl |
6 | 8 | mAb21F12 | Αβ33-42 | IgG2a |
Забележки
a. Брой на мишките в група при завършване на експеримента. Всички групи започват с 10 животни в група.
b. NA: не приложим
c. mAb: моноклонално антитяло
2. Материали и методи
а. Получаване на антитела
Анти-Αβ поликлоналното антитяло е изготвено от кръв събрана от две групи животни. Първата група се състои от 100 женски Swiss Webster мишки на възраст 6 до 8 седмици. Те са имунизирани на дни 0, 15 и 29 със ЮОцд AN1792, комбиниран с CFA/IFA. Четвъртата инжекция е правена на 36-ия ден с половината от дозата на AN1792. Животните са обезкървявани при убиването на 42-ия ден, отделян е серум и серумите са обединявани за получаване общо на 64 ml. Втората група се състои от 24 женски мишки изогенни с PDAPP мишките, но не-трансгенни за човешкия АРР ген, на възраст 6 до 9
133 седмични. Те са имунизирани на дни 0,14, 28 и 56 със 100μρ ΑΝ1792, комбиниран с CFA/IFA. Тези животни също са обезкървени при убиването на 63-ия ден, отделян е серум и е обединяван за общо обем 14 ml. Двете серии серуми са обединени. Антитяло фракцията е пречистена с помощта на последващи цикли на утаяване с 50% наситен амониев сулфат. Последният преципитат е диализиран срещу PBS и тестиран за ендотоксин. Нивото на ендотоксин беше по-малко OTlEU/mg.
Анти-Αβ моноклоналните антитела са получени от асцитна течност. Течността най-напред е делипидирана чрез добавка на концентриран натриев декстран сулфат към ледено-студена асцитна течност, чрез разбъркване върху лед за достигне на крайна концентрация 0.238%. След това е добавян с разбъркване концентриращ СаС12 за постигане на крайна концентрация 64тМ. Този разтвор е центрофугиран на 10,000х g и утайката е отстранявана. Надстоящата течност е разбърквана на лед с равен обем наситен амониев сулфат прибавян на капки. Разтворът е центрофугиран отново на 10,000 х g и надстоящата течност е отстранявана. Утайката е ресуспендирана и диализирана срещу 20тМ Tris-HCI, 0.4 М NaCl, pH 7.5. Тази фракция е нанесена на Pharmacia FPLC Sepharose Q колона и елюирана с обратен градиент от 0.4М до 0.275 М NaCl в 20mM Tris-HCI, pH 7.5.
Антитяло максимумът е идентифициран чрез абсорбция при 280nm и съответните фракции са обединявани. Пречистеният антитяло препарат е характеризиран чрез измерване белтъчната концентрация с помощта на ВСА метод и на чистотата, като е използувана SDS-PAGE. Обединеното количество е тестирано за ендотоксин. Нивото на ендотоксин е по-малко от 1EU/mg титри, титри по-малки от 100 условно са означени като стойност на тигъра 25.
134
3. Αβ и АРР нива в мозъка:
След около шест месеца третиране с различни анти-Αβ антитяло препарати, мозъците са отделяни от животните след перфузия с физиологичен разтвор. Едната хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ, а втората е използувана за количествено определяне на Αβ и АРР нива. За измерване концентрациите на различни форми бета амилоиден пептид и амилоиден прекурсорен протеин (АРР), хемисферите са сецираи и са изготвени хомогенати в 5М гуанидин от хипокампална, корова и малкомозъчна области. Те са разреждани серийно и е определяно количествено нивото на амилоиден пептид или АРР чрез сравнение със серии от разреждания на стандарти от Αβ пептид или АРР, с известни концентрации в ELISA формат.
Нивата на тотален Αβ и Αβ1-42, измерени чрез ELISA в хомогенати от мозъчната кора и хипокампа и нивото на тоталния Αβ в малкия мозък са представени на Таблици 11, 12 и 13, съответно. Медианната концентрация на тотален Αβ за контролната група, инокулиран с PBS, е 3.6-кратно по-висока в хипокампа отколкото в кората (медиана 63,389 ng/g хипокампална тъкан, сравнена със 17,818 ng/g за мозъчната кора). Медианното ниво в малкия мозък на контролната група (30.6 ng/g тъкан) е повече от 2,000-кратно по-ниско от това в хипокампа. Тези нива са сходни с тези, които ние съобщихме по-рано за хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки на тази възраст (Johnson-Woods et al., 1997).
За мозъчната кора, една третирана група има медианно Αβ ниво, измерено като Αβ1-42, различаващо се значимо от това на контролната група (р<0.05), тези животни са получавали поликлонално анти-Αβ антитяло, както е показано в Таблица 13. Медианното ниво на Αβ1-42 е намалено със 65% , сравнено с контролата за тази третирана група. Медианните нива на Αβ1-42 също са значимо намалени с 55%,
135 сравнени с контролата в една допълнителна група, тези животни са дозирани с mAb 10D5 (р =0.0433).
с: ю <0 co
CD □Г
S
Средни стойност | 3. | ELISA стойност | 12621+/-5738 | 4454+/-3347 | 6943+/-3351 | 7489+/-6921 | 11005+/-6324 | ||
Total Αβ | ι ELISA | стойност | 16150+/- 7456* | 5912+/- 4492 | 9695+/- 6929 | 9204+/- 9293 | 12481+/- 7082 | |||
CO X _ 05 o. C | <n | «Ί Ά 1 | I | ГЧ 1 | |||||
Αβ42 | πω o • X •X frl H- | iz | 0.0071 | 0.0433 | 0.1255 | 0.7003 | |||
1 ω o X g | 13802 | 4892 | 6214 | 00 oo | 13578 | ||||
X X | 1 | ||||||||
X § S | % Промяна | !Z | Ю 4 | VD tn 1 | o 5 | *n • | |||
Total Αβ | ъ ο е ω 04 | 1 | 0.0055 | 6ΙΟΓΟ | 0.1255 | 0.2898 | |||
< 0_ о | I ELISA стойност' 1 | 00 00 ^4 | 6160 | 7915 | 9144 | 15158 | |||
< | & | σχ | o | 00 | Ό | 00 | |||
1 т п о 2 | Третирана Група | PBS | T 4 5 « o S. 5 ί § s c | mAb 10D5 | x© X© <4 1 | Ξ СЧ i |
NA: не приложим е. Стандартно отклонение
136
В хипокампа, медианният процент намаление на тоталния Αβ, е свързан с третиране с поликлонално анти-Αβ антитяло (50%, р= 0.0055) не е толкова голям както наблюдавания за мозъчната кора (65%) (Таблица 14). Обаче, абсолютната величина на намалението е почти 3-кратно по-голям в хипокампа, в сравнение с кората, чисто намаление от 31,683 ng/g тъкан в хипокампа, срещу 11,658 ng/g тъкан в мозъчната кора. Когато е измерено като ниво на найамилоидогенните форми на Αβ, Αβ1-42, отколкото като тотален Αβ, намалението постигнато с поликлоналното антитяло е значимо (р=0.0025). Медиалните нива в групите третирани с mAb 10D5 и 266 са намалени съответно с 33% и 21% .
137
HIPPOCAMPUS | Средни ι ! 1 | $ CQ < | ELISA Стойност | о г’Т 1 ί О оо 04 Ά | 24853+/-18262 | $ «—< Ο* <η ТГ \ο СП | [32919+/-25372 1 | 50305+/-23927 |
CO. 4 -3 ί | ELISA стойност | 00 О сп m •-4 1 + ΜΊ on 00 | 30058+/-22454 | οι m νο 00 ^-4 + 00 •η | 136419+/-27304 j | 1 57327+/-28927 | ||
S X е 1 | % Промяна | ί | -50 | m | 4-4 ΟΙ I | 04 ΓΗ 1 | ||
iP стойност | ί | 0.0025 | 1 0.0543 ι | 10.0990 ι | 10.8099 ι | |||
Αβ42 | ELISA стойност | Οι Ο) 3 | 27127 | 1 36290 1 | 143034 ι | 147961 ι | ||
% Промяна | δ | Ο «η 1 | 1 -26 I | 1 1 | Ο\ I | |||
Total Αβ | р | стойност’ | ’ί | 0.0055 | 10.0675 ι | 10.0990 1 | 1 0.7728 | ||
ELISA стойност” | 163389 1 | 31706 | 146779 1 | 148689 1 | 151563 1 | |||
Οχ | ο | 00 | ο | οο | ||||
ex И H fr | tz> Вч | Ο X 5 см 15 ξ *-g £ § | 1П Q ο 1 | Ό \ο ΟΙ | mAb21F12 | |
Стандартно отклонение
138
Тоталнен Αβ е измерен също в малкия мозък (Таблица 15). Тези групи, третирани с поликлоналното анти-Αβ и 266 антитялото показват значими намаления нивата на тоталния Αβ (43% и 46%, р=0.0033 и р=0.0184, съответно) и групата третирана с 10D5 има близко значимо намаление (29%, р=0.0675).
Таблица 15
МАЛЪК МОЗЪК | |||||
Третирана група | № | Медиани | Средни | ||
Total Αβ | Total Αβ | ||||
ELISA Стойность | P стойност* | % Промяна | ELISA стойност | ||
PBS | 9 | 30.64 | NAd | ΝΑ | 40.00+/-31.89' |
Поликлонално anti-Ap42 | 10 | 17.61 | 0.0033 | -43 | 18.15+/-4.36 |
mAb 10D5 | 8 | 21.68 | 0.0675 | -29 | 27.29+/-19.43 |
mAb 266 | 6 | 16.59 | 0.0184 | -46 | 19.59+/-6.59 |
mAb 21F12 | 8 | 29.80 | >0.9999 | -3 | 32.88+/-9.90 |
Забележки:
a. Брой на животните в група в края на експеримента
b. Ng/g тъкан
c. Mann Whitney анализ
d. ΝΑ: не приложим
e. Стандартно отклонение
Определяна е също концентрацията на АРР с ELISA в мозъчната кора и малкия мозък от антитяло-третирани и контролни, PBS-третирани мишки. Използувани са два различни АРР тестове. Първият, означен като APP-ot/FL, разпознава АРР-алфа (а, секретираната форма на АРР, която е разцепена в Αβ последователността), пълноразмерните форми (FL) на АРР, докато вторият
139 разпознава само ΑΡΡ-α. За разлика от свързаното с третиране намаление на Αβ в една подгрупа от третираните групи, нивата на АРР са действително непроменени във всички от третираните, сравнени с контролните животни. Тези резултати показват, че имунизациите с Αβ антитела разрушават Αβ без да разрушават АРР.
В резюме, Αβ нива са значително намалени в мозъчната кора, хипокампа и малкия мозък у животни, третирани с поликлоналното антитяло, предизвикано срещу ΑΝ1792. В по-малка степен моноклонални антитела срещу амино-терминалната област на Αβ1-42, специфично аминокиселини 1-16 и 13-28 също показват значими ефекти от третиране.
4. Хистохимични анализи:
Морфологията на Αβ-имунореактивните плаки в една подгрупа мозъци от мишки на PBS, поликлонално Αβ42, 21F12, 266 и 10D5 третирани групи е сравнена качествено с тази от предишни проучвания, в които са следвани стандартните имунизационни процедури с Αβ42.
Най-обширни промени в степента и изгледа на амилоидни плаки се появяват у животните имунизирани с поликлоналното Αβ42 антитяло. Намаляването на амилоидното натрупване, еродираната морфология на плаките и клетъчно-свързаната Αβ имунореактивност, близко наподобява ефектите, предизвикани от стандартната имунизационна процедура. Тези наблюдения подкрепят резултатите от ELISA, при които са постигнати значими намаления на тоталния Αβ и Αβ42 чрез въвеждане на поликлоналното Αβ42 антитяло.
