CN108697889B - 用于预防、减轻和/或治疗痴呆的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于通过使用例如在体内同步活化受试者的特定细胞类型(例如，快闪‑小清蛋白(FS‑PV)免疫反应性中间神经元)和/或大脑区域(例如，感觉皮层和/或海马体)的频率(例如，约40Hz)下发射刺激(例如，光、声音和/或触觉)的刺激发射装置在所述受试者的所述大脑中诱导同步γ振荡来预防、降低和治疗所述受试者中的淀粉样蛋白‑β(Aβ)肽、C末端片段‑β(β‑CTF)、β‑分泌酶(BACE1)、γ‑分泌酶、神经炎症和/或痴呆(例如，阿尔茨海默氏病或年龄相关衰退)中的至少一种的水平或变化中的至少一种的系统和方法。

Description

用于预防、减轻和/或治疗痴呆的系统和方法
政府资助声明
本发明根据美国国立卫生研究院授予的授权号RF1 AG047661在政府资助下进行。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2015年11月 24日提交的标题为“System and Methods for Preventing,Mitigating, and/or Treating Dementia”的美国申请号62/259,187的优先权益，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆的系统和方法。更具体地，本公开涉及用于将同步γ振荡引入受试者的至少一个大脑区域中的系统和方法。
背景
阿尔茨海默氏病(AD)是特征在于记忆、定向和推理衰退的进行性神经退化性疾病。它是世界上痴呆的最常见形式，影响大约八分之一的年龄超过65的人，并且是美国第六种主要死亡原因。估计这种进行性神经退化性病症的患病率在接下来的十年中增加40％。
在组织病理学上，AD可通过包含淀粉样蛋白-β(Aβ)肽的淀粉样蛋白斑的积聚和由tau蛋白制成的神经纤维缠结表征。Aβ肽是36-43 个氨基酸蛋白，其正常生理功能未被识别。Aβ肽通过β-分泌酶1 (BACE1)和γ-分泌酶进行的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的顺序蛋白水解裂解形成。C末端片段β(β-CTF)是在通过BACE1进行的APP的淀粉样蛋白生成裂解过程中产生的APP衍生物并且因此是Aβ肽产生的另一种指示物。在正常状态下，可溶性Aβ肽通过神经元产生和分泌并且随后经由脑脊髓液(CSF)通路从大脑清除。然而，在患有AD 的受试者中，Aβ肽似乎聚集成更高级的物质而以浓度依赖性方式形成可溶性低聚物和不可溶性斑。此聚集可能引发许多神经毒性事件，包括紊乱的大脑代谢、神经炎症、降低的功能连接性、突触和神经元损失、和/或NFT的形成。
已证明Aβ浓度与神经元活性之间的基本关系。首先，使用河豚毒素处理从过表达APP的转基因(Tg)小鼠制备的器官型海马趾切片降低神经元活性并且随后降低Aβ水平。然后，在使用木防己苦毒素处理之后观察到相反作用-增加的神经元活性。还使用神经元活性证明Aβ肽浓度和体内最终斑沉积的动态调控。在人类AD患者中，神经成像示出最严重的斑沉积可能与最连续地具有活性的大脑区域一致，这称为“缺省模式网络”。
当前AD没有治愈方法，并且治疗选项不抑制AD的病理学进程，主要是缓和性的，并且/或者可能具有多种令人担忧的副作用。例如，靶向Aβ肽和/或其前体的预防性和/或治疗性策略(例如，Aβ免疫疗法以及β-分泌酶和γ-分泌酶的抑制)在临床试验中在减少AD病变方面是毒性的和/或无效的。涉及淀粉样蛋白β疫苗(例如，bapineuzumab) 的临床试验由于缺乏认知益处而失败。γ分泌酶抑制剂(例如， semagacestat)因为使受试者的认知缺陷恶化而使临床试验失败。甚至现有的药品像乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐和利凡斯的明)和 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)-受体拮抗剂(例如，美金刚胺)仅显示出轻微的认知益处。
概述
AD的关键微观病理学标志是存在淀粉样蛋白斑、NFT、和广泛的神经元损失。此神经元侵害的积聚在一个时间长度上发生并且诱导大脑中的宏观电路功能障碍，具体地是在记忆和注意力任务过程中的γ功率缺陷。这些γ振荡(例如，约20Hz至约100Hz，约20Hz至约80Hz，或约20Hz至约50Hz)主要引发快闪-小清蛋白(FS-PV)-中间神经元并且通过所述中间神经元调制。
在一方面，本公开提供用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆的装置、方法和系统，其包括在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡。在一些实施方案中，所述痴呆与AD、血管性痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、和/或年龄相关认知衰退相关联。所述受试者可以是人类或动物。
在一个实施方案中，所述同步γ振荡具有约20Hz至约50Hz，诸如约40Hz的频率。所述同步γ振荡可以细胞类型特异性方式诱导。例如，所述振荡可对应于FS-PV-中间神经元的同步活化。所述同步γ振荡可以大脑区域特异性方式诱导。例如，所述振荡可对应于海马体区域和感觉皮层区域中的至少一个中的同步活化。
在一个实施方案中，一种用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆的方法包括以下步骤：控制刺激发射装置来发射刺激并且将所述受试者暴露于所述刺激和/或向所述受试者施用所述刺激，从而在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导体内同步γ振荡。所述刺激可具有约35Hz至约45Hz的频率，诸如约40Hz的频率。所述刺激发射装置可以是触觉装置、光发射装置和/或声音发射装置。例如，所述光发射装置可以是光纤装置。将所述受试者暴露于所述刺激和/或向所述受试者施用所述刺激的持续时间可以是约一小时。将所述受试者暴露于所述刺激和/或向所述受试者施用所述刺激可在一个时间段内重复。例如，将所述受试者暴露于所述刺激和/或向所述受试者施用所述刺激可在所述时间段内重复至少一次/天。所述时间段可包括但不限于1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、两周、三周、和/ 或一月(或更长，诸如在所述受试者的剩余生命时间每天一次)。
在一方面，一种用于降低受试者的至少一个大脑区域中的Aβ肽的水平(例如，量或比率)的方法包括在所述受试者的所述至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡。所述Aβ肽可包括Aβ肽的一种或多种同种型(例如，同种型Aβ1-40、同种型Aβ1-42、和/或同种型Aβ1-43)、可溶性Aβ肽和/或不可溶Aβ肽。
在一些实施方案中，所述同步γ振荡例如通过降低所述受试者的所述至少一个大脑区域中的APP的C末端片段(CTF)和/或N末端片段(NTF)的水平(例如，量或比率)来减少所述受试者的所述至少一个大脑区域中的Aβ肽的产生。所述同步γ振荡可减少所述受试者的所述至少一个大脑区域中通过BACE1和/或γ-分泌酶进行的APP裂解为CTF和NTF。所述同步γ振荡可降低所述受试者的所示至少一个大脑区域中的内体的水平(例如，数量或比率)。例如，所述内体对于早期内体抗原1(EEA1)和/或由RAB5A基因(Rab5)编码的Ras相关蛋白可以是阳性的。在一些实施方案中，所述同步γ振荡促进所述受试者的所述至少一个大脑区域中的Aβ肽的清除。所述同步γ振荡可增加所述受试者的所述至少一个区域中通过小神经胶质细胞进行的Aβ肽的吸收。
在一方面，一种用于增加受试者的至少一个大脑区域中的小神经胶质细胞的水平(例如，数量或比率)、与神经保护性状态一致的所述小神经胶质细胞的形态学变化、和/或所述小神经胶质细胞的活性的方法包括在所述受试者的所述至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡。所述同步γ振荡可上调所述受试者的所述至少一个大脑区域中涉及所述小神经胶质细胞活性的至少一种差异表达的基因，诸如Nr4a1、 Arc、Npas4、Cd68、B2m、Bsr2、Icam1、Lyz2、Irf7、Spp1、Csf1r、和/或Csf2ra。与所述神经保护性状态一致的所述小神经胶质细胞的所述形态学变化可包括细胞体大小的增加和/或过程长度的降低。
在一方面，一种用于降低受试者的海马体中的Aβ肽的水平(例如，量或比率)的方法包括使用多个光脉冲光遗传地刺激所述海马体中的FS-PV-中间神经元，所述FS-PV-中间神经元表达光遗传致动器，从而调节降低所述海马体中的Aβ肽的所述水平的在激发神经元(例如，FS-PV-中间神经元)中通过局部场电势测量的体内同步γ振荡的周期。所述光脉冲可具有约40个脉冲/s的脉冲频率。每个光脉冲可具有约1ms的持续时间。至少一个光脉冲可具有约473nm的波长。所述光遗传致动器可包括通道视紫质、嗜盐菌紫质和/或古紫质。例如，所述光遗传致动器可以是通道视紫质-2(ChR2)。
在一方面，一种用于降低受试者的视觉皮层中的可溶性和/或不可溶Aβ肽的水平(例如，量或比率)的方法包括在约40个脉冲/s的脉冲频率下使用多个光脉冲刺激所述受试者，从而在所述视觉皮层中诱导降低所述视觉皮层中的所述可溶性和/或不可溶Aβ肽的所述水平的体内同步γ振荡。
在一方面，一种用于降低受试者的视觉皮层中的tau磷酸化的水平(例如，量或比率)的方法包括在约40个脉冲/s的脉冲频率下使用多个光脉冲刺激所述受试者，从而在所述视觉皮层中诱导减少所述视觉皮层中的tau磷酸化的体内同步γ振荡。
在一方面，一种用于降低受试者的海马体和/或听觉皮层中的Aβ肽的水平(例如，量或比率)的方法包括在约40个脉冲/s的脉冲频率下使用多个声音脉冲刺激所述受试者，从而在所述海马体和所述听觉皮层中的至少一个中诱导降低所述海马体和所述听觉皮层中的至少一个中的Aβ肽的所述水平的体内同步γ振荡。
在一方面，一种用于预防、降低和/或治疗受试者的Aβ肽的水平 (例如，量或比率)或变化、神经炎症和/或认知功能的系统包括用于所述受试者的大脑区域的体内同步活化的刺激发射装置、用于存储刺激参数和处理器可执行指令的至少一个存储器、和通信地连接到所述刺激发射装置和所述至少一个存储器的至少一个处理器。在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器控制所述刺激发射装置来根据所述刺激参数发射所述刺激，所述参数包括一个频率，在所述频率下同步活化所述大脑区域，由此所述受试者的所述Aβ肽、所述神经炎症和/或所述痴呆被预防、降低和/或治疗。所述频率可以是约35 Hz至约45Hz，诸如约40Hz。所述体内同步活化可通过酶调节和/ 或发生在特定细胞类型中，诸如免疫反应性FS-PV-中间神经元中。所述酶可包括光遗传活化剂、微生物视蛋白、ChR2和/或载体 AAV-DIO-ChR2-EYFP。
在一方面，一种用于预防、降低和/或治疗受试者的Aβ肽的水平 (例如，量或比率)或变化、神经炎症和/或认知功能的系统包括用于减少到所述受试者的至少一只眼的环境光的光闭塞装置和/或用于减少到所述受试者的至少一只耳的环境噪声的噪声消除装置。所述光闭塞装置可包括用于将光刺激发射到所述至少一只眼以用于所述受试者的视觉皮层和海马体中的至少一个的体内同步活化的光发射单元。所述噪声消除装置可包括用于将声音刺激发射到所述至少一只耳以用于所述受试者的听觉皮层和海马体中的至少一个的体内同步活化的扬声器单元。所述系统还包括用于存储处理器可执行指令的至少一个存储器和通信地连接到所述光闭塞装置和/或所述噪声消除装置和所述至少一个存储器的至少一个处理器。在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器可控制所述光闭塞装置，使得所述光发射单元在一个频率下发射在所述频率下同步活化所述视觉皮层和所述海马体中的至少一个的所述光刺激。可替代地或此外，所述至少一个处理器可控制所述噪声消除装置，使得所述扬声器单元在所述频率下致动在所述频率下同步活化所述听觉皮层和所述海马体中的至少一个的所述声音刺激。
在一方面，一种用于改善受试者的认知功能的方法包括控制至少一个电声换能器来将电音频信号转化为对应的声音刺激。在一些实施方案中，所述声音刺激包括具有约35次滴答声/s至约45次滴答声/s 的滴答声频率的滴答声系列。所述方法还包括将所述受试者暴露于所述声音刺激和/或向所述受试者施用所述刺激以在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡，所述同步γ振荡引起所述受试者的所述认知功能的改善。所述认知功能可包括识别力、辨别力和/或空间记忆。
在一方面，一种用于预防、降低和/或治疗受试者的Aβ肽的水平 (例如，量或比率)或变化、神经炎症和/或认知功能的方法包括控制至少一个电声换能器来将电音频信号转化为对应的声音刺激，所述声音刺激包括具有约35次滴答声/s至约45次滴答声/s的滴答声频率的滴答声系列，以及将所述受试者暴露于所述声音刺激和/或向所述受试者施用所述刺激以在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡，所述同步γ振荡引起所述受试者的Aβ肽的所述水平、神经炎症和/或痴呆的所述预防、所述减少和/或所述治疗。
所述Aβ肽可包括Aβ肽的一种或多种同种型(例如，同种型 Aβ1-40、同种型Aβ1-42、和/或同种型Aβ1-43)、可溶性Aβ肽和/或不可溶Aβ肽。所述同步γ振荡可通过增加所述受试者的所述至少一个大脑区域中的小神经胶质细胞的数量和/或增强所述至少一个大脑区域中通过所述小神经胶质细胞进行的Aβ肽的吸收来预防、降低和/或治疗所述受试者的Aβ肽的所述水平、神经炎症和/或痴呆。所述至少一个大脑区域可包括所述听觉皮层和/或所述海马体。
所述滴答声频率可以是约40次滴答声/s。所述滴答声系列中的每次滴答声可具有约1ms的持续时间。所述滴答声系列中的每次滴答声可具有约10Hz至约100kHz、约12Hz至约28kHz、约20Hz至约20kHz、和/或约2kHz至约5kHz的频率。所述滴答声系列中的每次滴答声可具有约0dB至约85dB、约30dB至约70dB、和约60 dB至约65dB的声压水平。
所述至少一个电声换能器可包括至少一个耳机，在所述情况下，所述方法可包括将所述至少一个耳机应用在所述受试者的至少一只耳周围、上和/或中，以将所述声音刺激导向到所述受试者的所述至少一只耳中。所述方法还可包括使用无源噪声隔离和/或有源噪声消除来减少环境噪声。
在一方面，一种用于预防、降低和/或治疗受试者的Aβ肽的水平 (例如，量或比率)或变化、神经炎症和/或认知功能的系统包括：用于将电音频信号转化为对应的声音刺激的至少一个电声换能器，所述声音刺激包括具有约35次滴答声/s至约45次滴答声/s的滴答声频率的滴答声系列；用于存储所述电音频信号和处理器可执行指令的至少一个存储器装置；以及通信地连接到所述至少一个电声换能器和所述至少一个存储器装置的至少一个处理器。在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器控制所述电声换能器来将所述声音刺激输出到所述受试者的至少一只耳，以在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡，所述同步γ振荡引起所述受试者的Aβ肽的所述水平、神经炎症和/或痴呆的所述预防、所述减少和/或所述治疗。
所述系统可以是固定式的或便携式的。如果所述至少一个电声换能器包括用于所述受试者佩戴在所述至少一只耳周围、上和/或中以将所述声音刺激导向到所述受试者的所述至少一只耳中并减少环境噪声的至少一个耳机，则所述系统还可包括用于将所述电音频信号传达到所述至少一个耳机的耳机接口。可替代地或此外，所述系统可包括在所述声音刺激的所述输出之前、过程中和/或之后监测所述受试者的所述至少一个大脑区域中的功能的神经成像扫描器。
在一方面，一种用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆的方法包括提供在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。
在一方面，一种用于维持和/或降低涉及受试者的应激反应的糖皮质素的血液水平(例如，量)的方法包括提供在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。
在一方面，一种用于预防和/或减少受试者的焦虑的方法包括提供在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。
在一方面，一种用于维持和/或增强记忆关联的方法包括提供在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。所述记忆关联可基于空间记忆。
在一方面，一种用于维持和/或增强认知灵活性的方法包括提供在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。
在一方面，一种用于维持和/或减少对于受试者的至少一个大脑区域的解剖学和/或形态学的变化的方法包括提供在所述受试者的所述至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。所述解剖学和/或形态学可包括大脑重量、侧脑室大小、皮质层的厚度、神经元层的厚度和/或血管直径。所述至少一个大脑区域可包括所述受试者的视觉皮层、躯体感觉皮层和/或岛叶皮层。
在一方面，一种用于维持和/或减少对于受试者的至少一个大脑区域中的神经元的数量、所述神经元中的DNA的质量和/或突触色斑密度(synaptic puncta density)的变化的方法包括提供在所述受试者的所述至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置。所述至少一个大脑区域可包括所述受试者的视觉皮层、躯体感觉皮层、岛叶皮层和/或海马体。
在一方面，一种在受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的装置可预防、减轻和/或治疗所述受试者的痴呆和/或焦虑，维持和/ 或增强所述受试者的记忆关联和/或认知灵活性，和/或维持和/或减少对于所述受试者的所述至少一个大脑区域的解剖学、形态学、细胞和分子的变化。
应认识到，前述概念和以下更详细地讨论的另外的概念的所有组合(前提是此类概念并非相互不一致)设想为本文公开的发明性主题的一部分。具体地，在本公开的结尾处出现的要求保护的主题的所有组合设想为本文公开的发明性主题的一部分。应认识到，也可出现在以引用的方式并入的任何公开内容中的本文明确采用的术语应被赋予与本文公开的具体概念最一致的意义。
在查阅以下附图和详细描述之后，其他系统、方法和特征将对于本领域的技术人员变得显而易见。所有此类另外的系统、方法和特征意图包括在本说明书内、本发明的范围内并且将受到随附权利要求书保护。
附图简述
技术人员将理解附图主要是出于说明性目的并且不意图限制本文所述的发明性主题的范围。附图不必按比例绘制；在一些情况下，本文公开的发明性主题的各个方面可在附图中夸大或放大示出以促进对不同特征的理解。在附图中，类似的附图标记通常参见例如类似的特征(例如，功能上相似和/或结构上相似的元件)。
图1是展示根据一些实施方案在球形跑步机上跑步通过虚拟线性迷宫的小鼠的示意图。
图2A和图2B是从海马趾CA1记录并且展示根据一些实施方案的θ振荡和锐波波纹(SWR)的电迹线。
图3A和图3B是展示根据一些实施方案在三月大的Tg 5XFAD 小鼠和野生型(WT)小鼠中在θ时间段过程中归一化功率谱和归一化功率谱密度的平均值和标准偏差的曲线图。
图4A和图4B是展示根据一些实施方案的WT小鼠和5XFAD小鼠的SWR的频谱图。
图5A-图5C是描绘根据一些实施方案在SWR过程中的瞬时γ频率的分布的曲线图。
图6A是描绘根据一些实施在5XFAD小鼠和WT小鼠中作为自从SWR的峰之后的时间的函数的Z得分γ功率的一系列图。图6B 是描绘根据一些实施方案在5XFAD小鼠和WT小鼠中在SWR过程中的γ功率的累积分布的曲线图。图6C和图6D是描绘根据一些实施方案在WT小鼠和5XFAD小鼠的SWR的峰周围的100ms过程中 Z得分γ功率的累积分布的曲线图。图6E是描绘根据一些实施方案在5XFAD小鼠和WT小鼠中在大SWR过程中γ功率的累积分布的曲线图。
图7A是描绘作为γ振荡的相的函数的尖峰分数的曲线图，并且图7B是描绘根据一些实施方案在SWR过程中尖峰调制的深度的曲线图。图7C和图7D是展示根据一些实施方案在SWR过程中在海马趾CA1中作为γ振荡的相的函数的尖峰分数的曲线图。图7E是描绘作为γ振荡的相的函数的尖峰分数的曲线图，并且图7F是描绘根据一些实施方案在大SWR过程中尖峰调制的深度的曲线图。
图8A和图8B是描绘根据一些实施方案针对每只动物和组合的所有动物在5XFAD动物和WT动物中的SWR速率/非θ时间段的曲线图。
图9是展示根据一些实施方案用于调节受试者的大脑中的特定细胞类型的活化的病毒载体的示意图。
图10A和图10B是展示根据一些实施方案向受试者的海马体的 CA1区域递送信号的示意图。
图11是展示根据一些实施方案使用ChR2和DAPI对受试者的神经组织进行免疫染色的免疫荧光图像。
图12A是展示根据一些实施方案在PV+中间神经元中表达的 ChR2-EYFP的免疫荧光图像。图12B是展示根据一些实施方案使用抗EYFP抗体和抗PV抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。
图13A和图13B包括根据一些实施方案的研究、局部场电势的电迹线、和FS-PV-中间神经元的功率谱密度的示意图。
图14A和图14B包括根据一些实施方案的原始电迹线、在光遗传刺激之后针对尖峰进行滤波的迹线、和在1ms激光脉冲启动之后尖峰可能性的曲线图。
图15A是展示根据一些实施方案在40-Hz刺激时间段与随机刺激时间段之间的击发速率的差异的柱状图。图15B是展示根据一些实施方案针对每只动物每个40-Hz刺激时间段、随机刺激时间段和没有刺激时间段的多单元击发速率的条形图。
图16A是根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域中特定细胞类型的刺激的频率特异性增加过程中从受试者的海马体记录的电迹线。图16B是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1 区域中特定细胞类型的刺激中的局部场电势功率的频率特异性增加的功率谱密度的曲线图。
图17A和图17B是描绘根据一些实施方案通过单向ANOVA获得的5XFAD/PV-Cre CA1的相对Aβ1-40和Aβ1-42水平的条形图。
图18A和图18B是描绘根据一些实施方案通过单向ANOVA获得的5XFAD/αCamKII-Cre CA1的相对Aβ1-40和Aβ1-42水平的条形图。
图19A是展示根据一些实施方案在海马趾CA1区域中使用抗Aβ抗体和抗EEA1抗体的免疫组织化学的一系列图像。图19B是描绘根据一些实施方案归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性的一系列条形图。
图20A是展示根据一些实施方案在5XFAD/PV-Cre的海马趾 CA1区域中使用抗Aβ抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图20B是描绘根据一些实施方案归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性的条形图。
图21A是描绘根据一些实施方案CA1中的APP(CT695)、APP NTF(A8967)、APP CTF(CT695)、和β-肌动蛋白(A5316)(负荷对照) 的水平的代表性蛋白质印迹。图21B是描绘根据一些实施方案在 40-Hz相对于EYFP和随机条件中APP CTF的相对(归一化到肌动蛋白)免疫反应性的条形图。图21C是描绘根据一些实施方案CA1中的全长APP 2106(CT695)、APPCTF 2108(CT695)和β-肌动蛋白2112 (A5316，负荷对照)的水平的一系列蛋白质印迹。
图22A是描绘根据一些实施方案在40-Hz相对于EYFP和随机条件中APP NTF的相对(归一化到激动蛋白)免疫反应性的条形图。图 22B是描绘根据一些实施方案在EYFP、随机和40-Hz条件中全长APP 的相对(归一化到肌动蛋白)免疫反应性的条形图。
图23是展示根据一些实施方案使用抗Rab5(ADI-KAp-GP006-E) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。
图24A是代表归一化到EYFP的EEA1的相对免疫反应性的条形图，并且图24B是描绘根据一些实施方案在EYFP、40Hz和随机刺激条件下来自5XFAD/PV-Cre的CA1的相对Rab5强度水平的条形图。
图25A是描绘根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后Aβ肽同种型Aβ1-40的水平的条形图。图25B是描绘根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的海马体的CA1区域中的特定细胞类型之后Aβ肽同种型Aβ1-42的降低的条形图。图25C是展示根据一些实施方案使用γ振荡刺激受试者的海马体的CA1区域中的特定细胞类型之后CTF(例如，β-CTF)的水平降低和全长APP (归一化到肌动蛋白)的水平增加的一系列图像。
图26A-图26B是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的 CA1区域的不同类型刺激之后的内体水平(基于EEA1水平)的免疫荧光图像。
图27是描绘根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后针对图6A-图6B的免疫荧光图像的平均强度值(归一化到FAD)的条形图。
图28是呈现根据一些实施方案在具有和不具有40-Hz刺激的情况下通过小鼠海马趾CA1区域的全转录组核糖核酸测序(RNA-seq)确定的差异表达的基因的热图。
图29是展示根据一些实施方案在EYFP和40-Hz条件中上调和下调基因的FPKM值的盒形图。
图30是展示根据一些实施方案在40-Hz刺激之后识别的上调基因的细胞类型特异性表达模式的饼形图。
图31是展示根据一些实施方案在RNA-seq数据集中特定基因靶的RT-qPCR验证的条形图。
图32A和图32B是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁表演过程中在大脑上方记录的局部场电势的功率谱密度的曲线图。
图33是描绘根据一些实施方案在RNA-seq数据集中特定基因靶的RT-qPCR验证的条形图。
图34是展示根据一些实施方案在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中在5XFAD/PV-Cre小鼠的海马趾CA1区域中使用抗Iba1 (019-19741)抗体和抗Aβ(12F4)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。
图35A是描绘根据一些实施方案在EYFP和40-Hz条件中小神经胶质细胞的数量的条形图。图35B是描绘根据一些实施方案在EYFP、 40-Hz和随机刺激条件中归一化到EYFP的小神经胶质细胞体的直径的条形图。图35C是描绘根据一些实施方案在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中归一化到EYFP的小神经胶质细胞初级过程的平均长度的条形图。图35D是描绘根据一些实施方案在EYFP和40-Hz刺激条件中也是Aβ-阳性的Iba1-阳性(小神经胶质细胞)细胞体的百分比的条形图。
图36是根据一些实施方案通过合并来自图34的免疫荧光图像形成的一系列3D渲染图。
图37A是展示根据一些实施方案在5XFAD/PV-Cre的海马趾 CA1区域中使用Hoechst的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图 37B是描绘根据一些实施方案在EYFP和40-Hz刺激条件中 5XFAD/PV-Cre的估计的CA1厚度的条形图。
图38A是显示根据一些实施方案在40-Hz FS-PV+刺激或对照刺激之后通过海马趾CA1的全基因组RNA-seq确定的差异表达的基因 (DEG)的热图。图38B是展示根据一些实施方案在图38A中的TREAT 条件中上调的DEG之间的重叠的图表。
图39是描绘根据一些实施方案在图38A的RNA-seq数据集中特定基因靶的RT-qPCR验证的条形图。
图40是展示根据一些实施方案图38A的上调基因与其相关的生物过程的图。
图41是展示根据一些实施方案图38A的下调基因与其相关的生物过程的图。
图42A是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后Iba1的水平的一系列免疫荧光图像。图42B是描绘根据一些实施方案针对图42A的免疫荧光图像的平均强度值的条形图。
图43A是展示根据一些实施方案暴露于光闪烁刺激的小鼠的示意图。图43B包括根据一些实施方案在40-Hz光闪烁之前和过程中视觉皮层中的局部场电势迹线和功率谱密度的曲线图。图43C-图43F 是描绘根据一些实施方案在视觉皮层中的局部场电势的功率谱密度的曲线图。
图44A是描绘根据一些实施方案针对40-Hz光闪烁的四个周期和当量时间段的随机光闪烁的作为时间的函数的视觉皮层中尖峰分数的一系列柱状图。图44B是根据一些实施方案在光闪烁过程中在大脑上方记录的局部场电势的一系列电迹线。
图45A是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁与随机光闪烁之间的击发速率的差异的柱状图。图45B是展示根据一些实施方案在视觉皮层中的多单元击发速率的图。
图46A是展示根据一些实施方案的实验范例的示意图。图46B- 图46C是分别进一步展示根据一些实施方案在图46A的实验范例之后Aβ肽同种型Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的图。
图47A和图47B是分别描绘根据一些实施方案在5XFAD视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图。
图48A是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在 5XFAD桶状皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图。图 48B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在APP/PS1 视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图。图48C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在WT视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图。
图49是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在 5XFAD视觉皮层中使用抗Iba1(019-19741)抗体和抗Aβ(12F4)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。
图50A是描绘根据一些实施方案的Iba1-阳性细胞(小神经胶质细胞)的数量的条形图。图50B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz 闪烁条件下归一化到对照的小神经胶质细胞体的直径的条形图。图 50C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下归一化到对照的小神经胶质细胞初级过程的平均长度的条形图。图50D是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下也是Aβ-阳性的小神经胶质细胞的百分比的条形图。
图51是根据一些实施方案来自CLARITY处理的100μm组织切片的在黑暗和40-Hz闪烁条件下的Iba+小神经胶质细胞的一系列3D 渲染图(来自免疫荧光图像)。CLARITY是使用例如从组织内构建并且连接到组织的基于丙烯酰胺的水凝胶来使得大脑组织透明的方法。
图52A是展示根据一些实施方案使用荧光活化的细胞分选术 (FACS)从视觉皮层分离小神经胶质细胞的方法的流程图。图52B是描绘根据一些实施方案使用图52A的方法从三月大的5XFAD动物和 WT对照动物的视觉皮层分离的小神经胶质细胞中的Aβ1-40水平的条形图。