В подобни качествени оценки, амилоидни плаки в 10D5 групата също са редуцирани по брой и вид, с известни данни за клетъчно-свързана Αβ имунореактивност. Главните разлики не са видими когато са сравнени 21F12 и 266 групите с PBS контролите.
140
3. Измерване на антитяло титри:
На една подгрупа от три произволно избрани мишки от всяка група е правено кръвопускане, непосредствено преди всяка интраперитонеална инокулация, общо 30 кръвопускания. Антитяло титрите са измерени като ΑβΙ-42-свързване на антитяло, като е използувана сандвич ELISA с пластмасови мулти-ямкови платки, покрити с Αβ1-42, както е описано подробно в Общи материали и методи. Средни титри за всяко кръвопускане са представени на Фигури 16-18 съответно за поликлоналното антитяло и ©моноклоналните антитела 10D5 и 21F12. Титрите са около 1:1000 за този период от време за препарата от поликлоналното антитяло и малко над това ниво за 10D5- и 21Р12-третираните животни.
5. Лимфопролиферативни отговори
Αβ-зависима лимфопролиферация е измерена като са използувани клетки от слезка, събрани осем дни след последната антитяло инфузия. Свежо събрани клетки, 105 за ямка, са култивирани за 5 дни в присъствие на Αβ1-40 при концентрация 5μΜ за стимулация. Като положителна контрола, допълнителни клетки са култивирани с Т клетъчен митоген, РНА, и като отрицателна контрола, © клетки са култивирани без добавен пептид.
Спленоцити от възрастни PDAPP мишки, пасивно имунизирани с различни анти-Αβ антитела, са стимулирани in vitro с AN 1792 и са измервани пролиферативните и цитокинови отговори. Целта на тези изследвания е да се определи, дали пасивната имунизация улеснява наличието на антиген и така да индуцира Т клетъчни отговори, специфични за AN 1792. Не са наблюдавани АМ1792-специфични пролиферативни или цитокинови отговори у мишки, пасивно имунизирани с анти-Αβ антителата.
141
В. Проучване 2
Във второ проучване, третиране с антитяло 10D5 е повторено и са тестирани две допълнителни анти-Αβ антитела, моноклонални антитела 3D6 (Αβμ5) и 16С11 (Αβ33.42)· Контролни групи са получили PBS или несъответно изотип-сдвоено антитяло (ТМ2а). Мишките са по-възрастни (11.5-12-месечни хетерозигоотни) в сравнение с предишното проучване; иначе, експерименталният дизайн е същия. Отново, след шест месеца третиране, 10D5 редуцира натрупването на плаки с повече от 80% в сравнение с PBS или изотип-сдвоените антитяло контроли (р=0.003). Едно от другите антитела срещу Αβ, 3D6, е еднакво ефективно, предизвикващо 86% намаление (р=0.003). За разлика от това, третото антитяло срещу пептида, 16С11, няма никакъв ефект върху натрупването на плаки. Сходни открития са получени с Αβ42 ELISA измервания. Тези резултати демонстрират, че антитяло отговор срещу Αβ пептид, в отсъствие на Т клетъчен имунитет, е достатъчен да намали амилоидно отлагане у PDAPP мишки, но не всички анти-Αβ антитела са ефикасни. Антитела насочени срещу епитопи съдържащи аминокиселини 1-5 или 3-7 от Αβ са особено ефикасни.
Тези проучвания демонстрират, че пасивно въведени антитела срещу Αβ намаляват степента на отлагане на плаки у миши модел на болест на Alzheimer. Когато са задържани на умерени серумни концентрации (25-75цд/т1), антителата получават достъп до централната нервна система в нива достатъчни за декорират βамилоидни плаки. Навлизането на антитела в централната нервна система не се дължи на абнормно пропускане на кръвно-мозъчната бариера, тъй като няма повишение на съдовия пермеабилиитет, според измерване с Evans Blue у PDAPP мишки. В допълнение, концентрацията на антитяло в мозъчния паренхим на възрастни PDAPP мишки е същата както у не-трансгенни мишки,
142 представляваща 0.1% от антитяло концентрацията в серума (по отношение на изотип).
С. Проучване 3: Контрол на антитяло свързване
За определяне дали антитела срещу Αβ могат да действуват директно в централната нервна система, мозъци взети от перфузирани с физиологичен разтвор мишки на края на Пример XII, са изследвани за наличие на периферно-въведени антитела. Нефиксирани криостатни мозъчни срези са излагани на действие на флуоресцентен реагент срещу миши имуноглобулин (кози анти-миши lgG-СуЗ). Плаки в мозъци на 10D5 и 3D6 групите са силно декорирани с антитяло, докато в 16С11 групата няма оцветяване. За разкриване напълно степента на отлагане на плаки, серийни срези от всеки мозък най-напред са имунореагирали с анти-Αβ антитяло и след това с вторичен реагент. 10D5 и 3D6, след периферно въвеждане, получават достъп до повечето плаки в централната нервна система. Отлагането на плаки е силно редуцирано в тези третирани групи, в сравнение с 16С11 групата. Тези данни показват, че периферно въведени антитела могат да навлизат в централната нервна система, където те могат директно да предизвикат амилоидно очистване. Възможно е 16С11 също да има достъп до плаките, но да е неспособно да се свързва с плаките.
XII. Профилактика и лечение на хора
За определяне безопасност при хора е проведено единична доза фаза I изпитване. Терапевтичен агент е въвеждан в нарастваща дозировка на различни пациенти, започвайки от около 0.01 от нивото на предвиждана ефикасност и нараствайки с един фактор от три докато се достигне около 10 пъти ефективната миша дозировка.
Фаза II на изпитването е проведена за определяне на терапевтичната ефикасност. Пациенти с ранна до средна болест на
143
Alzheimer, определена като са използувани критериите на Alzheimer’s disease and related Disorders Association (ADRDA) (Асоциация на болест на Alzheimer и сродни нарушения), са подбрани за вероятна AD. Подходящи пациенти са оценявани по 12-26 степенния Mini-mental Stat Exam (MMSE) )Мини-ментален щатски изпит). Други критерии за подбор са възможността пациентите да преживеят продължителността на изследването и липсата на усложняващи причини, като употребата на придружаващи медикаменти, които могат да повлияват. Изходните определения за функциите на пациента са правени с класически психометрични измервания, като MMSE и ADAS, която е сравнителна скала за оценка на пациентите, чието състояние и функция са свързани с болест на Alzheimer. Тези психометричните скали предоставят мярка за прогресиране състоянието на Alzheimer заболяването. Подходящи скали за качеството на живот могат също да бъдат използувани за контрол на третирането. Прогресирането на заболяването може също да бъде контролирано с MRI. Кръвни профили на пациенти могат също да бъдат контролирани, включително проби за имуноген-специфични антитела и Т-клетъчни отговори.
След изходните измервания, пациентите получават лечение. Те са произволно разпределени и третирани с терапевтичен агент или плацебо по слеп начин. Пациентите са контролирани най-малко на шест месеца. Ефикасността е определяна по специфично намаление прогресирането на третирана група в сравнение с плацебо група.
Втора фаза II на проучването е проведена за оценка превръщането на пациенти с ранна загуба на паметта от не-Alzheimer заболяване, понякога обозначавано като възрастово-свързано нарушение на паметта (AAMI) или леко когнитивно нарушение (MCI), във възможна болест на Alzheimer, определена с ADRDA критерии. Пациенти с висок риск за превръщане в болест на Alzheimer, са
144 подбрани от не-клинична популация чрез скрининг на референтна популация за ранни симптоми за загуба на памет или други затруднения, свързани с npe-Alzheimer симптоматология, фамилна анамнеза за болест на Alzheimer, генетични рискови фактори, възраст, пол и други особености, намерени, че предсказват висок риск за болест на Alzheimer. Събрани са изходни данни за подходящи метрични единици, включително MMSE и ADAS, заедно с други метрични единици, предвидени да оценят една по-нормална популация. Тези популации от пациенти са разделени на подходящи групи за сравнение с плацебо срещу алтернативни дозировки с ® агента. Тези популации от пациенти са последвани от интервали от около шест месеца и крайния срок за всеки пациент е в зависимост дали той или тя са се превърнали във възможна болест на Alzheimer, както е определено с критериите на ADRDA на края на наблюдението.
XIII. Общи материали и методи
1. Измерване на антитяло титри
На мишките е правено кръвопускане чрез малък срез на опашната вена и събиране около 200μΙ кръв в микро центрофужна епруветка. На морските свинчета е правено кръвопускане, като най© напред е избръснато място на задния крак и след това използувайки игла с размер 18 е пробивана метатарзалната вена и кръвта е събирана в микро центрофужни епруветки. Кръвта е оставяна да се съсири за един час на стайна температура (RT), разбърквана е на вортекс и след това е центрофугирана на 14,000х g за 10 минути, за отделяне съсирека от серума. След това серумът е прехвърлен в чиста центрофужна епруветка и съхраняван на 4°С докато се титрира.
Антитяло титрите са измерени с ELISA. 96-ямкови платки (Costar El А платки) са покрити със 100μΙ разтвор съдържащ 10цд/т1
Αβ42 или SAPP или други антигени, както е отбелязано във всеки от
145 отделните протоколи в Well Coating Buffer (Буфер за покриване на ямки) (0.1 М натриев фосфат, pH 8.5, 0.1% натриев азид) и са държани за една нощ на стайна температура. Ядките са аспирирани и са добавени серуми в ямките, започвайки при 1/100 разреждане в стандартен разредител (0.014 М натриев фосфат, pH 7.4, 0.15 М NaCl, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% thimerosal). Направени са седем серийни разреждания на пробите направо в платките, на трикратни етапи за достигане крайно разреждане от 1/218,700. Разрежданията са инкубирани в покритите ямки на платките за един час на RT. След ©това платките са измити четири пъти с PBS съдържащ 0.05% Tween
20. Второто антитяло, кози анти-миши Ig конюгиран с пероксидаза от хрян (получена от Boehringer Mannheim), е добавен към ямките като ΊΟΟμΙ1/3000 разреждане в стандартен разредител и са инкубирани за един час на RT. Платките са измити отново четири пъти cPBS, Tween 20. За развитие на хромогена, 100μΙ Slow ТМВ (3,3’,5,5’-тетраметил бензидин от Pierce Chemicals) са добавени към всяка ямка и са инкубирани за 15 минути на RT. Реакцията е прекъсвана чрез добавка на 25μΙ 2М H2SO4. Интезитета на оцветяването е отчитан на Molecular Devices Vmax при (450nm - 650nm).
Титрите са определени като реципрочни на серумното © разреждане, което дава % максималната OD. Максимална OD обикновено е взимана от едно начално 1/100 разреждане, с изключение на случаите с много високи титри, в който случай е необходимо по-високо начално разреждане за определяне на максималната OD. Ако 50% пункт попадне между две разреждания, се прави линейна екстраполация за изчисление на крайния титър. За изчисление на геометрични средни антитяло титри, титри, които са помалки от 100 условно, са означени със стойност на тигъра от 25.