图53A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在三月大的5XFAD视觉皮层中使用检测突触小泡蛋白的SVP38抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图53B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz光闪烁条件之后的5XFAD视觉皮层的相对SVP38强度水平的条形图。
图54A是展示根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的视觉皮层之后Aβ肽同种型Aβ1-42的降低的条形图。图54B是展示根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的视觉皮层之后和在刺激之后二十四小时再一次的Aβ肽同种型Aβ1-42的水平的条形图。
图55A包括根据一些实施方案在40-Hz光闪烁之前和过程中海马体中的局部场电势的电迹线和功率谱密度的曲线图。图55B是根据一些实施方案分别针对40-Hz光闪烁的四个周期和当量时间段的随机光闪烁的作为时间的函数的海马体中尖峰分数的一系列柱状图。
图56A是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁与随机光闪烁之间的击发速率的差异的柱状图。图56B是展示根据一些实施方案在 40-Hz光闪烁过程中在CA1中的多单元击发速率的图。
图57A是描绘根据一些实施方案在5XFAD视觉皮层中的相对 Aβ1-40水平的条形图。图57B是描绘根据一些实施方案在5XFAD视觉皮层中的相对Aβ1-42水平的条形图。
图58A是描绘根据一些实施方案在40-Hz光闪烁条件之后具有恢复的5XFAD视觉皮层中的相对Aβ1-40水平的条形图。图58B是描绘根据一些实施方案在40-Hz光闪烁之后具有恢复的5XFAD视觉皮层中的相对Aβ1-42水平的条形图。
图59A是展示根据一些实施方案的研究的示意图。图59B是描绘根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中的相对Aβ1-42水平的条形图。图59C是展示根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中的相对Aβ1-40水平的条形图。
图60A是展示根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中使用Aβ抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图60B是描绘根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中Aβ-阳性斑沉积物的数量的条形图。图60C 是描绘根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中Aβ-阳性斑的面积的条形图。
图61A是展示根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗磷酸化Tau(S202) 抗体和抗MAP2抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图61B 是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对磷酸化Tau(pTau)(S202)强度水平的条形图。图61C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz光闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对MAP2强度水平的条形图。
图62A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在4月大的P301S小鼠中使用抗pTau 6202(S404) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图62B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对pTau(S400/T403/S404)荧光强度水平的条形图。
图63A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗pTau 6302(S396) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图63B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对pTau(S396)荧光强度水平的条形图。
图64是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗Iba1抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。
图65A是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz光闪烁条件下一小时/天的七天之后小神经胶质细胞的数量的条形图。图65B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后归一化到对照的小神经胶质细胞体的直径的条形图。图65C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后归一化到对照的小神经胶质细胞初级过程的平均长度的条形图。
图66是展示根据一些实施方案在具有和不具有视觉γ刺激的情况下受试者的视觉皮层中的可溶性和不可溶Aβ肽同种型Aβ1-40和 Aβ1-42的水平的图。
图67A-图67B是展示根据一些实施方案在具有和不具有经颅γ刺激的情况下受试者的全脑Aβ肽水平的图。
图68A是展示实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否导致对受试者的应激的研究的流程图。图68B是描绘指示受试者的应激反应的皮质酮的水平的条形图。
图69A是展示实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否减少受试者的焦虑的研究的流程图。图69B是展示高架十字迷宫装置的图像。图69C和图69D是展示在高架十字迷宫会话过程中受试者的代表性轨迹的图像。
图70是描绘在高架十字迷宫会话过程中受试者在探索开放臂和闭合臂上花费的平均时间的条形图。
图71A是展示实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否减少受试者的应激和/或焦虑的研究的流程图。图71B是展示开放现场场地的图像。图71C和图71D是展示在开放现场测试过程中受试者的代表性轨迹的图像。
图72A是描绘在开放现场测试的每分钟过程中受试者在开放现场的中心花费的平均时间量的曲线图。图72B是描绘在开放现场测试过程中受试者的开放现场的边缘花费的平均总时间的条形图。
图73A和图73B是展示实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否改变受试者的固有的新奇性寻求行为的示意图。图73C 是描绘根据图73A的示意图与第二新型物品相比受试者在探索第一新型物品上花费的平均时间量的条形图。
图74是描绘根据图73B的示意图在每分钟过程中受试者在探索新型物品上花费的平均时间量的曲线图。
图75A是展示使用恐惧条件反射范例实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否影响受试者的学习和记忆的研究的流程图。图75B是展示作为时间的函数的在改变环境的情况下的音调测试的刺激图。
图76A和图76B是证明根据一些实施方案受试者的增强的记忆的条形图。
图77A是展示实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否改善受试者的记忆的研究的流程图。图77B是展示在靶象限中隐藏平台的Morris水迷宫的图。图77C和图77D是展示在Morris水迷宫探测测试过程中受试者的代表性轨迹的图像。
图78A是描绘受试者每天在发现Morris水迷宫测试中隐藏的平台上花费的平均时间量的曲线图。图78B是描绘受试者在每半分钟过程中在靶象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的曲线图。图 78C是描绘受试者在每半分钟过程中在相反象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的曲线图。
图79A是展示在第一象限中隐藏平台的Morris水迷宫测试的图。图79B是展示用于反向学习的在第二象限(与第一象限相反)中隐藏平台的Morris水迷宫测试的图。图79C是描绘受试者每天在发现Morris 水迷宫反向学习测试中隐藏的平台上花费的平均时间量的曲线图。
图80A是展示实施来检查根据一些实施方案的慢性γ暴露和/或施用是否影响受试者的空间学习和记忆的研究的流程图。图80B是描绘受试者每天在发现Morris水迷宫测试中隐藏的平台上花费的平均时间量的曲线图。图80C是描绘受试者在三十秒试验过程中在靶象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的条形图。
图81A是展示延伸来包括反向学习的图80A的研究的流程图。图81B是描绘受试者每天在发现Morris水迷宫反向学习测试中隐藏的平台上花费的平均时间量的曲线图。
图82A是描绘受试者在三十秒试验过程中在靶象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的条形图。图82B是描绘受试者在相反象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的条形图。
图83是实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用对于受试者的视觉皮层中的脱氧核糖核酸(DNA)损伤和神经元损失的作用的研究的时间线图。
图84是展示针对实施来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用的作用的研究的受试者的组的图。
图85是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较大脑重量变化的条形图。
图86是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较侧脑室扩张的倍数变化的条形图。
图87A-图87E是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的侧脑室的图像。
图88A-图88C是展示根据一些实施方案的感兴趣的大脑区域的大脑解剖结构图。
图89是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的V1-皮质层的平均厚度的条形图。
图90是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的 V1-NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图91A-图91E是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。
图92是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的SS1- 皮质层的平均厚度的条形图。
图93是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的 SS1-NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图94A-图94E是展示根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。
图95是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的岛叶皮层的皮质层的平均厚度的条形图。
图96是描绘根据一些实施方案的跨图84的受试者的组的岛叶皮层的NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图97A-图97E是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。
图98是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较视觉皮层 NeuN-阳性细胞的量的条形图。
图99是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较视觉皮层γH2AX-阳性细胞的量的条形图。
图100是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的视觉皮层样品的一系列图像。
图101是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较躯体感觉皮层NeuN-阳性细胞的量的条形图。
图102是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较躯体感觉皮层γH2AX-阳性细胞的量的条形图。
图103是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的躯体感觉皮层样品的一系列图像。
图104是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较岛叶皮层 NeuN-阳性细胞的量的条形图。
图105是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较岛叶皮层γH2AX-阳性细胞的量的条形图。
图106是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的岛叶皮层样品的一系列图像。
图107是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较海马体 NeuN-阳性细胞的量的条形图。
图108是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较海马体γH2AX-阳性细胞的量的条形图。
图109是展示代表根据一些实施方案的图84的受试者的组的海马体样品的一系列图像。
图110是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较视觉皮层色斑密度的条形图。
图111是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较躯体感觉皮层色斑密度的条形图。
图112是根据一些实施方案跨图84的受试者的组比较岛叶皮层色斑密度的条形图。
图113A-图113D是展示根据一些实施方案的代表性样品中的 Hoechst染色剂、VGluT1标记物和/或GAD65标记物的图像。图113E 和图113F是展示根据一些实施方案的色斑定量的方法的图像。
图114是展示根据一些实施方案的滴答声系列刺激的刺激图。
图115是展示实施来检查根据一些实施方案的听觉γ暴露和/或施用是否诱导受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞活化的研究的流程图。
图116A是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的平均数量的条形图。图116B是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞突起长度的倍数变化的条形图。
图117A和图117B是根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的代表性图像。
图118A和图118B是根据一些实施方案的来自图117A和图117B 的小神经胶质细胞突起长度的放大图像。
图119A和图119B是根据一些实施方案的来自图117A和图117B 的小神经胶质细胞胞体大小的放大图像。
图120A是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的平均数量/像场的条形图。图120B是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的胞体大小的平均倍数变化的条形图。
图121A和图121B是根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的代表性图像。
图122A-图122D是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层和海马体中的可溶性Aβ同种型Aβ1-40和Aβ1-42的水平的条形图。
图123A-图123D是描绘根据一些实施方案的受试者的听觉皮层和海马体中的不可溶Aβ同种型Aβ1-40和Aβ1-42的水平的条形图。
图124A-图124D是根据一些实施方案的受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞的代表性图像。
图125A是展示新型物品识别测试的流程图。图125B是证明根据一些实施方案的记忆改善的条形图。
图126A是展示新型物品定位测试的流程图。图126B是证明根据一些实施方案的记忆和/或辨别力改善的条形图。
图127A是描绘受试者每天在发现Morris水迷宫测试中隐藏的平台上花费的平均时间量的曲线图。图127B是描绘受试者在探测测试过程中在靶象限中寻找移除的平台上花费的平均时间量的条形图。
图128A是展示根据一些实施方案的视觉皮层中的扩大的脉管系统的一系列代表性免疫荧光图像。图128B是描绘视觉皮层中的血管直径并且展示根据一些实施方案的γ暴露之后血管直径的增加的条形图。
详细描述
在一方面，本公开提供用于预防、减轻和/或治疗受试者的大脑病症或认知功能障碍/缺陷的方法、装置和系统。在一些实施方案中，所述大脑病症是痴呆。
认知功能主要取决于与注意力和工作记忆相关的神经网络活动，具体地γ频率(节律(例如，约20Hz至约100Hz，约20Hz至约80Hz，或约20Hz至约50Hz))的振荡的精确定时。因为这些振荡从突触活动产生，所以它们提供神经元的分子特性与更高水平的相干大脑活动之间的直接关联。重要的是，γ振荡活动在通过AD的神经病变受损的神经电路中被破坏，并且可代表所述疾病中的记忆障碍的关键决定因素。还未确定病变与大脑振荡的障碍之间是否存在因果关系。然而，驱动大脑节律可充当用于治疗痴呆诸如AD的多靶疗法，并且可通过非侵入性疗法实现。
在一方面，本公开提供用于增强或诱导γ振荡的装置、方法和系统。在一些实施方案中，增强或诱导γ振荡通过光遗传方法进行。在其他实施方案中，增强或诱导γ振荡通过行为方法进行。本公开提供通过光遗传、行为或其他方法增强和/或诱导γ振荡减少AD病变。
在一方面，本公开提供用于恢复或诱导患有痴呆的受试者中的γ振荡节律的装置、系统和方法。在一些实施方案中，所述痴呆是AD、血管性痴呆、额颞痴呆(FTD)、和/或路易体痴呆。因此，在一些实施方案中，本公开提供用于治疗痴呆的装置、系统和方法。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treating)”是指治疗性治疗以及防范性或预防性措施两者。在一些实施方案中，需要治疗的受试者包括已患有疾病或病状的那些受试者以及可能发展疾病或病状并且其目的是预防、延迟或减弱疾病或病状的那些受试者。例如，在一些实施方案中，本文公开的装置、方法和系统可被采用来预防、延迟或减弱受试者在遗传上易患的疾病或病状，诸如AD。在一些实施方案中，本文公开的装置、方法和系统可被采用来治疗、减轻、减少受试者已诊断患有的疾病或病状诸如AD的症状和/或延迟所述疾病或病状的进程。
如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，诸如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物、或灵长类动物。优选地，根据本发明的受试者是人类。
如本文所用，术语“约”是指加上或减去“约”所修饰的对象的百分之十。
痴呆是特征在于智力能力和/或记忆障碍的损失的病症。痴呆包括例如AD、血管性痴呆、路易体痴呆、皮克氏病(Pick’s disease)、额颞痴呆(FTD)、AIDS痴呆、年龄相关认知障碍、以及年龄相关记忆障碍。痴呆还可与神经病学和/或精神病学病状相关联，例如像大脑肿瘤、大脑病灶、癫痫、多发性硬化症、唐氏综合征(Down’s syndrome)、雷特综合征(Rett’s syndrome)、进行性核上麻痹、额叶综合征、精神分裂症、以及创伤性脑损伤。
AD是在发达国家中最常见的神经退化性疾病。在组织病理学上， AD的特征在于包含Aβ肽的淀粉样蛋白斑的积聚和由tau蛋白制成的 NFT。在临床上，AD与特征在于记忆、功能、语言能力、判断、以及执行功能的损失的进行性认知障碍相关联。AD经常在其后期阶段导致严重的行为症状。
血管性痴呆还可称为脑血管性痴呆并且是指脑血管性疾病(例如，大脑半球的梗塞)，其通常具有改善和逐步恶化的时间段的起伏过程。血管性痴呆可包括迷向、受损记忆和/或受损判断的一种或多种症状。血管性痴呆可由离散的多发性梗塞或其他血管性病因导致，所述其他血管性病因包括例如自身免疫血管炎，诸如在系统性红斑狼疮中发现的自身免疫血管炎；感染性血管炎，诸如莱姆病(Lyme's disease)；复发性大脑内脑出血；和/或中风。
额颞痴呆(FTD)是进行性神经退化性病症。患有FTD的受试者通常表现出明显的行为和性格变化，经常伴随语言障碍。
路易体痴呆的特征在于：发展具有与AD的特征重叠的特征的痴呆的一种或多种症状；发展帕金森氏病(Parkinson's disease)的特征；和/或早期发展幻觉。路易体痴呆的特征通常在于症状的严重性的每天起伏。
在一些方面，本公开提供用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆的方法，其包括在受试者的大脑中诱导同步γ振荡。在一些实施方案中，在患有神经疾病或病症或年龄相关衰退的受试者中诱导γ振荡作用来恢复由于所述疾病或病症或年龄相关衰退或与其相关联而在受试者中被破坏的γ振荡节律。
在一些实施方案中，诱导γ振荡减少同种型Aβ1-40和Aβ1-42的生成。在一些实施方案中，诱导γ振荡增强从受试者的大脑清除Aβ(例如，同种型Aβ1-40和Aβ1-42)。在一些实施方案中，诱导γ振荡预防Aβ在受试者的大脑中积聚。在一些实施方案中，相对于在治疗之前受试者的大脑中的Aβ的水平，本文提供的方法使受试者的大脑中的Aβ的水平降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、或更多。在一些实施方案中，相对于在治疗之前受试者的大脑中的Aβ的水平，受试者的大脑中的Aβ的水平降低至少约50％。
在一些实施方案中，受试者的大脑中的Aβ的水平通过减少受试者的大脑中的APP的清除来降低。在一些实施方案中，相对于在治疗之前受试者的大脑中的APP清除的水平，本文提供的方法使受试者的大脑中的APP的清除降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、或更多。在一些实施方案中，相对于在治疗之前受试者的大脑中的APP清除的水平，受试者的大脑中的APP 清除的水平降低至少约50％。在一些实施方案中，APP清除的水平通过受试者的大脑中的C末端片段β(β-CTF)的水平来测量。在一些实施方案中，大脑中的APP清除的水平经由抑制β-分泌酶和/或γ-分泌酶(诸如通过增加抑制β-分泌酶和/或γ-分泌酶活性的水平)来降低。在一些实施方案中，本文提供的方法减少受试者的大脑中的Aβ斑的聚集。
在一些实施方案中，所述方法改善受试者的认知能力和/或记忆。
在另一方面，本公开提供用于在受试者的大脑中诱导神经保护性特征或神经保护性环境的方法，其包括在受试者的大脑中诱导同步γ振荡。例如，在一些实施方案中，神经保护性特征与神经保护性小神经胶质细胞特征相关联。在另外的实施方案中，神经保护性特征通过增加M-CSF通路的活性来诱导或与其相关联。在一些实施方案中，神经保护性环境与抗炎信号传导通路相关联。例如，在一些实施方案中，抗炎信号传导通路是抗炎小神经胶质细胞信号传导通路。
在一些实施方案中，神经保护性特征与促炎神经胶质细胞活性的降低或缺乏相关联。促炎神经胶质细胞活性与小神经胶质细胞的M1 表型相关联，并且包括产生反应性氧物质(ROS)、神经分泌蛋白嗜铬粒蛋白A、分泌辅因子半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、NADPH氧化酶、一氧化氮合成酶诸如iNOS、NF-κB-依赖性炎性反应蛋白、以及促炎细胞因子和趋化因子(例如，TNF、IL-1β、IL-6和IFNγ)。
相比之下，小神经胶质细胞的M2表型与炎症的下调和炎症诱导损伤的修复相关联。抗炎细胞因子和趋化因子(IL-4、IL-13、IL-10和 /或TGFβ)以及吞噬活性增加与M2表型相关联。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法引发小神经胶质细胞的神经保护性M2表型。在一些实施方案中，本文提供的方法增加受试者的大脑中的吞噬活性。例如，在一些实施方案中，本文提供的方法增加小神经胶质细胞的吞噬活性，使得增加Aβ的清除。
γ振荡可包括约20Hz至约100Hz。因此，在一些实施方案中，本公开提供用于预防、减轻或治疗受试者的痴呆的方法，其包括在受试者的大脑中诱导约20Hz至约100Hz、或约20Hz至约80Hz、或约20Hz至约50Hz、或约30Hz至约60Hz、或约35Hz至约45Hz、或约40Hz的γ振荡。优选地，γ振荡是约40Hz。
刺激可包括在至少一个大脑区域中直接或最终诱导γ振荡的受试者的内部或外部环境的任何可检测变化。例如，刺激可被设计来刺激电磁辐射受体(例如，光感受器、红外感受器、和/或紫外感受器)、机械性刺激感受器(例如，机械应力和/或应变)、疼痛感受器(即，疼痛)、声音感受器、电感受器(例如，电场)、磁感受器(例如，磁场)、氢感受器、化学感受器、热感受器、嗅觉感受器、和/或本体感受器(即，位置感觉)。引发来自感受器的反应所需要的感觉的绝对阈值或最小量可基于刺激的类型和受试者变化。在一些实施方案中，刺激基于个体敏感性来调整。
在一些实施方案中，γ振荡以大脑区域特异性方式诱导。例如，在一些实施方案中，γ振荡在海马体、视觉皮层、桶状皮层、听觉皮层、或其任何组合中被诱导。以举例的方式，在一些实施方案中，γ振荡使用闪光在视觉皮层中被诱导；并且在其他实施方案中，γ振荡使用在特定频率下的听觉刺激在听觉皮层中被诱导。在一些实施方案中，γ振荡使用视觉、听觉和/或其他刺激的组合在多个大脑区域中同时被诱导。在一些实施方案中，γ振荡在虚拟现实系统中被诱导。
在一些实施方案中，受试者通过被配置来诱导γ振荡的环境(诸如无源地或有源地阻挡非相关刺激的室(例如，光阻挡或噪声消除)) 来接受刺激。可替代地或此外，受试者可通过包括例如光阻挡或噪声消除外观的系统来接受刺激。在一些实施方案中，受试者通过刺激发射装置(诸如被设计来递送刺激的眼睛佩戴物)来接受视觉刺激。所述装置可将其他光阻挡在外。在一些实施方案中，受试者通过刺激发射装置(诸如被设计来递送刺激的耳机)来接受听觉刺激。所述装置可消除其他噪声。
除用于发射刺激的至少一个接口之外，一些实施方案可包括至少一个处理器(用于例如生成刺激、控制刺激的发射、监测刺激的发射/ 结果、和/或处理关于刺激/结果的反馈)、至少一个存储器(用于存储例如处理器可执行指令、至少一个刺激、刺激生成策略、反馈、和/ 或结果)、至少一个通信接口(用于与例如受试者、保健提供者、护理人员、临床研究调查员、数据库、监测应用程序等通信)、和/或检测装置(用于检测并提供关于例如刺激和/或受试者的反馈，包括γ振荡是否被诱导、受试者敏感性、认知功能、物理或化学变化、应力、安全性等)。
在一些实施方案中，γ振荡通过视觉刺激(诸如在约20Hz至约100Hz下的闪光)来诱导。在特定实施方案中，γ振荡通过在约20Hz 至约50Hz下的闪光来诱导。在另外的实施方案中，γ振荡通过在约 35Hz至约45Hz下的闪光来诱导。在又另外的实施方案中，γ振荡通过在约40Hz下的闪光来诱导。在一些实施方案中，受试者接受(例如，置于具有光阻挡装置的室中或佩戴光阻挡装置，所述装置发射) 约20Hz至约100Hz闪光、或约20Hz至约50Hz闪光或约35Hz 至约45Hz闪光、或约40Hz闪光。
在一些实施方案中，γ振荡通过听觉刺激来诱导，所述听觉刺激诸如在约20Hz至约100Hz、或约20Hz至约80Hz、或约20Hz至约50Hz、或约35Hz至约45Hz、或约40Hz的频率下的声音。在一些实施方案中，受试者接受(例如，置于具有噪声消除装置的室中或佩戴噪声消除装置，所述装置发射)约20Hz至约100Hz、约20Hz 至约80Hz、约20Hz至约50Hz、约35Hz至约45Hz、约40Hz的听觉刺激。
在一些实施方案中，受试者接受(例如，置于具有光阻挡装置的室中或佩戴光阻挡装置，所述装置发射)视觉和/或听觉刺激，持续约一小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、或更多。在一些实施方案中，受试者接受(例如，置于具有光阻挡装置的室中或佩戴光阻挡装置，所述装置发射)刺激，持续不多于约6小时、不多于约5小时、不多于约4小时、不多于约3小时、不多于约2小时、或不多于约一小时。在一些实施方案中，受试者接受(例如，置于具有光阻挡装置的室中或佩戴光阻挡装置，所述装置发射)刺激，持续小于一小时。
在一些实施方案中，受试者经历本文提供的方法。在其他实施方案中，受试者经历使用本文提供的方法对于多个单独情形的治疗。受试者可根据常规日程进行治疗或在症状出现或恶化时进行治疗。在一些实施方案中，慢性治疗可在减少可溶性Aβ肽和/或不可溶Aβ肽(即，斑)方面是有效的。
在一些实施方案中，γ振荡以细胞类型特异性方式诱导。在一些实施方案中，γ振荡在FS-PV-中间神经元中被诱导。当用于描述一类神经元时，术语“快闪”(FS)是指神经元在高速率下以很少的尖峰频率调整或尖峰高度衰减持续长时间段放电的能力。因此，这些神经元能够持续高频率(例如，等于或大于约100Hz或约150Hz)放电而没有显著调节。FS神经元的此特性在很大程度上可归因于其快速延迟整流通道(换言之，非常快地活化和灭活的通道)的表达。
在一方面，刺激可以是非侵入性的。如本文所用，术语“非侵入性的”是指不需要对身体的外科干预或操纵(诸如注射或植入组合物或装置)的装置、方法和系统。例如，刺激可以是视觉的(例如，闪烁光)、声音的(例如，声音振动)、和/或触觉的(使用力、振动或移动的机械刺激)。
在另一方面，刺激可以是侵入性的或至少部分侵入性的。例如，视觉的、声音的和/或触觉的刺激可与注射或植入组合物(例如，光敏蛋白)或装置(例如，整合的光纤和固态光源)组合。
实验数据
γ振荡在患病早期的5XFAD小鼠中在海马趾SWR过程中降低。
在若干神经和精神病症的多个大脑区域中已观察到γ缺陷，包括在患有AD的人类患者中自发γ同步的减少。令人感兴趣的是，减少的自发γ也在体内AD的两种小鼠模型(人类淀粉样蛋白前体蛋白 (hAPP)Tg小鼠和载脂蛋白E4等位基因(APOE4)敲入小鼠)中并且在另一种小鼠模型(Tg CRND8小鼠)的体外切片研究中发现。然而，不清楚γ振荡是否在AD的其他小鼠模型中改变，它是否在疾病进展早期发生，以及γ破坏是否影响疾病进展。
为了解决这些问题，记录来自清醒行为5XFAD小鼠(AD的携带五种家族性AD突变的良好建立的模型)的神经活性。具体地，5XFAD 小鼠表达五种不同的家族性AD等位基因，包括APP KM670/671NL (瑞典)、APP I716V(佛罗里达)、APP V717I(伦敦)、PSEN1 M146L (A&gt；C)、以及PSEN1 L286V。因此，5XFAD小鼠用作AD淀粉样蛋白病变的模型。在一些实施方案中，神经活性从大约3月大年龄 (此时，小鼠具有升高水平的Aβ)、但是在主要斑积聚发作以及学习和记忆缺陷表现之前的小鼠记录。图1是展示根据一些实施方案在球形跑步机上跑步通过虚拟线性迷宫的小鼠的示意图。食物受限的小鼠可由于在球形跑步机上来回跑步通过虚拟线性迷宫而接受奖励。
可记录来自海马趾亚区域CA1的神经活性。图2A和图2B是从海马趾CA1记录并且展示根据一些实施方案的θ振荡和锐波波纹 (SWR)的电迹线。在一些实施方案中，CA1中的γ振荡可在活性的不同时间段过程中存在，诸如在跑步过程中，此时观察到θ振荡(4-12 Hz)，如图2A所示，以及在静态和探索行为中，此时SWR发生，如图2B所示。
检查θ振荡过程中的功率谱密度，并且在5XFAD小鼠和WT同窝出生小鼠的缓慢γ功率(20Hz至50Hz范围)中未发现明显差异。图3A和图3B是展示根据一些实施方案在三月大的Tg 5XFAD小鼠和WT小鼠中在θ时间段过程中归一化功率谱和归一化功率谱密度的平均值和标准偏差的曲线图。图3A展示在三月大的5XFAD(n＝6 只小鼠)和WT(n＝6只小鼠)小鼠中在θ时间段过程中归一化功率谱的平均值和标准偏差。在一些实施方案中，每只动物的功率谱密度可归一化到其峰(在θ中)。图3B展示在三月大的5XFAD(n＝6只小鼠) 和WT(n＝6只小鼠)小鼠中在θ时间段过程中的归一化功率谱密度。
在一些实施方案中，作为下一步骤，检查在SWR过程中的γ振荡，这是持续大约50-100ms的150-250Hz的高频率振荡。SWR与群体活动的爆发(在该过程中，尖峰活动的模式跨海马体重演)相关联。之前的工作已示出缓慢γ在SWR过程中升高并且跨CA3和CA1同步。因此，跨这些海马趾亚区域的神经元更可能在SWR过程中一起击发，因为神经元更可能击发锁定到γ的相。实施一项研究，其中识别SWR(定义为约150Hz至约250Hz的波纹带中的功率高于平均值超过四个标准偏差的时间段)并且对频谱进行作图以检查在这些SWR 过程中跨一定频率范围的功率。在频谱图中，可观察到高于100Hz 的指示SWR的高频率振荡特征的增加的功率以及低于大约50Hz的指示γ功率的并发增加的增加的功率。
图4A和图4B是展示根据一些实施方案的WT小鼠和5XFAD小鼠的SWR的频谱图。图4A展示一只WT小鼠的平均SWR触发的频谱图示出在SWR 404过程中具有低于80Hz的频率的γ带402的增加，在右图中放大。图4B展示一只5XFAD小鼠的平均SWR触发的频谱图示出在SWR过程中γ带的增加，虽然此增加低于图4A所示的WT小鼠中的增加。
在一些实施方案中，所述研究发现这些较慢振荡(10-50Hz范围，如本文进一步所述)的瞬时频率是中心在40Hz周围的单峰分布。图 5A-图5C是描绘根据一些实施方案在SWR过程中的瞬时γ频率的分布的曲线图。图5A展示图4A所示的具有在40Hz周围的峰的同一只小鼠在SWR过程中的瞬时γ频率的分布(n＝370个SWR)。图5B 展示在5XFAD小鼠和WT小鼠中在SWR过程中的瞬时γ频率的分布示出每个记录会话的在40Hz周围的分布，并且图5C展示跨动物的平均值和平均值的标准误差(SEM)(在六只5XFAD动物中，n＝ 820、800、679、38、1875、57个γ周期/会话，并且在六只WT动物中，n＝181、1075、919、1622、51、1860、1903个γ周期/会话)。
在一些实施方案中，然后将在WT小鼠中在SWR过程中的这些γ振荡与5XFAD同窝出生小鼠中的那些γ振荡进行比较，并且发现在SWR过程中的γ的缺陷：虽然γ功率在5XFAD小鼠中在SWR过程中确实从基线增加，但是在SWR过程中的γ功率在5XFAD小鼠中比在WT小鼠中显著更小，如本文进一步所述的。
图6A是描绘根据一些实施分别在5XFAD小鼠和WT小鼠中作为自从SWR的峰之后的时间的函数的z得分γ功率的一系列图。图 6A示出平均值和SEM，并且展示γ功率在SWR过程中相对于基线增加。
图6B是描绘根据一些实施方案在5XFAD小鼠和WT小鼠中在 SWR过程中的γ功率的累积分布的曲线图。在SWR过程中的γ功率的累积分布示出在5XFAD小鼠中比在WT小鼠中显著更小的增加(秩和测试，p<10-5；在六只5XFAD小鼠中n＝2166个SWR，并且在六只WT小鼠中n＝3085个SWR；在5XFAD小鼠中z得分中值为 1.02(0.39-1.87，第25-第75百分点)，并且在WT小鼠中z得分中值为1.18(0.53-2.15，第25-第75百分点))。
图6C和图6D是描绘根据一些实施方案的WT小鼠606和 5XFAD小鼠608的在SWR的峰周围100ms过程中的z得分γ功率的累积分布以及跨动物的平均值和SEM(阴影)的曲线图(在六只 5XFAD动物中n＝514、358、430、22、805、37个SWR/会话，并且在六只WT动物中n＝82、311、370、776、18、710、818个SWR/ 会话)。
图6E是描绘根据一些实施方案在WT小鼠614和5XFAD小鼠 616中在大SWR(检测阈值高于平均值大于6个标准偏差)的峰周围 100ms过程中的z得分γ功率的累积分布的曲线图。针对非正态分布的数据全部执行秩和测试，如本文进一步所述的。图6E示出在WT 小鼠614和5XFAD小鼠616中显著更小的增加(秩和测试，p<10-5，在六只5XFAD小鼠中n＝1000个SWR，并且在六只WT小鼠中n＝ 1467个SWR)。
在一些实施方案中，尖峰在两个组中通过这些γ振荡进行相调制，然而通过γ相进行的尖峰的调制在5XFAD动物中比在WT动物中更弱。所述研究发现调制的深度在5XFAD动物中比在WT动物可显著更小。
图7A是描绘作为γ振荡的相的函数的尖峰分数的曲线图，并且图7B是描绘根据一些实施方案在三月大的5XFAD(n＝6只小鼠)和 WT(n＝6只小鼠)小鼠中在SWR过程中作为γ相的函数的在SWR 过程中的尖峰调制的深度的曲线图(秩和测试，bootstrap重采样，p<10-5，这在针对多重比较进行对照时是重要的，n＝2500个5XFAD 尖峰-γ相分布和3000个WT分布，在5XFAD小鼠中调制深度中值为0.35(0.21-0.44，第25-第75百分点)，并且在WT小鼠中调制深度中值为0.38(0.29-0.47，第25-第75百分点))。误差棒指示平均值 +/-SEM。曲线图704展示尖峰调制的深度的频率曲线
图7C和图7D是展示根据一些实施方案针对每只动物在5XFAD 动物和WT动物中作为γ振荡的相的函数的在SWR过程中的海马趾 CA1中尖峰分数以及跨动物的平均值和SEM的曲线图(在六只 5XFAD动物中在SWR过程中n＝2475、1060、3092、25、6521、123 个尖峰/会话，并且在六只WT动物中在SWR过程中n＝360、4741、 1564、2961、88、3058、4270个尖峰/会话)。
图7E是描绘作为γ振荡的相的函数的尖峰分数的曲线图，并且图7F是描绘在三月大的5XFAD(n＝6只小鼠)和WT(n＝6只小鼠) 小鼠中在大SWR(检测阈值高于平均值大于6个标准偏差，如本文进一步所述的)过程中的尖峰调制的深度的曲线图(秩和测试，bootstrap重采样，一个星号指示p<10-10，n＝2500个5XFAD尖峰-γ相分布和3000个WT分布)。误差棒指示平均值+/-SEM。
所述研究还发现与WT相比，在5XFAD小鼠中在非θ时间段中可能存在更少的SWR/次(秩和测试，p<10-5，在六只5XFAD小鼠中 n＝634个非θ时间段，并且在六只WT小鼠中n＝750个非θ时间段，在5XFAD小鼠中中值为0.07Hz(0-0.17，第25-第75百分点)，并且在WT小鼠中中值为0.12Hz(0-0.24，第25-第75百分点))，从而进一步减少如上公开的γ功率升高的时间段。
图8A和图8B是描绘根据一些实施方案针对每只动物(图8A)和组合的所有动物在5XFAD小鼠802和WT小鼠804中的SWR速率/ 非θ时间段的曲线图(秩和测试，p<10-10，在六只5XFAD动物中n ＝117、210、151、55、100、1个非θ时间段/会话，并且在六只WT 动物中n＝80、68、115、95、15、159、218个非θ时间段/会话)。这些结果揭示在发展主要淀粉样蛋白斑积聚之前AD的小鼠模型中γ振荡和海马趾CA1尖峰的调制的缺陷以及认知缺陷的证据。
在γ频率下的FS-PV-中间神经元的光遗传刺激在海马体的CA1 区域中驱动γ振荡。
在AD的此小鼠模型中的疾病进展早期在SWR过程中观察到γ缺陷引发以下问题：γ振荡是否可影响分子和细胞AD病理生理学。为了测试此问题，通过在2.5月大的5XFAD/PV-Cre双转基因小鼠的海马趾CA1中的FS-PV-中间神经元中使用双侧限定反向开放阅读框(double-floxed inverted open reading frame)(DIO)ChR2-EYFP腺病毒相关病毒(AAV)以Cre依赖性方式表达ChR2来光遗传地驱动γ振荡。实施研究来确定小鼠的海马趾γ振荡的遗传诱导是否影响AD的小鼠模型中的分子病变。在清醒行为WT小鼠和5XFAD小鼠中遗传地诱导海马趾γ振荡。
生成具有由EF1α启动子驱动的连接到增强的黄色荧光蛋白 (EYFP)的双侧限定反向开放阅读框(DIO)ChR2的腺病毒相关病毒 (即，AAV5病毒)。图9是展示根据一些实施方案用于调节受试者的大脑中的特定细胞类型的活化的病毒载体(即， AAV5-DIO-ChR2-EYFP)的示意图。将病毒表达以细胞类型特异性方式靶向到海马体的CA1区域。在Cre-重组酶的存在下，两种不相容的loxP变体中的一种翻转以实现ChR2的表达。
使用允许病毒感染的精确区域靶向的立体定位病毒注射方法用 AAV-DIO-ChR2-EYFP或仅EYFp构建体感染5XFAD小鼠的海马体的CA1区域。在一个实施方案中，在注射时，将含有光纤电缆的套管(白色棒)放置在高于靶向的大脑区域约0.3mm。在两周之后(这提供小鼠恢复和病毒在PV细胞中表达的时间)，光遗传地操纵CA1中间神经元。
图10A和图10B是展示根据一些实施方案向受试者的海马体的 CA1区域递送信号的示意图。在图10A中，根据一些实施方案，示出在通过海马体中的光遗传学经历刺激时在球上跑步通过迷宫的小鼠。如图10A和图10B所示，箭头1000指示在约40Hz下闪烁以活化大脑区域的蓝光。
在所述实施例中，使用光纤信道/物理接触连接器在每个端部将 200-mW 493-nmDPSS激光器连接到接插线。在所述实验过程中，递送约1mW的光学刺激，持续约一小时。更具体地，在各种频率下(包括θ(例如，约8Hz)、γ(例如，约40Hz))并且也在约40Hz下随机地将蓝光(例如，473nm)递送通过正好定位在海马体的CA1区域上方的光纤。在一些实施方案中，不测试刺激条件。根据一些实施方案，θ条件充当频率对照，并且随机条件针对节律性特异性进行对照。
在一小时刺激完成之后，切开大脑组织并且在-80℃下冷冻以用于染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析。图11是展示根据一些实施方案使用ChR2和DAPI对受试者的神经组织进行免疫染色的免疫荧光图像。在所述实施例中，图11示出海马体中的DAPI(核)和ChR2 染色。
图12A是展示根据一些实施方案在PV+中间神经元中表达的 ChR2-EYFP的免疫荧光图像。图12A示出ChR2-EYFP在三月大的5XFAD/PV-Cre小鼠的CA1中的PV+中间神经元中强表达(比例尺＝100μm)。图12B是展示在表达AAV DIO ChR2-EYFP(其仅在PV+ 细胞中显示EYFP表达)的三月大的5XFAD/PV-Cre CA1中在抗EYFP 抗体和抗PV抗体的情况下的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。为了比较5XFAD小鼠和WT小鼠，在5XFAD阴性同窝出生小鼠中的FS-PV-中间神经元中表达ChR2。作为光刺激的非特异性作用的对照，使用表达仅含有EYFP的AAV-DIO的5XFAD/PV-Cre双转基因小鼠。在这些小鼠中，在相同的遗传背景和光递送条件下，光递送不引起光遗传刺激。在一些实施方案中，出于两个原因选择在40Hz下的FS-PV-中间神经元。第一，先前的研究已示出在40Hz下驱动 FS-PV-中间神经元产生最大的LFP反应。第二，在一些实施方案中，发现在SWR过程中的γ缺陷，并且在SWR过程中的瞬时γ频率形成中心在40Hz周围的分布，如图5A-图5C所示。在一些实施方案中，用于电生理学记录，将40-Hz刺激的时间段与没有刺激的时间段或具有在随机间隔(选自中心在40Hz处的泊松分布)下递送的刺激的时间段交错，如本文进一步所述的。
图13A和图13B包括根据一些实施方案的研究、局部场电势的电迹线、和FS-PV-中间神经元的功率谱密度的示意图。参考图13A， 1302是在FS-PV-中间神经元的40Hz光遗传驱动之前和过程中的 CA1中的局部场电势的电迹线。曲线图1304展示在40-Hz刺激、随机刺激(具有选自中心在40Hz处的泊松分布的随机间隔下的刺激)、或没有刺激过程中CA1中的FS-PV-中间神经元的功率谱密度的平均值和标准偏差(n＝四只5XFAD小鼠和三只WT小鼠)。图13B展示在 40-Hz刺激1306、随机刺激1308、或没有刺激1310过程中每只小鼠的CA1中的FS-PV-中间神经元的功率谱密度(在169、130、240、73 个40Hz刺激，143、129、150、72个随机刺激，以及278、380、52、 215个没有刺激时间段/动物的情况下，n＝四只5XFAD小鼠；并且在65、93、91个40Hz刺激，64、93、90个随机刺激，以及187、276、 270个没有刺激的情况下，n＝三只WT小鼠)。在40Hz下递送1ms 的473-nm光脉冲在LFP中引起在40Hz下的增加的功率，如图13A 和图13B的曲线图1306所示，而随机刺激不引起在40-Hz下的增加的功率，如图13A和图13B的曲线图1308所示。
此外，在一些实施方案中，光脉冲在光启动之后2-3ms有效地驱动尖峰，并且尖峰/脉冲在随机和40-Hz条件两者中是相似的。图 14A和图14B包括根据一些实施方案的原始电迹线、在光遗传刺激之后针对尖峰进行滤波的迹线、和在1ms激光脉冲启动之后尖峰可能性的曲线图。图14A展示示例性原始迹线1402和在光遗传刺激1406 之后针对尖峰(300-6000Hz)1404滤波的迹线。曲线图1408展示在 40-Hz刺激、随机刺激或没有刺激过程中在1ms激光脉冲启动之后尖峰/脉冲的频率曲线(在四只5XFAD小鼠和三只WT小鼠中，n＝345762个40-Hz刺激、301559个随机脉冲刺激、以及32350个没有刺激时间，距离552个40-Hz刺激、543个随机刺激、以及1681个没有刺激时间段至少500ms)。图14B示出响应于40-Hz刺激1412、随机刺激1414、或没有刺激1410在1ms激光脉冲启动之后的尖峰可能性，其中在激光脉冲启动之后大约2-3ms尖峰增加(n＝四只 5XFAD，具有87、130、8、73个40-Hz刺激，85、129、5、72个随机刺激，以及251、379、15、215个没有刺激时间段/动物；并且n＝三只WT，具有65、93、91个40-Hz刺激时间段/动物，64、93、90 个随机刺激时间段/动物，以及187、277、270个没有刺激时间段/动物)。误差棒示出平均值+/-SEM。
因此，CA1中的40-Hz振荡通过FS-PV-中间神经元的光遗传刺激被有效地驱动。先前的研究已示出Aβ肽水平在神经活性增加之后升高并且在神经活性沉默之后降低。在一些实施方案中，随机刺激条件用于针对由刺激导致的尖峰活动的总体变化进行对照。在一些实施方案中，比较在40Hz刺激和随机刺激的交错时间段过程中的多单元击发速率，并且在这些条件中的击发速率之间没有发现显著的差异。
图15A是展示根据一些实施方案在40-Hz刺激时间段与随机刺激时间段之间的击发速率的差异的柱状图。图15A示出两种类型的刺激引发相似量的尖峰活动(针对零中值的Wilcoxon符号秩测试，p> 0.6，n＝538个来自四只5XFAD小鼠和三只WT小鼠的刺激时间段，“n.s.”指示非显著的)。针对所有小鼠一起的在40Hz刺激与随机刺激过程中的击发速率之间差异分布的零中值的Wilcoxon符号秩测试， p>0.6：中值-1.75×10-5Hz(-1.28-1.18Hz，第25-第75百分点)n＝538 个刺激时间段。
图15B是展示每只动物的多单元击发速率/40-Hz刺激1512、随机刺激1514、和没有刺激1510时间段的条形图(每只动物(三只WT 小鼠和四只5XFAD小鼠)的秩和测试，p>0.09，中值和四分位数在图中示出，n＝87、130、8、65、93、91、73个40-Hz刺激时间段和 85、129、5、64、93、90、72个随机刺激时间段/小鼠)。盒须图示出中值(盒中的白线)和四分位数(盒的顶部和底部)。在所有动物中，40 Hz刺激与随机刺激之间的击发速率不是显著地不同的，从而示出随机刺激条件充当尖峰活动的对照(针对每只动物(三只WT小鼠和四只 5XFAD小鼠)的秩和测试，p>0.09，中值和四分位数在图中示出，n ＝87、130、8、65、93、91、73个40-Hz刺激时间段和85、129、5、 64、93、90、72个随机刺激时间段/小鼠)。还检查相对于没有刺激， 40-Hz刺激是否导致神经元过强活性。在大部分动物中，40Hz刺激或随机刺激与没有刺激之间的击发速率不是显著地不同的(针对每只动物(2只WT和两只5XFAD)的秩和测试，p>0.25，n＝8、93、91、 73个40-Hz刺激时间段和15、277、270、215个基线时间段/动物)，或者在40Hz刺激或随机刺激过程中的击发速率低于在没有刺激过程中的击发速率(针对每只动物(1只WT和1只5XFAD)的秩和测试，p <10-5，这在针对执行多重比较进行校正时是显著的，n＝130、65个 40-Hz刺激时间段和379、187个基线时间段/动物)，从而指示40-Hz 刺激不导致神经元过强活性。在一只动物中，在40Hz刺激或随机刺激的情况下，存在比在基线过程中显著更多的活性(针对1只5XFAD 小鼠的秩和测试，p<10-5，n＝87个40-Hz刺激时间段和251个基线时间段/动物)。因此，在七只动物中的六只中，没有证据显示FS-PV- 中间神经元的40Hz光遗传刺激导致过强活性。因此，在一些实施方案中，虽然随机条件不诱导γ振荡，但是它确实引起相似量的多单元尖峰活动，如图15A所示。
图16A是根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域中特定细胞类型的刺激的频率特异性增加过程中从受试者的海马体记录的电迹线。更具体地，图16A根据一些实施方案在FS-PV+的刺激(即，γ条件)的频率特异性增加过程中从受试者的海马体记录。
图16B是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域中特定细胞类型的刺激中的局部场电势功率的频率特异性增加的功率谱密度的曲线图。具体地，图16B中的功率谱密度图验证刺激的特异性。当FS-PV+被40-Hz蓝光脉冲活化时，局部场电势(LFP)功率在γ刺激条件过程中仅在40Hz带1600中增强(n＝4只小鼠/组)。基线或随机刺激条件在此频率1600下均没有显示增强。
γ刺激减少海马体的CA1区域中的Aβ产生。
Aβ的积聚可引发对于AD病变典型的多种神经中毒事件。因此，在一些实施方案中，γ刺激影响检查的5XFAD小鼠中的总体Aβ肽水平。使用三月大的小鼠，因为斑在这些小鼠中在此阶段的海马体中不存在，从而允许调查与斑负荷无关的可溶性Aβ动力学。在一些实施方案中，发现在海马体的CA1区域中，与EYFP对照组相比，在40Hz 组中，FS-PV-中间神经元的一小时刺激使Aβ1-40减少53.22％并且使 Aβ1-42减少44.62％，如通过AβELISA分析测量的。
图17A和图17B是描绘根据一些实施方案将所有小鼠分组在一起通过单向ANOVA获得的5XFAD/PV-Cre CA1的相对Aβ1-40和 Aβ1-42水平的条形图(对于Aβ1-40，n＝8只EYFP小鼠和740Hz小鼠，对于Aβ1-42，n＝4只小鼠/组)。图17A中的条形图代表每种刺激条件中的5XFAD/PV-Cre CA1的相对Aβ1-40水平。条形图中叠加在条上的圆圈1702指示每个组中的单个数据点(n＝8只EYFP5XFAD/PV-Cre 小鼠，n＝7只40-Hz 5XFAD/PV-Cre小鼠，n＝4只8-Hz 5XFAD/PV-Cre小鼠，n＝6只随机5XFAD/PV-Cre小鼠/组)。符号“n.s.”1704指示非显著的，星号1706指示p<0.05，双星号1708指示p<0.01，在此图中针对所有的条形图通过单向ANOVA进行。图17B代表每种刺激条件中的5XFAD/PV-Cre CA1的相对Aβ1-42水平(n ＝4只EYFP小鼠，n＝4只40-Hz小鼠，n＝3只8Hz小鼠，n＝3 只随机5XFAD/PV-Cre小鼠/组)。图17A和图17B示出平均值和SEM。
表1(以下)描绘当比较来自接受不同条件的相同同窝出生小鼠的小鼠时显著不同的原始浓度(pg/ml)值，p<0.05，通过Student’s t-测试进行。表1显示每个实验组在ELISA稀释的情况下的原始Aβ1-40和Aβ1-42水平。
表1
Figure GDA0003623860480000441
Figure GDA0003623860480000451
Figure GDA0003623860480000461
在一些实施方案中，执行一组综合性的对照实验来确定所述作用是否对于频率、细胞类型和/或节律性是特异性的。为了确定频率特异性，在8Hz下驱动5XFAD/PV-Cre双特异性小鼠的FS-PV-中间神经元并且没有观察到Aβ水平的变化。然后在随机下驱动FS-PV-中间神经元并且所述作用对于节律刺激是特异性的。实际上，淀粉样蛋白水平在随机刺激之后没有降低，并且事实上，Aβ1-40反而增加230.1％并且Aβ1-42增加133.8％(参见，例如，图17A和图17B，p<0.01，将所有小鼠分组在一起通过单向ANOVA进行，对于Aβ1-40，n＝8只 EYFP小鼠并且n＝4只随机小鼠，对于Aβ1-42，n＝3只小鼠/组。比较来自接受不同条件的相同同窝出生小鼠的小鼠并且观察到显著不同，p<0.01，通过Student’s t-测试进行)。
最后，使用5XFAD/αCamKII-Cre双特异性小鼠通过在8Hz和 40Hz下在海马趾CA1中的CamKII+兴奋性神经元中进行刺激来测试所述作用的细胞类型特异性。图18A和图18B是描绘根据一些实施方案通过单向ANOVA获得的5XFAD/αCamKII-Cre CA1的相对 Aβ1-40和Aβ1-42水平的条形图。图18A代表每种刺激条件中的5XFAD/αCamKII-Cre CA1的相对Aβ1-40水平。条形图中叠加在条上的圆圈1802指示每个组中的单个数据点(n＝6只40-Hz 5XFAD/αCamKII-Cre小鼠，n＝3只8-Hz 5XFAD/αCamKII-Cre小鼠， n＝3只随机5XFAD/αCamKII-Cre小鼠/组，符号“n.s.”1804指示非显著的，星号1806指示p<0.001，通过单向ANOVA进行)。
图18B代表每种刺激条件中的5XFAD/αCamKII-Cre CA1的相对 Aβ1-42水平(n＝3只αCamKII-Cre小鼠/组)。在一些实施方案中，发现在8Hz或40Hz下驱动CamKII+兴奋性神经元不产生Aβ1-40和Aβ1-42水平的显著差异(参见，例如，图18A和图18B，右，p>0.05，通过单向ANOVA进行，n＝6只40Hz小鼠和3只8Hz小鼠(Aβ1-40)，n＝ 3只小鼠/组(Aβ1-42)。如果比较来自接受不同条件的相同同窝出生小鼠的小鼠，它们不是显著不同的，p>0.05，通过Student’st-测试进行)。与5XFAD/PV-Cre小鼠相似，使用随机刺激驱动CamKII+神经元也引起Aβ1-40的257.6％升高和Aβ1-42的133.3％增加(参见，例如，图18A 和图18B，右，p<0.001，通过单向ANOVA进行，对于Aβ1-40，n＝ 5只40Hz小鼠和3只随机小鼠，对于Aβ1-42，n＝3只小鼠/组。如果比较来自接受不同条件的相同同窝出生小鼠的小鼠，则Aβ1-40是显著不同的，p<0.001，通过Student’s t-测试进行，并且Aβ1-42是显著不同的，p＝0.13，通过Student’s t-测试进行)。
因此，在40-Hz刺激之后Aβ肽水平的降低对于驱动FS-PV-中间神经元可以是特异性的。在一些实施方案中，为了使用免疫组织化学确认这些ELISA发现，使用不与CA1中的APP交叉反应的β-淀粉样蛋白C-末端端部特异性抗体来执行Aβ-标记。
图19A是展示根据一些实施方案在海马趾CA1区域中使用抗Aβ抗体和抗EEA1抗体的免疫组织化学的一系列图像。具体地，图19A 是展示在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中在5XFAD/PV-Cre的海马趾CA1区域中使用抗Aβ1902(D54D2)和抗EEA1 1904(610457)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。图19B是描绘根据一些实施方案归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性的一系列条形图。具体地，图19B展示归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性(n＝4只小鼠/组，1908指示p<0.05并且1920指示p<0.01，通过单向ANOVA进行)。
图20A是展示根据一些实施方案在5XFAD/PV-Cre的海马趾 CA1区域中使用抗Aβ抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。具体地，图20A是展示在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中在 5XFAD/PV-Cre的海马趾CA1区域中使用抗Aβ2002(12F4)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。图20B是描绘根据一些实施方案归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性的条形图。具体地，图20B展示归一化到EYFP的Aβ的相对免疫反应性(n＝4 只小鼠/组，2004指示p<0.05并且2006指示p<0.001，通过单向 ANOVA进行)。当与EYFP组进行比较时，Aβ-标记的强度在三月大的5XFAD/PV-Cre双转基因小鼠中在FS-PV-中间神经元的40-Hz刺激之后降低39.5％，并且在随机刺激之后显著增加187.0％(参见，例如，图19A、图19B、图20A和图20B，p<0.05并且p<0.01，通过单向ANOVA进行，n＝4只小鼠/组)。
大脑淀粉样蛋白浓度可取决于Aβ产生和清除速率。在一些实施方案中，Aβ肽通过β-分泌酶和γ-分泌酶进行的APP的顺序蛋白水解裂解产生。当BACE1使APP全蛋白质裂解时，可产生APP的CTF 和NTF。在一些实施方案中，为了阐明40-Hz刺激如何降低Aβ水平，通过在FS-PV-中间神经元刺激之后测量APP的裂解中间体CTF和 NTF的水平来检查γ影响的APP裂解。在40-Hz刺激之后，发现与 EYFP组相比，CTF在40-Hz刺激之后显著降低18.6％并且与随机组相比，显著降低19.7％(p<0.05并且p<0.01，通过单向ANOVA进行，n＝6只小鼠/组)。
图21A是根据一些实施方案描绘在EYFP、随机和40-Hz刺激条件中在CA1中的APP(CT695)、APP NTF(A8967)、APP CTF(CT695)、以及β-肌动蛋白(A5316)(负荷对照)的水平的代表性蛋白质印迹，一只小鼠/泳道，其中每种条件两个生物重复。图21B是描绘根据一些实施方案的APP CTF的相对免疫反应性的条形图。具体地，图21B 展示在40-Hz相对于EYFP和随机条件中APP CTF的相对(归一化到肌动蛋白)免疫反应性(n＝6只小鼠/组，一个星号2102指示p<0.05，并且两个星号2104指示p<0.01，通过单向ANOVA进行)。图21C 是描绘根据一些实施方案CA1中的全长APP 2106(CT695)、APP CTF 2108(CT695)和β-肌动蛋白2112(A5316，负荷对照)的水平的一系列蛋白质印迹。具体地，图21C展示在EYFP、随机和40-Hz刺激条件中在CA1中的全长APP 2106(CT695)、APP CTF 2108(CT695)和β- 肌动蛋白2112(A5316，负荷对照)的水平，一只小鼠/泳道，其中每种条件两个生物重复。
图22A是描绘在40-Hz相对于EYFP和随机条件中APP NTF的相对(归一化到肌动蛋白)免疫反应性的条形图(n＝6只小鼠/组，符号“n.s”2204指示非显著的，并且2202指示p<0.05，通过单向ANOVA 进行)。图22B是描绘在EYFP、随机和40-Hz条件中全长APP的相对(归一化到肌动蛋白)免疫反应性的条形图(n＝6只小鼠/组，通过单向ANOVA进行)。
在一些实施方案中，在40-Hz刺激之后，发现与EYFP组相比， APP NTF水平显著降低28.5％，并且与随机组相比，显著降低28.2％ (参见，例如，图21A、图22A和图21C，p<0.05，通过单向ANOVA 进行，n＝6只小鼠/组)。此外，在各个组中全长APP的水平似乎是相似的，从而显示Aβ的降低不是由于前体水平的变化(参见，例如，图21A、图22B、图21C，在APP实验中n＝6只小鼠/组)。在一些实施方案中，由于在此小鼠模型中与其裂解产物相比APP的相对高丰度，全长APP的变化可能难以检测。
在一些实施方案中，APP的处理发生在囊泡运输通路内，并且之前的工作已显示APP在活性刺激之后被转运到循环内体中。此外，已在来自AD患者的大脑组织中和在衍生自AD患者的人类神经元中观察到扩大的早期内体。在一些实施方案中，为了测试γ刺激是否影响实验动物中的内体丰度，使用两种标记物EEA1(早期内体抗原1) 和Rab5(由RAB5A基因编码的Ras相关蛋白)在40Hz刺激和随机刺激之后在CA1中表征早期内体。图23是展示在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中在三月大的5XFAD/PV-Cre小鼠中使用抗Rab5 (ADI-KAp-GP006-E)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。
图24A是代表根据一些实施方案归一化到EYFP的EEA1的相对免疫反应性的条形图(n＝4只小鼠/组，一个星号2402指示p<0.05，并且两个星号2402指示p<0.01，通过单向ANOVA进行)。图24B 是描绘根据一些实施方案在EYFP、40-Hz和随机刺激条件下来自5XFAD/PV-Cre的CA1的相对Rab5强度水平的条形图(n＝3只小鼠/ 组，三个星号2408指示p<0.001，通过单向ANOVA进行)。在一些实施方案中，EEA1染色在神经元细胞体中产生点状的胞质和近膜图案，这对于早期内体是典型的(参见，例如，图19A)。在一些实施方案中，Rab5标记主要限于细胞体和质膜，由集中在内体和膜区室内的小的薄色斑代表(参见，例如，图23)。总之，CA1神经元的早期内体标记证明与EYFP对照相比在40-Hz刺激之后EEA1(39.7％)和 Rab5(40.1％)染色强度显著降低(参见，例如，图19A、图23、图24A， p<0.05并且p<0.001，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自3只小鼠/组的切片)。相比之下，与EYFP对照相比，FS-PV-中间神经元的随机刺激使EEA1染色强度增加122％(参见，例如，图19A和图 24A，p<0.01，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自3只小鼠/组的切片)。在一些实施方案中，EEA1染色强度的处理依赖性变化与CA1 中的Aβ的变化类似(参见，例如，图19A-图19B、图20A-图20B、以及图24A-图24B，p<0.05，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自 3只小鼠/组的切片)。这些结果表明除观察到的CTF的变化之外， 40-Hz刺激改变EEA1和Rab5，从而指示一般内体处理的差异。
图25A是描绘根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后Aβ肽同种型Aβ1-40的水平的条形图。在所述实验中，在约40Hz下的FS-PV+的一小时光遗传刺激502降低海马趾 CA1中的Aβ1-40水平。在8Hz下的兴奋性锥体刺激506和在40Hz 下的兴奋性锥体刺激508不显著地影响Aβ1-40水平。随机40-Hz刺激 504和具体地随机兴奋性锥体刺激510显著地增加Aβ1-40水平(n＝4-9 只动物/组)。
图25B是描绘根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的海马体的CA1区域中的特定细胞类型之后Aβ肽同种型Aβ1-42的降低的条形图。在所述实验中，在约40Hz下的FS-PV+的一小时光遗传刺激516降低海马趾CA1中的Aβ1-42水平(n＝2-4只动物/组)。在8Hz 下的刺激520、在40Hz下的兴奋性锥体刺激522和在8Hz下的兴奋性锥体刺激524增加Aβ1-42水平。随机40-Hz刺激518和具体地随机兴奋性锥体刺激526显著地增加Aβ1-42水平)。