146
2. Лимфоцитен пролиферативен тест
Мишките са анестезирани с изофлуран. Отделени са слезките и са изплакнати два пъти с 5 ml PBS, съдържащ 10% топлинно инактивиран фетален говежди серум (PBS-FBS) и след това са хомогенизирани в 50° Centricon unit (Dako A/S, Denmark) в 1.5 ml PBSFBS за 10 секунди при 100 об.мин. в Medimachine (Dako), последвано от филтриране през найлоново сито със 100 микрона големина на порите. Спленоцитите са измити отново с 15ml PBS-FBS, след това са утаени чрез центрофугиране на 200 х g за 5 минути. Червените кръвни клетки са лизирани чрез ресуспендиране на утайката в 5 ml буфер, съдържащ 0.15 М NH4CI, 1М КНСОЗ, 0.1 М NaEDTA, pH 7.4 за 5 минути на RT. След това левкоцитите са измити както по-горе. Свежо изолирани клетки от слезка (105 клетки за ямка) са култивирани в три повторения в 96-ямкови U-дънни третирани за клетъчни култури микротитрационни платки (Coming, Cambridge, МА) в RPMI 1640 среда (JRH Biosciences, Lenexa, KS), допълнена с 2.5 mM L глугамин, 1% пеницилин/стрептомицин и 10% топлинно-инактивиран FBS, за 96 часа на 37°С. Различни Αβ пептиди, Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 или Αβ40-1 белтък с обратна последователност, също са добавени в дози в границите на 5 до 0.18 микромоларни на четири етапа. Клетки в контролни ямки са култивирани с Concanavalin A (Con A) (Sigma, cat.# С-5275, при 1микрограм/т1) без добавен белтък. Клетките са белязани пулсово за последните 24 часа с 3Н-тимидин (1цС|/ямка, получен от Amersham Corp .Arlington Heights IL). След това клетките са събрани върху UniFilter платки и са изброени в Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Резултатите са изразени като импулси на минута (срт) включена радиоактивност в неразтворими макромолекули.
м
147
3. Препарат от мозъчна тъкан
След евтаназия, мозъците са отделени и едната хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ, докато три мозъчни области (хипокамп, мозъчна кора и малък мозък) са сецирани от другата хемисфера и са използувани за определяне концентрацията на различни Αβ белтъци и АРР форми, като са използувани специфични ELISAs (Johnson Wood et al., по-горе).
Тъканите определени за ELISAs са хомогенизирани в 10 обема ледено студен гуанидинов буфер (5.0 М гуанидин-HCI, 50тМ Трис-HCI, pH 8.0). Хомогенатите са размесени чрез внимателно разклащане като е използуван Adams Nutator (Fisher) за 3-4 часа на RT, след това са съхранявани на -20°С преди количественото определяне на Αβ и АРР. Предварителни експерименти показват, че анализираният материал е стабилен при тези условия на съхранение, и че синтетичен Αβ белтък (Bachem) може количествено да бъде възстановен когато е прибавен в хомогенати от контролна мозъчна тъкан от миши котила (Johnson-Wood et al., по-горе).
4. Определяне на Αβ нива
Мозъчните хомогенати са разредени 1:10 с ледено-студен казеинов разредител (0.25% казеин, PBS, 0.05% натриев азид, 20цд/т1 апротинин, 5 mM EDTA pH 8.0, 10 цд/т1 леупептин) и след това са центрофугирани при 16,000 х д за 20 минути на 4°С. Синтетичните Αβ белтъчни стандарти (1-42 аминокиселини) и АРР стандартите са изготвени да включват 0.5 М гуанидин и 0.1% говежди серум албумин (BSA) в крайния състав. “Тоталната” Αβ сандвич ELISA използува моноклонално антитяло 266, специфично за аминокиселини 13-28 от Αβ (Seubert et al.), като захващащо антитяло и биотинилирано моноклонално антитяло 3D6, специфично за аминокиселини 1-5 от Αβ (Johnson-Wood et al.), като репортерно антитяло. Моноклоналното
148 онтитяло 3D6 не разпознава секретиран АРР или пълноразмерен АРР, но открива само Αβ видове с амино-крайна аспаргинова киселина. Този тест има по-ниска граница на чувствителност от -50ng/ml (11 пМ) и не проявява кръстосана реактивност към ендогенния миши Αβ белтък при концентрация до 1ng/ml (JohnsonWood еу al., по-горе).
Αβ1-42 специфичната сандвич ELISA използува πιΑβ 21F12 , специфично за аминокиселини 33-42 от Αβ (Johnson-Wood et al.), като захващащо антитяло. Биотинилирано ηηΑβ 3D6 е също репортерното антитяло в този тест, което има по-ниска граница на чувствителност от ® около 125 цд/т1 (28 μΜ, Johnson-Wood et al.). За Αβ ELISAs, 100μΙ от mAp 266 (при 1Ομο/ΓπΙ) или ηηΑβ 21F12 при (δμρ/πηΙ) са нанесени да покрият ямките на 96-ямкови имунотест платки (Costar) чрез инкубация за една нощ на RT. Разтворът е отстранен чрез аспириране и ямките са блокирани чрез добавка на 200μΙ 0.25% човешки серум албумин в PBS буфер за най-малко един час на RT. Блокиращият разтвор е отстраняван и платките са съхранявани изсушени при 4°С до употреба. Платките са рехидратирани с буфер за измиване [Трисбуфериран физиологичен разтвор (0.15М NaCl, 0.01 М Трис-HCI, pH 7.5), плюс 0.05% Tween 20] преди употреба. Пробите и стандартите са © добавени по три успоредни порции от 100μΙ за ямка и са инкубирани за една нощ на 4°С. Платките са измити най-малко три пъти с буфер за измиване между всеки етап от теста. Биотинилираното πιΑβ 3D6, разредено до 0.5цд/т! в буфер за казеинов тест (0.25% казеин, PBS, 0.05 Tween 20, pH 7.4), е добавено и инкубирано в ямките за 1 час на RT. Авидин-пероксидаза от хрян конюгат (Avidin-HRP получена от Vector, Burlingame, СА), разреден 1:4000 в буфер за казеинов тест, е добавен към ямките за 1 час на RT. Колориметричният субстрат Slow TMB-ELISA (Pierce), е добавен и е оставен да реагира за 15 минути на RT, след което ензимната реакция е прекъсвана чрез добавяне на
149 μΙ 2Ν H2SO4. Реакционният продукт е определен количествено като е използуван Molecular Devices Vmax, измервайки разликата на абсорбцията при 450 nm и 650 nm.
5. Определяне на АРР нива
Използувани са два различни АРР теста. Първият, означен като ΑΡΡ-α/FL, разпознава APP-alpha(a) и пълноразмерни (FL) форми на АРР. Вторият тест е специфичен за APP-a. APP-a/FL тестът разпознава секретиран АРР, включително първите 12 аминокиселини от Αβ. Тъй като репортерното антитяло (2НЗ) не е специфично за азакачващото-място (a-clip-site), намиращо се между аминокиселини 612-613 от АРР695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); този тест разпознава също пълноразмерен АРР (АРР-FL). Предварителни експерименти, използувайки имобилизирани АРР антитела срещу цитоплазмената опашка на АРР-FL за изчерпване мозъчни хомогенати от АРР-FL, насочват, че приблизително 30-40% от APP-a/FL е FL (данните не са представени). Захващащото антитяло за APP-a/FL и АРР-a тестовете е mAb 8Е5, предизвикано срещу аминокиселини 444 до 592 от АРР695 формата (Games et al., по-горе). Репортерното mAb за ΑΡΡ-α/FL теста е mAb 2НЗ, специфично за аминокиселини 597-608 от АРР695 (Johnson-Wood et al., по-горе) и репортерното антитяло за АРР-а теста е биотинилирано производно на mAb 16Н9, предизвикано срещу аминокиселини 605 до 611 от АРР. По-ниската граница на чувствителност на APP-aFL теста е около 11ng/ml (150 рМ) (JohnsonWood et al.) и тази на АРР-а специфичен тест е 22ng/ml (0.3 пМ). За двата АРР теста, mAb 8Е5 е нанесено да покрие ямките от 96-EIA платки, както е описано по-горе за mAb 266. Пречистен, рекомбинангно секретиран АРР-а, е използуван като референтен стандарт за АРР-а теста и ΑΡΡ-α/FL теста (Esch et al., по-горе). Пробите от мозъчен хомогенат в 5 М гуанидини са разредени 1:10 в
150 стандартен разредител за ELISA ( 0.014 М фосфатен буфер, pH 7.4, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% thimerosal, 0.5М NaCI, 0.1% NP40). След това те са разредени 1:4 в стандартен разредител съдържащ 0.5М гуанидин. След това разредените хомогенати са центрофуирани при 16,000х g за 15 секунди на RT. АРР стандартите и пробите са добавени към платката в две успоредни проби и са инкубирани за 1.5 часа на RT. Биотинилираното репортерно антитяло 2НЗ или 16Н9 е инкубирано с проби за 1 час на RT. Стрептавидиналкална фосфатаза (Boehringer Mannheim), разредена 1:1000 със стандартен разредител, е инкубирана в ямките за 1 час на RT. Флуоресцентният субстрат 4-метил-умбелиферил-фосфат е добавен за 30 минутна инкубация на RT и платките са отчитани на Cytofluor tm 2350 fluorimeter (Millipore) при 356 nm облъчване и 450 nm емисия.
6. Имунохистохимия
Мозъците са фиксирани за три дни на 4°С в 4% параформалдехид в PBS и след това са съхранявани от един до седем дни на 4°С в 1% параформалдехид в PBS докато бъдат сецирани. Коронарни срези с дебелина 40μ са рязани на вибратом на RT и са съхранявани в криопротектор (30% глицерол, 30% етилен гликол във фосфатен буфер) на -20°С преди имунохистохимична обработка. За всеки мозък, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен чрез последователни 240цт интервали, са инкубирани за една нощ, с едно от следните антитела: (1) биотинилирано анти-Αβ (mAb, 3D6, специфично за човешки Αβ), разредено до концентрация 2μg/ml в PBS и 1% конски серум; или (2) биотинилирано mAb специфично за човешки АРР, 8Е5 , разредено до концентрация Зμg/ml в PBS и 0.1% конски серум; или (3) тАЬ специфично за глиялен кисел белтък (GFAP; Sigma Chemical Co.), разредено 1:500 с 0.25% Triton-X-100 и 1% конски серум, в Трие151 буфериран физиологичен разтвор, pH 7.4 (TBS); или (4) mAb специфично за CD11b, МАС-1 антиген, (Chemicon International), разреден 1:100 с 0.25% Triton-Х-ЮО и 1% заешки серум в TBS; или (5) mAb специфично за МНС II антиген, (Pharmingen) разредено 1:100 с 0.25% Тритон-Й-100 и 1% заешки серум в TBS; или (6) плъшо mAb специфично за CD 43 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (7) плъшо mAb специфично за CD 45RA (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (8) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45RB (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (9) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (10) биотинилирано поликлонално от хамстер Αβ специфично за CD3e (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (11) плъшо mAb специфично за CD3 (Serotec) разредено 1:200 с 1% заешки серум в PBS; или с (12) разтвор на PBS без първично антитяло, съдържащ 1% нормален конски серум.
Срези реагирали с антитяло разтворите, изброени в 1,2 и 6-12 са претретирани с 1.0%Triton-X-100, 0.4% водороден прекис в PBS за 20 минути на RT, за блокиране на ендогенната пероксидаза. След това те са инкубирани за една нощ на 4°С с първично антитяло. Срези реагирали с 3D6 или 8Е5, или CD3e mAb, след това са реагирали за един час на RTc пероксидаза от хрян-авидин-комплекс с компонентите “А” и “В” на кита, разреден 1:75 в PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, СА). Срези реагирали c антитела специфични за CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 и PBS разтвора без първично антитяло, са инкубирани за един час на RT с биотинилиран антиплъши IgG (Vector), разреден 1:75 в PBS или биотинилиран антимиши IgG (Vector), разреден в PBS, съответно. След това срезите са реагирали за един час на RT с пероксидаза от хрян-авидин-биотин152 комплекс c компонентите А” и В” от кита, разредени 1:75 в PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).