图25C是展示根据一些实施方案使用γ振荡刺激受试者的海马体的CA1区域中的特定细胞类型之后全长APP 528、534的水平(归一化到肌动蛋白532)增加和CTF(例如β-CTF)530、536的水平(归一化到肌动蛋白532)降低的一系列图像。与随机40-Hz对照条件相比，在 40-Hz下的FS-PV+刺激降低APPβ-CTF水平并且增加全长APP水平 (n＝4-6只动物/组)。因为β-CTF是在通过BACE1进行的APP的淀粉样蛋白生成裂解过程中产生的APP衍生物，所以更高的β-CTF水平代表增加的Aβ产生。
图26A-图26B是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的 CA1区域的不同类型刺激之后的内体水平(基于EEA1水平)的免疫荧光图像。具体地，图26B与图26A的比较显示与随机FS-PV+刺激900 相比，通过FS-PV+40-Hz刺激诱导γ振荡降低EEA1水平(内体水平的标记物)，如通过免疫荧光测量的(n＝3只小鼠/组，p＝0.007)。细胞中降低的内体水平指示APP与β-分泌酶之间的降低的相互作用，这引起降低的APP裂解和Aβ产生。因此，所述研究显示因为增加的内体水平指示增加的APP处理和因此增加的Aβ产生，所以γ振荡减少AD小鼠模型中的AP产生。
图27是描绘根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后针对图26A-图26B的免疫荧光图像的平均强度值 (归一化到FAD)的条形图。
γ刺激诱导小神经胶质细胞的形态学转化。
在一些实施方案中，为了以无偏方式进一步探索40-Hz刺激的细胞和分子作用，在5XFAD/PV-Cre双转基因小鼠的一小时40-Hz FS-PV-中间神经元刺激或没有刺激(EYFP)之后执行海马趾CA1的全基因组RNA-seq。在RNA-seq实验中，从三只刺激小鼠和三只非刺激小鼠获得26,518,345个测序读数的平均值。数据QC分析揭示外显子/内含子比率的183的平均值、外显子/基因间比率的272的平均值、以及核糖体RNA读数的百分比的3.6％的平均值。所述分析识别到 523种差异表达的基因(DEG)，其中响应于40-Hz刺激，所述基因中的130种上调并且393种下调。
图28是呈现在具有和不具有40-Hz刺激的情况下通过小鼠海马趾CA1区域的全转录组RNA-seq确定的差异表达的基因的热图。针对每种差异表达的基因(行)计算归一化的z得分值。颜色代表基因表达的相对低和高水平。表2(以下)呈现通过40-Hz FS-PV-中间神经元刺激上调的130种基因(p<0.05，使用Cufflinks 2.2软件(可从在华盛顿州，西雅图，华盛顿大学的Trapnell实验室获得，以用于组装转录物、估计其丰度、以及测试RNA-seq样品中的差异表达和调节))。
表2
Figure GDA0003623860480000521
Figure GDA0003623860480000531
Figure GDA0003623860480000541
表3(以下)呈现通过40-Hz FS-PV-中间神经元刺激下调的393种基因(p<0.05，通过Cufflinks 2.2软件(可从在华盛顿州，西雅图，华盛顿大学的Trapnell实验室获得))。
表3
Figure GDA0003623860480000542
Figure GDA0003623860480000551
Figure GDA0003623860480000561
Figure GDA0003623860480000571
在一些实施方案中，上调的基因通常具有比下调基因更高的表达值。图29是示出根据一些实施方案在EYFP和40-Hz条件中上调和下调基因的FPKM值的盒形图。所述盒示出中值(盒中的黑线)和四分位数(盒的顶部和底部)，须代表最小值和最大值，并且圆圈代表异常值。上调基因可高度富集在小神经胶质细胞中。具体地，所有上调基因中的约35％在小神经胶质细胞中具有其最高的表达(其中约19％在神经元中，约17％在内皮细胞中，约14％在星形胶质细胞中，约9％在髓鞘化的少突胶质细胞中，约5％在少突胶质细胞前体细胞中，并且约1％在新形成的少突胶质细胞中)。
图30是展示根据一些实施方案在40-Hz刺激之后识别的上调基因的细胞类型特异性表达模式的饼形图。根据来自不同大脑细胞类型的可公开获得的RNA-seq数据计算基因FPKM值，所述细胞类型包括星形胶质细胞、内皮细胞、小神经胶质细胞、髓鞘化的少突胶质细胞(MO)、神经元、新形成的少突胶质细胞(NFo)、以及少突胶质细胞前体细胞(OPC)。因此，RNA-seq分析强烈表明FS-PV-中间神经元的一小时40-Hz刺激导致小神经胶质细胞的细胞状态的改变，鉴于越来越多的证据显示这些细胞在AD病变中发挥作用，这是重要的。
在一些实施方案中，为了进一步探索40-Hz刺激对于小神经胶质细胞的潜在作用，使用基因集富集分析将在不同化学和基因扰动下来自小神经胶质细胞、外周巨噬细胞和神经元的一系列可公开获得的 RNA-seq数据集与来自在本文中的一些实施方案中所述的表征的基因列表进行比较。表4(以下)展示通过40-Hz刺激上调和下调的基因与在不同化学和基因扰动下可公开获得的神经元、小神经胶质细胞和巨噬细胞特异性RNA-seq数据之间的相关性的基于GSEA的统计显著性。
表4
Figure GDA0003623860480000581
有趣的是，在40-Hz刺激之后的转录组变化与由于增加的神经活性(通过NMDA和荷苞牡丹碱)引起的变化更相似并且与由于沉默活性(通过河豚毒素)引起的变化较少相似。这些发现还支持以下发现： FS-PV-中间神经元的40-Hz刺激不降低神经元活性。此外，已知通过神经元活性上调的立即早期基因Nr4a1、Arc和Npas4在一小时的 40-Hz刺激之后升高，这通过RNA-seq和RT-qPCR两者示出。图31 是展示根据一些实施方案在RNA-seq数据集中特定基因靶的 RT-qPCR验证的条形图。所述条形图示出来自EYFP 3102和40-Hz 刺激3104条件的相对RNA水平(倍数变化)(一个星号指示p<0.05，两个星号指示p<0.01，并且三个星号指示p<0.001，通过Student’s t-测试进行，n＝3只小鼠/组)。顶部下调基因是Grin4和Camk2d(参见，例如，图31，p<0.05，n＝3只小鼠/组)。
另外，转录组结果表明小神经胶质细胞的更具吞噬性的状态。在一些实施方案中，上调基因与通过巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)(两者均已知促进小神经胶质细胞Aβ吸收)诱导的基因组变化正相关。图32A和图32B是展示根据一些实施方案在40Hz光闪烁过程中在大脑上方记录的局部场电势的功率谱密度的曲线图。图32A和图32B示出在40Hz下功率没有增加，因此所述作用不是由于记录设备上的光电效应或电噪声(n＝4、 2、1、1、17、42、36、55、53个40-Hz闪烁时间段，来自经历视觉皮层记录的三只5XFAD动物的4个记录会话和来自经历海马趾记录的两只5XFAD小鼠和三只WT小鼠的5个记录会话)。跨记录的平均值(实线)和标准偏差(阴影区域)在左图(图32A)上示出，并且每只动物的平均值(实线)和标准偏差(阴影区域)在右图(图32B)上示出。具有小于3个闪烁时间段的记录3202比具有更多数据的记录3204引起噪声更多的功率谱密度，但是两者均未显示在40Hz下的峰的证据。在一些实施方案中，实施RT-qPCR来验证涉及已知的小神经胶质细胞功能的上调基因。确认了与小神经胶质细胞吞没相关联的基因(包括 Cd68、B2m、Bst2、Icam1、和Lyz2)在40-Hz刺激之后在海马趾CA1 区域中上调。
图33是描绘根据一些实施方案在RNA-seq数据集中特定基因靶的RT-qPCR验证的条形图。图33示出EYFP 3302和40-Hz刺激3304 条件中的相对RNA水平(倍数变化)(一个星号指示p<0.05并且两个星号指示p<0.01，通过Student’s t-测试进行，n＝6只小鼠/组)。其他值得注意的上调基因包括小神经胶质细胞富集转录调节子Irf7、细胞粘附和迁移调节子Spp1、以及小神经胶质细胞增殖标记物Csf1r和 Csf2ra(参见，例如，图33，p<0.05并且p<0.01，通过Student’s t- 测试进行，n＝6只小鼠/组)。RT-qPCR还显示促炎基因Il6、Il1b(Il1-β)、Itgam(CD11-b)和抗炎基因Igf1的表达水平不变化(参见，例如，图33，p>0.05，通过Student’s t-测试进行，n＝6只小鼠/组)。因此，本文所述的转录组结果表明40Hz神经元刺激将小神经胶质细胞诱导成促进吸收的状态。
鉴于40-Hz刺激上调吞噬相关基因和迁移/细胞粘附相关基因两者，检查小神经胶质细胞活化的形态学特征。在一些实施方案中，使用识别小神经胶质细胞标记物Iba1以标记来自一小时的40Hz、随机或没有刺激(EYFP小鼠)之后的5XFAD/PV-Cre小鼠的海马趾CA1切片中的小神经胶质细胞的抗体。图34是展示EYFP、40-Hz和随机刺激条件中在5XFAD/PV-Cre小鼠的海马趾CA1区域中使用抗Iba1 3402(019-19741)抗体和抗Aβ3404(12F4)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。使用40x物镜拍摄图像，比例尺＝50μm)。箭头指示细胞体中的+Iba1/+Aβ信号。
图35A是描绘根据一些实施方案在EYFP和40-Hz条件中小神经胶质细胞的数量的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。图35B 是描绘根据一些实施方案在EYFP、40-Hz和随机刺激条件中归一化到EYFP的小神经胶质细胞体的直径的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。图35C是描绘根据一些实施方案在EYFP、40-Hz和随机刺激条件EYFP、40Hz和随机中归一化到EYFP的小神经胶质细胞初级过程或突起的平均长度的条形图。图35D是描绘根据一些实施方案在EYFP和40-Hz刺激条件中也是Aβ-阳性的Iba1-阳性(小神经胶质细胞)细胞体的百分比的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。符号“n.s.”3502指示非显著的，两个星号3504指示p<0.01，三个星号3506指示p<0.001，并且四个星号3508指示p<0.0001，通过单向ANOVA进行。
第一，计数6只动物/条件中Iba1+小神经胶质细胞的数量，并且与未刺激EYFP条件(8个小神经胶质细胞/ROI的平均值)(参见，例如，图34和图35A，p<0.01，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)相比并且与随机条件(10个小神经胶质细胞 /ROI的平均值)(参见，例如，图34和图35A，p<0.05，通过单向 ANOVA进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)，观察到在40Hz组中的几乎两倍多的小神经胶质细胞(15个小神经胶质细胞/212.55μm x 212.55μm感兴趣区域(ROI))。先前的研究已显示吞噬性小神经胶质细胞的两个主要特征是增加的细胞体大小和降低的过程长度，因此检查这些特征如何被40-Hz刺激影响。在一些实施方案中，测量视场中的每个清楚标记的Iba1+细胞体的直径。发现在40-Hz刺激之后，小神经胶质细胞体直径与没有刺激相比增加135.3％，并且与随机条件相比增加138.7％(参见，例如，图34和图35B，p<0.0001，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。测量每种条件中的小神经胶质细胞的初级过程的长度，并且观察到在40-Hz刺激条件中与EYFP对照相比初级小神经胶质细胞过程长度的54.0％减少和与随机刺激相比的38.5％减少(参见，例如，图34和图35C，p<0.0001，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。这些发现不被Iba1水平影响，因为在本文所述的基因表达分析中未观察到条件之间的Iba1表达的差异(参见，例如，表2和表3)。因此，在40-Hz 刺激之后观察到的细胞体大小增加和过程长度降低是与这些小神经胶质细胞朝向吞噬状态的转移一致的形态学变化。在使用Aβ抗体 (12F4，其不与APP交叉反应)共免疫染色之后，评估小神经胶质细胞内的Aβ的潜在共定位来作为评估小神经胶质细胞Aβ吸收的手段。在Iba1+细胞主要定位的CA1神经纤维网中，在40-Hz刺激之后，细胞体中具有Aβ/Iba1共定位(ImageJ，Fuji共定位插件)的小神经胶质细胞的数量与小神经胶质细胞的总数量的比率与EYFP对照相比增加54.9％并且与随机条件相比增加50.3％(参见，例如，图34和图35D， p<0.01，通过单向ANOVA进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。排除小神经胶质细胞过程中的Iba1/Aβ信号重叠以避免包括潜在的随机非吞没共定位。
在一些实施方案中，为了提供在小神经胶质细胞内Aβ信号的存在的更好的分辨率，创建来自此组织的小神经胶质细胞的3D渲染图和来自这些渲染图的视频。图36是根据一些实施方案通过合并来自图34的免疫荧光图像形成的一系列3D渲染图，3602旋转0度，3604 绕Y轴旋转-25度，并且3606绕X轴旋转30度。使用40x物镜拍摄图像(比例尺＝50μm)。总之，基因表达和形态学分析表明40-Hz刺激通过增加将小神经胶质细胞募集到刺激位点并且增强其吞没活性、从而导致与Aβ的增加的缔合来影响小神经胶质细胞活性。重要的是，在一些实施方案中，通过使用具有Hoechst的核染色测量CA1细胞层的厚度没有发现神经元损失的证据。平均CA1体积在EYFP与40-Hz 刺激组之间不是显著地不同的。
图37A是展示根据一些实施方案在EYFP和40-Hz刺激条件中在 5XFAD/PV-Cre的海马趾CA1区域中使用Hoechst的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。图37B是描绘根据一些实施方案在EYFP和 40-Hz刺激条件中5XFAD/PV-Cre的估计的CA1厚度的条形图(n＝4 只小鼠/组，“n.s.”指示非显著的，通过Student’s t-测试进行)。
接下来，根据一些实施方案，在一小时的刺激之后通过海马趾 CA1的全基因组RNA-seq来评定使用AAV-DIO-ChR2-EYFP感染并且使用40-Hz FS-PV+刺激(TREAT)或对照刺激(CTRL)刺激的5XFAD 小鼠中的差异基因表达。图38A是显示根据一些实施方案在TREAT或CTRL之后通过海马趾CA1的全基因组RNA-seq确定的523种差异表达的基因(DEG)的热图。图38A中的每行代表DEG，并且图38A 中的列代表三只个体对照动物和三只个体处理(40-HzFS＝PV+刺激) 动物的转录组图谱。
图38B是展示根据一些实施方案在图38A中的TREAT条件中上调的DEG之间的重叠的图表。在图38B中，与随机FS-PV+刺激相比，通过FS-PV+40-Hz刺激诱导γ振荡降低Iba1水平，如通过免疫荧光测量的(n＝3只小鼠/组，p＝0.006)。图38B示出在TREAT条件中上调的基因与通过抗炎小神经胶质细胞活化上调的小神经胶质细胞基因(即，MCSF基因)显著地且特异性地重叠。基因在小神经胶质细胞中上调，上调程度大于在星形胶质细胞、内皮细胞、髓鞘化的少突胶质细胞(MO)、神经元、新形成的少突胶质细胞(NFO)、以及少突胶质细胞前体细胞(OPC)中。表5(以下)呈现用于上调基因的小神经胶质细胞/巨噬细胞通路。
表5
Figure GDA0003623860480000631
根据一些实施方案，实施RT-qPCR来验证来自RNA-seq数据集的特定基因靶。图39是描绘根据一些实施方案在图38A的RNA-seq 数据集中特定基因靶的RT-qPCR验证的条形图。具体地，图39示出在对照和处理条件中特定基因靶(包括基因CSF1、CSF1R、ll-6、ll1-β、CD11-b、CYBA、Hmox1、H2-K1、Lgals3、以及Icam1)的倍数变化(归一化到GAPDH)。
图40是展示根据一些实施方案图38A的上调基因与其相关的生物过程的图。重要的是，图40中的上调基因与免疫相关过程特异性地相关联。上调基因属于免疫相关生物过程，包括淋巴细胞介导的过程、适应性免疫过程和免疫球蛋白介导的过程。图41是展示根据一些实施方案图38A的下调基因与其相关的生物过程的图。下调基因属于生物过程，包括细胞运动、细胞-细胞信号传导、突触传递、运动行为、以及神经元突起，如图41所示。
图42A是展示根据一些实施方案在受试者的海马体的CA1区域的不同类型刺激之后Iba1的水平的一系列免疫荧光图像。图42B是描绘根据一些实施方案针对图42A的免疫荧光图像的平均强度值的条形图。图42A示出内体水平通过γ节律的光遗传增强降低。通过FS-PV+40-Hz刺激诱导γ振荡降低EEA1(内体的标记物)的水平，如通过免疫荧光测量的(n＝3只小鼠/组，p＝0.08)。所述结果显示因为增加的内体水平指示增加的APP处理和因此增加的Aβ产生，所以γ振荡减少AD小鼠模型中的Aβ产生。
综合考虑，研究结果显示γ节律的恢复或诱导使AD的小鼠模型中的分子病变恢复。通过光遗传进行的γ振荡的细胞类型特异性的和暂时精确的再引入减少同种型Aβ1-40和Aβ1-42的生成并且增强其清除，所述肽聚集而引发涉及AD神经病变的许多退化性级联。此外，此处理诱导抗炎小神经胶质细胞信号传导通路，从而抵消与神经退化相关的免疫机制。
根据一些实施方案，细胞类型特异性的和暂时受控的γ振荡可在没有光遗传的情况下在海马体、视觉皮层、桶状皮层、和/或听觉皮层中诱导。
在γ频率下的视觉刺激非侵入性地驱动视觉皮层中的γ振荡。
通过在40Hz下的光遗传刺激进行的Aβ水平的明显降低导致探索其他方式来在大脑中诱导40-Hz振荡，以便确保所述作用对于光遗传操纵或侵入性程序不是以某种方式特异性的。为了检查光闪烁是否可用作在视觉皮层中诱导40-Hz振荡的非侵入性方式，在一些实施方案中，将动物暴露于40Hz或随机闪烁的时间段和与黑暗时间段交错的连续光。
图43A是展示根据一些实施方案暴露于光闪烁刺激的小鼠的示意图。为了确定此光闪烁是否改变Aβ，将动物暴露于40-Hz光闪烁一小时，与如本文所述的减少Aβ的光遗传刺激的持续时间一致。光闪烁覆盖动物的整个视场。作为分子和细胞测定的对照，将三月大的5XFAD小鼠维持在恒定黑暗中三天或使用恒定光或20-Hz闪烁光或 80-Hz闪烁光处理一小时(参见，例如，图43A)。
图43B包括根据一些实施方案在40-Hz光闪烁之前和过程中视觉皮层中的局部场电势迹线和功率谱密度的曲线图。指示视觉皮层中在 40-Hz光闪烁4302、随机光闪烁4304或黑暗4306过程中的功率谱密度的平均值(实线)和标准偏差(阴影区域)(n＝4只来自5个记录会话的5FXFAD小鼠)。图43C-图43F是描绘根据一些实施方案针对每只小鼠的每个记录会话分别在40-Hz光闪烁、随机光闪烁、恒定黑暗、以及恒定光过程中在视觉皮层中的局部场电势的功率谱密度的曲线图(n＝5个来自四只5XFAD小鼠的记录，使用47、51、61、49、16个40-Hz闪烁，47、50、64、50、16个随机闪烁，279、302、382、 294、93个黑暗，以及47、50、64、49、15个光时间段)。在视觉皮层中，发现在40Hz下的光闪烁增加在40Hz下的LFP中的功率(参见，例如，图43B和图43C)，而随机间隔光闪烁和黑暗不增加所述功率(参见，例如，图43B、图43D和图43E)。
图44A是描绘根据一些实施方案针对40-Hz光闪烁的四个周期和当量时间段的随机光闪烁的作为时间的函数的视觉皮层中尖峰分数的一系列柱状图。图44A展示针对40-Hz光闪烁的4个周期4402 或当量时间段的随机光闪烁4404的作为时间的函数的视觉皮层中尖峰分数的柱状图(n＝四只来自五个记录会话的5XFAD小鼠，棒指示平均值并且误差棒指示跨动物的SEM)。上方的棒指示光打开4406 或关闭4408的时间。在一些实施方案中，尖峰随着光闪烁打开和关闭增加和降低，从而引起锁定到在40-Hz刺激过程中的40-Hz频率的尖峰相(图44A中的柱状图4402)，但是随机刺激过程中没有出现明显的频率(图44A中的柱状图4404)。
图44B是根据一些实施方案在光闪烁过程中在大脑上方记录的局部场电势的一系列电迹线。在一些实施方案中，当从大脑正上方的盐水记录时，没有发现在40-Hz闪烁过程中40Hz功率的增加，从而示出此作用不是由于光电效应或电噪声(参见，例如，图32和图44B)。如在光遗传刺激的情况下，随机闪烁提供针对由于光闪烁产生的活性的总体变化的对照。
图45A是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁与随机光闪烁之间的击发速率的差异的柱状图(n＝226个在四只5XFAD小鼠中来自五个记录会话的刺激时间段)。图45B是展示根据一些实施方案在 40-Hz光闪烁、随机光闪烁、黑暗、以及光时间段过程中在视觉皮层中的多单元击发速率的图。图45B展示视觉皮层中的多单元击发速率。盒须图示出中值(盒中的白线)和四分位数(盒的顶部和底部)。在所有动物中，40-Hz闪烁与随机闪烁条件之间的击发速率不是显著地不同的，从而示出随机刺激条件充当尖峰活动的对照(针对来自四只 5XFAD小鼠的5个记录会话中的每个的秩和测试，p>0.06，中值和四分位数在图中示出，n＝47、51、64、49、16个40-Hz闪烁时间段和47、50、64、50、16个随机闪烁时间段/记录)。40-Hz闪烁与光条件之间的击发速率没有显著的差异，从而指示40-Hz光闪烁通常不导致神经元过强兴奋性(针对来自四只5XFAD小鼠的5个记录会话中的每个的秩和测试，对于4个记录会话p>0.2，对于1个记录会话p> 0.01，当在针对执行多重比较进行校正时这不是显著的，中值和四分位数在图中示出，n＝47、51、64、49、16个40Hz时间段和47、50、 64、49、16个光时间段/记录)。在一个会话中，在40-Hz刺激中比在黑暗条件中存在更多活性。40Hz与随机闪烁时间段之间的多单元击发速率的差值往往接近零(参见，例如，45A)；并且在动物内比较这些时间段，没有发现显著差异(参见，例如，图45B，针对来自四只 5XFAD小鼠的5个记录会话中的每个的秩和测试，p>0.06，中值和四分位数在图中示出，n＝47、51、64、49、16个γ闪烁时间段和47、 50、64、50、16个随机闪烁时间段/记录)。
在γ频率下的视觉刺激降低视觉皮层中的Aβ水平。
鉴于光遗传方法的功效，设计一种平移式的非侵入性淀粉样蛋白减少治疗。图46A是展示根据一些实施方案的实验范例的示意图。如图46A所示，将AD模型小鼠的第一亚组置于具有40-Hz闪光的第一室4600中，并且将AD模型小鼠的第二亚组置于保持黑暗的第二室4602中。将第一室4600中的动物暴露于40-Hz闪光约一小时。
图46B和图46C是分别进一步展示根据一些实施方案在图46A 的实验范例之后Aβ肽同种型Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的图。图46B示出5XFAD小鼠的40-Hz光暴露显著降低视觉皮层V1中的 Aβ1-40和Aβ1-42水平。Aβ1-40和Aβ1-42水平呈现为pg/mL(n＝6只动物 /组)。
鉴于40-Hz光闪烁在初级视觉皮层中驱动40-Hz振荡并且40-Hz 振荡的光遗传诱导降低海马趾Aβ水平，目标是确定40-Hz光闪烁是否可降低视觉皮层中的Aβ水平。针对这些实验，在一些实施方案中，使用症状前的三月大的5XFAD小鼠。将小鼠置于黑暗箱中并且暴露于40-Hz光闪烁、恒定光打开(光照)、或恒定光关闭(黑暗)一小时。
图47A和图47B是分别描绘根据一些实施方案在黑暗、光照、 40-Hz闪烁、20-Hz闪烁、80-Hz闪烁、使用木防己苦毒素(PTX)的40-Hz 闪烁以及随机闪烁条件中5XFAD视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图(对于黑暗，n＝12只小鼠/组；对于光照、40-Hz 闪烁、20-Hz闪烁、80-Hz闪烁、以及PTX，n＝6只小鼠/组；对于随机闪烁，n＝4只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的，一个星号指示p <0.05，并且两个星号指示p<0.01，通过单向ANOVA进行)。图47A 和图47B示出平均值和SEM。条形图中叠加在条上的圆圈指示每个组中的单个数据点。在光暴露之后一小时后，观察到与黑暗条件相比，视觉皮层中的Aβ1-40水平降低57.96％并且Aβ1-42水平降低57.97％(如通过AβELISA测量的，参见，例如，图47A和图47B，p<0.05，通过单向ANOVA进行，n＝6只小鼠/组)。与光照对照相比，在一小时的40-Hz闪烁之后，淀粉样蛋白水平降低62.47％(Aβ1-40)和68.55％ (Aβ1-42)(如通过AβELISA测量的，参见，例如，图47，p<0.05，通过单向ANOVA进行，n＝6只小鼠/组)。此外，所述作用对于40-Hz 闪烁是特异性的，因为与黑暗和光照对照相比，20-Hz、80-Hz或随机闪烁均不显著降低Aβ水平(参见，例如，图47，“n.s.”指示非显著的，n＝6只小鼠/组)。
在一些实施方案中，为了测试区域特异性，检查躯体感觉桶状皮层(BC)中的Aβ水平并且没有发现显著差异。图48A是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下5XFAD桶状皮层的相对Aβ1-40和Aβ1-42水平的条形图(n＝3只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的，通过 Student’s t-测试进行)。当5XFAD小鼠使用低剂量GABA-A拮抗剂(木防己苦毒素，0.18mg/kg，其不诱导癫痫活动)预处理时，40-Hz闪烁对于Aβ水平的作用完全消除，从而指示γ-氨基丁酸能信号传导(最可能来自FS-PV-中间神经元)对于此作用是必要的(参见，例如，图47，“n.s.”指示非显著的，n＝6只小鼠/组)。
为了证明所述作用不是对于5XFAD小鼠特异性的，此结果在不同的AD模型APP/PS1小鼠(具有两个家族性AD突变(APP瑞典和 PSEN1 deltaE9)的良好验证的模型)中重复。图48B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在APP/PS1视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图(对于黑暗条件n＝5只小鼠/组并且对于40-Hz闪烁条件n＝4只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的并且一个星号指示p<0.05，通过Student’s t-测试进行)。
图48C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在 WT视觉皮层中的Aβ1-40和Aβ1-42的基线水平的变化的条形图(对于黑暗条件n＝11只小鼠/组并且对于40-Hz闪烁条件n＝9只小鼠/组；一个星号指示p<0.05，通过Student’s t-测试进行)。在一些实施方案中，在40-Hz闪烁处理之后的APP/PS1小鼠中，发现Aβ1-40显著降低 20.80％和Aβ1-42降低37.68％的趋势，虽然后者与黑暗条件并非显著地不同(参见，例如，图48B，Aβ1-40p<0.05，Aβ1-42p<0.09–非显著的，通过Student’s t-测试进行，对于黑暗n＝5只小鼠/组，对于40-Hz闪烁n＝4只小鼠/组)。此外，在老龄WT小鼠中，发现在一小时40-Hz 闪烁之后内源性小鼠Aβ1-40的58.2％减少(参见，例如，图48C，p< 0.05，通过Student’s t-测试进行，n＝11只黑暗小鼠并且n＝9只40-Hz 闪烁小鼠)。在这些动物中，Aβ1-42对于闪烁组和对照组两者均低于可检测水平。WT动物中内源性小鼠Aβ1-40的减少揭示这些结果可不限于Tg APP表达或突变体APP；相反它们可延伸至从APP产生的Aβ，表达由其内源性启动子驱动。图48A-图48C示出平均值和SEM。
接下来，在一些实施方案中，实施调查，以便确定40-Hz闪烁是否以与40-Hz光遗传FS-PV-中间神经元刺激改变海马趾CA1小神经胶质细胞相同的方式改变视觉皮层中的小神经胶质细胞活性。图49 是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在5XFAD视觉皮层中使用抗Iba1(019-19741)抗体和抗Aβ4904(12F4)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。使用40x物镜拍摄图像(比例尺＝50 μm)。右图：120X放大；箭头指示细胞体中的+Iba1/+Aβ信号。
图50A是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件中小神经胶质细胞的数量的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片；“n.s.”指示非显著的，通过Student’s t-测试进行)。图50B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件中归一化到对照的小神经胶质细胞体的直径的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片；两个星号指示 p<0.01，通过Student’s t-测试进行)。图50C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件中归一化到对照的小神经胶质细胞初级过程的平均长度的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片；四个星号指示p<0.0001，通过Student’s t-测试进行)。图50D是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下也是Aβ-阳性的Iba1-阳性(小神经胶质细胞)细胞体的百分比的条形图(n＝2个来自4只小鼠/组的切片；两个星号指示p<0.01，通过Student’s t-测试进行)。图50A-图 50D示出平均值和SEM。
在一些实施方案中，Iba1用于标记在一小时的40-Hz闪烁或黑暗条件之后的5XFAD小鼠的视觉皮层切片中的小神经胶质细胞(参见，例如，图49)。虽然小神经胶质细胞数量在黑暗与40-Hz闪烁条件之间不是不同的(参见，例如，图49和图50A，“n.s.”指示非显著的，n＝ 2个来自4只小鼠/组的切片)，但是与黑暗对照相比，小神经胶质细胞体直径在40-Hz闪烁之后在视觉皮层中增加65.8％(参见，例如，图49和图50B，p<0.01，通过Student’s t-测试进行，n＝2个来自4 只小鼠/组的切片)。与黑暗对照相比，小神经胶质细胞初级过程的长度在40-Hz闪烁条件中减少37.7％(参见，例如，图49和图50C，p< 0.0001，通过Student’st-测试进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。在一些实施方案中，因为视觉皮层中的小神经胶质细胞具有指示增强的吞没活性的形态，所以检查携带Aβ的小神经胶质细胞的数量。针对此实验，使用Iba1和Aβ(12F4)抗体共标记视觉皮层切片。细胞体中的Aβ/Iba1共定位在40-Hz闪烁条件中增加33.5％，这指示40-Hz 闪烁比黑暗对照引起更多携带Aβ的小神经胶质细胞(参见，例如，图 49和图50D，p<0.01，通过Student’s t-测试进行，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)
在一些实施方案中，为了提供小神经胶质细胞中形态学变化的更好的分辨率，使用CLARITY来创建来自视觉皮层的100μm切片的小神经胶质细胞的3D渲染图，并且从这些渲染图创建视频。图51 是来自CLARITY处理的100μm组织切片的在黑暗和40-Hz闪烁条件下的Iba+小神经胶质细胞的一系列3D渲染图(来自免疫荧光图像)， 5102旋转0°，5104绕X轴旋转45°，并且5106绕Y轴旋转45°。使用63x物镜拍摄图像(比例尺＝15μm)。最后，为了证明小神经胶质细胞确实吞没5XFAD小鼠中的Aβ，使用荧光活化的细胞分选术(FACS) 纯化来自5XFAD动物和WT动物的小神经胶质细胞并且通过ELISA 分析Aβ水平。
图52A是展示根据一些实施方案使用荧光活化的细胞分选术 (FACS)从视觉皮层分离小神经胶质细胞的方法的流程图。切开视觉皮层，并且然后悬浮单细胞并使用CD11b和CD45抗体进行标记。随后，通过荧光活化的细胞分选术(FACS)分选细胞并且进行裂解。通过ELISA分析Aβ1-40水平。图52B是描绘根据一些实施方案使用图52A 的方法从三月大的5XFAD动物和WT对照动物的视觉皮层分离的小神经胶质细胞中的Aβ1-40水平的条形图(对于5XFAD，n＝8只小鼠/ 组并且对于WT小鼠，n＝4只小鼠/组；一个星号指示p<0.05，通过Student’s t-测试进行)。条形图中叠加在条上的圆圈指示每个组中的单个数据点。
图53A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下在三月大的5XFAD视觉皮层中使用检测突触小泡蛋白的SVP38抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。使用40x物镜拍摄图像(比例尺＝50μm)。右图：100X的黑暗和40-Hz闪烁条件。图53B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40Hz闪烁条件中之后5XFAD视觉皮层的相对SVP38强度水平的条形图(n＝4只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的，通过Student’s t-测试进行)。
发现Aβ的小神经胶质细胞特异性水平在5XFAD动物中比在WT 对照中显著更高，其中在5XFAD小鼠中在27.2pg/104个小神经胶质细胞的水平下并且在WT对照小鼠中在9.78pg/104个小神经胶质细胞的水平下(参见，例如，图52A和图52B，p<0.05，通过Student’s t- 测试进行，对于5XFAD，n＝8并且对于WT小鼠，n＝4)。在这些动物中，Aβ1-42对于闪烁组和对照组两者均低于可检测水平。总体上，通过40-Hz刺激诱导的在视觉皮层中的小神经胶质细胞的转化似乎与发生在海马趾CA1中的转化相似。另外，突触小泡蛋白水平在黑暗与40-Hz闪烁条件之间不变化，从而指示小神经胶质细胞活化不显著地增加突触的吞没(参见，例如，图53A和图53B，“n.s.”指示非显著的，n＝2个来自4只小鼠/组的切片)。综合考虑，本文公开的数据证明通过感觉刺激非侵入性地诱导的40-Hz振荡可在AD小鼠模型中有效地降低Aβ丰度并且促进小神经胶质细胞/Aβ相互作用。此外， 40-Hz刺激可减少两个不同大脑电路中的Aβ，从而表明γ振荡在各种大脑区域中降低淀粉样蛋白丰度并且增强小神经胶质细胞吞噬的一般机制。
在另一个实验中，在暴露于黑暗(没有光照)、20-Hz闪光、40-Hz 闪光、或80-Hz闪光一小时之后，评定Aβ1-42水平，其中20Hz和80 Hz是40Hz的谐波。然而，仅40Hz闪光闪烁显著地降低Aβ1-42水平。图54A是展示根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的视觉皮层之后Aβ肽同种型Aβ1-42的降低的条形图。
实施另一个研究来评定Aβ1-42水平降低的时间。将小鼠暴露于无光照或40-Hz闪光一小时。在一小时处理之后确定Aβ1-42水平，并且在处理完成之后24小时再次确定Aβ1-42水平。图54B是展示根据一些实施方案在使用γ振荡刺激受试者的视觉皮层之后和在刺激之后二十四小时再一次的Aβ肽同种型Aβ1-42的水平的条形图。虽然Aβ水平在处理之后二十四小时保持降低，但是所述降低比紧接在处理之后的降低小。
在γ频率下的视觉刺激不影响海马体中的Aβ水平。
在一些实施方案中，为了确定通过光闪烁进行的视觉刺激是否可影响涉及AD的大脑电路，检查光闪烁对于海马体的影响，海马体是人类的在AD过程早期受影响的大脑区域中的一个。图55A包括根据一些实施方案在40-Hz光闪烁5502之前和过程中海马体中的局部场电势的电迹线和功率谱密度的曲线图。CA1中在黑暗5504、40-Hz 光闪烁5506和随机光闪烁5508过程中的功率谱密度的平均值(实线) 和标准偏差(阴影区域)(n＝两只5XFAD小鼠和三只WT小鼠)。
图55B是根据一些实施方案分别针对40-Hz光闪烁的4个周期 5510或当量时间段的随机光闪烁5512的作为时间的函数的海马体中尖峰分数的一系列柱状图(n＝两只5XFAD小鼠和三只WT小鼠，棒指示平均值并且误差棒指示跨动物的SEM)。上方的棒指示光打开(白色)或关闭(黑色)的时间。对于随机刺激，尖峰与光打开的开始对齐，具有在随机间隔下发生的光的另外时间段由灰色指示。使用相同的方法来检查视觉皮层中的如本文公开的CA1中的光闪烁的作用，发现在40Hz下的光闪烁增加LFP中的在40Hz下记录的功率(参见，例如，图55A和图55B中的图5510)，而随机间隔光闪烁(随机闪烁)和黑暗不增加所述功率(参见，例如，图50D，图43C中的图4310)。尖峰还通过在40H刺激过程中的40-Hz闪烁频率来调制，然而，所述调制似乎在视觉皮层中更小(参见，例如，图55B，海马体，图44A，视觉皮层)。
图56A是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁与随机光闪烁之间的击发速率的差异的柱状图(底部n＝168个在两只5XFAD小鼠和三只WT小鼠中来自5个记录会话的刺激时间段)。图56B是展示根据一些实施方案在40-Hz光闪烁5604、随机光闪烁5605、黑暗5602、或光照5608时间段过程中在CA1中的多单元击发速率的图。盒须图示出中值(盒中的白线)和四分位数(盒的顶部和底部)。在所有动物中， 40-Hz闪烁与随机闪烁条件之间的击发速率不是显著地不同的，从而示出随机刺激条件充当尖峰活动的对照(针对来自两只5XFAD动物和三只WT动物的5个记录中的每个的秩和测试，p>0.2，中值和四分位数在图中示出，n＝22、54、42、71、55个40-Hz闪烁时间段和 12、34、32、54、36个随机闪烁时间段/记录)。40-Hz闪烁与光条件之间的击发速率没有显著的差异，从而指示40-Hz光闪烁通常不导致神经元过强兴奋性(针对来自两只5XFAD动物和三只WT动物的5 个记录中的每个的秩和测试，p>0.3，中值和四分位数在图中示出， n＝22、54、42、71、55个40Hz时间段和12、34、33、54、35个光时间段/记录)。
如在视觉皮层中，40Hz与随机闪烁时间段之间的多单元击发速率的差值往往接近零(参见，例如，图56A)，并且在动物内比较这些时间段时，没有发现显著差异(参见，例如，图56B，针对来自四只 5XFAD小鼠的5个记录会话中的每个的秩和测试，p>0.06，中值和四分位数在图中示出，n＝22、54、42、71、55个40-Hz闪烁时间段和12、34、32、54、36个随机闪烁时间段/记录)。
在一些实施方案中，使用在视觉皮层中使用的相同方法检查视觉光闪烁对于海马体中的Aβ的水平的作用。图57A是描绘在5XFAD 视觉皮层中的相对Aβ1-40水平的条形图，并且图57B是描绘根据一些实施方案在5XFAD视觉皮层中的相对Aβ1-42水平的条形图(n＝4只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的)。相比于在视觉皮层中所观察到的，在CA1中，在40-Hz闪烁或随机刺激之后一小时没有发现Aβ1-40与 Aβ1-42水平之间的显著差异。40-Hz闪烁或随机闪烁之后的Aβ水平与黑暗条件不是显著地不同的：40Hz和随机闪烁之后的Aβ1-40水平分别是黑暗条件的108.4％和96.82％，并且40-Hz和随机闪烁之后的 Aβ1-42水平分别是黑暗条件的118.8％和92.15％(参见，例如，图57A 和图57B，“n.s.”指示非显著的，n＝4只小鼠/组)。因此，一小时的 40-Hz光闪烁不显著地降低海马体中的Aβ的水平。
在γ频率下的慢性视觉刺激降低视觉皮层中的斑负荷。
当40-Hz振荡光遗传地或通过经由光闪烁进行的视觉刺激被驱动时斑前5XFAD小鼠中的受影响的淀粉样蛋白丰度已进行检查并在本文中公开。接下来，目标是确定此处理在已显示斑负荷的动物中是否是有效的。为此，在一些实施方案中，使用六月大的5XFAD小鼠，因为它们在许多大脑区域(包括视觉皮层)中发展广泛的淀粉样蛋白斑病变。实施测试来查明在非侵入性γ刺激之后晚期Aβ相关病变将发生什么。在一些实施方案中，为了调查响应于一小时40-Hz闪烁的Aβ减少的持续时间，在一小时40-Hz闪烁或黑暗条件之后4小时、12 小时和24小时在视觉皮层中测量Aβ水平。
图58A和图58B是分别描绘根据一些实施方案在一小时的黑暗或40-Hz闪烁处理之后1小时、4小时、12小时和24小时5XFAD 视觉皮层的相对Aβ1-40和Aβ1-42水平的条形图(对于4小时和12小时等待n＝4只小鼠/组，对于1小时和24小时等待n＝6，对于黑暗n＝ 12；“n.s.”指示非显著的，一个星号指示p<0.05，并且两个星号指示p<0.01，通过单向ANOVA进行)。结果显示与黑暗对照相比，在 4小时之后，Aβ1-40水平降低63.4％并且Aβ1-42水平降低63.2％(参见，例如，图58，p<0.01，n＝4只小鼠/组)。截止12小时，Aβ1-40水平降低50.9％，而Aβ1-42水平与黑暗对照不是显著地不同的(参见，例如，图58，“n.s.”指示非显著的并且p<0.01，n＝4只小鼠/组)。最后，在一小时的40-Hz闪烁处理之后24小时，与黑暗对照条件相比，在40-Hz闪烁中，可溶性Aβ1-40和Aβ1-42水平不是显著地不同的(参见，例如，图58，“n.s.”指示非显著的，对于24小时n＝6只小鼠/组并且对于黑暗n＝4只小鼠/组)。这些结果指示40-Hz闪烁处理的作用是瞬时的。
因此，在一些实施方案中，为了破坏晚期斑病变，每天使用40-Hz 闪烁处理小鼠一小时，持续七天，或者用于对照，使用黑暗条件处理。图59A是描绘根据一些实施方案暴露于一小时的闪烁/天、持续七天的六月大的小鼠的示意图。图59B是展示根据一些实施方案在黑暗或 40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中的相对Aβ1-42水平的条形图(n＝13只小鼠/组，两个星号指示p <0.01并且三个星号指示p<0.001，Student’s t-测试)。图59C是展示根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中的相对Aβ1-40水平的条形图(n ＝13只小鼠/组，一个星号指示p<0.01并且两个星号指示p<0.01，通过Student’s t-测试进行)。图59B和图59C示出平均值和SEM。条形图中叠加在条上的圆圈指示每个组中的单个数据点。
在七天时间段结束时，通过ELISA和免疫染色分析视觉皮层。在一些实施方案中，将组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中裂解以提取 PBS可溶性Aβ级分并且发现在六月大的5XFAD小鼠中，七天的一小时40-Hz闪烁使可溶性Aβ1-40和Aβ1-42水平分别降低60.5％和51.7％，如通过ELISA测量的(参见，例如，图59B和图59C，p<0.05 和p<0.01，通过Student’st-测试进行，n＝13只小鼠/组)。使用胍基盐酸(HCl)进一步处理组织以便提取不可溶Aβ1-40和Aβ1-42级分，其构成聚集的淀粉样蛋白斑。不可溶Aβ1-40和Aβ1-42水平分别降低43.7％和57.9％，从而指示40-Hz闪烁破坏在六月大的小鼠中已形成的不可溶Aβ聚集物(参见，例如，图59B和图59C，p<0.01并且p<0.001，通过Student’s t-测试进行，n＝13只小鼠/组)。
在一些实施方案中，为了确定斑负荷具体地如何被影响，使用Aβ抗体执行免疫组织化学表征(细胞信号传导技术；D54D2)。图60A是展示根据一些实施方案在黑暗(顶部)或40-Hz闪烁(底部)条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中使用Aβ(D5452) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。排除出现在细胞内的Aβ信号。图60B是描绘根据一些实施方案在黑暗或 40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的5XFAD小鼠的视觉皮层中Aβ-阳性斑沉积物的数量的条形图(n＝8只小鼠/组，三个星号指示p<0.001，通过Student’s t-测试进行)。图60C是描绘根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后六月大的 5XFAD小鼠的视觉皮层中Aβ-阳性斑的面积的条形图(n＝8只小鼠/ 组；两个星号指示p<0.01，通过Mann Whitney测试进行)。图60B 和图60C示出平均值和SEM。
通过计数直径大于或等于约10μm的Aβ+沉积物的数量来定量斑丰度。与黑暗对照中的减少至33.5相比，40-Hz闪烁使斑数量减少至11.0(参见，例如，图60A和图60B，p<0.01，通过Student’s t- 测试进行，n＝8只小鼠/组)。此外，与黑暗对照相比，在一周的40-Hz 闪烁处理之后，斑大小(测量为致密斑区域的面积)降低大约63.7％(参见，例如，图60A和图60C，p<0.01，通过Mann Whitney测试进行， n＝8只小鼠/组)。综合考虑，这些实验识别对于淀粉样蛋白斑病变具有明显作用的完全非侵入性处理。
为了确定40-Hz闪烁是否改善另一种关键AD相关病变，使用 TauP301S tau蛋白病小鼠模型来研究tau磷酸化。使用40-Hz闪烁或黑暗对照条件每天处理四月大的TauP301STg小鼠(其在此年龄显示定位到细胞体的磷酸化的tau)一小时，持续七天。为了检查40-Hz闪烁如何改变tau磷酸化，使用针对pTau的三种不同表位(S202、S396 和S400/T403/S404；11834S、9632S、11837S)和作为对照的树突状标记物MAP2的pTau抗体执行视觉皮层的免疫组织化学表征。
图61A是展示根据一些实施方案在黑暗或40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗pTau 6102(S202) 抗体和抗MAP2 6104抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。使用40x物镜拍摄图像(比例尺＝50μm；插图包括在黑暗和40-Hz闪烁条件下的代表性细胞体的100X渲染图)。图61B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对pTau(S202)强度水平的条形图(n＝8只小鼠/组；一个星号指示p<0.05，通过Student’s t-测试进行)。图61C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz光闪烁条件下一小时/天的七天之后 P301S视觉皮层的相对MAP2强度水平的条形图(n＝8只小鼠/组；“n.s.”指示非显著的，通过Student’s t-测试进行)。图61B和图61C示出平均值和SEM。
图62A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在4月大的P301S小鼠中使用抗pTau 6202(S404) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。图62B 是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对pTau(S400/T403/S404)荧光强度水平的条形图(n＝8只小鼠/组；两个星号指示p<0.01，通过Student’s t- 测试进行)。图62B示出平均值和SEM。
图63A是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗pTau 6302(S396) 抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像(比例尺＝50μm)。图63B 是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后P301S视觉皮层的相对pTau(S396)荧光强度水平的条形图(n ＝8只小鼠/组；四个星号指示p<0.0001，通过Student’s t-测试进行)。
结果显示与黑暗对照相比，在40-Hz闪烁条件中，pTau(S202) 的信号强度降低41.2％并且pTau(S400/T403/S404)的信号强度降低 42.3％(参见，例如，图61A-图61B，图62A-图62B，p<0.01，通过 Student’s t-测试进行，n＝2个来自8只小鼠/组的切片)，而MAP2水平不变(参见，例如，图61A和图61C，“n.s.”指示非显著的，n＝2 个来自4只小鼠/组的切片)。使用针对pTau(S396)的抗体的染色显示相同方向的趋势：与黑暗对照相比，40-Hz闪烁使pTau(S396)水平降低14.4％(参见，例如，图63A-图63B，“n.s.”指示非显著的，n＝2 个来自8只小鼠/组的切片)。此外，与黑暗对照相比，响应于40-Hz 闪烁，观察到更少的色斑和pTau信号的细胞体定位。虽然看到tau 磷酸化的显著变化，但是在40-Hz闪烁处理的组与黑暗对照组之间未观察到不可溶tau的水平的可辨别的差异。
评估40-Hz闪烁对于TauP301S小鼠模型中的小神经胶质细胞的影响。图64是展示根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后在四月大的P301S小鼠中使用抗Iba1 (019-19741)抗体的免疫组织化学的一系列免疫荧光图像。使用40x物镜拍摄图像(比例尺＝50μm；插图包括在EYFP和40-Hz闪烁条件中的代表性小神经胶质细胞的100X渲染图)。
图65A是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后小神经胶质细胞的数量的条形图(n＝8只小鼠/ 组；“n.s.”指示非显著的，通过Student’st-测试进行)。图65B是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后归一化到对照的小神经胶质细胞体的直径的条形图(n＝8只小鼠/组；四个星号指示p<0.0001，通过Student’s t-测试进行)。图65C是描绘根据一些实施方案在黑暗和40-Hz闪烁条件下一小时/天的七天之后归一化到对照的小神经胶质细胞初级过程的平均长度的条形图(n＝8 只小鼠/组；四个星号指示p<0.0001，通过Student’s t-测试进行)。
在一些实施方案中，在七天的每天一小时40-Hz闪烁或黑暗条件之后使用抗Iba1抗体标记TauP301S小鼠的视觉皮层中的小神经胶质细胞(参见，例如，图64)。在一些实施方案中，与黑暗对照相比，在 40-Hz闪烁条件中，观察到小神经胶质细胞数量的朝向29.50％增加的趋势(参见，例如，图64和图65A，“n.s.”指示非显著的，n＝3只小鼠/组)，这与在5XFAD模型中进行的观察一致(参见，例如，图50A)。此外，与黑暗对照相比，在40-Hz闪烁之后，小神经胶质细胞体直径增加49.00％(参见，例如，图64和图65B，p<0.0001，通过Student’s t-测试进行，n＝3只小鼠/组)。与黑暗对照相比，在40-Hz闪烁组中，小神经胶质细胞初级过程的长度减少39.08％(参见，例如，图64和图65C，p<0.0001，通过Student’s t-测试进行，n＝3只小鼠/组)。
综合考虑，来自AD病变的多种模型和在WT动物中的这些数据证明40-Hz振荡可减轻淀粉样蛋白病变(如通过Aβ水平的降低测量的) 并且可减少tau磷酸化。此外，40Hz视觉闪烁在AD病变的淀粉样变性和tau蛋白病模型两者中均可驱动小神经胶质细胞的不同形态学转化。
在另一个实验中，将老龄小鼠(即，六月大)的亚组暴露于视觉γ刺激七天。将剩余的小鼠保持在黑暗中。图66是展示在小鼠的视觉皮层中的可溶性Aβ肽和不可溶Aβ肽(即，斑)两者的水平的图。如图 66所示，可溶性同种型Aβ1-40 6600、可溶性同种型Aβ1-42 6602、不可溶同种型Aβ1-40 6604、以及不可溶同种型Aβ1-42 6606中的每个的水平在暴露于视觉γ刺激的小鼠中显著地降低。
图67A-图67B是展示根据一些实施方案在具有和不具有经颅γ刺激的情况下受试者的Aβ肽水平的图。在图67A中，全脑Aβ肽水平在没有刺激6700的情况下保持不变，但是在一小时的经颅γ刺激 6702之后降低(n＝1只动物/组)。在图67B中，根据一些实施方案，全脑Aβ肽水平在40z经颅刺激之后在5xFAD小鼠的海马体6704处和在皮层6706处降低。
长久以来认为γ振荡与较高的认知功能和感觉反应相关联。在一些实施方案中，使用光遗传方法驱动FS-PV-中间神经元增强小鼠中的在40Hz下的LFP。如本文公开的，已证明在一些实施方案中，在 5XFAD小鼠模型中使用光遗传或非侵入性光闪烁处理驱动40-Hz振荡和相锁定尖峰引起在至少两个不同的大脑区域中的Aβ肽的明显降低。此降低并非由于降低的尖峰活动，因为Aβ肽水平响应于40-Hz 刺激比响应于在不增强40-Hz振荡的情况下产生相似量的多单元尖峰活动的随机刺激条件显著地更低。锥体细胞击发速率在这些条件之间可不同，但是FS-PV-中间神经元或其他细胞类型的击发掩蔽此变化。在一些实施方案中，FS-PV-中间神经元的随机光遗传刺激提供 FS-PV-中间神经元的相同量的直接刺激，但是不减少淀粉样蛋白。事实上，光遗传随机刺激使淀粉样蛋白水平增至多于三倍，而随机视觉闪烁没有产生显著变化，这可指示随机刺激的一些方面具有神经毒性作用。虽然在一些实施方案中，随机刺激没有引起增加的γ功率，但是在宽范围的频率(大约20Hz至大于60Hz)中注意到功率的少量增加的趋势。在一些实施方案中，注意到在20-Hz和80-Hz光闪烁的情况下增加的淀粉样蛋白水平的趋势。综合考虑，这些结果可表明在低于或高于40Hz的一些频率下的驱动活动可增加淀粉样蛋白水平。这些结果指出需要理解尖峰活动的模式如何影响分子通路和疾病病变。
总淀粉样蛋白水平的稳健降低可能通过降低的淀粉样蛋白生成介导，涉及EEA1/Rab5-阳性早期内体减少和通过小神经胶质细胞进行的淀粉样蛋白的内吞增加。重要的是，本文公开的基因集富集分析 (GSEA)统计分析(The Broad Institute，Cambridge，Massachusetts)显示经典的巨噬细胞促炎M1或抗炎M2细胞状态与在通过40-Hz振荡进行的神经元刺激之后的上调或下调的基因表达图谱不相关。实际上，促炎基因Il6、Il1b、Itgam和抗炎基因Igf1的表达水平在刺激之后不改变。相反，小神经胶质细胞促吞噬基因以及细胞粘附/迁移调节子 Spp1的数量在40-Hz刺激之后被活化。因此，似乎驱动40Hzγ振荡通过募集神经元和小神经胶质细胞两者来诱导总体神经保护性反应。 GABA-A拮抗剂处理完全消除40-Hz刺激对于降低Aβ水平的作用的事实强烈表明γ-氨基丁酸能信号传导(最可能涉及FS-PV-中间神经元) 对于这些作用是关键的。此外，在一些实施方案中，40-Hz闪烁刺激减少多种小鼠模型中的Aβ，所述多种小鼠模型除5XFAD小鼠之外包括APP/PS1和WT小鼠。多种小鼠模型中的此重复显示这些发现可以不是对于一种动物模型特异性的，并且重要的是，可延伸至APP 通过其生理启动子表达并且Aβ从内源性APP生成的情况，如在WT 动物中。此外，在一些实施方案中，发现40-Hz振荡减少tau蛋白病 TauP301S的小鼠模型中的pTau，从而显示γ刺激的保护性作用不仅推广至其他小鼠模型，还推广至其他病原蛋白。概括地说，本文公开的发现揭露通过γ振荡介导的先前未知的细胞和分子过程并且建立大脑γ节律、小神经胶质细胞功能与AD相关病变之间的功能性关系。在一些实施方案中，γ振荡缺陷的发现与AD的不同小鼠模型(hAPP 和apoE4)中的γ缺陷的证据汇总并且报告γ在患有AD的人类中被改变。通过寻找来自AD的多种小鼠模型(包括Tg和敲入模型)的汇总证据，可证明这些结果不仅是由于转基因的表达或由于一种模型特定的其他副作用。来自小鼠和人类的这些结果一起显示有助于Aβ病变的多种分子通路共同改变AD中的γ振荡。本文公开的发现具有针对 AD的新型治疗干预的前景。
AD病因的一种理论指出小神经胶质细胞功能故障(具体地，小神经胶质细胞不能清除病理分子)作为疾病进展的关键机制。因此，使小神经胶质细胞恢复到内吞状态(如40-Hz刺激所做的)的干预具有强治疗潜力。在本文进一步所述的实验中，光遗传地或通过光闪烁驱动γ振荡不导致神经元过强活性。因为此方法在根本上与之前的AD疗法不同，所以驱动此模式的神经活动来触发内源性修复将提供针对 AD的新型治疗方法。
在γ频率下的视觉刺激对于受试者行为具有积极作用。
实施研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否导致对受试者的任何应激。图68A是展示所述研究的流程图。如在图68A 中的6800处所示，根据一些实施方案将WT小鼠暴露于正常室内光照(N＝8)或40-Hz光闪烁(N＝8)一小时/天，持续连续七天，第1天- 第7天。在第8天，在6802处所示，从小鼠采集血液，并且分离血浆来检查皮质酮水平。在小鼠中，皮质酮是涉及应激反应的主要糖皮质素。
图68B是描绘从暴露于正常室内光照(NRL)的八只小鼠和暴露于 40-Hz光闪烁(40-Hz)的八只小鼠采集的血浆中的皮质酮(CORT)的水平(pg/ml)的条形图。在暴露于40-Hz光闪烁的小鼠中没有观察到皮质酮的增加。相反，与对照组相比，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠的组具有更低水平的皮质酮。对于N＝8个独立测量值/组，皮质酮水平的T 分布和p值计算为：
T(14)＝0.827；p＝0.422 (1)
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否减少受试者的焦虑。图68A是展示所述研究的流程图。如在图69A 中的6900处所示，根据一些实施方案将WT小鼠暴露于正常室内光照(N＝10)或40-Hz光闪烁(N＝10)一小时/天，持续连续七天，第1天 -第7天。在第8天，在6902处所示，实施高架十字迷宫的十分钟会话。
高架十字迷宫是用于测量实验室动物的焦虑的测试。行为模式基于啮齿类动物对于开放空间的普遍厌恶，这导致趋触性，一种对于保持在封闭空间中或接近界定空间的边缘的偏好。图69B是展示高架十字迷宫装置的图像。所述装置是具有两个开放臂(竖直)和两个封闭臂 (水平)的十字形状。焦虑通过动物在封闭臂中花费更多时间来表达。
图69C和图69D是展示在高架十字迷宫会话过程中受试者的代表性轨迹的图像。根据一些实施方案，在图69C中，暴露于正常室内光照的小鼠倾向于待在封闭臂中，从而指示更多的焦虑，而在图69D 中，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在开放臂和封闭臂两者中探索，从而指示相对较少的焦虑。
图70是描绘根据一些实施方案由暴露于正常室内光照(NRL)的十只小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的十只小鼠在探索开放臂和闭合臂上花费的总时间的条形图。根据一些实施方案，与对照组相比，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在闭合臂中花费较少的总时间并且在开放臂中花费较多的总时间，从而指示较少的焦虑。对于N＝10个独立测量值/组，在探索闭合臂上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(18)＝-1.652；p＝0.11 (2)
对于N＝10个独立测量值/组，在探索开放臂上花费的总时间的 T分布和p值计算为：
T(18)＝-2.136；p＝0.047 (3)
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否减少受试者的应激和/或焦虑。图71A是展示所述研究的流程图。在图71A中的7100处，根据一些实施方案将WT小鼠暴露于正常室内光照(N＝8)或40-Hz光闪烁(N＝8)一小时/天，持续连续七天，第1天-第7天。在第8天，在7102处所示，实施五分钟开放现场测试。
开放现场测试时用于测定实验室小鼠的普遍运动活性水平和焦虑的实验。行为模式基于由啮齿类动物避免明亮照明的区域、还探索觉察到的危险刺激的冲突欲望导致的焦虑。图71B是展示开放现场场地的图像。开放现场场地具有防止逃离的壁并且可使用网格标记或使用红外光束或与软件系统整合的摄像机监测。根据一些实施方案，增加的焦虑将引起较少的运动活动和对于现场的边缘的偏好，而降低的焦虑导致增加的探索行为。
图71C和图71D是展示在开放现场测试过程中受试者的代表性轨迹的图像。根据一些实施方案，在图71C中，暴露于正常室内光照的小鼠倾向于更喜欢场地的边缘，从而指示更多的应激和/或焦虑，而在图71D中，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠更多地在场地的中心探索，从而指示相对较少的应激和/或焦虑。
图72A和图72B是描绘根据一些实施方案由暴露于正常室内光照(NRL)的八只小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的八只小鼠在探索开放现场场地的中心和边缘上花费的总时间的图。图72A是对于五分钟中的每分钟在场地的中心花费的秒的平均量的曲线图。图72B 是对于整个五分钟持续时间(平均为每分钟)在场地的边缘花费的总时间的条形图。
平均而言，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在场地的中心花费更多的时间，在第2分钟、第4分钟和第5分钟过程中显著地如此，从而指示与对照组相比较少的应激和/或焦虑，这也与根据一些实施方案的高架十字迷宫结果一致。执行重复测量方差分析(RM ANOVA)。对于N＝8个独立测量值/组，在探索开放现场场地上花费的平均时间的F 分布和p值计算为：
F(1,14)＝4.860；p＝0.045 (4)
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否改变受试者的固有的新奇性寻求行为。图73A和图73B是展示使用新型识别任务的研究的示意图。在图73A中，在熟悉的场地中提供两个新型物品。在图73B中，在熟悉的场地中提供一个熟悉的物品和一个新型物品。根据一些实施方案将野生型小鼠暴露于正常室内光照(N＝8)或40-Hz光闪烁(N＝8)一小时/天，持续连续七天，第1天- 第7天。
在第8天，将小鼠暴露于图73A中的情景，在熟悉的场地中的两个新型物品，持续五分钟。图73C是描绘根据一些实施方案对于暴露于正常室内光照(NRL)的八只小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的八只小鼠在探索新物品A上花费的时间的百分比与在探索新物品B上花费的时间的百分比的条形图。如图73C所示，每个组示出对于每个物品的相等偏好。即，在所述组之间没有观察到物品探索的差异。
然后，将小鼠暴露于图73B中的情景，在熟悉的场地中的一个熟悉的物品和一个新型物品，持续五分钟。图74是描绘对于五分钟中的每分钟在探索新型物品上花费的秒的平均量的曲线图。平均而言，根据一些实施方案，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在探索新型物品上花费显著更大量的时间，尤其在第1-3分钟和第5分钟过程中，从而指示与对照组相比增加的新奇性寻求行为。执行Friedman非参数RM ANOVA。对于N＝8个独立测量值/组，在探索新型物品上花费的平均时间的测试统计值χ2和p值计算为：
χ2(4,n＝16)＝16.088；p＝0.003 (5)
对于在第3分钟过程中在探索新型物品上花费的平均时间执行 Mann-Whitney U测试。对于N＝8个独立测量值/组，U值、Z值和p 值计算为：
U＝58.00；Z＝2.731；p＝0.005 (6)
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否影响受试者的学习和记忆。图75A是展示使用恐惧条件反射范例的研究的流程图。如在图75A中的7500处所示，根据一些实施方案将WT小鼠暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时/天，持续连续七天，第1天-第7天。在第8天，在7502处所示，将小鼠经受适度的双音调-电击配对。具体地，将小鼠引入到新场地中，其中第一音调与脚部电击配对。小鼠进行条件反射而将环境(即，音调)与厌恶经历(即，脚部电击)相关联。对于此初始环境，在僵直(freezing)上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(24)＝0.577；p＝0.569 (7)