Срезите са третирани в 0.01% водороден прекис, 0.05% 3,3’диаминобензидин (DAB) на RT. Срезите определени за инкубация с GFAP-, МАС-1 и МНС ll-специфични антитела са претретирани с 0.6% водороден прекис на RT за блокиране ендогенната пероксидаза, след това са инкубирани за една нощ с първичното антитяло на 4°С. Срезите реагирали с GFAP антитяло са инкубирани за един час на RT с биотинилиран анти-миши IgG правен у кон (Vector Laboratories, Vectastain Elite ABC Kit), разреден 1:200 c TBS. След това срезите са реагирали за един час с авидин-биотин-пероксидаза комплекс (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit), разреден 1:1000 c TBS. Срезите инкубирани c МАС-1 или MAC ll-специфично моноклонално антитяло като първично антитяло, са реагирали последователно са един час на RT с биотинилиран анти-миши IgG направен у заек, разреден 1:200 cTBS, последвани от инкубация за един час с авидин-биотинпероксидаза комплекс, разреден 1:1000 с TBS. Срези инкубирани с GFAP-, МАС-1 и МАС ll-специфични антитела след това са визуализирани чрез третиране на RT с 0.05% DAB, 0.01% водороден прекис, 0.04% никелов хлорид, TBS за 4 и 11 минути, съответно.
Имунобелязани срези са монтирани върху предметни стъкла (VWR, Superfrost slides), изсушени са на въздух за една нощ, потапяни са в Propar (Anatech) и са покрити с покривни стъкла, като е използувана Permount (Fisher) като монтираща среда.
За контрастно оцветяване на Αβ плаки, една подгрупа от
GFAP-положителни срези са монтирани върху Suprfrost предметни стъкла и са инкубирани във воден 1% Thioflavin S (Sigma) за 7 минути, последвано от имунохистохимична обработка. След това срезите са дехидратирани и просветлени в Ргораг, след това са покрити с покривни стъкла и монтирани с Permount.
153
7. Анализ на образи
За количествена оценка на имунореактивните стъкла е използувана Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), свързана c Nikon Micropho t-FX микроскоп чрез CCD видео камера и Sony Trinitron монитор. Образът на среза е съхраняван във видео буфер и е определян праг на базата на цвят и насищане, за да се подбере и изчисли тоталната pixel площ, заета от имунобелязаните структури. За всеки срез, хипокампа е очертаван на ръка и е изчислявана тоталната pixel площ, заета от хипокампа. ©Процентът амилоидно натрупване е измерван като: (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща Αβ отлагания, имунореактивни с гпАЬ 3D6) х 100. Подобно, процентът невритно натрупване е измерен като : (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща дистрофични неврити, реактивни с моноклонално антитяло 8Е5) х 100. C-lmaging System (Compix, Inc., Camberry Township, PA), оперираща със Simple 32 Software Application Program е свързана c Nikon Microphot-FX микроскоп, чрез Optronics камера и е използувана за количествено определяне процента от ретросплениялната кора (retrosplenial cortex), зает от GFAP-положителни астроцити и МАС-I- и МАС П-положителна микроглия. Образът на имунореактивния срез е съхраняван във видео © буфер и е определян монохром-базирания праг за подбор и изчисление на тоталната pixel площ, заета от имунобелязани клетки. За всеки срез, ретросплениапната кора (RSC) е очертавана на ръка и е изчислявана тоталната pixel площ заета от RSC. Процентът астроцитоза е дефиниран като (фракцията от RSC, заета от GFAPреактивни астроцити) х 100. Подобно, процентът микроглиоза е определен като: (фракцията от RSC заета от МАС-I- или МНС llреактивна микроглия) х 100. За всички анализи на образи, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен от последователни 240μτη интервали, са определени количествено за всяко животно. Във
154 всички случаи, статусът от третиране на животните е неизвестен за наблюдаващия.
XIV: Ex vivo скрининг тест за активност на антитяло срещу амилоидни отлагания
Въведен е ex vivo тест, при който първични микроглиялни клетки с култивирани с нефиксирани криостаатни срези от PDAPP миши или човешки AD мозъци, за да се изследват ефектите на антитела върху очистване на плаки. Микроглиялни клетки са получени ф от мозъчна кора на неонатални DBA/2N мишки (1-3 дневни). Мозъчната кора е раздробена механично в HBSS’ (Hank’s Balanced Salt Solution, Sigma - Hank’s балансиран солеви разтвор) c 50 μοΛηΙ ДНКаза I (Sigma). Дисоциираните клетки са филтрувани със 100gm кпетъчена цедка (Falcon) и са центрофугирани на 1000 об.мин. за 5 минути. Утайката е ресуспендирана в среда за развитие (DMEM с високо глюкозно съдържание, 10% FBS, 25ng/ml rmGM-CSF), и клетките са посети с плътност от 2 мозъка за Т-75 пластмасови шишета за култивиране (матраци). След 7-9 дни, шишетата са завъртани в орбитална клатачка при 200 об.мин. за 2 часа на 37°С. ф Клетъчната суспензия е центрофугирана на 1000 об.мин. и е суспендирана в средата за тестиране.
10-μτη криостатни срези от PDAPP миши или човешки AD мозъци (post mortem интервал < 3 часа) са монтирани размразени върху покрити с полилизин кръгли покривни стъкла и са поставени в ямките на 24-ямкови платки за култивирани. Покривните стъкла са измити двукратно със среда за тестиране, състояща се от H-SFM (Hybridoma-serum free medium Gibco BRL - Хибридома безсерумна среда) с 1% FBS, глутамин, пеницилин/стрептомицин и 5ng/ml rmGMCSF (R&D). Добавени са контролни или анти-Αβ антитела в 2х концентрацията (5pg/ml крайна) за един час. След това микро
155 глиялните клетки са посети с плътност 0.8 х 10s клетки/ml среда за тестиране. Културите са подържани във влажна среда в инкубатор (37°С, 5% СО2) да 24 часа или по-дълго. На края на инкубацията, културите са фиксирани с 4% параформалдехид и са пермеабилизирани с 0.1% Triton-X-100. Срезите са оцветени с биотинилирано 3D6 последвано от стрептавидин/СуЗ конюгат (Jackson ImmunoResearch). Екзогенните микроглиялни клетки са визуализирани с ядрено багрило (DAPI). Културите са наблюдавани с инвертен флуоресцентен микроскоп (Nikon, ТЕ300) и фото микроснимки са правени със SPOT дигитална камера като е изпозувана SPOT програма (Diagnostic instruments). За Western blot анализ, културите са екстрахирани с 8М урея, разредени са 1:1 в редуциращ трицин буфер и са нанесени на 16% трицин гел (Novex). След пренос върху имобилон, блотовете са третирани с 5цд/т1 раЬАр42, последвано от HRP-конюгирано анти-мишо антитяло и са проявени с ECL (Amersham).
Когато тестът е правен със срези от PDAPP мозъци в присъствието на антитяло 16С11 (едно от антителата срещу Αβ, което не е ефикасно in vivo), β-амилоидните плаки остават интактни и не се наблюдава фагоцитоза. За разлика от това, когато съседни срези са култивирани в присъствието на 10D5, амилоидните отлагания са изчезнали в обширни области и микроглиялните клетки показват многобройни фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ. Идентични резултати са получени с AD мозъчни срези, 10D5 индуцирана фагоцитоза на AD плаки, докато 16С11 е неефективно. В допълнение, тестът предоставя сравними резултати, когато е проведен с миши или човешки микроглиялни клетки и с миши или заешки, или от бозайници антитела срещу Αβ.
Таблица 16 показва, че резултати получени с няколко антитела срещу Αβ, като сравнява тяхната способност да индуцират
156 фагоцитоза в in vivo тест и да редуцират in vivo натрупване на плаки в проучвания с пасивен пренос. Въпреки че 16С11 и 21F12 се свързват с агрегиран синтетичен Αβ пептид с висока активност, тези антитела са неспособни да реагират с β-амилоидни плаки в нефиксирани мозъчни срези, не могат да предизвикат фагоцитоза в ex vivo тест и не са ефикасни in vivo. 10D5, 3D6 и поликлонално антитяло срещу Αβ са активни и с трите измервания. 22С8 антитялото се свързва посилно с форма аналог на природен Αβ, в която аспаргинова киселина в позиции 1 и 7 е заменена с изо-аспаргинова киселина. Тези резултати показват, че ефикасността in vivo се дължи на директно антитяло медиирано очистване на плаките в централната нервна система и че ex vivo тестът е предсказващ за in vivo ефикасност.
Същият тест е използуван за тестиране очистването от едно антитяло срещу фрагмент от синуклеин означен като NAC. Показано е, че синуклеин е свързан с амилоидна плака белтък. Антитяло срещу NAC е поставяно в контакт с проба от мозъчна тъкан, съдържаща амилоидни плаки, микроглиялни клетки, както преди. Използуван е заешки серум като контрола. Последващ контрол показва подчертано намаление броя и големината на плаките, което е показателно за очистваща активност на антитялото.
157
Таблица 16 Тестът ex vivo е предсказващ за in vivo ефикасност
Антитяло Изотип | Афинитет за агрегиран Αβ(ρΜ) | Свързване с β-амилоидни плаки | Ex vivo ефикасност | In vivo ефик. | |
Моноклонално | |||||
3D6 | lgG2b | 470 | + | + | + |
10D5 | lgG1 | 43 | + | + | + |
16С11 | lgG1 | 90 | - | - | - |
21F12 | lgG2a | 500 | - | - | - |
ТМ2а | lgG1 | - | - | - | - |
Поликлонално | |||||
1-42 | МИКС | 600 | + | + | + |
Използувана е конфокална мокроскопия за потвърждение, че Αβ е интернализиран по време на ex vivo теста. В присъствие на контролни антитела, екзогенните микроглиялни клетки остават в конфокална равнина над тъканта, няма фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ и плаките се запазват интактни в среза. В присъствие на 10D5, почти целият материал от плаките се съдържа в мехурчета в екзогенните микроглиялни клетки. За определяне съдбата на интернализпрания пептид, 10D5 третирани култури са екстрахирани с 8М урея на различни срокове и са изследвани с Western blot анализ. На срок от един час, когато не се е появила още фагоцитоза, реакцията с поликлонално антитяло срещу Αβ разкрива силна 4 kD ивица (съответствуваща на Αβ пептида). Αβ имунореактивността намалява на първия ден и отсъствува на 3-ия ден. Така антитяломедиираната фагоцитоза на Αβ води до неговата деградация.
За определяне дали фагоцитоза в ex vivo тест е Fcмедиирана, са изготвени F(ab’)2 фрагменти на анти-Αβ антитяло 3D6. Въпреки че F(ab’)2 фрагменти запазват цялата си активност да реагират с плаки, те са неспособни да индуцират фагоцитоза с микроглиялни клетки. В допълнение, фагоцитоза с цяло антитяло
158 може да бъде блокирана с реагент срещу миши Fc рецептори (антиCD16/32). Тази данни показват, че in vivo очистване на Αβ се появява чрез FC-рецептор медиирана фагоцитоза.
XV: Преминаване на антитела през кръвно-мозъчната бариера
Описаният тук експеримент е проведен за да предостави информация относно способността на антитела да преминават в мозъка след интравенозно инжектиране и да предостави средства за измерване концентрацията на антитялото, достигнало мозъка след интарвенозно инжектиране в периферна тъкан на нормални или PDAPP мишки. Такива измервания са полезни за предсказване и определяне на ефективните дозировки.
PDAPP или контролни нормални мишки са перфузирани с 0.9% NaCI. Мозъчни области (хипокамп или мозъчна кора) са сецирани и бързо замразени. Мозъчната тъкан е хомогенизирана в 0.1% TritonХ-100 + протеазни инхибитори. Определян е имуноглобулин в екстракти чрез ELISA. Fab’2 кози анти-миши IgG са нанесени да покрият RIA платка като захващащ реагент. Серумът или мозъчните екстракти са инкубирани за 1 час. Изотипите са открити с анти-миши lgG1-HRP или lgG2a-HRP или lgG2b-HRP (Caltag). Антитела, независимо от изотипа, са налице в централната нервна система в концентрация, която е 1:1000, от тази открита в кръвта. Например, когато концентрацията на lgG1 е три пъти по-голяма от тази на lgG2a в кръвта, тя е също три пъти lgG2a в мозъка, и двете присъствуващи при 0.1% от съответните техни нива в кръвта. Този резултат е наблюдаван в трансгенните и нетрансгенни мишки - така че PDAPP мишките нямат уникално пропускане на кръвно-мозъчната бариера.