在第9天，在7504处所示，在改变的环境中实施音调测试。图 75B是展示作为时间的函数的音调测试的刺激图，包括第一音调环境 7506、第一音调后环境7508、第二音调环境7510、以及第二音调后环境7512。对于所述测试，将小鼠返回到第一音调与腿部电击配对的场地。当施加第一音调环境7506时，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在僵直上花费更多时间，可能在期待脚部电击，从而指示记忆的行为。与对照组相比，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠在第二音调环境7510过程中在僵直上也花费更多时间，但是在音调后环境过程中在僵直上花费较少时间。
图76A和图76B是证明根据一些实施方案增强的记忆的条形图。如图76A所示，根据一些实施方案，与对照组相比，对于暴露于40-Hz 光闪烁的小鼠，在第一音调环境7506和第二音调环境7510过程中在僵直上花费的时间的百分比更大，从而指示增强的记忆关联。此外，根据一些实施方案，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠表现出更强的恐惧消退音调后呈现。如图76B所示，根据一些实施方案，与暴露于40-Hz 光闪烁的小鼠相比，对于对照组，在第一音调后环境7506和第二音调后环境7510过程中在僵直上花费的时间的百分比更大，从而指示增强的记忆特异性。
对于音调前环境，在各组之间执行RM ANOVA，并且在僵直上花费的平均时间的F分布和p值计算为：
F(1,24)＝3.106；p＝0.091 (8)
对于第一音调环境，在僵直上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(24)＝-2.155；p＝0.041 (9)
对于第二音调环境，在僵直上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(24)＝-1.433；p＝0.164 (10)
对于音调环境，在各组之间执行RM ANOVA，并且在僵直上花费的平均时间的F分布和p值计算为：
F(1,24)＝4.559；p＝0.043 (11)
对于第一音调后环境，在僵直上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(24)＝1.874；p＝0.073 (12)
对于第二音调后环境，在僵直上花费的总时间的T分布和p值计算为：
T(24)＝2.223；p＝0.036 (13)
对于音调后环境，在各组之间执行RM ANOVA，并且在僵直上花费的平均时间的F分布和p值计算为：
F(1,24)＝6.646；p＝0.017 (14)
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否改善受试者的记忆。图77A是展示所述研究的流程图。如在图77A 中的7700处所示，根据一些实施方案将WT小鼠暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时/天，持续连续七天，第1天-第7天。在第8天，在7702处所示，实施Morris水迷宫测试。
Morris水导航任务或迷宫是用于研究实验室小鼠的空间记忆和学习的测试。行为程序涉及将受试者放置在具有不可见或可见的平台的大原形池，所述平台允许受试者使用praxic策略(记住达到平台所需要的移动)、taxic策略(使用视觉提示来定位平台)、或空间策略(使用距离提示作为参考点)逃离水。图77B是展示Morris水迷宫的图。所述迷宫包括具有分成方向象限的水和隐藏在西南(SW)象限中的平台7704的圆形池。
对于弱训练，Morris水迷宫测试每天重复两次，持续连续四天，第8天-第11天。图78A是描绘根据一些实施方案由暴露于正常室内光照(NRL)的小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的小鼠找到平台的延迟的曲线图。
在第12天，通过将隐藏的平台从Morris水迷宫移除来实施探测测试。图77C和图77D是展示在探测测试过程中受试者的代表性轨迹的图像。在图77C中，暴露于正常室内光照的小鼠似乎通过整个池寻找平台，而在图77D中，根据一些实施方案，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠似乎更有条理地并且主要在SW象限中寻找。图78B是描绘在靶象限(即，SW象限)中寻找平台上花费的总时间(每个半分钟中的秒数)的曲线图，而图78C是描绘在相反象限(即，NE象限)中寻找平台上花费的总时间(每个半分钟中的秒数)的曲线图。根据一些实施方案，暴露于40-Hz光闪烁的小鼠比对照组在靶象限中进行寻找上花费更多的时间并且比对照组在相反象限中进行寻找上花费更少的时间，从而指示空间记忆增强。
使用来自Morris水迷宫试验和探测测试的相同组的小鼠来实施反向学习。图79A是展示如在所述试验中在SW象限中隐藏平台7900 的Morris水迷宫的图。图79B是展示用于反向学习的在相反NE象限中隐藏平台7902的Morris水迷宫的图。
对于弱训练，反向学习每天重复两次，持续连续四天，第14天- 第17天。图79C是描绘根据一些实施方案由暴露于正常室内光照 (NRL)的小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的小鼠找到平台的延迟的曲线图。虽然在第7天之后没有接受另外的40-Hz暴露，暴露于40-Hz 光闪烁的小鼠仍显示增加的行为灵活性。
实施另一项研究来检查根据一些实施方案的慢性γ暴露和/或施用是否影响受试者的空间学习和记忆。图80A是展示所述研究的流程图。如在图80A中的8000处所示，根据一些实施方案将C57BL/6 小鼠暴露于正常室内光照(N＝7)或40-Hz光闪烁(N＝7)一小时/天，持续两周。在第三周过程中，在8002处所示，继续将小鼠在每天早上暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时，并且然后每天下午还经受Morris水迷宫测试。
图80B是描绘在第三周的第1天-第4天由暴露于正常室内光照 (NRL)的小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的小鼠找到平台的延迟的曲线图。在第三周之后，通过移除隐藏的平台来实施探测测试。图 80C是描绘在探测测试过程中在靶象限中寻找平台上花费的总时间 (每30秒试验中的秒数)的条形图。根据一些实施方案，与一周处理相似，慢性三周处理增强空间学习。
使用来自图80A-图80C的相同组的小鼠来实施反向学习。图81A 是展示扩展的研究的流程图。如在图81A中的8100处所示，根据一些实施方案将C57BL/6小鼠暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时/天，持续两周。在第三周过程中，在8102处所示，继续将小鼠在每天早上暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时，并且然后每天下午还经受Morris水迷宫测试。在第四周过程中，在8104处所示，继续将小鼠在每天早上暴露于正常室内光照或40-Hz光闪烁一小时，并且然后每天下午还经受Morris水迷宫反向测试。图81B是描绘根据一些实施方案在第四周的第1天-第4天由暴露于正常室内光照 (NRL)的小鼠和暴露于40-Hz光闪烁(40-Hz)的小鼠找到平台的延迟的曲线图。
在第四周之后，通过移除隐藏的平台来实施探测测试。图82A 是描绘在探测测试过程中在靶象限中寻找平台上花费的总时间(每30 秒试验中的秒数)的条形图。图82B是描绘在探测测试过程中在相反象限中花费的时间的条形图。暴露于40-Hz光闪烁的小鼠显示更强的认知灵活性。
在γ频率下的视觉刺激提供解剖学、形态学、细胞和分子益处。
实施研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用对于受试者的视觉皮层中的DNA损伤和神经元损失的作用。对于所述研究，使用p25积聚的诱导型小鼠模型(即，肌酸激酶-羧基末端片段p25 Tg 小鼠(CK-p25 Tg小鼠))。CK-p25 Tg小鼠模型显示AD的关键病理学标志，包括前脑中的明显的神经元损失、增加的Aβ肽产生、tau病变、DNA损伤、以及严重的认知障碍。在此模型中，在神经元损失之前观察到增加的Aβ肽产生；此外，减少Aβ肽产生减轻CK-p25 Tg 小鼠模型中的记忆缺陷，从而指示此事件与羧基末端片段p25协同作用，导致神经退化和记忆障碍的显现。
图83是展示CK-p25 Tg小鼠的变化的时间线图8300。在两周之后8302，小鼠表现出DNA损伤(例如，生物标记物γH2AX)、增加的 Aβ肽和小神经胶质细胞活化。在六周之后8304，小鼠表现出突触损失、神经元损失、tau过磷酸化、长期增强作用缺陷、以及记忆障碍。
实施研究来比较在不同处理方案下的小鼠的组。图84是各组的图，包括CK对照小鼠8400、非处理CK-p25 Tg小鼠8402、使用美金刚胺(10mg/kg每天)处理的CK-p25 Tg小鼠8404、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁(每天一小时，持续6周)的CK-p25 Tg小鼠8406、以及使用美金刚胺处理并且还暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠8408。美金刚胺是用于通过阻断NMDA受体、从而在谷氨酸能系统上起作用来治疗严重的AD的具有有限成功的药品。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护大脑解剖结构和/ 或减少大脑解剖结构的变化。例如，γ暴露减少和/或预防大脑重量的 CKp-25诱导的损失。图85是比较以下小鼠的大脑重量变化的条形图： CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。大脑重量损失在非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg 小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25Tg小鼠中是明显的。然而，根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠保留更多的大脑重量。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护大脑形态和/或减少大脑形态的变化。例如，γ暴露减少和/或预防受试者的CKp-25诱导的异常侧脑室扩张。图86是比较以下小鼠的侧脑室扩张的倍数变化的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的 CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的 CK-p25 Tg小鼠，以CK对照小鼠的扩张作为基线。侧脑室扩张在非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠中是明显的。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠的侧脑室比其他CK-p25 Tg小鼠的侧脑室扩张更少。
图87A-图87E是展示代表每个组的受试者的侧脑室的图像。侧脑室在非处理CK-p25 Tg小鼠(图87A)、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图87B)、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的 CK-p25 Tg小鼠(图87C)中最大。如图87D所示，根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠的侧脑室扩张远远更少。图 87E是CK对照小鼠中基线侧脑室大小的实例。
图88A-图88C是展示根据一些实施方案的用于分子表征的感兴趣的大脑区域的大脑解剖结构图。图88A包括视觉皮层(V1)8800、躯体感觉皮层(SS1)8802、海马体8804、以及岛叶皮层8806。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护视觉皮层中的皮质层和神经元层和/或减少所述皮质层和神经元层的变化。例如，γ暴露减少和/或预防受试者的视觉皮层中的CKp-25诱导的皮质层和神经元层损失。
使用具有Hoechst标记(即，用于染色DNA的蓝色荧光染料)的核染色来计量皮质层损失。使用NeuN(通常用作神经元的生物标记物的神经元核抗原)来计量神经元层损失。图89是描绘每个组中V1-皮质层的平均厚度的条形图，并且图90是描绘每个组中V1-NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图91A-图91E是展示代表每个组的受试者的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。图91A是CK对照小鼠的基线V1- 皮质层(例如，837±9μM)和V1-神经元层(例如，725±7μM)的厚度的实例。
V1-皮质层在以下小鼠中逐渐变薄：根据一些实施方案暴露于 40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠(图91D，例如，855±9μM)；使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠(图91E，例如， 821±22μM)；非处理CK-p25 Tg小鼠(图91B，例如，792±13μM)；以及使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图91C，例如，788±9μM)。
V1-神经元层在根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠中比在CK对照小鼠中实际上更厚(图91D，例如，743±9μM)，但是然后在以下小鼠中比在CK对照小鼠中逐渐更薄：使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠(图91E，例如，691±20 μM)；非处理CK-p25 Tg小鼠(图91B，例如，666±14μM)；以及使用美金刚胺处理的CK-p25Tg小鼠(图91C，例如，660±7μM)。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护躯体感觉皮层中的皮质层和神经元层和/或减少所述皮质层和神经元层的变化。例如，γ暴露减少和/或预防受试者的躯体感觉皮层中的CKp-25诱导的皮质层和神经元层损失。
图92是描绘每个组中SS1-皮质层的平均厚度的条形图，并且图 93是描绘每个组中SS1-NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图94A-图94E是展示代表每个组的受试者的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。图94A是CK对照小鼠的基线SS1- 皮质层(例如，846±10μM)和SS1-神经元层(例如，707±8μM)的厚度的实例。
SS1-皮质层在以下小鼠中逐渐变薄：根据一些实施方案暴露于 40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠(图94D，例如，834±9μM)；使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25Tg小鼠(图94E，例如， 778±13μM)；非处理CK-p25 Tg小鼠(图94B，例如，762±17μM)；以及使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图94C，例如，756±11 μM)。
根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠的SS1- 神经元层与CK对照小鼠的SS1-神经元层是几乎相同的厚度(图94D，例如，705±15μM)。然而，SS1-神经元层在以下小鼠中逐渐变薄：使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠(图94E，例如，650±11μM)；非处理CK-p25 Tg小鼠(图94B，例如，630±13 μM)；以及使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图94C，例如，629± 9μM)。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护岛叶皮层中的皮质层和神经元层和/或减少所述皮质层和神经元层的变化。例如，γ暴露减少和/或预防受试者的岛叶皮层中的CKp-25诱导的皮质层和神经元层损失。
图95是描绘每个组中岛叶皮层的皮质层的平均厚度的条形图，并且图96是描绘每个组中岛叶皮层的NeuN-阳性细胞层的平均厚度的条形图。
图97A-图97E是展示代表每个组的受试者的具有Hoechst标记和/或NeuN标记的细胞的图像。图97A是CK对照小鼠的岛叶皮层的基线皮质层(例如，1134±10μM)和神经元层(例如，1010±11μM) 的厚度的实例。
皮质层在以下小鼠的岛叶皮层中逐渐变薄：根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠(图97D，例如，1079±20μM)；使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图97C，例如，983±12μM)；使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠(图97E，例如，965±16μM)；以及非处理CK-p25 Tg小鼠(图97B，例如，764 ±27μM)。
神经元层在以下小鼠的岛叶皮层中逐渐变薄：根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠(图97D，例如，953±17μM)；非处理CK-p25 Tg小鼠(图97B，例如，861±30μM)；使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠(图97C，例如，850±18μM)；以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠(图97E，例如，848 ±15μM)。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护DNA的神经元和 /或损伤的数量和/或减少DNA的神经元和/或损伤的数量的变化。例如，γ暴露减少受试者的视觉皮层中的CKp-25诱导的神经元损失和 DNA损伤。
图98是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的NeuN-阳性细胞的百分比的NeuN-阳性细胞的量的条形图：CK对照小鼠、非处理 CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。因此，CK对照小鼠NeuN- 阳性细胞的百分比在CK对照小鼠中是100％，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中仅约80％，从而证实CK-p25 Tg小鼠模型中的神经元损失。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理在CK-p25 Tg小鼠中预防一定神经元损失。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁在CK-p25 Tg小鼠中预防最多的神经元损失。因此，图98展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可保护视觉皮层中的神经元。然而，美金刚胺和暴露于40-Hz光闪烁的组合不能预防同样多的神经元损失。
DNA双链断裂(DSB)是真核细胞中的DNA损伤的一个实例，其导致基因组不稳定性，从而引发肿瘤发生和可能加速的老化。磷酸化的组蛋白H2AX(γH2AX)用作对于DSB的细胞反应的生物标记物。图99是比较以下小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。对于γH2AX 阳性的细胞在CK对照小鼠中几乎不存在，但是在非处理CK-p25 Tg 小鼠中非常高，从而指示大量的DSB和其他DNA损伤。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理减少CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁引起CK-p25 Tg 小鼠中的γH2AX-阳性细胞的甚至更大的减少。因此，图99展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可减少视觉皮层中的 DNA损伤。然而，美金刚胺和暴露于40-Hz光闪烁的组合显著地增加CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的数量。
图100是展示代表每个组的受试者的使用Hoechst染色剂(指示皮层细胞)、绿色荧光蛋白或GFP(指示CK-p25)、γH2AX(指示DSB)、或NeuN(指示神经元)标记的视觉皮层样品的一系列图像。
γ暴露还减少受试者的躯体感觉皮层中的CKp-25诱导的神经元损失和DNA损伤。图101是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的 NeuN-阳性细胞的百分比的NeuN-阳性细胞的量的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。因此，CK对照小鼠NeuN-阳性细胞的百分比在CK对照小鼠中是100％，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中更接近于80％，从而证实CK-p25 Tg小鼠模型中的神经元损失。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理不能预防CK-p25 Tg小鼠的任何神经元损失，与暴露于40-Hz光闪烁的组合除外，所述组合在CK-p25 Tg小鼠中预防最多的神经元损失。因此，图101展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可保护躯体感觉皮层中的神经元。
图102是比较以下小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量的条形图：CK 对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg 小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。对于γH2AX阳性的细胞在CK对照小鼠中不存在，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中非常高，从而指示大量的DSB和其他DNA损伤。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理减少CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁引起 CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的甚至更大的减少。因此，图 102展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可减少躯体感觉皮层中的DNA损伤。然而，美金刚胺和暴露于40-Hz光闪烁的组合显著地增加CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的数量。
图103是展示代表每个组中的受试者的使用NeuN(指示神经元)、γH2AX(指示DSB)、GFP(指示CK-p25)、和/或Hoechst染色剂(指示皮层细胞)标记的躯体感觉皮层样品的一系列图像。
γ暴露还减少受试者的岛叶皮层中的CKp-25诱导的神经元损失和DNA损伤。图104是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的NeuN- 阳性细胞的百分比的NeuN-阳性细胞的量的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。因此，CK对照小鼠NeuN-阳性细胞的百分比在CK对照小鼠中是100％，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中更接近于80％，从而证实CK-p25 Tg小鼠模型中的神经元损失。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理预防 CK-p25 Tg小鼠的一定神经元损失，与暴露于40-Hz光闪烁的组合除外，所述组合在CK-p25 Tg小鼠中预防最少的神经元损失。因此，图 104展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可保护岛叶皮层中的神经元。
图105是比较以下小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量的条形图：CK 对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg 小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。对于γH2AX阳性的细胞在CK对照小鼠中不存在，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中非常高，从而指示大量的DSB和其他DNA损伤。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理减少CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁引起 CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的相似的减少。因此，图105 展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可减少岛叶皮层中的DNA损伤。然而，美金刚胺和暴露于40-Hz光闪烁的组合显著地增加CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的数量。
图106是展示代表每个组中的受试者的使用NeuN(指示神经元)、γH2AX(指示DSB)、GFP(指示CK-p25)、或Hoechst染色剂(指示皮层细胞)标记的岛叶皮层样品的一系列图像。
γ暴露还减少受试者的海马体中的CKp-25诱导的神经元损失和 DNA损伤。图107是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的NeuN- 阳性细胞的百分比的NeuN-阳性细胞的量的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。因此，CK对照小鼠NeuN-阳性细胞的百分比在CK对照小鼠中是100％，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中更接近于80％，从而证实CK-p25 Tg小鼠模型中的神经元损失。与非处理组相比，使用美金刚胺的使用或不使用暴露于40-Hz光闪烁进行的处理预防CK-p25 Tg小鼠的一定神经元损失，所述非处理组在CK-p25 Tg小鼠中预防最少的神经元损失。因此，图107展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可保护海马体中的神经元。
图108是比较以下小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量的条形图：CK 对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg 小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。对于γH2AX阳性的细胞在CK对照小鼠中不存在，但是在非处理CK-p25 Tg小鼠中非常高，从而指示大量的DSB和其他DNA损伤。与非处理组相比，使用美金刚胺进行的处理减少CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的量。根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁引起 CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的更好的减少。因此，图108 展示根据一些实施方案的40-Hz视觉闪烁处理如何可减少海马体中的DNA损伤。然而，美金刚胺和暴露于40-Hz光闪烁的组合显著地增加CK-p25 Tg小鼠中的γH2AX-阳性细胞的数量。
图109是展示代表每个组的受试者的使用Hoechst染色剂(指示皮层细胞)、GFP(指示CK-p25)、γH2AX(指示DSB)、或NeuN(指示神经元)标记的海马体样品的一系列图像。
显示根据一些实施方案的γ暴露和/或施用保护突触和/或减少突触损失。突触连接性的变化可使用针对谷氨酸能突触的特异性标记物 (例如，VGluT1、VGluT2、PSD95、和GluR2)和针对γ-氨基丁酸能突触的特异性标记物(例如，GAD和VGAT)来定量。
例如，γ暴露减少受试者的视觉皮层中的CKp-25诱导的突触损失。图110是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的基线突触色斑密度的百分比的谷氨酸能突触(使用VGluT1)和γ-氨基丁酸能突触(使用 GAD65)的色斑密度的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于 40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。
γ暴露还减少受试者的躯体感觉皮层中的CKp-25诱导的突触损失并且甚至增加突触色斑密度。图111是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的基线突触色斑密度的百分比的谷氨酸能突触(使用 VGluT1)和γ-氨基丁酸能突触(使用GAD65)的色斑密度的条形图：CK 对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg 小鼠、根据一些实施方案暴露于40-Hz光闪烁的CK-p25 Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。
γ暴露还减少受试者的岛叶皮层中的CKp-25诱导的突触损失。图112是比较以下小鼠的作为CK对照小鼠中的基线突触色斑密度的百分比的谷氨酸能突触(使用VGluT1)和γ-氨基丁酸能突触(使用 GAD65)的色斑密度的条形图：CK对照小鼠、非处理CK-p25 Tg小鼠、使用美金刚胺处理的CK-p25 Tg小鼠、根据一些实施方案暴露于 40-Hz光闪烁的CK-p25Tg小鼠、以及使用美金刚胺和40-Hz光闪烁两者处理的CK-p25 Tg小鼠。
图113A是展示具有Hoechst染色剂(指示皮层细胞)的代表性样品的图像。图113B是展示代表性样品中的VGluT1(指示谷氨酸能突触) 的图像。图113C是展示代表性样品中的GAD65(指示γ-氨基丁酸能突触)的图像。图113D是展示代表性样品中的Hoechst染色剂、VGluT1 和GAD65的合并图像。图113E和图113F展示使用GAD65的色斑定量的方法。图113E是从图113C转换的GAD65的二值图像。ImageJ 软件(可从美国国立卫生研究院，Bethesda，Maryland获得)用于定量二值图像，如图113F所示。
实施研究来检查根据一些实施方案的γ暴露和/或施用是否影响大脑脉管系统。将小鼠置于黑暗箱中并且暴露于40-Hz发光二极管 (LED)或恒定光关闭(黑暗)一小时。在刺激之后，对小鼠进行处死并进行灌注。使用连接到荧光团的凝集素对大脑切片进行染色以荧光地标示血管。使用共焦成像，测量脉管系统大小(即，血管直径)的变化。在一小时的40-Hz LED闪烁之后观察血管舒张。
图128A是展示根据一些实施方案的视觉皮层中的扩大的脉管系统的一系列代表性免疫荧光图像。图128B是描绘视觉皮层中的血管直径并且展示根据一些实施方案的γ暴露之后血管直径的增加的条形图。
因此，证明γ暴露和/或施用提供解剖学益处(例如，预防和/或减少大脑重量损失和脉管系统的扩大)、形态学益处(例如，预防和/或减少异常脑室扩张和皮质层厚度损失)、细胞益处(例如，预防和/或减少神经元损失)、以及分子益处(例如，预防和/或减少DNA损伤和突触损失)。
此外，显示γ暴露和/或施用是神经保护性的。在γ处理之后， CK-p25 Tg小鼠模型-其以其他方式表现出增加的Aβ肽水平、明显的神经元损失、DNA损伤、突触损失、tau过磷酸化、长期增强作用缺陷、以及严重的认知/记忆障碍-显示神经元结构和/或功能的相对保护 (例如，维持和/或预防疾病进程和/或减少/减缓疾病进展)，并且在一些情况下表明神经元结构和/或功能的改善。
在γ频率下的听觉刺激非侵入性地诱导受试者的小神经胶质细胞变化。
在一些实施方案中，γ暴露和/或施用包括听觉刺激。听觉刺激可包括声音脉冲或滴答声。声音刺激可包括约35次声音脉冲或滴答声/ 秒(滴答声/s)至约45次滴答声/s的滴答声系列。图114是展示根据一些实施方案的滴答声系列刺激的刺激图。图114中的刺激具有40次滴答声/s的滴答声频率，每次滴答声之间具有25ms，并且每次滴答声具有1ms的持续时间。
在一些实施方案中，声音刺激具有约10Hz至约100kHz、约12 Hz至约28kHz、约20Hz至约20kHz、和/或约2kHz至约5kHz的频率。例如，滴答声系列中的每次声音脉冲或滴答声具有约10kHz 的频率。
在一些实施方案中，声音刺激具有约0dB至约85dB、约30dB 至约70dB、和/或约60dB至约65dB的声压水平。例如，滴答声系列中的每次声音脉冲或滴答声具有约65dB的声压水平。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激诱导受试者的小神经胶质细胞状态变化。实施研究来检查根据一些实施方案的听觉γ暴露和/ 或施用是否诱导受试者的听觉皮层中的小神经胶质细胞活化。使用与图114相似的40-Hz滴答声系列刺激，所述刺激具有约40次滴答声 /s的滴答声频率，其中每次滴答声具有在约10kHz和约60-65dB的音调下的约1ms的持续时间。假设滴答声系列刺激调节听觉皮层中的PV+神经元，从而外源性地调节听觉皮层中的γ振荡。
图115是展示所述研究的流程图。在图115中，将WT小鼠饲养在其居住笼11500中。将小鼠移到行为箱(即，隔音室)11502一小时/ 天，持续连续七天(第1天-第7天)。当在行为箱11502中时，根据一些实施方案，将第一组小鼠暴露于无声，并且将第二组小鼠暴露于滴答声系列刺激。在行为箱11502中每一小时之后，将小鼠返回到其居住笼11500。在第8天，对小鼠进行处死以用于组织采集和染色11504。
针对小神经胶质细胞的水平、小神经胶质细胞的形态学变化、和小神经胶质细胞活化(如通过胞体大小指示)检查所述组织。图116A 是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激)的小鼠中的小神经胶质细胞的平均数量的条形图。在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中观察到更多的小神经胶质细胞。图116B是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激)的小鼠中的小神经胶质细胞的突起长度的平均倍数变化的条形图。小神经胶质细胞突起的长度的平均倍数变化在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中显著地更小。图116C 是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激)的小鼠中的小神经胶质细胞的胞体大小的平均倍数变化的条形图。小神经胶质细胞的胞体大小的平均倍数变化在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中显著地更大，从而指示更大的小神经胶质细胞活化。
图117A是暴露于无声的小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。图117B是根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。根据一些实施方案小神经胶质细胞的突起和胞体在图117A与图117B之间是可见地不同的。图118A是来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠的小神经胶质细胞的来自图117B的放大图像。突出显示小神经胶质细胞的一个突起 11800。同时，图118B是来自暴露于无声的小鼠的小神经胶质细胞的来自图117A的放大图像。突出显示小神经胶质细胞的一个突起11802，以便显示其相对于来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠的小神经胶质细胞的相比而言较短的突起11800的长度。
图119A是来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠的小神经胶质细胞的来自图117B的放大图像。突出显示小神经胶质细胞的胞体11900的区域。同时，图119B是来自暴露于无声的小鼠的小神经胶质细胞的来自图117A的放大图像。突出显示小神经胶质细胞的胞体11902的区域，以便显示其相对于来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠的小神经胶质细胞的相比而言较大的胞体11900(从而指示更大的小神经胶质细胞活化)的大小。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激诱导受试者的类似于小神经胶质细胞活化的表型。根据一些实施方案使用5XFAD Tg小鼠重复图 115的研究。针对小神经胶质细胞的水平、小神经胶质细胞的形态学变化(例如，突起长度)、和小神经胶质细胞活化(例如，如通过胞体大小指示)检查所述组织。图120A是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激)的小鼠中的小神经胶质细胞的平均数量/像场的条形图。在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中观察到显著更多的小神经胶质细胞。图120B是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激)的小鼠中的小神经胶质细胞的胞体大小的平均倍数变化的条形图。胞体大小的平均倍数变化在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中显著地更大，从而指示更大的小神经胶质细胞活化。图120C是描绘与暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠相比的暴露于无声(无刺激) 的小鼠中的小神经胶质细胞的突起长度的平均倍数变化的条形图。突起的长度的平均倍数变化在根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中显著地更小。
图121A是暴露于无声的小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。图121B是根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。小神经胶质细胞的突起和胞体在图 121A与图121B之间是可见地不同的，其中来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的小鼠的小神经胶质细胞中突起长度相比而言较短并且胞体大小较大。
在γ频率下的听觉刺激非侵入性地减少受试者的听觉皮层和海马体中的Aβ。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激降低受试者的Aβ的水平。根据一些实施方案使用六月大的5XFAD Tg小鼠重复图115的研究。在第8天，切开听觉皮层和海马体。ELISA用于测量可溶性和不可溶 Aβ同种型(包括同种型Aβ1-40肽和同种型Aβ1-42肽)的水平。使用5M胍基-HCl处理不可溶Aβ三小时以便使斑溶解。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激降低受试者的可溶性Aβ的水平。图122A是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激) 的小鼠的听觉皮层中的可溶性同种型Aβ1-42肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的听觉皮层中的可溶性同种型Aβ1-42肽的远远更小水平的条形图。
图122B是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的听觉皮层中的可溶性同种型Aβ1-40肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的听觉皮层中的可溶性同种型Aβ1-40肽的更小水平的条形图。
图122C是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的海马体中的可溶性同种型Aβ1-42肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的海马体中的可溶性同种型Aβ1-42肽的远远更小水平的条形图。
图122D是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的海马体中的可溶性同种型Aβ1-40肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的海马体中的可溶性同种型Aβ1-40肽的更小水平的条形图。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激降低受试者的不可溶Aβ的水平。图123A是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激) 的小鼠的听觉皮层中的不可溶同种型Aβ1-42肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的听觉皮层中的不可溶同种型Aβ1-42肽的远远更小水平的条形图。
图123B是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的听觉皮层中的不可溶同种型Aβ1-40肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的听觉皮层中的不可溶同种型Aβ1-40肽的更小水平的条形图。
图123C是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的海马体中的不可溶同种型Aβ1-42肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的海马体中的不可溶同种型Aβ1-42肽的远远更小水平的条形图。
图123D是描绘根据一些实施方案相对于暴露于无声(无刺激)的小鼠的海马体中的不可溶同种型Aβ1-40肽的水平的暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠的海马体中的不可溶同种型Aβ1-40肽的更小水平的条形图。
图124A是根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的5XFAD 小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。图124B是暴露于无声的 5XFAD小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。小神经胶质细胞的突起和胞体在图124A与图124B之间是可见地不同的，其中来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的5XFAD小鼠的小神经胶质细胞中突起长度相比而言较短并且胞体大小较大。
图124C是暴露于无声的WT小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。图124D是根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的WT小鼠中的小神经胶质细胞的代表性图像。小神经胶质细胞的突起和胞体在图124C与图124D之间是可见地不同的，其中来自根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的WT小鼠的小神经胶质细胞中突起长度相比而言较短并且胞体大小较大。
因此，根据一些实施方案，在γ频率下的非侵入性听觉刺激促进听觉皮层和海马体中的γ振荡和AD相关病变的明显减少。
在γ频率下的听觉刺激对于受试者行为具有积极作用。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激改善受试者的识别力。图 125A是展示使用根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的 5XFAD小鼠和暴露于无声的5XFAD小鼠执行的新型物品识别测试的流程图。所述测试基于啮齿类动物在探索新型物品上比在探索熟悉物品上花费更多时间的倾向来评定受试者从熟悉物品识别新型物品的能力(即，识别记忆)。识别指数RI用于对受试者进行比较：
Figure GDA0003623860480001061
在图125A中，使5XFAD小鼠适应于环境12500。在时间T1处，引入两个新型物品12502。然后在时间T2处，在一小时休息之后，将小鼠暴露于一个熟悉物品12504和一个新型物品12506一小时。图 125B是描绘根据一些实施方案的新型物品识别测试的结果的条形图，其中暴露于滴答声系列刺激的小鼠具有更高的RI，从而指示暴露于滴答声系列刺激的小鼠由于更好的识别记忆而在新物品上比在熟悉物品上花费远远更多时间。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激改善受试者的辨别力。图 126A是展示使用根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的 5XFAD小鼠和暴露于无声的5XFAD小鼠执行的新型物品定位测试的流程图。所述测试基于啮齿类动物在探索新定位的物品上花费更多时间的倾向来评定空间记忆和/或辨别力。识别指数RI用于对受试者进行比较：
Figure GDA0003623860480001062
在图126A中，使5XFAD小鼠适应于环境12600。在时间T1处，将两个物品引入在第一位置12602处。然后在时间T2处，在一小时休息之后，将小鼠暴露于在其第一位置处的所述物品中的一个12604 和定位在新的第二位置处的另一个物品12606一小时。图126B是描绘根据一些实施方案的新型物品定位测试的结果的条形图，其中暴露于滴答声系列刺激的小鼠具有更高的RI，从而指示暴露于滴答声系列刺激的小鼠由于更好的空间记忆和/或辨别力而在移动的物品上比在保持在相同位置中的物品上花费远远更多时间。
根据一些实施方案，显示听觉γ刺激改善受试者的空间记忆。使用根据一些实施方案暴露于滴答声系列刺激的5XFAD小鼠和暴露于无声的5XFAD小鼠执行Morris水迷宫测试。如上所述，所述测试基于受试者使用来从开放游泳场地的周边周围的起始位置进行导航以定位淹没的逃离平台的距离提示来评定空间和/或参考记忆。所述测试进过重复试验进行评定，并且空间和/或参考记忆通过当平台不存在时对于平台区域的偏好来确定。
图127A是描绘根据一些实施方案由暴露于无声(无刺激)的小鼠和暴露于滴答声系列刺激(刺激)的小鼠找到平台的平均延迟的曲线图。图127B是描绘平台移除的探测测试的结果的条形图。根据一些实施方案，暴露于滴答声系列刺激的小鼠比暴露于无声的小鼠在靶象限中寻找消失的平台上花费更多时间，从而指示暴露于滴答声系列刺激的小鼠具有更好的空间和/或参考记忆。
因此，根据一些实施方案，在γ频率下的非侵入性听觉刺激诱导小神经胶质细胞活化，减少AD相关(例如，Aβ)病变，并且显著地减轻认知缺陷(在例如识别力、辨别力和空间记忆方面)。在简单的且可使用的施用选择(包括自己施用)的情况下，听觉γ刺激具有用于广泛的商业应用的潜力，包括但不限于用于家庭或移动使用(例如，使用噪声消除耳机)的应用。除自己施用潜力之外，临床医生和/或研究人员可根据一些实施方案向范围是动物模型至人类患者的受试者施用刺激范例。临床医生和/或研究人员可发现将听觉γ刺激与各种形式的监测组合起来是有用的。例如，治疗会话可包括将受试者定位在隔音房间中或为受试者提供噪声消除耳机或限制干扰的另一种装置。受试者可针对任何有益的大脑状态变化使用例如功能性磁共振成像 (fMRI)来在刺激过程中进行监测。
实验方法
动物
所有的动物工作均经由比较医学部的动物护理委员会 (Committee for AnimalCare of the Division of Comparative Medicine) (麻省理工学院，Cambridge，Massachusetts)批准。通过将5XFAD Tg 小鼠与Tg PV或CW2启动子驱动的Cre系杂交来产生成年(三月大) 雄性双重Tg 5XFAD Cre小鼠。成年(5月大)雄性和雌性APP/PS1小鼠由Tonegawa实验室(麻省理工学院，Cambridge，Massachusetts)赠送。成年(4月大)雄性TauP301S小鼠从Jackson实验室获得。老龄 WT小鼠(8月大，C57Bl/6)从Jackson实验室(BarHarbor，Maine)获得。将小鼠以3-5只的组根据标准12小时光照/12小时黑暗周期进行饲养，并且所有的实验在光照周期过程中执行。除非另外指明，随意提供食物和水。实验员将同窝出生小鼠随机分配到每种条件。实验员在组织处理和电生理记录和分析过程中对于动物基因型不知情。没有动物从分析被排除。
AAV载体
具有血清型5的腺病毒相关病毒颗粒从Vector Core Facility(北卡罗来纳大学，教堂山，北卡罗来纳)获得。AAV5病毒含有融合到由 EF1α启动子驱动的双侧限定反向开放阅读框(DIO)中的增强的黄色荧光蛋白(EYFP)的ChR2(参见，例如，图9)。AAV DIO EYFP构建体用作对照。
外科手术程序
使用腹膜内注射开他敏(1.1mg kg-1)和安耐宁(0.16mg kg-1)的混合物对三月大的5XFAD/PV-Cre或CW2小鼠进行麻醉。在前颅后2.0 mm处并且在中线左侧上横侧1.8mm处进行小的开颅术。通过附接到Quintessential Stereotaxic InjectorTM(可购自Stoelting公司，Wood Dale，Illinois)的玻璃微量移液管通过小的硬脊膜切开来递送病毒。将玻璃微量移液管降低至大脑表面以下1.2mm。将1μl病毒的丸剂 (AAV DIO ChR2–EYFP或AAV DIOEYFP；2X 1012个病毒分子/ml) 在0.075μl min-1下注射到海马体的CA1区域中。在注射之后将移液管保持在适当位置5min，然后从大脑回缩。将单一光纤植入物(300 μm芯部直径，可从Thorlabs公司，Newton，New Jersey获得)降低至注射部位周围的大脑表面以下0.9mm。将锚固在手术部位的前部和后部边缘处的两个小螺钉使用牙胶结合以使植入物固定在适当位置。针对电生理记录，使用异氟烷对成年(三月大)雄性5XFAD/PV-Cre双转基因小鼠以及5XFAD阴性同窝出生(针对CA1记录)或5XFAD及其WT同窝出生(针对视觉皮层记录)小鼠进行麻醉并且放置在立体定向框架中。刮去头皮，将眼用软膏(例如，
Figure GDA0003623860480001091
Vet软膏(Dechra Pharmaceuticals上市公司，Northwich，英国))施加到眼睛，并且使用
Figure GDA0003623860480001093
抗菌剂(可从Purdue Products L.P.，Stamford，Connecticut获得)和70％乙醇对手术区域进行灭菌。针对CA1记录，进行开颅术(以 mm计，从前颅：-2A/P，1.8M/L)以将1μL病毒递送到CA1(如上所述)。将用于LFP记录的靶开颅术部位标记在颅骨上(以mm计，从前颅：针对CA1，-3.23A/P，0.98M/L并且针对视觉皮层，2.8A/P，2.5 M/L)，将三个自攻螺钉(例如，F000CE094，可从Morris Precision Screws and Parts公司，Southbridge，Massachusetts获得)附接到颅骨，并且使用牙粘固剂(例如，C&B
Figure GDA0003623860480001092
可从Parkell公司，Edgewood，New York获得)附连定制的不锈钢顶板。在第一记录会话的当天，使用牙钻来进行LFP开颅术(例如，300-400μm直径)，这通过以下来进行：首先使颅骨变薄，直至大约100μm厚，并且然后使用30规格针来制作小孔。然后使用无菌硅氧烷弹性体(例如， Kwik-SilTM粘合剂，可从World Precision Instruments公司，Sarasota， Florida获得)密封开颅的颅骨，直至记录当天和之间的记录会话为止。
光遗传刺激方案
在病毒注射和植入物放置之后二至四周(这为小鼠提供恢复并且经历用于电生理学的针对动物的行为训练的时间并且为病毒提供在神经元中表达的时间)，光遗传地操纵海马趾CA1神经元。使用光纤信道/物理接触连接器在每个端部将200mW 4793nm DPSS激光器连接到接插线。在实验过程中，递送1mW(从光纤的端部进行测量)的光学刺激，持续一小时。针对分子和生物化学分析，每只动物接受三种刺激方案中的一种：8Hz、40Hz或随机刺激(在通过具有40Hz的平均频率的泊松过程确定的随机间隔的情况下递送光脉冲)，或者针对电生理记录，每只动物接受在记录过程中交错的所有刺激条件。
视觉刺激方案
在实验之前十五分钟，使用盐水(对照)或木防己苦毒素(0.18 mg/kg)处理5XFAD小鼠。针对分子和生物化学分析，然后将小鼠置于通过LED电灯照明的黑暗室中并且暴露于以下五种刺激条件中的一种一小时：黑暗、光照、20-Hz闪烁、40-Hz闪烁、或80-Hz闪烁(12.5ms光打开，12.5ms光关闭)(参见，例如，图43A)。针对电生理记录，每只动物接受黑暗、光照、40-Hz闪烁、或在记录过程中以 10s时间段交错的随机(在通过具有40Hz的平均间隔的泊松过程确定的随机间隔的情况下递送光脉冲)刺激条件。
针对电生理学的行为训练和虚拟现实环境(VR)
针对CA1记录，头部固定的动物在由气垫支撑的8”球形跑步机上跑步通过虚拟现实环境，如Harvey等人所述的。球形跑步机的运动通过光学鼠标测量并且馈送到虚拟现实软件中，在
Figure GDA0003623860480001101
计算环境(软件版本2013b，可从MathWorks，Natick，Massachusetts获得) 中运行。虚拟环境由在端部处具有两个小围栏的线性轨道组成，在端部处，动物可转弯。动物由于交替到达轨道的每个端部而在轨道的每个端部处被奖励甜炼乳(在水中1:2稀释)。动物在大约一周内学习在虚拟线性轨道上跑步。使动物静置以从手术恢复，持续一周，并且使其适应于操作，持续一至两天，然后开始行为训练。为了学习在跑步机上运动并且在测试环境中感觉舒服，在训练的前两天，将动物在不佩戴虚拟现实系统的情况下置于球形跑步机上，并且被奖励未稀释的甜炼乳。在球形跑步机上训练的第二天，限制动物的食物以促使其跑步。将动物限于其基线重量的不多于85％并且通常称重高于其基线重量的88％。从第三天直至训练结束(通常5-七天)，将动物置于跑步机上以用于增加在VR线性轨道中跑步的时间量(30min至2小时)。在穿过轨道的长度之后，动物在线性轨道的端部处被奖励稀释(1:2)的甜炼乳。在记录会话之间，动物被给予复习训练会话以维持行为表现。针对视觉皮层记录，动物在球形跑步机上跑步，同时暴露于黑暗、光照或光闪烁条件(在以下数据采集中描述)。在记录之前，通过置于球形跑步机上(在不佩戴虚拟现实系统的情况下)并且接受未稀释的甜炼乳的奖励，动物学习在跑步机上运动并且在测试环境中感觉舒服。
电生理数据采集
针对CA1的光遗传刺激，在记录过程中，将300μm芯部光纤前进通过用于将病毒递送到CA1以进入到大脑中的900μm深度的开颅的颅骨。1ms且1mW(从光纤的端部测量)的光脉冲通过473nm DPSS(二极管泵浦固态)激光器(如上所述)进行递送。为了避免光电假象，使用玻璃电极记录神经活性。将LFP电极在基于纤丝的微量移液管拉出器(例如，P-97Flaming/BrownTM微量移液管拉出器，可从 Sutter Instrument公司，Novato，California获得)上从硼硅酸盐玻璃移液管(例如，可从Warner Instruments，Hamden，Connecticut获得)拉出到精细尖端，所述精细尖端然后手动破碎至大约10-20μm的直径并且然后填充有无菌盐水。针对CA1记录，将LFP电极以冠状面向后60度和水平面向下45度的角度前进通过LFP记录开颅的颅骨，直至观察到海马趾锥体层的清楚的电生理信号(在动物跑步时大约 600-1000μVθ波，在静态过程中清楚地可分辨的SWR，大于150μV 的多重尖峰，参见，例如，图2A-图2B)。针对视觉皮层记录，将LFP 电极竖直地前进通过LFP记录开颅的颅骨至600-900μm的深度，并且观察到大于150μV的多重尖峰。在20kHz的采样速率和带通滤波 1Hz-1kHz的情况下采集数据。动物在球形跑步机上跑步或休息延长的时间段。针对光遗传刺激会话，在开始任何刺激之前，记录数据 30分钟。然后将刺激在γ(40Hz)、随机(如在光遗传刺激下所述的)或θ(8Hz)频率下进行递送，持续10s时间段，与10s基线时间段(无刺激)交错。在两只动物中，每种类型的刺激或基线刺激递送5min 时间段而不是10s时间段。每30分钟的刺激记录接着5-30分钟的没有刺激的记录。针对视觉光闪烁刺激会话，在动物光周围的LED条形光在γ(40Hz)、随机(以上在视觉刺激方案中所述的)、θ(8Hz)或 20Hz频率下闪烁10s时间段，或者持续10s时间段，与光关闭的 10s时间段交错。在光闪烁过程中在大脑表面上方进行一些记录，以便确保光在记录过程中不产生电噪声或光电噪声。记录会话在大约 3-5小时之后终止。动物在记录时3-4月大。电生理记录的分析
尖峰检测
通过阈值分割300-6000Hz带通信号来检测尖峰。阈值是滤波信号加上五倍的滤波信号的标准偏差的稳健估计值的中值(中值 /0.675)，以避免标准偏差测量值被尖峰污染(参见，例如，Rossant等人，“Spike Sorting for Large,Dense Electrode Arrays”，bioRxiv doi: dx_doi_org_10.1101_015198(2015年2月16日))。
局部场电势(LFP)
将记录的迹线下采样至2kHz并且然后在1Hz至300Hz之间进行带通滤波。
θ和SWR检测
当动物跑步或安静地站立时，跨海马趾网络的活性明显地变化，并且这些变化经常被称为不同的网络状态。这些网络状态可通过不同频率带中LFP振荡的存在或不存在清楚地分辨。当动物跑步时，观察到CA1中的大θ(4-12Hz)振荡，如其他所示(参见，例如，图2A)。当动物安静地站立时，θ振荡不再可见，并且记录到SWR，所述SWR 是持续大约50-100ms并且与群体活动的爆发相关联的150-250Hz的高频振荡(参见，例如，图2B)。当滤波迹线的包络幅度大于高于平均值的四个标准偏差至少15ms时，检测到SWR(参见，例如，图4A、图4B、图5A、图5B、图6A、图6B、图7B、和图8)。包络幅度通过取滤波LFP的希尔伯特变换(Hilberttransform)的绝对值来计算。已确认，当使用SWR检测的更高阈值，即高于平均值的6个标准偏差(其检测更大的SWR)时，本文公开的结果仍然成立(参见，例如，图6C 和图7C)。为了检测θ(参见，例如，图3A和图3B )，使用FIR等涟波滤波器针对θ(4-12Hz)、δ(1-4Hz)和β(12-30Hz)对LFP进行带通滤波。θ与δ和β的比率(‘θ比率’)计算为θ包络幅度除以δ和β包络幅度的总和。θ时间段归类为这样的时间：θ比率大于高于平均值一个标准偏差至少两秒，并且所述比率达到高于平均值至少两个标准偏差的峰。非θ时间段归类为这样的时间：θ比率小于一至少两秒。目视检查SWR、θ时间段和非θ时间段以确保这些准则分别准确地检测 SWR、θ时间段和非θ时间段。
功率谱
使用多椎体法(multitaper methods)执行光谱分析(例如，Chronux 开源软件，可从在Cold Spring Harbor实验室，Cold Spring Harbor， New York的Mitra实验室获得，时间-带宽乘积＝3，锥体数量＝5)。为了检查在没有刺激的情况下的功率谱(参见，例如，图3A和图3B )，仅包括θ时间段：大于5秒长的θ时间段分为5秒试验并且关于这些试验针对每只动物计算平均功率谱密度。为了检查在光遗传刺激(参见，例如，图13A和图6C)和视觉刺激(参见，例如，图43B和图43C) 过程中的功率谱，数据分为每种刺激条件或基线时间段的10秒试验，并且关于这些试验针对每只动物计算平均功率谱密度。
SWR过程中的γ
使用多椎体法计算频谱(例如，Chronux开源软件，可从在Cold Spring Harbor实验室，Cold Spring Harbor，New York的Mitra实验室获得)。针对每个SWR(包括SWR的峰之前和之后400ms的窗口)计算频谱。然后使用跨整个记录会话计算的频谱的平均值和标准偏差在每个频率带中计算z得分频谱来创建标准偏差的单元中的功率的归一化测量值(参见，例如，图4A、图4B、图5A和图5B)。SWR过程中的γ振荡的瞬时频率通过以下来计算：针对10-50Hz带通滤波LFP，进行希尔伯特变换，然后取变换信号的峰的差值的倒数(参见，例如，图4A、图5A和图5B)。在SWR之前、过程中和之后的γ频率通过以下计算：针对低γ(20-50Hz)滤波LFP并且取希尔伯特变换的包络幅度以获得中心在SWR峰上的100ms仓中的平均γ功率。此功率通过整个记录会话的包络幅度的平均值和标准偏差进行归一化以获得每个SWR周围的每个仓的z得分γ功率(参见，例如，图6A和图7B)。通过SWR过程中的γ进行的相调制通过以下计算：针对γ(20-50Hz) 滤波LFP，进行希尔伯特变换，并且确定发生在SWR过程中的每个尖峰的所得的信号的相(参见，例如，图7E)。为了测量5XFAD动物与WT动物之间相调制的差值，使用重采样用于替换：随机选择来自每个记录的100个尖峰的亚组以创建相调制分布，并且这针对每个记录重复500次(参见，例如，图6C和图7A)。然后通过计算峰与谷之间的差值除以每个分布的峰和谷的总和来针对尖峰-γ相分布测量调制的深度(参见，例如，图6C和图7A)。刺激过程中击发的差异：为了绘制刺激诱发的多单元击发柱状图，在脉冲上的每个光开始之后针对100ms将尖峰分仓在2.5ms仓中，并且计算每个仓中的尖峰分数。然后跨时间段上的所有光计算平均值和SEM。为了计算各条件之间的多单元击发速率的差值，针对刺激或基线的每个10秒时间段计算击发速率(尖峰的总数量除以时间段的持续时间)。取相关类型的刺激的附近时间段之间的击发速率的差值(γ刺激时间段中的击发速率减去光遗传刺激的基线或随机时间段中的击发速率，γ刺激时间段中的击发速率减去光闪烁刺激的基线、连续或随机时间段中的击发速率)。来自所有动物的差值在柱状图中进行绘制(参见，例如，图14A和图 44A)，并且在盒形图中绘制每只动物的差值的中值和四分位数(参见，例如，图13B和图44A)。
免疫组织化学
在深度麻醉下使用4％多聚甲醛灌注小鼠，并且大脑在固定后在 4％多聚甲醛中过夜。使用振动切片机(例如，Leica VT100S，可从Leica Biosystems，Buffalo Grove，Illinois获得)在40μm下对大脑进行切片。使切片透化并且在室温下在含有0.2％TritonX-100和10％正常驴血清的PBS中阻断一小时。将切片在4℃下在具有0.2％Triton X-100和10％正常驴血清的PBS中的初级抗体中孵育过夜。初级抗体是抗 EEA1(BD TransductionLaboratoriesTM EEA1(641057)，可从BD Biosciences，San Jose，California获得)、抗β-淀粉样蛋白(例如，β- 淀粉样蛋白(D54D2)
Figure GDA0003623860480001151