Въпреки че горното изобретение е описано подробно с цел яснота и разбиране, очевидно е, че някои модификации могат да
159 бъдат приложени в рамките на обсега на приложените претенции. Всички публикации и патентни документи цитирани тук, са включени чрез цитат в тяхната цялост за всякакви цели, в същата степен както ако всеки от тях е индивидуално представен.
Claims (57)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Фармацевтичен състав, съдържащ агент, който е ефективен да индуцира имунен отговор срещу амилоиден компонент у пациент и фармацевтичен ексципиент.
- 2. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където амилоидният компонент е фибрилен пептид или белтък.
- 3. Фармацевтичен състав съгласно претенция 2, където амилоидният компонент е производен на фибрилен прекурсорен белтък, подбран от група, състояща се от белтъци или пептиди, състоящи се от Серумен амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мугантни белтъци, белтъчни фрагменти и техни протеолитични пептиди.
- 4. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, където споменатият агент индуцира имунен отговор, насочен срещу неоепитоп, образуван от споменатия фибрилен белтък или пептид, с оглед фибрилен прекурсорен белтък.
- 5. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, където споменатият амилоиден компонент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AApoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, ΑΒ2Μ, AScr, Acai, ΑΙΑΡΡ и синуклеин-NAC фрагмент.мшм·161
- 6. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, където споменатият агент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, ААроА1, Agel, Acys, Αβ, АВ2М, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
- 7. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където споменатият състав съдържа агент, който е ефективен да индуцира имуногенен отговор срещу най-малко два различни амилоидни компоненти.
- 8. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където споменатият агент е пептид, свързан с носител белтък.
- 9. Фармацевтичен състав съгласно всяка от претенции 1 до 8, където съставът включва адювант.
- 10. Фармацевтичен състав съгласно претенция 9, където споменатият адювант е подбран от група състояща се от QS21, монофосфорил липид, alum и адювант на Freund.
- 11. Метод за профилактика и лечение на нарушение, характеризиращо се с амилоидно отлагане у бозайник, характеризиращ се с това, че се въвежда у индивид дозировка от агент, който е ефективен да произведе имунен отговор срещу амилоиден компонент, характерен за споменатото нарушение.
- 12. Метод съгласно претенция 11, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен белтък или пептид.162
- 13. Метод съгласно претенция 12, където споменатият имунен отговор е насочен срещу фибрилен компонент, произхождащ от прекурсорен белтък, подбран от група състояща се от Серумен амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β прекурсорен протеин (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен белтък (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мутантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
- 14. Метод съгласно претенция 13, където споменатият агент индуцира имунен отговор, насочен срещу неоепитоп, образуван със споменатия амилоиден компонент, с оглед на споменатия прекурсорен белтък.
- 15. Метод съгласно претенция 13, където споменатият амилоиден компонент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, Ab2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеинNAC фрагмент.
- 16. Метод съгласно претенция 15, където споменатият агент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Agel, Acys, Αβ, АВ2М, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
- 17. Метод съгласно претенция 11, където споменатият агент е ефективен да индуцира имуногенен отговор срещу най-малко два различни амилоидни компоненти.163
- 18. Метод съгласно претенция 17, където споменатото приложение включва въвеждане на най-малко два амилоидни фибрилни компонента.
- 19. Метод съгласно претенция 11, където споменатият агент е пептид, свързан с носител белтък.
- 20. Метод съгласно всяка от претенции 11-19, където споменатото приложение по-нататък включва адювант.
- 21. Метод съгласно претенция 20, където споменатият адювант е подбран от група състояща се от QS21, монофосфорил липид, alum и адювант на Freund.
- 22. Метод съгласно претенция 11, където споменатият имуногенен отговор се характеризира със серумен титър най-малко 1:1000, по отношение на споменатия амилоиден компонент.
- 23. Метод съгласно претенция 22, където споменатият серумен титър е най-малко 1:5000, по отношение на споменатия фибрилен компонент.
- 24. Метод съгласно претенция 11, където споменатият имунологичен отговор се характеризира със серумно количество имунореактивност, съответствуващо на по-високо около четири пъти ниво на серумна имунореакгивност, спрямо измереното преди третирането в контролна серумна проба.164
- 25. Метод съгласно претенция 24, където споменатото серумно количество имунореактивност е измерено при серумно разреждане от около 1:100.
- 26. Метод за определяне прогнозата за пациент, подложен на третиране за амилоидно нарушение, характеризиращ се с това, че се измерва серумното количество имунореактивност на пациент срещу подбран амилоиден компонент, където серумното количество имунореактивност на пациента, което е най-малко четири пъти над изходното контролно ниво на серумна имунореактивност, е показателно за прогноза на подобрено състояние по отношение на споменатото нарушение.
- 27. Метод съгласно претенция 26, където серумното количество имунореактивност на пациент срещу подбран амилоиден компонент, е характеризирано със серумен титър от най-малко около 1:1000.
- 28. Метод съгласно претенция 27, където споменатото серумно количество имунореактивност на пациент срещу споменатия подбран амилоиден компонент, се характеризира със серумен титър от най-малко 1:5000.
- 29. Метод за профилактика или лечение на заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане у пациент, характеризиращ се с това, че на споменатия пациент се въвежда ефективна дозировка антитяло или антитяло фрагмент, който специфично се свързва с амилоиден компонент, присъствуващ в споменатото отлагане.165
- 30. Метод съгласно претенция 29, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен компонент.
- 31. Метод съгласно претенция 30, където споменатото антитяло или антитяло фрагмент, се свързва с епитоп на споменатия фибрилен компонент.
- 32. Метод съгласно претенция 31, където антитялото или антитяло фрагментът се свързва специфично със споменатия фибрилен компонент, без да се свързва с прекурсор на споменатия фибрилен компонент.
- 33. Метод съгласно претенция 30, където антитялото е човешко антитяло срещу споменатия фибрилен компонент, изготвено от В клетки на човек, имунизиран с епитоп на фибрилен компонент.
- 34. Метод съгласно претенция 30, където споменатият фибрилен компонент е производно на прекурсорен белтък, подбран от групата състояща се от Серум Амилоид А протеин (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Вета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоид полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мугантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
- 35. Метод съгласно претенция 34, където споменатият амилоид фибрилен компонент е подбран от групата състояща се от АА, AL,166ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, AB2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
- 36. Метод съгласно претенция 29, където споменатото приложение включва въвеждане на антитела, които се свързват с най-малко два фибрилни компоненти.
- 37. Метод съгласно претенция 29, където споменатата ефективна дозировка се характеризира с ниво на серумното количество имунореактивност у пациента, срещу споменатия амилоиден компонент, което е най-малко около четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу споменатия компонент, измерено преди третирането в контролна серумна проба.
- 38. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагмент е въведен с носител като фармацевтичен състав.
- 39. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагментът е въведен интраперитонеално, орално, подкожно, интрамускулно, интраназално, топично или интравенозно.
- 40. Метод съгласно претенция 29, където антитялото е приложено чрез въвеждане у пациент на полинуклеотид, кодиращ най-малко една антитяло верига и където полинуклеотидът е експресиран да произвежда антитяло веригата у пациента.
- 41. Метод съгласно претенция 40, където полинуклеотидът кодира тежка и лека вериги на антитялото, който полинуклеотид е експресиран да произвежда тежката и леката вериги у пациента.167
- 42. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагментът е въведено в множествени дозировки за един период от най-малко шест месеца.
- 43. Метод съгласно претенция 29, където антитялото е въведено като състав със забавено освобождаване.
- 44. Фармацевтичен състав за профилактика или лечение на заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане у пациент, съдържащ ефективна дозировка от антитяло или антитяло фрагмент, който се свързва специфично с ами лой ден компонент, присъствуващ в споменатото отлагане.
- 45. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен компонент.
- 46. Фармацевтичен състав съгласно претенция 45, където споменатото антитяло се свързва с епитоп на споменатия фибрилен компонент.
- 47. Фармацевтичен състав съгласно претенция 46, където антитялото специфично се свързва със споменатия фибрилен компонент, без да се свързва с прекурсор на споменатия фибрилен компонент.
- 48. Фармацевтичен състав съгласно претенция 46, където антитялото е човешко антитяло срещу споменатия компонент, изготвено от В клетки от човек, имунизиран с епитоп на фибрилен компонент.168
- 49. Фармацевтичен състав съгласно претенция 45, където споменатият амилоид фибрилен компонент произхожда от прекурсорен белтък, подбран от група състояща се от Серумен Амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоид пептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мутантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
- 50. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, където споменатият фибрилен компонент е подбран от групата, състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, ΑΒ2Μ, AScr, Acai, ΑΙΑΡΡ и синуклеин-NAC компонент.
- 51. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият състав включва антитела или антитяло фрагменти, които се свързват с най-малко два амилоид фибрилни компоненти.Q
- 52. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатата ефективна дозировка се характеризира с количество антитяло или антитяло фрагмент, ефективно да произвежда у пациент ниво на серумна имунореактивност срещу споменатия амилоиден компонент, което е най-малко четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу споменатия компонент, измерено преди третиране в контролна серумна проба.
- 53. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав включва носител.169
- 54. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав е комбиниран за приложение интраперитонеално, орално, подкожно, интрамускулно, интраназално, топично или интравенозно.
- 55. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав включва полинуклеотид, кодиращ наймалко една антитяло верига, ефективен да експресира антитяло веригата у пациента.
- 56. Фармацевтичен състав съгласно претенция 55, където полинуклеотидът кодира тежки и леки вериги на антитялото, който полинуклеотид е способен на експресия за да произвежда тежките и леките вериги у пациенти.
- 57. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият фармацевтичен състав е комбиниран като препарат със забавено освобождаване.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13701099P | 1999-06-01 | 1999-06-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG106140A true BG106140A (bg) | 2002-08-30 |
BG65756B1 BG65756B1 (bg) | 2009-10-30 |
Family
ID=22475417
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG106140A BG65756B1 (bg) | 1999-06-01 | 2001-11-23 | Фармацевтичен състав, използван за профилактика, и лечение на амилоидогенно заболяване |
Country Status (31)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US8124081B2 (bg) |
EP (2) | EP2364719B1 (bg) |
KR (3) | KR101142772B1 (bg) |
CN (2) | CN101091795A (bg) |
AT (1) | ATE495755T1 (bg) |
AU (1) | AU5316300A (bg) |
BG (1) | BG65756B1 (bg) |
BR (1) | BR0011103A (bg) |
CA (1) | CA2375104C (bg) |
CY (1) | CY1111639T1 (bg) |
CZ (1) | CZ302971B6 (bg) |
DE (1) | DE60045550D1 (bg) |
EA (1) | EA200101250A1 (bg) |
EE (1) | EE05492B1 (bg) |
ES (2) | ES2445799T3 (bg) |
HK (2) | HK1045117B (bg) |
HR (1) | HRP20010893A2 (bg) |
HU (1) | HU229986B1 (bg) |
IL (3) | IL146563A0 (bg) |
IS (1) | IS2925B (bg) |
MX (1) | MXPA01012293A (bg) |
NO (1) | NO20015758L (bg) |
NZ (2) | NZ587223A (bg) |
PL (1) | PL202217B1 (bg) |
PT (1) | PT1185296E (bg) |
SG (2) | SG147274A1 (bg) |
SK (1) | SK288207B6 (bg) |
TR (1) | TR200103469T2 (bg) |
UA (1) | UA81216C2 (bg) |
WO (1) | WO2000072876A2 (bg) |
ZA (1) | ZA200109662B (bg) |
Families Citing this family (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9706957D0 (en) | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
US8173127B2 (en) * | 1997-04-09 | 2012-05-08 | Intellect Neurosciences, Inc. | Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof |
US6743427B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US7964192B1 (en) * | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US20030147882A1 (en) | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
CA2362204C (en) | 1999-02-17 | 2011-11-08 | John Cooper Cox | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
DE60031792T2 (de) | 1999-12-08 | 2007-02-22 | Intellect Neurosciences, Inc. | Schimärische amyloid-beta peptide |
GB0000891D0 (en) * | 2000-01-14 | 2000-03-08 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
IL151378A0 (en) | 2000-02-24 | 2003-04-10 | Univ Washington | Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide |
AU2001253158A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | University Of Tennessee Research Corporation | Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis |
AU2001268005A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-21 | Lars Lannfelt | Prevention and treatment of alzheimer's disease |
AU2007200047B2 (en) * | 2000-07-07 | 2009-11-26 | Bioarctic Neuroscience Ab | Prevention and treatment of Alzheimer's disease |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
WO2002088307A2 (en) | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies |
DE60230736D1 (de) | 2001-04-30 | 2009-02-26 | Lilly Co Eli | HUMANISIERTE ANTIKÖRPER DIE DAS BETA-AMYLOID PEPTID ERKENNEN& x9; |
US6906169B2 (en) * | 2001-05-25 | 2005-06-14 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide |
EP1944040B1 (en) | 2001-08-17 | 2012-08-01 | Washington University | Assay method for Alzheimer's disease |
US20050227941A1 (en) * | 2001-12-17 | 2005-10-13 | Karen Duff | Sequestration of ass in the periphery in the absence of immunomodulating agent as a therapeutic approach for the treatment or prevention of beta-amyloid related diseases |
US20060210555A1 (en) | 2001-12-21 | 2006-09-21 | Antigenics, Inc. | Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof |
MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
WO2004006861A2 (en) * | 2002-07-17 | 2004-01-22 | Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. | Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease |
US20070213512A1 (en) * | 2002-10-01 | 2007-09-13 | Krafft Grant A | Amyloid beta peptide analogs and assemblies thereof |
US20080014194A1 (en) | 2003-10-31 | 2008-01-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease |
TW200509968A (en) * | 2002-11-01 | 2005-03-16 | Elan Pharm Inc | Prevention and treatment of synucleinopathic disease |
US8697082B2 (en) | 2002-11-01 | 2014-04-15 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
WO2008103472A2 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US9034337B2 (en) | 2003-10-31 | 2015-05-19 | Prothena Biosciences Limited | Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US8506959B2 (en) | 2002-11-01 | 2013-08-13 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
DE602004027348D1 (de) | 2003-02-10 | 2010-07-08 | Applied Molecular Evolution | Abeta-bindende moleküle |
US8663650B2 (en) | 2003-02-21 | 2014-03-04 | Ac Immune Sa | Methods and compositions comprising supramolecular constructs |
ES2246177B1 (es) * | 2003-05-08 | 2007-03-01 | Universidad De Zaragoza. | Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas. |
US7358331B2 (en) | 2003-05-19 | 2008-04-15 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease |
JP4820291B2 (ja) | 2003-05-19 | 2011-11-24 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | レヴィー小体病におけるαシヌクレインの切断断片 |
TWI374893B (en) | 2003-05-30 | 2012-10-21 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US7807171B2 (en) | 2003-07-25 | 2010-10-05 | Ac Immune Sa | Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers |
WO2005047860A2 (en) | 2003-11-08 | 2005-05-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies to alpha-synuclein |
WO2005080435A1 (ja) | 2004-02-20 | 2005-09-01 | Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. | モノクローナル抗体およびその利用 |
SE0401601D0 (sv) | 2004-06-21 | 2004-06-21 | Bioarctic Neuroscience Ab | Protofibril specific antibodies and uses thereof |
JP5042828B2 (ja) | 2004-07-30 | 2012-10-03 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられる抗体、および該抗体を用いる方法 |
MX2007001679A (es) | 2004-08-09 | 2007-05-23 | Elan Pharm Inc | Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica. |
AR052051A1 (es) | 2004-12-15 | 2007-02-28 | Neuralab Ltd | Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion |
GT200600031A (es) | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
NZ629387A (en) * | 2005-11-30 | 2016-01-29 | Abbvie Inc | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
WO2007064972A2 (en) | 2005-11-30 | 2007-06-07 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
ES2524984T3 (es) | 2005-11-30 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Anticuerpos anti-globulómero a?, porciones de unión a antígeno de estos, hibridomas correspondientes, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, métodos para producir dichos anticuerpos, composiciones que comprenden dichos anticuerpos, usos de dichos anticuerpos, y métodos para usar dichos anticuerpos |
KR101413615B1 (ko) | 2006-03-23 | 2014-07-18 | 바이오악틱 뉴로사이언스 에이비 | 인간 프로토피브릴에 선택적인 개선된 항체 및 이의 용도 |
WO2009017467A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic diseases |
US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
EP2434288B1 (en) * | 2006-09-25 | 2014-07-30 | Universiteit Maastricht | Means and methods for diagnosing and/or treating a subject at risk of developing heart failure |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
IL199534A (en) | 2007-01-05 | 2013-01-31 | Univ Zuerich | An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses. |
CN103408661B (zh) | 2007-01-05 | 2016-04-06 | 苏黎世大学 | 提供疾患特异性结合分子和靶的方法 |
US8147833B2 (en) | 2007-02-23 | 2012-04-03 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
EP3067066B1 (en) | 2007-02-23 | 2019-03-27 | Prothena Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US8895004B2 (en) | 2007-02-27 | 2014-11-25 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
EP2149584B1 (en) * | 2007-04-20 | 2017-12-13 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for enhancing immune response with peptide |
EP2175879A4 (en) * | 2007-08-09 | 2010-09-22 | Sylvan Pharmaceuticals Pty Ltd | TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH PRION PROTEIN |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
ES2709048T3 (es) | 2008-04-29 | 2019-04-15 | Bioarctic Ab | Anticuerpos y vacunas para su uso en métodos terapéuticos y diagnósticos para trastornos relacionados con alfasinucleína |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
MX2011006422A (es) | 2008-12-19 | 2011-09-15 | Panima Pharmaceuticals Ag | Autoanticuerpos humanos anti-alfa-sinucleina. |
WO2011104696A1 (en) | 2010-02-26 | 2011-09-01 | Bioarctic Neuroscience Ab | Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies |
KR20110111594A (ko) * | 2010-04-05 | 2011-10-12 | 서울대학교산학협력단 | 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법, 이를 이용한 하이드로젤의 제조 방법 및 그 이용 방법 |
JP2013523182A (ja) | 2010-04-15 | 2013-06-17 | アボット・ラボラトリーズ | アミロイドベータ結合タンパク質 |
CN103037891A (zh) * | 2010-06-03 | 2013-04-10 | 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 | 治疗糖尿病的方法和能够治疗糖尿病的组合物 |
CN102311499A (zh) * | 2010-07-09 | 2012-01-11 | 博生吉医药科技(苏州)有限公司 | 一种癌症治疗用人源化单克隆抗体及其制备及应用 |
EP2603233A1 (en) | 2010-08-12 | 2013-06-19 | AC Immune S.A. | Vaccine engineering |
US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
AR083561A1 (es) | 2010-10-26 | 2013-03-06 | Ac Immune Sa | Preparacion de una construccion antigenica |
JP6048845B2 (ja) * | 2011-06-01 | 2016-12-21 | シャモン ユニヴァーシティー | ジフテリア毒素の無毒性突然変異体crm197又はその断片を含む融合タンパク質 |
PL2723379T3 (pl) | 2011-06-23 | 2019-05-31 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Cząsteczki wiążące przeciwko alfa-synukleinie |
PT2579042E (pt) * | 2011-10-04 | 2014-09-09 | Affiris Ag | Método para detecção de anticorpos específicos para a numa amostra biológica. |
MA53887A (fr) | 2014-07-10 | 2021-10-27 | Bioarctic Ab | Anticorps à liaison protofibrille a-bêta améliorée |
CN105616405B (zh) * | 2014-11-05 | 2021-05-07 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病的药物中的应用 |
MA41115A (fr) | 2014-12-02 | 2017-10-10 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer |
US9879080B2 (en) | 2015-01-28 | 2018-01-30 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
US10633433B2 (en) | 2015-01-28 | 2020-04-28 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
US10464999B2 (en) | 2015-01-28 | 2019-11-05 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
EP3070096A1 (en) * | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Ludwig-Maximilians-Universität München | A peptide or collection of peptides derived from amyloid precursor protein |
CA3004494A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | The University Of British Columiba | Epitopes in amyloid beta mid-region and conformationally-selective antibodies thereto |
CA3004498A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Neil R. Cashman | Amyloid beta epitopes and antibodies thereto |
JP7065516B2 (ja) | 2015-11-09 | 2022-05-12 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | アミロイドベータのn末端エピトープおよびそれに対する立体配座選択的抗体 |
KR102603963B1 (ko) * | 2015-11-24 | 2023-11-20 | 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법 |
US20180125920A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-10 | The University Of British Columbia | Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions |
US11530257B2 (en) | 2017-06-29 | 2022-12-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases |
US11382974B2 (en) * | 2017-08-01 | 2022-07-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods and compositions for treatment of amyloid deposition diseases |
MA49947B1 (fr) | 2017-08-22 | 2023-03-31 | Biogen Ma Inc | Compositions pharmaceutiques contenant des anticorps anti-bêta-amyloïdes |
KR20200074956A (ko) | 2017-10-06 | 2020-06-25 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 항-트랜스타이레틴 항체 |
CU20200042A7 (es) | 2017-11-29 | 2021-03-11 | Prothena Biosciences Ltd | Formulación liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra la transtirretina |
GB201720975D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Ucb Biopharma Sprl | Anti-alpha synuclein antibodies |
GB201720970D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
KR102135130B1 (ko) * | 2019-02-15 | 2020-07-17 | 충북대학교 산학협력단 | 트랜스타이레틴 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 |
CN116528888A (zh) * | 2020-10-30 | 2023-08-01 | 拉什大学医学中心 | 用于治疗阿尔兹海默症的鼻内免疫疗法 |
CN115475247B (zh) * | 2021-06-16 | 2024-02-20 | 厦门大学 | β2-微球蛋白或其抑制剂的制药用途 |
WO2023099788A1 (en) * | 2021-12-03 | 2023-06-08 | Neurimmune Ag | Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor |
TWI824398B (zh) * | 2022-01-27 | 2023-12-01 | 慈濟學校財團法人慈濟大學 | 一種肌動蛋白重組調節物之抑制劑用於製備治療睡眠剝奪引起之記憶退化之藥物之用途 |
Family Cites Families (203)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US573547A (en) * | 1896-12-22 | smith | ||