，可从Cell Signaling Technology，Danvers，MA获得)、抗Iba1(例如，019-19741，可从Wako Chemicals，Richmond， Virginia获得)、抗小清蛋白(例如，ab32895，可从Abcam，Cambridge， Massachusetts获得)、抗Rab5(ADI-KAp-GP006-E，可从Enzo Life Sciences公司，Farmingdale，New York获得)。为了确认ELISA实验，使用抗Aβ抗体D54D2，因为它允许与EEA1进行共标记，并且使用抗Aβ抗体12F4，因为它不与APP反应，从而允许确定标记是否对于Aβ是特异性的。针对共标记实验，使用抗Aβ抗体12F4(805501，可从BioLegend，San Diego，California获得)。初级抗体使用 Alexa-Fluor488和Alex-Fluor 647二级抗体(分子探针)进行过可视化，神经元核使用Hoechst 33342(94403，可从Sigma-Aldrich，St.Louis， Missouri获得)进行可视化。使用共焦显微镜(LSM710；ZeissTM)在相同设定下针对所有条件采集图像。由对于处理组不知情的实验员使用ImageJ 1.42q对图像进行定量。针对每种实验条件，使用来自至少3 只动物的至少2个冠状切片用于定量。针对海马趾CA1成像，分析限于锥体细胞层，不同的是Iba1+细胞分析的情况，在所述情况下，需要整个视场来对细胞的足够数量进行成像。ImageJ用于测量Iba1+ 细胞体的直径并且追踪长度测量的过程。此外，Coloc2插件用于测量 Iba1和Aβ的共定位。Imaris x64 8.1.2(可从Bitplane，Belfast，英国获得)用于3-D渲染图。针对计数“斑数量”，包括大于或等于10μm 的沉积物。
CLARITY
在1XPBS中将固定的大脑在振动切片机(例如，Leica VT100S，可从LeicaBiosystems，Buffalo Grove，Illinois获得)上切成100uM冠状切片。参考Allen MouseBrain Atlas选择含有视觉皮层的切片，并且在清理缓冲液(pH 8.5-9.0，ddH2O中的200mM十二烷基硫酸钠、 20mM氢氧化锂一水合物、4mM硼酸)中孵育2小时，在55℃下摇动。将清理的切片在1XPBST(0.1％Triton-X100/1XPBS)中洗涤3x10 min并且放到阻断溶液(2％胎牛血清/1XPBST)中过夜，在RT下摇动。随后，在1X.PBST中执行三个一小时洗涤，在RT下摇动。然后将切片在摇动情况下在4℃下与在1X PBST中稀释至1:100的抗β- 淀粉样蛋白(805501，可从BioLegend，San Diego，California获得) 和抗Iba1(Wako Chemicals，Richmond，Virginia；019-19741)初级抗体一起孵育2天。实施在1XPBST中的另一组3x1 h洗涤，然后将切片在摇动情况下在RT下在1:100 1X PBS稀释的二级抗体混合物中孵育。片段化的驴抗兔Alexa
Figure GDA0003623860480001161
488(ab175694)和抗小鼠568 (ab150101)二级抗体(均可从Abcam，Cambridge，Massachusetts获得) 用于使初级抗体标记可视化。在此孵育时间段经过一半时，在1:250 最终稀释度下将Hoechst 33258(Sigma-Aldrich；94403)掺入到每个样品中。然后将切片在摇动的情况下在RT下在1xPBS中洗涤过夜。在安装用于成像之前，将薄片在摇动的情况下在RT下在RIMS(折射率匹配溶液：75g Histodenz，20mL 0.1M磷酸盐缓冲液，60mL ddH2O) 中孵育一小时。使用Fluoromount G封固剂(Electron MicroscopySciences，Hatfield，PA，USA)将组织切片安装到具有盖玻片的显微镜载玻片(例如，VistaVisionTM，可从VWR International，LLC，Radnor， PA获得)上。在具有附带的ZenBlack 2.1软件的ZeissTM LSM 880显微镜(Carl Zeiss Microscopy，Jena，Germany)上采集图像。使用 Plan-Apochromat 63x/1.4Oil DIC物镜拍摄用于3-D重建的切片概况和细胞水平图像。使用Imarisx64 8.1.2(BitplaneTM(Zurich，Switzerland) 用于3-D渲染图和分析。
蛋白质印迹
使用来自三月大的雄性5XFAD/PV-Cre小鼠的组织制备海马趾 CA1全细胞裂解液。使用手动均化器(Sigma-Aldrich(St.Louis， Missouri))将组织在1ml RIPA(50mM TrisHCl pH 8.0，150mM NaCl，1％Np-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中均化，在冰上孵育15min，并且在4℃下旋转30min。通过在14,000rpm下离心10分钟来分离并弃去细胞碎片。使用纳米滴来定量裂解液并且将25μg蛋白质加载在10％丙烯酰胺凝胶上。将蛋白质在100V下从丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜(例如，InvitrogenTM，可从Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts获得)120min。使用在TBS:Tween中稀释的胎牛血清白蛋白(5％w/v)阻断膜。将膜在初级抗体中在4℃下孵育过夜并且在二级抗体中在室温下孵育90分钟。初级抗体是抗APP (InvitrogenTMPAD CT695，可从Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts获得)、抗APP(A8967，可从Sigma-Aldrich，St.Louis， Missouri获得)、抗β-肌动蛋白(ab9485，可从Abcam，Cambridge， Massachusetts获得)。二级抗体是辣根过氧化物酶连接的(例如，可从 GE Healthcare，Marlborough，Massachusetts获得)。使用ImageJ1.46a 定量信号强度并且归一化到β-肌动蛋白的值。使用顺序蛋白质提取检查tau蛋白溶解性。使用针对Tau5的抗体(例如，AHB0042，可从 Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts获得)探测洗涤剂不可溶tau级分。
ELISA
从雄性小鼠分离海马趾CA1或VC，使用PBS或5M胍基HCl 裂解，并且根据制造商的说明书使用小鼠/人类Aβ1-40或Aβ1-42ELISA 试剂盒(例如，InvitrogenTM，可从ThermoFisher Scientific，Waltham， Massachusetts获得)使其经受Aβ测量。使组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中裂解以提取PBS可溶性Aβ级分。可溶性Aβ级分可能含有单体Aβ和低聚Aβ。还使用胍基盐酸(HCl)处理组织以提取不可溶Aβ级分。
全基因组RNA测序
使用
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试剂盒(可从Qiagen，Hilden，Germany获得)从海马趾CA1分离物提取总RNA。根据制造商的说明书，使用BIOO NEXTflexTM试剂盒(BIOO#5138-08)将纯化的mRNA用于RNA-seq文库制备。简而言之，将1μg的总mRNA经受以下顺序工作流：聚A 纯化、分段、第一柔性链和第二链合成、DNA端部腺苷酸化、以及衔接子连接。文库通过PCR反应的15个循环来富集并且使用
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AMPure XP磁珠(可从Beckman Coulter Genomics， Danvers，Massachusetts获得)清洁。使用先进的分析片段分析仪评定文库的质量。条形码文库相等地混合以用于在MIT BioMicro中心(麻省理工学院，Cambridge，Massachusetts)处的Illumina HiSeq 2000平台上的单条泳道中进行测序。使用TopHat 2.0软件(可从在JohnsHopkins大学，Baltimore，Maryland处的计算生物学中心获得，用于使用超高通量短读取比对器Bowtie将RNA-seq读取与哺乳动物大小的基因组进行比对，并且然后分析映射结果以识别外显子之间的剪接点)将50-bp单一端部测序读取的原始fastq数据与小鼠mm9参考基因组进行比对。通过Cufflinks 2.2软件(可从在华盛顿州，西雅图，华盛顿大学的Trapnell实验室获得)使用UCSC mm9参考基因簇处理映射读取以估计转录物丰度，并且针对差异表达进行测试。通过外显子的片段/千碱基/百万个映射片段(FPKM)测量转录物的相对丰度。使用 Cuffdiff模块(用于找到转录物表达、剪接和启动子用途之间的显著变化，包括作为Cufflinks 2.2软件(可从在华盛顿州，西雅图，华盛顿大学的Trapnell实验室获得)的一部分)执行处理组与非处理组之间的基因差异表达测试，其中统计显著性的调整的p值<0.05(GEO登录： GSE77471)。
为了理解RNA-seq数据的细胞和分子机制，针对细胞类型特异性分析处理14个可公开获得的RNA-seq数据集。另外，下载在不同化学和基因扰动下的60个可公开获得的神经元、小神经胶质细胞和巨噬细胞特异性RNA-seq数据集并且使用TopHat Cufflinks 2.2软件 (可从在华盛顿州，西雅图，华盛顿大学的Trapnell实验室获得)进行处理以用于GSEA统计分析。基因集富集分析(GSEA)用于确定来自 RNA-seq数据的限定的基因集是否在来自特定扰动研究的排序的基因列表的方向上显著地富集。在公开的RNA-seq数据集中检测的基因通过倍数变化(情况相对于对照)的log2值从正值到负值排序。当标称p值和FDR q值小于0.05时，认为限定的基因集(在此情况下，在γ处理之后上调或下调的基因)与扰动诱导的转录组变化(上调或下调) 显著地相关。计算的归一化的富集得分(NES)的符号指示基因集在排序列表的顶部或底部处富集。使用自定义R脚本生成差异表达的基因的热图，并且基于基因FPKM值计算跨每种基因的所有文库的z得分值。还基于基因FPKM值通过R程序生成细胞类型特异性分析的盒形图。
定量RT-PCR
从三月大的雄性5XFAD/PV-Cre小鼠的海马体分离CA1。使用液氮将组织快速冷冻并且在-80℃下保存，并且根据制造商的方案 (Qiagen(Hilden，Germany))使用RNeasy试剂盒提取RNA。将RNA(3 μg)进行DNA酶I处理(4U，Worthington Biochemical公司(Lakewood，New Jersey))，根据制造商的说明书使用RNA提纯和浓缩器-5试剂盒 (RNA Clean andConcentrator-5Kit)(Zymo Research(Irvine,California)) 进行纯化，并且使用14μlDEPC处理水进行洗脱。针对每个样品，将1μg RNA在50℃下在含有随机六聚物混合物和Superscript III逆转录酶(50U，InvitrogenTM，可从Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts获得)的20μl反应体积中逆转录一小时。将第一链 cDNA 1:10稀释，并且将1μl用于在含有引物(0.2μM)的20μl反应 (SsoFastTM
Figure GDA0003623860480001191
Supermix，Bio-Rad)中进行的RT-qPCR扩增。使用2-ΔΔCt方法评定基因表达的相对变化。
从视觉皮层分离小神经胶质细胞。快速切开V1区域并且放置在冰冷的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(GibcoTM 14175-095，可从Life Technologies获得)中。然后根据制造商的方案在微小修改的情况下使用神经组织解离试剂盒(P)(130-092-628，Miltenyi Biotec，Cambridge， Massachusetts)对组织进行酶促煮解。具体地，将组织在37℃下酶促煮解15分钟而不是35分钟，并且将所得的细胞悬浮液穿过40μm细胞滤过器(352340，Falcon细胞滤过器，Sterile，Corning，New York) 而不是
Figure GDA0003623860480001202
智能滤过器70μm。使用别藻蓝蛋白(APC)-缀合物 CD11b小鼠克隆体M1/70.15.11.5(130-098-088，Miltenyi Biotec，Cambridge，Massachusetts)和藻红蛋白(PE)-缀合的CD45抗体(例如， BD PharmingenTM，553081)对所得的细胞悬浮液进行染色。然后使用荧光活化的细胞分选术(FACS)来纯化CD11b和CD45阳性小神经胶质细胞。将细胞直接分选到1XPBS中(参见，例如，图52A)。
统计学
针对非正态分布的电生理数据，结果呈现为中值和四分位数，除非另外指出。当这些中值和四分位数不认为数据正态分布时，执行针对相等中值的双边Wilcoxon秩和测试来确定分布是否是显著地不同的，或者执行Wilcoxon符号秩测试来确定分布是否显著地不同于零。波动在统计上比较的组之间是相似的。使用Bonferroni方法来针对多重比较进行校正。分子和生物化学结果呈现为平均值和SEM。本公开中声明的百分比是组平均值。使用Prism GraphPad软件(GraphPad 软件公司，La Jolla，California)执行所有的统计分析。使用D’Agostino &Pearson全能正态性测试确定正态性。波动在统计上比较的组之间是相似的。通过双侧非配对t测试分析由两个组组成的正态分布数据的比较数据。通过单向ANOVA、接着通过Tukey多重比较测试分析由三个或更多个组组成的正态分布数据的数据比较。使用Mann Whitney测试实施非正态分布数据的比较数据。在图例中指定每个实验的统计测试、精确的p值和样品大小(n)。使用三个生物重复/条件的最小值执行分子和生物化学分析。
听觉γ刺激生成
以
Figure GDA0003623860480001201
编程语言编辑的以下脚本(可从MathWorks， Natick，Massachusetts获得)展示根据一些实施方案生成听觉滴答声系列刺激的一种方法：
滴答声_频率＝输入(‘指定滴答声数量/秒：’)；％从键盘获得所需的滴答声数量/秒
滴答声_持续时间＝输入(‘指定以毫秒为单位的滴答声持续时间：’)；％从键盘获得所需的滴答声持续时间
声音_频率＝输入(‘指定以Hertz为单位的声音频率：’)；％从键盘获得所需的以Hertz为单位的声音频率
声音_持续时间＝输入(‘指定以秒为单位的声音持续时间：’)；％从键盘获得所需的声音持续时间
％音频_采样_率＝输入(‘指定以Hertz为单位的音频采样率：’)；％从键盘获得所需的音频采样率
音频_文件_名称＝输入(‘指定音频文件名称和扩展名：’)；％从键盘获得所需的音频文件名称
角频率＝2*π*声音_频率；％将声音频率转化为角频率
％％音频_采样_率＝两倍(声音_频率*8)；
％％
％％如果音频_采样_率<8192
％％音频_采样_率＝8192
％％结束
音频_采样_率＝200000；
％Ts＝linspace(0，声音_持续时间，音频_采样_率*声音_持续时间)；％指定4秒内的采样时间(8192Hz的缺省材料率)
Ts＝0:1/音频_采样_率:声音_持续时间；
声音_信号＝cos(角频率*Ts)；％针对整个声音持续时间计算余弦
脉冲_宽度＝滴答声_持续时间/1000；％脉冲宽度
D_1＝脉冲_宽度/2:1/滴答声_频率:最大(Ts)；％50Hz重复频率；注意：以宽度/2而不是0开始D以便将脉冲系列向右移动宽度/2并且因此以0开始系列
脉冲_系列_掩蔽物＝脉冲系列(Ts，D_1，‘rectpuls’，脉冲_宽度)：
％使用脉冲系列掩蔽物掩蔽声音信号
声音_信号_掩蔽＝声音_信号.*脉冲_系列_掩蔽物；
％播放滴答声
Soundsc(声音_信号_掩蔽，音频_采样_率)；
％保存音频文件
音频编写(音频_文件_名称，声音_信号_掩蔽，音频_采样_率)；
结论
虽然各种发明性实施方案已在本文中进行描述和说明，本领域的普通技术人员应易于预想各种其他手段和/或结构以用于执行功能和/ 或获得本文所述的结果和/或优点中的一种或多种，并且此类变化和/ 或修改各自被视为在本文所述的发明性实施方案的范围内。更一般而言，本领域的普通技术人员应易于理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料、以及构型意在是示例性的并且实际参数、尺寸、材料、和/或构型将取决于特定应用或发明性教义所用于的应用。本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验即能够确定本文所述的具体发明性实施方案的许多等效物。因此，应理解，前述实施方案仅以举例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，发明性实施方案可按不同于具体描述和要求的方式来实践。本公开的发明性实施方案涉及本文所述的各个单独的特性、系统、物品、材料、试剂盒，和/ 或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒、和/或方法互相不一致，则两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒、和/或方法的任何组合包括在本公开的发明性范围内。
以上所述的实施方案可以多种方式中的任一种实现。例如，本文公开的实施方案可使用硬件、软件或其组合实现。当在软件中实现时，软件代码可在任何合适的处理器或处理器的集合上执行，无论提供在单个计算机中或分配在多个计算机之间。
另外，应理解，计算机可以多种形式中的任一种体现，诸如机架安装计算机、台式计算机、膝上型计算机、或平板计算机。另外，计算机可嵌入在通常不视为计算机但具有合适的处理能力的装置中，包括个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其他合适的便携式或固定的电子装置。
另外，计算机可具有一个或多个输入和输出装置。除其他情况之外，这些装置可用于呈现用户接口。可用于提供用户接口的输出装置的实例包括用于输出的视觉呈现的打印机或显示屏以及扬声器或用于输出的可听呈现的其他声音生成装置。可用于用户接口的输入装置的实例包括键盘和指向装置，诸如鼠标、触摸垫和数字化图形输入板。作为另一个实例，计算机可通过语音识别或以其他可听形式接收输入信息。
此类计算机可通过一个或多个网络以任何合适的形式互连，包括局域网或广域网，诸如企业网络和智能网络(IN)或因特网。此类网络可基于任何合适的技术并且可根据任何合适的协议进行操作，并且可包括无线网络、有线网络或光纤网络。
本文概括的各种方法或过程可编码为可在采用各种操作系统或平台中的任一种的一个或多个处理器上执行的软件。另外，此类软件可使用多种合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种编写，并且还可编译为可执行的机器语言编码或在框架或虚拟机器上执行的中间编码。
另外，各种发明性概念可体现为一种或多种方法，所述方法的一个实例已提供。作为所述方法的一部分执行的动作可以任何合适的方式排序。因此，实施方案可以构造成其中动作以不同于所说明的顺序执行，这可包括同时执行一些动作，尽管在说明性实施方案中视为顺序动作。
本文提到的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式整体并入。
所有的定义，如本文所定义和使用，应理解为控制所定义的术语的字典定义、在以引用的方式并入的文件中的定义，和/或普通含义。
如本文所用，在说明书和在权利要求书中，不定冠词“一个(种)”应理解为意指“至少一个(种)”，除非相反地明确指示。
如本文所用，在说明书和在权利要求书中，短语“和/或”应理解为意指所结合的元素，即在一些情况下结合存在并且在其他情况下分离存在的元素的“一者或两者”。在“和/或”的情况下列出的多种元素应以相同的方式解释，即所结合的元素的“一种或多种”。除了由“和/或”从句所具体定义的元素以外，其他元素可任选地存在，无论是否与所具体定义的那些元素相关或无关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言诸如“包括”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可仅指代A(任选地包括除了B以外的元素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包括除了A以外的元素)；在又一个实施方案中，指代A和B两者(任选地包括其他元素)；等。
如本文所用，在说明书和在权利要求书中，“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包括端值，即包括多种元素或元素列表和任选地另外的未列出项目中的至少一种，但是也包括多于一种。仅相反地明确指示的术语，诸如“中的仅一个(种)”或“中的正好一个(种)”或当在权利要求书中使用时的“由…组成”将理解为例如包括多种元素或元素列表中的正好一种元素。一般来讲，当之前有排他性的术语，诸如“任一个(种)”、“中的一个(种)”、“中的仅一个(者)”、或“中的正好一个(种)”时，如本文所用的术语“或”应仅解释为指示排他性的替代方案(即，“一个(种)或另一个(种)但并非两个(种)”)。当在权利要求书中使用时，“主要由…组成”应具有如在专利法的领域中使用的普通含义。
如本文所用，在说明书中和在权利要求书中，参考一种或多种元素的列表，短语“至少一个(种)”应理解为意指选自元素列表中的任一种或多种元素的至少一种元素，但是并不一定包括元素列表内具体列出的每一种元素中的至少一种并且不排除元素列表中的元素的任何组合。此定义还允许除了短语“至少一个(种)”指代的元素列表内所具体定义的元素以外，无论是否与所具体定义的那些元素相关或无关，元素可任选地存在。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指代至少一个，任选地包括多于一个A， B不存在(并且任选地包括除了B以外的元素)；在另一个实施方案中，指代至少一个，任选地包括多于一个B，A不存在(并且任选地包括除了A以外的元素)；在又一个实施方案中，指代至少一个，任选地包括多于一个A以及至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他元素)；等。
在权利要求书中，以及在以上说明书中，所有的过渡短语诸如“包含(comprising)”、“包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“含有(containing)”、“涉及(involving)”、“拥有(holding)”、“由…构成 (composed of)”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡短语“由…组成(consisting of)”和“主要由…组成(consisting essentially of)”应分别是封闭式或半封闭式过渡短语，如在专利审查程序的美国专利局手册，章节2111.03中所列出的。

Claims (32)

1.一种用于预防、减轻和治疗受试者的痴呆中的至少一种的系统，所述系统包括：
刺激发射装置，其被配置成施用刺激以在所述受试者的大脑区域中诱导体内同步γ振荡，其中所述刺激包括视觉或听觉刺激；
至少一个存储器，其用于存储刺激参数和处理器可执行指令；以及
至少一个处理器，其通信地连接到所述刺激发射装置和所述至少一个存储器，其中在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器控制所述刺激发射装置来根据所述刺激参数发射所述刺激，所述参数包括一个频率，在所述频率下同步活化所述大脑区域，
由此所述受试者的痴呆被预防、减少和治疗中的至少一种。
2.一种用于预防、减轻和治疗受试者的痴呆中的至少一种的系统，所述系统包括：
刺激发射装置，其被配置成施用刺激以在所述受试者的大脑区域中诱导体内同步γ振荡；
至少一个存储器，其用于存储刺激参数和处理器可执行指令；以及
至少一个处理器，其通信地连接到所述刺激发射装置和所述至少一个存储器，其中在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器控制所述刺激发射装置来根据所述刺激参数发射所述刺激，所述参数包括一个频率，在所述频率下同步活化所述大脑区域，其中所述频率是20Hz至50Hz，
由此所述受试者的痴呆被预防、减少和治疗中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的系统，其中所述频率是40Hz。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述体内同步γ振荡发生在特定细胞类型中并且通过酶调节。
5.如权利要求4所述的系统，其中所述特定细胞类型是快闪-小清蛋白(FS-PV)免疫反应性中间神经元。
6.如权利要求4或5所述的系统，其中所述酶是光遗传活化剂、微生物视蛋白、通道视紫质-2(ChR2)和载体AAV-DIO-ChR2-EYFP中的至少一种。
7.一种用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，所述用途包括：
控制所述刺激发射装置来使用γ振荡发射刺激，其中所述刺激包括视觉或听觉刺激；以及
非侵入性地向所述受试者施用所述刺激，由此在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导体内同步γ振荡，以治疗所述受试者的痴呆。
8.一种用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，所述用途包括：
控制所述刺激发射装置来使用γ振荡发射刺激，其中所述刺激具有20Hz至50Hz的频率；以及
非侵入性地向所述受试者施用所述刺激，由此在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导体内同步γ振荡，以治疗所述受试者的痴呆。
9.如权利要求8所述的用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，其中所述频率是40Hz。
10.如权利要求7或8所述的用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，其中所述刺激发射装置是触觉装置、光发射装置和声音发射装置中的至少一种。
11.如权利要求7所述的用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，其中：
所述刺激发射装置是光发射装置和声音发射装置中的至少一种；
所述光发射装置包括光闭塞装置，用于减少到所述受试者的至少一只眼的环境光，所述光闭塞装置包括用于将视觉刺激发射到所述受试者的至少一只眼以在所述受试者的视觉皮层和海马体中的至少一个中诱导同步γ振荡的光发射单元；以及
所述声音发射装置包括噪声消除装置，用于减少到所述受试者的至少一只耳的环境噪声，所述噪声消除装置包括用于将声音刺激发射到所述受试者的至少一只耳以用于在所述受试者的听觉皮层和海马体中的至少一个中诱导同步γ振荡的扬声器单元。
12.如权利要求7所述的用于治疗有此需要的受试者的痴呆的用途的刺激发射装置，其中向所述受试者施用所述刺激包括以下中的一个或多个：
a)在所述受试者的至少一个大脑区域中维持或减少淀粉样蛋白-β(Aβ)肽的量；
b)在所述受试者的至少一个大脑区域中增加小神经胶质细胞的数量、诱导与神经保护性状态一致的所述小神经胶质细胞的形态学变化、或促进所述小神经胶质细胞的活性；以及
c)在所述受试者的至少一个大脑区域中减少tau磷酸化。
13.一种用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆，预防和/或减少所述受试者的焦虑，维持和/或降低所述受试者的应激反应中涉及的糖皮质素的血液水平，维持和/或增强所述受试者的记忆关联，维持和/或增强所述受试者的认知灵活性，维持和/或减少所述受试者的至少一个大脑区域的解剖学和形态学中的至少一种的变化以及维持和/或减少所述受试者的至少一个大脑区域中的神经元的数量、所述神经元中的脱氧核糖核酸(DNA)的质量和突触色斑密度中的至少一种的变化的装置，其在受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡，其中所述同步γ振荡具有20Hz至50Hz的频率。
14.如权利要求13所述的装置，其中所述同步γ振荡具有40Hz的频率。
15.如权利要求14所述的装置，其中所述装置包括：
信号发生器以产生信号；以及
刺激发射器，其连接至所述信号发生器，以基于由所述信号发生器产生的信号向所述受试者非侵入性地施用非侵入性刺激，以在所述受试者的至少一个大脑区域中非侵入性地诱导所述同步γ振荡。
16.如权利要求15所述的装置，其中所述刺激发射器是光发射器、声音发射器和触觉发射器中的至少一种。
17.如权利要求16所述的装置，其中所述刺激发射器是光发射器，并且选自光纤发射器和固态发射器。
18.如权利要求17所述的装置，其中所述光发射器是固态发射器并且包括至少一个发光二极管(LED)。
19.如权利要求16所述的装置，其中所述刺激发射器是包括显示屏的光发射器。
20.如权利要求16所述的装置，其中所述刺激发射器是声音发射器，并且所述刺激是可听滴答声系列。
21.如权利要求16所述的装置，其中所述刺激发射器是触觉发射器，并且所述刺激是触觉刺激。
22.一种用于预防、减轻和/或治疗受试者的痴呆，预防和/或减少所述受试者的焦虑，维持和/或降低所述受试者的应激反应涉及的糖皮质素的血液水平，维持和/或增强所述受试者的记忆关联，维持和/或增强所述受试者的认知灵活性；维持和/或减少所述受试者的至少一个大脑区域的解剖学和形态学中的至少一种的变化以及维持和/或减少所述受试者的至少一个大脑区域中的神经元的数量、所述神经元中的脱氧核糖核酸(DNA)的质量和突触色斑密度中的至少一种的变化的装置，其包括：
刺激发射器，其被配置来根据刺激策略生成在受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡的刺激，其中所述刺激发射器是光发射器、声音发射器和触觉发射器中的至少一种。
23.如权利要求22所述的装置，其中所述同步γ振荡具有20Hz至50Hz的频率。
24.如权利要求23所述的装置，其中所述同步γ振荡具有40Hz的频率。
25.如权利要求22所述的装置，其中所述刺激发射器是光发射器，并且选自光纤发射器和固态发射器。
26.如权利要求25所述的装置，其中所述光发射器是固态发射器并且包括至少一个发光二极管(LED)。
27.如权利要求22所述的装置，其中所述刺激发射器是包括显示屏的光发射器。
28.如权利要求22所述的装置，其中所述刺激发射器是声音发射器并且所述刺激是可听滴答声系列。
29.如权利要求22所述的装置，其中所述刺激发射器是触觉发射器并且所述刺激是触觉刺激。
30.一种用于预防、减少和治疗受试者的淀粉样蛋白-β(Aβ)肽、神经炎症和认知功能中的至少一种的变化中的至少一种的系统，所述系统包括：
至少一个电声换能器，其用于将电音频信号转化为对应的声音刺激，所述声音刺激包括具有35次滴答声/s至45次滴答声/s的滴答声频率的滴答声系列；
至少一个存储器装置，其用于存储电音频信号和处理器可执行指令；以及
至少一个处理器，其通信地连接到所述至少一个电声换能器和所述至少一个存储器装置，其中在执行所述处理器可执行指令之后，所述至少一个处理器控制所述电声换能器来将所述声音刺激输出到所述受试者的至少一只耳，以在所述受试者的至少一个大脑区域中诱导同步γ振荡，所述同步γ振荡引起所述受试者的所述Aβ肽、所述神经炎症和所述认知功能中的至少一种的所述变化的所述预防、所述减少和所述治疗中的至少一种。
31.如权利要求30所述的系统，其中：
所述系统是便携式的；
所述至少一个电声换能器包括用于所述受试者佩戴在所述至少一只耳周围、上和中的至少一种以将所述声音刺激导向到所述受试者的所述至少一只耳中并减少环境噪声的至少一个耳机；并且
所述系统还包括用于将所述电音频信号传达到所述至少一个耳机的耳机接口。
32.如权利要求30所述的系统，其还包括在所述声音刺激的所述输出之前、过程中和之后中的至少一种监测所述受试者的所述至少一个大脑区域中的功能的神经成像扫描器。
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