US14692A (en) * | 1856-04-15 | Improved diaphragm fluid-meter | ||
US73655A (en) * | 1868-01-21 | Improvement in safety-pockets | ||
CH652145A5 (de) | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
US4443427A (en) * | 1982-06-21 | 1984-04-17 | Sidney Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibody |
US4634666A (en) | 1984-01-06 | 1987-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human-murine hybridoma fusion partner |
US5208036A (en) | 1985-01-07 | 1993-05-04 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4666829A (en) | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
DE3687751T2 (de) * | 1985-09-19 | 1993-05-27 | Toray Industries | Kolonne zum entfernen von beta-2-mikroglobulin. |
US4641473A (en) * | 1985-12-23 | 1987-02-10 | Trezza Ronald F | Clip construction for wall arrangement |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US5231170A (en) | 1986-08-27 | 1993-07-27 | Paul Averback | Antibodies to dense microspheres |
GB8625435D0 (en) * | 1986-10-23 | 1986-11-26 | Erba Farmitalia | Human apolipoprotein ai |
US5187153A (en) * | 1986-11-17 | 1993-02-16 | Scios Nova Inc. | Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives |
US5220013A (en) | 1986-11-17 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease |
US5290762A (en) * | 1986-12-24 | 1994-03-01 | John Lezdey | Treatment of inflammation |
DE3702789A1 (de) | 1987-01-30 | 1988-08-18 | Bayer Ag | Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins |
EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
GB8720115D0 (en) * | 1987-08-26 | 1987-09-30 | Cooper G J S | Treatment of diabetes mellitus |
US4883666A (en) * | 1987-04-29 | 1989-11-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US5583112A (en) | 1987-05-29 | 1996-12-10 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin-antigen conjugates and the use thereof |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
EP0666080B1 (en) | 1987-06-24 | 2004-01-21 | Brigham & Women's Hospital | Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens |
US5869054A (en) * | 1987-06-24 | 1999-02-09 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens |
US5571500A (en) | 1987-06-24 | 1996-11-05 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens |
US5641474A (en) | 1987-06-24 | 1997-06-24 | Autoimmune, Inc. | Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5571499A (en) | 1987-06-24 | 1996-11-05 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5849298A (en) | 1987-06-24 | 1998-12-15 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin |
US5645820A (en) * | 1987-06-24 | 1997-07-08 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5004697A (en) * | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
CA1339014C (en) | 1987-10-08 | 1997-03-25 | Ronald E. Majocha | Antibodies to a4 amyloid peptide |
US5231000A (en) * | 1987-10-08 | 1993-07-27 | The Mclean Hospital | Antibodies to A4 amyloid peptide |
JP2518911B2 (ja) | 1987-10-23 | 1996-07-31 | 森永乳業株式会社 | c―fms癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法 |
US5266561A (en) * | 1988-01-11 | 1993-11-30 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of type 2 diabetes mellitus |
WO1989006689A1 (en) | 1988-01-13 | 1989-07-27 | The Mclean Hospital Corporation | Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene |
US5785973A (en) * | 1988-02-01 | 1998-07-28 | Praxis Biologics, Inc. | Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
DE68907045T2 (de) | 1989-01-17 | 1993-12-02 | Eniricerche Spa | Synthetische Peptide und deren Verwendung als allgemeine Träger für die Herstellung von immunogenischen Konjugaten, die für die Entwicklung von synthetischen Impfstoffen geeignet sind. |
WO1990012871A1 (en) | 1989-04-14 | 1990-11-01 | Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. | Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10 |
WO1990012870A1 (en) | 1989-04-14 | 1990-11-01 | Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. | Monoclonal antibody to amyloid peptide |
CA2017507C (en) | 1989-05-25 | 1996-11-12 | Gary Van Nest | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5262303A (en) | 1989-10-13 | 1993-11-16 | Trustees Of Boston University | Ligand/anti-ligand assays for adherent proteins |
IT1237764B (it) | 1989-11-10 | 1993-06-17 | Eniricerche Spa | Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici. |
US5633076A (en) | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
HUT61487A (en) | 1989-12-20 | 1993-01-28 | Brigham & Womens Hospital | Process for producing aerosol pharmaceutical composition comprising autoantigens |
EP1690934A3 (en) | 1990-01-12 | 2008-07-30 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
JPH05508621A (ja) | 1990-03-02 | 1993-12-02 | オートイミューン インク | 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患のダウンコントロール |
US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
EP0451700A1 (en) | 1990-04-10 | 1991-10-16 | Miles Inc. | Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
EP0527823A1 (en) * | 1990-04-24 | 1993-02-24 | The Regents Of The University Of California | Purification, detection and methods of use of protease nexin-2 |
JP2980677B2 (ja) | 1990-04-27 | 1999-11-22 | マクマイケル,ジョン | 不正常なアミロイドβタンパク質と関連する中枢神経系疾患状態の治療のための方法および組成物 |
US5753624A (en) | 1990-04-27 | 1998-05-19 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Materials and methods for treatment of plaquing disease |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
ES2109945T3 (es) | 1990-06-01 | 1998-02-01 | Chiron Corp | Composiciones y procedimientos para identificar moleculas biologicamente activas. |
US5593970A (en) | 1990-06-11 | 1997-01-14 | Biochem Pharma Inc. | Heterocyclic anthracycline analogs |
AU646877B2 (en) | 1990-06-15 | 1994-03-10 | Scios Nova Inc. | Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
ES2139598T3 (es) | 1990-07-10 | 2000-02-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica. |
US5780587A (en) | 1990-08-24 | 1998-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5789650A (en) | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
CA2089661C (en) | 1990-08-29 | 2007-04-03 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
NZ239643A (en) * | 1990-09-17 | 1996-05-28 | North American Vaccine Inc | Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group. |
EP0550675A1 (en) | 1990-09-28 | 1993-07-14 | Cephalon, Inc. | Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene |
DE69133516T2 (de) | 1990-10-15 | 2006-08-10 | Autoimmune, Inc., Pasadena | Behandlung von autoimmunkrankheiten durch orale verabreichung von autoantigenen |
DK0568575T4 (da) | 1991-01-21 | 2010-12-20 | Elan Pharm Inc | Test og model for Alzheimers sygdom |
US5192753A (en) * | 1991-04-23 | 1993-03-09 | Mcgeer Patrick L | Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia |
US5858657A (en) | 1992-05-15 | 1999-01-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5871907A (en) | 1991-05-15 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
DE69233254T2 (de) | 1991-06-14 | 2004-09-16 | Genentech, Inc., South San Francisco | Humanisierter Heregulin Antikörper |
US5672805A (en) | 1991-07-18 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein |
US5434050A (en) * | 1991-08-13 | 1995-07-18 | Regents Of The University Of Minnesota | Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease |
US5283185A (en) | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
DE69217497T2 (de) | 1991-09-18 | 1997-06-12 | Affymax Tech Nv | Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
WO1993014200A1 (en) | 1992-01-07 | 1993-07-22 | Tsi Corporation | Transgenic animal models for alzheimer's disease |
US5679348A (en) * | 1992-02-03 | 1997-10-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunotherapy for recurrent HSV infections |
EP0911036A3 (en) | 1992-02-11 | 2001-05-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Dual carrier immunogenic construct |
US5314813A (en) | 1992-02-19 | 1994-05-24 | Scripps Research Institute | Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines |
HU220357B (hu) | 1992-02-28 | 2001-12-28 | Autoimmune Inc. | Eljárás és készítmények autoimmun betegségek kezelésére bystander antigén alkalmazásával |
WO1993019180A1 (en) * | 1992-03-17 | 1993-09-30 | Ciba-Geigy Ag | Genetically engineered antibodies |
EP0561087B1 (en) | 1992-03-20 | 1999-08-04 | N.V. Innogenetics S.A. | Mutated form of the beta-amyloid precursor protein gene |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5441870A (en) | 1992-04-15 | 1995-08-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein |
US5604102A (en) | 1992-04-15 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors |
GB9209118D0 (en) | 1992-04-28 | 1992-06-10 | Sb 120 Amsterdam Bv | Vaccine compositions |
US5766846A (en) | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
US5837672A (en) | 1992-07-10 | 1998-11-17 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide |
WO1994001772A1 (en) | 1992-07-13 | 1994-01-20 | The Children's Medical Center Corporation | SCREEN FOR ALZHEIMER'S DISEASE THERAPEUTICS BASED ON β-AMYLOID PRODUCTION |
DK0652962T3 (da) | 1992-07-31 | 1999-08-23 | Medeva Holdings Bv | Ekspression af rekombinante fusionsproteiner i attenuerede bakterier |
US5958883A (en) * | 1992-09-23 | 1999-09-28 | Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology | Animal models of human amyloidoses |
IL107166A (en) | 1992-10-01 | 2000-10-31 | Univ Columbia | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5605811A (en) * | 1992-10-26 | 1997-02-25 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein |
DE69333144T2 (de) * | 1992-10-26 | 2004-05-19 | Elan Pharmaceuticals, Inc., San Francisco | Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffe der Produktion des beta-Amyloidpeptids |
WO1994012629A1 (en) | 1992-12-02 | 1994-06-09 | Baylor College Of Medicine | Episomal vectors for gene therapy |
JP3720353B2 (ja) | 1992-12-04 | 2005-11-24 | メディカル リサーチ カウンシル | 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 |
US5955317A (en) * | 1993-01-25 | 1999-09-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof |
US5750349A (en) | 1993-01-25 | 1998-05-12 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof |
CA2115900A1 (en) | 1993-02-22 | 1994-08-23 | Gerald W. Becker | Pharmaceutical screens and antibodies |
WO1994021292A1 (en) | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a |
US5643562A (en) * | 1993-03-29 | 1997-07-01 | Queen's University Of Kingston | Method for treating amyloidosis |
JP3795914B2 (ja) * | 1993-04-27 | 2006-07-12 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | ワクチン用免疫原性lhrhペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器 |
AU7043894A (en) | 1993-05-28 | 1994-12-20 | Miriam Hospital, The | Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits |
WO1995004151A2 (en) | 1993-07-30 | 1995-02-09 | Medeva Holdings B.V. | Vaccine compositions containing recombinant tetc-fusion proteins |
WO1995004990A1 (fr) * | 1993-08-10 | 1995-02-16 | Sony Corporation | Enregistreur-lecteur |
US5728385A (en) * | 1993-08-12 | 1998-03-17 | Classen Immunotherapies, Inc. | Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae |
JPH09501936A (ja) | 1993-08-26 | 1997-02-25 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組成物および装置 |
JP3926839B2 (ja) | 1993-09-14 | 2007-06-06 | エピミューン,インコーポレイティド | 万能dr−結合性ペプチドを用いる免疫応答の改変 |
US5446650A (en) | 1993-10-12 | 1995-08-29 | Tektronix, Inc. | Logic signal extraction |
EP0728215B1 (en) | 1993-10-20 | 2002-02-20 | Duke University | METHOD OF BINDING MATERIAL TO THE Beta-AMYLOID PEPTIDE |
NZ276860A (en) | 1993-11-02 | 1997-09-22 | Affymax Tech Nv | Apparatus and its use for synthesising diverse molecular products on substrates |
US5744368A (en) * | 1993-11-04 | 1998-04-28 | Research Foundation Of State University Of New York | Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR) |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US5434170A (en) | 1993-12-23 | 1995-07-18 | Andrulis Pharmaceuticals Corp. | Method for treating neurocognitive disorders |
US5914349A (en) | 1994-01-10 | 1999-06-22 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives |
US5877399A (en) | 1994-01-27 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University | Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease |
AU1909695A (en) * | 1994-01-27 | 1995-08-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease |
JPH09511492A (ja) | 1994-02-03 | 1997-11-18 | ザ ピコワー インスティテュート フォア メディカル リサーチ | アミロイドーシスの前進性グリコシル化終末産物仲介モジュレーション用組成物及び方法 |
CA2189634A1 (en) | 1994-05-06 | 1995-11-16 | John J. Baldwin | Combinatorial dihydrobenzopyran library |
WO1995031996A1 (en) * | 1994-05-25 | 1995-11-30 | Milkhaus Lab | Materials and methods for treatment of plaquing diseases |
US5505947A (en) | 1994-05-27 | 1996-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus |
US5622701A (en) * | 1994-06-14 | 1997-04-22 | Protein Design Labs, Inc. | Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin |
US5663046A (en) | 1994-06-22 | 1997-09-02 | Pharmacopeia, Inc. | Synthesis of combinatorial libraries |
US6417178B1 (en) * | 1994-07-19 | 2002-07-09 | University Of Pittsburgh | Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits |
US6114133A (en) | 1994-11-14 | 2000-09-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) |
US5688651A (en) | 1994-12-16 | 1997-11-18 | Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. | Prevention of protein aggregation |
US5786180A (en) * | 1995-02-14 | 1998-07-28 | Bayer Corporation | Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide |
ES2175083T3 (es) | 1995-03-14 | 2002-11-16 | Praecis Pharm Inc | Moduladores de la agregacion de amiloides. |
US7153510B1 (en) | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
DE19518147B4 (de) * | 1995-05-17 | 2013-09-05 | Günther Nath | UV-stabiler Flüssigkeitslichtleiter |
WO1996039176A1 (en) | 1995-06-05 | 1996-12-12 | Brigham & Women's Hospital | USE OF ORAL TOLERANCE TO SUPPRESS BOTH Th1 AND Th2 IMMUNE RESPONSES AND TO SUPPRESS ANTIBODY PRODUCTION |
US5948763A (en) * | 1995-06-07 | 1999-09-07 | New York University | Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits |
ES2174027T3 (es) * | 1995-06-30 | 2002-11-01 | American Cyanamid Co | Composiciones estables que contienen macrolidos y macrolidos combinados con unas vacunas. |
US5671500A (en) * | 1995-08-07 | 1997-09-30 | Balk; Brett | Overhead door spring shield system |
US5824322A (en) | 1995-08-21 | 1998-10-20 | Cytrx Corporation | Compositions and methods for growth promotion |
JP3713074B2 (ja) | 1995-08-30 | 2005-11-02 | 栄研化学株式会社 | 血清アミロイドaを認識するモノクローナル抗体 |
EP1416280A3 (en) * | 1995-09-14 | 2005-08-10 | The Regents of the University of California | Antibodies specific for native PrPsc |
US5750361A (en) | 1995-11-02 | 1998-05-12 | The Regents Of The University Of California | Formation and use of prion protein (PRP) complexes |
WO1997017614A1 (en) | 1995-11-10 | 1997-05-15 | Elan Corporation, Plc | Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same |
WO1997021728A1 (en) | 1995-12-12 | 1997-06-19 | Karolinska Innovations Ab | PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b) |
JPH09178743A (ja) | 1995-12-27 | 1997-07-11 | Oriental Yeast Co Ltd | 可溶性appの定量法 |
US6150091A (en) * | 1996-03-06 | 2000-11-21 | Baylor College Of Medicine | Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia |
KR100266924B1 (ko) | 1996-03-23 | 2000-09-15 | 무따이 마사히꼬 | 파상풍독소의 기능적 단편 항원 및 파상풍 백신 |
CA2183901A1 (en) | 1996-08-22 | 1998-02-23 | Johanna E. Bergmann | Targets for therapy and diagnosis of alzheimer's disease and down syndrome in humans |
US6057367A (en) | 1996-08-30 | 2000-05-02 | Duke University | Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses |
US6797495B2 (en) * | 1996-11-05 | 2004-09-28 | The Regents Of The University Of California | Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use |
DK1005368T3 (da) | 1997-03-10 | 2010-01-04 | Ottawa Hospital Res Inst | Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer |
ATE333266T1 (de) | 1997-03-31 | 2006-08-15 | Alza Corp | Diffusionsgesteuertes implantierbares verabreichungssystem |
US8173127B2 (en) * | 1997-04-09 | 2012-05-08 | Intellect Neurosciences, Inc. | Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof |
AU743827B2 (en) * | 1997-04-09 | 2002-02-07 | Intellect Neurosciences, Inc. | Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof |
US5972269A (en) * | 1997-06-17 | 1999-10-26 | Taurus International Manufacturing, Inc. | Method of forming cavities in ceramic or metal injection molded parts using a fugitive core |
WO1999000150A2 (en) | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Regents Of The University Of California | Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor |
IT1293511B1 (it) | 1997-07-30 | 1999-03-01 | Gentili Ist Spa | Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati |
WO1999006545A2 (en) | 1997-08-01 | 1999-02-11 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation |
US6004925A (en) * | 1997-09-29 | 1999-12-21 | J. L. Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
US6923964B1 (en) * | 1997-12-02 | 2005-08-02 | Neuralab Limited | Active immunization of AScr for prion disorders |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7964192B1 (en) * | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
EP1033998B1 (en) | 1997-12-03 | 2005-10-19 | Neuralab, Ltd. | Suppressing beta-amyloid-related changes in alzheimer's disease |
PL340736A1 (en) | 1997-12-03 | 2001-02-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Drug in the form of soft granules and method of obtaining same |
FR2777015B3 (fr) | 1998-02-23 | 2000-09-15 | Financ De Biotechnologie | Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives |
NO314086B1 (no) | 1998-05-08 | 2003-01-27 | Gemvax As | Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til |
WO1999060021A2 (en) | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Use of activated t cells, nervous system-specific antigens for treating disorders of the nevrous system |
CN1589903A (zh) | 1998-05-21 | 2005-03-09 | 田纳西州立大学研究基金会 | 用淀粉样蛋白抗体除去淀粉样蛋白的方法 |
US20030147882A1 (en) * | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
AU778270C (en) | 1999-01-19 | 2005-07-21 | Pharmacia & Upjohn Company | Gamma-irradiation sterilized polyethylene packaging |
WO2000043039A1 (en) * | 1999-01-22 | 2000-07-27 | Matthew John During | Vaccine-mediated treatment of neurological disorders |
UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
AR024558A1 (es) | 1999-06-01 | 2002-10-16 | Neuralab Ltd | Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas |
CA2376693C (en) | 1999-06-16 | 2013-09-10 | Boston Biomedical Research Institute | Immunological control of .beta.-amyloid levels in vivo |
US6294171B2 (en) | 1999-09-14 | 2001-09-25 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies |
KR20080059676A (ko) | 1999-11-29 | 2008-06-30 | 뉴로겜 인터내셔널 리미티드 | 알츠하이머 및 아밀로이드 관련 질병의 예방 및 치료용백신 |
DE60031792T2 (de) | 1999-12-08 | 2007-02-22 | Intellect Neurosciences, Inc. | Schimärische amyloid-beta peptide |
HUP0300067A3 (en) | 2000-02-21 | 2010-03-29 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
IL151378A0 (en) | 2000-02-24 | 2003-04-10 | Univ Washington | Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide |
AU2001253158A1 (en) | 2000-04-05 | 2001-10-23 | University Of Tennessee Research Corporation | Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis |
ES2238049T3 (es) * | 2000-05-22 | 2005-08-16 | New York University | Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides. |
AU2001268005A1 (en) | 2000-07-07 | 2002-01-21 | Lars Lannfelt | Prevention and treatment of alzheimer's disease |
US20020009445A1 (en) | 2000-07-12 | 2002-01-24 | Yansheng Du | Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease |
EP1172378A1 (en) | 2000-07-12 | 2002-01-16 | Richard Dr. Dodel | Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease |
IT1319277B1 (it) | 2000-10-24 | 2003-09-26 | Chiesi Farma Spa | Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer. |
IL139308A0 (en) | 2000-10-26 | 2001-11-25 | Marikovsky Moshe | Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis |
WO2002060920A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-08-08 | Board Of Regents, University Of Texas System | Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers |
US20020147882A1 (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-10 | Pua Khein Seng | Universal serial bus flash memory storage device |
DE60121729T2 (de) * | 2001-04-19 | 2007-11-29 | Dr. Hermann Schätzl | Prion Proteindimere für Impfungen |
WO2003000714A2 (en) | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Panacea Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases |
US6923954B2 (en) * | 2001-08-06 | 2005-08-02 | Kao Corporation | Conditioner |
AU2003254202A1 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-16 | Esperion Therapeutics, Inc. | Methods of using non-human animal apoliprotein a-i protein |
WO2010033861A1 (en) * | 2008-09-18 | 2010-03-25 | Cedars-Sinai Medical Center | Optical method for the detection of alzheimer's disease |
-
2000
- 2000-01-06 UA UA2001118223A patent/UA81216C2/uk unknown
- 2000-06-01 PL PL352717A patent/PL202217B1/pl unknown
- 2000-06-01 ES ES10182493.6T patent/ES2445799T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-01 EE EEP200100645A patent/EE05492B1/xx unknown
- 2000-06-01 NZ NZ587223A patent/NZ587223A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-01 KR KR1020107019313A patent/KR101142772B1/ko active IP Right Review Request
- 2000-06-01 AU AU53163/00A patent/AU5316300A/en not_active Abandoned
- 2000-06-01 EP EP10182493.6A patent/EP2364719B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-01 SG SG200401385-0A patent/SG147274A1/en unknown
- 2000-06-01 CN CNA2007101032809A patent/CN101091795A/zh active Pending
- 2000-06-01 WO PCT/US2000/015239 patent/WO2000072876A2/en active Application Filing
- 2000-06-01 CZ CZ20014154A patent/CZ302971B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-01 SK SK1718-2001A patent/SK288207B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-06-01 PT PT00938075T patent/PT1185296E/pt unknown
- 2000-06-01 TR TR2001/03469T patent/TR200103469T2/xx unknown
- 2000-06-01 CA CA2375104A patent/CA2375104C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-01 DE DE60045550T patent/DE60045550D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-01 AT AT00938075T patent/ATE495755T1/de active
- 2000-06-01 BR BR0011103-1A patent/BR0011103A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-01 NZ NZ556622A patent/NZ556622A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-01 KR KR1020017015508A patent/KR100930559B1/ko active IP Right Grant
- 2000-06-01 ES ES00938075T patent/ES2362029T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-01 CN CN00808358A patent/CN1377278A/zh active Pending
- 2000-06-01 KR KR1020097012115A patent/KR20090071673A/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-01 SG SG200401386-8A patent/SG147275A1/en unknown
- 2000-06-01 IL IL14656300A patent/IL146563A0/xx unknown
- 2000-06-01 MX MXPA01012293A patent/MXPA01012293A/es active IP Right Grant
- 2000-06-01 EA EA200101250A patent/EA200101250A1/ru unknown
- 2000-06-01 HU HU0201205A patent/HU229986B1/hu unknown
- 2000-06-01 EP EP00938075A patent/EP1185296B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-19 IL IL146563A patent/IL146563A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-21 IS IS6170A patent/IS2925B/is unknown
- 2001-11-23 BG BG106140A patent/BG65756B1/bg unknown
- 2001-11-23 ZA ZA200109662A patent/ZA200109662B/en unknown
- 2001-11-26 NO NO20015758A patent/NO20015758L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-11-30 HR HR20010893A patent/HRP20010893A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-09-12 HK HK02106697.1A patent/HK1045117B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-20 US US11/842,052 patent/US8124081B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-08-20 US US11/842,046 patent/US7977316B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-13 US US12/403,414 patent/US20090285822A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-30 US US12/414,347 patent/US20090285809A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-07-22 IL IL207166A patent/IL207166A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-11-05 US US12/940,750 patent/US20110064734A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-02-23 US US13/033,336 patent/US20110177066A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-23 US US13/033,418 patent/US20110182893A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-18 US US13/088,983 patent/US20110287049A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-19 CY CY20111100403T patent/CY1111639T1/el unknown
-
2012
- 2012-01-30 HK HK12100846.2A patent/HK1160392A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6936246B1 (en) | Passive immunization of ASCR for prion disorders | |
US7977316B2 (en) | Prevention and treatment of amyloidogenic diseases | |
US6923964B1 (en) | Active immunization of AScr for prion disorders | |
US6710226B1 (en) | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics | |
US7964192B1 (en) | Prevention and treatment of amyloidgenic disease | |
US8535673B2 (en) | Prevention and treatment of amyloidogenic disease | |
AU2005202644B2 (en) | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |